TW202227529A - 聚乙二醇衍生物、包括其之組成物以及使用其之具生物活性胜肽偶聯物之製程 - Google Patents

聚乙二醇衍生物、包括其之組成物以及使用其之具生物活性胜肽偶聯物之製程 Download PDF

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Abstract

根據一方面的聚乙二醇衍生物化合物由說明書內的化學式1表示。在所述化學式1中，n為30至115的自然數，R 1與R 2為相同或不同的C1至C5烷基。

Description

聚乙二醇衍生物、包括其之組成物以及使用其之具生物活性胜肽偶聯物之製程
本發明係關於聚乙二醇衍生物、包括其之組合物以及使用該聚乙二醇衍生物的生理活性多肽偶聯物的製備。
肽類藥品是指兩個或更多氨基酸以一定的化學鍵形式連接的物質，主要通過化學合成產生的醫藥品。已知，肽類醫藥品具有‘生物相容性’、‘體內特異性’的特性，因此副作用少，同時即使是少量也可表現出強力的藥理學作用和活性。因此，有期待肽類醫藥品會彌補合成醫藥品和蛋白醫藥品的缺點。
然而，由於肽類醫藥品很容易被消化道中的蛋白酶降解為氨基酸，不適合口服施用，因此需要通過注射傳遞。并且，其血液半衰期較短，因此，其生物利用度較低且需要反復施用。并且，由於其尺寸小於蛋白醫藥品，在施用藥物時無法到達靶並通過腎臟在體內迅速消失。
為了解決上述問題，迄今為止研究了各種方法，例如：通過提高肽類藥物的生物膜滲透性以通過口腔或鼻腔吸入將肽類藥物傳輸至體內的方法；變更對蛋白水解酶敏感的特定氨基酸序列以抑制蛋白水解酶降解肽的方法；製備使用重組融合技術的生理活性多肽和人血清白蛋白或免疫蛋白片段（Fc）的融合蛋白的方法；以及在肽表面上化學添加高溶解性非肽聚合物的方法。
作為非肽基聚合物，聚乙二醇（PEG; polyethylene glycol）為具有非離子性、非毒性、生物相容性及高親水性的聚合物。由於PEG是容易實施化學變形的，可以通過共價鍵將其貼附至肽或蛋白藥物以增加相應藥物的分子量來抑制由腎臟引起的消失且從蛋白分解酶保護藥物。并且，由於PEG不引起任何特別的副作用，因此最近積極研究PEG作為延長肽類藥物的血液半衰期的方法。
PEG為美國食品藥品監督管理局（U. S. Food and Drug Administration）批准為“通常認為安全（GRAS; Generally recognized as safe）”的物質。國際專利公開WO 06/076471號記述通過將PEG結合至用作充血性心力衰竭（congestive heart failure）治療藥的B型利尿鈉肽（BNP; B-type natriuretic peptide）來持續生理活性。美國專利第6,924,264記述通過將PEG結合至exendin-4的賴氨酸殘基來在體內增加持續時間的方法。
作為未經改質或變形的PEG的乙二醇之均聚物的兩側或一側末端具有羥基。可以將PEG衍生物使用於結合至藥物的用途，例如可以使用將PEG鏈的一個或兩個末端的羥基轉化為高反應性官能團的PEG衍生物。例如，可以使用PEG-醛、PEG-乙醛、PEG-丙醛等作為PEG衍生物。這些醛PEG衍生物可以通過其末端的醛基與蛋白質的氨基酸一端選擇性反應以與肽類藥物形成化學鍵而連接的。
然而，若將兩側末端均為醛基的PEG衍生物使用於藥物結合，兩側醛基皆可參與反應，由此導致不希望的附加產物的生成或PEG的過量使用，結果對收率和純度帶來負面影響。
本發明的一個目的在於提供一種可用於多肽醫藥品製備的聚乙二醇衍生物及包括其之組合物。
本發明的另一目的在於提供使用上述的聚乙二醇衍生物的生理活性多肽偶聯物的製備方法。
根據一實施例的聚乙二醇衍生物化合物由以下的化學式1表示。
＜化學式1＞
Figure 02_image001
在所述化學式1中，n為30至115的自然數，並且，
R 1和R 2為彼此相同或不同的C 1至C 5烷基。
所述C 1至C 5烷基可以為甲基、乙基、丙基或丁基。
所述R 1和R 2可以為乙基。
n可以為50至100的自然數。
n可以為67至83的自然數。
根據一實施例的聚乙二醇衍生物組合物包括：
由以下化學式1A表示的聚乙二醇衍生物；
由以下化學式2表示的聚乙二醇衍生物；以及
由以下化學式3表示的聚乙二醇衍生物：
＜化學式1A＞
Figure 02_image003
＜化學式2＞
Figure 02_image005
＜化學式3＞
Figure 02_image007
n可以為30至115的自然數。
在所述組合物中，
在數均分子量2950至3650的範圍內由所述化學式1A表示的聚乙二醇衍生物的含量比基於高效液相色譜（HPLC; high performance liquid chromatography）為至少70面積%，
在數均分子量2950至3650的範圍內由所述化學式2表示的聚乙二醇衍生物的含量比基於高效液相色譜為15面積%或更低，
并且，在數均分子量2950至3650的範圍內由所述化學式3表示的聚乙二醇衍生物的含量比基於高效液相色譜為10面積%或更低。
當使用凝膠滲透色譜測量時，所述組合物中所述聚乙二醇衍生物的數均分子量在2950至3650的範圍內。
當使用凝膠滲透色譜測量時，所述組合物中所述聚乙二醇衍生物的數均分子量在3000至3200的範圍內。
根據一實施例的生理活性多肽偶聯物的製備方法包括
（a）聚乙二醇化(pegylation)步驟，其使以下化學式1中的聚乙二醇衍生物與生理活性多肽反應以生成連接體，其中所述生理活性多肽以共價鍵連接至以下化學式1的聚乙二醇衍生物的醛碳；
（b）水解步驟，其在酸性的水性條件下處理所述連接體以生成連接體水解物；及
（c）偶聯(conjugation)步驟，其使所述連接體水解物與免疫蛋白Fc片段或其衍生物反應以生成偶聯物。
＜化學式1＞
Figure 02_image001
在所述化學式1中，n為50至100的自然數，并且，
R 1和R 2為相同或不同的C 1至C 5烷基。
所述偶聯物具有其中Fc片段或其衍生物以共價鍵連接至衍生自所述連接體水解物內的所述化學式1的聚乙二醇衍生物的縮醛碳的碳原子的結構。
所述生理活性多肽可以選自激素、細胞因子、酶、抗體、生長因子、轉錄調節因子、凝血因子、疫苗、結構蛋白、配體蛋白以及受體。
所述（a）步驟的反應可以為還原性胺化，
並且，所述連接體可以為所述生理活性多肽的N-末端氮或賴氨酸的ε-氨基氮原子以共價鍵連接至所述化學式1中化合物的醛碳原子的物質。
所述（a）步驟的聚乙二醇化反應可以在pH3.0至9.0的範圍內執行。
所述步驟（b）的水解可以在pH1.0至5.0的範圍內執行。
所述步驟（c）的偶聯反應可以為還原性胺化。
所述還原性胺化可在pH5.0至8.5的範圍內執行。
所述Fc片段或衍生物的序列可以在其N-末端具有脯氨酸。
在所述偶聯物中，Fc片段或衍生物的N-末端脯氨酸的氮原子可以以共價鍵連接至衍生自所述縮醛碳的碳原子。
所述Fc片段或衍生物可以具有序列號2的氨基酸序列。
所述R 1和R 2可以為乙基。
n可以為67至83的自然數。
可以通過使生理活性多肽和Fc片段或其衍生物結合至一端具有反應性醛基且在另一端具有反應遲鈍的縮醛基的聚乙二醇衍生物來製備高收率的生理活性多肽偶聯物。
下文中，將詳細描述本發明。
除非另有定義，在本發明中使用的所有技術術語使用為與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的同樣的意味。并且，儘管在本說明書中記載了較佳的方法或試劑，其類似物或等價物也包括在本發明的範疇之內。并且，即使沒有明示，本說明書中記載的數值視為包括“約”的意義。以引用方式并入本文中的所有出版物的內容通過引用整體併入本說明書中。
描述根據本發明一實施例的聚乙二醇衍生物。
所述聚乙二醇衍生物為在聚乙二醇(PEG)的一端具有醛基(ALD)且在另一端具有縮醛基(ACT)的聚乙二醇衍生物。所述聚乙二醇衍生物可以由以下的式1表示。
