TW202222171A - 具抗氧化、美白及dna保護之米發酵物 - Google Patents

Abstract

本發明係一種米發酵物，以米作為基質，進行二階段發酵以獲得具有抗氧化以及美白功能之米發酵物，其可防止氧化劑對細胞所引起之傷害。上述之米發酵物製備方法如下：先將蒸餾水添加至米中，藉由高溫高壓滅菌釜進行滅菌，其後將所獲得之熟米接種孢子懸浮液進行二階段發酵培養，即獲得米發酵物；其二階段發酵所使用之菌株分別為米麴菌 Aspergillus oryzaeJC01-Wu(寄存編號BCRC930223)以及酵母菌 Saccharomyces cerevisiaeJC02-Wu(寄存編號BCRC920124)。

Description

具抗氧化、美白及DNA保護之米發酵物

本發明係關於一種具抗氧化、美白及DNA保護之米發酵物以及其製造方法，該米發酵物可應用在食品、化妝品和醫療產業等領域中，作為天然之抗氧化劑，以取代人工合成之抗氧化劑。

水稻(Oryza sativa L.)通常被稱為「東方黃金」，是全球近一半人口最普遍食用之日常主食；食用水稻之人口超過35億人，大多來自亞洲、非洲、部分拉丁美洲和加勒比地區。稻米在世界發展中國家的糧食安全，發揮著極為關鍵之作用。據估計，中國和印度合計約佔全球稻米消費量的50%，在亞洲各國中的稻米每日消費量最高。2011年，全球每人平均稻米消費量接近60kg/年，而亞洲國家則達到約100kg/年(http://irri.org/rice-today/trends-in-global-rice- consumption)。米飯提供全球近20%的人體卡路里攝取量，使其成為全球人類營養中最重要的作物(Zeigler and Barclay, 2008)。據估計，米飯提供高達50%的每日熱量供應，並為亞洲地區約5.2億貧困人口，提供大量膳食蛋白質需求(Muthayya et al., 2014)。稻米為亞洲國家蛋白質的主要來源之一(Wang et al., 2015)，也是日本最豐富的植物蛋白來源(Kubota et al., 2013)。亞洲的水稻生產具有深厚的社會政治和社會文化根基，約佔全球產量的 90%。

在所有的食品中代表功能性食品最簡單的食材便是稻米，稻米除了提供簡單的能量和營養外，還具有增強健康的能力。稻米其成分組成分析，約包含了72-79%醣類(碳水化合物)、7.0-9.0%植物性蛋白質、0.6-2.5%脂肪、0.1-2%膳食纖維，0.4-1.0%灰份，及豐富礦物質及維生素B群。但除了上述營養價值外，近年研究已知稻米所具有之保健機能性成分，包含生育醇(T)、生育三烯醇(T3)、γ-谷維素、植物固醇、多酚類(如阿魏酸)、膳食纖維、維生素B群等等成分，而生育三烯醇及γ-谷維素為稻米之獨特機能性成分，且含量較高。而在稻米所含之植物性蛋白質，特別是儲藏性蛋白質與結構性醣蛋白，不僅具良好的耐熱性，符合加熱烹煮米食之特性，更有助於人體生理機能之促進與維護。稻米在各個亞洲傳統藥物中使用於抗糖尿病、抗發炎、抑制腸胃疾病和抗心血管疾病的用途，也被當作利尿劑(Ahuja et al., 2008；Umadevi et al., 2012)。此外，它被認為是被用於預防酒精性肝病(Ding et al., 2012)，除亞洲之外，在義大利中也被使用於傳統治療(Pieroni et al., 2004；Saikia et al., 2006)，並作為營養不良和慢性病的潛在性解決方案(Dipti et al., 2012)，含有高濃度的γ-胺基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)，是一種非蛋白胺基酸，是目前所發現最主要的抑制性神經傳導物質(Umadevi etal., 2012；Zhang et al., 2006)，另外，γ-GABA亦具有許多生理功效，(1)降血壓；(2)幫助睡眠；(3)抗焦慮；(4)抗衰老；(5)生殖作用；(6)皮膚癒合；(7)胃腸運動；(8)作為飼料添加使禽畜提高存活率，維持穩定生長(林玥妦&呂英震，2012)。

包含膳食纖維、insulin、β-glucan、phenolics和tocopherols，具有增提健康的特性，全穀物似乎在心血管疾病和高血壓、2 型糖尿病、肥胖和癌症等疾病中預防作用(Gani et al., 2012；Jones and Engleson, 2010)，特別是，作為植物性食品中次級代謝產物的抗氧化成分已突顯並繼續被證明是健康成分。

