TW202210476A

TW202210476A - 用於抑制cdk7之化合物

Info

Publication number: TW202210476A
Application number: TW110117213A
Authority: TW
Inventors: 菲格羅亞瑪莉亞卡曼費爾南德斯; 亞曼朵溫瑟斯羅盧玫瑞斯; 馬丁尼茲康塞普桑傑茲
Original assignee: 美商美國禮來大藥廠
Priority date: 2020-05-27
Filing date: 2021-05-13
Publication date: 2022-03-16
Also published as: AU2021281176B2; AU2021281176A1; CA3178919A1; IL298054A; JP7428830B2; SA522441473B1; MX2022014908A; CN115667257A; TWI783480B; KR20230015428A; JP2023529070A; US20230203031A1; BR112022023019A2; EP4157840A1; WO2021242602A1; CN115667257B

Abstract

本發明提供下式之CDK7抑制劑，

其中X係-CH(OH)CH₃ 、-CHFCH₃ 、-CF₂ CH₃ 或-CF₃ ；Y係-CH=CH₂ 或-C² H=C² H₂ ；且Z係-CH(CH₃ )₂ 或-C² H(CH₃ )(CH₂ ² H)；其醫藥上可接受之鹽，其醫藥組合物，及其使用方法。

Description

用於抑制CDK7之化合物

週期蛋白依賴性激酶係對於癌細胞增殖及失調性致癌轉錄較為重要之激酶之主要種類。CDK7係結合至週期蛋白H及MATI以形成三聚體週期蛋白活化激酶之週期蛋白依賴性激酶，該三聚體週期蛋白活化激酶藉由磷酸化涉及細胞週期控制之其他週期蛋白活化激酶來實施其功能。該等複合物控制了細胞週期中之兩個後續階段之間之特定轉變。CDK7與細胞週期暫時控制及轉錄活性有關。CDK7藉由磷酸化RNA聚合酶II之Rbp1亞單元來參與轉錄起始過程。不受控細胞增殖及失調轉錄係癌症之標誌。選擇性靶向CDK7可藉由同時抑制活性轉錄及細胞週期進展來提供優點。因此，CDK7係用於治療癌症、尤其攻擊性及難以治療之癌症之有前景靶。

一些針對CDK7之小分子抑制劑已報導於文獻中(例如參見 WO 2015/154022、WO 2016/142855、WO 2016/160617、WO 2016/193939及WO 2017/044858)。然而，已知CDK7抑制劑可能對CDK7並無特異性且尚未達到有效治療細胞增殖性病症(例如癌症)所需之效果。因此，仍需提供用以治療細胞增殖性病症之新選擇性CDK7抑制劑。

本文提供下式之化合物：

(I) 其醫藥上可接受之鹽或其醫藥組合物。在此式中，X可為-CH(OH)CH₃ 、-CHFCH₃ 、-CF₂ CH₃ 或-CF₃ ；Y可為-CH=CH₂ 或-C² H=C² H₂ ；且Z可為-CH(CH₃ )₂ 或-C² H(CH₃ )(CH₂ ² H)。此式之化合物含有對掌性中心，從而提供如本文所展示之R-對映異構體形式及所展示S-對映異構體形式：

(R-對映異構體)

(S-對映異構體) 本文亦提供R-對映異構體及S-對映異構體、其醫藥上可接受之鹽或其醫藥組合物，其中X、Y及Z係如上文所定義。

亦提供使用此式之化合物、其醫藥上可接受之鹽及其醫藥組合物來治療尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰臟癌、子宮頸癌、前列腺癌、血液癌症、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤之方法。該等方法包含向有需要之患者投與治療有效量之此式之化合物或其醫藥上可接受之鹽。該等方法亦可包含測試來自患者之生物試樣中之ARID1A 、 KMT2C 、 KMT2D 或RB1 基因是否存在至少一種功能喪失型突變，且在試樣針對功能喪失型突變測試為陽性時向患者投與治療有效量之此式之化合物或其醫藥上可接受之鹽。該等方法可進一步或替代地包含向患者投與治療有效量之此式之化合物或其醫藥上可接受之鹽，條件係來自患者之生物試樣在ARID1A 、 KMT2C 、 KMT2D 或RB1 基因中含有至少一種功能喪失型突變。該等方法可進一步或替代地包含向患者投與治療有效量之此式之化合物或其醫藥上可接受之鹽，條件係在來自患者之生物試樣針對ARID1A 、 KMT2C 、 KMT2D 或RB1 基因至中之少一種功能喪失型突變測試為陽性時選擇該患者進行治療。

本文亦提供用於療法中之此式之化合物及其醫藥上可接受之鹽。本文亦提供用於治療尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰臟癌、子宮頸癌、前列腺癌、血液癌症、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤之此式之化合物及其醫藥上可接受之鹽。在另一實例中，該治療可包含使用來自患者之生物試樣實施活體外分析，測定在ARID1A 、 KMT2C 、 KMT2D 及RB1 基因中是否存在至少一種不活化突變，及在任一基因中存在至少一種不活化突變時向患者投與治療有效量之此式之化合物或其醫藥上可接受之鹽。

亦提供此式之化合物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用以製造用於治療尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰臟癌、子宮頸癌、前列腺癌、血液癌症、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤之藥劑。此用途可包含使用來自患者之生物試樣實施活體外分析，測定在ARID1A 、 KMT2C 、 KMT2D 及RB1 基因中是否存在至少一種不活化突變，及在任一基因中存在至少一種不活化突變時向患者投與治療有效量之此式之化合物(包含R-對映異構體及S-對映異構體形式)或其醫藥上可接受之鹽。

本申請案主張2020年5月27日提出申請之歐洲申請案第20382446.1號之優先權權益，該申請案之內容以全文引用方式併入本文中。

本文闡述新穎選擇性CDK7抑制劑化合物。該等新化合物可解決強效治療癌症、尤其源自失調轉錄之癌症之需要。更具體而言，該等新化合物可解決強效治療尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰臟癌、子宮頸癌、前列腺癌、血液癌症、肉瘤、皮膚癌及/或神經膠質瘤之需要。

本文所闡述之化合物係式(I)化合物：

(I) 或其醫藥上可接受之鹽。在式(I)中，X係-CH(OH)CH₃ 、-CHFCH₃ 、-CF₂ CH₃ 或-CF₃ ；Y係-CH=CH₂ 或-C² H=C² H₂ 且Z係-CH(CH₃ )₂ 或-C² H(CH₃ )(CH₂ ² H)。式(I)之具體實例包含X係-CH(OH)CH₃ 、-CHFCH₃ 或-CF₂ CH₃ 、Y係-CH=CH₂ 且Z係- CH(CH₃ )₂ 之化合物。式(I)之其他實例包含X係-CF₃ 、Y係-CH=CH₂ 或-C² H=C² H₂ 且Z係- CH(CH₃ )₂ 或-C² H(CH₃ )(CH₂ ² H)之化合物。熟習此項技術者應瞭解，如由式(I)闡述之化合物或其醫藥上可接受之鹽含有對掌性中心，該對掌性中心之位置在上文中由*指示。熟習此項技術者亦應瞭解，對掌性中心之Cahn-Ingold-Prelog (R)或(S)名稱將端視對掌性中心周圍之取代模式而有所變化。式(I)化合物中之對掌性中心提供由式(II)展示之R-對映異構體形式及由式(III)展示之S-對映異構體形式：

(II)

(III) 本文亦提供式(II)及式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中X、Y及Z係如針對式(I)所定義。

可自對掌性試劑開始或藉由立體選擇性或立體特異性合成技術來製備特定對映異構體。或者，可藉由標準對掌性層析或結晶技術在合成式(I)、式(II)及式(III)之化合物之任何便利點處自不同對掌性形式之混合物分離單一對映異構體。式(II)及式(III)之化合物之所有個別對映異構體以及對映異構體混合物(包含外消旋物)皆意欲包含於本文中。

式(II)化合物之具體實例(包含IUPAC命名名稱)展示於本文中：

1-[(2R)-2-[[4-[[3-異丙基-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮；

1-[(2R)-2-[[4-[[6-(1,1-二氟乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮；

1-[(2R)-2-[[4-[[6-(1-氟乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮；

1-[(2R)-2-[[4-[[6-(1-羥乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮；

1-[(2R)-2-[[4-[[3-(1,2-二氘代-1-甲基-乙基)-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮；及

2,3,3-三氘代-1-[(2R)-2-[[4-[[3-異丙基-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮。

式(III)化合物之具體實例(包含IUPAC命名名稱)展示於本文中：

1-[(2S)-2-[[4-[[3-異丙基-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮；

1-[(2S)-2-[[4-[[6-(1,1-二氟乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮；

1-[(2S)-2-[[4-[[6-(1-氟乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮；

1-[(2S)-2-[[4-[[6-(1-羥乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮；

1-[(2S)-2-[[4-[[3-(1,2-二氘代-1-甲基-乙基)-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮；及

2,3,3-三氘代-1-[(2S)-2-[[4-[[3-異丙基-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮。

若干氘代分子特定地闡述於本文中，例如Y係-C² H=C² H₂ 且Z係-C² H(CH₃ )(CH₂ ² H)之式(I)化合物。其他氘代分子係可行的且本文考慮揭示所揭示分子中之氫可由氘代替者。

本文所闡述之化合物可經反應以形成醫藥上可接受之鹽，且意欲包含式(I)、式(II)及式(III)之化合物之醫藥上可接受之鹽以及式(I)、式(II)及式(III)之化合物之具體實例。醫藥上可接受之鹽及其常用製備方法在業內已眾所周知(例如參見 P. Stahl等人，Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use ，第2修訂版(Wiley-VCH, 2011)；S.M. Berge等人，「Pharmaceutical Salts,」 Journal of Pharmaceutical Sciences ，第66卷，第1期，1977年1月)。醫藥上可接受之有用鹽之具體實例包含鹽酸鹽及硫酸鹽，但此清單並不意欲具有排他性。

本文所闡述之化合物通常在較寬劑量範圍內有效。舉例而言，每天之劑量在約1 mg至約2 g之範圍內。應理解，化合物之實際投與量將由內科醫師根據包含以下各項之相關情況確定：擬治療病狀、所選投與途徑、實際投與之化合物、個別患者之年齡、體重及反應以及患者症狀之嚴重程度。

本文所闡述之化合物可調配為可藉由各種途徑投與之醫藥組合物。該等醫藥組合物及其製備方法在業內已眾所周知。(例如參見 Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro等人編輯，第21版，Mack Publishing Co., 2005))。具體而言，可組合如本文所闡述之式(I)、式(II)及式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。更特定而言，本文所闡述之式(I)、式(II)及式(III)之化合物可調配為醫藥組合物。另外，如本文所闡述之式(I)、式(II)及式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽可與一或多種其他治療劑進行組合。舉例而言，如本文所闡述之式(I)、式(II)及式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽可為用於治療癌症之醫藥組合物中之組分，其與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑及視情況一或多種其他治療劑進行組合。含有如本文所闡述之式(I)、式(II)及式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽之醫藥組合物可用於本文所闡述之方法中。

本文所用之術語「治療(treating或treat或treatment)」係指限制、減緩、中斷、停止或逆轉現有症狀、病狀或病症之進展或嚴重程度。

如本文中所使用，術語「癌症」及「癌性」係指或闡述患者之通常特徵在於細胞增殖失調之生理學病狀。此定義中包含良性及惡性癌症。「早期癌症」或「早期腫瘤」意指並非晚期或轉移或分類為0、I或II期癌症之癌症。癌症之實例包含(但不限於)尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰臟癌、子宮頸癌、前列腺癌、血液癌症、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤。

提供使用如本文所闡述之式(I)、式(II)或式(III)之化合物來治療癌症、尤其治療轉錄失調之癌症的方法。一種此類方法包含向有需要之患者投與治療有效量之如本文所闡述之式(I)、式(II)或式(III)之化合物。可使用本文所闡述組合物治療之癌症類型包含尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰臟癌、子宮頸癌、前列腺癌、血液癌症、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤。更具體而言，癌症類型可為結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。具體而言，癌症可為乳癌。該等類型之癌症可與ARID1A 、 KMT2C 、 KMT2D 或RB1 基因中之功能喪失型突變有關。因此，ARID1A 、KMT2C 、KMT2D 或RB1 基因中之功能喪失型突變可指示需要治療。ARID1A 、KMT2C 、KMT2D 或RB1 基因中之一或多者之功能喪失型突變可指示，使用本文所闡述之一或多種方法進行治療可能有用。

治療患者之尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰臟癌、子宮頸癌、前列腺癌、血液癌症、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤之另一方法包含：測試在來自患者之生物試樣中之ARID1A 、KMT2C 、KMT2D 或RB1 基因中是否存在至少一種功能喪失型突變；及在生物試樣針對ARID1A 、KMT2C 、KMT2D 或RB1 基因中之任一者中之至少一種功能喪失型突變測試為陽性時，向患者投與治療有效量之如本文所闡述之式(I)、式(II)或式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽。

治療患者之尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰臟癌、子宮頸癌、前列腺癌、血液癌症、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤之另一方法包含向患者投與治療有效量之如本文所闡述之式(I)、式(II)或式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽，條件係來自患者之生物試樣在ARID1A 、KMT2C 、KMT2D 或RB1 基因中含有至少一種功能喪失型突變。

治療患者之尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰臟癌、子宮頸癌、前列腺癌、血液癌症、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤之另一方法包含向患者投與治療有效量之如本文所闡述之式(I)、式(II)或式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽，條件係在來自患者之生物試樣針對ARID1A 、KMT2C 、KMT2D 或RB1 基因中之至少一種功能喪失型突變測試為陽性時選擇該患者進行治療。

在本文所闡述之方法中，生物試樣可為腫瘤試樣。在獲得生物試樣時，可使用熟習此項技術者已知之方法(例如基因體/DNA定序)來分析試樣。在該等方法中，可在首次投與如本文所闡述之式(I)、式(II)或式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽之前自患者獲得試樣。

