TW202228736A - 使用CD47-SIRPα 阻斷劑觸發安全殺滅機制之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑的方法及組合物，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。

Description

使用CD47-SIRPα阻斷劑觸發安全殺滅機制之方法
相關申請案之交互參照
本PCT申請案要求2020年10月9日提交之美國臨時專利申請案第63/090,001號，及2021年1月8日提交之美國臨時專利申請案第63/135,518號之優先權，兩者全部以引用方式併入本文。 序列表
本申請案含有序列表，該序列表經由EFS-Web以ASCII格式提交並且全部以引用方式併入本文。在2021年10月9日建置之ASCII複本被命名為2021-10-09 Sana 8007.WO00 sequence listing.txt並且大小為121 KB。
再生醫學(細胞療法)涉及製備細胞並且將其輸送至患者。此等細胞可為可分化成任何細胞類型之多能幹細胞(PSC；pluripotent stem cell)、自此等PSC分化之細胞、或原代細胞。此等細胞可經工程化以含有一或多個編碼CD47之外源核酸、生物體內之宿主細胞上之跨膜蛋白及已知「自身」標誌物、及視情況一或多個其他蛋白。當CD47結合至循環免疫細胞上之一種跨膜受體蛋白，信號調控蛋白α(SIRPα；signal regulatory protein alpha)，以便傳遞抑制性「不要吃我」信號時，表現CD47之宿主細胞逃避患者免疫系統例如經由巨噬細胞及/或自然殺手細胞(NK；natural killer)介導之死亡的排斥反應。此類工程化細胞之免疫抑制特性可使得其對於移植有該等細胞之患者而言為危險的，例如，當發生不受抑制的生長時，從而產生研發安全機制之需要，該等安全機制可藉由作用於CD47-SIRPα軸或相互作用來調節經移植之細胞群體，例如，經由患者先天免疫系統來消除經移植之細胞群體。
本發明提供用於調節先前投與或移植至受試者中之細胞群體的方法及組合物，該等方法及組合物包括將CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者，其中細胞群體含有一或多個編碼CD47及/或表現或過度表現CD47之外源核酸。此CD47-SIRPα阻斷劑包括結合至CD47或SIRPα，由此作用於、干擾、阻斷、及/或抑制CD47-SIRPα軸或相互作用的小分子、巨分子、多肽、融合蛋白、雙功能抗體、抗體、或其組合。調節過度表現CD47或另外表現外源CD47多肽之細胞群體包括在投與此類細胞之受試者中觸發先天殺滅機制。先天殺滅機制可藉由投與CD47-SIRPα阻斷劑來觸發並且可包括免疫細胞介導之細胞殺滅，諸如NK介導之殺滅、巨噬細胞介導之殺滅、ADCC及/或CDC。
在一態樣中，本文提供包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑的方法，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。
在另一態樣中，本文提供包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑的方法，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之T細胞群體。
在另一態樣中，本文提供包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑的方法，其中先前已向受試者投與T細胞群體，該等細胞(i)經工程化以表現外源CD47多肽及至少一個嵌合抗原受體(CAR；chimeric antigen receptor)並且(ii)具有MHC I類HLA分子、MHCII類HLA分子、T細胞受體(TCR；T cell receptor)α、及/或TCR β之減少之表現。
在另一態樣中，本文提供包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑的方法，其中先前已向受試者投與T細胞群體，該等細胞具有MHC I類HLA分子、MHC II類HLA分子、及TCRα之減少之表現並且經工程化以表現外源CD47多肽及CD19嵌合抗原受體(CAR)。
在另一態樣中，本文提供包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑的方法，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之胰島細胞群體。
在另一態樣中，本文提供包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑的方法，其中先前已向受試者投與胰島細胞群體，該等細胞(i)經工程化以表現外源CD47多肽並且(ii)具有MHC I類HLA及/或MHC II類HLA分子之減少之表現。
在另一態樣中，本文提供包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑的方法，其中先前已向受試者投與胰島細胞群體，該等細胞(i)經工程化以表現外源CD47、CD46、及CD59多肽並且(ii)具有MHC I類HLA及/或MHC II類HLA分子之減少之表現。
在另一態樣中，本文提供減少受試者中之經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體的方法，該方法包括：(a)向受試者投與第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑；(b)測定在(a)中投與之第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑之第一結果；(c)視情況基於(b)中之第一結果，投與第二劑量之CD47-SIRPα阻斷劑；及(d)視情況測定在(c)中投與之第二劑量之CD47-SIRPα阻斷劑之第二結果。
在另一態樣中，本文提供包括以下之方法：(a)量化受試者中之經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體；(b)測定有效減少細胞群體至少20%之CD47-SIRPα阻斷劑之第一劑量；及(c)將第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，T細胞為原代細胞。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，T細胞為同種異體細胞。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，T細胞自iPSC分化。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，T細胞進一步經工程化以表現嵌合抗原受體(CAR)。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CAR為選自由以下組成之群的CD19 CAR：tisagenlecleucel、lisocabtagene maraleucel、axicabtagene ciloleucel、及brexucabtagene autoleucel。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CAR為包含SEQ ID NO:117之胺基酸序列的CD19 CAR。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CD19 CAR由SEQ ID NO:116之核酸序列編碼。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，T細胞經工程化以表現至少一種選自由以下組成之群的額外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制劑、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重鏈、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8、及其組合。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，胰島細胞經工程化以表現至少一種選自由以下組成之群的額外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制劑、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重鏈、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8、及其組合。
如請求項5、6、或7中任一項所述之方法，其中胰島細胞經工程化以具有CD142之減少之表現。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，胰島細胞為原代細胞。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，胰島細胞自iPSC分化。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CAR及編碼外源CD47多肽之基因在雙順反子載體中引入T細胞中。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，雙順反子載體經由慢病毒來引入T細胞中。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CAR及編碼外源CD47多肽之基因在單一啟動子之控制下。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，第一結果及第二結果獨立地選自由以下組成之群：(i)約10%與100%之間之細胞數目之減少，(ii)約10%與100%之間之不良事件之減少，及(iii)(i)及(ii)之組合。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量：(i)以0.05、0.1、0.3、1、3、或10 mg/kg；(ii)每12小時一次、每24小時一次、每36小時一次、或每48小時一次；及/或(iii)1天與3週之間投與。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，第一劑量與第二劑量為相同的。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，細胞為原代細胞。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，原代細胞為T細胞或胰島細胞。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，細胞自iPSC分化。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，分化細胞選自由以下組成之群：心臟細胞、神經細胞、內皮細胞、T細胞、胰島細胞、視網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲狀腺細胞、皮膚細胞、血細胞、原代細胞、及上皮細胞。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，細胞經工程化以表現至少一種選自由以下組成之群的額外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制劑、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重鏈、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8、及其組合。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，T細胞經工程化以具有TCRα及/或TCRβ之減少之表現。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，T細胞經工程化以具有細胞毒性T淋巴球相關蛋白4(CTLA4；cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)及/或計畫性細胞死亡(PD1；programmed cell death)之減少之表現。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，編碼外源CD47多肽之基因經由同源引導修復(HDR；homology directed repair)介導插入細胞之基因組基因座中來引入細胞中。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，基因組基因座選自由以下組成之群：B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRBC基因座、及安全港基因座。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，安全港基因座選自由以下組成之群：AAVS1、ABO、CCR5、CLYBL、CXCR4、F3、FUT1、HMGB1、KDM5D、LRP1、MICA、MICB、RHD、ROSA26、及SHS231基因座。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CAR結合選自由以下組成之群之抗原：CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CD138、BCMA、及其組合。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，第一結果及/或第二結果為不良事件。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在向受試者投與細胞之後至少一天投與。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在向受試者投與細胞之後至少一週投與。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在向受試者投與細胞之後至少一個月投與。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在受試者經歷與投與細胞相關之不良事件之後投與。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，不良事件選自由以下組成之群：異常增生、轉型、腫瘤形成、細胞因子釋放症候群、移植物抗宿主疾病(GVHD；graft-versus-host disease)、免疫效應細胞相關神經中毒性症候群(ICANS；immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome)、發炎、感染、噁心、嘔吐、出血、間質性肺炎、呼吸道疾病、黃疸、體重損失、腹瀉、食欲損失、抽筋、腹部疼痛、肝靜脈閉塞疾病(VOD；hepatic veno-occlusive disease)、移植失敗、器官損傷、不孕、激素變化、異常生長形成、白內障、及移植後淋巴增殖病症(PTLD；post-transplant lymphoproliferative disorder)。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑包含CD47-結合域。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CD47結合域包含信號調控蛋白α(SIRPα；signal regulatory protein alpha)或其片段。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑包含免疫球蛋白G(IgG；immunoglobulin G)Fc域。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，IgG Fc域包含IgG1 Fc域。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，IgG1 Fc域包含人類抗體之片段。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑選自由TTI-621、TTI-622、及ALX148組成之群。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，IgG Fc域包含IgG4 Fc域。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑為抗體。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，抗體選自由以下組成之群：MIAP410、B6H12、及麥格羅單抗(Magrolimab)。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以有效減少細胞群體之劑量投與。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，細胞群體減少約10%與100%之間。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，細胞群體得以消除。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，細胞群體之減少經由免疫反應而發生。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，免疫反應為NK細胞介導之細胞殺滅、巨噬細胞介導之細胞殺滅、補體依賴性細胞毒性(CDC；complement-dependent cytotoxicity)、及/或細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC；antibody-dependent cellular cytotoxicity)。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內、或顱內投與受試者。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以1-20天之間之時間間隔投與受試者持續10天與6個月之間之時段。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑：(i)以0.05、0.1、0.3、1、3、或10 mg/kg之劑量；(ii)每12小時一次、每24小時一次、每36小時一次、或每48小時一次；及/或(iii)1天與3週之間投與受試者。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，方法進一步包括將IL-2投與受試者。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑選自由以下組成之群：結合CD47之抗體或其片段、結合CD47之雙特異性抗體、結合CD47之免疫細胞因子融合蛋白、含有CD47之融合蛋白、結合SIRPα之抗體或其片段、結合SIRPα之雙特異性抗體、結合SIRPα之免疫細胞因子融合蛋白、含有SIRPα之融合蛋白、及其組合。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：麥格羅單抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47、及IMC-002。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對CD47之單鏈Fv片段(scFv)、針對CD47之Fab、針對CD47之VHH奈米抗體、針對CD47之DARPin、及其變異體。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23、及P362。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對SIRPα之單鏈Fv片段(scFv；single-chain Fv fragment)、針對SIRPα之Fab、針對SIRPα之VHH奈米抗體、針對SIRPα之DARPin、及其變異體。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，含有SIRPα之融合蛋白包含連接至Fc域之SIRPα之CD47結合域。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，Fc域包含選自由以下組成之群的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，細胞具有MHC I類HLA及/或MHC II類HLA分子之減少之表現。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，MHC I類及/或MHC II類表現得以敲除。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，MHC I類HLA之減少表現由B2M之減少表現來介導並且MHC II類之減少表現由CIITA之減少表現來介導。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，B2M及/或CIITA表現得以敲除。
在每個或任何以上或以下提及實施例之一些實施例中，外源CD47多肽包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
再生醫學(細胞療法)涉及製備細胞並且將其輸送至患者。細胞療法，亦即，將細胞移植至受試者中以替換或修復受損細胞，可在治療以細胞、組織、及/或器官之進行性惡化或不存在為特徵之疾病方面極有用的。在一些實施例中，細胞療法以修復、替換、恢復、及/或提供在其他情形下受損、功能異常、或不存在的細胞為目標。用於細胞療法中之細胞可為可分化成任何細胞類型之多能幹細胞(PSC)、自此等PSC分化之細胞、或原代細胞。用於細胞療法中之細胞可經工程化以含有一或多個編碼致耐受性因子諸如CD47之外源核酸、生物體內之宿主細胞上之跨膜蛋白及已知「自身」標誌物、及視情況一或多個其他蛋白。當CD47結合至循環免疫細胞上之一種跨膜受體蛋白，信號調控蛋白α(SIRPα)，以便傳遞抑制性「不要吃我」信號時，表現CD47之宿主細胞逃避患者免疫系統例如經由巨噬細胞及/或自然殺手細胞(NK)介導之死亡的排斥反應。此類工程化細胞之免疫抑制特性可使得其對於移植有該等細胞之患者而言為危險的，例如，當發生不受抑制的生長時，從而產生研發安全機制之需要，該等安全機制可藉由作用於CD47-SIRPα軸或相互作用來調節經移植之細胞群體，例如，經由患者先天免疫系統來消除經移植之細胞群體。本發明提供用於藉由將CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者來調節先前投與或移植至受試者中之細胞或細胞群體的方法及組合物，其中細胞或細胞群體含有一或多個編碼CD47之外源核酸及/或表現或過度表現外源CD47多肽。CD47-SIRPα阻斷劑可包括結合至CD47或SIRPα，由此作用於、干擾、阻斷、及/或抑制CD47-SIRPα軸或相互作用的小分子、巨分子、多肽、融合蛋白、雙功能抗體、抗體、或其組合。此相互作用觸發針對先前投與細胞之先天殺滅機制，包括免疫細胞介導之細胞殺滅，諸如NK介導之殺滅、巨噬細胞介導之殺滅、ADCC及/或CDC。以此方式，投與CD47-SIRPα阻斷劑導致受試者中之先前投與細胞減少，並且在某些實施例中完全消除。 I.定義
術語「抗體」用於指示，除了天然抗體、遺傳工程化或另外經修飾形式之免疫球蛋白或其部分以外，包括嵌合抗體、人類抗體、人源化抗體、或合成抗體。抗體可為單株或多株抗體。在抗體為免疫球蛋白分子之免疫原性活性部分的實施例中，抗體可包括但是不限於單鏈可變片段抗體(scFv)、二硫化物連接Fv、單域抗體(sdAb)、VHH抗體、抗原結合片段(Fab)、Fab'、F(ab')2片段、或雙功能抗體。藉由用短連接子肽來連接免疫球蛋白之可變區重(VH)及輕(VL)鏈，scFv抗體衍生自抗體。scFv可包含Vh-Vl或Vl-Vh。類似地，二硫化物連接Fv抗體可藉由使用域間二硫鍵來連接VH及VL而產生。另一方面，sdAbs僅由重或輕鏈之可變區組成並且通常為抗體之最小抗原結合片段。VHH抗體為僅重鏈之抗原結合片段。雙功能抗體為由藉由小肽連接子來非共價連接或彼此共價連接之VH及VL區域組成的scFv片段之二聚體。本文揭示之抗體，包括包含免疫球蛋白分子之免疫原性活性部分之抗體，保持結合特異性抗原之能力。
本文使用之術語「安全開關」係指控制所關注蛋白或基因之表現的系統，該蛋白或基因在經下調或上調時，例如經由藉由宿主之免疫系統來識別而導致細胞之清除或死亡。安全開關可被設計成或包括外源分子，該分子經投與以預防或減輕不良臨床事件。安全開關可藉由在DNA、RNA及蛋白層次上調控表現來工程化。安全開關可包括允許響應於不良事件來控制細胞活性的蛋白或分子。在一些實施例中，安全開關係指結合特異性細胞並且靶向其以達成細胞死亡或消除之因子(例如，蛋白、分子等)。在一些情況下，安全開關為結合靶細胞表面上之標靶蛋白，進而觸發免疫反應的阻斷劑。在一個實施例中，安全開關為在不活動狀態下表現之「殺滅開關」，並且在藉由選擇性、外部提供因子來活化開關後，對於表現安全開關之細胞而言為致死的。在一個實施例中，安全開關基因相對於構建體中之所關注基因為順式作用的。安全開關之活化導致細胞經由細胞凋亡或壞死來僅殺滅自身或自身及相鄰細胞。
如本文用於表徵細胞，術語「低免疫原性」通常意謂此細胞不太易於發生此類細胞植入或移植至其中之受試者之免疫排斥。例如，相對於未改變或未修飾野生型細胞，此低免疫原性細胞可約2.5%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97.5%、99%或更少易於發生此類細胞移植至其中之受試者之免疫排斥。在一些態樣中，基因組編輯技術用於調節MHC I及/或MHC II基因之表現，並且視情況表現致耐受性因子諸如但不限於CD47，並且由此產生低免疫原性細胞。在一些實施例中，低免疫原性細胞逃避MHC失配同種異體接受者中之免疫排斥。在一些實例中，在投與(例如，移植或嫁接)至MHC失配同種異體接受者時，由本文概述之低免疫原性幹細胞產生之分化細胞逃避免疫排斥。在一些情況下，在投與(例如，移植或移植)至MHC失配同種異體接受者時，由本文概述之低免疫原性幹細胞產生之低免疫原性或分化細胞逃避免疫排斥，並且免疫抑制水準低於非低免疫原性細胞所需要之水準。在一些實施例中，保護低免疫原性細胞以免適應性免疫排斥及/或先天免疫細胞排斥。
細胞之低免疫原性可藉由評估細胞之免疫原性諸如細胞引起適應性及先天免疫反應之能力來測定。此免疫反應可使用熟習此項技術者公認之檢定來量測。在一些實施例中，免疫反應檢定量測低免疫原性細胞對於T細胞增殖、T細胞活化、T細胞殺滅、NK細胞增殖、NK細胞活化、及巨噬細胞活性之效應。在一些情況下，在投與受試者後，低免疫原性細胞及其衍生物經歷T細胞及/或NK細胞之減少之殺滅。在一些情況下，與未修飾或野生型細胞相比，細胞及其衍生物展示減少之巨噬細胞吞噬。在一些實施例中，與對應未修飾野生型細胞相比，低免疫原性細胞在接受者受試者中引起減少或減弱之免疫反應。在一些實施例中，低免疫原性細胞在接受者受試者中為非免疫原性的或未能引起免疫反應。
如本文使用之「免疫抑制因子」或「免疫調控因子」包括低免疫性因子及補體抑制劑。
在一些情況下，如本文使用之「免疫信號轉導因子」係指活化免疫信號轉導途徑之分子、蛋白、肽及其類似物。
如本文使用之「安全港基因座」係指允許轉殖基因或外源基因之安全表現的基因座位。安全港或基因組安全港係基因組中之能夠以一定方式容納新遺傳物質之整合的位點，該方式允許新插入遺傳元件：(i)可預測地起作用並且(ii)不導致對於宿主細胞或生物體構成風險的宿主基因組之變化。示例性「安全港」基因座包括CCR5基因、CXCR4基因、PPP1R12C(亦稱為AAVS1)基因、白蛋白基因、及Rosa基因。
外源分子或構建體可與內源性分子相同類型之分子，例如，外源蛋白或核酸。在此類情況下，外源分子以比細胞中之內源性分子更大之濃度引入細胞中。在一些情況下，外源核酸可包括引入細胞中之感染病毒基因組、質體或游離基因，或不通常存在於細胞中之染色體。將外源分子引入細胞中之方法為熟習此項技術者已知的，並且包括但不限於脂質介導轉移(亦即，脂質體，包括中性及陽離子脂質)、電穿孔、直接注射、細胞融合、粒子轟擊、磷酸鈣共沉澱、DEAE-葡聚糖介導轉移及病毒載體介導轉移。
出於本發明之目的，「基因」包含編碼基因產物之DNA區域，以及調控基因產物之產生之所有DNA區域，不論是否此類調控序列與編碼及/或轉錄序列相鄰。因此，基因包括但不一定限於啟動子序列、終止子、翻譯調控序列諸如核糖體結合位點及內部核糖體進入位點、增強子、沉默子、絕緣子、邊界元件、複製起點、基質附著位點及基因座控制區。
「基因表現」係指包含於基因中之資訊轉化成基因產物。基因產物可為基因(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反義RNA、核酶、結構RNA或任何其他類型之RNA)之直接轉錄產物或藉由mRNA之轉譯來產生之蛋白。基因產物亦包括藉由諸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化、及編輯之過程來修飾之RNA，及藉由例如甲基化、乙醯化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、肉豆蔻化、及醣化來修飾之蛋白。
「調節基因表現」係指基因之表現水準之變化。調節表現可包括但是不限於基因活化及基因抑制。調節亦可為完全的，亦即，其中基因表現完全失活或活化至野生型水準或以上；或其可為部分的，其中基因表現部分減少，或部分活化至野生型水準之某個分率。
如本文使用，術語「減少表現」或「降低表現」係指與未修飾對應細胞或野生型細胞(例如，正常、健康或親本細胞)相比，細胞展現更低之基因或蛋白之表現水準(例如，低至少約2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%之水準)。
如本文使用，術語「增強表現」或「增加表現」係指與未修飾對應細胞或野生型細胞(例如，正常、健康或親本細胞)相比，細胞展現更高之基因或蛋白之表現水準(例如，高至少約2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%之水準)。
關於並列兩個或兩個以上部件(諸如序列元件)的術語「可操作連接」或「可操作地連接」可互換使用，其中部件被配置成使得兩個部件正常地起作用並且允許至少一個部件可介導賦予至少另一部件之功能的可能性。以實例說明，若響應於一或多個轉錄調控因子之存在或不存在，轉錄調控序列控制編碼序列之轉錄水準，則轉錄調控序列，諸如啟動子，可操作連接至編碼序列。轉錄調控序列通常與編碼序列可操作順式連接，但是不一定與其直接相鄰。例如，增強子為可操作連接至編碼序列之轉錄調控序列，雖然其並不鄰接。
「載體」或「構建體」能夠將基因序列轉移至靶細胞。通常，「載體構建體」、「表現載體」、及「基因轉移載體」意謂能夠引導所關注基因之表現並且可將基因序列轉移至靶細胞的任何核酸構建體。因此，該術語包含選殖、及表現媒介物，以及整合載體。將載體或構建體引入細胞中之方法為熟習此項技術者已知的，並且包括但不限於脂質介導轉移(亦即，脂質體，包括中性及陽離子脂質)、電穿孔、直接注射、細胞融合、粒子轟擊、磷酸鈣共沉澱、DEAE-葡聚糖介導轉移及病毒載體介導轉移。
如本文使用之「多能幹細胞」或「原代細胞」具有分化成三個胚層中之任一者的潛力：內胚層(例如，胃壁、胃腸道、肺等)，中胚層(例如，肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖系統組織等)或外胚層(例如，表皮組織及神經系統組織)。如本文使用之術語「多能幹細胞」亦涵蓋「誘導多能幹細胞」或「iPSC」，衍生自非多能細胞之多能幹細胞類型。親本細胞之實例包括已藉由各種手段重新編程來誘導多能、未分化表型的體細胞。此類「iPS」或「iPSC」細胞可藉由誘導某些調控基因之表現或藉由外源應用某些蛋白來產生。誘導iPS細胞之方法在此項技術中為已知的並且進一步於下文描述。(參見例如Zhou等人, Stem Cells 27 (11): 2667-74 (2009); Huangfu等人, Nature Biotechnol. 26 (7): 795 (2008); Woltjen等人, Nature 458 (7239): 766-770 (2009); 及Zhou等人, Cell Stem Cell 8:381-384 (2009)；其中之各者全部以引用方式併入。) 以下概述誘導多能幹細胞(iPSC)之產生。如本文使用，「hiPSC」為人類誘導多能幹細胞。
「HLA」或「人類白血球抗原」複合物為編碼人類中之主要組織相容性複合物(MHC；major histocompatibility complex)蛋白的基因複合物。構成HLA複合物之此等細胞表面蛋白負責調控對於抗原之免疫反應。在人類中，存在兩種MHC，I類及II類，「HLA-I」及「HLA-II」。HLA-I包含三種蛋白，HLA-A、HLA-B及HLA-C，該等蛋白呈遞來自細胞內部之肽，並且藉由HLA-I複合物呈遞之抗原吸引殺手T細胞(亦稱為CD8 +T細胞或細胞毒性T細胞)。HLA-I蛋白與β-2微球蛋白(B2M；β-2 microglobulin)相關。HLA-II包含五種蛋白，HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOB、HLA-DQ及HLA-DR，該等蛋白將來自細胞外部之抗原呈遞至T淋巴球。此舉刺激CD4 +細胞(亦稱為T-輔助細胞)。應瞭解「MHC」或「HLA」之使用不意欲具有限制性，因為其視是否該等基因來自人類(HLA)或鼠科(MHC)而定。因此，因為其與哺乳動物細胞相關，因此此等術語可在本文中可互換使用。
如應用於經分離細胞之術語「治療(「treat/treating/treatment」)」包括使細胞經受任何種類之過程或條件或對於細胞執行任何種類之處理或程序。如應用於受試者，該術語係指將細胞或細胞群體投與個體，其中標靶多核苷酸序列(例如，B2M)根據本文描述之方法來離體改變。個體通常有病或受傷，或相對於群體之普通成員，處於患病之增加之風險中並且需要此關注、照顧、或管理。
如本文使用，術語「治療(「treating/treatment」)」係指向受試者投與有效量的具有根據本文描述之方法離體改變之標靶多核苷酸序列的細胞以使得受試者具有疾病之至少一個症狀之減少或疾病之改善，例如，有益或所需臨床結果。出於本技術之目的，有益的或所需的臨床結果包括但不限於一或多個症狀的減輕、疾病程度的減小、疾病狀態的穩定(即不惡化)、疾病進程的延緩或減慢、疾病狀態的改善或緩和，以及緩解(無論是部分緩解或是全部緩解)，無論是可檢測或是不可檢測。「治療」可意指與未接受治療時期望的存活相比延長存活。因此，熟習此項技術者認識到治療可改善疾病狀況，但是可能不完全治癒疾病。如本文使用，術語「治療」包含預防。或者，若疾病進展減少或暫停，則治療為「有效的」。「治療」還可意指與未接受治療時期望的存活相比延長存活。需要治療之人包括已經診斷患有與多核苷酸序列之表現相關之病症的人，以及歸因於遺傳易感性或其他因素而可能患上此病症之人。
「治療」或「預防」疾病或病症意指延遲或預防此疾病或病症之發作、逆轉、減輕、改善、抑制、減緩或停止進展、加重或惡化，與此疾病或病症相關之病狀的進展或嚴重性。在一個實施例中，疾病或病症之症狀減輕至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、或至少50%。
藉由導致所引入細胞至少部分定位於所需位點之方法或途徑，將細胞安置在受試者體內時，如本文使用，術語「投與」、「引入」及「移植」可互換使用，例如包含根據本發明之方法來改變之標靶多核苷酸序列的本文所述細胞。細胞可直接植入所需位點，或替代地藉由導致遞送至受試者體內之所需位置之任何合適途徑來投與，其中植入細胞之至少一部分或細胞之組分仍然為有生存的。投與受試者之後的細胞生存時期可短至幾小時，例如二十四小時，直至幾天，直至長達幾年。在一些情況下，細胞亦可例如在膠囊中投與除了所需位點以外之位置，諸如肝臟或皮下，以便將植入細胞保持於植入位置並且避免植入細胞之位移。
在額外或替代態樣中，本技術涵蓋以熟習此項技術者可利用之任何方式來改變標靶多核苷酸序列，例如，使用TALEN系統。應瞭解雖然使用CRISPR/Cas(例如，Cas9及Cpf1)及TALEN之方法之實例在本文中詳細描述，但是該技術不限於使用此等方法/系統。可在本文中利用熟習此項技術者已知的靶向例如B2M，以便減少或消除靶細胞中之表現之其他方法。
本發明之方法可用於改變細胞中之標靶多核苷酸序列。本發明涵蓋出於任何目的來改變細胞中之標靶多核苷酸序列。在一些實施例中，細胞中之標靶多核苷酸序列經改變以便產生突變體細胞。如本文使用，「突變體細胞」係指具有不同於其原始基因型之所得基因型的細胞。在一些情況下，「突變體細胞」展現突變體表型，例如當通常運作基因使用本發明之CRISPR/Cas系統來改變時。在其他情況下，「突變體細胞」展現野生型表型，例如當CRISPR/Cas系統用於校正突變體基因型時。在一些實施例中，細胞中之標靶多核苷酸序列經改變以便校正或修復遺傳突變(例如，恢復細胞之正常表型)。在一些實施例中，細胞中之標靶多核苷酸序列經改變以便誘導遺傳突變(例如，干擾基因或基因組元件之功能)。
在一些實施例中，改變為插入缺失。如本文使用，「插入缺失」係指由插入、缺失、或其組合產生之突變。如熟習此項技術者瞭解，基因組序列之編碼區域中之插入缺失導致移碼突變，除非插入缺失之長度為三的倍數。在一些實施例中，改變為點突變。如本文使用，「點突變」係指置換一個核苷酸之取代。CRISPR/Cas系統可用於在標靶多核苷酸序列中誘導任何長度之插入缺失或點突變。
如本文使用，「敲除」包括以干擾標靶多核苷酸序列之功能的方式，使標靶多核苷酸序列之全部或一部分缺失。例如，藉由在標靶多核苷酸序列之功能域(例如，DNA結合域)中，誘導標靶多核苷酸序列中之插入缺失，改變標靶多核苷酸序列，可達成敲除。熟習此項技術者容易認識到如何基於本文所述細節來使用CRISPR/Cas系統敲除標靶多核苷酸序列或其一部分。
在一些實施例中，改變導致敲除標靶多核苷酸序列或其一部分。使用CRISPR/Cas系統來敲除標靶多核苷酸序列或其一部分可適用於各種應用。例如，敲除細胞中之標靶多核苷酸序列可在活體外執行用於研究目的。對於離體目的，敲除細胞中之標靶多核苷酸序列可適用於治療或預防與標靶多核苷酸序列之表現相關之病症(例如，藉由離體敲除細胞中之突變體等位基因並且將包含敲除突變體等位基因之彼等細胞引入受試者中)。
「敲入」在本文中意指向宿主細胞添加遺傳功能之方法。在一些實施例中，此舉導致敲入基因產物，例如，RNA或編碼蛋白之水準增加或降低。如瞭解熟習此項技術者，此舉可以多種方式完成，包括向宿主細胞添加基因之一或多個額外複本或改變內源性基因之調控部件，從而增加所產生蛋白之表現。此舉可藉由修飾啟動子、添加不同啟動子、添加增強子、或修飾其他基因表現序列來完成。
在一些實施例中，改變導致標靶多核苷酸序列之表現減少。術語「降低(「decrease」)」、「減少(「reduced/reduction」)」都在本文中通常用於意指統計上顯著量之降低。然而，為免生疑問，「降低(「decrease」)」、「減少(「reduced/reduction」)」意謂如與參考水準相比，降低至少10%，例如如與參考水準相比，降低至少約20%，或至少約30%，或至少約40%，或至少約50%，或至少約60%，或至少約70%，或至少約80%，或至少約90%或降低多達並且包括100%(亦即，如與參考樣品相比，水準不存在)，或10-100%之間之任何降低。
術語「增加(「increased/increase」)」或「增強(enhance)」或「活化(activate)」都在本文中通常用於意指增加統計顯著量；為免生任何疑問，術語「增加(「increased/increase」)」或「增強(enhance)」或「活化(activate)」意謂如與參考水準相比，增加至少10%，例如如與參考水準相比，增加至少約20%，或至少約30%，或至少約40%，或至少約50%，或至少約60%，或至少約70%，或至少約80%，或至少約90%或增加多達並且包括100%或10-100%之間之任何增加，或如與參考水準相比，至少約2倍，或至少約3倍，或至少約4倍，或至少約5倍或至少約10倍增加，或2倍及10倍之間或更大之任何增加。
如本文使用，術語「外源」意欲意指將所提及分子或所提及多肽引入所關注之細胞中。例如藉由將編碼核酸引入細胞之遺傳物質中，可引入多肽，諸如藉由整合至染色體中或作為非染色體遺傳物質諸如質體或表現載體。因此，涉及編碼核酸之表現所使用之該術語係指將可表現形式之編碼核酸引入細胞中。「外源」分子為通常不存在於細胞中，但是可藉由一或多種遺傳、生物化學或其他方法來引入細胞中之分子、構建體、因子及其類似物。「正常存在於細胞中」相對於細胞之特定發育階段及環境條件來決定。因此，例如，僅在神經元之胚胎發育期間存在之分子為相對於成年神經元細胞之外源分子。外源分子可包括例如不正常運作內源性分子之運作型式或正常運作內源性分子之不正常運作型式。
外源分子或因子可尤其為諸如藉由組合化學方法來產生之小分子，或巨分子諸如蛋白、核酸、碳水化合物、脂質、醣蛋白、脂蛋白、多醣、上述分子之任何經修飾衍生物、或包含以上分子中之一或多者的任何複合物。核酸包括DNA及RNA，可為單鏈或雙鏈；可為直鏈、支鏈或環形；並且可為任何長度。核酸包括能夠形成雙鏈體之核酸，以及形成三鏈體之核酸。參見例如美國專利第5,176,996號及第5,422,251號。蛋白包括但不限於DNA結合蛋白、轉錄因子、染色質重塑因子、甲基化DNA結合蛋白、聚合酶、甲基化酶、脫甲基酶、乙醯化酶、脫乙醯酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重組酶、連接酶、拓撲異構酶、迴旋酶及解旋酶。
術語「內源性」係指所提及分子或多肽存在於細胞中。類似地，涉及編碼核酸之表現所使用之該術語係指包含於細胞內並且並非外源引入之編碼核酸之表現。
在兩個或兩個以上核酸或多肽序列之情形中，術語「一致性」百分比係指當出於最大對應性進行比較及比對時，如使用以下描述之序列比較演算法(例如，BLASTP及BLASTN或熟習此項技術者可利用之其他演算法)中之一者或藉由目測所量測，兩個或兩個以上序列或子序列具有指定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基。取決於應用，「一致性」百分比可存在於所比較之序列之一個區域上，例如，一個功能域上，或替代地，存在於待比較之兩個序列之全部長度上。關於序列比較，典型地，一個序列充當與測試序列進行比較之參考序列。當使用序列比較算法時，將測試序列及參照序列皆輸入電腦中，若需要，則設定子序列座標，接著設定序列算法程式參數。隨後，序列比較算法係基於設定的程式參數計算測試序列相對於參照序列之序列一致性百分比。
為了比較之序列之最優比對可例如藉由Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)之局部同源性演算法、藉由Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)之同源性比對演算法、藉由Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988)之搜索相似性方法、藉由此等演算法(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.中之GAP、BESTFIT、FASTA、及TFASTA)之電腦化實行方案，或藉由目測(參見通常Ausubel等人下文)來進行。
適於測定序列一致性及序列相似性百分比之演算法的一種實例為BLAST演算法，其描述於Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)中。用於執行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。
術語「受試者」及「個體」在本文中可互換使用，並且係指動物例如人類，可自該動物例如人類獲得細胞及/或向該動物例如人類提供使用如本文描述之細胞之治療，包括預防性治療。關於對於特定動物諸如人類受試者具有特定性之感染、病狀或疾病狀況的治療，術語受試者係指彼特定動物。如在本文中可互換使用之「非人類動物」及「非人類哺乳動物」包括哺乳動物諸如大鼠、小鼠、兔、綿羊、貓、犬、牛、豬、及非人類靈長類動物。術語「受試者」亦涵蓋任何脊椎動物包括但不限於哺乳動物爬行動物、兩棲動物及魚。然而，有利地，受試者為哺乳動物諸如人類，或其他哺乳動物諸如馴化哺乳動物、例如犬、貓、馬、及其類似動物，或生產哺乳動物，例如奶牛、綿羊、豬、及其類似動物。
應注意，申請專利範圍可經草擬而排除任何視情況存在之要素。因此，對於與敘述權利要求要素有關所使用的象「單獨」、「只」等這樣的排他性術語或所使用的「否定性」限制，這份說明書僅欲充當一個先行基礎。如熟習此項技術者在閱讀本發明後所顯而易知，本文中描述和說明的每個個別實施例具有可輕易地與任何其他幾個實施例的的功能件分離或組合的分立組件和功能件，而不背離本發明的範圍或精神。所敘述的任何方法可以所敘述的事件順序或在邏輯上是可能的任何其他順序來執行。雖然與本文中所述的那些方法和材料相似或相等的任何方法和材料也可用於實踐或測試本技術，但是現在描述代表性例示方法和材料。
如本文描述之以下術語將予以使用，並且如以下指示來定義。
在更詳細地描述本技術之前，應理解本技術不限於所描述的特定實施例，因為此類實施例當然可變化。還應理解本文中使用的術語僅用於描述特定實施例的目的，並且無意具有限制性，因為本技術的範圍僅受附加申請專利範圍限制。
除非另外定義，否則本文中使用之所有技術及科學術語皆具有與由一般熟習本發明所屬技術者通常理解相同之含義。當提供數值範圍時，應瞭解在彼範圍之上限與下限之間的直至下限之十分之一單位之各間插值(除非上下文另外明確規定)以及在彼陳述之範圍內之任何其他陳述值或間插值皆涵蓋在本技術內。這些較小範圍的上下限可獨立地包含於較小範圍中，並且也涵蓋於本技術中，所明示範圍中的任何極限可特別地加以排除。在所陳述範圍包括極限之一者或兩者時，排除彼等包括之極限之任一者或兩者的範圍亦可包括在本技術內。某些範圍在本文中以前面有術語「約」之數值來提供。術語「約」在本文中用於對於其後接之確切數字，以及與該術語後接之數字接近或近似的數字提供文字上的支援。在測定是否數字與特定敘述數字接近或近似時，接近或近似未敘述數字可為如下數字，在所呈現之上下文中，該數字與特定敘述數字實質性相等。
在本說明書中提到的所有公開、專利及專利申請以引用之方式併入本文，以達到如同每個單獨的公開、專利或專利申請係確切地及單獨地指出以引用之方式併入一樣。此外，各敘述公開、專利、或專利申請以引用方式併入本文以便揭示並且描述與所敘述之公開有關之標的物。任何公開的引用是針對其在本申請日期前的揭示內容，並且不應被視為承認由於存在先前發明而使本文描述之技術無權享有該公開的優先權。此外，所提供之公開日期可與實際公開日期有所不同，實際公開日期可能需要單獨確認。 II. CD47、信號調控蛋白α (SIRPα)、及免疫系統
本文提供用於調節表現CD47並且先前投與或移植至受試者中之細胞群體的方法及組合物，包括向受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑。 A. CD47-SIRPα軸/相互作用
分化抗原簇47(CD47；Cluster of Differentiation 47)為免疫球蛋白超家族中之高度醣化、廣泛表現細胞表面蛋白。CD47在重要細胞功能如增殖、黏附、遷移、細胞凋亡及吞噬作用中發揮作用。CD47之分子結構包含胞外免疫球蛋白可變(IgV；immunoglobulin variable)樣域、跨膜域、及短的替代拼接胞質尾區。在一些實施例中，CD47與信號調控蛋白α(SIRPα)反式相互作用並且在將顆粒球及T細胞募集至感染位點方面發揮作用。SIRPα編碼在巨噬細胞及樹突狀細胞之表面上表現之Ig-超家族受體，其胞質區域含有免疫受體酪胺酸抑制模體(ITIM；immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif)，該等模體可觸發級聯以便抑制吞噬作用。
CD47充當生物體內之宿主細胞上之「自身」標誌物。在一些實施例中，當表現時，CD47結合至循環免疫細胞之表面上之SIRPα以便傳遞抑制性「不要吃我」信號。CD47-SIRPα結合導致SIRPα上之ITIM之磷酸化，從而觸發一系列事件，該等事件可最終防止吞噬作用。靶細胞藉由巨噬細胞之吞噬作用藉由活化信號及抑制信號(SIRPα-CD47)之平衡來調控。此平衡由於癌細胞而該等翻轉，癌細胞利用「自身」信號並且上調CD47表現以便逃避免疫監視及隨後破壞。在一些實施例中，CD47-結合劑及/或SIRPα-結合劑，亦即，CD47-SIRPα阻斷劑，阻斷及/或干擾抑制性SIRPα-CD47信號，由此觸發吞噬作用及/或其他免疫系統機制。 B. 免疫系統介導之靶細胞殺滅
本文在某些實施例中提供藉由向受試者投與一或多種CD47-SIRPα阻斷劑來觸發針對先前投與或移植至受試者中之細胞或細胞群體之先天殺滅機制的方法，其中細胞表現或過度表現CD47。在某些此等實施例中，表現或過度表現CD47之細胞包含一或多個編碼CD47之外源核酸。所觸發之先天殺滅機制可為一或多種免疫細胞介導之殺滅機制，包括NK介導之殺滅、巨噬細胞介導之殺滅、ADC及/或CDCC。
本文在某些實施例中提供觸發NK細胞介導殺滅先前投與或移植至受試者中並且表現或過度表現CD47之細胞或細胞群體的方法，包括經工程化以表現或過度表現CD47之細胞。
本文在某些實施例中提供觸發巨噬細胞介導殺滅先前投與或移植至受試者中並且表現或過度表現CD47之細胞或細胞群體的方法，包括經工程化以表現或過度表現CD47之細胞。巨噬細胞為先天性免疫之重要組分，可經由吞噬作用來抑制腫瘤生長。SIRPα在包括巨噬細胞、顆粒球、單核球、及樹突狀細胞之骨髓細胞之表面上表現。當巨噬細胞經由SIRPα來結合至靶細胞，諸如癌細胞或其他外源細胞上之CD47時，巨噬細胞介導殺滅靶細胞得以抑制。在一些實施例中，SIRPα及/或CD47結合劑，亦即，CD47-SIRPα阻斷劑，阻斷及/或干擾巨噬細胞介導吞噬作用之抑制，觸發巨噬細胞介導殺滅表現CD47之靶細胞。
本文在某些實施例中提供觸發抗體依賴性細胞毒性(ADCC)介導殺滅先前投與或移植至受試者中並且表現或過度表現CD47之細胞或細胞群體的方法，包括經工程化以表現或過度表現CD47之細胞。一些免疫細胞介導抗體調理癌細胞之腫瘤細胞死亡的誘導，該腫瘤細胞死亡係被稱為ADCC之過程。一些免疫細胞賦有抑制受體，諸如SIRPα，該等受體結合至諸如癌細胞或其他外源細胞之靶細胞上之CD47，導致抑制免疫細胞介導之ADCC。在一些實施例中，SIRPα及/或CD47結合劑，亦即，CD47-SIRPα阻斷劑，阻斷及/或干擾免疫細胞介導ADCC之抑制，觸發ADCC介導殺滅表現CD47之靶細胞。ADCC可經由不同Fc受體之活化及藉由不同Fc受體表現細胞，諸如自然殺手細胞(NK)細胞、巨噬細胞、及嗜中性球來介導。在一些實施例中，ADCC有效地藉由包括IgG1及/或IgG4之CD47-SIRPα阻斷劑來觸發。
本文在某些實施例中提供觸發補體依賴性細胞毒性(CDC)介導殺滅先前投與或移植至受試者中並且表現或過度表現CD47之細胞或細胞群體的方法，包括經工程化以表現或過度表現CD47之細胞。在一些實施例中，補體系統經由與靶細胞上之抗原諸如CD47複合之含有Fc域之抗體之結合來活化。C1q結合至抗體-抗原複合物中之抗體Fc域，觸發其他補體蛋白之結合，最終導致形成一或多種細胞裂解膜攻擊複合物(MAC；membrane attack complex)，在靶細胞之膜中形成孔，導致細胞裂解/死亡。在一些實施例中，CDC有效地藉由包括IgG1之CD47-SIRPα阻斷劑來觸發。
在本文提供之方法之一些實施例中，含有一或多個編碼CD47之核酸及/或表現或過度表現CD47之細胞或細胞群體包含SEQ ID NO:1 (NCBI Ref. No. NM_001777.4列出之核苷酸序列之編碼序列(CDS))或SEQ ID NO:3(NCBI Ref. No. NM_198793.2列出之核苷酸序列之CDS)列出之核苷酸序列，或與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)之核苷酸序列。在某些此等實施例中，編碼CD47之核酸為外源的。在某些實施例中，由細胞表現或過度表現之CD47包含以下各者、由以下各者組成、或基本上由以下各者組成：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4列出之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列。在一些實施例中，編碼CD47之核苷酸序列經密碼子最佳化以便在哺乳動物細胞，例如，人類細胞中表現。在一些實施例中，編碼CD47之密碼子最佳化核苷酸序列與SEQ ID NO:5列出之核苷酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同) 表1. CD47之示例性序列
SEQ ID NO: 序列 描述
1 atgtggcccctggtagcggcgctgttgctgggctcggcgtgctgcggatcagctcagctactatttaataaaacaaaatctgtagaattcacgttttgtaatgacactgtcgtcattccatgctttgttactaatatggaggcacaaaacactactgaagtatacgtaaagtggaaatttaaaggaagagatatttacacctttgatggagctctaaacaagtccactgtccccactgactttagtagtgcaaaaattgaagtctcacaattactaaaaggagatgcctctttgaagatggataagagtgatgctgtctcacacacaggaaactacacttgtgaagtaacagaattaaccagagaaggtgaaacgatcatcgagctaaaatatcgtgttgtttcatggttttctccaaatgaaaatattcttattgttattttcccaatttttgctatactcctgttctggggacagtttggtattaaaacacttaaatatagatccggtggtatggatgagaaaacaattgctttacttgttgctggactagtgatcactgtcattgtcattgttggagccattcttttcgtcccaggtgaatattcattaaagaatgctactggccttggtttaattgtgacttctacagggatattaatattacttcactactatgtgtttagtacagcgattggattaacctccttcgtcattgccatattggttattcaggtgatagcctatatcctcgctgtggttggactgagtctctgtattgcggcgtgtataccaatgcatggccctcttctgatttcaggtttgagtatcttagctctagcacaattacttggactagtttatatgaaatttgtggcttccaatcagaagactatacaacctcctaggaaagctgtagaggaaccccttaatgcattcaaagaatcaaaaggaatgatgaatgatgaataa NM_001777.4 CDS (nts 124-1095) 之核苷酸序列
2 MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRKAVEEPLNAFKESKGMMNDE 由NM_001777.4之CDS編碼之胺基酸序列
3 atgtggcccctggtagcggcgctgttgctgggctcggcgtgctgcggatcagctcagctactatttaataaaacaaaatctgtagaattcacgttttgtaatgacactgtcgtcattccatgctttgttactaatatggaggcacaaaacactactgaagtatacgtaaagtggaaatttaaaggaagagatatttacacctttgatggagctctaaacaagtccactgtccccactgactttagtagtgcaaaaattgaagtctcacaattactaaaaggagatgcctctttgaagatggataagagtgatgctgtctcacacacaggaaactacacttgtgaagtaacagaattaaccagagaaggtgaaacgatcatcgagctaaaatatcgtgttgtttcatggttttctccaaatgaaaatattcttattgttattttcccaatttttgctatactcctgttctggggacagtttggtattaaaacacttaaatatagatccggtggtatggatgagaaaacaattgctttacttgttgctggactagtgatcactgtcattgtcattgttggagccattcttttcgtcccaggtgaatattcattaaagaatgctactggccttggtttaattgtgacttctacagggatattaatattacttcactactatgtgtttagtacagcgattggattaacctccttcgtcattgccatattggttattcaggtgatagcctatatcctcgctgtggttggactgagtctctgtattgcggcgtgtataccaatgcatggccctcttctgatttcaggtttgagtatcttagctctagcacaattacttggactagtttatatgaaatttgtggcttccaatcagaagactatacaacctcctaggaataactga NM_198793.2 CDS (nts 181-1098) 之核苷酸序列
4 MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRNN 由NM_198793.2之CDS編碼之胺基酸序列
5 atgtggcccctggtcgccgccctgttgctgggctcggcatgctgcggatcagctcagctactgtttaataaaacaaaatctgtagaattcacgttttgtaacgacactgtcgtgatcccatgctttgttactaatatggaggcacaaaacaccactgaagtgtacgtgaagtggaaattcaaaggcagagacatttacacctttgacggcgccctcaacaagtccaccgtgcccactgactttagtagcgcaaaaattgaggtcagccaattactaaaaggagatgcctctttgaagatggacaagagcgatgctgtcagccacacagggaactacacttgtgaagtaacagagttaacccgcgaaggtgaaacgatcatcgagctgaagtatcgagtggtgtcctggttttctccgaacgagaatatccttatcgtaattttcccaattttcgctatcctcctgttctggggccagtttggtatcaagacactcaaatatcggtccggtgggatggatgagaagacaattgccctgcttgttgctggactcgtgatcaccgtcatcgtgattgttggggccatccttttcgtcccaggggagtacagcctgaagaatgctacgggcctgggattaattgtgacctctacagggatactcatcctgcttcactactatgtgttcagtaccgcgattggactgacctccttcgtcattgccatattggtgattcaggtgatagcctacatcctcgccgtggttggcctgagtctctgtatcgcggcgtgcatacccatgcatggccctcttctgatttcagggttgagtatcctcgcactagcacagttgctgggactggtttatatgaaatttgtggcctccaaccagaagactatacagcctcctaggaaggctgtagaggagcccctgaatgcattcaaggaatcaaaaggcatgatgaatgatgaa 編碼CD47之密碼子最佳化核苷酸序列
C. 使用工程化細胞上之CD47表現來逃避免疫系統
本文提供外源表現CD47之工程化細胞及其使用方法。在一些實施例中，此類CD47表現細胞投與患者，並且在一些情況下，在投與CD47-SIRPα阻斷劑之前投與。如瞭解，如上所述可抑制或阻斷CD47及SIRPα之相互作用的任何劑可以任何組合用於充當本文所述逃避免疫識別之任何工程化細胞之安全開關。
在一些實施例中，將可逃避免疫識別或反應(例如，展現減少之免疫原性或低免疫原性)之外源表現CD47之細胞引入接受者受試者。逃避免疫識別可經由過度表現一或多種免疫抑制因子或分子來達成，包括致耐受性因子及補體抑制劑。在一些實施例中，細胞亦展現MHC I或MHC II、或兩者(例如，HLA I及/或HLA II)之減少之表現。在許多實施例中，細胞進一步展現減少之表現或不表現T細胞受體(TCR；T-cell receptors (TCR)(例如，TCRα及/或TCRβ)。此類細胞及產生此類之方法的詳細描述在本文中描述。
在一個實施例中，免疫抑制因子之表現基於調節免疫調控因子CD47之表現。CD47為先天免疫系統之組分，在一些態樣中，作為先天免疫系統之部分，充當「不要吃我」信號以便阻斷藉由巨噬細胞之吞噬作用。可工程化以便由所關注之細胞來表現之可用免疫抑制因子包括但不限於CD47、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、HLA-C、HLA-E、HLA-E重鏈、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4、C1-抑制劑、IL-10、IL-35、FASL、Serpin B9、CCL21、Mfge8、TGF-β、Cd73、Cd39、LAG3、IL1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrsf23、Tnfrsf10、Dad1、或IFNγRI d39，包括在2018年6月12日提交之WO2018227286中描述之因子，該申請案之內容包括其中表1提供之序列，並且序列表以全文引用方式併入本文。
