TW202222828A - 抗dkk2抗體、包含該抗dkk2抗體的組合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本揭露涉及人源化的並且CMC特性改善的抗DKK2抗體，包含該抗體的組合物，以及使用該抗體或該組合物來治療疾病的方法。

Description

抗DKK2抗體、包含該抗DKK2抗體的組合物及其用途

本揭露涉及人源化的並且CMC（化學、製造和控制）特性改善的抗DKK2抗體，包含該抗體的組合物，以及使用該抗體或該組合物來治療疾病的方法。

這部分的陳述僅提供與本揭露有關的背景資訊，而不必然地構成先前技術。

癌症是全世界的主要健康問題。每年，世界各地有數千萬人被診斷為癌症，並且超過一半的患者最終死於癌症。在美國，所有男性中約一半和所有女性中約三分之一將在其一生中的某一時間被診斷患有癌症，並且四分之一的死亡是由癌症引起的（Jemal等人, CA Cancer J. Clin., 2002, 52:23-47; Howlader等人, SEER Cancer Statistics Review, 1975-2010, National Cancer Institute）。最常被發現的人類癌症包括由器官和實體組織產生的癌症，例如，結腸癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌和子宮內膜癌。結腸癌影響西半球二十分之一的人（Henderson, Nature Cell Biology, 2000, 2(9): 第653-60頁）。在全球範圍內，每年有100萬新患者被診斷為結腸癌，並且其中一半死於該疾病（Liu等人, Cell, 2002, 108(6): 第837-47頁）。

在過去幾十年中，癌症治療和診斷方面取得了顯著進步。癌症的治療選擇包括手術、化學療法、放射療法和免疫療法。最近的免疫療法治療，旨在刺激免疫系統，特別吸引了大量的研究。儘管免疫療法可以是高度有效的，但無論腫瘤的起源器官是什麼，只有一部分患者通常對療法有反應。顯然需要該領域的新發現以提高免疫療法的功效和特異性。

Wnt信號傳導控制多種細胞過程，包括細胞命運決定、分化、極性、增殖和遷移。分泌蛋白的Wnt家族結合幾類受體，例如低密度脂蛋白受體相關(LRP)蛋白5和6(LRP5/6)，從而導致幾種不同的細胞內信號傳導級聯的啟動，包括Wnt/β-聯蛋白、Wnt/鈣和Wnt/Jnk通路。Wnt與LRP5/6的結合藉由阻斷多蛋白複合物的功能特異性啟動Wnt/β-聯蛋白通路，該多蛋白複合物引發β-聯蛋白的降解，導致β-聯蛋白在細胞質和細胞核中的積累。核β-聯蛋白與Lef/TCF家族轉錄因數的成員複合並啟動基因表現。

可能由幹細胞功能改變引起的病理狀態，例如退行性疾病和癌症，通常與Wnt/β-聯蛋白通路活性的變化相關。事實上，Wnt/β-聯蛋白通路的過度啟動被認為誘導幹細胞的過早衰老和老化相關的幹細胞功能喪失（Brack等人, Science, 2007, 第317卷第5839期第807-810頁; Liu等人, Science, 2007, 第317卷第5839期第803-806頁）。在癌症中，Wnt/β-聯蛋白通路的過度啟動，其通常與其它細胞生長調節基因的突變結合，可導致異常細胞生長（Reya和Clevers, Nature, 2005, 434(7035):843-50）。因此，許多正在進行的研究集中在Wnt/β-聯蛋白通路作為癌症中的潛在治療靶標（Breuhahn等人, Oncogene, 2006, 25: 3787-3800; Greten等人, Br J Cancer, 2009, 100: 19-23）。特別地，包括癌症基因組測序項目在內的幾個研究揭示，超過80%的結腸癌具有腺瘤性結腸息肉病(adenomatosis polyposis coli)(APC)基因的突變或甚至喪失，該基因是Wnt/β-聯蛋白通路的主要抑制基因（Kinzler和Vogelstein, Cell. 1996年10月18日; 87(2):159-70. Review; Sjoblom等人, Science, 2006年10月13日; 314(5797):268-74; Mann等人, Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(4): 第1603-8頁）。APC和蛋白質如GSK3β和軸蛋白（Axin）形成標記β-聯蛋白降解的複合物。APC中的突變破壞這種複合物，並導致細胞質β-聯蛋白水準提高及其核易位。由於β-聯蛋白是Wnt信號傳導的最重要的銜接子，因此它促進致癌因數回應於Wnt配體的表現。

Wnt信號傳導也受許多分泌的多肽拮抗劑調節。這些拮抗劑包括四種分泌的Dickkopf(DKK)蛋白（Monaghan等人, Mech Dev, 1999. 87: 45-56; Krupnik等人, Gene, 1999. 238: 301-13）。在這四種DKK蛋白中，已經證明DKK1、DKK2和DKK4藉由以高親和力直接結合至Wnt共同受體LRP 5/6（Mao等人, Nature, 2001. 411: 321-5; Semenov等人, Curr Biol, 2001. 11: 951-61; Bafico等人, Nat Cell Biol, 2001. 3: 683-6）而成為經典Wnt信號傳導的有效拮抗劑（Mao等人, Nature, 2001. 411: 321-5; Semenov等人, Curr Biol, 2001. 11: 951-61; Bafico等人, Nat Cell Biol, 2001. 3: 683-6; Niehrs, Nature, 2006. 25: 7469-81）。雖然據報導DKK1在脊椎動物發育中在頭和心形成中起關鍵作用（Niida等人, Oncogene, 2004, Nov. 4; 23(52):8520-6），但是DKK2看起來不在脊椎動物發育中發揮關鍵作用。缺乏DKK2的小鼠具有較低的血糖（Li等人, Proc Natl Acad Sci USA, 2012. 109: 11402-7）、降低的骨骼品質（Li等人, Nat Genet, 2005. 37: 945-52）和缺陷性眼表上皮（Gage等人, Dev Biol, 2008. 317: 310-24; Mukhopadhyay等人, Development, 2006. 133: 2149-54）。鑑於DKK蛋白是Wnt拮抗劑，常規的認識是DKK的失活會提高Wnt活性並因此加速癌症形成。然而，它們在癌症形成中的作用尚未被直接研究。

DKK分子含有兩個保守的富含半胱氨酸的結構域（Niehrs, Nature, 2006. 25: 7469-81）。以前，顯示DKK1和DKK2的第二富含Cys的結構域在抑制經典Wnt信號傳導中起更重要的作用（Li等人, J Biol Chem, 2002. 277: 5977-81; Brott and Sokol Mol. Cell. Biol., 2002. 22: 6100-10）。最近，解析了DKK2的第二富含Cys結構域的結構，並描繪了DKK與LRP5/6和Kremen的相互作用所需的結構域上的氨基酸殘基（Chen等人, J Biol Chem, 2008. 283: 23364-70; Wang等人, J Biol Chem, 2008. 283: 23371-5）。DKK與LRP5/6的相互作用是DKK介導的Wnt抑制的主要機制的基礎。儘管DKK與Kremen（也是跨膜蛋白）的相互作用顯示促進Wnt信號傳導的DKK拮抗作用，但是這種相互作用可能具有其它未解析的功能。Ala掃描誘變鑑定了LRP5的第三YWTD重複結構域上的氨基酸殘基對結合DKK1和DKK2是重要的（Zhang等人, Mol. Cell. Biol., 2004. 24: 4677-84）。這些結果已經藉由DKK1/LRP6的第三和第四YWTD重複結構域複合物的結構研究得以證實（Cheng等人, Nat Struct Mol Biol, 2011. 18: 1204-10; Chen等人, Dev Cell, 2011. 21: 848-61; Ahn等人, Dev Cell, 2011. 21: 862-73. Bourhis等人, Structure, 2011. 19: 1433-42）。上述結構研究之一還揭示了DKK的N末端與LRP的第一YWTD重複結構域之間的第二DKK-LRP相互作用位點（Bourhis等人, Structure, 2011. 19: 1433-42）。

WO 2016/004055揭露了抑制DKK2會增加CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活性、減弱腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤形成的發現，並提供了藉由給患者施用有效量的DKK2基因消耗劑來治療癌症的方法。WO 2017/074774提供了藉由給患者施用有效量的人源化的抗DKK2抗體來治療癌症的方法。

本揭露的發明人認識到此類抗DKK2抗體具有不利的生物物理屬性，包括低穩定性和聚集趨勢，因而對未來的臨床階段CMC開發和商業化而言不夠理想。

本揭露涉及具有經改進的可開發性和可製造性的抗DKK2抗體、包含該抗DKK2抗體的組合物、該抗DKK2抗體或該組合物的用途，以及使用該抗DKK2抗體或該組合物來治療疾病的方法。

特別地，本揭露提供了一種特異性地結合人DKK2蛋白的抗體，其包含含有互補決定區CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區以及含有互補決定區CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區，其中： (a) CDRH1具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列； (b) CDRH2具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列； (c) CDRH3具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列； (d) CDRL1具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列； (e) CDRL2具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；且 (f) CDRL3具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

本揭露還提供了一種藥物組合物，其包含如本揭露所述的抗體以及藥學上可接受的載體。

本揭露還提供了一種DNA分子，其編碼如本揭露所述的抗體的重鏈和/或輕鏈。

本揭露還提供了一種治療有此需要的受試者的癌症或者刺激或增強有此需要的受試者的免疫反應的方法，該方法包括向該受試者施用有效量的本揭露所述的抗體或藥物組合物。

本揭露還提供了本揭露所述的抗體或藥物組合物在製造用於治療有此需要的受試者的癌症或者用於刺激或增強有此需要的受試者的免疫反應的藥物中的用途。

除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本揭露所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。儘管與本文所述相似或等同的任何方法和材料可以用於本揭露的測試的實踐中，但是本文描述了較佳的材料和方法。在描述和要求保護本揭露時，將使用以下術語。

