TW202143950A

TW202143950A - 可溶性石蓴多醣微針

Info

Publication number: TW202143950A
Application number: TW109117298A
Authority: TW
Inventors: 黃意真; 李亦淇; 佳欣陳
Original assignee: 國立臺灣海洋大學
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2020-05-25
Publication date: 2021-12-01
Also published as: CN113712896A; TWI748476B

Abstract

本發明涉及一種可溶性石蓴多醣微針貼片，包含一微針部以及一背板部，該微針部係以石蓴多醣所製成。

Description

可溶性石蓴多醣微針

本發明係關於一種經皮傳送活性物質的微針貼片，特別是一種含有石蓴多醣的微針貼片。

經皮輸藥系統(Transdermal drug delivery, TDD)利用皮膚作為門戶將生物活性物質或藥物輸送到體循環中，除了方便使用者使用之外，同時避免因口服用藥而由胃腸道引起的降解或首渡效應(first pass liver effects)。然而，經皮輸藥系統需要克服皮膚最外層的角質層屏障，以將生物活性物質或藥物輸送至體內。

微針技術是以具有微小尺寸的針在皮膚中形成可逆的微小通道，以將不能滲透至皮膚內的各種大分子藥物或活性物質輸送至體內，故能有效促進輸送效率。然而，以金屬或矽所製備的微針，除了可能刺激受試者皮膚內的神經而造成受試者的不適外，也可能在皮膚內脫落而變成尖銳的生物危害廢物，因此有安全上的疑慮。

可溶性微針(dissolving microneedle)為利用水溶性或生物可降解高分子為材料所製成的微針。這類型的微針將藥物或活性物質包覆其中，待微針穿刺皮膚角質層後，藉由微針的融化而釋放出藥物或活性物質，因此不會有金屬或矽所製成的微針在皮膚中脫落所造成的安全問題。

然而，可溶性微針常有機械強度不足的問題，無法有效穿透皮膚的角質層。此外，可溶性微針的溶解速率也會影響藥物傳輸的時間與效率，若微針溶解的速率太慢，可能不利於藥物的傳輸。再者，大多數的可溶性微針僅為載體，需包覆有效成分才能發揮效用，增加製作程序的複雜度及不確定性。因此，仍需開發改良上述缺點的可溶性微針。

於一方面，本發明涉及一種石蓴多醣用於製備滲透皮膚用的微針之用途。

於另一方面，本發明涉及一種可溶性石蓴多醣微針，係以石蓴多醣所製成。

於又一方面，本發明涉及一種製備可溶性石蓴多醣微針的方法。

於再一方面，本發明涉及一種可溶性石蓴多醣微針貼片，包含一微針部以及一背板部，該微針部係以石蓴多醣所製成。

於又一方面，本發明涉及一種製備可溶性石蓴多醣微針貼片的方法。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。

本發明以石蓴多醣作為可溶性微針的材料，不僅具有足夠的機械強度，可有效穿透皮膚的角質層，且本發明之可溶性石蓴多醣微針的溶解速率快，有利於藥物的傳輸。更重要的是，石蓴多醣本身具有抗氧化、抗發炎、抗腫瘤等生物活性，不僅只是作為載體，本身即為有效成分，不需包覆其他活性成分即可發揮效用。

因此，本發明提供一種石蓴多醣用於製備滲透皮膚用的微針之用途。

本發明並提供一種可溶性石蓴多醣微針，係以石蓴多醣所製成。

本發明並提供一種可溶性石蓴多醣微針貼片，包含一微針部以及一背板部，該微針部係以石蓴多醣所製成。

於某些具體實施例中，該可溶性石蓴多醣微針係以約3.5~6.5% (w/v)的石蓴多醣溶液所製成，較佳為約3.5%、約3.6%、約3.7%、約3.8%、約3.9%、約4.0%、約4.1%、約4.2%、約4.3%、約4.4%、約4.5%、約4.6%、約4.7%、約4.8%、約4.9%、約5.0%、約5.1%、約5.2%、約5.3%、約5.4%、約5.5%、約5.6%、約5.7%、約5.8%、約5.9%、約6.0%、約6.1%、約6.2%、約6.3%、約6.4%、約6.5% (w/v)，或為約3.5~6.5% (w/v) 任一濃度，不限為整數之濃度，例如，但不限於4.56% (w/v)；於某些較佳具體實施例中，該可溶性石蓴多醣微針係以約4%、約5%，或約6%的石蓴多醣所製成。

