TW202204626A - 用於活體內基因療法之調節方案 - Google Patents

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漢斯 彼得 基姆
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美國弗莱德哈欽森癌症研究中心
美國華盛頓大學
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Abstract

本發明提供特別是用於活體內基因療法之免疫抑制方案及其用途。在本發明之各種實施例中，活體內基因療法包括將至少一個外源性編碼核酸序列遞送至個體之幹細胞。活體內基因療法的成效會因免疫毒性受到抑制或降低。本發明提供包括特別是免疫抑制方案之組合物及方法，該等降低活體內基因療法(例如包括向個體投與病毒基因療法載體之活體內基因療法)之免疫毒性。

Description

用於活體內基因療法之調節方案
本發明提供特別是用於活體內基因療法之免疫抑制方案及其用途。在本發明之各種實施例中，活體內基因療法包括將至少一個外源性編碼核酸序列遞送至個體之幹細胞。活體內基因療法的成效會因免疫毒性受到抑制或降低。本發明提供包括特別是免疫抑制方案之組合物及方法，該等降低活體內基因療法(例如包括向個體投與病毒基因療法載體之活體內基因療法)之免疫毒性。
許多現有基因療法係經由離體工程改造細胞向個體遞送所關注之核酸序列。某些此類方法具有多種缺陷，包括(但不限於)基於離體工程改造細胞之療法的成本及技術複雜性，包括對分離、修飾及擴增離體工程改造細胞之精密設施的需求。基於離體工程改造細胞之某些療法的其他挑戰包括難以在接受體中實現移植。提供一實例，包括高劑量化學療法以便於移植工程改造細胞的離體療法尤其不適合用於治療血紅素病變。出於至少此等原因，需要增強活體內基因療法之安全性及/或功效的活體內基因療法策略及方案。
本發明提供特別是用於活體內基因療法之免疫抑制方案及其用途。如本文所揭示，活體內基因療法包括將至少一個外源性編碼核酸序列遞送至個體之細胞而不從該個體移除該等細胞的療法。在本發明之各種實施例中，活體內基因療法包括將至少一個外源性編碼核酸序列遞送至個體之幹細胞。在本發明之各種實施例中，活體內基因療法包括向個體投與病毒載體，該病毒載體包括編碼外源性編碼核酸序列之核酸序列。活體內基因療法之成效會因免疫毒性受到抑制或降低，亦即，藉由治療劑或方案，諸如包括病毒基因療法載體之治療劑或方案，在個體中誘發對該個體之治療及/或健康起反作用的免疫反應。在一些情況下，免疫毒性包括發炎反應及/或細胞介素反應。本發明提供降低活體內基因療法，例如包括向個體投與病毒基因療法載體之活體內基因療法之免疫毒性的組合物及方法，尤其包括免疫抑制方案。
特定實施例包括一種轉導哺乳動物個體之幹細胞而不自該個體移除該等幹細胞之方法，該方法包括向已被投與包括發炎性信號抑制劑之免疫抑制方案的個體遞送病毒基因療法載體。
特定實施例包括一種在哺乳動物個體中進行活體內基因療法之方法，該方法包括：(i)向該個體投與包括發炎性信號抑制劑之免疫抑制方案；及(ii)向該個體投與至少一次劑量之病毒基因療法載體。
在其他態樣中，本文提供首次證明，阿那白滯素(anakinra)(Kineret®)及托珠單抗(tocilizumab)(Actemra®)與地塞米松(dexamethasone)之組合完全能夠鈍化對於HDAd5/35++之先天性免疫反應。此證明IL-1及IL-6驅動對於此等載體之先天性反應之作用。
在至少一個態樣中，本發明提供一種在哺乳動物個體中進行活體內基因療法之方法，該方法包括：(i)向該個體投與包括發炎性信號抑制劑之免疫抑制方案；及(ii)向該個體投與至少一次劑量之病毒基因療法載體。
在至少一個態樣中，本發明提供一種轉導哺乳動物個體之幹細胞而不自該個體移除該等幹細胞之方法，該方法包括向已被投與包括發炎性信號抑制劑之免疫抑制方案的個體遞送病毒基因療法載體。
在各種實施例中，該發炎性信號抑制劑為介白素-1 (IL-1)信號抑制劑，視情況其中該IL-1信號抑制劑為IL-1受體(IL-1R)拮抗劑。
在各種實施例中，IL-1R拮抗劑為阿那白滯素。
在各種實施例中，該免疫抑制方案進一步包括介白素6 (IL-6)受體拮抗劑。
在各種實施例中，IL-6受體拮抗劑為托珠單抗。
在各種實施例中，該免疫抑制方案進一步包括皮質類固醇。
在各種實施例中，該皮質類固醇為地塞米松(dexamethasone)。
在各種實施例中，該免疫抑制方案進一步包括鈣調神經磷酸酶抑制劑。
在各種實施例中，該鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司(tacrolimus)。
在各種實施例中，該免疫抑制方案進一步包括TNF-α信號抑制劑。
在各種實施例中，該TNF-α信號抑制劑係選自包括以下之群：依那西普(etanercept)、英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、聚乙二醇化賽妥珠單抗(certolizumab)及戈利木單抗(golimumab)。
在各種實施例中，該免疫抑制方案進一步包括JAK信號抑制劑。
在各種實施例中，該JAK信號抑制劑係選自包括以下之群：巴瑞替尼(baricitinib)、托法替尼(tofacitinib)、魯索利替尼(ruxolitinib)及非戈替尼(filgotinib)。
在各種實施例中，該免疫抑制方案之投與包括在以下時間向該個體投與IL-1受體拮抗劑：(i)在投與第一次劑量之該載體的前一天；(ii)在投與第一次劑量之該載體的當天，視情況包括在投與該第一次劑量之該載體之前1至3小時，投與至少一次劑量之IL-1受體拮抗劑；(iii)在投與一或多次後續劑量之該載體的當天，視情況包括在投與該一或多次後續劑量之該載體之前1至3小時，投與至少一次劑量之IL-1受體拮抗劑；(iv)在投與第一次劑量之該載體的當天與投與最後一次劑量之該載體的當天之間的每一天；及/或(v)在投與最後一次劑量之該載體的當天之後的一天、兩天或更多天中之每一天；視情況其中該IL-1受體拮抗劑為阿那白滯素。
在各種實施例中，該免疫抑制方案之該投與包括向該個體每天投與單次劑量之IL-1受體拮抗劑或每天投與複數次劑量之IL-1受體拮抗劑，視情況其中該IL-1受體拮抗劑為阿那白滯素。
在各種實施例中，該免疫抑制方案之該投與包括向該個體投與0.01至20 mg/kg/天之阿那白滯素，視情況其中該投與為靜脈內或皮下投與。
在各種實施例中，該免疫抑制方案之該投與包括向該個體投與10至200 mg/天之阿那白滯素，視情況其中該投與為靜脈內或皮下投與。
在各種實施例中，該免疫抑制方案之該投與包括在以下時間向該個體投與IL-6受體拮抗劑：(i)在投與第一次劑量之該載體的前一天；(ii)在投與第一次劑量之該載體的當天，視情況包括在投與該第一次劑量之該載體之前不超過1小時，投與至少一次劑量之IL-6受體拮抗劑；(iii)在投與一或多次後續劑量之該載體的當天，視情況包括在投與該一或多次後續劑量之該載體之前不超過1小時，投與至少一次劑量之IL-6受體拮抗劑；(iv)在投與第一次劑量之該載體的當天與投與最後一次劑量之該載體的當天之間的每一天；及/或(v)在投與最後一次劑量之該載體的當天之後的一天、兩天或更多天中之每一天；視情況其中該IL-6受體拮抗劑為托珠單抗。
在各種實施例中，該免疫抑制方案之該投與包括向該個體每天投與單次劑量之IL-6受體拮抗劑或每天投與複數次劑量之IL-6受體拮抗劑，視情況其中該IL-6受體拮抗劑為托珠單抗。
在各種實施例中，該免疫抑制方案之該投與包括向該個體投與1至15 mg/kg/天之托珠單抗或5至200 mg/天之托珠單抗，視情況其中該投與為靜脈內投與。
在各種實施例中，該免疫抑制方案之該投與包括在以下時間向該個體投與皮質類固醇：(i)在投與第一次劑量之該載體的前一天；(ii)在投與第一次劑量之該載體的當天；(iii)在投與一或多次後續劑量之該載體的當天；(iv)在投與第一次劑量之該載體的當天與投與最後一次劑量之該載體的當天之間的每一天；及/或(v)在投與最後一次劑量之該載體的當天之後的一天、兩天或更多天中之每一天；視情況其中該皮質類固醇為地塞米松、普賴蘇(prednisone)、普賴蘇穠(prednisolone)、甲基普賴蘇穠(methylprednisolone)、曲安西龍(triamcinolone)、帕拉米松(paramethasone)或貝皮質醇(betamethasone)。
在各種實施例中，該免疫抑制方案之該投與包括向該個體每天投與單次劑量之皮質類固醇或每天投與複數次劑量之皮質類固醇，視情況其中該皮質類固醇為地塞米松。
在各種實施例中，該免疫抑制方案之該投與包括向該個體投與0.1至10 mg/kg/天之地塞米松，視情況其中該投與為靜脈內、經口或肌內投與。
在各種實施例中，該免疫抑制方案之該投與包括在以下時間向該個體投與鈣調神經磷酸酶抑制劑：(i)在投與第一次劑量之該載體的前四天中之每一天；(ii)在投與第一次劑量之該載體的當天；(iii)在投與一或多次後續劑量之該載體的當天；及/或(iv)在投與第一次劑量之該載體的當天與投與最後一次劑量之該載體的當天之間的每一天；及/或(v)在投與最後一次劑量之該載體的當天之後的一天、兩天或更多天中之每一天；視情況其中該鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司。
在各種實施例中，該免疫抑制方案之該投與包括向該個體每天投與單次劑量之鈣調神經磷酸酶抑制劑或每天投與複數次劑量之鈣調神經磷酸酶抑制劑，視情況其中該鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司。
在各種實施例中，該免疫抑制方案之該投與包括向該個體投與0.001至0.1 mg/kg/天之他克莫司，視情況其中該投與為皮下投與。
在各種實施例中，該方法與不包括一或多種免疫抑制劑的對照相比，(i)並未引起IFN-g、TNF、IL-2、IL-4、IL-5或IL-6中之一或多者之量的顯著增加；或(ii)引起IFN-g、TNF、IL-2、IL-4、IL-5或IL-6中之一或多者的量的顯著較小增加，視情況其中該對照不包括選自以下之一或多種免疫抑制劑：(a)該發炎性信號抑制劑；(b)該IL-6受體拮抗劑；(c)該皮質類固醇；及(d)該鈣調神經磷酸酶抑制劑；視情況其中該量係藉由ELISA或細胞介素珠陣列法來量測。
在各種實施例中，該方法進一步包括向該個體投與幹細胞動員方案。
在各種實施例中，該載體包括編碼可篩選標記之核酸序列，視情況其中該可篩選標記為MGMTP140K 。
在各種實施例中，該方法包括向該個體投與選擇劑，視情況其中該可篩選標記為MGMTP140K 且該選擇劑為O6 BG/BCNU。
在各種實施例中，以一或多次劑量向該個體投與該選擇劑，視情況其中，在向該個體投與第一次劑量之載體之後約1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週及/或10週，向該個體投與第一次劑量之該選擇劑。
在各種實施例中，藉由注射向該個體投與該載體，視情況其中該注射為靜脈內或皮下注射。
在各種實施例中，至少第一次劑量之該載體包括至少1E10、1E11或1E12病毒粒子/公斤(vp/kg)。
在各種實施例中，該載體以至少1E10、1E11、1E12、2E12或3E12 vp/kg之總劑量投與。
在各種實施例中，該載體為腺病毒載體、腺相關病毒載體、單純疱疹病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體、α病毒載體、黃病毒載體、棒狀病毒(rhabdoviral)載體、麻疹病毒載體、新城雞瘟(Newcastle disease)病毒載體、痘病毒載體或微小RNA病毒(picornaviral)載體。
在各種實施例中，該載體為腺病毒載體。
在各種實施例中，該載體為B族腺病毒載體。
在各種實施例中，該載體為或衍生自Ad5/35或Ad35腺病毒載體，視情況其中該載體為Ad35++或Ad5/35++腺病毒載體。
在各種實施例中，該載體為不具有複製能力的載體，視情況其中該不具有複製能力的載體為輔助依賴性腺病毒載體。
在各種實施例中，病毒基因療法載體包括含有治療性有效負載之核酸，且其中該方法進一步包括向該個體投與支持載體，該支持載體編碼有助於將該治療性有效負載整合至目標細胞基因體中之藥劑。
在各種實施例中，將該支持載體與該病毒基因療法載體一起向該個體投與。
在各種實施例中，該支持載體以1E9至1E14病毒粒子/公斤(vp/kg)之總劑量投與。
在各種實施例中，該病毒基因療法載體包括含有治療性有效負載之核酸，且其中該方法使得將該治療性有效負載遞送至幹細胞，視情況其中該治療性有效負載之遞送包括將該治療性有效負載整合至該等幹細胞之基因體中。
在各種實施例中，該病毒基因療法載體包括含有編碼蛋白質之治療性有效負載的核酸，且在向該個體投與該載體之後，該個體之至少約70%、約80%或約90%之PBMC表現該蛋白質。
在各種實施例中，該個體為人類個體。
在各種實施例中，該人類個體罹患鐮狀細胞貧血、地中海型貧血、中間型地中海貧血、A型血友病、B型血友病、馮威里氏病(von Willebrand Disease)、第五因素缺陷、第七因素缺陷、第十因素缺陷、第十一因素缺陷、第十二因素缺陷、第十三因素缺陷、伯納德-蘇里爾症候群(Bernard-Soulier Syndrome)、灰色血小板症候群。
在各種實施例中，在投與至少一次劑量之該病毒基因療法載體之後，基於該個體或來自該個體之樣本中免疫毒性生物標記之所量測含量，使該免疫抑制方案中之一或多種免疫抑制劑之給藥方案在單位劑量、每日劑量、總劑量、劑量頻率及/或劑量總數方面增加，其中若該所量測含量指示免疫毒性，則增加該一或多種免疫抑制劑之該給藥方案。
在各種實施例中，該免疫毒性生物標記係選自包括以下之群：IL-Iβ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-23、IL-27、IL-30、IL-36、IL-1Ra、IL-2R、IFN-a、IFN-b、IFN-γ、MIP-Ia、MIP-Iβ、MCP-1、TNF-α、TNF-β GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、VEGF、RANTES、EGF、HGF、FGF-β、CD40、CD40L、C反應蛋白、降鈣素原、鐵蛋白、D-二聚體、淋巴球總群、淋巴球亞群、個體溫度及其組合。
在各種實施例中，在投與至少一次劑量之該病毒基因療法載體之後，基於該個體或來自該個體之樣本中針對該病毒基因療法載體之抗體之所量測含量，使該免疫抑制方案中之一或多種免疫抑制劑之給藥方案在單位劑量、每日劑量、總劑量、劑量頻率及/或劑量總數方面增加，其中若該所量測含量指示免疫毒性，則增加該一或多種免疫抑制劑之該給藥方案，視情況其中該所量測含量為抗體力價，及視情況其中該等抗體為中和抗體。
在各種實施例中，該免疫抑制方案中之該一或多種免疫抑制劑之該給藥方案包括具有以下中之一或多者的給藥方案：(i)介白素-1(IL-1)信號抑制劑，視情況其中該IL-1信號抑制劑為阿那白滯素；(ii) IL-6信號抑制劑，視情況其中該IL-6信號抑制劑為托珠單抗；(iii)皮質類固醇，視情況其中該皮質類固醇為地塞米松；及(iv)鈣調神經磷酸酶抑制劑，視情況其中該鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司。 定義
約 ：如本文所用，術語「約」當在提及一個值時使用時係指上下文中對於所提及之值而言類似的值。一般而言，在熟悉上下文的情況下，熟習此項技術者應瞭解由該上下文中之「約」所涵蓋的相關變化程度。舉例而言，在一些實施例中，術語「約」可涵蓋在所提及之值的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小之內的一系列值。
投與 ：如本文所用，術語「投與」通常係指向個體或系統投與組合物以達成本身為該組合物或包括於該組合物中之藥劑的遞送。
親和力 ：如本文所用，「親和力」係指特定結合劑(例如病毒載體)及/或其結合部分與結合目標(例如細胞)之間的非共價相互作用總和的強度。除非另外指示，否則如本文所用，「結合親和力」係指結合劑與其結合目標(例如病毒載體與病毒載體之目標細胞)之間的1:1相互作用。熟習此項技術者瞭解親和力變化可藉由與參考比較(例如相對於參考增加或減少)來描述，或可經由數值描述。親和力可以此項技術中已知之多種方式加以量測及/或表示，包括平衡解離常數(KD )及/或平衡締合常數(KA )。KD 為k解離 /k締合 之商，而KA 為k締合 /k解離 之商，其中k締合 係指例如病毒載體與目標細胞之締合速率常數，且k解離 係指例如病毒載體自目標細胞之解離。可藉由熟習此項技術者已知之技術測定k締合 及k解離 。
藥劑 ：如本文所用，術語「藥劑」可指任何化學實體，包括但不限於原子、分子、化合物、胺基酸、多肽、核苷酸、核酸、蛋白質、蛋白複合物、液體、溶液、醣、多醣、脂質或其組合或複合物中的任一或多者。
抗體 ：如本文所用，術語「抗體」係指包括足以賦予與特定目標抗原之特異性結合的典型免疫球蛋白序列元件的多肽。如此項技術中已知，天然產生之完整抗體為150 kD之四聚藥劑，其由彼此締合為常稱為「Y形」結構之結構的兩個相同重鏈多肽(各自約50 kD)及兩個相同輕鏈多肽(各自約25 kD)構成。各重鏈由至少四個域(各自約110個胺基酸長)構成：胺基端可變(VH)域(位於Y結構頂端處)，繼之為三個恆定域：CH1、CH2及羧基端CH3(位於Y莖之基底處)。稱為「開關」之短區連接重鏈可變區及恆定區。「鉸鏈」將CH2及CH3域連接至抗體其餘部分。此鉸鏈區中之兩個二硫鍵使完整抗體中之兩個重鏈多肽彼此連接。各輕鏈由兩個域構成：胺基端可變(VL)域，繼之為羧基端恆定(CL)域，其藉由另一「開關」彼此分離。完整抗體四聚體由兩個重鏈-輕鏈二聚體構成，其中該等重鏈及輕鏈藉由單個二硫鍵彼此連接，並且另外兩個二硫鍵使重鏈鉸鏈區彼此連接，使得二聚體彼此連接且形成四聚體。天然產生之抗體亦經糖基化，通常在CH2域上經糖基化。天然抗體中各域之結構的特徵在於由兩個β摺疊(例如，3、4或5股摺疊)相對於彼此堆積為壓縮反平行β桶而形成的「免疫球蛋白摺疊」。各可變域含有三個稱為「互補決定區」(CDR1、CDR2及CDR3)之高變環及四個在某種程度上恆定之「構架」區(FR1、FR2、FR3及FR4)。當天然抗體摺疊時，FR區形成為域提供結構構架之β摺疊，且使來自重鏈及輕鏈兩者之CDR環區在三維空間中結合在一起以使得其產生位於Y結構頂端處之單個高變抗原結合位點。天然存在之抗體的Fc區結合於補體系統之元件，且亦結合於效應細胞，包括(例如)介導細胞毒性之效應細胞上的受體。如此項技術中已知，Fc區對Fc受體之親和力及/或其他結合特質可經由糖基化或其他修飾來加以調節。在一些實施例中，根據本發明產生及/或利用之抗體包括經糖基化之Fc域，包括具有經修飾或工程改造之此類糖基化的Fc域。出於本發明之目的，在某些實施例中，包括如在天然抗體中發現之足夠免疫球蛋白域序列之任何多肽或多肽複合物可稱為及/或用作「抗體」，無論該多肽係天然產生(例如藉由使生物體與抗原反應而生成)或藉由重組工程改造、化學合成或其他人工系統或方法產生均如此。在一些實施例中，抗體為多株抗體；在一些實施例中，抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗體具有小鼠、兔、靈長類動物或人類抗體所特有之恆定區序列。在一些實施例中，如此項技術中已知，抗體序列元件經人類化、靈長類化、嵌合等。此外，在適當具體實例中(除非另外陳述或自上下文明確得知，否則)，如本文所用之術語「抗體」可指此項技術已知或研發的用於在替代性呈現中利用抗體結構及功能特徵之構築體或形式中的任一者。舉例而言，在一些實施例中，根據本發明使用之抗體呈選自以下之形式：完整IgA、IgG、IgE或IgM抗體；雙特異性或多特異性抗體(例如Zybodies® 等)；抗體片段，諸如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd'片段、Fd片段及經分離之CDR或其集合；單鏈Fv；多肽-Fc融合物；單域抗體(例如鯊魚單域抗體，諸如IgNAR或其片段)；駝樣抗體(cameloid antibody)；遮蔽抗體(例如Probodies® )；小模塊免疫藥物(Small Modular ImmunoPharmaceuticals) (「SMIPsTM」)；單鏈或串聯雙功能抗體(TandAb® )；VHH；Anticalins®；Nanobodies®微型抗體；BiTE®；錨蛋白重複蛋白質或DARPINs®；Avimers®；DART；TCR樣抗體；Adnectins®；Affilins®；Trans-bodies® ；Affibodies®；TrimerX®；MicroProteins；Fynomers®、Centyrins®；及KALBITOR®。在一些實施例中，抗體可能缺少在其天然產生的情況下將具有之共價修飾(例如附接聚糖)。在一些實施例中，抗體可含有共價修飾(例如附接聚糖、治療劑、融合多肽或其他側基，諸如聚乙二醇)。
抗體片段 ：如本文所用，「抗體片段」係指如本文所描述之抗體或抗體藥劑的一部分，且通常係指包括其抗原結合部分或可變區的一部分。抗體片段可藉由任何手段產生。舉例而言，在一些實施例中，可藉由完整抗體或抗體藥劑之片段化來以酶促或以化學方式產生抗體片段。或者，在一些實施例中，抗體片段可以重組方式產生(亦即藉由經工程改造之核酸序列之表現)。在一些實施例中，可完全或部分合成地產生抗體片段。在一些實施例中，抗體片段(尤其抗原結合抗體片段)之長度可為至少約50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190個胺基酸或更多，在一些實施例中為至少約200個胺基酸。
相關聯 ：當「相關聯」在本文中使用時，若一個事件或實體之存在、程度及/或形式與另一事件或實體之存在、程度及/或形式相關，則兩個事件或實體彼此「相關聯」。舉例而言，若特定實體(例如，多肽、基因標籤、代謝物、微生物等)之存在、含量及/或形式與(例如，在整個相關群體中)疾病、病症或病況之發生及/或對疾病、病症或病況之易感性相關，則將該特定實體視為與該特定疾病、病症或病況相關。在一些實施例中，若兩個或更多個實體直接或間接相互作用，使得其彼此具有及/或保持物理接近性，則其彼此物理上「相關」。在一些實施例中，彼此物理上相關之兩個或更多個實體彼此共價連接；在一些實施例中，彼此物理上相關之兩個或更多個實體彼此不共價連接，但以非共價形式相關，例如藉助於氫鍵、凡得瓦爾力相互作用(van der Waals interaction)、疏水相互作用、磁性及其組合。
之間或自 ：如本文所用，術語「之間」係指屬於所指示之上部邊界與下部邊界或第一邊界與第二邊界之間的內容，包括邊界。類似地，當在值範圍之上下文中使用時，術語「自」指示該範圍包括屬於所指示之上部邊界與下部邊界或第一邊界與第二邊界之間的內容，包括邊界。
結合 ：如本文所用，術語「結合」係指兩個或更多個藥劑之間或之中的非共價締合。「直接」結合涉及藥劑之間的物理接觸；間接結合涉及藉助於與一或多種中間藥劑物理接觸之物理相互作用。兩種或更多種藥劑之間的結合可在多種背景中之任一者下發生及/或評估，包括在相互作用之藥劑以隔離形式或在更複雜系統之背景下(例如在與載劑藥劑共價或以其他方式締合及/或在生物系統或細胞中時)研究的情況。
生物標記 ：如本文所用，與其在此項技術中之用途一致之術語「生物標記」係指一種實體、條件或活動，其存在、程度或形式與所關注之特定生物事件或狀態相關，以使得其被視為該事件或狀態之「標記」。僅給出生物標記之幾個實例，在一些實施例中，生物標記可為或包括特定疾病、病症或病況之標記，或可為例如個體中可產生、出現或復發特定疾病、病症或病況之定性或定量機率的標記。在一些實施例中，生物標記可為或包括特定治療結果或其定性或定量機率之標記。因此，在各種實施例中，生物標記可為所關注之相關生物事件或狀態之預測、預後及/或診斷。生物標記可為任何化學物質類別之實體。舉例而言，在一些實施例中，生物標記可為或包括核酸、多肽、脂質、碳水化合物、小分子、無機藥劑(例如金屬或離子)或其組合。在一些實施例中，生物標記為細胞表面標記。在一些實施例中，生物標記為細胞內的。在一些實施例中，生物標記發現於細胞外部(例如被分泌或以其他方式產生或存在於細胞外部，例如體液中，諸如血液、尿液、淚液、唾液、腦脊髓液及其類似物中)。在一些實施例中，生物標記為一種活動，諸如由基因編碼之產物的表現或經由生物路徑之信號傳導。熟習此項技術者應瞭解，生物標記可個別地確定所關注之特定生物事件或狀態，或可代表或有助於確定所關注之特定生物事件或狀態的統計機率。在一些實施例中，生物標記具有高度特異性，此係由於其反映所關注之生物事件或狀態之特定狀態的高機率。在一些情況下，特異性與敏感性之間存在逆相關，使得增加之特異性可以敏感性為代價出現，或使得增加之敏感性可以特異性為代價出現。熟習此項技術者應瞭解，適用生物標記無需具有100%特異性及/或100%準確性，且可反映此等或其他考慮之平衡。熟習此項技術者應瞭解，標記之特異性及/或敏感性可隨著與所關注之特定生物事件或狀態相關而不同。在一些情況下，生物標記可稱為「標記」。
可比較 ：如本文所用，術語「可比較」係指兩個或更多個條件、情況、藥劑、實體、群體等之集合內的成員可彼此不一致但充分類似以允許其間的比較，使得熟習此項技術者將瞭解到，可基於觀測到之差異或類似性合理地得出結論。在一些實施例中，條件、情況、藥劑、實體、群體等之可比較集合典型地特徵在於複數個基本上一致之特徵及零、一或複數個不同特徵。一般熟習此項技術者應理解，在上下文中，需要何種程度之一致性才使集合之成員可比較。舉例而言，一般熟習此項技術者應瞭解，條件、情況、藥劑、實體、群體等之集合成員，在藉由足夠數目及類型之實質上一致特徵表徵以保證所觀測到之差異可完全或部分歸因於其不一致特徵之合理結論時彼此可比較。
控制表現或活性 ：如本文所用，若第二元件(例如蛋白質或編碼諸如蛋白質之藥劑的核酸)之表現或活性完全或部分依賴於第一元件(例如蛋白質，諸如轉錄因子，或核酸序列，諸如啟動子)在至少一組條件下的狀態(例如存在、不存在、構形、化學修飾、相互作用或其他活性)，則第一元件「控制」或「驅動」第二元件之表現或活性。表現或活性之控制可為實質控制或活性，例如其中在至少一組條件下第一元件之狀態之變化可引起第二元件之表現或活性與參考對照相比變化至少10% (例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍)。
