TW202216165A

TW202216165A - 氧合膽固醇硫酸酯於治療胰島素抗性、糖尿病、及糖尿病前期中至少一者之用途

Info

Publication number: TW202216165A
Application number: TW110123459A
Authority: TW
Inventors: 順林任; 雅平王; 偉琦林; 詹姆士布朗; 泰倫斯布萊斯克
Original assignee: 美商杜瑞克公司; 維吉尼亞聯邦大學; 美國政府退伍軍人事務部
Priority date: 2020-06-26
Filing date: 2021-06-25
Publication date: 2022-05-01
Also published as: EP4171503A4; JP2023532866A; CA3187346A1; US20230372361A1; EP4171504A1; WO2021263186A1; WO2021263180A1; US20230293551A1; JP2023533685A; CA3187310A1; JP2023531735A; EP4171502A1; WO2021263177A1; EP4171503A1; US20230218639A1; TW202216163A; US20230233580A1; EP4171504A4; TW202216166A; CA3187337A1

Abstract

本揭示之態樣包括用於治療下列至少一者之方法：胰島素抗性、糖尿病、和糖尿病前期、及視需要地，還有非酒精性脂肪性肝炎(steatohepatitis)(NASH)。於實施本發明方法時，對個體投予有效量之至少一種選自下列的化合物：25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽。

Description

氧合膽固醇硫酸酯於治療胰島素抗性、糖尿病、及糖尿病前期中至少一者之用途

引言

長期以來，氧固醇據信為核受體之配體，諸如肝x受體(LXR) 且其在脂質穩態和免疫系統中發揮重要作用，其中它們同時涉及轉錄和轉錄後機制。氧固醇為膽固醇之氧化形式。在體內，固醇經酶促轉化成氧固醇係為了生物合成細胞、血液和組織中重要的生物產品，諸如類固醇激素、膽汁酸和維生素D。氧固醇參與許多生物過程，包括膽固醇穩態、三酸甘油酯代謝、發炎反應、細胞增殖、血小板聚集和細胞凋亡。氧固醇亦牽涉許多疾病，諸如代謝症候群和神經退化性疾病。氧固醇可藉由磺基轉移酶2B1b(SULT2B1b)在膽固醇之環A的位置3被硫酸化成氧固醇3-硫酸酯，包括5-膽固烯-3β-25-二醇-3-硫酸酯(25HC3S)、5-膽固烯-3β-24-二醇-3-硫酸酯(24HC3S)、5-膽固烯-3β-27-二醇-3-硫酸酯(27HC3S)以及Xol3S(膽固醇3-硫酸酯)。相關申請案之交叉引用

本申請案根據35 U.S.C§119(e)主張下列臨時申請案之優先權：2020年6月26日提交之美國臨時申請案63/044,631號、2020年12月18日提交之臨時申請案63/127,905號、2021年1月25日提交之臨時申請案63/141,382號、2021年2月5日提交之臨時申請案63/146,559號、2021年2月5日提交之臨時申請案63/146,563號、2021年2月5日提交之臨時申請案63/146,565號、2021年2月5日提交之臨時申請案63/146,566號、2021年2月5日提交之臨時申請案63/146,568號、2021年2月16日提交之臨時申請案63/149,977號、2021年2月16日提交之臨時申請案63/149,993號，其全文以引用方式被明確地併入本文。聯邦資助之研究和研發聲明

本發明有一部分係在退伍軍人事務部授予之VA Merit Review Grant(撥款編號1I01BX003656)的政府支持下完成。政府具有本發明之某些權利。

先前已表明膽固醇代謝物，5-膽固烯-3β-25-二醇-3-硫酸酯會減少脂質生物合成並增加膽固醇分泌和降解，且可能用於治療和預防高膽固醇血症、高三酸甘油酯血症和與脂肪堆積和發炎相關之病況(例如非酒精性脂肪肝(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性肝炎、急性腎損傷(AKI)、牛皮癬和動脈粥樣硬化)。氧固醇亦牽涉多種疾病，諸如代謝症候群。氧固醇可被硫酸化，且該硫酸化之氧固醇以不同方向作用：它們減少脂質生物合成、抑制發炎反應並促進細胞存活。

本揭示提供用於治療下列至少一者之方法：胰島素抗性、糖尿病、和糖尿病前期、及視需要地，還治療非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。如本文中更詳細討論者，25HC3S對胰島素抗性之影響的幅度令人驚訝。於實施本發明方法時，對個體投予有效量之至少一種選自下列的氧固醇活性劑化合物：25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽。

本揭示之態樣包括： 1. 一種治療有其需要之人類個體之胰島素抗性的方法，該方法包含對該個體口服投予1 mg/天至300 mg/天範圍之量的至少一種選自下列之化合物：25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽。 2. 一種治療有其需要之人類個體之胰島素抗性的方法，該方法包含對該個體口服投予1 mg/天至100 mg/天範圍之量的至少一種選自下列之化合物：25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽。 3. 如態樣1或2之方法，其中該人類個體患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。 4. 一種治療有其需要之人類個體之胰島素不足的方法，該方法包含對該個體口服投予1 mg/天至300 mg/天範圍之量的至少一種選自下列之化合物：25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽。 5. 一種治療有其需要之人類個體之胰島素不足的方法，該方法包含對該個體口服投予1 mg/天至100 mg/天範圍之量的至少一種選自下列之化合物：25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽。 6. 如態樣4或5之方法，其中該人類個體患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。 7. 一種治療有其需要之人類個體之糖尿病的方法，該方法包含對該個體口服投予1 mg/天至300 mg/天範圍之量的至少一種選自下列之化合物：25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽。 8. 一種治療有其需要之人類個體的糖尿病之方法，該方法包含對該個體口服投予1 mg/天至100 mg/天範圍之量的至少一種選自下列之化合物：25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽。 9. 如態樣7或8之方法，其中該人類個體患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。 10. 如態樣7或8之方法，其中該糖尿病為第I型糖尿病。 11. 如態樣7或8之方法，其中該糖尿病為第II型糖尿病。 12. 一種治療有其需要之人類個體的糖尿病前期之方法，該方法包含對該個體口服投予1 mg/天至300 mg/天範圍之量的至少一種選自下列之化合物：25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽。 13. 一種治療有其需要之人類個體的糖尿病前期之方法，該方法包含對該個體口服投予1 mg/天至100 mg/天範圍之量的至少一種選自下列之化合物：25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽。 14. 如態樣12或13之方法，其中該人類個體患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。 15. 一種治療有其需要之人類個體的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及胰島素抗性、糖尿病、和糖尿病前期中至少一者之方法，該方法包含對該個體口服投予有效量之至少一種選自下列的化合物：25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽。 16. 如態樣1及3、4、6、7、9至12、14和15中任一項之方法，其中該口服投予包含以範圍在5 mg/天至200 mg/天之量口服投予至少一種化合物。 17. 如態樣1至16中任一項之方法，其中該口服投予包含以範圍在5 mg/天至90 mg/天之量口服投予至少一種化合物。 18. 如態樣1至16中任一項之方法，其中該口服投予包含以範圍在10 mg/天至80 mg/天之量口服投予至少一種化合物。 19. 如態樣1至16中任一項之方法，其中該口服投予包含以範圍在30 mg/天至70 mg/天之量口服投予至少一種化合物。 20. 如態樣1至19中任一項之方法，其中對該個體口服投予之至少一種化合物的每kg總量係在0.1 mg/kg/天至10 mg/kg/天之範圍內。 21. 如態樣1至19中任一項之方法，其中對該個體口服投予之至少一種化合物的每kg總量係在0.1 mg/kg/天至5 mg/kg/天之範圍內 22. 如態樣21之方法，其中該每kg總量係在0.2 mg/kg/天至4 mg/kg/天之範圍。 23. 如態樣21之方法，其中該每kg總量係在0.3 mg/kg/天至3 mg/kg/天之範圍。 24. 如態樣21之方法，其中該每kg總量在0.4 mg/kg/天至2 mg/kg/天之範圍。 25. 如態樣1至24中任一項之方法，其中該口服投予包含口服投予該至少一種化合物之多種劑量。 26. 如態樣25之方法，其中該劑量係以範圍在每週一次至一天3次之頻率口服投予。 27. 如態樣25之方法，其中該劑量係每天一次口服投予。 28. 如態樣25之方法，其中該劑量係每天2次口服投予。 29. 如態樣25至28中任一項之方法，其中該口服投予包含口服投予至少7天，諸如至少14天、至少28天、至少3個月、至少6個月、或至少1年的給藥期間。 30. 如態樣1至29中任一項之方法，其中該至少一種化合物係以包含該至少一種化合物和醫藥上可接受之載劑的調配物口服投予。 31. 如態樣1至30中任一項之方法，其中該至少一種化合物包含鹽，諸如25HC3S之鹽。 32 如態樣31之方法，其中該鹽為鈉鹽。 33. 如態樣1至32中任一項之方法，其中該人類個體在治療前具有至少5%之磁共振成像-質子密度脂肪分數(MRI-PDFF)。 34. 如態樣1至33中任一項之方法，其中該人類個體在治療前具有≥2.75 kPa之磁共振彈性影像(elastography) (MRE)。 35. 如態樣1至34中任一項之方法，其中該個體顯現出投予後該至少一種化合物在血漿中之半衰期(T _1/2)係在約1小時至約5小時、或約1.5小時至約4小時之範圍。 36. 如態樣1至35中任一項之方法，其中該個體顯現出該至少一種化合物之Cmax係在約25 ng/mL至約4000 ng/mL、約25 ng/mL至約200 ng/mL、約50 ng/mL至約150 ng/mL、約75 ng/mL至約125 ng/mL、約300 ng/mL至約1500 ng/mL、約400 ng/mL至約1250 ng/mL、或約500 ng/mL至約1000 ng/mL之範圍。 37. 如態樣1至36中任一項之方法，其中該個體顯現出在每100mg的口服投予之至少一種化合物，該至少一種化合物之Cmax係在約100 ng/mL至約300 ng/mL、約120 ng/mL至約250 ng/mL、約150 ng/mL至約200 ng/mL、約100 ng/mL至約300 ng/mL、約120 ng/mL至約250 ng/mL、或約150 ng/mL至約200 ng/mL之範圍。 38. 如態樣1至37中任一項之方法，其中該個體顯現出該至少一種化合物之AUCinf係在約300 ng*h/mL至約1000 ng*h/mL、約400 ng*h/mL至約900 ng*h/mL、約500 ng* h/mL至約800 ng*h/mL、約2700 ng*h/mL至約9000 ng*h/mL、約3000 ng*h/mL至約8000 ng*h/mL、或約3500 ng*h/mL至約7000 ng*h/mL之範圍。 39. 如態樣1至38中任一項之方法，其中該個體顯現出在每100mg的口服投予之至少一種化合物，該至少一種化合物之AUCinf係在約600 ng*h/mL至約1000 ng*h/mL、約700 ng*h/mL至約900 ng*h/mL、或約800 ng *h/mL至約900 ng*h/mL之範圍。 40. 如態樣1至39中任一項之方法，其中該個體顯現出該至少一種化合物之擬分佈體積(Vz/F)係在約300 L至約1000 L、約400 L至約900 L、或約500 L至約800 L之範圍。 41. 如態樣1至40中任一項之方法，其中該個體顯現出該至少一種化合物之擬似清除率(CL/F)係在約100 L至約200 L/h、約110 L至約180 L/h、或約120 L至約160 L/h之範圍。 42. 如態樣1至41中任一項之方法，其中該個體正服用降脂藥物，諸如下列至少一者：斯他汀類、非諾貝特(fenofibrate)、ω-3脂肪酸、二十碳五烯酸乙酯(icosapent ethyl)和魚油，或進一步包含投予降脂藥物，諸如下列至少一者：斯他汀類、非諾貝特、ω-3脂肪酸、二十碳五烯酸乙酯和魚油。 43. 如態樣1至42中任一項之方法，其中該個體正服用下列至少一者：胰島素、格列酮(glitazone)、GLP-1、升糖素(glucagon)、DDP-4抑制劑、阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)和辛伐他汀(simvastatin)，或進一步包含對該個體投予下列至少一者：阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。 44. 如態樣1至43中任一項之方法，其中該人類個體在治療前具有≥200 mg/dL之三酸甘油酯。 45. 至少一種選自25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽之化合物，其係用於治療有其需要之人類個體中下列至少一者之方法中：胰島素抗性、糖尿病、糖尿病前期、及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，其中該方法如態樣1至44中任一項所定義者。 46. 至少一種選自25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽之化合物，其係用於治療有其需要之人類個體中下列至少一者之方法中：胰島素抗性、糖尿病、糖尿病前期、及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，該人類個體在治療前具有≥200 mg/dL之三酸甘油酯，其中該方法如態樣1至44中任一項所定義者。 47. 至少一種選自25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽之化合物於製造藥物之方法中的用途，該藥物係用於治療有其需要之人類個體中下列至少一者之方法中：胰島素抗性、糖尿病、糖尿病前期、及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，其中該方法如態樣1至44中任一項所定義者。 48. 至少一種選自25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽之化合物於製備藥物之方法中的用途，該藥物係用於治療有其需要之人類個體中下列至少一者之方法中：胰島素抗性、糖尿病、糖尿病前期、及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，該人類個體在治療前具有≥200 mg/dL之三酸甘油酯，其中該方法如態樣1至44中任一項所定義者。 49. 至少一種選自25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽之化合物，其係用於治療有其需要之人類個體中下列至少一者之方法中：胰島素抗性、糖尿病、糖尿病前期、及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，其中該人類個體接受斯他汀類療法。 50. 至少一種選自25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽之化合物，其係用於如態樣49之用途，其中該斯他汀類療法包含投予下列至少一者：阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。 51. 至少一種選自25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽之化合物，其係用於如態樣49或50之用途，其中該方法如態樣1至44中任一項所定義者，且視需要地，其中該人類個體在治療前具有≥ 200 mg/dL之三酸甘油酯。 52. 至少一種選自25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽之化合物，其係用於治療人類個體中下列至少一者之方法中：胰島素抗性、糖尿病、糖尿病前期、和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，該方法係藉由共同投予至少一種斯他汀類進行，視需要地，其中該至少一種斯他汀類包含阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。 53. 至少一種選自25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽之化合物，其係用於如態樣52之用途，其中該人類個體在開始該方法之前為接受斯他汀類療法之個體，且視需要地，其中該斯他汀類療法包含投予與該方法中與25HC3S或其鹽共同投予之相同斯他汀或斯他汀類。 54. 至少一種選自25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽之化合物，其係用於如態樣52或53 之用途，其中該方法如態樣1至44中任一項所定義者，且視需要地，其中該人類個體在治療前具有≥200 mg/dL之三酸甘油酯。 55. 至少一種選自25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽之化合物於製備藥物之方法中的用途，該藥物係用於治療有其需要之人類個體中下列至少一者之方法中：胰島素抗性、糖尿病、糖尿病前期、及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，其中該人類個體正接受斯他汀類療法。 56. 如態樣55之用途，其中該斯他汀類療法包含投予下列至少一者：阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。 57. 如態樣55或56之用途，其中該治療方法為如態樣1至44中任一項所定義之方法，且視需要地，其中該人類個體在治療前具有≥200 mg/dL之三酸甘油酯。 58. 至少一種選自25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽之化合物於製備藥物之方法中的用途，該藥物係用於治療有其需要之人類個體中下列至少一者之方法中：胰島素抗性、糖尿病、糖尿病前期、及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，該方法係藉由共同投予至少一種斯他汀類進行，視需要地，其中該至少一種斯他汀類包含下列至少一者：阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。 59. 如態樣58之用途，其中該人類個體在開始該方法之前為接受斯他汀類療法之個體，且視需要地，其中該斯他汀類療法包含投予與該方法中與25HC3S或其鹽共同投予之相同斯他汀或斯他汀類。 60. 如態樣58或59之用途，其中該治療方法為如態樣1至44中任一項所定義之方法，且視需要地，其中該人類個體在治療前具有≥200 mg/dL之三酸甘油酯。 61. 至少一種選自25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽之化合物，其係用於如態樣1至44中任一項所定義之方法中。 62. 至少一種選自25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽之化合物，其係用於製備藥物之方法中，該藥物係用於如態樣1至44中任一項所定義之方法中。