於某些具體實施例中，該背板部可由，但不限於，以下材料之一所製成：一澱粉(starch)與明膠(gelatin)之組合材料、一聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)與蔗糖(sucrose)之組合材料、一幾丁聚醣(chitosan)，以及一聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone, PVP)與羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose, CMC)之組合材料。

於某些具體實施例中，該背板部係以該聚乙烯吡咯烷酮(PVP)與羧甲基纖維素鈉(CMC)之組合材料(PVP/CMC)所製成。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可加強背板的硬度，而羧甲基纖維素鈉(CMC)可加強背板的彈性；二者的比例可依實際需求調整。於某些具體實施例中，該PVP/CMC的比例為約1:10至約10:1 (w/w)，較佳為約1:1、約1:2、約1:3、約1:4、約1:5、約1:6、約1:7、約1:8、約1:9、約1:10、約2:1、約3:1、約4:1、約5:1、約6:1、約7:1、約8:1、約9:1、約10:1 (w/w)，或為約1:10至約10:1 (w/w)任一比例，不限為整數之比例，例如，但不限於1:3.56 (w/w)；於某些較佳具體實施例中，該PVP/CMC的比例為約1:4 (w/w)。

於某些具體實施例中，該溶液還包含其他生物活性物質。

本發明並提供一種製備可溶性石蓴多醣微針的方法，包含下列步驟：(i) 提供一微針模具，該微針模具包含一微針部模具，該微針部模具包含一針尖部模具以及一針底部模具；(ii) 將一包含約3.5~6.5% (w/v)石蓴多醣的溶液加至該微針部模具中，使該包含約3.5~6.5% (w/v)石蓴多醣的溶液乾燥形成一微針部；以及(iii) 將該微針部與該微針模具分離，以得到該可溶性石蓴多醣微針。

本發明並提供一種製備可溶性石蓴多醣微針貼片的方法，包含下列步驟：(i) 提供一微針模具，該微針模具包含一微針部模具以及一背板部模具，該微針部模具包含一針尖部模具以及一針底部模具，該背板部模具與該針底部模具相連；(ii) 將一包含約3.5~6.5% (w/v)石蓴多醣的溶液加至該微針部模具中，使該包含約3.5~6.5% (w/v)石蓴多醣的溶液乾燥形成一微針部；(iii) 將一背板部材料溶液加至該微針模具的該背板部模型中，使該背板部材料溶液乾燥形成一背板部；以及(iv) 將該微針部連同該背板部與該微針模具分離，以得到該可溶性石蓴多醣微針貼片。

於某些具體實施例中，該溶液中的石蓴多醣濃度為約3.5~6.5% (w/v)，較佳為約3.5%、約3.6%、約3.7%、約3.8%、約3.9%、約4.0%、約4.1%、約4.2%、約4.3%、約4.4%、約4.5%、約4.6%、約4.7%、約4.8%、約4.9%、約5.0%、約5.1%、約5.2%、約5.3%、約5.4%、約5.5%、約5.6%、約5.7%、約5.8%、約5.9%、約6.0%、約6.1%、約6.2%、約6.3%、約6.4%、約6.5% (w/v)，或為約3.5~6.5% (w/v) 任一濃度，不限為整數之濃度，例如，但不限於4.56% (w/v)；於某些較佳具體實施例中，該溶液中的石蓴多醣濃度為約4%、約5%，或約6%。

於某些具體實施例中，該背板部材料為下列之一：一澱粉與明膠之組合材料、一聚乙烯醇(PVA)與蔗糖之組合材料、一幾丁聚醣，以及一聚乙烯吡咯烷酮(PVP)與羧甲基纖維素鈉(CMC)之組合材料。

於某些具體實施例中，該背板部材料為該聚乙烯吡咯烷酮(PVP)與羧甲基纖維素鈉(CMC)之組合材料，且該聚乙烯吡咯烷酮(PVP)與羧甲基纖維素鈉(CMC)的組合物溶液的比例為約1:10至約10:1 (w/w)，較佳為約1:1、約1:2、約1:3、約1:4、約1:5、約1:6、約1:7、約1:8、約1:9、約1:10、約2:1、約3:1、約4:1、約5:1、約6:1、約7:1、約8:1、約9:1、約10:1 (w/w)，或為約1:10至約10:1 (w/w)任一比例，不限為整數之比例，例如，但不限於1:3.56 (w/w)；於某些較佳具體實施例中，該PVP/CMC的比例為約1:4 (w/w)。

除非另有定義，本文使用的所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域中的技術人員所通常理解相同的含義。