在一些實施例中，本文提供之工程化細胞包含外源表現CD47及一或多種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種)選自包括以下各者之群的另外外源表現多肽：DUX4、PD-L1、CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-G(H2-M3)、FASL(FASLG)、CCL21(Ccl21b)、Mfge8、Serpin B9(Spi6)、及其任何組合。在一些實施例中，工程化細胞包含外源表現CD47及DUX4。在一些實施例中，工程化細胞包含外源表現CD47及PD-L1。在一些實施例中，工程化細胞包含外源表現CD47及CD24。在一些實施例中，工程化細胞包含外源表現CD47及CD46。在一些實施例中，工程化細胞包含外源表現CD47及CD55。在一些實施例中，工程化細胞包含外源表現CD47及CD59。在一些實施例中，工程化細胞包含外源表現CD47及CD200。在一些實施例中，工程化細胞包含外源表現CD47及HLA-G。在一些實施例中，工程化細胞包含外源表現CD47及FASL。在一些實施例中，工程化細胞包含外源表現CD47及CCL21。在一些實施例中，工程化細胞包含外源表現CD47及Mfge8。在一些實施例中，工程化細胞包含外源表現CD47及Serpin B9 (Serpinb9)。在一些實施例中，工程化細胞包含外源表現CD47、PD-L1、HLAG、CD200、FASL、CCL21、Mfge8、及Serpin B9。
在一些實施例中，本發明提供產生經修飾以便表現選自包括以下各者之群之免疫抑制因子中之一或多者之細胞或其群體的方法：CD47、PD-L1、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、HLA-C、HLA-E、HLA-E重鏈、HLA-G、IDO1、CTLA4、C1-抑制劑、IDO1、IL-10、IL-35、FASL、CCL21、Mfge8、及Serpin B9。在某些實施例中，本發明提供經修飾以便表現選自包括以下各者之群之免疫抑制因子中之一或多者之細胞或其群體：CD47、PD-L1、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、HLA-C、HLA-E、HLA-E重鏈、HLA-G、IDO1、CTLA4、C1-抑制劑、IDO1、IL-10、IL-35、FASL、CCL21、Mfge8、及Serpin B9。在其他實施例中，免疫抑制因子選自包括以下各者之群：B2M、CIITA、NLRC5、TAP1、HLA-A、HLA-B、HLA-C、RFX-ANK、NFY-A、RFX5、RFX-AP、HLA-G、HLA-E、NFY-B、PD-L1、NFY-C、IRF1、GITR、4-1BB、CD28、B7-1、CD47、B7-2、OX40、CD27、HVEM、SLAM、CD226、ICOS、LAG3、TIGIT、TIM3、CD160、BTLA、CD244、LFA-1、ST2、HLA-F、CD30、B7-H3、VISTA、TLT、PD-L2、CD58、CD2、及HELIOS。
在一些實施例中，免疫抑制因子整合至內源性基因座中以便保護該因子或容納該因子之載體匣的表現。在一些實施例中，免疫抑制因子插入選自B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRBC基因座、及安全港基因座之位點中。安全港基因座之非限制性實例包括但不限於AAVS1(亦稱為PPP1R12C)、ABO、CCR5、CLYBL、CXCR4、F3(亦稱為CD142)、FUT1、HMGB1、KDM5D、LRP1(亦稱為CD91)、MICA、MICB、RHD、ROSA26、及SHS231基因座位。免疫抑制因子可插入安全港基因座之合適區域中，包括，例如內含子、外顯子、及/或基因編碼區域(亦稱為編碼序列，或「CDS；CoDing Sequence」)。在一些實施例中，安全港基因座選自由以下組成之群：AAVS1基因座、CCR5基因座、及CLYBL基因座。在一些實施例中，插入發生於特定基因組基因座之一個等位基因中。在一些實施例中，插入發生於特定基因組基因座之兩個等位基因中。在此等實施例中之任一者中，插入標靶基因組基因座中之轉殖基因之取向可與彼基因座中之基因之方向相同或相反。
本文提供代表任何植入細胞類型之有生存力來源的工程化細胞。經由表現一或多種免疫抑制因子，在投與接受者受試者後，可保護此類細胞以免適應性及先天免疫排斥反應。在一些實施例中，本文概述之細胞不經受先天免疫細胞排斥。在一些情況下，細胞不易受NK細胞介導之裂解。在一些情況下，本文所述細胞不易受巨噬細胞吞噬。
在一些態樣中，工程化細胞為多能幹細胞、分化細胞、或原代T細胞。在一些實施例中，使用特定細胞類型之選定分化方案，分化細胞自多能幹細胞產生。在一些實施例中，原代T細胞選自包括以下各者之群：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、記憶T細胞、調控T細胞、腫瘤浸潤淋巴球、及其組合。
在一些實施例中，原代T細胞來自不同於接受者受試者(例如，投與細胞之患者)之一或多個供給者受試者的原代T細胞之池。原代T細胞可獲自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100或更多個供給者受試者並且視情況彙集在一起。在一些實施例中，原代T細胞自一個或複數個個體收穫，並且在一些情況下，原代T細胞或原代T細胞之池在活體外培養。在一些實施例中，原代T細胞或原代T細胞之池經工程化以便外源表現CD47並且在活體外培養。
在某些實施例中，原代T細胞或原代T細胞之池經工程化以便表現嵌合抗原受體(CAR)。CAR(亦稱為嵌合免疫受體、嵌合T細胞受體、或人工T細胞受體)為經工程化以便給予宿主細胞(例如，T細胞)靶向特定蛋白之新能力的受體蛋白。受體為嵌合的，因為其將抗原結合及T細胞活化功能兩者組合至單一受體中。CAR可為熟習此項技術者已知的任何CAR。可用CAR包括結合選自包括以下各者之群之抗原的CAR：CD19、CD22、CD38、CD123、CD138、及BCMA。在一些情況下，CAR與用於FDA批準之CAR-T細胞療法中之CAR相同或相等，諸如但不限於，tisagenlecleucel及axicabtagene ciloleucel，或在臨床試驗中在調查下之CAR。在一些實施例中，CAR為CD19特異性CAR。
在某些實施例中，CAR可在N端包含信號肽。信號肽之非限制性實例包括CD8α信號肽、IgK信號肽、及顆粒球-巨噬細胞菌落刺激因子受體亞單位α(GMCSFR-α；granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor subunit alpha，亦稱為集落刺激因子2受體亞單位α(CSF2RA；colony stimulating factor 2 receptor subunit alpha))信號肽，及其變異體，該等肽之胺基酸序列提供於下表2中。 表2. 信號肽之示例性序列
SEQ ID NO: 序列 描述
6 MALPVTALLLPLALLLHAARP CD8α 信號肽
7 METDTLLLWVLLLWVPGSTG IgK 信號肽
8 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP GMCSFR-α (CSF2RA) 信號肽
在某些實施例中，CAR之胞外結合域可包含對於一個標靶抗原或多個標靶抗原具有特異性的一或多個抗體。抗體可為抗體片段，例如，scFv，或單域抗體片段，例如，VHH。在某些實施例中，scFv可包含藉由連接子連接之抗體之重鏈可變區(V H)及輕鏈可變區(V L)。V H及V L可以任一順序連接，亦即，V H-連接子-V L或V L-連接子-V H。連接子之非限制性實例包括Whitlow連接子，(G 4S) n(n可為自然數，例如，1、2、3、4、5、6等)連接子、及其變異體。在某些實施例中，抗原可為排他性地或優先表現於腫瘤細胞上之抗原，或自體免疫或發炎性疾病特有之抗原。示例性標靶抗原包括但不限於CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD70、Kappa、Lambda、及B細胞成熟劑(BCMA；B cell maturation agent)、G-蛋白偶聯受體家族C群組5成員D(GPRC5D；G-protein coupled receptor family C group 5 member D)(與白血病相關)；CS1/SLAMF7、CD38、CD138、GPRC5D、TACI、及BCMA(與骨髓瘤相關)；GD2、HER2、EGFR、EGFRvIII、B7H3、PSMA、PSCA、CAIX、CD171、CEA、CSPG4、EPHA2、FAP、FRα、IL-13Rα、間皮素、MUC1、MUC16、及ROR1(與實體腫瘤相關)。在任何此等實施例中，CAR之胞外結合域可經密碼子最佳化以便在宿主細胞中表現或具有變異體序列以便增加胞外結合域之功能。
在某些實施例中，CAR可包含鉸鏈域，亦被稱為間隔物。術語「鉸鏈」及「間隔物」可在本發明中可互換使用。鉸鏈域之非限制性實例包括CD8α鉸鏈域、CD28鉸鏈域、IgG4鉸鏈域、IgG4鉸鏈-CH2-CH3域、及其變異體，該等域之胺基酸序列提供於下表3中。 表3. 鉸鏈域之示例性序列
SEQ ID NO: 序列 描述
9 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD CD8α 鉸鏈域
10 IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP CD28 鉸鏈域
113 AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP CD28 鉸鏈域
11 ESKYGPPCPPCP IgG4 鉸鏈域
12 ESKYGPPCPSCP IgG4 鉸鏈域
13 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK IgG4 鉸鏈-CH2-CH3 域
在某些實施例中，CAR之跨膜域可包含T細胞受體之α、β、或ζ鏈，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其功能變異體之跨膜區域，包括此等序列中之各者之人類型式。在其他實施例中，跨膜域可包含CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS、及FGFR2B、或其功能變異體之跨膜區域，包括此等序列中之各者之人類型式。表4提供幾個示例性跨膜域之胺基酸序列。 表4. 跨膜域之示例性序列
SEQ ID NO: 序列 描述
14 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC CD8α 跨膜域
15 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV CD28 跨膜域
114 MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV CD28 跨膜域
在某些實施例中，CAR之細胞內信號轉導域及/或細胞內共刺激域可包含一或多個選自以下各者之信號轉導域：B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC、PDCD6、4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配位體/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配位體/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配位體/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配位體/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配位體/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNFβ、OX40/TNFRSF4、OX40配位體/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNFα、TNF RII/TNFRSF1B、2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6、SLAM/CD150、CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I類、HLA-DR、IKAROS、整聯蛋白α4/CD49d、整聯蛋白α4β1、整聯蛋白α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLPR、淋巴球功能相關抗原-1(LFA-1；lymphocyte function associated antigen-1)、NKG2C、CD3ζ、免疫受體酪胺酸活化模體(ITAM；immunoreceptor tyrosine-based activation motif)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性結合之配位體，及其功能變異體，包括此等序列中之各者之人類型式。在一些實施例中，細胞內信號轉導域及/或細胞內共刺激域包含一或多個選自以下各者之信號轉導域：CD3ζ域、ITAM、CD28域、4-1BB域、或其功能變異體。表5提供幾個示例性細胞內共刺激及/或信號轉導域之胺基酸序列。在某些實施例中，如在如下所述之tisagenlecleucel的情況下，CD3ζ信號轉導域SEQ ID NO:18可在胺基酸位置14(參見SEQ ID NO:115)處具有突變，例如，麩醯胺酸(Q)至離胺酸(K)突變。 表5. 細胞內共刺激及/或信號轉導域之示例性序列
SEQ ID NO: 序列 描述
16 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL 4-1BB 共刺激域
17 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28 共刺激域
18 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CD3ζ 信號轉導域
115 RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CD3ζ 信號轉導域 (在位置14具有Q至K突變)
在某些實施例中，使用載體將CAR插入T細胞或其他免疫細胞中。在某些此等實施例中，載體含有單一表現匣用於表現CAR。在其他實施例中，載體為含有兩個或兩個以上表現匣之多順反子載體，例如，雙順反子載體、三順反子載體、或四順反子載體，允許在宿主細胞中，自一個mRNA轉錄物同時表現兩個或兩個以上單獨蛋白。在此等實施例中，一個表現匣可表現CAR，而一或多個額外表現匣可表現額外因子，包括例如CD47、CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制劑、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重鏈、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8。在某些實施例中，兩個或兩個以上表現匣在單一啟動子控制下並且藉由一或多個裂解位點來彼此分隔以便達成自一個轉錄物共表現所關注之蛋白。在其他實施例中，兩個或兩個以上基因可在分開啟動子之控制下。在某些實施例中，多順反子載體可進一步包含安全開關。多順反子載體可為適合於將核苷酸序列引入宿主細胞中之任何類型之載體，包括，例如，質體、腺病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、噬菌體、及基於同源介導修復(HDR)之供給者載體。
在某些實施例中，多順反子載體之兩個或兩個以上表現匣可藉由一或多個裂解位點來分隔。在一些實施例中，一或多個裂解位點包含一或多個自身裂解位點。在一些實施例中，自身裂解位點包含2A位點。2A肽為一種首先在小核糖核酸病毒中發現之18-22胺基酸長肽並且可在蛋白轉譯期間誘導核糖體跳過，由此自同一mRNA轉錄物產生相等量之多個基因。藉由在甘胺酸(G)與脯胺酸(P)殘基之間，使得核糖體跳過C端處之肽鍵合成，導致2A序列之末端與下游後續肽之間之分離，2A肽用於「裂解」mRNA轉錄物。存在通常用於分子生物學中之四種2A肽，T2A、P2A、E2A、及F2A，該等肽之序列概述於表6中。甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸(GSG；glycine-serine-glycine)連接子視情況添加至2A肽之N末端以便增加裂解效率。在本發明中，在序列周圍使用「()」意謂所包圍之序列為視情況選用的。 表6. 2A肽之序列
SEQ ID NO: 胺基酸序列 2A 肽
85 (GSG) EGRGSLLTCGDVEENPGP T2A
86 (GSG) ATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A
87 (GSG) QCTNYALLKLAGDVESNPGP E2A
88 (GSG) VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP F2A
在一些實施例中，一或多個裂解位點另外包含一或多個蛋白酶位點。在多順反子載體之5’至3’順序中，一或多個蛋白酶位點可在自身裂解位點(例如，2A位點)之前或之後。在轉譯完整轉錄物之後或在轉譯各表現匣之後，蛋白酶位點可藉由蛋白酶裂解以使得在轉譯下一個表現匣之前，釋放第一表現產物。在此等實施例中，除了2A位點以外，尤其在5’至3’順序中，在2A位點之前，具有蛋白酶位點可減少附接至所關注之表現蛋白的額外胺基酸殘基之數目。在一些實施例中，蛋白酶位點包含弗林蛋白酶位點，亦稱為成對鹼性胺基酸裂解酶(PACE；Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme)位點。存在至少三個弗林蛋白酶裂解序列，FC1、FC2、及FC3，該等序列之胺基酸序列概述於表7中。類似於2A位點，可包括一或多個可選甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸(GSG)序列以促進裂解效率。 表7. 弗林蛋白酶位點之序列
SEQ ID NO: 胺基酸序列 弗林蛋白酶位點
89 RRRR (GSG) FC1
90 RKRR (GSG) FC2
91 RKRR (GSG) TPDPW (GSG) FC3
在一些實施例中，一或多個裂解位點包含一或多個自身裂解位點、一或多個蛋白酶位點、及/或其任何組合。例如，裂解位點可僅包括2A位點。對於另一個實例，裂解位點可包括FC2或FC3位點，繼之以2A位點。在此等實施例中，一或多個自身裂解位點可相同或不同。類似地，一或多個蛋白酶位點可相同或不同。
在一些實施例中，多順反子載體包含驅動哺乳動物細胞中之組成性基因表現的啟動子。常用啟動子包括例如延長因子1α(EF1α；elongation factor 1 alpha)啟動子、巨細胞病毒(CMV；cytomegalovirus)即刻早期啟動子(Greenaway等人, Gene 18: 355-360 (1982))、猿猴空泡病毒40(SV40；simian vacuolating virus 40)早期啟動子(Fiers等人, Nature 273:113-120 (1978))、脾病灶形成病毒(SFFV；spleen focus-forming virus)啟動子，磷酸甘油酸激酶(PGK；phosphoglycerate kinase)啟動子(Adra等人, Gene 60(1):65-74 (1987))、人類β肌動蛋白啟動子、聚泛素C基因(UBC；polyubiquitin C gene)啟動子、及CAG啟動子(Nitoshi等人, Gene 108:193-199 (1991))。能夠表現哺乳動物細胞(例如，T細胞)中之CAR轉殖基因的啟動子之實例為EF1α啟動子。天然EF1α啟動子驅動延長因子-1複合物之α亞單位之表現，該複合物負責酶促遞送胺醯基tRNA至核糖體。EF1α啟動子廣泛用於哺乳動物表現質體中並且已被證明有效驅動自選殖至慢病毒載體中之轉殖基因之CAR表現。參見例如Milone等人, Mol. Ther. 17(8):1453-1464 (2009)。
在其他實施例中，多順反子載體包含可誘導啟動子。不同於組成性啟動子，可誘導啟動子可響應於某些刺激(例如，化學劑、溫度、光)在啟用與停用狀態之間切換並且可以組織或細胞特異性方式來調控。常用可誘導啟動子之非限制性實例包括四環素啟用(Tet-On)系統及四環素停用(Tet-Off)系統，該系統利用安置於最小啟動子(例如，CMV啟動子)上游之四環素反應元件(TRE；tetracycline response element)(Gossen & Bujard，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89(12):5547-5551 (1992))。TRE由19-核苷酸四環素操縱子(tetO；tetracycline operator)序列之7個重複序列製成並且可藉由四環素抑制因子(tetR；tetracycline repressor)來識別。在Tet-Off系統中，四環素控制之反式活化因子(tTA；tetracycline-controlled transactivator)藉由將tetR與單純性疱疹病毒之病毒顆粒蛋白16之活化域融合來發展。當不存在四環素或其類似物(例如，脫氧土黴素)時，tTA結合TRE之tetO序列並且驅動表現；當存在四環素時，rTA結合至四環素並且不結合至TRE，導致基因表現減少。相反地，在Tet-On系統中，反向反式活化因子(rtTA；reverse transactivator)藉由對於四環素依賴性抑制而言至關重要之胺基酸殘基之誘變來產生，並且rtTA結合於TRE處並且在四環素或脫氧土黴素存在下驅動基因表現(Gossen等人，Science 268(5218):1766-1769 (1995))。可誘導啟動子之其他實例包括例如AlcA、LexA、及Cre。
在一些實施例中，多順反子載體包含在第一表現匣之前的Kozak共有序列。Kozak共有序列為核酸模體，該模體在大多數真核mRNA轉錄物中充當蛋白轉譯啟始位點並且介導核糖體組裝及轉譯啟始。在一些實施例中，Kozak共有序列包含或由SEQ ID NO:92列出之序列組成，其中r為嘌呤(亦即，a或g)：(gcc)gccrccatgg (SEQ ID NO:92)。
在一些實施例中，多順反子載體包含在第二表現匣之後的Woodchuck肝炎病毒(WHV；Woodchuck Hepatitis Virus)轉錄後調控元件(WPRE；Posttranscriptional Regulatory Element)。WPRE為在轉錄時產生增強表現之三級結構的DNA序列。WPRE序列通常用於增加藉由病毒載體遞送之基因之表現。在一些實施例中，WPRE序列包含或由SEQ ID NO:93列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:93列出之序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成： aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgc (SEQ ID NO:93)。
在一些實施例中，多順反子載體包含側接含有表現匣之片段的同源臂及/或用於定點插入(敲入)宿主細胞中之指定基因座中之啟動子，例如，藉由如所描述的基於同源引導修復(HDR)之方法。通常含有至少表現匣及視情況亦含有啟動子的待插入之多順反子載體之片段藉由直接在標靶插入位點上游及下游之同源序列(亦即，左同源臂(LHA；left homology arm)及右同源臂(RHA；right homology arm))來側接。同源臂針對標靶基因組基因座來特別設計以便該片段充當HDR之模板。各同源臂之長度通常取決於所引入插入物之尺寸，並且更大插入物需要更長同源臂。
在某些實施例中，表現外源CAR及外源CD47多肽之細胞或細胞群體自兩個單獨載體來表現CAR及CD47。在其他實施例中，外源CAR及外源CD47多肽經由多順反子載體來引入細胞或細胞群體中，例如，包含表現外源CAR之第一表現匣及表現外源CD47之第二表現匣的雙順反子載體。在某些此等實施例中，多順反子載體可包含表現一或多個額外因子之一或多個額外表現匣。在細胞或細胞群體包含編碼外源CAR及外源CD47多肽之雙順反子載體的某些實施例中，雙順反子載體經由慢病毒來引入細胞或細胞中。 CD19 CAR
在一些實施例中，CAR為CD19 CAR。在一些實施例中，CD19 CAR可包含串聯的信號肽、特異性結合CD19之胞外結合域、鉸鏈域、跨膜域、細胞內共刺激域、及/或細胞內信號轉導域。
在一些實施例中，CD19 CAR之信號肽包含CD8α信號肽。在一些實施例中，CD8α信號肽包含或由SEQ ID NO:6列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:6列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，信號肽包含IgK信號肽。在一些實施例中，IgK信號肽包含或由SEQ ID NO:7列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:7列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，信號肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信號肽。在一些實施例中，GMCSFR-α或CSF2RA信號肽包含或由SEQ ID NO:8列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:8列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，CD19 CAR之胞外結合域對於CD19，例如，人類CD19具有特異性。CD19 CAR之胞外結合域可經密碼子最佳化以便在宿主細胞中表現或具有變異體序列以便增加胞外結合域之功能。在一些實施例中，胞外結合域包含免疫球蛋白分子之免疫原性活性部分，例如，scFv。
在一些實施例中，CD19 CAR之胞外結合域包含衍生自FMC63單株抗體(FMC63)之scFv，包含藉由連接子來連接之FMC63之重鏈可變區(V H)及輕鏈可變區(V L)。FMC63及衍生scFv描述於Nicholson等人, Mol. Immun. 34(16-17):1157-1165 (1997)及PCT申請公開案第WO2018/213337號，該等參考文獻中之各者之全部內容以引用方式併入本文。在一些實施例中，整個FMC63衍生scFv(亦被稱為FMC63 scFv)及其不同部分之胺基酸序列提供於下表8中。在一些實施例中，CD19-特異性scFv包含或由SEQ ID NO:19、20、或25列出之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:19、20、或25列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，CD19特異性scFv可包含一或多個具有SEQ ID NO: 21-23及26-28列出之胺基酸序列的CDR。在一些實施例中，CD19特異性scFv可包含一或多個CDR具有SEQ ID NO: 21-23列出之胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中，CD19特異性scFv可包含一或多個CDR具有SEQ ID NO: 26-28列出之胺基酸序列的重鏈。在任何此等實施例中，CD19特異性scFv可包含含有一或多個胺基酸取代、或含有與鑑別之任何序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)之序列的一或多個CDR。在一些實施例中，CD19 CAR之胞外結合域包含或由一或多個如本文描述之CDR組成。
在一些實施例中，連接scFv之V H及V L部分之連接子為具有SEQ ID NO:24列出之胺基酸序列的Whitlow連接子。在一些實施例中，Whitlow連接子可藉由不同連接子，例如，具有SEQ ID NO:30列出之胺基酸序列之3xG 4S連接子來置換，從而產生具有SEQ ID NO:29列出之胺基酸序列之不同FMC63衍生scFv。在某些此等實施例中，CD19-特異性scFv包含或由SEQ ID NO:29列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:29列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。 表8. 抗CD19 scFv及組分之示例性序列
SEQ ID NO: 胺基酸序列 描述
19 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS 抗CD19 FMC63 scFv 完整序列，具有 Whitlow 連接子
20 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT 抗CD19 FMC63 scFv 輕鏈可變區
21 QDISKY 抗CD19 FMC63 scFv 輕鏈 CDR1
22 HTS 抗CD19 FMC63 scFv 輕鏈 CDR2
23 QQGNTLPYT 抗CD19 FMC63 scFv 輕鏈 CDR3
24 GSTSGSGKPGSGEGSTKG Whitlow 連接子
25 EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS 抗CD19 FMC63 scFv 重鏈可變區
26 GVSLPDYG 抗CD19 FMC63 scFv 重鏈 CDR1
27 IWGSETT 抗CD19 FMC63 scFv 重鏈 CDR2
28 AKHYYYGGSYAMDY 抗CD19 FMC63 scFv 重鏈 CDR3
29 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS 抗CD19 FMC63 scFv 完整序列，具有 3xG 4S 連接子
30 GGGGSGGGGSGGGGS 3xG 4S 連接子
在一些實施例中，CD19 CAR之胞外結合域衍生自對於CD19具有特異性之抗體，包括，例如，SJ25C1(Bejcek等人，Cancer Res. 55:2346-2351 (1995))、HD37 (Pezutto等人, J. Immunol. 138(9):2793-2799 (1987))、4G7 (Meeker等人, Hybridoma 3:305-320 (1984))、B43 (Bejcek (1995))、BLY3 (Bejcek (1995))、B4 (Freedman等人, 70:418-427 (1987))、B4 HB12b (Kansas & Tedder, J. Immunol. 147:4094-4102 (1991); Yazawa等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:15178-15183 (2005); Herbst等人, J. Pharmacol. Exp. Ther. 335:213-222 (2010))、BU12 (Callard等人, J. Immunology, 148(10): 2983-2987 (1992))、及CLB-CD19 (De Rie Cell. Immunol. 118:368-381(1989))。在任何此等實施例中，CD19 CAR之胞外結合域可包含或由V H、V L、及/或任何抗體之一或多個CDR組成。
在一些實施例中，CD19 CAR之鉸鏈域包含CD8α鉸鏈域，例如人類CD8α鉸鏈域。在一些實施例中，CD8α鉸鏈域包含或由SEQ ID NO:9列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:9列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，鉸鏈域包含CD28鉸鏈域，例如人類CD28鉸鏈域。在一些實施例中，CD28鉸鏈域包含或由SEQ ID NO:10列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:10列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，鉸鏈域包含IgG4鉸鏈域，例如人類IgG4鉸鏈域。在一些實施例中，IgG4鉸鏈域包含或由SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12列出之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，鉸鏈域包含IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3域，例如人類IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3域。在一些實施例中，IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3域包含或由SEQ ID NO:13列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:13列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，CD19 CAR之跨膜域包含CD8α跨膜域，例如人類CD8α跨膜域。在一些實施例中，CD8α跨膜域包含或由SEQ ID NO:14列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:14列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，跨膜域包含CD28跨膜域，例如人類CD28跨膜域。在一些實施例中，CD28跨膜域包含或由SEQ ID NO:15列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:15列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，CD19 CAR之細胞內共刺激域包含4-1BB共刺激域。4-1BB，亦稱為CD137，向T細胞傳送有效共刺激信號，促進分化並且增強T淋巴球之長期存活。在一些實施例中，4-1BB共刺激域為人類共刺激域。在一些實施例中，4-1BB共刺激域包含或由SEQ ID NO:16列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:16列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，細胞內共刺激域包含CD28共刺激域。CD28為T細胞上之另一種共刺激分子。在一些實施例中，CD28共刺激域為人類共刺激域。在一些實施例中，CD28共刺激域包含或由SEQ ID NO:17列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:17列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，CD19 CAR之細胞內共刺激域包含如所描述之4-1BB共刺激域及CD28共刺激域。
在一些實施例中，CD19 CAR之細胞內信號轉導域包含CD3澤塔(ζ)信號轉導域。CD3ζ與T細胞受體(TCR)締合來產生信號並且含有免疫受體酪胺酸活化模體(ITAM)。CD3ζ信號轉導域係指來自ζ鏈之胞質域之胺基酸殘基，該等殘基足以在功能上傳輸T細胞活化必不可少的起始信號。在一些實施例中，CD3ζ信號轉導域為人類信號轉導域。在一些實施例中，CD3ζ信號轉導域包含或由SEQ ID NO:18列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:18列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，CD19 CAR包含具有SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:29列出之序列之CD19特異性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之IgG4鉸鏈域、SEQ ID NO:15之CD28跨膜域、SEQ ID NO:16之4-1BB共刺激域、SEQ ID NO:18之CD3ζ信號轉導域、及/或其變異體(亦即，具有與所揭示序列至少80%相同，例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99相同之序列)。在任何此等實施例中，CD19 CAR可另外包含如所描述之信號肽(例如，CD8α信號肽)。
在一些實施例中，CD19 CAR包含具有SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:29列出之序列之CD19特異性scFv、SEQ ID NO:10之CD28鉸鏈域、SEQ ID NO:15之CD28跨膜域、SEQ ID NO:17之CD28共刺激域、SEQ ID NO:18之CD3ζ信號轉導域、及/或其變異體(亦即，具有與所揭示序列至少80%相同，例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99相同之序列)。在任何此等實施例中，CD19 CAR可另外包含如所描述之信號肽(例如，CD8α信號肽)。
在一些實施例中，CD19 CAR藉由SEQ ID NO:116列出之核苷酸序列或與SEQ ID NO:116列出之核苷酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)之核苷酸序列來編碼(參見表9)。所編碼之CD19 CAR具有SEQ ID NO:117列出之對應胺基酸序列或與SEQ ID NO:117列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)，具有以下組分：CD8α信號肽、FMC63 scFv(V L-Whitlow連接子-V H)、CD8α鉸鏈域、CD8α跨膜域、4-1BB共刺激域、及CD3ζ信號轉導域。
在一些實施例中，CD19 CAR為商購實施例之CD19 CAR，包括但不限於由T細胞表現及/或編碼之CD19 CAR，包括tisagenlecleucel、lisocabtagene maraleucel、axicabtagene ciloleucel、及brexucabtagene autoleucel。Tisagenlecleucel包含具有以下組分之CD19 CAR：CD8α信號肽、FMC63 scFv(V L-3xG 4S連接子-V H)、CD8α鉸鏈域、CD8α跨膜域、4-1BB共刺激域、及CD3ζ信號轉導域。tisagenlecleucel中之CD19 CAR之核苷酸及胺基酸序列提供於表9中，並且序列之注釋提供於表10中。Lisocabtagene maraleucel包含具有以下組分之CD19 CAR：GMCSFR-α或CSF2RA信號肽、FMC63 scFv(V L-Whitlow連接子-V H)、IgG4鉸鏈域、CD28跨膜域、4-1BB共刺激域、及CD3ζ信號轉導域。lisocabtagene maraleucel中之CD19 CAR之核苷酸及胺基酸序列提供於表9中，並且序列之注釋提供於表11中。Axicabtagene ciloleucel或其部分。Axicabtagene ciloleucel包含具有以下組分之CD19 CAR：GMCSFR-α或CSF2RA信號肽、FMC63 scFv(V L-Whitlow連接子-V H)、CD28鉸鏈域、CD28跨膜域、CD28共刺激域、及CD3ζ信號轉導域。axicabtagene ciloleucel中之CD19 CAR之核苷酸及胺基酸序列提供於表9中，並且序列之注釋提供於表12中。Brexucabtagene autoleucel或其部分。Brexucabtagene autoleucel包含具有以下組分之CD19 CAR：GMCSFR-α信號肽、FMC63 scFv、CD28鉸鏈域、CD28跨膜域、CD28共刺激域、及CD3ζ信號轉導域。
在一些實施例中，CD19 CAR藉由SEQ ID NO：31、33、或35列出之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：31、33、或35列出之核苷酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)之核苷酸序列來編碼。所編碼之CD19 CAR具有分別在SEQ ID NO：32、34、或36列出之對應胺基酸序列，或分別與SEQ ID NO：32、34、或36列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)。 表9. CD19 CAR之示例性序列
SEQ ID NO: 序列 描述
116 atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatcacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc 示例性 CD19 CAR 核苷酸序列
117 MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 示例性 CD19 CAR 胺基酸序列
31 atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatcacaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc Tisagenlecleucel CD19 CAR 核苷酸序列
32 MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR Tisagenlecleucel CD19 CAR 胺基酸序列
33 atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatccccgacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccaggaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagcgaatctaagtacggaccgccctgccccccttgccctatgttctgggtgctggtggtggtcggaggcgtgctggcctgctacagcctgctggtcaccgtggccttcatcatcttttgggtgaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgcgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaatcagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacgtcctggataagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagcctcggcggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcggggcaagggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccaagg Lisocabtagene maraleucel CD19 CAR 核苷酸序列
34 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSESKYGPPCPPCPMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR Lisocabtagene maraleucel CD19 CAR 胺基酸序列
35 atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc Axicabtagene ciloleucel CD19 CAR 核苷酸序列
36 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR Axicabtagene ciloleucel CD19 CAR 胺基酸序列
表10. tisagenlecleucel CD19 CAR序列之注釋
特徵 核苷酸序列位置 胺基酸序列位置
CD8α 信號肽 1-63 1-21
FMC63 scFv (V L-3xG 4S 連接子-V H) 64-789 22-263
CD8α 鉸鏈域 790-924 264-308
CD8α 跨膜域 925-996 309-332
4-1BB 共刺激域 997-1122 333-374
CD3ζ 信號轉導域 1123-1458 375-486
表11. lisocabtagene maraleucel CD19 CAR序列之注釋
特徵 核苷酸序列位置 胺基酸序列位置
GMCSFR-α 信號肽 1-66 1-22
FMC63 scFv (V L-Whitlow 連接子-V H) 67-801 23-267
IgG4 鉸鏈域 802-837 268-279
CD28 跨膜域 838-921 280-307
4-1BB 共刺激域 922-1047 308-349
CD3ζ 信號轉導域 1048-1383 350-461
表12. axicabtagene ciloleucel CD19 CAR序列之注釋
特徵 核苷酸序列位置 胺基酸序列位置
CSF2RA 信號肽 1-66 1-22
FMC63 scFv (V L-Whitlow 連接子-V H) 67-801 23-267
CD28 鉸鏈域 802-927 268-309
CD28 跨膜域 928-1008 310-336
CD28 共刺激域 1009-1131 337-377
CD3ζ 信號轉導域 1132-1467 378-489
CD20 CAR
在一些實施例中，CAR為CD20 CAR。CD20係早在前B期即存在於B細胞表面上並且逐漸增加水準直到B細胞成熟為止的抗原，並且存在於大多數B細胞腫瘤之細胞上。CD20陽性細胞亦有時發現於何杰金疾病、骨髓瘤、及胸腺瘤的病例中。在一些實施例中，CD20 CAR可包含串聯的信號肽、特異性結合CD20之胞外結合域、鉸鏈域、跨膜域、細胞內共刺激域、及/或細胞內信號轉導域。
在一些實施例中，CD20 CAR之信號肽包含CD8α信號肽。在一些實施例中，CD8α信號肽包含或由SEQ ID NO:6列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:6列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，信號肽包含IgK信號肽。在一些實施例中，IgK信號肽包含或由SEQ ID NO:7列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:7列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，信號肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信號肽在一些實施例中，GMCSFR-α或CSF2RA信號肽包含或由SEQ ID NO:8列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:8列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，CD20 CAR之胞外結合域對於CD20，例如，人類CD20具有特異性。CD20 CAR之胞外結合域可經密碼子最佳化以便在宿主細胞中表現或具有變異體序列以便增加胞外結合域之功能。在一些實施例中，胞外結合域包含免疫球蛋白分子之免疫原性活性部分，例如，scFv。
在一些實施例中，CD20 CAR之胞外結合域衍生自對於CD20具有特異性之抗體，包括，例如，Leu16、IF5、1.5.3、利妥昔單抗(rituximab)、阿托珠單抗(obinutuzumab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、奧法木單抗(ofatumumab)、托西木單抗(tositumumab)、奧卓昔單抗(odronextamab)、維圖珠單抗(veltuzumab)、烏利妥昔單抗(ublituximab)、及奧瑞珠單抗(ocrelizumab)。在任何此等實施例中，CD20 CAR之胞外結合域可包含或由V H、V L、及/或任何抗體之一或多個CDR組成。
在一些實施例中，CD20 CAR之胞外結合域包含衍生自Leu16單株抗體之scFv，包含藉由連接子來連接之Leu16之重鏈可變區(V H)及輕鏈可變區(V L)。參見Wu等人, Protein Engineering. 14(12):1025-1033 (2001)。在一些實施例中，連接子為3xG 4S連接子。在其他實施例中，連接子為如本文描述之Whitlow連接子。在一些實施例中，整個Leu16衍生scFv(亦被稱為Leu16 scFv)之不同部分及其不同部分之胺基酸序列提供於下表13中。在一些實施例中，CD20-特異性scFv包含或由SEQ ID NO:37、38、或42列出之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:37、38、或42列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，CD20特異性scFv可包含一或多個具有SEQ ID NO: 39-41、43及44列出之胺基酸序列的CDR。在一些實施例中，CD20特異性scFv可包含一或多個CDR具有SEQ ID NO: 39-41列出之胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中，CD20特異性scFv可包含一或多個CDR具有SEQ ID NO: 43-44列出之胺基酸序列的重鏈。在任何此等實施例中，CD20特異性scFv可包含含有一或多個胺基酸取代、或含有與鑑別之任何序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)之序列的一或多個CDR。在一些實施例中，CD20 CAR之胞外結合域包含或由一或多個如本文描述之CDR組成。 表13. 抗CD20 scFv及組分之示例性序列
SEQ ID NO: 胺基酸序列 描述
37 DIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSS 抗CD20 Leu16 scFv 完整序列，具有 Whitlow 連接子
38 DIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIK 抗CD20 Leu16 scFv 輕鏈可變區
39 RASSSVNYMD 抗CD20 Leu16 scFv 輕鏈 CDR1
40 ATSNLAS 抗CD20 Leu16 scFv 輕鏈 CDR2
41 QQWSFNPPT 抗CD20 Leu16 scFv 輕鏈 CDR3
42 EVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSS 抗CD20 Leu16 scFv 重鏈
43 SYNMH 抗CD20 Leu16 scFv 重鏈 CDR1
44 AIYPGNGDTSYNQKFKG 抗CD20 Leu16 scFv 重鏈 CDR2
在一些實施例中，CD20 CAR之鉸鏈域包含CD8α鉸鏈域，例如人類CD8α鉸鏈域。在一些實施例中，CD8α鉸鏈域包含或由SEQ ID NO:9列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:9列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，鉸鏈域包含CD28鉸鏈域，例如人類CD28鉸鏈域。在一些實施例中，CD28鉸鏈域包含或由SEQ ID NO:10列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:10列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，鉸鏈域包含IgG4鉸鏈域，例如人類IgG4鉸鏈域。在一些實施例中，IgG4鉸鏈域包含或由SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12列出之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，鉸鏈域包含IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3域，例如人類IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3域。在一些實施例中，IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3域包含或由SEQ ID NO:13列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:13列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，CD20 CAR之跨膜域包含CD8α跨膜域，例如人類CD8α跨膜域。在一些實施例中，CD8α跨膜域包含或由SEQ ID NO:14列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:14列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，跨膜域包含CD28跨膜域，例如人類CD28跨膜域。在一些實施例中，CD28跨膜域包含或由SEQ ID NO:15列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:15列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，CD20 CAR之細胞內共刺激域包含4-1BB共刺激域，例如人類4-1BB共刺激域。在一些實施例中，4-1BB共刺激域包含或由SEQ ID NO:16列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:16列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，細胞內共刺激域包含CD28共刺激域，例如人類CD28共刺激域。在一些實施例中，CD28共刺激域包含或由SEQ ID NO:17列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:17列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，CD20 CAR之細胞內信號轉導域包含CD3澤塔(ζ)信號轉導域，例如人類CD3ζ信號轉導域。在一些實施例中，CD3ζ信號轉導域包含或由SEQ ID NO:18列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:18列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，CD20 CAR包含具有SEQ ID NO:37列出之序列之CD20特異性scFv、SEQ ID NO:9之CD8α鉸鏈域、SEQ ID NO:14之CD8α跨膜域、SEQ ID NO:16之4-1BB共刺激域、SEQ ID NO:18之CD3ζ信號轉導域、及/或其變異體(亦即，具有與所揭示序列至少80%相同，例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99相同之序列)。
在一些實施例中，CD20 CAR包含具有SEQ ID NO:37列出之序列之CD20特異性scFv、SEQ ID NO:10之CD28鉸鏈域、SEQ ID NO:14之CD8α跨膜域、SEQ ID NO:16之4-1BB共刺激域、SEQ ID NO:18之CD3ζ信號轉導域、及/或其變異體(亦即，具有與所揭示序列至少80%相同，例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99相同之序列)。
在一些實施例中，CD20 CAR包含具有SEQ ID NO:37列出之序列之CD20特異性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之IgG4鉸鏈域、SEQ ID NO:14之CD8α跨膜域、SEQ ID NO:16之4-1BB共刺激域、SEQ ID NO:18之CD3ζ信號轉導域、及/或其變異體(亦即，具有與所揭示序列至少80%相同，例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99相同之序列)。
在一些實施例中，CD20 CAR包含具有SEQ ID NO:37列出之序列之CD20特異性scFv、SEQ ID NO:9之CD8α鉸鏈域、SEQ ID NO:15之CD28跨膜域、SEQ ID NO:16之4-1BB共刺激域、SEQ ID NO:18之CD3ζ信號轉導域、及/或其變異體(亦即，具有與所揭示序列至少80%相同，例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99相同之序列)。
在一些實施例中，CD20 CAR包含具有SEQ ID NO:37列出之序列之CD20特異性scFv、SEQ ID NO:10之CD28鉸鏈域、SEQ ID NO:15之CD28跨膜域、SEQ ID NO:16之4-1BB共刺激域、SEQ ID NO:18之CD3ζ信號轉導域、及/或其變異體(亦即，具有與所揭示序列至少80%相同，例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99相同之序列)。
在一些實施例中，CD20 CAR包含具有SEQ ID NO:37列出之序列之CD20特異性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:1之IgG4鉸鏈域、SEQ ID NO:15之CD28跨膜域、SEQ ID NO:16之4-1BB共刺激域、SEQ ID NO:18之CD3ζ信號轉導域、及/或其變異體(亦即，具有與所揭示序列至少80%相同，例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99相同之序列)。 CD22 CAR
在一些實施例中，CAR為CD22 CAR。作為一種主要存在於成熟B細胞表面上之跨膜蛋白，CD22充當B細胞受體(BCR；B cell receptor)信號轉導之抑制性受體。CD22表現於60-70%之B細胞淋巴瘤及白血病(例如，B慢性淋巴細胞白血病、毛細胞白血病、急性淋巴細胞白血病(ALL；acute lymphocytic leukemia)、及伯基特氏淋巴瘤)中並且不存在於B細胞發育早期階段中之細胞表面上或幹細胞上。在一些實施例中，CD22 CAR可包含串聯的信號肽、特異性結合CD22之胞外結合域、鉸鏈域、跨膜域、細胞內共刺激域、及/或細胞內信號轉導域。
在一些實施例中，CD22 CAR之信號肽包含CD8α信號肽。在一些實施例中，CD8α信號肽包含或由SEQ ID NO:6列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:6列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，信號肽包含IgK信號肽。在一些實施例中，IgK信號肽包含或由SEQ ID NO:7列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:7列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，信號肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信號肽。在一些實施例中，GMCSFR-α或CSF2RA信號肽包含或由SEQ ID NO:8列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:8列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，CD22 CAR之胞外結合域對於CD22，例如，人類CD22具有特異性。CD22 CAR之胞外結合域可經密碼子最佳化以便在宿主細胞中表現或具有變異體序列以便增加胞外結合域之功能。在一些實施例中，胞外結合域包含免疫球蛋白分子之免疫原性活性部分，例如，scFv。
在一些實施例中，CD22 CAR之胞外結合域衍生自對於CD22具有特異性之抗體，包括，例如，SM03、奧英妥珠單抗(inotuzumab)、艾波妥珠單抗(epratuzumab)、莫西單抗(moxetumomab)、及匹那珠單抗(moxetumomab)。在任何此等實施例中，CD22 CAR之胞外結合域可包含或由V H、V L、及/或任何抗體之一或多個CDR組成。
在一些實施例中，CD22 CAR之胞外結合域包含衍生自m971單株抗體(m971)之scFv，包含藉由連接子來連接之m971之重鏈可變區(V H)及輕鏈可變區(V L)。在一些實施例中，連接子為3xG 4S連接子。在其他實施例中，可替代地使用Whitlow連接子。在一些實施例中，整個m971衍生scFv(亦被稱為m971 scFv)及其不同部分之胺基酸序列提供於下表14中。在一些實施例中，CD22-特異性scFv包含或由SEQ ID NO:45、46、或50列出之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:45、46、或50列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，CD22特異性scFv可包含一或多個具有SEQ ID NO: 47-49及51-53列出之胺基酸序列的CDR。在一些實施例中，CD22特異性scFv可包含一或多個CDR具有SEQ ID NO: 47-49列出之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，CD22特異性scFv可包含一或多個CDR具有SEQ ID NO: 51-53列出之胺基酸序列的輕鏈。在任何此等實施例中，CD22特異性scFv可包含含有一或多個胺基酸取代、或含有與鑑別之任何序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)之序列的一或多個CDR。在一些實施例中，CD22 CAR之胞外結合域包含或由一或多個如本文描述之CDR組成。