還應當理解，本文所使用的術語僅用於描述特定實施方式的目的，而不意在限制。

除非上下文中另有明確說明，否則單數形式“一”，“一個”和“該”包括其複數形式。

如在本說明書和申請專利範圍中所使用的，開放式過渡詞語“包含”、“包括”、“具有”、“含有”及其變體要求存在指定成分/步驟並允許其它成分/步驟的存在。這些短語也應理解為揭露了僅允許指定成分/步驟和不可避免的雜質，並排除其它成分/步驟的封閉式短語“由...組成”或“基本上由...組成”。

本申請的說明書和申請專利範圍中的數值應理解為包括當保留到相同的有效數時數值相同的值，以及與所限定的數值的差距小於本申請中所描述的常規測量技術會產生的實驗誤差的值。

本文所揭露的所有範圍都包括引入的端點值，並可以單獨組合。貫穿本揭露內容，本揭露的各個方面可以以範圍格式呈現。應當理解，範圍格式的描述僅為了方便和簡明，並且不應當解釋為是對本揭露的範圍的硬性限制。因此，範圍的描述應當被認為已經明確揭露了所有可能的子範圍以及該範圍內的單獨數值。例如，諸如從1至6的範圍的描述應當被認為已經明確揭露了子範圍，例如從1至3、從1至4、從1至5、從2至4、從2至6、從3到6等，以及在該範圍內的單獨數值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。無論範圍的寬度，上述均適用。

術語“約”可以用於包括在不改變值的基本功能的情況下能夠變化的任意數值。當與範圍聯用時，“約”也揭露了由兩個端點的絕對值所限定的範圍。例如，“從約2至約4”也揭露了“從2至4”的範圍。術語“約”還可以指給定值±10%。

術語“同一性”指的是一對序列（核苷酸或氨基酸）之間的相似性程度。同一性是藉由將相同的殘基數除以殘基的總數，並且將商乘以100以獲得百分比從而進行測定的。評價同一性時缺口不計算在內。因此，完全相同的序列的兩個拷貝具有100%的同一性，但是具有缺失、添加或置換的序列可能具有較低程度的同一性。本領域技術人員將認識到有幾種電腦程式可以用於確定序列的同一性，例如那些採用諸如BLAST之類的演算法的程式。BLAST核苷酸搜尋是使用NBLAST程式進行的，並且BLAST蛋白質搜尋是利用BLASTP程式進行的，其中使用了各程式的預設參數。

兩個不同的序列可以彼此不同，而不影響由該序列編碼的蛋白質的整體功能。在這方面，本領域公知的是化學上相似的氨基酸可以相互取代，通常功能不會發生改變。相關性質可以包括酸性/鹼性、極性/非極性、電荷、疏水性和化學結構。例如，鹼性殘基Lys和Arg被認為是化學上相似的，並且經常互相取代，其他例子如酸性殘基Asp和Glu、羥基殘基Ser和Thr、芳香族殘基Tyr、Phe和Trp以及非極性殘基Ala、Val、Ile、Leu和Met。這些置換被認為是“保守的”。相似地，核苷酸密碼子和可接受的變化在本領域中也是已知的。例如，密碼子ACT、ACC、ACA和ACG都編碼氨基酸蘇氨酸，即第三個核苷酸可以在不改變所得到的氨基酸的情況下進行變化。相似性是藉由將相似的殘基數除以殘基的總數，並且將商乘以100以獲得百分比從而進行測定的。注意，相似性和同一性測量的是不同的性質。

如本文所用，術語“對照”或“參考”可互換使用，並且是指用作比較標準的值(例如，健康受試者中DKK2表現水準)。

如本文中使用的“物件/受試者（subject）”或“患者”可以是人或非人哺乳動物。非人哺乳動物包括例如家畜和寵物，例如羊、牛、豬、犬、貓和鼠哺乳動物。較佳地，受試者是人。

如本文所用，術語“化合物”包括大分子化合物（例如，抗體）和小分子化合物。

如本文所用，術語“活化/啟動（activation）”是指在充分的細胞表面部分連接後誘導明顯的生物化學或形態學變化的細胞狀態。在T細胞的語境中，這種活化是指已經被充分刺激以誘導細胞增殖的T細胞的狀態。T細胞的活化還可以誘導細胞因數產生及調節或細胞溶解效應物功能的發揮。在其它細胞的語境中，該術語推斷特定物理化學過程的上調或下調。術語“活化的T細胞”表示目前正在進行細胞分裂、細胞因數產生、調節或細胞溶解效應物功能的發揮，和/或最近經歷了“活化”過程的T細胞。

如本文所用，術語“肽”、“多肽”和“蛋白質”可互換使用，並且是指由藉由肽鍵共價連接的氨基酸殘基組成的化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個氨基酸，並且沒有限制可構成蛋白質或肽序列的氨基酸的最大數目。多肽包括包含藉由肽鍵彼此連接的兩個或更多個氨基酸的任何肽或蛋白質。如本文所用，該術語是指短鏈(其在本領域中通常也稱為例如肽、寡肽和寡聚體)以及較長鏈(其在本領域中通常稱為蛋白質，其存在很多類型)二者。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚體、異源二聚體、多肽變體、修飾的多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。

本文所用的術語“免疫治療劑”意在包括調節患者免疫系統的任何藥劑。“免疫療法”是指改變患者免疫系統的治療。

在本揭露的上下文中使用的術語“治療”意在包括用於疾病或病症的治療性治療以及預防性或抑制性措施。因此，例如，術語治療包括在疾病或病症發作之前或之後施用藥劑，從而預防或消除疾病或病症的所有徵兆。作為另一個實例，在疾病的臨床表現後施用藥劑以對抗疾病的症狀包括疾病的“治療”。這包括預防癌症。

“DKK蛋白”是指含有一個或多個富含半胱氨酸的結構域的DKK蛋白家族的蛋白質。DKK蛋白家族包括DKK1、DKK2、DKK3和DKK4，以及在序列水準、結構或功能上與這些蛋白質中的一種或多種足夠相關的任何其它蛋白質。這種蛋白家族描述於例如Krupnik等人(1999)Gene 238:301中。此定義也包括DKK蛋白的等位基因變體和突變體，例如本文所述的那些。

非人(例如，鼠)抗體的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白，嵌合免疫球蛋白的免疫球蛋白鏈或片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗體的其它抗原結合子序列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。大多數情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的互補決定區(CDR)的殘基被具有期望的特異性、親和力和容量（capacity）的來自非人物種(供體抗體)例如小鼠、大鼠或兔的CDR的殘基替換。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架區(FR)殘基被相應的非人殘基替換。另外，人源化抗體可以包括在受體抗體以及在輸入的CDR和框架序列中均未發現的殘基。進行這些修飾以進一步改善和優化抗體性能。一般而言，人源化抗體將包括基本上所有至少一個並且通常兩個可變域，其中所有或基本上所有CDR區對應於非人免疫球蛋白的那些並且所有或基本上所有FR區是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體最佳地還將包括免疫球蛋白恆定區(Fc)的至少部分，通常人免疫球蛋白的Fc。對於進一步的細節，參見Jones等人, Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann等人, Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992。

本文所用的術語“癌症”包括任何惡性腫瘤，包括但不限於癌、肉瘤。癌症起因於細胞的不受控制和/或異常的分裂，然後侵入並破壞周圍組織。如本文所用，“增殖”是指經歷有絲分裂的細胞。如本文所用，“轉移”是指惡性腫瘤從其起源處向遠處擴散。癌細胞可藉由血流、藉由淋巴系統、穿過體腔或其任何組合轉移。

如本文所用，術語“藥物組合物”是指在本揭露中有用的至少一種化合物與其它化學組分例如載體、穩定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑和/或賦形劑的混合物。藥物組合物有助於將該化合物施用至生物體。本領域中存在施用化合物的多種技術，包括但不限於：靜脈內、經口（oral）、氣霧劑、腸胃外、眼部、肺部和局部施用。

術語“藥學上可接受的載體”包括藥學上可接受的鹽、藥學上可接受的材料、組合物或載體，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或封裝材料，其涉及在受試者內攜帶或輸送本揭露的(一種或多種)化合物或攜帶或輸送本揭露的 (一種或多種) 化合物至受試者，使得其可以執行其預期功能。通常，此類化合物從身體的一個器官或部分攜帶或輸送至身體的另一器官或部分。每種鹽或載體在與製劑的其它成分相容的意義上必須是“可接受的”，並且不對受試者有害。可以用作藥學上可接受的載體的材料的一些實例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；澱粉，例如玉米澱粉和馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；粉末黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，例如可哥脂和栓劑蠟類；油，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇類，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯類，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林格氏溶液；乙醇；磷酸鹽緩衝溶液；稀釋劑；造粒劑；潤滑劑；黏合劑；崩解劑；潤濕劑；乳化劑；著色劑；脫模劑；塗層劑；甜味劑；調味劑；加香劑；防腐劑；抗氧化劑；增塑劑；膠凝劑；增稠劑；硬化劑；定型劑；懸浮劑；表面活性劑；保濕劑；載體；穩定劑；和在藥物製劑中使用的其它無毒的相容性物質，或其任何組合。如本文所用，“藥學上可接受的載體”還包括與化合物的活性相容並且對於受試者是生理上可接受的任何和所有的包衣、抗菌劑和抗真菌劑，以及吸收延遲劑等。補充性活性化合物也可以摻入組合物中。