如本文所用，除非上下文另有明確規定，單數形式「一」、「一個」，以及「該」包括複數參照物。因此，例如，提及「一個部件」包括本領域技術人員已知的多個這樣的部件及其等同物。

如本文所用，「大約」、「約」或「近似」通常意指在給定值或範圍內的20%以內，較佳在10%以內，更佳在5%以內。本文所給之數量為近似值，其代表若無明確說明時，可以推斷是指術語「大約」、「約」或「近似」。

如本文所用，術語「石蓴多醣(Ulvan polysaccharide)」意指由石蓴屬(Ulva )藻類的細胞壁中以熱水(100~121^o C)萃取出的水溶性複合酸性硫酸多醣，其主要成分為硫酸鹽 (Sulfate)、鼠李糖 (Rhamnose)、木糖 (Xylose)、葡萄糖醛酸 (Glucuronic acid)，以及艾杜糖醛酸 (Iduronic acid)；石蓴多醣的主要結構為重複的二醣Type A (即，葡萄醣醛酸3-硫酸鹽，Glucurorhamnose 3-sulphate, A3s)以及Type B (即艾杜糖鼠李糖3-硫酸鹽，Iduronic Rhamnose 3-sulphate, B3s)以線性的方式組成，Type A與Type B的化學結構式如下所示：