ALD-PEG-ACT      ＜式1＞
在式1中，ALD為醛基官能團，PEG為聚乙二醇部位，ACT為縮醛基。
在式1中，所述聚乙二醇（PEG）部位可以由(-O-C 2H 4) n-O-表示，此時，n可以為30至115或50至100。根據更具體的例子，n可以屬於67至83的範圍。所述聚乙二醇可以與生理活性多肽和Fc片段或其衍生物結合來增加生理活性多肽的體內半衰期，且可以將生理活性多肽傳輸至體內。
所述醛基可以為反應性官能團，可以是烷基醛，例如C 2至C 6烷基醛。具體地，所述醛基可以為丙醛基、丁醛基等，但不限於此。所述醛基可以與生理活性多肽反應來將生理活性多肽結合至聚乙二醇。或者，所述醛基可以與Fc片段或其衍生物反應來將Fc片段或其衍生物結合至聚乙二醇。
所述縮醛基偉反應遲鈍的官能團，且不與生理活性多肽或Fc片段或其衍生物反應。因此，在聚乙二醇的一端通過醛基的反應結合至生理活性多肽或Fc片段或其衍生物的期間，聚乙二醇的另一端可以由反應遲鈍的縮醛基保護。
所述縮醛基可以由-R 1CH(OR 2)(OR 3)表示，并且，R 1至R 3可以彼此獨立地為C 2至C 6烷基。所述縮醛基具體地可以為1,1-二乙氧基丙基、1,1-二乙氧基丁基等，但不限於此。
所述縮醛基可以水解為醛基來形成第二醛基。第二醛基可以與生理活性多肽或Fc片段或其衍生物反應來將生理活性多肽或Fc片段或其衍生物結合至聚乙二醇的另一端。
所述式1的聚乙二醇衍生物的一個具體例子可以由以下的化學式1表示。
＜化學式1＞
Figure 02_image001
在所述化學式1中，R 1和R 2可以為彼此相同或不同的C 1至C 5烷基。此時，C 1至C 5烷基可以包括線形、分枝形，或環形烷基。C 1至C 5烷基例如可為甲基、乙基、丙基或丁基。R 1和R 2例如可為乙基。
n可以屬於30至115的範圍，例如50至100的範圍，再例如67至83的範圍。所述化學式1的縮醛基可以在生理活性肽偶聯物的形成過程中被水解且轉化為第二醛基。
具體地，化學式1的聚乙二醇衍生物可以由以下的化學式1A表示。
＜化學式1A＞
Figure 02_image003
對n，請參照化學式1中的n。
以下，描述根據本發明另一實施例的聚乙二醇衍生物組合物。
上述的聚乙二醇衍生物可以形成包括雜質的組合物。所述雜質可以包括聚乙二醇的兩端均為縮醛基的聚乙二醇衍生物及/或聚乙二醇的兩端均為醛基的聚乙二醇衍生物。在所述組合物中一端具有醛基且另一端具有縮醛基的聚乙二醇衍生物的含量比可以視為一端具有醛基且另一端具有縮醛基的聚乙二醇衍生物的純度。這種雜質的含量可以計算為通過使用高效液相色譜(HPLC: High-performance liquid chromatography)測量的相應峰的面積%。
例如，聚乙二醇衍生物組合物可以包括：
由以下化學式1A表示的聚乙二醇衍生物；
由以下化學式2表示的聚乙二醇衍生物；及
由以下化學式3表示的聚乙二醇衍生物。
＜化學式1A＞
Figure 02_image003
＜化學式2＞
Figure 02_image005
＜化學式3＞
Figure 02_image007
在化學式1A、化學式2以及化學式3中，n可以為30至115的自然數。
在所述組合物中，
由所述化學式1A表示的聚乙二醇衍生物可以具有2950至3650範圍內的數均分子量，且可以具有基於高效液相色譜表示為至少75面積%的含量比。
由所述化學式2表示的聚乙二醇衍生物可以具有2950至3650範圍內的數均分子量，并且可以具有基於高效液相色譜表示為15面積%或更低的含量比。
由所述化學式2表示的聚乙二醇衍生物可以具有2950至3650範圍內的數均分子量，并且可以具有基於高效液相色譜表示為10面積%或更低的含量比。
在所述組合物中，所述聚乙二醇衍生物的數均分子量可以為用凝膠滲透色譜測量的值。
當使用凝膠滲透色譜測量時，所述組合物中的所述聚乙二醇衍生物的數均分子量可以在3000至3200的範圍內。
可以由凝膠滲透色譜測量化合物的數均分子量。
以下，描述根據本發明另一實施例的生理活性多肽偶聯物的製備方法。圖1為用於描述根據一實施例的生理活性多肽偶聯物的製備方法的流程圖。
參照圖1，根據所述生理活性多肽偶聯物的製備方法，首先提供聚乙二醇衍生物（S110），其包括在一端具有醛基官能團且在另一端具有縮醛基官能團的聚乙二醇。所述聚乙二醇衍生物為由所述式1、化學式1或化學式1A表示的化合物，對此，請參照對上述的式1、化學式1或化學式1A中的化合物的描述。
接著，使所述聚乙二醇衍生物與生理活性多肽反應（S120）。通過所述反應，可以形成一種連接體，其中所述生理活性多肽以共價鍵連接至聚乙二醇衍生物的醛碳。這種連接體形成反應可以為聚乙二醇化反應（pegylation reaction）。所述聚乙二醇化反應可以為還原性胺化反應。所述聚乙二醇化反應可在pH3.0至9.0，例如在pH5.0至9.0的範圍內執行。
所述生理活性多肽例如可以包括激素、細胞因子、酶、抗體、生長因子、轉錄調節因子、凝血因子、疫苗、結構蛋白、配體蛋白或受體。例如，生理活性多肽可以為exendin-4或咪唑乙醯exendin-4(imidazoacetyl exendin-4)。例如，所述連接體可以為其中所述生理活性多肽的N-末端氮或賴氨酸的ε-氨基氮原子以共價鍵連接至所述化學式1的化合物的醛碳原子的物質。
接著，可以將其一端與所述生理活性多肽的所述聚乙二醇衍生物的另一端的所述縮醛基轉化為醛基（S130）。
例如，可以通過水解將縮醛基轉化為醛基。此時，水解例如可以在酸性和水性條件下執行。所述水解可以在pH1.0至5.0的範圍，例如在pH2.0至5.0的範圍內執行。若所述化學式1的縮醛基的R 1及/或R 2為丙基，通過水解生成的醛基可以為丙醛基。
接著，可以使所述聚乙二醇衍生物的經轉化的醛基與Fc或其衍生物反應（S140）。通過所述反應，所述聚乙二醇衍生物的另一端可以與Fc片段或其衍生物形成偶聯(conjugation)。此時，Fc片段或其衍生物可以以共價鍵連接至衍生自縮醛基的碳的碳原子。
例如，若聚乙二醇衍生物為由所述化學式1表示的聚乙二醇衍生物，可以首先將該聚乙二醇衍生物的醛基與生理活性多肽反應來將生理活性多肽結合至聚乙二醇衍生物的一端。此時，生理活性多肽可以與醛基進行聚乙二醇化反應。例如，還原性胺化反應可以用於所述聚乙二醇化反應。接著，可以將縮醛基水解且轉化為具有反應性的第二醛基。縮醛基是在通過上述方式獲得的聚乙二醇衍生物-生理活性多肽連接體中未反應而殘留的官能團。可以使該聚乙二醇衍生物-生理活性多肽連接體的經轉化的第二醛基與Fc片段或其衍生物反應。該反應為偶聯反應(conjugation reaction)，例如可以使用還原性胺化反應。所述還原性胺化可在pH5.0至8.5的範圍內執行。通過該反應，可以使Fc片段或其衍生物結合至聚乙二醇衍生物-生理活性多肽連接體的另一端。通過這樣的過程，可以形成一種生理活性多肽偶聯物，其中，聚乙二醇衍生物的一端連接至生理活性多肽，并且另一端連接至Fc片段或其衍生物。所述偶聯物例如可以為Fc片段或衍生物的N-末端脯氨酸的氮原子以共價鍵連接至衍生自聚乙二醇衍生物的縮醛碳的碳原子的偶聯物。縮醛碳為-OR基連接至縮醛基的碳素。
使用根據本發明實現例的使用聚乙二醇衍生物的生理活性多肽偶聯物的製備方法具有可以抑制雜質或有關物質(related substance)的產生且收率高的優點。
在將生理活性多肽連接至在末端包括官能團的聚乙二醇衍生物的步驟（聚乙二醇化）中，可能不可避免地生成兩個或更多個單位的聚乙二醇衍生物連接至一個單位的生理活性多肽的有關物質中間體作為副產物。若聚乙二醇衍生物的分子量不大，僅使用常規的色譜方法不容易在進入後續偶聯反應之前完全淨化並過濾這種有關物質中間體。