術語“抗體”是免疫系統用來識別靶抗原的蛋白質。抗體的基本功能單位是免疫球蛋白單體。單體由形成Y形蛋白質的兩個相同的重鏈和兩個相同的輕鏈構成。每條輕鏈由一個恆定域（constant domain）和一個可變域（variable domain）組成。對於輕鏈，恆定域也可以被稱為“恆定區（constant region）”，而可變域也可以被稱為“可變區（variable region）”。每條重鏈由一個可變域和三個或四個恆定域組成。對於重鏈，恆定域一起被稱為“恆定區”，而可變域也可以被稱為“可變區”。Y的臂被稱為片段，抗原結合(Fab)區，每個臂被稱為Fab片段。每個Fab片段由來自重鏈的一個恆定域和一個可變域、以及來自輕鏈的一個恆定域和一個可變域組成。Y的基部稱為Fc區，由來自每個重鏈的兩個或三個恆定域組成。在Fab區中的重鏈和輕鏈的可變域是抗體的結合抗原（如本揭露中的DKK2）的部分。更具體地，可變域的互補決定區(CDR)結合它們的抗原(如DKK2)。在每個可變域的氨基酸序列中，有非連續的三個CDR。術語“完整”在本文中用於指包含Fab區和Fc區的抗體。

本文所用的“抗體重鏈”是指以其天然存在的構象存在于抗體分子中的兩種類型多肽鏈中的較大者，並且其通常決定抗體所屬的類別。

本文所用的“抗體輕鏈”是指以其天然存在的構象存在于抗體分子中的兩種類型多肽鏈中的較小者。κ和λ輕鏈是指兩種主要的抗體輕鏈同種型。

本文使用的術語“抗原”或“Ag”定義為引發免疫反應的分子。這種免疫反應可涉及抗體產生，或特異性免疫活性細胞的活化，或涉及二者。技術人員將理解，任何大分子，包括實際上所有的蛋白質或肽，可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重組或基因組DNA。技術人員將理解，包含編碼引發免疫反應的蛋白質的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此編碼如本文所使用的術語“抗原”。此外，本領域技術人員將理解，抗原不需要僅由基因的全長核苷酸序列編碼。明顯的是，本揭露包括但不限於使用多於一個基因的部分核苷酸序列，並且這些核苷酸序列以各種組合排列以引發期望的免疫反應。此外，技術人員將理解，抗原根本不需要由“基因”編碼。明顯的是，抗原可以是合成的或可以源自生物學樣品。這樣的生物學樣品可以包括但不限於組織樣品、腫瘤樣品、細胞或生物流體。

免疫系統在啟動和抑制之間達到平衡。逃避免疫監視是腫瘤形成的先決條件之一。腫瘤逃避免疫監視的方法之一是產生升高量的免疫抑制分子。多年來已經確定了越來越多的免疫抑制分子和機理。已經表明這些免疫抑制分子的中和在治療各種惡性腫瘤中是有效的。

本揭露涉及抑制自然殺傷(NK)細胞和CD8 ⁺細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活性的DKK2的發現。DKK2是一種分泌蛋白，其能夠抑制β-聯蛋白介導的Wnt信號傳導，改變非β-聯蛋白介導的Wnt活性，並且還可以具有Wnt非依賴性功能。DKK2在許多組織中表現，並在人結腸直腸癌、胃腸癌、肝癌、腎癌和胰腺癌中上調。下面描述的實驗證據表明抗DKK2抗體是用於治療其中表現DKK2的癌症的關鍵免疫調節劑。因此DKK2是治療這些癌症的有希望的靶標。

在一些實施方式中，抗DKK2抗體可以是人源化的，其中修飾抗體的特定序列或區域以增加與在人中天然產生的抗體的相似性。例如，在本揭露中，抗體或其片段可以包括非人哺乳動物scFv。在一個實施方式中，抗原結合結構域部分是人源化的。

可以使用本領域已知的各種技術產生人源化抗體，包括但不限於CDR-移植(參見，例如，歐洲專利號EP 239,400；國際公佈號WO 91/09967；和美國專利號5,225,539、5,530,101和5,585,089，其中每個均藉由引用以其全部併入本文)、覆蓋(veneering)或表面重建(resurfacing)(參見，例如，歐洲專利號592,106和EP 519,596；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka等人, 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814;和oguska等人, 1994, PNAS, 91:969-973，其中每個均藉由引用以其全部併入本文)、鏈改組(chain shuffling)(參見，例如，美國專利號5,565,332，其藉由引用以其全部併入本文)、和在如下中揭露的技術，例如，美國專利申請公佈號US2005/0042664、美國專利申請公佈號US2005/0048617、美國專利號6,407,213、美國專利號5,766,886、國際公佈號WO 9317105、Tan等人, J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas等人, Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea等人, Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca等人, J. Biol. Chem., 272(16): 10678-84 (1997), Roguska等人, Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto等人, Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto等人, Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994)以及Pedersen等人, J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)，其中每個均藉由引用以其全部併入本文。通常，框架區中的框架殘基將被置換為來自CDR供體抗體的相應的殘基以變更、較佳地改進抗原結合。藉由本領域熟知的方法鑑定這些框架置換，例如，藉由對CDR和框架殘基的相互作用進行建模以鑑定對抗原結合重要的框架殘基以及藉由序列比較以鑑定在特定位置處不尋常的框架殘基(參見，例如，Queen等人, U.S. Pat. No. 5,585,089; 和Riechmann等人, 1988, Nature, 332:323，其藉由引用以其全部併入本文)。

人源化抗體具有從非人來源引入其中的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常被稱為“輸入”殘基，其通常取自“輸入”可變域。因此，人源化抗體包括來自非人免疫球蛋白分子的一個或多個CDR和來自人的框架區。抗體的人源化是本領域熟知的，並且可以基本上遵循Winter與合作者的方法進行（Jones等人, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等人, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen等人, Science, 239:1534-1536 (1988)），這藉由將齧齒動物CDR或CDR序列置換為相應的人抗體序列，即CDR-移植(EP 239,400；PCT公佈號WO 91/09967；和美國專利號4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640，其內容藉由引用以其全部併入本文)。在這樣的人源化嵌合抗體中，大幅小於完整人可變域已經被置換為來自非人物種的相應的序列。實際上，人源化抗體通常是其中一些CDR殘基和可能的一些框架(FR)殘基被置換為來自齧齒動物抗體中的類似位點的殘基的人抗體。抗體的人源化也可以藉由覆蓋或表面重建(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka等,Protein Engineering,7(6):805-814(1994)；以及Roguska等,PNAS,91:969-973(1994))或鏈改組(美國專利號5,565,332)實現，其內容藉由引用以其全部併入本文。

用於製備人源化抗體的人可變域（輕鏈可變域和重鏈可變域二者）的選擇是為了降低抗原性。根據所謂的“最佳擬合”方法，齧齒動物抗體的可變域的序列針對已知的人可變域序列的整個文庫進行篩選。最接近於齧齒動物的人序列然後被接受為用於人源化抗體的人框架(FR)( Sims等人, J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia等人, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)，其內容藉由引用以其全部併入本文)。另一種方法使用源自特定的輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列的特定框架。相同的框架可以用於數種不同的人源化抗體(Carter等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta等人, J. Immunol., 151:2623 (1993)，其內容藉由引用以其全部併入本文)。

抗體可以被人源化，同時保留對靶抗原的高親和力以及其它有利的生物學性質。根據本揭露的一個方面，人源化抗體藉由使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產物的方法來製備。三維免疫球蛋白模型普遍可用並且是本領域技術人員熟悉的。圖解和展示選擇的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構象結構的電腦程式是可獲得的。檢查這些展示允許對殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中的可能作用的分析，即，對影響候選免疫球蛋白結合靶抗原的能力的殘基的分析。以此方式，FR殘基可以從受體和輸入序列選擇和組合，使得能夠實現期望的抗體特性，比如對靶抗原的增加的親和力。一般而言，CDR殘基直接地和最實質性地參與影響抗原結合。

人源化抗體保留與原始抗體相似的抗原特異性。然而，使用某些人源化方法時，可以使用“定向進化”的方法增加抗體對靶抗原的結合親和力和/或特異性，如由Wu等人, J. Mol. Biol., 294:151 (1999)描述的，其內容藉由引用以其全部併入本文。

本揭露的抗體可以藉由本領域已知的任何方法評估免疫特異性結合。可使用的免疫測定包括但不限於使用以下技術的競爭性和非競爭性測定系統：例如，蛋白質印跡、放射免疫測定、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、“夾心”免疫測定、免疫沉澱測定、沉澱素反應、凝膠擴散沉澱素反應、免疫擴散測定、凝集測定、補體固定測定、免疫放射測定、螢光免疫測定、蛋白A免疫測定，僅舉幾個例子。此類測定是常規的並且是本領域熟知的(參見，例如，Current Protocols in Molecular Biology, (Ausubel等人, 編), Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, 2002)。

在一些實施方式中，本揭露涉及一種特異性地結合人DKK2蛋白的抗體，其包含含有互補決定區CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區以及含有互補決定區CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區，其中： (a) CDRH1具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列； (b) CDRH2具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列； (c) CDRH3具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列； (d) CDRL1具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列； (e) CDRL2具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；且 (f) CDRL3具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

在一些實施方式中，該抗體的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRLH2、CDRL3分別具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

在一些實施方式中，該抗體的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRLH2、CDRL3分別具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

在一些實施方式中，該抗體的輕鏈可變區包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的輕鏈可變區包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的輕鏈可變區包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的輕鏈可變區具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的輕鏈可變區具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

在一些實施方式中，該抗體的重鏈可變區包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的重鏈可變區包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的重鏈可變區包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的重鏈可變區具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的重鏈可變區具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