在一些實施例中，CD22 CAR之胞外結合域包含衍生自m971-L7之scFv，與親本抗體m971相比，該m971-L7係具有顯著改良CD22結合親和力的m971之親和力成熟變異體(改良約2 nM至少於50 pM)。在一些實施例中，衍生自m971-L7之scFv包含藉由3xG 4S連接子來連接之m971-L7之V H及V L。在其他實施例中，可替代地使用Whitlow連接子。在一些實施例中，整個m971-L7衍生scFv(亦被稱為m971-L7 scFv)及其不同部分之胺基酸序列提供於下表14中。在一些實施例中，CD22-特異性scFv包含或由SEQ ID NO:54、55、或59列出之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:54、55、或59列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，CD22特異性scFv可包含一或多個具有SEQ ID NO: 56-58及60-62列出之胺基酸序列的CDR。在一些實施例中，CD22特異性scFv可包含一或多個CDR具有SEQ ID NO: 56-58列出之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，CD22特異性scFv可包含一或多個CDR具有SEQ ID NO: 60-62列出之胺基酸序列的輕鏈。在任何此等實施例中，CD22特異性scFv可包含含有一或多個胺基酸取代、或含有與鑑別之任何序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)之序列的一或多個CDR。在一些實施例中，CD22 CAR之胞外結合域包含或由一或多個如本文描述之CDR組成。 表14. 抗CD22 scFv及組分之示例性序列
SEQ ID NO: 胺基酸序列 描述
45 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK 抗CD22 m971 scFv 完整序列，具有 3xG 4S 連接子
46 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSS 抗CD22 m971 scFv 重鏈可變區
47 GDSVSSNSAA 抗CD22 m971 scFv 重鏈 CDR1
48 TYYRSKWYN 抗CD22 m971 scFv 重鏈 CDR2
49 AREVTGDLEDAFDI 抗CD22 m971 scFv 重鏈 CDR3
50 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK 抗CD22 m971 scFv 輕鏈
51 QTIWSY 抗CD22 m971 scFv 輕鏈 CDR1
52 AAS 抗CD22 m971 scFv 輕鏈 CDR2
53 QQSYSIPQT 抗CD22 m971 scFv 輕鏈 CDR3
54 QVQLQQSGPGMVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSVAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSTWYNDYAVSMKSRITINPDTNKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMIQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYRQRPGEAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK 抗CD22 m971-L7 scFv 完整序列，具有 3xG 4S 連接子
55 QVQLQQSGPGMVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSVAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSTWYNDYAVSMKSRITINPDTNKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSS 抗CD22 m971-L7 scFv 重鏈可變區
56 GDSVSSNSVA 抗CD22 m971-L7 scFv 重鏈 CDR1
57 TYYRSTWYN 抗CD22 m971-L7 scFv 重鏈 CDR2
58 AREVTGDLEDAFDI 抗CD22 m971-L7 scFv 重鏈 CDR3
59 DIQMIQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYRQRPGEAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK 抗CD22 m971-L7 scFv 輕鏈可變區
60 QTIWSY 抗CD22 m971-L7 scFv 輕鏈 CDR1
61 AAS 抗CD22 m971-L7 scFv 輕鏈 CDR2
62 QQSYSIPQT 抗CD22 m971-L7 scFv 輕鏈 CDR3
在一些實施例中，CD22 CAR之胞外結合域包含免疫毒素HA22或BL22。免疫毒素BL22及HA22係包含融合至細菌毒素的對於CD22具有特異性之scFv的治療劑，並且因此可結合至表現CD22之癌細胞之表面並且殺滅癌細胞。BL22包含融合至38-kDa截短形式之 假單胞菌 (Pseudomonas)外毒素A的抗CD22抗體RFB4之dsFv(Bang等人, Clin. Cancer Res., 11:1545-50 (2005))。HA22(CAT8015，moxetumomab pasudotox)係突變的更高親和力型式之BL22(Ho等人, J. Biol. Chem., 280(1): 607-17 (2005))。對於CD22具有特異性之HA22及BL22之抗原結合域之合適序列揭示於例如美國專利第7,541,034號；第7,355,012號；及第7,982,011號中，該等專利全部以引用形式併入本文。
在一些實施例中，CD22 CAR之鉸鏈域包含CD8α鉸鏈域，例如人類CD8α鉸鏈域。在一些實施例中，CD8α鉸鏈域包含或由SEQ ID NO:9列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:9列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，鉸鏈域包含CD28鉸鏈域，例如人類CD28鉸鏈域。在一些實施例中，CD28鉸鏈域包含或由SEQ ID NO:10列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:10列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，鉸鏈域包含IgG4鉸鏈域，例如人類IgG4鉸鏈域。在一些實施例中，IgG4鉸鏈域包含或由SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12列出之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，鉸鏈域包含IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3域，例如人類IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3域。在一些實施例中，IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3域包含或由SEQ ID NO:13列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:13列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，CD22 CAR之跨膜域包含CD8α跨膜域，例如人類CD8α跨膜域。在一些實施例中，CD8α跨膜域包含或由SEQ ID NO:14列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:14列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，跨膜域包含CD28跨膜域，例如人類CD28跨膜域。在一些實施例中，CD28跨膜域包含或由SEQ ID NO:15列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:15列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，CD22 CAR之細胞內共刺激域包含4-1BB共刺激域，例如，人類4-1BB共刺激域。在一些實施例中，4-1BB共刺激域包含或由SEQ ID NO:16列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:16列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，細胞內共刺激域包含CD28共刺激域，例如人類CD28共刺激域。在一些實施例中，CD28共刺激域包含或由SEQ ID NO:17列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:17列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，CD22 CAR之細胞內信號轉導域包含CD3澤塔(ζ)信號轉導域，例如人類CD3ζ信號轉導域。在一些實施例中，CD3ζ信號轉導域包含或由SEQ ID NO:18列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:18列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，CD22 CAR包含具有SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:54列出之序列之CD22特異性scFv、SEQ ID NO:9之CD8α鉸鏈域、SEQ ID NO:14之CD8α跨膜域、SEQ ID NO:16之4-1BB共刺激域、SEQ ID NO:18之CD3ζ信號轉導域、及/或其變異體(亦即，具有與所揭示序列至少80%相同，例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99相同之序列)。
在一些實施例中，CD22 CAR包含具有SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:54列出之序列之CD22特異性scFv、SEQ ID NO:10之CD28鉸鏈域、SEQ ID NO:14之CD8α跨膜域、SEQ ID NO:16之4-1BB共刺激域、SEQ ID NO:18之CD3ζ信號轉導域、及/或其變異體(亦即，具有與所揭示序列至少80%相同，例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99相同之序列)。
在一些實施例中，CD22 CAR包含具有SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:54列出之序列之CD22特異性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之IgG4鉸鏈域、SEQ ID NO:14之CD8α跨膜域、SEQ ID NO:16之4-1BB共刺激域、SEQ ID NO:18之CD3ζ信號轉導域、及/或其變異體(亦即，具有與所揭示序列至少80%相同，例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99相同之序列)。
在一些實施例中，CD22 CAR包含具有SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:54列出之序列之CD22特異性scFv、SEQ ID NO:9之CD8α鉸鏈域、SEQ ID NO:15之CD28跨膜域、SEQ ID NO:16之4-1BB共刺激域、SEQ ID NO:18之CD3ζ信號轉導域、及/或其變異體(亦即，具有與所揭示序列至少80%相同，例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99相同之序列)。
在一些實施例中，CD22 CAR包含具有SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:54列出之序列之CD22特異性scFv、SEQ ID NO:10之CD28鉸鏈域、SEQ ID NO:15之CD28跨膜域、SEQ ID NO:16之4-1BB共刺激域、SEQ ID NO:18之CD3ζ信號轉導域、及/或其變異體(亦即，具有與所揭示序列至少80%相同，例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99相同之序列)。
在一些實施例中，CD22 CAR包含具有SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:54列出之序列之CD22特異性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之IgG4鉸鏈域、SEQ ID NO:15之CD28跨膜域、SEQ ID NO:16之4-1BB共刺激域、SEQ ID NO:18之CD3ζ信號轉導域、及/或其變異體(亦即，具有與所揭示序列至少80%相同，例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99相同之序列)。 BCMA CAR
在一些實施例中，CAR為BCMA CAR。BCMA為表現於B細胞譜系之細胞上之腫瘤壞死家族受體(TNFR；tumor necrosis family receptor)成員，並且在終末分化B細胞或成熟B淋巴球上之表現最高。BCMA涉及介導漿細胞之存活以便保持長期體液免疫。BCMA之表現最近與許多癌症相關，諸如多發性骨髓瘤、何杰金及非何杰金淋巴瘤、各種白血病、及膠質母細胞瘤。在一些實施例中，BCMA CAR可包含串聯的信號肽、特異性結合BCMA之胞外結合域、鉸鏈域、跨膜域、細胞內共刺激域、及/或細胞內信號轉導域。
在一些實施例中，BCMA CAR之信號肽包含CD8α信號肽。在一些實施例中，CD8α信號肽包含或由SEQ ID NO:6列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:6列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，信號肽包含IgK信號肽。在一些實施例中，IgK信號肽包含或由SEQ ID NO:7列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:7列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，信號肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信號肽。在一些實施例中，GMCSFR-α或CSF2RA信號肽包含或由SEQ ID NO:8列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:8列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，BCMA CAR之胞外結合域對於BCMA，例如，人類BCMA具有特異性。BCMA CAR之胞外結合域可經密碼子最佳化以便在宿主細胞中表現或具有變異體序列以便增加胞外結合域之功能。
在一些實施例中，胞外結合域包含免疫球蛋白分子之免疫原性活性部分，例如，scFv。在一些實施例中，BCMA CAR之胞外結合域衍生自對於BCMA具有特異性之抗體，包括，例如，貝蘭他單抗(belantamab)、厄拉那單抗(erlanatamab)、替尼單抗(teclistamab)、LCAR-B38M、及西他他因(ciltacabtagene)。在任何此等實施例中，BCMA CAR之胞外結合域可包含或由V H、V L、及/或任何抗體之一或多個CDR組成。
在一些實施例中，BCMA CAR之胞外結合域包含衍生自C11D5.3之scFv，C11D5.3係一種如Carpenter等人，Clin.Cancer Res. 19(8):2048-2060 (2013)所描述之鼠科單株抗體。亦參見PCT申請公開案第WO2010/104949號。C11D5.3衍生scFv可包含藉由Whitlow連接子連接之C11D5.3之重鏈可變區(V H)及輕鏈可變區(V L)，該scFv之胺基酸序列提供於下表15中。在一些實施例中，BCMA-特異性胞外結合域包含或由SEQ ID NO:63、64、或68列出之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:63、64、或68列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，BCMA特異性胞外結合域可包含一或多個具有SEQ ID NO: 65-67及69-71列出之胺基酸序列的CDR。在一些實施例中，BCMA特異性胞外結合域可包含一或多個CDR具有SEQ ID NO: 65-67列出之胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中，BCMA特異性胞外結合域可包含一或多個CDR具有SEQ ID NO: 69-71列出之胺基酸序列的重鏈。在任何此等實施例中，BCMA特異性scFv可包含含有一或多個胺基酸取代、或含有與鑑別之任何序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)之序列的一或多個CDR。在一些實施例中，BCMA CAR之胞外結合域包含或由一或多個如本文描述之CDR組成。
在一些實施例中，BCMA CAR之胞外結合域包含衍生自另一種鼠科單株抗體C12A3.2之scFv，如Carpenter等人, Clin. Cancer Res. 19(8):2048-2060 (2013)及PCT申請公開案第WO2010/104949號所描述，該scFv之胺基酸序列亦提供於下表15中。在一些實施例中，BCMA-特異性胞外結合域包含或由SEQ ID NO:72、73、或77列出之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:72、73、或77列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，BCMA特異性胞外結合域可包含一或多個具有SEQ ID NO: 74-76及78-80列出之胺基酸序列的CDR。在一些實施例中，BCMA特異性胞外結合域可包含一或多個CDR具有SEQ ID NO: 74-76列出之胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中，BCMA特異性胞外結合域可包含一或多個CDR具有SEQ ID NO: 78-80列出之胺基酸序列的重鏈。在任何此等實施例中，BCMA特異性scFv可包含含有一或多個胺基酸取代、或含有與鑑別之任何序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)之序列的一或多個CDR。在一些實施例中，BCMA CAR之胞外結合域包含或由一或多個如本文描述之CDR組成。
在一些實施例中，BCMA CAR之胞外結合域包含Friedman等人, Hum. Gene Ther. 29(5):585-601 (2018))中之被稱為BB2121的對於人類BCMA具有較高特異性之鼠科單株抗體。亦參見PCT申請公開案第WO2012163805號。
在一些實施例中，BCMA CAR之胞外結合域包含如Zhao等人, J. Hematol. Oncol. 11(1):141 (2018)所描述之可結合至BCMA之兩個抗原決定基的兩個重鏈(VHH)之單一可變片段，亦被稱為LCAR-B38M。亦參見PCT申請公開案第WO2018/028647號。
在一些實施例中，BCMA CAR之胞外結合域包含如Lam等人, Nat. Commun. 11(1):283 (2020)所描述之完全人類重鏈可變域(FHVH；fully human heavy-chain variable domain)，亦被稱為FHVH33。亦參見PCT申請公開案第WO2019/006072號。FHVH33及其CDR之胺基酸序列提供於下表15中。在一些實施例中，BCMA-特異性胞外結合域包含或由SEQ ID NO:81列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:81列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，BCMA特異性胞外結合域可包含一或多個具有SEQ ID NO: 82-84列出之胺基酸序列的CDR。在任何此等實施例中，BCMA特異性胞外結合域可包含含有一或多個胺基酸取代、或含有與鑑別之任何序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)之序列的一或多個CDR。在一些實施例中，BCMA CAR之胞外結合域包含或由一或多個如本文描述之CDR組成。
在一些實施例中，BCMA CAR之胞外結合域包含如美國專利第11,026,975 B2號所描述之衍生自CT103A(或CAR0085)之scFv，該scFv之胺基酸序列提供於下表15中。在一些實施例中，BCMA-特異性胞外結合域包含或由SEQ ID NO:118、119、或123列出之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：118、119、或123列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，BCMA特異性胞外結合域可包含一或多個具有SEQ ID NO: 120-122及124-126列出之胺基酸序列的CDR。在一些實施例中，BCMA特異性胞外結合域可包含一或多個CDR具有SEQ ID NO: 120-122列出之胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中，BCMA特異性胞外結合域可包含一或多個CDR具有SEQ ID NO: 124-126列出之胺基酸序列的重鏈。在任何此等實施例中，BCMA特異性scFv可包含含有一或多個胺基酸取代、或含有與鑑別之任何序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)之序列的一或多個CDR。在一些實施例中，BCMA CAR之胞外結合域包含或由一或多個如本文描述之CDR組成。
另外，針對BCMA之CAR及結合劑描述於美國申請公開案第2020/0246381 A1號及第2020/0339699 A1號中，該等公開案中之各者之整個內容以引用方式併入本文。 表15. 抗BCMA結合劑及組分之示例性序列
SEQ ID NO: 胺基酸序列 描述
63 DIVLTQSPASLAMSLGKRATISCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEEDDVAIYSCLQSRIFPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSS 抗BCMA C11D5.3 scFv 完整序列，具有 Whitlow 連接子
64 DIVLTQSPASLAMSLGKRATISCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEEDDVAIYSCLQSRIFPRTFGGGTKLEIK 抗BCMA C11D5.3 scFv 輕鏈可變區
65 RASESVSVIGAHLIH 抗BCMA C11D5.3 scFv 輕鏈 CDR1
66 LASNLET 抗BCMA C11D5.3 scFv 輕鏈 CDR2
67 LQSRIFPRT 抗BCMA C11D5.3 scFv 輕鏈 CDR3
68 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSS 抗BCMA C11D5.3 scFv 重鏈可變區
69 DYSIN 抗BCMA C11D5.3 scFv 重鏈 CDR1
70 WINTETREPAYAYDFRG 抗BCMA C11D5.3 scFv 重鏈 CDR2
71 DYSYAMDY 抗BCMA C11D5.3 scFv 重鏈 CDR3
72 DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIYWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFRHYSMNWVKQAPGKGLKWMGRINTESGVPIYADDFKGRFAFSVETSASTAYLVINNLKDEDTASYFCSNDYLYSLDFWGQGTALTVSS 抗BCMA C12A3.2 scFv 完整序列，具有 Whitlow 連接子
73 DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIYWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIK 抗BCMA C12A3.2 scFv 輕鏈可變區
74 RASESVTILGSHLIY 抗BCMA C12A3.2 scFv 輕鏈 CDR1
75 LASNVQT 抗BCMA C12A3.2 scFv 輕鏈 CDR2
76 LQSRTIPRT 抗BCMA C12A3.2 scFv 輕鏈 CDR3
77 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFRHYSMNWVKQAPGKGLKWMGRINTESGVPIYADDFKGRFAFSVETSASTAYLVINNLKDEDTASYFCSNDYLYSLDFWGQGTALTVSS 抗BCMA C12A3.2 scFv 重鏈可變區
78 HYSMN 抗BCMA C12A3.2 scFv 重鏈 CDR1
79 RINTESGVPIYADDFKG 抗BCMA C12A3.2 scFv 重鏈 CDR2
80 DYLYSLDF 抗BCMA C12A3.2 scFv 重鏈 CDR3
81 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGDYIYYADSVKGRFTISRDISKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEGTGANSSLADYRGQGTLVTVSS 抗BCMA FHVH33 完整序列
82 GFTFSSYA 抗BCMA FHVH33 CDR1
83 ISGSGDYI 抗BCMA FHVH33 CDR2
84 AKEGTGANSSLADY 抗BCMA FHVH33 CDR3
118 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKYDLLTFGGGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSISYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRGDTILDVWGQGTMVTVSS 抗BCMA CT103A scFv 完整序列，具有 Whitlow 連接子
119 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKYDLLTFGGGTKVEIK 抗BCMA CT103A scFv 輕鏈可變區
120 QSISSY 抗BCMA CT103A scFv 輕鏈 CDR1
121 AAS 抗BCMA CT103A scFv 輕鏈 CDR2
122 QQKYDLLT 抗BCMA CT103A scFv 輕鏈 CDR3
123 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSISYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRGDTILDVWGQGTMVTVSS 抗BCMA CT103A scFv 重鏈可變區
124 GGSISSSSYY 抗BCMA CT103A scFv 重鏈 CDR1
125 ISYSGST 抗BCMA CT103A scFv 重鏈 CDR2
126 ARDRGDTILDV 抗BCMA CT103A scFv 重鏈 CDR3
在一些實施例中，BCMA CAR之鉸鏈域包含CD8α鉸鏈域，例如人類CD8α鉸鏈域。在一些實施例中，CD8α鉸鏈域包含或由SEQ ID NO:9列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:9列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，鉸鏈域包含CD28鉸鏈域，例如人類CD28鉸鏈域。在一些實施例中，CD28鉸鏈域包含或由SEQ ID NO:10列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:10列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，鉸鏈域包含IgG4鉸鏈域，例如人類IgG4鉸鏈域。在一些實施例中，IgG4鉸鏈域包含或由SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12列出之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，鉸鏈域包含IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3域，例如人類IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3域。在一些實施例中，IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3域包含或由SEQ ID NO:13列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:13列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，BCMA CAR之跨膜域包含CD8α跨膜域，例如人類CD8α跨膜域。在一些實施例中，CD8α跨膜域包含或由SEQ ID NO:14列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:14列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，跨膜域包含CD28跨膜域，例如人類CD28跨膜域。在一些實施例中，CD28跨膜域包含或由SEQ ID NO:15列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:15列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，BCMA CAR之細胞內共刺激域包含4-1BB共刺激域，例如，人類4-1BB共刺激域。在一些實施例中，4-1BB共刺激域包含或由SEQ ID NO:16列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:16列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。在一些實施例中，細胞內共刺激域包含CD28共刺激域，例如人類CD28共刺激域。在一些實施例中，CD28共刺激域包含或由SEQ ID NO:17列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:17列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，BCMA CAR之細胞內信號轉導域包含CD3澤塔(ζ)信號轉導域，例如人類CD3ζ信號轉導域。在一些實施例中，CD3ζ信號轉導域包含或由SEQ ID NO:18列出之胺基酸序列或與SEQ ID NO:18列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，BCMA CAR包含如所描述之任何BCMA特異性胞外結合域、SEQ ID NO:9之CD8α鉸鏈域、SEQ ID NO:14之CD8α跨膜域、SEQ ID NO:16之4-1BB共刺激域、SEQ ID NO:18之CD3ζ信號轉導域、及/或其變異體(亦即，具有與所揭示序列至少80%相同，例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99相同之序列)。在任何此等實施例中，BCMA CAR可另外包含如所描述之信號肽(例如，CD8α信號肽)。
在一些實施例中，BCMA CAR包含如所描述之任何BCMA特異性胞外結合域、SEQ ID NO:9之CD8α鉸鏈域、SEQ ID NO:14之CD8α跨膜域、SEQ ID NO:17之CD28共刺激域、SEQ ID NO:18之CD3ζ信號轉導域、及/或其變異體(亦即，具有與所揭示序列至少80%相同，例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99相同之序列)。在任何此等實施例中，BCMA CAR可另外包含如所描述之信號肽。
在一些實施例中，BCMA CAR藉由SEQ ID NO:127列出之核苷酸序列或與SEQ ID NO:127列出之核苷酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)之核苷酸序列來編碼(參見表16)。所編碼之BCMA CAR具有SEQ ID NO:128列出之對應胺基酸序列或與SEQ ID NO:128列出之胺基酸序列至少80%相同(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同)，具有以下組分：CD8α信號肽、CT103A scFv(V L-Whitlow連接子-V H)、CD8α鉸鏈域、CD8α跨膜域、4-1BB共刺激域、及CD3ζ信號轉導域。
在一些實施例中，BCMA CAR為商購實施例之BCMA CAR，包括，例如，idecabtagene vicleucel(ide-cel，亦被稱為bb2121)。Idecabtagene vicleucel包含具有以下組分之BCMA CAR：BB2121結合劑、CD8α鉸鏈域、CD8α跨膜域、4-1BB共刺激域、及CD3ζ信號轉導域。 表16. BCMA CAR之示例性序列
SEQ ID NO: 序列 描述
127 atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcagcaaaaatacgacctcctcacttttggcggagggaccaaggttgagatcaaaggcagcaccagcggctccggcaagcctggctctggcgagggcagcacaaagggacagctgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtggctccatcagcagtagtagttactactggggctggatccgccagcccccagggaaggggctggagtggattgggagtatctcctatagtgggagcacctactacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatccgtagacacgtccaagaaccagttctccctgaagctgagttctgtgaccgccgcagacacggcggtgtactactgcgccagagatcgtggagacaccatactagacgtatggggtcagggtacaatggtcaccgtcagctcattcgtgcccgtgttcctgcccgccaaacctaccaccacccctgcccctagacctcccaccccagccccaacaatcgccagccagcctctgtctctgcggcccgaagcctgtagacctgctgccggcggagccgtgcacaccagaggcctggacttcgcctgcgacatctacatctgggcccctctggccggcacctgtggcgtgctgctgctgagcctggtgatcaccctgtactgcaaccaccggaacaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcagatccgccgacgcccctgcctaccagcagggacagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggcagacgggaagagtacgacgtgctggacaagcggagaggccgggaccccgagatgggcggaaagcccagacggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcgcggcaagggccacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccccaga 示例性 BCMA CAR 核苷酸序列
128 MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKYDLLTFGGGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSISYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRGDTILDVWGQGTMVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 示例性 BCMA CAR 胺基酸序列
在一些實施例中，原代T細胞或原代T細胞之池經工程化以便與未修飾原代T細胞相比，展現內源性T細胞受體之減少之表現。在某些實施例中，原代T細胞或原代T細胞之池經工程化以便如與未修飾原代T細胞相比，展現CTLA4、PD1、或CTLA4及PD1兩者之減少之表現。遺傳修飾細胞包括T細胞之方法詳細描述於例如WO2016183041中，揭示內容以全文引用方式併入本文，包括表、附錄、序列表及圖式。
在一些實施例中，在本文所述工程化細胞投與接受者受試者或患者之後，細胞在接受者體內經歷不適當的擴增或增殖；存在於接受者身體中之不適當位置；或經歷惡性轉型。在某些實施例中，此等工程化細胞在接受者中誘導細胞因子釋放症候群、誘導神經中毒性；或誘導毒性諸如中靶偏離腫瘤毒性。並且此後，向接受者受試者投與阻斷、中和、失活、干擾CD47及SIRPα結合、信號轉導、活性及功能之因子。
不希望受理論束縛，咸信工程化細胞之修飾使其「隱藏」以逃避負責清除感染、惡性或非自身細胞的接受者免疫系統之效應細胞。「隱藏」細胞以逃避免疫系統允許特定細胞，例如，同種異體細胞在身體中之存在及持久性。在一些情況下，本文所述工程化細胞可能在接受者中不再為治療上有效的或可誘導非所需不良效應。不良事件之非限制性實例包括異常增生、轉型、腫瘤形成、細胞因子釋放症候群、GVHD、免疫效應細胞相關神經中毒性症候群(ICANS)、發炎、感染、噁心、嘔吐、出血、間質性肺炎、呼吸道疾病、黃疸、體重損失、腹瀉、食欲損失、抽筋、腹部疼痛、肝靜脈閉塞疾病(VOD)、移植失敗、器官損傷、不孕、激素變化、異常生長形成、白內障、及移植後淋巴增殖病症(PTLD)及其類似事件。因此，控制工程化細胞在接受者身體中之存在的能力對於安全係至關緊要的。因此，「揭露」細胞起安全開關之作用並且可藉由阻斷或中和免疫抑制因子，諸如CD47之功能來達成。
在一些實施例中，在使細胞與CD47-SIRPα阻斷劑接觸後，細胞藉由接受者之免疫系統識別。在一些實施例中，工程化細胞表現免疫抑制因子CD47以使得該等細胞為低免疫原性的或具有減少之免疫原性直到一或多種CD47-SIRPα阻斷劑投與接受者為止。在CD47-SIRPα阻斷劑存在下，細胞經揭露並且藉由免疫細胞識別以便定為細胞死亡或清除之目標。 1.修飾MHC I類及/或MHC II類複合物之表現
本文提供細胞，該等細胞包含外源CD47蛋白及調控MHC I人類白血球抗原及/或MHC II人類白血球抗原之表現的一或多個靶向多核苷酸序列之修飾。在一些實施例中，MHC I人類白血球抗原或MHC II人類白血球抗原之表現得以調節。在一些實施例中，MHC I人類白血球抗原及MHC II人類白血球抗原之表現得以調節。在一些實施例中，細胞經遺傳修飾以便使MHC I類複合物之表現減少或失效、使MHC II類複合物之表現減少或失效、防止藉由接受者受試者之CD8 T細胞之直接識別、及/或逃避藉由接受者受試者之NK細胞識別。在一些實施例中，細胞展現減少之免疫原性。遺傳修飾細胞之詳細說明發現於例如WO2016183041中，揭示內容全部併入本文，包括序列表、表、及圖式。
在一些實施例中，工程化細胞包含調控MHC I蛋白及MHC II蛋白之表現的一或多個靶向多核苷酸序列之基因組修飾。在某些實施例中，細胞包含調控MHC I蛋白或MHC II蛋白之表現的一或多個靶向多核苷酸序列之基因組修飾。在一些態樣中，遺傳編輯系統用於修飾一或多個靶向多核苷酸序列。在一些實施例中，靶向多核苷酸序列為選自包括B2M、CIITA、及NLRC5之群之一或多者。在某些實施例中，細胞之基因組經改變以使HLA表現之關鍵組分減少或缺失。在一些實施例中，遺傳修飾包含失活突變(例如，缺失、添加或取代)。
在一些實施例中，工程化細胞包含選自來自包括以下各者之群之一或多者的基因中之遺傳修飾：B2M、CIITA、NLRC5、B7-1、B7-2、B7-H3、CD27、CD28、CD47、GITR、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、IRF1、NFY-A、NFY-B、PD-L1、PD-L2、NFY-C、OX40、RFX5、RFX-ANK、RFX-AP、TAP1、HVEM、SLAM、LFA-1、ST2、CD2、CD30、CD58、CD74、CD160、CD226、CD244、4-1BB、BTLA、ICOS、LAG3、HELIOS、TIGIT、TIM3、TLT、VISTA、及NKG2D之配位體。在一些實施例中，NKG2D之配位體選自包括以下各者之群中之一或多者：MICA、MICB、Raetl e、Raetl g、Raetl I、Ulbpl、Ulbp2、及Ulbp3。
在一些態樣中，本發明提供包含基因組之細胞或其群體，其中基因經編輯以便使基因組DNA之連續鏈段缺失，由此減少或消除細胞或其群體中之MHC I類分子之表面表現。在某些態樣中，本發明提供包含基因組之細胞或其群體，其中基因經編輯以便使基因組DNA之連續鏈段缺失，由此減少或消除細胞或其群體中之MHC II類分子之表面表現。在特定態樣中，本發明提供包含基因組之細胞或其群體，其中一或多個基因經編輯以便使基因組DNA之連續鏈段缺失，由此減少或消除細胞或其群體中之MHC I類及/或MHC II類分子之表面表現。
在某些實施例中，MHC I或MHC II分子之表現藉由靶向及缺失基因組DNA之連續鏈段來調節，由此減少或消除選自包括但是不限於B2M、CIITA、及NLRC5之之群之標靶基因之表現。
在一些實施例中，本文描述之細胞及方法包括基因組學編輯人類細胞以便裂解CIITA基因序列以及編輯此類細胞之基因組以便改變一或多個額外標靶多核苷酸序列諸如但不限於B2M及NLRC5。在一些實施例中，本文描述之細胞及方法包括基因組學編輯人類細胞以便裂解B2M基因序列以及編輯此類細胞之基因組以便改變一或多個額外標靶多核苷酸序列諸如但不限於CIITA及NLRC5。在一些實施例中，本文描述之細胞及方法包括基因組學編輯人類細胞以便裂解NLRC5基因序列以及編輯此類細胞之基因組以便改變一或多個額外標靶多核苷酸序列諸如但不限於B2M及CIITA。 i.CIITA
在一些態樣中，本文揭示之本技術藉由靶向及調節(例如，減少、降低或消除)II類反式活化因子(CIITA；Class II transactivator)表現來調節(例如，減少、降低或消除)MHC II基因之表現。在一些態樣中，調節使用CRISPR/Cas系統來發生。CIITA為LR或核苷酸結合域(NBD；nucleotide binding domain)富含白胺酸重複序列(LRR；leucine-rich repeat)蛋白家族之成員並且藉由與MHC增強體關聯來調控MHC II之轉錄。
在一些實施例中，本文所述標靶多核苷酸序列為CIITA之變異體。在一些實施例中，標靶多核苷酸序列為CIITA之同源物。在一些實施例中，標靶多核苷酸序列為CIITA之異種同源物。
在一些態樣中，減少或消除CIITA之表現減少或消除以下MHC II分子中之一或多者之表現：HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、及HLA-DR。
在一些實施例中，本文概述之低免疫原性細胞包含靶向CIITA基因之遺傳修飾。在一些實施例中，藉由稀少切割核酸內切酶來靶向CIITA基因之遺傳修飾包含Cas蛋白或編碼Cas蛋白之多核苷酸、及至少一個特異性靶向CIITA基因之引導核糖核酸序列。在一些實施例中，至少一個用於特異性靶向CIITA基因之引導核糖核酸序列選自包括WO2016/183041之表12之SEQ ID NO:5184-36352之群。在一些實施例中，細胞具有誘導接受者受試者中之免疫反應的減少之能力。
測試是否CIITA基因失活之檢定為已知的並且在本文中描述。在一個實施例中，藉由PCR導致之CIITA基因之遺傳修飾及HLA-II表現之減少可藉由FACS分析來檢定。在另一實施例中，CIITA蛋白表現使用以CIITA蛋白之抗體來探測之細胞裂解物之西方墨點法來偵測。在另一實施例中，反轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)用於確認失活遺傳修飾之存在。 ii. B2M
在某些實施例中，所描述之本發明方法藉由靶向及調節(例如，減少、降低或消除)附屬鏈B2M之表現來調節(例如，減少、降低或消除)MHC-I基因之表現。在一些態樣中，調節使用CRISPR/Cas系統來發生。藉由調節(例如，減少、降低或缺失)B2M之表現，MHC-I分子之表面轉運得以阻斷並且細胞呈現低免疫原性。在一些實施例中，細胞具有誘導接受者受試者中之免疫反應的減少之能力。
在一些實施例中，本文所述標靶多核苷酸序列為B2M之變異體。在一些實施例中，標靶多核苷酸序列為B2M之同源物。在一些實施例中，標靶多核苷酸序列為B2M之異種同源物。
在一些態樣中，降低或消除B2M之表現減少或消除以下MHC I分子中之一或多者之表現：HLA-A、HLA-B、及HLA-C。
在一些實施例中，本文概述之低免疫原性細胞包含靶向B2M基因之遺傳修飾。在一些實施例中，藉由稀少切割核酸內切酶來靶向B2M基因之遺傳修飾包含Cas蛋白或編碼Cas蛋白之多核苷酸、及至少一個特異性靶向B2M基因之引導核糖核酸序列。在一些實施例中，至少一個用於特異性靶向B2M基因之引導核糖核酸序列選自包括WO2016/183041之表15之SEQ ID NO:81240-85644之群。
測試是否B2M基因失活之檢定為已知的並且在本文中描述。在一個實施例中，藉由PCR導致之B2M基因之遺傳修飾及HLA-II表現之減少可藉由FACS分析來檢定。在另一實施例中，B2M蛋白表現使用以B2M蛋白之抗體來探測之細胞裂解物之西方墨點法來偵測。在另一實施例中，反轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR；reverse transcriptase polymerase chain reaction)用於確認失活遺傳修飾之存在。 iii. NLRC5
在某些態樣中，本文揭示之方法藉由靶向及調節(例如，減少、降低或消除)含有5/NOD27/CLR16.1之NLR家族，CARD域(NLRC5)之表現來調節(例如，減少、降低或消除)MHC-I基因之表現。在一些態樣中，調節使用CRISPR/Cas系統來發生。NLRC5為MHC-I介導免疫反應之關鍵調控因子並且類似於CIITA，NLRC5為可藉由IFN-γ來高度誘導的並且可轉運至細胞核中。NLRC5活化MHC-I基因之啟動子並且誘導MHC-I以及涉及MHC-I抗原呈遞之相關基因的轉錄。
在一些實施例中，本文所述標靶多核苷酸序列為NLRC5之變異體。在一些實施例中，標靶多核苷酸序列為NLRC5之同源物。在一些實施例中，標靶多核苷酸序列為NLRC5之異種同源物。
在一些態樣中，降低或消除NLRC5之表現減少或消除以下MHC I分子中之一或多者之表現：HLA-A、HLA-B、及HLA-C。
在一些實施例中，本文概述之低免疫原性細胞包含靶向NLRC5基因之遺傳修飾。在一些實施例中，藉由稀少切割核酸內切酶來靶向NLRC5基因之遺傳修飾包含Cas蛋白或編碼Cas蛋白之多核苷酸、及至少一個特異性靶向NLRC5基因之引導核糖核酸序列。在一些實施例中，至少一個用於特異性靶向NLRC5基因之引導核糖核酸序列選自包括WO2016/183041之表14之SEQ ID NO:36353-81239之群。在一些實施例中，細胞具有誘導接受者受試者中之免疫反應的減少之能力。
測試是否NLRC5基因失活之檢定為已知的並且在本文中描述。在一個實施例中，藉由PCR導致之NLRC5基因之遺傳修飾及HLA-II表現之減少可藉由FACS分析來檢定。在另一實施例中，NLRC5蛋白表現使用以NLRC5蛋白之抗體來探測之細胞裂解物之西方墨點法來偵測。在另一實施例中，反轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)用於確認失活遺傳修飾之存在。
在一些實施例中，所描述細胞包括調節表現選自包括以下各者之群之一者的修飾：CD24、CD27、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重鏈、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制劑、IL-10、IL-35、FASL、Serpinb9、CCL21、及Mfge8。在某些情況下，細胞過度表現一或多個選自包括以下各者之群的基因或蛋白：CD24、CD27、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重鏈、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制劑、IL-10、IL-35、FASL、Serpinb9、CCL21、及Mfge8。在某些情況下，細胞經修飾以便展現一或多個選自包括以下各者之群之基因或蛋白的減少之表現：CD24、CD27、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重鏈、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制劑、IL-10、IL-35、FASL、Serpinb9、CCL21、及Mfge8。
在一些實施例中，所描述細胞包含外源表現之CD47多肽及減少表現之MHC I類分子。在一些實施例中，所描述細胞包含外源表現之CD47多肽及減少表現之MHC II類分子。在一些實施例中，所描述細胞包含外源表現之CD47多肽及減少表現之MHC I類及MHC II類分子。
在一些實施例中，所描述細胞包含外源表現之CD47多肽及減少表現之B2M。在某些實施例中，所描述細胞包含外源表現之CD47多肽及減少表現之CIITA在其他實施例中，所描述細胞包含外源表現之CD47多肽及減少表現之B2M及CIITA。
在一些實施例中，所描述細胞包含外源表現之CD47多肽及一或多種選自包括以下各者之群之額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。在一些實施例中，所描述細胞包含外源表現之CD47多肽；一或多種選自包括以下各者之群之額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合；及減少表現之MHC I類分子。在一些實施例中，所描述細胞包含外源表現之CD47多肽；一或多種選自包括以下各者之群之額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合；及減少表現之MHC II類分子。在一些實施例中，所描述細胞包含外源表現之CD47多肽；一或多種選自包括以下各者之群之額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合；及減少表現之MHC I類及MHC II類分子。
在一些實施例中，所描述細胞包含外源表現之CD47多肽；一或多種選自包括以下各者之群之額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合；及減少表現之B2M。在一些實施例中，所描述細胞包含外源表現之CD47多肽；一或多種選自包括以下各者之群之額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合；及減少表現之CIITA。在一些實施例中，所描述細胞包含外源表現之CD47多肽；一或多種選自包括以下各者之群之額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合；及減少表現之NLRC5。在一些實施例中，所描述細胞包含外源表現之CD47多肽；一或多種選自包括以下各者之群之額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合；及減少表現之包括以下各者之群中之任一者：(a) B2M及CIITA；(b) B2M及NLRC5；(c) CIITA及NLRC5；及(d) B2M、CIITA及NLRC5。 2. 修飾 TCR 複合物之表現
本文提供細胞，該等細胞包含外源CD47蛋白及調控TCR複合物之表現的一或多個靶向多核苷酸序列之修飾。在一些實施例中，TCRα蛋白或TCRβ蛋白之表現得以調節。在一些實施例中，TCRα蛋白及TCRβ蛋白之表現得以調節。在一些實施例中，細胞經遺傳修飾以便使一或多個TCR複合物之表現減少或失效、使TCRα之表現減少或失效、使TCRβ之表現減少或失效、及/或減少免疫原性。遺傳修飾細胞之詳細說明發現於例如WO2016183041中，該文獻之揭示內容全部併入本文，包括序列表、表、及圖式。
在一些實施例中，工程化細胞包含調控TCRα蛋白及TCRβ蛋白之表現的一或多個靶向多核苷酸序列之基因組修飾。在某些實施例中，細胞包含調控TCRα蛋白或TCRβ蛋白之表現的一或多個靶向多核苷酸序列之基因組修飾。在一些態樣中，遺傳編輯系統用於修飾一或多個靶向多核苷酸序列。在一些實施例中，靶向多核苷酸序列為選自包括TRAC及TRB之群之一或多者。在某些實施例中，細胞之基因組經改變以便使TCR表現之關鍵組分減少或缺失以使得一或多個TCR複合物之表面表現得以改變。在一些實施例中，遺傳修飾包含失活突變(例如，缺失、添加或取代)。 i. TRAC
在某些實施例中，本文揭示之技術藉由靶向及調節(例如，減少或消除)T細胞受體α鏈之恆定區之表現來調節(例如，減少或消除)TCR基因，包括TRAC基因之表現。在一些態樣中，調節使用CRISPR/Cas系統來發生。在根據本文揭示之技術來調節之細胞中，藉由調節(例如，減少或缺失)TRAC之表現，TCR分子之表面轉運得以阻斷。在一些實施例中，其基因組經工程化以調節TCR基因包括TRAC基因之表現的細胞亦 具有誘導接受者受試者中之免疫反應的減少之能力。在一些實施例中，在TRAC基因表現經調節的細胞中，一或多個TCR複合物之表現得以改變。
在一些實施例中，本文所述標靶多核苷酸序列為TRAC之變異體。在一些實施例中，標靶多核苷酸序列為TRAC之同源物。在一些實施例中，標靶多核苷酸序列為TRAC之異種同源物。
在一些態樣中，減少或消除TRAC之表現減少或消除TCR表面表現。因此，與未修飾細胞中之表現相比，一或多個TCR複合物之表現降低。
在一些實施例中，本文所述細胞包含編碼TRAC蛋白之基因座位處之基因修飾。換言之，細胞包含TRAC基因座處之遺傳修飾。在一些情況下，編碼TRAC蛋白之核苷酸序列在Genbank No. X02592.1中列出。在一些情況下，TRAC基因座位在RefSeq. No. NG_001332.3及NCBI基因ID No. 28755中描述。在某些情況下，TRAC之胺基酸序列描述為Uniprot No. P01848。TRAC蛋白及基因座位之額外描述可發現於Uniprot No. P01848、HGNC Ref. No. 12029、及OMIM Ref. No. 186880中。
在一些實施例中，本文概述之低免疫原性細胞包含靶向TRAC基因之遺傳修飾。在一些實施例中，藉由稀少切割核酸內切酶來靶向TRAC基因之遺傳修飾包含Cas蛋白或編碼Cas蛋白之多核苷酸、及至少一個特異性靶向TRAC基因之引導核糖核酸序列。在一些實施例中，至少一個用於特異性靶向TRAC基因之引導核糖核酸序列選自由US20160348073之SEQ ID NO:532-609及9102-9797組成之群，該文獻以引用方式併入本文。
測試是否TRAC基因失活之檢定為已知的並且在本文中描述。在一個實施例中，藉由PCR導致之TRAC基因之遺傳修飾及HLA-II表現之減少可藉由FACS分析來檢定。在另一實施例中，TCRα蛋白表現使用以TCRα蛋白之抗體來探測之細胞裂解物之西方墨點法來偵測。在另一實施例中，反轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)用於確認失活遺傳修飾之存在。 ii. TRB
在某些實施例中，本文揭示技術藉由靶向及調節(例如，減少或消除)T細胞受體β鏈之恆定區之表現來調節(例如，減少或消除)TCR基因之表現，包括編碼T細胞抗原受體，β鏈(例如，TRB或TCRB基因)之基因。在一些態樣中，調節使用CRISPR/Cas系統來發生。在根據本文揭示之技術來調節之細胞中，藉由調節(例如，減少或缺失)TRB之表現，TCR分子之表面轉運得以阻斷。在一些實施例中，其基因組經工程化以調節TCR基因包括TRB基因之表現的細胞亦具有誘導接受者受試者中之免疫反應的減少之能力。在一些實施例中，在TRB基因經調節之細胞中，一或多個TCR複合物之表現得以改變。
在一些實施例中，本文所述標靶多核苷酸序列為TRB之變異體。在一些實施例中，標靶多核苷酸序列為TRB之同源物。在一些實施例中，標靶多核苷酸序列為TRB之異種同源物。
在一些態樣中，減少或消除TRB之表現減少或消除TCR表面表現。因此，與未修飾細胞中之表現相比，一或多個TCR複合物之表現降低
在一些實施例中，本文所述細胞包含編碼TRB蛋白之基因座位處之基因修飾。換言之，細胞包含TRB基因座處之遺傳修飾。在一些情況下，編碼TRB蛋白之核苷酸序列在UniProt No. P0DSE2中列出。在一些情況下，TRB基因座位描述於RefSeq. No. NG_001333.2及NCBI基因ID No. 6957中。在某些情況下，TRB之胺基酸序列描述為Uniprot No. P01848。TRB蛋白及基因座位之額外描述可發現於GenBank No. L36092.2、Uniprot No. P0DSE2、及HGNC Ref. No. 12155中。
在一些實施例中，本文概述之低免疫原性細胞包含靶向TRB基因之遺傳修飾。在一些實施例中，藉由稀少切割核酸內切酶來靶向TRB基因之遺傳修飾包含Cas蛋白或編碼Cas蛋白之多核苷酸、及至少一個特異性靶向TRB基因之引導核糖核酸序列。在一些實施例中，至少一個用於特異性靶向TRB基因之引導核糖核酸序列選自由US20160348073之SEQ ID NO:610-765及9798-10532組成之群，該文獻以引用方式併入本文。
測試是否TRB基因失活之檢定為已知的並且在本文中描述。在一個實施例中，藉由PCR導致之TRB基因之遺傳修飾及HLA-II表現之減少可藉由FACS分析來檢定。在另一實施例中，TCRβ蛋白表現使用以TCRβ蛋白之抗體來探測之細胞裂解物之西方墨點法來偵測。在另一實施例中，反轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)用於確認失活遺傳修飾之存在。
本文提供經工程化以便與對應野生型或未修飾細胞相比，減少MHC I類及/或MHC II類人類白血球抗原之表現或不存在表現，減少TCR複合物之表現或不存在表現，及增加CD47之表現的細胞。在一些實施例中，工程化細胞亦表現嵌合抗原受體(CAR)。在一些情況下，CAR為CD19-特異性CAR。在一些實施例中，CD19-特異性CAR展現與tisagenlecleucel或其生物類似物或替代物之細胞中表現之CAR實質上類似之結構及/或功能。在一些態樣中，細胞包括一或多個選自由B2M、CIITA、TRAC及TRB基因組成之群之基因中之遺傳修飾。在一些實施例中，將遺傳修飾引入B2M及CIITA基因中。在一些實施例中，將遺傳修飾引入B2M、CIITA、及TRAC基因中。在一些實施例中，將遺傳修飾引入B2M、CIITA、及TRB基因中。在一些實施例中，將遺傳修飾引入B2M、CIITA、TRAC、及TRB基因中。在一些實施例中，細胞為 B2M -/- 、 CIITA -/- 、 TRAC -/- 細胞。在一些實施例中，細胞為 B2M -/- 、 CIITA -/- 、 TRB -/- 細胞。在一些實施例中，細胞為 B2M -/- 、 CIITA -/- 、 TRAC -/- 、 TRB -/- 細胞。
在許多態樣中，細胞包括一或多個選自由B2M、CIITA、TRAC及TRB基因組成之群之基因中之遺傳修飾並且過度表現CD47。在一些實施例中，細胞過度表現CD47並且帶有引入B2M及CIITA基因中之遺傳修飾。在一些實施例中，細胞過度表現CD47並且帶有引入B2M、CIITA、及TRAC基因中之遺傳修飾。在一些實施例中，細胞過度表現CD47並且帶有引入B2M、CIITA、及TRB基因中之遺傳修飾。在一些實施例中，細胞過度表現CD47並且帶有引入B2M、CIITA、TRAC、及TRB基因中之遺傳修飾。在一些實施例中，細胞為 B2M -/- 、 CIITA -/- 、 TRAC -/- 、 CD47tg細胞。在一些實施例中，細胞為 B2M -/- 、 CIITA -/- 、 TRB -/- 、 CD47tg細胞。在一些實施例中，細胞為 B2M -/- 、 CIITA -/- 、 TRAC -/- 、 TRB -/- 、 CD47tg細胞。在一些實施例中，藉由所描述細胞來表現外源CD47藉由組成性啟動子或可誘導啟動子來控制。