ROS(活性氧化物)產生和抗氧化防禦之間的平衡取決於氧化壓力的總體程度，而氧化壓力被認為會導致組織中的分子和細胞受損，許多環境刺激，包括細胞因子、紫外線(UV)照射、化學藥劑、體溫過高、甚至是生長因子，都會產生高含量的ROS，這些ROS會擾亂正常的氧化還原平衡並使細胞轉變為氧化壓力狀態(Finkel and Holbrook, 2000)。因此，ROS 在老化以及許多疾病的發病機制中具有作用，例如糖尿病、癌症、神經性退化疾病和呼吸道疾病(Anderson et al., 2000)，細胞的存活依賴於適應或抵抗壓力以及修復或替換受損分子，因此發展天然食物以促進細胞和生物體以協同或拮抗方式適應急性壓力是非常具有發展潛力的(Finkel and Holbrook, 2000)。

發酵已經使用了近5000年，是一種有效且低成本的技術，用於保存食物以及提高品量和安全性，此外，它增加了價值，提高了營養品量和消化率，並提供膳食濃縮，這些所有變化都由自然存在或藉由接種的微生物在原料中進行發酵(Fleet, 2006；Romano et al., 2006)，常見的發酵細菌包括 Leuconostoc、 Lactobacillus、 Streptococcus、 Pediococcus、 Micrococcus、 Micrococcus和 Bacillus，最常見的真菌屬是 Aspergillus、 Paeciloyces、 Cladosporium、 Fusarium、 Penicillium和 Trichothecium(Blandino et al., 2003)。在發酵微生物中，酵母是食品、飲料和藥物中常見且重要的微生物，發酵也可以應用於含有對健康效果有益成分的功能性食品設計和製造(Fleet, 2006)。發酵功能性食品的健康益處直接歸因於攝取活的微生物、細菌或酵母與宿主之間相互作用(益生菌作用)或間接攝取發酵過程中產生的微生物代謝物(生物效應)，發酵功能性食品的生物特性是微生物在發酵過程中產生的生物活性代謝物如維生素、生物活性胜肽、有機酸或脂肪酸的結果(Stanton et al., 2005)。

發酵在食品加工中至少扮演六個角色：(1)改變食物中各種味道、香氣和質地並豐富人類飲食；(2)藉由乳酸、酒精、醋酸、鹼和高鹽發酵保存大量食物；(3)食品基質的生物富集含有維生素、蛋白質、必需氨基酸和必需脂肪酸；(4)在食品發酵加工過程中的解毒作用；(5)減少烹飪時間和燃料需求和(6)提高食物之附加價值(例如:提高食物之抗氧化能力、美白等等)。

穀物被認為是食物蛋白質、碳水化合物、維生素、礦物質和纖維的最重要來源之一，然而，與乳製品相比，它們含有較低的蛋白質含量，並且缺乏某些必需氨基酸，例如lysine(Chavan and Kadam, 1989)。穀物的發酵亦可以降低碳水化合物的含量以及一些不易消化的多醣和寡醣，此外，可以合成某些氨基酸，和可以改善維生素B的可用性(Chavan and Kadam, 1989；Haard et al., 1999)，發酵還可以改善產品的保存期限、質地、味道和香氣。因此，發酵穀物在食品中非常廣泛地應用，包括麵包和啤酒，具有改善的保存期限和整體接受度(Fleet, 2006)。

在20世紀50年代中期，Harman證實了一種老化的自由基理論，意旨在細胞中產生內源性氧自由基，會導致累積損傷的模式(Harman, 1957)。活性氧化物(Reactive oxygen species, ROS)包括各種不同的化學物質，超氧陰離子、羥基自由基和hydrogen peroxide。近年來，大量研究指出ROS誘導的慢性發炎與癌症之間的關係，癌症是一個多階段的過程，分為至少三個階段：起始、促進和發展(Ames and Gold, 1992；Guyton and Kensler, 1993；Schulte-Hermann et al., 1990)，氧化壓力與這三個階段相關，在起始階段，ROS可能藉由引起基因突變和結構改變來破壞DNA；在促進階段，ROS有助於異常基因的表現，細胞間的訊息傳遞被阻斷和二級傳導物質系統的修飾，從而提高起始細胞的增殖或減少細胞凋亡，最後，氧化壓力還可以藉由向啟動的細胞群引入DNA改變而參與癌症的發展階段(Stevenson and Walborg Jr, 1998)。

當環境中氧化劑和抗氧化劑之間發生不平衡時，若環境有利於氧化劑時可能導致損害因此被稱為氧化壓力(Sies, 1997)。實驗研究證明細胞和生物體需要氧化防衛機制，氧化劑可以破壞所有類型的分子，包括DNA、脂類、蛋白質和碳水化合物(Hawkins et al., 2009)。因此，氧化壓力可能造成細胞突變、致癌作用、細胞膜受損、脂質過氧化、蛋白質氧化和碎裂以及碳水化合物受損的過程(Klaunig et al., 2010；Lobo et al., 2010；Wei and Lee, 2002)，細胞和器官抵抗氧化壓力的第一道防線是防止活性含氧物(ROS)誘導所產生的受損(Yu, 1994)，與好氧代謝所引起的氧化壓力類似，動物和人類細胞已經發展出普遍存在的抗氧化防禦系統包含超氧化物歧化酶(SOD)、catalase(CAT)、glutathione peroxidase(GPx)和glutathione reductase以及許多小分子量的抗氧化劑如ascorbate、α-tocopherol、glutathione和vitamins等(Rahman et al., 2012；Lobo et al., 2010；Wei and Lee, 2002)。