若使用兩側末端都具有醛官能團的現有技術的聚乙二醇衍生物，如此殘留的有關物質中間體可能在後續偶聯步驟中與Fc片段反應且產生多聚體（二聚體、三聚體等）形式的雜質。并且，在使用現有技術的聚乙二醇衍生物的製備中，在聚乙二醇化步驟可能形成如生理活性多肽-聚乙二醇衍生物-生理活性多肽的三明治結構的聚乙二醇連接體。由於這些反應副產物，收率可能減少。
若使用兩側末端皆具有醛官能團的現有技術的聚乙二醇衍生物，由於醛基的反應性高，醛基可能與反應目標以外的其他物質先反應而消失。并且，在聚乙二醇衍生物的製備過程中，生成末端基團被修飾的雜質，因此，聚乙二醇衍生物本身可能包括某種程度的雜質。當一側末端的醛基由於醛基活性的消失或修飾轉化為羥基或醚基等，且具有單一醛基的有關物質進行聚乙二醇化反應時，可以生成具有相應結構的聚乙二醇連接體。這種聚乙二醇連接體中沒有通過後續偶聯反應可以與Fc片段或其衍生物反應的醛基，因此不會導致最終偶聯物。因此，產生具有這種單一醛基的有關物質在現有技術的偶聯物製備方法中可能導致雜質和收率降低。
若將根據本發明實施例的聚乙二醇衍生物用於製備生理活性多肽偶聯物，可以根本預防產生這種雜質。與現有技術的聚乙二醇衍生物不同，根據本發明實施例的聚乙二醇衍生物僅在一側包括醛基，因此基本上無法形成多聚體。并且，在使用根據本發明實施例的聚乙二醇衍生物的製備方法中，若醛基在聚乙二醇化以前消失或變成有關物質，無法從開始生成生理活性多肽-聚乙二醇連接體，即聚乙二醇化的產物。因此，可以抑制產生有關物質，容易淨化，這導致在聚乙二醇化步驟的收率增加。進而，如下面記述，聚乙二醇化後的偶聯反應步驟的效率也在比現有技術高，也可以改善淨化工藝中的純度。
關於這些優點，將本發明製備方法的收率與現有技術的製備方法的收率總體上進行比較。首先，在本發明具體實施方式中，聚乙二醇化產物即生理活性多肽-聚乙二醇連接體的醛活性程度（醛基保持至偶聯反應直前的程度）通常為80至95%水平。這顯著高於使用現有技術中聚乙二醇衍生物的連接體的醛活性程度60至75%。并且，在本發明製備方法中偶聯步驟的收率也增加，因此，在本發明的具體實施方式中，生理活性多肽偶聯物的最終收率通常增加至現有技術中的製備方法的約1.2倍至1.7倍水平。 [實施方式]
在下文中，以具體實施例描述本發明的生理活性多肽偶聯物的製備方法。
首先，製備將乙二醇重複部的兩側末端分別改質為丙醛基和3-二乙氧基丙基的聚乙二醇衍生物（ALD-PEG-DEP）。
試驗例1：製備ALD-PEG-DEP（1）
（a）製備PEG-Ms
Figure 02_image015
在氮氣氣氛下的反應器中將PEG（數均分子量3400）100 g溶解於300 mL的二氯甲烷（CH 2Cl 2）的溶液冷卻至5℃。將23.0 mL的三乙胺（TEA）加入所述溶液中，并且維持5℃的同時添加12.6 mL的甲磺醯氯(MsCl)。在5℃下攪拌該反應液兩個半小時後，添加300 mL的蒸餾水，再攪拌十分鐘後從此分離有機層。
向水層添加300 mL的二氯甲烷以進一步萃取有機層後，將其結合至已分離的有機層。在使用蒸餾水洗滌所結合的有機層後，用無水硫酸鎂進行乾燥後過濾。對濾液進行減壓下濃縮後，將該濃縮液溶解於100 mL的二氯甲烷，並將其逐滴添加于1500 mL的甲基叔丁基醚中三十分鐘。在室溫下攪拌反應液一小時後過濾固體，使用甲基叔丁基醚洗滌該固體後在室溫下用氮素進行乾燥以獲得目標化合物即PEG-Ms（mesylate）97 g（收率：92.6%）。
（b）製備PEG-DEP
Figure 02_image017
在氮素氣氛下將1.8 mL的3,3-二乙氧基-1-丙醇和40 mL的甲苯投入第一反應器中。在向其投入1.4 g的叔丁醇鉀（t-BuOK），升溫至50℃並攪拌一小時後，將反應液冷卻至室溫。
在氮素氣氛下，將如上所述製備的10 g的PEG-Ms和40 mL的甲苯投入第二反應器中。向其緩慢滴加第一反應器中的活化溶液一個小時。在室溫下攪拌兩個小時，並在反應結束後向反應物添加飽和的氯化銨水溶液。在攪拌反應物五分鐘後，添加二氯甲烷以萃取有機層。向水層添加二氯甲烷以進一步萃取有機層。收集有機層並將其減壓下濃縮並完全溶解於10 mL的二氯甲烷後通過滴加甲基叔丁基醚來進行結晶化。在室溫下攪拌兩個小時後，過濾結晶並使用甲基叔丁基醚進行洗滌。在室溫下使用氮素乾燥結晶以獲得9.3 g的目標化合物即PEG-二乙縮醛（PEG-DEP）（收率：90.0%）
（c）製備ALD-PEG-DEP
Figure 02_image019
將0.1 N的醋酸360 mL和60 g的PEG-DEP投入反應器並將其溶解後在20℃下攪拌四個小時。向該溶液投入5%的碳酸氫鈉水溶液和蒸餾水後攪拌五分鐘。將二氯甲烷和己烷投入反應液並攪拌十分鐘後分離水層。將二氯甲烷和己烷投入水層並攪拌十分鐘後分離有機層。收集有機層並使用硫酸鎂進行乾燥，在過濾後進行減壓下濃縮。將二氯甲烷加入濃縮液以溶解後滴加甲基叔丁基醚來進行結晶化。在室溫下攪拌三十分鐘後，過濾結晶並使用甲基叔丁基醚進行洗滌。在室溫下將結晶氮氣乾燥以獲得目標化合物。目標化合物為3.4 kDa的ALD-PEG-DEP，其中3.4 kDa乙二醇重複部的兩側末端各自由丙醛和3-甲氧基丙基改質，其生成量為16.0 g（收率：26.7%）。通過凝膠滲透色譜（GPC; gel permeation chromatography）測量的數均分子量為3111。
試驗例2：製備ALD-PEG-DEP
Figure 02_image019
（a）製備PEG-Ms
通過與試驗例1的PEG-Ms製備方法相同的方法製備PEG-Ms。
（b）製備ALD-PEG-DEP
在氮素氣氛下將45 mL的3,3-二乙氧基-1-丙醇和400 mL的甲苯投入第一反應器中。向其投入15.7 g的叔丁醇鉀（t-PeOK）後將溫度升高至50℃，并將其攪拌一個小時。將反應液冷卻至常溫。
在氮素氣氛下，將如上所述製備的100 g的PEG-Ms和400 mL的甲苯投入第二反應器中。向其緩慢滴加第一反應器中的活化溶液一個小時。在室溫下攪拌兩個半小時且反應結束後，將蒸餾水加入反應物中。將反應物攪拌五分鐘後分離水層。將二氯甲烷和甲苯加入水層以萃取有機層。向有機層添加蒸餾水並攪拌五分鐘後再次分離水層。
將醋酸13 mL投入經分離的水層並在常溫下攪拌兩個半小時。向此投入5%的碳酸氫鈉水溶液後攪拌五分鐘。在第三反應器中混合二氯甲烷和己酸後向其添加上述的反應液。將混合液攪拌十分鐘後分離水層。向經分離的水層添加5%的碳酸氫鈉水溶液並攪拌五分鐘。在第三反應器中混合二氯甲烷和己酸後向其添加上述的反應液並攪拌十分鐘後分離有機層。向經分離的有機層投入蒸餾水並進行攪拌後分離有機層。使用硫酸鎂乾燥有機層，且過濾後進行減壓濃縮。將二氯甲烷加入濃縮液以溶解後滴加甲基叔丁基醚來進行結晶化。在室溫下攪拌三十分鐘後，過濾結晶並使用甲基叔丁基醚進行洗滌。在室溫下對結晶進行氮素乾燥以獲得10.1 g的目標化合物即3.4 kDa ALD-PEG-DEP（收率：10.1%）。通過凝膠滲透色譜測量的數均分子量為3163。
分析例：對ALD-PEG-DEP與ALD-PEG-ALD特性的比較
對按照根據本發明實施例的方法製備的聚乙二醇衍生物即ALD-PEG-DEP和兩內側末端由丙醛基改質的市售聚乙二醇衍生物即ALD-PEG-ALD（由韓國韓美精密化學製備，其聚乙二醇重複部的化學式重量為3.4 kDa）的特性進行測量和比較。為此執行基質輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI-TOF: matrix-assisted laser desorption ionization- time of flight)質譜分析、核磁共振分析（ 1H NMR, 13C NMR）和傅里葉變換紅外光譜（FT-IR; Fourier transform infrared spectroscopy）。