本揭示提供用於治療下列至少一者之方法：胰島素抗性、糖尿病、和糖尿病前期、及視需要地，還治療非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

於實施本發明方法時，對個體(例如人類個體)投予一或多種選自下列之氧固醇活性劑化合物：25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯(24,25-EC3S)、或其鹽。如本文所描述者，化合物25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)係指具有下列化學結構之化合物：

化合物25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)係指具有下列化學結構之化合物：

化合物27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)係指具有下列化學結構之化合物：

化合物27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)係指具有下列化學結構之化合物：

化合物24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)係指具有下列化學結構之化合物：

化合物24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)係指具有下列化學結構之化合物：

化合物24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯 (25HC3S)係指具有下列化學結構之化合物：

根據某些實例，氧固醇可藉由磺基轉移酶2B1b(SULT2B1b)在膽固醇之環A的位置3被硫酸化成氧固醇3-硫酸酯類，包括如第6圖中概述之25HC3S、24HC3S、27HC3S、以及Xol3S(膽固醇-3-硫酸酯)。該氧固醇硫酸酯可藉由磺基轉移酶2A1(SULT2A1)進一步被硫酸化為氧固醇二硫酸酯。例如，25-羥基膽固醇 3-硫酸酯(25HC3S)可藉由SULT2A1被進一步硫酸化成5-膽固烯-3β,25-二醇-二硫酸酯(25HCDS)。25HC3S和25HCDS為體內已被鑑定出之肝細胞核中唯一的氧固醇硫酸酯，而27HC3S係在人血清中且24HC3S係在尿液中。25HC3S和25HCDS亦為強效調控劑，但以與其前體25HC不同之方向發揮功能。

膽固醇可在線粒體中被CYP27A1羥基化為25HC或27HC，及在內質網中被CYP3A4、或被膽固醇25-羥化酶(CH25HL)羥基化為25HC。膽固醇亦可在腦組織中被膽固醇24-羥基酶羥基化為24HC。此膽固醇前體亦可用於經由甲羥戊酸(mevalonate)途徑之分流合成鏈固醇(desmosterol)。鏈固醇可藉由CYP46A1氧合以形成24,25-環氧基膽固醇(24,25EC)。25HC、27HC、24HC和膽固醇可隨後被SULT2B1b在3β-位置處硫酸化以分別形成25HC3S、27HC3S、24HC3S和Xol3S。24,25EC可被硫酸化為24,25EC3S。

不受理論之束縛，25HC和25HC3S在整體調控中之功能表明它們為表觀遺傳調控子。DNA啟動子區中之胞嘧啶的位置5處之甲基化(5-甲基胞嘧啶， ^5mC)為調節基因表現和基因體之其他功能的重要表觀遺傳修飾。啟動子區中CpG之胞嘧啶甲基化與相關基因之轉錄活性呈負相關，因其導致染色質凝聚和基因靜默。CpG甲基化和基因表現之失調影響代謝、組織功能和代謝狀態。胞嘧啶甲基化係由DNA甲基轉移酶(DNMT-1、3a/3b)催化，在一些情況下，其在DNA甲基化/去甲基化之調控中起作用。25HC和25HC3S為DNA甲基轉移酶-1(DNMT-1)之配體。在一些情況下，本文描述之氧固醇活性劑化合物為細胞調控分子，其經由DNA CpG甲基化和 ^5mCpG去甲基化而在表觀遺傳上調控脂質代謝、細胞存活/死亡和發炎反應。在一些情況下，高葡萄糖培育經由增加核25HC量來增加啟動子區中之CpG甲基化，這會使參與PI3K-Akt、cAMP、NAFLD、第II型糖尿病和胰島素分泌訊號傳導途徑之關鍵基因的表現靜默。在某些情況下，本文揭示之氧固醇活性劑化合物(例如25HC3S)將這些啟動子中之 ^5mCpG去甲基化，增加基因表現，並上調這些訊號傳導途徑。在一些情況下，該氧固醇活性劑化合物以與前體25HC相反之方向調控該訊號傳導途徑。在一些情況下，該一或多種氧固醇活性劑化合物調控細胞訊號傳導途徑以回應刺激反應。在某些情況下，該一或多個氧固醇活性劑化合物影響調控細胞功能之蛋白質磷酸化、肌醇磷酸化和神經鞘胺醇磷酸化。在某些情況下，該一或多種氧固醇活性劑化合物調控轉錄層級之基因表現。第7圖中描繪說明性機制。在某些情況下，該一或多種氧固醇活性劑化合物(例如25HC3S)藉由增加基因表現來減少脂質累積、抗發炎反應和抗細胞凋亡，基因表現之增加係透過將涉及MAPK-ERK和鈣-AMPK訊號傳導途徑之關鍵基因，諸如CREB5(CAMP反應元件結合蛋白5)、BAD(BCL2相關之細胞死亡促效劑)和ERK(有絲分裂原活之化蛋白激酶1)的啟動子區中之 ^5mCpG去甲基化來進行。

在一些情況下，本文中所使用之術語“治療”係指對人類個體投予至少一種選自下列之氧固醇活性劑化合物：25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS) 及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽，該人類個體：(1)已表現出至少一種胰島素抗性、糖尿病、和糖尿病前期、及視需要地，還有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)之症狀；及/或(2)被診斷為患有胰島素抗性、糖尿病、和糖尿病前期、及視需要地，還有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。在一些情況下，“治療”涉及減輕或減弱，或在一些情況下，徹底根除在投予至少一種選自25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽之氧固醇活性劑化合物之前或投予當時已存在之下列者的至少一種症狀：胰島素抗性、糖尿病、和糖尿病前期、及視需要地，還有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。在一些情況下，根據本揭示之治療足以改善該個體之臨床指標。在某些情況下，該個體之臨床指標改善使得該個體被認為不再患有胰島素抗性、糖尿病、和糖尿病前期、及視需要地，亦不再患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

在一些情況下，該個體為表現出患有第1型糖尿病之至少一種症狀的個體。在一些情況下，該個體被診斷為患有第1型糖尿病。在一些情況下，該個體為表現出患有第2型糖尿病之至少一種症狀的個體。在一些情況下，該個體被診斷為患有第2型糖尿病。在一些情況下，該個體為表現出具有妊娠糖尿病之至少一種症狀的個體。在一些情況下，該個體被診斷為患有妊娠糖尿病。在一些情況下，該個體為表現出具有糖尿病前期之至少一種症狀的個體。在一些情況下，該個體被診斷為患有糖尿病前期。在某些情況下，方法包括將該個體診斷為患有胰島素抗性、第1型糖尿病、第2型糖尿病、妊娠糖尿病或糖尿病前期。可藉由任何方便之臨床方案來診斷該個體，諸如藉由血糖分析、糖化血紅素(A1C)之分析或一些其他實驗室分析。

在一些情況下，該個體為表現出患有NASH之至少一種症狀，同時具有第1型糖尿病、第2型糖尿病、妊娠期糖尿病、或糖尿病前期之至少一種症狀的個體。在一些情況下，該個體為除了被診斷為患有第1型糖尿病、第2型糖尿病、妊娠期糖尿病、或糖尿病前期外，還被診斷為患有NASH之個體。

於實施本發明之方法中，對該個體投予有效量之至少一種選自下列之氧固醇活性劑化合物：25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽。在一些情況下，對該個體投予劑量為0.00001 mg/kg/天至500 mg/kg/天之氧固醇活性劑化合物，諸如0.00005 mg/kg/天至450 mg/kg/天，諸如0.0001 mg/kg/天至400 mg/kg/天，諸如0.0005 mg/kg/天至350 mg/kg/天，諸如0.001 mg/kg/天至300 mg/kg/天，諸如0.005 mg/kg/天至250 mg/kg/天，諸如0.01 mg/kg/天至200 mg/kg/天，諸如0.05 mg/kg/天至150 mg/kg/天，且包括0.001 mg/kg/天至100 mg/kg/天。在某些情況下，對該個體投予劑量為0.001 mg/kg/天至100 mg/kg/天之氧固醇活性劑化合物。在某些情況下，對該個體投予劑量為0.1 mg/kg/天至100 mg/kg/天、0.1 mg/kg/天至10 mg/kg/天、或0.1 mg/kg/天至5 mg/kg/天之氧固醇活性劑化合物。在某些情況下，對該個體投予劑量為1 mg/kg/天至100 mg/kg/天之氧固醇活性劑化合物。

在一些情況下，對該個人投予之該至少一種氧固醇活性劑化合物，諸如25-羥基-3-硫酸酯或25-羥基-3-硫酸鈉的各個每日劑量之量為0.5 mg至5 mg、5 mg至10 mg、10 mg至15 mg、15 mg至20 mg、20 mg至25 mg、20 mg至50 mg、25 mg至50 mg、50 mg至75 mg、50 mg至100 mg、75 mg至100 mg、100 mg至125 mg、125 mg至150 mg、150 mg至175 mg、175 mg至200 mg、200 mg至225 mg、225 mg至250 mg、250 mg至300 mg、300 mg至350 mg、350 mg至400 mg、400 mg至450 mg、或450 mg至500 mg、或1 mg至300 mg、或1 mg至100 mg。在一些情況下，以有效量(例如，單位劑型)對該個人投予之氧固醇活性劑化合物的量係在0.5 mg至500 mg之範圍，諸如1 mg至450 mg，諸如2 mg至400 mg，諸如5 mg至300 mg，諸如10 mg至200 mg，或諸如20 mg至100 mg。

可每天對該個體投予一次或更多次之該氧固醇活性劑化合物，諸如每天二次或更多次，諸如每天三次或更多次，且包括每天四次或更多次。例如，該氧固醇活性劑化合物可每天投予二次、每天投予一次、每隔一天投予一次、每三天投予一次、每週投予一次或每月投予一次。在一些情況下，每天對該個體投予一次該氧固醇活性劑化合物。在一些情況下，每天對該個體投予二次該氧固醇活性劑化合物。在一些情況下，在一個週期中每天對該個體投予一次或二次該氧固醇活性劑化合物，該週期持續之期間為1天至10天、1天至30天、7天至30天、7天至90天、10天至180天、或30天至1年、30天至5年、90天至5年、或1年至10年。在一些情況下，每天對該個體投予一次該氧固醇活性劑化合物並持續1天至30天，諸如每天一次並持續1天至28天、1天至21天、7天至14天。在一些情況下，每天對該個體投予二次該氧固醇活性劑化合物並持續1天至30天，諸如每天二次並持續1天至28天、1天至21天、7天至14天。在一些情況下，每天對該個體投予三次該氧固醇活性劑化合物並持續1天至30天，諸如每天三次並持續1天至28天、1天至21天、7天至14天。

在一些情況下，該用藥係在氧固醇活性劑化合物之投予週期中投予。在一些情況下，該週期為1天或更久，諸如2天或更久、諸如3天或更久、諸如4天或更久、諸如5天或更久、諸如6天或更久、諸如7天或更久、諸如14天或或更久、諸如21天或更久、諸如28天或更久，且在一些情況下，該週期為30天或更久。該藥物投予之週期可重複1、2、3、4、5、6、7、8、或超過8個用藥週期，總期間為6個月、1年、2年、3年、或4年以上。可在延長之期間內(諸如在維持療法期間)投予各醫藥組成物，諸如一個月至長達七年。在一些情況下，該氧固醇活性劑化合物可在約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30、36、48、60、72或84個月其中任一者之期間內投予。在其他情況下，該個體之餘生持續投予該氧固醇活性劑化合物。

該方法之實施通常涉及鑑定(例如診斷)罹患下列者或處於罹患下列者之風險的患者：胰島素抗性、糖尿病、或糖尿病前期、及視需要地，還有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。欲投予之確切劑量可能根據個別患者之年齡、性別、體重和整體健康狀況，以及該疾病之準確病因而變化。該劑量將隨著投予途徑、生物可利用度、和投予之特定調配物，以及根據接受預防或治療之疾病的性質而變化。此外，該有效劑量可根據，諸如該患者之性別、年齡、和其他病況，以及正接愛治療之疾病狀況的程度或進展等因素而變化。在一些情況下，該氧固醇活性劑化合物的每個劑量係在0.1小時至12小時之期間內投予個體(例如藉由靜脈內投予)，諸如在0.5小時至10小時，諸如1小時至8小時，且包括在2小時至6小時之期間內。

投予可為口服或經由腸胃道外，包括靜脈內、肌肉內、皮下、皮內注射、腹膜內注射，等，或藉由其他途徑(例如透皮、舌下、直腸和口腔遞送、吸入氣霧劑、陰道內、鼻內、局部(為眼藥水形式)、經由噴霧劑，等)。在某些情況下，該氧固醇活性劑化合物係藉由下列一或多者投予個體：口服投予、腸道投予、舌下投予、經皮投予、靜脈內投予、腹膜投予、腸胃道外投予、注射投予、皮下注射，和肌肉內注射。投予途徑將取決於正接受治療之疾病的性質或病況，例如取決於該疾病之類型或程度，和該治療是否為預防性或意圖治癒。此外，藉由任何方式投予該化合物時可以單一療法之模式進行，或與其他療法和治療模式，例如飲食方案，等聯合進行。

在一些情況下，該組成物之投予係根據影響該個體之疾病而與其他治療方式，諸如各種鎮痛藥劑、抗關節炎藥劑、化學治療藥劑、抗生素藥劑、抗神經退化藥劑、抗成癮藥劑、其他糖尿病藥劑，等聯合投予。“聯合”係指亦投予該一或多種另外之藥劑的單獨製劑，且亦指在本揭示之組成物中包含該一或多種另外之藥劑。

在一些情況下，本文描述之方法和組成物係在該個體正服用下列至少一者時投予：胰島素、吸入型胰島素、胰島素類似物、門冬胰島素(insulin aspart)、德谷胰島素(insulin degludec)、甘精胰島素(insulin glargine)、異芬胰島素(insulin isophane)、離脯胰島素(insulin lispro)、甲福明二甲雙胍(metformin)、格列酮(glitazone)、GLP-1、GLP-1類似物、艾塞那肽(exenatide)、利拉魯肽(liraglutide)、司美魯肽(semaglutide)、度拉糖肽(dulaglutide)、利西拉肽(lixisenatide)、GLP-1/升糖素促效劑、GLP-1/GCGR促效劑、FGF-21/GLP-1雙重促效劑、GIP/GLP-1雙重促效劑、GLP-1/GIP/升糖素三重促效劑、SGLT-2抑制劑、卡格列淨(canagliflozin)、達格列淨(dapagliflozin)、恩格列淨(empagliflozin)、艾托格列淨(ertugliflozin)、磺醯脲類、優降糖(glyburide)、格列吡嗪(glipizide)、格列美脲(glimepiride)、普蘭林肽(pramlinitide)、格列奈(glinide)類、瑞格列奈(repaglinide)、那格列奈(nateglinide)、噻唑烷二酮(thiazolidinedione)類、羅格列酮(rosiglitazone)、格列苯脲(glibenclamide)、吡格列酮(pioglitazone)、升糖素、DDP-4抑制劑、西他列汀(sitagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、利格列汀(linagliptin)、維格列汀(vildagliptin)、阿卡波糖(acarbose)、阿必魯泰(albiglutide)、阿格列汀(alogliptin)、甲磺酸溴隱亭(bromocriptine mesylate)、米格列醇(miglitol)、阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀，或進一步包含對該個體投予下列至少一者：阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、及辛伐他汀。在一些情況下，本文描述之方法和組成物係在該個體正服用降脂藥物時投予，諸如下列至少一者：斯他汀類、非諾貝特、ω-3脂肪酸、二十碳五烯酸乙酯和魚油，或進一步包含投予降脂藥，諸如下列至少一者：斯他汀類、非諾貝特、ω-3脂肪酸、二十碳五烯酸乙酯、及魚油。在一些情況下，本文描述之方法和組成物係在該個體正接受斯他汀類療法時投予。在一些情況下，短語“正服用”或“正接受”係指在該個體正根據本文描述之方法經歷氧合膽固醇硫酸酯之治療時對該個體投予這些補充治療方式。