對應於 ：如本文所用，術語「對應於」可用以經由與適當的參考化合物或組合物比較來標明化合物或組合物中結構元素之位置/標識。舉例而言，在一些實施例中，聚合物中之單體殘基(例如多肽中之胺基酸殘基或多核苷酸中之核酸殘基)可鑑別為「對應於」適當的參考聚合物中之殘基。舉例而言，熟習此項技術者瞭解，所提供多肽或多核苷酸序列中之殘基通常根據相關參考序列之流程命名(例如編號或標記)(即使例如此類名稱不反映所提供序列之文字編號)。藉助於說明，若參考序列在位置100-110處包括特定胺基酸模體，且第二相關序列在位置110-120處包括相同模體，則第二相關序列之模體位置可稱為「對應於參考序列之位置100-110」。熟習此項技術者瞭解，對應位置可容易例如藉由序列比對來鑑別，且此類比對通常藉由多種已知工具、策略及/或算法中之任一者實現，包括但不限於軟體程式，諸如(例如)BLAST、CS-BLAST、CUDASW++、DIAMOND、FASTA、GGSEARCH/GLSEARCH、Genoogle、HMMER、HHpred/HHsearch、IDF、Infernal、KLAST、USEARCH、parasail、PSI-BLAST、PSI-Search、ScalaBLAST、Sequilab、SAM、SSEARCH、SWAPHI、SWAPHI-LS、SWIMM或SWIPE。
劑型或單位劑型 ：熟習此項技術者應瞭解，術語「劑型」可用於指用於向個體投與之活性劑(例如治療劑或診斷劑)之物理離散單位。通常，各此類單位含有預定量之活性劑。在一些實施例中，此類量為適合於根據已確定當向相關群體投與時與所需或有益結果相關之給藥方案(亦即以治療給藥方案)投與之單位劑量之量(或其整個部分)。一般熟習此項技術者瞭解，向特定個體投與之治療組合物或治療劑之總量或散量係由一或多名主治醫師確定且可涉及投與多個劑型。
給藥方案 ：如本文所用，術語「給藥方案」可指投與個體之一或多種相同或不同單位劑量的集合，通常包括複數個單位劑量，各單位劑量之投與與其他單位劑量之投與相隔一段時間。在各種實施例中，給藥方案之一或多個或所有單位劑量可相同或可變化(例如隨時間推移增加、隨時間推移減少或根據個體及/或根據開業醫師之決定調節)。在各種實施例中，各劑量之間的一或多個或所有時間段可相同或可變化(例如隨時間推移增加、隨時間推移減少或根據個體及/或根據開業醫師之決定調節)。在一些實施例中，既定治療劑具有推薦給藥方案，其可涉及一或多次劑量。通常，市售藥物之至少一種推薦給藥方案為熟習此項技術者已知。在一些實施例中，給藥方案在跨相關群體投與時與所需或有益結果相關(亦即為治療給藥方案)。
下游及上游 ：如本文所用，術語「下游」意謂第一DNA區相對於第二DNA區更接近包括第一DNA區及第二DNA區之核酸之3'端。如本文所用，術語「上游」意謂第一DNA區相對於第二DNA區更接近包括第一DNA區及第二DNA區之核酸之5'端。
經工程改造 ：如本文所用，術語「經工程改造」係指已人工操控之態樣。舉例而言，當兩個或更多個不以自然界中之順序連接在一起之序列經人工操控以在經工程改造之多核苷酸中彼此連接時，該多核苷酸被視為「經工程改造」。熟習此項技術者應瞭解，「經工程改造」之核酸或胺基酸序列可為重組核酸或胺基酸序列。在一些實施例中，經工程改造之多核苷酸包括在自然界中發現與第一序列可操作地連接但在自然界中未發現與第二序列可操作地連接，呈經工程改造之多核苷酸形式且藉由人工與第二序列可操作地連接的編碼序列及/或調節序列。在一些實施例中，若細胞或生物體經操控以使得其遺傳資訊改變(例如，例如藉由轉型、交配、體細胞雜交、轉染、轉導或其他機制引入先前不存在的新遺傳物質，或例如藉由取代、缺失或交配改變或移除先前存在的遺傳物質)，則視為該細胞或生物體「經工程改造」。作為慣例且如熟習此項技術者所理解，經工程改造之多核苷酸或細胞之完全或不完全子代或複本通常仍稱為「經工程改造」，即使直接操控係對先前實體進行。
賦形劑 ：如本文所用，「賦形劑」係指可包括於醫藥組合物中例如以提供或促成所需稠度或穩定效果之非治療劑。在一些實施例中，適合醫藥賦形劑可包括例如澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻穀、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、乙二醇、水、乙醇或其類似物。
表現 ：如本文所用，「表現」係個別及/或累計指促使自諸如多肽之經編碼藥劑之核酸序列產生的一或多種生物過程。表現特定地包括轉錄及轉譯中之任一或兩者。
基因或轉殖基因 ：如本文所用，術語「基因」係指作為或包括編碼序列(亦即，編碼表現產物(諸如RNA產物及/或多肽產物)之DNA序列)，視情況連同控制編碼序列表現之一些或全部調節序列的DNA序列。在一些實施例中，基因包括非編碼序列，諸如但不限於內含子。在一些實施例中，基因可包括編碼(例如外顯子)與非編碼(例如內含子)序列。在一些實施例中，基因包括作為啟動子之調節序列。在一些實施例中，基因包括以下中之一或兩者：(i)在諸如源基因體之參考情形下在編碼序列上游延伸預定數目個核苷酸的DNA核苷酸；及(ii)在諸如源基因體之參考情形下在編碼序列下游延伸預定數目個核苷酸的DNA核苷酸。在各種實施例中，核苷酸之預定數目可為500 bp、1 kb、2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、10 kb、20 kb、30 kb、40 kb、50 kb、75 kb或100 kb。如本文所用，「轉殖基因」係指基因相對於存在該基因或可藉由工程改造而置放該基因的參考背景而言係非內源性或天然的。
基因產物或表現產物 ：如本文所用，術語「基因產物」或「表現產物」通常係指自基因(加工前及/或加工後)轉錄之RNA或由自基因轉錄之RNA編碼的多肽(修飾前及/或修飾後)。
宿主細胞 / 目標細胞 ：如本文所用，「宿主細胞」係指已引入外源性核酸(重組或以其他方式)(諸如轉殖基因)之細胞。熟習此項技術者瞭解，「宿主細胞」可為最初引入外源性核酸的細胞及/或其完全或不完全的子代或複本。在一些實施例中，宿主細胞包括一或多種病毒基因或轉殖基因。在一些實施例中，預期或潛在宿主細胞可稱為「目標細胞」。
一致性 ：如本文所用，術語「一致性」係指聚合分子之間，例如核酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。用於計算如兩個所提供之序列之間的一致性百分比的方法係此項技術中已知的。舉例而言，兩個核酸或多肽序列之一致性百分比的計算可例如藉由出於最佳比較目的比對兩個序列(或一個或兩個序列之互補序列)來進行(例如可將間隙引入第一及第二序列中之一個或兩個中以便最佳比對，且出於比較目的可忽略非一致序列)。接著比較對應位置處之核苷酸或胺基酸。當第一序列中之位置由與第二序列中之相應位置處相同之殘基(例如核苷酸或胺基酸)佔據時，則分子在彼位置處一致。在視情況考慮到可能需要引入以供用於最佳比對兩個序列的空隙之數目及各空隙之長度的情況下，該兩個序列之間的一致性百分比與該等序列共有之一致位置之數目有關。序列之比較及兩個序列之間的一致性百分比的確定可使用計算演算法，諸如BLAST (基於局部比對算法的檢索工具)實現。
改善、增加、抑制及減少 ：如本文所用，術語「改善」、「增加」、「抑制」及「減少」及其語法同等物指示相對於參考之定性或定量差異。
抑制劑 ：如本文所用，術語「抑制劑」係指一種實體、條件或事件，其存在、含量或程度與目標之含量、表現或活性降低相關。在一些實施例中，抑制劑可直接起作用(在此情況下，其例如藉由結合至目標直接對其目標施加其影響)；在一些實施例中，抑制劑可間接起作用(在此情況下，其藉由與目標之調節因子相互作用及/或以其他方式改變目標之調節因子而施加其影響，使得目標之含量及/或活性降低)。在一些實施例中，抑制劑為其存在或含量與目標含量或活性相關的抑制劑，該目標含量或活性相對於特定參考含量或活性(例如在適當參考條件下觀測到的，諸如在已知抑制劑之存在或在不存在所討論之抑制劑等情況下)降低。
經分離 ：如本文所用，「經分離」係指如下物質及/或實體：已(a)與至少一些在最初產生(無論在自然界中及/或在實驗環境中)時與其結合的組分分離，及/或(b)藉由人工設計、產生、製備及/或製造。經分離之物質及/或實體可與約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或大於約99%之最初與其相關之其他組分分離。在一些實施例中，經分離藥劑為約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或大於約99%純。如本文所用，若物質實質上不含其他組分，則該物質為「純」的。在一些實施例中，如熟習此項技術者將理解，在與某些其他組分(諸如(例如)一或多種載劑或賦形劑(例如緩衝劑、溶劑、水等))組合之後，物質仍可被視為「經分離」或甚至「純」的；在此類實施例中，在不包括此類載劑或賦形劑的情況下計算物質之分離或純度百分比。僅給出一個實例，在一些實施例中，當(i)藉助於其衍生起源或來源，不與在自然界中在其天然狀態中伴隨其之一些或全部組分結合；(ii)其實質上不含與在自然界中產生其之物種相同的物種之其他多肽或核酸；(iii)由來自不為在自然界中產生其之物種的細胞或其他表現系統的組分表現或以其他方式與該等組分結合時，自然界中存在之生物聚合物(諸如多肽或多核苷酸)被視為「經分離」。因此，舉例而言，在一些實施例中，以化學方式合成或在與在自然界中產生其之系統不同的細胞系統中合成的多肽被視為「經分離」多肽。或者或另外，在一些實施例中，已經歷一或多種純化技術之多肽可在其已與(i)在自然界中與其結合；及/或(ii)在最初產生時與其結合之其他組分分離的程度上被視為「經分離」多肽。
可操作地連接 ：如本文所用，「可操作地連接」係指至少第一元件與第二元件相關聯，使得組件元件處於允許其以其預期方式起作用的關係。舉例而言，若調節序列及編碼序列以允許藉由調節序列控制編碼序列之表現的方式相關聯，則核酸調節序列「可操作地連接」至核酸編碼序列。在一些實施例中，「可操作地連接」之調節序列直接或間接地與編碼序列共價連接(例如在單個核酸中)。在一些實施例中，調節序列控制編碼序列呈反式之表現且在與編碼序列相同之核酸中包括調節序列並非可操作連接之要求。
醫藥學上可接受 ：如本文所用，應用於用於調配如本文所揭示之組合物之一或多種或所有組分的術語「醫藥學上可接受」意謂各組分必須與組合物之其他成分相容且對其接受體無害。
醫藥學上可接受之載劑 ：如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」係指促進藥劑(例如，醫藥劑)調配、改良藥劑之生體可用率或促進藥劑自個體之一個器官或部分輸送至另一個器官或部分的醫藥學上可接受之物質、組合物或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑囊封物質。可充當醫藥學上可接受之載劑的物質之一些實例包括：糖，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及乙酸纖維素；粉末狀黃蓍；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可油及栓劑蠟；油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；二醇，諸如丙二醇；多元醇，諸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇及聚乙二醇；酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；褐藻酸；無熱原質水；等張生理食鹽水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；pH緩衝溶液；聚酯、聚碳酸酯及/或聚酸酐；及醫藥調配物中採用之其他無毒相容性物質。
醫藥組合物 ：如本文所用，術語「醫藥組合物」係指將活性劑連同一或多種醫藥學上可接受之載劑一起調配之組合物。
多肽 ：如本文所用，「多肽」係指胺基酸之任何聚合鏈。在一些實施例中，多肽具有在自然界中存在之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽具有在自然界中不存在之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽具有經工程改造之胺基酸序列，此係因為其經由人工操作設計及/或產生。在一些實施例中，多肽可包括天然胺基酸、非天然胺基酸或兩者。在一些實施例中，多肽可僅包括天然胺基酸或僅包括非天然胺基酸。在一些實施例中，多肽可包括D-胺基酸、L-胺基酸或兩者。在一些實施例中，多肽可僅包括L-胺基酸。在一些實施例中，多肽可例如在多肽之N端、在多肽之C端、在非末端胺基酸處或在其任何組合處包括一或多個側基或其他修飾，例如一或多個胺基酸側鏈。在一些實施例中，此類側基或修飾可選自包括以下之群：乙醯化、醯胺化、脂質化、甲基化、磷酸化、糖基化、糖化、硫酸化、甘露糖基化、亞硝基化、醯化、棕櫚醯化、異戊二烯化、聚乙二醇化等(包括其組合)。在一些實施例中，多肽可為環狀及/或可包括環狀部分。
在一些實施例中，術語「多肽」可附接於參考多肽、活性或結構之名稱以指示共有相關活性或結構之一類多肽。對於此類類別，本發明提供及/或熟習此項技術者應瞭解該類別內的例示性多肽，其胺基酸序列及/或功能為已知的。在一些實施例中，多肽類別或家族之成員顯示與該類別之參考多肽之顯著序列同源性或一致性，與該類別之參考多肽共有共同序列模體(例如，特徵序列元件)，及/或與該類別之參考多肽共有共同活性(在一些實施例中，在可比含量下或在指定範圍內)。舉例而言，在一些實施例中，成員多肽顯示與參考多肽之總體序列同源性或一致性程度，其為至少約30%-40%且通常大於約50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高；及/或包括至少一個區(例如保守區，其在一些實施例中可為或包括特徵序列元件)，其顯示極高序列一致性，常常大於90%或甚至95%、96%、97%、98%或99%。此類保守區通常涵蓋至少3-4個且在一些情況下至多20或更多個胺基酸；在一些實施例中，保守區涵蓋至少一個具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個相鄰胺基酸的延伸段。在一些實施例中，相關多肽可包括親本多肽之片段。在一些實施例中，適用多肽可包括複數個片段，發現其中每一者在同一親本多肽中呈與在所關注多肽中所發現不同的相對於彼此的空間排列(例如在親本中直接連接之片段可在所關注多肽中空間分離或反之亦然，及/或片段可以與在親本中不同的順序存在於所關注多肽中)，使得所關注多肽為其親本多肽之衍生物。
預防 (Prevent/prevention)：如本文所用，與疾病、病症或病況之發生有關的術語「預防(prevent/prevention)」係指降低產生該疾病、病症或病況之風險；延遲該疾病、病症或病況之發作；延遲該疾病、病症或病況之一或多種特徵或症狀之發作；及/或降低該疾病、病症或病況之一或多種特徵或症狀之頻率及/或嚴重程度。預防可指在特定個體中之預防或對一群個體產生之統計影響。當疾病、病症或病況之發作已延遲一段時間(該段時間由熟習此項技術者預定義或理解)時，可視為預防已發生。
啟動子 ：如本文所用，「啟動子」或「啟動子序列」可為直接或間接(例如經由結合啟動子之蛋白質或物質)參與編碼序列之轉譯起始及/或持續合成能力的DNA調節區。啟動子可在適合條件下在一或多種轉錄因子及/或調節部分與啟動子結合後起始編碼序列之轉譯。參與編碼序列轉錄起始之啟動子「可操作地連接」至編碼序列。在某些情況下，啟動子可為或包括DNA調節區，其自轉錄起始位點(在其3'端)延伸至上游(5'方向)位置，使得如此指定之序列包括起始轉錄事件所必需的最小數目之鹼基或元件中之一或兩者。啟動子可為、包括諸如強化子及抑制子序列之表現控制序列或可操作地與之相關聯或可操作地與之連接。
參考 ：如本文所用，「參考」係指進行比較所相對於之標準或對照。例如，在一些實施例中，藥劑、樣本、序列、受試者、動物或個體、或其群體、或其量度或特徵性代表與參考，亦即藥劑、樣本、序列、受試者、動物或個體、或其群體、或其量度或特徵性代表相比較。在一些實施例中，參考為量測值。在一些實施例中，參考為確立之標準或預期值。在一些實施例中，參考為歷史參考。參考可為定量定性的。通常，如熟習此項技術者應理解，參考及與其比較之值表示在可比條件下的量度。熟習此項技術者應瞭解何時存在足以證明依賴性及/或比較的相似性。在一些實施例中，適當參考可為藥劑、樣本、序列、受試者、動物或個體、或其群體，在熟習此項技術者識別作為可比之條件下，例如以便評估一或多個特定變數(例如存在或不存在藥劑或條件)或其量度或特徵性代表。
調節序列 ：如本文所用，在核酸編碼序列表現之上下文中，調節序列為控制編碼序列之表現的核酸序列。在一些實施例中，調節序列可控制或影響基因表現之一或多個態樣(例如，細胞類型特異性表現、譜系特異性表現、誘導型表現等)。
樣本 ：如本文所用，術語「樣本」通常係指獲取於或衍生自如本文中所描述的所關注生物源(例如，組織或生物體或細胞培養物)的樣本。在一些實施例中，生物源為或包括諸如動物或人類之生物體。在一些實施例中，樣本為或包括生物組織或液體。在一些實施例中，樣本可為或包括細胞、組織或體液。在一些實施例中，樣本可為或包括血液、血球、無細胞DNA、游離漂浮核酸、腹水、活檢樣本、手術試樣、含細胞體液、痰液、唾液、糞便、尿液、腦脊髓液、腹膜液、胸膜液、淋巴、婦科液、分泌物、排泄物、皮膚拭子、陰道拭子、口腔拭子、鼻拭子、洗液或灌洗液(諸如導管灌洗液或支氣管肺泡灌洗液)、抽吸物、刮屑或骨髓。在一些實施例中，樣本為或包括自單個個體或自複數個個體獲得之細胞。樣本可為直接獲自生物源之「原始樣本」，或可為「經處理之樣本」(例如，例如藉由諸如分離例如mRNA、DNA或蛋白質之方法，藉由修飾原始樣本之化學結構的方法，及/或藉由產生代表原始樣本之一或多種組分或特性之新型或不同組合物的方法，來由原始樣本製備之樣本)。
個體 ：如本文所用，術語「個體」係指生物體，通常為哺乳動物(例如人類、大鼠或小鼠)。在一些實施例中，個體罹患疾病、病症或病況。在一些實施例中，個體易患疾病、病症或病況。在一些實施例中，個體呈現疾病、病症或病況之一或多種症狀或特徵。在一些實施例中，個體未罹患疾病、病症或病況。在一些實施例中，個體不呈現疾病、病症或病況之任何症狀或特徵。在一些實施例中，個體具有一或多個特點，該一或多個特點之特徵在於易患疾病、病症或病況或具有罹患疾病、病症或病況之風險。在一些實施例中，個體為已針對疾病、病症或病況進行測試及/或已投與療法之個體。在一些情況下，人類受試者可互換稱為「患者」或「個體」。
治療劑 ：如本文所用，術語「治療劑」係指在向個體投與時引發所需藥理學作用之任何藥劑。在一些實施例中，若藥劑在適合的群體中展現統計顯著效果，則其被視為治療劑。在一些實施例中，適當群體可為模型生物體群體或人類群體。在一些實施例中，適當群體可由各種標準定義，諸如特定年齡組、性別、基因背景、先前存在之臨床病況等。在一些實施例中，治療劑為可用於治療疾病、病症或病況之物質。在一些實施例中，治療劑為在可出售以向人類投與之前已經或需要由政府機構批准之藥劑。在一些實施例中，治療劑為醫學處方所需要以用於向人類投與之藥劑。
治療有效量 ：如本文所用，「治療有效量」係指對其所投與者產生所需作用之量。在一些實施例中，該術語係指當根據治療給藥方案向罹患或易患疾病、病症及/或病況之群體投與時足以治療該疾病、病症及/或病況的量。在一些實施例中，治療有效量為降低疾病、病症及/或病況之一或多種症狀之發生率及/或嚴重程度，及/或延遲其發作的量。一般熟習此項技術者應瞭解，治療有效量未必在每一特定經治療之個體中達成成功治療。確切而言，治療有效量可為當向需要此類治療之患者投與時在相當大數目之個體中提供特定所需藥理學反應的該量。在一些實施例中，提及治療有效量可為提及如在一或多種特定組織(例如受疾病、病症或病況影響之組織)或流體(例如血液、唾液、血清、汗液、淚液、尿液等)中量測之量。一般熟習此項技術者應瞭解，在一些實施例中，治療有效量之特定藥劑或療法可以單次劑量調配及/或投與。在一些實施例中，治療有效之藥劑可以複數個劑量，例如作為給藥方案之一部分調配及/或投與。
治療 ：如本文所用，術語「治療(treatment)」(亦為「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指投與部分或完全緩解、改善、減輕、抑制特定疾病、病症或病況之一或多種症狀、特點及/或病因、延遲其發作、降低其嚴重程度及/或降低其發生率，或經投與以便實現任何此類結果的療法。在一些實施例中，此類治療可對不展現相關疾病、病症或病況之病徵的個體及/或僅展現疾病、病症或病況之早期病徵的個體進行。或者或另外，此類治療可對展現相關疾病、病症及/或病況之一或多種經確認之病徵的個體進行。在一些實施例中，治療可對已診斷為罹患相關疾病、病症及/或病況之個體進行。在一些實施例中，治療可對已知具有一或多種在統計學上與相關疾病、病症或病況發展風險增加相關的易感性因素之個體進行。
單位劑量 ：如本文所用，術語「單位劑量」係指以單次劑量及/或以醫藥組合物之物理離散單位投與之量。在多個實施例中，單位劑量含有預定量之活性劑。在一些實施例中，單位劑量含有整個單次劑量之藥劑。在一些實施例中，投與超過一個單位劑量以達成總單次劑量。在一些實施例中，需要或者認為需要投與多個單位劑量，以便達成既定作用。單位劑量可為例如含有預定量之一或多種治療劑之一定體積的液體(例如可接受之載劑)、預定量之呈固體形式之一或多種治療劑、含有預定量之一或多種治療劑之持續釋放調配物或藥物傳遞裝置等。應瞭解，單位劑量可以除治療劑之外亦包括各種組分中之任一者的調配物形式存在。舉例而言，可包括可接受之載劑(例如醫藥學上可接受之載劑)、稀釋劑、穩定劑、緩衝劑、防腐劑等。熟習此項技術者應瞭解，在多個實施例中，特定治療劑之總適當日劑量可包括單位劑量之一部分或複數個單位劑量，且可例如由開業醫師在合理的醫學判斷範圍內來決定。在一些實施例中，任何特定個體或生物體之特定有效劑量含量可視多種因素而定，該等因素包括經治療之病症及該病症之嚴重程度；所採用之特定治療劑之活性；所採用之特定組合物；個體之年齡、體重、總體健康狀況、性別及飲食；投與時間及所採用之特定治療劑之排泄速率；治療持續時間；與所採用之特定治療劑組合或同時使用之藥物及/或其他療法；及醫療技術中熟知之類似因素。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張於2020年12月4日申請之美國臨時申請案第63/121,777號及於2020年4月13日申請之美國臨時申請案第63/009,218號之較早申請日之優先權及權益。此等先前申請案中之每一者以全文引用之方式併入本文中。 政府支持
本發明系在政府支持下在由美國國家衛生研究院(the National Institutes of Health)授予的HL136135、HL128288及HL130040下進行。政府享有本發明之某些權利。
活體內療法之挑戰。 病毒基因療法可在哺乳動物中誘發反作用的免疫反應。舉例而言，病毒載體可經由多種路徑中之任一者，包括經由偵測病原體相關分子模式而引起先天性免疫反應。偵測病毒載體之先天性免疫感測器可見於細胞質、核內體或細胞表面中且識別諸如衣殼、包膜、病毒DNA或病毒RNA之病毒特徵。典型先天性免疫反應包括在向個體投與病毒基因療法載體一小時內誘發之細胞介素反應。抗病毒細胞介素可由細胞產生，諸如抗原呈遞細胞(APC)，包括(但不限於)漿細胞樣樹突狀細胞(DC)、習知DC、巨噬細胞及B細胞。先天性免疫反應可包括募集效應淋巴細胞、抑制基因療法載體轉導目標細胞及促進反作用的後天性免疫系統活性之促炎性效應。
在外源性編碼核酸序列之表現產生的產物為個體中之非天然抗原或藉由後天性免疫系統以其他方式識別為外來物之抗原的情況下，後天性免疫亦可證明有問題的。在此類情況下，後天性免疫系統可介導表現外源性編碼核酸序列之個體細胞的毀壞。
已顯示一些腺病毒載體誘發先天性免疫反應及後天性免疫反應。腺病毒載體可經由包括補體活化之各種路徑誘發先天性免疫反應。腺病毒載體可例如在投與腺病毒基因療法載體1小時內迅速誘發促炎性細胞介素之產生。對於某些常見腺病毒，許多人類在投與腺病毒基因療法載體之前具有預先存在之中和抗體。
本發明尤其提供降低由投與病毒載體及/或由基因療法(例如使用病毒基因療法載體之活體內基因療法)產生之免疫毒性的免疫抑制方案。本發明尤其提供包括發炎性信號抑制劑之免疫抑制方案，視情況其中發炎性信號為介白素-1 (IL-1)信號抑制劑，諸如IL-1受體(IL-1R)信號抑制劑。
免疫抑制劑。 本發明包括降低基因療法，例如包括投與病毒基因療法載體之活體內基因療法之免疫毒性的免疫抑制方案。本發明之免疫抑制方案可包括一或多種免疫抑制劑，包括發炎性信號抑制劑。本發明之免疫抑制方案可包括一或多種免疫抑制劑，包括以下中之任一或多者： (i)     發炎性信號抑制劑，諸如介白素-1 (IL-1)信號抑制劑； (ii)    IL-6信號抑制劑； (iii)   皮質類固醇； (iv)   鈣調神經磷酸酶抑制劑； (v)    TNF-α信號抑制劑； (vi)   JAK信號抑制劑；及 (vii)  T細胞活化之共刺激信號傳導抑制劑。
本發明之某些免疫抑制方案可包括一或多種免疫抑制劑，包括以下中之任一或多者： (i)     介白素-1 (IL-1)信號抑制劑； (ii)    IL-6信號抑制劑； (iii)   皮質類固醇； (iv)   鈣調神經磷酸酶抑制劑，及 (vii)  T細胞活化之共刺激信號傳導抑制劑。
在各種實施例中，降低基因療法(例如活體內基因療法)之免疫毒性之免疫抑制方案係與包括一或多種選自以下之病毒載體藥劑的病毒基因療法方案一起向個體投與： (i)     病毒基因療法載體；及 (ii)    支持載體。
在各種實施例中，免疫抑制劑中之任一者可以單次劑量或以複數個劑量向個體投與。在各種實施例中，可在單日或多日內向個體投與免疫抑制劑中之任一者。在各種實施例中，免疫抑制劑中之任一者可以單次劑量或以複數個單獨劑量向個體投與之日劑量投與。在各種實施例中，免疫抑制劑中之任一者之劑量可以包括整個劑量及/或整個日劑量之單一單位劑量或以一起提供整個劑量及/或整個日劑量之複數個單位劑量投與。
在各種實施例中，劑型可包括一定量之作為免疫抑制劑之一或多種藥劑中之每一者。在各種實施例中，劑型可包括一定量之作為屬於相同免疫抑制劑類別或複數個免疫抑制劑類別之免疫抑制劑的兩種或更多種藥劑中之每一者。在各種實施例中，劑型可包括第一免疫抑制劑類別之至少一種免疫抑制劑及作為不同於第一免疫抑制劑類別之免疫抑制劑類別的第二免疫抑制劑類別之至少一種免疫抑制劑。
發炎性信號抑制劑。 已鑑別出可例如在向個體投與外源性藥劑(諸如病毒基因療法載體)後促成發炎反應的廣泛多種信號。轉導發炎性信號之路徑典型地至少部分包括促炎性信號傳導劑及促炎性信號傳導受體，其中促炎性信號傳導劑充當配位體。在各種情況下，促炎性信號傳導受體與促炎性信號傳導受體之結合介導免疫及/或發炎反應。