圖2A和圖2B分別為在試驗例2中製備的ALD-PEG-DEP和市售的的ALD-PEG-ALD的MALDI-TOF的質量分析圖表。以下表1示出對在試驗例2中製備的ALD-PEG-DEP和市售的ALD-PEG-ALD的分子量進行比較的結果。
【表1】
分子量 ALD-PEG-DEP ALD-PEG-ALD
Mn 3538.8 3520.7
Mw 3551.8 3536.4
Mw/Mn 1.00 1.00
參照圖2A、圖2B及表1可知，在試驗例2的ALD-PEG-DEP與市售的ALD-PEG-ALD之間不存在顯著的分子量差。圖3A和圖3B分別為在試驗例2的ALD-PEG-DEP和市售ALD-PEG-ALD的核磁共振（ 1H NMR）的光譜的圖表。在圖3A和圖3B的 1H-NMR光譜中，可以通過符合二乙氧基的峰（三重線即4.6 ppm附近的（b）、1.2 ppm附近的（i），多重線即1.8 ppm附近的（h））確認試驗例的ALD-PEG-DEP具有縮醛端基。相反，在圖2B的 1H-NMR中不出現符合二乙氧基的峰。
圖3C和圖3D分別為在試驗例2的ALD-PEG-DEP和市售ALD-PEG-ALD的核磁共振（13C NMR）的光譜的圖表。在圖3C的 13C-NMR光譜中，在δ15 ppm（i）、62 ppm（f）觀察到符合乙基的峰，且在δ101 ppm（b）觀察到二次碳的峰。在圖3C的圖表中觀察到在分子結構上具有非對稱結構的複數個ALD-PEG-DEP峰；相反，在圖3D的圖表中觀察到在分子結構上構成對稱結構的複數個ALD-PEG-ALD峰（ALD-PEG-DEP的峰（e）、（f）：ALD-PEG-ALD的峰（c）；ALD-PEG-DEP的峰（h）、（i）：ALD-PEG-ALD的峰（d））。
圖4A和圖4B分別為在試驗例2的ALD-PEG-DEP和市售ALD-PEG-ALD的FT-IR光譜。基於圖4A和圖4B的FT-IR光譜具有類似的峰模式的事實，可知試驗例2的ALD-PEG-DEP和市售的ALD-PEG-ALD具有類似的高分子骨骼架。
為了把握包括ALD-PEG-DEP的該聚乙二醇衍生物組合物的純度，由高效液相色譜（HPLC）進行分析。使用辛基矽烷化矽膠充填的柱子（內徑4.6 mm×長度250 mm，5.0 μm），並使用純淨水和乙腈作為流動相通過反相色譜進行分析。將聚乙二醇衍生物的含量比計算為由高效液相色譜測量的相應峰的面積比。
實施例1：使用ALD-PEG-DEP製備CA GLP-2(RK)-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物
Figure 02_image022
使用序列號1的多肽CA GLP-2（RK）即人胰高血糖素樣肽-2（GLP-2）的衍生物作為生理活性多肽製備生理活性多肽偶聯物。
序列號1的多肽CA GLP-2(RK)的氨基酸序列如下：
(4-imidazoacetyl-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Arg-Ile-Thr-Asp-Lys)
（1）製備CA-GLP-2(RK)-PEG-DEP偶聯物
將CA GLP-2（RK）的第34賴氨酸殘基鍵合至3.4 kDa的ALD-PEG-DEP末端以製備CA-GLP-2(RK)-PEG-DEP。此時，將CA GLP-2(RK)和ALD-PEG-ALD的摩爾比設定為1：8且CA GLP-2(RK)多肽的濃度設定為10 mg/mL並在室溫下反應約二十五小時。此時，將包括50 mM的三乙醇胺（pH8.0）和作為還原劑的100 mM硼氫化鈉氰化鈉（NaBH 3CN）的溶液用作反應液。在反應結束後，通過使用20 mM的Bis-Tris緩衝液（pH6.2）和NaCl濃度梯度的陰離子交換色譜淨化反應混合物來分離CA GLP-2(RK)-PEG-DEP。淨化收率為59.6%，并且，根據SE-HPLC和RP-HPLC分析結果，純度各自為99%、99%。
（2）製備CA GLP-2(RK)-PEG-ALD偶聯物
為了將淨化的CA GLP-2(RK)-PEG-DEP的二乙氧基官能團(DEP)水解而轉化為醛基(ALD)，使用20 mM的檸檬酸鈉（pH2.0）緩衝液降低pH後，為了後續工藝，使用20 mM的Bis-Tris（pH6.5）緩衝液來更換緩衝液以獲得CA GLP-2(RK)-PEG-ALD。
（3）製備CA GLP-2(RK)-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物
接著，將如此獲得的CA GLP-2(RK)-PEG-ALD和免疫蛋白Fc片段（序列號2）的摩爾比設定為1：2，並將整體蛋白（CA GLP-2(RK）和免疫蛋白Fc片段）的濃度設定為30 mg/mL且在室溫下進行偶聯反應十四至十六小時。此時，將20 mM的Bis-Tris（pH6.2）和乙醇、作為還原劑的30 mM的NaBH 3CN加入反應液中。在反應結束後，通過使用疏水作用色譜（hydrophobic interaction chromatography; HIC）和陰離子交換色譜來從該反應混合中淨化CA GLP-2(RK)-PEG-免疫蛋白Fc。淨化收率為70.2%，并且，根據SE-HPLC和RP-HPLC分析結果，純度各自為98.1%、97%。
序列號2的免疫蛋白Fc的氨基酸序列如下：
(Pro-Ser-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Phe-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Asn-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Lys)
比較例1：使用ALD-PEG-ALD製備CA GLP-2(RK)-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物
Figure 02_image024
（1）製備CA GLP-2(RK)-PEG-ALD偶聯物
為了將3.4 kDa ALD-PEG-ALD（韓國韓美精密化學，產品名PGA）聚乙二醇化至CA GLP-2(RK)的第34賴氨酸殘基，將CA GLP-2(RK)和3.4 kDa ALD-PEG-ALD的摩爾比設定為1：8，並將CA GLP-2(RK)的濃度設定為12 mg/mL，且在常溫下進行反應兩個小時至四個小時。此時，通過將作為還原劑的200 mM的2-甲基吡啶硼烷絡合物加入50 mL的三乙醇胺（pH8.0）和異丙醇來製備反應溶液。在反應結束後，將反應液應用於使用20 mM的Bis-Tris（pH6.2）緩衝液和氯化鈉濃度梯度的陰離子交換柱子來淨化CA GLP-2(RK)-PEG-ALD。淨化收率為55.3%，并且，根據SE-HPLC和RP-HPLC分析結果，純度各自為90%、87%（表1）。
（2）製備CA GLP-2(RK)-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物
接著，將CA GLP-2(RK)-PEG-ALD和免疫蛋白Fc片段（序列號2）的摩爾比設定為1：2，並將免疫蛋白Fc片段濃度設定為30 mg/mL在室溫下進行反應十四至十六小時。此時，將包括20 mM的2-甲基吡啶硼烷絡合物作為還原劑的溶液加入20 mM的Bis-Tris（pH6.2）和異丙醇作為反應液。在反應結束后，通過使用疏水作用色譜和陰離子交換色譜來從該反應混合物中淨化CA-GLP-2(RK)-PEG-免疫蛋白Fc。淨化收率為67.7%，并且，根據SE-HPLC和RP-HPLC分析結果，純度各自為98.6%和96.1%。
分析例：維持聚乙二醇衍生物的醛基活性
對於在生理活性多肽偶聯物的製備方法中醛基殘留直至與Fc片段的偶聯反應步驟之前的程度（活性程度），對使用本發明的聚乙二醇衍生物的實施例和使用現有技術中具有兩側末端的醛基PEG衍生物的比較例進行比較。