該氧固醇活性劑化合物可以純的形式或以醫藥上可接受之調配物投予，該醫藥上可接受之調配物包括合適之酏劑、黏合劑，等(通常稱為“載劑”)，或可以醫藥上可接受之鹽(例如鹼金屬鹽類，諸如鈉、鉀、鈣、或鋰鹽、銨，等)或其他複合物形式投予。應理解的是，醫藥上可接受之調配物包括常規用於製備可注射之劑型和固體劑型(諸如片劑和膠囊劑)，以及霧化劑型之液體和固體材料。此外，該氧固醇活性劑化合物可與水基或油基載劑一起調配。可使用水作為載劑以用於製備組成物(例如可注射之組成物)，其亦可包括常規緩衝液和試劑以使該組成物成為等張性。其他可能之添加劑和其他材料(較佳為那些通常被認為是安全的[GRAS])包括：著色劑；調味劑；表面活性劑(吐溫®、油酸，等)；溶劑、安定劑、酏劑和黏合劑或封裝劑(乳糖、脂質體，等)。固體稀釋劑和賦形劑包括乳糖、澱粉、常規崩散劑、塗層，等。亦可使用防腐劑，諸如對羥基苯甲酸甲酯或氯化苯銨。根據該調配物，預期該活性組分(至少一種氧固醇活性劑)將佔該組成物之1%至99%，而該媒介之“載劑”將構成該組成物之1%至99%。本揭示之醫藥組成物可包括任何合適之醫藥上可接受的添加劑或佐劑，只要其不妨礙或干擾該至少一種氧固醇活性劑化合物之治療效果。可共同投予或共同調配之其他合適的作用劑亦包括其他作用劑，包括，但不限於：甲硫胺酸及/或麩胱甘肽生物合成途徑之代謝物，諸如S-腺苷升半胱胺酸(SAH)、S-甲基甲硫胺酸(SMM)、胱胺酸、甜菜鹼，等，或其各種形式及/或鹽，例如乙醯半胱胺酸(例如靜脈內N-乙醯半胱胺酸)、各種營養品，等。

醫藥組成物可包括一或多種醫藥上可接受之載劑。醫藥上可接受之賦形劑已在多種出版物中被充分描述，包括，例如A. Gennaro (2000)“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins；和Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc。例如，該一或多種賦形劑可包括蔗糖、澱粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纖維素、滑石、磷酸鈣、或碳酸鈣、黏合劑(例如纖維素、甲基纖維素、羥甲基纖維素、聚丙基吡咯啶酮、聚乙烯吡咯啶酮、明膠、阿拉伯膠、聚(乙二醇)、蔗糖、或澱粉)、崩散劑(例如澱粉、羧甲基纖維素、羥丙基澱粉、低取代之羥丙基纖維素、碳酸氫鈉、磷酸鈣、或檸檬酸鈣)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂、輕質無水矽酸、滑石、或月桂基硫酸鈉)、調味劑(例如檸檬酸、薄荷醇、甘胺酸、或橙粉)、防腐劑(例如苯甲酸鈉、亞硫酸氫鈉、對羥基苯甲酸甲酯、或對羥基苯甲酸丙酯)、安定劑(例如檸檬酸、檸檬酸鈉、或醋酸)、懸浮劑(例如甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、或硬脂酸鋁)、分散劑(例如羥丙基甲基纖維素)、稀釋劑(例如水)和基質蠟(例如可可脂、白凡士林、或聚乙二醇)。

在一些情況下，所欲之組成物包括水性緩衝液。合適之水性緩衝液包括，但不限於強度在5 mM至100 mM變化之醋酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽和磷酸鹽緩衝液。在一些情況下，該水性緩衝液包括提供等張溶液之試劑。該等試劑包括，但不限於氯化鈉；和糖類，例如甘露醇、右旋糖、蔗糖，等。在一些情況下，該水性緩衝液進一步包括非離子性表面活性劑，諸如聚山梨醇酯20或80。在一些情況下，所欲之組成物進一步包括防腐劑。合適之防腐劑包括，但不限於苯甲醇、苯酚、氯丁醇、氯化苯銨，等。在許多情況下，該組成物係儲存在約4℃下。亦可將調配物凍乾，在該情況下，它們通常包括冷凍保護劑，諸如蔗糖、海藻糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇，等。凍乾之調配物可長期儲存，即使在周圍溫度下。

在一些情況下，組成物包括其他添加劑，諸如乳糖、甘露醇、玉米澱粉、或馬鈴薯澱粉；加上黏合劑，諸如結晶型纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米澱粉、或明膠；加上崩散劑，諸如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、或羧甲基纖維素鈉；及潤滑劑，諸如滑石或硬脂酸鎂；且若需要時，加上稀釋劑、緩衝劑、潤濕劑、防腐劑、和調味劑。

當組成物被調配成供注射用時，該組成物可藉由將該氧固醇活性劑化合物溶解、懸浮、或乳化在水性或非水性溶劑(諸如植物油或其他類似油、合成之脂族酸甘油酯、較高脂族酸之酯類、或丙二醇)中來調配；且若需要時，加上常規之添加劑，諸如增溶劑、等張劑、懸浮劑、乳化劑、安定劑和防腐劑。

在一些情況下，當對個體投予氧固醇活性劑化合物時，根據本揭示之方法係針對基於細胞反應來治療個體。在本揭示的一些實例中，表觀遺傳修飾在調控和協調基因表現中起作用。DNA中之胞嘧啶的位置5處甲基化(5-甲基胞嘧啶，5mC)為重要之表觀遺傳修飾，其調控該基因體之其他功能中的基因表現。不受理論束縛，該啟動子區中之CpG的胞嘧啶甲基化與相關基因之轉錄活性呈負相關，因為其導致染色質凝聚，因而導致基因靜默。CpG甲基化和基因表現之失調會影響組織功能和代謝狀態。胞嘧啶甲基化係由DNA甲基轉移酶(DNMT-1、3a/3b)催化，該酶亦在DNA甲基化之調控中起作用。

主要之表觀遺傳調控包括DNA和組蛋白甲基化、去甲基化、乙醯化和去乙醯化。參與該過程之酶為DNA和組蛋白甲基轉移酶/去甲基酶，以及乙醯轉移酶/去乙醯酶。在一些情況下，投予一或多種氧固醇活性劑化合物足以作為下列一或多者之表觀遺傳調控劑：DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、GCN3(先天性巨型痣)、p300(組蛋白乙醯轉移酶)、Pcaf(KAT2B離胺酸乙醯轉移酶2B)、HDAC1(組蛋白去乙醯酶1)、HDAC2(組蛋白去乙醯酶2)、HDAC3(組蛋白去乙醯酶3)、HDAC6(組蛋白去乙醯酶6)、HDAC10(組蛋白去乙醯酶10)和KDM6B-JMJD3(離胺酸去甲基酶6B)，諸如其中25HC3S、27HC和27HC3S、或膽固醇(Xol)和膽固醇-3-硫酸酯(Xol3S)為下列一或多者之內源性配體：DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、GCN3(先天性巨型痣)、p300(組蛋白乙醯轉移酶)、Pcaf(KAT2B離胺酸乙醯轉移酶2B)、HDAC1(組蛋白去乙醯酶1)、HDAC2(組蛋白去乙醯酶2)、HDAC3(組蛋白去乙醯酶3)、HDAC6(組蛋白去乙醯酶6)、HDAC10(組蛋白去乙醯酶10)和KDM6B-JMJD3(離胺酸去甲基酶6B)。

不受理論束縛，在一些情況下，該一或多種經投予之氧固醇活性劑化合物抑制DNMT-1、3a和3b，其將啟動子區中之 ^5mCpG去甲基化、增加基因表現和上調主訊號傳導途徑，諸如MAPK、鈣、AMPK和CREB訊號傳導途徑。在某些情況下，該一或多種氧固醇活性劑化合物調控細胞核中轉錄層級之細胞訊號傳導途徑。在一些情況下，該一或多種氧固醇活性劑化合物係以足以影響調控細胞功能之蛋白質磷酸化、肌醇磷酸化及/或神經鞘胺醇磷酸化之量投予。

在一些情況下，對人肝細胞添加一或多種本發明之氧固醇活性劑化合物足以逆轉由HG誘導之甲基化、增加關鍵基因之啟動子區中低甲基化的CpG和增加靶向基因表現。不受理論束縛，在一些情況下，該氧固醇活性劑化合物將CpG去甲基化為其整體調控功能之機制：減少脂質累積、抗發炎反應、抗氧化劑及抗細胞死亡。

該DUSP家族為蛋白酪胺酸磷酸酶之子集，其中有多種可將有絲分裂原活化之蛋白激酶(MAPK)去磷酸化，因此被稱為MAPK磷酸酶。DUSP8(DUSP家族之獨特成員)在磷酸化介導之MAPK途徑的訊號轉導中發揮重要作用，該MAPK途徑調控各種人類疾病中對氧化壓力反應和細胞死亡訊號的反應。在一些情況下，投予一或多種氧固醇活性劑化合物足以將DUSP基因(包括DUSP8、DUSP1和DUSP7)及其下游基因CREB5、PRDX、BAD和ERK)之啟動子區中的 ^5mCpG去甲基化，並增加其表現。不受理論束縛，該從這些基因轉錄之蛋白質負責細胞存活和增殖。在某些情況下，該至少一種氧固醇活性劑化合物對促進細胞存活/增殖和減輕氧化壓力的效果係透過抑制DNMT和增加DUSP家族，尤其是DUSP8及其下游元件之表現發生。

在一些情況下，治療方法涉及調控至少一種選自下列之基因：ABCC4、AC005264.2、ADCY1、ADCY4、ADCY5、ADH6、ADRB、ADRB1、AFDN、AGTR1、AKAP12、AL671762.1、ALAD、ANKRD1、ANKRD43、ATF3、ATP1A3、BAD、BIRC3、C11orf96、CACNA1A、CACNA1C-AS1、CACNA1D、CACNA1H、CACNB2、CACNG8、CELSR2、CREB5、CTB-186G2.1、CXCL2、CYB5B、CYP24A1、CYP51A1、CYR61、DDIT3、DRD5P2、DUSP基因、DUSP8、DUSP1、DUSP7、CREB5、EDNRB、EDN1、EHHADH、ELOVL6、ERK、FABP1、FDFT1、FRMD3、FMC1、FSTL3、GABBR1、GABBR2、GADD45B、GIPR、GLI3、GNA11、GNAQ、GNAS、GRIN2A、GRIN2C、GRIN3B、HBEGF、HMGCR、HMGCS1、HRAS、HRH1、HSPA6、ICAM1、ID3、ID4、IDI1、IL8、IL11、ITPKB、KANK4、KLB、KLF5、KLLN、KRTAP3-1、MAP2K6、MAP4K1、MAP4K4、MAPK1、MAPK8、MAT1A、MAX、METTL7A、MVK、NAP1L5、NCMAP、NTF3、P2RY8、PAQR8、PAQR9、PCSK9、PDE4D、PDGFB、PLA2G12B、PLCD1、PLPPR1、PMAIP1、PNPLA3、POU2AF1、PPP1CB、PRDX、PRLR、PTCH1、RAB11FIP4、RALGPS1、RAPGEF2、RELA、RHOBTB1、ROCK2、SC4MOL、SCN1A、SEC16B、SERPINE1、SKIL、SLC8A3、SLCO2B1、SLCO4C1、SLC2A14、SOCS2、SORBS2、SPHK1、SPTLC3、SQLE、TAB3、TCIM、TGFB3、THBS1、TMEM170B、TNS1、TNFSF10、TUBB8、UBASH3B、VAV2、VAV3和ZNF385B。

在一些情況下，治療方法涉及調控至少一種選自下列之途徑：cAMP訊號轉導途徑、cGMP-PKG訊號傳導途徑、晝夜夾帶、麩胺酸能突觸、心肌細胞中之腎上腺素能訊號傳導、間隙連接、第II型糖尿病、內吞作用、鈣訊號傳導途徑、擴張型心肌病、血管平滑肌收縮、MAPK訊號傳導途徑、膽鹼能突觸、Rap1訊號傳導途徑、多巴胺能突觸、黏附連接(adherens junction)、致心律失常性右心室心肌病、癌症途徑、GnRH訊號傳導途徑、催產素訊號傳導途徑、癌症中之轉錄誤調節、雌激素訊號傳導途徑、胰島素分泌、逆行內生性大麻訊號傳導、長期憂鬱、結腸直腸癌、胰島素訊號傳導途徑、軸突導向、酗酒、血小板活化、安非他命成癮、單純皰疹病毒感染、緊密連接、甲狀腺激素訊號傳導途徑、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、notch訊號傳導途徑和背腹軸形成。 [ 實驗]

本發明將藉由下列實施例進一步說明。這些實施例為非限制性且不限制本發明之範圍。除非另有說明，實施例中呈現之所有百分比、份數等均按重量計。提出下列實施例以對本技藝之一般技術人士提供如何製作和使用本發明的完整揭示內容和描述，且不意圖限制本發明者所認定之其發明範圍，亦不意圖代表下列實驗為全部或唯一進行的實驗。已努力確保所使用之數字(例如量、溫度，等)之準確性，但應考慮一些實驗誤差和偏差。除非另有說明，份數為按重量計之份數、分子量為重均分子量、溫度為攝氏溫度、壓力為大氣壓或接近大氣壓。“平均值”意指算術平均值。可以使用標準縮寫，例如bp，鹼基對；kb，千鹼基；pl，微微升；s或sec，秒；min，分鐘；h或hr，小時；aa，胺基酸；kb，千鹼基；bp，鹼基對；nt，核苷酸；im，肌肉內；ip，腹膜內；sc，皮下；等。 [ 實施例 1] 縮寫

25HC	25-羥基膽固醇
25HC3S	25-羥基膽固醇 3-硫酸酯
27HC	27-羥基膽固醇
27HC3S	27-羥基膽固醇 3-硫酸酯
^5mC	5-甲基胞嘧啶
BAD	BCL2相關之細胞死亡促效劑
CaV1	電位門控式鈣通道次單元α1D，CACNA1D
CaV2	電位門控式鈣通道次單元α1A，CACNA1A
CaV3	電位門控式鈣通道次單元α1H，CACNA1H
CREB	cAMP反應元件結合蛋白
DMEM	Eagle氏最小必需培養基
DMG	差異甲基化基因
DMR	差異甲基化區
DNMT	DNA甲基轉移酶
DUSP	雙特異性磷酸酶
FAS	脂肪酸合成酶
GCN3	先天性巨大型痣
HDAC1	組蛋白去乙醯酶 1
HDAC10	組蛋白去乙醯酶 10
HDAC2	組蛋白去乙醯酶 2
HDAC3	組蛋白去乙醯酶 3
HDAC6	組蛋白去乙醯酶 6
HG	高葡萄糖
HMGR	3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶
KDM6B-JMJD3	離胺酸去甲基酶 6B
KEGG	京都基因與基因體百科全書
LINE	長散布[胞]核元件
LPS	脂多醣
LXR	核肝氧固醇受體
MAPX	有絲分裂原活化之蛋白激酶
NAFLD	非酒精性脂肪肝病
NFκB	活化之B細胞的核因子κ-輕鏈增強子
p300	組蛋白乙醯轉移酶
Pcaf	KAT2B離胺酸乙醯轉移酶2B
PGC-1α	Pparg共活化子1α
PPARγ	過氧化物酶體增殖物活化受體
PRDX6	過氧化還原蛋白6
RT-PCR	逆轉錄聚合酶鏈反應
SREBP	固醇調控元件結合蛋白
WGBS	全基因體亞硫酸氫鹽定序
Xol	膽固醇
Xol3S	膽固醇 3-硫酸酯