如本文所闡述之式(I)、式(II)及式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽亦用於療法中且尤其用於治療轉失調錄之癌症。如本文所述，轉錄失調之癌症包含尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰臟癌、子宮頸癌、前列腺癌、血液癌症、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤。更具體而言，癌症類型可為結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。具體而言，癌症可為乳癌。可將式(I)、式(II)或式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽投與在ARID1A 、 KMT2C 、 KMT2D 或RB1 基因中具有至少一種不活化突變(如藉由使用來自患者之生物試樣實施活體外分析所測定)之患者。生物試樣可為腫瘤試樣，且可使用熟習此項技術者已知之方法(例如基因體/DNA定序)來分析腫瘤試樣。另外，可在首次投與如本文所闡述之式(I)、(II)或(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽之前自患者獲得試樣。如本文所闡述之式(I)、式(II)及式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽在療法中之用途可基於以下情形：患者因在ARID1A 、 KMT2C 、 KMT2D 或RB1 基因中具有至少一種不活化突變而選擇用於治療。在用於療法中時，可以約1 mg至2 g之劑量將如本文所闡述之式(I)、式(II)或式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽投與患者。

如本文所闡述之式(I)、式(II)或式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽可用以製造用於治療癌症之藥劑。可使用如本文所闡述之藥劑治療之癌症包含尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰臟癌、子宮頸癌、前列腺癌、血液癌症、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤。更具體而言，癌症類型可為結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。具體而言，癌症可為乳癌。如本文所闡述之式(I)、式(II)或式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽在藥劑製造中的用途亦可包含以下步驟：使用來自患者之生物試樣實施活體外分析，測定在ARID1A 、 KMT2C 、 KMT2D 或RB1 基因中是否存在至少一種不活化突變，及在任一基因存在至少一種不活化突變時向患者投與治療有效量之如本文所闡述之式(I)、式(II)或式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽。在該等用途中，生物試樣可為腫瘤試樣且可使用熟習此項技術者已知之方法(例如基因體/DNA定序)來分析腫瘤試樣。另外，在該等用途中，可在首次投與如本文所闡述之式(I)、式(II)及式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽之前自患者獲得試樣。如本文所闡述之式(I)、式(II)及式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽在療法中之該等用途可基於以下情形：患者因在ARID1A 、 KMT2C 、 KMT2D 或RB1 基因中具有至少一種不活化突變而選擇用於治療。另外，在該等用途中，可以約1 mg至2 g之劑量將如本文所闡述之式(I)、式(II)或式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽投與患者。

可藉由業內已知之各種程序以及下述製備及實例來製備式(I)、式(II)及式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽。可將該等途徑中之每一者之特定合成步驟以不同方式組合或與來自不同反應圖之步驟聯合來製備式(I)、式(II)及式(III)之化合物或其醫藥上可接受之鹽。下述方案中每一步驟之產物可藉由業內熟知之習用方法回收，包含萃取、蒸發、沈澱、層析、過濾、研磨及結晶。熟習此項技術者可容易地獲得試劑及起始材料。

熟習此項技術者可在藉由諸如選擇性結晶技術或對掌性層析等方法合成本文所闡述化合物中在任何便利點處分離或拆分個別異構體及對映異構體(例如參見 J. Jacques等人，「Enantiomers, Racemates, and Resolutions 」, John Wiley and Sons, Inc., 1981；以及E.L. Eliel及S.H. Wilen, 「Stereochemistry of Organic Compounds 」, Wiley-Interscience, 1994)。

用於合成由式(I)、式(II)及式(III)闡述之化合物之中間體及製程意欲包含於本說明中。

另外，本文所闡述之某些中間體可含有一或多個保護基團。端視特定反應條件及擬實施之特定轉變，可變保護基團可在每次出現時相同或不同。保護及去保護條件已為熟習此項技術者所熟知且闡述於文獻中(例如參見「Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis 」，第4版，Peter G.M. Wuts及Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007)。

呈現下列製備及實例以闡釋本文所闡述之方法及化合物。

製備及實例 某些縮寫定義如下：「¹ H NMR」係指¹ H-核磁共振；「eq」係指當量；「THF」係指四氫呋喃；「DCM」係指二氯甲烷；「NCS」係指N-氯琥珀醯亞胺；「NIS」係指N-碘琥珀醯亞胺；「IPA」係指異丙醇；「ACN」係指乙腈；「DIPEA」係指N,N-二異丙基乙基胺；「DMSO」係指二甲基亞碸；「EtOH」係指乙醇；「MTBE」係指甲基第三丁基醚；「TEA」係指三乙胺；「2-MeTHF」係指2-甲基四氫呋喃；「MeOH」係指甲醇；「UV」係指紫外；「RP-LC/MS」係指反相液相層析質譜；「ES/MS」係指電噴霧質譜；「DMEA」係指二甲基乙醇胺；「DMAP」係指二甲基胺基吡啶；「EtOAc」係指乙酸乙酯；「DMF」係指N,N -二甲基甲醯胺；「TFA」係指三氟乙酸；「SCX」係指強陽離子交換；「e.e.」係指對映異構體過量；「min」係指分鐘；「h」係指小時；「ATP」係指三磷酸腺苷；「DTT」係指二硫蘇糖醇；「HEPES」係指(4-(2-羥乙基)-1-六氫吡嗪乙磺酸)；「EDTA」係指乙二胺四乙酸；「ATCC」係指美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection)；「RT」係指室溫；「Rt」係指滯留時間；「PBS」係指磷酸鹽緩衝鹽水；「BSA」係指牛類血清白蛋白；「FBS」係指胎牛血清；「RNAase」係指核糖核酸酶；且「His」係指組胺酸。

反應圖1

反應圖1繪示化合物3之合成。可使用適當鹼將市售對掌性羥甲基嗎啉1轉化成對甲苯磺酸酯2。然後可經由親核取代使用市售4-胺基六氫吡啶置換磺酸酯2以提供經N-保護之對掌性嗎啉基六氫吡啶一級胺3。

反應圖2

反應圖2繪示化合物8之合成。可藉由在業內熟知之金屬催化(例如Pd)偶合條件下使用二苯基甲亞胺處理市售二氟乙基吡啶4來合成吡啶基甲亞胺5。可在酸性條件下將亞胺5去保護以提供2-胺基吡啶6。可藉由採用適宜氯化劑來達成區域選擇性氯加成以提供氯吡啶7。可在熟習此項技術者已知之各種條件下(包含(但不限於)環縮合、重排及氧化環化)自2-胺基吡啶7來合成咪唑并吡啶8。

反應圖3

反應圖3繪示式A化合物之合成。可藉由使用適當含碘試劑(例如NIS、I₂ )進行處理來碘化咪唑并吡啶9以提供3-碘咪唑并吡啶10。隨後可在熟習此項技術者熟知之各種條件下(包含金屬(例如Pd、Ni)催化反應)偶合3-碘咪唑并吡啶10以提供異丙烯基咪唑并吡啶11。可使用還原條件(包含(但不限於) Pd/C)在H₂ 氣體氣氛下自異丙烯基咪唑并吡啶11來合成異丙基咪唑并吡啶12。可使用4-胺基六氫吡啶3置換化合物12之芳基氯以提供胺基咪唑并吡啶13。可藉由使用適當強酸進行處理來將N-保護嗎啉13去保護以提供二級胺14。可藉由使用鹼及適當醯氯處理二級胺14來形成式A丙烯醯胺。

反應圖4

反應圖4繪示式A1化合物之合成。可使用適當錫試劑及金屬催化自雜芳基氯15來合成雜芳基烯醇醚16。使用適當強酸水溶液處理烯醇醚16以產生雜芳基酮17。隨後可使用諸多還原劑(例如使用金屬氫化物、硼氫化物鹽或二硼烷)在極性非質子溶劑中還原至二級醇18。可使用適當氟化試劑(例如DAST、Deoxofluor或XtalFluor)將二級醇18轉化成苄基氟19。然後可基本上如反應圖3中所闡述來製備式A1。

反應圖5

反應圖5繪示式A2化合物之合成。可使用過渡金屬催化在加壓氘氣氛及高溫下自異丙烯基咪唑并吡啶21來製備氘代異丙基咪唑并吡啶22。可藉由親核置換使用經N-保護之4-胺基六氫吡啶基本上如反應圖3中所闡述來取代雜芳基氯22並使用適當強酸去保護至二級胺。可基本上如反應圖1中所闡述使用經N-保護之嗎啉基磺酸酯2來取代六氫吡啶24並基本上如反應圖3中所闡述進行至式A2。

反應圖6

反應圖6繪示式A3之合成，該化合物可基本上如反應圖3中所闡述來製得。

反應圖7

反應圖7繪示式A4化合物之合成。可基本上如反應圖5中所闡述來將28去保護且隨後使用經N-保護之嗎啉基磺酸酯2進行取代。可基本上如反應圖4中所闡述來加成烯醇醚且隨後水解並還原至二級醇33。可基本上如反應圖3中所闡述來還原異丙烯基咪唑并吡啶33。可基本上如反應圖3中所闡述來將經N-保護之嗎啉基18去保護並形成式A4丙烯醯胺。

製備 1 N-[5-(1,1-二氟乙基)-2-吡啶基]-1,1-二苯基-甲亞胺

將二苯基甲亞胺(9.5 g, 52 mmol)、(外消旋)-2,2'-雙(二苯基膦基)-1,1'-聯萘(4.2 g, 6.5 mmol)及Cs₂ CO₃ (18.5 g, 57 mmol)添加2-溴-5-(1,1-二氟乙基)吡啶(10 g, 44 mmol)於甲苯(175 mL)中之溶液中。添加乙酸鈀(II) (0.98 g, 4.4 mmol)，使用N₂ 吹掃並在100℃下加熱。在16 h之後，經由矽藻土墊過濾並使用EtOAc (400 mL)洗滌。在減壓下去除溶劑以提供褐色油狀物。藉由使用EtOAc:己烷(0-30%梯度)洗脫之管柱層析純化殘餘物。合併適當部分並在減壓下濃縮以得到N-[5-(1,1-二氟乙基)-2-吡啶基]-1,1-二苯基-甲亞胺。在此製備後得到8.2 g (49%產率)黃色油狀物。ES/MS (m/z): 323 (M+H)。

製備 2 5-(1,1-二氟乙基)吡啶-2-胺

將HCl (5 M於IPA中，13 mL, 67 mmol)添加至N-[5-(1,1-二氟乙基)-2-吡啶基]-1,1-二苯基-甲亞胺(8.6 g, 27 mmol)於DCM (134 mL)及MeOH (134 mL)中之溶液中。在室溫攪拌1h。蒸發溶劑並使用己烷/MTBE (9:1) (50 mL)超音波處理殘餘物。傾析固體並再使用溶劑混合物(2 × 50 mL)洗。使用於MeOH中之2N NH₃ (40 mL)處理該固體。在減壓下蒸發溶劑，得到5-(1,1-二氟乙基)吡啶-2-胺。在此製備後得到4.77 g (96%產率)油狀白色固體。ES/MS (m/z): 159 (M+H)。¹ H NMR (400.13 MHz, DMSO): 8.10 (dd, J= 0.9, 2.3 Hz, 1H), 7.54-7.49 (m, 1H), 6.47 (dd, J= 0.6, 8.7 Hz, 1H), 6.31 (bs, 2H), 1.93 (t, J= 18 Hz, 3H)。

製備 3 3-氯-5-(1,1-二氟乙基)吡啶-2-胺

NCS (1.3 g, 9.8 mmol)經20分鐘逐份添加至5-(1,1-二氟乙基)吡啶-2-胺(1.5 g, 6.5 mmol)於ACN (26 mL)中之溶液中並在室溫攪拌3天。在減壓下去除揮發物並藉由SCX管柱(50 g): 2體積MeOH純化殘餘物。將粗製物質溶於DCM (5 × 3 mL)中並加載至管柱中。首先使用DCM洗，然後使用MeOH洗並使用於MeOH中之7M NH₃ (250 mL)洗脫。蒸發鹼性部分，提供3-氯-5-(1,1-二氟乙基)吡啶-2-胺。在此製備後得到1.17 g (84%產率)深褐色油狀物。ES/MS m/z (³⁵ Cl/³⁷ Cl) 193/195。¹ H NMR (400.13 MHz, DMSO): 8.12-8.11 (m, 1H), 7.76 (d, J= 2.1 Hz, 1H), 6.72 (s, 2H), 1.96 (t, J= 18 Hz, 3H)。

製備 4 8-氯-6-(1,1-二氟乙基)咪唑并[1,2-a]吡啶

使用2-氯乙醛(55質量%, 8.9 mL, 76 mmol)處理3-氯-5-(1,1-二氟乙基)吡啶-2-胺(4.5 g, 19 mmol)於EtOH (95 mL)中之溶液。使反應液回流2.5 h。蒸發EtOH並使用飽和NaHCO₃ 水溶液處理殘餘物，且使用DCM (2 × 80 mL)萃取。有機相經無水Na₂ SO₄ 乾燥，過濾並在減壓下濃縮，提供深褐色油狀物。藉由管柱層析使用EtOAc:己烷(0-60%梯度)洗脫純化殘餘物。合併適當溶離份並在減壓下濃縮，得到8-氯-6-(1,1-二氟乙基)咪唑并[1,2-a]吡啶。在此製備後得到1.48 g (36%產率)褐色油狀物。ES/MS m/z (³⁵ Cl/³⁷ Cl) 217/219。¹ H NMR (400.13 MHz, DMSO): 8.95 (q, J= 1.5 Hz, 1H), 8.15 (d, J= 1.3 Hz, 1H), 7.72 (d, J= 1.3 Hz, 1H), 7.64 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 2.06 (t, J= 19 Hz, 3H)。

製備 5 8-氯-6-(1,1-二氟乙基)-3-碘-咪唑并[1,2-a]吡啶

將NIS (1.7 g, 7.4 mmol)添加至8-氯-6-(1,1-二氟乙基)咪唑并[1,2-a]吡啶(1.48 g, 6.7 mmol)於ACN (34 mL)中之溶液中並在室溫下攪拌16 h。蒸發所有揮發物，將粗製材料溶於2-MeTHF (350 mL)中，使用1M Na₂ S₂ O₃ (1 × 50 mL)及飽和NaHCO₃ 水溶液(3 × 50 mL)洗滌。藉由無水Na₂ SO₄ 乾燥有機層，過濾並蒸發以得到褐色油狀物。藉由使用EtOAc:己烷(0-35%梯度)洗脫之管柱層析純化殘餘物。合併適當部分並在減壓下濃縮以得到8-氯-6-(1,1-二氟乙基)-3-碘-咪唑并[1,2-a]吡啶。在此製備後得到1.9 g (81%產率)淺褐色固體。ES/MS m/z (³⁵ Cl/³⁷ Cl) 343/345。¹ H NMR (400.13 MHz, DMSO): 8.36 (q, J= 1.5 Hz, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.78 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 2.11 (t, J= 19 Hz, 3H)。