至今為止，全球的發展趨勢是從藥用或膳食植物中找出或轉化出存在的天然物質作為天然抗氧化劑，應用在食品、化妝品和醫療產業中，以取代合成的抗氧化劑的有前景替代物。

本發明為防止氧化劑對細胞所引起的傷害，欲利用天然食材結合微生物發酵技術，發展具有抗氧化之防禦系統以及天然之植物性抗氧化劑。

目前穀物被認為是最亞洲重要的膳食營養來源之一，有良好的成分以及抗氧化劑的前驅物來源。因此，本發明擬以米為基質，進行二階段發酵以獲得具有抗氧化以及美白功能之米發酵物，其發酵流程圖如第1圖所示。

本發明之目的之一為尋找可從米中有效發酵出具抗氧化能力之菌種，故在進行發酵步驟前，透過菌種之分子鑑定、親緣樹分析，先挑選出合適之菌種，以利後續提高發酵出具抗氧化能力物質之產率。

菌種之分子鑑定為透過Genomic DNA萃取方式進行，依據Zhang et al.,(2010)熱裂解方式，純菌培養於PDA(potato dextrose agar，馬鈴薯葡萄糖)，使用滅過菌的牙籤刮取10 mg菌絲至含有100 μL無菌水的1.5 mL的離心管中，震盪幾秒清洗菌絲，並使用9000rpm轉速離心1分鐘；移除液體後，再加入100 μL含有50 mmol sodium phosphate( pH 7.4)、1 mmol EDTA與5%之glycerol裂解液，於85℃反應30分鐘。菌種鑑定使用ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)引子(Rajaet et al., 2017)擴增5.8S核醣體DNA與internal transcribed spacer(ITS)基因。RCR使用以下條件進行擴增:initial denaturation(95度，2分鐘)、denaturation(94度，30秒)、annealing(55度，1分鐘)、extension(72度，1分30秒)與final extension(72度，7分鐘)。PCR產物使用2%之agarose gel進行電泳，挖取純擴增的DNA並委託基隆米克斯公司使用ITS1引子，對於整個ITS1、5.8S rDNA和ITS2區域定序；擴增的基因定完序後，再使用NCBI的BLAST程式搜尋基因庫判定菌種。

親緣樹分析為將菌種序列由上述ITS1與ITS4引子擴增，且在基因定序完成後使用NCBI資料庫的比對與搜尋序列的菌種，再下載相似度高的序列以BioEdit軟體使用clustalW Multiple aligment進行功能排列。 Phycomyces blakesleeanus(JN206308)作為根霉菌屬的outgroup，而酵母菌屬則使用 Neurospora crassastrain CBS 709.71(MH860307.1)。親緣樹分析使用MEGA X程式中最大似然法則(maximum likelihood:ML)方法與近鄰結合法(neighbor-joining:NJ)繪製。最大似然法則模式使用Tamura 3 parameter與Gamma distributed作為分析。親緣樹的內部分枝強度測試使用 bootstrap(BS)的1000 replications分析，其他參數使用依據MEGA X預設定；而近鄰結合法分析模式內部分枝強度測試同樣使用bootstrap(BS)的1000 replications分析，substitution model使用Maximum composite likehood作為分析。

本發明之另一目的為提供一種具抗氧化、美白及DNA保護之米發酵物，其藉由二階段發酵而獲得，並透過不同發酵條件，找出具有良好抗氧化及美白功能之米發酵物。

此外，本發明之又一目的為提供一種組合物，其包含上述具有良好抗氧化及美白功能之米發酵物；該組合物係呈選自以下群組之一形式：化妝品組合物、皮膚保養組合物、醫藥組合物、飲料組合物、營養補充組合物、食用組合物以及保健食用組合物。

菌株之準備

用於二階段發酵之菌株分別為米麴菌 Aspergillus oryzaeJC01-Wu(寄存編號BCRC930223)以及酵母菌 Saccharomyces cerevisiaeJC02-Wu(寄存編號BCRC920124)，其中米麴菌菌株以15%甘油溶液保存在-80℃條件下，在接種之前，將菌株接種於PDA上，並在30℃條件下培養1天，藉由將10 mL含有0.01%Tween 80之蒸餾水添加到培養基表面，以無菌環輕輕摩擦，並透過無菌紗布過濾懸浮液以收穫孢子；使用血球計數器測定孢子計數，並將溶液稀釋至10 ⁶孢子/mL，作為工作孢子懸浮液備用。