材料和方法材料

自GIBCO BRL(紐約州Grand Island)購買細胞培養劑和補充品；自美國典型培養物保藏中心獲得Huh-7細胞(馬利蘭州Rockville)。用於即時RT-PCR之試劑係來自AB應用生物系統(Warrington，大英國協)。本研究中所使用之化學品係來自Sigma化學公司(密蘇里州聖路易斯)或Bio-Rad實驗室(加州Hercules)。除非另行指出，否則所有溶劑均購自Fisher(紐澤西州Fair Lawn)。 細胞培養

在37℃和5% CO ₂加濕之大氣下，將Huh-7和HepG-2細胞培養在補充有10%經熱滅活之胎牛血清(FBS)、高葡萄糖(HG，4.5 g/L)的DMEM培養基中。 萃取和測定 DNA 和 mRNA 量

將Huh-7 細胞在含有HG之DMEM培養基中培養72小時，再以25μM 25HC3S處理4小時後，使用QIAamp DNA迷你套組(QIAGEN，德國Hilden)從5,000個細胞中萃取基因體DNA。將2μg之各樣品送至EpigenDx公司(麻薩諸塞州霍普金頓市)進行整體甲基化亞硫酸氫鹽定序分析。將6μg之相同樣品送至Novogene有限公司(中國天津)進行全基因體亞硫酸氫鹽定序(WGBS)之分析。使用Promega SV總RNA單離系統(威斯康辛州麥迪遜市)，以DNA酶處理將全部RNA單離出。依製造商(Invitrogen，加州Carlsbad)之建議，使用2μg之各樣品來合成第一股cDNA。在ABI 7500快速實時PCR系統(應用生物系統，加州卡斯巴德)上使用SYBR Green作為指示劑來進行即時RT-PCR。使用擴增之β肌動蛋白或GAPDH作為內部對照。使用表1.1中所示之引子組，藉由比較性循環閾值(Ct)法定量相對信使RNA(mRNA)表現，並表示為2 ^-ΔΔCt。

固醇硫酸酯、 25HC3S 、 Xol3S 、 27HC3S 之化學合成和表徵

依前述，稍加修飾來合成5-膽固烯-3β,25-二醇3-硫酸酯(25-羥基膽固醇3-硫酸酯，25HC3S)；5-膽固烯-3β-醇,3-硫酸酯(膽固醇3-硫酸酯，Xol3S)；5-膽固烯-3β,27-二醇3-硫酸酯(27-羥基膽固醇3-硫酸酯，27HC3S)。簡單地說，將25-羥基膽固醇、膽固醇或27-羥基膽固醇(6.5mg，0.016mmol)和三乙胺-三氧化硫(3.5mg，0.019 mmol)之混合物溶解在無水吡啶(300μl)中，並在室溫下攪拌2小時。將溶劑在40℃，氮氣流下蒸發，並將漿液加入2 ml之50%乙腈(加載緩衝液)中。將產物施加至6cc Oasis柱體(Waters)上，該柱體已使用甲醇(15ml)和水(15ml)促發。依次使用加載緩衝液(15 ml)、水(15 ml)、甲醇(15 ml)、50%甲醇(15 ml)、在10%甲醇溶液中之5%氫氧化氨(15 ml)和在50%甲醇溶液(15 ml)中之5%氫氧化氨洗滌該柱體。以在80%甲醇(10 ml)中之5%氫氧化氨將保留之硫酸化固醇分別洗提出。以10倍體積之乙腈稀釋後，將溶劑在氮氣流下蒸乾，所得之固醇硫酸酯為白色粉末狀。 5- 膽固烯 -3β,25- 二醇 3- 硫酸酯之酶動力學研究

在DNMT1活性分析方面，使用在50 mM Tris-HCl，pH 7.5、50 mM NaCl、5 mM EDTA、5 mM DTT、1 mM PMSF、5%甘油、0.01% Brij35、1% DMSO中之受質溶液，0.001 mg/ml聚(dI-dC)：聚(dI-dC)。在DNMT3a/3b活性分析方面，使用在50 mM Tris-HCl，pH 7.5、50 mM NaCl、5 mM EDTA、5 mM DTT、1 mM PMSF、5%甘油、1% DMSO中之0.0075 mg/ml λDNA。將所指明之DNMT1、DNMT3a、或DNMT3b加入適當之受質溶液中並輕輕混合。藉由Acoustic技術(Echo550，LabCyte公司，加州桑尼維爾)將在1% DMSO中之含量在5.08E-09至0.0001 M範圍內的膽固醇(Xol)、25HC、27HC、Xol3S、25HC3S、或27HC3S加入反應混合物中。首先將該混合物溫育15分鐘，然後將 ³H-SAM加入該反應混合物中以起始反應，並將該混合物在30℃溫育60min。溫育後，最後將該反應混合物轉移至濾紙以供檢測放射性計數。 整體甲基化之分析，長散布核苷酸元件 1(LINE-1) 檢定

在整體DNA甲基化分析方面，使用EZ DNA甲基化套組(Zymo Research公司，加州)將500 ng之萃取的基因體DNA進行亞硫酸氫鹽處理。依製造商之方案(GE健康護理生命科學)進行PCR反應和產品純化。在PSQ96 HS系統上，按照製造商之說明書(Pyrosequencing，Qiagen)將10μl之PCR產物進行定序。使用QCpG軟體(Pyrosequencing ，Qiagen)，各CpG位點之甲基化狀態被個別確定為人工C/T SNP。各CpG位點之甲基化程度的計算為甲基化之等位基因除以所有甲基化和未甲基化等位基因之總和的百分比。該平均甲基化程度係使用各基因之標靶區內的所有測量之CpG位點的甲基化程度計算。各實驗包括非CpG胞嘧啶作為內部對照，以檢測該輸入之DNA的不完全亞硫酸氫鹽轉化。此外，各PCR分析中包括一系列未甲基化和甲基化之DNA來作為對照。此外，將未甲基化之對照DNA在體外與不同比例之甲基化DNA(0%、5%、10%、25%、50%、75%和100%)混合，再進行亞硫酸氫鹽修飾、PCR和Pyro-定序分析而進行PCR偏差測試。 全人類基因體亞硫酸氫鹽定序 (WGBS) 之分析

使用Covaris S220，藉由超音波將各樣品，摻入26 ngλDNA之5.2μg基因體DNA破碎成200-300 bp，再進行末端修復和腺苷酸化。按照製造商之說明，將胞嘧啶甲基化之條帶與經超音波處理之DNA連接。使用EZ DNA甲基化-Gold TM套組(Zymo Research)，以亞硫酸氫鹽處理該等DNA片段二次，再使用KAPA HiFi Hot Start Uracil and Ready Mix(2X)將所得之單股DNA片段進行PCR擴增。藉由Qubit® 2.0螢光計(Life Technologies，美國加州)和定量性PCR來定量集合庫濃度，並在Agilent Bioanalyzer 2100系統上檢定該插入片段之大小。

將集合庫製品在Illumina Hiseq 2500/4000或Novaseq平台上定序，並生成125 bp/150 bp雙端序列讀取(paired-end reads)。使用 Illumina CASAVA管線進行圖像分析和鹼基判定(base calling)。使用Trimmomatic (Trimmomatic-0.36)軟體來品質控制。使用Bismark軟體(0.16.3版；Krueger F，2011)來進行亞硫酸氫鹽處理之讀取與參考基因體(-X700--dovetail)的比對。使用DSS軟體(23)來鑑定差別甲基化之區域(DMRS)。使用KOBAS軟體來進行京都基因和基因體百科全書(KEGG)途徑中之DMR相關基因的富集統計檢定。 轉錄剖析和數據分析

使用SV總RNA分離系統(Promega，威斯康辛州Madison)從HepG-2細胞萃取和純化總RNA。依先前之描述，在上海生物技術公司之技術支持下，使用GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 Array，Affymetrix(Santa Clara，美國)製備和分析cDNA。本研究中之直接標靶基因的選擇係根據在二個樣品中減少超過2倍，且陣列檢測訊號超過5。選擇顯示出在至少一個樣品中倍數變化大於2且陣列檢測訊號大於7之基因作為差別表現基因。使用DAVID軟體(https://david.ncifcrf.gov/conversion.jsp)來分析差別表現基因之GO富集。結果 25- 羥基膽固醇 -3- 硫酸酯 (25HC3S) 特異地使 DNMT 失去活性

為了研究固醇硫酸酯對表觀遺傳調控標靶之效果，合成25HS3S、Xol3S和27HC3S(第1A圖)，並依第1B圖所示，使用三乙胺硫酸酯複合方法將其純化至95%以上之純度。結果顯示25HC3S僅顯著抑制DNMT-1、3a及3b活性，其IC ₅₀分別=4.04、3.03、和9.05×10 ^-6M(第1C圖，左圖)，而其前體25HC活化DNMT-1，使其活性提高8倍，其EC ₅₀=3.5×10 ^-6M(第1D圖，左圖)。作為對照組，Xol及Xol3S未顯著影響酶活性，儘管Xol3S稍微抑制DNMT3a，其IC ₅₀= 8.2×10 ^-5M，這很可能沒有生理意義(第1C圖，中圖)。如第1C圖，右圖所示，與25HC3S相比較，27HC3S確實抑制DNMT，其IC ₅₀類似，在DNMT1方面，IC ₅₀=3.58×10 ^-6M、在DNMT3a方面，IC ₅₀=8.88×10 ^-6M，而在DNMT3b方面，IC ₅₀=2.68×10 ^-6M。相反地，其前體27HC在活化DNMT-1方面之效力低得多，其EC ₅₀=3.3×10 ^-5M，且對其他酶無作用(第1D圖，右圖)。相對於該3種DNMT，其他9種表觀遺傳酶不會被該等氧固醇或固醇硫酸酯影響(未顯示數據)。如先前之報導，作為陽性對照組，1μM之S-腺苷升半胱胺酸(SAH)可抑制95%之DNMT1活性(數據未顯示)。結果證明25HC3S和27HC3S二者為有效之DNMT抑制劑。然而，體內僅在人肝細胞核中發現25HC3S：粒線體膽固醇遞送蛋白，StarD1過度表現後，首先發現之濃度為20μg/g(~40μM)。該動力學研究表明IC50係介於1至10μM之間。 25- 羥基膽固醇 -3- 硫酸酯 (25HC3S) 降低整體啟動子區中之 ^5m CpG 量

先前之研究已表明整體DNA甲基化和特定基因之甲基化涉及內臟脂肪組織中之脂肪生成、脂質代謝和發炎，此又與代謝症候群之特定病因有關。為了研究25HC3S對整體啟動子區中之 ^5mCpG甲基化狀態的效果，首先進行LINE-1分析以估計整體去甲基化。甲基化通常發生在重複元件中，諸如LINE元件。總人類基因體中約有500,000個LINE元件和7.5億個複本。人類LINE-1為逆轉位區(啟動子區)且僅具有700,000個複本，其與約17%之人類基因體相關。該特定序列包括四個CpG二核苷酸(Pos1、2、3、和4)，其作為LINE-1中之甲基化/去甲基化標靶。如第2A圖中所示，將Huh-7細胞培養在高葡萄糖培養基(HG)中，Pos3和Pos4具有較高之甲基化，而將細胞培養在乙醇對照組中後所有4個Pos甲基化增加。將細胞與25HC3S一起培育4小時後，Pos 1(-5%)、Pos 3(-10%)和Pos 4(-5.6%)發生甲基化減少(去甲基化)。結果表明，25HC3S顯著減少啟動子區中由HG或乙醇誘導之 ^5mCpG甲基化。經 25HC3S 處理之人肝細胞中全基因體 DNA 甲基化之剖析

為了了解經25HC3S處理之Huh-7細胞中 ^5mCpG去甲基化之可能的細胞功能，收穫該細胞以用於構建經亞硫酸氫鹽處理之基因體DNA集合庫。在總共5個WGBS中，藉由雙端定序分別從二個集合庫中產生3.66億(載劑)和3.7億(經25HC3S處理的)個原始序列讀取。在來自載劑集合庫之3.6億個清楚的序列讀取中，77%(2.77億)獨特映射至“人類參考基因體(hg38)”的參考基因體，而在來自經25HC3S處理之集合庫的3.65億個清楚的序列讀取中，78%(2.86億)獨特映射至參考基因體，顯示出10個平均序列讀取深度分別為22和20。在該二個集合庫中，超過80%之胞嘧啶殘基被“人類參考基因體(hg38)”中至少10個序列讀取涵蓋。該定序之深度和密度對高品質全基因體甲基化分析而言是足夠的。同時，亞硫酸氫鹽轉化成集合庫之效率(由λDNA代表)超過99%，為WGBS提供可靠和準確之結果(表1.2)。

CpG甲基化和去甲基化已被充分記錄為與基因表現有關。在CG之背景下共約有7,136個差別甲基化區(DMR)被鑑定為位於1,106個基因(差別甲基化之基因，DMG)中之低甲基化區域。在97%(1,074)之DMG中，該低甲基化區係在其啟動子中鑑定出(第2B圖)。該低甲基化基因高度富集在75條KEGG途徑中(p＜0.05)(表1.3)。前20條途徑(從最顯著者開始，p＜10 ^-9)顯示在第2E和2F圖中。在該等途徑中，MAPK-ERK和鈣-cAMP訊號傳導被認為是調控細胞存活、抗氧化劑、抗凋亡、能量代謝和脂質穩態的主要途徑。從全基因體鑑定出之途徑顯示於第2E圖中，而從啟動子區中鑑定出之途徑顯示於第2F圖中。來自全基因體或啟動子區之二組途徑非常相似。從啟動子區鑑定出之所有途徑均為低甲基化，其啟動子區中無任何高甲基化之CpG，表明基因表現被上調。

第2B圖中顯示全基因體和差別甲基化區(DMR)中之DNA甲基化程度。為了呈現該二個集合庫之整體DNA甲基化略圖，第2B圖中顯示在CG、CHG(H表示腺苷或胸苷殘基)和CHH之背景下，整個染色體之不均勻的甲基化程度。二個集合庫之間共篩選出6,923個差別甲基化基因(DMG)。再者，1,510個係在CG之背景下鑑定出，420個係在CHG之背景下鑑定出，且3,359個係在CHH之背景下鑑定出、83個係在CG和CHG之背景下鑑定出，481個係在CG和CHH之背景下鑑定出、793個係在CHG和CHH之背景下鑑定出、僅277個係在CG、CHG和CHH之背景下鑑定出。此外，被鑑定為啟動子區的有2,853個，1,413個係在CG之背景下鑑定出，186個係在CHG之背景下鑑定出，且787個係在CHH之背景下鑑定出。在該等DMG方面，59個係在CG和CHG之背景下鑑定出，46個係在CG和CHH之背景下鑑定出，260個係在CHG和CHH之背景下鑑定出，且僅103個係在CG、CHG和CHH之背景下鑑定出。而在該等DMG中，80.93%(5,603)被鑑定為低甲基化且在5個啟動子區中有37.55%(2,104)被鑑定為低甲基化(第2C圖)。表1.3-在CG之背景下，啟動子區中低甲基化之DMG顯著富集的KEGG途徑