在許多態樣中，細胞包括一或多個選自由B2M、CIITA、TRAC及TRB基因組成之群之基因中之遺傳修飾並且過度表現CD47及CAR。在一些實施例中，細胞過度表現CD47及CAR，並且帶有引入B2M及CIITA基因中之遺傳修飾。在一些實施例中，細胞過度表現CD47及CAR，並且帶有引入B2M、CIITA、及TRAC基因中之遺傳修飾。在一些實施例中，細胞過度表現CD47及CAR，並且帶有引入B2M、CIITA、及TRB基因中之遺傳修飾。在一些實施例中，細胞過度表現CD47及CAR，並且帶有引入B2M、CIITA、TRAC、及TRB基因中之遺傳修飾。在一些實施例中，細胞為亦表現嵌合抗原受體之 B2M -/- 、 CIITA -/- 、 TRAC -/- 、 CD47tg細胞。在一些實施例中，細胞為亦表現嵌合抗原受體之 B2M -/- 、 CIITA -/- 、 TRB -/- 、 CD47tg細胞。在一些實施例中，細胞為亦表現嵌合抗原受體之 B2M -/- 、 CIITA -/- 、 TRAC -/- 、 TRB -/- 、 CD47tg細胞。
在一些實施例中，CAR之表現藉由組成性啟動子或可誘導啟動子來控制。在一些實施例中，藉由所描述細胞來表現外源CD47藉由組成性啟動子或可誘導啟動子來控制。在某些實施例中，CAR及CD47之表現藉由單一啟動子來控制。在許多實施例中，表現CAR及CD47控制兩個啟動子。在一些實施例中，CAR之表現藉由第一啟動子來控制並且CD47藉由第二啟動子來控制，以使得第一啟動子及第二啟動子為相同類型之啟動子。在其他情況下，第一啟動子及第二啟動子為不同類型之啟動子。在一些情況下，藉由細胞之CAR之表現水準比CD47之表現更高(例如，高5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%、300%或更多)。在一些情況下，藉由細胞之CD47(例如，外源CD47)之表現水準比CAR之表現更高(例如，高5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%、300%或更多)。在許多情況中，CAR及外源CD47之表現水準實質上相同。 III. 原代細胞：產生、工程化、分化、移植
本文提供用於調節含有一或多個編碼CD47之核酸及視情況其他蛋白之細胞，包括原代細胞及非原代細胞之群體的方法及組合物，包括向受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中細胞群體先前投與或移植至受試者中。在一些實施例中，原代細胞包含可分化成其他非原代細胞類型之細胞。在一些實施例中，原代細胞為多能細胞。在一些實施例中，原代細胞包含多能幹細胞。在一些實施例中，原代細胞為人類原代細胞。在一些實施例中，人類原代細胞為人類多能幹細胞(hPSC；human pluripotent stem cell)。在一些實施例中，非原代細胞為人類非原代細胞。
包括多能幹細胞、分化細胞、原代細胞、及原代T細胞之治療細胞可工程化以便表現免疫調控蛋白並且逃避接受者免疫系統之排斥。並且因此，此類細胞對於同種異體細胞療法有很大的希望。在一些態樣中，本技術之細胞包含用於抑制對於植入細胞之接受者免疫反應的免疫抑制(例如，免疫原性)因子。在一些實施例中，將CD47-SIRPα阻斷劑投與接受者促進此等細胞及其衍生物(例如，子代細胞)之吞噬作用、細胞清除及/或細胞死亡。在一些態樣中，CD47-SIRPα阻斷劑為中和、阻斷、拮抗、或干擾CD47、SIRPα、或兩者之細胞表面表現的因子。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑抑制或阻斷CD47、SIRPα或兩者之相互作用。此類CD47-SIRPα阻斷劑可用作調節所投與或植入細胞之活性的安全開關，由此改良此等基於細胞療法之安全性。
本文提供使用CD47-SIRPα阻斷劑來減少表現CD47之細胞(例如，投與或引入患者之CD47表現細胞)之數目的方法。亦提供表現CD47之細胞及其衍生物(例如，多能幹細胞、誘導多能幹細胞、來自多能幹細胞之分化細胞、原代T細胞、及其子代)。在一些實施例中，細胞包含外源表現CD47。在一些實施例中，將本文所述工程化細胞投與接受者受試者，並且然後在將CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者後，彼等工程化細胞被定為接受者受試者免疫系統之細胞死亡及/或細胞清除的目標。
在一些實施例中，在向接受者受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑之後，本文概述之細胞經受先天免疫細胞排斥。在一些情況下，在投與CD47-SIRPα阻斷劑之前，表現免疫抑制因子(例如，CD47)之細胞不易受NK細胞介導之裂解。在一些情況下，在投與CD47-SIRPα阻斷劑之前，細胞不易受巨噬細胞吞噬。在一些實施例中，該等細胞可用作可在需要極少直至不需要免疫抑制劑的情況下，移植至接受者受試者中之普遍相容細胞或組織(例如，普遍供給者細胞或組織)的來源。此類細胞在移植後保持特定細胞特性及特徵。
在一些實施例中，本文提供在MHC失配同種異體接受者中逃避免疫排斥之細胞及/或其分化衍生物。在一些情況下，表現CD47之細胞及其子代，包括表現CD47之植入細胞及任何子代(例如，細胞之直接或間接子代)可逃避接受者受試者之免疫識別。在一些實施例中，細胞及/或衍生自此類細胞之分化細胞為低免疫原性的。因此，細胞及其子代可逃避免疫識別並且不引起接受者受試者中之免疫反應。在一些實施例中，自本文概述之幹細胞產生之分化細胞在投與(例如，移植或嫁接)MHC失配同種異體接受者時逃避免疫排斥。在一些實施例中，細胞及/或衍生自此類細胞之分化細胞為低免疫原性的。 A.產生原代及/或分化細胞
本發明提供產生包含外源表現CD47之工程化細胞的方法。在一些實施例中，細胞包含多能幹細胞、誘導多能幹細胞、分化細胞、及衍生自原代T細胞之細胞。在一些實施例中，分化細胞包括選自由以下組成之群的細胞類型：心臟細胞、神經細胞、內皮細胞、T細胞、胰島細胞、視網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲狀腺細胞、皮膚細胞、血細胞、及上皮細胞。在一些實施例中，工程化細胞或其子代為身體之任何器官或組織之細胞，包括但不限於心臟、大腦、皮膚、眼睛、胰腺、膀胱、脾臟、肝臟、肺、腎臟、甲狀腺、心血管系統、呼吸系統、神經系統、及免疫系統。在一些實施例中，多能幹細胞使用特異性分化條件來分化成身體之任何器官或組織之細胞。
在一些實施例中，本文描述之方法包含使用熟習此項技術者已知之方法來產生之原代細胞。在一些實施例中，本文所述方法包含使用熟習此項技術者已知之方法來產生之多能幹細胞。小鼠及人類誘導多能幹細胞(通常被稱為iPSC；induced pluripotent stem cell；鼠科細胞之miPSC或人類細胞之hiPSC)之產生通常在此項技術中為已知的。如熟習此項技術者瞭解，存在產生iPSC之各種不同方法。使用四種轉錄因子Oct3/4、Sox2、c-Myc及Klf4之病毒引入，進行來自小鼠胚胎或成人纖維母細胞之最初誘導；參見Takahashi及Yamanaka，Cell，126:663-676 (2006)，該文獻全部並且尤其針對其中概述之技術以引用方式併入本文。此後，已發展許多方法；參見Seki等人，World J. Stem Cells 7(1): 116-125 (2015)之評述，及Lakshmipathy及Vermuri編, Methods in Molecular Biology: Pluripotent Stem Cells, Methods and Protocols, Springer 2013，兩種文獻全部並且尤其針對產生hiPSC之方法(參見例如後一參考文獻之第3章)以引用方式明確併入本文。
總體上，iPSC藉由通常使用游離基因載體來引入之一或多種「重新編程因子」在宿主細胞中之瞬時表現來產生。在此等條件下，少量細胞經誘導成為iPSC(通常，此步驟之效率較低，因為未使用選擇標誌物)。一旦細胞經「重新編程」，並且成為多能細胞，其失去游離基因載體並且使用內源性基因來產生該等因子。
亦如熟習此項技術者瞭解，可使用或經使用之許多重新編程因子可變化。通常，當使用較少重新編程因子時，細胞轉型至多能狀態之效率以及「多能性」降低，例如，較少重新編程因子可導致細胞並非完全多能的，但是可能只能夠分化成較少細胞類型。
在一些實施例中，使用單一重新編程因子OCT4。在其他實施例中，使用兩個重新編程因子OCT4及KLF4。在其他實施例中，使用三個重新編程因子OCT4、KLF4及SOX2。在其他實施例中，使用四個重新編程因子OCT4、KLF4、SOX2及c-Myc。在其他實施例中，可使用5、6或7個選自SOKMNLT；SOX2、OCT4(POU5F1)、KLF4、MYC、NANOG、LIN28、及SV40L T抗原之重新編程因子。通常，此等重新編程因子基因提供於諸如在此項技術中已知並且可購得之游離基因載體上。
通常，如在此項技術中已知，藉由如本文描述瞬時表現重新編程因子，iPSC自非多能細胞諸如但不限於血細胞、纖維母細胞等產生。
一旦產生低免疫原性多能幹細胞，其可保持如已知用於保持iPSC之未分化狀態。例如，細胞可使用防止分化及保持多能性之培養基來在基質膠上培養。另外，其可在保持多能性之條件下，處於培養基中。 B. 原代及/或分化細胞之工程化
所提供之方法可用於使諸如但不限於多能幹細胞、其分化細胞、原代T細胞、及其類似細胞之細胞中之一或多個基因失活或消除。在一些實施例中，工程化細胞包含減少或消除MHC I類複合物之任何組分及/或MHC I類複合物之任何組分之表面表現的遺傳修飾。在一些實施例中，工程化細胞包含編碼B2M之基因之遺傳修飾。在一些實施例中，工程化細胞包含編碼CIITA之基因之遺傳修飾。在一些實施例中，工程化細胞包含編碼NLRC5之基因之遺傳修飾。在一些實施例中，工程化細胞包含編碼細胞毒性T-淋巴球相關蛋白4 (CTLA4)之基因之遺傳修飾。在一些實施例中，工程化細胞包含編碼計畫性細胞死亡1 (PD1)之基因之遺傳修飾。遺傳修飾T細胞之詳細說明發現於例如WO2016160721中，揭示內容全部併入本文，包括序列表、表、及圖式。
在一些實施例中，使用稀少切割核酸內切酶(例如，CRISPR/Cas、TALEN、鋅指核酸酶、兆鹼基大範圍核酸酶、及歸巢核酸內切酶系統)之基因組編輯技術亦用於減少或消除人類幹細胞中之關鍵免疫基因之表現(例如，藉由使關鍵免疫基因之基因組DNA缺失)。在某些實施例中，基因組編輯技術或其他基因調節技術用於將耐受性誘導因子插入人類細胞中，使得其及由此製備之分化細胞成為低免疫原性(或減少免疫原性)細胞。因此，低免疫原性細胞具有減少或消除之MHC I及/或MHC II表現。在一些實施例中，細胞在接受者受試者中為非免疫原性的(例如，不誘導免疫反應)。在某些實施例中，細胞在接受者受試者中具有減少之免疫原性(例如，降低誘導免疫反應之可能性)。
基因組編輯技術實現所需基因座位點處之雙鏈DNA斷裂。此等受控雙鏈斷裂促進特定基因座位點處之同源重組。此方法著重於使用核酸內切酶來靶向諸如染色體之核酸分子之特定序列，該等核酸內切酶識別並且結合至序列並且誘導核酸分子中之雙鏈斷裂。雙鏈斷裂藉由易於出錯的非同源末端連接(NHEJ；non-homologous end-joining)或同源重組(HR；homologous recombination)來修復。
除非特別指出相反的情況，特定實施例之實踐使用熟習此項技術者技能內之化學、生化學、有機化學、分子生物學、微生物學、重組DNA技術、遺傳學、免疫學、及細胞生物學的習知方法，許多方法出於說明目的於下文描述。此類技術在文獻中有充分說明。參見例如Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版, 2001); Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, 1989)；Maniatis等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)；Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, 2008年七月更新)；Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, 第I & II卷 (IRL Press, Oxford, 1985)；Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992)；Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins編, 1984)；Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober編, 1991)；Annual Review of Immunology；以及諸如Advances in Immunology之期刊中之專著。
在一些實施例中，稀少切割內切核酸酶以編碼稀少切割內切核酸酶之核酸形式來引入含有標靶多核苷酸序列之細胞中。將核酸引入細胞中之方法可藉由任何合適技術達成。合適技術包括磷酸鈣或脂質介導轉染、電穿孔、及使用病毒載體之轉導或感染。在一些實施例中，核酸包含DNA。在一些實施例中，核酸包含如本文描述之經修飾DNA。在一些實施例中，核酸包含mRNA。在一些實施例中，核酸包含如本文描述之經修飾mRNA，(例如，合成、修飾mRNA)。
本發明涵蓋以熟習此項技術者使用CRISPR/Cas系統可利用之任何方式來改變標靶多核苷酸序列。可使用能夠改變細胞中之標靶多核苷酸序列之任何CRISPR/Cas系統。此CRISPR-Cas系統可使用各種Cas蛋白(Haft等人.PLoS Comput Biol.; 2005; 1(6)e60)。允許CRISPR/Cas系統改變細胞中之標靶多核苷酸序列之此類Cas蛋白之分子機制包括RNA結合蛋白、核酸內切酶及核酸外切酶、解旋酶、及聚合酶。在一些實施例中，CRISPR/Cas系統為CRISPR I型系統。在一些實施例中，CRISPR/Cas系統為CRISPR II型系統。在一些實施例中，CRISPR/Cas系統為CRISPR V型系統。
CRISPR/Cas系統通常包含至少兩個組分：一或多個引導RNA(gRNA；guide RNA)及Cas蛋白。Cas蛋白為將DSB引入靶位點中之核酸酶。CRISPR-Cas系統分成兩個主要類別：類別1系統使用多個Cas蛋白之複合物來使核酸降級；類別2系統使用單一大Cas蛋白用於相同目的。等級1劃分成類型I、III、及IV；類別2劃分成類型II、V、及VI。適於基因編輯應用之不同Cas蛋白包括但不限於Cas3、Cas4、Cas5、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas12、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f(C2c10)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12k(C2c5)、Cas13、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、C2c4、C2c8、C2c9、Cmr5、Cse1、Cse2、Csf1、Csm2、Csn2、Csx10、Csx11、Csy1、Csy2、Csy3、及Mad7。參見例如Jinek等人, Science(2012) 337 (6096):816-821；Dang等人, Genome Biology(2015) 16:280；Ran等人, Nature(2015) 520:186-191；Zetsche等人, Cell(2015) 163:759-771；Strecker等人, Nature Comm. (2019) 10:212；Yan等人, Science(2019) 363:88-91。最廣泛使用之Cas9為II型Cas蛋白並且本文描述為示例性的。此等Cas蛋白可來源於不同源物種。例如，Cas9可衍生自 化膿性鏈球菌 (S. pyogenes)或 金黃色葡萄球菌 (S. aureus)。
在原始微生物基因組中，II型CRISPR系統將侵入DNA之序列併入被編碼為宿主基因組內之陣列的CRISPR重複序列之間。來自CRISPR重複陣列之轉錄物被處理成CRISPR RNA(crRNA)，各自容納自侵入DNA轉錄之可變序列，被稱為「原型間隔物」序列，以及CRISPR重複序列之一部分。各crRNA與第二反式活化CRISPR RNA(tracrRNA)雜交，並且此等兩個RNA與Cas9核酸酶形成複合物。crRNA之原型間隔物編碼部分引導Cas9複合物裂解互補標靶DNA序列，限制條件為其與被稱為「原型間隔物相鄰模體」(PAM；protospacer adjacent motif)之較短序列相鄰。
雖然前述描述著重於Cas9核酸酶，應瞭解存在利用gRNA之其他RNA引導核酸酶，該等核酸酶在某些方面不同於迄今為止所描述之彼等核酸酶。例如，Cpf1(來自普雷沃氏菌及弗朗西斯氏菌1之CRISPR；亦稱為Cas12a)為僅需要crRNA並且不需要tracrRNA來起作用之RNA引導核酸酶。
自從其發現以來，CRISPR系統經調適以便在自細菌至包括人類細胞之真核細胞的廣泛範圍之細胞及生物體中誘導序列特異性DSB及靶向基因組編輯。在其基因編輯應用中之用途中，人工設計、合成之gRNA已替代原始crRNA:tracrRNA複合物，包括在某些實施例中經由單一gRNA。例如，gRNA可為由crRNA、四環、及tracrRNA組成之單一引導RNA(sgRNA；single guide RNA)。crRNA通常包含經使用者設計以便識別所關注之標靶DNA的互補區域(亦被稱為間隔物，通常約20個核苷酸長度)。tracrRNA序列包含用於Cas核酸酶結合之支架區域。crRNA序列及tracrRNA序列藉由四環來連接並且各自具有較短重複序列以便彼此雜交，由此產生嵌合sgRNA。可藉由僅改變存在於gRNA中之間隔物或互補區域序列來改變Cas核酸酶之基因組標靶。互補區域經由標準RNA-DNA互補鹼基配對規則來將Cas核酸酶引導至標靶DNA位點。
為了使Cas核酸酶發揮作用，必須在基因組DNA中之標靶序列直接下游存在PAM。藉由Cas蛋白來識別PAM被視為使相鄰基因組序列去穩定，允許藉由gRNA來訊問該序列並且當存在匹配序列時，導致gRNA-DNA配對。PAM之特異性序列取決於Cas基因之種類而變化。例如，衍生自 化膿性鏈球菌之最常用Cas9核酸酶識別5’-NGG-3’之PAM序列或在不太有效速率下，識別5’-NAG-3’，其中「N」可為任何核苷酸。具有替代PAM之其他Cas核酸酶變異體具有亦得以表徵並且成功用於基因組編輯，該等變異體概述於下表17中。 表17. 示例性Cas核酸酶變異體及其PAM序列
CRISPR 核酸酶 來源生物體 PAM 序列 (5’→3’)
SpCas9 化膿性鏈球菌 (Streptococcus pyogenes) ngg或nag
SaCas9 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ngrrt或ngrrn
NmeCas9 腦膜炎奈瑟氏菌 (Neisseria meningitides) nnnngatt
CjCas9 空腸彎曲桿菌 (Campylobacter jejuni) nnnnryac
StCas9 嗜熱鏈球菌 (Streptococcus thermophiles) nnagaaw
TdCas9 齒垢密螺旋體 (Treponema denticola) naaaac
LbCas12a (Cpf1) 毛螺科菌 (Lachnospiraceae bacterium) tttv
AsCas12a (Cpf1) 胺基酸球菌屬 (Acidaminococcus sp.) tttv
AacCas12b 嗜酸脂環桿菌 (Alicyclobacillus acidiphilus) ttn
BhCas12b v4 久志桿菌 (Bacillus hisashii) attn、tttn、或gttn
r = a或g；y = c或t；w = a或t；v = a或c或g；n = 任何鹼基
在一些實施例中，Cas核酸酶可包含一或多個突變以便改變其活性、特異性、識別、及/或其他特性。例如，Cas核酸酶可具有一或多個突變，該或該等突變改變其減輕脫靶效應的保真性(例如，SpCas9之eSpCas9、SpCas9-HF1、HypaSpCas9、HeFSpCas9、及evoSpCas9高保真變異體)。對於另一個實例，Cas核酸酶可具有改變其PAM特異性之一或多個突變。
在一些實施例中，提供具有藉由如所描述之任何基因編輯系統來修飾之基因組基因座的宿主細胞或其組合物。在一些實施例中，遺傳修飾藉由使用選自由以下組成之群之定點核酸酶：Cas3、Cas4、Cas5、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas12、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f(C2c10)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12k(C2c5)、Cas13、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、C2c4、C2c8、C2c9、Cmr5、Cse1、Cse2、Csf1、Csm2、Csn2、Csx10、Csx11、Csy1、Csy2、Csy3、Mad7、鋅指核酸酶(ZFN；zinc finger nuclease)、轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN；transcription activator-like effector nuclease)、兆鹼基大範圍核酸酶、及CRISPR相關轉座酶。在某些此等實施例中，經修飾之基因組基因座為B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRBC基因座、或安全港基因座。安全港基因座之非限制性實例包括但不限於AAVS1、ABO、CCR5、CLYBL、CXCR4、F3、FUT1、HMGB1、KDM5D、LRP1、MICA、MICB、RHD、ROSA26、及SHS231基因座位。
用於CRISPR編輯中之gRNA包含crRNA序列，該序列進而包含識別並且結合所關注之互補標靶DNA的互補區域(亦被稱為間隔物)。間隔物或互補區域之長度通常在15與30個核苷酸之間，通常約20個核苷酸長度，但是基於特定CRISPR/Cas系統之要求來變化。在某些實施例中，間隔物或互補區域與標靶DNA序列完全互補。在其他實施例中，間隔物與標靶DNA序列部分互補，例如至少80%、85%、90%、95%、98%、或99%互補。
在某些實施例中，本文提供之gRNA進一步包含tracrRNA序列，該序列包含結合至核酸酶之支架區域。tracrRNA之長度及/或序列可取決於用於編輯之特定核酸酶而變化。在某些實施例中，藉由gRNA之核酸酶結合不需要tracrRNA序列。在其中gRNA包含tracrRNA的實施例中，crRNA序列可進一步包含用於與tracrRNA之互補序列雜交之重複區域。
在一些實施例中，本文提供之gRNA包含呈兩個單獨分子之兩個或兩個以上gRNA分子，例如，crRNA及tracrRNA。在其他實施例中，gRNA為單一引導RNA(sgRNA)，包括在單一RNA分子上包含crRNA及tracrRNA的sgRNA。在某些此等實施例中，crRNA及tracrRNA藉由間插四環來連接。
在一些實施例中，一個gRNA可與用於所關注之基因座位之靶向編輯的定點核酸酶結合使用。在其他實施例中，靶向所關注之同一基因座位之兩個或兩個以上gRNA可與定點核酸酶結合使用。
在一些實施例中，與同時需要crRNA及tracrRNA之各種常見Cas核酸酶，包括Cas9及Cas12b(C2c1)一起使用的示例性gRNA(例如，sgRNA)提供於表18中。參見例如Jinek等人, Science(2012) 337 (6096):816-821；Dang等人, Genome Biology(2015) 16:280；Ran等人, Nature(2015) 520:186-191；Strecker等人, Nature Comm. (2019) 10:212。對於各示例性gRNA，示出gRNA之不同部分之序列，包括互補區域或間隔物、crRNA重複區域、四環、及tracrRNA。在一些實施例中，gRNA包含SEQ ID NO:94-97列出之核苷酸序列之全部或部分。在一些實施例中，gRNA包含SEQ ID NO:98-101列出之核苷酸序列之全部或部分。在一些實施例中，gRNA包含SEQ ID NO:102-105列出之核苷酸序列之全部或部分。在一些實施例中，gRNA包含SEQ ID NO:106-109列出之核苷酸序列之全部或部分。
在一些實施例中，gRNA包含crRNA重複區域，該重複區域包含SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:103、或SEQ ID NO:108列出之核苷酸序列、由該核苷酸序列組成、或基本上由該核苷酸序列組成。在一些實施例中，gRNA包含crRNA重複區域，該重複區域包含SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:107列出之核苷酸序列、由該核苷酸序列組成、或基本上由該核苷酸序列組成。在一些實施例中，gRNA包含crRNA重複區域，該重複區域包含SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:105、或SEQ ID NO:106列出之核苷酸序列、由該核苷酸序列組成、或基本上由該核苷酸序列組成。 表18. CRISPR/Cas之示例性gRNA結構及序列
SEQ ID NO: 序列 (5’→3’) 描述
94 nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 示例性 spCas9 1 互補區(間隔物)
95 guuuuagagcua 示例性 spCas9 1 crRNA 重複區
96 gaaa 示例性 spCas9 1 四環
97 uagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuu 示例性 spCas9 1 tracrRNA
98 nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 示例性 spCas9 2 互補區(間隔物)
99 guuusagagcuaugcug 示例性 spCas9 2 crRNA 重複區
100 gaaa 示例性 spCas9 2 四環
101 cagcauagcaaguusaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuu 示例性 spCas9 2 tracrRNA
102 nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 示例性 saCas9 互補區(間隔物)
103 guuuuaguacucug 示例性 saCas9 crRNA 重複區
104 gaaa 示例性 saCas9 四環
105 cagaaucuacuaaaacaaggcaaaaugccguguuuaucucgucaacuuguuggcgagauuuuuu 示例性 saCas9 tracrRNA
106 gucgucuauaggacggcgaggacaacgggaagugccaaugugcucuuuccaagagcaaacaccccguuggcuucaagaugaccgcucg 示例性 AkCas12b tracrRNA
107 aaaa 示例性 AkCas12b 四環
108 cgagcggucugagaaguggcacu 示例性 AkCas12b crRNA 重複區
109 nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 示例性 AkCas12b 互補區(間隔物)
s = c或g；n = 任何鹼基
在一些實施例中，gRNA包含對於所關注之標靶基因座位具有特異性的互補區域，例如，B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRBC基因座、或選自由以下組成之群的安全港基因座：AAVS1、ABO、CCR5、CLYBL、CXCR4、F3、FUT1、HMGB1、KDM5D、LRP1、MICA、MICB、RHD、ROSA26、及SHS231基因座位。互補區域可結合標靶基因座位之任何區域中之序列，包括例如CDS、外顯子、內含子、橫跨外顯子之一部分及相鄰內含子之一部分的序列、或調控區域(例如，啟動子、增強子)。當標靶序列為CDS、外顯子、內含子、或橫跨外顯子及內含子之部分之序列時，CDS、外顯子、內含子，或外顯子/內含子邊界可根據標靶基因之任何接合變異體來定義。在一些實施例中，藉由gRNA來靶向之基因組基因座位於如所描述之任何基因座或其區域之4000 bp、3500 bp、3000 bp、2500 bp、2000 bp、1500 bp、1000 bp、或500 bp內。本文進一步提供包含一或多種本文提供之gRNA及Cas蛋白或編碼Cas蛋白之核苷酸序列的組合物。在某些此等實施例中，一或多種gRNA及編碼Cas蛋白之核苷酸序列包含於載體，例如，病毒載體中。
在一些實施例中，gRNA在本文中用於定點插入包含識別AAVS1中之標靶序列之互補區域的轉殖基因。在某些此等實施例中，標靶序列位於AAVS1之內含子1中。AAVS1位於染色體19：55,090,918-55,117,637反向鏈處，並且AAVS1內含子1(基於轉錄物ENSG00000125503)位於染色體19：55,117,222-55,112,796反向鏈處。在某些實施例中，gRNA靶向位於染色體19: 55,117,222-55,112,796之任何位置處之位點之4000 bp內、3500 bp內、3000 bp內、2500 bp內、2000 bp內、1500 bp內、1000 bp內、或 500 bp內之基因組基因座。在某些實施例中，gRNA靶向位於染色體19: 55,115,674之4000 bp內、3500 bp內、3000 bp內、2500 bp內、2000 bp內、1500 bp內、1000 bp內、或500 bp內之基因組基因座。在某些實施例中，gRNA被組配來在染色體19: 55,115,674處，或在染色體19: 55,115,674之5、10、15、20、30、40、或50個核苷酸內之位置處產生切割位點。在某些實施例中，gRNA為在Li等人，Nat. Methods 16:866-869 (2019)中所描述之GET000046，亦稱為「sgAAVS1-1」。此gRNA包含互補區域，該互補區域包含SEQ ID NO:110列出之核酸序列、由該序列組成、或基本上由該序列組成並且靶向AAVS1(亦稱為PPP1R12C)之內含子1。
在一些實施例中，gRNA在本文中用於定點插入包含識別CLYBL中之標靶序列之互補區域的轉殖基因。在某些此等實施例中，標靶序列位於CLYBL之內含子2中。CLYBL位於染色體13: 99,606,669-99,897,134前向鏈處，並且CLYBL內含子2 (基於轉錄物ENST00000376355.7)位於染色體13: 99,773,011-99,858,860前向鏈處。在某些實施例中，gRNA靶向位於染色體13: 99,773,011-99,858,860之任何位置處之位點之4000 bp內、3500 bp內、3000 bp內、2500 bp內、2000 bp內、1500 bp內、1000 bp內、或 500 bp內之基因組基因座。在某些實施例中，gRNA靶向位於染色體13: 99,822,980之4000 bp內、3500 bp內、3000 bp內、2500 bp內、2000 bp內、1500 bp內、1000 bp內、或500 bp內之基因組基因座。在某些實施例中，gRNA被組配來在染色體13: 99,822,980處，或在染色體13: 99,822,980之5、10、15、20、30、40、或50個核苷酸內之位置處產生切割位點。在某些實施例中，gRNA為包含互補區域之GET000047，該互補區域包含SEQ ID NO:111列出之核酸序列、由該序列組成、或基本上由該序列組成並且靶向CLYBL之內含子2。靶位點類似於如Cerbini等人，PLoS One, 10(1): e0116032 (2015)所描述之TALEN之靶位點。
在一些實施例中，gRNA在本文中用於定點插入包含識別CCR5中之標靶序列之互補區域的轉殖基因。在某些此等實施例中，標靶序列位於CCR5之外顯子3中。CCR5位於染色體3: 46,370,854-46,376,206前向鏈處，及CCR5外顯子3 (基於轉錄物ENST00000292303.4)位於染色體3: 46,372,892-46,376,206前向鏈處。在某些實施例中，gRNA靶向位於染色體3: 46,372,892-46,376,206之任何位置處之位點之4000 bp內、3500 bp內、3000 bp內、2500 bp內、2000 bp內、1500 bp內、1000 bp內、或 500 bp內之基因組基因座。在某些實施例中，gRNA靶向位於染色體3: 46,373,180之4000 bp內、3500 bp內、3000 bp內、2500 bp內、2000 bp內、1500 bp內、1000 bp內、或500 bp內之基因組基因座。在某些實施例中，gRNA被組配來在染色體3: 46,373,180處，或在染色體3: 46,373,180之5、10、15、20、30、40、或50個核苷酸內之位置處產生切割位點。在某些實施例中，gRNA為在Mandal等人, Cell Stem Cell 15:643-652 (2014)中所描述之GET000048，亦稱為「crCCR5_D」。此gRNA包含互補區域，該互補區域包含SEQ ID NO:112列出之核酸序列、由該序列組成、或基本上由該序列組成並且靶向CCR5之外顯子3(在Ensembl基因組資料庫中替代地標注為外顯子2)。參見Gomez-Ospina等人, Nat. Comm. 10(1):4045 (2019)。
在本文使用之gRNA之某些實施例中，表19列出之互補區域序列中之一或多個胸腺嘧啶經尿嘧啶取代。 表19. 示例性gRNA互補區域序列
SEQ ID NO: 核酸序列 (5’→3’) 描述
110 accccacagtggggccacta GET000046 引導
111 tgttggaaggatgaggaaat GET000047 引導
112 tcactatgctgccgcccagt GET000048 引導
在一些實施例中，提供鑑別用於如所描述之定點基因編輯方法中之新基因座及/或gRNA序列的方法。例如，對於CRISPR/Cas系統，當特定基因座(例如，安全港基因座)之現有gRNA已知時，藉由針對通常在整個基因組中約每100個鹼基對(bp)出現之PAM序列，掃描基因座之任一側上之側接區域，「尺蠖蠕動」方法可用於鑑別用於靶向插入轉殖基因之額外基因座。PAM序列取決於所使用之特定Cas核酸酶，因為不同核酸酶通常具有不同對應PAM序列。基因座之任一側上之側接區域可為約500至4000 bp之間長，例如，約500 bp、約1000 bp、約1500 bp、約2000 bp、約2500 bp、約3000 bp、約3500 bp、或約4000 bp長。當在搜尋範圍內鑑別PAM序列時，可根據彼基因座之序列來設計新引導以便用於定點插入轉殖基因。雖然CRISPR/Cas系統描述為示例性的，但是如所描述之任何基因編輯方法可用於鑑別新基因座之此方法中，包括使用ZFN、TALEN、兆鹼基大範圍核酸酶、及轉座酶之方法。
在一些實施例中，gRNA之活性、穩定性、及/或其他特性可經由併入化學及/或序列修飾來改變。作為一實例，瞬時表現或遞送之核酸可易於藉由例如細胞核酸酶來降級。因此，本文所述gRNA可含有一或多個向核酸酶引入穩定性的經修飾核苷或核苷酸。雖然不受特定理論束縛，但是咸信本文所述某些經修飾gRNA在引入細胞，尤其本技術之細胞之群體中時可展現減少之先天免疫反應。如本文使用，術語「先天性免疫反應」包括對外源核酸，包括單鏈核酸(通常來源於病毒或細菌)之細胞反應，該反應涉及誘導細胞因子表現及釋放(具體為干擾素)以及細胞死亡。改良穩定性、增加核酸酶抗性、及/或減少免疫反應的gRNA之其他常見化學修飾包括2’-O-甲基修飾、2’-氟修飾、2’-O-甲基硫代磷酸酯鍵修飾、及2’-O-甲基3’thioPACE修飾。
一種常見3’末端修飾係添加包含一或多個(並且通常5-200個)腺嘌呤(A)殘基之聚腺苷酸束。聚腺苷酸束可包含於編碼gRNA之核酸序列中或可在化學合成期間，或在使用聚腺苷酸聚合酶(例如，大腸桿菌聚(A)聚合酶)活體外轉錄之後添加至gRNA。活體內聚腺苷酸束可經由使用聚腺苷酸化信號來添加至自DNA載體轉錄之序列。此類信號之實例提供於Maeder中。其他合適gRNA修飾包括不限於美國專利申請案第US 2017/0073674 A1號及國際公開案第WO 2017/165862 A1號所描述之修飾，該等文獻中之各者之整個內容以引用方式併入本文。
CRISPR/Cas系統可用於改變細胞中之任何標靶多核苷酸序列。熟習此項技術者容易認識到任何特定細胞中之待改變之合意標靶多核苷酸序列可對應於基因組序列之表現與病症相關或另外促進病原體進入細胞中之任何基因組序列。例如，細胞中之待改變之合意標靶多核苷酸序列可為與含有疾病相關單一多核苷酸多態性之基因組序列對應的多核苷酸序列。在此實例中，CRISPR/Cas系統可用於藉由將疾病相關SNP用野生型等位基因來置換而校正細胞中之疾病相關SNP。作為另一個實例，負責病原體進入細胞或增殖之標靶基因之多核苷酸序列可為缺失或插入之合適標靶以便干擾標靶基因之功能，從而防止病原體進入細胞或在細胞內部增殖。
在一些實施例中，標靶多核苷酸序列為基因組序列。在一些實施例中，標靶多核苷酸序列為人類基因組序列。在一些實施例中，標靶多核苷酸序列為哺乳動物基因組序列。在一些實施例中，標靶多核苷酸序列為脊椎動物基因組序列。
在一些實施例中，CRISPR/Cas系統包含Cas蛋白及至少一個至兩個能夠將Cas蛋白引導至標靶多核苷酸序列之標靶模體並且雜交至該模體的核糖核酸。如本文使用，「蛋白」及「多肽」可互換使用以指代藉由肽鍵來連接之一系列胺基酸殘基(亦即，胺基酸之聚合物)並且包括經修飾胺基酸(例如，磷酸化、糖化、醣化等)及胺基酸類似物。示例性多肽或蛋白包括基因產物、天然存在之蛋白、同源物、旁系同源物、片段及上述之其他等效物、變異體、及類似物。
在一些實施例中，Cas蛋白包含一或多個胺基酸取代或修飾。在一些實施例中，一或多個胺基酸取代包含保守胺基酸取代。在一些情況下，取代及/或修飾可預防或減少蛋白分解降級且/或延長細胞中之多肽之半衰期。在一些實施例中，Cas蛋白可包含肽鍵置換(例如，脲、硫脲、胺基甲酸酯、磺醯基脲等)。在一些實施例中，Cas蛋白可包含天然存在之胺基酸。在一些實施例中，Cas蛋白可包含替代胺基酸(例如，D-胺基酸、β-胺基酸、升半胱胺酸、磷酸絲胺酸等)。在一些實施例中，Cas蛋白可包含修飾以便包括部分(例如，聚乙二醇化、醣化、脂化、乙醯化、末端加帽等)。
在一些實施例中，Cas蛋白包含核心Cas蛋白。示例性Cas核心蛋白包括但不限於Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8及Cas9。在一些實施例中，Cas蛋白包含大腸桿菌亞型之Cas蛋白(亦稱為CASS2)。大腸桿菌亞型之示例性Cas蛋白包括但不限於Cse1、Cse2、Cse3、Cse4、及Cas5e。在一些實施例中，Cas蛋白包含Ypest亞型之Cas蛋白(亦稱為CASS3)。Ypest亞型之示例性Cas蛋白包括但不限於Csy1、Csy2、Csy3、及Csy4。在一些實施例中，Cas蛋白包含Nmeni亞型之Cas蛋白(亦稱為CASS4)。Nmeni亞型之示例性Cas蛋白包括但不限於Csn1及Csn2。在一些實施例中，Cas蛋白包含Dvulg亞型之Cas蛋白(亦稱為CASS1)。Dvulg亞型之示例性Cas蛋白包括Csd1、Csd2、及Cas5d。在一些實施例中，Cas蛋白包含Tneap亞型之Cas蛋白(亦稱為CASS7)。Tneap亞型之示例性Cas蛋白包括但不限於Cst1、Cst2、Cas5t。在一些實施例中，Cas蛋白包含Hmari亞型之Cas蛋白。Hmari亞型之示例性Cas蛋白包括但不限於Csh1、Csh2、及Cas5h。在一些實施例中，Cas蛋白包含Apern亞型之Cas蛋白(亦稱為CASS5)。Apern亞型之示例性Cas蛋白包括但不限於Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5、及Cas5a。在一些實施例中，Cas蛋白包含Mtube亞型之Cas蛋白(亦稱為CASS6)。Mtube亞型之示例性Cas蛋白包括但不限於Csm1、Csm2、Csm3、Csm4、及Csm5。在一些實施例中，Cas蛋白包含RAMP模組Cas蛋白。示例性RAMP模組Cas蛋白包括但不限於Cmr1、Cmr2、Cmr3、Cmr4、Cmr5、及Cmr6。
在一些實施例中，Cas蛋白包含本文所述Cas蛋白或其功能部分中之任一者。如本文使用，「功能部分」或「功能片段」係指肽或蛋白因子之一部分，該部分保留其與至少一個核糖核酸(例如，引導RNA(gRNA))複合並且裂解標靶多核苷酸序列之能力。在一些實施例中，功能部分包含選自包括以下各者之群之可操作連接Cas9蛋白功能域之組合：DNA結合域、至少一個RNA結合域、解旋酶域、及核酸內切酶域。在一些實施例中，功能部分包含選自包括以下各者之群之可操作連接Cpf1蛋白功能域之組合：DNA結合域、至少一個RNA結合域、解旋酶域、及核酸內切酶域。在一些實施例中，功能域形成複合物。在一些實施例中，Cas9蛋白之功能部分包含RuvC樣域之功能部分。在一些實施例中，Cas9蛋白之功能部分包含HNH核酸酶域之功能部分。在一些實施例中，Cpf1蛋白之功能部分包含RuvC樣域之功能部分。
在一些實施例中，外源Cas蛋白可以多肽形式來引入細胞中。在某些實施例中，Cas蛋白可偶聯至或融合至細胞穿透多肽或細胞穿透肽。如本文使用，「細胞穿透多肽」及「細胞穿透肽」分別係指促進分子吸收至細胞中之多肽或肽。細胞穿透多肽可含有可偵測標籤。
在某些實施例中，Cas蛋白可偶聯至或融合至帶電荷之蛋白(例如，其帶有正、負或總體中性電荷)。此鍵可為共價的。在一些實施例中，Cas蛋白可融合至帶超級正電荷之GFP以便顯著增加Cas蛋白穿透細胞之能力(Cronican等人ACS Chem Biol.; 2010; 5(8):747-52)。在某些實施例中，Cas蛋白可融合至蛋白轉導域(PTD；protein transduction domain)以便促進其進入細胞中。示例性PTD包括Tat、低聚精胺酸、及滲透素。在一些實施例中，Cas9蛋白包含融合至細胞穿透肽之Cas9多肽。在一些實施例中，Cas9蛋白包含融合至PTD之Cas9多肽。在一些實施例中，Cas9蛋白包含融合至tat域之Cas9多肽。在一些實施例中，Cas9蛋白包含融合至低聚精胺酸域之Cas9多肽。在一些實施例中，Cas9蛋白包含融合至滲透素域之Cas9多肽。在一些實施例中，Cas9蛋白包含融合至帶超級正電荷之GFP之Cas9多肽。
在一些實施例中，Cas多肽包含Cpf1(Cas12a)蛋白或其變異體。在一些實施例中，Cpf1(Cas12a)蛋白包含融合至細胞穿透肽之Cpf1多肽。在一些實施例中，Cpf1蛋白包含融合至PTD之Cpf1多肽。在一些實施例中，Cpf1蛋白包含融合至tat域之Cpf1多肽。在一些實施例中，Cpf1蛋白包含融合至低聚精胺酸域之Cpf1多肽。在一些實施例中，Cpf1蛋白包含融合至滲透素域之Cpf1多肽。在一些實施例中，Cpf1蛋白包含融合至帶超級正電荷之GFP之Cpf1多肽。Cpf1蛋白之詳細說明可發現於例如Safari等人, Cell & Bioscience, 2019; 9, 36; doi.org/10.1186/s13578-019-0298-7中。
在一些實施例中，Cas蛋白可以編碼Cas蛋白之核酸形式來引入含有標靶多核苷酸序列之細胞中。將核酸引入細胞中之方法可藉由任何合適技術達成。合適技術包括磷酸鈣或脂質介導轉染、電穿孔、及使用病毒載體之轉導或感染。在一些實施例中，核酸包含DNA。在一些實施例中，核酸包含如本文描述之經修飾DNA。在一些實施例中，核酸包含mRNA。在一些實施例中，核酸包含如本文描述之經修飾mRNA，(例如，合成、修飾mRNA)。
在一些實施例中，Cas蛋白與一個至兩個核糖核酸複合。在一些實施例中，Cas蛋白與兩個核糖核酸複合。在一些實施例中，Cas蛋白與一個核糖核酸複合。在一些實施例中，Cas蛋白藉由如本文描述之經修飾核酸(例如，合成、經修飾mRNA)來編碼。
本發明之方法涵蓋能夠將Cas蛋白引導至標靶多核苷酸序列之標靶模體並且雜交至該模體的任何核糖核酸之用途。在一些實施例中，核糖核酸中之至少一者包含tracrRNA。在一些實施例中，核糖核酸中之至少一者包含CRISPR RNA(crRNA)。在一些實施例中，單一核糖核酸包含將Cas蛋白引導至細胞中之標靶多核苷酸序列之標靶模體並且雜交至該標靶模體的引導RNA。在一些實施例中，核糖核酸中之至少一者包含將Cas蛋白引導至細胞中之標靶多核苷酸序列之標靶模體並且雜交至該標靶模體的引導RNA。在一些實施例中，一個至兩個核糖核酸中之兩者包含將Cas蛋白引導至細胞中之標靶多核苷酸序列之標靶模體並且雜交至該標靶模體的引導RNA。本發明之核糖核酸可被選擇來雜交至各種不同標靶模體，此舉取決於所使用之特定CRISPR/Cas系統、及標靶多核苷酸之序列，如本熟習此項技術者瞭解。一個至兩個核糖核酸亦可被選擇來最大限度地減少與除了標靶多核苷酸序列以外之核酸序列的雜交。在一些實施例中，一個至兩個核糖核酸雜交標靶模體，該標靶模體在與細胞中之所有其他基因組核苷酸序列比較時含有至少兩個失配。在一些實施例中，一個至兩個核糖核酸雜交標靶模體，該標靶模體在與細胞中之所有其他基因組核苷酸序列比較時含有至少一個失配。在一些實施例中，一個至兩個核糖核酸被設計來雜交至與藉由Cas蛋白識別之脫氧核糖核酸模體直接相鄰之標靶模體。在一些實施例中，一個至兩個核糖核酸中之各者被設計來雜交至與藉由Cas蛋白識別之脫氧核糖核酸模體直接相鄰之標靶模體，該等模體側接位於標靶模體之間之突變體等位基因。
在一些實施例中，一個至兩個核糖核酸中之各者包含將Cas蛋白引導至細胞中之標靶多核苷酸序列之標靶模體並且雜交至該標靶模體的引導RNA。
在一些實施例中，一個或兩個核糖核酸(例如，引導RNA)與標靶多核苷酸序列之同一鏈上之序列互補及/或雜交。在一些實施例中，一個或兩個核糖核酸(例如，引導RNA)與標靶多核苷酸序列之相反鏈上之序列互補及/或雜交。在一些實施例中，一個或兩個核糖核酸(例如，引導RNA)與標靶多核苷酸序列之相反鏈上之序列不互補及/或不雜交。在一些實施例中，一個或兩個核糖核酸(例如，引導RNA)與標靶多核苷酸序列之重疊標靶模體互補及/或雜交。在一些實施例中，一個或兩個核糖核酸(例如，引導RNA)與標靶多核苷酸序列之偏移標靶模體互補及/或雜交。
在一些實施例中，編碼Cas蛋白之核酸及編碼至少一個至兩個核糖核酸之核酸經由病毒轉導(例如，慢病毒轉導)來引入細胞中。在一些實施例中，Cas蛋白與1-2個核糖核酸複合。在一些實施例中，Cas蛋白與兩個核糖核酸複合。在一些實施例中，Cas蛋白與一個核糖核酸複合。在一些實施例中，Cas蛋白藉由如本文描述之經修飾核酸(例如，合成、經修飾mRNA)來編碼。
適用於基於CRISPR/Cas之靶向輸送本文所述基因之示例性gRNA序列提供於下表20中。序列可發現於2016年5月9日提交之WO2016/183041中，包括表、附錄、及序列表之揭示內容以全文引用方式併入本文。 表20. 適用於靶向輸送基因之示例性gRNA序列
基因 名稱 WO2016183041中之SEQ ID NO WO2016183041中之表/附錄編號
HLA-A SEQ ID NOs: 2-1418 Table 8, 附錄 1
HLA-B SEQ ID NOs: 1419-3277 Table 9, 附錄 2
HLA-C SEQ ID NOS:3278-5183 Table 10, 附錄 3
RFX-ANK SEQ ID NOs: 95636-102318 Table 11, 附錄 4
NFY-A SEQ ID NOs: 102319-121796 Table 13, 附錄 6
RFX5 SEQ ID NOs: 85645-90115 Table 16, 附錄 9
RFX-AP SEQ ID NOs: 90116-95635 Table 17, 附錄 10
NFY-B SEQ ID NOs: 121797-135112 Table 20, 附錄 13
NFY-C SEQ ID NOs: 135113-176601 Table 22, 附錄 15
IRF1 SEQ ID NOs: 176602-182813 Table 23, 附錄 16
TAP1 SEQ ID NOs: 182814-188371 Table 24, 附錄 17
CIITA SEQ ID NOS:5184-36352 Table 12, 附錄 5
B2M SEQ ID NOS:81240-85644 Table 15, 附錄 8
NLRC5 SEQ ID NOS:36353-81239 Table 14, 附錄 7
CD47 SEQ ID NOS:200784-231885 Table 29, 附錄 22
HLA-E SEQ ID NOS:189859-193183 Table 19, 附錄 12
HLA-F SEQ ID NOS:688808-699754 Table 45, 附錄 38
HLA-G SEQ ID NOS:188372-189858 Table 18, 附錄 11
PD-L1 SEQ ID NOS:193184-200783 Table 21, 附錄 14
CIITA SEQ ID NOS:5184-36352 Table 12, 附錄 5
B2M SEQ ID NOS:81240-85644 Table 15, 附錄 8
NLRC5 SEQ ID NOS:36353-81239 Table 14, 附錄 7
CD47 SEQ ID NOS:200784-231885 Table 29, 附錄 22
HLA-C SEQ ID NOS:3278-5183 Table 10, 附錄 3
HLA-E SEQ ID NOS:189859-193183 Table 19, 附錄 12
HLA-F SEQ ID NOS:688808-699754 Table 45, 附錄 38
HLA-G SEQ ID NOS:188372-189858 Table 18, 附錄 11
PD-L1 SEQ ID NOS:193184-200783 Table 21, 附錄 14
在一些實施例中，所描述之細胞使用轉錄活化因子樣效應核酸(TALEN)方法來產生。
「TALE-核酸酶」(TALEN)意指含有通常衍生自轉錄活化因子樣效應物(TALE；Transcription Activator Like Effector)之核酸結合域及裂解核酸標靶序列之一個核酸酶催化域的融合蛋白。催化域較佳為核酸酶域並且更佳具有核酸內切酶活性之域，如例如I-TevI、ColE7、NucA及Fok-I。在一個特定實施例中，TALE域可融合至兆鹼基大範圍核酸酶如例如I-CreI及I-OnuI或其功能變異體。在一個更佳實施例中，該核酸酶為單體TALE-核酸酶。單體TALE-核酸酶為不需要二聚化以便特異性識別及裂解之TALE-核酸酶，諸如在WO2012138927中描述的工程化TAL重複序列與I-TevI之催化域之融合物。轉錄活化因子樣效應物(TALE)為來自細菌物種黃單孢菌屬之包含複數個重複序列的蛋白，各重複序列包含在位置12及13中之二殘基(RVD)，該等二殘基對於核酸靶向序列之各核苷酸鹼基具有特異性。具有類似模組化鹼基對鹼基核酸結合性質之結合域(MBBBD；Binding domains with similar modular base-per-base nucleic acid binding properties)亦可衍生自最近由申請者在不同細菌物種中發現之新模組化蛋白。新模組化蛋白具有比TAL重複序列顯示更大序列可變性之優點。較佳地，與識別不同核苷酸相關之RVD為用於識別C之HD，用於識別T之NG，用於識別A之NI，用於識別G或A之NN，識別用於A、C、G或T之NS，用於識別T之HG，用於識別T之IG，用於識別G之NK，用於識別C之HA，用於識別C之ND，用於識別C之HI，用於識別G之HN，用於識別G之NA，識別用於G或A之SN及用於識別T之YG，用於識別A之TL，用於識別A或G之VT及用於識別A之SW。在另一實施例中，關鍵胺基酸12及13可突變成其他胺基酸殘基以便調節其對於核苷酸A、T、C及G之特異性並且尤其增強此特異性。TALEN套組係商業上出售的。
在一些實施例中，細胞使用鋅指核酸酶(ZFN)來處理。「鋅指結合蛋白」為由於經由鋅離子之配位使蛋白結構穩定化而較佳以序列特異性方式結合DNA、RNA及/或蛋白之蛋白或多肽。術語鋅指結合蛋白經常縮寫為鋅指蛋白或ZFP。個別DNA結合域通常被稱為「指狀物」。ZFP具有最少一個指狀物、通常兩個指狀物、三個指狀物、或六個指狀物。各指狀物結合兩個至四個DNA鹼基對，通常三個或四個DNA鹼基對。ZFP結合至被稱為靶位點或標靶區段之核酸序列。各指狀物通常包含大約30個胺基酸、鋅螯合、DNA結合子區域。研究證明此類別之單一鋅指由含有與鋅配位之兩個不變組胺酸殘基的α螺旋以及單一β轉角之兩個半胱胺酸殘基組成(參見，例如，Berg & Shi, Science 271:1081-1085 (1996))。
在一些實施例中，所揭示之細胞使用歸巢核酸內切酶來產生。此類歸巢核酸內切酶為此項技術熟知的(B. L. Stoddard, QRev Biophys, 2005;38(1):49-95 2005)。歸巢核酸內切酶識別DNA標靶序列並且產生單鏈或雙鏈斷裂。歸巢核酸內切酶含有高度特異性、識別DNA標靶位點，長度在12至45個鹼基對(bp；base pair)範圍內，通常長度在14至40個bp範圍內。歸巢核酸內切酶可例如對應於LAGLIDADG核酸內切酶、HNH核酸內切酶、或GIY-YIG核酸內切酶。根據本發明之較佳歸巢核酸內切酶可為I-CreI變異體。
在一些實施例中，所描述之細胞使用兆鹼基大範圍核酸酶來產生。兆鹼基大範圍核酸酶按照定義為識別較大序列之序列特異性核酸內切酶(Chevalier, B.S. and B. L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757-3774)。它們可裂解活細胞中之獨特位點，由此在裂解位點附近增強基因靶向輸送1000倍或更多(Puchta等人，Nucleic Acids Res., 1993, 21, 5034-5040; Rouet等人, Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 8096-8106; Choulika等人, Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 1968-1973; Puchta等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 5055-5060; Sargent等人, Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 267-77; Donoho等人, Mol. Cell. Biol, 1998, 18, 4070-4078; Elliott等人, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 93-101; Cohen-Tannoudji等人, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 1444-1448)。
在一些實施例中，本文所述細胞使用RNA緘默或RNA干擾(RNAi；RNA interference)來產生以便敲低(例如，減少、消除、或抑制)多肽諸如免疫抑制因子、致耐受性因子、及其類似物之表現。可用RNAi方法包括利用合成RNAi分子、短干擾RNA(siRNA；short interfering RNA)、PIWI-相互作用NRA(piRNA)、短髮夾RNA(shRNA；short hairpin RNA)、微小RNA(miRNA；microRNA)之方法，及熟習此項技術者公認之其他瞬時敲低方法。用於RNAi包括序列特異性shRNA、siRNA、miRNA及其類似物之試劑為可購得的。例如，藉由引入CIITA siRNA或將CIITA shRNA表現病毒轉導至細胞中，CIITA可在多能幹細胞中敲低。在一些實施例中，RNA干擾用於減少或抑制選自包括CIITA、B2M、及NLRC5之群之至少一者的表現。 1. 示例性表現構建體
為了將外源基因轉移至所關注之細胞中，使用熟知重組技術來產生如本文概述之重組核酸。適用於在靶細胞中外源表現多肽之許多載體為可利用的。載體可為游離基因，例如質體、病毒衍生載體諸如巨細胞病毒、腺病毒等，或可經由同源重組或隨機整合來整合至靶細胞基因組中，例如逆轉錄病毒衍生載體諸如MMLV、HIV-1、ALV、及其類似載體。在幹細胞之一些實施例中，慢病毒載體為較佳的。
在某些實施例中，編碼免疫抑制因子之重組核酸可操作地連接至表現構建體中之一或多個調控核苷酸序列。調控核苷酸序列通常適合於待治療之宿主細胞及受試者。各種宿主細胞之許多類型合適表現載體及合適調控序列在此項技術中為已知的。通常，一或多個調控核苷酸序列可包括但不限於啟動子序列、前導或信號序列、核糖體結合位點、轉錄開始及終止序列、轉譯開始及終止序列、及增強子或活化子序列。亦涵蓋如在此項技術中已知之組成性或可誘導啟動子。啟動子可為天然存在之啟動子，或組合一個以上啟動子之要素的雜合啟動子。表現構建體可在游離基因諸如質體上存在於細胞中，或表現構建體可插入染色體中。在一個特定實施例中，表現載體包含允許選擇轉型宿主細胞之可選擇標記基因。某些實施例包括包含可操作地連接至至少一個調控序列之編碼變異體多肽之核苷酸序列的表現載體。在本文中使用之調控序列包括啟動子、增強子、及其他表現控制元件。在某些實施例中，表現載體針對待轉型之宿主細胞、需要表現之特定變異體多肽、載體之複製數、控制彼複製數之能力、或藉由載體編碼之任何其他蛋白諸如抗生素標誌物之表現的選擇來設計。
合適哺乳動物啟動子之實例包括例如以下基因之啟動子：倉鼠之泛素/S27a啟動子(WO 97/15664)、猿猴空泡病毒40(SV40)早期啟動子、腺病毒主要晚期啟動子、小鼠金屬硫蛋白-I啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV；Rous Sarcoma Virus)之長末端重複區域、小鼠乳瘤病毒啟動子(MMTV；mouse mammary tumor virus)、莫洛尼鼠科白血病病毒長末端重複區域、及人類巨細胞病毒(CMV)之早期啟動子。其他異源哺乳動物啟動子之實例為肌動蛋白、免疫球蛋白或熱休克啟動子。在另外的實施例中，用於哺乳動物宿主細胞中之啟動子可獲自病毒之基因組諸如多形瘤病毒、雞痘病毒(1989年7月5日公佈之UK 2,211,504)、牛乳頭瘤病毒、鳥類肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、肝炎-B病毒及猿猴病毒40(SV40)。在其他實施例中，使用異源哺乳動物啟動子。實例包括肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、及熱休克啟動子。SV40之早期及晚期啟動子便利地作為亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制片段獲得(Fiers等人，Nature, 273: 113-120 (1978))。人類巨細胞病毒之即刻早期啟動子便利地作為HindIII限制酶片段獲得(Greenaway等人, Gene, 18: 355-360 (1982))。前述參考全部以引用方式併入。
將本文所述多核苷酸引入細胞中之方法可藉由任何合適技術達成。合適技術包括磷酸鈣或脂質介導轉染、電穿孔、及使用病毒載體之轉導或感染。在一些實施例中，多核苷酸經由病毒轉導(例如，慢病毒轉導)來引入細胞中。
一旦改變，本文所述任何分子之表現之存在可使用已知技術諸如西方墨點法、ELISA檢定、FACS檢定、及其類似技術來分析。 2. 低免疫細胞
本文提供低免疫細胞，包括低免疫幹細胞、細胞分化幹細胞、或原代細胞(在本文中統稱為「HIP細胞；hypoimmune cell」)，該等細胞經工程化以便在作為同種異體細胞療法之部分，投與接受者受試者後，表現免疫調控蛋白並且逃避接受者宿主之免疫系統之排斥。在投與接受者受試者後，引入安全開關來調節此類細胞之活性為改良此等細胞療法之安全性的重要技術。
HIP細胞之關鍵特徵為其表現用於抑制植入細胞群體之宿主細胞免疫反應的免疫抑制因子。在一些實施例中，引入接受者受試者之細胞之低免疫性經由過度表現包括諸如CD47之低免疫性因子之免疫抑制分子、及補體抑制劑，伴隨著抑制或遺傳干擾HLA-I及HLA-II基因座來達成。此等修飾使細胞隱藏以避免負責清除感染、惡性或非自身細胞的接受者免疫系統之效應細胞，諸如T細胞、B細胞、NK細胞及巨噬細胞。隱藏細胞以逃避免疫系統允許同種異體細胞在身體中之存在及持久性。工程化細胞自身體中之受控移除對於患者安全而言為至關緊要的並且可藉由揭露來自免疫系統之細胞來達成。揭露充當安全開關並且可經由阻斷及/或干擾CD47-SIRPα軸或相互作用來達成。 C. 低免疫原性表型及保持多能性之檢定
一旦產生低免疫原性細胞或逃避免疫識別之細胞，可針對其免疫原性及/或保持多能性來對其進行分析，如WO2016183041、WO2018132783、及WO2018175390所描述。
在一些實施例中，低免疫原性使用如WO2018132783之第13圖及第15圖例示之許多技術來分析。此等技術包括移植至同種異體或異種宿主中並且監測逃避宿主免疫系統之低免疫原性多能細胞生長(例如畸胎瘤)。在一些情況下，低免疫原性細胞衍生物經轉導來表現螢光素酶並且可然後使用生物發光成像來跟蹤。類似地，宿主動物對於此類細胞之T細胞及/或B細胞反應經測試以便確認細胞不導致宿主動物之免疫反應。T細胞功能藉由Elispot、ELISA、FACS、PCR、或大量細胞計數法(CYTOF；mass cytometry)來評定。B細胞反應或抗體反應使用FACS或Luminex來評定。另外或替代地，細胞可針對其避免先天免疫反應例如NK細胞殺滅之能力來進行分析，如通常在WO2018132783之第14圖及第15圖中示出。
在一些實施例中，細胞之免疫原性使用熟習此項技術者公認之T細胞免疫檢定諸如T細胞增殖檢定、T細胞活化檢定、及T細胞殺滅檢定來評估。在一些情況下，T細胞增殖檢定包括用干擾素-γ預處理細胞並且將細胞與加標記T細胞共培養並且在預先選定之時間量之後，測定T細胞群體(或增殖T細胞群體)之存在。在一些情況下，T細胞活化檢定包含將T細胞與本文概述之細胞共培養並且測定T細胞中之T細胞活化標誌物之表現水準。
可執行活體內檢定以便評估本文概述之細胞之免疫原性。在一些實施例中，細胞之存活及免疫原性使用同種異體人源化免疫缺陷小鼠模型來測定。在一些情況下，將低免疫原性多能幹細胞移植至同種異體人源化NSG-SGM3小鼠中並且分析細胞排斥、細胞存活、及畸胎瘤形成。在一些情況下，經移植之低免疫原性多能幹細胞或其分化細胞在小鼠模型中展示長期存活。
測定細胞之免疫原性包括低免疫原性之額外技術描述於例如，Deuse等人, Nature Biotechnology, 2019, 37, 252-258及Han等人, Proc Natl Acad Sci USA, 2019, 116(21), 10441-10446中，包括圖式、圖例、及方法之描述的揭示內容全部以引用方式併入本文。
類似地，多能性之保持以許多方法來測試。在一個實施例中，多能性藉由某些多能性特異性因子之表現來分析，如通常本文描述並且在WO2018132783之第29圖中示出。另外或替代地，多能細胞分化成一或多種細胞類型，作為多能性之指示。