促炎性信號傳導劑之實例包括細胞介素IL-1β、IL-1α、IL-6、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-8(在此項技術中亦稱為CXCL8)、IL-12、GM-CSF、IL-15及CCL2。
促炎性信號傳導受體(及其配位體)之實例包括IL-1R (IL-1β、IL-1α)、IL-3R、IL-4Ra、IL-5R、IL-6Rα (IL-6)、IL-36R、TNFR1 (TNF-α)、TGFβR1/TGFβR2 (TGF-β)、IFNGR (IFN-γ)、干擾素-α/β受體、IL-8R (包括IL-8RA及IL-8RB型式，亦稱為CXCR1及CXCR2型式) (IL-8/CXCL8)、IL-12R (IL-12)、GM-CSFR (GM-CSF)、IL-15R (IL-15)、CCR2 (CCL2)及CCR4 (CCL2)。
在各種實施例中，發炎性信號抑制劑可為結合或修飾促炎性信號傳導劑以使得促炎性信號傳導劑無法結合促炎性信號傳導受體的藥劑。在各種實施例中，發炎性信號抑制劑可為結合或修飾促炎性信號傳導劑以使得促炎性信號傳導劑以例如與未暴露於抑制劑之參考促炎性信號傳導劑相比降低之親和力、親合力或頻率結合促炎性信號傳導受體的藥劑，包括(但不限於)阻斷劑。在各種實施例中，發炎性信號抑制劑可為結合或修飾促炎性信號傳導劑以使得促炎性信號傳導劑具有例如與未暴露於抑制劑之參考促炎性信號傳導劑相比減少之半衰期的藥劑。在各種實施例中，作為促炎性信號傳導劑之抑制劑的藥劑可稱為促炎性信號傳導劑之拮抗劑。因此，例如受體之抑制劑可稱為受體拮抗劑(例如阿那白滯素為例示性IL-1受體拮抗劑)。
在各種實施例中，發炎性信號抑制劑可為結合或修飾促炎性信號傳導受體以使得促炎性信號傳導受體無法結合促炎性信號傳導劑的藥劑。在各種實施例中，發炎性信號抑制劑可為結合或修飾促炎性信號傳導受體以使得促炎性信號傳導受體以例如與未暴露於抑制劑之參考促炎性信號傳導受體相比降低之親和力、親合力或頻率結合促炎性信號傳導劑的藥劑，包括(但不限於)阻斷劑。在各種實施例中，發炎性信號抑制劑可為結合或修飾促炎性信號傳導受體以使得促炎性信號傳導受體具有例如與未暴露於抑制劑之參考促炎性信號傳導受體相比減少之半衰期的藥劑。在各種實施例中，作為促炎性信號傳導受體之抑制劑的藥劑可稱為促炎性信號傳導受體之拮抗劑。
在各種實施例中，與未暴露於發炎性信號抑制劑之參考相比，將發炎性信號抑制劑遞送至個體引起個體中促炎性信號傳導受體之磷酸化減少，其中促炎性信號傳導受體之磷酸化引起發炎或與發炎正相關。在各種實施例中，與未暴露於發炎性信號抑制劑之參考相比，將發炎性信號抑制劑遞送至個體引起個體中促炎性信號傳導受體之去磷酸化減少，其中促炎性信號傳導受體之去磷酸化引起發炎或與發炎正相關。
在各種實施例中，與未暴露於發炎性信號抑制劑之參考相比，將發炎性信號抑制劑遞送至個體引起發炎減少。在各種實施例中，與未暴露於發炎性信號抑制劑之參考相比，將發炎性信號抑制劑遞送至個體引起指示發炎之生物標記的減少。在各種實施例中，指示發炎之生物標記可為指示免疫活化之細胞介素及/或以下中之任一或多者：IL-Iβ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-23、IL-27、IL-30、IL-36 IL-1Ra、IL-2R、IFN-a、IFN-b、IFN-γ、MIP-Ia、MIP-Iβ、MCP-1、TNF-α、TNF-β、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、VEGF、RANTES、EGF、HGF、FGF-β、CD40及CD40L。其他例示性生物標記可包括相對於向個體投與之藥劑的抗體之濃度或量的量度，諸如對於活體內基因療法方案中向個體投與之載體的中和抗體。
在一些實施例中，發炎性信號抑制劑可為蛋白質，例如結合促炎性信號傳導劑或促炎性信號傳導受體之蛋白質。在各種實施例中，發炎性信號抑制劑可為抗體，例如結合促炎性信號傳導劑或促炎性信號傳導受體之抗體或抗體片段。在各種實施例中，發炎性信號抑制劑可為不為蛋白質之分子，諸如促炎性信號傳導劑或促炎性信號傳導受體之小分子抑制劑。
為提供發炎性信號抑制劑之若干非限制性實例，在各種實施例中，發炎性信號抑制劑可為抗IL-8/CDCL8抗體或抗CCL2抗體。
在一些實施例中，發炎性信號抑制劑為肌苷-5'-單磷酸去氫酶之抑制劑，例如黴酚酸(MPA)。將MPA遞送至個體之例示性發炎性信號抑制劑為黴酚酸嗎啉乙酯(MMF)，其為MPA之前藥。
熟習此項技術者應瞭解，除非另外規定，否則發炎性信號抑制劑可包括本發明中所提供之一或多種其他類別之藥劑。熟習此項技術者應瞭解，如本文所用，發炎性信號傳導之減少應理解為包括、涵蓋、暗示發炎之減輕或治療及/或可與其互換，例如臨床上相關之減輕或治療個體之發炎。
量測個體之發炎的方法為此項技術中已知的。舉例而言，可使用各種生物標記定量量測、定性量測、定量比較或定性比較樣本、個體或病況中或之間的發炎。例示性生物標記包括(但不限於)以下中之任一或多者：C反應蛋白(hs-CRP)、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-23、IL-27、IL-30、IL-36、IL-1Ra、IL-2R、IFN-a、IFN-b、IFN-γ、MIP-Ia、MIP-Iβ、MCP-1、TNF-α、TNF-β、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、VEGF、RANTES、EGF、HGF、FGF-β、CD40及CD40L。其他例示性生物標記可包括相對於向個體投與之藥劑的抗體之濃度或量的量度，諸如對於活體內基因療法方案中向個體投與之載體的中和抗體。
IL - 1 信號抑制劑。 在各種實施例中，發炎性信號抑制劑可為作為促炎性信號傳導劑IL-1β及/或IL-1α或促炎性信號傳導受體IL-1R之抑制劑的藥劑，其中此類發炎性信號抑制劑可累積地稱為IL-1信號抑制劑。在各種實施例中，IL-1信號抑制劑可為競爭性地抑制IL-1β及/或IL-1α與IL-1R之結合的藥劑。舉例而言，康納單抗(canakinumab) (ACZ885)為抑制IL-1β與IL-1R之結合且因此減少發炎性信號傳導的人類抗IL-1β單株抗體。
發炎性信號抑制劑之另一實例為IL-1信號抑制劑利納西普(rilonacept)。利納西普為包括以下之可溶性藥劑：(i)人類IL-1受體(IL-1R1)之胞外部分之配體結合域及(ii) IL-1受體輔助蛋白(IL-1RAcP)之配體結合域，該等配體結合域連接至人類IgG1之Fc區。利納西普可充當誘餌受體及/或拮抗IL-1活化。
發炎性信號抑制劑之另一實例為IL-1信號抑制劑，其為經工程改造以使得其結合IL-1β及/或IL-1α但不轉導促炎性信號之IL-1受體(IL-1R)藥劑。結合IL-1β及/或IL-1α但不轉導促炎性信號之經工程改造IL-1R藥劑可稱為IL-1R拮抗劑。發炎性信號抑制劑之另一實例為IL-1信號抑制劑，其為經工程改造以使得其結合IL-1R且阻斷IL-1R與IL-1β及/或IL-1α之結合但不轉導促炎性信號之IL-1Ra藥劑。阿那白滯素為經工程改造人類IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)藥劑，其藉由競爭性結合IL-1R抑制人類中由IL-1β及/或IL-1α經由IL-1R之信號傳導。阿那白滯素具有與典型人類IL-1Ra胺基酸序列類似但與典型人類IL-1Ra胺基酸序列不同之胺基酸序列，至少因為其在其胺基端處包括甲硫胺酸殘基，如SEQ ID NO: 1中所示。此外，阿那白滯素為重組蛋白，其通常由大腸桿菌藉由編碼SEQ ID NO: 1之核酸序列之表現產生，且為非經糖基化的。
SEQ ID NO : 1 ( 153 aa ； 阿那白滯素 ) MRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE
在各種實施例中，本發明之發炎性信號抑制劑為與SEQ ID NO: 1具有至少80%序列一致性，例如與SEQ ID NO: 1具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之分子。在各種實施例中，本發明之發炎性信號抑制劑為與SEQ ID NO: 1之胺基酸2-153具有至少80%序列一致性，例如與SEQ ID NO: 1之胺基酸2-153具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之分子。在各種實施例中，與SEQ ID NO: 1具有至少80%序列一致性之發炎性信號抑制劑包括胺基端甲硫胺酸殘基。
IL - 6 信號抑制劑。 在各種實施例中，發炎性信號抑制劑可為作為促炎性信號傳導劑IL-6或促炎性信號傳導受體IL-6R之抑制劑的藥劑，其中此類發炎性信號抑制劑可累積地稱為IL-6信號抑制劑。在各種實施例中，IL-6信號抑制劑可為競爭性地抑制IL-6與IL-6R之結合的藥劑。例示性IL-6信號抑制劑包括巴多昔芬(bazedoxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、沙瑞盧單抗(sarilumab)及托珠單抗。
巴多昔芬為IL-6信號傳導之小分子抑制劑，應理解為干擾具有信號傳導能力之IL-6受體複合物之形成。IL-6及IL-6Rα形成二元複合物，其與GP130進一步複合，且兩個此類三元複合物之異二聚化可轉導包括促炎性信號之信號。巴多昔芬為IL-6/GP130相互作用之抑制劑且因此可抑制IL-6信號轉導。
雷洛昔芬為IL-6信號傳導之小分子抑制劑，應理解為干擾具有信號傳導能力之IL-6受體複合物之形成。雷洛昔芬為IL-6/GP130相互作用之抑制劑且因此可抑制IL-6信號轉導。
沙瑞盧單抗為完全人類、單株抗體，其藉由結合及阻斷IL-6受體來抑制介白素-6 (IL-6)路徑。沙瑞盧單抗結合於IL-6受體(可溶性及膜結合形式；sIL-6R及mIL-6R)，且由此抑制IL-6介導之信號轉導。
托珠單抗為人類化IgG1單株抗體，其相對於IL-6R之80 kD組分以高親和力結合IL-6受體。此結合隨後抑制IL-6/IL-6R複合物與膜結合gp130之二聚，從而防止信號傳導。托珠單抗由此抑制IL-6介導之信號轉導。
皮質類固醇。 一或多種皮質類固醇可包括於本發明之免疫抑制方案中。皮質類固醇為具有與激素皮質醇之結構類似性的消炎劑。皮質酮及氫皮質酮可指由人類腎上腺皮質天然產生的皮質類固醇藥劑或以合成方式產生的其類似物。皮質類固醇之實例亦包括貝皮質醇(bethamethasone)、普賴蘇(prednisone)、普賴蘇穠(prednisolone)、曲安西龍(triamcinolone)、甲基普賴蘇穠(methylprednisolone)、帕拉米松(paramethasone)、地塞米松(dexamethasone)、伊塞米松(ethamethasoneb)、氟氫可的松(fludrocortisone)及布地奈德(budesonide)。熟習此項技術者應瞭解此等為皮質類固醇之代表性實例，且皮質類固醇之許多實例為此項技術中熟知的。在一些實施例中，皮質類固醇為糖皮質激素。在一些實施例中，皮質類固醇為鹽皮質激素。在某些實施例中，皮質類固醇為地塞米松。
鈣調神經磷酸酶抑制劑。 磷酸酶鈣調神經磷酸酶抑制劑可例如藉由減少淋巴細胞增殖來抑制免疫毒性。例示性鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司及環孢素(cyclosporine)(或者稱為環孢菌素(ciclosporin)或環孢黴素(cyclosporin))。鈣調神經磷酸酶抑制劑已按免疫抑制劑形式用於器官移植中以治療或減少同種異體移植排斥反應。環孢素為環狀十一肽，而他克莫司為巨環內酯。
TNF - α 信號抑制劑。 在各種實施例中，發炎性信號抑制劑可為作為腫瘤壞死因子(TNF)-α之拮抗劑及/或作為TNF-α信號傳導之抑制劑的藥劑。TNF可參與發炎性及免疫反應且可結合於TNF受體1 (TNFR1)或TNF受體2 (TNFR2)。在結合於至少某些受體後，TNF可觸發包括NFkB及MAPK路徑之路徑，此可增加多種發炎性細胞介素之產生。某些TNF-α信號抑制劑直接結合細胞介素TNF且抑制TNF與TNF受體之相互作用。
TNF-α信號抑制劑包括依那西普、英利昔單抗、阿達木單抗、聚乙二醇化賽妥珠單抗及戈利木單抗。依那西普為兩種TNFR2受體胞外域及人類IgG1之Fc片段的融合蛋白。依那西普可抑制TNF-α及/或TNF-β與TNFR之結合。英利昔單抗為結合TNF-α之可溶性及跨膜形式且抑制TNF-α與TNFR之結合的嵌合單株抗體。阿達木單抗及戈利木單抗為針對TNF-α之完全人類單株抗體，且如英利昔單抗，阿達木單抗及戈利木單抗結合TNF-α及/或抑制TNF-α與TNFR之結合。賽妥珠單抗為結合至聚乙二醇(PEG)之人類化Fab片段。
JAK 信號抑制劑。 在各種實施例中，發炎性信號抑制劑可為作為詹納斯(Janus)激酶(JAK)之拮抗劑及/或作為JAK信號傳導之抑制劑的藥劑。JAK(包括JAK1、JAK2、JAK3及TYK2)為與細胞介素功能(包括發炎功能)相關之細胞質酪胺酸激酶。JAK例如藉由諸如信號轉導及轉錄活化因子(STAT)之分子之自體磷酸化及/或轉磷酸化介導信號轉導。
超過二十種抑制一或多個JAK之信號傳導的抑制劑為此項技術中已知的。並非所有JAK抑制劑拮抗JAK之相同子集。例如(但不限於)，本發明之一些JAK信號抑制劑為JAK1/2信號抑制劑。例示性JAK抑制劑包括巴瑞替尼(抑制JAK1及JAK2)、托法替尼(抑制JAK3、JAK1，及以更低程度抑制JAK2)、魯索利替尼(抑制JAK1及JAK2)及非戈替尼(抑制JAK1)。額外JAK信號抑制劑(例如JAK1/2信號抑制劑)為此項技術中已知的。至少某些其他JAK信號抑制劑提供於Fragoulis(2019Rheumatology 58(增刊1): i43-i54)中，其關於JAK抑制劑以引用之方式併入本文中。
T 細胞活化之共刺激信號傳導抑制劑。 在各種實施例中，T細胞活化之共刺激信號傳導抑制劑為阿巴西普。阿巴西普為重組融合蛋白，其包括人類細胞毒性T淋巴細胞抗原4之胞外域及人類IgG1之Fc域的片段。阿巴西普至少部分藉由與CD28競爭結合至CD80/CD86，從而調節全T細胞活化所需的第二共刺激信號而起作用。阿巴西普至少部分藉由防止T細胞活化之CD80/CD86-CD28共刺激信號而起作用。病毒載體藥劑 .
病毒基因療法載體。 本發明之病毒基因療法載體包括含有病毒載體基因體之病毒粒子，該病毒載體基因體可包括外源性編碼核酸序列，視情況其中外源性編碼核酸序列存在於治療性有效負載中。向個體投與病毒基因療法載體可將病毒基因療法載體之病毒載體基因體遞送至個體，例如遞送至個體之一或多個細胞。在各種實施例中，病毒載體基因體或其治療性有效負載包括在個體之一或多個細胞中表現及/或併入個體之一或多個細胞之基因體中的外源性編碼核酸序列。在各種實施例中，外源性編碼核酸序列編碼蛋白質，諸如能夠在個體中達成所需治療效果(包括治療個體之疾病、病症或病況)之蛋白質。在各種實施例中，外源性編碼核酸序列編碼小干擾RNA，諸如能夠在個體中達成所需治療效果(包括治療個體之疾病、病症或病況)之小干擾RNA，視情況其中治療效果係藉由抑制蛋白質表現來介導。在各種實施例中，外源性編碼核酸序列編碼miRNA，諸如能夠在個體中達成所需治療效果(包括治療個體之疾病、病症或病況)之miRNA，視情況其中治療效果係藉由抑制蛋白質表現來介導。在各種實施例中，外源性編碼核酸序列編碼長非編碼RNA，諸如能夠在個體中達成所需治療效果(包括治療個體之疾病、病症或病況)之長非編碼RNA，視情況其中治療效果係藉由表現調節型染色質效應來介導。在各種實施例中，外源性編碼核酸序列編碼單導引RNA (sgRNA)，諸如能夠在個體中達成所需治療效果(包括治療個體之疾病、病症或病況)之sgRNA，視情況其中治療效果係至少部分藉由核酸內切酶活性(例如CRISPR/Cas9之活性)來介導。在各種實施例中，外源性編碼核酸序列編碼強化子RNA，諸如能夠在個體中達成所需治療效果(包括治療個體之疾病、病症或病況)之強化子RNA，視情況其中治療效果係藉由基因之增加表現來介導。
在各種實施例中，病毒載體基因體及/或治療性有效負載包括啟動子或其他調節區，且啟動子或其他調節區與外源性編碼核酸序列可操作地連接。在各種實施例中，外源性編碼核酸序列編碼CRISPR系統，諸如能夠在個體中達成所需治療效果(包括治療個體之疾病、病症或病況)之Cas蛋白質(例如II型或V型Cas蛋白質，包括Cas9、Cas12a或Cas 14蛋白質，或VI型Cas蛋白質，諸如Cas13)及導引RNA分子。在各種實施例中，病毒載體基因體及/或治療性有效負載包括一或多個啟動子或其他調節區，且啟動子或其他調節區與外源性編碼核酸序列可操作地連接。
在各種實施例中，外源性編碼核酸序列或包括其之治療性有效負載可編碼引起β-血球蛋白及/或γ-血球蛋白或其例如在造血幹細胞中之功能替代物之表現增加的藥劑。在各種實施例中，外源性編碼核酸序列或包括其之治療性有效負載可編碼引起第八因素或其在造血幹細胞中之功能替代物(例如ET3)之表現增加的藥劑。在各種實施例中，外源性編碼核酸序列或包括其之治療性有效負載可編碼藉由基因編輯，例如CRISPR系統，諸如能夠達成所需基因病變校正之Cas蛋白質(例如II型或V型Cas蛋白質，包括Cas9或Cas12a蛋白質)及導引RNA分子，引起造成鐮狀細胞貧血之基因病變之校正的藥劑。病毒基因療法載體之例示性應用進一步揭示於例如於2019年7月2日申請之美國臨時專利申請案第62/869,907號中，該申請案以全文引用之方式併入本文中，且尤其關於病毒基因療法載體及病毒基因療法之應用。
以下參考文獻提供功能性血球蛋白胺基酸序列、核酸序列及由所提供之核酸序列編碼之胺基酸序列的特定例示性序列。參考文獻1至4係關於α型血球蛋白序列，而參考文獻4至12係關於β型血球蛋白序列(包括β及γ血球蛋白序列)：(1) GenBank寄存編號Z84721 (1997年3月19日)；(2) GenBank寄存編號NM_000517 (2000年10月31日)；(3) Hardison等人,J . Mol . Biol . 222(2):233-249, 1991；(4) A Syllabus of Human Hemoglobin Variants (1996), 由Titus等人, 出版自Augusta, GA中之The Sickle Cell Anemia Foundation (可上網globin.cse.psu.edu取得)；(5) GenBank寄存編號J00179 (1993年8月26日)；(6) Tagle等人,Genomics 13(3):741-760, 1992；(7) Grovsfeld等人,Cell 51(6):975-985, 1987；(8) Li等人,Blood 93(7):2208-2216, 1999；(9) Gorman等人,J . Biol . Chem .275(46):35914-35919, 2000；(10) Slightom等人,Cell 21(3):627-638, 1980；(11) Fritsch等人,Cell 19(4): 959-972, 1980；(12) Marotta等人,J . Biol . Chem . 252(14):5040-5053, 1977。關於編碼血球蛋白之基因的額外編碼及非編碼區，參見例如Marotta等人,Prog . Nucleic Acid Res . Mol . Biol . 19, 165-175, 1976, Lawn等人,Cell 21 (3), 647-651, 1980,及Sadelain等人,PNAS . 92:6728-6732, 1995。血紅素次單元β之例示性胺基酸序列例如以NCBI寄存編號P68871提供。β-血球蛋白之例示性胺基酸序列例如以NCBI寄存編號NP_000509提供。本發明包括本文提供之血球蛋白蛋白質之變異體，包括與本文提供之血球蛋白蛋白質之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸一致性之變異體。
在各種實施例中，外源性編碼核酸序列或包括其之治療性有效負載可編碼蛋白質，其選自γC、JAK3、IL7RA、RAG1、RAG2、DCLRE1C、PRKDC、LIG4、NHEJ1、CD3D、CD3E、CD3Z、CD3G、PTPRC、ZAP70、LCK、AK2、ADA、PNP、WHN、CHD7、ORAI1、STIM1、CORO1A、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、RMRP、DKC1、TERT、TINF2、DCLRE1B及SLC46A1；FANC家族基因，其包括FancA、FancB、FancC、FancD1 (BRCA2)、FancD2、FancE、FancF、FancG、FancI、FancJ (BRIP1)、FancL、FancM、FancN (PALB2)、FancO (RAD51C)、FancP (SLX4)、FancQ (ERCC4)、FancR (RAD51)、FancS (BRCA1)、FancT (UBE2T)、FancU (XRCC2)、FancV (MAD2L2)及FancW (RFWD3)；可溶性CD40；CTLA；Fas L；針對CD4、CD5、CD7、CD52等之抗體；針對IL1、IL2、IL6之抗體；針對特異性呈現於自體反應性T細胞上之TCR的抗體；IL4；IL10；IL12；IL13；IL1Ra、sIL1RI、sIL1RII；sTNFRI；sTNFRII；針對TNF之抗體；P53、PTPN22及DRB1*1501/DQB1*0602；血球蛋白家族基因；WAS；phox；肌縮蛋白；丙酮酸激酶；CLN3；ABCD1；芳基硫酸酯酶A；SFTPB；SFTPC；NLX2.1；ABCA3；GATA1；核糖體蛋白基因；TERT；TERC；DKC1；TINF2；CFTR；LRRK2；PARK2；PARK7；PINK1；SNCA；PSEN1；PSEN2；APP；SOD1；TDP43；FUS；泛素2；及C9ORF72。
在各種實施例中，包括啟動子及/或其他調節區之治療性有效負載可操作地連接於外源性編碼核酸序列，且該病毒基因療法可將治療性有效負載遞送至患者，使得外源性編碼核酸序列在染色體外表現。在各種實施例中，包括啟動子及/或其他調節區之治療性有效負載可操作地連接於外源性編碼核酸序列，且該病毒基因療法可將治療性有效負載遞送至患者，使得治療性有效負載整合至目標細胞之基因體中。
此項技術中已知多種用於病毒基因療法(包括人類病毒基因療法)之載體。例示性載體包括腺病毒(Ad)、腺相關病毒(AAV)、單純疱疹病毒(例如HSV、HSV1)、反轉錄病毒(例如MLV、MMSV、MSCV)、慢病毒(例如HIV-1、HIV-2)、α病毒(例如SFV、SIN、VEE、M1)、黃病毒(例如昆津(Kunjin)病毒、西尼羅(West Nile)病毒、登革熱(Dengue)病毒)、棒狀病毒(rhabdovirus)(例如狂犬病(rabies)、VSV)、麻疹病毒(例如MV-Edm)、新城雞瘟(Newcastle disease)病毒(NDV)、痘病毒及微小RNA病毒(picornavirus)(例如柯沙奇病毒(coxsackievirus))。
腺病毒基因療法載體可具有此項技術中已知之各種血清型中之任一者。腺病毒基因療法載體之實例包括靶向CD46之腺病毒載體。腺病毒基因療法載體之實例包括Ad5及Ad35。腺病毒基因療法載體亦可為假型化腺病毒載體，諸如Ad5/35。腺病毒基因療法載體可為與CD46具有增強結合之載體，例如Ad35++ 或Ad5/35++ 腺病毒載體。腺病毒基因療法載體之實例進一步揭示於2019年7月2日申請之美國申請案第62/869,907號及2020年7月2日申請之國際申請案第PCT/US2020/040756號中，其關於腺病毒基因療法載體以引用之方式併入本文中。
AAV基因療法載體可具有此項技術中已知之各種血清型中之任一者。在一些情況下，AAV載體係選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8及AAV9。AAV基因療法載體亦可為假型化AAV載體，其中在某些情況下，載體為能夠感染人類細胞之假型化載體，例如選自AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8及AAV2/9之假型化載體。
在各種實施例中，病毒基因療法載體為輔助依賴性(HD)病毒基因療法載體。如此項技術中所熟知，一種基於天然病毒之基因體進行工程改造適用於基因療法之病毒載體的方式為產生複製缺陷型病毒。複製缺陷型病毒可感染個體，但其毒性受到其不能複製之限制，使得其尤其適用於個體。儘管當向個體投與病毒載體時病毒載體複製可為不合需要的，但產生治療上適用量之病毒載體可能需要複製。一種方案為使用僅能夠在不藉由HD病毒基因療法載體之基因體或病毒載體療法之接受體編碼之某些蛋白質存在下複製之HD病毒基因療法載體。實情為，複製HD病毒基因療法載體所需之額外蛋白質係藉由自輔助病毒、質體或其他輔助核酸之表現提供。負責引導包裝之病毒基因體之區可稱為包裝序列或信號(ψ)或衣殼化序列(E)。因為輔助基因體、質體或其他輔助核酸不包括包裝信號或包括條件性包裝信號，所以輔助不包裝於病毒粒子中。然而，將的確包括功能性包裝信號之HD病毒載體基因體包裝於HD病毒基因療法載體中。因此，使用輔助，可提供額外蛋白質以用於在第一背景下(例如，活體外，例如在細胞培養中)產生HD病毒基因療法載體，但當向個體投與HD病毒基因療法載體產物時並未提供。
輔助依賴型腺病毒(HDAd)載體為HD病毒基因療法載體之例示性。在一些HDAd載體系統中，一種病毒基因體(輔助)編碼複製所需之所有蛋白質但在包裝序列中具有條件性缺陷，使得其不大可能包裝成病毒粒子。第二病毒基因體僅包括病毒反向末端重複序列(ITR)、治療性有效負載及正常包裝序列，此允許此第二病毒基因體選擇性地包裝至HDAd病毒載體中且自生產細胞分離。HDAd病毒載體可藉由物理手段自輔助載體進一步純化。一般而言，HDAd病毒載體及HDAd病毒載體調配物中輔助載體及/或輔助基因體之一些污染可能發生且可容許。