在一些實施方式中，該抗體的輕鏈可變區包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性的氨基酸序列，且該抗體的重鏈可變區包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的輕鏈可變區包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性的氨基酸序列，且該抗體的重鏈可變區包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的輕鏈可變區包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，且該抗體的重鏈可變區包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的輕鏈可變區包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，且該抗體的重鏈可變區包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的輕鏈可變區具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，且該抗體的重鏈可變區具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的輕鏈可變區具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，且該抗體的重鏈可變區具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

在一些實施方式中，該抗體的輕鏈可變區和/或重鏈可變區是單鏈可變片段（scFv）、F(ab’) ₂片段、Fab或Fab’片段、雙價抗體、三價抗體、四價抗體或單殖株抗體的部分。

scFv包括輕鏈可變區和重鏈可變區，通常藉由連接基團接合在一起，該連接基團通常的長度為約10至約25個氨基酸(雖然它不必一定在此範圍內)。一個可變域的N-末端被連接到其它可變域的C末端。如果期望的話，該scFv可以被PEG化(用聚乙二醇)，以增加其大小，像賽妥珠單抗（certolizumab pegol）那樣。兩個scFv可以利用另一連接基團接合在一起，以產生串聯scFv。

如果輕鏈可變區和重鏈可變區藉由短的連接基團接合在一起以形成scFv，那麼這兩個可變域不能折疊在一起，scFv將發生二聚化以形成二價抗體。甚至更短的連接基團可導致形成三聚體(即，三價抗體)和四聚體(即，四價抗體)。

完整單殖株抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈形成。再次，每條輕鏈和每條重鏈均包含可變域。每條輕鏈與重鏈結合。兩條重鏈在鉸鏈區接合在一起。如果去除鉸鏈區以下的重鏈恆定區，則產生了包含總共四個可變域的F(ab’) ₂片段。該F(ab’) ₂片段可以被分成兩個Fab’片段。Fab’片段包含來自鉸鏈區的巰基。當去除鉸鏈區以上的重鏈恆定區時，形成Fab片段，其不包含來自鉸鏈區的巰基。然而，所有這些片段都包含輕鏈可變區和重鏈可變區。

在一些實施方式中，本揭露的抗體是由上述具有可變區/域的輕鏈和重鏈與人恆定區組合形成的完整單殖株抗體。重鏈恆定區可以是任何人類同種型，包括IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM，較佳地IgG4。人輕鏈恆定區可以是κ或λ同種型，較佳地κ同種型。在一些實施方式中，重鏈恆定區是IgG4同種型，且輕鏈恆定區是κ同種型。

在一些實施方式中，該抗體的輕鏈包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的輕鏈包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的輕鏈包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的輕鏈具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的輕鏈具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

在一些實施方式中，該抗體的重鏈包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的重鏈包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的重鏈包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的重鏈具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的重鏈具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

在一些實施方式中，該抗體的輕鏈包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性的氨基酸序列，且該抗體的重鏈包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的輕鏈包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性的氨基酸序列，且該抗體的重鏈包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的輕鏈包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，且該抗體的重鏈包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的輕鏈包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，且該抗體的重鏈包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的輕鏈具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，且該抗體的重鏈具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，該抗體的輕鏈具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，且該抗體的重鏈具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

在一個方面，本揭露考慮本揭露的抗體可以與治療劑組合使用，該治療劑例如抗腫瘤劑，包括但不限於化學治療劑、免疫治療劑、抗細胞增殖劑或其任何組合。例如，以下非限制性示例性類別的任何常規化學治療劑包括在本揭露中：烷化劑；亞硝基脲；抗代謝物；抗腫瘤抗生素；植物生物鹼；紫杉烷；激素藥；和混合式(miscellaneous)藥劑。

烷化劑是這樣命名的，因為它們能夠在細胞中存在的條件下向許多電負性基團添加烷基，從而干擾DNA複製以阻止癌細胞繁殖。大多數烷化劑是細胞週期非特異性的。在具體方面，它們藉由交聯DNA雙螺旋鏈中的鳥嘌呤鹼基來停止腫瘤生長。非限制性實例包括白消安、卡鉑、苯丁酸氮芥、順鉑、環磷醯胺、達卡巴嗪、異環磷醯胺、鹽酸氮芥、鹽酸美沙拉秦、丙卡巴肼、塞替派和尿嘧啶芥。

抗代謝物阻止在細胞週期的合成(S)期期間將鹼基併入DNA，從而阻止正常發育和分裂。抗代謝物的非限制性實例包括例如5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、卡培他濱、阿糖胞苷、氟尿苷、氟達拉濱、吉西他濱、甲氨蝶呤和硫鳥嘌呤的藥物。

抗腫瘤抗生素通常藉由干擾細胞分裂所需的酶或藉由改變細胞周圍的膜來阻止細胞分裂。此類中包括蒽環類，例如多柔比星，其藉由破壞DNA的結構並終止其功能來阻止細胞分裂。這些藥劑是細胞週期非特異性的。抗腫瘤抗生素的非限制性實例包括阿克拉黴素、放線菌素、安定黴素、重氮絲氨酸、博萊黴素、松節黴素、加利車黴素、卡黴素、卡莫西黴素、凱西林素、色黴素、更生黴素、柔紅黴素、地柔紅黴素、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、阿黴素、伊達比星、馬賽洛黴素、絲裂黴素、米托蒽醌、黴酚酸、諾加黴素、橄欖黴素、培黴素、紫菜黴素、嘌呤黴素、三鐵阿黴素、羅多比星、鏈黑黴素、鏈脲菌素、殺結核菌素、烏苯美司、淨司他丁、佐柔比星。

植物生物鹼抑制或停止有絲分裂或抑制阻止細胞產生細胞生長所需的蛋白質的酶。常用的植物生物鹼包括長春花鹼、長春新鹼、長春地辛和長春瑞濱。然而，本揭露不應被解釋為僅限於這些植物生物鹼。

紫杉烷影響在細胞功能中是重要的稱為微管的細胞結構。在正常的細胞生長中，當細胞開始分裂時形成微管，但是一旦細胞停止分裂，則微管被分解或破壞。紫杉烷阻止微管分解，使得癌細胞變得如此被微管堵塞，以致它們不能生長和分裂。非限制性的示例性紫杉烷包括紫杉醇和多西紫杉醇。

激素劑和類激素藥物用於某些類型的癌症，包括例如白血病、淋巴瘤和多發性骨髓瘤。它們常常與其它類型的化學療法藥物一起使用以增強其有效性。性激素用於改變雌性或雄性激素的作用或產生，並用於減緩乳腺癌、前列腺癌和子宮內膜癌的生長。抑制這些激素的產生(芳香酶抑制劑)或作用(他莫昔芬)通常可用作治療的輔助。一些其它腫瘤也是激素依賴性的。他莫昔芬是激素劑的非限制性實例，其干擾促進乳腺癌細胞生長的雌激素的活性。

混合式藥劑包括化學治療劑，例如博萊黴素、羥基脲、L-天冬醯胺酶和丙卡巴肼。

化學治療劑的其它實例包括但不限於以下及其藥學上可接受的鹽、酸和衍生物：氮芥例如苯丁酸氮芥、氯氮平、氯磷醯胺、雌莫司汀、異環磷醯胺、氮芥、鹽酸氮芥氧化物、美法侖、新恩比興、苯芥膽甾醇、潑尼氮芥、曲洛磷胺、尿嘧啶芥子；亞硝基脲例如卡莫司汀、氯卓卡星、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；嘌呤類似物例如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫柳寧、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物例如阿紮他濱、阿紮胞苷、6-氮尿嘧啶、卡莫氟、阿糖胞苷、二去氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU；雄激素例如卡魯斯特、丙酸色丙酸托烷酯、表薄甾烷醇、美雄烷、睾內酯；抗腎上腺藥例如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補充劑例如亞葉酸；醋葡醛內酯；醛磷醯胺糖苷；氨基乙醯丙酸；安吖啶；貝伐單抗；比生群；依達曲沙；地磷醯胺(defofamine)；地美可辛；地吖醌；依洛尼塞；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明；米托胍腙；米托蒽醌；莫匹達莫；硝唑蘭；噴司他丁；苯來美特；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基肼；丙卡巴肼；PSK@雷佐生；西佐呋喃；鍺螺胺；絲裂酸；三唑酮；2,2′,2″-三氯三乙胺；氨基甲酸乙酯；長春地辛；達卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；呱泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；環磷醯胺；塞替呱；紫杉烷，例如太平洋紫杉醇(TAXOLO,Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton,N.J.)和多西他賽(TAXOTERE,Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物例如順鉑和卡鉑；長春花鹼；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；絲裂黴素C；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞濱；諾維本；諾安托；替尼泊苷；道諾黴素；氨基蝶呤；塞羅達；伊班膦酸鹽；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；視黃酸；埃斯波黴素；和卡培他濱。

抗細胞增殖劑可以進一步定義為凋亡誘導劑或細胞毒性劑。凋亡誘導劑可以是顆粒酶、Bcl-2家族成員、細胞色素C、半胱天冬酶或其組合。示例性顆粒酶包括顆粒酶A、顆粒酶B、顆粒酶C、顆粒酶D、顆粒酶E、顆粒酶F、顆粒酶G、顆粒酶H、顆粒酶I、顆粒酶J、顆粒酶K、顆粒酶L、顆粒酶M、顆粒酶N或其組合。在其它具體方面，Bcl-2家族成員是例如Bax、Bak、Bcl-Xs、Bad、Bid、Bik、Hrk、Bok或其組合。