製備 6 8-氯-6-(1,1-二氟乙基)-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶

將8-氯-6-(1,1-二氟乙基)-3-碘-咪唑并[1,2-a]吡啶(2.2 g, 6.4 mmol)溶於EtOH (43 mL)中。在N₂ 下添加於水中之1.2 M K₂ CO₃ (16 mL, 19.3 mmol)。使用出氣針利用N₂ 吹掃5 min。添加2-異丙烯基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環(dioxaborolane)㖦(1.25 g, 7.1 mmol)及BrettPhos Pd G3 (0.3 g, 0.32 mmol)。使用N₂ 再次吹掃5 min.並在室溫下攪拌20 h。去除揮發物並將殘餘物分配於2-MeTHF (22 mL)與水(11 mL)之間。使用2-MeTHF (22 mL)進一步萃取水層，藉由無水Na₂ SO₄ 乾燥有機物，過濾並蒸發所有揮發物以得到褐色油狀物。藉由使用EtOAc:己烷(0-40%梯度)洗脫之管柱層析純化殘餘物。合併適當部分並在減壓下濃縮以提供8-氯-6-(1,1-二氟乙基)-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶。在此製備後得到1.49 g (90%產率)淺褐色油狀物。ES/MS m/z (³⁵ Cl/³⁷ Cl) 257/259。¹ H NMR (400.21 MHz, DMSO): 8.61 (q, J= 1.5 Hz, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.70 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 5.51 (s, 1H), 5.47 (dd, J= 0.7, 1.4 Hz, 1H), 2.09 (t, J= 19 Hz, 3H)。

製備 7 8-氯-6-(1,1-二氟乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶

將8-氯-6-(1,1-二氟乙基)-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶(1.49 g, 5.80 mmol)溶於MeOH (41 mL)中。在N₂ 下添加鉑(128M型，5.34% Pt (以乾重計)，58%水分，1.06 g, 0.12 mmol)。在H₂ 氣氛(氣囊)下攪拌80 min。經由矽藻土墊過濾並使用1:1 MeOH/EtOH混合物(100 mL)洗脫。在減壓下去除所有揮發物以獲得8-氯-6-(1,1-二氟乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶。在此製備後得到1.47 g (91%產率)淺黃色油狀物。ES/MS m/z (³⁵ Cl/³⁷ Cl) 259/261。¹ H NMR (400.13 MHz, DMSO): 8.52 (q, J= 1.5 Hz, 1H), 7.61 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 7.56 (d, J= 0.7 Hz, 1H), 2.10 (t, J= 19 Hz, 3H), 1.33 (d, J= 6.8 Hz, 6H)。

製備 8 6,8-二氯-3-碘-咪唑并[1,2-a]吡啶

將NIS (70.3 g, 306 mmol)添加至6,8-二氯咪唑并[1,2-a]吡啶(52.1 g, 278.5 mmol)於ACN (1.4 L )中之溶液中並在室溫下攪拌30 h。過濾懸浮液並使用ACN洗滌固體。在空氣流下乾燥以提供淺褐色固體形式之6,8-二氯-3-碘-咪唑并[1,2-a]吡啶(54.4 g, 62%產率)。在減壓下蒸發母液。將粗製物溶於2-MeTHF (520 mL)中，使用Na₂ S₂ O₃ (25% w/v) (520 mL)及NaHCO₃ (9% w/v) (520 mL)洗滌。分離有機相，藉由無水MgSO₄ 乾燥並在減壓下濃縮以提供6,8-二氯-3-碘-咪唑并[1,2-a]吡啶。在此製備後得到30.4 g (35%產率)白色固體。ES/MS (m/z): (³⁵ Cl/³⁷ Cl) 312/314。¹ H NMR (400.21 MHz, CDCl₃ ): 8.17 (d, J= 1.7 Hz, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.38 (d, J= 1.7 Hz, 1H)。

製備 9 6,8-二氯-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶

在高壓管中添加6,8-二氯-3-碘-咪唑并[1,2-a]吡啶(54.9 g, 175.7 mmol)、1,4-二噁烷(1.1 L)及於水中之1.2 M K₂ CO₃ (440 mL, 527 mmol)。使用N₂ 流(三次)吹掃混合物，添加2-異丙烯基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環㖦(34.2 g, 193 mmol)、Brettphos Pd G3 (4.06 g, 4.39 mmol)並再次吹掃(3×)。封蓋該管並將混合物在50℃下加熱26 h。在減壓下去除揮發物。將殘餘物懸浮於2-MeTHF (550 mL)及水(275 mL)中。分離有機相，藉由無水MgSO₄ 乾燥，並在減壓下濃縮。藉由使用EtOAc:己烷(0-40%梯度)洗脫之急速層析純化殘餘物。合併適當部分並在減壓下濃縮以提供6,8-二氯-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶。在此製備後得到36.4 g (87%產率)黃色固體。ES/MS (m/z): (³⁵ Cl/³⁷ Cl) 227/229。

製備 10 6,8-二氯-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶

將6,8-二氯-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶(23.6 g, 98.7 mmol)、鉑(18.1 g, 2.0 mmol)及MeOH (592 mL)之溶液在室溫及H₂ 下攪拌7 h。經由矽藻土墊過濾混合物，使用MeOH沖洗並在減壓下濃縮。使用288 mL水研磨粗製材料過夜。在減壓下使用燒結式漏斗(3 Å孔徑)過濾。在空氣流下乾燥並在高真空下過夜以提供6,8-二氯-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶。在此製備後得到14.9 g (63%產率)白色固體。ES/MS (m/z): (³⁵ Cl/³⁷ Cl) 229/231。¹ H NMR (400.13 MHz, CDCl₃ ): 7.94 (d, J= 1.7 Hz, 1H), 7.50 (d, J= 0.6 Hz, 1H), 7.27 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 3.19-3.12 (m, 1H), 1.42 (d, J= 6.8 Hz, 6H)。

製備 11 (2R)-2-[[4-[(6-氯-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯

在高壓管中添加6,8-二氯-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶(1.0 g, 4.17 mmol)、(2R)-2-[(4-胺基-1-六氫吡啶基)甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(1.9 g, 6.25 mmol)、第三丁醇鈉(1.24 g, 12.5 mmol)及1,4-二噁烷(21 mL)。使N₂ 鼓泡至溶液中並添加BrettPhos Pd G3 (0.24 g, 0.25 mmol)。封蓋該管並將反應混合物在100℃及N₂ 下加熱22 h。將反應混合物冷卻至室溫，使用MTBE稀釋並使用水洗滌。分離有機相並使用MTBE (兩次)萃取水相。合併有機層，藉由無水Na₂ SO₄ 乾燥並在減壓下濃縮。藉由使用MeOH: DCM (0-3%梯度)洗脫之急速層析純化粗製材料。在減壓下濃縮適當部分並在高真空下乾燥以提供(2R)-2-[[4-[(6-氯-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯。在此製備後得到1.37 g (66%產率)微綠色發泡體。ES/MS (m/z): 492 (M+H)。¹ H NMR (400.21 MHz, DMSO): 7.74 (d, J= 1.7 Hz, 1H), 7.22 (s, 1H), 6.14 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 5.94 (d, J= 8.3 Hz, 1H), 3.86-3.68 (m, 3H), 3.49-3.41 (m, 3H), 3.26-3.20 (m, 1H), 2.87-2.79 (m, 3H), 2.40-2.31 (m, 2H), 2.23-2.10 (m, 2H), 1.90-1.87 (m, 2H), 1.62-1.50 (m, 2H), 1.41 (s, 9H), 1.28 (d, J= 6.8 Hz, 6H)。

製備 12 (2R)-2-[[4-[(6-乙醯基-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯

將三丁基(1-乙氧基乙烯基)錫烷(0.86 mL, 2.5 mmol)、CsF (0.59 g, 3.9 mmol)及XPhos- Pd G2 (0.15 g, 0.19 mmol)添加至(2R)-2-[[4-[(6-氯-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(1.0 g, 1.9 mmol)於甲苯(10 mL)中之溶液中。使用N₂ 吹掃溶液並在95℃下攪拌4 h。冷卻至室溫，經由矽藻土墊過濾混合物，使用EtOAc沖洗，並在減壓下濃縮。將殘餘物再溶於2-丙醇(19 mL)中。添加HCl (0.2 M於水中) (19 mL)並在室溫下攪拌5.5 h。使用飽和NaHCO₃ 溶液中和。添加EtOAc並攪拌10 min。分離有機層並使用額外EtOAc萃取水相。合併有機層，藉由無水Na₂ SO₄ 乾燥，並在減壓下濃縮。藉由矽膠純化粗製材料，其中首先使用DCM:己烷(50%等度)洗脫且然後使用MeOH: DCM (0-3%梯度)洗脫。在減壓下濃縮，在高真空下乾燥以提供(2R)-2-[[4-[(6-乙醯基-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯。在此製備後得到0.76 g (68 %產率)黃色發泡體固體。ES/MS (m/z): 500 (M+H)。¹ H NMR (400.13 MHz, CDCl₃ ): 8.04 (d, J= 1.4 Hz, 1H), 7.30 (d, J= 0.7 Hz, 1H), 6.60 (d, J= 1.1 Hz, 1H), 5.22-5.16 (m, 1H), 4.01-4.00 (m, 3H), 3.63-3.58 (m, 3H), 3.26-3.20 (m, 1H), 2.97-2.89 (m, 3H), 2.62 (s, 5H), 2.41-2.34 (m, 3H), 2.19-2.11 (m, 2H), 1.82-1.80 (m, 2H), 1.49 (s, 9H), 1.44 (d, J= 6.9 Hz, 6H)。

製備 13 外消旋-(2R)-2-[[4-[[6-(1-羥乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯

在N₂ 下，將(2R)-2-[[4-[(6-乙醯基-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(460 mg, 0.79 mmol)於MeOH (4 mL)中之溶液冷卻至0℃。逐份添加NaBH₄ (0.04 g, 0.9 mmol)並將混合物在室溫下攪拌15 min。使用MeOH稀釋並緩慢添加水。在減壓下去除有機溶劑。使用EtOAc稀釋殘餘物並使用水洗滌。合併有機層，藉由無水MgSO₄ 乾燥，過濾，並在減壓下濃縮以提供標題化合物。在此製備後得到0.4 g (88%產率)淺褐色固體。ES/MS (m/z): 502 (M+H)。¹ H NMR (400.21 MHz, CDCl₃ ): 7.38 (s, 1H), 7.22 (d, J= 0.7 Hz, 1H), 6.09 (d, J= 0.7 Hz, 1H), 5.12 (d, J= 7.9 Hz, 1H), 4.89 (q, J= 6.4 Hz, 1H), 3.97-3.86 (m, 3H), 3.60-3.50 (m, 3H), 3.19-3.12 (m, 1H), 2.94 (d, J= 9.5 Hz, 3H), 2.72-2.56 (m, 2H), 2.37-2.25 (m, 3H), 2.13-2.10 (m, 2H), 1.74-1.64 (m, 4H), 1.57 (d, J= 6.4 Hz, 3H), 1.49 (s, 9H), 1.39 (d, J= 6.8 Hz, 3H)。

製備 14 外消旋-(2R)-2-[[4-[[6-[1-氟乙基]-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯

在N₂ 下，向特氟龍管(teflon tube)中裝填(2R)-2-[[4-[[6-(1-羥乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(406 mg, 0.7 mmol)及DCM (2.3 mL)並冷卻至-78℃。依序添加TEA (0.1 mL, 0.7 mmol)、三甲胺三氫氟酸鹽(0.2 mL, 1.4 mmol)及Xtalfluoro-E (279 mg, 1.1 mmol)。將混合物在-78℃下攪拌30 min.且然後升溫至室溫，並攪拌20 h。冰冷卻混合物並藉由緩慢添加飽和NaHCO₃ 水溶液、水及DCM淬滅。使用DCM進一步萃取水層。合併有機層，藉由無水MgSO₄ 乾燥，過濾，並在減壓下濃縮。藉由使用MeOH: DCM (0-5%梯度)洗脫之矽膠純化粗製材料。在減壓下濃縮並在高真空下乾燥以提供外消旋(2R)-2-[[4-[[6-[1-氟乙基]-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(以星號表示對掌性)。在此製備後得到0.23 g (60%產率)褐色固體。ES/MS (m/z): 504 (M+H)。

製備 15 及 16 異構體1-(2R)-2-[[4-[[6-(1-氟乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯異構體2-(2R)-2-[[4-[[6-(1-氟乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯

純化外消旋(2R)-2-[[4-[[6-[1-氟乙基]-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(0.23 g, 0.4 mmol)。[儀器：SFC10 (Sepiatec)；管柱：Chiralpak IG (25 × 2 cm, 5 um)；移動相：CO₂ (A)/IPA (0.2% DMEA) (B)；洗脫程式：等度40% B；出口壓力：100巴；管柱溫度：40℃；流速：65 mL/min；檢測：220nm下之UV，從而提供以下兩種經分離之對映異構體：異構體1：在此方法後，獲得72 mg (2R)-2-[[4-[[6-(1-氟乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(19%產率)且係以褐色固體形式獲得。(藉由RP-LC/MS獲得非對掌性純度，Rt = 1.3 min, 92%)。ES/MS (m/z): 504 (M+H)。(對掌性分析，Rt = 1.1 min, e.e. ＞98%)。異構體2：在此方法後，獲得105 mg褐色固體形式之(2R)-2-[[4-[[6-(1-氟乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(27%產率)。(藉由RP-LC/MS獲得非對掌性純度，Rt = 1.3 min, 90%)。ES/MS (m/z): 504 (M+H)。(對掌性分析，Rt = 1.4 min, e.e. ＞98%)。儘管分離出製備15及16之異構體1及異構體2對映異構體，但每一對映異構體在星號位置處之特定對掌性未確定。