在一些HDAd載體系統中，輔助基因體利用Cre/loxP系統。在某些此類HDAd載體系統中，HDAd病毒基因療法載體基因體包括500 bp之非編碼腺病毒DNA，其包括載體基因體複製所需之腺病毒ITR，及作為載體基因體衣殼化至衣殼中所需之包裝序列的ψ。亦已觀測到，當HDAd病毒基因療法載體基因體之總長度為約27.7 kb至約37 kb時，其可最有效地包裝，該長度可由例如治療性有效負載及或「填充片段」序列構成。HDAd病毒基因療法載體基因體可遞送至細胞，諸如表現Cre重組酶之293細胞，視情況其中該HDAd病毒基因療法載體基因體以非病毒載體形式，諸如細菌質體形式遞送至細胞(例如其中HDAd病毒基因療法載體基因體構築為細菌質體(pHDAd)且藉由限制酶消化釋放)。相同細胞可經輔助基因體轉導，該輔助基因體可包括帶有側接loxP位點之包裝序列的E1缺失之腺病毒載體，使得在表現Cre重組酶之293細胞感染之後，藉由loxP位點之間的Cre介導之位點特異性重組自輔助基因體切除包裝序列。因此，HDAd病毒基因療法載體基因體可轉染至293細胞中，該等細胞表現Cre且經帶有側接loxP位點之包裝信號(ψ)的輔助基因體或載體轉導或轉染，使得Cre介導之ψ切除致使輔助病毒基因體不可包裝，但仍能夠提供用於HDAd傳播必需之所有反式作用因子。在切除包裝序列之後，輔助基因體無法包裝，但仍能夠進行DNA複製且因此反式補充HDAd病毒基因療法載體基因體之複製及衣殼化。在一些實施例中，為防止因293細胞中存在之輔助與HDAd病毒基因療法載體基因體之間的同源重組而產生具有複製能力之Ad (RCA；E1+ )，可將「填充片段」序列插入至E3區中以使得任何E1+ 重組體太大而不能包裝。已使用FLP (例如FLPe)/frt位點特異性重組開發類似HDAd產生系統，其中側接輔助基因體之包裝信號的frt位點之間的FLP介導之重組針對表現FLP (例如FLPe)之293細胞中輔助基因體之衣殼化進行選擇。已開發出針對輔助載體選擇之替代性策略。
病毒基因療法可篩選標記。 在各種實施例中，病毒基因療法載體包括病毒基因療法載體基因體，其包括例如治療性有效負載中之可篩選標記。與病毒基因療法組合使用可篩選標記允許選擇已用病毒基因療法載體轉導及/或表現至少一種由基因療法載體之基因體編碼的可篩選標記及/或已將基因療法載體之基因體之治療性有效負載整合至宿主細胞之基因體中的宿主細胞，其中治療性有效負載包括編碼可篩選標記之核酸。
在各種實施例中，病毒基因療法載體基因體包括適用於個體之活體內選擇的可篩選標記。選擇可增加個體之宿主細胞群至例如目標細胞群之至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%。包括耐藥性基因如活體內可篩選標記可增加基因修飾之HSC在暴露於對移植物中未經修飾之細胞具有毒性的藥物之後的移植。此類活體內可篩選標記包括多重耐藥菌(MDR-1)、二氫葉酸還原酶(DHFR)及O6 -甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)之基因。為提供僅一個實例，使用包括MGMTP140K 可篩選標記之病毒基因療法載體的病毒載體基因療法顯示在投與O6 -苯甲基鳥嘌呤(O6 BG)及1,3-雙(2-氯乙基)-1-亞硝基-脲(BCNU) (O6 BG/BCNU)或曲莫唑胺(tremozolomide)之後經標記宿主細胞之增加。
在各種實施例中，可例如在向個體投與病毒基因療法載體之後，向個體投與諸如O6 BG之選擇劑與包括MGMTP140K 可篩選標記之病毒基因療法載體的組合。在各種實施例中，可在向個體投與病毒基因療法載體之後，例如在向個體投與第一次劑量之病毒基因療法載體之後或在向個體投與最後一次劑量之病毒基因療法載體之後約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15週中之任一或多者向個體投與選擇劑。
在各種實施例中，若目標細胞群體，諸如造血幹細胞之標記(轉導)小於10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%，則向個體投與選擇劑。在各種實施例中，若目標細胞群體，諸如造血幹細胞之標記大於10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%，則不向個體投與選擇劑，及/或中斷選擇劑之投與。在各種實施例中，經標記之造血幹細胞之數目百分比係基於骨髓抽吸物中經標記CD34+ 細胞之分率確定。
至少因為向個體投與病毒基因療法載體，包括向個體投與上文或本文別處闡述之任何類型的病毒基因療法載體可引起免疫毒性，熟習此項技術者應瞭解，本文所揭示之免疫抑制方案一般適用於活體內基因療法之方法，而不管向個體投與之病毒基因療法載體之類型如何。
支持載體。 病毒基因療法載體可為不需要轉座酶以整合於宿主細胞基因體中且在單一病毒載體基因體中包括所有對於在目標細胞中整合及/或表現外源性編碼核酸序列所需、必需及/或足夠的序列之載體(「自給自足病毒基因療法載體」)，或可為在單一病毒載體基因體中不包括所有對於在目標細胞中整合及/或表現外源性編碼核酸序列所需、必需及/或足夠的序列之載體(「經支持病毒基因療法載體」)。在各種情況下，將經支持病毒基因療法載體與編碼及/或表現藥劑的支持載體組合向個體投與，該藥劑促進目標細胞中經支持病毒基因療法載體之病毒載體基因體之外源性編碼核酸序列的整合及/或表現。
在一些實施例中，經支持病毒基因療法載體為具有病毒載體基因體之病毒基因療法載體，該病毒載體基因體不包括至少一種對於將病毒載體基因體之外源性編碼核酸序列整合至目標細胞基因體中必需的藥劑。為提供一個非限制性實例，在一些實施例中，經支持病毒基因療法載體之病毒載體基因體包括治療性有效負載，其中包括外源性編碼核酸編碼序列之核酸側接轉座酶反向重複序列，使得對應轉座酶之存在可介導治療性有效負載整合至宿主細胞基因體中。然而，在某些此類實施例中，經支持病毒基因療法載體之病毒載體基因體不編碼轉座酶，且轉置不另外或天然存在於宿主細胞中。在某些此類實施例中，與經支持病毒基因療法載體組合向個體投與之支持載體可包括編碼對應轉座酶之病毒載體基因體，該轉座酶可引起治療性有效負載整合至宿主細胞基因體中。
在某些特定實施例中，經支持病毒基因療法載體基因體包括治療性有效負載，其側接有睡美人(sleeping beauty) (SB)轉座酶反向重複序列，從而使得治療性有效負載成為轉位子，且支持載體編碼且表現引起治療性有效負載在宿主基因體中整合的SB轉座酶。在各種實施例中，治療性有效負載轉位子(包括SB轉座酶反向重複序列)側接重組位點，該等重組位點在暴露於重組酶時引起包括治療性有效負載轉位子之核酸的環化，該環化增加SB轉座酶可介導治療性有效負載整合至宿主細胞基因體中的效率。在各種實施例中，SB轉座酶為SB10、SB11、SB100或SB100x。
包括經支持病毒基因療法載體及支持載體之病毒載體基因療法可為適用的，例如在需要獨立滴定在單獨載體上編碼之藥劑的情況下，或在載體能力侷限性抑制在單一載體基因體中包括編碼所有所需藥劑之核酸序列的情況下。與僅使用單一載體物種之病毒載體基因療法相比，投與包括經支持病毒基因療法載體及支持載體之病毒載體基因療法可能需要較高劑量之支持-病毒基因療法載體，例如呈一段時間內(例如在單次投與、小時、天或治療方案中)之總劑量。如熟習此項技術者應瞭解，較高劑量(例如單位劑量或總劑量)之病毒載體在向個體投與時，與包括投與較低劑量(例如單位劑量或總劑量)之病毒載體(例如同一載體或多個相同載體)之參考相比，可引起誘發更快速、更嚴重及/或更持久的免疫毒性反應。因此，除了一般需要用於與病毒載體基因療法一起使用之免疫抑制方案之外，尤其需要用於包括經支持病毒基因療法載體及支持載體之病毒載體基因療法的免疫抑制方案。
支持載體可為任何類型之病毒載體，包括(但不限於)上述之彼等病毒載體，例如腺病毒(Ad)、腺相關病毒(AAV)、單純疱疹病毒(例如HSV、HSV1)、反轉錄病毒(例如MLV、MMSV、MSCV)、慢病毒(例如HIV-1、HIV-2)、α病毒(例如SFV、SIN、VEE、M1)、黃病毒(例如昆津病毒、西尼羅病毒、登革熱病毒)、棒狀病毒(例如狂犬病、VSV)、麻疹病毒(例如MV-Edm)、新城雞瘟病毒(NDV)、痘病毒或微小RNA病毒(例如柯沙奇病毒)。因此，支持載體可為例如此項技術中已知之多種血清型及假型中之任一者的AAV基因療法載體或腺病毒基因療法載體，包括(但不限於) Ad5、Ad35、Ad5/35、Ad35++或Ad5/35++載體。
在各種實施例中，病毒載體基因療法包括經支持病毒基因療法載體及支持載體，其中經支持病毒基因療法載體及支持載體具有相同病毒類型、類別、血清型或假型。在各種實施例中，病毒載體基因療法包括經支持病毒基因療法載體及支持載體，其中經支持病毒基因療法載體及支持載體具有兩種不同病毒類型、類別、血清型或假型。至少出於上文及本文別處所闡述之原因，熟習此項技術者應瞭解本文所揭示之免疫抑制方案適用於活體內基因療法之方法，其一般包括經支持病毒基因療法載體及支持載體，而不管經支持病毒基因療法載體及支持載體之病毒類型、類別、血清型或假型相同或不同。
活體內基因療法方案。 在本發明之各種實施例中，活體內基因療法包括向個體投與至少一種病毒基因療法載體以及至少一種免疫抑制方案。在包括超過一種載體物種，諸如作為經支持病毒基因療法載體的第一載體結合作為支持載體之第二載體的活體內基因療法中，第一載體及第二載體可以單一調配物或劑型或以兩種單獨調配物或劑型投與。在各種實施例中，第一及第二載體可同時或在不同時間投與，例如在同一一小時時段期間或在非重疊一小時時段期間投與。在各種實施例中，第一及第二載體可同時或在不同時間投與，例如在同一天或在不同日子投與。在各種實施例中，第一及第二載體可以相同劑量或不同劑量投與，例如其中劑量係以病毒粒子之總數目或以每公斤個體病毒粒子之數目形式量測。在各種實施例中，第一及第二載體可以預定義比率投與。在各種實施例中，該比率在2:1至1:2範圍內，例如1:1。
在各種實施例中，在一天內以單次總劑量向個體投與載體。在各種實施例中，載體以一起構成總劑量之兩個、三個、四個或更多個單位劑量投與。在各種實施例中，在連續一天、兩天、三天、四天或更多天中之每一天向個體每天投與一個單位劑量之載體。在各種實施例中，在連續一天、兩天、三天、四天或更多天中之每一天向個體每天投與兩個單位劑量之載體。因此，在各種實施例中，每日劑量可指個體在一天時程內接受之載體的劑量。在各種實施例中，術語日係指二十四小時時段，諸如自第一日曆日期之子夜至下一日曆日期之子夜的二十四小時時段。
在各種實施例中，諸如病毒基因療法載體或支持載體之載體的單位劑量、每日劑量或總劑量，或病毒基因療法載體及支持載體之總組合劑量可為至少1E8、5E8、1E9、5E9、1E10、5E10、1E11、5E11、1E12、5E12、1E13、5E13、1E14或1E15病毒粒子/公斤(vp/kg)。在各種實施例中，諸如病毒基因療法載體或支持載體之載體的單位劑量、每日劑量或總劑量，或病毒基因療法載體及支持載體之總組合劑量可在具有選自1E8、5E8、1E9、5E9、1E10、5E10、1E11、5E11、1E12、5E12、1E13、5E13、1E14或1E15 vp/kg之下限及選自1E8、5E8、1E9、5E9、1E10、5E10、1E11、5E11、1E12、5E12、1E13、5E13、1E14或1E15 vp/kg之上限的範圍內。
在各種實施例中，以至少1E10、5E10、1E11、5E11、1E12、5E12、1E13、5E13、1E14或1E15 vp/kg之單位劑量、每日劑量或總劑量投與病毒基因療法載體且以至少1E8、5E8、1E9、5E9、1E10、5E10、1E11及5E11 vp/kg之單位劑量、每日劑量或總劑量投與支持載體，視情況其中病毒基因療法載體之單位劑量、每日劑量或總劑量在具有選自1E10、5E10、1E11、5E11、1E12及5E12 vp/kg之下限及選自1E11、5E11、1E12、5E12、1E13、5E13、1E14及1E15 vp/kg之上限的範圍內，及/或其中支持載體之單位劑量、每日劑量或總劑量在具有選自1E8、5E8、1E9、5E9、1E10及5E10 vp/kg之下限及選自1E9、5E9、1E10、5E10、1E11及5E11 vp/kg之上限的範圍內。
在各種實施例中，以至少1E10、5E10、1E11、5E11、1E12、5E12、1E13、5E13、1E14或1E15 vp/kg之單位劑量、每日劑量或總劑量投與支持載體且以至少1E8、5E8、1E9、5E9、1E10、5E10、1E11及5E11 vp/kg之單位劑量、每日劑量或總劑量投與經支持病毒基因療法載體，視情況其中支持載體之單位劑量、每日劑量或總劑量在具有選自1E10、5E10、1E11、5E11、1E12及5E12 vp/kg之下限及選自1E11、5E11、1E12、5E12、1E13、5E13、1E14及1E15 vp/kg之上限的範圍內，及/或其中經支持病毒基因療法載體之單位劑量、每日劑量或總劑量在具有選自1E8、5E8、1E9、5E9、1E10及5E10 vp/kg之下限及選自1E9、5E9、1E10、5E10、1E11及5E11 vp/kg之上限的範圍內。在各種實施例中，經支持病毒基因療法載體及支持載體係以預定義比率投與。在各種實施例中，該比率在2:1至1:2範圍內，例如1:1。
在各種實施例中，免疫抑制方案係向亦接受至少一種病毒基因療法載體之個體投與，其中該免疫抑制方案包括在以下時間向該個體投與至少一種免疫抑制劑：(i)在向個體投與第一次劑量之病毒基因療法載體之前一或多天；(ii)在投與第一次劑量之病毒基因療法載體的同一天；(iii)在投與一或多個第二次或其他後續劑量之病毒基因療法載體的同一天；及/或(iv)在向個體投與第一次劑量之病毒基因療法載體及投與一或多個或所有第二次或其他後續劑量之病毒基因療法載體之間間插的一或多天或所有天中之任一者。
與病毒載體基因療法結合向個體投與之免疫抑制方案可包括含有作為發炎性信號抑制劑之任何藥劑的免疫抑制方案。與病毒載體基因療法結合向個體投與之免疫抑制方案可包括選自以下1、2、3、4、5或6種中之任一者的免疫抑制劑：(i)發炎性信號抑制劑，諸如介白素-1 (IL-1)信號抑制劑；(ii) IL-6信號抑制劑；(iii)皮質類固醇；(iv)鈣調神經磷酸酶抑制劑；(v) TNF-α信號抑制劑；及(vi) JAK信號抑制劑；其之任一者或全部(若存在)可根據不同免疫抑制劑方案投與。在某些實施例中，與病毒載體基因療法結合向個體投與之免疫抑制方案可包括選自以下1、2、3或4種中之任一者的免疫抑制劑：(i)介白素-1 (IL-1)信號抑制劑；(ii) IL-6信號抑制劑；(iii)皮質類固醇；及(iv)鈣調神經磷酸酶抑制劑；其之任一者或全部(若存在)可根據不同免疫抑制劑方案投與。
在包括不僅一種免疫抑制劑(諸如不同免疫抑制劑類別之第一免疫抑制劑及至少第二免疫抑制劑)之免疫抑制方案的活體內基因療法中，各免疫抑制劑可以單一調配物或劑型與一或多種其他免疫抑制劑或以複數個單獨調配物或劑型一起投與。在各種實施例中，各免疫抑制劑可與一或多種其他免疫抑制劑同時或在不同時間投與，例如在同一一小時時段期間或在非重疊一小時時段期間投與。在各種實施例中，各免疫抑制劑可與一或多種其他免疫抑制劑同時或在不同時間投與，例如在同一天或在不同日子投與。
在各種實施例中，在一天內以單次總劑量向個體投與免疫抑制劑。在各種實施例中，免疫抑制劑以一起構成總劑量之兩個、三個、四個或更多個單位劑量投與。在各種實施例中，在連續一天、兩天、三天、四天或更多天中之每一天向個體每天投與一個單位劑量之免疫抑制劑。在各種實施例中，在連續一天、兩天、三天、四天或更多天中之每一天向個體每天投與兩個單位劑量之免疫抑制劑。因此，在各種實施例中，每日劑量可指個體在一天時程內接受之免疫抑制劑的劑量。
在各種實施例中，免疫抑制方案包括介白素-1 (IL-1)信號抑制劑，諸如IL-1受體拮抗劑，例如阿那白滯素。在各種實施例中，介白素-1 (IL-1)信號抑制劑，諸如IL-1受體拮抗劑，例如阿那白滯素，係在以下時間向個體投與：(i)在投與第一次劑量之該載體的前一天；(ii)在投與第一次劑量之該載體的當天；(iii)在投與一或多次後續劑量之該載體的當天；(iv)在投與第一次劑量之該載體的當天與投與最後一次劑量之該載體的當天之間的每一天；及/或(v)在投與最後一次劑量之該載體的當天之後的一天、兩天或更多天中之每一天。在各種實施例中，介白素-1 (IL-1)信號抑制劑，諸如IL-1受體拮抗劑，例如阿那白滯素，係在以下時間向個體投與：(i)在投與第一次劑量之該載體的當天及(ii)在投與一或多次後續劑量之該載體的當天。在各種實施例中，IL-1信號抑制劑，例如阿那白滯素，係在此等天數中之每一天向個體投與兩次，例如在上午投與一次且在下午投與一次。
在各種實施例中，阿那白滯素或另一IL-1信號抑制劑係在一或多次劑量之載體之前1至10小時投與(例如在投與載體之前約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小時，例如一或多次劑量之載體之前約1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、0至1、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4或0至3小時。在某些特定實施例中，一定劑量之阿那白滯素或另一IL-1信號抑制劑係在投與第一次劑量之載體之前1至3小時投與。在某些特定實施例中，一定劑量之阿那白滯素或另一IL-1信號抑制劑係在投與一或多次後續劑量之載體之前1至3小時投與。
在各種實施例中，阿那白滯素或另一IL-1信號抑制劑係在投與一或多次劑量之載體之前約1小時內(例如在投與一或多次劑量之載體之前約60、45、30、25、20、15、10、5、4、3、2或1分鐘內)投與。在各種實施例中，阿那白滯素或另一IL-1信號抑制劑經靜脈內投與。在各種實施例中，阿那白滯素或另一IL-1信號抑制劑經皮下投與。在各種實施例中，阿那白滯素或另一IL-1信號抑制劑係在投與第一次劑量之載體之前約1至10(例如約1至3)小時經皮下投與。在各種實施例中，阿那白滯素或另一IL-1信號抑制劑係在投與一或多次劑量之載體之前約1小時內(例如在投與一或多次劑量之載體之前約60、45、30、25、20、15、10、5、4、3、2或1分鐘內)經靜脈內投與。
在各種實施例中，IL-1信號抑制劑為阿那白滯素或另一IL-1R拮抗劑，且阿那白滯素或另一IL-1R拮抗劑之每日劑量為或至少為0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20 mg/kg/天。在某些實施例中，阿那白滯素或另一IL-1R拮抗劑之劑量為0.01至20、0.01至10或0.01至5 mg/kg/天。在某些實施例中，阿那白滯素或另一IL-1R拮抗劑之劑量為1至2、1至4、1至6、1至8或1至10 mg/kg/天。在各種實施例中，IL-1信號抑制劑為阿那白滯素或另一IL-1R拮抗劑，且阿那白滯素或另一IL-1R拮抗劑之每日劑量為1至8 mg/kg/天。在某些實施例中，阿那白滯素或另一IL-1R拮抗劑之劑量為或至少為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175或200 mg/天。在某些實施例中，阿那白滯素或另一IL-1R拮抗劑之劑量為10至200、20至200、30至175、40至175、50至150、60至150、80至125、90至125或100 mg/天。在各種實施例中，阿那白滯素或另一IL-1R拮抗劑之每日劑量具有下限為10、20、30、40、50、60、70、80、90或100 mg/天且上限為100、125、150、175或200 mg/天的範圍。在各種實施例中，阿那白滯素或另一IL-1R拮抗劑之每日劑量為100 mg/天。在各種實施例中，以兩次分開的投與向個體投與每日劑量，各次以每日劑量之一半，例如在上午投與一次且在下午投與一次。
除阿那白滯素以外之其他IL-1信號抑制劑包括例如ADC-1001 (Alligator Bioscience)、FX-201 (Flexion Therapeutics)、GQ-303 (Genequine Biotherapeutics GmbH)、HL-2351 (Handok, Inc.)、MBIL-1RA (ProteoThera, Inc.)及人類免疫球蛋白G或球蛋白S (GC Pharma)。
在各種實施例中，免疫抑制方案包括IL-6信號抑制劑，例如托珠單抗。在各種實施例中，IL-6信號抑制劑，例如托珠單抗，係在以下時間向個體投與：(i)在投與第一次劑量之該載體的前一天；(ii)在投與第一次劑量之該載體的當天；(iii)在投與一或多次後續劑量之該載體的當天；(iv)在投與第一次劑量之該載體的當天與投與最後一次劑量之該載體的當天之間的每一天；及/或(v)在投與最後一次劑量之該載體的當天之後的一天、兩天或更多天中之每一天。在各種實施例中，IL-6信號抑制劑，例如托珠單抗，係在以下時間向個體投與：(i)在投與第一次劑量之該載體的當天及(ii)在投與一或多次後續劑量之該載體的當天。在各種實施例中，IL-6信號抑制劑，例如托珠單抗，係在此等天數中之每一天向個體投與兩次，例如在上午投與一次且在下午投與一次。在各種實施例中，托珠單抗或另一IL-6信號抑制劑係在投與一或多次劑量之載體之前約1小時內(例如在投與一或多次劑量之載體之前約60、45、30、25、20、15、10、5、4、3、2或1分鐘內)投與。
在各種實施例中，IL-6信號抑制劑為托珠單抗且托珠單抗之每日劑量為或至少為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200 mg/kg/天。在各種實施例中，托珠單抗之每日劑量具有下限為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 mg/天且上限為15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200 mg/天的範圍。在各種實施例中，IL-6信號抑制劑為托珠單抗且托珠單抗之每日劑量為或至少為0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50 mg/kg/天。在各種實施例中，托珠單抗之每日劑量具有下限為0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 mg/kg/天且上限為15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50 mg/kg/天的範圍。在各種實施例中，托珠單抗之每日劑量具有1-15、1-12、1-10、1-5、5-10、5-12或5-15 mg/kg/天之範圍。在各種實施例中，托珠單抗之劑量為162 mg，例如每日劑量或每週劑量。在各種實施例中，以兩次分開的投與向個體投與每日劑量，各次以每日劑量之一半，例如在上午投與一次且在下午投與一次。
除托珠單抗以外之其他IL-6信號抑制劑包括BCD-089 (Biocad)、HS-628 (Zhejiang Hisun Pharm)及APX-007 (Apexigen)。
在各種實施例中，免疫抑制方案包括皮質類固醇，例如地塞米松。在各種實施例中，皮質類固醇，例如地塞米松，係在以下時間向個體投與：(i)在投與第一次劑量之該載體的前一天；(ii)在投與第一次劑量之該載體的當天；(iii)在投與一或多次後續劑量之該載體的當天；(iv)在投與第一次劑量之該載體的當天與投與最後一次劑量之該載體的當天之間的每一天；及/或(v)在投與最後一次劑量之該載體的當天之後的一天、兩天或更多天中之每一天。在各種實施例中，皮質類固醇，例如地塞米松，係在以下時間向個體投與：(i)在投與第一次劑量之該載體的前一天；(ii)在投與第一次劑量之該載體的當天；及(iii)在投與一或多次後續劑量之該載體的當天。在各種實施例中，皮質類固醇，例如地塞米松，係在此等天數中之第一天(例如在下午)向個體投與一次且在其他天數中之每一天向個體投與兩次，例如在上午投與一次且在下午投與一次。
在各種實施例中，皮質類固醇為地塞米松且地塞米松之每日劑量為或至少為0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、7.5、10.0、12.5或15 mg/kg/天。在各種實施例中，地塞米松之每日劑量具有下限為0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0 mg/kg/天及上限為5.0、7.5、10.0、12.5或15 mg/kg/天之範圍。在各種實施例中，以兩次分開的投與向個體投與每日劑量，各次以每日劑量之一半，例如在上午投與一次且在下午投與一次。
在各種實施例中，免疫抑制方案包括鈣調神經磷酸酶抑制劑，例如他克莫司。在各種實施例中，鈣調神經磷酸酶抑制劑，例如他克莫司，係在以下時間向個體投與：(i)在投與第一次劑量之該載體的前一天；(ii)在投與第一次劑量之該載體的當天；(iii)在投與一或多次後續劑量之該載體的當天；(iv)在投與第一次劑量之該載體的當天與投與最後一次劑量之該載體的當天之間的每一天；及/或(v)在投與最後一次劑量之該載體的當天之後的一天、兩天或更多天中之每一天。在各種實施例中，鈣調神經磷酸酶抑制劑，例如他克莫司，係在以下時間向個體投與：在投與第一次劑量之該載體之前四天；(ii)在投與第一次劑量之該載體的當天；(iii)在投與一或多次後續劑量之該載體的當天；(iv)在投與最後一次劑量之該載體之後的兩天中之每一天；及視情況，(v)在一個、兩個或更多個額外天數中之每一天。在各種實施例中，鈣調神經磷酸酶抑制劑，例如他克莫司，係在此等天數中之每一天向個體投與兩次，例如在上午投與一次且在下午投與一次。
在各種實施例中，鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司且他克莫司之每日劑量為或至少為0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4或0.5 mg/kg/天。在各種實施例中，他克莫司之每日劑量具有下限為0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04或0.05 mg/kg/天及上限為0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4或0.5 mg/kg/天之範圍。在各種實施例中，以兩次分開的投與向個體投與每日劑量，各次以每日劑量之一半，例如在上午投與一次且在下午投與一次。
在各種實施例中，如本文所揭示，免疫抑制方案包括以下中之每一者：(i)介白素-1 (IL-1)信號抑制劑，諸如IL-1受體拮抗劑；(ii) IL-6信號抑制劑；(iii)皮質類固醇；及(iv)鈣調神經磷酸酶抑制劑。在各種實施例中，如本文所揭示，免疫抑制方案包括以下中之每一者：(i)阿那白滯素；(ii)托珠單抗；(iii)地塞米松；及(iv)他克莫司。