A: [-＞ 4-β-D-Glcp -(1 -＞ 4)-α-L-Rhap 3S-(1-＞]_n ; B: [-＞4-α-L-Idop -(1-＞4)-α-L-Rhap 3S-(1-＞]_n 。石蓴多醣具有抗氧化(Li等人(2018) Antioxidant and antihyperlipidemic activities of purified polysaccharides from Ulva pertusa.Journal of Applied Phycology 30 , 2619-2627.)、抗凝劑(Adrien等人(2019)，Anticoagulant Activity of Sulfated Ulvan Isolated from the Green Macroalga Ulva rigida.Mar Drugs 17 , 291-329.)、抗腫瘤 (Abd-Ellatef等人(2017)，Ulva lactuca polysaccharides prevent Wistar rat breast carcinogenesis through the augmentation of apoptosis, enhancement of antioxidant defense system, and suppression of inflammation.Breast Cancer (Dove Med Press) 9 , 67-83.)，以及免疫調節 (Tabarsa等人(2018)，Water-soluble polysaccharides from Ulva intestinalis: Molecular properties, structural elucidation and immunomodulatory activities.J Food Drug Anal 26 , 599-608)等生理活性，此外，富含鼠李醣的多醣類表現出抗發炎、降低細菌貼附、防止紫外線損傷、刺激細胞增殖以及膠原蛋白合成等生理活性(Adrien等人(2016)，Pilot production of ulvans from Ulva sp. and their effects on hyaluronan and collagen production in cultured dermal fibroblasts.Carbohydrate Polymers 157 , 1306-1314.；de Araujo等人(2016)，Analgesic and anti-inflammatory actions on bradykinin route of a polysulfated fraction from alga Ulva lactuca.Int J Biol Macromol 92 , 820-830.)。石蓴多醣可從石蓴屬(Ulva )藻類中萃取或分離，石蓴屬(Ulva )藻類包含，但不限於，魚棲台石蓴(Ulva acanthophora )、阿南德氏石蓴(Ulva anandii )、窄葉石蓴(Ulva angusta )、阿氏石蓴(Ulva arasakii )、阿莫里加石蓴(Ulva armicalicana )、綠石蓴(Ulva atroviridis )、薄葉石蓴(Ulva attenuata )、貝特石蓴(Ulva beytensis )、雙面石蓴(Ulva bifrons )、短柄石蓴(Ulva brevistipitata )、球石蓴(Ulva bulbosa )、緬甸石蓴(Ulva burmanica )、柔石蓴(Ulva byssoides )、加州石蓴(Ulva californica )、蝶形石蓴(Ulva chaetomorphoides )、格石蓴(Ulva clathrata )、渥紅石蓴(Ulva coccinea )、扁石蓴(Ulva compressa )、族石蓴(Ulva conglobata )、羊角石蓴(Ulva cornucopiae )、角石蓴(Ulva cornuta )、科夫龍石蓴(Ulva covelongensis )、厚石蓴(Ulva crassa )、厚膜石蓴(Ulva crassimembrana )、拱石蓴(Ulva curvata )、椰棗石蓴(U. dactylifera )、鋸齒石蓴(Ulva denticulata )、秀剛石蓴(Ulva elegans )、艾米氏石蓴(Ulva elminthoides ) 、腸形石蓴(Ulva enteromorpha )、直石蓴(Ulva erecta )、寬石蓴(Ulva expansa )、裂片石蓴(U. fasciata )、窗石蓴(Ulva fenestrata )、曲石蓴(Ulva fiexuosa )、膠石蓴(Ulva gelatinosa )、雙生石蓴(Ulva geminoidea ) 、巨石蓴(U. gigantea )、大石蓴(Ulva grandis )、亨德石蓴(Ulva hendayensis )、勾石蓴(Ulva hookeriana )、霍克石蓴(Ulva hopkirkii )、腸石蓴(Ulva intestinalis )、類口服石蓴(Ulva intestinoides )、絞石蓴(Ulva intricata )、管狀石蓴(Ulva intybacea )、加唾石蓴(Ulva javanica )、科林石蓴(Ulva kylinii )、萬石蓴(U. lactuca )、萬葉石蓴(Ulva lactucaefolia )、亮綠石蓴(Ulva laetevirens )、朗吉石蓴(Ulva laingii )、線石蓴(Ulva linearis )、舌石蓴(Ulva lingulata )、鏈石蓴(Ulva linkiana )、緣管石蓴(Ulva linza )、里皮石蓴(Ulva lippii )、濱海石蓴(Ulva litoralis )、海岸石蓴(Ulva littorea )、裂石蓴(Ulva lobata ) 、滑石蓴(Ulva lubrica )、替代石蓴(Ulva marginat a)、微球石蓴(Ulva micrococca )、米亞塔石蓴(Ulva myriotrem a)、那不勒斯石蓴(Ulva neapolitana )、線蟲石蓴(Ulva nematoidea )、歐尼石蓴(Ulva ohnoi )、撤石蓴(Ulva olivacea )、撤除石蓴(Ulva olivaceum )、太平洋石蓴(Ulva pacifica )、匙形石蓴(Ulva papenfussii )、奇形石蓴(Ulva paradoxa )、小石蓴(Ulva parva )、微小石蓴(Ulva parvula )、潘騰石蓴(Ulva patengensis )、狹帶石蓴(Ulva percursa )、孔石蓴(Ulva pertusa )、菲氏石蓴(Ulva phyllosa )、拍石蓴(Ulva popenguinensis )、韭葉石蓴(Ulva porrifolia )、闊石蓴(Ulva procera )、深石蓴(Ulva profunda )、游石蓴(Ulva prolifera )、假曲石蓴(Ulva pseudocurvata )、假林氏石蓴(Ulva pseudolinza )、剛石蓴(Ulva pulchra )、紫絲石蓴(Ulva purpurascens )、奎隆石蓴(Ulva quilonensis )、福狀石蓴(Ulva radiata )、拉爾夫石蓴(Ulva ralfsii )、毛茛石蓴(Ulva ranunculata )、網紋石蓴(Ulva reticulata ) 、拉科石蓴(Ulva rhacodes )、硬石蓴(Ulva hardica )、切石蓴(Ulva rotundata )、魯本斯石蓴(Ulva rubens )、塞弗拉石蓴(Ulva saifullahii )、斯凱戈爾石蓴(Ulva scagelii )、斯堪的納維亞石蓴(Ulva scandinavica ) 、賽瑞石蓴(Ulva sericea )、齒葉石蓴(Ulva serrata )、單葉石蓴(Ulva simplex )、索倫森石蓴(Ulva sorensenii )、紡石蓴(Ulva spinulosa )、狹葉石蓴(Ulva stenophylla )、柄石蓴(Ulva stipitata )、海邊石蓴(Ulva sublittoralis )、針葉石蓴(Ulva subulata )、帶狀石蓴(Ulva taeniata )、細葉石蓴(Ulva tenera )、四角石蓴(Ulva quadgona )、絞線石蓴(Ulva torta )、荸養石蓴(Ulva tuberosa )、臍狀石蓴(Ulva umbilicata )、芒石蓴(Ulva uncialis )、鉤刺石蓴(Ulva uncinata )、松蘿石蓴(Ulva usneoides )、囊狀石蓴(Ulva utricularis )、革質石蓴(Ulva utriculosa )、卵形石蓴(Ulva uvoides )，以及紫花瓣石蓴(Ulva ventricosa )。