酵母菌菌株則以15%甘油溶液保存在-80℃條件下，接種於15 mL之NB(nutrient broth)培養基在30℃條件下中進行活化，取10%活化完成之酵母菌菌液擴大培養於300 mL之NB上，並在30℃溫度條件下培養1天；上述所有微生物接種流程皆在無菌環境下進行。

實施例1

米麴菌及酵母菌之種親緣鑑定係以tree-basedmethod方式進行評估，Internal transcribed spacer(ITS)序列作為分析菌種的單系物種(monophyletic species)。米麴菌屬使用 Schizosac charomycespombe strainUCDFST:70-49(MH595274.1)作為outgroup，而酵母菌種分析使用 Neurospora crassastrain CBS 709.71(MH860307.1)作為outgroup。親源樹圖分析使用MEGA X的中最大似然法則(maximum likelihood:ML)方法與近鄰結合法(neighbor-joining:NJ)繪製。米麴菌單系物種評估親源樹圖繪製，則加入作為 Aspergillus oryzaestrain做為區別，最大似然法則方法與近鄰結合法結果都高達96%以上，由結果可知此一鑑定菌株為米麴菌 Aspergillus oryzaeJC01-Wu(寄存編號BCRC930223)，參考第2-1圖。而酵母菌鑑定儘管最大似然法則分數只有63%，但是近鄰結合法結果都高達84%，結果可知於種之間變異度大；結果知為鑑定物種為酵母菌 Saccharomyces cerevisiaeJC02-Wu(寄存編號BCRC920124)，參考第2-2圖。

實施例2

用於二階段發酵之白米由吉康食品股份有限公司提供。

二階段發酵步驟包含：(A)將米與水以1：1.5(V/V，共50L)以高溫高壓滅菌釜在121℃、15分鐘下蒸煮滅菌，製成熟白米備用；(B)將培養於PDA上之米麴菌 Aspergillus oryzaeJC01-Wu(寄存編號BCRC930223)孢子藉由10 mL含有0.01% Tween 80之蒸餾水收穫，以112孢子/mL製備工作孢子懸浮液，另取10%活化完成之酵母菌 Saccharomyces cerevisiaeJC02-Wu(寄存編號BCRC920124)菌液擴大培養於300 mL之NB上，並在30℃溫度條件下培養3天；(C)將培養完成之米麴菌 Aspergillus oryzaeJC01-Wu菌液接種15 mL至熟白米中進行發酵，並靜置培養至第2天使熟白米些微出水；(D)將培養完成之酵母菌 Saccharomyces cerevisiaeJC02-Wu菌液接種15 mL至步驟(C)中已些微出水之熟白米中，倒入105 mL之無菌水搖晃均勻進行發酵，並靜置培養3天，獲得米發酵物。

米發酵物成分分析

分析藥劑及米發酵萃取液製備

標準品：精確稱取GABA標準品粉末溶於D.I. water(去離子水)，配置為濃度5 mg/mL之溶液，其後進行稀釋配置成各濃度標準品(1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.01 mg/mL)備用。

硼酸緩衝溶液製備：秤取1.2 g boric acid 及0.8 g NaOH溶於100 mL去離子水中，利用HCl及NaOH調整至 pH 10.0即製備完成。

ortho-phtalaldehyde(OPA，鄰苯二甲醛)衍生劑製備：將10 mg之OPA 粉末溶於0.3 mL甲醇溶液，並添加20 µL MPA(3-mercaptopropoinic acid，3-巰基丙酸)及添加4 mL之0.1 M borate buffer(硼酸鹽緩衝液，pH 10.0)即可製備OPA衍生劑。

磷酸緩衝溶液製備：稱取71.64 g Na ₂HPO ₄•12H ₂O將其完全溶解於1L之去離子水中，即為0.2M Na ₂HPO ₄•2H ₂O水溶液；稱取31.21g NaH ₂PO ₄•2H ₂O將其完全溶解於1L之去離子水中，即為0.2M NaH ₂PO ₄•2H ₂O水溶液；將0.2M Na ₂HPO ₄•2H ₂O、0.2M NaH ₂PO ₄•2H ₂O及去離子水以30.5:19.5:50的比例混和，再以0.2M NaH ₂PO ₄•2H ₂O、0.2M NaH ₂PO ₄•2H ₂O調整至pH 7.0便可製備pH 7.0之磷酸緩衝溶液。

細胞毒性試劑製備：磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、DMSO、3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)以及Trypsin購自Sigma-Aldrich(USA)。DMEM、胎牛血清(FBS)和青黴素/鏈黴素購自Gibco(USA)。