途徑名稱	P 值	途徑名稱	P 值
cAMP訊號傳導途徑	3.69E-07	古柯鹼成癮	0.014096
cGMP-PKG訊號傳導途徑	2.65E-05	病毒致癌作用	0.01429
晝夜夾帶	5.68E-05	胰臟癌	0.015201
麩胺酸能突觸	8.40E-05	TRP通道之發炎介質調控	0.015802
心肌細胞中之腎上腺素能訊號傳導	0.000108	Hippo訊號傳導途徑	0.017014
間隙連接	0.000227	黑色素生成	0.017221
第II型糖尿病	0.000505	神經營養因子訊號傳導途徑	0.018561
內吞作用	0.000656	沙門氏菌感染	0.018615
鈣訊號傳導途徑	0.000656	蔡格司病(Chagas disease)(美洲錐蟲病)	0.01954
擴張型心肌病	0.000656	甲狀腺激素合成	0.021071
血管平滑肌收縮	0.000752	HTLV-I感染	0.021071
MAPK訊號傳導途徑	0.000877	前列腺癌	0.021071
膽鹼能突觸	0.001123	GABA能突觸	0.021665
Rap1訊號傳導途徑	0.001123	唾液分泌	0.021665
多巴胺能突觸	0.001194	細胞黏附分子 (CAM)	0.022648
黏附連接	0.001194	阿米巴病	0.023054
致心律失常性右心室心肌病	0.001203	病毒性心肌炎	0.024448
癌症之途徑	0.001203	第I型糖尿病	0.024448
GnRH訊號傳導途徑	0.001679	點狀黏著	0.024448
催產素訊號傳導途徑	0.002196	Ras訊號傳導途徑	0.024601
癌症中之轉錄誤調節	0.002515	果糖和甘露糖代謝	0.025877
雌激素訊號傳導途徑	0.002932	葉酸一碳庫	0.027147
胰島素分泌	0.003045	血清素能突觸	0.027147
逆行內生性大麻訊號傳導	0.003437	內分泌和其他因子調控之鈣重吸收	0.029495
長期憂鬱	0.003463	肥厚型心肌病(HCM)	0.034694
大腸直腸癌	0.004132	長期增強效應	0.036088
胰島素訊號傳導途徑	0.004549	卵巢類固醇生成	0.036088
軸突引導	0.005282	Wnt訊號傳導途徑	0.036088
酗酒	0.005377	子宮內膜癌	0.038405
血小板活化	0.006325	AMPK訊號傳導途徑	0.040972
安非他命成癮	0.006325	FcεRI訊號傳導途徑	0.041787
單純皰疹感染	0.006736	同種異體排斥	0.045211
緊密連接	0.007081	膽汁分泌	0.045703
甲狀腺激素訊號傳導途徑	0.007681	催乳素訊號傳導途徑	0.045703
急性骨髓性白血病	0.007681	趨化因子訊號傳導途徑	0.046416
慢性粒細胞白血病	0.008581	神經活性配體-受體交互作用	0.046416
Notch訊號傳導途徑	0.012054	FcγR介導之吞噬作用	0.047019
背腹軸形成	0.013526

先前報告已表明高葡萄糖培育(HG)(用於研究NAFLD之體外模型)經由增加DNA啟動子甲基化訊號傳導來誘導脂質累積。令人注意的是，啟動子區中由HG誘導之高甲基化 ^5mCpG係藉由25HC3S去甲基化。25HC3S將在MAPK訊號傳導途徑中之23個基因(表1.4)、鈣通道中之19個基因(表1.5)及cAMP途徑中之28個基因(表1.6)的啟動子區中之 ^5mCpG去甲基化。參與訊號傳導途徑之基因中未發現高甲基化之DMR。表中比較啟動子區中藉由HG高甲基化之 ^5mCpG和藉由25HC3S低甲基化之CpG的染色體和序列位置。據觀察，該等基因亦涉及許多其他KEGG途徑，包括胰島素、第II型糖尿病和cGMP-PKG訊號傳導途徑。結果表明，25HC3S之整體調控機制係透過參與MAPK-ERK和鈣-cAMP主訊號傳導途徑之關鍵基因(諸如DUSP和鈣通道家族)的啟動子區中之 ^5mCpG去甲基化。

DNA甲基化程度通常在基因體之不同功能區中顯示出不同的分佈。在載劑和25HC3S處理組之間，CGI(CG島)、CGI-岸(距CGI最多2k bp)、啟動子(轉錄起始位點之上游2k bp序列)、5'非轉譯區(UTR5)、外顯子、內含子、3'非轉譯區(UTR3)和重複序列中之甲基化程度係10個顯著不同之差異。有趣的是，25HC3S處理導致低甲基化程度係明顯高於載劑(第2D圖)。在總共34,508個之鑑定出的DMR中，3,676個(1,549個高甲基化及2,127個低甲基化的)分佈在CGI中、2206個(627個高甲基化及1,579個低甲基化的)分佈在CGI-岸、3,263個(1,213個高甲基化和2,050個低甲基化的)分佈在外顯子中、9,850個(2,340個高甲基化和15 7,510個低甲基化)分佈在內含子中、3,696個(1,187個高甲基化和2,509個低甲基化)分佈在啟動子中、8,956個(1,882個高甲基化和7,774個低甲基化)分佈在重複序列區中、61個(16個高甲基化和45個低甲基化)分佈在TES元件中、452個(179個高甲基化和273個低甲基化)分佈在TSS元件中、403個(123個高甲基化和280個低甲基化)分佈在UTR3區中且1245個(432個高甲基化和813個低甲基化)分佈在UTR5區中。在幾乎所有20個DMR中，CpG低甲基化程度明顯高於高甲基化程度。據報導，啟動子區中之CG甲基化在沉默基因表現中具有關鍵作用。

在總共6,923個DMG中，在CG之背景下，基因高度富集在120條KEGG途徑(69條低甲基化和51條高甲基化)中。在CHG之背景下，基因富集在48條途徑(33條低甲基化和15條高甲基化)中，在CHH之背景下，基因富集在136條(101條低甲基化和35條高甲基化)途徑中。啟動子區中之DMG高度富集在114條(31個高甲基化和83個低甲基化)途徑，在CG之背景下，基因富集在75條(0條高甲基化和75條低甲基化)途徑中，在CHG之背景下，基因富集在13條(13條高甲基化和0條低甲基化)途徑中，而在CHH之背景下，基因富集在26條(18條高甲基化和8條低甲基化)途徑中(表1.3)。

表1.4-將Huh-7細胞培養在具有HG之DMEM培養基中72小時後，再使用乙醇(載劑)和25μM 25HC3S處理4小時，使用QIAamp DNA迷你套組(QIAGEN，德國希爾登)從5,000個細胞萃取基因體DNA。使用6μg之各樣品進行全基因體亞硫酸氫鹽定序(WGBS)之分析。KEGG分析顯示去甲基化之基因參與MAPK訊號傳導途徑(p=0.00087)。在MAPK訊號傳導途徑中總共257個基因中，23個基因被25HC3S處理去甲基化。在這23個基因中，發現有10個基因被HG環境甲基化(以粗體顯示)。第一列代表基因名稱，第二列(啟動子區中之DMR位置)顯示染色體中差別甲基化區之位置，第三列(DMR(甲基化%))顯示由高糖(HG)誘導之甲基比率和由25HC3S誘導之去甲基比率。

表1.5-細胞製備和DNA甲基化如表1.1中之描述。KEGG分析顯示該去甲基化基因參與鈣訊號傳導途徑(P=0.00066)。在鈣訊號傳導途徑中之總共180個基因中，19個被25HC3S處理去甲基化。在該等19個基因中，發現有10個被HG環境甲基化(以粗體顯示)。第一列代表基因名稱，第二列(啟動子區中之DMR位置)顯示染色體中之差別甲基化區的位置，第三列(DMR(甲基化%))顯示由高糖(HG)誘導之甲基化比率和由25HC3S誘導之去甲基化比率。

表1.6-細胞製備方法和DNA甲基化如表1.1中之描述。KEGG分析顯示出該去甲基化之基因明顯參與cAMP訊號傳導途徑(P=3.69E-07)。在cAMP訊號傳導途徑中之總共200個基因中，28個被25HC3S處理去甲基化。在這28個基因中，發現有13個被HG環境甲基化(以粗體顯示)。第一列代表基因名稱，第二列(啟動子區中之DMR位置)顯示染色體中之差別甲基化區的位置，第三列(DMR(甲基化%))顯示由高糖(HG)誘導之甲基化比率和由25HC3S誘導之去甲基化比率。 啟動子區中之 ^5m CpG 去甲基化與基因表現之間的關係： 25HC3S 減少啟動子區中由 HG 誘導之 ^5m CpG 量

為了從KEGG途徑分析之結果探索啟動子 ^5mCpG去甲基化與基因表現之間的關係，藉由RT-PCR分析測定關鍵基因(DUSP7、8和MAPK1)及其靶基因CREB5、PRDX6和BAD在MAPK途徑中之表現，以及關鍵基因CACNA1D(CaV1)、CACNA1A(CaV2)和CACNA1H(CaV3) (編碼鈣電壓門控通道次單元)及其靶向基因(PGC1A、HMGR和FAS)在鈣-AMK途徑中之表現。DUSP-MAPK訊號傳導途徑為參與細胞存活/死亡和抗氧化之主要途徑，且鈣訊號傳導途徑控制脂質和能量代謝。如所預期者，25HC3S使DUSP8之表現增加5倍，使其靶向基因CREB5之表現增加高達20倍，其為參與細胞存活和死亡的關鍵元素(第3A和3B圖)。同時，25HC3S處理顯著增加參與鈣訊號傳導途徑之關鍵基因及其下游元件PGC1A之表現12倍，同時其降低HMGR和FAS基因之表現約90%，該HMGR和FAS基因編碼控制線粒體中之能量代謝、膽固醇生物合成和脂肪酸生物合成的關鍵酶，如第3C和3D圖所示。 肝細胞中之轉錄陣列分析

為了檢查25HC3S對人肝細胞中之全基因表現的效果，38,500全長基因和EST(表現之序列標籤)簇之人類基因體U133Aplus2.0 Genechip®陣列分析表明在HpG-2細胞中使用25HC3S處理可顯著調節許多基因簇表現。受影響之主要基因簇為參與膽固醇和三酸甘油酯代謝、細胞存活和發炎之基因。如第4圖所示，與膽固醇和三酸甘油酯生物合成相關之基因被顯著下調，而與細胞存活、增殖和抗氧化相關之基因被顯著上調。總之，25HC3S以時間依賴方式調節1,276個基因之轉錄(＞1.6倍)。不同GO過程(與特定之生物功能過程相關之基因的集合)之遺傳分析揭露在8小時時大多數上調之途徑涉及細胞存活(第4A和B圖)；相反地，大多數下調之基因涉及脂質代謝(第4C和D圖)。與抗凋亡相關之上調的基因(在8小時時增加3至12倍)列於第4E圖；與脂質代謝相關之下調的基因(下降50%至95%)列於第4F圖中。詳細之個別上調基因列於表1.7中；下調基因列於表1.8中。許多研究表明表觀遺傳修飾可整體調控參與重要細胞功能之基因表現，包括代謝、發炎和細胞死亡/增殖。我們的數據證明25HC3S經由啟動子區中之DNA ^5mCpG去甲基化在表觀遺傳上調控基因表現。表 1.7- 藉由 25HC3S 處理 Huh-7 細胞 8 小時之上調的基因列表。

基因符號	倍數變化	基因名稱或功能
IL8	11.91	介白素8
ANKRD1	8.67	錨蛋白重複序列結構域1
FSTL3	8.24	卵泡抑素樣蛋白3
CYR61	8.08	富含半胱胺酸之血管生成誘導因子61
EDN1	8.03	內皮素1
C11orf96	6.30	描述：11號染色體開讀框96
BIRC3	5.81	桿狀病毒含IAP重複序列3
IL11	5.53	介白素11
HBEGF	4.43	肝素結合EGF樣生長因子
CYP24A1	4.33	細胞色素P450家族24亞家族A成員1
SERPIN11	4.20	絲胺酸蛋白酶抑制劑(Serpin)家族E成員1
DDIT3	4.10	DNA損傷誘導性轉錄子3
ATF3	4.08	活化轉錄因子3
HSPA6	3.92	熱休克蛋白家族A(Hsp70)成員6
TNS1	3.89	張力蛋白(Tensin)1
DUSP1	3.88	雙特異性磷酸酶1
KLF5	3.88	Kruppel樣因子5
THBS1	3.82	血小板反應蛋白(thrombospondin) 1
SLC2A14	3.73	溶質載劑家族2成員14
PMAIP1	3.65	佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-醋酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate)誘導之蛋白1
CXCL2	3.63	趨化因子(C-X-C基序)配體2
KRTAP3-1	3.49	角蛋白相關蛋白3-1
SKIL	3.36	SKI樣原癌基因
AKAP12	3.30	A-激酶錨定蛋白12
TCIM	3.29	轉錄和免疫反應調控子
ICAM1	3.22	細胞間黏附分子1
GABBR1	3.20	γ-胺基丁酸B型受體次單元1
UBASH3B	3.15	含泛素相關和SH3結構域蛋白B
SOCS2	3.15	細胞因子訊號傳導抑制因子2
CREB5	3.12	cAMP反應元件結合蛋白5

表 1.8- 藉由 25HC3S 處理 8 小時之 Huh-7 細胞的下調基因列表。

基因符號	百分比變化 (%)	基因名稱或功能
SC4MOL	-81.12	甲基固醇單加氧酶1
SLCO4C1	-72.30	溶質載劑有機陰離子轉運蛋白家族成員4C1
HMGCR	-71.32	3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶
PNPLA3	-70.45	含Patatin樣磷脂酶結構域蛋白3
ANKRD43	-69.19	Sosondowah錨蛋白重複序列結構域家族成員A
HMGCS1	-67.71	3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A合成酶1
TUBB8	-67.29	微管蛋白β8第VIII類
IDI1	-66.48	異戊烯-二磷酸δ異構酶1
TNFSF10	-65.42	TNF超家族成員10
NCMAP	-65.26	非緻密髓鞘相關蛋白
RHOBTB1	-64.85	含Rho相關BTB結構域蛋白1
EHHADH	-64.46	烯醯-coa水合酶和3-羥醯coa脫氫酶
SQLE	-64.42	角鯊烯環氧化酶
PCSK9	-62.51	前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin第9型
KANK4	-61.28	KN基序和錨蛋白重複結構域4
SPTLC3	-60.32	絲胺酸棕櫚醯轉移酶長鏈鹼基次單元3
PAQR8	-60.05	孕激素和adipoq受體家族成員8
RALGPS1	-59.86	具有PH結構域和SH3結合基序1之Ral GEF
MAP2K6	-59.78	促分裂原活化之蛋白激酶激酶6
ZNF385B	-58.25	鋅指蛋白385B
PLPPR1	-57.91	磷脂磷酸酶相關蛋白1
SEC16B	-57.72	SEC16同源物B，內質網輸出因子
ID3	-57.51	DNA結合抑制劑3，HLH蛋白
VAV3	-57.09	Vav鳥嘌呤核苷酸交換因子3
KLLN	-56.31	Killin，p53調控之DNA複製抑制劑
SCN1A	-56.24	鈉電壓門控通道α次單元1
PLA2G12B	-56.10	磷脂酶A2 第XIIB組
FRMD3	-55.75	含FERM結構域蛋白3
ID4	-55.58	DNA結合抑制劑4，HLH蛋白
SLCO2B1	-55.27	溶質載劑有機陰離子轉運蛋白家族成員2B1
KLB	-54.22	克洛素(Klotho)β
FABP1	-54.20	脂肪酸結合蛋白1
SORBS2	-53.92	含山梨糖( Sorbin)和SH3結構域蛋白2
POU2AF1	-53.59	第2類POU同源框相關因子1
METTL7A	-53.26	甲基轉移酶樣7A
RAB11FIP4	-53.16	RAB11家族交互作用蛋白4
MAT1A	-53.04	甲硫胺酸腺苷轉移酶1A
CELSR2	-53.00	鈣黏蛋白EGF LAG七通G型受體2
AGTR1	-52.98	血管緊張素II受體第1型
ELOVL6	-52.72	ELOVL脂肪酸延長酶6
MVK	-52.63	甲羥戊酸激酶
CYB5B	-52.60	細胞色素b5 B型
CYP51A1	-52.40	細胞色素P450家族51亞族A成員1
FDFT1	-52.07	法呢基二磷酸法呢基轉移酶1
PRLR	-51.88	催乳素受體
ALAD	-51.76	胺基乙醯丙酸脫水酶
PAQR9	-51.51	孕激素和脂聯素(adipoq)受體家族成員9
FMC1	-51.27	線粒體複合物V組裝因子1同源物之形成
P2RY8	-50.91	P2Y受體家族成員8
TAB3	-50.37	TGF-β活化激酶1(MAP3K7)結合蛋白3
ADH6	-50.18	醇脫氫酶6(第V類)
NAP1L5	-50.17	核小體組裝蛋白1樣5
TMEM170B	-50.02	跨膜蛋白170B