製備 17 異構體1- 6-(1-氟乙基)-3-異丙基-N-[1-[[(2S)-嗎啉-2-基]甲基]-4-六氫吡啶基]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-胺

將於二噁烷中之4M HCl (0.32 mL, 1.3 mmol)添加至異構體1-(2R)-2-[[4-[[6-(1-氟乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(72 mg, 0.13 mmol)於DCM (1.3 mL)中之溶液中並在室溫下攪拌1 h。在減壓下去除揮發物並在SCX管柱(10 g): 2體積MeOH中純化殘餘物。將粗製材料溶於MeOH中並加載至管柱中，使用MeOH洗滌並使用於MeOH中之2M NH₃ 洗脫。蒸發鹼性部分以提供異構體1- 6-(1-氟乙基)-3-異丙基-N-[1-[[(2S)-嗎啉-2-基]甲基]-4-六氫吡啶基]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-胺。在此製備後得到55 mg (98%產率)白色固體。ES/MS (m/z): 404 (M+H)。

實例 1 異構體1- 1-[(2R)-2-[[4-[[6-(1-氟乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮

將丙烯醯氯(0.009 ml, 0.118 mmol)逐滴添加至異構體1- 6-(1-氟乙基)-3-異丙基-N-[1-[[(2S)-嗎啉-2-基]甲基]-4-六氫吡啶基]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-胺(56 mg, 0.131 mmol)及TEA (0.07 ml, 0.527 mmol)於DCM (1.3 mL)中之冷溶液(冰浴)中並將混合物在此溫度下攪拌30 min。使用飽和NaHCO₃ 水溶液將反應混合物淬滅，在室溫下攪拌5 min，添加水，並使用DCM萃取。分離有機相併合併，藉由無水MgSO₄ 乾燥，過濾，並在減壓下濃縮。藉由使用MeOH: DCM (0-6%梯度)洗脫之矽膠純化粗製材料。在減壓下濃縮並在高真空下乾燥以提供異構體1- 1-[(2R)-2-[[4-[[6-(1-氟乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮。在此製備後得到20 mg (31%產率)白色固體。ES/MS (m/z): 458 (M+H)。¹ H NMR (400.21 MHz, CDCl₃ ): 7.38 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 6.62-6.60 (m, 1H), 6.35 (dd, J= 1.7, 16.8 Hz, 1H), 6.09-6.07 (m, 1H), 5.77-5.74 (m, 1H), 5.70-5.55 (m, 1H), 4.60-4.56 (m, 1H), 4.01-3.95 (m, 2H), 3.69-3.65 (m, 3H), 3.34-3.32 (m, 5H), 2.66-2.61 (m, 7H), 1.75-1.68 (m, 5H), 1.40 (dd, J= 0.5, 6.8 Hz, 6H)。

製備 18 異構體2- 6-(1-氟乙基)-3-異丙基-N-[1-[[(2S)-嗎啉-2-基]甲基]-4-六氫吡啶基]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-胺

將於二噁烷中之4M HCl (0.4 mL, 1.8 mmol)添加至異構體2- (2R)-2-[[4-[[6-(1-氟乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(90 mg, 0.18 mmol)於DCM (1.8 mL)中之溶液中並在室溫下攪拌1 h。在減壓下去除揮發物並在SCX管柱(10 g): 2體積MeOH中純化殘餘物。將粗製材料溶於MeOH中並加載至管柱中，使用MeOH洗滌並使用於MeOH中之2M NH₃ 洗脫。蒸發鹼性部分以提供異構體2- 6-(1-氟乙基)-3-異丙基-N-[1-[[(2S)-嗎啉-2-基]甲基]-4-六氫吡啶基]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-胺。在此製備後得到75 mg (98%產率)淺褐色固體。ES/MS (m/z): 404 (M+H)。

實例 2 異構體2- 1-[(2R)-2-[[4-[[6-(1-氟乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮

將丙烯醯氯(0.012 ml, 0.159 mmol)逐滴添加至異構體2- 6-(1-氟乙基)-3-異丙基-N-[1-[[(2S)-嗎啉-2-基]甲基]-4-六氫吡啶基]咪唑并[1,2-a]吡啶-8-胺(75 mg, 0.176 mmol)及TEA (0.098 mL, 0.706 mmol)於DCM (1.7 mL)中之冷溶液(冰浴)中並將混合物在此溫度下攪拌30 min。使用飽和NaHCO₃ 水溶液將反應混合物淬滅，在室溫下攪拌5 min，添加水並使用DCM萃取。分離有機相併合併，且藉由無水MgSO₄ 乾燥。過濾並在減壓下濃縮。藉由使用MeOH: DCM (0-6%梯度)洗脫之矽膠純化粗製材料。在減壓下濃縮並在高真空下乾燥以提供異構體2- 1-[(2R)-2-[[4-[[6-(1-氟乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮。在此製備後得到28 mg (33%產率)淺褐色固體。ES/MS (m/z): 458 (M+H)。¹ H NMR (400.13 MHz, CDCl₃ ): 7.37 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 6.66-6.61 (m, 1H), 6.34 (dd, J= 1.7, 16.8 Hz, 1H), 6.06 (s, 1H), 5.77-5.57 (m, 2H), 4.61-4.57 (m, 1H), 4.00-3.95 (m, 2H), 3.69-3.65 (m, 3H), 3.33-3.32 (m, 5H), 2.67-2.62 (m, 7H), 1.75-1.68 (m, 5H), 1.40 (d, J= 6.9 Hz, 6H)。

製備 19 4-[(6-氯-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)胺基]六氫吡啶-1-甲酸第三丁基酯

向高壓器皿中裝填6,8-二氯-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶(3.42 g, 12.3 mmol)、1,4-二噁烷(84 mL)、4-胺基六氫吡啶-1-甲酸第三丁基酯(3.05 g, 15.2 mmol)及第三丁醇鈉(3.65 g, 38.0 mmol)。使N₂ 鼓泡至溶液中並添加Brettphos Pd G3 (940 mg, 1.02 mmol)。再次將N₂ 鼓泡至所得混合物中，封蓋管並將反應混合物在95℃及N₂ 下加熱2 h。將反應混合物冷卻至室溫，使用EtOAc稀釋，並使用飽和NaHCO₃ 水溶液洗滌。分離有機相並飽和NaCl水溶液洗滌，藉由無水MgSO₄ 乾燥，過濾，並在減壓下濃縮。藉由急速層析純化殘餘物，使用MTBE:己烷混合物(10-60%梯度)洗脫，隨後使用丙酮:己烷(10-40%梯度)洗脫。在減壓下濃縮並乾燥以提供4-[(6-氯-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)胺基]六氫吡啶-1-甲酸第三丁基酯。在此製備後得到3.16 g (62.8%產率)黃色油狀物。ES/MS (m/z): 391 (M+H)。¹ H NMR (400.13 MHz, DMSO): 7.88 (d, J= 1.7 Hz, 1H), 7.56 (s, 1H), 6.33 (d, J= 1.7 Hz, 1H), 6.20 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 5.35 (d, J= 30.3 Hz, 2H), 3.95 (d, J= 12.8 Hz, 2H), 3.72-3.62 (m, 1H), 2.99-2.81 (m, 2H), 2.17 (s, 3H), 1.90 (dd, J= 2.0, 12.7 Hz, 2H), 1.58-1.37 (m, 2H), 1.42 (s, 9H)。

製備 20 6-氯-3-異丙烯基-N-(4-六氫吡啶基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-胺

將TFA (12 mL, 158.7 mmol)添加至4-[(6-氯-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)胺基]六氫吡啶-1-甲酸第三丁基酯(2.96 g, 7.57 mmol)於DCM (50 mL)中之溶液中並將混合物在室溫下攪拌1 h。在減壓下去除揮發物並將殘餘物溶於MeOH中。將溶液加載於經MeOH預處理之SCX柱(50 g)上。使用MeOH及MeOH (7N NH₃ )洗脫。收集鹼性部分並在真空中濃縮以產生6-氯-3-異丙烯基-N-(4-六氫吡啶基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-胺。在此製備後得到2.2 g (98.9%產率)綠色油狀物。ES/MS (m/z): 291 (M+H)。¹ H NMR (400.13 MHz, DMSO): 7.87 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 7.55 (s, 1H), 6.26 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 5.98 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 5.35 (d, J= 29.7 Hz, 2H), 3.59-3.53 (m, 2H), 2.97-2.92 (m, 2H), 2.60 (td, J= 12.1, 2.1 Hz, 2H), 2.17 (d, J= 0.6 Hz, 3H), 1.90-1.87 (m, 2H), 1.58-1.37 (m, 2H)。

製備 21 (2R)-2-[[4-[(6-氯-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯

將DIPEA (4 mL, 22.9 mmol)添加至6-氯-3-異丙烯基-N-(4-六氫吡啶基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-胺(2.2 g, 7.5 mmol)及(2S)-2-(對-甲苯基磺醯基氧基甲基)嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(3.4 g, 9.2 mmol)於無水ACN (25 mL)中之經攪拌溶液中。將混合物在100℃下攪拌過夜。將反應混合物冷卻至室溫並在減壓下蒸發揮發物。藉由急速層析使用MeOH: DCM (0-10%梯度)來純化殘餘物。在真空中濃縮以產生(2R)-2-[[4-[(6-氯-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯。在此製備後得到2.18 g (59%產率)淺綠色半固體。ES/MS (m/z): 490 (M+H)。¹ H NMR (400.13 MHz, CDCl₃ ): 7.80 (d, J= 1.7 Hz, 1H), 7.44 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 6.09 (d, J= 1.7 Hz, 1H), 5.34-5.25 (m, 3H), 4.02-3.97 (m, 3H), 3.60-3.52 (m, 3H), 2.95 (d, J= 8.3 Hz, 3H), 2.69-2.63 (m, 2H), 2.38-2.25 (m, 3H), 2.13-2.10 (m, 2H), 1.75-1.65 (m, 3H), 1.49 (s, 9H)。

製備 22 (2R)-2-[[4-[[6-(1-乙氧基乙烯基)-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯

向微波管中添加於甲苯(17 mL)中之(2R)-2-[[4-[(6-氯-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(0.42 g, 0.85 mmol)、三丁基(1-乙氧基乙烯基)錫(0.39 mL, 1.12 mmol)、氯(2-二環己基膦基-2',4',6'-三-異丙基-1,1'-聯苯)(2'-胺基-1,1'-聯苯-2-基)鈀(II) (75 mg, 0.093 mmol)及CsF (0.26 g, 1.71 mmol)之溶液。將N₂ 鼓泡至反應混合物中並持續5 min，封蓋管並在100℃下加熱3 h。冷卻至室溫，將EtOAc添加至粗製混合物中並經由矽藻土墊過濾，且使用EtOAc沖洗。在減壓下去除揮發物以提供(2R)-2-[[4-[[6-(1-乙氧基乙烯基)-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯。在此製備後得到0.757 g (粗製材料)褐色油狀物。ES/MS (m/z): 526 (M+H)。

製備 23 (2R)-2-[[4-[(6-乙醯基-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯

將於水中之HCl (4 mL, 0.2 M)添加至(2R)-2-[[4-[[6-(1-乙氧基乙烯基)-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(0.72 g, 0.82 mmol)於2-丙醇(1.5 mL)中之溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌1 h。添加EtOAc，隨後添加NaHCO₃ 飽和水溶液並將混合物在室溫下攪拌1 h。分離有機層，使用水洗滌，藉由無水MgSO₄ 乾燥，過濾，並在減壓下濃縮。藉由使用EtOH:己烷(20-50%梯度)洗脫之急速層析純化殘餘物以得到(2R)-2-[[4-[(6-乙醯基-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯。在此製備後得到0.25 g (58%產率)褐色油狀物。ES/MS (m/z): 498 (M+H)。¹ H NMR (400.13 MHz, DMSO): 8.50 (d, J= 1.3 Hz, 1H), 7.65 (s, 1H), 6.54 (d, J= 1.1 Hz, 1H), 5.87 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 5.51 (s, 1H), 5.40 (s, 1H), 3.89-3.77 (m, 3H), 3.50-3.43 (m, 4H), 2.90-2.75 (m, 3H), 2.60 (s, 3H), 2.42-2.33 (m, 2H), 2.28-2.10 (m, 4H), 1.97-1.78 (m, 2H), 1.65-1.54 (m, 3H), 1.41 (s, 9H)。

製備 24 外消旋-(2R)-2-[[4-[[6-(1-羥乙基)-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯

將NaBH₄ (0.04 g, 1.03 mmol)添加至(2R)-2-[[4-[(6-乙醯基-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(0.39 g, 0.756 mmol)於EtOH (7.5 mL)中之溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌1 h。添加水，隨後添加EtOAc以中和過量NaBH₄ 。分離有機層，藉由無水MgSO₄ 乾燥，過濾，並在減壓下濃縮以提供外消旋(2R)-2-[[4-[[6-(1-羥乙基)-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(以星號表示對掌性)。在此製備後得到0.376 g (粗製材料，94%產率)褐色油狀物。ES/MS (m/z): 500 (M+H)。¹ H NMR (400.13 MHz, DMSO): 7.83 (s, 1H), 7.50 (s, 1H), 6.21 (s, 1H), 5.54-5.18 (m, 4H), 4.75-4.69 (m, 1H), 4.09 (q, J= 5.3 Hz, 1H), 3.90-3.77 (m, 3H), 3.52-3.27 (m, 5H), 2.92-2.88 (m, 2H), 2.42-2.33 (m, 2H), 2.18-2.15 (m, 4H), 2.02-1.95 (m, 2H), 1.41-1.36 (m, 14H)。

製備 25 外消旋-(2R)-2-[[4-[[6-(1-羥乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯

將鈀(10質量%)/林德拉觸媒(Lindlar catalyst) (0.25 g, 0.23 mmol)添加至外消旋(2R)-2-[[4-[[6-(1-羥乙基)-3-異丙烯基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(0.29 g, 0.59 mmol)於MeOH (30 mL)中之溶液中。將N₂ 鼓泡至所得混合物中，隨後經歷三個真空-H₂ 循環。將反應混合物在H₂ (1 atm)及室溫下攪拌5 h。經由矽藻土墊過濾反應混合物並使用MeOH充分洗滌。在減壓下去除揮發物並乾燥以提供外消旋(2R)-2-[[4-[[6-(1-羥乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(以星號表示對掌性)。在此製備後得到0.18 g (55.6%產率)褐色固體。ES/MS (m/z): 502 (M+H)。¹ H NMR (400.21 MHz, DMSO): 7.47 (s, 1H), 7.15 (d, J= 0.7 Hz, 1H), 6.13 (s, 1H), 5.43-5.41 (m, 1H), 5.27-5.22 (m, 1H), 4.72-4.68 (m, 1H), 3.90-3.85 (m, 4H), 3.50-3.27 (m, 8H), 3.23-3.16 (m, 1H), 2.96-2.93 (m, 4H), 2.40-2.33 (m, 2H), 2.29-2.28 (m, 2H), 2.03-2.00 (m, 2H), 1.41-1.29 (m, 14H)。

製備 26 外消旋-1-[3-異丙基-8-[[1-[[(2S)-嗎啉-2-基]甲基]-4-六氫吡啶基]胺基]咪唑并[1,2-a]吡啶-6-基]乙醇

將TFA (0.5 mL)添加至外消旋(2R)-2-[[4-[[6-(1-羥乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(160 mg, 0.319 mmol)於DCM (3 mL)中之溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌2 h。在減壓下蒸發溶劑並藉由SCX (10 g柱)純化殘餘物，使用MeOH (3 CV)洗脫，然後使用於MeOH中之2N NH₃ (3 CV)洗脫。合併鹼性部分並在真空中去除溶劑以得到外消旋1-[3-異丙基-8-[[1-[[(2S)-嗎啉-2-基]甲基]-4-六氫吡啶基]胺基]咪唑并[1,2-a]吡啶-6-基]乙醇(以星號表示對掌性)。在此製備後得到120 mg (88%產率)褐色固體。ES/MS (m/z): 402 (M+H)。¹ H NMR (400.13 MHz, DMSO): 7.47 (s, 1H), 7.15 (s, 1H), 6.12 (s, 1H), 5.39 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 5.18-5.11 (m, 1H), 4.74-4.65 (m, 1H), 3.72-3.63 (m, 1H), 3.50-3.45 (m, 4H), 3.23-3.14 (m, 2H), 2.90-2.73 (m, 2H), 2.70-2.63 (m, 2H), 2.43-2.41 (m, 4H), 2.04-2.01 (m, 2H), 1.62-1.55 (m, 2H), 1.38-1.29 (m, 10H)。

實例 3 外消旋-1-[(2R)-2-[[4-[[6-(1-羥乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮

將DIPEA (156 μL, 0.894 mmol)添加至外消旋1-[3-異丙基-8-[[1-[[(2S)-嗎啉-2-基]甲基]-4-六氫吡啶基]胺基]咪唑并[1,2-a]吡啶-6-基]乙醇(120 mg, 0.299 mmol)於乙腈(5 mL)中之溶液中。在0℃下冷卻反應混合物並逐滴添加丙-2-烯醯氯(25 μL, 0.307 mmol)於DCM (1.5 mL)中之溶液。將所得混合物在0℃下攪拌60 min。在減壓下蒸發溶劑。使用NaHCO₃ 飽和溶液處理反應混合物並使用EtOAc萃取。使用水洗滌有機層，藉由無水MgSO₄ 乾燥，過濾，並在減壓下濃縮。藉由使用於MeOH中之7N NH₃ :DCM (0-10%梯度)洗脫之急速層析純化殘餘物。濃縮適當部分以提供外消旋-1-[(2R)-2-[[4-[[6-(1-羥乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮(以星號表示對掌性)。在此製備後得到72 mg (47%產率)黃色油狀物。ES/MS (m/z): 456 (M+H)。

實例 4 及 5 異構體3：1-[(2R)-2-[[4-[[6-(1-羥乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮，異構體4：1-[(2R)-2-[[4-[[6-(1-羥乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮

藉由對掌性層析純化外消旋-1-[(2R)-2-[[4-[[6-(1-羥乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮(0.072 g, 0.141 mmol)。[儀器：SFC10 (Sepiatec)，管柱：Chiralpak AD (25 cm × 2 cm, 5 um)。移動相：CO₂ (A)/MeOH (0.2% DMEA)(B)。洗脫程式：20%等度。流速：65 mL/min。載量：每9.92 min注射15 mg.]，從而提供以下兩種經分離之對映異構體：異構體3：在此方法後，獲得18.4 mg淺黃色油狀物形式之1-[(2R)-2-[[4-[[6-(1-羥乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮(27%產率)。(藉由RP-LC/MS獲得非對掌性純度，Rt = 0.87 min, 96%)。(對掌性分析，Rt = 0.92 min, e.e. ＞98%)。ES/MS (m/z): 456 (M+H)。¹ H NMR (400.21 MHz, DMSO): 7.47 (s, 1H), 7.15 (s, 1H), 6.82-6.75 (m, 1H), 6.15-6.11 (m, 2H), 5.71 (d, J= 10.3 Hz, 1H), 5.47-5.39 (m, 1H), 5.14 (d, J= 4.4 Hz, 1H), 4.73-4.67 (m, 1H), 4.41-4.23 (m, 1H), 4.00-3.86 (m, 2H), 3.51-3.47 (m, 3H), 3.25-3.20 (m, 1H), 3.01-2.92 (m, 3H), 2.48-2.33 (m, 3H), 2.30-2.17 (m, 2H), 1.95-1.92 (m, 2H), 1.58-1.50 (m, 2H), 1.38-1.29 (m, 9H)。異構體4：在此方法後，獲得24.5 mg淺黃色油狀之1-[(2R)-2-[[4-[[6-(1-羥乙基)-3-異丙基-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮(36.7%產率)。(藉由RP-LC/MS獲得非對掌性純度，Rt = 0.87 min, 97%)。(對掌性分析，Rt = 1.16 min, e.e. ＞90%)。ES/MS (m/z): 456(M+H)。¹ H NMR (400.21 MHz, DMSO): 7.47 (s, 1H), 7.15 (s, 1H), 6.79 (dd, J= 10.4, 16.5 Hz, 1H), 6.15-6.11 (m, 2H), 5.71 (d, J= 10.3 Hz, 1H), 5.44-5.39 (m, 1H), 5.15 (d, J= 4.4 Hz, 1H), 4.73-4.67 (m, 1H), 4.41-4.14 (m, 1H), 3.97-3.80 (m, 3H), 3.23-3.13 (m, 2H), 2.98-2.85 (m, 3H), 2.45-2.33 (m, 3H), 2.26-2.14 (m, 2H), 1.95-1.92 (m, 2H), 1.60-1.47 (m, 2H), 1.38-1.29 (m, 9H)。儘管分離出實例4及5之異構體3及異構體4對映異構體，但每一對映異構體在星號位置之特定對掌性未確定。

實例 6 2,3,3-三氘-1-[(2R)-2-[[4-[[3-異丙基-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮

在室溫將2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧雜三磷烷-2,4,6-三氧化物(50%於DMF中) (0.25 mL, 0.42 mmol)添加至2,3,3-三氘丙-2-烯酸(0.029 g, 0.3863 mmol，如Adv. Synth. Catal. 2018 ,360 , 2303中所闡述製得)及3-異丙基-N-[1-[[(2S)-嗎啉-2-基]甲基]-4-六氫吡啶基]-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-胺(0.15 g, 0.35 mmol)於無水DMF (3 mL)及TEA (0.2 mL, 1 mmol)中之溶液中並將混合物攪拌2小時。反應混合物使用1 mL NaHCO₃ 飽和水溶液淬滅並使用MTBE (兩次)萃取。分離及合併有機相，且經無水Na₂ SO₄ 乾燥。過濾並在減壓下濃縮。藉由使用DCM: (DCM: MeOH 9/1) (0%等度(isocratic))、然後使用梯度DCM: (DCM: MeOH 9/1) (0-60%梯度)洗脫來純化粗製物質。在減壓下濃縮並在高真空下乾燥，提供2,3,3-三氘-1-[(2R)-2-[[4-[[3-異丙基-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮。在此製備後得到85.6 mg (50%產率)白色固體。ES/MS (m/z): 482 (M+H)。(非對掌性Rt= 1.128 min., 100%)。¹ H NMR (400.21 MHz, DMSO): 8.02 (s, 1H, NH), 7.34 (s,1H), 6.11-6.03 (m, 1H), 4.40-4.12 (m, 1H), 4.00-3.80 (m, 2H), 3.51-3.27 (m, 3H), 3.22-3.08 (m, 1H), 2.90-2.80 (m, 3H), 2.41-2.40 (d, J= 5.5Hz, 2H), 2.25-2.14 (m, 2H), 1.91-1.88 (m, 2H), 1.63-1.55 (m, 2H), 1.30 (d, J= 6 Hz, 6H)。

製備 27 8-氯-3-[外消旋-1,2-二氘-1-甲基-乙基]-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶

在手套箱中，使用攪拌棒將1,1'-雙(二-異丙基膦基)二茂鐵(1,5-環辛二烯)四氟硼酸銠(I) (0.124 g, 0.17 mmol)等分至三個10-20 mL Biotage管中。將8-氯-3-異丙烯基-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶(1.84 g, 7.04 mmol)溶於THF (24 ml)中，並將溶液均分至三個小瓶中。封蓋小瓶並自手套箱取出。將小瓶置於高壓滅菌器中(一起)。向每一小瓶中插入針以容許氣體流動。密封高壓滅菌器並使用氘吹掃三次直至最終壓力為80 psi。將混合物攪拌3h 40 min。將高壓滅菌器排氣並打開三個含有橙色溶液之管。使用EtOAc沖洗至燒瓶中。合併三個管並在減壓下去除溶劑。將殘餘物溶於DCM中並藉由矽膠使用EtOAc: DCM之梯度(0-20%梯度)進行純化。在減壓下去除溶劑以提供8-氯-3-[外消旋-1,2-二氘代-1-甲基-乙基]-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶(以星號表示對掌性)。在此製備後得到1.72 g (92%產率)淺黃色固體。ES/MS m/z (³⁵ Cl/³⁷ Cl): 265/267。¹ H NMR (399.80 MHz, DMSO): 8.93-8.92 (m, 1H), 7.75 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H), 1.31-1.30 (m, 5H)。

製備 28 4-[[3-[外消旋-1,2-二氘代-1-甲基-乙基]-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]六氫吡啶-1-甲酸第三丁基酯

向密封管中添加8-氯-3-[外消旋-1,2-二氘代-1-甲基-乙基]-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶(0.503 g, 1.90 mmol)、4-胺基六氫吡啶-1-甲酸第三丁基酯(0.418 g, 2.09 mmol)、第三丁醇鈉(0.6 g, 6 mmol)及1,4-二噁烷(10 mL)。使用N₂ 吹掃混合物，隨後抽真空(3個循環)。添加brettphos Pd G3 (0.1 g, 0.1 mmol)，再次使用N₂ -真空吹掃，封蓋管並將混合物在95℃下加熱2.5 h。將反應混合物冷卻至室溫，使用MTBE稀釋混合物並使用水洗滌。分離有機相並使用MTBE (3×)萃取水層。合併有機相，藉由無水Na₂ SO₄ 乾燥，過濾並在減壓下濃縮以提供褐色油殘餘物。藉由使用DCM/Hex及DCM/MeOH (1:1) (0-2%梯度)洗脫之矽膠柱純化殘餘物。收集適當部分，去除揮發物並在高真空下乾燥以提供4-[[3-[外消旋-1,2-二氘代-1-甲基-乙基]-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]六氫吡啶-1-甲酸第三丁基酯(以星號表示對掌性)。在此製備後得到0.52 g (55%產率)黃色發泡體。ES/MS (m/z): 429 (M+H)。

製備 29 3-(外消旋-1,2-二氘代-1-甲基-乙基)-N-(4-六氫吡啶基)-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-胺

將TFA (1.6 mL, 21 mmol)添加至4-[[3-[外消旋-1,2-二氘代-1-甲基-乙基]-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]六氫吡啶-1-甲酸第三丁基酯(0.524 g, 1.05 mmol)於DCM (7 mL)中之溶液中並將混合物在室溫下攪拌3 h。使用水(20 mL)處理反應混合物，分離有機層，並棄除。使用NaHCO₃ 飽和溶液處理水層並使用DCM (3× 20 mL)萃取。合併有機相，藉由無水Na₂ SO₄ 乾燥，過濾，並濃縮以產生3-(外消旋-1,2-二氘代-1-甲基-乙基)-N-(4-六氫吡啶基)-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-胺(以星號表示對掌性)。在此製備後得到0.27 g (78%產率)黃色固體。ES/MS (m/z) 329 (M+H)⁺ 。¹ H NMR (400.21 MHz, CDCl₃ ): 7.68 (d, J= 1.2 Hz, 1H), 7.29 (d, J= 7.1 Hz, 1H), 6.15 (d, J= 1.2 Hz, 1H), 5.36-5.32 (m, 1H), 3.62-3.53 (m, 1H), 3.22 (d, J= 11.7 Hz, 2H), 2.83 (t, J= 10.0 Hz, 2H), 2.25-2.04 (m, 3H), 1.58-1.50 (m, 2H), 1.40-1.39 (m, 5H)。

製備 30 (2R)-2-[[4-[[3-[外消旋-1,2-二氘代-1-甲基-乙基]-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯

向密封管中添加3-(外消旋-1,2-二氘代-1-甲基-乙基)-N-(4-六氫吡啶基)-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-胺(0.27 g, 0.82 mmol)、(2S)-2-(對-甲苯基磺醯基氧基甲基)嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(0.361 g, 0.97 mmol)及ACN (4 mL)。將TEA (0.23 mL, 1.7 mmol)添加至所得橙色溶液中。封蓋燒瓶並將混合物在95℃下加熱24 h。在真空下去除揮發物並使用DCM (20 mL)及水(20 mL)處理殘餘物。分離有機層並使用DCM (2×)萃取水層。藉由無水Na₂ SO₄ 乾燥合併之有機物，過濾，並在減壓下濃縮。藉由使用MeOH: DCM (0-3%梯度)洗脫之矽膠純化殘餘物。合併適當部分，去除揮發物並在高真空下乾燥以提供(2R)-2-[[4-[[3-[外消旋-1,2-二氘代-1-甲基-乙基]-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(以星號表示對掌性)。在此製備後得到0.34 g (69%產率)微紅色固體。ES/MS (m/z): 528 (M+H)。