如本文所用，術語「背板部」意指連接微針底部的底座，使微針固定排列以形成貼片形式，便於使用者使用。

如本文所用，術語「滲透皮膚」意指可穿透皮膚角質層(厚度約10-40 µm)。本發明之石蓴多醣微針可穿透皮膚角質層，而將活性物質送至表皮層(厚度約50-150 µm)及真皮層(厚度約1.5-4 mm)。

如本文所用，術語「微針的高度」或「微針部的高度」意指自一微針針尖至該微針底部的垂直距離。本發明之石蓴多醣微針可穿透皮膚角質層，將活性物質送至表皮層及真皮層，故本發明之石蓴多醣微針的高度多於皮膚角質層加上表皮層的厚度。於某些具體實施例中，本發明之石蓴多醣微針的高度不小於200 微米(µm)，較佳為約200 µm、約250 µm、約300 µm、約350 µm、約400 µm、約450 µm、約500 µm、約550 µm、約600 µm、約650 µm、約700 µm，或為不小於200 µm的任一高度，不限為整數之高度，例如，但不限於652.67 µm；於某些較佳具體實施例中，該微針的高度為約650 µm。

在以下的說明性實施例中更詳細地描述本發明。儘管實施例可以僅代表本發明的選定具體實施例，但是應當理解的是，以下實施例為說明性的而非限制性的。

本發明進一步透過以下的實施例闡釋，其不應以任何方式被解釋為進一步的限縮。本申請案中引用的所有文件(包括參考文獻、核准的專利、公開的專利申請，以及一同在申請中的專利申請案)的整體內容，在此透過引用的方式明確地併入本案中。

實施例

實施例一 石蓴多醣之萃取

將石蓴粉末(台灣肥料股份有限公司，台灣)溶於去離子水，於高溫(約100^o C至約121^o C)下進行萃取後，過濾並進行減壓濃縮，再進行冷凍乾燥得到石蓴多醣粉末。

實施例二 石蓴多醣微針貼片之製備

以兩層澆鑄方法製備石蓴多醣微針貼片，製備步驟如圖1所示。首先，以具有類似金字塔形的3M^TM 微針板(聖保羅市，明尼蘇達州，美國)作為母模板1，將液態聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS) 20灌鑄於該母模板1上，待該液態聚二甲基矽氧烷(PDMS) 20硬化後，將其與該母模板1分離，獲得一PDMS負向模具21，該PDMS負向模具21包含一微針部模具211以及一背板部模具212，該微針部模具211包含一針尖部模具2111以及一針底部模具2112。接著，將上述實施例一所得到的石蓴多醣粉末溶於去離子水，得到石蓴多醣溶液3。將不同濃度(4%、5%、6% (w/v))的石蓴多醣溶液3加入至該PDMS負向模具21中，離心15分鐘後於室溫下靜置隔夜乾燥以形成石蓴多醣微針貼片的微針部51。接著，將聚乙烯吡咯烷酮(PVP)與羧甲基纖維素鈉(CMC)的混合液(PVP/CMC，比例為1:4 (w/w)) 4加入至該PDMS負向模具21中，離心15分鐘後於室溫下靜置隔夜乾燥以形成石蓴多醣微針貼片的背板部52。待該PVP/CMC混合液4完全乾燥後，將該微針部51連同該背板部52與該PDMS負向模具21分離，得到石蓴多醣微針貼片5。

實施例三 石蓴多醣微針貼片的外觀觀察

利用解剖顯微鏡(Olympus公司，型號SZX16，日本)觀察上述實施例二所得到的石蓴多醣微針貼片的外觀。觀察角度分別為0度角(微針貼片與顯微鏡的載物台之間的角度為0度，亦即，微針貼片平放在顯微鏡的載物台上)、45度角(微針貼片與顯微鏡的載物台之間的角度為45度)，以及90度角(微針貼片與顯微鏡的載物台之間的角度為90度)。

以不同濃度(4%、5%、6% (w/v))的石蓴多醣溶液製備的微針貼片的0度角觀察結果分別如圖2A-1、圖2B-1、圖2C-1所示，45度角觀察結果分別如圖2A-2、圖2B-2、圖2C-2所示，90度角觀察結果分別如圖2A-3、圖2B-3、圖2C-3所示。不論是4% (w/v)、5% (w/v)，或6% (w/v)的石蓴多醣溶液製備的微針貼片，皆形成具有類似金字塔形的微針(如圖2A-2、圖2B-2、圖2C-2所示)，且微針皆均勻的分佈在貼片上(如圖2A-1、圖2B-1、圖2C-1所示)並具有完整的針尖(如圖2A-3、圖2B-3、圖2C-3所示)。這些結果與作為母模板的3M^TM 微針板外觀一致。