鈣、AMPK和PPAR訊號傳導途徑為涉及能量、脂質和碳水化合物代謝之調節者。Ca ²⁺/鈣調蛋白(calmodulin)依賴性蛋白激酶(CaMKK)和AMPK訊號傳導途徑增加PGC-1α之表現並降低PGC-1α之乙醯化，其調控線粒體生物發生和脂質代謝。實施例1中所示之來自全基因體DNA甲基化(基因體層級)和人類基因體U133Aplus2.0 Genechip®之轉錄陣列(mRNA層級)分析的數據表明25HC3S處理明顯將包括鈣通道之關鍵基因及CaMKK和AMPK之基因的啟動子區中之 ^5mCpG去甲基化，增加其表現，並調節下游元件。這些結果證明25HC3S主要經由鈣-AMPK訊號傳導途徑整體調控代謝途徑，如第5圖所示。25HC和25HC3S為調控DNA甲基化之有效調節因子。25HC將CpG甲基化，25HC3S將 ^5mCpG去甲基化，同時亦下調和上調該關鍵基因之表現。PGC-1α為線粒體生物發生、氧化磷酸化和線粒體抗氧化防禦之關鍵調控因子，且其亦負責維持代謝穩態。PGC-1α表現被CREB蛋白和AMPK訊號傳導途徑上調。目前的發現表明25HC3S經由將其啟動子區中之 ^5mCpG去甲基化，隨後增加細胞內PGC-1α量來上調CREB和AMPK之表現(第3圖)，其提供25HC3S如何發揮作用之詳細機制，如第5圖所示。25HC3S抑制DNMTs活性並將關鍵啟動子區中之 ^5mCpG去甲基化。去甲基化可上調基因表現並增加MAPK-CREB訊號傳導，此可阻斷細胞凋亡，誘導細胞增殖。如第5圖所示，去甲基化亦上調鈣AMPK訊號傳導，導致SREBP-1活性受抑制，從而抑制脂肪酸和三酸甘油酯生物合成，並抑制HMGCR表現、降低膽固醇生物合成且增加丙二醯-輔酶A之量。結論

本實施例中已證明氧固醇硫酸酯，25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)在脂質代謝、發炎反應和細胞存活中發揮重要作用。實施例1提供分子機制之研究，25HC3S藉由該分子機制作為內源性表觀遺傳調控因子。表觀遺傳酶之動力學研究證明25HC3S特異性抑制DNA甲基轉移酶、DNMT1、DNMT3a和DNMT3b，其IC50分別為4.04、3.03和9.05×10 ^-6M。在人類肝細胞中，高葡萄糖藉由增加涉及非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)發展之關鍵基因的啟動子CpG甲基化來誘導脂質累積。使用該模型，25HC3S將1074個參與79條KEGG途徑的基因之啟動子區中的 ^5mCpG轉化為CpG。參與主要訊號傳導途徑(包括MAPK-ERK、鈣-AMPK和第II型糖尿病途徑)之去甲基化基因的表現增加。信使RNA陣列分析表明編碼保持細胞存活之關鍵元素的上調基因和編碼減少脂質生物合成之關鍵酶的下調基因。實施例1中所示之結果表明這些元件和酶之表現被去甲基化之訊號傳導途徑調控，而啟動子區中之 ^5mCpG的25HC3S DNA去甲基化為有效之調控機制。 實施例 2 概述

本實施例為對患有NASH之個體和對照組健康個體投予之25HC3S的隨機、劑量範圍、單劑量安全性和藥物動力學研究。該研究係在評估2個口服22 5HC3S單劑量水準的2個連續群組中進行。在每個群組方面，登記10名患有NASH之個體，這些個體被進一步分類為肝硬化和非肝硬化。每個個體僅接受一個研究治療劑量。在審查來自第1組之安全性和耐受性數據後，給予第二組劑量。第1組接受50 mg之25HC3S鈉，而第2組接受200 mg之25HC3S鈉。結果

25HC3S之藥物動力學(PK)血漿濃度總結於下列表2.1(50mg 劑量)和表2.2(200 mg劑量)中。群組1健康個體在給藥後長達12小時，而群組2健康個體在給藥後長達16小時可檢測到血漿25HC3S量(表2.1)。在投予50 mg 25HC3S(第2圖)和200 mg 25HC3S(第3圖)後，健康個體與NASH個體之血漿變化概況相似。在健康個體方面，劑量增加四倍導致平均C _max增加約三倍(50 mg劑量：93.967±27.343 ng/mL，而200 mg劑量：260.500±54.779 ng/mL)。此亦在AUC參數觀察到(表2.1和2.2)。同樣地，NASH個體亦顯示出劑量增加四倍時，C _max和AUC參數二者增加約三倍(表2.1和2.2)。平均%AUC _exp低，表明採血計劃足以捕捉大部分可能計算之AUC。

個體血漿疊加圖表明儘管健康(n=6)和NASH (n=10)個體之個體數量不同，但NASH個體之C _max和AUC參數傾向表現出較大之變異性。在NASH個體中，群組1和2之幾何平均C _max較健康個體增加18至24%，伴隨NASH個體之25至50%較高CV%幾何平均數(表2.1)。群組1中，NASH和健康個體之幾何平均AUC _0-12和AUC _0-last相似，但在群組2中傾向高出約30%，其中NASH個體之%CV高出50%。NASH個體中之AUC _0-inf(群組2)約高出20%。因此，當考慮較高之%CV時，得出的結論是健康個體與NASH個體在C _max和AUC方面沒有明顯差異(表2.1)。

在給藥前和給藥後藉由瞬時彈性影像(TE)和磁共振彈性影像(MRE)測量肝臟硬度，在50 mg組方面改變-11%(TE)或-6%(MRE)，在150 mg組方面改變-7%(TE)或4%(MRE)，而在600 mg組方面改變-2%(TE)或0%(MRE)中。

在4週給藥結束時，投予50 mg、150 mg和600 mg之組別中前-C3(肝纖維化標誌物)之血漿量分別從基線降低-8%、-1%和-5%。在2週給藥後之追蹤中，投予50 mg、150 mg和600 mg之組別的前-C3量從基線開始分別為 -7%、8%和1%。

在4週25HC3S治療後，藉由胰島素抗性之穩態模型評估(HOMA-IR)亦觀察到總體改善。在給藥結束時，經投予50 mg、150 mg和600 mg之組別的HOMA-IR從基線開始分別為-22%、18%和1%。在2週給藥後追蹤，投予50 mg之組別從基線開始為10%，投予150 mg和600 mg之組別分別為17%和3%。這些結果更詳細地顯示於第8圖和表2.3中：

表2.3中顯示之結果令人驚訝，特別是在50 mg/天和150 mg/天劑量方面。25HC3S對胰島素抗性之影響的幅度令人吃驚。相對於其他糖尿病藥物，考慮25HC3S給藥之持續時間短，對胰島素抗性之影響的幅度相對較高。比較表2.3之結果與表2.4中其他藥物之結果。表2.4 對其他藥物之胰島素抗性之影響

藥品	MOA	臨床試驗	Tx 持續時間	HOMA-IR
司美魯肽 ( 皮下 )	升糖素樣肽-1 (GLP-1) 類似物	SUSTAIN 1-3 T2D	30週或56週	0.5 mg(27%至36%) 1.0 mg(32%至46%) 比較物(17%至28%)
羅格列酮 ( 口服 )	噻唑烷二酮 PPRA-γ活化劑	研究性研究 250分安慰劑對照研究 493分	5至6個月 26 週	HOMA-IR指數2.82+/-1.94 相對於 2.01+/-1.58 2 mg bd 16% 4 mg bd 24.6%
沙格列汀 ( 口服 )	二肽基肽酶- 4(DPP-4)抑制劑	臨床試驗相對於SOC 102分	3、6、12 個月	在3、6和12個月時相對於基線，P＜ 0.001
達格列淨 ( 口服 )	鈉-葡萄糖協同轉運蛋白 2(SGLT2)抑制劑	安慰劑對照研究 15分	1週	每天一次10 mg，持續 1週 4.52±2.27至3.78±1.59 (P 0.044)

結論

本報告呈現對正常健康個體和NASH個體口服投予劑量為50 mg(群組1)至200 mg(群組2)之25HC3S後的藥物動力學。群組2中之健康個體提供足夠數據，而能夠測得CL/F為171.25±28.60 L/h，且V _z/F為434.0±128.07 L。此受到T _1/2結果之支持，該結果保持相對恆定，健康和NASH個體組之平均值範圍在1.674小時至2.511小時。群組內之AUC _0-last和AUC _inf相一致，且傾向隨著25HC3S劑量的增加，以不成比例的方式與C _max一起增加。

與健康個體相比較，觀察到NASH之C _max(幾何平均數)增加18至24%。然而，NASH個體之CV%幾何平均數較高使得此觀察結果沒有定論。同樣地，當考慮暴露(AUC參數)時，NASH個體之可能增加趨勢(高達31%)被較高之CV%幾何平均數抵消。因此，得出結論為無論是否對健康個體還是對NASH患者投予25HC3S鈉，藥物動力學均無明顯差異。

此外，25HC3S對胰島素抗性之影響幅度令人驚訝。相對於其他糖尿病藥物，考慮到25HC3S給藥之持續時間短，對胰島素抗性之影響幅度相對較高。 實施例 3 目的

本研究之目的是測定雄性Sprague Dawley大鼠中[4- ¹⁴C]-25HC3S衍生之放射性的血漿藥物動力學、測定雄性Sprague Dawley大鼠中[4- ¹⁴C]-25HC3S衍生之放射性的排除途徑和排泄質量平衡、使用定量全身放射自顯影方法測定在單次靜脈注射(推注)劑量後，雄性Sprague Dawley大鼠和Long Evans大鼠中[4- ¹⁴C]-25HC3S衍生之放射性的組織分佈和組織藥物動力學，並提供用於[4- ¹⁴C]-25HC3S衍生之放射性的代謝物剖析之血漿、尿液和糞便勻漿樣品。 研究設計

分派9隻雄性Sprague Dawley大鼠(第1組)用於藥物動力學階段，3隻雄性Sprague Dawley大鼠(第2組)用於排泄質量平衡階段，以及7隻雄性Sprague Dawley大鼠(第3組)和9隻雄性Long Evans大鼠(第4組)用於組織分佈階段。所有動物均接受10mg/kg之[ ¹⁴C]-25HC3S的單一靜脈內劑量和225 μCi/kg之標的放射性。在給藥後約0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、48和72小時從第1組之所有動物收集血液樣品。定期從第2組之所有動物收集尿液和糞便，直至給藥後168小時。在第3組之給藥後約0.083、0.5、1、4、8、24和168小時，和第4組之給藥後約0.083、0.5、1、4、8、24、168、336和504小時，使用異氟醚，以1隻動物/組/時間點來麻醉動物並收集血液樣品。收集血後，藉由吸入CO ₂將動物安樂死，並將屍體在乾冰/己烷浴中冷凍以藉由定量性全身放射自顯影進行處理。藉由液體閃爍計數來分析全血、血漿、尿液、糞便、籠子漂洗液和籠子洗滌液的總放射性。 結果和主要發現

投予大鼠10mg/kg之[4- ¹⁴C]-25HC3S的單次靜脈內(推注)劑量後，平均血漿C ₀為25,900 ng-equiv./g，且AUC _last為27,900 h*ng-equiv./g。終末消除階段T _1/2為26.6小時。

根據排泄數據，在10mg/kg之[4- ¹⁴C]- 25HC3S的單次靜脈內(推注)劑量後，來自大鼠之尿液、糞便和籠子漂洗液在168小時內可回收該投予之劑量的約100.2%。大部分回收之放射性係在糞便(83.0%)中，此表明膽汁排泄為大鼠排泄的主要途徑。

至第3組雄性Sprague Dawley大鼠10 mg/kg之[4- ¹⁴C]-25HC3S單次靜脈內(推注)劑量後，[4- ¹⁴C]-25HC3S及/或其代謝物廣泛分佈並藉由定量性全身放射自顯影檢測除眼睛(晶狀體)以外之所有組織。血漿濃度類似於在藥物動力學階段中所測定者。該全血C _max為8530 ng-equiv./g，且AUC _last為25,200 h*ng-equiv./g。血漿和全血暴露中之差異可忽略，因為所測得之血漿：全血AUC _last比為0.79，此表明25HC3S均等分佈在血漿和血細胞中。血漿中之T _1/2為44.3小時，而全血中之T _1/2為52.2小時；PK階段與QWBA階段之間的血漿T _1/2之差異係由於採血時間點不同。

[4- ¹⁴C]-25HC3S衍生之放射性的C _max和 AUC _last在肝臟中最高：分別高達87,900 ng-equiv./g和364,000 h·ng/g。腎(所有部分)、小腸(壁)、肺和腎上腺濃度係在43,200 ng-equiv./g至13,600 ng-equiv./g之範圍內，高於12400 ng-equiv./g之最大血漿濃度。相對於其他組織，胸腺、骨骼(股骨)、葡萄膜、脂肪、睾丸和腦的濃度最低：＜5000 ng-equiv./g(約1500ng-equiv./g)。其餘組織具有濃度介於5000和10,800 ng-equiv./g之間。T _max最常為給藥後0.083至0.5小時。給藥後168小時，除了腎上腺、副淚腺、肝臟和小腸外，所有組織中之濃度均低於定量限值。當使用AUC _last計算時，肝臟和小腸(壁)之組織：血漿比高，分別為11.4和7.44。在靜脈內劑量之後，肝臟和小腸之高濃度與廣泛的膽汁(糞便)排泄一致。所有其他組織：血漿比表明對其餘組織類型的親和力有限。