如熟習此項技術者瞭解，多能細胞中之MHC I功能(當細胞衍生自人類細胞時為HLA I)之成功減少可使用在此項技術中已知並且如下所述的技術來量測；例如，使用結合HLA複合物之經標記抗體的FACS技術；例如，使用結合至人類主要組織相容性HLA I類抗原之α鏈的商購HLA-A、B、C抗體。
另外，可測試細胞以便確認HLA I複合物不在細胞表面上表現。此可使用如以上論述之一或多種HLA細胞表面組分之抗體的FACS分析來檢定。
多能細胞或其衍生物中之MHC II功能(當細胞衍生自人類細胞時為HLA II)之成功減少可使用在此項技術中已知的技術諸如使用蛋白之抗體的蛋白質印跡、FACS技術、RT-PCR技術等來量測。
另外，可測試細胞以便確認HLA II複合物不在細胞表面上表現。另外，此檢定如在此項技術中已知(參見例如WO2018132783之第21圖)來進行並且通常使用西方墨點法或FACS分析、基於結合至人類HLA II類HLA-DR、DP及大多數DQ抗原之市售抗體來進行。
除了減少HLA I及II(或MHC I及II)以外，所揭示之細胞可具有對於巨噬細胞吞噬作用及NK細胞殺滅之減少之敏感性。咸信(不希望受理論束縛)所得細胞逃避免疫巨噬細胞及先天途徑係歸因於一或多個CD47轉殖基因之表現。 D. 幹細胞之分化
本發明提供可分化成不同細胞類型以便隨後移植至受試者中之多能細胞。如熟習此項技術者瞭解，分化方法取決於使用已知技術之所需細胞類型。細胞可在懸浮液中分化，然後置於凝膠基質形式，諸如基質膠、明膠、或纖維蛋白/凝血酶形式以便促進細胞存活。在一些情況下，分化如在此項技術中已知來檢定，通常藉由評估細胞特異性標誌物之存在。
在一些實施例中，多能細胞分化成肝細胞以便解決肝細胞功能損失或肝硬化。許多技術可用於使低免疫原性多能細胞分化成肝細胞；參見例如Pettinato等人, doi:10.1038/spre32888, Snykers等人, Methods Mol Biol698:305-314 (2011), Si-Tayeb等人, Hepatology51:297-305 (2010)及Asgari等人, Stem Cell Rev(:493-504 (2013)，該等文獻皆全部並且尤其針對分化方法及試劑來明確以引用方式併入本文。分化如在此項技術中已知來檢定，通常藉由評估相關肝細胞及/或特異性標誌物之存在，包括但不限於白蛋白、α胎蛋白、及纖維蛋白原。分化亦可在功能上量測，諸如氨之新陳代謝、LDL儲存及吸收、ICG吸收及釋放及糖原儲存。
在一些實施例中，多能細胞分化成β樣細胞或胰島類器官供移植以便解決I型糖尿病(T1DM；type I diabetes mellitus)。細胞系統為解決T1DM之有希望的方法，參見，例如，Ellis等人，doi/10.1038/nrgastro.2017.93，該文獻以引用方式併入本文。另外，Pagliuca等人報告β細胞自人類iPSC成功分化(參見doi/10.106/j.cell.2014.09.040，全部並且尤其針對其中概述的自人類多能幹細胞大規模產生功能性人類β細胞之方法及試劑以引用方式併入本文)。此外，Vegas等人示出自人類多能幹細胞產生人類β細胞，隨後囊封以避免宿主之免疫排斥；(doi:10.1038/nm.4030，全部並且尤其針對其中概述的自人類多能幹細胞大規模產生功能性人類β細胞之方法及試劑以引用方式併入本文)。
分化如在此項技術中已知來檢定，通常藉由評估相關β細胞或特異性標誌物之存在，包括但不限於胰島素。分化亦可在功能上量測，諸如量測葡萄糖代謝，通常參見Muraro等人，doi:10.1016/j.cels.2016.09.002，全部並且尤其針對其中概述之生物標誌物以引用方式併入本文。
在一些實施例中，多能細胞分化成視網膜色素上皮細胞(RPE；retinal pigment epithelium)以便解決威脅視力之眼睛疾病。使用Kamao等人， Stem Cell Reports2014:2:205-18概述之技術，人類多能幹細胞分化成RPE細胞，該文獻全部並且尤其針對其中概述之關於分化技術及試劑之方法及試劑以引用方式併入本文；亦參見Mandai等人，doi:10.1056/NEJMoa1608368，該文獻亦針對產生RPE細胞薄層並且移植至患者中之技術而全部併入。
分化可如在此項技術中已知來檢定，通常藉由評估相關RPE及/或特異性標誌物之存在或藉由在功能上量測。參見例如Kamao等人，doi:10.1016/j.stemcr.2013.12.007，該文獻全部並且尤其針對結果部分之第一段落中概述之標誌物以引用方式併入本文。
在一些實施例中，多能細胞分化成心肌細胞以便解決心血管疾病。hiPSC分化成心肌細胞之技術在此項技術中為已知的並且在實例中論述。分化可如在此項技術中已知來檢定，通常藉由評估相關心肌細胞或特異性標誌物之存在或藉由在功能上量測；參見例如Loh等人，doi:10.1016/j.cell.2016.06.001，該文獻全部並且尤其針對分化幹細胞包括心肌細胞之方法來以引用方式併入本文。
在一些實施例中，多能細胞分化成內皮集落形成細胞(ECFC；endothelial colony forming cell)以形成新血管以便解決周圍動脈疾病。分化內皮細胞之技術為已知的。參見，例如，Prasain等人，doi:10.1038/nbt.3048，該文獻全部並且尤其針對自人類多能幹細胞產生內皮細胞之方法及試劑，並且亦針對移植技術以引用方式併入。分化可如在此項技術中已知來檢定，通常藉由評估相關內皮細胞或特異性標誌物之存在或藉由在功能上量測。
在一些實施例中，多能細胞分化成甲狀腺祖細胞及甲狀腺濾泡性類器官，該等類器官可分泌甲狀腺激素以便解決自體免疫性甲狀腺炎。分化甲狀腺細胞之技術在此項技術中為已知的。參見，例如Kurmann等人，doi:10.106/j.stem.2015.09.004，全部並且尤其針對自人類多能幹細胞產生甲狀腺細胞之方法及試劑，並且亦針對移植技術據此明確以引用方式併入。分化可如在此項技術中已知來檢定，通常藉由評估相關甲狀腺細胞或特異性標誌物之存在或藉由在功能上量測。
分化多能細胞之方法之額外描述可發現於例如Deuse等人，Nature Biotechnology, 2019, 37, 252-258及Han等人, Proc Natl Acad Sci USA, 2019, 116(21), 10441-10446中。 E. 投與/移植原代細胞及/或衍生自原代細胞之細胞
在一些實施例中，原代細胞或其非原代細胞衍生物使用在此項技術中已知的視細胞類型及此等細胞之最終用途兩者而定之技術來移植或植入。通常，本發明之細胞可靜脈內或藉由注射來投與患者中之特定位置處。當移植於特定位置處時，細胞可懸浮於凝膠基質中以便防止分散。在一些實施例中，向接受細胞之患者投與免疫抑制劑。在其他實施例中，不向接受細胞之患者投與免疫抑制劑。
在一些實施例中，本文提供治療需要細胞療法之患者之方法，包括投與包含自包含外源免疫抑制因子之工程化幹細胞產生之分化細胞的細胞群體。在可用實施例中，本文提供治療需要細胞療法之患者之方法，包括投與包含自包含外源人類CD47之幹細胞產生之分化細胞的細胞群體。總體上，工程化細胞之安全及有效量例如為在患者中引起所需治療效果，同時最大限度地減少非所需不良效應之量。在另外的實施例中，向患者投與本文所述任何CD47-SIRPα阻斷劑，並且由此最大限度地減少來自所投與工程化細胞之非所需不良效應。
在一些實施例中，本文提供治療需要細胞療法之患者之方法，包括投與原代T細胞群體，包括表現外源免疫信號轉導因子之原代T細胞。在可用實施例中，本文提供治療需要細胞療法之患者之方法，包括投與原代T細胞群體，包括表現外源人類CD47之原代T細胞。在一些實施例中，向患者投與本文所述任何CD47-SIRPα阻斷劑。
在一些實施例中，當投與患者之細胞在接受者中經歷不適合擴增或增殖時，投與CD47-SIRPα阻斷劑。在一些實施例中，當投與患者之細胞存在於接受者身體中之不適當位置中時，投與CD47-SIRPα阻斷劑。在一些實施例中，當投與患者之細胞經歷惡性轉型時，投與CD47-SIRPα阻斷劑。在一些實施例中，當投與患者之細胞誘導細胞因子釋放症候群時，投與CD47-SIRPα阻斷劑。在一些實施例中，在投與患者之細胞誘導神經中毒性時，投與CD47-SIRPα阻斷劑。在一些實施例中，當投與患者之細胞誘導毒性諸如中靶偏離腫瘤毒性時，投與CD47-SIRPα阻斷劑。
在一態樣中，所描述之方法包括向有需要之接受者受試者投與一或多個劑量之CD47工程化細胞群體(例如，外源表現CD47之細胞群體)，並且然後投與CD47-SIRPα阻斷劑。在一些實施例中，接受者受試者接受1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多劑量之細胞群體。在一些實施例中，患者接受初始劑量之CD47工程化細胞群體，然後向患者投與CD47-SIRPα阻斷劑。在具體實施例中，向患者投與初始劑量之CD47工程化細胞群體，然後投與CD47-SIRPα阻斷劑，然後投與後續CD47工程化細胞群體。在某些實施例中，向患者投與初始劑量之CD47工程化細胞群體，然後第一次投與CD47-SIRPα阻斷劑，然後投與後續CD47工程化細胞群體，然後第二次投與CD47-SIRPα阻斷劑。CD47工程化細胞群體之初始劑量包括一或多次(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次)輸注或注射細胞。CD47工程化細胞群體之後續劑量包括一或多次(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次)輸注或注射細胞。
在另一態樣中，該方法包括執行包含治療週期之治療方案，該治療週期包括投與工程化細胞群體，然後投與CD47-SIRPα阻斷劑。在一些實施例中，治療方案包含一或多個(例如，1、2、3、4、或更多個)治療週期以使得各治療週期包括投與工程化細胞群體，然後投與CD47-SIRPα阻斷劑。在一些實施例中，向接受者受試者投與工程化細胞群體之步驟包括投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個劑量之細胞群體。在一些實施例中，在接受CD47-SIRPα阻斷劑之前，向接受者受試者投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個劑量之細胞群體。
在一些實施例中，本文所述方法包括投與CD47工程化細胞群體，然後在間隔時間期之後，投與CD47-SIRPα阻斷劑。在一些情況下，間隔時間期為至少1週或更長。在一些情況下，間隔時間期為至少1個月或更長。在一些情況下，若接受者受試者展現藉由所投與細胞誘導之不良效應，則間隔時間期結束。在一些實施例中，若所投與細胞在接受者中經歷不適當擴增或增殖，則間隔時間期結束。在某些實施例中，若所投與細胞存在於接受者身體中之不適當位置中，則間隔時間期結束。在具體實施例中，若所投與細胞經歷惡性轉型，則間隔時間期結束。在一些實施例中，若所投與細胞誘導細胞因子釋放症候群，則間隔時間期結束。在其他實施例中，若所投與細胞誘導神經中毒性，則間隔時間期結束。在具體實施例中，若所投與細胞誘導毒性諸如中靶偏離腫瘤毒性，則間隔時間期結束。
在一些實施例中，該方法包括CD47-SIRPα阻斷劑療法之多個週期。在一些情況下，治療方案包括投與一個或複數個劑量之CD47-SIRPα阻斷劑以使得所投與細胞及其衍生物(例如，接受者受試者中之所投與細胞及由此類細胞產生之任何細胞)之量減少至少10%(例如，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大)。在一些實施例中，投與CD47-SIRPα阻斷劑以使得實質上所有投與細胞經歷細胞死亡及/或細胞清除(例如，吞噬作用)。 IV. CD47-SIRPα阻斷劑
引入安全開關改良細胞療法之安全性，諸如涉及包含CD47之工程化細胞之療法。本文描述用於減少植入接受者受試者中之此類細胞中之CD47之免疫逃避效應的方法。在一些實施例中，接受者受試者用抑制或阻斷CD47及SIRPα相互作用之治療劑來治療。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑(例如，CD47-SIRPα阻斷、抑制、減少、拮抗、中和、或干擾劑)包含選自包括以下各者之群的劑：結合CD47之抗體或其片段、結合CD47之雙特異性抗體、結合CD47之免疫細胞因子融合蛋白、含有CD47之融合蛋白、結合SIRPα之抗體或其片段、結合SIRPα之雙特異性抗體、結合SIRPα之免疫細胞因子融合蛋白、含有SIRPα之融合蛋白、及其組合。在本發明之一態樣中，本文提供包括向先前投與包含外源表現CD47蛋白之細胞之患者投與CD47-SIRPα阻斷劑的方法。因此，不希望受理論束縛，咸信細胞可不再逃避免疫識別並且由此被患者之免疫細胞識別並且被定為細胞死亡及/或細胞清除之目標。在一些情況下，患者之先天免疫細胞經活化或調動以便減少先前投與細胞及其衍生物(例如，子代)之數目。
本文所述任何CD47-SIRPα阻斷劑可用於治療患有對於細胞療法作出響應之病狀或疾病之患者。例如，此病狀或疾病可藉由存在可藉由包含健康細胞之治療性幹預措施來置換之不健康細胞或組織(例如，患病細胞或組織)來表徵，包括未處於患病狀態中之細胞。在一些實施例中，向患有病狀或疾病之患者投與預期改善病狀或疾病之一或多個症狀的細胞療法。任何CD47-SIRPα阻斷劑可用於治療、減少或改善不良效應，該不良效應在投與包含外源表現CD47多肽之細胞群體之後發生。在一些實施例中，該劑用於控制患者中之細胞療法之效應，調節患者中之細胞療法之活性，或減少患者中之包含外源表現CD47多肽之細胞之數目。
在一些態樣中，CD47-SIRPα阻斷劑在接受者患者中減少外源表現CD47多肽之細胞之數目，包括但不限於亦外源表現一或多種嵌合抗原受體之細胞。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑降低患者中之CD47表現細胞之數目，而與藉由此類細胞之CAR表現水準無關。在一些情況下，與諸如但不限於tisagenlecleucel生物類似物、tisagenlecleucel替代物及其類似物之對照CAR-T細胞之水準相比，藉由該等細胞之CAR表現水準更少(例如，少1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或99%)。在某些情況下，與諸如但不限於tisagenlecleucel生物類似物、tisagenlecleucel替代物及其類似物之對照CAR-T細胞之水準相比，藉由該等細胞之CAR表現水準更大(例如，大1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、150%、200%、300%、或更高百分比)。 A.CD47結合阻斷劑
在本文提供之方法之一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑為結合CD47之劑。該劑可為CD47阻斷、中和、拮抗或干擾劑。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑選自包括以下各者之群：結合CD47之抗體或其片段、結合CD47之雙特異性抗體、及結合CD47之免疫細胞因子融合蛋白。
結合CD47之可用抗體或其片段可選自包括以下各者之群：麥格羅單抗 ((Hu5F9-G4)) (Forty Seven, Inc.; Gilead Sciences, Inc.)、烏拉瑞單抗(urabrelimab)、CC-90002 (Celgene; Bristol-Myers Squibb)、IBI-188 (Innovent Biologics)、IBI-322 (Innovent Biologics)、TG-1801 (TG Therapeutics；亦稱為NI-1701, Novimmune SA)、ALX148 (ALX Oncology)、TJ011133 (亦稱為TJC4, I-Mab Biopharma)、FA3M3、ZL-1201 (Zai Lab Co., Ltd)、AK117 (Akesbio Australia Pty, Ltd.)、AO-176 (Arch Oncology)、SRF231 (Surface Oncology)、GenSci-059 (GeneScience)、C47B157 (Janssen Research and Development)、C47B161 (Janssen Research and Development)、C47B167 (Janssen Research and Development)、C47B222 (Janssen Research and Development)、C47B227 (Janssen Research and Development)、Vx-1004 (Corvus Pharmaceuticals)、HMBD004 (Hummingbird Bioscience Pte Ltd)、SHR-1603 (Hengrui)、AMMS4-G4 (Beijing Institute of Biotechnology)、RTX-CD47 (University of Groningen)、及IMC-002. (Samsung Biologics; ImmuneOncia Therapeutics)。在一些實施例中，抗體或其片段不與選自包括以下各者之群的抗體競爭CD47結合：麥格羅單抗、烏拉瑞單抗、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47、及IMC-002。在一些實施例中，抗體或其片段與選自以下各者之抗體競爭CD47結合：麥格羅單抗、烏拉瑞單抗、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47、及IMC-002。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段選自包括以下各者之群：針對CD47之單鏈Fv片段(scFv)、針對CD47之Fab、針對CD47之VHH奈米抗體、針對CD47之DARPin、及其變異體。在一些實施例中，針對CD47之scFv、針對CD47之Fab、及其變異體基於選自包括以下各者之群之任何抗體的抗原結合域：麥格羅單抗、烏拉瑞單抗、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47、及IMC-002。
結合CD47之可用雙特異性抗體包含結合CD47之第一抗原結合域及結合選自包括CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD38、CD44、CD52、CD56、CD70、CD96、CD97、CD99、CD123、CD279(PD-1)、EGFR、HER2、CD117、c-Met、PTHR2、HAVCR2(TIM3)之群之抗原，及在癌細胞上表現之抗原的第二抗原結合域。
在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑為包含細胞因子及結合CD47之抗原結合域、抗體、或其片段的免疫細胞因子融合蛋白。
示例性CD47結合分子(例如，識別或結合CD47之抗原結合域、抗體、奈米抗體、雙功能抗體、抗體模擬物蛋白(例如，DARPin)、及其片段)之詳細描述，包括重鏈、輕鏈、VH區域、VL區域、CDR、及構架區之序列，可發現於例如WO2009091601；WO2011143624；WO2013119714；WO201414947；WO2014149477；WO2015138600；WO2016033201；WO2017049251；Pietsch等人, Blood Cancer J, 2017, 7(2), e536；van Brommel等人, 2018, 7(2), e1386361；Yu等人, Biochimie, 2018, 151, 54-66；及Andrechak等人, Phil Trans R Soc, 2019, 374, 20180217中；諸如序列表、說明書、及圖式之揭示內容全部併入本文中。 B. SIRPα結合阻斷劑
在一些實施例中，投與接受者受試者之CD47-SIRPα阻斷劑為結合SIRPα之劑。該劑可為SIRPα阻斷、中和、拮抗或滅活劑。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑選自包括但是不限於以下各者之群：結合SIRPα之抗體或其片段、結合SIRPα之雙特異性抗體、及結合SIRPα之免疫細胞因子融合蛋白。
結合SIRPα之可用抗體或其片段可選自包括但是不限於以下各者之群：ADU-1805 (Aduro Biotech Holdings)、OSE-172 (OSE Immunotherapeutics；亦稱為BI 765063，Boehringer Ingelheim)、CC-95251 (Celgene; Bristol-Myers Squibb)、KWAR23 (Leland Stanford Junior University)、及P362 (Leland Stanford Junior University)。在一些實施例中，抗體或其片段不與選自包括以下各者之群之抗體競爭SIRPα結合：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23、及P362。在一些實施例中，抗體或其片段與選自包括以下各者之群之抗體競爭SIRPα結合：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23、及P362。
在一些實施例中，結合SIRPα之抗體或其片段選自包括以下各者之群：針對SIRPα之單鏈Fv片段(scFv)、針對SIRPα之Fab、針對SIRPα之VHH奈米抗體、針對SIRPα之DARPin、及其變異體。在一些實施例中，針對SIRPα之scFv、針對SIRPα之Fab、及其變異體基於選自包括以下各者之群之任何抗體之抗原結合域：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23、及P362。
在一些實施例中，結合SIRPα之雙特異性抗體及結合選自包括CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD38、CD44、CD52、CD56、CD70、CD96、CD97、CD99、CD123、CD279(PD-1)、EGFR、HER2、CD117、c-met、PTHR2、HAVCR2(TIM3)之群之抗原，及在癌細胞上表現之抗原的抗原結合域。在一些情況下，雙特異性抗體結合SIRPα及腫瘤相關抗原。在一些情況下，雙特異性抗體結合SIRPα及在免疫細胞表面上表現之抗原。
在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑為免疫細胞因子融合蛋白，該蛋白包含細胞因子及結合SIRPα之抗原結合域、抗體、或其片段。
示例性SIRPα結合分子(例如，識別或結合SIRPα之抗原結合域、抗體、奈米抗體、雙功能抗體、抗體模擬物蛋白(例如，DARPin)、及其片段)之詳細描述，包括重鏈、輕鏈、VH區域、VL區域、CDR、及構架區之序列，可發現於例如WO2019226973；WO2018190719；WO2018057669；WO2017178653；WO2016205042；WO2016033201；WO2016022971；WO2015138600；及WO2013109752中；包括序列表、說明書、及圖式之揭示內容全部併入本文中。 C. 含有CD47及/或SIRPα之融合蛋白
如本文描述，CD47-SIRPα阻斷劑可包含結合SIRPα之含有CD47之融合蛋白。在一些實施例中，結合SIRPα之此含有CD47之融合蛋白為投與接受者受試者之劑。在一些實施例中，含有CD47之融合蛋白包含結合SIRPα之CD47胞外域或其變異體。在一些實施例中，融合蛋白包含Fc區域。示例性CD47融合蛋白之詳細描述，包括序列，可發現於例如US20100239579中，包括序列表、說明書、及圖式之揭示內容全部併入本文中。
在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑可包含結合CD47之含有SIRPα之融合蛋白。SIRPα之序列在SEQ ID NO:129(UniProt P78324)中列出。總體上，含有SIRPα之融合蛋白包含SIRPα之域，該域包括以下中任一者(a)人類SIRPα之免疫球蛋白樣域(例如，含有SIRP之IgV域之膜遠側(D1)環，(b)含有IgC域之第一膜近側環，及(c)含有IgC域之第二膜近側環)。在一些情況下，SIRPα域結合CD47。在一些實施例中，含有SIRPα之融合蛋白包含結合CD47之SIRPα胞外域或其變異體。在一些實施例中，融合蛋白包含Fc區域，包括但不限於人類IgG1 Fc區域(例如，UniProtKB/Swiss-Prot P01857, SEQ ID NO:130)或IgG4 Fc區域(例如，UniProt P01861，SEQ ID NO:131；GenBank CAC20457.1，SEQ ID NO:132)。視情況，Fc區域可包含一或多個取代。在一些實施例中，含有SIRPα之融合蛋白選自包括以下各者之群：TTI-621 (Trillium Therapeutics)、TTI-622 (Trillium Therapeutics)、及ALX148 (ALX Oncology)。TTI-621(SEQ ID NO:133)為由融合至人類IgG1 Fc區域之人類SIRPα之N末端V域組成的融合蛋白(Petrova等人Clin Cancer Res 23(4):1068-1079 (2017))，而TTI-622(SEQ ID NO:134)為具有單一取代的由融合至人類IgG4 Fc區域之人類SIRPα之N末端V域組成之融合蛋白。 表21. SIRPα、IgG1/IgG4、及CD47融合蛋白之示例性序列
SEQ ID NO: 序列 描述
129 MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYIVVGVVCTLLVALLMAALYLVRIRQKKAQGSTSSTRLHEPEKNAREITQVQSLDTNDITYADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTEYASIQTSPQPASEDTLTYADLDMVHLNRTPKQPAPKPEPSFSEYASVQVPRK SIRPα (UniProt P78324)
130 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 人類IgG1 (UniProtKB/Swiss-Prot P01857)
131 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 人類IgG4 (UniProt P01861)
132 ASFKGPSVFPLVPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSCALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVRVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 人類IgG4 (GenBank CAC20457.1)
133 EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK TTI-621
134 EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK TTI-622
TTI-621、TTI-622、及其他相關融合蛋白揭示於PCT公開案第WO14/94122號中，關於該等蛋白之內容以引用形式併入本文。AL148為由融合至經修飾人類IgG1 Fc域之SIRPα之N末端D1域組成之融合蛋白(Kauder等人PLoS One (13(8):e0201832 (2018))。示例性SIRPα融合蛋白之詳細描述，包括序列，可發現於例如PCT公開案第WO14/94122號；第WO16/23040號；第WO17/27422號；第WO17/177333號；及第WO18/176132號中，包括序列表、說明書、及圖式之揭示內容全部併入本文中。
含有SIRPα之融合蛋白，包括TTI-621，經研發用於單獨或與其他癌症治療藥物組合來治療癌症，諸如血液腫瘤。評估在患有復發/難治性血液腫瘤及選定實體腫瘤之患者中靜脈內TTI-621投與之劑量及安全性(NCT02663518)的1期試驗發現TTI-621良好耐受並且作為單一療法及與其他癌症治療劑組合均展示活性(Ansell等人Clin Cancer Res 27(8):2190-2199 (2021))。在初始遞增階段中，受試者接受0.05、0.1、0.3、1、3、及10 mg/kg之劑量之TTI-621以便評估安全性及最大耐受劑量(MTD；maximum tolerated dose)。在擴展階段中，受試者接受作為單一療法之0.2 mg/kg或與利妥昔單抗或妮威祿單抗(nivolumab)組合之0.1 mg/kg之MTD。 V. CD47-SIRPα阻斷劑及相關方法之用途
本文揭示使用CD47-SIRPα阻斷劑來減少或消除經工程化來表現致耐受性因子諸如CD47之細胞群體的方法及組合物，其中細胞群體先前投與受試者。在一些實施例中，細胞群體進一步經工程化以表現至少一種CAR。在一些實施例中，細胞群體進一步經工程化以表現額外因子。在一些實施例中，細胞群體進一步楷工程化以表現至少一種CAR及額外因子。在一些實施例中，細胞為原代細胞。在一些實施例中，細胞為T細胞。在一些實施例中，T細胞自多能細胞，諸如經誘導多能細胞(iPSC)分化。在一些實施例中，T細胞為原代T細胞。在一些實施例中，T細胞為同種異體T細胞。在一些實施例中，細胞為胰島細胞。在一些實施例中，胰島細胞自多能細胞，諸如iPSC分化。在一些實施例中，胰島細胞為原代胰島細胞。在一些實施例中，胰島細胞為同種異體胰島細胞。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，細胞自iPSC分化。在一些實施例中，細胞為分化細胞。在一些實施例中，分化細胞選自由以下組成之群：心臟細胞、神經細胞、內皮細胞、T細胞、胰島細胞、視網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲狀腺細胞、皮膚細胞、血細胞、原代細胞、及上皮細胞。在一些實施例中，細胞為原代細胞。在一些實施例中，原代細胞為T細胞或胰島細胞。在一些實施例中，原代細胞為T細胞。在一些實施例中，原代細胞為胰島細胞。在一些實施例中，細胞經工程化以表現至少一種選自由以下組成之群的額外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制劑、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重鏈、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8、及其組合。
在一些實施例中，額外因子為CD16。在一些實施例中，額外因子為CD24。在一些實施例中，額外因子為CD35。在一些實施例中，額外因子為CD39。在一些實施例中，額外因子為CD46。在一些實施例中，額外因子為CD52。在一些實施例中，額外因子為CD55。在一些實施例中，額外因子為CD59。在一些實施例中，額外因子為CD200。在一些實施例中，額外因子為CCL22。在一些實施例中，額外因子為CTLA4-Ig。在一些實施例中，額外因子為C1抑制劑。在一些實施例中，額外因子為FASL。在一些實施例中，額外因子為IDO1。在一些實施例中，額外因子為HLA-C。在一些實施例中，額外因子為HLA-E。在一些實施例中，額外因子為HLA-E重鏈。在一些實施例中，額外因子為HLA-G。在一些實施例中，額外因子為IL-10。在一些實施例中，額外因子為IL-35。在一些實施例中，額外因子為PD-1。在一些實施例中，額外因子為PD-L1。在一些實施例中，額外因子為Serpinb9。在一些實施例中，額外因子為CCl21。在一些實施例中，額外因子為Mfge8。在一些實施例中，細胞具有MHC I類HLA及/或MHC II類HLA分子之減少之表現。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之T細胞群體。在一些實施例中，細胞具有MHC I類HLA及/或MHC II類HLA分子之減少之表現。在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與T細胞群體，該等細胞(i)經工程化以表現外源CD47多肽及至少一個嵌合抗原受體(CAR)並且(ii)具有MHC I類HLA分子、MHCII類HLA分子、T細胞受體(TCR)α、及/或TCR β之減少之表現。在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與T細胞群體，該等細胞具有MHC I類HLA分子、MHC II類HLA分子、及TCRα之減少之表現並且經工程化以表現外源CD47多肽及CD19嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與T細胞群體，該等細胞具有MHC I類HLA分子、MHC II類HLA分子、及TCRβ之減少之表現並且經工程化以表現外源CD47多肽及CD19嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，CAR結合選自由以下組成之群之抗原：CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CD138、BCMA、及其組合。在一些實施例中，MHC I類及/或MHC II類表現得以敲除。在一些實施例中，MHC I類HLA之減少表現由B2M之減少表現來介導並且MHC II類之減少表現由CIITA之減少表現來介導。在一些實施例中，B2M及/或CIITA表現得以敲除。在一些實施例中，CAR結合CD19抗原並且為CD19 CAR。在一些實施例中，CAR結合CD20抗原並且為CD20 CAR。在一些實施例中，CAR結合CD22抗原並且為CD22 CAR。在一些實施例中，CAR結合CD38抗原並且為CD38 CAR。在一些實施例中，CAR結合CD123抗原並且為CD123 CAR。在一些實施例中，CAR結合CD138抗原並且為CD138 CAR。在一些實施例中，CAR結合BCMA抗原並且為BCMA CAR。
在一些實施例中，T細胞為原代細胞。在一些實施例中，T細胞為同種異體細胞。在一些實施例中，T細胞自iPSC分化。在一些實施例中，T細胞經工程化以具有TCRα及/或TCRβ之減少之表現。在一些實施例中，T細胞經工程化以具有細胞毒性T淋巴球相關蛋白4(CTLA4)及/或計畫性細胞死亡(PD1)之減少之表現。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之T細胞群體。在一些實施例中，T細胞進一步經工程化以表現嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，CAR為選自由以下組成之群之CD19 CAR：tisagenlecleucel、lisocabtagene maraleucel、axicabtagene ciloleucel、及brexucabtagene autoleucel。在一些實施例中，CD19 CAR為tisagenlecleucel。在一些實施例中，CD19 CAR為lisocabtagene。在一些實施例中，CD19 CAR為maraleucel。在一些實施例中，CD19 CAR為axicabtagene。在一些實施例中，CD19 CAR為ciloleucel。在一些實施例中，CD19 CAR為brexucabtagene autoleucel。在一些實施例中，CAR為包含SEQ ID NO:117之胺基酸序列的CD19 CAR。在一些實施例中，CD19 CAR由SEQ ID NO:116之核酸序列編碼。在一些實施例中，T細胞經工程化以表現至少一種選自由以下組成之群的額外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制劑、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重鏈、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8、及其組合。在一些實施例中，額外因子為CD16。在一些實施例中，額外因子為CD24。在一些實施例中，額外因子為CD35。在一些實施例中，額外因子為CD39。在一些實施例中，額外因子為CD46。在一些實施例中，額外因子為CD52。在一些實施例中，額外因子為CD55。在一些實施例中，額外因子為CD59。在一些實施例中，額外因子為CD200。在一些實施例中，額外因子為CCL22。在一些實施例中，額外因子為CTLA4-Ig。在一些實施例中，額外因子為C1抑制劑。在一些實施例中，額外因子為FASL。在一些實施例中，額外因子為IDO1。在一些實施例中，額外因子為HLA-C。在一些實施例中，額外因子為HLA-E。在一些實施例中，額外因子為HLA-E重鏈。在一些實施例中，額外因子為HLA-G。在一些實施例中，額外因子為IL-10。在一些實施例中，額外因子為IL-35。在一些實施例中，額外因子為PD-1。在一些實施例中，額外因子為PD-L1。在一些實施例中，額外因子為Serpinb9。在一些實施例中，額外因子為CCl21。在一些實施例中，額外因子為Mfge8。在一些實施例中，CAR及編碼外源CD47多肽之基因在雙順反子載體中引入T細胞中。在一些實施例中，雙順反子載體經由慢病毒來引入T細胞中。在一些實施例中，CAR及編碼外源CD47多肽之基因在單一啟動子之控制下。
在一些實施例中，本文揭示之方法為減少受試者中之經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體的方法，該方法包括：(a)向受試者投與第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑；(b)測定在(a)中投與之第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑之第一結果；(c)視情況基於(b)中之第一結果，投與第二劑量之CD47-SIRPα阻斷劑；及(d)視情況測定在(c)中投與之第二劑量之CD47-SIRPα阻斷劑之第二結果。在一些實施例中，細胞自iPSC分化。在一些實施例中，細胞為分化細胞。在一些實施例中，分化細胞選自由以下組成之群：心臟細胞、神經細胞、內皮細胞、T細胞、胰島細胞、視網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲狀腺細胞、皮膚細胞、血細胞、原代細胞、及上皮細胞。在一些實施例中，細胞為原代細胞。在一些實施例中，原代細胞為T細胞或胰島細胞。在一些實施例中，原代細胞為T細胞。在一些實施例中，原代細胞為胰島細胞。在一些實施例中，細胞經工程化以表現至少一種選自由以下組成之群的額外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制劑、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重鏈、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8、及其組合。在一些實施例中，額外因子為CD16。在一些實施例中，額外因子為CD24。在一些實施例中，額外因子為CD35。在一些實施例中，額外因子為CD39。在一些實施例中，額外因子為CD46。在一些實施例中，額外因子為CD52。在一些實施例中，額外因子為CD55。在一些實施例中，額外因子為CD59。在一些實施例中，額外因子為CD200。在一些實施例中，額外因子為CCL22。在一些實施例中，額外因子為CTLA4-Ig。在一些實施例中，額外因子為C1抑制劑。在一些實施例中，額外因子為FASL。在一些實施例中，額外因子為IDO1。在一些實施例中，額外因子為HLA-C。在一些實施例中，額外因子為HLA-E。在一些實施例中，額外因子為HLA-E重鏈。在一些實施例中，額外因子為HLA-G。在一些實施例中，額外因子為IL-10。在一些實施例中，額外因子為IL-35。在一些實施例中，額外因子為PD-1。在一些實施例中，額外因子為PD-L1。在一些實施例中，額外因子為Serpinb9。在一些實施例中，額外因子為CCl21。在一些實施例中，額外因子為Mfge8。在一些實施例中，細胞具有MHC I類HLA及/或MHC II類HLA分子之減少之表現。在一些實施例中，MHC I類及/或MHC II類表現得以敲除。在一些實施例中，MHC I類HLA之減少表現由B2M之減少表現來介導並且MHC II類之減少表現由CIITA之減少表現來介導。在一些實施例中，B2M及/或CIITA表現得以敲除。
在一些實施例中，本文揭示之方法為減少受試者中之經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體的方法，該方法包括：(a)向受試者投與第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑；(b)測定在(a)中投與之第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑之第一結果；(c)視情況基於(b)中之第一結果，投與第二劑量之CD47-SIRPα阻斷劑；及(d)視情況測定在(c)中投與之第二劑量之CD47-SIRPα阻斷劑之第二結果。在一些實施例中，第一結果及第二結果獨立地選自由以下組成之群：(i)約10%與100%之間之細胞數目之減少，(ii)約10%與100%之間之不良事件之減少，及(iii)(i)及(ii)之組合。在一些實施例中，第一結果及/或第二結果為不良事件。在一些實施例中，不良事件選自由以下組成之群：異常增生、轉型、腫瘤形成、細胞因子釋放症候群、移植物抗宿主疾病(GVHD)、免疫效應細胞相關神經中毒性症候群(ICANS)、發炎、感染、噁心、嘔吐、出血、間質性肺炎、呼吸道疾病、黃疸、體重損失、腹瀉、食欲損失、抽筋、腹部疼痛、肝靜脈閉塞疾病(VOD)、移植失敗、器官損傷、不孕、激素變化、異常生長形成、白內障、及移植後淋巴增殖病症(PTLD)。在一些實施例中，不良事件為異常增生。在一些實施例中，不良事件為轉型。在一些實施例中，不良事件為腫瘤形成。在一些實施例中，不良事件為細胞因子釋放症候群。在一些實施例中，不良事件為移植物抗宿主疾病(GVHD)。在一些實施例中，不良事件為免疫效應細胞相關神經中毒性症候群(ICANS)。在一些實施例中，不良事件為發炎。在一些實施例中，不良事件為感染。在一些實施例中，不良事件為噁心。在一些實施例中，不良事件為嘔吐。在一些實施例中，不良事件為出血。在一些實施例中，不良事件為間質性肺炎。在一些實施例中，不良事件為呼吸道疾病。在一些實施例中，不良事件為黃疸。在一些實施例中，不良事件為體重損失。在一些實施例中，不良事件為腹瀉。在一些實施例中，不良事件為食欲損失。在一些實施例中，不良事件為抽筋。在一些實施例中，不良事件為腹部疼痛。在一些實施例中，不良事件為肝靜脈閉塞疾病(VOD)。在一些實施例中，不良事件為移植失敗。在一些實施例中，不良事件為器官損傷。在一些實施例中，不良事件為不孕。在一些實施例中，不良事件為激素變化。在一些實施例中，不良事件為異常生長形成。在一些實施例中，不良事件為白內障。在一些實施例中，不良事件為移植後淋巴增殖病症(PTLD)。
在一些實施例中，本文揭示之方法為減少受試者中之經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體的方法，該方法包括：(a)向受試者投與第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑；(b)測定在(a)中投與之第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑之第一結果；(c)視情況基於(b)中之第一結果，投與第二劑量之CD47-SIRPα阻斷劑；及(d)視情況測定在(c)中投與之第二劑量之CD47-SIRPα阻斷劑之第二結果。在一些實施例中，第一結果包括約10%與約15%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第一結果包括約15%與約20%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第一結果包括約20%與約25%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第一結果包括約25%與約30%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第一結果包括約30%與約35%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第一結果包括約35%與約40%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第一結果包括約40%與約45%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第一結果包括約45%與約50%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第一結果包括約50%與約55%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第一結果包括約55%與約60%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第一結果包括約60%與約65%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第一結果包括約65%與約70%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第一結果包括約70%與約75%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第一結果包括約75%與約80%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第一結果包括約80%與約85%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第一結果包括約85%與約90%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第一結果包括約90%與約95%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第一結果包括約95%與約100%之間之細胞數目之減少。
在一些實施例中，本文揭示之方法為減少受試者中之經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體的方法，該方法包括：(a)向受試者投與第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑；(b)測定在(a)中投與之第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑之第一結果；(c)視情況基於(b)中之第一結果，投與第二劑量之CD47-SIRPα阻斷劑；及(d)視情況測定在(c)中投與之第二劑量之CD47-SIRPα阻斷劑之第二結果。在一些實施例中，第一結果包含約10%與約15%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第一結果包含約15%與約20%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第一結果包含約20%與約25%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第一結果包含約25%與約30%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第一結果包含約30%與約35%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第一結果包含約35%與約40%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第一結果包含約40%與約45%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第一結果包含約45%與約50%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第一結果包含約50%與約55%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第一結果包含約55%與約60%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第一結果包含約60%與約65%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第一結果包含約65%與約70%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第一結果包含約70%與約75%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第一結果包含約75%與約80%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第一結果包含約80%與約85%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第一結果包含約85%與約90%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第一結果包含約90%與約95%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第一結果包含約95%與約100%之間之不良事件之減少。
在一些實施例中，本文揭示之方法為減少受試者中之經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體的方法，該方法包括：(a)向受試者投與第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑；(b)測定在(a)中投與之第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑之第一結果；(c)視情況基於(b)中之第一結果，投與第二劑量之CD47-SIRPα阻斷劑；及(d)視情況測定在(c)中投與之第二劑量之CD47-SIRPα阻斷劑之第二結果。在一些實施例中，第二結果包括約10%與約15%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第二結果包括約15%與約20%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第二結果包括約20%與約25%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第二結果包括約25%與約30%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第二結果包括約30%與約35%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第二結果包括約35%與約40%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第二結果包括約40%與約45%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第二結果包括約45%與約50%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第二結果包括約50%與約55%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第二結果包括約55%與約60%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第二結果包括約60%與約65%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第二結果包括約65%與約70%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第二結果包括約70%與約75%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第二結果包括約75%與約80%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第二結果包括約80%與約85%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第二結果包括約85%與約90%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第二結果包括約90%與約95%之間之細胞數目之減少。在一些實施例中，第二結果包括約95%與約100%之間之細胞數目之減少。
在一些實施例中，本文揭示之方法為減少受試者中之經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體的方法，該方法包括：(a)向受試者投與第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑；(b)測定在(a)中投與之第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑之第一結果；(c)視情況基於(b)中之第一結果，投與第二劑量之CD47-SIRPα阻斷劑；及(d)視情況測定在(c)中投與之第二劑量之CD47-SIRPα阻斷劑之第二結果。在一些實施例中，第二結果包含約10%與約15%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第二結果包含約15%與約20%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第二結果包含約20%與約25%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第二結果包含約25%與約30%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第二結果包含約30%與約35%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第二結果包含約35%與約40%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第二結果包含約40%與約45%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第二結果包含約45%與約50%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第二結果包含約50%與約55%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第二結果包含約55%與約60%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第二結果包含約60%與約65%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第二結果包含約65%與約70%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第二結果包含約70%與約75%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第二結果包含約75%與約80%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第二結果包含約80%與約85%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第二結果包含約85%與約90%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第二結果包含約90%與約95%之間之不良事件之減少。在一些實施例中，第二結果包含約95%與約100%之間之不良事件之減少。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括：(a)量化受試者中之經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體；(b)測定有效減少細胞群體至少20%之CD47-SIRPα阻斷劑之第一劑量；及(c)將第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者。在一些實施例中，細胞自iPSC分化。在一些實施例中，細胞為分化細胞。在一些實施例中，分化細胞選自由以下組成之群：心臟細胞、神經細胞、內皮細胞、T細胞、胰島細胞、視網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲狀腺細胞、皮膚細胞、血細胞、原代細胞、及上皮細胞。在一些實施例中，細胞為原代細胞。在一些實施例中，原代細胞為T細胞或胰島細胞。在一些實施例中，原代細胞為T細胞。在一些實施例中，原代細胞為胰島細胞。在一些實施例中，細胞經工程化以表現至少一種選自由以下組成之群的額外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制劑、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重鏈、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8、及其組合。在一些實施例中，額外因子為CD16。在一些實施例中，額外因子為CD24。在一些實施例中，額外因子為CD35。在一些實施例中，額外因子為CD39。在一些實施例中，額外因子為CD46。在一些實施例中，額外因子為CD52。在一些實施例中，額外因子為CD55。在一些實施例中，額外因子為CD59。在一些實施例中，額外因子為CD200。在一些實施例中，額外因子為CCL22。在一些實施例中，額外因子為CTLA4-Ig。在一些實施例中，額外因子為C1抑制劑。在一些實施例中，額外因子為FASL。在一些實施例中，額外因子為IDO1。在一些實施例中，額外因子為HLA-C。在一些實施例中，額外因子為HLA-E。在一些實施例中，額外因子為HLA-E重鏈。在一些實施例中，額外因子為HLA-G。在一些實施例中，額外因子為IL-10。在一些實施例中，額外因子為IL-35。在一些實施例中，額外因子為PD-1。在一些實施例中，額外因子為PD-L1。在一些實施例中，額外因子為Serpinb9。在一些實施例中，額外因子為CCl21。在一些實施例中，額外因子為Mfge8。在一些實施例中，細胞具有MHC I類HLA及/或MHC II類HLA分子之減少之表現。在一些實施例中，MHC I類及/或MHC II類表現得以敲除。在一些實施例中，MHC I類HLA之減少表現由B2M之減少表現來介導並且MHC II類之減少表現由CIITA之減少表現來介導。在一些實施例中，B2M及/或CIITA表現得以敲除。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括：(a)量化受試者中之經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體；(b)測定有效減少細胞群體至少20%之CD47-SIRPα阻斷劑之第一劑量；及(c)將第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者。在一些實施例中，第一劑量有效減少細胞群體約20%與約30%之間。在一些實施例中，第一劑量有效減少細胞群體約30%與約40%之間。在一些實施例中，第一劑量有效減少細胞群體約40%與約50%之間。在一些實施例中，第一劑量有效減少細胞群體約50%與約60%之間。在一些實施例中，第一劑量有效減少細胞群體約60%與約70%之間。在一些實施例中，第一劑量有效減少細胞群體約70%與約80%之間。在一些實施例中，第一劑量有效減少細胞群體約80%與約90%之間。在一些實施例中，第一劑量有效減少細胞群體約90%與約100%之間。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括：(a)量化受試者中之經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體；(b)測定有效減少細胞群體至少20%之CD47-SIRPα阻斷劑之第一劑量；及(c)將第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量：(i)以0.05、0.1、0.3、1、3、或10 mg/kg；(ii)每12小時一次、每24小時一次、每36小時一次、或每48小時一次；及/或(iii)1天與3週之間投與。在一些實施例中，第一及第二劑量為相同的。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量以0.05 mg/kg投與。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量以0.1 mg/kg投與。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量以0.3 mg/kg投與。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量以1 mg/kg投與。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量以3 mg/kg投與。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量以10 mg/kg投與。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量以約0.01 mg/kg與約20 mg/kg之間投與。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量以約0.01 mg/kg與約0.05 mg/kg之間投與。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量以約0.05 mg/kg與約0.1 mg/kg之間投與。