對GLP-2衍生物，即在實施例1的偶聯物製備工藝中使用的生理活性多肽，執行實施例1中記載的聚乙二醇化、色譜淨化和水解步驟以獲得連接體水解物。對同樣的生理活性多肽，執行比較例1中記載的聚乙二醇化和色譜淨化以獲得相應的連接體。
隨後，通過使所述連接體水解物和連接體與試劑反應來形成衍生物，並使用紫外-可見分光光度法定量衍生物生成程度以測量醛基的活性程度，并且在圖5中示出該測量結果。
參照圖5可確認，通過使用根據本發明的ALD-PEG-DEP而獲得的連接體水解物的醛基活性程度為87.2%，即，相對於使用現有ALD-PEG-ALD而獲得的連接體的醛基活性程度69.8%，醛基保持在相當高的比例。
如上所述，在使用根據本發明實施例的聚乙二醇衍生物化合物的生理活性多肽偶聯物的製備方法中，醛末端的活性可以保持為更高。并且，即使在後續工藝中使用與現有技術中的制法相同的淨化工藝，本發明製備方法的偶聯反應步驟的製備收率高於現有技術中的製備收率。對於本發明實施例而言，偶聯反應製備收率為50.8%，相比於使用現有ALD-PEG-ALD時的40.5%增加25%或更多。
在CA GLP-2(RK)-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物製備中，本發明實施例1中的整體收率為30.3%，即表現出比現有技術的比較例1的22.4%增加約35%的結果。
實施例2：使用ALD-PEG-DEP製備CA EXD4(Lys27)-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物
Figure 02_image026
（1）製備CA EXD4-PEG-DEP偶聯物
使用exendin-4的衍生物即咪唑乙醯-exendin-4（imidazoacetyl-Exendin-4，韓美精密化學，韓國）（以下，稱謂CD EDX4，序列號3）作為生理活性多肽來製備生理活性多肽偶聯物。序列號3的CA EXD4的氨基酸序列如下：
(4-imidazoacetyl-Gly -Glu -Gly -Thr -Phe -Thr -Ser -Asp -Leu -Ser -Lys -Gln -Met -Glu -Glu -Glu -Ala -Val -Arg -Leu -Phe -Ile -Glu -Trp -Leu -Lys -Asn -Gly -Gly -Pro -Ser -Ser -Gly -Ala -Pro -Pro -Pro -Ser -NH 2)
為了將試驗例1中製備的3.4kDa ALD-PEG-DEP聚乙二醇化至CA EXD4的賴氨酸27（Lys27）位置，將CA EXD4 :ALD-PEG-DEP的摩爾比設定為1：3且CA EXD4的濃度設定為12 g/L在8±2℃下進行反應約16小時。具體地，在0.1M的Bis-Tris（pH7.9）、45%（v/v）異丙醇條件中進行反應，并且，添加50 mM的氰基硼氫化鈉（NaCNBH 3，SCB: sodium cyanoborohydride）作為還原劑來進行反應。
反應結束後，應用包括檸檬酸鈉和乙醇的緩衝溶液和KCL線性濃度梯度並使用SOURCE 15S柱子（Cytiva）來從反應液中分離並淨化CA EXD4(Lys27)-PEG-DEP偶聯物。
CA EXD4(Lys27)-PEG-DEP對所投入的CA EXD4的收率確認為50%左右。
（2）製備CA -EXD4-PEG-ALD偶聯物
為了將CA EXD(Lys27)-PEG-DEP偶聯物的二乙氧基丙基（DEP）官能團水解為丙醛基團，將緩衝液更換為酸性溶液。具體地，用水稀釋CA EXD4(Lys27)-PEG-DEP)後，通過分離膜超濾/滲濾（ultra filtration/diafiltration）方法使用25 mM的鹽酸更換並濃縮緩衝液後分離CA EXD4(Lys27)-PEG-ALD偶聯物，使得最終回收濃度為約0.8 g/L或更高。根據使用RP-HPLC分析法分析末端官能團的更換程度的結果，確認二乙氧基丙的至少95%轉化為丙醛基。
（3）製備CA EXD4(Lys27)-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物
為了製備CA EXD4(Lys27)-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物，連接在（2）中獲得的CA EXD4(Lys27)-PEG-ALD偶聯物和免疫蛋白Fc（序列號2）。此時，設定CA EXD4(Lys27)-PEG-ALD偶聯物和免疫蛋白Fc的摩爾比設定為1：2且設定整個蛋白（CA EXD4和免疫蛋白Fc）的濃度設定為10 g/L在室溫下進行反應兩個小時。此時，使用包括bis-tris和用作還原劑的SCB的溶液作為反應溶液。
反應結束後，使用疏水相互作用色譜和陰離子交換色譜來從該反應混合物獲得CA EXD4(Lys27)-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物。
CA EXD4(Lys27)-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物對所投入的CA EXD4生理活性多肽的收率確認為50%至60%左右。
比較例2：使用ALD-PEG-ALD製備CA EXD4(Lys27)-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物
Figure 02_image028
（1）製備CA EXD4-PEG-ALD偶聯物
為了將3.4 kDa ALD-PEG-ALD（韓國，韓美精密化學）聚乙二醇化至exendin-4的衍生物即CA EXD4的Lys27位置，將CA EXD4：PEG的摩爾比設定為1：5並將CA EXD4的濃度設定為18 g/L，在8±2℃下進行反應約4小時。此時，在0.1 M的HEPES緩衝溶液（pH7.5）、45%異丙醇中進行反應，並添加50 mM的SCB作為還原劑來進行反應。
反應結束後，應用包括檸檬酸鈉、乙醇的緩衝液和KCI線性濃度梯度並使用SOURCE 15S 柱子（Cytiva）來從反應液中分離並淨化CA EXD4(Lys27)-PEG-ALD偶聯物。
接著，用水稀釋CA EXD4(Lys27)-PEG-ALD偶聯物的淨化液後，通過使用分離膜超濾/滲濾方法用10 mM的磷酸鉀溶液更換並濃縮緩衝液以獲得約0.6 g/L或更高的最終回收濃度。
CA EXD4(Lys27)-PEG-ALD偶聯物對所投入的CA EXD4生理活性多肽的收率確認為35%至43%。
（2）製備CA EXD4(Lys27)-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物
為了製備CA EXD4(Lys27)-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物，連接在（1）中獲得的CA EXD4(Lys27)-PEG-ALD偶聯物和免疫蛋白Fc(序列號2)。此時，將CA EXD4(Lys27)-PEG-ALD偶聯物和免疫蛋白Fc的摩爾比設定為1：2並將整個蛋白（CA EXD4和免疫蛋白Fc）濃度設定為10 g/L並在室溫下進行反應十六小時。此時，使用包括HEPES和作為乙醇還原劑的SCB的溶液作為反應液。
反應結束後，使用疏水作用色譜和陰離子交換色譜來從該反應混合物獲得CA EXD4(Lys27)-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物。相對於所投入的生理活性多肽的收率確認為35%至40%。
相對於CA-EXD4-PEG-免疫蛋白Fc製備的整個收率，實施例2的收率表現出比比較例2的收率改善的結果。