在各種實施例中，投與免疫抑制方案或其免疫抑制劑係基於免疫毒性生物標記之所量測含量，其中，若標記含量指示免疫毒性及/或相對於參考(諸如來自同一個體之先前樣本中生物標記之所量測含量)之增加之免疫毒性，則使免疫抑制劑或免疫抑制方案中之一或多種免疫抑制劑之劑量在量及/或投與頻率方面增加(例如在單位劑量、每日劑量、總劑量、劑量頻率、及/或劑量總數方面增加)；若標記含量指示免疫毒性不存在及/或相對於參考(諸如來自同一個體之先前樣本中生物標記之所量測含量)之降低之免疫毒性，則使免疫抑制劑或免疫抑制方案中之一或多種免疫抑制劑之劑量在量及/或投與頻率方面降低。免疫毒性之生物標記可包括以下中之任一或多者：IL-Iβ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-23、IL-27、IL-30、IL-36 IL-1Ra、IL-2R、IFN-a、IFN-b、IFN-γ、MIP-Ia、MIP-Iβ、MCP-1、TNF-α、TNF-β、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、VEGF、RANTES、EGF、HGF、FGF-β、CD40、CD40L、C反應蛋白、降鈣素原、鐵蛋白、D-二聚體、淋巴球總群、淋巴球亞群、個體溫度及其組合。可在投與一或多次劑量之病毒基因療法載體及/或免疫抑制劑之前、期間或之後量測生物標記。
在某些實施例中，在投與至少一次劑量之病毒基因療法載體之後，基於該個體或來自該個體之樣本中免疫毒性生物標記之所量測含量，免疫抑制方案中之一或多種免疫抑制劑之給藥方案在單位劑量、每日劑量、總劑量、劑量頻率及/或劑量總數方面增加，其中若該所量測含量指示顯著、較高或增加之免疫毒性(例如與參考相比)，則使一或多種免疫抑制劑之給藥方案增加；及/或若該所量測含量指示較低、沒有或降低之免疫毒性(例如與參考相比)，則使該給藥方案減少。在一些實施例中，該免疫毒性生物標記係選自：IL-Iβ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-23、IL-27、IL-30、IL-36 IL-1Ra、IL-2R、IFN-a、IFN-b、IFN-γ、MIP-Ia、MIP-Iβ、MCP-1、TNF-α、TNF-β GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、VEGF、RANTES、EGF、HGF、FGF-β、CD40、CD40L、C反應蛋白、降鈣素原、鐵蛋白、D-二聚體、淋巴球總群、淋巴球亞群、個體溫度及其組合。
在某些實施例中，在投與至少一次劑量之病毒基因療法載體之後，基於該個體或來自該個體之樣本中相對於病毒基因療法載體之抗體的所量測含量，免疫抑制方案中之一或多種免疫抑制劑之給藥方案在單位劑量、每日劑量、總劑量、劑量頻率及/或劑量總數方面增加，其中若該所量測含量指示顯著、較高或增加之免疫毒性(例如與參考相比)，則使一或多種免疫抑制劑之給藥方案增加；及/或若該所量測含量指示較低、沒有或降低之免疫毒性(例如與參考相比)，則使該給藥方案減少，視情況其中該所量測含量為抗體力價，且視情況其中該等抗體為中和抗體。量測抗體含量(例如抗體力價)之手段為此項技術中已知的，包括(但不限於)酶聯免疫分析(ELISA)。
在各種實施例中，本發明之活體內基因療法方案進一步包括幹細胞動員方案，其中幹細胞動員方案包括向個體投與一或多種使得治療學上不可進入之幹細胞變得治療學上可進入之藥劑。舉例而言，向個體投與幹細胞動員療法可增加造血幹細胞之循環及/或動員在骨髓中螯合之造血幹細胞以使該等幹細胞離開骨髓進入隔室中，在該等隔室中可進入該等幹細胞以藉由病毒基因療法載體進行活體內轉導。造血幹細胞可為例如結合造血幹細胞之病毒基因療法載體(諸如結合CD46之腺病毒基因療法載體)的目標細胞。例示性幹細胞動員藥劑包括(但不限於)幹細胞因子(SCF)、小分子VLA-4抑制劑BIO5192、BOP(N-(苯磺醯基)-L-脯胺醯基-L-O-(1-吡咯啶基羰基)酪胺酸)、肝素、粒細胞群落刺激因子(G-CSF)及普樂沙福/AMD3100。
在各種實施例中，幹細胞動員方案包括投與G-CSF及普樂沙福/AMD3100。在各種實施例中，G-CSF係在以下時間向個體投與：(i)在投與第一次劑量之該載體的前四天中之每天；(ii)在投與第一次劑量之該載體的當天；及(iii)在投與一或多次後續劑量之該載體的當天。在各種實施例中，普樂沙福/AMD3100係在以下時間向個體投與：(i)在投與第一次劑量之該載體的前一天及(ii)在投與第一次劑量之該載體的當天。在各種實施例中，以呈或以至少呈10、20、30、40、50、75、100、150或200 ug/kg之劑量每天一次投與G-CSF。在各種實施例中，G-CSF之每日劑量具有下限為10、20、30、40、50或75 ug/kg/天及上限為100、150或200 ug/kg/天之範圍。在各種實施例中，以呈或以至少呈1、2、3、4、5、7.5、10、15或20 mg/kg之劑量每天一次投與普樂沙福/AMD3100。在各種實施例中，G-CSF之每日劑量具有下限為1、2、3、4、5或7.5 mg/kg//天及上限為10、15或20 mg/kg/天之範圍。
各種實施例 。在本發明之各種實施例中，活體內基因療法包括向個體投與至少一種病毒基因療法載體，例如本發明之腺病毒基因療法載體(諸如例如結合CD46之與如本文所描述包括此等之輔助依賴型(諸如Ad5、Ad35、Ad5/35、Ad35++及Ad5/35++)之腺病毒支持載體結合的經支持腺病毒基因療法載體，例如其中該等兩個載體以1:1比率一起投與連續兩天，諸如在此等天數中之每一天之上午投與)，結合以下： (a)免疫抑制方案，其包括(i)發炎性信號抑制劑，諸如介白素-1 (IL-1)信號抑制劑，例如阿那白滯素(諸如在投與第一次劑量之載體的當天及在投與一或多次後續劑量之載體的當天，例如在此等天數中之每一天投與兩次，例如在上午投與一次且在下午投與一次，其中所投與之每日劑量如本文中所描述)；(ii) IL-6信號抑制劑，例如托珠單抗(諸如在投與第一次劑量之載體的當天及在投與一或多次後續劑量之載體的當天，例如在此等天數中之每一天投與兩次，例如在上午投與一次且在下午投與一次，其中所投與之每日劑量如本文中所描述)；(iii)皮質類固醇，例如地塞米松(諸如在投與第一次劑量之載體的前一天；在投與第一次劑量之載體的當天；及在投與一或多次後續劑量之載體的當天，例如在此等天數中之第一天投與一次，例如在上午投與一次，且在其他天數中之每一天投與兩次，例如在上午投與一次且在下午投與一次，其中所投與之每日劑量如本文中所描述)；及(iv)鈣調神經磷酸酶抑制劑，例如他克莫司(諸如在投與第一次劑量之載體的前四天；在投與第一次劑量之載體的當天；在投與一或多次後續劑量之載體的當天；在投與最後一次劑量之載體之後的兩天中之每一天；及視情況，在一個、兩個或更多個額外天數中之每一天，例如其中將該藥劑在此等天數中之每一天向個體投與兩次，例如在上午投與一次且在下午投與一次，其中所投與之每日劑量如本文中所描述)； (b)幹細胞動員方案，諸如以下之方案：增加造血幹細胞之循環及/或動員骨髓中螯合之造血幹細胞以使該等幹細胞離開骨髓進入隔室中，在該等隔室中可進入該等幹細胞以藉由載體進行活體內轉導，例如包括G-CSF及普樂沙福/AMD3100之幹細胞動員方案，諸如以下之方案，其中(i) G-CSF係在以下時間每天向個體投與：在投與第一次劑量之載體之前四天；在投與第一次劑量之載體的當天；及在投與一或多次後續劑量之載體的當天，例如其中G-CSF係在此等天數中之每一天投與一次(諸如在上午投與一次)，其中所投與之每日劑量如本文中所描述；及(ii)普樂沙福/AMD3100係在以下時間向個體投與：在投與第一次劑量之載體之前一天及在投與第一次劑量之載體的當天，例如其中普樂沙福/AMD3100係在此等天數中之每一天投與一次(諸如在上午投與一次)(或在第一次劑量及第二次劑量之載體之前9至11小時)，其中所投與之每日劑量如本文中所描述；及 (c)選擇方案，諸如選擇已藉由載體進行活體內轉導之造血幹細胞的方案，例如包括O6 -苯甲基鳥嘌呤(O6 BG)及1,3-雙(2-氯乙基)-1-亞硝基-脲(BCNU) (O6 BG/BCNU)之選擇方案，諸如以下之方案，其中O6 BG/BCNU係在投與第一次劑量之載體的當天之後的第4週、第6週(視情況)及第8週(視情況)投與(及視情況，若需要進一步選擇經轉導細胞，則在其後之額外2週間期投與)。
調配及投與 。載體可經調配以使得其為醫藥學上可接受的以便向細胞或動物，例如向人類投與。載體可活體內投與。在各種情況下，載體可經調配以包括醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。醫藥學上可接受之載劑之實例包括(但不限於)生理上相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑，以及其類似物。本發明之組合物可包括醫藥學上可接受之鹽，例如酸加成鹽或鹼加成鹽。
在各種實施例中，包括如本文所描述之載體(例如，注射用無菌調配物)的組合物可根據習知醫藥實踐使用注射用蒸餾水作為媒劑來調配。舉例而言，生理食鹽水或含有葡萄糖之等張溶液及其他補充劑(諸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇及氯化鈉)可用作注射用水溶液，視情況與適合的增溶劑(例如醇，諸如乙醇及多元醇，諸如丙二醇或聚乙二醇)及非離子界面活性劑(諸如聚山梨醇酯80™、HCO-50及其類似物)組合。
如本文所揭示，組合物可呈此項技術中已知之任何形式。此類形式包括例如液體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液(例如，可注射溶液及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、散劑、脂質體及栓劑。
任何特定形式之選擇或用途可部分地視預期投與模式及治療應用而定。舉例而言，含有意欲全身性或局部遞送之組合的組合物可呈可注射或可輸注溶液形式。因此，載體可經調配以藉由非經腸模式(例如靜脈內、皮下、腹膜內或肌內注射)投與。如本文所用，非經腸投與係指通常藉由注射之除腸及局部投與之外的投與模式，且包括(不限於)靜脈內、鼻內、眼內、經肺、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、肺內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛膜下、脊柱內、硬膜外、大腦內、顱內、頸動脈內及胸骨內注射及輸注。非經腸投與途徑可為例如藉由注射、經鼻投與、經肺投與或經皮投與來投與。投與可藉由靜脈內注射、肌內注射、腹膜內注射、皮下注射而為全身性或局部的。
在各種實施例中，本發明之載體可調配為溶液、微乳液、分散液、脂質體或適合於以高濃度穩定儲存之其他有序結構。無菌可注射溶液可藉由視需要將所需量之本文所描述之組合物與上文所列之一種成分或成分組合併入適當溶劑中，隨後進行過濾滅菌來製備。一般而言，分散液藉由將本文所描述之組合物併入含有鹼性分散介質及來自上文所列成分的所需其他成分的無菌媒劑中來製備。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液之情況下，製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥，其自其經預先無菌過濾之溶液產生本文所描述之組合物加任何額外所需成分(參見下文)之粉末。溶液之適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收之試劑(例如,單硬脂酸酯鹽及明膠)來達成。
載體可呈可注射調配物形式非經腸投與，該可注射調配物包括於水或另一醫藥學上可接受之液體中之無菌溶液或懸浮液。舉例而言，載體可藉由適當地組合治療性分子與醫藥學上可接受之媒劑或介質來調配，該等媒劑或介質諸如無菌水及生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、穩定劑、調味賦形劑、稀釋劑、媒劑、防腐劑、黏合劑，接著以一般接受之醫藥實踐所需的單位劑型混合。醫藥製劑中所包括之載體之量使得提供指定範圍內之適合劑量。油性液體之非限制性實例包括芝麻油及大豆油，且其可與苯甲酸苯甲酯或苯甲醇組合作為增溶劑。可包括之其他物品為緩衝劑，諸如磷酸鹽緩衝液或乙酸鈉緩衝液；舒緩劑，諸如普魯卡因鹽酸鹽(procaine hydrochloride)；穩定劑，諸如苯甲醇或苯酚；及抗氧化劑。經調配之注射液可封裝於適合之安瓿中。
在各種實施例中，皮下投與可藉助於諸如以下之裝置實現：注射器、預填充注射器、自動注射器(例如拋棄式或可再用)、筆式注射器、貼片注射器、可穿戴式注射器、具有皮下輸液組之可活動式注射器輸液泵或用於皮下注射之其他裝置。
在一些實施例中，本文所描述之載體可在治療時藉助於局部投與而遞送至個體。如本文所用，「局部投與」或「局部遞送」可指遞送不依賴於經由血管系統輸送該或該等載體至其預定目標組織或位點。舉例而言，載體可藉由注射或植入組合物或藥劑或藉由注射或植入含有組合物或藥劑之裝置來遞送。在某些實施例中，在目標組織或位點附近局部投與後，組合物或藥劑或其一或多種組分可擴散至並非投與部位之預定目標組織或位點。
在一些實施例中，本文所提供之組合物以單位劑型存在，該單位劑型可適合於自我投與。此類單位劑型可提供於容器內，通常例如小瓶、藥筒、預填充注射器或拋棄式筆。諸如美國專利第6,302,855號中所描述之劑量儀裝置之劑量儀亦可(例如)與如本文中所描述之注射系統一起使用。
適合於注射之載體調配物之醫藥形式可包括無菌水溶液或分散液。調配物可為無菌的且必須為流體以允許適當流入及流出注射器。調配物在製造及儲存條件下亦可為穩定的。載劑可為含有例如水及生理食鹽水或緩衝水溶液之溶劑或分散介質。較佳地，等張劑，例如糖或氯化鈉可用於調配物中。
此外，熟習此項技術者亦可考慮額外遞送方法，可經由電穿孔、超音波電滲法、骨內注射方法或藉由使用基因槍。載體亦可植入微晶片、奈米晶片或奈米粒子中。
本文所描述之載體之適合劑量可視多種因素而定，包括例如待治療之個體之年齡、性別及體重、待治療之病況或疾病及所用特定載體。影響向個體投與之劑量的其他因素包括例如病況或疾病之類型或嚴重程度。其他因素可包括例如同時或先前影響個體之其他醫學病症、個體之一般健康狀況、個體之遺傳傾向、飲食、投與時間、排泄速率、藥物組合及向個體投與之任何其他額外治療劑。可基於待治療之病況或疾病及個體年齡及病況選擇投與載體之適合方式。投與之劑量及方法可視患者之體重、年齡、病況及其類似因素而變化，且可根據熟習此項技術者之需要而適當地選擇。任何特定個體之特定劑量及治療方案可基於開業醫師之判斷而調整。
載體溶液可包括治療有效量之本文所描述之組合物。此類有效量可容易由一般熟習此項技術者部分地基於所投與組合物之效應或組合物與一或多種額外活性劑之組合效應(若使用超過一種藥劑)來確定。治療有效量可為治療有益效應超過組合物之任何毒性或有害效應的量。
本發明之免疫抑制劑可以本文所提供或此項技術中另外已知之各種形式中之任一者單獨地或一起調配。在各種實施例中，本文所描述之免疫抑制劑可以醫藥組合物形式調配。醫藥組合物可藉由熟習此項技術者已知之方法調配(諸如描述於Remington's Pharmaceutical Sciences, 第17版, 編Alfonso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)中)。
在各種情況下，免疫抑制劑醫藥組合物可經調配以包括醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。醫藥學上可接受之載劑之實例包括(但不限於)生理上相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑，以及其類似物。本發明之組合物可包括醫藥學上可接受之鹽，例如酸加成鹽或鹼加成鹽。
在各種實施例中，包括如本文所描述之免疫抑制劑(例如，注射用無菌調配物)的醫藥組合物可根據習知醫藥實踐使用注射用蒸餾水作為媒劑來調配。舉例而言，生理食鹽水或含有葡萄糖之等張溶液及其他補充劑(諸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇及氯化鈉)可用作注射用水溶液，視情況與適合的增溶劑(例如醇，諸如乙醇及多元醇，諸如丙二醇或聚乙二醇)及非離子界面活性劑(諸如聚山梨醇酯80™、HCO-50及其類似物)組合。
如本文所揭示，免疫抑制劑醫藥組合物可呈此項技術中已知之任何形式。此類形式包括例如液體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液(例如，可注射溶液及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、散劑、脂質體及栓劑。任何特定形式之選擇或用途可部分地視預期投與模式及治療應用而定。舉例而言，含有意欲全身性或局部遞送之組合的組合物可呈可注射或可輸注溶液形式。因此，該等組合物可經調配以藉由非經腸模式(例如靜脈內、皮下、腹膜內或肌內注射)投與。如本文所用，非經腸投與係指通常藉由注射之除腸及局部投與之外的投與模式，且包括(不限於)靜脈內、鼻內、眼內、經肺、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、肺內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛膜下、脊柱內、硬膜外、大腦內、顱內、頸動脈內及胸骨內注射及輸注。投與途徑可為非經腸，例如藉由注射、經鼻投與、經肺投與或經皮投與來投與。投與可藉由靜脈內注射、肌內注射、腹膜內注射、皮下注射而為全身性或局部的。
在各種實施例中，本發明之免疫抑制劑醫藥組合物可調配為溶液、微乳液、分散液、脂質體或適於在高濃度下穩定儲存之其他有序結構。無菌可注射溶液可藉由視需要將所需量之本文所描述之組合物與上文所列之一種成分或成分組合併入適當溶劑中，隨後進行過濾滅菌來製備。一般而言，分散液藉由將本文所描述之組合物併入含有鹼性分散介質及來自上文所列成分的所需其他成分的無菌媒劑中來製備。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液之情況下，製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥，其自其經預先無菌過濾之溶液產生本文所描述之組合物加任何額外所需成分(參見下文)之粉末。溶液之適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收之試劑(例如,單硬脂酸酯鹽及明膠)來達成。
醫藥組合物可呈可注射調配物形式非經腸投與，該可注射調配物包括於水或另一醫藥學上可接受之液體中之無菌溶液或懸浮液。舉例而言，醫藥組合物可藉由適當地組合免疫抑制劑與醫藥學上可接受之媒劑或介質來調配，該等媒劑或介質諸如無菌水及生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、穩定劑、調味賦形劑、稀釋劑、媒劑、防腐劑、黏合劑，接著以一般接受之醫藥實踐所需的單位劑型混合。醫藥製劑中所包括之免疫抑制劑之量使得提供指定範圍內之適合劑量。油性液體之非限制性實例包括芝麻油及大豆油，且其可與苯甲酸苯甲酯或苯甲醇組合作為增溶劑。可包括之其他物品為緩衝劑，諸如磷酸鹽緩衝液或乙酸鈉緩衝液；舒緩劑，諸如普魯卡因鹽酸鹽；穩定劑，諸如苯甲醇或苯酚；及抗氧化劑。經調配之注射液可封裝於適合之安瓿中。
包括一或多種如本文所描述之免疫抑制劑之組合物可以免疫脂質體組合物形式調配。此類調配物可藉由此項技術中已知之方法製備。循環時間延長的脂質體揭示於例如美國專利第5,013,556號中。
在某些實施例中，組合物可用將保護免疫抑制劑免於快速釋放之載劑調配，諸如控制釋放型調配物，包括植入物及微膠囊化遞送系統。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此類調配物之許多方法在此項技術中已知。參見例如J. R. Robinson (1978)「Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,」Marcel Dekker, Inc., New York。
在各種實施例中，皮下投與可藉助於諸如以下之裝置實現：注射器、預填充注射器、自動注射器(例如拋棄式或可再用)、筆式注射器、貼片注射器、可穿戴式注射器、具有皮下輸液組之可活動式注射器輸液泵或與用於皮下注射之免疫抑制劑組合之其他裝置。
在一些實施例中，本文所描述之組合物可在治療時藉助於局部投與而遞送至個體。如本文所用，「局部投與」或「局部遞送」可指遞送不依賴於經由血管系統輸送組合物或藥劑至其預定目標組織或位點。舉例而言，組合物可藉由注射或植入組合物或藥劑或藉由注入或植入含有組合物或藥劑之裝置來遞送。在某些實施例中，在目標組織或位點附近局部投與後，組合物或藥劑或其一或多種組分可擴散至並非投與部位之預定目標組織或位點。
在一些實施例中，本文所提供之組合物以單位劑型存在，該單位劑型可適合於自我投與。此類單位劑型可提供於容器內，通常例如小瓶、藥筒、預填充注射器或拋棄式筆。諸如美國專利第6,302,855號中所描述之劑量儀裝置之劑量儀亦可(例如)與如本文中所描述之注射系統一起使用。
醫藥溶液可包括治療有效量之本文所描述之組合物。此類有效量可容易由一般熟習此項技術者部分地基於所投與組合物之效應或組合物與一或多種額外活性劑之組合效應(若使用超過一種藥劑)來確定。本文所描述之組合物之治療有效量亦可根據諸如以下因素而變化：個體之疾病狀態、年齡、性別及體重，以及組合物(及一或多種其他活性劑)誘發個體中之所需反應的能力，例如至少一種病況參數之改善，例如補體介導性病症之至少一種症狀改善。舉例而言，治療有效量之本文所描述之組合物可抑制(減輕嚴重程度或消除發生)及/或預防特定病症，及/或此項技術中已知或本文所描述之特定病症之任一種症狀。治療有效量亦為治療有益效應超過組合物之任何毒性或有害效應的量。
本文所描述之免疫抑制劑組合物的適合劑量可視多種因素而定，該等多種因素包括例如待治療之個體的年齡、性別及體重以及使用的特定抑制劑化合物，該劑量能夠治療或預防個體之病症。影響向個體投與之劑量的其他因素包括例如病症之類型或嚴重程度。其他因素可包括例如同時或先前影響個體之其他醫學病症、個體之一般健康狀況、個體之遺傳傾向、飲食、投與時間、排泄速率、藥物組合及向個體投與之任何其他額外治療劑。亦應理解，針對任何特定個體之具體劑量及治療方案亦可基於治療開業醫師之判斷而調節。
在各種實施例中，免疫抑制方案包括如本文所揭示之以下中之任一者或全部：(i)介白素-1 (IL-1)信號抑制劑，諸如IL-1受體拮抗劑；(ii) IL-6信號抑制劑；(iii)皮質類固醇；及(iv)鈣調神經磷酸酶抑制劑，其中各自可獨立地調配用於投與及/或藉由注射，例如靜脈內或皮下注射來投與。在各種實施例中，免疫抑制方案包括如本文所揭示之以下中之任一者或全部：(i)阿那白滯素；(ii)托珠單抗；(iii)地塞米松；及(iv)他克莫司，其中各自可獨立地調配用於投與及/或藉由注射，例如靜脈內或皮下注射來投與。為避免疑義，對於本文在免疫抑制方案中提供之複數種免疫抑制劑之任何組合，免疫抑制劑中之每一者可各自獨立地調配用於投與及/或藉由注射，例如靜脈內或皮下注射來投與。
免疫抑制方案之應用 。如熟習此項技術者應瞭解，基因療法係具有許多用途之平臺，且基因療法之平臺亦必須理解為在基因療法領域中具有一般適用性以及對許多個別應用具有特定適用性。由於工程改造幹細胞以用於基因療法之方法中的離體方法的缺點，其包括(但不限於)成本過高且技術複雜，如本文所闡述之經改良的活體內基因療法方法在基因療法領域中具有廣泛且潛在轉化的價值。儘管本發明所揭示之方法對基因療法領域之普遍適用性顯而易見，但本文闡述若干例示性特定應用。
在某些例示性應用中，免疫抑制方案可與轉導造血幹細胞之病毒基因療法載體組合使用，視情況進一步與動員來自骨髓之造血幹細胞的幹細胞動員方案組合使用。造血幹細胞可例如藉由腺病毒基因療法載體，例如靶向CD46之腺病毒基因療法載體轉導。在各種實施例中，造血幹細胞之轉導可用作治療各種特定疾病之手段，該等特定疾病例如鐮狀細胞貧血、地中海型貧血、中間型地中海貧血、A型血友病、B型血友病、馮威里氏病(von Willebrand Disease)、第五因素缺陷、第七因素缺陷、第十因素缺陷、第十一因素缺陷、第十二因素缺陷、第十三因素缺陷、伯納德-蘇里爾症候群或灰色血小板症候群。舉例而言，靶向CD46之腺病毒載體可用於藉由將表現β-血球蛋白及/或γ-血球蛋白及/或增加其之表現的治療性有效負載遞送至造血幹細胞，來治療地中海型貧血或中間型地中海貧血。在另一實例中，靶向CD46之腺病毒載體可用於藉由遞送在造血幹細胞中表現第八因素或第九因素及/或增加其之表現的治療性有效負載來治療血友病(例如，A型血友病或B型血友病)。在另一實例中，靶向CD46之腺病毒載體可用於藉由遞送治療性有效負載以用於藉由基因編輯校正引起鐮狀細胞貧血之基因病變來治療鐮狀細胞貧血。病毒基因療法載體之例示性應用進一步揭示於例如於2019年7月2日申請之美國臨時專利申請案第62/869,907號中，該申請案以全文引用之方式併入本文中，且尤其關於病毒基因療法載體及病毒基因療法之應用。
本發明涵蓋以下理解：例如與不包括免疫抑制方案或其藥劑之參考相比，包括本發明之病毒基因療法載體及免疫抑制方案之病毒基因療法減少接受病毒基因療法之個體中所引起的免疫毒性及/或發炎。其中包括以下理解：例如與不包括免疫抑制方案或其藥劑之參考相比，由包括本發明之病毒基因療法載體及免疫抑制方案的病毒基因療法引起的降低之免疫毒性及/或發炎包括免疫毒性及/或發炎之一或多種生物標記之含量的降低。發炎之生物標記包括(但不限於) IFN-g、TNF、IL-2、IL-4、IL-5及IL-6。因此，本發明涵蓋，與諸如接受包括病毒基因療法載體但不包括免疫抑制方案或其藥劑之病毒基因療法的個體的參考相比，IFN-g、TNF、IL-2、IL-4、IL-5及IL-6中之任一或多者可在接受包括本發明之病毒基因療法載體及免疫抑制方案的病毒基因療法的個體中減少(例如顯著減少，例如減少之p值小於0.05)。在各種實施例中，IFN-g、TNF、IL-2、IL-4、IL-5及IL-6中之任一或多者的含量、含量變化率或含量變化之定性或定量變化藉由此項技術中已知之方法測定，包括例如ELISA或細胞介素珠陣列法。