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量以約0.1 mg/kg與約0.5 mg/kg之間投與。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量以約0.5 mg/kg與約1 mg/kg之間投與。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量以約1 mg/kg與約5 mg/kg之間投與。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量以約5 mg/kg與約10 mg/kg之間投與。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量以約10 mg/kg與約15 mg/kg之間投與。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量以約15 mg/kg與約20 mg/kg之間投與。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括：(a)量化受試者中之經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體；(b)測定有效減少細胞群體至少20%之CD47-SIRPα阻斷劑之第一劑量；及(c)將第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每6小時投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每12小時投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每18小時投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每24小時投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每36小時投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每48小時投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每3天投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每4天投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每5天投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每6天投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每7天投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每2週投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每4週投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每6週投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每8週投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每3個月投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每4個月投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每5個月投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每6個月投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每約6個月與約12個月之間投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每18個月投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每24個月投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每3年投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每4年投與一次。在一些實施例中，第一劑量及/或第二劑量每5年投與一次。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括：(a)量化受試者中之經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體；(b)測定有效減少細胞群體至少20%之CD47-SIRPα阻斷劑之第一劑量；及(c)將第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約1天與約50年之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約1天與約1週之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約1週與約2週之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約2週與約3週之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約3週與約1個月之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約1個月與約2個月之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約2個月與約3個月之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約3個月與約4個月之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約4個月與約5個月之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約5個月與約6個月之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約6個月與約1年之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約1年與約2年之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約2年與約3年之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約3年與約4年之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約4年與約5年之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約5年與約10年之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約10年與約15年之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約15年與約20年之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約20年與約30年之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約30年與約40年之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續約40年與約50年之間。在一些實施例中，投與第一劑量及/或第二劑量持續受試者之一生。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之胰島細胞群體。在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與胰島細胞群體，該等細胞(i)經工程化以表現外源CD47多肽並且(ii)具有MHC I類HLA及/或MHC II類HLA分子之減少之表現。在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與胰島細胞群體，該等細胞(i)經工程化以表現外源CD47、CD46、及CD59多肽並且(ii)具有MHC I類HLA及/或MHC II類HLA分子之減少之表現。在一些實施例中，MHC I類及/或MHC II類表現得以敲除。在一些實施例中，MHC I類HLA之減少表現由B2M之減少表現來介導並且MHC II類之減少表現由CIITA之減少表現來介導。在一些實施例中，B2M及/或CIITA表現得以敲除。在一些實施例中，胰島細胞經工程化以具有CD142之減少之表現。在一些實施例中，胰島細胞為原代細胞。在一些實施例中，胰島細胞自iPSC分化。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之胰島細胞群體。在一些實施例中，胰島細胞經工程化以表現至少一種選自由以下組成之群的額外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制劑、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重鏈、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8、及其組合。在一些實施例中，額外因子為CD16。在一些實施例中，額外因子為CD24。在一些實施例中，額外因子為CD35。在一些實施例中，額外因子為CD39。在一些實施例中，額外因子為CD46。在一些實施例中，額外因子為CD52。在一些實施例中，額外因子為CD55。在一些實施例中，額外因子為CD59。在一些實施例中，額外因子為CD200。在一些實施例中，額外因子為CCL22。在一些實施例中，額外因子為CTLA4-Ig。在一些實施例中，額外因子為C1抑制劑。在一些實施例中，額外因子為FASL。在一些實施例中，額外因子為IDO1。在一些實施例中，額外因子為HLA-C。在一些實施例中，額外因子為HLA-E。在一些實施例中，額外因子為HLA-E重鏈。在一些實施例中，額外因子為HLA-G。在一些實施例中，額外因子為IL-10。在一些實施例中，額外因子為IL-35。在一些實施例中，額外因子為PD-1。在一些實施例中，額外因子為PD-L1。在一些實施例中，額外因子為Serpinb9。在一些實施例中，額外因子為CCl21。在一些實施例中，額外因子為Mfge8。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，編碼外源CD47多肽之基因經由同源引導修復(HDR)介導插入細胞之基因組基因座中來引入細胞中。在一些實施例中，基因組基因座選自由以下組成之群：B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRBC基因座、及安全港基因座。在一些實施例中，基因組基因座為B2M基因座。在一些實施例中，基因組基因座為CIITA基因座。在一些實施例中，基因組基因座為TRAC基因座。在一些實施例中，基因組基因座為TRBC基因座。在一些實施例中，基因組基因座為安全港基因座。在一些實施例中，安全港基因座選自由以下組成之群：AAVS1、ABO、CCR5、CLYBL、CXCR4、F3、FUT1、HMGB1、KDM5D、LRP1、MICA、MICB、RHD、ROSA26、及SHS231基因座。在一些實施例中，安全港基因座為AAVS1基因座。在一些實施例中，安全港基因座為ABO基因座。在一些實施例中，安全港基因座為CCR5基因座。在一些實施例中，安全港基因座為CLYBL基因座。在一些實施例中，安全港基因座為CXCR4基因座。在一些實施例中，安全港基因座為F3基因座。在一些實施例中，安全港基因座為FUT1基因座。在一些實施例中，安全港基因座為HMGB1基因座。在一些實施例中，安全港基因座為KDM5D基因座。在一些實施例中，安全港基因座為LRP1基因座。在一些實施例中，安全港基因座為MICA基因座。在一些實施例中，安全港基因座為MICB基因座。在一些實施例中，安全港基因座為RHD基因座。在一些實施例中，安全港基因座為ROSA26基因座。在一些實施例中，安全港基因座為SHS231基因座。在一些實施例中，細胞具有MHC I類HLA及/或MHC II類HLA分子之減少之表現。在一些實施例中，MHC I類及/或MHC II類表現得以敲除。在一些實施例中，MHC I類HLA之減少表現由B2M之減少表現來介導並且MHC II類之減少表現由CIITA之減少表現來介導。在一些實施例中，B2M及/或CIITA表現得以敲除。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在向受試者投與細胞之後至少一天投與。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在向受試者投與細胞之後至少兩天投與。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在向受試者投與細胞之後至少三天投與。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在向受試者投與細胞之後至少四天投與。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在向受試者投與細胞之後至少五天投與。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在向受試者投與細胞之後至少六天投與。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在向受試者投與細胞之後至少一週投與。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在向受試者投與細胞之後至少兩週投與。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在向受試者投與細胞之後至少三週投與。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在向受試者投與細胞之後至少一個月投與。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在向受試者投與細胞之後至少兩個月投與。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在向受試者投與細胞之後至少三個月投與。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在向受試者投與細胞之後至少四個月投與。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在向受試者投與細胞之後至少五個月投與。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在向受試者投與細胞之後至少六個月投與。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在向受試者投與細胞之後至少1年投與。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑在受試者經歷與投與細胞相關之不良事件之後投與。在一些實施例中，不良事件選自由以下組成之群：異常增生、轉型、腫瘤形成、細胞因子釋放症候群、移植物抗宿主疾病(GVHD)、免疫效應細胞相關神經中毒性症候群(ICANS)、發炎、感染、噁心、嘔吐、出血、間質性肺炎、呼吸道疾病、黃疸、體重損失、腹瀉、食欲損失、抽筋、腹部疼痛、肝靜脈閉塞疾病(VOD)、移植失敗、器官損傷、不孕、激素變化、異常生長形成、白內障、及移植後淋巴增殖病症(PTLD)。在一些實施例中，不良事件為異常增生。在一些實施例中，不良事件為轉型。在一些實施例中，不良事件為腫瘤形成。在一些實施例中，不良事件為細胞因子釋放症候群。在一些實施例中，不良事件為移植物抗宿主疾病(GVHD)。在一些實施例中，不良事件為免疫效應細胞相關神經中毒性症候群(ICANS)。在一些實施例中，不良事件為發炎。在一些實施例中，不良事件為感染。在一些實施例中，不良事件為噁心。在一些實施例中，不良事件為嘔吐。在一些實施例中，不良事件為出血。在一些實施例中，不良事件為間質性肺炎。在一些實施例中，不良事件為呼吸道疾病。在一些實施例中，不良事件為黃疸。在一些實施例中，不良事件為體重損失。在一些實施例中，不良事件為腹瀉。在一些實施例中，不良事件為食欲損失。在一些實施例中，不良事件為抽筋。在一些實施例中，不良事件為腹部疼痛。在一些實施例中，不良事件為肝靜脈閉塞疾病(VOD)。在一些實施例中，不良事件為移植失敗。在一些實施例中，不良事件為器官損傷。在一些實施例中，不良事件為不孕。在一些實施例中，不良事件為激素變化。在一些實施例中，不良事件為異常生長形成。在一些實施例中，不良事件為白內障。在一些實施例中，不良事件為移植後淋巴增殖病症(PTLD)。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑包含CD47-結合域。在一些實施例中，CD47結合域包含信號調控蛋白α(SIRPα)或其片段。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑包含免疫球蛋白G(IgG)Fc域。在一些實施例中，IgG Fc域包含IgG1 Fc域。在一些實施例中，IgG1 Fc域包含人類抗體之片段。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑選自由TTI-621、TTI-622、及ALX148組成之群。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑為TTI-621、TTI-622、及ALX148。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑為TTI-622。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑為ALX148。在一些實施例中，IgG Fc域包含IgG4 Fc域。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑為抗體。在一些實施例中，抗體選自由以下組成之群：MIAP410、B6H12、及麥格羅單抗。在一些實施例中，抗體為MIAP410。在一些實施例中，抗體為B6H12。在一些實施例中，抗體為麥格羅單抗。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以有效減少細胞群體之劑量投與。在一些實施例中，細胞群體減少約10%與100%之間。在一些實施例中，細胞群體減少約10%與約20%之間。在一些實施例中，細胞群體減少約20%與約30%之間。在一些實施例中，細胞群體減少約30%與約40%之間。在一些實施例中，細胞群體減少約40%與約50%之間。在一些實施例中，細胞群體減少約50%與約60%之間。在一些實施例中，細胞群體減少約60%與約70%之間。在一些實施例中，細胞群體減少約70%與約80%之間。在一些實施例中，細胞群體減少約80%與約90%之間。在一些實施例中，細胞群體減少約90%與約100%之間。在一些實施例中，細胞群體得以消除。在一些實施例中，細胞群體之減少經由免疫反應而發生。在一些實施例中，免疫反應為NK細胞介導之細胞殺滅、巨噬細胞介導之細胞殺滅、補體依賴性細胞毒性(CDC)、及/或細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。在一些實施例中，免疫反應為細胞之NK細胞介導之細胞殺滅。在一些實施例中，免疫反應為細胞之巨噬細胞介導之細胞殺滅。在一些實施例中，免疫反應為細胞之補體依賴性細胞毒性(CDC)。在一些實施例中，免疫反應為細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內、或顱內投與受試者。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑靜脈內投與受試者。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑皮下投與受試者。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑腹膜內投與受試者。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑肌肉內投與受試者。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑顱內投與受試者。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以1-20天之間之時間間隔投與受試者持續10天與6個月之間之時段。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以1-2天之間之時間間隔投與受試者持續10天與6個月之間之時段。CD47-SIRPα阻斷劑以2-3天之間之時間間隔投與受試者持續10天與6個月之間之時段。CD47-SIRPα阻斷劑以3-4天之間之時間間隔投與受試者持續10天與6個月之間之時段。CD47-SIRPα阻斷劑以4-5天之間之時間間隔投與受試者持續10天與6個月之間之時段。CD47-SIRPα阻斷劑以5-6天之間之時間間隔投與受試者持續10天與6個月之間之時段。CD47-SIRPα阻斷劑以6-7天之間之時間間隔投與受試者持續10天與6個月之間之時段。CD47-SIRPα阻斷劑以7-10天之間之時間間隔投與受試者持續10天與6個月之間之時段。CD47-SIRPα阻斷劑以10-15天之間之時間間隔投與受試者持續10天與6個月之間之時段。CD47-SIRPα阻斷劑以15-20天之間之時間間隔投與受試者持續10天與6個月之間之時段。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以1-10天之間之時間間隔投與受試者持續10-15天之間之時段。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以1-15天之間之時間間隔投與受試者持續15-20天之間之時段。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以1-20天之間之時間間隔投與受試者持續20-25天之間之時段。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以1-20天之間之時間間隔投與受試者持續25-30天之間之時段。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以1-20天之間之時間間隔投與受試者持續1-2個月之間之時段。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以1-20天之間之時間間隔投與受試者持續2-3個月之間之時段。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以1-20天之間之時間間隔投與受試者持續3-4個月之間之時段。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以1-20天之間之時間間隔投與受試者持續4-5個月之間之時段。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以1-20天之間之時間間隔投與受試者持續5-6個月之間之時段。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑：(i)以0.05、0.1、0.3、1、3、或10 mg/kg；(ii)每12小時一次、每24小時一次、每36小時一次、或每48小時一次；及/或(iii)1天與3週之間投與受試者。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以0.05 mg/kg投與。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以0.1 mg/kg投與受試者。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以0.3 mg/kg投與受試者。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以1 mg/kg投與受試者。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以3 mg/kg投與受試者。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以10 mg/kg投與受試者。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以約0.01 mg/kg與約20 mg/kg之間投與受試者。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以約0.01 mg/kg與約0.05 mg/kg之間投與受試者。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以約0.05 mg/kg與約0.1 mg/kg之間投與受試者。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以約0.1 mg/kg與約0.5 mg/kg之間投與受試者。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以約0.5 mg/kg與約1 mg/kg之間投與受試者。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以約1 mg/kg與約5 mg/kg之間投與受試者。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以約5 mg/kg與約10 mg/kg之間投與受試者。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以約10 mg/kg與約15 mg/kg之間投與受試者。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑以約15 mg/kg與約20 mg/kg之間投與受試者。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每6小時投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每12小時投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每18小時投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每24小時投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每36小時投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每48小時投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每3天投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每4天投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每5天投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每6天投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每7天投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每2週投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每4週投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每6週投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每8週投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每3個月投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每4個月投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每5個月投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每6個月投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每約6個月與約12個月之間投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每18個月投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每24個月投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每3年投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每4年投與受試者一次。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑每5年投與受試者一次。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約1天與約50年之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約1天與約1週之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約1週與約2週之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約2週與約3週之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約3週與約1個月之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約1個月與約2個月之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約2個月與約3個月之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約3個月與約4個月之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約4個月與約5個月之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約5個月與約6個月之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約6個月與約1年之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約1年與約2年之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約2年與約3年之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約3年與約4年之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約4年與約5年之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約5年與約10年之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約10年與約15年之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約15年與約20年之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約20年與約30年之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約30年與約40年之間。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑投與受試者持續約40年與約50年之間。在一些實施例中，向受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑持續受試者之一生。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，本文揭示之方法進一步包括將IL-2投與受試者。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑選自由以下組成之群：結合CD47之抗體或其片段、結合CD47之雙特異性抗體、結合CD47之免疫細胞因子融合蛋白、含有CD47之融合蛋白、結合SIRPα之抗體或其片段、結合SIRPα之雙特異性抗體、結合SIRPα之免疫細胞因子融合蛋白、含有SIRPα之融合蛋白、及其組合。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑為結合CD47之抗體或其片段。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑為結合CD47之雙特異性抗體。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑為結合CD47之免疫細胞因子融合蛋白。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑為含有CD47之融合蛋白。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑為結合SIRPα之抗體或其片段。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑為結合SIRPα之雙特異性抗體。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑為結合SIRPα之免疫細胞因子融合蛋白。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑為含有SIRPα之融合蛋白。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑選自由以下組成之群：結合CD47之抗體或其片段、結合CD47之雙特異性抗體、結合CD47之免疫細胞因子融合蛋白、含有CD47之融合蛋白、結合SIRPα之抗體或其片段、結合SIRPα之雙特異性抗體、結合SIRPα之免疫細胞因子融合蛋白、含有SIRPα之融合蛋白、及其組合。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：麥格羅單抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47、及IMC-002。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為麥格羅單抗(Hu5F9-G4)。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為CC-90002。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為IBI-188。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為IBI-322。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為TG-1801 (NI-1701)。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為ALX148。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為TJ011133。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為FA3M3。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為ZL1201。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為AK117。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為AO-176。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為SRF231。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為GenSci-059。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為C47B157。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為C47B161。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為C47B167。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為C47B222。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為C47B227。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為Vx-1004。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為HMBD004。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為SHR-1603。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為AMMS4-G4。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為RTX-CD47。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為IMC-002。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑選自由以下組成之群：結合CD47之抗體或其片段、結合CD47之雙特異性抗體、結合CD47之免疫細胞因子融合蛋白、含有CD47之融合蛋白、結合SIRPα之抗體或其片段、結合SIRPα之雙特異性抗體、結合SIRPα之免疫細胞因子融合蛋白、含有SIRPα之融合蛋白、及其組合。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對CD47之單鏈Fv片段(scFv)、針對CD47之Fab、針對CD47之VHH奈米抗體、針對CD47之DARPin、及其變異體。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為針對CD47之單鏈Fv片段(scFv)、及其變異體。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為針對CD47之Fab、及其變異體。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為針對CD47之VHH奈米抗體、及其變異體。在一些實施例中，結合CD47之抗體或其片段為針對CD47之DARPin、及其變異體。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑選自由以下組成之群：結合CD47之抗體或其片段、結合CD47之雙特異性抗體、結合CD47之免疫細胞因子融合蛋白、含有CD47之融合蛋白、結合SIRPα之抗體或其片段、結合SIRPα之雙特異性抗體、結合SIRPα之免疫細胞因子融合蛋白、含有SIRPα之融合蛋白、及其組合。在一些實施例中，結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23、及P362。在一些實施例中，結合SIRPα之抗體或其片段為ADU-1805。在一些實施例中，結合SIRPα之抗體或其片段為CC-95251。在一些實施例中，結合SIRPα之抗體或其片段為OSE-172 (BI 765063)。在一些實施例中，結合SIRPα之抗體或其片段為KWAR23。在一些實施例中，結合SIRPα之抗體或其片段為P362。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑選自由以下組成之群：結合CD47之抗體或其片段、結合CD47之雙特異性抗體、結合CD47之免疫細胞因子融合蛋白、含有CD47之融合蛋白、結合SIRPα之抗體或其片段、結合SIRPα之雙特異性抗體、結合SIRPα之免疫細胞因子融合蛋白、含有SIRPα之融合蛋白、及其組合。在一些實施例中，結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對SIRPα之單鏈Fv片段(scFv)、針對SIRPα之Fab、針對SIRPα之VHH奈米抗體、針對SIRPα之DARPin、及其變異體。在一些實施例中，結合SIRPα之抗體或其片段為針對SIRPα之單鏈Fv片段(scFv)、及其變異體。在一些實施例中，結合SIRPα之抗體或其片段為針對SIRPα之Fab、及其變異體。在一些實施例中，結合SIRPα之抗體或其片段為針對SIRPα之VHH奈米抗體、及其變異體。在一些實施例中，結合SIRPα之抗體或其片段為針對SIRPα之DARPin、及其變異體。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，CD47-SIRPα阻斷劑選自由以下組成之群結合CD47之抗體或其片段、結合CD47之雙特異性抗體、結合CD47之免疫細胞因子融合蛋白、含有CD47之融合蛋白、結合SIRPα之抗體或其片段、結合SIRPα之雙特異性抗體、結合SIRPα之免疫細胞因子融合蛋白、含有SIRPα之融合蛋白、及其組合。在一些實施例中，含有SIRPα之融合蛋白包含連接至Fc域之SIRPα之CD47結合域。在一些實施例中，Fc域包含選自由以下組成之群的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。在一些實施例中，Fc域包含作為IgG1之Fc域或其一部分。在一些實施例中，Fc域包含作為IgG2之Fc域或其一部分。在一些實施例中，Fc域包含作為IgG3之Fc域或其一部分。在一些實施例中，Fc域包含作為IgG4之Fc域或其一部分。
在一些實施例中，本文揭示之方法包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中先前已向受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。在一些實施例中，外源CD47多肽包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之胺基酸序列。在一些實施例中，外源CD47多肽包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列。在一些實施例中，外源CD47多肽包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列。在一些實施例中，外源CD47多肽包含與內源性CD47多肽之胺基酸序列相同的胺基酸序列。在一些實施例中，外源CD47多肽包含與內源性CD47多肽之胺基酸序列類似的胺基酸序列。在一些實施例中，外源CD47多肽包含與內源性CD47多肽之胺基酸序列不同的胺基酸序列。 實施例
實施例1. 一種方法，其包括向先前投與包含外源表現CD47多肽之細胞群體的患者投與CD47-信號調控蛋白α(SIRPα)阻斷劑。
實施例2. 任何以上或以下實施例之方法，其中CD47-SIRPα阻斷劑選自由以下組成之群：結合CD47之抗體或其片段、結合CD47之雙特異性抗體、結合CD47之免疫細胞因子融合蛋白、含有CD47之融合蛋白、結合SIRPα之抗體或其片段、結合SIRPα之雙特異性抗體、結合SIRPα之免疫細胞因子融合蛋白、含有SIRPα之融合蛋白、及其組合。
實施例3. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：麥格羅單抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47、及IMC-002。
實施例4. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對CD47之單鏈Fv片段(scFv)、針對CD47之Fab、針對CD47之VHH奈米抗體、針對CD47之DARPin、及其變異體。
實施例5. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23、及P362。
實施例6. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對SIRPα之單鏈Fv片段(scFv)、針對SIRPα之Fab、針對SIRPα之VHH奈米抗體、針對SIRPα之DARPin、及其變異體。
實施例7. 任何以上或以下實施例之方法，其中含有SIRPα之融合蛋白包含連接至Fc域之SIRPα之CD47結合域。
實施例8. 任何以上或以下實施例之方法，其中Fc域包含選自由以下組成之群的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。
實施例9. 任何以上或以下實施例之方法，其中投與CD47‑SIRPα阻斷劑減少在患者中仍然有生存力的細胞群體之量。
實施例10. 任何以上或以下實施例之方法，其中投與CD47‑SIRPα阻斷劑減少患者中之外源表現CD47肽之細胞之數目。
實施例11. 任何以上或以下實施例之方法，其中在投與細胞群體之後患者經歷不良事件之後，投與CD47-SIRPα阻斷劑。
實施例12. 任何以上或以下實施例之方法，其中不良事件選自由以下組成之群：異常增生、轉型、腫瘤形成、細胞因子釋放症候群、移植物抗宿主疾病(GVHD)、免疫效應細胞相關神經中毒性症候群(ICANS)。
實施例13. 任何以上或以下實施例之方法，其中在投與細胞群體之後至少1週或更長，投與CD47‑SIRPα阻斷劑。
實施例14. 任何以上或以下實施例之方法，其中在投與細胞群體之後至少1個月或更長，投與CD47‑SIRPα阻斷劑。
實施例15. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含減少表現之MHC I類及/或MHC II人類白血球抗原。
實施例16. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含減少表現之一或多種TCR複合物。
實施例17. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含一或多個轉殖基因，其中轉殖基因編碼選自由以下組成之群的外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、CCL21、Mfge8、及Serpin B9。
實施例18. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現CD47多肽及一或多種選自由以下組成之群之額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA‑G、CD200、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例19. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現CD47多肽及減少表現水準之B2M及/或CIITA。
實施例20. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現CD47多肽並且進一步包含減少表現水準之B2M及CIITA。
實施例21. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現之CD47多肽、減少表現水準之B2M及/或CIITA、及一或多種選自以下各者之群的額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、HLA-G、IDO1、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例22. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現之CD47多肽、減少表現水準之B2M及CIITA、及一或多種選自以下各者之群的額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、HLA-G、IDO1、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例23. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含減少表現水準之TCRα、TCRβ、或兩者。
實施例24. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞為衍生自多能幹細胞之分化細胞。
實施例25. 任何以上或以下實施例之方法，其中多能幹細胞包括經誘導之多能幹細胞。
實施例26. 任何以上或以下實施例之方法，其中分化細胞選自由以下組成之群：心臟細胞、神經細胞、內皮細胞、T細胞、胰島細胞、視網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲狀腺細胞、皮膚細胞、血細胞、及上皮細胞。
實施例27. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包括衍生自原代T細胞之細胞。
實施例28. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞衍生自原代T細胞之池，該等原代T細胞包括來自不同於該患者之一或多個(例如，兩個或兩個以上、三個或三個以上、四個或四個以上、五個或五個以上、十個或十個以上、二十個或二十個以上、五十個或五十個以上、或一百個或一百個以上)受試者之原代T細胞。
實施例29. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞包含嵌合抗原受體(CAR)。
實施例30. 任何以上或以下實施例之方法，其中CAR及外源表現CD47多肽在單一啟動子控制下表現。
實施例31. 任何以上或以下實施例之方法，其中CAR結合選自由以下組成之群之抗原：CD19、CD22、CD38、CD123、CD138、及BCMA。
實施例32. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞包含減少表現之內源性T細胞受體。
實施例33. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞包括細胞毒性T淋巴球相關蛋白4 (CTLA4)及/或計畫性細胞死亡(PD1)之減少之表現。
實施例34. 一種方法，該方法包括：(a)向患者投與一定量之包含外源表現CD47之細胞群體；及(b)向患者投與一定量的有效減少患者中之細胞及其衍生物之數目的CD47-SIRPα阻斷劑。
實施例35. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含減少表現之MHC I類及/或MHC II類人類白血球抗原。
實施例36. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含減少表現之MHC I類及MHC II類人類白血球抗原。
實施例37. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含減少表現之一或多種TCR複合物。
實施例38. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現CD47多肽及一或多種選自由以下組成之群之額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例39. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含一或多個轉殖基因，其中轉殖基因編碼選自由以下組成之群的外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、及Serpin B9。
實施例40. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現CD47多肽及減少表現水準之B2M及/或CIITA。
實施例41. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現CD47多肽及減少表現水準之B2M及CIITA。
實施例42. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現之CD47多肽、減少表現水準之B2M及/或CIITA、及一或多種選自以下各者之群的額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例43. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現之CD47多肽、減少表現水準之B2M及CIITA、及一或多種選自以下各者之群的額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例44. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含減少表現水準之TCRα、TCRβ、或兩者。
實施例45. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞為衍生自多能幹細胞之分化細胞。
實施例46. 任何以上或以下實施例之方法，其中多能幹細胞包括經誘導之多能幹細胞。
實施例47. 任何以上或以下實施例之方法，其中分化細胞選自由以下組成之群：心臟細胞、神經細胞、內皮細胞、T細胞、胰島細胞、視網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲狀腺細胞、皮膚細胞、血細胞、及上皮細胞。
實施例48. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包括衍生自原代T細胞之細胞。
實施例49. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞衍生自原代T細胞之池，該等原代T細胞包括來自不同於該患者之一或多個(例如，兩個或兩個以上、三個或三個以上、四個或四個以上、五個或五個以上、十個或十個以上、二十個或二十個以上、五十個或五十個以上、或一百個或一百個以上)受試者之原代T細胞。
實施例50. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞包含嵌合抗原受體(CAR)。
實施例51. 任何以上或以下實施例之方法，其中CAR及外源表現CD47多肽在單一啟動子控制下表現。
實施例52. 任何以上或以下實施例之方法，其中CAR結合選自由以下組成之群之抗原：CD19、CD22、CD38、CD123、CD138、及BCMA。
實施例53. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞包含減少表現之內源性T細胞受體。
實施例54. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞包括細胞毒性T淋巴球相關蛋白4 (CTLA4)及/或計畫性細胞死亡(PD1)之減少之表現。
實施例55. 任何以上或以下實施例之方法，其中CD47-SIRPα阻斷劑選自由以下組成之群：結合CD47之抗體或其片段、結合CD47之雙特異性抗體、結合CD47之免疫細胞因子融合蛋白、含有CD47之融合蛋白、結合SIRPα之抗體或其片段、結合SIRPα之雙特異性抗體、結合SIRPα之免疫細胞因子融合蛋白、含有SIRPα之融合蛋白、及其組合。
實施例56. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：麥格羅單抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47、及IMC-002。
實施例57. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對CD47之單鏈Fv片段(scFv)、針對CD47之Fab、針對CD47之VHH奈米抗體、針對CD47之DARPin及其變異體。
實施例58. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23、及P362。
實施例59. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對SIRPα之單鏈Fv片段(scFv)、針對SIRPα之Fab、針對SIRPα之VHH奈米抗體、針對SIRPα之DARPin、及其變異體。
實施例60. 任何以上或以下實施例之方法，其中含有SIRPα之融合蛋白包含連接至Fc域之SIRPα之CD47結合域。
實施例61. 任何以上或以下實施例之方法，其中Fc域包含選自由以下組成之群的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。
實施例62. 任何以上或以下實施例之方法，其中在投與細胞群體之後患者經歷不良事件時，投與CD47-SIRPα阻斷劑。
實施例63. 任何以上或以下實施例之方法，其中不良 事件選自由以下組成之群：異常增生、轉型、腫瘤形成、細胞因子釋放症候群、移植物抗宿主疾病(GVHD)、免疫效應細胞相關神經中毒性症候群(ICANS)。
實施例64. 任何以上或以下實施例之方法，其中在投與細胞群體之後至少1週或更長，投與CD47-SIRPα阻斷劑。
實施例65. 任何以上或以下實施例之方法，其中在投與細胞群體之後至少1個月或更長，投與CD47-SIRPα阻斷劑。
實施例66. 一種方法，該方法包括：(a)向患者投與細胞群體，其中細胞包含外源表現CD47多肽；及(b)在步驟(a)之後的時間間隔期之後，向患者投與CD47-SIRPα阻斷劑，其中時間間隔期包括至少1週或更長。
實施例67. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含減少表現之MHC I類及/或MHC II類人類白血球抗原。
實施例68. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含減少表現之MHC I類及MHC II類人類白血球抗原。
實施例69. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含減少表現之一或多種TCR複合物。
實施例70. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現CD47多肽及一或多種選自由以下組成之群之額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例71. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含一或多個轉殖基因，其中轉殖基因編碼選自由以下組成之群的外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、及Serpin B9。
實施例72. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞表現外源CD47多肽並且進一步包含減少表現水準之B2M及/或CIITA。
實施例73. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞表現外源CD47多肽並且進一步包含減少表現水準之B2M及CIITA。
實施例74. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現之CD47多肽、減少表現水準之B2M及/或CIITA、及一或多種選自以下各者之群的額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例75. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現之CD47多肽、減少表現水準之B2M及CIITA、及一或多種選自以下各者之群的額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例76. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含減少表現水準之TCRα、TCRβ、或兩者。
實施例77. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包括衍生自多能幹細胞之分化細胞。
實施例78. 任何以上或以下實施例之方法，其中多能幹細胞包括經誘導之多能幹細胞。
實施例79. 任何以上或以下實施例之方法，其中分化細胞選自由以下組成之群：心臟細胞、神經細胞、內皮細胞、T細胞、胰島細胞、視網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲狀腺細胞、皮膚細胞、血細胞、及上皮細胞。