製備 31 3-[外消旋-1,2-二氘代-1-甲基-乙基]-N-[1-[[(2S)-嗎啉-2-基]甲基]-4-六氫吡啶基]-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-胺

將TFA (0.855 mL, 11.3 mmol)添加至(2R)-2-[[4-[[3-[外消旋-1,2-二氘代-1-甲基-乙基]-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(338 mg, 0.56 mmol)於DCM (5 mL)中之溶液中。將所得混合物在室溫下攪拌16 h。使用飽和NaHCO₃ 水溶液(30 mL)處理反應混合物並使用DCM (2 × 15 mL)萃取。合併有機相，藉由無水Na₂ SO₄ 乾燥，過濾，並在減壓下濃縮以產生3-[外消旋-1,2-二氘代-1-甲基-乙基]-N-[1-[[(2S)-嗎啉-2-基]甲基]-4-六氫吡啶基]-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-胺(以星號表示對掌性)。在此製備後得到222 mg (82.3%產率)微紅色發泡體。ES/MS (m/z): 428 (M+H)。

實例 7 1-[(2R)-2-[[4-[[3-[外消旋-1,2-二氘代-1-甲基-乙基]-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮

在0℃下，將TEA (0.199 mL, 1.43 mmol)、隨後丙烯醯氯(0.048 mL, 0.58 mmol)添加至3-[外消旋-1,2-二氘代-1-甲基-乙基]-N-[1-[[(2S)-嗎啉-2-基]甲基]-4-六氫吡啶基]-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-胺(220 mg, 0.46 mmol)於二氯甲烷(2.2 mL)中之冷卻溶液中。將所得混合物在此溫度下攪拌20 min。使用5 mL飽和NaHCO₃ 水溶液將反應混合物淬滅並使用DCM (2×)萃取。合併有機層，藉由無水Na₂ SO₄ 乾燥，過濾，並在減壓下濃縮。藉由使用MeOH: DCM (0- 4%梯度)洗脫之矽膠純化殘餘物。合併適當部分，去除揮發物，並在高真空下乾燥以提供1-[(2R)-2-[[4-[[3-[外消旋-1,2-二氘代-1-甲基-乙基]-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮(以星號表示對掌性)。在此製備後得到103 mg (45.3%產率)微紅色發泡體。ES/MS (m/z): 482 (M+H)。¹ H NMR (400.21 MHz, CD₃ OD): 7.96 (s, 1H), 7.34 (s, 1H), 6.83-6.73 (m, 1H), 6.30-6.22 (m, 2H), 5.79 (d, J= 10.5 Hz, 1H), 4.48-4.45 (m, 4H), 4.07-3.96 (m, 2H), 3.68-3.56 (m, 3H), 3.15-2.91 (m, 2H), 2.67-2.49 (m, 4H), 2.13 (dd, J= 4.0, 8.9 Hz, 2H), 1.75-1.67 (m, 2H), 1.40-1.38 (m, 5H)。

製備 33 (2S)-2-(對-甲苯基磺醯基氧基甲基)嗎啉-4-甲酸第三丁基酯

將DMAP (5.62 g, 46.1 mmol, 0.1當量)、TEA (112 g, 154 mL, 1.11 mol, 2.4當量)及對甲苯磺醯氯(105.4 g, 553 mmol, 1.2當量)添加至(2S)-2-(羥甲基)嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(100 g, 461 mmol)於THF (921 mL)中之溶液中，並將混合物在23℃下攪拌24 h。添加9% NaHCO₃ 水溶液(1151 mL)並使用EtOAc (506 mL)萃取。使用飽和NaCl水溶液(506 mL)洗滌有機相，藉由無水MgSO₄ 乾燥，過濾，並在真空中濃縮。將庚烷(1000 mL)添加至殘餘物中，並攪拌24 h。過濾，使用庚烷(2 × 150 mL)洗滌，且在空氣流下乾燥1 h並在10毫巴真空、45℃下乾燥過夜以獲得(2S)-2-(對-甲苯基磺醯基氧基甲基)嗎啉-4-甲酸第三丁基酯。在此製備後得到147g (86%產率)白色固體。ES/MS m/z 394 (M+Na)⁺ 。

製備 34 (2R)-2-[(4-胺基-1-六氫吡啶基)甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯

向壓力器皿中裝填(2S)-2-(對-甲苯基磺醯基氧基甲基)嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(81.2 g, 216 mmol)、六氫吡啶-4-胺(43.3 g, 433 mmol, 2當量)、甲基乙基酮(216 mL)及DIPEA (55.9 g, 75.5 mL, 433 mmol, 2當量)。將混合物在80℃下攪拌40 h。關斷加熱，冷卻至23℃，使用MTBE (649 mL)稀釋，使用水(649 mL)、5%檸檬酸水溶液(649 mL)洗滌，並使用使用MTBE (649 mL)反萃取水相。藉由使用18 M NaOH水溶液(35.3 mL)進行攪拌來鹼化合併之水相並使用DCM (3 × 649 mL)萃取。藉由無水Na₂ SO₄ 乾燥合併之有機物，過濾，並在真空中濃縮。將殘餘物懸浮於庚烷(649 mL)中並保持2 h，過濾，在真空中濃縮，並在10毫巴及45℃下乾燥48 h以獲得(2R)-2-[(4-胺基-1-六氫吡啶基)甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯。在此製備後得到47.7 g (69%產率)無色油狀物。ES/MS m/z 300 (M+H)⁺ 。¹ H NMR (CDCl₃ ) δ 1.34-1.62 (m, 2H), 1.47 (s, 9H), 1.71-1.85 (m, 2H), 2.00-2.18 (m, 2H), 2.20-2.38 (m, 1H), 2.50 (dd, 1H), 2.54-2.74 (m, 2H), 2.83-2.99 (m, 2H), 3.44-3.63 (m, 2H), 3.78-4.04 (m, 4H)。

製備 35 8-氯-3-碘-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶

將NIS (69.5 g, 303 mmol, 1.3當量)添加至8-氯-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶(51.4 g, 233 mmol)於ACN (1164 mL)中之溶液中，並將混合物在23℃下攪拌72 h。在真空中濃縮。將殘餘物溶於2-Me-THF (514 mL)中，並使用25% Na₂ S₂ O₃ 水溶液(514 mL)及9% NaHCO₃ 水溶液(3 × 514 mL)洗滌。藉由無水MgSO₄ 乾燥有機相，過濾，並在真空中濃縮以獲得8-氯-3-碘-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶。在此製備後得到71.3 g (88%產率)白色固體。ES/MS m/z (³⁵ Cl/³⁷ Cl) 346/348。¹ H NMR (CDCl₃ ) δ 7.53 (d, 1H), 7.89 (s, 1H), 8.46 (m, 1H)。

製備 36 8-氯-3-異丙烯基-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶

在N₂ 下使8-氯-3-碘-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶(25.1 g, 72.4 mmol)、EtOH (483 mL)及1.2 M K₂ CO₃ 水溶液(180 mL)之混合物脫氣5 min。添加2-異丙烯基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環(14.1 g, 79.6 mmol, 1.1當量)及BrettPhos Pd G3 (1.67 g, 1.81 mmol, 0.025當量)，並脫氣5 min。在23℃下攪拌24 h。在真空中濃縮，將殘餘物溶於2-MeTHF (251 mL)中，並使用水(125 mL)洗滌。藉由無水MgSO₄ 乾燥有機相，過濾，並在真空中濃縮。藉由矽膠層析使用EtOAc:己烷(0-50%梯度)來純化殘餘物以獲得8-氯-3-異丙烯基-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶。在此製備後得到16.9 g (85%產率)淺黃色固體。ES/MS m/z (³⁵ Cl/³⁷ Cl) 261/263。¹ H NMR (d₆ -DMSO) δ 2.22 (m, 3H), 5.47 (m, 1H), 5.51 (m, 1H), 7.70 (d, 1H), 7.86 (s, 1H), 8.61 (m, 1H)。

製備 37 8-氯-3-異丙基-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶

在N₂ 下使8-氯-3-異丙烯基-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶(33.2 g, 110 mmol)、鉑(20.1 g, 2.31 mmol, 0.021當量)及MeOH (659 mL)之混合物脫氣。使用三個真空循環將N₂ 氣氛替換為H₂ 。將混合物在23℃下攪拌8 h。經由矽藻土墊過濾並使用MeOH沖洗。在真空中濃縮。藉由矽膠層析使用EtOAc:己烷(10-70%梯度)來純化殘餘物以獲得8-氯-3-異丙基-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶。在此製備後得到24.2 g (65%產率)黃色固體。ES/MS m/z (³⁵ Cl/³⁷ Cl) 263/265。¹ H NMR (d₆ -DMSO) δ 1.33 (d, 6H), 3.51 (dq, 1H), 7.63 (d, 1H), 7.75 (d, 1H), 8.92 (m, 1H)。

製備 38 (2R)-2-[[4-[[3-異丙基-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯

在N₂ 下使8-氯-3-異丙基-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶(22.7 g, 79.2 mmol)、(2R)-2-[(4-胺基-1-六氫吡啶基)甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(37.9 g, 119 mmol, 1.5 mmol)、第三丁醇鈉(23.5 g, 238 mmol, 3當量)及1,4-二噁烷(396 mL)之混合物脫氣。添加BrettPhos Pd G3 (4.53 g, 4.75 mmol, 0.06當量)並使混合物脫氣5 min。在100℃下加熱48 h。冷卻至23℃，在真空中濃縮，將殘餘物溶於2-MeTHF (227 mL)中，並使用水(127 mL)洗滌。使用2-MeTHF (114 mL)萃取水相，藉由無水MgSO₄ 乾燥合併之有機物，過濾，並在真空中濃縮以獲得(2R)-2-[[4-[[3-異丙基-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯。在此製備後得到59.7 g (70%純，100%產率)褐色膠狀物。ES/MS m/z 526 (M+H)⁺ 。¹ H NMR (d₆ -DMSO) δ 1.30 (d, 6H), 1.41 (s, 9H), 1.52-1.68 (m, 2H), 1.81-1.95 (m, 2H), 2.09-2.29 (m, 2H), 2.31-2.43 (m, 2H), 2.75-2.94 (m, 3H), 3.25-3.58 (m, 5H), 3.62-3.92 (m, 3H), 6.07 (d, 1H), 6.21 (d, 1H), 7.34 (d, 1H), 8.03 (m, 1H)。

製備 39 3-異丙基-N-[1-[[(2S)-嗎啉-2-基]甲基]-4-六氫吡啶基]-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-胺

將於2-丙醇中之HCl (5.5 M, 86 mL, 6當量)添加至(2R)-2-[[4-[[3-異丙基-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-甲酸第三丁基酯(59.5 g, 70%純，79.1 mmol)於2-丙醇(476 mL)中之懸浮液中。將混合物在95℃下加熱4 h。冷卻至23℃並在真空中濃縮。將殘餘物懸浮於2-MeTHF (476 mL)中，添加2 M NaOH水溶液(198 mL)，並在23℃下攪拌5 min。經由矽藻土墊過濾並使用2-MeTHF沖洗。使用20%檸檬酸水溶液(2 × 476 mL)萃取有機相。使用18.4 M NaOH水溶液(476 mL)處理合併之水相並使用2-MeTHF (2 × 476 mL)萃取。藉由無水MgSO₄ 乾燥合併之有機物，過濾，並在真空中濃縮。使用SiliaMetS^® 硫醇樹脂(40-63 µm；載量 = 1.46 mmol/g；10.8 g, 15.7 mmol)在23℃下處理殘餘物，且加熱至65℃並保持18 h。冷卻至23℃，過濾，並在真空中濃縮以獲得3-異丙基-N-[1-[[(2S)-嗎啉-2-基]甲基]-4-六氫吡啶基]-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-胺。在此製備後得到27.2 g (76%產率)橙色固體。ES/MS m/z 426 (M+H)⁺ 。¹ H NMR (d₆ -DMSO) δ 1.30 (d, 6H), 1.51-1.68 (m, 2H), 1.80-1.94 (m, 2H), 2.07-2.23 (m, 2H), 2.23-2.42 (m, 3H), 2.58-2.76 (m, 2H), 2.76-2.92 (m, 3H), 3.28-3.59 (m, 5H), 3.66-3.78 (m, 1H), 6.04 (d, 1H), 6.21 (bs, 1H), 7.34 (bs, 1H), 8.02 (m, 1H)。

實例 8 1-[(2R)-2-[[4-[[3-異丙基-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮

在0℃下，將TEA (16.3 g, 22.4 mL, 161 mmol, 4當量)及丙烯醯氯(3.79 g, 3.40 mL, 40.1 mmol, 1.0當量)於DCM (34 mL)中之溶液逐滴添加至3-異丙基-N-[1-[[(2S)-嗎啉-2-基]甲基]-4-六氫吡啶基]-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-胺(17.7 g, 40.1 mmol)於DCM (268 mL)中之溶液中並攪拌15 min。添加9% NaHCO₃ 水溶液(142 mL)，藉由無水MgSO₄ 乾燥有機相，過濾，並在真空中濃縮。藉由矽膠層析使用MeOH: DCM (0-10%梯度)來純化殘餘物以獲得1-[(2R)-2-[[4-[[3-異丙基-6-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]胺基]-1-六氫吡啶基]甲基]嗎啉-4-基]丙-2-烯-1-酮。在此製備後得到12.9 g (67%產率)灰棕色發泡體。ES/MS m/z 480 (M+H)⁺ 。¹ H NMR (d₆ -DMSO) δ 1.30 (d, 6H), 1.52-1.71 (m, 2H), 1.83-1.95 (m, 2H), 2.10-2.30 (m, 2H), 2.36-2.46 (m, 2H), 2.74-3.23 (m, 3H), 3.31-3.60 (m, 5H), 3.78-4.02 (m, 2H), 4.08-4.47 (m, 1H), 5.71 (d, 1H), 6.06 (m, 1H), 6.14 (dd, 1H), 6.22 (d, 1H), 6.79 (dd, 1H), 7.39 (d, 1H), 8.02 (m, 1H)。