投予雄性Long Evans大鼠10 mg/kg之[4- ¹⁴C]-25HC3S的單次靜脈內劑量揭露在給藥後之最初168小時內，血漿或全血濃度相對於Sprague Dawley大鼠而言沒有實質差異；給藥後336小時，有色動物之血漿和全血濃度均低於血漿和全血之定量限值。與有色或非有著色之皮膚或葡萄膜的結合似乎沒有差異；給藥後168小時，所有組織中之濃度均低於定量限值。

分析來自大鼠之血漿、尿液和糞便以測定與25HC3S相關之放射性標記物質。使用具有放射檢測之高效液相色層分析法來剖析樣品並使用質譜法和串聯質譜分析進行代謝表徵。

血漿池係從0.083、0.25、0.5和1小時之時間點收集的第1組大鼠的血漿製備。來自該等第1組樣品池和來自第3組之0.083小時的血漿樣品中，存在於0.083和0.25小時收集物中的最大成分係由母25HC3S產生，代表該放射性之約58%至92%。在0.5小時和1小時收集物中，存在之放射性＞10%的三種代謝物為M14(高達15%相對觀察強度)、M24(高達13%相對觀察強度)和M28(高達83%相對觀察強度)。在具有用於代謝物剖析和表徵之合適的放射性之時間點中(至多為給藥後1小時)，約54%之對25HC3S相關放射性的暴露(AUC)係由25HC3S產生，約34%係由M28產生，其餘係由次要代謝物產生。

在給藥後0至6和6至12小時製備第2組之尿池。存在之最大成分係由母25HC3S產生，代表該放射性之約78%至93%。共鑑定出4種代謝物，雖然沒有代謝物之存在量＞1.2%之劑量或＞10%相對觀察強度。在至少1個樣品中，存在量＜10%相對觀察強度的四種代謝物為M7(＜5%相對觀察強度)、M16(＜3%相對觀察強度)、M19(＜6%相對觀察強度)和M25(＜5%相對觀察強度)。

在給藥後0至12、12至24和24至48小時製備第2組之糞便池。

共鑑定出14種代謝物。存在量≥5%劑量的四種代謝物為M1(21%劑量和23%至30%之相對觀察強度)、M2(7%劑量和4%至12%之相對觀察強度)、M3(15%劑量和13%至23%之相對觀察強度)和M4(8%劑量和6%至12%之相對觀察強度)。母25HC3S之存在量為2%劑量(1%至5%之相對觀察強度)。

主要代謝途徑涉及25HC3S之氧化，導致硫酸酯基轉化為羥基，然後進一步氧化以形成與去氧膽酸和膽酸或其異構體相關之膽汁酸結構。此外，去氧膽酸(或去氧膽酸之異構體)的麩胱甘肽共軛作用係由出現具有該結構之對應分子量的代謝物表明。在血漿、尿液或糞便之任一樣本中均未檢測到硫酸鏈固醇(desmosterol)，亦未檢測到25-羥基膽固醇。 實施例 4

投予大鼠75 mg/kg之[ ¹⁴C]-25HC3S的單次口服(管飼)劑量後，血漿C _max為3800 ng equiv./g且AUC _last為96,400 h·ngequiv./g。終末消除階段T _1/2為27.3小時。

根據排泄數據，在單次口服(管飼)75mg/kg之[ ¹⁴C]-25HC3S劑量後，從大鼠之尿液、糞便和籠子漂洗液中回收約94.5%之投予劑量。大部分回收之放射性係在糞便中(94.2%)，表明膽汁排泄為大鼠中經吸收之25HC3S的主要排泄途徑。

投予雄性Sprague Dawley大鼠75 mg/kg之[ ¹⁴C]-25HC3S的單次口服(管飼)劑量後，[ ¹⁴C]-25HC3S及/或其代謝物廣泛分佈在除了眼睛(晶狀體)外的所有組織中並藉由定量性全身放射自顯影檢測。在眼睛(晶狀體)中未檢測至[ ¹⁴C]-25HC3S衍生之放射性。血漿濃度與藥物動力學階段中所測定者相似且高於定量下限。全血C _max為2850 ng equiv./g且AUC _last為127,000 h·ngequiv./g。血漿和全血暴露中之差異可忽略，因為所測得之血漿：全血AUC _last比為1.12，此表明25HC3S近似均等地分佈在血漿和血細胞中。

在藉由定量性全身放射自顯影分析之組織方面，當可測量時，[ ¹⁴C]-25HC3S衍生之放射性的C _max在小腸(壁)中最高，其次為胃(壁)：分別為424,000 ng equiv./g和204,000 ng equiv./g。胰臟和肝臟濃度係在23,500 ng equiv./g至28,100 ng equiv./g之範圍內。相對於其他組織，葡萄膜和腦之濃度最低，且約為1000 ng equiv./g。皮膚、胸腺、前列腺和垂體組織濃度＜3000 ng equiv./g。其餘組織具有濃度介於3600 ng equiv./g和10,700 ng equiv./g之間。T _max為給藥後6小時或更短。給藥後168小時，除了腎上腺和肝臟外，所有組織中之組織濃度接近或低於定量限值。當使用AUC _last計算時，小腸(壁，15.4)之組織：血漿比最高，其次為肝臟和腎上腺，分別為6.96和6.64。肝臟和小腸之高濃度與口服投予和膽汁(糞便)排泄一致。所有其他組織：血漿比證明對其餘組織類型之親和力有限。

使用放射-高效液相色層分析法(HPLC)和高效液相色層分析法/質譜(HPLC/MS)法來剖析和鑑定血漿和糞便萃取物中之放射標記的組分。

沒有尿液樣本含有足夠放射性而需要代謝物剖析和鑑定。

製備在給藥後2、4和6小時收集之第1組(75mg/kg，[ ¹⁴C]-25HC3S)樣品的血漿池。在給藥後2小時之血漿中，主要之經放射標記的成分為母25HC3S，其存在量為63%相對觀察強度(ROI)和濃度2090 ng-equiv./g。一種代謝物M29被鑑定為25-羥基膽固醇，其具有37%ROI且濃度為1233 ng-equiv./g。在給藥後4小時和6小時之血漿收集物中並未含有足夠用於放射剖析之濃度。

製備在給藥後0至24、24至48、48至72、72至96、96至120、120至144、和144至168小時收集之第2組 (75 mg/kg，[ ¹⁴C]-25HC3S)樣品的糞便池。共鑑定出11種代謝物。沒有代謝物之存在量＞5%劑量。存在量為2-5%劑量之代謝物為M1(總劑量之4.5%和1%-69%ROI)、M3(總劑量之4.6%和1%-44%ROI)、M4(總劑量之2.0%和0%-10%ROI)、M8(總劑量之3.1%和1%-46%ROI)、M29(總劑量之1.9%和0%-2%ROI)和M30(總劑量之3.3%和0%-5% ROI)。主要之經放射標記的成分為母25HC3S，其存在量為總劑量之71.1%(0%-88%ROI)。

在血漿或糞便之任一樣品中均未發現經放射標記之硫酸鏈固醇。

主要代謝途徑涉及25HC3S之氧化，導致硫酸酯基轉化為羥基，然後進一步氧化以形成與去氧膽酸和膽酸或其異構體相關之膽汁酸結構和25-羥基膽固醇。 [ 實施例 5] 概述

本實施例為用於評估投予4週後，25HC3S在具有1至3期纖維化之NASH患者中的安全性、藥物動力學及生物活性之訊號的隨機、開放標籤、多中心US研究。總共63名患者完成弦研究，每個劑量組21名患者(完成MRI-PDFF測量)。每日口服投予50 mg、150 mg或600 mg(300 mg BID)之25HC3S鈉。監測該試驗中之患者2週(14天)，給藥4週(28天)，並再追蹤4週(28天)。

試驗標題：	隨機、開放標籤、第1b期研究以評估25HC3S在患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)之患者中的安全性、藥物動力學和藥效動力學訊號
發展階段：終點：	第1b期 •測定患有NASH之個體每日口服25HC3S劑量共4週之安全性和藥物動力學(PK) •測定25HC3S對患有NASH之個體中的藥效動力學(PD)訊號之影響　•藉由磁共振成像-質子密度脂肪分數(MRI-PDFF)測量之從基線到給藥結束(第6週結束)的肝臟脂肪含量變化　•藉由瞬時彈性影像(TE)測量之從基線到給藥結束(第6週結束)的肝臟硬度變化　•在4週之給藥期間，每週一次及研究結束(第10週結束)時藉由血漿丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)和γ-麩胺醯轉肽酶(GGT)測量從基線至給藥結束(第6週結束)的肝功能參數；該群組將為實驗室安全性測試之一部分 :基線定義為第一個研究藥物之劑量前的最後一個非遺漏值
安全性評估：	•不良事件(AE)係從簽署知情同意書的時間起記錄直到研究結束或分別提前終止訪視：　　•生命體徵、身體檢查和12導聯EGG結果　　•安全性實驗室測試(化學、血液學、凝血和尿液分析)
試驗群：	共共有65名被診斷為患有NASH或疑似NASH之個體(包括男性和女性)參加該研究。每一個下列劑量組包括至少20名患者。　　　•第1組：50 mg 25HC3S鈉，口服QD 　　　•第2組：150 mg 25HC3S鈉，口服QD 　　　•第3組：300 mg 25HC3S鈉，口服BID
納入標準：	1. 個體提供書面知情同意書以參與研究　2. 簽署知情同意書時年滿18歲之男性或女性個體　3. BMI 20-45 kg/m ²　4. 個體具有在篩選訪視前之12個月內得到證實之NASH的歷史組織學診斷，證明存在第1至3期纖維化且NAS≥ 4，該三種成分(脂肪變性(steatosis)、肝細胞氣球狀變性(hepatocellular ballooning)和肝小葉發炎(lobular inflammation))中的每一種至少1分，或使用臨床診斷、實驗室結果和脂肪變性之影像學評估的組合(包括MRI-PDFF＞10%和用於異質肝臟之Fibroscan®的CAP評分＞238dB/m)被診斷為“疑似NASH”和纖維化，後者在本臨床試驗中之定義為：　　a. Fibroscan®之值＞7 kPa 　　或者　　b.MRE ≥ 2.75 kPa 　　本臨床試驗中NASH之臨床診斷被定義為存在一或多種下列NASH之風險因素，即：　　a. 第2型糖尿病或空腹血糖升高　　b. 腹部肥胖　　c. 血脂濃度升高，尤其是血清三酸甘油酯濃度升高　　d.高血壓，或　　e. HDL膽固醇之濃度低　5. 在血清轉胺酶方面，在沒有其他肝病病因之情況下，所有患者在篩選時之ALT濃度為＞1和＜5倍之中央實驗室的正常上限(ULN)。若患者具有過去6個月內之實驗室記錄，則女性ALT濃度為＜20 U/L且男性＜30 U/L。篩選時，所有患者之AST濃度＜5x ULN 　6. 在篩選期間，血清ALT、AST、ALP和TBL濃度不會波動＞30% 　7 血小板計數≥120,000/mm ³　8.女性個體若符合下列標準則有資格參加研究：　　O 沒有懷孕或哺乳　　O 育齡婦女(定義為未經手術成為不育或未超過52歲且閉經至少12個月以上之女性)在整個研究期間必須利用適當之節育。可使用之可接受的方法包括禁慾、生育控制藥丸(“避孕藥”)或貼片、子宮帽、IUD(線圈)、陰道環、保險套、手術絕育、或植入或注射孕激素，或性生活僅限於絕育(例如輸精管切除術)之男性伴侶　9. 男性參與者同意從登記到最後一個研究藥物劑量後30天一貫且正確地使用保險套並結合上述避孕方法之一　10. 參與者能夠遵照用藥並能夠完成評估之研究時間表

結果

25HC3S之所有三種劑量均被良好耐受，未觀察到與藥物相關之嚴重不良事件。重複給藥後之PK參數與單一劑量後之PK參數相當且為劑量依賴性的。

低和高劑量組顯示出血清ALT量之中位數統計學上顯著地從基線降低，分別為-16%和-17%。高劑量組亦顯示出血清AST(-18%)和GGT(-8%)量，以及FIB-4( -15%)和APRI(-26%)評分之中位數統計學上顯著地從基線降低。藉由Fibroscan(-10%)測得低劑量組的肝臟硬度在第28天統計學上顯著地從基線降低。

低劑量組和中劑量組之患者的血清三酸甘油酯(50 mg組中-13%)或LDL-C(150 mg組中-11%)中位數在第28天亦統計學上顯著地從基線降低。第28天，所有劑量組中之具有升高之基線三酸甘油酯(≥200 mg/dL；n=16)的患者具有中位數均從基線降低-24%(p ＜0.01)。

各劑量組中，接受MRI-PDFF之患者中有43%在給藥後4週後藉由MRI-PDFF測量顯示出肝臟脂肪從基線減少≥10%。在各次組中，這些患者之肝臟脂肪中位數分別從基線降低-18%、-19%和-23%，為統計學上顯著。各劑量組之肝臟脂肪含量降低亦伴隨著血清ALT量顯著降低。各次組顯示出血清ALT量中位數統計學上顯著地分別從基線降低-21%、19%和-32%。

在第28天，所有劑量組中具有升高之基線三酸甘油酯(≥200 mg/dL；n=16)的患者的血清三酸甘油酯從基線降低24%(p＜0.01)。

在藉由PDFF測得之肝脂肪減少≥10%的43%患者中，經低和高劑量25HC3S治療4週的患者亦具有AST中位數(-24%和-39%)、FIB-4評分中位數(-19%和-21%)和APRI評分中位數(-27%和-36%)統計學上顯著降低，而經低劑量治療之患者亦具有統計學上顯著降低之GGT(-13%)量中位數。

此外，在所有3個劑量組中，藉由PDFF測得之肝脂肪減少≥10%的43%患者中，藉由Fibroscan®測得之肝臟硬度趨向或統計學上顯著降低(分別為-7%、-9%和-9 %)。結果進一步總結於下表中：

下表顯示具有MRI-PDFF降低≥10%之患者在第28天相對於基線數據

藥物動力學

測定投予之25HC3S的藥物動力學。平均(標準偏差)藥物動力學參數總結在第9圖和下表中。藥物動力學參數之參考

從血漿濃度數據估計25HC3S之下列PK參數。 C _max25HC3S之最大觀察血漿濃度 T _maxC _max之時間(觀察之時間點) C _last最後觀察到之血漿中25HC3S之可量化濃度 T _lastC _last之最後觀察的時間點 AUC _0-12從時間零至給藥後12小時之血漿濃度對時間曲線下面積。藉由線性/對數梯形法則計算。 AUC _0-last從時間零至高於定量限值之最後測量濃度的血漿濃度對時間曲線下面積(線性/對數梯形法則)。 C _min25HC3S之最低觀察濃度。 T _lastC _las之最後(觀察的時間點) AUC _inf外推至無限時間之濃度對時間曲線下面積(線性/對數梯形法則)，計算方法為AUC _0-last+(C _last/λ) %AUC _exp在AUC _0-last和AUC _inf之間外推之AUC百分比 T _½血漿中藥物之終末消除半衰期的估計值，藉由將2之自然對數除以終末消除速率常數(λ)來計算 λ 與血漿濃度對時間曲線之末端對數線性部分相關的一級速率常數。 CL/F 投予該藥物後之擬似清除率：CL=劑量/AUC _inf，其中“劑量”為該藥物之劑量。 V _z/F 25HC3S之擬分佈體積。

在研究之前和研究期間，一些個體接受斯他汀類(阿托伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀或辛伐他汀)。如下表中所示，同時接受25HC3和斯他汀類之個體在給藥後第28天具有三酸甘油酯和非HDL降低：

患者	平均TG對基線平均值	平均非HDL對基線平均值	中位數TG對基線平均值	中位數非HDL對基線平均值
所有使用斯他汀類(n = 20)	-2%	-9%	-6%	-9%
除了一個離群值外之所有使用斯他汀類(n=19)	-10%	-11%	-9%	-10%