套組 。在各種實施例中，本發明亦提供用於根據本發明之方法進行活體內基因療法方法之套組。舉例而言，套組可包括容器(視情況具有書面說明書，例如用於活體內基因療法)，該等容器包括選自以下1、2、3、4、5或6種中之任一者的免疫抑制劑：(i)發炎性信號抑制劑，諸如介白素-1 (IL-1)信號抑制劑，例如阿那白滯素；(ii) IL-6信號抑制劑，例如托珠單抗；(iii)皮質類固醇，例如地塞米松；(iv)鈣調神經磷酸酶抑制劑，例如他克莫司；(v) TNF-α信號抑制劑；及(vi) JAK信號抑制劑；其之任一者或全部(若存在)可以對應於如本文所描述之每日或其他劑量或半部每日劑量之單位劑量形式提供。在某些實例中，套組可包括容器(視情況具有書面說明書，例如用於活體內基因療法)，該等容器包括選自以下1、2、3或4種中之任一者的免疫抑制劑：(i)介白素-1 (IL-1)信號抑制劑，例如阿那白滯素；(ii) IL-6信號抑制劑，例如托珠單抗；(iii)皮質類固醇，例如地塞米松；及(iv)鈣調神經磷酸酶抑制劑，例如他克莫司；其之任一者或全部(若存在)可以對應於如本文所描述之每日或其他劑量或半部每日劑量之單位劑量形式提供。在各種實施例中，套組亦可包括容器，該等容器包括幹細胞動員藥劑，其增加造血幹細胞之循環及/或動員在骨髓中螯合之造血幹細胞以使該等幹細胞離開骨髓進入隔室中，在該等隔室中可進入該等幹細胞以藉由載體進行活體內轉導，該等幹細胞動員藥劑例如G-CSF及普樂沙福/AMD3100；其之任一者或全部(若存在)可以對應於如本文所描述之每日或其他劑量之單位劑量形式提供。在各種實施例中，套組亦可包括容器，該等容器包括選擇劑，諸如選擇已藉由載體進行活體內轉導之造血幹細胞的選擇劑，例如O6 -苯甲基鳥嘌呤(O6 BG)及1,3-雙(2-氯乙基)-1-亞硝基-脲(BCNU) (O6 BG/BCNU)；其之任一者或全部(若存在)可以對應於如本文所描述之每日或其他劑量之單位劑量形式提供。
例示性實施例： 1.      一種在哺乳動物個體中進行活體內基因療法之方法，該方法包括：向該個體投與包括發炎性信號抑制劑之免疫抑制方案；及向該個體投與至少一次劑量之病毒基因療法載體。 2.      一種轉導哺乳動物個體之幹細胞而不自該個體移除該等幹細胞之方法，該方法包括向已被投與包括發炎性信號抑制劑之免疫抑制方案的個體遞送病毒基因療法載體。 3.      如實施例1或2之方法，其中該發炎性信號抑制劑包括介白素-1 (IL-1)信號抑制劑，視情況其中該IL-1信號抑制劑包括IL-1受體(IL-1R)拮抗劑。 4.      如實施例3之方法，其中該IL-1R拮抗劑包括阿那白滯素。 5.      如實施例1至4中任一項之方法，其中該免疫抑制方案進一步包括介白素6 (IL-6)受體拮抗劑。 6.      如實施例5之方法，其中該IL-6受體拮抗劑包括托珠單抗。 7.      如實施例1至6中任一項之方法，其中該免疫抑制方案進一步包括皮質類固醇。 8.      如實施例7之方法，其中該皮質類固醇包括地塞米松。 9.      如實施例1至8中任一項之方法，其中該免疫抑制方案進一步包括鈣調神經磷酸酶抑制劑。 10.    如實施例9之方法，其中該鈣調神經磷酸酶抑制劑包括他克莫司。 11.    如實施例1至10中任一項之方法，其中該免疫抑制方案進一步包括TNF-α信號抑制劑。 12.    如實施例11之方法，其中該TNF-α信號抑制劑包括依那西普、英利昔單抗、阿達木單抗、聚乙二醇化賽妥珠單抗及/或戈利木單抗。 13.    如實施例1至12中任一項之方法，其中該免疫抑制方案進一步包括JAK信號抑制劑。 14.    如實施例13之方法，其中該JAK信號抑制劑包括巴瑞替尼、托法替尼、魯索利替尼及/或非戈替尼。 15.    如實施例1至14中任一項之方法，其中該免疫抑制方案之投與包括在以下時間向該個體投與IL-1受體拮抗劑：在投與第一次劑量之該載體的前一天；在投與第一次劑量之該載體的當天；在投與一或多次後續劑量之該載體的當天；在投與第一次劑量之該載體的當天與投與最後一次劑量之該載體的當天之間的每一天；及/或在投與最後一次劑量之該載體的當天之後的一天、兩天或更多天中之每一天； 視情況其中該IL-1受體拮抗劑包括阿那白滯素。 16.    如實施例1至15中任一項之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包括向該個體每天投與單次劑量之IL-1受體拮抗劑或每天投與複數次劑量之IL-1受體拮抗劑，視情況其中該IL-1受體拮抗劑包括阿那白滯素。 17.    如實施例15或16之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包括向該個體投與0.01至20 mg/kg/天之阿那白滯素，視情況其中該投與包括靜脈內投與。 18.    如實施例15或16之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包括向該個體投與10至200 mg/天之阿那白滯素，視情況其中該投與包括靜脈內投與。 19.    如實施例1至18中任一項之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包括在以下時間向該個體投與IL-6受體拮抗劑： 在投與第一次劑量之該載體的前一天；在投與第一次劑量之該載體的當天；在投與一或多次後續劑量之該載體的當天；在投與第一次劑量之該載體的當天與投與最後一次劑量之該載體的當天之間的每一天；及/或在投與最後一次劑量之該載體的當天之後的一天、兩天或更多天中之每一天； 視情況其中該IL-6受體拮抗劑包括托珠單抗。 20.    如實施例1至19中任一項之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包括向該個體每天投與單次劑量之IL-6受體拮抗劑或每天投與複數次劑量之IL-6受體拮抗劑，視情況其中該IL-6受體拮抗劑包括托珠單抗。 21.    如實施例19或20之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包括向該個體投與1至15 mg/kg/天之托珠單抗、1至12 mg/kg/天之托珠單抗、1至10 mg/kg/天之托珠單抗或5至200 mg/天之托珠單抗，視情況其中該投與包括靜脈內投與。 22.    如實施例1至21中任一項之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包括在以下時間向該個體投與皮質類固醇：在投與第一次劑量之該載體的前一天；在投與第一次劑量之該載體的當天；在投與一或多次後續劑量之該載體的當天；在投與第一次劑量之該載體的當天與投與最後一次劑量之該載體的當天之間的每一天；及/或在投與最後一次劑量之該載體的當天之後的一天、兩天或更多天中之每一天； 視情況其中該皮質類固醇包括地塞米松。 23.    如實施例1至22中任一項之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包括向該個體每天投與單次劑量之皮質類固醇或每天投與複數次劑量之皮質類固醇，視情況其中該皮質類固醇包括地塞米松。 24.    如實施例22或23之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包括向該個體投與0.1至10 mg/kg/天之地塞米松，視情況其中該投與包括靜脈內投與。 25.    如實施例1至24中任一項之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包括在以下時間向該個體投與鈣調神經磷酸酶抑制劑：在投與第一次劑量之該載體的前四天中之每一天；在投與第一次劑量之該載體的當天；在投與一或多次後續劑量之該載體的當天；及/或在投與第一次劑量之該載體的當天與投與最後一次劑量之該載體的當天之間的每一天；及/或在投與最後一次劑量之該載體的當天之後的一天、兩天或更多天中之每一天； 視情況其中該鈣調神經磷酸酶抑制劑包括他克莫司。 26.    如實施例1至25中任一項之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包括向該個體每天投與單次劑量之鈣調神經磷酸酶抑制劑或每天投與複數次劑量之鈣調神經磷酸酶抑制劑，視情況其中該鈣調神經磷酸酶抑制劑包括他克莫司。 27.    如實施例25或26之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包括向該個體投與0.001至0.1 mg/kg/天之他克莫司，視情況其中該投與包括皮下投與。 28.    如實施例1至27中任一項之方法，其中該方法與不包括一或多種免疫抑制劑的對照相比，(i)並未引起IFN-g、TNF、IL-2、IL-4、IL-5或IL-6中之一或多者之量的顯著增加；或(ii)引起IFN-g、TNF、IL-2、IL-4、IL-5或IL-6中之一或多者的量的顯著較小增加，視情況其中該對照不包括選自以下之一或多種免疫抑制劑：(a)該發炎性信號抑制劑；(b)該IL-6受體拮抗劑；(c)該皮質類固醇；及(d)該鈣調神經磷酸酶抑制劑；視情況其中該量係藉由ELISA及/或細胞介素珠陣列法來量測。 29.    如實施例1至28中任一項之方法，其中該方法進一步包括向該個體投與幹細胞動員方案。 30.    如實施例1至29中任一項之方法，其中該載體包括編碼可篩選標記之核酸序列，視情況其中該可篩選標記包括MGMTP140K 。 31.    如實施例30之方法，其中該方法包括向該個體投與選擇劑，視情況其中該可篩選標記包括MGMTP140K 且該選擇劑包括O6 BG/BCNU。 32.    如實施例30或31之方法，其中以一或多次劑量向該個體投與該選擇劑，視情況其中，在向該個體投與第一次劑量之該載體之後約1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週及/或10週，向該個體投與第一次劑量之該選擇劑。 33.    如實施例1至32中任一項之方法，其中藉由注射向該個體投與該載體，視情況其中該注射包括靜脈內或皮下投與。 34.    如實施例1至33中任一項之方法，其中至少第一次劑量之該載體包括至少1E10、1E11或1E12病毒粒子/公斤(vp/kg)。 35.    如實施例1至34中任一項之方法，其中該載體以至少1E10、1E11、1E12、2E12或3E12 vp/kg之總劑量投與。 36.    如實施例1至35中任一項之方法，其中該載體包括腺病毒載體、腺相關病毒載體、單純疱疹病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體、α病毒載體、黃病毒載體、棒狀病毒載體、麻疹病毒載體、新城雞瘟病毒載體、痘病毒載體或微小RNA病毒載體。 37.    如實施例1至35中任一項之方法，其中該載體包括腺病毒載體。 38.    如實施例1至37中任一項之方法，其中該載體包括B族腺病毒載體。 39.    如實施例1至38中任一項之方法，其中該載體包括或衍生自Ad5/35或Ad35腺病毒載體，視情況其中該載體包括Ad35++ 或Ad5/35++ 腺病毒載體。 40.    如實施例1至39中任一項之方法，其中該載體包括不具有複製能力的載體，視情況其中該不具有複製能力的載體包括輔助依賴性腺病毒載體。 41.    如實施例1至40中任一項之方法，其中病毒基因療法載體包括含有治療性有效負載之核酸，且其中該方法進一步包括向該個體投與支持載體，該支持載體編碼有助於將該治療性有效負載整合至目標細胞基因體中之藥劑。 42.    如實施例41之方法，其中將該支持載體與該病毒基因療法載體一起向該個體投與。 43.    如實施例41或42之方法，其中該支持載體以1E9至1E14病毒粒子/公斤(vp/kg)之總劑量投與。 44.    如實施例1至43中任一項之方法，其中該病毒基因療法載體包括含有治療性有效負載之核酸，且其中該方法使得將該治療性有效負載遞送至幹細胞，視情況其中該治療性有效負載之遞送包括將該治療性有效負載整合至該等幹細胞之基因體中。 45.    如實施例1至44中任一項之方法，其中該病毒基因療法載體包括含有編碼蛋白質之治療性有效負載的核酸，且在向該個體投與該載體之後，該個體之至少約70%、約80%或約90%之PBMC表現該蛋白質。 46.    如實施例1至45中任一項之方法，其中該個體為人類個體。 47.    如實施例46之方法，其中該人類個體罹患鐮狀細胞貧血、地中海型貧血、中間型地中海貧血、A型血友病、B型血友病、馮威里氏病、第五因素缺陷、第七因素缺陷、第十因素缺陷、第十一因素缺陷、第十二因素缺陷、第十三因素缺陷、伯納德-蘇里爾症候群、灰色血小板症候群。 48.    如實施例1至47中任一項之方法，其中在投與至少一次劑量之該病毒基因療法載體之後，基於該個體或來自該個體之樣本中免疫毒性生物標記之所量測含量，使該免疫抑制方案中之一或多種免疫抑制劑之給藥方案在單位劑量、每日劑量、總劑量、劑量頻率及/或劑量總數方面增加，其中若該所量測含量指示免疫毒性，則增加該一或多種免疫抑制劑之該給藥方案。 49.    如實施例48之方法，其中該免疫毒性生物標記包括：IL-Iβ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-23、IL-27、IL-30、IL-36 IL-1Ra、IL-2R、IFN-a、IFN-b、IFN-γ、MIP-Ia、MIP-Iβ、MCP-1、TNF-α、TNF-β GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、VEGF、RANTES、EGF、HGF、FGF-β、CD40、CD40L、C反應蛋白、降鈣素原、鐵蛋白、D-二聚體、淋巴球總群、淋巴球亞群、個體溫度及/或其組合。 50.    如實施例1至49中任一項之方法，其中，在投與至少一次劑量之該病毒基因療法載體之後，基於該個體或來自該個體之樣本中針對該病毒基因療法載體之抗體之所量測含量，使該免疫抑制方案中之一或多種免疫抑制劑之該給藥方案在單位劑量、每日劑量、總劑量、劑量頻率及/或劑量總數方面增加，其中若該所量測含量指示免疫毒性，則增加該一或多種免疫抑制劑之該給藥方案，視情況其中該所量測含量為抗體力價，及視情況其中該等抗體為中和抗體。 51.    如實施例48至50中任一項之方法，其中該免疫抑制方案中之該一或多種免疫抑制劑之該給藥方案包括具有以下中之一或多者的給藥方案：(i)介白素-1 (IL-1)信號抑制劑，視情況其中該IL-1信號抑制劑包括阿那白滯素；(ii) IL-6信號抑制劑，視情況其中該IL-6信號抑制劑為托珠單抗；(iii)皮質類固醇，視情況其中該皮質類固醇包括地塞米松；及(iv)鈣調神經磷酸酶抑制劑，視情況其中該鈣調神經磷酸酶抑制劑包括他克莫司。 實例
實例 1 ： 包括病毒載體、支持載體及免疫抑制方案之活體內基因療法的例示性流程。
本實例提供包括病毒基因療法載體及支持載體之活體內基因療法的方案。如圖1中所示，HDAd支持載體編碼(i)可操作地連接於EF1α啟動子之Flpe重組酶及(ii)可操作地連接於PGK啟動子之轉座酶(SB100x)，此兩種酶安置於腺病毒反向末端重複序列(ITR)之間。填充片段亦包括於支持載體中以產生具有藉由腺病毒有效封裝之大小的病毒載體基因體。HDAd病毒基因療法載體包括治療性有效負載，其包括編碼治療蛋白(rh γ-血球蛋白)之核酸序列，該治療蛋白可操作地連接於β-血球蛋白啟動子及β-血球蛋白基因座控制區(LCR)兩者，且進一步可操作地連接於3'UTR及雞超敏位點4 (cHS4；雞β樣血球蛋白基因簇)調節區。病毒基因療法載體進一步(視情況)包括編碼MGMTP140K 可篩選標記之核酸序列，該標記可操作地連接於PGK啟動子。治療性有效負載側接有作為SB100x轉位目標之反向重複序列(IR)，由此治療性有效負載可整合至宿主細胞基因體中。IR轉而側接有frt位點，其在暴露於Flpe時使側接之核酸環化，以促進治療性有效負載之轉位。病毒基因療法載體進一步包括腺病毒ITR。
如圖2中所示，將腺病毒病毒基因療法載體及支持載體混合(以1:1比率)成單一調配物以便向個體投與。個體在連續兩天中之每一天接受兩次劑量之HDAd組合調配物。第一次劑量為在20分鐘時段內向個體投與之5E10 vp/kg之劑量。在同一天隨後投與之第二次劑量為在30分鐘時段內向個體投與之1.6E12 vp/kg之劑量。因此，組合(以1:1比率)之兩種載體之每日總劑量為1.65E12 vp/kg。所有劑量均經靜脈內投與，且繼之為靜脈內投與生理食鹽水推注。闡述於圖2中之病毒基因療法載體方案進一步描述於下表1中。
免疫抑制方案係基於HDAd投與之時序投與。闡述於圖2中之免疫抑制方案包括阿那白滯素、托珠單抗、他克莫司及地塞米松。闡述於圖2中之免疫抑制方案進一步描述於表1中。表 1 ： 例示性免疫抑制方案
藥劑 給藥流程 投與途徑 投與時序 ( 天數 )
地塞米松 2 mg/kg一天兩次 靜脈內 -1、0
他克莫司 0.01 mg/kg一天兩次 皮下 -5、-4、-3、-2、-1、0、1、2天及視情況在第2天之後的額外天數
托珠單抗 8 mg/kg一天兩次 靜脈內 -1、0
阿那白滯素 50 mg/動物 一天兩次 靜脈內 -1、0
生理食鹽水 8 ml/kg 靜脈內推注(在各HDAd給藥後15 min內) -1及0
HDAd 1.65E12 vp/kg 靜脈內 -1
HDAd 1.65E12 vp/kg 靜脈內 0
實例 2 ： 包括病毒載體、支持載體、免疫抑制方案及選擇劑之活體內基因療法的例示性流程。
本實例增加實例1中所闡述之方案。本實例規定，HDAd病毒基因療法載體肯定地包括如圖1中所示及如實例1中指示為視情況選用之MGMTP140K 可篩選標記。因此，本實例進一步提供選擇方案，其包括選擇劑O6 BG/BCNU，如圖3中所示。圖3中所示之選擇方案進一步描述於表2中。表 2 ：例示性選擇方案
藥劑 給藥流程 投與途徑 投與時序 ( 週數 )
O6 BG/BCNU 劑量#1、#2及#3分別為10、20及30 mg/m2 靜脈內 4、6、8
實例 3 ： 包括病毒載體、支持載體、免疫抑制方案、選擇劑及幹細胞動員方案之活體內基因療法的例示性流程。
本實例增加實例1中所闡述之方案及/或實例2中所闡述之方案。本實例提供可向個體投與以改良通常駐存於骨髓中之幹細胞(包括造血幹細胞)之轉導的幹細胞動員方案。如圖4中所示，例示性幹細胞動員方案包括G-CSF及AMD3100。圖4中所示之選擇方案進一步描述於表3中。表 3 ： 例示性幹細胞動員方案
藥劑 給藥流程 投與途徑 投與時序 ( 天數 )
G-CSF 50 ug/kg一天一次 皮下 -5、-4、-3、-2、-1、0
AMD3100 5 mg/kg一天一次 皮下 -2、-1(在HDAd給藥之前9至11小時投與)
實例 4 ： 包括病毒載體、支持載體、免疫抑制方案、選擇劑及幹細胞動員方案之活體內基因療法的例示性流程。
本實例描述圖5中所示之替代性流程且描述如下。
基因轉移載體 ：將使用基因轉移載體HDAd組合(HDAd-組合)：該載體含有介導以下轉殖基因之隨機基因體整合的SB100x轉座酶：i)在微型LCR之控制下的恆河猴γ-血球蛋白基因，以便在紅血球中有效表現；ii)在廣泛活性EF1a啟動子之控制下的恆河猴MGMTP140K ，以便用O6 BG/BCNU活體內選擇經轉導細胞，iii)在廣泛活性EF1a啟動子之控制下的GFP，以便分析周邊血液T細胞轉導及載體生物分佈研究。其將進一步包括腺嘌呤鹼基編輯器，其用於經由HBG啟動子中BCL11a抑制因子蛋白質結合位點之不活化及紅血球系bcl11a強化子之同時不活化(其引起紅血球系細胞中之BCL11a抑制因子蛋白質表現減少)來再活化內源性γ-血球蛋白。此外，鹼基編輯器表現卡匣將在Flp重組酶介導之轉位子切除後移除，僅引起iCas-BE之短暫表現。最後，含有SB100x轉座酶及Flp重組酶之載體將不整合且將在HSC細胞增殖期間損失(圖6)。
治療方案 ：使用HSC動員及O6 BG/BCNU活體內選擇方案，用三個恆河獼猴(Macaca mulatta )進行六個月研究(圖5)。該方案將以測試一隻動物開始。當截至第8週(最後一個活體內選擇週期結束)未出現嚴重併發症時，將在剩餘的兩隻動物中重複該研究。
動員 ：將有5天在上午皮下給與GCSF及SCF(各50 ug/kg)。最後兩天皮下給與GCSF/SCF及AMD3100將在下午進行(5 mg/kg)。
治療前 ：以4 mg/kg給藥之地塞米松，在HDAd5/35++注射之前16小時經靜脈內給與。以20 mg/kg給藥之甲基潑尼龍加以4 mg/kg給藥之地塞米松將經靜脈內給與，同時在HDAd5/35++注射之前30分鐘，將皮下給與以100 mg給藥之阿那白滯素。
HDAd 注射 ：將經靜脈內給與兩輪HDAd注射：(a)在第-1天之低劑量(3E11 vp/kg，於20 mL磷酸鹽緩衝生理食鹽水中，以2 mL/min)；(b)在第0天相隔30分鐘給與兩種完整劑量(1E12 vp/kg，於20 mL磷酸鹽緩衝生理食鹽水中，以2 mL/min)。
短暫免疫抑制 ：免疫抑制將在第1天開始起始直至第一次劑量之O6 BG/BCNU(第4週)，且必要時，在最後一次劑量之O6 BG/BCNU之後持續2週。免疫抑制將包括0.2 mg/kg/天之雷帕黴素(rapamycin)、30 mg/kg/天之黴酚酸嗎啉乙酯及0.25 mg/kg/天之他克莫司，所有均每天經由食物經口給予。
用 O6 BG / BCNU 進行之活體內選擇 ：O6 BG ：動物將接收200 mL生理食鹽水中之120 mg/m2 O6 BG，在至少30分鐘內經靜脈內輸注。BCNU將在O6 BG輸注開始之後60分鐘投與。在BCNU投與之後，動物將接著在至少30分鐘、六至八小時內經靜脈內接受200 mL生理食鹽水中之另一劑量的O6 BG。將在HDAd注射之後四週給與第一次治療；視γ-血球蛋白標記及血液學而定，以2週時間間隔(視情況)進行第二次及第三次治療。
待收集之資料 ：將收集血液樣本，如圖5中所指示。將進行每日物理觀測及每週體重量測。
血液樣本 ：對於兩小時及六小時血液樣本，將進行以下分析：將定量CD34+中GFP+細胞之百分比及CD38-/Cd45RA、CD90+細胞中GFP+細胞之百分比，群落形成單位分析將用於評估GFP+群落%之百分比、朝向SDF1-a之遷移及CXCR4及/或VLA-4之表現百分比。對於所有其他樣本，將量測血球計數、化學物質、反應蛋白及促炎性細胞介素。γ-血球蛋白表現將經由流式細胞量測術量測(紅血球系/非紅血球系細胞)，而HPLC及qRT-PCR將用於量測再活化相對於所添加之γ-血球蛋白之含量。細胞離心塗片機(Cytospins)將用於評估γ-血球蛋白免疫螢光。將量測載體複本數及Cas9、SB100x及Flpe mRNA含量。將量測白血球(CD4+、CD8+、CD25、CD45RO、CD45RA、CCR-7、CD62L、FOXP3、整合素αeβ7)中之GFP表現。
骨髓樣本 ：骨髓樣本將在第四天收集且接著每月收集(參見圖5)。骨髓樣本之譜系組合物將藉由流式細胞量測術評估。亦將量測CD34+細胞中之載體複本數。將使用流式細胞量測術藉由用Ter119+/Ter119-標記之分選來評估γ-血球蛋白。HPLC及qRT-PCR將用於量測再活化相對於所添加γ-血球蛋白之含量。除了此等分析之外，在屍檢之後，將對CD34+細胞進行全基因體定序以鑑別SB100x介導之整合及鹼基編輯器脫靶效應。亦將對CD34+細胞進行RNA定序以比較治療前與治療後之間的mRNA及miRNA型態。
屍檢之組織 ( 包括生殖系組織及精液 ) ：將進行常規組織學研究，且將量測主要組織群之載體複本數。將評估組織切片上γ-血球蛋白及GFP免疫螢光。
結果 ：此實驗將驗證SB100x介導之基因添加及內源性γ-血球蛋白之BE介導再活化兩者在活體內HSC轉導之後在非人類靈長類動物中為有效的。其將證明，載體將達成在SCA患者中為治癒性之紅血球中γ-血球蛋白表現量(亦即＞80% γ-血球蛋白+RBC，其中γ-血球蛋白含量＞成年恆河猴血球蛋白中之20%)。其亦將證明不存在長期血液副作用且不存在HSC轉錄組中非所需的基因體重排及變化。最後，其將證明，經靜脈內注射之HDAd5/35++載體轉導記憶T細胞。
實例 5 ： 針對血紅素病變之活體內 HSC 基因療法 ： 包括病毒載體、支持載體、免疫抑制方案、選擇劑及幹細胞動員方案之恆河猴中的活體內基因療法。
針對血紅素病變之多種基因療法或基因體編輯研究需要高度複雜的醫療設施以進行造血幹細胞收集/選擇及基因修飾。另外，患者接受高劑量化學療法以便於移植經基因修飾之細胞。因此，許多罹患血紅素病變之患者無法獲得某些基因療法方案。此實例中之某些材料如Li等人. (Blood , 136(增刊1): 46-47, 2020; doi.org/10.1182/blood-2020-141468)公開。
本實例包括高度可攜帶且可擴展之基因療法方法，其包括活體內造血幹細胞(HSC)基因療法且可能克服此等侷限性。在本發明活體內HSC基因療法方法中，HSC自骨髓中動員，且儘管該等HSC以高數值在周邊循環，但用經靜脈內注射之HSC向性(HSC-tropic)、輔助依賴性腺病毒HDAd5/35++基因療法載體系統轉導(參見圖7A之示意圖)。經轉導細胞返回至骨髓，其中該等經轉導細胞長期存留(參見圖7B中之例示性圖示)。由基因療法載體編碼之治療性有效負載之整合可藉由睡美人(Sleeping Beauty)轉座酶(SB100x)以隨機模式或藉由同源定向修復成安全基因體包藏位點(harbor site)來實現。在本實例中，包括含有活體內選擇系統之可篩選標記(在藉由低劑量O6 BG/BCNU選擇情況下的mgmtP140K 可篩選標記)的有效負載之載體用於達成周邊血球中之80-100%標記含量。HDAd5/35++載體之安全性及功效已證明於中間型地中海貧血、鐮狀細胞疾病及A型血友病之小鼠模型中，其中實現了表型校正。已觀測到，投與腺病毒載體誘發先天性免疫反應(例如參見圖11A中之示意圖，其進一步顯示本發明之某些免疫抑制劑)。小鼠中之觀測結果支持以下之可能性：投與免疫抑制方案可鈍化對腺病毒載體投與之免疫反應(圖11B及11C)。
本實例顯示，新型免疫抑制方案(地塞米松、IL-6受體拮抗劑、IL-1受體拮抗劑、生理食鹽水靜脈內推注)能夠減輕與靜脈內HDAd5/35++載體投與相關之副作用。呈現3個恆河猴之資料。顯示用G-CSF/AMD3100之治療導致HSC高效動員進入血液循環且HDAd5/35++載體系統之後續靜脈內注射(總計1-3 x 1012 vp/kg，以兩次劑量)耐受良好。在用O6 BG加低劑量(10至20 mg/m2 )(比某些自體移植方案中所用之劑量低至多100倍之劑量)之BCNU進行活體內選擇之後，周邊紅血球中之γ-血球蛋白標記上升至90%且在研究持續時間穩定(參見圖15A)。紅血球中之γ-血球蛋白含量為成年α1-血球蛋白之18%(藉由HPLC)。第3天骨髓之分析顯示30%經轉導之HSC。載體DNA生物分佈研究證明大部分組織(包括睪丸及CNS)之極低轉導或不存在轉導。對骨髓之分析顯示經轉導之CD34+/CD90+細胞對骨髓之有效、優先HSC轉導及重新歸巢。在第4週，約5%之祖細胞群落形成細胞證明使用整合載體之穩定轉導，且此頻率在開始活體內選擇之後增加。活體內選擇之後，PBMC中人類mgmtP140K mRNA表現量亦增加。
結果概述