生物分析 下列分析證實，本文所闡述之化合物係CDK7活性之抑制劑。該等分析之結果亦展示，本文所闡述之化合物抑制癌細胞中之CDK7信號傳導。另外，本文所闡述之化合物抑制癌細胞系之增殖及癌症異種移植物腫瘤模型中之腫瘤生長。

「IC₅₀ 」係指藥劑產生關於該藥劑之最大可能抑制反應之50%之濃度，或替代地係指置換50%之配體-受體特異性結合之藥劑濃度；使用螢光單位藉由計算相對於板上「MIN」及「MAX」對照之抑制百分比且然後將10-點劑量反應數據擬合至4-參數邏輯方程式來測定相對IC₅₀ 值。

CDK7 及 CDK9 激酶活性分析 該等分析之目的在於量測本文所闡述之化合物抑制CDK7/週期蛋白H/Mat1複合激酶活性之能力。為證實本文所闡述之化合物是否對CDK7及CDK9展現任何親和力，在不預培育酶與化合物下或在3小時預培育下實施生物化學分析。功能分析可證實本文所闡述之化合物是否展現抑制CDK7及CDK9激酶活性之能力。下列分析中所採用之所有配體、溶劑及試劑皆易於自商業來源獲得，或可易於由熟習此項技術者合成。如下所述來測定CDK7及CDK9之IC₅₀ 。

CDK7/ 週期蛋白 H/MAT1 之抑制之生物化學分析 使用放射性標記過濾結合(FB)分析使用經純化人類重組酶在ATP//[³³ P]ATP及肽受質存在下來測定本文所闡述化合物之IC₅₀ 活性。所選ATP濃度等於或接近ATP之酶K_m 。

在96孔聚苯乙烯板中以25 μL/孔之最終體積來實施反應。混合5 μL於20% DMSO中之測試化合物、10 μL受質溶液(ATP/33PATP及CDK7/9 tide)及10 μL酶溶液。製備受質溶液以得到100 μM ATP/[³³ P]ATP (NEN 10μCi/μL, 3000 Ci/mmol)及250 μM CDK7/9肽((YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSKKKK) (SEQ ID NO: 1))之最終濃度，該等物質稀釋於4 mM MgCl₂ 、0.01% TRITON^TM X-100、2 mM DTT及20 mM HEPES之激酶緩衝液中。製備最終濃度為1nM CDK7/週期蛋白H/Mat1酶[Proqinase 0366-0360-4 Lot 002)] (稀釋於激酶緩衝液中)之酶溶液。在20% DMSO中以1:3連續稀釋測試化合物以產生起始濃度為20 µM之10點曲線。採用不含測試化合物之單獨20% DMSO緩衝液作為高對照(不存在任何抑制劑下之完整活性)，使用500 mM EDTA來測定在不存在酶活性下之背景值(低對照)。在混合5 μL化合物與10 μL酶溶液之後，將板在22℃下培育0或180分鐘。然後，藉由添加10 μL受質溶液來引發反應並在22℃下培育50分鐘。藉由添加80 μL冷10%正磷酸溶液來終止反應。使用10 µL 10%正磷酸溶液預洗滌過濾板(不透明，有菌過濾板)之每一孔。將100 µL混合物轉移至磷酸纖維素過濾器中並在室溫下培育45分鐘。在過濾板處理器上使用200 μL 0.5 %正磷酸將過濾板洗滌3次。藉由將80 μL MICROSCINT™添加至每一孔中來測定33Pi納入(計數「cpm」)並在一小時之後於計數器上進行讀數。經由GENEDATA SCREENER^® 工具處理數據。使用4-參數非線性邏輯方程式(4-參數邏輯濃度-反應曲線)分析數據：Y = bot + [(top-bot)/1+(x/ IC₅₀ )斜率]，其中Y =抑制%，X =產生y抑制%之濃度，Bot=藉由曲線達成之最小y值，Top =藉由曲線達成之最大y值且斜率=曲線在IC₅₀ 下之陡度。%Inh = [(中值Max- x/中值Max-中值Min)] ∙ 100，IC₅₀ ：使既定反應(配體結合、酶反應)減小50%之化合物濃度。

在無預培育下，實例1、2、4、5、6、7及8中所闡述之化合物針對CDK7分別顯示0.123 μM、0.256 μM、0.155 μM、0.367 μM、0.0674 μM、0.0845 μM及0.0656 μM之IC₅₀ 。在將CDK7酶與實例1、2、4、5、6、7及8一起預培育3小時之後，該等實例分別展示0.0143 μM、0.0266 μM、0.0143 μM、0.0415 μM、0.00396 μM、0.00625 μM及0.00574 μM之IC₅₀ 。該等數據展示，實例1、2、4、5、6、7及8抑制CDK7。

CDK9/ 週期蛋白 T1 激酶活性之抑制之分析 ：使用放射性標記過濾結合(FB)分析使用經純化人類重組酶在ATP及肽受質存在下來測定本文所闡述化合物之IC₅₀ 活性。所選ATP濃度等於或接近ATP之酶Km。在96孔聚苯乙烯板中以25 μL/孔之最終體積來實施反應。混合5 μL於20% DMSO中之測試化合物、10 μL受質溶液(ATP//[³³ P]ATP及CDK7/9 tide)及10 μL酶溶液。製備受質溶液以得到100 μM ATP/[³³ P]ATP (NEN 10uCi/μL, 3000 Ci/mmol)及200 μM CDK7/9肽((YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSKKKK) (SEQ ID NO: 1))之最終濃度，該等物質稀釋於4 mM MgCl₂ 、0.0025% TRITON^TM X-100、1.58 mM DTT及15.80 mM HEPES之激酶緩衝液中。製備最終濃度為7.5 nM CDK9/週期蛋白T1酶[Proqinase 0371-0345-1 (批號：004)] (稀釋於激酶緩衝液中)之酶溶液。在20% DMSO中以1:3連續稀釋測試化合物以產生起始濃度為20 µM之10點曲線。採用不含測試化合物之單獨20% DMSO緩衝液作為高對照(不存在任何抑制劑下之完整活性)，使用500 mM EDTA來測定在不存在酶活性下之背景值(低對照)。在混合5 μL化合物與10 μL酶溶液之後，將板在22℃下培育0或180分鐘。然後，藉由添加10 μL受質溶液來引發反應並在22℃下培育60分鐘。藉由添加80 μL冷10%正磷酸溶液來終止反應。使用10 µL 10%正磷酸溶液預洗滌過濾板(不透明，有菌過濾板)之每一孔。將100 µL混合物轉移至磷酸纖維素過濾器中並在室溫下培育45分鐘。在過濾板處理器上使用200 μL 0.5 %正磷酸將過濾板洗滌3次。將80 μL MICROSCINT™添加至每一孔中並在一小時之後於閃爍計數器上進行讀數。經由GENEDATA-SCREENER^® 工具處理數據。使用4-參數非線性邏輯方程式(4-參數邏輯濃度-反應曲線)分析數據：Y = bot + [(top-bot)/1+(x/ IC₅₀ )斜率]，其中Y =抑制%，X =產生y抑制%之濃度，Bot=藉由曲線達成之最小y值，Top =藉由曲線達成之最大y值且斜率=曲線在IC₅₀ 下之陡度。%Inh = [(中值Max- x/中值Max-中值Min)] ∙ 100，IC₅₀ ：使既定反應(配體結合、酶反應)減小50%之化合物濃度。相對IC₅₀ ：產生化合物之最大反應之一半之濃度。

實例1、2、4、5、6、7及8中所闡述之化合物針對CDK9 (預培育3小時)分別顯示1.77 μM、3.18 μM、8.05 μM、7.13 μM、1.61 μM、2.03 μM、及2.14 µM之IC₅₀ 。該等數據展示，實例1、2、4、5、6、7及8並不強效抑制CDK9活性。

總而言之，來自上述分析之數據證實，實例1、2、4、5、6、7及8之化合物較CDK9選擇性抑制CDK7。

CDK7 及 CDK9 細胞機制分析 該等分析之目的在於量測本文所闡述之化合物在活體外抑制癌細胞中之CDK7及CDK9信號傳導的能力。

基於磷酸 - 羧基末端結構域 (Rbp2) (Ser2) p-CTD (S2) 細胞之 Acumen 分析在補充有10% FBS、1% NaPyr及1% Pen/Strep之McCoy’s 5Å改良培養基中培養HCT116細胞(ATCC CCL-247)並以5,000個細胞/孔之密度及100 µL體積平鋪(在變得70%鋪滿之前)於96孔平底板中。然後將細胞在細胞培養培育器(5% CO₂ 、95%相對濕度(RH)及37℃)中培育過夜並使其附著至板上。次日早晨，向細胞中投用化合物。首先將化合物抑制劑以60 µM溶於含有0.6% DMSO之培養基中。隨後，在60 μM至0.003 μM之範圍內製備化合物連續稀釋液(1:3)。細胞投用包括將50 µL來自連續稀釋板者添加至含有附著細胞與100 µL培養基之分析板中，從而產生0.2%之最終DMSO濃度與介於20 µM與0.001 µM之間之最終化合物濃度劑量範圍。針對最大點使用含有0.2% DMSO之培養基，且針對最小點使用在含有0.2% DMSO之生長培養基中稀釋於0.83 µM最終濃度之參考化合物。在投用化合物之後，將細胞板在37℃及5% CO₂ 下培育4小時。小心去除生長培養基且藉由在室溫下添加100 μL 4%低聚甲醛30分鐘來固定細胞。使用PBS將細胞洗滌一次並在室溫下與100 μL冷MeOH一起培育15分鐘以供細胞滲透。使用PBS (各100 μL)將細胞洗滌兩次並在室溫下使用100 μL/孔之1% BSA/PBS阻斷30分鐘。將50 μL於1% BSA/PBS中之1:1000一級抗體(抗磷酸CTD Ser2 Abcam，目錄號：ab5095-100)稀釋液添加至每一孔中，密封板並在4℃下培育過夜。

第二天，使用PBS (100 μL/孔)將細胞洗滌三次並在室溫下與50 μL/孔於PBS中之二級抗體(1:2000稀釋液，山羊抗兔IgM ALEXA FLUOR™ 488)一起培育1小時。在使用PBS (100 μL/孔)洗滌3次之後，將100 μL 50 μg/mL RNAase及於PBS中之1:1000碘化丙啶稀釋液添加至每一孔中。密封板並在室溫下於工作臺上培育1小時(避光)。在Acumen上分析板之FL2 (平均強度)及FL3 (總強度)。使用ACUMEN EXPLORER™ [由TTP LABTECH LTD製造之雷射掃描螢光微量板細胞計數器]掃描螢光板以量測絲胺酸2處之抗磷酸-羧基末端結構域(pCTD)。基於細胞螢光信號來分析影像以鑑別陽性細胞。根據500-530下之平均強度高於臨限值來鑑別pCTD (S2)陽性細胞。使用來自碘化丙啶/DNA之575-640下總強度來鑑別個別細胞。分析輸出為pCTD陽性細胞%。

藉由使用GENE DATA™針對每一輸出曲線擬合至四參數邏輯來測定IC₅₀ 。實例1、2、4、5、6、7及8中所闡述之化合物針對磷酸CTD (S2)分別顯示5.73 μM、6.36 μM、3.71 μM、7.79 μM、3.79 μM、2.92 μM及2.59 µM之相對IC₅₀ 。該等數據展示，實例1、2、4、5、6、7及8並不強效抑制細胞中之CDK9。

基於磷酸 - 羧基末端結構域 (Rbp2) (Ser5) p-CTD (S5) 細胞之 Acumen 分析在補充有10% FBS、1% NaPyr及1% Pen/Strep之McCoy’s 5A改良培養基中培養HCT116細胞(ATCC CCL-247)並以5,000個細胞/孔之密度及100 µL體積平鋪(在變得70%鋪滿之前)於96孔平底板中。將細胞在細胞培養培育器(5% CO₂ 、95%相對濕度(RH)及37℃)中培育過夜並使其附著至板上。次日早晨，向細胞中投用化合物。將化合物抑制劑以60 µM溶於含有0.6% DMSO之培養基中。隨後，在60 μM至0.003 μM之範圍內製備化合物連續稀釋液(1:3)。細胞投用包括將50 µL來自連續稀釋板者添加至含有附著細胞與100 µL培養基之分析板中，從而產生0.2%之最終DMSO濃度與介於20 µM與0.001 µM之間之最終化合物濃度劑量範圍。針對最大點使用含有0.2% DMSO之培養基，且針對最小點使用在含有0.2% DMSO之生長培養基中稀釋於0.83 µM最終濃度之參考化合物。在投用化合物之後，將細胞板在37℃及5% CO₂ 下培育4小時。小心去除生長培養基且藉由在室溫下添加100 μL 4%低聚甲醛30分鐘來固定細胞。使用PBS將細胞洗滌一次並在室溫下與100 μL冷MeOH一起培育15分鐘以供細胞滲透。使用PBS (各100 μL)將細胞再洗滌兩次並在室溫下使用100 μL/孔之1% BSA/PBS阻斷30 min。將50 μL於1% BSA/PBS中之1:1000一級抗體(抗磷酸CTD Ser5 Bethyl Laboratories，目錄號：A300-655A)稀釋液添加至每一孔中，密封板並在4℃下培育過夜。