在另外的方面，半胱天冬酶為半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-10、半胱天冬酶-11、半胱天冬酶12、半胱天冬酶-13、半胱天冬酶-14或其組合。在具體方面，細胞毒性劑是TNF-α、白樹毒素、靈桿菌素、核糖體抑制蛋白(RIP)、假單胞菌外毒素、艱難梭菌毒素B（Clostridium difficile Toxin B）、幽門螺桿菌VacA、小腸結腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）YopT、紫色桿菌素（Violacein）、二亞乙基三胺五乙酸、伊洛福芬(irofulven)、白喉毒素、米托潔林(mitogillin)、蓖麻毒素、肉毒桿菌毒素、霍亂毒素、皂草素6或其組合。

免疫治療劑可以是但不限於白細胞介素-2或其它細胞因數，程式性細胞死亡蛋白1(PD-1)信號傳導的抑制劑，例如結合PD-1的單殖株抗體，易普利姆瑪。免疫治療劑還可以阻斷細胞毒性T淋巴細胞相關抗原A-4(CTLA-4)信號傳導，並且其還可以涉及癌症疫苗和基於樹突狀細胞的療法。

免疫治療劑還可以是藉由細胞因數治療或藉由過繼細胞療法和/或藉由造血幹細胞移植轉移外源細胞而被活化和擴增的NK細胞。適合於過繼細胞療法的NK細胞可以源自不同來源，包括自體NK細胞的離體擴增，來自外周血的未刺激或擴增的同種異體NK細胞，來自外周血和臍帶血的CD34+造血祖細胞，和NK細胞系。表現嵌合抗原受體或細胞因數的遺傳修飾的NK細胞也包括在本揭露中。用於本揭露的另一種免疫治療劑是基於過繼T細胞療法(ACT)的藥劑，其中向患者施用腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。施用的T細胞可以被遺傳工程化以表現腫瘤特異性抗原受體，例如以非主要組織相容性(MHC)限制的方式識別細胞表面抗原的嵌合抗原受體(CAR)；或者它們可以是傳統的αβTCR，其識別由MHC分子呈遞的細胞內抗原的表位。

在一些實施方式中，本揭露涉及一種DNA分子，其編碼本揭露所述的抗體的重鏈和/或輕鏈。在一些實施方式中，本揭露涉及一種DNA分子，其編碼SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，本揭露涉及一種DNA分子，其編碼SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，本揭露涉及一種DNA分子，其編碼SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，本揭露涉及一種DNA分子，其編碼SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，本揭露涉及一種DNA分子，其編碼SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在一些實施方式中，本揭露涉及一種DNA分子，其編碼SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

在一些實施方式中，本揭露涉及一種藥物組合物，其包含本揭露所述的抗體以及藥學上可接受的載體。

在一些實施方式中，藥物組合物包括藥學上可接受的載體。該載體充當用於遞送抗體的媒介。藥學上可接受的載體的實例包括抗體可以溶解或懸浮於其中的液體載體（如水、油和醇類）。

藥物組合物還可以包括賦形劑。具體的賦形劑包括緩衝劑、表面活性劑、防腐劑、填充劑、聚合物和穩定劑，它們可與該抗體一起使用。緩衝劑用於控制組合物的pH值。表面活性劑用於穩定蛋白質、抑制蛋白質聚集、抑制蛋白質吸附到表面上，並協助蛋白質重折疊。示例性的表面活性劑包括吐溫80、吐溫20、Brij 35、Triton X-10、PluronicF127和十二烷基硫酸鈉。防腐劑用於抑制微生物生長。防腐劑的實例包括苯甲醇、間甲酚和苯酚。在凍乾過程中使用填充劑，從而增加體積。親水性聚合物(如葡聚糖、羥乙基澱粉、聚乙二醇、明膠)可用於穩定蛋白質。具有非極性部分的聚合物(如聚乙二醇聚合物)也可以用作表面活性劑。蛋白穩定劑可包括多元醇類、糖類、氨基酸類、胺類和鹽類。合適的糖類包括蔗糖和海藻糖。氨基酸類包括組氨酸、精氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、賴氨酸、麩氨酸，以及它們的混合物。如人血清白蛋白之類的蛋白質也可以競爭性地吸附到表面上，並且降低抗體的聚集。應當注意的是，特定的分子可用于多種目的。例如，組氨酸可作為緩衝劑和抗氧化劑。甘氨酸可以用作緩衝劑和填充劑。

在一個實施方式中，可以以0.01-50 mg/kg/天的劑量向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以0.1-40 mg/kg/天的劑量向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以1-30 mg/kg/天的劑量向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以10-20 mg/kg/天的劑量向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。

在一個實施方式中，可以以介於1-14天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以介於1-10天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以介於1-7天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以介於1-5天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以介於1-3天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以介於2-14天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以介於2-10天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以介於2-7天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以介於2-5天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以介於2-3天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以介於3-14天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以介於3-10天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以介於3-7天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以介於3-5天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以介於5-14天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以介於5-10天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以介於5-7天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以介於7-14天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以介於7-10天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。

在一個實施方式中，可以以0.01-50 mg/kg/天的劑量和介於1-14天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以0.1-40 mg/kg/天的劑量和介於1-14天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以1-30 mg/kg/天的劑量和介於1-14天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。在一個實施方式中，可以以10-20 mg/kg/天的劑量和介於1-14天之間的間隔向受試者施用本揭露的抗體或藥物組合物。

本揭露的藥物組合物中活性成分、藥學上可接受的載體和任何另外的成分的相對量將根據所治療的物件的身份、大小和狀況而變化，並且還取決於施用組合物的途徑而變化。舉例來說，組合物可以包含在0.1%與100%(w/w)之間的活性成分。

本揭露的抗體或藥物組合物可適當地開發用於吸入、經口、直腸、陰道、腸胃外、局部、經皮、肺部、鼻內、頰部（buccal）、眼部、鞘內、靜脈內或其它施用途徑。其它考慮的製劑包括設計的納米顆粒(projected nanoparticle)、脂質體製品、含有活性成分的重新封裝的紅細胞，和基於免疫的製劑。施用途徑對於本領域技術人員是明顯的，並且取決於許多因素，包括所治療的疾病的類型和嚴重性、所治療的獸類或人類患者的類型和年齡等。

本揭露的抗體或藥物組合物的製劑可以藉由藥理學領域已知的或以後開發的任何方法製備。通常，這種製備方法包括使活性成分與載體或一種或多種其它輔助成分組合的步驟，然後如果必要或期望，將產品成形或包裝成期望的單劑量或多劑量單位。

如本文所用，“單位劑量”是包含預定量的活性成分的藥物組合物的離散量。活性成分的量通常等於將施用至受試者的活性成分的劑量或這種劑量的合宜分數，例如這樣劑量的一半或三分之一。單位劑型可用於單個日劑量（single daily dose）或多個日劑量（multiple daily doses）之一(例如，每天約1至4次或更多次)。當使用多個日劑量時，對於每個劑量，單位劑型可以相同或不同。

儘管本揭露的抗體或藥物組合物的描述主要涉及適合於對人進行倫理施用的抗體或藥物組合物，但是本領域技術人員應當理解，這樣的抗體或藥物組合物通常適於施用至各種動物。對適於施用至人的抗體或藥物組合物修飾以使該抗體或藥物組合物適於施用至各種動物是眾所周知的，且普通技術的獸醫藥理學家可以僅使用普通(如果有的話)實驗來設計和進行這種修飾。考慮施用本揭露的抗體或藥物組合物的物件包括但不限於人和其它靈長類動物、哺乳動物，包括商業上相關的哺乳動物，例如牛、豬、馬、綿羊、貓和狗。

在一個實施方式中，使用一種或多種藥學上可接受的賦形劑或載體來配製藥物組合物。在一個實施方式中，藥物組合物包含治療有效量的人源化的抗DKK2抗體和藥學上可接受的載體。可用的藥學上可接受的載體包括但不限於甘油、水、鹽水、乙醇和其它藥學上可接受的鹽溶液，例如磷酸鹽和有機酸鹽。這些和其它藥學上可接受的載體的實例描述於Remington’s Pharmaceutical Sciences,1991,Mack Publication Co.,New Jersey中。

載體可以是溶劑或分散介質，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、它們適當的混合物以及植物油。恰當的流動性可以被維持，例如藉由使用包衣例如卵磷脂，藉由在分散體的情況下維持所需的顆粒尺寸，以及藉由使用表面活性劑。阻止微生物的作用可以藉由各種抗細菌劑以及抗真菌劑，例如對羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等等來實現。在許多情況下，較佳在組合物中包含等滲劑，例如糖、氯化鈉或多元醇例如甘露醇和山梨醇。可注射的組合物的延長吸收可以藉由將延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁或明膠包括在組合物中而實現。

製劑可以與常規賦形劑，即適合於經口、胃腸外、鼻部、靜脈內、皮下、腸內或本領域已知的任何其它合適的施用方式的藥學上可接受的有機或無機載體物質的混合物一起使用。可以將藥物製品滅菌，並且如果期望的話，與助劑混合，該助劑例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、用於影響滲透壓的鹽、緩衝劑、著色劑、調味劑和/或芳香物質等。它們也可以根據期望與其它活性劑例如其它止痛劑組合。

本揭露的組合物可包含占組合物總重量約0.005%至2.0%的防腐劑。防腐劑用於防止在暴露於環境中的污染物的情況下的腐敗。根據本揭露可用的防腐劑的實例包括但不限於選自苄醇、山梨酸、對羥基苯甲酸酯、亞胺尿素及其組合的那些。特別佳的防腐劑是約0.5%至2.0%的苄醇和0.05%至0.5%的山梨酸的組合。