米發酵萃取液製備：將乾燥後米發酵樣品與水以1:10(w/v)比例萃取，以超音波萃取1小時後，以9000 rpm離心吸取上清液，即獲得米發酵萃取液，並將米發酵萃取液保存於4℃下，待進一步進行分析。

以下實施例中所使用之代號，如表1所示。 表1

實施例3

γ-胺基丁酸(GABA)含量分析：將乾燥後米發酵樣品研磨成粉末，取0.5 g粉末樣品與5 mL之10%三氯乙酸混合，並將樣品提取物在振盪器上振盪1分鐘，將樣品置於40℃水浴下萃取2小時，將萃取物以13,000 rpm 離心15分鐘。

150 µL標準品或經離心後之樣品與750 µL之OPA衍生劑混合均勻，於室溫下避光反應1分鐘，之後以0.22 µm濾膜過濾，取20 µL進行HPLC分析，HPLC分析條件如表2所示。

藉由上述分析方法，50L米發酵物之GABA含量如表3所示，由表3中可發現經二階段發酵後，米發酵物之GABA之含量明顯較未發酵及一階段發酵之含量高。 表2

表3

實施例4

多醣、蛋白質及總酚含量分析：多醣含量分析係將0.5 mL樣品或標準品與0.5 mL酚溶液混合，再加入2.5 mL濃硫酸混合靜置反應10分鐘，再放置冷水浴終止反應15分鐘，將混合物在490 nm的波長處測定混合物的吸光度，使用葡萄糖作為標準品以0至0.2 mg/mL的濃度範圍建立標準曲線(參考第3-1圖)，結果以葡萄糖當量(mg/g)來表示萃取物乾燥後的多醣含量，並在操作的時候進行三重複的動作；蛋白質含量分析係將0.2 mL樣品或標準品與0.2 mL 1N NaOH混合，再加入2 mL鹼性銅溶液避光混合反應20分鐘，再加入0.2 mL 1N Folin-Ciocalteu Reagent，避光混合反應20分鐘後，將混合物在650 nm的波長處測定混合物的吸光度，使用牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)作為標準品以0至1.0 mg/mL的濃度範圍建立標準曲線(參考第3-2圖)，結果以BSA當量(mg/g)來表示萃取物乾燥後的蛋白質含量，並在操作的時候進行三重複的動作；總酚含量分析係將1 mL的萃取物和1 mL的Folin-Ciocalteu Reagent混合均勻，並避光反應3分鐘，再加入0.1 mL 碳酸鈉溶液，於9000 rpm離心3分鐘，在750 nm的波長下測量樣品吸光值，使用沒食子酸(gallic acid)作為標準品以0至0.2 mg/mL的濃度範圍建立標準曲線(參考第3-3圖)，以沒食子酸當量(mg/g)來表示萃取物乾燥後的總酚含量，並在操作的時候進行三重複的動作。

藉由上述分析方法，50L米發酵物之多醣、蛋白質及總酚含量如表4所示，Rice、AOW-D2、AOW-LWS- D50D2,3之多醣含量分別為92.07±2.41、619.42±4.41、539.68±4.07 mg/g；Rice、AOW-D2、AOW-LWS-D50D2,3之蛋白質含量分別為3.31±0.67、56.21±4.15、55.01±3.45 mg/g；Rice、AOW-D2、AOW-LWS-D50D2,3之總酚含量分別為0.1148±0.0174、1.919±0.1674、2.5214±0.2271 mg/g，由表4中可看出經二階段發酵後，米發酵物之多醣、蛋白質及總酚含量均明顯較未發酵前高出許多，尤以二階段發酵後，總酚含量明顯提高。 表4

實施例5

抗氧化功能性試驗(DPPH自由基、ABTS自由基及FRAP(Ferric Reducing Antioxidant Power，鐵降低抗氧化能力))：DPPH自由基清除試驗係將3 mL DPPH溶液和1.5 mL不同濃度的萃取物混合，並在37℃下反應30分鐘，反應後，以9000 rpm離心，在517 nm波長下用空白組清除背景值並測定混合物的吸光值，透過以下公式計算DPPH自由基清除活性，其中Ae和Ac分別為萃取物和對照組的吸光值，以1%BHT作為標準品，並在操作的時候進行三重複的動作；ABTS清除活性試驗係將ABTS水溶液和過硫酸鉀溶液均勻混合且於室溫下避光反應24小時，之後將水溶液稀釋至735 nm波長處之吸光值為1±0.05備用，取3 mL的ABTS ⁺自由基實驗標準混合液與3 mL 樣品反應，在735 nm波長下測量吸光值，以1%抗壞血酸(Vit C)作為標準品，並在操作的時候進行三重複的動作；FRAP試驗係將FRAP試劑(含300 mM醋酸緩衝溶液、10 mM 2,4,6-三吡啶基-s-三嗪(2,4,6-tripyridyl-s-triazine, TPTZ)及20 mM FeCl ₃‧6H ₂O)置於37℃預熱，再將0.2 mL樣品與0.8 mL試劑混合均勻，在37℃下反應10分鐘，使用分光光度計在波長為593 nm測量吸光值，以FeSO ₄‧7H ₂O作為標準品並建立標準曲線，結果以μM(FeSO ₄)/mL表示，並在操作的時候進行三重複的動作。