實施例3：使用ALD-PEG-DEP製備GCSF衍生物-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物
Figure 02_image030
（1）製備GCSF-PEG-DEP
使用人粒細胞刺激因子（GCSF; granulocyte colony stimulating factor）的衍生物（序列號4）作為生理活性多肽製備生理活性多肽偶聯物。
序列號4的GCSF衍生物的氨基酸序列如下：
(TPLGPASSLP QSFLLKSLEQ VRKIQGDGAA LQEKLCATYK LCHPEELVLL GHSLGIPWAP LSSCSSQALQ LAGCLSQLHS GLFLYQGLLQ ALEGISPELG PTLDTLQLDV ADFATTIWQQ MEELGMAPAL QPTQGAMPAF ASAFQRRAGG VLVASHLQSF LEVSYRVLRH LAQP)
為了將在試驗例1中製備的3.4 kDa ALD-PEG-DEP聚乙二醇化至所述GCSF衍生物N-末端的蘇氨酸位置，將GCSF衍生物：ALD-PEG-DEP的摩爾比設定為1：4並將GCSF衍生物的濃度設定為8 g/L，並在6±4℃下進行反應八小時。具體地，在0.1 M的磷酸鉀（pH 6.0）中進行反應，並添加50 mM的SCB作為還原劑來進行反應。
在偶聯反應後，使用SP-HP柱子（Cytiva，陽離子交換色譜）來淨化GCSF衍生物-PEG-DEP。此時，使用乙酸鈉緩衝液，且使用氯化鈉濃度梯度進行淨化。
GCSF-PEG-DEP對所投入的GCSF衍生物的收率確認為61.2%。
（2）DEP官能團的水解
為了將GCSF衍生物-PEG-DEP的二乙氧基丙基官能團水解為丙醛基團(ALD)，將緩衝液更換為酸性溶液。具體地，通過使用分離膜超濾/滲濾(UF/DF)方法將緩衝液pH降低至2.0後在常溫下保存經淨化的GCSF-PEG-DEP十六小時。
（3）製備GCSF衍生物-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物
為了製備GCSF-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物，連接在（2）中獲得的GCSF衍生物-PEG-ALD與免疫蛋白Fc（序列號2）。此時，將GCSF衍生物-PEG-ALD連接體和免疫蛋白Fc的摩爾比設定為1：4並將整個蛋白（GCSF和免疫蛋白Fc）的濃度設定為50 g/L，並在6±4℃進行反應十六小時。具體地，在0.1 M的磷酸鉀（pH6.0）中進行反應，並添加20 mM的SCB作為還原劑來進行反應。
反應結束後，使用疏水作用色譜和陰離子交換色譜來從該反應混合物獲得GCSF衍生物-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物。
GCSF衍生物-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物對所投入的GCSF衍生物-PEG-DEP的收率確認為50.2%。
比較例3：使用ALD-PEG-ALD製備GCSF衍生物-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物
Figure 02_image032
（1）製備GCSF-PEG-ALD
為了將3.4 kDa ALD-PEG-ALD(NOF)聚乙二醇化至所述GCSF衍生物N-末端的蘇氨酸位置，將GCSF衍生物：ALD-PEG-ALD的摩爾比設定為1：10，並將GCSF衍生物的濃度設定為5 g/L，且在6±4℃下進行反應一個半小時。具體地，在0.1 M的磷酸鉀（pH6.0）中進行反應，並添加20 mM的SCB作為還原劑來進行反應。
在偶聯反應後，使用SP-HP柱子（Cytiva，陽離子交換色譜）來淨化GCSF衍生物-PEG-ALD連接體。此時，使用乙酸鈉緩衝液，且使用氯化鈉濃度梯度進行淨化。
GCSF衍生物-PEG-ALD連接體對所投入的GCSF衍生物的收率確認為56.5%。
（2）製備GCSF衍生物-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物
為了製備GCSF衍生物-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物，連接GCSF衍生物-PEG-ALD和免疫蛋白Fc（序列號2）。此時，將GCSF-PEG-ALD連接體和免疫蛋白Fc的摩爾比設定為1：4並將整個蛋白（GCSF衍生物和免疫蛋白Fc）的濃度設定為50 g/L，並在6±4℃進行反應十六小時。具體地，在0.1 M的磷酸鉀（pH6.0）中進行反應，並添加20 mM的SCB作為還原劑來進行反應。
反應結束後，使用疏水相互作用色譜和陰離子交換色譜來從該反應混合物獲得GCSF衍生物-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物。
GCSF衍生物-PEG-DEP偶聯物對所投入的GCSF衍生物的收率確認為39.9%。
對GCSF衍生物-PEG-免疫蛋白Fc偶聯物製備的整個收率時，根據本發明制法的實施例3表現出比現有技術的對比例3提高1.36倍的收率。
無。
圖1為用於描述根據一實施例的生理活性多肽偶聯物的製備方法的流程圖。
圖2A和圖2B分別為在試驗例2中製備的ALD-PEG-DEP和市售的ALD-PEG-ALD的基質輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI-TOF: matrix-assisted laser desorption ionization- time of flight)的質量分析圖表。
圖3A和圖3B分別為試驗例2的ALD-PEG-DEP和市售ALD-PEG-ALD的核磁共振（ 1H NMR）的光譜的圖表。
圖3C和圖3D分別為試驗例2的ALD-PEG-DEP和市售ALD-PEG-ALD的核磁共振（ 13C NMR）的光譜的圖表。
圖4A和圖4B分別為試驗例2的ALD-PEG-DEP和市售ALD-PEG-ALD的FT-IR光譜。
圖5為示出實施例1的連接體水解物和比較例1的連接體的醛基活性的圖表。
 
<![CDATA[<110>    南韓商韓美精密化學股份有限公司]]>
                          南韓商韓美藥品股份有限公司       
          <![CDATA[<120>    聚乙二醇衍生物、包括其之組成物以及]]>
                   使用其之具生物活性胜肽偶聯物之製程
          <![CDATA[<130>    PX066298TW]]>
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          <![CDATA[<170>    KoPatentIn 3.0]]>
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          <![CDATA[<211>    34]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    人胰高血糖素樣肽-2的衍生物]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>    MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>    (1)]]>
          <![CDATA[<223>    Xaa 為 4-咪唑乙醯 (CA)]]>
          <![CDATA[<400>    1]]>