實施例80. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包括衍生自原代T細胞之細胞。
實施例81. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞衍生自原代T細胞之池，該等原代T細胞包括來自不同於該患者之一或多個(例如，兩個或兩個以上、三個或三個以上、四個或四個以上、五個或五個以上、十個或十個以上、二十個或二十個以上、五十個或五十個以上、或一百個或一百個以上)受試者之原代T細胞。
實施例82. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞包含嵌合抗原受體(CAR)。
實施例83. 任何以上或以下實施例之方法，其中CAR及外源表現CD47多肽在單一啟動子控制下表現。
實施例84. 任何以上或以下實施例之方法，其中CAR結合選自由以下組成之群之抗原：CD19、CD22、CD38、CD123、CD138、及BCMA。
實施例85. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞包含減少表現之內源性T細胞受體。
實施例86. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞包括細胞毒性T淋巴球相關蛋白4 (CTLA4)及/或計畫性細胞死亡(PD1)之減少之表現。
實施例87. 任何以上或以下實施例之方法，其中時間間隔期包括至少1個月或更長。
實施例88. 任何以上或以下實施例之方法，其中CD47-SIRPα阻斷劑選自由以下組成之群：結合CD47之抗體或其片段、結合CD47之雙特異性抗體、結合CD47之免疫細胞因子融合蛋白、含有CD47之融合蛋白、結合SIRPα之抗體或其片段、結合SIRPα之雙特異性抗體、結合SIRPα之免疫細胞因子融合蛋白、含有SIRPα之融合蛋白、及其組合。
實施例89. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：麥格羅單抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47、及IMC-002。
實施例90. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對CD47之單鏈Fv片段(scFv)、針對CD47之Fab、針對CD47之VHH奈米抗體、針對CD47之DARPin及其變異體。
實施例91. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23、及P362。
實施例92. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對SIRPα之單鏈Fv片段(scFv)、針對SIRPα之Fab、針對SIRPα之VHH奈米抗體、針對SIRPα之DARPin、及其變異體。
實施例93. 任何以上或以下實施例之方法，其中含有SIRPα之融合蛋白包含連接至Fc域之SIRPα之CD47結合域。
實施例94. 任何以上或以下實施例之方法，其中Fc域包含選自由以下組成之群的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。
實施例95. 任何以上或以下實施例之方法，其中步驟(b)減少在患者中仍然有生存力的細胞群體之量。
實施例96. 任何以上或以下實施例之方法，其中步驟(b)減少患者中之外源表現CD47肽之細胞之數目。
實施例97. 任何以上或以下實施例之方法，進一步包括在步驟(b)之後，投與第二細胞群體。
實施例98. 一種調節患者中之細胞療法之活性的方法，其中患者已接受至少一個劑量的治療有效之包含外源表現CD47多肽之細胞群體，該方法包括以有效調節細胞群體活性之量向患者投與CD47-SIRPα阻斷劑。
實施例99. 任何以上或以下實施例之方法，其中CD47-SIRPα阻斷劑選自由以下組成之群：結合CD47之抗體或其片段、結合CD47之雙特異性抗體、結合CD47之免疫細胞因子融合蛋白、含有CD47之融合蛋白、結合SIRPα之抗體或其片段、結合SIRPα之雙特異性抗體、結合SIRPα之免疫細胞因子融合蛋白、含有SIRPα之融合蛋白、及其組合。
實施例100. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：麥格羅單抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47、及IMC-002。
實施例101. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對CD47之單鏈Fv片段(scFv)、針對CD47之Fab、針對CD47之VHH奈米抗體、針對CD47之DARPin及其變異體。
實施例102. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23、及P362。
實施例103. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對SIRPα之單鏈Fv片段(scFv)、針對SIRPα之Fab、針對SIRPα之VHH奈米抗體、針對SIRPα之DARPin、及其變異體。
實施例104. 任何以上或以下實施例之方法，其中含有SIRPα之融合蛋白包含連接至Fc域之SIRPα之CD47結合域。
實施例105. 任何以上或以下實施例之方法，其中Fc域包含選自由以下組成之群的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。
實施例106. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含減少表現之MHC I類及/或MHC II類人類白血球抗原。
實施例107. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含減少表現之MHC I類及MHC II類人類白血球抗原。
實施例108. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含減少表現之一或多種TCR複合物。
實施例109. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現CD47多肽及一或多種選自由以下組成之群之額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例110. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含一或多個轉殖基因，其中轉殖基因編碼選自由以下組成之群的外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、及Serpin B9。
實施例111. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現CD47多肽及減少表現水準之B2M及/或CIITA。
實施例112. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現CD47多肽及減少表現水準之B2M及CIITA。
實施例113. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現之CD47多肽、減少表現水準之B2M及/或CIITA、及一或多種選自以下各者之群的額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例114. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現之CD47多肽、減少表現水準之B2M及CIITA、及一或多種選自以下各者之群的額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例115. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含減少表現水準之TCRα、TCRβ、或兩者。
實施例116. 任何以上或以下實施例之方法，其中治療有效細胞群體之至少一個劑量包括該群體之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多個劑量。
實施例117. 任何以上或以下實施例之方法，其中調節包括降低患者中之治療有效細胞群體之數目。
實施例118. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包括衍生自多能幹細胞之分化細胞。
實施例119. 任何以上或以下實施例之方法，其中多能幹細胞包括經誘導之多能幹細胞。
實施例120. 任何以上或以下實施例之方法，其中分化細胞選自由以下組成之群：心臟細胞、神經細胞、內皮細胞、T細胞、胰島細胞、視網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲狀腺細胞、皮膚細胞、血細胞、及上皮細胞。
實施例121. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包括衍生自原代T細胞之細胞。
實施例122. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞衍生自原代T細胞之池，該等原代T細胞包括來自不同於該患者之一或多個(例如，兩個或兩個以上、三個或三個以上、四個或四個以上、五個或五個以上、十個或十個以上、二十個或二十個以上、五十個或五十個以上、或一百個或一百個以上)受試者之原代T細胞。
實施例123. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞包含嵌合抗原受體(CAR)。
實施例124. 任何以上或以下實施例之方法，其中CAR及外源表現CD47多肽在單一啟動子控制下表現。
實施例125. 任何以上或以下實施例之方法，其中CAR結合選自由以下組成之群之抗原：CD19、CD22、CD38、CD123、CD138、及BCMA。
實施例126. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞包含減少表現之內源性T細胞受體。
實施例127. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞包括細胞毒性T淋巴球相關蛋白4 (CTLA4)及/或計畫性細胞死亡(PD1)之減少之表現。
實施例128. 任何以上或以下實施例之方法，其中患者中之細胞群體之活性包括細胞之不當活性。
實施例129. 任何以上或以下實施例之方法，其中不當活性選自由以下組成之群：異常增生、轉型、腫瘤形成、細胞因子釋放症候群、移植物抗宿主疾病(GVHD)、免疫效應細胞相關神經中毒性症候群(ICANS)。
實施例130. 一種控制患者中之細胞療法效應之方法，該方法包括：(a)向患者投與包含細胞群體之組合物，其中細胞包含外源表現CD47多肽；(b)在步驟(a)之後的時間間隔之後，以有效誘導針對在步驟(a)中投與之細胞群體之免疫反應之量，進一步向患者投與CD47-SIRPα阻斷劑，由此控制患者中之細胞群體效應。
實施例131. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含減少表現之MHC I類及/或MHC II類人類白血球抗原。
實施例132. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含減少表現之MHC I類及MHC II類人類白血球抗原。
實施例133. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含減少表現之一或多種TCR複合物。
實施例134. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現CD47多肽及一或多種選自由以下組成之群之額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例135. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含一或多個轉殖基因，其中轉殖基因編碼選自由以下組成之群的外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、及Serpin B9。
實施例136. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現CD47多肽及減少表現水準之B2M及/或CIITA。
實施例137. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現CD47多肽及減少表現水準之B2M及CIITA。
實施例138. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現之CD47多肽、減少表現水準之B2M及/或CIITA、及一或多種選自以下各者之群的額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例139. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現之CD47多肽、減少表現水準之B2M及CIITA、及一或多種選自以下各者之群的額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例140. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含減少表現水準之TCRα、TCRβ、或兩者。
實施例141. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包括衍生自多能幹細胞之分化細胞。
實施例142. 任何以上或以下實施例之方法，其中多能幹細胞包括經誘導之多能幹細胞。
實施例143. 任何以上或以下實施例之方法，其中分化細胞選自由以下組成之群：心臟細胞、神經細胞、內皮細胞、T細胞、胰島細胞、視網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲狀腺細胞、皮膚細胞、血細胞、及上皮細胞。
實施例144. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包括衍生自原代T細胞之細胞。
實施例145. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞衍生自原代T細胞之池，該等原代T細胞包括來自不同於該患者之一或多個(例如，兩個或兩個以上、三個或三個以上、四個或四個以上、五個或五個以上、十個或十個以上、二十個或二十個以上、五十個或五十個以上、或一百個或一百個以上)受試者之原代T細胞。
實施例146. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞包含嵌合抗原受體(CAR)。
實施例147. 任何以上或以下實施例之方法，其中CAR及外源表現CD47多肽在單一啟動子控制下表現。
實施例148. 任何以上或以下實施例之方法，其中CAR結合選自由以下組成之群之抗原：CD19、CD22、CD38、CD123、CD138、及BCMA。
實施例149. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞包含減少表現之內源性T細胞受體。
實施例150. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞包括細胞毒性T淋巴球相關蛋白4 (CTLA4)及/或計畫性細胞死亡(PD1)之減少之表現。
實施例151. 任何以上或以下實施例之方法，其中時間間隔包括至少1週或更長。
實施例152. 任何以上或以下實施例之方法，其中時間間隔包括至少1個月或更長。
實施例153. 任何以上或以下實施例之方法，其中CD47-SIRPα阻斷劑選自由以下組成之群：結合CD47之抗體或其片段、結合CD47之雙特異性抗體、結合CD47之免疫細胞因子融合蛋白、含有CD47之融合蛋白、結合SIRPα之抗體或其片段、結合SIRPα之雙特異性抗體、結合SIRPα之免疫細胞因子融合蛋白、含有SIRPα之融合蛋白、及其組合。
實施例154. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：麥格羅單抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47、及IMC-002。
實施例155. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對CD47之單鏈Fv片段(scFv)、針對CD47之Fab、針對CD47之VHH奈米抗體、針對CD47之DARPin及其變異體。
實施例156. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23、及P362。
實施例157. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對SIRPα之單鏈Fv片段(scFv)、針對SIRPα之Fab、針對SIRPα之VHH奈米抗體、針對SIRPα之DARPin、及其變異體。
實施例158. 任何以上或以下實施例之方法，其中含有SIRPα之融合蛋白包含連接至Fc域之SIRPα之CD47結合域。
實施例159. 任何以上或以下實施例之方法，其中Fc域包含選自由以下組成之群的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。
實施例160. 任何以上或以下實施例之方法，其中在在投與步驟(b)之前，步驟(a)重複至少1-10次。
實施例161. 任何以上或以下實施例之方法，其中患者中之細胞群體效應包括細胞之不良效應或不當效應。
實施例162. 任何以上或以下實施例之方法，其中不良效應選自由以下組成之群：異常增生、轉型、腫瘤形成、細胞因子釋放症候群、移植物抗宿主疾病(GVHD)、免疫效應細胞相關神經中毒性症候群(ICANS)。
實施例163. 一種控制患者中之細胞療法效應之方法，該方法包括向先前投與包含外源表現CD47多肽之細胞的患者投與CD47-SIRPα阻斷劑。
實施例164. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含減少表現之MHC I類及/或MHC II類人類白血球抗原。
實施例165. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含減少表現之MHC I類及MHC II類人類白血球抗原。
實施例166. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含減少表現之一或多種TCR複合物。
實施例167. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現CD47多肽及一或多種選自由以下組成之群之額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例168. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含一或多個轉殖基因，其中轉殖基因編碼選自由以下組成之群的外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、及Serpin B9。
實施例169. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現CD47多肽及減少表現水準之B2M及/或CIITA。
實施例170. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現CD47多肽及減少表現水準之B2M及CIITA。
實施例171. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現之CD47多肽、減少表現水準之B2M及/或CIITA、及一或多種選自以下各者之群的額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例172. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包含外源表現之CD47多肽、減少表現水準之B2M及CIITA、及一或多種選自以下各者之群的額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例173. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞進一步包含減少表現水準之TCRα、TCRβ、或兩者。
實施例174. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包括衍生自多能幹細胞之分化細胞。
實施例175. 任何以上或以下實施例之方法，其中多能幹細胞包括經誘導之多能幹細胞。
實施例176. 任何以上或以下實施例之方法，其中分化細胞選自由以下組成之群：心臟細胞、神經細胞、內皮細胞、T細胞、胰島細胞、視網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲狀腺細胞、皮膚細胞、血細胞、及上皮細胞。
實施例177. 任何以上或以下實施例之方法，其中細胞包括衍生自原代T細胞之細胞。
實施例178. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞衍生自原代T細胞之池，該等原代T細胞包括來自不同於該患者之一或多個(例如，兩個或兩個以上、三個或三個以上、四個或四個以上、五個或五個以上、十個或十個以上、二十個或二十個以上、五十個或五十個以上、或一百個或一百個以上)受試者之原代T細胞。
實施例179. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞包含嵌合抗原受體(CAR)。
實施例180. 任何以上或以下實施例之方法，其中CAR及外源表現CD47多肽在單一啟動子控制下表現。
實施例181. 任何以上或以下實施例之方法，其中CAR結合選自由以下組成之群之抗原：CD19、CD22、CD38、CD123、CD138、及BCMA。
實施例182. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞包含減少表現之內源性T細胞受體。
實施例183. 任何以上或以下實施例之方法，其中衍生自原代T細胞之細胞包括細胞毒性T淋巴球相關蛋白4 (CTLA4)及/或計畫性細胞死亡(PD1)之減少之表現。
實施例184. 任何以上或以下實施例之方法，其中CD47-SIRPα阻斷劑選自由以下組成之群：結合CD47之抗體或其片段、結合CD47之雙特異性抗體、結合CD47之免疫細胞因子融合蛋白、含有CD47之融合蛋白、結合SIRPα之抗體或其片段、結合SIRPα之雙特異性抗體、結合SIRPα之免疫細胞因子融合蛋白、含有SIRPα之融合蛋白、及其組合。
實施例185. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：麥格羅單抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47、及IMC-002。
實施例186. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對CD47之單鏈Fv片段(scFv)、針對CD47之Fab、針對CD47之VHH奈米抗體、針對CD47之DARPin及其變異體。
實施例187. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23、及P362。
實施例188. 任何以上或以下實施例之方法，其中結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對SIRPα之單鏈Fv片段(scFv)、針對SIRPα之Fab、針對SIRPα之VHH奈米抗體、針對SIRPα之DARPin、及其變異體。
實施例189. 任何以上或以下實施例之方法，其中含有SIRPα之融合蛋白包含連接至Fc域之SIRPα之CD47結合域。
實施例190. 任何以上或以下實施例之方法，其中Fc域包含選自由以下組成之群的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。
實施例191. 任何以上或以下實施例之方法，其中先前投與細胞之效應包括患者中之不良效應或不當效應。
實施例192. 任何以上或以下實施例之方法，其中不良效應選自由以下組成之群：異常增生、轉型、腫瘤形成、細胞因子釋放症候群、移植物抗宿主疾病(GVHD)、免疫效應細胞相關神經中毒性症候群(ICANS)。
實施例193. 一種用於治療不良效應之CD47-SIRPα阻斷劑，該不良效應在投與包含外源表現CD47多肽之細胞群體之後發生。
實施例194. 一種用於治療不良效應之CD47-SIRPα阻斷劑，該不良效應在投與包含外源表現CD47多肽及減少表現之MHC I類及MHC II人類白血球抗原的細胞群體之後發生。
實施例195. 一種用於治療不良效應之CD47-SIRPα阻斷劑，該不良效應在投與包含外源表現CD47多肽及減少表現之MHC I類及MHC II人類白血球抗原及一或多種TCR複合物的細胞群體之後發生。
實施例196. CD47-SIRPα阻斷劑在製造供在有需要之患者中進行細胞療法之藥物中的用途，其中已向患者投與包含外源表現CD47多肽之細胞。
實施例197. CD47-SIRPα阻斷劑在製造供在有需要之患者中進行細胞療法之藥物中的用途，其中已向患者投與包含外源表現CD47多肽及減少表現之MHC I類及MHC II人類白血球抗原之細胞。
實施例198. CD47-SIRPα阻斷劑在製造供在有需要之患者中進行細胞療法之藥物中的用途，其中已向患者投與包含外源表現CD47多肽及減少表現之MHC I類及MHC II人類白血球抗原及一或多種TCR複合物之細胞。
實施例199. CD47-SIRPα阻斷劑在製造供調節患者中之細胞療法活性之藥物中的用途，其中患者已接受至少一個劑量的治療有效之包含外源表現CD47多肽之細胞群體。
實施例200. CD47-SIRPα阻斷劑在製造供調節患者中之細胞療法活性之藥物中的用途，其中患者已接受至少一個劑量的治療有效之包含外源表現CD47多肽及減少表現之MHC I類及MHC II人類白血球抗原之細胞群體。
實施例201. CD47-SIRPα阻斷劑在製造供調節患者中之細胞療法活性之藥物中的用途，其中患者已接受至少一個劑量的治療有效之包含外源表現CD47多肽及減少表現之MHC I類及MHC II人類白血球抗原及一或多種TCR複合物之細胞群體。
實施例202. CD47-SIRPα阻斷劑在製造供控制患者中之細胞療法效應之藥物中的用途，其中已向患者投與包含外源表現CD47多肽之細胞。
實施例203. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中CD47-SIRPα阻斷劑選自由以下組成之群：結合CD47之抗體或其片段、結合CD47之雙特異性抗體、結合CD47之免疫細胞因子融合蛋白、含有CD47之融合蛋白、結合SIRPα之抗體或其片段、結合SIRPα之雙特異性抗體、結合SIRPα之免疫細胞因子融合蛋白、含有SIRPα之融合蛋白、及其組合。
實施例204. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：麥格羅單抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47、及IMC-002。
實施例205. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對CD47之單鏈Fv片段(scFv)、針對CD47之Fab、針對CD47之VHH奈米抗體、針對CD47之DARPin、及其變異體。
實施例206. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23、及P362。
實施例207. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對SIRPα之單鏈Fv片段(scFv)、針對SIRPα之Fab、針對SIRPα之VHH奈米抗體、針對SIRPα之DARPin、及其變異體。
實施例208. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中含有SIRPα之融合蛋白包含連接至Fc域之SIRPα之CD47結合域。
實施例209. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中Fc域包含選自由以下組成之群的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。
實施例210. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中細胞進一步包含減少表現之MHC I類及/或MHC II類人類白血球抗原。
實施例211. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中細胞包含減少表現之MHC I類及MHC II類人類白血球抗原。
實施例212. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中細胞包含外源表現CD47多肽及一或多種選自由以下組成之群之額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例213. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中細胞進一步包含一或多個轉殖基因，其中轉殖基因編碼選自由以下組成之群的外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、及Serpin B9。
實施例214. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中細胞包含外源表現CD47多肽及減少表現水準之B2M及/或CIITA。
實施例215. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中細胞包含外源表現CD47多肽及減少表現水準之B2M及CIITA。
實施例216. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中細胞包含外源表現CD47多肽及減少表現水準之B2M及CIITA。
實施例217. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中細胞包含外源表現之CD47多肽、減少表現水準之B2M及/或CIITA、及一或多種選自以下各者之群的額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例218. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中細胞包含外源表現之CD47多肽、減少表現水準之B2M及CIITA、及一或多種選自以下各者之群的額外外源表現多肽：CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、DUX4、PD-L1、IDO1、HLA-G、FasL、CCL21、Mfge8、Serpin B9、及其任何組合。
實施例219. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中細胞進一步包含減少表現水準之TCRα、TCRβ或兩者。
實施例220. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中細胞為衍生自多能幹細胞之分化細胞。
實施例221. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中多能幹細胞包括經誘導之多能幹細胞。
實施例222. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中分化細胞選自由以下組成之群：心臟細胞、神經細胞、內皮細胞、T細胞、胰島細胞、視網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲狀腺細胞、皮膚細胞、血細胞、及上皮細胞。
實施例223. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中細胞包括衍生自原代T細胞之細胞。
實施例224. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中衍生自原代T細胞之細胞衍生自原代T細胞之池，該等原代T細胞包括來自不同於該患者之一或多個(例如，兩個或兩個以上、三個或三個以上、四個或四個以上、五個或五個以上、十個或十個以上、二十個或二十個以上、五十個或五十個以上、或一百個或一百個以上)受試者之原代T細胞。
實施例225. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中衍生自原代T細胞之細胞包含嵌合抗原受體(CAR)。
實施例226. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中CAR及外源表現CD47多肽在單一啟動子控制下表現。
實施例227. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中CAR結合選自由以下組成之群之抗原：CD19、CD22、CD38、CD123、CD138、及BCMA。
實施例228. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中衍生自原代T細胞之細胞包含減少表現之內源性T細胞受體。
實施例229. 任何以上或以下實施例之CD47-SIRPα阻斷劑或用途，其中衍生自原代T細胞之細胞包括細胞毒性T淋巴球相關蛋白4 (CTLA4)及/或計畫性細胞死亡(PD1)之減少之表現。
實施例230. 一種用於治療不良效應之CD47-SIRPα阻斷劑，該不良效應在投與包含外源表現CD47多肽及減少表現之B2M、CIITA及TCRα的細胞群體之後發生。
實施例231. 一種用於治療不良效應之CD47-SIRPα阻斷劑，該不良效應在投與包含外源表現CD47多肽及減少表現之B2M、CIITA及TCRβ的細胞群體之後發生。
實施例232. CD47-SIRPα阻斷劑在製造供在有需要之患者中進行細胞療法之藥物中的用途，其中已向患者投與包含外源表現CD47多肽及減少表現之B2M、CIITA及TCRα之細胞。
實施例233. CD47-SIRPα阻斷劑在製造供在有需要之患者中進行細胞療法之藥物中的用途，其中已向患者投與包含外源表現CD47多肽及減少表現之B2M、CIITA及TCRβ之細胞。
實施例234. CD47-SIRPα阻斷劑在製造供調節患者中之細胞療法活性之藥物中的用途，其中患者已接受至少一個劑量的治療有效之包含外源表現CD47多肽及減少表現之B2M、CIITA及TCRα之細胞群體。
實施例235. CD47-SIRPα阻斷劑在製造供調節患者中之細胞療法活性之藥物中的用途，其中患者已接受至少一個劑量的治療有效之包含外源表現CD47多肽及減少表現之B2M、CIITA及TCRβ之細胞群體。 實例 實例1. 活體外CD47阻斷
CD47阻斷劑(在本文中亦稱為CD47-SIRPa阻斷劑)消除CD47對於NK細胞及巨噬細胞殺滅之抑制效應的能力在XCELLIGENCE MP平台(ACEA BioSciences)上分析。將96孔E板(ACEA BioSciences)以膠原蛋白(Sigma-Aldrich)塗佈並且將4×105人類HIP( B2M -/- 、 CIITA -/- 、 CD47 + )或雙重敲除( B2M -/- 、 CIITA -/- )細胞塗鋪於100 μL細胞特異性培養基中。將人類細胞塗鋪並且一天後用100 ug/ml抗CD47抗體MIP410(BioXCell, Lebanon, NH)或IgG1同型對照(BioXCell)治療。細胞指數值達到0.7之後，在使用或不使用1 ng/ml人類IL-2(PeproTech)的情況下，以1:1之E:T比率添加人類NK細胞或人類巨噬細胞(Lonza)。作為殺滅對照，細胞用2% TRITON X100治療。未觀察到經刺激或未刺激NK細胞(第1A圖)或巨噬細胞(第2A圖)對於表現CD47之HIP細胞的殺滅，而雙重敲除細胞藉由NK細胞(第1B圖)及巨噬細胞(第2B圖)兩者快速殺滅。相反，用抗CD47抗體治療之HIP細胞被NK細胞(第1D圖)及巨噬細胞(第2D圖)快速殺滅，而在IgG1同型對照治療之後，未發現殺滅(第1C圖及第2C圖)。此實例證明CD47阻斷消除CD47針對NK細胞及巨噬細胞殺滅之保護效應。 實例2. 活體內CD47阻斷
NSG小鼠具有功能性巨噬細胞，但是缺少其他免疫細胞。因此將1百萬人類NK細胞i.v. 轉移至NSG小鼠中並且同時將5萬人類HIP( B2M -/- 、 CIITA -/- 、 CD47 + )iPSC皮下注射至同一小鼠中。每日s.c.注射(n = 5) 500 ug/kg抗CD47抗體(MIP410; BioXCell)。對照小鼠接受IgG1同型對照(BioXCell)(n=3)。對於生物發光成像(BLI)，將D-螢火蟲螢光素鉀鹽(375 mg/kg; Biosynth)溶解於PBS (pH 7.4) (Gibco, Invitrogen)中並且腹膜內注射(每個小鼠250 μL)至麻醉小鼠中。動物使用AMI成像器(Spectral Instruments)成像。所關注之區域(ROI)生物發光以最大光子/秒/平方公分/球面度(p s−1 cm−2 sr−1)為單位來定量。來自ROI之最大信號使用Living Image software (MediaCybernetics)來量測。小鼠在第0天、第2天及每第4天監測直到信號達到背景或畸胎瘤達到＞2000 mm 3體積為止。投與IgG1同型對照抗體之小鼠中之HIP iPSC之生物發光在25天過程中增加，指示iPSC之存活(第3A圖)。相反，在投與抗CD47抗體之後，HIP iPSC之生物發光快速降低，到第4天降至背景以下(第3B圖)。此實例展示CD47阻斷可誘導表現CD47之低免疫細胞之殺滅。 實例3. 產生低免疫原性CAR-T細胞來逃避免疫識別以便有利於同種異體療法 A.摘要
現成CAR-T細胞可提供超過自體策略之優勢，包括製造簡易、品質控制及避免惡性污染及T細胞功能障礙。然而，針對組織不相容T細胞之劇烈宿主抗移植物免疫反應阻止同種異體CAR-T細胞之擴增及持久性並且減輕此方法之功效。本文描述使用新穎低免疫編輯平台來工程化並且產生人類免疫逃避CAR-T細胞之方法。該系統部分地基於以下發現：當人類白血球抗原(HLA)I類及II類基因失活並且CD47過度表現時，T細胞失去其免疫原性。另外，發現TCR敲除可用於控制移植物抗宿主疾病之風險。
此實例描述低免疫原性CD19特異性CAR-T細胞(在本文中亦稱為HIP CD19CAR-T細胞)，以及在活體外腫瘤功效實驗中，與對照CD19特異性CAR-T細胞相比，外源CD47表現對於此類細胞之活性的效應。在實驗中，CD19 +腫瘤細胞用作靶細胞並且HIP CD19CAR-T細胞(諸如測試及對照CAR-T細胞)用作效應細胞。在所描述實驗中，HIP CD19CAR-T細胞(亦被稱為「HIPCAR-T細胞」)為含有以下各者之T細胞：(a) B2M、 CIITA及 TRAC基因之基因組編輯及(b)帶有編碼CD19特異性CAR之多核苷酸及編碼CD47之多核苷酸的轉殖基因。此類HIP CD19CAR-T細胞亦被稱為 B2M -/- 、 CIITA -/- 、 TRAC -/- 、CD19特異性CAR-CD47 T細胞。另外，在實驗中，對照CAR-T細胞包括(a)表現編碼CD19特異性CAR之多核苷酸的免疫原性T細胞，包括表現與tisagenlecleucel或其生物類似物/替代物相同CAR構建體的T細胞，(b)表現編碼CD19特異性CAR及EGFRt之多核苷酸的免疫原性T細胞，及(c)假轉染T細胞，亦即假轉染之T細胞。
當移植至同種異體人源化小鼠中時，與自相同人類供給者產生之免疫原性CD19陽性CAR-T細胞相比，HIP CD19CAR -T細胞(例如， B2M -/- 、 CIITA -/- 、 TRAC -/- 、CD19特異性CAR-CD47 T細胞)逃避T及B細胞之免疫識別。先天免疫細胞(例如，NK細胞或巨噬細胞)檢定顯示在活體外及活體內，CD47過度表現保護HIP CD19CAR-T細胞免於先天免疫細胞殺滅。藉由使用每個細胞結合之抗體的流式細胞計數估計方法，分析CD47表現水準以便評估臨界保護水準。針對CD47之阻斷抗體使得HIP CD19CAR-T細胞易被巨噬細胞及NK細胞殺滅，證實CD47過度表現對於逃避先天免疫清除之重要性。因此，使用針對CD47之阻斷抗體預期為提供本文所述HIP CD19CAR-T細胞之安全開關的策略。
經分離之CD47過度表現及使 B2M、 CIITA及 TRAC基因失活之遺傳修飾均不顯示對於CAR-T細胞之細胞毒性潛力的任何效應。在一系列腫瘤細胞: HIP CD19CAR-T細胞比率下，HIP CD19CAR-T細胞(例如， B2M -/- 、 CIITA -/- 、 TRAC -/- 、CD19特異性CAR-CD47 T細胞)在活體外CD19 +腫瘤模型中以及在免疫缺陷NSG小鼠中保持其抗腫瘤活性。如與免疫原性CAR-T細胞相比，引入低免疫基因編輯(例如， B2M/CIITA/TRAC基因失活)似乎不改變其與細胞因子無關之生長。此等發現結果顯示在同種異體接受者中，HIP CD19CAR-T細胞在功能上為免疫逃避的，具有延長的細胞毒性抗腫瘤能力。因此，結果表明HIP CD19CAR-T細胞可為癌症患者提供普遍免疫治療選項。 B. 方法
產生CAR-CD47工程化全T細胞：將全T細胞解凍並且在補充有IL-2之標準T細胞培養基中培養隔夜。將有生存力的T細胞點計並且以1:1之珠粒:細胞比率用CD3/CD28珠粒來活化。在魚精蛋白硫酸鹽存在下，以100之MOI，使用CD19特異性CAR及CD47表現慢病毒(例如，在單一啟動子控制下表現CD19特異性CAR及CD47轉殖基因之慢病毒)來執行T細胞轉導以便產生CD47工程化全T細胞。另外，產生假轉染平移T細胞，其中將T細胞假轉染。細胞在補充有IL-2之標準T細胞培養基中擴增並且在標準冷凍培養基中冷凍以供稍後使用。
產生 B2M/CIITA雙重敲除全T細胞及 B2M/CIITA雙重敲除/CAR-CD47工程化全T細胞：將冷凍假轉染T細胞，亦即假轉染之T細胞，及CD47工程化T細胞解凍並且隔夜培養，然後用CD3/CD28珠粒將細胞重新活化。在約第4天之後，將珠粒自細胞移除。含有Cas9及靶向 B2M及 CIITA之引導RNA的核糖核蛋白(RNP)複合物根據標準方案來形成。在使用標準細胞電穿孔裝置來電穿孔之前，將T細胞重新懸浮於核轉染緩衝液中並且添加至RNP複合物。電穿孔之後，細胞在補充有IL-2之標準T細胞培養基中回收。編輯效率藉由CD47、HLA-ABC、及HLA-DR之FACS分析來評定。
與細胞因子無關之生長檢定：工程化T細胞在使用之前在1xPBS中洗滌兩次並且在用於檢定中之前，重新懸浮於標準T細胞培養基中隔夜。在第1天，將細胞重新懸浮於用或不用IL-2補充之標準培養基中。其後，活細胞每週藉由錐蟲藍排除來計數兩次。在整個檢定中，細胞濃度使用IL-2補充培養基來調整。
NK細胞培養：在細胞用於檢定中之前，在標準NK細胞培養基(例如，RPMI 1640加上10%熱失活FCS及1% Pen/Strep)中，人類原代NK細胞用人類IL-2刺激。
巨噬細胞培養：藉由聚蔗糖分離，將PBMC自新鮮血液分離並且重新懸浮於標準巨噬細胞培養基(例如，具有10%熱失活FCS及1% Pen/Strep之RPMI 1640)。將細胞塗鋪並且在人類M-CSF中培養。每隔一天更換培養基。自第6天開始，將人類IL-2添加至培養基中約24小時，然後將細胞用於實驗檢定中。
CD19 +腫瘤培養物：在用於實驗檢定中之前，將CD19 +腫瘤細胞在標準細胞培養基(例如，具有10%熱失活FCS及1% Pen/Strep之RPMI 1640)中培養。
使用即時細胞分析系統之先天殺滅：NK細胞殺滅檢定及巨噬細胞吞噬檢定在即時細胞分析儀器(例如，XCelligence®MP平台，Agilent)上執行。簡言之，將T細胞塗鋪於CD19 +腫瘤細胞特異性培養基中。在細胞指數值達到0.7之後，以1:1之E:T比率，添加人類NK細胞或人類巨噬細胞，並且人類IL-2用於NK細胞並且沒有IL-2用於巨噬細胞。一些孔用人類CD47阻斷抗體或人類EGFR抗體(例如，西妥昔單抗)預處理並且在即時分析檢定過程期間再次處理。將資料標準化並且用即時細胞分析儀器軟體來分析。
約48小時之後，將T細胞收集並且用活/死亡細胞生存力染色檢定之組分來染色。簡言之，根據製造商之方案，將細胞用鈣黃綠素AM及乙錠同二聚體-1染色。藉由流式細胞術執行分析並且結果表示為死亡細胞之百分比。
使用即時細胞分析系統之活體外CD19 +腫瘤細胞殺滅：活體外CD19 +腫瘤細胞殺滅檢定在即時細胞分析儀器(例如，XCelligence®MP平台，Agilent)上執行。簡言之，將T細胞塗鋪於CD19 +腫瘤細胞特異性培養基中。在細胞指數值達到0.7之後，以0.125:1、0.25:1、0.5:1、1:1、3:1或7:1之E:T比率，將人類NK細胞或人類巨噬細胞添加至標準T細胞培養基中。將資料標準化並且用即時細胞分析儀器軟體來分析。
具有接受性轉移之活體內細胞毒性檢定：(1)未修飾T細胞及修飾 B2M-/-CIITA-/-T細胞或(2)未修飾T細胞及修飾 B2M-/-CIITA-/-CD47 tgT細胞混合併且使用多色細胞標記套組，用不同螢光團染料來染色。將細胞稀釋於鹽水及人類IL-2中。然後，細胞與人類原代NK細胞或人類巨噬細胞組合併且i.p.注射至免疫缺陷NSG小鼠中。人類原代NK細胞在注射之前用人類IL-2活體外預處理。注射之後大約48小時，腹膜細胞自實驗小鼠收集並且藉由流式細胞術來分析。比較未修飾T細胞與修飾T細胞之間之比率。結果在第5A-5B圖中示出。接受性轉移資料顯示帶有失活 HLA-I/II基因之CAR-T細胞在活體內藉由NK細胞及巨噬細胞殺滅。但是，帶有失活HLA-I/II及TCR基因與過度表現CD47之CAR-T細胞不被先天免疫細胞殺滅。
酶聯免疫吸收斑點ELISpot檢定：將低免疫原性CAR-T細胞或同種異體CAR-T細胞注射至每組n=3之NSG-SGM3人源化小鼠中。在細胞注射之後大約6天，接受者脾細胞自脾臟分離並且用作應答細胞。供給者T細胞經絲裂黴素治療並且用作刺激細胞。將刺激細胞與接受者應答T細胞一起培育48小時並且IFN-γ斑點頻率使用ELISpot板讀取器來點計。結果在第6圖中示出。低免疫原性CAR-T細胞不誘導T細胞活化，然而，在人源化小鼠中偵測到活化T細胞同種異體CAR-T細胞。
供給者特異性抗體檢定：藉由加熱至56℃大約30 min，將來自接受者小鼠(例如，注射低免疫原性CAR-T細胞或同種異體CAR-T細胞之NSG-SGM3人源化小鼠)之血清將去補體。相等量之血清及細胞懸浮液在4℃下培育大約45 min。細胞用FITC-偶聯山羊抗人類IgM標記並且藉由流式細胞術來分析。結果在第6圖中示出。低免疫原性CAR-T細胞不誘導供給者特異性抗體結合，但是偵測到針對同種異體CAR-T細胞之IgM結合。 C. 結果
由於人類白血球抗原(HLA)I類及II及TCR基因滅活(例如，敲除 B2M、 CIITA及 TRAC基因)及CD47過度表現，本文所述低免疫原性T細胞似乎缺少免疫原性。此類低免疫T細胞經工程化以便表現CD19特異性CAR分子。如與對應免疫原性CAR-T細胞相比，引入低免疫基因編輯不改變細胞之與細胞因子無關之生長。
此外，暴露於針對CD47之阻斷抗體(例如，麥格羅單抗)使得低免疫原性CAR-T細胞(例如， B2M -/- 、 CIITA -/- 、 TRAC -/- 、CD19特異性CAR-CD47 T細胞)易被巨噬細胞及NK細胞殺滅，證實CD47過度表現對於逃避先天免疫清除之重要性。參見例如第4A-4J圖及第5A-5B圖。資料顯示CD19特異性CAR及CD47構建體在實驗細胞中以低或高水準表現。又，此類構建體在單一啟動子(例如，單一組成性活性啟動子)控制下表現。結果顯示低免疫原性CAR-T細胞在活體外檢定中未被先天免疫細胞殺滅。相比之下，藉由麥格羅單抗來阻斷CD47誘導在活體外由先天免疫細胞殺滅低免疫原性CD19特異性CAR-T細胞。如預期，未偵測到藉由先天免疫細胞殺滅對照CAR-T細胞(諸如表現CAR-EGFRt構建體或tisagenlecleucel生物類似物或替代物之T細胞)。先天細胞殺滅表現CAR-EGFRt構建體之對照CAR-T細胞使用針對EGFR之阻斷抗體(例如，西妥昔單抗)來誘導。資料亦顯示在不存在或存在麥格羅單抗或西妥昔單抗的情況下，假轉染T細胞，藉由假轉染之T細胞，不被NK細胞及巨噬細胞殺滅。
總之，用CD47抗體治療可用作消除本文所述低免疫原性CAR-T細胞之低免疫原性特性的安全策略，由此允許接受者受試者之身體移除該等細胞。 實例4. 投與CD47-SIRPα阻斷劑導致在活體外及活體內殺滅低免疫細胞
在活體外及活體內使用低免疫( B2M-/-、 CIITA-/-、及 CD47tg+)細胞之安全機制研究使用本文所述方案來進行。 A.安全機制研究方案 1. 細胞植入
皮下。在可拆卸腔室中，健康雄性NSG小鼠經由異氟醚吸入麻醉來麻醉。將麻醉小鼠自腔室移除並且置於背臥位中。注射位點(右腹股溝區域)用70% EtOH噴霧。鄰近腹股溝區，將細胞皮下注射。
腦部。預定手術之前24至48小時，藉由MediGel(Clear H2O, Portland, ME)向動物提供卡洛芬(5毫克/公斤/天)。計算量基於標準攝取。向各個MediGel(蔗糖素)杯子中，添加1.5mg卡洛芬。或者，在開始手術之前，每12小時投與丁丙諾啡(0.05-0.1mg/Kg IM或IP) BID持續三天或投與丁丙諾啡SR(0.5-1.0 mg/Kg SC)一次。丁丙諾啡SR或丁丙諾啡不在手術後聯合MediGel使用。
在手術當天，將動物經由異氟醚吸入來麻醉並且保持(分別3%及1.5%)。將頭頂部修剪並且用氯己定洗滌並且用70% EtOH擦拭。將動物置於立體定位裝置中。切開經過頭皮中線之切口，該切口足夠長以便容易地暴露自前囟至人字縫尖的中縫。
在預定坐標(如藉由Allen Brain Atlas或George Paxinos之Mouse Brain Atlas來鑑別)處，鑽穿頭骨而不穿透硬腦膜。使用Hamilton注射器及針，將微型打孔轉換成微型輸注泵。將針「降下」至到達大腦目標區所需要之深度並且輸注可注射物(1μl-5μl鹽水中之分化幹細胞)。使用可吸收縫線，將切口閉合，並且小鼠在加溫墊上恢復。動物保持於MediGel(具有卡洛芬之蔗糖素凝膠)上3天。 2. 生物發光成像 (BLI ； Bioluminescent Imaging)
小鼠經由異氟醚吸入麻醉來麻醉並且腹膜內(IP；intraperitoneally)注射與250μl螢光素(45.45mg/ml)。然後小鼠在鼻吸中定位於生物發光腔室中(在1.5%下以500ml氧/min來保持麻醉)。將小鼠成像180秒。圍繞所關注區域(ROI；region of interest)繪製圓圈，給出發射光之光子/sec讀數。 3. 抗體 (Ab ； Antibody ) 給藥
IP 給藥。藉由刺穿皮膚及肌肉層，將抗體(100ul)注射至腹面之腹腔。
SC 給藥。小鼠經由異氟醚吸入麻醉來麻醉並且置於背臥位中。注射位點(右腹股溝區域)用70% EtOH噴霧並且將抗體(100ul)注射至植入細胞區域中。
IV 給藥。小鼠在熱燈下加溫並且將抗體注射至擴張側靜脈中。 B. 人類iPSC：活體外及活體內之麥格羅單抗
如第7A-7B圖示出，當添加抗CD47麥格羅單抗抗體時，發生藉由NK細胞及巨噬細胞殺滅人類HIP iPSC。將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中。使用局部同型對照(小鼠IgG4)並且在第0天至第10天期間(D0-D10)，執行治療。如第8A-B圖示出，在具有接受性轉移之NK細胞之NSG小鼠中，人類HIP iPSC形成畸胎瘤。用IgG4同型對照治療不影響HIP存活。
將5x10 4個人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之1x10 6個人類NK細胞之NSG小鼠中。使用局部同型對照(小鼠IgG4)並且在第0天至第10天期間(D0-D10)，執行治療。如第9A-B圖示出，活體內阻斷CD47導致殺滅HIP iPSC。在D10之後，麥格羅單抗治療停止。在6個月隨訪期間檢查時，iPSC未重新出現。 C. 人類iPSC：活體外及活體內之MIAP410
在活體外人類免疫細胞中觀察到藉由抗CD47抗體MIAP410之CD47阻斷。如第10A-B圖示出，當添加抗CD47 MIAP410抗體時，觀察到人類NK細胞及人類巨噬細胞殺滅人類HIP iPSC。
活體內觀察到藉由抗CD47抗體MIAP410之CD47阻斷。將2.5x10 4個人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之1x10 6個人類NK細胞之NSG小鼠中。使用局部同型對照(小鼠IgG1)並且在第0天至第10天期間(D0-D10)，執行治療。如第11A-B圖示出，在具有接受性轉移之NK細胞之NSG小鼠中，人類iPSC形成畸胎瘤。用IgG1同型對照治療不影響HIP存活。
將1.5x10 4個人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之1x10 6個人類NK細胞之NSG小鼠中。將IL-2腹膜內(i.p.)投與NK細胞供活化。在D0-D10期間，執行局部抗CD47低劑量(LD) (500ug)治療。如第12A-B圖示出，活體內阻斷CD47導致殺滅HIP iPSC。在D10之後，抗CD47治療停止。在6個月隨訪期間檢查時，iPSC未重新出現。
將15.5x10 4個人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之1x10 6個人類NK細胞(未藉由IL-2活化)之NSG小鼠中。高劑量(HD；1mg)之局部抗CD47 MIAP410治療在D0、D1、及D3執行。如第13A-B圖示出，活體內阻斷CD47導致殺滅HIP iPSC。給予抗CD47治療3次(D0、D1、D3)。在6個月隨訪期間檢查時，iPSC未在任何小鼠中重新出現。
將16.5x10 4個人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之1x10 6個人類NK細胞(未藉由IL-2活化)之NSG小鼠中。在D0、D1、D3腹膜內執行抗CD47 HD(1mg)治療。如第14A-B圖示出，活體內阻斷CD47導致殺滅HIP iPSC。腹膜內給予抗CD47治療3次(D0、D1、D3)。在6個月隨訪期間檢查時，iPSC未在任何小鼠中重新出現。
在活體內在大腦中觀察到藉由抗CD47抗體MIAP410之CD47阻斷。將5x10 4個人類HIP iPSC顱內注射至具有接受性轉移之1x10 6個人類NK細胞之NSG小鼠中。如第15A-B圖示出，在具有接受性轉移之NK細胞之NSG小鼠中，人類iPSC形成畸胎瘤。用IgG4同型對照顱內治療不影響HIP存活。在D0、D1、及D3執行局部IgG4同型對照HD(1mg)治療。
將5x10 4個人類HIP iPSC顱內注射至具有接受性轉移之1x10 6個人類NK細胞之NSG小鼠中。在D0、D1、D3執行局部抗CD47 HD (1mg)治療。如第16A-B圖示出，CD47之顱內阻斷導致大腦中之HIP iPSC之殺滅。三次之後，抗CD47治療停止。在40天隨訪期間檢查時，iPSC未在任何小鼠中重新出現。
將5x10 4個人類HIP iPSC顱內注射至具有接受性轉移之1x10 6個人類NK細胞之NSG小鼠中。在D0、D1、及D3腹膜內執行抗CD47 HD(1mg)治療，其中血腦屏障藉由甘露糖醇注射來打破。如第17A-B圖示出，CD47之顱內阻斷導致殺滅大腦中之HIP iPSC。三次之後，抗CD47治療(i.p.)停止。在40天隨訪期間檢查時，在5只小鼠中之4只中，iPSC未重新出現。 D. 人類iPSC：活體外及活體內之SIRPα IgG1Fc或IgG4Fc (融合蛋白)
在活體外研究SIRPαFc融合蛋白對於人類iPSC之效應。相對於藉由NK細胞、ADCC NK細胞、及CDC介導之殺滅來研究對於HIP CD19CAR-T細胞之效應(第18A圖)。SIRPα IgG1Fc對於HIP細胞之效應相對於藉由NK細胞、ADCC NK細胞、及CDC介導之殺滅來研究(第18B圖)。SIRPα IgG4Fc(包括dKO殺滅對照)對於HIP細胞之效應相對於藉由NK細胞、ADCC NK細胞、及CDC介導之殺滅來研究(第18C圖)。對於HIP細胞之效應相對於藉由巨噬細胞及ADCC巨噬細胞介導之殺滅來研究(第18D圖)。SIRPα IgG1Fc對於HIP細胞之效應相對於藉由巨噬細胞及ADCC巨噬細胞介導之殺滅來研究(第18E圖)。SIRPα IgG4Fc(包括dKO殺滅對照)對於HIP細胞之效應相對於藉由巨噬細胞及ADCC巨噬細胞介導之殺滅來研究(第18F圖)。如預期，觀察到IgG4介導藉由阻斷CD47來實現之殺滅。此外，觀察到IgG1另外誘導CDC及ADCC。
在活體內觀察到藉由SIRPα IgG1Fc之CD47阻斷及ADCC。將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中。在D0、D1、D3執行局部SIRPα IgG1Fc (1mg)治療。在D20及D40，執行人類HIP iPSC之重新注射，隨後進行SIRPα IgG1Fc注射(持續3天)。如第19A-B圖示出，用SIRPα IgG1 Fc治療在所有小鼠中重複地導致殺滅HIP iPSC。執行隨訪6個月。
在活體內觀察到藉由SIRPα IgG4Fc之CD47阻斷。將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中。在D0、D1、D3執行局部SIRPα IgG4Fc (1mg)治療。在D20及D40，執行人類HIP iPSC之重新注射，隨後進行SIRPα IgG4Fc注射(持續3天)(第20A-B圖)。
在活體內觀察到藉由SIRPα IgG1Fc之CD47阻斷及ADCC。將人類HIP iPSC顱內注射至具有接受性轉移之人類NK細胞及人類小神經膠質細胞之NSG小鼠中。在D0、D1、D3執行局部IgG1同型對照(1mg)治療。如第21A-B圖示出，在具有接受性轉移之NK細胞及小神經膠質細胞之NSG小鼠中，人類HIP iPSC形成畸胎瘤。用IgG1同型對照治療不影響HIP存活。
在活體內觀察到藉由SIRPα IgG1Fc之CD47阻斷及ADCC。將人類HIP iPSC顱內注射至具有接受性轉移之人類NK細胞及小神經膠質細胞之NSG小鼠中。在D0、D1、D3執行局部SIRPα IgG1Fc (1mg)治療。如第22A-B圖示出，顱內SIRPα IgG1Fc導致殺滅大腦中之HIP iPSC。
在活體內觀察到藉由SIRPα IgG1Fc之CD47阻斷及ADCC。將人類HIP iPSC顱內注射至具有接受性轉移之人類NK細胞及人類小神經膠質細胞之NSG小鼠中。在D0、D1、D3腹膜內執行IgG1同型對照(1mg)治療。如第23A-B圖示出，在具有接受性轉移之NK細胞及小神經膠質細胞之NSG小鼠中，人類HIP iPSC形成畸胎瘤。用IgG1同型對照腹膜內治療不影響HIP存活。
在活體內觀察到藉由SIRPα IgG1Fc之CD47阻斷及ADCC。將人類HIP iPSC顱內注射至具有接受性轉移之人類NK細胞及小神經膠質細胞之NSG小鼠中。SIRPα IgG1Fc (1mg)治療在D0、D1、D3執行並且腹膜內投與，其中藉由甘露糖醇來打破血腦屏障。如第24A-B圖示出，在5只小鼠中之1只中，全身SIRPα IgG1Fc誘導殺滅大腦中之HIP iPSC。與局部投與相比，腹膜內應用似乎不太有效。
在活體內觀察到藉由SIRPα IgG4Fc之CD47阻斷。將人類HIP iPSC顱內注射至具有接受性轉移之人類NK細胞及人類小神經膠質細胞之NSG小鼠中。在D0、D1、D3執行局部IgG4同型對照(1mg)治療。如第25A-B圖示出，在具有接受性轉移之NK細胞及小神經膠質細胞之NSG小鼠中，人類HIP iPSC形成畸胎瘤。用IgG4同型對照治療不影響HIP存活。由於在D16及D20之畸胎瘤尺寸/症狀，將小鼠安樂死。
在活體內觀察到藉由SIRPα IgG4Fc之CD47阻斷。將人類HIP iPSC顱內注射至具有接受性轉移之人類NK細胞及小神經膠質細胞之NSG小鼠中。在D0、D1、D3執行局部SIRPα IgG4Fc (1mg)治療。如第26A-B圖示出，在5只小鼠中之1只中，顱內SIRPα IgG4Fc治療導致殺滅大腦中之HIP iPSC。IgG1Fc似乎更有效。
將人類HIP iPSC皮下注射至NSG小鼠中，並且接受性轉移人類NK細胞及在D0、D1、及D3，抗SIRPα以1mg皮下混合。在D20執行人類HIP iPSC之重新注射，將50,000細胞(50k)皮下(注入左側)，並且在D20(混合)、D21、及D23，1mg B6H12。在D40執行人類HIP iPSC之重新注射，將50k皮下(注入胸部中間上部)，並且在D40(混合)、D41、及D43，1mg B6H12(第27圖)。 E. 人類CD19 Car T：活體外及活體內之SIRPα IgG1Fc或IgG4Fc(融合蛋白)
功能端點為：(a)藉由NK細胞或巨噬細胞之T細胞殺滅；及(b)藉由抗CD47抗體(麥格羅單抗/IgG1融合蛋白/IgG4融合蛋白)誘導HIP T細胞殺滅，確認CD47防止NK細胞/巨噬細胞殺滅之相關性。活體外讀出使用Xcelligence來執行。 表22. 細胞類型及群組
1 HIP-CAR
2 EGFRt CAR
3 EGFRt CAR +tKO*
4 假轉染T細胞(亦即假轉染之T細胞)
*確認CD47防止NK細胞/巨噬細胞殺滅之相關性
在活體外觀察到藉由SIRPα IgG1Fc或SIRPα IgG4Fc之CD47阻斷。研究對於NK細胞(第28A圖)、巨噬細胞(第28B圖)、CD19 HIP CAR及NK細胞(第29A圖)、及CD19 HIP CAR及巨噬細胞(第29B圖)之效應。
使用Nalm6腫瘤模型來研究NSG小鼠。在具有及不具有靜脈內融合蛋白的情況下，靜脈內執行人類NK細胞及人類HIP CAR-T細胞之接受性轉移。在分選之前，將100U/ml IL-2解凍隔夜，隨後在分選之後及注射之前，100U/ml IL-2隔夜(第30圖)。當HIP CAR藉由安全策略來消除時，Nalm-6腫瘤生長(第31圖)。
如第32圖示出，(a)用假轉染T細胞，亦即假轉染之T細胞來治療之小鼠顯現腫瘤；(b)用HIP CAR T細胞治療之小鼠顯示腫瘤清除；並且(c)由於CD47阻斷，IgG1及IgG4融合蛋白治療導致殺滅HIP CAR T細胞並且因此腫瘤生長似乎與假轉染T細胞群相當。HIP CAR T細胞藉由IgG1及IgG4抗CD47融合蛋白來消除，指示Nalm-6腫瘤生長(第33及34圖)。 F. 小鼠原代HIP胰島：活體外及活體內之MIAP410