組合物較佳包含抑制化合物降解的抗氧化劑和螯合劑。對於一些化合物，較佳的抗氧化劑是BHT、BHA、α-生育酚和抗壞血酸，其較佳範圍為組合物總重量的約0.01%至0.3%（按重量計），更佳組合物總重量的0.03%至0.1%（按重量計）範圍內的BHT。較佳地，螯合劑以組合物總重量的0.01%至0.5%（按重量計）的量存在。特別佳的螯合劑包括按組合物總重量計約0.01-0.20%（按重量計），更佳0.02-0.10%（按重量計）範圍的乙二胺四乙酸鹽(例如乙二胺四乙酸二鈉)和檸檬酸。螯合劑可用於螯合組合物中可能對製劑的保存期限有害的金屬離子。雖然BHT和乙二胺四乙酸二鈉分別是對於一些化合物而言特別佳的抗氧化劑和螯合劑，但是如本領域技術人員已知的，其它合適和等效的抗氧化劑和螯合劑因此可能被替代。

施用方案可影響有效量的構成。例如，治療製劑可在與癌症相關的外科手術之前或之後，或在患者被診斷患有癌症之後不久施用至患者。此外，可以每天施用或者順序地施用若干分開的劑量（divided dosages）以及交錯劑量（staggered dosages），或者劑量可以連續地輸注、或者可以是單次快速靜脈注射（bolus injection）。此外，治療製劑的劑量可按比例地增加或減少，如治療或預防情況的緊急情況所指示的。

向患者，較佳哺乳動物，更佳人施用本揭露的抗體或組合物可以使用已知的程式，以有效治療患者癌症的劑量和時間進行。實現治療效果所需的治療化合物的有效量可以根據以下因素而變化：例如所使用的具體化合物的活性；施用時間；化合物的排泄速率；治療的持續時間；其它藥物，與該化合物組合使用的化合物或材料；所治療患者的疾病或病症的狀態、年齡、性別、體重、狀況、一般健康和在先病史，以及醫學領域中熟知的類似因素。可對劑量方案加以調節，以提供最佳治療反應。例如，可每日施用若干分開的劑量或可按治療情形緊迫程度所指示的成比例減少劑量。本揭露的治療化合物的有效劑量範圍的非限制性實例為約0.01至50mg/kg體重/每天。本領域普通技術人員將能夠研究相關因素並且在不進行過度實驗的情況下確定治療化合物的有效量。

治療化合物可以以每天若干次的頻率施用至動物，或者可以更低頻率地施用，例如每天一次，每週一次，每兩週一次，每月一次或甚至更低頻率，例如每幾個月一次或甚至每年一次或更少。應當理解，在非限制性實例中，可以每天，每隔一天，每2天，每3天，每4天或每5天施用每天給藥化合物的量。例如，對於每隔一天的施用，可以在週一開始5mg/天的劑量，在週三施用第一後續的5mg/天劑量，在週五施用第二後續的5mg/天劑量，等等。劑量的頻率對於本領域技術人員是明顯的，並且取決於許多因素，例如但不限於所治療的疾病的類型和嚴重性，以及動物的類型和年齡。本揭露的藥物組合物中活性成分的實際劑量水準可以改變以獲得能夠有效實現對於特定患者、組合物和施用模式而言期望的治療反應、而不對患者具有毒性的活性成分的量。具有本領域普通技術的醫生，例如醫師或獸醫，可以容易地確定和開出所需的藥物組合物的有效量。例如，醫師或獸醫可以以低於實現期望療效需要的水準開始在藥物組合物中採用的本揭露的抗體的劑量，且逐步增加劑量直至實現期望的效果。

在具體實施方式中，特別有利的是以劑量單位形式配製化合物以易於施用和劑量均勻性。如本文所用的劑量單位形式指適宜作為待治療患者的單一劑量的物理上分離的單位；每個單位含有與所需藥物載劑相組合的經計算產生期望治療效應的預先確定量的治療化合物。本揭露的劑量單位形式由以下因素決定並直接取決於以下因素：(a)治療化合物的獨特特徵和要實現的特定治療效果，以及(b)混配/配製這樣的用於治療患者的癌症的治療化合物領域固有的限制。

本領域技術人員將認識到，儘管可以使用多於一種途徑用於施用，但是特定途徑可以提供比另一種途徑更直接和更有效的反應。

本揭露的抗體或組合物的施用途徑包括吸入、經口、鼻部、直腸、腸胃外、舌下、經皮、經黏膜(例如，舌下、舌部、(經)頰部、(經)尿道、陰道(例如，經陰道和陰道內)、(經)鼻部和(經)直腸)、膀胱內、肺內、十二指腸內、胃內、鞘內、皮下、肌肉內、皮膚內、動脈內、靜脈內、支氣管內、吸入和局部施用。合適的組合物和劑型包括例如片劑、膠囊、囊劑、丸劑、軟膠囊(gel cap)、含片、分散體、懸浮液、溶液、糖漿、顆粒、珠粒、經皮貼劑、凝膠、粉末、彈丸劑、漿劑、錠劑、乳霜、糊劑、膏劑、洗劑、盤劑、栓劑、用於鼻或口服給藥的液體噴霧劑、用於吸入的乾粉或氣霧化製劑、用於膀胱內給藥的組合物和製劑等。應當理解，可用於本揭露的製劑和組合物不限於本文所述的具體製劑和組合物。

本揭露的藥物組合物的控釋（controlled-release）或持續釋放（sustained-release）製劑可以使用常規技術製備。在一些情況下，待使用的劑型可以作為一種或多種活性成分的緩釋（slow-release）或控釋而提供，其中使用例如羥丙基甲基纖維素、其它聚合物基質、凝膠、可滲透膜、滲透系統、多層包衣、微粒、脂質體或微球體或其組合，以提供不同比例的期望的釋放曲線。本領域普通技術人員已知的合適的控釋製劑，包括本文所述的那些，可以容易地選擇用於本揭露的藥物組合物。因此，適合於經口施用的單一單位劑型，例如適於控釋的片劑、膠囊、軟膠囊和囊劑，包括在本揭露中。

大多數控釋藥品都具有相對其非控釋相應物改進藥物療法的共同目標。理想的是，在醫學治療中最佳設計的控釋製品的使用的特徵為：採用最少量的藥物物質在最短的時間內治癒或控制病況。控釋製劑的優點包括延長藥物活性、減少給藥頻率和增加患者順應性。此外，控釋製劑可用於影響作用開始的時間或其它特徵，例如藥物的血液水準，因此可影響副作用的發生。

在一些實施方式中，本揭露涉及一種治療有此需要的受試者的癌症或者刺激或增強有此需要的受試者的免疫反應的方法，該方法包括向該受試者施用有效量的本揭露所述的抗體或藥物組合物。

在一些實施方式中，本揭露涉及一種治療有此需要的受試者的癌症或者刺激或增強有此需要的受試者的免疫反應的方法，該方法包括向該受試者施用有效量的本揭露所述的抗體或藥物組合物，其中以0.01-50 mg/kg/天的劑量和介於1-14天之間的間隔向該受試者施用本揭露所述的抗體或藥物組合物。

在一些實施方式中，本揭露涉及本揭露所述的抗體或藥物組合物在製造用於治療有此需要的受試者的癌症或者用於刺激或增強有此需要的受試者的免疫反應的藥物中的用途。

在第一方面，本揭露涉及一種特異性地結合人DKK2蛋白的抗體，其包含含有互補決定區CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區以及含有互補決定區CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區，其中： (a) CDRH1具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列； (b) CDRH2具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列； (c) CDRH3具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列； (d) CDRL1具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列； (e) CDRL2具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；且 (f) CDRL3具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

在第二方面，本揭露涉及如第一方面所述的抗體，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

在第三方面，本揭露涉及如第一方面或第二方面所述的抗體，其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

在第四方面，本揭露涉及如第一方面至第三方面中任一項所述的抗體，其中該抗體的重鏈包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性的氨基酸序列。

在第五方面，本揭露涉及如第一方面至第四方面中任一項所述的抗體，其中該抗體的輕鏈包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性的氨基酸序列。

在第六方面，本揭露涉及如第一方面至第五方面中任一項所述的抗體，其中該重鏈可變區和/或該輕鏈可變區是單鏈可變片段scFv、F(ab’) ₂片段、Fab或Fab’片段、雙價抗體、三價抗體、四價抗體或單殖株抗體的部分。

在第七方面，本揭露涉及一種藥物組合物，其包含如第一方面至第六方面中任一項所述的抗體以及藥學上可接受的載體。

在第八方面，本揭露涉及一種DNA分子，其編碼如第一方面至第六方面中任一項所述的抗體的重鏈和/或輕鏈。

在第九方面，本揭露涉及一種治療有此需要的受試者的癌症或者刺激或增強有此需要的受試者的免疫反應的方法，該方法包括向該受試者施用有效量的如第一方面至第六方面中任一項所述的抗體或第七方面所述的藥物組合物。

在第十方面，本揭露涉及如第九方面所述的方法，其中以0.01-50 mg/kg/天的劑量和介於1-14天之間的間隔向該受試者施用如第一方面至第六方面中任一項所述的抗體或第七方面所述的藥物組合物。

在第十一方面，本揭露涉及如第一方面至第六方面中任一項所述的抗體或第七方面所述的藥物組合物在製造用於治療有此需要的受試者的癌症或者用於刺激或增強有此需要的受試者的免疫反應的藥物中的用途。

本揭露將進一步在以下非限制性的工作實施例中進行說明。應當理解，這些實施例僅用於解釋本揭露而不是用於限制在本文中所引用的材料、條件、製程參數等。除非另有說明，否則所有比例都是基於重量計算的。 實施例