使用新型及最佳化免疫抑制方案，腺病毒載體(藉由HDAd5/35++例示)之靜脈內遞送耐受極好而無顯著偵測到之細胞介素活化。如圖12A-12C中所示，用包括IL-6信號抑制劑(托珠單抗)及皮質類固醇(地塞米松)之免疫抑制方案治療之NHP在腺病毒載體投與時經歷穩固免疫反應(藉由血清IL-6量測)，而接受包括IL-6信號抑制劑(托珠單抗)、IL-1信號抑制劑(阿那白滯素)及皮質類固醇(地塞米松)之免疫抑制方案的NHP藉由同一量度展現極少可偵測之免疫反應。此外，阿那白滯素與托珠單抗及地塞米松之組合而非僅托珠單抗及地塞米松之組合消除對腺病毒載體投與之免疫反應，如藉由血清TNFα所量測(圖12D及12E)。此等結果一起證明阿那白滯素及包括阿那白滯素之方案出乎意料地穩定調節對腺病毒載體投與之免疫反應。證明了在低劑量O6 BG/BCNU下HSC之有效轉導及經轉導祖細胞的高效活體內選擇。據本發明人所知，本實例首次證明活體內HSC基因療法在人類中係可行的而無需高劑量化學療法調節且無需高度專業化醫療設施。此方法為基因療法及基因體編輯領域提供重大進展，且使得必要的便攜性及可獲得性能夠使處於具有有限醫療資源之場所中之患者所獲取。
方法概述
所用載體 ：HDAd5/35++
載體有效負載 ：投與之載體包括HDAd5/35++供體載體與HDAd5/35++支持載體之1:1混合物，亦即其中供體載體包括轉位子及經支持載體編碼之轉位子整合機制(參見圖7C及8A-8D中供體及支持載體之例示性圖示)。在本文所提供之特定實例中，支持載體編碼SB100x轉座酶及Flpe重組酶，且供體載體編碼轉位子，其側接用於SB識別之IR及用於Flpe重組酶識別之FRT位點。在本文所提供之某些實例中，轉位子包括可操作地與β-血球蛋白啟動子/LCR連接之人類γ血球蛋白cDNA及可操作地與PGK啟動子連接之GFP/MGMTp140K 卡匣(參見圖7D中例示性選擇方案之示意圖)。在某些實例中，供體載體有效負載除了轉位子之外進一步包括編碼恆河猴γ血球蛋白再活化CRISPR/Cas9卡匣之導引序列，其靶向HBG啟動子中之紅血球系bcl11a強化子及BCL11A結合位點(各在U6啟動子之控制下)及在EF1α啟動子之控制下的spCas9 cDNA。在某些實例中，γ血球蛋白再活化卡匣插入3' IR(用於SB識別)及frt位點(用於Flp介導之重組)外部，從而允許再活化卡匣之短暫表現。HDAd5/35++載體優先轉導HSC(參見圖9A-9D中之例示性資料)。
HDAd5/35++載體以兩次相隔24 h之輸注(各在40分鐘內)投與。第一次輸注(在第-1天)在0.5-1.65E12 vp/kg之間；第二次HDAd5/35++輸注(在第0天)在0.5-1.6E12 vp/kg之間。
動員方案 ：在第-5天開始且持續至第0天(治療六天)，各動物接受以50 μg/kg劑量之G-CSF之皮下(SQ)注射。AMD3100 (5.0 mg/kg)皮下給與兩次，第一次注射在第-2天(10PM)且第二次注射在第-1天(10PM) (圖10A)。對於全部三個NHP (圖10B、10C及10D)，動員為有效。
免疫抑制方案 ：在第-2天開始且持續至第0天，動物接靜脈內(IV)劑量之地塞米松(5.0 mg/kg)。此補充有僅以8.0 mg/kg之劑量靜脈內給與之Actemra® (托珠單抗) (NHP#1)，其在第-1天開始且持續至第2天；或Actemra®與阿那白滯素(靜脈內50 mg/動物，NHP#2及NHP#3)，其在第-1天開始且持續至第2天。
表 4 ： 免疫抑制方案
天 所投與之免疫抑制劑及劑量
NHP#1 NHP#2 NHP#3
-6         
-5         
-4         
-3         
-2 地塞米松(2.0 mg/kg)每天一次 地塞米松(7.0 mg/kg)每天一次 地塞米松(4.0 mg/kg)每天一次
-1* 地塞米松(2.0 mg/kg)每天兩次 普賴蘇穠(10 mg/kg)每天兩次 托珠單抗(8.0 mg/kg)每天兩次 地塞米松(7.0 mg/kg)每天兩次 托珠單抗(8.0 mg/kg)每天兩次 阿那白滯素(50 mg/動物)每天兩次 地塞米松(4.0 mg/kg)每天兩次 托珠單抗(8.0 mg/kg)每天兩次 阿那白滯素(50 mg/動物)每天兩次
0* 地塞米松(2.0 mg/kg)每天兩次 普賴蘇穠(10 mg/kg)每天兩次 托珠單抗(8.0 mg/kg)每天兩次 地塞米松(7.0 mg/kg)每天兩次 托珠單抗(8.0 mg/kg)每天兩次 阿那白滯素(50 mg/動物)每天兩次 地塞米松(4.0 mg/kg)每天兩次 托珠單抗(8.0 mg/kg)每天兩次 阿那白滯素(50 mg/動物)每天兩次
1       托珠單抗(8.0 mg/kg)每天一次 阿那白滯素(50 mg/動物)每天一次
2       托珠單抗(8.0 mg/kg)每天一次 阿那白滯素(50 mg/動物)每天一次
*投與腺病毒載體之日。
選擇方案 ：在第28天及第57天，各動物在30 min內接受BCNU (20 mg/m2 )及O6 BG (120 mg/m2)之靜脈內輸注。
HDAd5 / 35 ++ 載體及 NHP 研究概述 ：
在此等研究中，在每所用HDAd5/35++載體N=1情況下處理三隻雄性恆河猴。NHP#1接受含有兩個有效負載模組之供體載體：i)轉位子模組，用於隨機整合至與微型β-血球蛋白LCR可操作地連接之人類γ-血球蛋白基因、以及與EF1α啟動子可操作地連接之MGMTP140K 選擇標記的宿主細胞基因體中，以及ii) CRISPR/Cas9模組，用於CRISPR/Cas9介導之內源性恆河猴γ-血球蛋白表現之再活化(圖8B)。此組合供體載體與表現增強活性的睡美人轉座酶(SB100x)之支持載體(HDAd-SB)共注射，該活性藉由將轉位子整合至宿主細胞基因體中而介導γ-血球蛋白基因添加且觸發CRISPR/Cas9模組之破壞，因此限制CRISPR/Cas9系統之表現及活性的持續時間(圖8B)。使NHP#2注射HDAd5/35++供體載體，以便將γ-血球蛋白卡匣靶向整合至安全基因體港(safe genomic harbor)，即AAVS1基因座(圖8C)。注射至NHP#3中之載體與NHP#1的載體類似，但編碼恆河猴γ-血球蛋白而非人類γ-血球蛋白，以使NHP中針對轉殖基因產物之免疫反應減至最少(圖8D)。
在入選時，三隻動物均不具有可偵測之抗載體抗體。出乎意料地，NHP#1在隔離期間得到了抗體(力價1:680)。監測NHP#1及#3持續6個月。NHP#2在HDAd注射後第3天，由於他克莫司用藥過量(通過胃導管在5天內給與)而不得不被安樂死。儘管如此，亦可自此動物收集一組相關資料。對於活體內HSC選擇，NHP#1在第4、6及8週分別接受30mg/kg O6 BG加10、20及30mg/kg BCNU。在第4、8及13週用30mg/kg O6 BG加10、20及20mg/kg BCNU處理NHP#3。
HSC 動員 。藉由在HDAd注射之前11小時給與四次注射G-CSF(皮下，AM)繼之為AMD3100(皮下PM)來動員HSC。此時序考慮在人類中，經動員HSC之峰值係在AMD3100投與之後11小時。如下文所概述，不同於人類，NHP在紅血球上表現CD46 (HDAd5/35++載體之目標受體)。此帶有所注射HDAd5/35++粒子之螯合風險。為解決此問題，動員方案經改良且給與HDAd5/35++之第二次注射(圖10A-10D)。
免疫抑制 ：由暴露於腺病毒載體引起之先天性免疫活化之標誌為促炎性細胞介素之升高。特定言之，IL-1及IL-6信號傳導似乎在調節全身性投與之腺病毒載體之不良作用中極其重要(Shayakhmetov等人，J Immunol. 174(11): 7310-7319, 2005；Koizumi等人，J Immunol. 178(3): 1767-1773, 2007；Benihoud等人，J Gene Med. 2(3): 194-203, 2000)。在研究期間，得到使針對人類轉殖基因產物(MGMTP140K 及γ-血球蛋白)之先天性(細胞介素)反應及後天性免疫反應降至最低的方案(表5)。向NHP#1投與包括地塞米松(2 mg/kg)及托珠單抗(8 mg/kg)之預防性免疫抑制方案。此方案不足以完全抑制在載體給藥之後6小時時達到峰值之IL-6及TNF-a之釋放(圖12A-12E)。經24小時使血清細胞介素恢復至基線。新型免疫抑制方案(地塞米松、IL-6R拮抗劑、IL-1bR拮抗劑、生理食鹽水靜脈內推注)減輕與靜脈內HDAd5/35++載體投與相關之所有副作用。包括靜脈內流體推注，預防低血壓及後續噁心。
表 5 . 免疫抑制
動物 載體劑量 細胞介素預防 其他免疫抑制 研究持續時間
NHP#1 (11.5 kg) 0.5及1.2x1012 vp/kg 地塞米松、托珠單抗 他克莫司、MMF、西羅莫司(sirolimus)(IM)  148天
NHP#2 (9.0 kg) 1.6及1.6x1012 vp/kg 地塞米松、托珠單抗、阿那白滯素 他克莫司(胃導管)  6天
NHP#3 (6.0 kg) 1.6及0.5x1012 vp/kg 地塞米松、托珠單抗、阿那白滯素 他克莫司、MMF (IM)、阿巴西普(abatacept) (靜脈內，第21週-第24週)  192天
值得注意地，GCSF/AMD3100動員導致所有三隻動物中嗜中性白血球計數自第0天至第4天之關鍵增加(亦參見圖20)。嗜中性白血球含有可在衰老期間釋放之促炎性細胞介素。向NHP#3投與之免疫抑制方案旨在藉由在第1及2天亦包括阿那白滯素/托珠單抗來抵消此情況。
為抑制後天性免疫反應，NHP#1每日接受他克莫司/西羅莫司/MMF。在較長時間段內給與，此方案引起胃腸道(GI-tract)及腎臟毒性。對於NHP#3，因此決定對其投與僅他克莫司(皮下)，因為此在髓細胞切除/調節之恆河猴中已經足夠。然而，本研究包括以下觀測結果，因為此研究中之動物具有完全免疫潛能，單獨之他克莫司並未妨礙產生抗人類MGMTP140K 抗體(及T細胞反應) (亦參見圖21A、21B)。嘗試藉由使用MMF及CTLA4-Ig(阿巴西普；Orencia®)之額外治療來增加NHP#3中之免疫抑制僅部分有效。經由胃導管給與之免疫抑制藥物可引起嚴重副作用。
載體血清清除 ：在靜脈內注射1.6x1012 vp/細胞後，對於NHP#2及NHP#3，載體自血液中之清除顯示出類似的動力學，其中半衰期為2-3小時(圖19A-19C)。截至注射之後9-10小時，載體不再可偵測到。在NHP#1中，載體基因體在注射後24小時仍可偵測到。值得注意地，NHP#1在隔離期間已獲得抗HDAd5/35++ IgG抗體，其可能已導致免疫複合物之形成並影響載體清除。總體而言，HDAd5/35++之清除似乎比例如Ad5載體之清除慢得多(Seshidhar等人，Virology. 311(2): 384-393，2003)。
身體健康及血液學 ：雖然由於積極免疫抑制(他克莫司+西羅莫司+MMF)及活體內選擇(最後BCNU劑量：30mg/kg)，在NHP#1中觀測到了不良副作用，但在方案調整後(僅他克莫司，最大BCNU劑量：20mg/kg)，NHP#3之安全概況極佳(圖20A-20B)。未觀測到臨床症狀、異常體重減輕、異常血球計數及異常血液化學物質。值得注意地，肝轉胺酶並未升高，此與對於注射Ad5載體之動物所預期之情況形成鮮明對比(Seshidhar等人，Virology. 311(2): 384-393, 2003) (參見圖13A-13D)。(HDAd5/35++載體經設計以避免肝細胞吸收。)此外，對骨髓中譜系陽性細胞及CD34+細胞之分析證明，所用之O6 BG/BCNU劑量並未影響NHP #3中之骨髓及HSC (圖21A-21C)。
編輯酶表現及抗體反應 ：由於HDAd-SB載體之游離型性質及Cas9自毀機制(參見圖8A)，如針對對應mRNA藉由qRT-PCR所示，基因體編輯酶(SB100x、Flpe及Cas9)之表現截至第3週損失(圖16G-16I)。因此，儘管Flpe、SB100x及Cas9 mRNA可偵測到，但未觀測到針對經編碼Flpe、SB100x及Cas9產物之顯著IgM及IgG抗體反應，但偵測到針對GFP之反應(對於來自NHP#1之資料，參見例如圖16C-16I)。然而，如所預期，靜脈內注射HDAd5/35++觸發了針對HDAd病毒衣殼蛋白之IgM及IgG反應(參見例如圖16A中提供之NHP#1資料，圖16B中提供之NHP#3資料)。此等反應隨時間推移消退。值得注意地，在HDAd注射時，NHP#1之抗HDAd力價為1:680，最可能係由於在4週之隔離期間暴露於Ad。
第 3 天之載體生物分佈 ：來自動物#2(因他克莫司之意外用藥過量而在第3天被安樂死)之血清及組織樣本顯示，新型免疫抑制方案(地塞米松、IL-6R、IL-1bR拮抗劑、生理食鹽水靜脈內推注)減輕與HDAd5/35++載體投與相關之所有副作用。載體DNA生物分佈研究證明大部分組織(包括睪丸及CNS)之極低轉導或不存在轉導(圖22)。肺、肝臟及脾臟中之載體信號衍生於殘餘血球(即使動物已在組織收集之前用5公升PBS灌注)。第24週骨髓樣本用於RNA-seq以評估基因添加/編輯對轉錄組之潛在副作用(與研究開始之前收集之骨髓樣本相比較) (參見excel檔案)。未發現顯著異常。
PBMC 之轉導 ：在HDAd注射之後不同時間點量測PBMC中之載體複本數(VCN) (圖23A-23C)。該資料指示PBMC之早期轉導。然而，載體信號截至第2週損失，最可能係由於分化血球之天然轉換及/或游離型載體DNA降解。
HSC 之優先轉導 ：在HDAd注射之後第3天及第8天總骨髓單核細胞(MNC)及骨髓CD34+細胞之分析顯示載體陽性細胞。每個細胞之載體複本數(VCN)視注射之病毒劑量而定。重要地，該資料指示接著返回至骨髓之經動員CD34+細胞之優先轉導(圖24-24D)。在此等早期時間點偵測到之載體信號最可能來源於游離型載體DNA。
穩定 HSC 轉導 ：為量測轉殖基因整合，將骨髓細胞塗鋪用於CFU分析。在群落形成/細胞增殖期間，大部分游離型載體損失(參見例如根據圖14A所收集之來自NHP#3之資料且示於圖14B及14C中)。來自VCN為1之單一群落之DNA分析表明5-10%之整合頻率(參見圖25A及25B)。此頻率由於活體內選擇並未顯著增加。認為後者以祖細胞含量產生，而非以原始HSC/CFU含量產生。
來自 NHP # 1 之資料
NHP#1已預先存在抗HDAd5/35++血清抗體，且在第-1天接受0.5x1012 vp/kg HDAd且在第0天接受1.2x1012 vp/kg。由於此，最初CD34+細胞轉導比在其他兩隻動物中不太有效(參見圖24A-24D、25A及25B)。然而，在第2週之後，γ-血球蛋白變得可藉由流式細胞量測術在20%周邊紅血球上偵測到(圖15A-15C)。使用O6 BG/BCNU之活體內選擇暫時減少了γ-血球蛋白標記，最可能係由於對紅血球系祖細胞之細胞毒性作用。然而，在O6 BG/BCNU治療之第三週期之後，γ-血球蛋白-陽性RBC之百分比上升至90%且保持穩定直至實驗結束，除了在約第18週短暫降低以外。在骨髓中之紅血球系祖細胞中發現類似模式。對RBC裂解物之HPLC分析允許吾等區分內源性恆河猴γ-血球蛋白與所添加之人類γ-血球蛋白。γ-血球蛋白含量相對於α1血球蛋白鏈表現，該等蛋白結合以形成HbF。在完成活體內選擇之後人類γ-血球蛋白鏈變得可偵測到，且以1% α1血球蛋白保持相對穩定直至第22週(圖26A、26B)。與人類γ-血球蛋白一致，為另一轉殖基因人類mgmtP140K 之表現動力學。活體內選擇將mgmtP140K mRNA之含量提高兩個數量級，達到與GAPDH mRNA表現相當之含量(每個細胞2000個mRNA複本)。此為可賦予對O6 BG/BCNU治療之耐受性的穩定含量。可偵測之mgmtP140K mRNA在第15週降低至GAPDH mRNA之10%。在第15週之後，保持穩定(圖26C)。活體內選擇亦引起恆河猴γ-血球蛋白之增加，在第16週時開始且在第15週以α1血球蛋白之6%達到峰值(圖27A)。後續下降可能係由於具有有害基因體重排之CRISPR編輯細胞之損失。此部分由T7E1失配PCR資料支持，在第14週在HBG1/2啟動子目標位點中顯示2.5%插入缺失但在第21週顯示不可偵測之裂解(圖27B)。人類及恆河猴mRNA之表現反映對應蛋白質含量之表現。總體而言，人類γ-血球蛋白及mgmtP140K 表現資料指示允許活體內選擇/擴增經轉導祖細胞/周邊血球之含量下的載體整合。隨著第15週之後的恆河猴γ-血球蛋白表現減少，在第15週之後藉由流式細胞量測術偵測到之RBC上的高γ-血球蛋白標記(圖25A)最可能係基於人類γ-血球蛋白形式之表現。在預定屍檢時，在NHP#1之基因體及轉錄組分析中未發現異常。
來自 NHP # 3 之功效資料
此動物之注射前抗HDAd抗體力價為1:66，比NHP#1低十倍。以2.1x1012 vp/kg注射之病毒劑量比NHP#1高20%。NHP#3皮下接受他克莫司直至第15週。在第18週以他克莫司/MMF/阿巴西普恢復免疫抑制。
最初之CD34+轉導(第3天及第8天)及穩定轉導之CFU百分比比NHP#1高至少兩倍(圖24A-24D、25A及25B)。用於NHP#3中之載體含有恆河猴γ-血球蛋白基因，以減少針對治療蛋白之免疫反應。出乎意料地，恆河猴γ-血球蛋白之表現不如人類γ-血球蛋白基因在與人類β-血球蛋白LCR組合時有效。RBC之γ-血球蛋白標記及表現量因此低估活體內方法之潛能。γ-血球蛋白-陽性RBC之百分比在第三次活體內選擇週期之後開始增加，在第18週時達到45%，然而，標記截至第21週降低至7%，保持相對穩定直至研究結束(第28週) (圖17A)。此下降在骨髓單核細胞中較不明顯(圖17B、17C)。類似於NHP#1，藉由流式細胞量測術量測之γ-血球蛋白中之絕大部分來源於所添加之恆河猴γ-血球蛋白基因。CRISPR編輯之細胞似乎損失(圖27B)。
在第一輪活體內選擇之後，PBMC中人類mgmtP140K mRNA表現量亦增加，然而，在第2週期及第3週期鈍化之後增加。在以他克莫司+MMF+阿巴西普重新開始免疫抑制之後不久恢復mgmtP140K 表現(圖17D)。此指示抗人類MGMTP140K 免疫反應之作用，尤其指示能夠消除周邊中轉殖基因表現細胞之T細胞反應，且在較小程度上指示能夠消除骨髓中轉殖基因表現細胞之T細胞反應。針對人類MGMT之血清IgG抗體支持此假設(圖18A及18B)。然而，總體而言，在NHP#3中觀測到比在NHP#1中更高轉殖基因表現量(圖17E及17F)。一起採用mgmtP140K mRNA及抗體資料，吾人可推測每當mgmtP140K 含量增加(例如O6 BG/BCNU之後)時，存在更多不能完全由他克莫司控制之免疫刺激。當中斷他克莫司2週(在第15週至第17週)時，抗MGMT抗體含量增加，且用MMF及CTLA4-Ig(阿巴西普)之額外治療僅部分地抵消免疫反應。值得注意地，三重免疫抑制劑治療使γ-血球蛋白及mgmtP140K 表現之進一步下降停止(第22週-第28週)。圖18A及18B亦顯示，NHP#1中之更積極免疫抑制方案(他克莫司/西羅莫司/MMF)可減低抗MGMT免疫反應。
此研究之未來NHP實施例可包括以下中之一或多者：i)用此突變型之恆河猴型式置換人類mgmtP140K 基因(參見例如圖18C)及ii)在第-1天、第7天、第14天且接著每月投與阿巴西普，以觸發一些程度的對外源轉殖基因產物之耐受性。重要地，針對人類轉殖基因產物之免疫反應不應為人類之問題。
恆河猴紅血球上之 CD46 。不同於人類，恆河猴紅血球在其表面上具有CD46 (圖28A)。配位體(包括HAd5/35++)結合至CD46導致CD46之胞外域脫落(Sakurai等人, Gene Ther. 14(11): 912-919, 2007)。考慮到血液中紅血球之巨大數目，NHP中之紅血球產生對於靜脈內注射之HDAd5/35++載體粒子之非特異性螯隔/損失的主要彙集點(sink)。其亦使得難以進行「載體劑量-反應」研究。支持恆河猴紅血球可阻斷活體外HDAd5/35++注射之資料示於圖28B中。另一方面，Zafar等人(Cancer Gene Therapy , 2020, doi.org/10.1038/s4147-020-00226-z)之最新資料指示與紅血球之Ad結合係可逆的。HDAd基因體之緩慢(雙相)血清清除(圖19A-19C)及在HDAd注射之後血清中sCD46濃度之變化(圖28C)可指示此觀測結果為正確的。然而，為了使紅血球上之CD46飽和，在兩個週期中注射高載體劑量。因為急性反應可控制，所以將遵循此路線。
總之，此實例尤其證明，IL-1信號抑制劑(例如阿那白滯素)為抑制對腺病毒載體投與之活體內免疫反應的強力藥劑，可與諸如IL-6信號抑制劑(例如托珠單抗)及/或皮質類固醇(例如地塞米松)之其他藥劑組合使用，且可將對例示性腺病毒載體(HDAd5/35++)之先天性免疫反應完全鈍化。此證明IL-1及/或IL-6驅動對於此等載體之先天性反應之作用。此實例進一步證明：用HDAd5/35++進行之活體內HSC轉導可在適當免疫抑制情況下安全地在經動員NHP中進行；5% CFU經穩定轉導(在活體內選擇之前)；周邊血球中之轉殖基因標記/表現可藉由活體內選擇提高；藉由完全完整免疫系統，且CRISPR/Cs9編輯之細胞可隨時間推移損失。
實例 6 ： 針對血紅素病變之活體內 HSC 基因療法 ： 包括病毒載體、支持載體、免疫抑制方案、選擇劑及幹細胞動員方案之恆河猴中的活體內基因療法。
本實例進一步說明使用包括托珠單抗、阿那白滯素及地塞米松之免疫抑制方案。除了如本文另外所指出之外，試劑及實驗設計如同實例5。托珠單抗為例示性IL-6受體拮抗劑，阿那白滯素為例示性IL-1受體拮抗劑，且地塞米松為例示性皮質類固醇。本發明包括以下認識：IL-6受體拮抗劑(例如托珠單抗)及IL-1受體拮抗劑(例如阿那白滯素)之組合(視情況進一步與皮質類固醇(例如地塞米松)組合)為出乎意料地強力組合，用於抑制例如出於活體內基因療法之目的以其他方式由向哺乳動物投與病毒載體(例如腺病毒載體)產生之細胞介素含量(尤其IL-6及/或TNF)的增加。向本發明之非人類靈長類動物投與托珠單抗、阿那白滯素及地塞米松。在向NHP投與額外藥劑之情況下，熟習此項技術者應瞭解，此類額外藥劑並非為與向哺乳動物投與病毒載體有關之細胞介素含量之有益抑制所必需的。舉例而言，投與他克莫司以抑制後天性免疫反應。
向哺乳動物個體全身性投與病毒載體(例如投與腺病毒載體)之主要風險為先天性免疫系統之活化。急性先天性免疫反應在載體遞送之後不久(亦即數分鐘至數小時)發生且為劑量依賴性的。舉例而言，血清IL-6之升高可在全身性投與腺病毒載體後1小時時提昇且在投與後3至6小時達到峰值含量。此先天性免疫反應可構成或引起急性毒性；細胞介素含量之增加可包括細胞介素風暴，其可導致死亡。
本實例包括如下發現：阿那白滯素、托珠單抗及地塞米松減弱先天性免疫活化，實質上減少藉由靜脈內投與Ad5/35++引起之細胞介素釋放。向NHP#4及NHP#5投與包括托珠單抗、阿那白滯素及地塞米松之免疫抑制方案(參見表6)。在HDAd給藥之前半小時投與阿那白滯素。如根據可用資訊所估計，達到峰值血清阿那白滯素濃度之時間在皮下投與後2.5至4.5小時之間。NHP#4及NHP#5中所量測之IL-6含量確認藉由所投與之藥劑抑制IL-6含量(圖29及31)。NHP#4及NHP#5中所量測之TNF含量確認藉由所投與之藥劑抑制TNF含量(圖30及32)。因此，本實例確認，如藉由IL-6及/或TNF含量所量測，投與阿那白滯素、托珠單抗及地塞米松對抑制先天性免疫反應為有效的。表 6 ： 免疫抑制方案
天 所投與之免疫抑制劑及劑量
NHP#4 NHP#5
-6      
-5      
-4      
-3      
-2 地塞米松(4.0 mg/kg靜脈內)每天一次 地塞米松(4.0 mg/kg靜脈內)每天一次
-1* 地塞米松(4.0 mg/kg)每天兩次 托珠單抗(8.0 mg/kg靜脈內)每天兩次 阿那白滯素(50 mg/動物，皮下)每天兩次 地塞米松(4.0 mg/kg)每天兩次 托珠單抗(8.0 mg/kg靜脈內)每天兩次 阿那白滯素(50 mg/動物，皮下)每天兩次
0* 地塞米松(4.0 mg/kg靜脈內)每天兩次 托珠單抗(8.0 mg/kg靜脈內)每天兩次 阿那白滯素(50 mg/動物，皮下)每天兩次 地塞米松(4.0 mg/kg靜脈內)每天兩次托珠單抗(8.0 mg/kg靜脈內)每天兩次阿那白滯素(50 mg/動物，皮下)每天兩次
1 阿那白滯素(50 mg/動物，皮下)每天一次   
2 阿那白滯素(50 mg/動物，皮下)每天一次 阿那白滯素(50 mg/動物，皮下)每天一次
*投與腺病毒載體之日
其他實施例。 雖然已描述多種實施例，但顯而易見，本發明及實例可提供利用本文所描述之組合物及方法或由本文所描述之組合物及方法涵蓋之其他實施例。因此，應瞭解範疇應由以下定義：可根據本發明及隨附申請專利範圍而非藉由已借助於實例表示之特定實施例來理解。本文中引用之所有參考文獻均以引用之方式併入本文中。序列概述
本文所描述之核酸及/或胺基酸序列使用標準字母縮寫顯示，如37 C.F.R. §1.822中所定義。具有4 KB之檔案大小之於或約於2021年4月9日創建之題為「F053-0131PCT_SeqList.txt (Sequence Listing.txt)」的電腦可讀文字檔案含有本申請案之序列表且以全文引用之方式併入本文中。
在隨附序列表中，SEQ ID NO: 1為阿那白滯素之胺基酸序列，如下： MRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE
圖 1 係例示性輔助依賴型腺病毒(HDAd)支持載體(頂部)及例示性HDAd病毒基因療法載體(底部)之示意性圖示。支持載體編碼(i)可操作地連接於EF1α啟動子之Flpe重組酶及(ii)可操作地連接於PGK啟動子之轉座酶(SB100x)，此兩種酶安置於腺病毒反向末端重複序列(ITR)之間。填充片段亦包括於支持載體中以產生具有藉由腺病毒有效封裝之大小的病毒載體基因體。病毒基因療法載體包括治療性有效負載，其包括編碼治療蛋白(rh γ-血球蛋白)之核酸序列，該治療蛋白可操作地連接於β-血球蛋白啟動子及β-血球蛋白基因座控制區(LCR)兩者，且進一步可操作地連接於3'UTR及雞超敏位點4 (cHS4；雞β樣血球蛋白基因簇)調節區。病毒基因療法載體進一步(視情況)包括編碼MGMTP140K 可篩選標記之核酸序列，該標記可操作地連接於PGK啟動子及polyA序列(PA)。治療性有效負載側接有作為SB100x轉位目標之反向重複序列(IR)，由此治療性有效負載可整合至宿主細胞基因體中。IR轉而側接有frt位點，其在暴露於Flpe時使側接之核酸環化，以促進治療性有效負載之轉位。病毒基因療法載體進一步包括腺病毒ITR。
圖 2 係病毒基因療法之例示性方法的示意性圖示，該病毒基因療法包括與本發明之免疫抑制方案組合使用之病毒基因療法載體。在此示意圖中，參考向個體投與病毒載體之最後一天來確定天數。
圖 3 係包括病毒基因療法載體之病毒基因療法的例示性選擇方案之示意性圖示，該病毒基因療法載體包括MGMTP140K 可篩選標記，使得使用O6 BG/BCNU之選擇選出表現及/或已整合可篩選標記之細胞。
圖 4 係例示性幹細胞動員方案之示意性圖示。在此示意圖中，參考向個體投與病毒載體之最後一天來確定天數。