第4-1圖係50L米發酵物之DPPH自由基清除能力分析，Rice、AOW-D2、AOW-LWS-D50D2,3之DPPH清除率分別為3.8413±0.3874%、77.7041±0.8134%、82.1611±2.9256%；第4-2圖係50L米發酵物之ABTS自由基清除活性分析，Rice、AOW-D2、AOW-LWS-D50D2,3之ABTS清除活性分別為7.4701±1.9754%、33.1673±1.645%、81.9925±0.9189%；第4-3圖係50L米發酵物之FRAP試驗分析，Rice、AOW-D2、AOW-LWS-D50D2,3在濃度為1000 mg/mL時，FRAP值分別為0.158±0.005、1.066±0.028、1.58±0.029 μM/mL；由第4-1圖至第4-3圖中可看出，經二階段發酵後，米發酵物之DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除活性及FRAP值明顯提高，抗氧化能力大幅增加。

實施例6

美白試驗(體外抑制酪胺酸酶活性分析-以L-Dopa、Tyrosine為基質)：酪胺酸酶在黑色素合成中，扮演者重要的催化角色，因此如果能抑制此酶之作用即可延緩黑色素之生成，進而產生美白的效果。

將米發酵萃取液分別加入至試管中，加入200 mM pH 6.8磷酸緩衝溶液及0.25 mg/mL L-dopa基質(或Tyrosine基質)溶液並震盪混合10分鐘後，於60秒內加入50 U/mL酪胺酸酶，立即以分光光度計(OD ₄₇₅)下測吸光值，反應25分鐘後再一次以分光光度計(OD ₄₇₅)下測吸光值。

第5-1圖係50L米發酵物-以L-Dopa為基質之體外抑制酪胺酸酶能力分析，Rice、AOW-D2、AOW-LWS-D50D2,3之體外抑制酪胺酸酶能力分別為11.8487±1.6741、0、42.6877±1.9763%；第5-2圖係50L米發酵物-以Tyrosine為基質之體外抑制酪胺酸酶能力分析，Rice、AOW-D2、AOW-LWS-D50D2,3之體外抑制酪胺酸酶能力分別為5.8433±1.754%、56.8045±1.6736%、45.0867±2.8901%；由第5-1圖及第5-2圖中可看出，經二階段發酵後，米發酵物抑制酪胺酸酶之能力明顯提高，代表美白效果大幅增加。

實施例7

MTT細胞活性測定：透過細胞活性測定測試萃取物對JB6(老鼠表皮細胞)和CCD-966Sk(人類皮膚纖維母細胞)的細胞毒性作用，JB6和CCD-966Sk細胞購自食品工業研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center, BCRC)；將JB6和CCD-966Sk細胞以1×10 ⁵cells/well的密度接種在96-well上並培養24小時以利細胞貼附，接著在各well中分別加入不同製程之米發酵萃取物，在相同的條件下，將不含樣品的培養基作為對照組，分別於培養24和48小時後，使用PBS(Sigma-Aldrich, USA)洗滌細胞，並在各well中加入100 μL的MTT 5 mg/mL(Sigma-Aldrich, USA)，將well盤上覆蓋鋁箔並在37℃下再培養3小時；最後在每well中加入100 μL的DMSO並再振盪10分鐘以溶解有色的藍色晶體；使用微量盤式分析儀(Powerscan HT, Dainippon Pharmaceuticals USA Corporation, Marlborough, MA, USA)在波長為570 nm下測量吸光值，使用僅含有培養基、MTT和水的負對照組來校正吸光值，將負對照組細胞的吸光值設定為100%的細胞活性。

研究中蒐集的所有數據均來自每個條件的至少三次獨立實驗，使用SPSS19.0分析軟體進行統計學分析，所得之數據以平均值±標準偏差(SD)表示，細胞存活率分析以 One Way ANOVA進行統計分析，並以scheffe法進行顯著性比較，P ＜0.05者用*表示，P＜0.01者用**表示，其皆具有統計上的顯著差異性。