5F8獲自京天成生物技術(北京)有限公司，M-751、M-755和M-763是以M-747作為親本抗體，藉由本領域公知的用於抗體人源化的常規實驗操作（例如，改變IgG子類、再次人源化、改變信號肽、氨基酸點突變和/或上述的組合）獲得的。5F8、M-747、M-751、M-755和M-763的CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRL1、CDRL2和CDRL3，VH（重鏈可變區），VL（輕鏈可變區），HC（全長重鏈）以及LC（全長輕鏈）的氨基酸序列以及與SEQ ID NO的對應關係如下表1所示。 表1

名稱	區域	SEQ ID NO	序列
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CDRL2	6	FASTRES
CDRL3	7	QQHYITPLT
VH	25	QVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMNWVRQAPGQGLEWMGMIHPSDSETRLNQKFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGRLGLRSYAMDYWGQGTLVTVSS
VL	26	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLQSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLVYFASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQHYITPLTFGGGTKVEIKR
HC	27	MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMNWVRQAPGQGLEWMGMIHPSDSETRLNQKFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGRLGLRSYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
LC	28	MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLQSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLVYFASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQHYITPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

實施例 1 ：抗體的製備

抗體材料是由中國倉鼠卵巢（CHO）懸浮細胞系產生的。基本上如ThermoFisher（目錄號A29133，檔部分號A29518）所述，遵循ExpiCHO-STM“最大滴定度”方法。使用ExpiFectamine將含有LC或HC編碼區的pcDNA3.4表現載體以6x10 ⁶的VCD共轉染到CHO-S細胞中。在32°C、5%CO ₂和85%濕度，搖動速度為500 RPM（3 mm軌道）或130 RPM（19 mm軌道）的條件下，表現持續時間為10-12天。藉由以下方式產生所有澄清的上清液：將細胞以3000 g沉澱20分鐘，然後進行0.22μm過濾。使用Mab Select SuRe蛋白A樹脂從澄清的上清液中純化抗體。使用具有精氨酸洗滌和pH 3.5的乙酸鹽洗脫的磷酸鈉，氯化鈉緩衝系統。將蛋白A洗脫液用tris中和，並將緩衝液更換為20 mM磷酸鈉，150 mM NaCl，pH 7.4。 實施例 2 ：結合親和力試驗

利用酶聯免疫吸附測定（ELISA）來評估與親本抗體（M-747）相比，候選抗體（M-751、M-755和M-763）與人DKK2蛋白的結合親和力。將人DKK2蛋白（R&D系統，目錄號：6628-DK-010）在50 ul 1xPBS緩衝液中以每孔1 ng蛋白包被在384孔板中。然後將經包被的板密封，在4℃下孵育過夜。然後將板用60ul /孔的1x PBS緩衝液洗滌兩次，隨後使用3% BSA-PBST封閉，每孔50ul，密封並在37℃下孵育2小時。洗滌兩次後，將50 ul用1%BSA-PBST稀釋至圖中所示濃度的一抗添加到板的每個孔中，然後在37℃下孵育2小時。兩次洗滌後，將50ul用1%BSA-PBST以1:5000稀釋的二抗山羊抗人IgG-Fc HRP標記抗體（Bethyl Laboratories，目錄號：A80-104P）添加到板的每個孔中，然後在37℃下孵育1小時。兩次洗滌後，在室溫下將80 ul SuperSignal™ West Pico PLUS化學發光底物（Thermo Scientific，目錄號：34580）添加到每個孔中。在EnVision多模式讀板器上使用470nm讀取板。重複測定三輪。在每輪中一式三份地測試每個變體。 圖 1中所示的是來自三輪之一的代表性資料。條（bars）表示平均值±SEM。 實施例 3 ：使用穩定細胞系產生的材料藉由候選抗體的 DSF 評估構象穩定性

使用 CHO 穩定轉染系統產生抗體：使用Lipofectamine 3000（Invitrogen L3000-015），按照製造商推薦的程式，將帶有抗體重鏈編碼序列的表現質粒pDL5（GenScript）和帶有抗體輕鏈編碼序列的表現質粒pDL2（GenScript）與輔助質粒pDL4一起共轉染到CHO-K1宿主細胞中。將被轉染的細胞在無選擇壓力的培養基中孵育1天，然後在含有20mg/L嘌呤黴素的培養基中孵育6天。將回收的細胞在生產培養基中培養，以允許分泌的抗體在消耗的培養基（spent media）中積累。

小規模純化：使用Protein-A柱（Nab Protein A Plus旋轉柱，Thermo Scientific，目錄號89952），按照製造商的流程，將消耗的培養基在藉由離心澄清後進行抗體純化。然後藉由高容量內毒素去除柱（Thermo Scientific，目錄號88274）對純化的抗體進行內毒素去除。使用E-Toxate試劑盒（Sigma-Aldrich，目錄號ET0100、ET0200和ET0300）測試了去除步驟後的內毒素水準，並證實其低於0.1 EU/mL。抗體濃度藉由OD280測量。

DSF 評估：對純化的候選抗體進行差示掃描螢光（DSF）分析，以確定其相對構象穩定性（ 表 2）。與親本分子M-747相比，所有候選抗體均顯示出提高的穩定性。

分子	WSS rep 1	WSS rep 2	T1 Rep 1	T1 Rep 2	T2 Rep 1	T2 Rep 2
M-747	6.7	6.9	71.2	70.8	-	72.4
M-751	55.1	52.8	67.3	67.1	84.6	84.6
M-755	42.8	41.7	67.3	67.5	80.9	80.8
M-763	22.8	22.6	67.3	67.3	84.6	84.6

表 2. 與親本抗體相比，候選抗體的DSF。更高的WSS值指示更好的熱穩定性。 實施例 4 ：使用穩定細胞系產生的材料評估候選抗體在動物模型中的功效

使用同基因腫瘤模型在C57BL/6雌性小鼠（Envigo）中評估穩定細胞系產生的候選抗體（參見實施例3產生和純化部分）的體內活性。人多殖株IgG（BioXCell，目錄號BE0092）被用作陰性對照。5F8被用作陽性對照。將上述獲得的抗體對腫瘤生長和免疫細胞啟動的作用與陽性組和陰性組進行比較。與親本分子M-747相比，M-751和M-755表現出更強的腫瘤抑制和免疫啟動作用。

腫瘤移植：在小鼠的右腋窩（外側）皮下接種小鼠結腸癌細胞系MC38（Kerafast，目錄號ENH204）。藉由使用卡尺在二維上進行測量來監測腫瘤體積，並使用公式V = 0.5 a × b ²以mm ³表示體積，其中a和b分別是腫瘤的長徑和短徑。然後在接種後第10天，當平均腫瘤體積達到200mm ³時，將動物隨機分組（n=5）進行處理。在第10天、第13天和第16天，以12.5 mg/kg腹膜內（IP）注射抗人DKK2抗體（ 圖 2）。在第17天，處死小鼠並稱重腫瘤（ 圖 3）。

圖 2示出了在用候選抗體（M-751、M-755或M-763）、親本抗體（M-747）或對照（人多殖株IgG或5F8）處理的組中，在注射後第10天、第13天和第16天測量的腫瘤體積。結果表示為平均值±SEM。藉由比較平均腫瘤大小，M-751處理和M-755處理展示出比M-747更強的腫瘤生長控制。

圖 3示出了在用候選抗體（M-751、M-755或M-763）、親本抗體（M-747）或對照（人多殖株IgG或5F8）處理的組中，在注射後第17天的平均終點腫瘤重量。結果表示為平均值±SEM。藉由比較平均腫瘤重量，M-751處理和M-755處理展示出比M-747更強的腫瘤生長控制。

腫瘤浸潤白細胞的製備：將收集的腫瘤用剪刀和手術刀刀片切碎，並用消化緩衝液（RPMI 1640培養基，5%FBS，1%青黴素/鏈黴素，25 mM HEPES和300 U膠原酶（Sigma C0130））在搖床上於37°C下孵育2小時。將分散的細胞藉由70微米的細胞濾器過濾，以消除團塊和碎屑。在500 g和4°C下離心5分鐘後，將細胞沉澱重懸在紅細胞裂解緩衝液（Sigma R7757）中，並在室溫下孵育5分鐘以去除紅細胞。將細胞再次沉澱，重懸，於37%下在0.05%胰蛋白酶/ EDTA中孵育5分鐘，然後用1μg/ml I型DNase（Sigma，D4263）進行DNA消化5分鐘。藉由添加FBS至5%來停止胰蛋白酶消化，並藉由40-μm細胞濾器再次過濾細胞。最後，將細胞再次沉澱，並以2 × 10 ⁷的濃度重懸於PBS中。

流式細胞術：將單細胞懸液中的細胞用2% PFA（Santa Cruz，sc-281692）固定。用流式細胞術染色緩衝液（eBioscience，00-4222-26）洗滌後，在黑暗中於冰上用細胞表面標記物抗體對細胞染色1小時。為了對細胞內蛋白染色，將細胞洗滌並重懸於透化緩衝液（BD，554723）中，然後在黑暗中於冰上在透化緩衝液中用抗體染色1 h。然後將細胞沉澱並重懸在流式細胞術染色緩衝液中以進行流式細胞術分析。 圖 4、 圖 5和 圖 6示出了來自不同處理組的顆粒酶B、IFNγ和CD69的幾何平均值。資料以平均值±SEM表示。藉由單因素方差分析來分析統計學顯著性。*: p＜0.05; ***: P＜0.0005; ****: p＜0.0001。 實施例 5 ：使用補料分批產生的材料時， M-751 、 M-755 與親本分子的可開發性的比較