圖 5 係病毒基因療法之例示性方法的示意性圖示，該病毒基因療法包括與免疫抑制方案、選擇方案及幹細胞動員方案組合之病毒基因療法載體。
圖 6 係例示性輔助依賴型腺病毒(HDAd)支持載體(頂部)及例示性HDAd病毒基因療法載體(底部)之示意性圖示。支持載體編碼(i)可操作地連接於EF1α啟動子之Flpe重組酶及(ii)可操作地連接於PGK啟動子之轉座酶(SB100x)，此兩種酶安置於腺病毒反向末端重複序列(ITR)之間。填充片段亦包括於支持載體中以產生具有藉由腺病毒有效封裝之大小的病毒載體基因體。病毒基因療法載體包括治療性有效負載，其包括編碼治療蛋白(rh γ-血球蛋白)之核酸序列，該治療蛋白可操作地連接於β-血球蛋白啟動子及β-血球蛋白基因座控制區(LCR)兩者，且進一步可操作地連接於3'UTR及雞超敏位點4 (cHS4；雞β樣血球蛋白基因簇)調節區。病毒基因療法載體進一步(視情況)包括編碼MGMTP140K 可篩選標記之核酸序列，該標記可操作地連接於EF1α啟動子。治療性有效負載側接有作為SB100x轉位目標之反向重複序列(IR)，由此治療性有效負載可整合至宿主細胞基因體中。IR轉而側接有frt位點，其在暴露於Flpe時使側接之核酸環化，以促進治療性有效負載之轉位。病毒基因療法載體進一步包括具有啟動子及編碼鹼基編輯CRISPR系統之核酸序列的獨立卡匣。病毒基因療法載體進一步包括腺病毒ITR。
圖 7A - 圖 7D .活體內HSC基因療法。圖7A說明代表性實施例中之活體內轉導，避免HSC收集及離體操作；不需要骨髓清除、調理或移植；且提供低成本載體製造。圖7B係顯示歷經26週研究在所指示之時間時六個動物中PMBC中GFP+細胞之百分比的圖式；紅色箭頭指示O6 BG/BCNU投與(給藥時程如圖7D中所說明)。圖7C顯示例示性HDAd-mgmt/GFP/HDAd-SB載體系統；mgmtP140K 提供耐藥性及基因修飾細胞之選擇性擴增機制。圖7D係用於活體內HSC基因療法之代表性給藥時程。AMD3100=普樂沙福(plerixafor)。
圖 8A - 8D .圖8A係例示性載體之示意圖。(圖8B) NHP#1之載體設計：HDAd5/35++組合。在CD46tg及Townes模型中得到驗證：相加性HbF表現(＞20%)。所示之Ad5/35「組合」供體載體使用CRISPR/Cas9靶向BCL11aE及HBG1/2 BCL11a抑制因子蛋白結合位點並且使用SB100x用於整合編碼hu-γ-血球蛋白及MGMTP140K 之轉位子。(圖8C) NHP#2之載體設計：所示之供體載體包括(i)用於將包括γ-血球蛋白及MGMTP140K 可篩選標記之有效負載靶向插入至AAVS1基因座的CRISPR/Cas9；及(ii)靶向HBG1/2 BCL11a抑制因子蛋白結合位點及BCL11aE的CRISPR/Cas9。(圖8D) NHP#3之載體設計：HDAd-rh組合。所示之Ad5/35「組合」供體載體包括(i)靶向HBG1/2 BCL11a抑制因子蛋白結合位點之CRISPR/Cas9；及(ii)用於將編碼rh-γ-血球蛋白及MGMTP140K 可篩選標記之有效負載進行整合的SB100x。所示之供體載體允許活體內選擇表現mgmtP140k 之經轉導細胞，LCR β-血球蛋白啟動子驅動外源性γ-血球蛋白及經由CRISPR/Cas9介導之對γ-血球蛋白啟動子之抑制因子結合區的破壞而重新激活內源性γ-血球蛋白。
圖 9A - 9D . HDAd5/35++載體優先轉導HSC(經由CD46)。
圖 10A - 10D .由G-CSF/AMD3100在恆河猴(rhesus macaques)中進行高效HSC動員。將HDAd注射至經動員之恆河猴中。(圖10A)GCSF、AMD3100及HDAd注射之時間安排。圖10B-10D 周邊血液中之原始(CD34+/CD45RA-/CD90+) HSC之數目。在兩個動員峰值時注射HDAd。(圖10B) NHP#1中之載體給藥為保守的(0.5至1.65×1012 vp/kg)。(圖10C) NHP#2之HDAd劑量均為1.6×1012 vp/kg。(圖10D) NHP#3中之HDAd劑量，顯示HDAd之第二次劑量有減少，但此減少係基於隨後被發現為錯誤的嗜中性白血球計數。
圖 11A -11C .圖11A說明在靜脈內腺病毒載體注射及藥理學干預之後的先天性免疫反應。圖11B為給藥時程；且圖11C係說明在小鼠中進行地塞米松處理導致鈍化的細胞介素反應之圖。
圖 12A - 12E .細胞介素預防：使用細胞學珠陣列法量測恆河猴血清細胞介素含量。僅IL-6 (圖12A-12C)及TNFα (圖12D、12E)可偵測。添加托珠單抗(抗IL6R)及阿那白滯素(IL1R拮抗劑)進一步減少血清IL-6及TNFα。(圖12A-12C)血清IL-6。(圖12D、12E)血清TNFα。TNFα在NHP#2 (+托珠單抗(Toci)、+阿那白滯素)中不可偵測
圖 13A - 13D .在靜脈內HDAd5/35++注射之後在(圖13A、13B)小鼠或(圖13C、13D)恆河猴中不存在肝毒性。顯示小鼠中幾乎沒有或沒有藉由HDAd5/35++轉導肝臟，且小鼠及NHP中之肝酶AST及ALT之血清含量並無升高。此為重要毒性讀數且顯示HDAd5/35++具有極少肝毒性。在HDAd5/35++中，短Ad35纖維軸防止因子X結合於六鄰體且因此防止肝細胞轉導。
圖 14A - 14C .5%原始HSC (CFU)在活體內選擇之前穩定地轉導(NHP#3)。圖14A概述CFU分析之方案。原始HSC藉由HDAd5/35++轉導(早期均為游離型)，其中在第四週選擇之前僅有5%原始HSC經轉導(穩定整合)，在恆河猴中在用單輪O6 BG及BCNU處理之後，在第8週增加至10% (NHP#3)。
圖 15A - 15C 。活體內選擇後：在周邊紅血球中有90% γ-血球蛋白標記(NHP#1)。(圖15A、15B)對於周邊RBC上γ-血球蛋白(恆河猴+人類)(圖15A)及骨髓抽吸物(BMA)中紅血球系祖細胞(圖15B)之流式細胞量測術。向下箭頭指示O6 BG/BCNU處理。圖15C顯示在三輪O6 BG及BCNU處理之後，用人類γ血球蛋白對恆河猴RBC之100%標記(NHP#1)。此等結果證實選擇方案奏效。
圖 16A - 16I .針對HDAd5/35++載體及轉殖基因產物之抗體反應。對於NHP#1(圖16A)及NHP#3(圖16B)，針對HDAd5/35++之血清抗體。基因體編輯酶之mRNA含量(圖16G SB100x；圖16H Flpe；圖16I Cas9)及針對此等酶之血清抗體(圖16D抗Flpe抗體；圖16E抗SB100x抗體；及圖16F抗Cas9血清抗體)以及針對GFP+之血清抗體(圖16C)(NHP#1)。在NHP#3中，表現與免疫反應動力學均類似(未圖示)。此等資料顯示對於病毒基因療法衣殼及由轉殖基因編碼之外源性GFP報導體的典型熟知抗體反應。相比之下，發現針對Flpe、SB或Cas9之抗體反應極少或沒有，此進一步支持此系統中之安全及長期轉殖基因表現。
圖 17A - 17F .針對轉殖基因產物之免疫反應引起轉導細胞之損失(NHP#3)。藉由流式細胞量測術分析γ-血球蛋白表現。(圖17A) RBC。(圖17B)骨髓抽吸物。圖17C顯示代表性標繪圖。箭頭指示O6 BG/BCNU處理。(圖17E、17F)較高轉殖基因表現量存在於NHP#3中。此等資料顯示，表現人類γ血球蛋白之恆河猴RBC之損失伴隨PBMC中之人類MGMTp140K 表現之損失，其似乎係由於針對恆河猴模型中人類MGMTP140K 之抗體反應。此很可能係由於與NHP#1相比，NHP#3中γ血球蛋白及MGMT表現之高含量。在NHP#1中未發現γ血球蛋白及MGMT表現之損失。
圖 18A - 18C .針對NHP#3(圖18A)及NHP#1(圖18B)中重組人類MGMT蛋白之血清抗體(IgG及IgM)力價。(圖18C)接下來為載體：恆河猴γ-血球蛋白及mgmtP140K 。在NHP#1中，抗MGMT反應藉由在該研究過程期間連續暴露至免疫抑制劑而被鈍化。當停止使用他克莫司時，NHP#3中之抗MGMT抗體增加。
圖 19A - 19C .載體自血液清除。藉由qPCR量測血清樣本中之載體基因體。
圖 20A - 20B .重量及血液資料。對於血液資料，正常範圍以透明灰色顯示。
圖 21A - 21C .細胞骨髓組合物。(圖21A、21B)：譜系+細胞(CD20、CD3、CD14)及HSC (CD34)之百分比。CD34細胞(NHP#3)單獨示於圖21C中。
圖 22 .每個細胞的載體複本數(藉由qPCR用人類mgmtP140K引子量測)。在最後HDAd注射之後第3天採集組織。膽囊、空腸、肺及肝含有大量血液。
圖 23A - 23C .在NHP#1 (圖23A)、NHP#2 (圖23B)及NHP#3 (圖23C)中，PBMC中之載體複本數。
圖 24A - 24D .CD34+細胞之優先轉導。顯示HDAd注射之後第3天及第8天來自總骨髓單核細胞(MNC)及骨髓CD34+細胞之VCN/細胞。右圖顯示mgmtP140K mRNA含量。(mgmt基因處於廣泛活性EF1α啟動子之控制下)。
圖 25A 、 25B .載體陽性祖細胞群落之百分比。將CD34+細胞塗鋪用於祖細胞群落分析。塗鋪之後12天，收集約100個單一群落且使用mgmtP140K 特異性引子藉由qPCR分析基因體DNA。
圖 26A - 26C .人類γ-血球蛋白及mgmtP140K 轉殖基因表現。(圖26A)藉由HPLC量測之人類γ-血球蛋白含量。HPLC可區分恆河猴及人類γ-血球蛋白鏈。(圖26B)代表性HPLC。(圖26C)藉由qRT-PCR量測之人類mgmtP140K mRNA表現。注意類似動力學。
圖 27A 、 27B .恆河猴γ-血球蛋白之表現及目標位點之CRISPR裂解。
圖 28A - 28C .HDAd5/35++藉由存在於恆河猴紅血球上之CD46之潛在螯合。(圖28A)流式細胞量測術結果支持CD46tg小鼠及恆河猴作為適合模型以評估基於Ad35之載體的轉導。(圖28B)為了測試此假設，藉由Ad5/35++ GFP載體及添加來自不同動物物種及模型之全血進行活體外轉導研究。簡言之，自人類、恆河猴、CD46tg小鼠及C57Bl/6小鼠在EDTA中收集全血。將EDTA全血接著用PBS洗滌，集結且再懸浮於細胞培養基(杜爾貝科氏經改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)[DMEM]/胎牛血清[FCS])中。將全血添加至HEK293細胞中且將細胞用Ad5/35++ GFP載體以如下MOI轉導：0、10、100、250、500及1000。1小時後，將293細胞用PBS洗滌且添加新鮮培養基。在24小時時藉由流式細胞量測術針對GFP陽性細胞分析載體轉導效率。(圖28C)在NHP#2及NHP#3中靜脈內HDAd5/35++注射之後血清中可溶性/脫落CD46含量。
圖 29 .使用細胞學珠陣列法量測恆河猴血清細胞介素含量。顯示NHP#4之血清IL-6 (pg/mL)含量。沿X軸指示相關日期及時間。箭頭指示腺病毒載體之投與。
圖 30 .使用細胞學珠陣列法量測恆河猴血清細胞介素含量。顯示NHP#4之TNFα (pg/mL)含量。沿X軸指示相關日期及時間。箭頭指示腺病毒載體之投與。
圖 31 .使用細胞學珠陣列法量測恆河猴血清細胞介素含量。顯示NHP#5之血清IL-6 (pg/mL)含量。沿X軸指示相關日期及時間。箭頭指示腺病毒載體之投與。
圖 32 .使用細胞學珠陣列法量測恆河猴血清細胞介素含量。顯示NHP#5之TNFα (pg/mL)含量。沿X軸指示相關日期及時間。箭頭指示腺病毒載體之投與。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002

Claims (51)

  1. 一種在哺乳動物個體中進行活體內基因療法之方法，該方法包含： (i)向該個體投與包含發炎性信號抑制劑之免疫抑制方案；及 (ii)向該個體投與病毒基因療法載體至少一次劑量。
  2. 一種轉導哺乳動物個體之幹細胞而不從該個體移除該等幹細胞之方法，該方法包含向已被投與包含發炎性信號抑制劑之免疫抑制方案的個體遞送病毒基因療法載體。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該發炎性信號抑制劑為介白素-1 (interleukin-1；IL-1)信號抑制劑，視情況其中該IL-1信號抑制劑為IL-1受體(IL-1R)拮抗劑。
  4. 如請求項3之方法，其中該IL-1R拮抗劑為阿那白滯素(anakinra)。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該免疫抑制方案進一步包含介白素6 (IL-6)受體拮抗劑。
  6. 如請求項5之方法，其中該IL-6受體拮抗劑為托珠單抗(tocilizumab)。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該免疫抑制方案進一步包含皮質類固醇。
  8. 如請求項7之方法，其中該皮質類固醇為地塞米松(dexamethasone)。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該免疫抑制方案進一步包含鈣調神經磷酸酶(calcineurin)抑制劑。
  10. 如請求項9之方法，其中該鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司(tacrolimus)。
  11. 如請求項1至10中任一項之方法，其中該免疫抑制方案進一步包含TNF-α信號抑制劑。
  12. 如請求項11之方法，其中該TNF-α信號抑制劑係選自由以下組成之群：依那西普(etanercept)、英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、聚乙二醇化賽妥珠單抗(certolizumab)及戈利木單抗(golimumab)。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中該免疫抑制方案進一步包含JAK信號抑制劑。
  14. 如請求項13之方法，其中該JAK信號抑制劑係選自由以下組成之群：巴瑞替尼(baricitinib)、托法替尼(tofacitinib)、魯索利替尼(ruxolitinib)及非戈替尼(filgotinib)。
  15. 如請求項1至12中任一項之方法，其中該免疫抑制方案之投與包含在以下時間向該個體投與IL-1受體拮抗劑： (i)在投與該載體第一次劑量的前一天； (ii)在投與該載體第一次劑量的當天，視情況包括在投與該載體第一次劑量之前1至3小時，投與至少一次劑量之IL-1受體拮抗劑； (iii)在投與該載體一或多次後續劑量的當天，視情況包括在投與該載體一或多次後續劑量之前1至3小時，投與至少一次劑量之IL-1受體拮抗劑； (iv)在介於投與該載體第一次劑量的當天與投與該載體最後一次劑量的當天之間的每一天；及/或 (v)在投與該載體最後一次劑量的當天之後的一天、兩天或更多天中之每一天； 視情況其中該IL-1受體拮抗劑為阿那白滯素。
  16. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包含向該個體每天投與單次劑量之IL-1受體拮抗劑或每天投與複數次劑量之IL-1受體拮抗劑，視情況其中該IL-1受體拮抗劑為阿那白滯素。
  17. 如請求項15之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包含向該個體投與0.01至20 mg/kg/天之阿那白滯素，視情況其中該投與為靜脈內或皮下投與。
  18. 如請求項15之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包含向該個體投與10至200 mg/天之阿那白滯素，視情況其中該投與為靜脈內或皮下投與。
  19. 如請求項1至18中任一項之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包含在以下時間向該個體投與IL-6受體拮抗劑： (i)在投與該載體第一次劑量的前一天； (ii)在投與該載體第一次劑量的當天，視情況包括在投與該載體第一次劑量之前不超過1小時，投與至少一次劑量之IL-6受體拮抗劑； (iii)在投與該載體一或多次後續劑量的當天，視情況包括在投與該載體一或多次後續劑量之前不超過1小時，投與至少一次劑量之IL-6受體拮抗劑； (iv)在介於投與該載體第一次劑量的當天與投與該載體最後一次劑量的當天之間的每一天；及/或 (v)在投與該載體最後一次劑量的當天之後的一天、兩天或更多天中之每一天； 視情況其中該IL-6受體拮抗劑為托珠單抗。
  20. 如請求項1至19中任一項之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包含向該個體每天投與單次劑量之IL-6受體拮抗劑或每天投與複數次劑量之IL-6受體拮抗劑，視情況其中該IL-6受體拮抗劑為托珠單抗。
  21. 如請求項19或20之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包含向該個體投與1至15 mg/kg/天之托珠單抗或5至200 mg/天之托珠單抗，視情況其中該投與為靜脈內投與。
  22. 如請求項1至21中任一項之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包含在以下時間向該個體投與皮質類固醇： (i)在投與該載體第一次劑量的前一天； (ii)在投與該載體第一次劑量的當天； (iii)在投與該載體一或多次後續劑量的當天； (iv)在介於投與該載體第一次劑量的當天與投與該載體最後一次劑量的當天之間的每一天；及/或 (v)在投與該載體最後一次劑量的當天之後的一天、兩天或更多天中之每一天； 視情況其中該皮質類固醇為地塞米松、普賴蘇(prednisone)、普賴蘇穠(prednisolone)、甲基普賴蘇穠(methylprednisolone)、曲安西龍(triamcinolone)、帕拉米松(paramethasone)或貝皮質醇(betamethasone)。
  23. 如請求項11至22中任一項之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包含向該個體每天投與單次劑量之皮質類固醇或每天投與複數次劑量之皮質類固醇，視情況其中該皮質類固醇為地塞米松。
  24. 如請求項22或23之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包含向該個體投與0.1至10 mg/kg/天之地塞米松，視情況其中該投與為靜脈內、經口或肌內投與。
  25. 如請求項1至24中任一項之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包含在以下時間向該個體投與鈣調神經磷酸酶抑制劑： (i)在投與該載體第一次劑量的前四天中之每一天； (ii)在投與該載體第一次劑量的當天； (iii)在投與該載體一或多次後續劑量的當天；及/或 (iv)在介於投與該載體第一次劑量的當天與投與該載體最後一次劑量的當天之間的每一天；及/或 (v)在投與該載體最後一次劑量的當天之後的一天、兩天或更多天中之每一天； 視情況其中該鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司。
  26. 如請求項1至25中任一項之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包含向該個體每天投與單次劑量之鈣調神經磷酸酶抑制劑或每天投與複數次劑量之鈣調神經磷酸酶抑制劑，視情況其中該鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司。
  27. 如請求項25或26之方法，其中該免疫抑制方案之該投與包含向該個體投與0.001至0.1 mg/kg/天之他克莫司，視情況其中該投與為皮下投與。
  28. 如請求項1至27中任一項之方法，其中該方法與不包含一或多種免疫抑制劑的對照相比，(i)並未引起IFN-g、TNF、IL-2、IL-4、IL-5或IL-6中之一或多者之量的顯著增加；或(ii)引起IFN-g、TNF、IL-2、IL-4、IL-5或IL-6中之一或多者的量顯著較小增加，視情況其中該對照不包含選自以下之一或多種免疫抑制劑：(a)該發炎性信號抑制劑；(b)該IL-6受體拮抗劑；(c)該皮質類固醇；及(d)該鈣調神經磷酸酶抑制劑；視情況其中該量係藉由ELISA或細胞介素珠陣列法來量測。
  29. 如請求項1至28中任一項之方法，其中該方法進一步包含向該個體投與幹細胞動員方案(stem cell mobilization regimen)。
  30. 如請求項1至29中任一項之方法，其中該載體包含編碼可篩選標記之核酸序列，視情況其中該可篩選標記為MGMTP140K 。
  31. 如請求項30之方法，其中該方法包含向該個體投與選擇劑，視情況其中該可篩選標記為MGMTP140K 且該選擇劑為O6 BG/BCNU。
  32. 如請求項30或31之方法，其中該選擇劑係向該個體投與一或多次劑量，視情況其中，該選擇劑第一次劑量係在向該個體投與該載體第一次劑量之後約1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週及/或10週向該個體投與。
  33. 如請求項1至32中任一項之方法，其中該載體係藉由注射向該個體投與，視情況其中該注射為靜脈內或皮下注射。
  34. 如請求項1至33中任一項之方法，其中至少該載體第一次劑量包含至少1E10、1E11或1E12病毒粒子/公斤(vp/kg)。
  35. 如請求項1至34中任一項之方法，其中該載體以至少1E10、1E11、1E12、2E12或3E12 vp/kg之總劑量投與。
  36. 如請求項1至35中任一項之方法，其中該載體為腺病毒載體、腺相關病毒載體、單純疱疹病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體、α病毒載體、黃病毒載體、棒狀病毒(rhabdoviral)載體、麻疹病毒載體、新城雞瘟(Newcastle disease)病毒載體、痘病毒載體或微小RNA病毒(picornaviral)載體。
  37. 如請求項1至36中任一項之方法，其中該載體為腺病毒載體。
  38. 如請求項1至37中任一項之方法，其中該載體為B族腺病毒載體。
  39. 如請求項1至38中任一項之方法，其中該載體為或衍生自Ad5/35或Ad35腺病毒載體，視情況其中該載體為Ad35++ 或Ad5/35++ 腺病毒載體。
  40. 如請求項1至39中任一項之方法，其中該載體為不具有複製能力的載體，視情況其中該不具有複製能力的載體為輔助依賴性腺病毒載體。
  41. 如請求項1至40中任一項之方法，其中病毒基因療法載體包含含有治療性有效負載之核酸，且其中該方法進一步包含向該個體投與支持載體，該支持載體編碼有助於將該治療性有效負載整合至目標細胞基因體中之藥劑。
  42. 如請求項41之方法，其中將該支持載體與該病毒基因療法載體一起向該個體投與。
  43. 如請求項41或42之方法，其中該支持載體係投與1E9至1E14病毒粒子/公斤(vp/kg)之總劑量。
  44. 如請求項1至43中任一項之方法，其中該病毒基因療法載體包含含有治療性有效負載之核酸，且其中該方法使得該治療性有效負載遞送至幹細胞，視情況其中該治療性有效負載之遞送包含將該治療性有效負載整合至該等幹細胞之基因體中。
  45. 如請求項1至44中任一項之方法，其中該病毒基因療法載體包含含有編碼蛋白質之治療性有效負載的核酸，且在向該個體投與該載體之後，該個體至少約70%、約80%或約90%之PBMC表現該蛋白質。
  46. 如請求項1至45中任一項之方法，其中該個體為人類個體。
  47. 如請求項46之方法，其中該人類個體罹患鐮狀細胞貧血、地中海型貧血、中間型地中海貧血、A型血友病、B型血友病、馮威里氏病(von Willebrand Disease)、第五因素缺陷、第七因素缺陷、第十因素缺陷、第十一因素缺陷、第十二因素缺陷、第十三因素缺陷、伯納德-蘇里爾症候群(Bernard-Soulier Syndrome)、灰色血小板症候群(Gray Platelet Syndrome)。
  48. 如請求項1至47中任一項之方法，其中在投與至少一次劑量之該病毒基因療法載體之後，基於該個體或來自該個體之樣本中免疫毒性生物標記之所量測含量，使該免疫抑制方案中之一或多種免疫抑制劑之給藥方案在單位劑量、每日劑量、總劑量、劑量頻率及/或劑量總數方面增加，其中若該所量測含量指示免疫毒性，則增加該一或多種免疫抑制劑之該給藥方案。
  49. 如請求項48之方法，其中該免疫毒性生物標記係選自由以下組成之群：IL-Iβ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-23、IL-27、IL-30、IL-36 IL-1Ra、IL-2R、IFN-a、IFN-b、IFN-γ、MIP-Ia、MIP-Iβ、MCP-1、TNF-α、TNF-β GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、VEGF、RANTES、EGF、HGF、FGF-β、CD40、CD40L、C反應蛋白、降鈣素原、鐵蛋白、D-二聚體、淋巴球總群、淋巴球亞群、個體溫度及其組合。
  50. 如請求項1至49中任一項之方法，其中，在投與至少一次劑量之該病毒基因療法載體之後，基於該個體或來自該個體之樣本中針對該病毒基因療法載體之抗體之所量測含量，使該免疫抑制方案中之一或多種免疫抑制劑之該給藥方案在單位劑量、每日劑量、總劑量、劑量頻率及/或劑量總數方面增加，其中若該所量測含量指示免疫毒性，則增加該一或多種免疫抑制劑之該給藥方案，視情況其中該所量測含量為抗體力價，及視情況其中該等抗體為中和抗體。
  51. 如請求項48至50中任一項之方法，其中該免疫抑制方案中之該一或多種免疫抑制劑之該給藥方案包括具有以下中之一或多者的給藥方案： (i)介白素-1 (IL-1)信號抑制劑，視情況其中該IL-1信號抑制劑為阿那白滯素； (ii)IL-6信號抑制劑，視情況其中該IL-6信號抑制劑為托珠單抗； (iii)皮質類固醇，視情況其中該皮質類固醇為地塞米松；及 (iv)鈣調神經磷酸酶抑制劑，視情況其中該鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司。
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