結論

本實施例顯示與較高之劑量相比較，低劑量導致肝臟脂肪減少(例如藉由MRI-PDFF測量)。本實施例顯示出中等劑量導致低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)量改善。本實施例顯示出高劑量導致酶(例如ALT、AST、GGT)量改善，表明肝功能改善。

雖然前述發明已藉由說明和示例之方式詳細的描述以用於清楚理解之目的，本技藝之一般技術人士鑑於本發明之教示內容可輕易明白能夠在不脫離所附之申請專利範圍的精神或範圍下做出某些改變和修飾。

因此，前述僅說明本發明之原理。應理解的是，本技藝之技術熟習人士將能夠設計出各種佈置，這些佈置儘管在本文中沒有明確描述或顯示出，但其體現本發明之原理且包括在其精神和範圍內。此外，本文中引用之所有實例和條件語言主要旨在協助讀者理解本發明之原理和本發明者為促進本技藝所貢獻之概念，且應被解釋為不受限於該等具體引用之實例和條件。再者，本文引用之原理、態樣和實施態樣及其具體實例的所有陳述旨在同時涵蓋其結構和功能等效物。此外，此類等效物旨在同時包括當前已知之等效物和未來研發之等效物，即，所研發之執行相同功能的任何元件，無論結構如何。此外，不管申請專利範圍中是否明確引用該等揭示內容，本文揭示之任何內容均不意圖奉獻公眾使用。

因此，本發明之範圍並不意圖侷限於本文所顯示和描述之示例性實施態樣。相反地，本發明之範圍和精神係由所附之申請專利範圍體現。在申請專利範圍中，35USC§112(f)或35USC§112(6)被明確定義為僅在申請專利範圍中該特性之開頭引用精確短語“方式為”或精確短語“步驟為”時才被援引用於申請專利範圍中之該特性；若申請專利範圍中之特性中未使用該等精確短語，則不會援引35U.S.C§112(f)或35U.S.C§112(6)。

[ 第 1 至 1D 圖]. Xol3S、25HC3S和27HC3S之合成和酶動力學研究。第 1A 圖顯示在細胞中生物合成Xol3S、25HC3S和27HC3S。第 1B 圖顯示純化之25HC3S；Xol3S；和27HC3S之HPLC概況。25HC3S、27HC3S、Xol3S及其前體，25HC、27HC和膽固醇對DNMT1/3a/3b活性之影響。第 1C 圖顯示25HC3S、Xol3S和27HC3S對酶活性之濃度依賴性(0-0.001 M(10分))效果。第 1D 圖顯示25HC與25HC3S、膽固醇與Xol3S，以及27HC與27HC3S之比較。

[ 第 2A 至 2F 圖]. 藉由整體甲基化定序分析25HC3S對肝細胞中DNA甲基化的效果。將Huh-7細胞在HG培養基中培養72小時，並使用乙醇(載劑)和在乙醇中之25mM 25HC3S處理4小時。藉由LINE-1檢定估計整體甲基化之水準。如第 2A 圖所示，選擇LINE-1元件之啟動子區中的四個CpG位點作為標靶位置。藉由WGBS測量詳細之整體甲基化。第 2B 圖顯示染色體中之DMR分佈的Circos譜：第一個圓圈顯示高甲基化DMR之分佈；第二個圓圈顯示轉位元(TE)密度；而第三個圓圈顯示低甲基化DMR之分佈。第 2C 圖顯示在全基因體(上)及啟動子區(低)之CG、CHG和CHH背景下，25HC3S和載劑集合庫中之低甲基化DMR相關基因(DMG)的文氏(Venn)圖。使用KOBAS軟體來測試京都基因與基因體百科全書(KEGG)途徑中DMR相關基因之統計富集。第 2D 圖中為全基因體之不同基因體功能區中的DNA甲基化水準，其中x軸代表不同基因體區(CGI、CGI-島岸、啟動子、UTR 5、外顯子、內含子、UTR3及重複序列)，且y軸代表在CG、CHG和CHH之背景下，25HC3S和載劑集合庫中的甲基化水準。第 2E 圖顯示KEGG途徑中之全基因體中的低甲基化DMR之高富集。第 2F 圖顯示KEGG途徑中之啟動子區中的低甲基化DMR之高富集。詳細之KEGG途徑顯示於表1.3中。

[ 第 3A 至 3D 圖]. 與訊號傳導途徑相關之關鍵基因的表現。將Huh-7細胞在HG培養基中培養72小時並使用6.25μM、12.5μM、25μM和50μM之25HC3S處理1小時、2小時、4小時、6小時和8小時。藉由RT-PCR分析測定關鍵基因及其靶向基因表現。第 3A 圖顯示MAPK訊號傳導途徑中之DUSP8(雙特異性磷酸酶8)、DUSP7(雙特異性磷酸酶7)和MAPK1(有絲分裂原(mitogen)活化之蛋白激酶1)的表現；第 3B 圖顯示其標靶基因，CREB(cAMP反應元件結合蛋白)、PRDX6(過氧化還原酶6)和BAD(BCL2相關之細胞死亡促效劑)；第 3C 圖顯示鈣-AMK途徑中之關鍵基因，CACNA家族(鈣電壓-門控之通道次單元)；第 3D 圖顯示其靶向基因PGC1A(PPARG共同活化子1α)、HMGR(3-羥基-3-甲基戊二醯基-CoA還原酶)和FAS(脂肪酸合成酶)。

[ 第 4A 至 4F 圖]. 25HC3S對肝細胞轉錄水準之效果。將HepG-2細胞培養在HG培養基中，並使用25μM之25HC3S處理2小時、4小時和8小時。第 4A 圖顯示上調之基因(＞1.6倍)。第 4B 圖顯示對基因本體(GO)群富集之上調的基因(8小時)(NRAP：細胞凋亡過程之負調控；NRPCD：程序性細胞死亡之負調控；RS：訊號傳導之調控；SP：磷酸化之調控；NRCD：細胞死亡之負調控；RES：對壓力反應；NRPP：蛋白質磷酸化之負調控；CRCS：對化學刺激之細胞反應；NRP：磷酸化之負調控；ST：訊號轉導)。第 4C 圖顯示下調之基因(減少＞40%)。第 4D 圖顯示對GO群富集之下調的基因(8小時)(CLMP：細胞脂質代謝過程；SBP：類固醇生物合成過程；AMP：醇代謝過程；CMP：膽固醇代謝過程；FAMP：脂肪酸代謝過程；TBP：三酸甘油酯生物合成過程；NLBP：中性脂質生物合成過程；ACMP：醯基-CoA代謝過程；OABP：有機酸生物合成過程；BAMP：膽汁酸代謝過程)。第 4E 圖顯示與此研究相關之上調基因的熱圖；第 4F 圖顯示下調之基因。

[ 第 5 圖]. 作為表觀遺傳調控途徑之25HC的硫酸化。25HC為DNMT-1之內源性促效劑，其可將啟動子區中之CpG甲基化並隨後使基因歹表現，導致細胞死亡和脂肪生成。25HC可經硫酸化成25HC3S，25HC3S作為內源性配體並抑制DNMT之活性。25HC3S使啟動子區中之 ^5mCpG去甲基化，並依次增加基因表現。該受氧固醇硫酸化調控之主要途徑涉及能量和脂質代謝、MAPK-ERK及鈣-AMPK。25HC3S顯著增加雙特異性磷酸酶(DUSP)和CREB表現，此可活化MAPK/ERK途徑，包括CREB、BAD和ERK，且隨後調控細胞存活和死亡。25HC3S減少脂質生物合成並藉由將啟動子區中之 ^5mCpG去甲基化來減少脂質積聚，增加涉及鈣通道和AMPK之關鍵基因的表現，並活化對應之訊號傳導途徑，此導致游離脂肪酸(FFA)氧化增加和減少膽固醇和FFA之生物合成。藉由氧固醇之硫酸化的整體調控表明該調控機制之生理和病理生理學意義。

[ 第 6 圖]. 氧固醇硫酸酯之硫酸化機制和代謝途徑。

[ 第 7 圖]. 氧固醇硫酸化之調控途徑。

[ 第 8 圖]. 胰島素抗性。由每天服用50 mg/天、150 mg/天和600 mg/天之25-羥基膽固醇-3-硫酸酯劑量共4週之個體所表現出之胰島素抗性的穩態模型評估顯示出胰島素抗性從基線降低之百分比。亦顯示出追蹤第6週時表現出之胰島素抗性。

[ 第 9 圖]. 描繪根據某些實施態樣投予25HC3S之個體的平均藥物動力學(PK)參數。

<![CDATA[<110>  美商杜瑞克公司(Durect Corporation)]]>
                      維吉尼亞聯邦大學(Virginia Commonwealth University)
                      美國政府退伍軍人事務部(The United States Government as 
                      Represented by the Department of Veterans Affairs) 
          <![CDATA[<120>  氧合膽固醇硫酸酯於治療胰島素抗性、糖尿病、及 ]]>
                      糖尿病前期中至少一者之用途
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          aagaatcgga ttcaggtctg tt                                                22
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          cccgattcct atcatcgatg at                                                22
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          acgtctttgt ggcttttgct                                                   20
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          ggcatcaaac ctagacaggt c                                                 21
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          ctccttaatg tcacgcacga t                                                 21
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          ttgattttgg agggatctcg                                                   20

Claims

一種治療有其需要之人類個體的胰島素抗性之方法，該方法包含對該個體口服投予1 mg/天至300 mg/天範圍之量的至少一種選自下列之化合物：25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽。
一種治療有其需要之人類個體的胰島素不足之方法，該方法包含對該個體口服投予1 mg/天至300 mg/天範圍之量的至少一種選自下列之化合物：25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽。
一種治療有其需要之人類個體的糖尿病之方法，該方法包含對該個體口服投予1 mg/天至300 mg/天範圍之量的至少一種選自下列之化合物：25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽。
如請求項3之方法，其中該糖尿病為第I型糖尿病。
如請求項3之方法，其中該糖尿病為第II型糖尿病。
一種治療有其需要之人類個體的糖尿病前期之方法，該方法包含對該個體口服投予1 mg/天至300 mg/天範圍之量的至少一種選自下列之化合物：25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽。
如請求項1至6中任一項之方法，其中該人類個體患有非酒精性脂肪性肝炎(steatohepatitis) (NASH)。
一種治療有其需要之人類個體的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及胰島素抗性、糖尿病、和糖尿病前期中至少一者之方法，該方法包含對該個體口服投予有效量之至少一種選自下列的化合物：25-羥基膽固醇-3-硫酸酯(25HC3S)、25-羥基膽固醇-二硫酸酯(25HCDS)、27-羥基膽固醇-3-硫酸酯(27HC3S)、27-羥基膽固醇-二硫酸酯(27HCDS)、24-羥基膽固醇-3-硫酸酯(24HC3S)、24-羥基膽固醇-二硫酸酯(24HCDS)、及24,25-環氧基膽固醇-3-硫酸酯、或其鹽。
如請求項1至8中任一項之方法，其中該口服投予包含以範圍在1 mg/天至100 mg/天之量口服投予至少一種化合物。
如請求項1至8中任一項之方法，其中該口服投予包含以範圍在5 mg/天至90 mg/天、或10 mg/天至80 mg/天之量口服投予至少一種化合物。
如請求項1至8中任一項之方法，其中該口服投予包含以範圍在30 mg/天至70 mg/天之量口服投予至少一種化合物。
如請求項1至11中任一項之方法，其中對該個體口服投予之至少一種化合物的每kg總量為：(a)在0.1 mg/kg/天至5 mg/kg/天之範圍；或(b)在0.2 mg/kg/天至4 mg/kg/天之範圍；或(c)在0.3 mg/kg/天至3 mg/kg/天之範圍；或(d)在0.4 mg/kg/天至2 mg/kg/天之範圍。
如請求項1至12中任一項之方法，其中該口服投予包含口服投予該至少一種化合物之多種劑量。
如請求項13之方法，其中： (a) 該劑量係以範圍為每週一次至一天3次、或一天一次、或一天2次之頻率口服投予；及/或 (b) 該口服投予包含口服投予至少7天，諸如至少14天、至少28天、至少3個月、至少6個月、或至少1年的給藥期間。
如請求項1至14中任一項之方法，其中該至少一種化合物係以包含該至少一種化合物和醫藥上可接受之載劑的調配物口服投予。
如請求項1至15中任一項之方法，其中： (a) 該至少一種化合物包含鹽；或 (b) 該至少一種化合物包含25HC3S之鹽；或 (c) 該至少一種化合物包含為鈉鹽之鹽；或 (d) 該至少一種化合物包含25HC3S之鈉鹽。
如請求項1至16中任一項之方法，其中該人類個體在治療前具有至少5%之磁共振成像-質子密度脂肪分數(MRI-PDFF)。
如請求項1至17中任一項之方法，其中該人類個體在治療前具有≥2.75 kPa之磁共振彈性影像(elastography)(MRE)。
如請求項1至18中任一項之方法，其中該個體顯現出下列一或多者： (a) 投予後該至少一種化合物在血漿中之半衰期(T _1/2)係在約1小時至約5小時、或約1.5小時至約4小時之範圍； (b) 該至少一種化合物之Cmax係在約25 ng/mL至約4000 ng/mL、約25 ng/mL至約200 ng/mL、約50 ng/mL至約150 ng/mL、約75 ng/mL至約125 ng/mL、約300 ng/mL至約1500 ng/mL、約400 ng/mL至約1250 ng/mL、或約500 ng/mL至約1000 ng/mL之範圍； (c) 在每100mg的口服投予之至少一種化合物，該至少一種化合物之Cmax係在約100 ng/mL至約300 ng/mL、約120 ng/mL至約250 ng/mL、約150 ng/mL至約200 ng/mL、約100 ng/mL至約300 ng/mL、約120 ng/mL至約250 ng/mL、或約150 ng/mL至約200 ng/mL之範圍； (d) 該至少一種化合物之AUCinf係在約300 ng*h/mL至約1000 ng*h/mL、約400 ng*h/mL至約900 ng*h/mL、約500 ng* h/mL至約800 ng*h/mL、約2700 ng*h/mL至約9000 ng*h/mL、約3000 ng*h/mL至約8000 ng*h/mL、或約3500 ng*h/mL至約7000 ng*h/mL之範圍； (e) 在每100mg的口服投予之至少一種化合物，該至少一種化合物之AUCinf係在約600 ng*h/mL至約1000 ng*h/mL、約700 ng*h/mL至約900 ng*h/mL、或約800 ng *h/mL至約900 ng*h/mL之範圍； (f) 該至少一種化合物之擬分佈體積(Vz/F)係在約300 L至約1000 L、約400 L至約900 L、或約500 L至約800 L 之範圍；及 (g) 該至少一種化合物之擬似清除率(CL/F)係在約100 L至約200 L/h、約110 L/h至約180 L/h、或約120 L/h至約160 L/h之範圍。
如請求項1至19中任一項之方法，其中該個體正服用降脂藥物，諸如下列至少一者：斯他汀類、非諾貝特(fenofibrate)、ω-3脂肪酸、二十碳五烯酸乙酯(icosapent ethyl)和魚油，或進一步包含投予降脂藥物，諸如下列至少一者：斯他汀類、非諾貝特、ω-3脂肪酸、二十碳五烯酸乙酯和魚油。
如請求項1至20中任一項之方法，其中該個體正服用下列至少一者：胰島素、格列酮(glitazone)、GLP-1、升糖素(glucagon)、DDP-4抑制劑、阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)和辛伐他汀(simvastatin)，或進一步包含對該個體投予下列至少一者：阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。