第二天，使用PBS (100 μL/孔)將細胞洗滌三次並在室溫下與50 μL/孔於PBS中之二級抗體(1:2000稀釋液，山羊抗兔IgM ALEXA FLUOR™ 488)一起培育1小時。在使用PBS (100μL/孔)洗滌3次之後，將100 μL 50 μg/mL RNAase (Sigma)及於PBS中之1:1000碘化丙啶稀釋液添加至每一孔中。密封板並在室溫下於工作臺上培育1小時(避光)。在Acumen上分析板之FL2 (平均強度)及FL3 (總強度)。使用ACUMEN EXPLORER™ [由TTP LABTECH LTD製造之雷射掃描螢光微量板細胞計數器]掃描螢光板以量測絲胺酸5處之抗磷酸-羧基末端結構域(pCTD)。基於細胞螢光信號來分析影像以鑑別陽性細胞。根據500-530下之平均強度高於臨限值來鑑別pCTD (S5)陽性細胞。使用來自碘化丙啶/DNA之575-640下總強度來鑑別個別細胞。分析輸出為pCTD陽性細胞%。藉由使用GENE DATA™針對每一輸出曲線擬合至四參數邏輯來測定IC₅₀ 。

實例1、2、4、5、6、7及8中所闡述之化合物針對pCTD Ser5分別顯示0.161 μM、0.162 μM、0.0551 μM、0.118 μM、0.0159 μM、0.0717 μM及0.0262 µM之相對IC₅₀ 。該等數據展示，實例1、2、4、5、6、7及8抑制CDK7細胞活性。

基於 cMyc 細胞之 Acumen 分析在補充有10% FBS、1% NaPyr及1% Pen/Strep之McCoy’s 5Å改良培養基中培養HCT116細胞(ATCC CCL-247)並以5,000個細胞/孔之密度及100 µL體積平鋪(在變得70%鋪滿之前)於96孔平底板中。然後將細胞在細胞培養培育器(5% CO₂ 、95%相對濕度(RH)及37℃)中培育過夜並使其附著至板上。次日早晨，向細胞中投用化合物。將化合物抑制劑以60 µM溶於含有0.6% DMSO之培養基中。隨後，在60 μM至0.003 μM之範圍內製備化合物連續稀釋液(1:3)。細胞投用包括將50 µL來自連續稀釋板者添加至含有附著細胞與100 µL培養基之分析板中，從而產生0.2%之最終DMSO濃度與介於20 µM與0.001 µM之間之最終化合物濃度劑量範圍。針對最大點使用含有0.2% DMSO之培養基，且針對最小點使用在含有0.2% DMSO之生長培養基中稀釋於0.83 µM最終濃度之參考化合物。在投用化合物之後，將細胞板在37℃及5% CO₂ 下培育4小時。小心去除生長培養基且藉由在室溫下添加100 μL 4%低聚甲醛30分鐘來固定細胞。使用PBS將細胞洗滌一次並在室溫下與100 μL冷MeOH一起培育15分鐘以供細胞滲透。使用PBS (各100 μL)將細胞再洗滌兩次並在室溫下使用100 μL/孔之1% BSA/PBS阻斷30分鐘。將50 μL於1% BSA/PBS中之1:1000一級抗體(抗c-Myc抗體[Y69]，Abcam目錄號：ab32072)稀釋液添加至每一孔中，密封板並在4℃下培育過夜。第二天，使用PBS (100 μL/孔)將細胞洗滌三次並在室溫下與50 μL/孔於PBS中之二級抗體(1:2000稀釋液，山羊抗兔IgM ALEXA FLUOR™ 488)一起培育1小時。在使用PBS (100μL/孔)洗滌3次之後，將100μL 50 μg/mL RNAase (Invitrogene)及於PBS中之1:1000碘化丙啶稀釋液添加至每一孔中。密封板並在室溫下於工作臺上培育1小時(避光)。在Acumen上分析板之FL2 (平均強度)及FL3 (總強度)。使用ACUMEN EXPLORER™ [由TTP LABTECH LTD製造之雷射掃描螢光微量板細胞計數器]掃描螢光板以量測絲胺酸5處之抗磷酸-羧基末端結構域(pCTD)。基於細胞螢光信號來分析影像以鑑別陽性細胞。根據500-530下之平均強度高於臨限值來鑑別pCTD (S5)陽性細胞。使用來自碘化丙啶/DNA之575-640下總強度來鑑別個別細胞。分析輸出為pCTD陽性細胞%。藉由使用GENE DATA™針對每一輸出曲線擬合至四參數邏輯來測定IC₅₀ 。

實例1、2、4、5、6、7及8中所闡述之化合物針對cMyc顯示0.082 μM、0.0947 μM、0.038 μM、0.14 μM、0.00791 μM、0.0138 μM及0.0245 µM之相對IC₅₀ 。該等數據展示，實例1、2、4、5、6、7及8皆抑制HCT116細胞中之cMyc轉錄。

選擇性剖析實驗 ： DiscoverX ScanMax 該研究之目的在於生成實例8之化合物之活體外選擇性特徵。為分析選擇性，在DiscoverX Corporation處使用KINOMEscan™篩選平臺於一組(468種)人類激酶中測試實例8之化合物。KINOMEscan™採用新穎及專屬之活性位點導向性競爭結合分析來定量量測測試化合物與超過450種人類激酶及疾病相關突變變體之間之相互作用。與可能取決於ATP濃度之IC₅₀ 值不同，KINOMEscan™分析無需ATP且由此報告真實之熱動力學相互作用親和力。

結合激酶活性位點且直接(空間上)或間接(別位上)防止激酶結合至固定配體之化合物將減小捕獲於固體載體上之激酶量。然而，不結合激酶之分子對捕獲於固體載體上之激酶量並無效應。藉由使用檢測相關DNA標記之qPCR方法量測捕獲於測試試樣與對照試樣中之激酶量來監測化合物活性。關於DiscoverX Corporation KINOMEscan™篩選平臺之其他資訊可參見http://www.discoverx.com。

在DiscoverX^® Corporation (Fremont, CA)處實施分析以監測與468種激酶組之結合。在20 µM、2 µM及0.2 µM最終濃度下測試實例8。向激酶加DNA標籤以供qPCR檢測。在室溫下使用生物素化小分子配體將經鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)塗覆之磁性珠粒處理30分鐘以產生親和樹脂以供激酶分析。使用過量生物素封阻配體化珠粒，且使用封阻緩衝液(SeaBlock (Pierce)，1 % BSA、0.05 % Tween 20、1 mM DTT)洗滌以去除未結合配體並減少非特異性結合。藉由在1×結合緩衝液(20% SeaBlock、0.17× PBS、0.05% Tween 20、6 mM DTT)中合併激酶、結合配體之親和性珠粒及測試化合物來組合結合反應。將測試化合物製備為於100% DMSO中之40×儲備液並直接稀釋至分析中。所有反應皆係以0.02 ml之最終體積在聚丙烯384孔板實施。將分析板在室溫下振盪培育1小時並使用洗滌緩衝液(1× PBS、0.05% Tween 20)洗滌親和性珠粒。隨後將珠粒再懸浮於洗脫緩衝液(1× PBS、0.05% Tween 20、0.5 μM非生物素化親和配體)中並在室溫下於振盪下培育30分鐘。藉由qPCR量測洗脫液中之激酶濃度。

主要篩選結合相互作用之結果報告為「Ctrl%」，其中較低數值指示矩陣中之較強命中。

Ctrl%計算：

陰性對照 = DMSO (100%Ctrl) 陽性對照 = 對照化合物 (0%Ctrl)

實例8之化合物針對468種蛋白質激酶組展示極佳選擇性。CDK7係在0.2 µM濃度之實例8化合物下展示小於35%對照活性之唯一激酶。具體而言，實例8之化合物針對CDK7展示大約4%之對照活性(亦即約96%抑制)。

細胞增殖分析 表1中之數據展示，實例1化合物抑制指定腫瘤細胞系之增殖及活力。將細胞系以5000個細胞/孔之密度平鋪於白色96孔細胞培養板中之100 μL/孔生長培養基中。參見表1之細胞系及培養基資訊。在37℃及5% CO₂ 下培育板。第二天，藉由將化合物以1:3稀釋於DMSO中並進行10個點來製備測試化合物之連續稀釋液。DMSO板係1000×最終濃度。除CDK7抑制劑外，亦包含僅DMSO管柱作為最大生長對照且包含10 µM星形孢菌素(staurosporine)最終管柱作為最大生長抑制對照。然後藉由將2 μL/孔之來自1000X DMSO板者添加至198 μL/孔之OMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA，目錄號：31985-070)中來製備10X稀釋板。使用指示化合物藉由將11 μL/孔之來自10X OMEM板者添加至含有100 μL/孔生長培養基之細胞板中(1X最終濃度)來處理細胞。將板放回在37℃及5% CO₂ 下之培育器中。對於HCC1806或A2780細胞而言，分別在添加化合物之後6或7天，自培育器取出板並平衡至室溫。在室溫下將CELL TITER GLO^® 試劑解凍，且然後藉由混合一小瓶分析緩衝液與一小瓶受質並輕輕渦旋以混合來進行製備。然後將CELL TITER GLO^® 試劑以100 μL/孔添加至細胞板中，且在室溫下置於速度設定為2之滴定板振盪器上並保持15分鐘。在振盪器上培育15分鐘之後，使用Wallac VICTOR2™在1秒/孔下讀取發光。使用非線性回歸及S形劑量-反應曲線且利用Graphpad Prism 6軟體來計算半數最大抑制濃度(IC₅₀ )。表 1 ：實例1化合物對癌細胞系之抑制

細胞系	組織學	IC₅₀ (µM)	目錄號	培養基資訊
HCC1806	乳癌	0.01948	ATCC# CRL-2335	含有HEPES及L-麩醯胺酸(Gibco 22400)+ 10% FBS (Gibco目錄號：10082)之RPMI 1640
A2780	卵巢癌	0.0228	ATCC# CRL-2772	含有L-麩醯胺酸(Gibco 22400) + 1X NEAA (Corning 25-025-ci) + 10% FBS (Hyclone SH30071.03)之RPMI 1640

該等數據展示，實例I化合物以劑量依賴性方式抑制來自各種組織(包含乳房及卵巢)之癌細胞系之活體外生長。

異種移植物腫瘤模型 此分析之目的在於量測腫瘤體積因應於實例1化合物之減小。為評估測試化合物之活體內效能，利用多種異種移植物腫瘤模型。簡言之，將2.5 × 10⁶ 個於1:1 MATRIGEL®混合物中之腫瘤細胞(0.2 mL總體積)經皮下注射至雌性無胸腺裸小鼠(Envigo, Harlan Laboratories)中。在使腫瘤達到約300-500 mm³ 之期望大小之後，將動物隨機分配至5成員組中以供效能研究。在指示劑量及方案下，經由口服胃管灌食(PO)投與測試化合物。隨時間監測腫瘤生長及體重以評估效能及毒性體徵。

在1%羥乙基纖維素、0.25%聚山梨醇酯80、0.05%消泡劑/純化水(HEC)中調配測試化合物並藉由口服胃管灌食(最終體積為0.2 mL)以表2中所指示之劑量進行投與。每週調配測試化合物並儲存於4℃下。根據上文所用時間表使用0.2 mL/劑量之體積將媒劑投與對照組中。經由口服胃管灌食向小鼠投藥且在終點時收集腫瘤試樣，並儲存於-80℃下。

每兩週一次記錄腫瘤大小及體重並加以分析。

實例1化合物在人類癌症異種移植物模型中顯示顯著抗腫瘤活性(表2)。

表2 ：在所指示不同劑量值下測試之實例1化合物在HCC1806異種移植物腫瘤模型中之活體內單藥劑效能(ΔT/C)之匯總。

模型	組織學	突變	實例 1 劑量 (mg/kg)	時間表	Avg. ΔT/C
HCC1806	乳房	KMT2C	10	QDx28	16.5
HCC1806	乳房	KMT2C	20	QDx28	-38.0

在經治療組中之終點腫瘤體積係在基線腫瘤體積下或其以上時，計算ΔT/C%。公式為100×(T-T₀ )/(C-C₀ )。此處，T及C分別係治療組或對照組中之平均終點腫瘤體積。T₀ 及C₀ 係該等組中之平均基線腫瘤體積。

儘管僅具體闡述本文所揭示之某些代表性化合物、材料及方法步驟，但化合物、材料及方法步驟之其他組合亦意欲屬隨附申請專利範圍之範圍內，即使並未具體引述。因此，可在本文中明確提及步驟、要素、組分或成分之組合；然而，包含步驟、要素、組分及成分之其他組合，即使並未明確陳述。本文所用之術語「包括」及其變體與術語「包含」及其變體同義使用且係開放、非限制性術語。儘管在本文中使用術語「包括」及「包含」來闡述各個實施例，但可使用術語「基本上由……組成」及「由……組成」代替「包括」及「包含」以提供本發明之更具體實施例且亦加以揭示。

Claims

一種下式之化合物，
其中， X係-CH(OH)CH₃ 、-CHFCH₃ 、-CF₂ CH₃ 或-CF₃ ； Y係-CH=CH₂ 或-C² H=C² H₂ ；且 Z係-CH(CH₃ )₂ 或-CH(CH₃ )(CH₂ ² H)；或其醫藥上可接受之鹽。
如請求項1之化合物，其中該化合物係
或其醫藥上可接受之鹽。
如請求項1之化合物，其中該化合物係
或其醫藥上可接受之鹽。
如請求項2之化合物，其中該化合物係
或其醫藥上可接受之鹽。
如請求項2之化合物，其中該化合物係
。
如請求項2之化合物，其中該化合物係
或其醫藥上可接受之鹽。
如請求項2之化合物，其中該化合物係
。
如請求項1至4或6中任一項之化合物，其中該醫藥上可接受之鹽係鹽酸鹽。
如請求項1至4或6中任一項之化合物，其中該醫藥上可接受之鹽係硫酸鹽。
一種醫藥組合物，其包括如請求項1至9中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑組合。
一種如請求項1至9中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用以製造用於治療患者之尿路上皮癌(urothelial cancer)、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌(hepatobiliary cancer)、胰臟癌、子宮頸癌、前列腺癌、血液癌症、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤之藥劑。
如請求項11之用途，其中該癌症係選自由以下組成之群：結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。
如請求項11或12之用途，其中該癌症係乳癌。
如請求項11或12之用途，其中來自該患者之生物試樣含有至少一種功能喪失突變在ARID1A 、 KMT2C 、 KMT2D 或RB1 基因中。
如請求項11或12之用途，其中若來自該患者之生物試樣測試在ARID1A 、KMT2C 、KMT2D 或RB1 基因中至少一種功能喪失突變陽性，則選擇該患者進行治療。