在活體外小鼠HIP原代胰島中觀察到藉由抗CD47抗體MIAP410之阻斷。如第35A圖示出，NK細胞殺滅由MIAP410導致。如第35B圖示出，觀察到巨噬細胞殺滅。
在活體內在小鼠HIP原代胰島中觀察到藉由MIAP410之阻斷。1只小鼠對應於約150個胰島簇。1個胰島對應於約1500個細胞。在移植期間，每只小鼠(18g-20g)使用300個簇，亦即，肌肉內(i.m.)約450,000個細胞(450k)。 表23. HIP胰島細胞研究
組 細胞株 N 品系 細胞劑量 ROA 安全
1 HIP* 胰島 luc + 5 BALB/c 300 簇 i.m. MIAP410 5mg; D7、8、9、10，直至細胞死亡
2 HIP*胰島luc + 5 BALB/c 300簇 i.m. IgG1同型對照
*HIP胰島來自 B2M -/- 小鼠；CD47藉由慢病毒遞送
在小鼠細胞中使用STZ誘導糖尿病。6天之後，將同種異體HIP胰島細胞(MHC單倍體型：H2 b；對於luc及CD47(CAG啟動子)為MOI 20)注射/移植至小鼠中。(第36圖)。在同種異體 Balb/C小鼠中，使用原代胰島移植來執行安全策略研究。如第37A-C圖示出，同種異體HIP胰島存活並且治癒同種異體小鼠中之糖尿病。當使用5mg肌肉內IgG1同型對照時，未觀察到HIP胰島之殺滅。如第38A-C圖示出，在D7-D18肌肉內注射5mg之MIAP410時，HIP胰島在同種異體小鼠中存活並且治癒糖尿病。當使用抗CD47(「安全策略」)時，將HIP胰島殺滅並且小鼠再次變得糖尿病性的。 實例5. 在活體內具有接受性轉移人類NK細胞之人類細胞中，投與具有小鼠IgG1 Fc域之MIAP410抗CD47抗體阻斷CD47
遵循如實例4中之方案。 A. 沒有IL-2依賴性
如第39A-B圖示出，在將人類HIP iPSC注射至具有接受性轉移人類NK細胞及人類巨噬細胞之NSG小鼠中時，在具有或不具有活體內IL-2刺激的情況下，投與具有Fc同型IgG1之MIAP410導致藉由先天細胞之時間依賴性殺滅，可能經由NSG巨噬細胞之活化。 B. 結果變化取決於何時開始治療
如第40A-B圖示出，在第0天(D0)開始之局部皮下更高劑量(HD；三次)之MIAP410似乎比在第11天開始治療更有效。腹膜內劑量與D0，而非D11之局部劑量一樣有效。 C. 大腦中之局部治療
如第41圖示出，大腦中之局部治療與局部皮下治療一樣有效。當血腦屏障被打破，允許MIAP410更容易接近時，腹膜內治療似乎為有效的。 D. 在活體內阻斷CD47，同時投與IL-2導致殺滅HIP iPSC
如第42A-B圖示出，在具有接受性轉移NK細胞之NSG小鼠中，人類HIP iPSC形成畸胎瘤。當將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中時，投與Fc同型IgG1對照不影響HIP存活。
如第43A-B圖示出，當將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中時，局部LD 500µg投與具有Fc同型IgG1之MIAP410同時將IL-2投與NK細胞供活化導致殺滅HIP iPSC。在D0-D10期間，發生MIAP410抗體治療並且第10天(D10)之後停止。在治療之後6個月執行隨訪時，未觀察到iPSC重新出現。
如第44A-B圖示出，將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中，並且局部投與具有Fc同型IgG1之MIAP410(LD 500μg)，同時將IL-2投與NK細胞供活化。MIAP410抗體治療在第3天(D3)開始並且在D3-D36期間發生。對於小鼠之子集，重新治療在D80開始。在開始治療之後6個月執行隨訪時，觀察到在1只小鼠中，iPSC得以消除，同時在4只小鼠中，畸胎瘤顯現，並且在1只小鼠中，重新治療消除iPSC。
如第45A-B圖示出，將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中，並且局部投與具有Fc同型IgG1之MIAP410(LD 500g)，同時將IL-2投與NK細胞供活化。MIAP410抗體治療在第11天(D11)開始並且在D11-D36期間發生。在開始治療之後6個月執行隨訪時，觀察到在1只小鼠中，iPSC得以消除，同時在4只小鼠中，畸胎瘤顯現。 E. 在活體內阻斷CD47，同時不投與IL-2導致殺滅HIP iPSC
如第46A-B圖示出，當將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中時，局部LD 500µg投與具有Fc同型IgG1之MIAP410導致殺滅HIP iPSC。MIAP410抗體治療在第0天(D0)開始並且在D0-D10期間發生，並且在D16之後治療停止。在開始治療之後6個月執行隨訪時，未觀察到iPSC在4只小鼠中重新出現，而畸胎瘤在1只小鼠中顯現，該小鼠為螢光素酶的。
如第47A-B圖示出，當將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中時，局部LD 500µg投與具有Fc同型IgG1之MIAP410導致殺滅HIP iPSC。MIAP410抗體治療在第3天(D3)開始並且在D3-D11期間發生，並且在D11之後治療停止。在開始治療之後6個月執行隨訪時，未觀察到iPSC在任何小鼠中重新出現。
如第48A-B圖示出，將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中，並且局部投與具有Fc同型IgG1之MIAP410 (LD 500µg)。MIAP410抗體治療在第11天(D11)開始並且在D11-D36期間發生，並且在D36之後治療停止。在開始治療之後6個月執行隨訪時，觀察到 在1只小鼠中，iPSC得以消除，同時在4只小鼠中，畸胎瘤顯現。
如第49A-B圖示出，當將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中時，局部HD 1mg投與具有Fc同型IgG1之MIAP410導致殺滅HIP iPSC。MIAP410抗體治療在D0、D1、及D3發生。在開始治療之後120天執行隨訪時，未觀察到iPSC在任何小鼠中重新出現。
如第50A-B圖示出，將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中，並且局部投與具有Fc同型IgG1之MIAP410 (HD 1mg)。MIAP410抗體治療在D11、D12、及D14發生。在開始治療之後44天執行隨訪時，觀察到iPSC未在3只小鼠中重新出現並且畸胎瘤在2只小鼠中顯現。
如第51A-B圖示出，當將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中時，腹膜內HD 1mg投與具有Fc同型IgG1之MIAP410導致殺滅HIP iPSC。MIAP410抗體治療在D0、D1、及D3發生。在開始治療之後100天執行隨訪時，未觀察到iPSC在任何小鼠中重新出現。
如第52A-B圖示出，將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中，並且腹膜內投與具有Fc同型IgG1之MIAP410 (HD 1mg)。MIAP410抗體治療在D11、D12、及D14發生。在開始治療之後44天執行隨訪時，觀察到iPSC未在1只小鼠中重新出現並且畸胎瘤在6只小鼠中顯現。 實例6. 在活體內具有或不具有接受性轉移人類NK細胞/小神經膠質細胞之小鼠中，在用具有IgG1 Fc域之MIAP410抗CD47抗體治療後，人類低免疫細胞之殺滅在小鼠身體與大腦之間為不同的
遵循如實例4中描述之方案。
如第53圖示出，在將人類dKO( B2M-/CIITA-/-)細胞皮下注射至NSG小鼠中時，在接受性轉移人類NK細胞時，人類iPSC被人類NK細胞殺滅，同時在未接受性轉移NK細胞時，人類iPSC被NSG巨噬細胞殺滅。後者大概歸因於巨噬細胞之「異種感測缺失自身」。
如第54圖示出，在將人類dKO( B2M-/CIITA-/-)細胞注射至NSG小鼠之大腦中時，在接受性轉移人類NK細胞或人類小神經膠質細胞時，人類iPSC被殺滅。然而，在人類NK細胞或人類小神經膠質細胞之接受性轉移未發生時，人類iPSC不被NSG小神經膠質細胞單獨殺滅。後者大概歸因於不存在小神經膠質細胞之「異種感測缺失自身」。 A.大腦中之感測缺失自身視同種異體小神經膠質細胞而定
如第55A-B圖示出，將5x10 4人類dKO( B2M-/-CIITA-/-)細胞皮下注射至具有或不具有接受性轉移人類NK細胞之NSG小鼠中。當接受性地轉移人類NK細胞時，人類dKO iPSC被皮下殺滅。當未轉移人類NK細胞時，人類dKO iPSC被NSG巨噬細胞殺滅，大概經由「異種感測缺失自身」。
如第56A-B圖示出，將5x10 4人類dKO( B2M-/-CIITA-/-)細胞注射至具有或不具有接受性轉移人類NK細胞之NSG小鼠之大腦中。當接受性地轉移人類NK細胞時，人類dKO iPSC在大腦中被殺滅，但是當未轉移人類NK細胞時，不被NSG小神經膠質細胞殺滅。
如第57A-B圖示出，在將5x10 4人類dKO( B2M-/-CIITA-/-)細胞注射至具有接受性轉移人類小神經膠質細胞之NSG小鼠之大腦中時，人類dKO iPSC在大腦中被殺滅，大概經由同種異體感測「缺失自身」。 實例7. CD47保護小鼠大腦中之人類低免疫細胞免於小神經膠質細胞介導殺滅
遵循如實例4中描述之方案。
如第58圖示出，在人類wt、dKO( B2M-/-CIITA-/-)或HIP 1.0( B2M-/-CIITA-/-CD47tg)與同種異體人類巨噬細胞或小神經膠質細胞共培養時，CD47保護dKO細胞免於巨噬細胞殺滅以及小神經膠質細胞殺滅兩者。 A. dKO細胞之小神經膠質細胞及巨噬細胞殺滅中之差異
如第59圖示出，當人類dKO( B2M-/-CIITA-/-)細胞與同種異體人類巨噬細胞或小神經膠質細胞共培養或小鼠dKO( B2M-/-CIITA-/-)細胞與同種異體小鼠巨噬細胞或小神經膠質細胞共培養時，同種異體巨噬細胞及小神經膠質細胞感測到缺失自身並且殺滅dKO細胞。
如第60圖示出，在人類dKO( B2M-/-CIITA-/-)細胞與異種(跨物種)小鼠巨噬細胞或小神經膠質細胞共培養或小鼠dKO( B2M-/-CIITA-/-)細胞與異種人類巨噬細胞或小神經膠質細胞共培養時，異種巨噬細胞及小神經膠質細胞不感測到缺失自身並且因此不殺滅dKO細胞。 B. 給藥研究
如第61A-B圖示出，當將人類HIP iPSC顱內注射至具有接受性轉移人類NK細胞之NSG小鼠中時，在D0、D1、及D3局部IgG1同型對照之局部HD(小鼠IgG1；1 mg)投與不影響HIP存活。
如第62A-B圖示出，當將人類HIP iPSC顱內注射至具有接受性轉移人類NK細胞之NSG小鼠中時，在D0、D1、及D3局部HD(1 mg)投與MIAP410導致殺滅大腦中之HIP iPSC。40天隨訪時，未觀察到iPSC重新出現。
如第63A-B圖示出，當將人類HIP iPSC顱內注射至具有接受性轉移人類NK細胞之NSG小鼠中時，在血腦屏障藉由甘露糖醇注射來打破的情況下，在D0、D1、及D3腹膜內HD(1 mg)投與MIAP410導致殺滅大腦中之HIP iPSC。40天隨訪時，在5只小鼠中之4只中，未觀察到iPSC重新出現。 實例8. 投與具有小鼠IgG1 Fc域之B6H12抗CD47抗體在活體外及/或活體內阻斷人類低免疫細胞中之CD47
遵循如實例4中之方案。
在活體外在人類NK細胞及/或巨噬細胞存在下，投與具有小鼠IgG1 Fc域之B6H12抗CD47抗體阻斷人類低免疫細胞中之CD47。第64A圖(人類HIP iPSC及人類NK細胞)及第64B圖(人類HIP iPSC及人類巨噬細胞)示出投與100 μg/ml抗CD47抗體B6H12活體外以便靶向人類HIP iPSC導致被人類NK細胞及人類巨噬細胞殺滅。
在活體內具有接受性轉移人類NK細胞之人類低免疫細胞中，投與具有小鼠IgG1 Fc域之B6H12抗CD47抗體阻斷CD47。如第65圖示出，三次1 mg之皮下更高劑量(HD)似乎比連續投與LD (500μg)之B6H12抗CD47抗體更有效。腹膜內劑量似乎為無效的。 A. 結果變化取決於何時開始治療
如第66A-B圖示出，在具有接受性轉移NK細胞之NSG小鼠中，人類HIP iPSC形成畸胎瘤。當將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中，在D0-D40期間局部LD(500μg)投與Fc同型IgG4對照不影響HIP存活。
如第67A-B圖示出，將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中，並且局部投與具有Fc同型IgG1之B6H12抗CD47抗體(LD 500μg)。B6H12抗體治療在D0-D96期間發生。在治療之後6個月執行隨訪時，觀察到在2只小鼠中，iPSC得以消除並且在3只小鼠中，畸胎瘤顯現。
如第68A-B圖示出，將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中，並且局部投與具有Fc同型IgG1之B6H12 (LD 500 µg)。B6H12抗體治療在D3-D40期間發生。在開始治療40天之後隨訪時，在所有4只小鼠中，觀察到畸胎瘤顯現。
如第69A-B圖示出，將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中，並且局部投與具有Fc同型IgG1之B6H12 (LD 500µg)。B6H12抗體治療在D11-D44期間發生。在開始治療160天之後隨訪時，在所有5只小鼠中之4只，觀察到畸胎瘤顯現。
如第70A-B圖示出，當將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中時，局部HD 1mg投與具有Fc同型IgG1之B6H12導致殺滅HIP iPSC。B6H12抗體治療在D0、D1、及D3執行三次。在開始治療120天之後隨訪時，未觀察到iPSC在任何小鼠中重新出現。
如第71A-B圖示出，當將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中時，局部HD 1mg投與具有Fc同型IgG1之B6H12導致殺滅HIP iPSC。B6H12抗體治療在D3、D4、及D6執行三次。在開始治療100天之後隨訪時，未觀察到iPSC在任何小鼠中重新出現。
如第72A-B圖示出，當將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中時，局部HD 1mg投與與Fc同型IgG1之B6H12導致殺滅HIP iPSC。B6H12抗體治療在D11、D12、及D14執行三次。在開始治療40天之後隨訪時，未觀察到iPSC在任何小鼠中重新出現。
如第73A-B圖示出，將人類HIP iPSC皮下注射至具有接受性轉移之人類NK細胞之NSG小鼠中，並且腹膜內(HD 1mg)投與具有Fc同型IgG1之B6H12在D0、D1、及D3執行三次。在開始治療120天之後隨訪時，在所有4只小鼠中，觀察到畸胎瘤顯現。 實例9. 投與氟胞嘧啶及/或更昔洛韋導致活體外及/或活體內之低免疫細胞之殺滅
遵循如實例4中之方案。 A. 活體外之小分子氟胞嘧啶及更昔洛韋
在活體外研究小分子氟胞嘧啶及更昔洛韋分別對於胞嘧啶去胺酶及HsVtk殺滅開關之效應。觀察到所有測試純系具有足夠CD47水準以便防止NK細胞及巨噬細胞殺滅(第74圖)。亦獲得前藥殺滅資料(第75圖)。 B. 活體內之小分子氟胞嘧啶
在活體內研究小分子氟胞嘧啶對於胞嘧啶去胺酶殺滅開關之效應。將人類HIP iPSC (CyD純系2G11)皮下注射至組5 NSG小鼠中。鹽水用作對照。如第76A-B圖示出，在NSG小鼠(鹽水對照)中，人類HIP-CyD iPSC形成畸胎瘤。組5小鼠治療如下：在稀MG, S.C.中之hiPSC HIP CyD純系2G11，未治療(鹽水，IP，D0)。
將人類HIP iPSC (CyD純系2G11)皮下注射至組1 NSG小鼠中。每日腹膜內投與氟胞嘧啶LD (200mg/kg)治療。如第77A-B圖示出，給予氟胞嘧啶LD導致在16-44天內殺滅HIP-CyD iPSC。組1小鼠治療如下：稀MG, S.C中之1x10 6hiPSC HIP CyD純系2G11；治療 = 200毫克/公斤/天氟胞嘧啶，IP (D0)。
將人類HIP iPSC (CyD純系2G11)皮下注射至組2 NSG小鼠中。每日腹膜內投與氟胞嘧啶HD (500mg/kg)治療。如第78A-B圖示出，在44天隨訪的情況下，給予氟胞嘧啶HD導致在16-32天內殺滅HIP-CyD iPSC。如與LD相比，未觀察到HD之主要益處。組2小鼠治療如下：稀MG，S.C.中之1x10 6hiPSC HIP CyD純系2G11；治療為500毫克/公斤/天氟胞嘧啶，IP(D0)。
將人類HIP iPSC (CyD純系2G11)皮下注射至組3 NSG小鼠中。氟胞嘧啶LD (200mg/kg)治療在第13天開始，然後每日腹膜內投與。如第79A-B圖示出，給予氟胞嘧啶LD導致在開始治療之後3-11天殺滅HIP-CyD iPSC。在40D隨訪期間檢查小鼠。組3小鼠治療如下：稀MG，S.C.中之1x10 6hiPSC HIP CyD純系2G11；治療為200毫克/公斤/天氟胞嘧啶，IP(D13)。
將人類HIP iPSC (CyD純系2G11)皮下注射至組4 NSG小鼠中。在第13天開始，每日腹膜內投與氟胞嘧啶HD (500mg/kg)治療。如第80A-B圖示出，給予氟胞嘧啶HD導致在開始治療之後3-11天殺滅HIP-CyD iPSC。在40D隨訪期間檢查小鼠。與LD相比，未觀察到HD之益處。組4小鼠治療如下：稀MG，S.C.中之1x10 6hiPSC HIP CyD純系2G11；治療為500毫克/公斤/天氟胞嘧啶，IP(D13)。
將人類HIP iPSC (純系15；沒有殺滅開關)皮下注射至組6 NSG小鼠中。每日腹膜內投與氟胞嘧啶HD (500mg/kg)治療。如第81A-B圖示出，雖然細胞沒有殺滅開關，但是人類HIP iPSC存活似乎被氟胞嘧啶HD削弱。將該組擴展以便資料驗證(第81C-D圖及第81E-F圖)。組6小鼠治療如下：稀MG，S.C.中之1x10 6hiPSC HIP純系15；治療為500毫克/公斤/天氟胞嘧啶，IP(D0)。
將1x10 6人類HIP iPSC luc +(胞嘧啶去胺酶純系2-G11)皮下注射至NSG小鼠中。對於此對照組未執行治療。如第82A-B圖示出，觀察到胞嘧啶去胺酶基因編輯不影響在NSG小鼠中存活之iPSC。 C. 活體內之小分子更昔洛韋
在活體內研究小分子更昔洛韋對於HsVtk殺滅開關之效應。將人類HIP iPSC (HSVTk純系1-B10)皮下注射至組5 NSG小鼠中。對照組接受鹽水治療。如第83A-B圖示出，人類HIP-HsVtk iPSC存活似乎在NSG小鼠中削弱，或許歸因於殺滅開關編輯。組5小鼠治療如下：稀MG，S.C.中之1x10 6hiPSC HIP HSVtk純系1-B10 luc +；未治療(鹽水，IP，D0)。
將人類HIP iPSC (HSVTk純系1-B10)皮下注射至組1 NSG小鼠中。更昔洛韋LD (50mg/kg)治療每日腹膜內執行。如第84A-B圖示出，給予更昔洛韋LD導致在12-24天內殺滅HIP-HsVtk iPSC。在44D隨訪期間檢查小鼠。組1小鼠治療如下：稀MG，S.C.中之1x10 6hiPSC HIP HSVtk純系1-B10 luc +；治療為50毫克/公斤/天更昔洛韋，IP(D0)。
將人類HIP iPSC (HSVTk純系1-B10)皮下注射至組2 NSG小鼠中。每日腹膜內投與氟胞嘧啶HD (75mg/kg)治療。如第85A-B圖示出，給予更昔洛韋HD導致在12-16天內殺滅HIP-HsVtk iPSC。在40d隨訪期間檢查小鼠。HD似乎在很小的程度上有益。組2小鼠治療如下：稀MG，S.C.中之1x10 6hiPSC HIP HSVtk純系1-B10 luc +；治療為75毫克/公斤/天更昔洛韋，IP(D0)。
將人類HIP iPSC (HSVTk純系1-B10)皮下注射至組3 NSG小鼠中。在第13天開始，每日腹膜內投與氟胞嘧啶LD (50mg/kg)治療。如第86A-B圖示出，給予更昔洛韋LD導致在開始治療7天內殺滅HIP-HsVtk iPSC。在40d隨訪期間檢查小鼠。組3小鼠治療如下：稀MG，S.C.中之1x10 6hiPSC HIP HSVtk純系1-B10 luc +；治療為50毫克/公斤/天更昔洛韋，IP(D13)。
將人類HIP iPSC (HSVTk純系1-B10)皮下注射至組4 NSG小鼠中。在第13天開始，每日腹膜內投與氟胞嘧啶HD (75mg/kg)治療。如第87A-B圖示出，給予更昔洛韋HD導致在開始治療7天內殺滅HIP-HsVtk iPSC。在40d隨訪期間檢查小鼠。與LD相比，未觀察到HD之明顯益處。組4小鼠治療如下：稀MG，S.C.中之1x10 6hiPSC HIP HSVtk純系1-B10 luc +；治療為75毫克/公斤/天更昔洛韋，IP(D13)。
將人類HIP iPSC (純系15；沒有殺滅開關)皮下注射至組6 NSG小鼠中。在第0天開始，每日腹膜內投與氟胞嘧啶HD (75mg/kg)治療。如第88A-B圖示出，更昔洛韋HD治療似乎對於沒有殺滅開關之HIP iPSC沒有影響。組6小鼠治療如下：稀MG，S.C.中之1x10 6hiPSC HIP純系15 luc +；治療為75毫克/公斤/天更昔洛韋，IP(D0)。
將1x10 6人類HIP iPSC luc +(HSVtk純系1-B10)皮下注射至NSG小鼠中。未投與治療(初步研究)。如第89A-B圖示出，對於對照組，HSVtk編輯似乎不影響NSG小鼠中之iPSC存活。 結論
本技術之實施例之以上詳細說明不意欲為詳盡的或將本技術限制於以上揭示之精確形式。雖然本技術之具體實施例及實例如上出於示例性目的來描述，但是在熟習相關技術者辨識之技術之範圍內，各種等效修改為可能的。例如，雖然步驟以給定順序來呈現，但是替代實施例可以不同順序來執行步驟。本文所述之各種實施例亦可組合以便提供進一步實施例。
自前述，應認識到本技術之具體實施例已在本文中出於示例目的來描述，但是熟知部件及功能未詳細示出或描述以避免不必要地混淆本技術之實施例之描述。當上下文允許時，單數或複數術語亦可分別包括複數或單數術語。此外，雖然與本技術之一些實施例相關之優勢已在彼等實施例之情形中描述，但是其他實施例亦可展現此類優勢，並且並非所有實施例必需展現此類優勢以便落入本技術之範圍內。因此，本揭示案及相關技術可包涵未在本文中明確示出或描述之其他實施例。
無
第1A-1D圖描述IL-2刺激NK細胞對於人類HIP(B2M -/-，CIITA -/-，CD47 +)細胞(第1A圖)、人類dKO(B2M -/-，CIITA -/-)細胞(第1B圖)、用抗CD47 IgG1同型對照抗體治療之人類HIP細胞(第1C圖)、或用抗CD47抗體MIP410治療之人類HIP細胞(第1D圖)之殺滅。
第2A-2D圖描述巨噬細胞對於人類HIP(B2M -/-，CIITA -/-，CD47 +)細胞(第2A圖)、人類dKO(B2M -/-，CIITA -/-)細胞(第2B圖)、用抗CD47 IgG1同型對照抗體治療之人類HIP細胞(第2C圖)、或用抗CD47抗體MIP410治療之人類HIP細胞(第2D圖)之殺滅。
第3A及3B圖描述在藉由IgG1同型對照抗體(第3A圖)或抗CD47抗體MIP410(第3B圖)治療之後，皮下注射至接受性地轉移人類NK細胞之NSG小鼠中之人類HIP(B2M -/-、CIITA -/-、CD47 +)細胞之生物發光量測。
第4A-4J圖描述在暴露於抗CD47抗體時(參見，例如，第4A-4E圖)，NK細胞及巨噬細胞誘導殺滅表現外源CD47及CD19特異性CAR構建體之人類HIP(例如，B2M -/-，CIITA -/-，TRAC -/-)CAR-T細胞(參見，例如，「HIP CAR-T，單一啟動子CD47-CAR」)之即時細胞分析資料。資料亦示出NK細胞及巨噬細胞誘導殺滅表現CAR及EGFRt構建體之對照CAR-T細胞、實質上類似於tisagenlecleucel生物類似物或替代物之對照CAR-T細胞、及對照假T細胞(第4E-4J圖)之程度。
第5A及5B圖示出與人類假T細胞及人類HLA-I及HLA-II雙重敲除CAR-T細胞(第5A圖)或低免疫原性人類HLA-I、HLA-II及TCR三重敲除CAR-T細胞(第5B圖)之混合物一起，將人類NK細胞及巨噬細胞接受性轉移至免疫缺陷NSG小鼠中之後的活體內免疫逃避資料。
第6圖示出注射同種異體CAR-T細胞(諸如，表現CAR-EGFRt構建體之CAR-T細胞(「CAR(EGFRt)」)及tisagenlecleucel生物類似物或替代物(「CAR(tisagenlecleucel)」)或低免疫原性人類HLA-I、HLA-II及TCR三重敲除CAR-T細胞(「HIP」)的人源化小鼠之樣品中偵測到之T細胞活化及供給者特異性抗體結合的水準。
第7A及7B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及巨噬細胞並且在第0天至第10天期間(D0-D10)投與100μg/ml抗CD47麥格羅單抗抗體後，人類HIP iPSC之活體外細胞生存力。
第8A及8B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及投與IgG4同型對照後，NSG小鼠中之畸胎瘤形成(HIP iPSC存活)。
第9A及9B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞並且在第0天至第10天期間(D0-D10)投與抗CD47麥格羅單抗抗體後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第10A及10B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及巨噬細胞並且在第0天至第10天期間(D0-D10)投與抗CD47 MIAP410抗體後，人類HIP iPSC之活體外細胞生存力。
第11A及11B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及投與IgG1同型對照後，NSG小鼠中之畸胎瘤形成(HIP iPSC存活)。
第12A及12B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞並且在第0天至第10天期間(D0-D10)投與抗CD47 MIAP410抗體後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第13A及13B圖示出在皮下移植15.5x10 4個人類iPSC及接受性轉移1x10 6個人類NK細胞及在第0天、第1天、及第3天投與抗CD47 MIAP410抗體後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第14A及14B圖示出在皮下移植16.5x10 4個人類iPSC及接受性轉移1x10 6個人類NK細胞及在第0天、第1天、及第3天腹膜內投與抗CD47 MIAP410抗體後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第15A及15B圖示出在顱內移植5x10 4個人類iPSC及接受性轉移1x10 6個NK細胞及在第0天、第1天、及第3天投與IgG4同型對照後，NSG小鼠之大腦中之畸胎瘤形成(HIP iPSC存活)。
第16A及16B圖示出在顱內移植5x10 4個人類iPSC及接受性轉移1x10 6個人類NK細胞及在第0天、第1天、及第3天腹膜內投與抗CD47 MIAP410抗體後，大腦中之人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第17A及17B圖示出在顱內移植5x10 4個人類iPSC及接受性轉移1x10 6個人類NK細胞及在第0天、第1天、及第3天腹膜內投與抗CD47 MIAP410抗體後，大腦中之人類HIP iPSC之活體內細胞生存力，其中血腦屏障藉由甘露糖醇注射來打破。
第18A-18F圖示出相對於以下各者的人類HIP iPSC之活體外殺滅資料，NK細胞-ADCC NK細胞-、及CDC-介導殺滅(A)，在投與SIRPα IgG1Fc後，NK細胞-ADCC NK細胞-、及CDC-介導殺滅(B)，在投與SIRPα IgG4Fc後，NK細胞-ADCC NK細胞-、及CDC-介導殺滅(C)，ADCC巨噬細胞-及巨噬細胞-介導殺滅(D)，在投與SIRPα IgG1Fc後，ADCC巨噬細胞-及巨噬細胞-介導殺滅(E)，及在投與SIRPα IgG4Fc後，ADCC巨噬細胞-及巨噬細胞-介導殺滅。
第19A及19B圖示出在皮下移植人類iPSC及接受性轉移人類NK細胞及在第0天、第1天、及第3天投與SIRPα IgG1Fc後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力，其中在D20及D40執行人類HIP iPSC之重新注射，隨後 SIRPα IgG1Fc注射(持續3天)。
第20A及20B圖示出在皮下移植人類iPSC及接受性轉移人類NK細胞及在第0天、第1天、及第3天投與SIRPα IgG4Fc後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力，其中在D20及D40執行人類HIP iPSC之重新注射，隨後 SIRPα IgG4Fc注射(持續3天)。
第21A及21B圖示出在顱內移植人類iPSC及接受性轉移人類NK細胞及人類小神經膠質細胞及在第0天、第1天、及第3天投與IgG1同型對照後，NSG小鼠之大腦中之畸胎瘤形成(HIP iPSC存活)。
第22A及22B圖示出在顱內移植人類iPSC及接受性轉移人類NK細胞及人類小神經膠質細胞及在第0天、第1天、及第3天投與SIRPα IgG1Fc後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第23A及23B圖示出在顱內移植人類iPSC及接受性轉移人類NK細胞及人類小神經膠質細胞及在第0天、第1天、及第3天腹膜內投與IgG1同型對照後，NSG小鼠之大腦中之畸胎瘤形成(HIP iPSC存活)。
第24A及24B圖示出在顱內移植人類iPSC及接受性轉移人類NK細胞及在第0天、第1天、及第3天腹膜內投與SIRPα IgG1Fc後，大腦中之人類HIP iPSC之活體內細胞生存力，其中血腦屏障藉由甘露糖醇注射來打破。
第25A及25B圖示出在顱內移植人類iPSC及接受性轉移人類NK細胞及人類小神經膠質細胞及在第0天、第1天、及第3天投與IgG4同型對照後，NSG小鼠之大腦中之畸胎瘤形成(HIP iPSC存活)。
第26A及26B圖示出在顱內移植人類iPSC及接受性轉移人類NK細胞及在第0天、第1天、及第3天腹膜內投與SIRPα IgG4Fc後，大腦中之人類HIP iPSC之活體內細胞生存力
第27圖示出在將人類iPSC皮下注射至NSG小鼠中，並且接受性轉移人類NK細胞及在D0、D1、及D3，抗SIRPα以1mg皮下混合後，人類HIP iPSC之細胞生存力。在D20執行人類HIP iPSC之重新注射，將50,000細胞(50k)皮下(注入左側)，並且在D20(混合)、D21、及D23，1mg B6H12。在D40執行人類HIP iPSC之重新注射，將50k皮下(注入胸部中間上部)，並且在D40(混合)、D41、及D43，1mg B6H12。
第28A及28B圖示出SIRPα IgG1Fc或SIRPα IgG4Fc活體外之CD47阻斷資料，並且研究對於NK細胞(A)及巨噬細胞(B)之效應。
第29A及29B圖示出SIRPα IgG1Fc或SIRPα IgG4Fc活體外之CD47阻斷資料，並且研究對於CD19 HIP CAR及NK細胞(A)，及CD19 HIP CAR及巨噬細胞(B)之效應。
第30圖示出使用Nalm6腫瘤模型之NSG小鼠之研究。在具有及不具有靜脈內融合蛋白的情況下，靜脈內執行人類NK細胞及人類HIP CAR-T細胞之接受性轉移。在分選之前，將100U/ml IL-2解凍隔夜，隨後在分選之後及注射之前，100U/ml IL-2隔夜。
第31圖示出使用Nalm6腫瘤模型之NSG小鼠之研究。在具有及不具有靜脈內融合蛋白的情況下，靜脈內執行人類NK細胞及人類HIP CAR-T細胞之接受性轉移。在分選之前，將100U/ml IL-2解凍隔夜，隨後在分選之後及注射之前，100U/ml IL-2隔夜。當HIP CAR藉由安全策略來消除時，Nalm-6腫瘤生長。
第32圖示出使用Nalm6腫瘤模型之NSG小鼠之研究。
第33及34圖示出使用Nalm6腫瘤模型之NSG小鼠之研究，其中HIP CAR T細胞藉由IgG1及IgG4抗CD47融合蛋白來消除，指示Nalm-6腫瘤之生長。
第35A及35B圖示出在投與抗CD47 MIAP410抗體後，由於NK細胞介導殺滅(A)及巨噬細胞介導殺滅(B)導致之小鼠HIP原代胰島之活體外細胞生存力。
第36圖示出胰島小鼠研究模型。
第37A-37C圖示出在肌肉內投與IgG1同型對照後，同種異體HIP胰島及同種異體小鼠糖尿病緩解的細胞生存力資料。
第38A-38C圖示出在D7-D18肌肉內投與5mg MIAP410後，同種異體HIP胰島及同種異體小鼠糖尿病緩解的細胞生存力資料。
第39A-B圖示出在將人類HIP iPSC注射至具有接受性轉移人類NK細胞及人類巨噬細胞之NSG小鼠中，並且在具有或不具有活體內IL-2刺激的情況下，投與具有Fc同型IgG1之MIAP410後，HIP iPSC之細胞生存力。
第40A-B圖示出在將人類HIP iPSC注射至具有接受性轉移人類NK細胞及人類巨噬細胞之NSG小鼠中，並且投與高劑量具有Fc同型IgG1之MIAP410三次後，HIP iPSC之細胞生存力。
第41圖示出大腦用MIAP410局部皮下治療或腹膜內治療後，HIP iPSC之細胞生存力。
第42A及42B圖示出在皮下移植人類HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及投與IgG1同型對照後，NSG小鼠中之畸胎瘤形成(HIP iPSC存活)。
第43A及43B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及在第0天至第10天期間(D0-D10)，投與局部低劑量(LD；500μg)具有Fc同型IgG1之MIAP410，同時將IL-2投與NK細胞供活化後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第44A及44B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及在第3天至第36天期間，投與局部低劑量(LD；500μg)具有Fc同型IgG1之MIAP410，同時將IL-2投與NK細胞供活化後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第45A及45B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及在第11天至第36天期間，投與局部低劑量(LD；500μg)具有Fc同型IgG1之MIAP410，同時將IL-2投與NK細胞供活化後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第46A及46B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及在第0天至第10天期間(D0-D10)，投與局部低劑量(LD；500μg)具有Fc同型IgG1之MIAP410後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第47A及47B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及在第3天至第36天期間，投與局部低劑量(LD；500μg)具有Fc同型IgG1之MIAP410後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第48A及48B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及在第11天至第36天期間，投與局部低劑量(LD；500μg)具有Fc同型IgG1之MIAP410後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第49A及49B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及在D0、D1、及D3，投與局部高劑量(HD；1mg)具有Fc同型IgG1之MIAP410後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第50A及50B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及在D11、D12、及D14，投與局部高劑量(HD；1mg)具有Fc同型IgG1之MIAP410後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第51A及51B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及在D0、D1、及D3，腹膜內投與局部高劑量(HD；1mg)具有Fc同型IgG1之MIAP410後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第52A及52B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及在D11、D12、及D14，腹膜內投與局部高劑量(HD；1mg)具有Fc同型IgG1之MIAP410後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第53圖示出在將人類dKO(B2M-/CIITA -/-)細胞皮下注射至NSG小鼠中及接受性轉移人類NK細胞後，人類iPSC之細胞生存力。
第54圖示出在將人類dKO(B2M-/CIITA -/-)細胞皮下注射至NSG小鼠中及接受性轉移人類NK細胞或人類小神經膠質細胞後，人類iPSC之細胞生存力。
第55A及55B圖示出在將人類dKO(B2M-/CIITA -/-)細胞皮下注射至NSG小鼠中，具有或不具有接受性轉移人類NK細胞的情況下，人類iPSC之細胞生存力。
第56A及56B圖示出將人類dKO(B2M-/CIITA -/-)細胞注射至NSG小鼠之大腦中，具有或不具有接受性轉移人類NK細胞的情況下，人類iPSC之細胞生存力。
第57A及57B圖示出在將人類dKO(B2M-/CIITA -/-)細胞注射至NSG小鼠之大腦中，並且接受性轉移人類小神經膠質細胞後，人類iPSC之細胞生存力。
第58圖示出與同種異體人類巨噬細胞或小神經膠質細胞共培養之人類wt、dKO(B2M -/-CIITA -/-)或HIP 1.0(B2M -/-CIITA -/-CD47 tg)之細胞生存力資料。
第59圖示出與同種異體人類巨噬細胞或小神經膠質細胞共培養之人類dKO(B2M -/-CIITA -/-)細胞或與同種異體小鼠巨噬細胞或小神經膠質細胞共培養之小鼠dKO(B2M -/-CIITA -/-)細胞的細胞生存力資料。
第60圖示出與異種(跨物種)小鼠巨噬細胞或小神經膠質細胞共培養之人類dKO(B2M -/-CIITA -/-)細胞或與異種人類巨噬細胞或小神經膠質細胞共培養之小鼠dKO(B2M -/-CIITA -/-)細胞的細胞生存力資料。
第61A及61B圖示出在將HIP iPSC顱內移植至NSG小鼠中及接受性轉移NK細胞及在D0、D1、及D3，投與高劑量(HD；1mg)Fc同型IgG1對照後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第62A及62B圖示出在將HIP iPSC顱內移植至NSG小鼠中及接受性轉移NK細胞及在D0、D1、及D3，投與高劑量(HD；1mg) MIAP410後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第63A及63B圖示出在將HIP iPSC顱內移植至NSG小鼠中及接受性轉移NK細胞及在D0、D1、及D3，投與高劑量(HD；1mg) MIAP410後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力，其中血腦屏障藉由甘露糖醇注射來打破。
第64A及64B圖示出在人類NK細胞(A)或人類巨噬細胞(B)存在下，投與100μg/ml具有小鼠IgG1 Fc域之B6H12抗CD47抗體後，人類HIP iPSC活體外之細胞生存力資料。
第65圖示出在皮下移植人類HIP iPSC並且接受性轉移人類NK細胞及投與B6H12後，人類HIP iPSC活體內之細胞生存力資料。
第66A及66B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及在D0-D40期間，投與局部低劑量(LD；500μg) Fc同型IgG4對照後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第67A及67B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及在D0-D96期間，投與局部低劑量(LD；500μg)具有Fc同型IgG1之B6H12抗CD47抗體後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第68A及68B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及在D3-D40期間，投與局部低劑量(LD；500μg)具有Fc同型IgG1之B6H12抗CD47抗體後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第69A及69B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及在D11-D44期間，投與局部低劑量(LD；500μg)具有Fc同型IgG1之B6H12抗CD47抗體後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第70A及70B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及在D0、D1、及D3，投與局部高劑量(HD；1mg)具有Fc同型IgG1之B6H12抗CD47抗體後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第71A及71B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及在D3、D4、及D6，投與局部高劑量(HD；1mg)具有Fc同型IgG1之B6H12抗CD47抗體後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第72A及72B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及在D11、D12、及D14，投與局部高劑量(HD；1mg)具有Fc同型IgG1之B6H12抗CD47抗體後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第73A及73B圖示出在皮下移植HIP iPSC及接受性轉移NK細胞及在D0、D1、及D3，腹膜內投與局部高劑量(HD；1mg)具有Fc同型IgG1之B6H12抗CD47抗體後，人類HIP iPSC之活體內細胞生存力。
第74圖示出關於保護具有足夠CD47水準之細胞以免NK細胞及巨噬細胞殺滅，小分子氟胞嘧啶及更昔洛韋分別對於胞嘧啶去胺酶及HsVtk殺滅開關之效應之小分子活體外研究。
第75圖示出小分子氟胞嘧啶及更昔洛韋分別對於胞嘧啶去胺酶及HsVtk殺滅開關之效應之小分子活體外研究的前藥殺滅資料。
第76A及76B圖示出人類HIP-CyD iPSC在NSG小鼠中形成畸胎瘤。
第77A及77B圖示出在皮下注射至NSG小鼠中及每日腹膜內投與氟胞嘧啶LD (200mg/kg)治療劑後，人類HIP iPSC(CyD純系2G11)之細胞生存力資料，其中HIP-CyD iPSC之殺滅在16-44天內發生。
第78A及78B圖示出在皮下注射至NSG小鼠中及每日腹膜內投與氟胞嘧啶HD (500mg/kg)治療劑後，人類HIP iPSC(CyD純系2G11)之細胞生存力資料，其中HIP-CyD iPSC之殺滅在16-32天內發生。
第79A及79B圖示出在皮下注射至NSG小鼠中及在第13天開始每日腹膜內投與氟胞嘧啶LD (200mg/kg)治療劑後，人類HIP iPSC(CyD純系2G11)之細胞生存力資料，其中HIP-CyD iPSC之殺滅在開始投與後3-11天內發生。
第80A及80B圖示出在皮下注射至NSG小鼠中及在第13天開始每日腹膜內投與氟胞嘧啶HD (500mg/kg)治療劑後，人類HIP iPSC(CyD純系2G11)之細胞生存力資料，其中HIP-CyD iPSC之殺滅在開始投與後3-11天內發生。
第81A-81F圖示出在皮下注射至NSG小鼠中及每日腹膜內投與氟胞嘧啶HD (500mg/kg)治療劑後，人類HIP iPSC(純系15；無殺滅開關)之細胞生存力資料，其中儘管不存在殺滅開關，HIP-CyD iPSC存活受損(A及B)並且研究之擴展確認該等結果(C-F)。
第82A及82B圖示出在皮下注射至NSG小鼠中後，人類HIP iPSC luc +(胞嘧啶去胺酶純系2-G11)之細胞生存力資料。
第83A及83B圖示出在皮下注射至NSG小鼠中後及投與鹽水後，人類HIP iPSC (HSVTk純系1-B10)之細胞生存力資料。
第84A及84B圖示出在皮下注射至NSG小鼠中及每日腹膜內投與更昔洛韋LD (50mg/kg)治療劑後，人類HIP iPSC (HSVTk純系1-B10)之細胞生存力資料，其中HIP-HsVtk iPSC之殺滅在12-24天內發生。
第85A及85B圖示出在皮下注射至NSG小鼠中及每日腹膜內投與更昔洛韋HD (75mg/kg)治療劑後，人類HIP iPSC (HSVTk純系1-B10)之細胞生存力資料，其中HIP-HsVtk iPSC之殺滅在12-16天內發生。
第86A及86B圖示出在皮下注射至NSG小鼠中及在第13天開始每日腹膜內投與更昔洛韋LD (50mg/kg)治療劑後，人類HIP iPSC (HSVTk純系1-B10)之細胞生存力資料，其中HIP-HsVtk iPSC之殺滅在開始投與後7天內發生。
第87A及87B圖示出在皮下注射至NSG小鼠中及在第13天開始每日腹膜內投與更昔洛韋HD (75mg/kg)治療劑後，人類HIP iPSC (HSVTk純系1-B10)之細胞生存力資料，其中HIP-HsVtk iPSC之殺滅在開始投與後7天內發生。
第88A及88B圖示出在皮下注射至NSG小鼠中及在第0天開始每日腹膜內投與更昔洛韋HD (75mg/kg)治療劑後，人類HIP iPSC (純系15；無殺滅開關)之細胞生存力資料，其中HIP iPSC之殺滅未發生。
第89A及89B圖示出在皮下注射至NSG小鼠中後，人類HIP iPSC luc +(HSVtk純系1-B10)之細胞生存力資料。
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Claims (74)

  1. 一種包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑的方法，其中先前已向該受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體。
  2. 一種包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑的方法，其中先前已向該受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之T細胞群體。
  3. 一種包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑的方法，其中先前已向該受試者投與T細胞群體，該等細胞(i)經工程化以表現外源CD47多肽及至少一個嵌合抗原受體(CAR)並且(ii)具有MHC I類HLA分子、MHC II類HLA分子、T細胞受體(TCR)α、及/或TCR β之減少之表現。
  4. 一種包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑的方法，其中先前已向該受試者投與T細胞群體，該等細胞具有MHC I類HLA分子、MHC II類HLA分子、及TCRα之減少之表現並且經工程化以表現外源CD47多肽及CD19嵌合抗原受體(CAR)。
  5. 一種包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑的方法，其中先前已向該受試者投與經工程化以表現外源CD47多肽之胰島細胞群體。
  6. 一種包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑的方法，其中先前已向該受試者投與胰島細胞群體，該等細胞(i)經工程化以表現外源CD47多肽並且(ii)具有MHC I類HLA及/或MHC II類HLA分子之減少之表現。
  7. 一種包括向有需要之受試者投與CD47-SIRPα阻斷劑的方法，其中先前已向該受試者投與胰島細胞群體，該等細胞(i)經工程化以表現外源CD47、CD46、及CD59多肽並且(ii)具有MHC I類HLA及/或MHC II類HLA分子之減少之表現。
  8. 一種減少受試者中之經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體的方法，該方法包括以下步驟： (a) 向該受試者投與第一劑量之CD47-SIRPα阻斷劑； (b) 測定在(a)中投與之第一劑量之該CD47-SIRPα阻斷劑之第一結果； (c) 視情況基於(b)中之第一結果，投與第二劑量之該CD47-SIRPα阻斷劑；及 (d) 視情況測定在(c)中投與之第二劑量之該CD47-SIRPα阻斷劑之第二結果。
  9. 一種方法，該方法包括以下步驟： (a) 量化受試者中之經工程化以表現外源CD47多肽之細胞群體； (b) 測定有效減少細胞群體至少20%之CD47-SIRPα阻斷劑之第一劑量；及 (c) 將第一劑量之該CD47-SIRPα阻斷劑投與該受試者。
  10. 如請求項2、3、或4中任一項所述之方法，其中該等T細胞為原代細胞。
  11. 如請求項2、3、或4中任一項所述之方法，其中該等T細胞為同種異體細胞。
  12. 如請求項2、3、或4中任一項所述之方法，其中該等T細胞自iPSC分化。
  13. 如請求項2所述之方法，其中該等T細胞進一步經工程化以表現嵌合抗原受體(CAR)。
  14. 如請求項3、4、或13中任一項所述之方法，其中該CAR為選自由以下組成之群之CD19 CAR：tisagenlecleucel、lisocabtagene maraleucel、axicabtagene ciloleucel、及brexucabtagene autoleucel。
  15. 如請求項3、4、或13中任一項所述之方法，其中該CAR為包含SEQ ID NO:117之胺基酸序列的CD19 CAR。
  16. 如請求項15所述之方法，其中該CD19 CAR由SEQ ID NO:116之核酸序列編碼。
  17. 如請求項2、3、或4中任一項所述之方法，其中該等T細胞經工程化以表現至少一種選自由以下組成之群的額外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制劑、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重鏈、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8、及其組合。
  18. 如請求項5、6、或7中任一項所述之方法，其中該等胰島細胞經工程化以表現至少一種選自由以下組成之群的額外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制劑、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重鏈、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8、及其組合。
  19. 如請求項5、6、或7中任一項所述之方法，其中該等胰島細胞經工程化以具有CD142之減少之表現。
  20. 如請求項5、6、或7中任一項所述之方法，其中該等胰島細胞為原代細胞。
  21. 如請求項5、6、或7中任一項所述之方法，其中該等胰島細胞自iPSC分化。
  22. 如請求項3、4、或13中任一項所述之方法，其中該CAR及編碼該外源CD47多肽之基因在雙順反子載體中引入該等T細胞中。
  23. 如請求項22所述之方法，其中該雙順反子載體經由慢病毒來引入該等T細胞中。
  24. 如請求項23所述之方法，其中該CAR及編碼該外源CD47多肽之基因在單一啟動子之控制下。
  25. 如請求項8所述之方法，其中該第一結果及第二結果獨立地選自由以下組成之群：(i)約10%與100%之間之細胞數目之減少，(ii)約10%與100%之間之不良事件之減少，及(iii)(i)及(ii)之組合。
  26. 如請求項8或9所述之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量按以下方式投與： (i) 以0.05、0.1、0.3、1、3、或10 mg/kg； (ii) 每12小時一次、每24小時一次、每36小時一次、或每48小時一次；及/或 (iii) 持續1天與3週之間。
  27. 如請求項26所述之方法，其中該第一劑量及該第二劑量為相同的。
  28. 如請求項1、8、或9中任一項所述之方法，其中該等細胞為原代細胞。
  29. 如請求項28所述之方法，其中該等原代細胞為T細胞或胰島細胞。
  30. 如請求項1、8、或9中任一項所述之方法，其中該等細胞自iPSC分化。
  31. 如請求項12、21、或30中任一項所述之方法，其中該等分化細胞選自由以下組成之群：心臟細胞、神經細胞、內皮細胞、T細胞、胰島細胞、視網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲狀腺細胞、皮膚細胞、血細胞、原代細胞、及上皮細胞。
  32. 如請求項1、8、或9中任一項所述之方法，其中該等細胞經工程化以表現至少一種選自由以下組成之群的額外因子：CD16、CD24、CD35、CD39、CD46、CD52、CD55、CD59、CD200、CCL22、CTLA4-Ig、C1抑制劑、FASL、IDO1、HLA-C、HLA-E、HLA-E重鏈、HLA-G、IL-10、IL-35、PD-1、PD-L1、Serpinb9、CCl21、Mfge8、及其組合。
  33. 如請求項2、3、4、或29中任一項所述之方法，其中該等T細胞經工程化以具有TCRα及/或TCRβ之減少之表現。
  34. 如請求項2、3、4、或29中任一項所述之方法，其中該等T細胞經工程化以具有細胞毒性T淋巴球相關蛋白4(CTLA4)及/或計畫性細胞死亡(PD1)之減少之表現。
  35. 如請求項1-9中任一項所述之方法，其中編碼該外源CD47多肽之基因經由同源引導修復(HDR)介導插入細胞之基因組基因座中來引入該細胞中。
  36. 如請求項35所述之方法，其中該基因組基因座選自由以下組成之群：B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRBC基因座、及安全港基因座。
  37. 如請求項36所述之方法，其中該安全港基因座選自由以下組成之群：AAVS1、ABO、CCR5、CLYBL、CXCR4、F3、FUT1、HMGB1、KDM5D、LRP1、MICA、MICB、RHD、ROSA26、及SHS231基因座。
  38. 如請求項3、4、或13中任一項所述之方法，其中該CAR結合選自由以下組成之群之抗原：CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CD138、BCMA、及其組合。
  39. 如請求項8所述之方法，其中該第一結果及/或第二結果為不良事件。
  40. 如請求項1-7中任一項所述之方法，其中該CD47-SIRPα阻斷劑在向該受試者投與該等細胞之後至少一天投與。
  41. 如請求項1-7中任一項所述之方法，其中該CD47-SIRPα阻斷劑在向該受試者投與該等細胞之後至少一週投與。
  42. 如請求項1-7中任一項所述之方法，其中該CD47-SIRPα阻斷劑在向該受試者投與該等細胞之後至少一個月投與。
  43. 如請求項1-7中任一項所述之方法，其中該CD47-SIRPα阻斷劑在該受試者經歷與所投與細胞相關之不良事件之後投與。
  44. 如請求項39或43所述之方法，其中該不良事件選自由以下組成之群：異常增生、轉型、腫瘤形成、細胞因子釋放症候群、移植物抗宿主疾病(GVHD)、免疫效應細胞相關神經中毒性症候群(ICANS)、發炎、感染、噁心、嘔吐、出血、間質性肺炎、呼吸道疾病、黃疸、體重損失、腹瀉、食欲損失、抽筋、腹部疼痛、肝靜脈閉塞疾病(VOD)、移植失敗、器官損傷、不孕、激素變化、異常生長形成、白內障、及移植後淋巴增殖病症(PTLD)。
  45. 如請求項1-9中任一項所述之方法，其中該CD47-SIRPα阻斷劑包含CD47結合域。
  46. 如請求項45所述之方法，其中該CD47結合域包含信號調控蛋白α(SIRPα)或其片段。
  47. 如請求項1-9中任一項所述之方法，其中該CD47-SIRPα阻斷劑包含免疫球蛋白G (IgG) Fc域。
  48. 如請求項47所述之方法，其中該IgG Fc域包含IgG1 Fc域。
  49. 如請求項48所述之方法，其中該IgG1 Fc域包含人類抗體之片段。
  50. 如請求項1-9中任一項所述之方法，其中該CD47-SIRPα阻斷劑選自由TTI-621、TTI-622、及ALX148組成之群。
  51. 如請求項47所述之方法，其中該IgG Fc域包含IgG4 Fc域。
  52. 如請求項1-9中任一項所述之方法，其中該CD47-SIRPα阻斷劑為抗體。
  53. 如請求項52所述之方法，其中該抗體選自由以下組成之群：MIAP410、B6H12、及麥格羅單抗(Magrolimab)。
  54. 如請求項1-7中任一項所述之方法，其中該CD47-SIRPα阻斷劑以有效減少細胞群體之劑量投與。
  55. 如請求項54所述之方法，其中細胞群體減少約10%與約100%之間。
  56. 如請求項54所述之方法，其中細胞群體得以消除。
  57. 如請求項54所述之方法，其中細胞群體之減少經由免疫反應而發生。
  58. 如請求項57所述之方法，其中該免疫反應為NK細胞介導之細胞殺滅、巨噬細胞介導之細胞殺滅、補體依賴性細胞毒性(CDC)、及/或細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
  59. 如請求項1-9中任一項所述之方法，其中該CD47-SIRPα阻斷劑靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內、或顱內投與該受試者。
  60. 如請求項59所述之方法，其中該CD47-SIRPα阻斷劑以1-20天之間之時間間隔投與該受試者持續10天與6個月之間之時段。
  61. 如請求項60所述之方法，其中該CD47-SIRPα阻斷劑按以下方式投與該受試者： (i) 以0.05、0.1、0.3、1、3、或10 mg/kg之劑量； (ii) 每12小時一次、每24小時一次、每36小時一次、或每48小時一次；及/或 (iii) 持續1天與3週之間。
  62. 如請求項1-9中任一項所述之方法，進一步包括以下步驟：將IL-2投與該受試者。
  63. 如請求項1-9中任一項所述之方法，其中該CD47-SIRPα阻斷劑選自由以下組成之群：結合CD47之抗體或其片段、結合CD47之雙特異性抗體、結合CD47之免疫細胞因子融合蛋白、含有CD47之融合蛋白、結合SIRPα之抗體或其片段、結合SIRPα之雙特異性抗體、結合SIRPα之免疫細胞因子融合蛋白、含有SIRPα之融合蛋白、及其組合。
  64. 如請求項63所述之方法，其中結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：麥格羅單抗(Hu5F9-G4)、CC-90002、IBI-188、IBI-322、TG-1801(NI-1701)、ALX148、TJ011133、FA3M3、ZL1201、AK117、AO-176、SRF231、GenSci-059、C47B157、C47B161、C47B167、C47B222、C47B227、Vx-1004、HMBD004、SHR-1603、AMMS4-G4、RTX-CD47、及IMC-002。
  65. 如請求項63所述之方法，其中結合CD47之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對CD47之單鏈Fv片段(scFv)、針對CD47之Fab、針對CD47之VHH奈米抗體、針對CD47之DARPin、及其變異體。
  66. 如請求項63所述之方法，其中結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：ADU-1805、CC-95251、OSE-172(BI 765063)、KWAR23、及P362。
  67. 如請求項63所述之方法，其中結合SIRPα之抗體或其片段選自由以下組成之群：針對SIRPα之單鏈Fv片段(scFv)、針對SIRPα之Fab、針對SIRPα之VHH奈米抗體、針對SIRPα之DARPin、及其變異體。
  68. 如請求項63所述之方法，其中含有SIRPα之融合蛋白包含連接至Fc域的SIRPα之CD47結合域。
  69. 如請求項68所述之方法，其中該Fc域包含選自由以下組成之群的Fc域或其一部分：IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。
  70. 如請求項1、2、5、8、或9中任一項所述之方法，其中該等細胞具有MHC I類HLA及/或MHC II類HLA分子之減少之表現。
  71. 如請求項3、4、6、7、或70中任一項所述之方法，其中MHC I類及/或MHC II類表現得以敲除。
  72. 如請求項3、4、6、7、或70中任一項所述之方法，其中MHC I類HLA之減少表現由B2M之減少表現來介導並且MHC II類之減少表現由CIITA之減少表現來介導。
  73. 如請求項71所述之方法，其中B2M及/或CIITA表現得以敲除。
  74. 如請求項1-9中任一項所述之方法，其中該外源CD47多肽包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
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