          Xaa Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
            1               5                  10                  15 
          Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Arg Ile Thr
                       20                  25                  30 
          Asp Lys
          <![CDATA[<210>    2]]>
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          <![CDATA[<212>    PRT]]>
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          <![CDATA[<400>    2]]>
          Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
            1               5                  10                  15 
          Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                       20                  25                  30 
          Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
                   35                  40                  45 
          Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
               50                  55                  60 
          Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
           65                  70                  75                  80 
          Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
                           85                  90                  95 
          Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                      100                 105                 110 
          Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
                  115                 120                 125 
          Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
              130                 135                 140 
          Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
          145                 150                 155                 160 
          Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
                          165                 170                 175 
          Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                      180                 185                 190 
          Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
                  195                 200                 205 
          His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
              210                 215                 220 
          <![CDATA[<210>    3]]>
          <![CDATA[<211>    40]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    咪唑乙醯-exendin-4]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>    MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>    (1)]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>    MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>    (40)]]>
          <![CDATA[<223>    Xaa 為 NH2]]>
          <![CDATA[<400>    3]]>
          Xaa Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
            1               5                  10                  15 
          Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
                       20                  25                  30 
          Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa
                   35                  40
          <![CDATA[<210>    4]]>
          <![CDATA[<211>    174]]>
          <![CDATA[<212>    PRT]]>
          <![CDATA[<213>    人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>    粒細胞刺激因子, GCSF]]>