第6-1圖係50L米發酵物對JB6老鼠表皮細胞培養24與48小時之存活率分析，米發酵物在不同製程條件下(Rice、AOW-D2、AOW-LWS-D50D2,3)與JB6細胞培養24 hr後，與控制組(未添加任何樣品者)相比，其細胞存活率分別為119.24%、71.16%、107.96%，細胞存活率皆高於控制組，而當不同製程條件下的米發酵物與JB6細胞培養48 hr後，細胞存活率分別為98.60%、70.95%和115.779%，其細胞存活率與控制組相近或高於控制組，代表萃取物對JB6老鼠表皮細胞無毒；第6-2圖係50L米發酵物對CCD-966Sk人類皮膚纖維母細胞培養24與48小時之存活率分析，米發酵物在不同製程條件下(Rice、AOW-D2、AOW-LWS-D50D2,3) )與 CCD-966Sk 細胞培養24 hr後，與控制組(未添加任何樣品者)相比，其細胞存活率分別為99.91%、76.08%和90.77%，AOW-LWS-D50L2,3對CCD-966Sk人類皮膚纖維母細胞具有細胞增生之效果，而當不同製程條件下的米發酵物與CCD-966Sk細胞培養48 hr後，細胞存活率分別為126.90%、73.70%和91.35%，其細胞存活率與控制組相近或高於控制組，代表萃取物對CCD-966Sk細胞無毒。

實施例8

肌膚水分分析(水分保濕及水分散失)：水分保濕係使用角質層水合儀(MoistureMeterSC，Delfin)進行分析，首先使用RO水清洗測試部位，30分鐘後測量水分保濕(AU)為A ₀，之後將樣品定量塗抹至測試部位，30 分鐘後再次測量水分保濕(AU)為A，水分保濕增加率由下列公式計算：AU(%)=(A-A ₀)/A ₀×100%；水分散失係使用經皮水分散失儀(VapoMeter，Delfin)進行分析，首先使用RO水清洗測試部位，30分鐘後測量水分散失(TEWL g/m²h)為B ₀，之後將樣品定量塗抹至測試部位，30分鐘後再次測量水分散失(TEWL g/m²h)為B，水分散失改善率由下列公式計算：TWEL(%) = (B ₀-B)/B ₀×100%。

第7-1圖係50L米發酵物之水分保濕增加率，Rice、AOW-D2、AOW-LWS-D50D2,3在濃度為1000 mg/mL時，其水分保濕增加率分別為10.34±0.23%、1.85±0.46%、28.13±0.26%；第7-2圖係50L米發酵物之水分散失改善率，Rice、AOW-D2、AOW-LWS-D50D2,3在濃度為1000 mg/mL時，其水分散失改善率分別為8.3±0.2%、2.33±0.11%、12.51±0.43%；由第7-1圖及第7-2圖中可看出，經二階段發酵後，米發酵物可使肌膚之水分保濕率提高，且水分散失率降低。

實施例9

DNA保護實驗：為了探討不同米發酵物的DNA保護能力，依據Jothy et al.,(2013)方法並些許修改，本試驗混合5 μL的各種米發酵萃取物、2.5 μL超螺旋質體yT&A(supercoiled, form I)，其濃度為150 ng/μL，與10 μL含有20 mM Tris-HCl緩衝液、30 mM 過氧化氫、100 μM 氯化鐵與100 μM 抗壞血酸配置成的芬頓試劑(Fenton reagent)，反應體積補至20 μL；抗氧化劑槲皮素(250 μg/mL Quercetin)作為探討不同米發酵的DNA保護能力之保護控制組；作為萃取用溶劑對照組，5 μL的米發酵物替換成無菌水；所有試劑混合於200 μL的PCR tube中，5 μL的各種米發酵物、2.5 μL質體yT&A與2.5 μL無菌水混合後靜置於室溫下預反應10分鐘，隨後加入10 μL芬頓試劑；反應的操作使用Veriti 96-Well Thermal Cycler機器控溫，試劑反應於37℃下30分鐘，反應完後，1 μL 6x loading dye與5 μL各反應物液體均勻混合，加入1% 瓊脂糖凝膠(agarose gel)中(含有safe dye染劑)，使用50 volts進行DNA電泳1小時，隨後用UV box 觀察與拍照；若有DNA保護效果，超螺旋質體yT&A之含量增加，反之，超螺旋質體yT&A之含量下降。

第8圖係50L米發酵物之DNA保護效果，而不同米發酵物組別如Rice、AOW-D2、AOW-LWS- D50D2,3有不同之抑制DNA傷害的效果；第9圖中，Lane 1為單純質體、Lane 2為質體與Fenton試劑組別、Lane 3為質體與Fenton試劑與250 µg/mL 槲皮素組別、Lane 4-8為不同米發酵物不同濃度與Fenton試劑共同處理組別；在同一濃度下之米發酵物DNA保護效果依序為AOW-LWS-D50D2,3＞AOW-D2＞Rice，由此可知，經二階段發酵後，米發酵物之DNA保護效果明顯提高。