另外，利用掃描式電子顯微鏡(Scanning electron microscope, SEM) (Hitachi公司，型號S-3400N，日本)由兩個不同的角度(0度角與90度角)觀察石蓴多醣微針的詳細外觀，並使用ImageJ軟體測量每個石蓴多醣微針的高度(針尖至針底的垂直距離)、針底的寬度、兩個微針針尖的間距，以及兩個微針針底邊緣的間距。本試驗重複三次(n = 3)，並計算各濃度微針樣品的平均值與標準差。

掃描式電子顯微鏡的觀察結果如圖3A-1至圖3C-2所示。由掃描式電子顯微鏡以0度角觀察可看出，不論是4% (w/v)、5% (w/v)，或6% (w/v)的石蓴多醣溶液製備的微針貼片，皆形成具有類似金字塔形的微針(如圖3A-1、圖3B-1、圖3C-1所示)。而由掃描式電子顯微鏡以90度角觀察可看出，不論是4% (w/v)、5% (w/v)，或6% (w/v)的石蓴多醣溶液製備的微針貼片，其上的微針皆具有完整的針尖(如圖3A-2、圖3B-2、圖3C-2所示)。

以ImageJ軟體測量的微針尺寸結果如表1所示，並且與作為母模板的3M^TM 微針板的微針尺寸進行比較。整體而言，不論是4% (w/v)、5% (w/v)，或6% (w/v)石蓴多醣微針，其高度、寬度、高寬比都相當接近母模板的微針高度、寬度、高寬比，而且與母模板的微針高度、寬度的差異，皆在母模板的微針高度、寬度的10%以內。表示本發明之石蓴多醣微針貼片與作為母模板的3M^TM 微針板具有相似的外觀性質。

表1 母模板的微針以及不同濃度的石蓴多醣微針的高度、底部間距、寬度、針尖間距，以及高寬比的比較

測量材料	高度 (µm)	底部間距(µm)	寬度 (µm)	針尖間距(µm)	高寬比
母模板	650	233.90	272.79	515.95	2.38
4% (w/v)石蓴多醣微針	678.00±3.06	229.33±2.96	280.33±4.33	511.67±4.06	2.42
5% (w/v)石蓴多醣微針	652.67±3.33	236.33±6.12	262.00±1.73	508.00±2.89	2.49
6% (w/v)石蓴多醣微針	682.67±3.18	261.00±1.00	248.00±2.65	515.00±7.21	2.75

實施例四 石蓴多醣微針貼片的機械性質測試

利用萬能材料測試機(型號：H1KS，Tinius Olsen公司，美國)確認微針的機械性質。將上述實施例二所得到的以不同濃度(4%、5%、6% (w/v))的石蓴多醣溶液製備的微針貼片放置於該萬能材料測試機的不鏽鋼基板載台上，固定該貼片後，將測壓儀移動至距離該貼片10 mm處，以10 mm/min的恆定移動速度，測試本發明之石蓴多醣微針貼片的機械強度，記錄該測壓儀的力隨微針位移的變化，並繪製機械強度曲線圖(力-位移曲線圖)。

石蓴多醣微針的機械強度曲線圖如圖4所示。以不同濃度(4%、5%、6% (w/v))的石蓴多醣溶液製備的微針貼片的斷裂力分別為 2.73、2.64，以及2.74 N；亦即每支微針的斷裂力為約0.0075~0.0078 N/needle。微針的斷裂力代表壓下整支微針高度所需的力量。根據Lee等人先前的研究(Lee等人(2015). Fabrication of a novel partially dissolving polymer microneedle patch for transdermal drug delivery.Journal of Materials Chemistry B 3 , 276-285)，斷裂力約為0.005 N/needle的可溶性微針即已具有足夠的機械性質用於穿刺皮膚。而本發明之石蓴多醣微針的斷裂力高於Lee等人的微針的斷裂力，顯示本發明之石蓴多醣微針具有良好的機械性質。

實施例五 石蓴多醣微針貼片的穿刺試驗

為了確認本發明之石蓴多醣微針是否具有穿刺皮膚的能力，本實施例以豬皮模擬人體皮膚進行微針穿刺試驗。首先，依照實施例二之方法製備含有麗絲胺綠(Lissamine Green B, LGB)染劑的石蓴多醣微針貼片，與實施例二所述方法唯一的差異僅在於，在製備微針部時，於4% (w/v)石蓴多醣溶液中加入終濃度為6 g/L的LGB染劑。