          <![CDATA[<400>    4]]>
          Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys
            1               5                  10                  15 
          Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln
                       20                  25                  30 
          Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val
                   35                  40                  45 
          Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys
               50                  55                  60 
          Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser
           65                  70                  75                  80 
          Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser
                           85                  90                  95 
          Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp
                      100                 105                 110 
          Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro
                  115                 120                 125 
          Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe
              130                 135                 140 
          Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe
          145                 150                 155                 160 
          Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
                          165                 170
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
無。

Claims (20)

  1. 一種聚乙二醇衍生物化合物，其由以下化學式1表示： ＜化學式1＞
    Figure 03_image001
    在所述化學式1中，n為30至115的自然數，並且， R 1和R 2為彼此相同或不同的C 1至C 5烷基。
  2. 如請求項1所述之聚乙二醇衍生物化合物，其中，所述C 1至C 5烷基為甲基、乙基、丙基或丁基。
  3. 如請求項1所述之聚乙二醇衍生物化合物，其中，所述R 1和R 2為乙基。
  4. 如請求項1至3中之任何一項所述之化合物，其中，n為50至100的自然數。
  5. 如請求項4之化合物，其中，n為67至83的自然數。
  6. 一種聚乙二醇衍生物組合物，其包括： 由以下化學式1A表示的聚乙二醇衍生物； 由以下化學式2表示的聚乙二醇衍生物；以及 由以下化學式3表示的聚乙二醇衍生物， ＜化學式1A＞
    Figure 03_image003
    ＜化學式2＞
    Figure 03_image005
    ＜化學式3＞
    Figure 03_image007
    在所述組合物中， 在數均分子量2950至3650的範圍內由所述化學式1A表示的聚乙二醇衍生物的含量比基於高效液相色譜為至少70面積%， 在數均分子量2950至3650的範圍內由所述化學式2表示的聚乙二醇衍生物的含量比基於高效液相色譜為15面積%或更低， 并且，在數均分子量2950至3650的範圍內由所述化學式3表示的聚乙二醇衍生物的含量比基於高效液相色譜為10面積%或更低。
  7. 如請求項6之組合物，其中，當使用凝膠滲透色譜測量時，所述聚乙二醇衍生物的數均分子量在2950至3650的範圍內。
  8. 如請求項7之組合物，其中，當使用凝膠滲透色譜測量時，所述聚乙二醇衍生物的數均分子量在3000至3200的範圍內。
  9. 一種生理活性多肽偶聯物的製備方法，包括: （a）聚乙二醇化步驟，其使以下化學式1中的聚乙二醇衍生物與生理活性多肽反應以生成連接體，其中所述生理活性多肽以共價鍵連接至以下化學式1的聚乙二醇衍生物的醛碳； （b）水解步驟，其在酸性的水性條件下處理所述連接體以生成連接體水解物；及 （c）偶聯步驟，其使所述連接體水解物與免疫蛋白Fc片段或其衍生物反應以生成偶聯物， 并且，所述偶聯物具有Fc片段或其衍生物以共價鍵連接至衍生自所述連接體水解物內的所述化學式1的聚乙二醇衍生物的縮醛碳的碳原子的結構： ＜化學式1＞
    Figure 03_image001
    在所述化學式1中，n為50至100的自然數，并且， R 1和R 2為彼此相同或不同的C1至C5烷基。
  10. 如請求項9之生理活性多肽偶聯物的製備方法，其中，所述生理活性多肽選自激素、細胞因子、酶、抗體、生長因子、轉錄調節因子、凝血因子、疫苗、結構蛋白、配體蛋白或受體。
  11. 如請求項9之生理活性多肽偶聯物的製備方法，其中，（a）步驟的反應為還原性胺化， 并且，所述連接體為所述生理活性多肽的N-末端氮或賴氨酸的ε-氨基氮原子以共價鍵連接至所述化學式1中化合物的醛碳原子而產生的物質。
  12. 如請求項11之偶聯物製備方法，其中（a）步驟的聚乙二醇化在pH3.0至9.0的範圍內執行。
  13. 如請求項11之偶聯物製備方法，其中，（b）步驟的水解在pH1.0至5.0範圍執行。
  14. 如請求項9之偶聯物製備方法，其中，（c）步驟的偶聯反應為還原性胺化。
  15. 如請求項14之偶聯物製備方法，所述還原性胺化在pH5.0至8.5的範圍內執行。
  16. 如請求項9之偶聯物製備方法，其中，所述Fc片段或衍生物的序列中，脯氨酸位於N-末端。
  17. 如請求項16之偶聯物製備方法，在所述偶聯物中，所述Fc片段或衍生物的N-末端脯氨酸的氮素原子與衍生自所述縮醛碳的碳原子以共價鍵連接。
  18. 如請求項17之偶聯物製備方法，其中，所述Fc片段或衍生物為序列號2。
  19. 如請求項9之偶聯物製備方法，其中R 1和R 2為乙基。
  20. 如請求項9之偶聯物製備方法，其中n為67至83的自然數。
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