由上述實施例之結果可知，以米作為基質，利用米麴菌 Aspergillus oryzaeJC01-Wu(寄存編號BCRC930223)以及酵母菌 Saccharomyces cerevisiaeJC02-Wu(寄存編號BCRC920124)進行二階段發酵，可獲得具有高GABA含量、高抗氧化能力及高DNA保護能力，且對細胞無毒性之米發酵物。

雖然本發明已藉由實施例說明，但就各種形式及細節變化，一般對此領域之通常知識者而言係顯而易見，其均未脫離本發明申請專利範圍之定義及範圍；此外，依據本發明的教導可以作許多修改，以適合特定情況或材料，而不偏離本發明實質範圍。因此，本發明不局限於實施本發明的最佳模式之特定示例性實施方式，而是本發明將包括落入所附申請專利範圍內的所有實施方式。

無

第1圖係米發酵物之製備流程及其成分與活性分析流程圖； 第2-1圖係使用MEGA-X中的Neighbor-Joining推斷米麴菌的親緣關係圖； 第2-2圖係使用MEGA-X中的Neighbor-Joining推斷酵母菌的親緣關係圖； 第3-1圖係多醣之檢量標準曲線圖； 第3-2圖係蛋白質之檢量標準曲線圖； 第3-3圖係總酚之檢量標準曲線圖； 第4-1圖係50L米發酵物之DPPH自由基清除能力分析圖； 第4-2圖係50L米發酵物之ABTS自由基清除活性分析圖； 第4-3圖係50L米發酵物之FRAP試驗分析圖； 第5-1圖係50L米發酵物-以L-Dopa為基質之體外抑制酪胺酸酶能力分析圖； 第5-2圖係50L米發酵物-以Tyrosine為基質之體外抑制酪胺酸酶能力分析圖； 第6-1圖係50L米發酵物對JB6老鼠表皮細胞培養24與48小時之存活率分析圖； 第6-2圖係50L米發酵物對CCD-966Sk人類皮膚纖維母細胞培養24與48小時之存活率分析圖； 第7-1圖係50L米發酵物之水分保濕增加率示意圖； 第7-2圖係50L米發酵物之水分散失改善率示意圖； 第8圖係50L米發酵物之DNA保護效果示意圖。

國內寄存資訊(請依寄存機構、日期號碼順序註記)

主張利用生物材料1 寄存國家：TW中華民國 寄存機構：食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心 寄存日期：2020/09/22 寄存號碼：BCRC930223

主張利用生物材料2 寄存國家：TW中華民國 寄存機構：食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心 寄存日期：2020/11/05 寄存號碼：BCRC920124

Claims (10)

1. 一種米發酵物的製造方法，其包含： (A)     將米與水以高溫高壓滅菌釜蒸煮滅菌，製成熟白米備用； (B)     將米麴菌的菌液接種至熟白米中進行發酵，並靜置培養至熟白米些微出水； (C)     將酵母菌的菌液接種至步驟(B)中已些微出水之熟白米中，倒入無菌水搖晃均勻進行發酵，並靜置培養獲得米發酵物。
2. 如請求項1所述之米發酵物的製造方法，其中，該米與水比例為1：1至1：2；該滅菌條件為121℃、5至20分鐘。
3. 如請求項1所述之米發酵物的製造方法，其中，該米麴菌的菌液係將培養於PDA上之一米麴菌的孢子藉由含有0.01% Tween 80之蒸餾水收穫，以112孢子/mL製備工作孢子懸浮液；該酵母菌的菌液係取10%活化完成之一酵母菌的菌液擴大培養於NB上，並在30℃溫度條件下培養。
4. 如請求項1所述之米發酵物的製造方法，其中，步驟(B)中該米麴菌的菌液接種至熟白米中進行發酵，並靜置培養至第1至3天；步驟(C)中該酵母菌的菌液接種進行發酵，並靜置培養至第2至4天。
5. 如請求項1所述之米發酵物的製造方法，其中，該米麴菌為米麴菌 Aspergillus oryzaeJC01-Wu(寄存編號BCRC930223)，而該酵母菌為酵母菌 Saccharomyces cerevisiaeJC02-Wu(寄存編號BCRC920124)。
6. 如請求項1至5中之任一項所述之米發酵物的製造方法，其中，該米發酵物具有抗氧化、美白及DNA保護作用。
7. 一種以如請求項1至5中之任一項所述之米發酵物的製造方法所製成之米發酵物。
8. 如請求項7所述之米發酵物，其中，該米發酵物包含γ-胺基丁酸(GABA)、多醣化合物、蛋白質及酚類化合物。
9. 一種組合物，其包含如申請專利範圍第7項所述之米發酵物，該組合物具有抗氧化、美白及DNA保護作用。
10. 如請求項9所述之組合物，其係呈選自以下群組之一形式：化妝品組合物、皮膚保養組合物、醫藥組合物、飲料組合物、營養補充組合物、食用組合物以及保健食用組合物。

Images