進行穿刺試驗前先處理豬皮，先將冷凍的小豬耳朵皮膚解凍，並浸泡於二次蒸餾水(double distilled water, ddH₂ O)；以擦手紙輕輕擦乾豬皮後，塗上除毛膏作用5分鐘以除掉微毛，清除除毛膏後若豬皮上還有未除掉的毛，則以剃刀剃除。接著，將處理好的豬皮以角質層面朝上的方式置於自行組裝的施用器上，並將已剪掉背板的含有LGB染劑的石蓴多醣微針放置於該豬皮表面上，利用該施用器使微針刺穿豬皮10秒。最後利用解剖顯微鏡觀察豬皮表面的狀態並算出穿刺的孔洞數，並以下式計算穿刺的成功率：[(豬皮上的孔洞數 / 微針總數) x 100%]。

豬皮穿刺試驗結果如圖5A至圖5D所示。以本發明之石蓴多醣微針穿刺豬皮10秒後，在豬皮上觀察到被微針穿刺後釋放的染劑所產生的藍色斑點(如圖5A及圖5B所示)，表示本發明之石蓴多醣微針具有穿刺豬皮的能力，且該藍色斑點的數目代表微針穿刺豬皮的孔洞數。經計算後得到穿刺的成功率高達80%。此外，以解剖顯微鏡觀察進行穿刺試驗後的微針外觀，結果如圖5C及圖5D所示，觀察到微針針尖的損失，表示本發明之石蓴多醣微針在穿刺豬皮後可快速溶解。由本實施例之試驗可知，本發明之石蓴多醣微針具有足夠的機械強度以穿透豬皮的角質層屏障。

實施例六 石蓴多醣微針的溶解試驗 1

含有LGB染劑的石蓴多醣微針貼片以及豬皮穿刺試驗如實施例五所述進行，但增加不同的微針穿刺時間(10、30、60，以及120秒)。進行豬皮穿刺試驗後，以解剖顯微鏡觀察微針的外觀變化，以了解微針針尖溶解的狀況。接著，利用Image J軟體測量微針的高度變化，並以下式計算微針高度損失率：[(原始微針高度 - 穿刺後的微針高度) / 原始微針高度 x 100%]；本試驗重複三次(n = 3)，並計算各樣品的平均值與標準差。

以不同時間(10、30、60，以及120秒)進行豬皮穿刺試驗後，微針的外觀變化分別如圖6A至圖6D所示，明顯觀察到微針的高度隨著穿刺時間的增加而變短。與微針的原始高度比較所計算出的微針高度損失率如表2所示，進行豬皮穿刺120秒後，微針針尖的高度已減少90%，表示本發明之石蓴多醣微針在穿透皮膚角質層屏障後，與皮膚中的組織間液接觸而快速溶解，將活性成分釋放於皮膚內，由皮膚吸收。

表2 經過不同穿刺時間後，石蓴多醣微針的高度損失率

穿刺時間(秒)	微針高度損失率(%)
10	35.37 +/- 5.35
30	46.90 +/- 1.80
60	76.19 +/- 2.17
120	90.62 +/- 1.41

實施例七 石蓴多醣微針的溶解試驗 2

首先製備石蓴多醣標準品：配製10 mg/mL的石蓴多醣溶液，然後連續稀釋共3次，利用ELISA reader測定各稀釋濃度的石蓴多醣標準品的OD₆₁₀ 值，並繪製石蓴多醣濃度標準曲線，以計算各樣品中石蓴多醣的濃度。接著，將上述實施例二所得到的石蓴多醣微針貼片浸泡於2 mL二次蒸餾水(ddH₂ O)中，於不同時間點(1、3、5、10、20、30、40，以及60分鐘)取出300 µL水溶液作為分析樣品，並補回相同體積的ddH₂ O。將200 µL的天青A加入100 µL的樣品中，靜置反應5分鐘後以ELISA reader測定各樣品的OD₆₁₀ 值，並以上述石蓴多醣濃度標準曲線計算各樣品中石蓴多醣的濃度。最後，以下式計算微針貼片的石蓴多醣含量的溶出率：[(在不同時間點取出之樣品的石蓴多醣含量/最大的石蓴多醣含量 (亦即溶解60分鐘後的樣品中的石蓴多醣含量) x 100%)]；本試驗重複三次(n = 3)，並計算各濃度微針樣品的平均值與標準差。