補料分批生產：將M-747、M-751和M-755的穩定庫解凍並擴展（expanded），以在補料分批設置下產生更具代表性的材料（與短暫的（transient）（實施例2）和實驗室規模的材料（實施例3和實施例4）相比），以用於非臨床和臨床開發中供進一步分析。將來自每種分子的穩定庫擴展到搖瓶中，並在培養基M1（CD FortiCHO+4mM麩氨醯胺+5μg/mL殺稻瘟素+10μg/mL嘌呤黴素）中傳代約2周，然後接種用於補料分批培養。補料分批接種後，將細胞直接在搖瓶中以約10x10 ⁶個細胞/mL的密度稀釋到培養基M2（ActiPro+4mM麩氨醯胺+1X GS補充劑）中，第0天的初始工作容積為200mL。在InFors HT恆溫箱（37.0℃，85%濕度，5%CO ₂、110 RPM，50mm軌道擺度）中孵育補料分批培養物。在第1、3、5、7和9天將補料培養基添加到補料分批培養物中。將葡萄糖添加到培養物中以使其水準保持在＞3 g/L，將GlutaMAX添加到培養物中以將麩氨醯胺水準保持在＞2mM。在第2天，當細胞密度達到約20x10 ⁶個細胞/mL時，將培養溫度調節至32℃。在第10天收穫補料分批培養物。藉由Cedex Bio分析儀測量來自收穫的培養物的上清液的滴度。藉由一步蛋白A層析法純化補料分批培養物的上清液。

SEC 分析：以以下方式測試樣品：在不調節pH的情況下直接以蛋白A洗脫物的形式，或使用1M乙酸鈉中和至pH5.5，或對於保持低pH持續表中所示的時間段的條件，用1M乙酸調節至pH3.7（ 表 3）。使用配製緩衝液（20mM組氨酸，250mM山梨糖醇和0.2%泊洛沙姆188）將樣品稀釋至10mg/mL，以用於注射。在開始樣品設置之前，用Milli-Q水以0.5 mL/min的流速洗滌柱不少於60分鐘，然後用流動相平衡系統，直到達到穩定的基線和反壓或至少40分鐘。每個樣品注射兩次。最多十次樣品注射後，注射括弧內的參考標準品。使用Empower進行色譜圖的積分。如下計算%主峰、%HMW（高分子量）和%LMW（低分子量）： %HMW =（HMW峰面積的總和）/（總峰面積）*100% %主峰 =（主峰面積）/（總峰面積）*100% %LMW =（LMW峰面積的總和）/（總峰面積）*100% 資料表示為兩次注射的平均值。

不調節
分子	%HMW	%主峰	%LMW
M-747	16.52	83.07	0.41
M-751	2.94	96.67	0.39
M-755	4.23	95.08	0.69
pH 調節至 5.5
分子	%HMW	%主峰	%LMW
M-747	16.68	82.99	0.33
M-751	1.68	98.31	0.01
M-755	3.87	96.08	0.05
低 pH （ pH3.7 ）保持， 1 小時
分子	%HMW	%主峰	%LMW
M-747	16.3	83.5	0.3
M-751	2.9	98.1	0.1
M-755	4.9	94.9	0.1
低 pH （ pH3.7 ）保持， 2 小時
分子	%HMW	%主峰	%LMW
M-747	15.6	84.1	0.3
M-751	3.7	96.0	0.3
M-755	5.5	94.3	0.2

表 3.M-751、M-755與M-747的穩定性評估。在各種處理條件下藉由SEC分析樣品。與親本分子M-747相比，M-751和M-755二者在所有條件下均顯示出更小的%HMW。

SDS-PAGE 分析：以以下方式測試樣品：在不調節pH的情況下直接以蛋白A洗脫物的形式，或使用1M乙酸鈉中和至pH5.5。上樣之前，將樣品用Milli-Q水稀釋至1mg/mL，與上樣緩衝液（EZ Biolab，LS003）以4:1混合，並在100℃下孵育10分鐘，然後以10,000rpm離心5分鐘。將預染色的蛋白質標記物（Tanon，180-6003）和樣品以每孔5μl上樣至凝膠（Tanon，180-8008）。電泳在80V下運行10分鐘，然後在160V下運行，直到染料前沿跑出凝膠。然後將凝膠用染色溶液（Tanon，180-7001）染色60分鐘，並用Milli-Q水洗滌3次，然後成像（ 圖 7）。親本分子M-747顯示出重鏈異質性，而M-751和M-755（進行了序列優化）均顯示出典型的IgG譜。一些重鏈和輕鏈片段（用*表示）在M-751和M-755洗脫物中被觀察到，但在pH調節後減少了。

自締合結合常數：在高濃度下，不期望的溶液性質例如自締合可對製劑開發提出重大挑戰。除了潛在的製造和遞送挑戰外，自締合物質還可影響生物活性和藥代動力學特性。測量了與親本分子M-747相比M-751和M-755的自締合結合常數。結果顯示，M-751和M-755彼此相似，兩者的性能均優於M-747（ 表 4）。

使用forteBIO Octet技術（Octet RED96）測量自締合結合常數。將抗體用醋酸鹽pH 5.5緩衝液稀釋至150 ug /mL，然後加樣至樣品板（forteBIO，Greiner，PN655209）。ProA生物感測器（forteBIO）被用於捕獲抗體。使用基本動力學在以下設置下進行測量：基線60 /負載900 /基線60 /締合300 /解離300。計算目標抗原的締合（Kon）和解離（Kdis）速率常數，並用於得出解離常數（KD）。所有計算均使用forteBIO提供的軟體進行。

變體	在 pH5.5 的乙酸鹽中的自締合常數 (KD, mM)
M-751	0.438±0.086
M-755	0.456±0.101
M-747	0.208±0.040

表 4.計算了M-751、M-755與M-747的自締合結合常數。M-751和M-755均顯示出較低的自締合親和力，而親本分子M-747則顯示出形成穩定的自聚集體的較高趨勢。

儘管具體的實施方式已被描述，然而對於申請人或其它本領技術人員而言，可能存在或目前無法預見上述實施方式的替代、修改、變化、改進和實質等效物。因此，提交的所附的申請專利範圍以及可能被修改的申請專利範圍旨在涵蓋所有這樣的替代、修改、變化、改進和實質等效物。

M-747、M-751、M-755、M-763:抗體

以下提供附圖的簡要說明，其用於說明本文所揭露的示例性實施方式，而不是為了限制這些實施方式。 圖1示出了與親本抗體（M-747）相比，候選抗體（M-751、M-755或M-763）與人DKK2蛋白的結合親和力。 圖2示出了在用候選抗體（M-751、M-755或M-763）、親本抗體（M-747）或對照（人多殖株IgG或5F8）處理的組中，在注射後第10天、第13天和第16天測量的腫瘤體積。 圖3示出了在用候選抗體（M-751、M-755或M-763）、親本抗體（M-747）或對照（人多殖株IgG或5F8）處理的組中，在注射後第17天的平均終點腫瘤重量。 圖4示出了在用候選抗體（M-751、M-755或M-763）、親本抗體（M-747）或對照（人多殖株IgG或5F8）處理的小鼠中，顆粒酶B（腫瘤浸潤性CD8 ⁺T細胞和NK1.1 ⁺T細胞的活化標誌物）的水準的比較。 圖5示出了在用候選抗體（M-751、M-755或M-763）、親本抗體（M-747）或對照（人多殖株IgG或5F8）處理的小鼠中，干擾素γ（IFNγ，其是腫瘤浸潤性CD8 ⁺T細胞和NK1.1 ⁺T細胞的活化標誌物）的幾何平均值的比較。 圖6示出了在用候選抗體（M-751、M-755或M-763）、親本抗體（M-747）或對照（人多殖株IgG或5F8）處理的小鼠中，CD69（腫瘤浸潤性CD8 ⁺T細胞和NK1.1 ⁺T細胞的活化標誌物）的幾何平均值的比較。 圖7示出了候選抗體（M-751、M-755）與親本抗體（M-747）在洗脫後直接或者 將pH調節至5.5後情況下的SDS-PAGE分析。

M-747、M-751、M-755、M-763:抗體

Claims (10)

1. 一種特異性地結合人DKK2蛋白的抗體，其包含含有互補決定區CDRH1、CDRH2和CDRH3的一重鏈可變區以及含有互補決定區CDRL1、CDRL2和CDRL3的一輕鏈可變區，其中： (a) CDRH1具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列； (b) CDRH2具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列； (c) CDRH3具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列； (d) CDRL1具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列； (e) CDRL2具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；且 (f) CDRL3具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
2. 如請求項1所述的抗體，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
3. 如請求項2所述的抗體，其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
4. 如請求項3所述的抗體，其中該抗體的重鏈包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性的氨基酸序列。
5. 如請求項4所述的抗體，其中該抗體的輕鏈包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性的氨基酸序列。
6. 如請求項1至請求項5中任一項所述的抗體，其中該重鏈可變區和/或該輕鏈可變區是單鏈可變片段scFv、F(ab’) ₂片段、Fab或Fab’片段、雙價抗體、三價抗體、四價抗體或單殖株抗體的部分。
7. 一種藥物組合物，其包含如請求項1至請求項6中任一項所述的抗體以及藥學上可接受的載體。
8. 一種DNA分子，其編碼如請求項1至請求項6中任一項所述的抗體的重鏈和/或輕鏈。
9. 一種如請求項1至請求項6中任一項所述的抗體或如請求項7所述的藥物組合物在製造用於治療有此需要的受試者的癌症或者用於刺激或增強有此需要的受試者的免疫反應的藥物中的用途。
10. 如請求項9所述的用途，其中以0.01-50 mg/kg/天的劑量和介於1-14天之間的間隔向該受試者施用如請求項1至請求項6中任一項所述的抗體或如請求項7所述的藥物組合物。

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