石蓴多醣含量的溶出率如圖7所示。於1分鐘內，各濃度(4%、5%、6% (w/v))的石蓴多醣微針貼片的石蓴多醣溶出率皆已達50%，並於30分鐘內完全溶解(溶出率為 100%)，表示本發明之石蓴多醣微針可快速且完全溶解，適合作為有效且安全的經皮輸送裝置提供人體使用。

實施例八 石蓴多醣微針貼片的活性物質體外擴散深度試驗

為了確認本發明之石蓴多醣微針穿刺皮膚溶解後，活性物質及/或藥物在皮膚內擴散的深度，本實施例同樣以豬皮模擬人體皮膚進行微針穿刺試驗。首先，依照實施例二之方法製備含有螢光染劑羅丹明6G (Rhodamine 6G, R6G)的石蓴多醣微針貼片，與實施例二所述方法唯一的差異僅在於，在製備微針部時，於4% (w/v)石蓴多醣溶液中加入終濃度為500 mg/L的R6G染劑。

豬皮穿刺試驗方法同實施例五所述，微針穿刺豬皮10分鐘後移除微針。接著，以雷射掃描共軛焦顯微鏡 (confocal laser scanning microscope, CLSM，Nikon C2+，Nikon公司，日本)於激發光波長561 nm下觀察螢光染劑R6G在豬皮內的擴散深度，在不同的z軸高度下進行掃描，並透過在不同的z軸高度重疊x軸與y軸的平面圖像獲得3D重建圖像。

R6G螢光染劑在豬皮內的3D重建圖像如圖8A所示。該3D重建圖像顯示，本發明之石蓴多醣微針最大皮膚穿透深度為約500 μm，此深度約對應於人類皮膚的真皮層淺層。此外，豬皮在不同的z軸高度下進行掃描的結果如圖8B所示。石蓴多醣微針穿刺豬皮10分鐘後，由於石蓴多醣微針的可溶性質，活性物質/藥物(於本實施例中為石蓴多醣與R6G螢光染劑)在皮膚內會被釋放並擴散，其最大擴散深度約為520 µm (如圖6B所示)。由此可知，本發明之石蓴多醣微針除了本身可以做為活性物質之外，亦可輔助其他活性物質及/或藥物輸送至真皮層，並能增強活性物質及/或藥物往皮膚更深層擴散的效率。

實施例九 石蓴多醣微針貼片的體外經皮滲透試驗

為了確認本發明之石蓴多醣微針穿刺皮膚溶解後，活性物質及/或藥物是否滲透至皮膚內，本實施例同樣以豬皮模擬人體皮膚進行微針穿刺試驗，並以垂直式擴散槽(vertical diffusion cell，又稱Franz Cell)分析。

使用實施例二所得到之以4% (w/v)的石蓴多醣溶液製備的微針貼片，以實施例五所述之方法進行豬皮穿刺試驗。微針穿刺豬皮30秒後，將豬皮移至含有17 ml二次蒸餾水(ddH₂ O)的Franz Cell的受體槽，將溫度控制於37^o C，連續攪拌。在不同時間點(2、5、10、20、30、40、60、90、120、150、180分鐘)取出400 µL的樣品，並補回同樣體積的ddH₂ O。利用天青A (azure A) 分光光度法測定微針釋放出的石蓴多醣含量。將 100 µL的天青A加入200 µL的樣品中，靜置反應5分鐘，並以盤式酵素免疫分析儀(ELISA reader)測定波長610 nm下的吸光值(OD₆₁₀ 值)。此外，製備石蓴多醣標準品：配製10 mg/mL的石蓴多醣溶液，然後連續稀釋共 3次，利用ELISA reader測定各稀釋濃度的石蓴多醣標準品的OD₆₁₀ 值，並繪製石蓴多醣濃度標準曲線，以計算各樣品中石蓴多醣的濃度。以下式計算石蓴多醣的累積釋放率：[(在不同時間點的石蓴多醣含量/最大的石蓴多醣含量) x 100%]；本試驗重複三次(n = 3)，並計算各樣品的平均值與標準差。

石蓴多醣微針在不同時間點的體外經皮滲透累積釋放量如圖9A所示，而累積釋放率則如圖9B所示。由圖9A及圖9B可知，在最初的60分鐘內微針快速釋放石蓴多醣，而後續緩慢釋放至3小時。微針在20分鐘時已經釋放出109.33 ± 19.08 µg (累積釋放率為約50%)的石蓴多醣，而至3小時後石蓴多醣的累積釋放量為201.05 ± 21.09 µg (累積釋放率為100%)。本實施例結果表示，本發明之石蓴多醣微針可在皮膚內快速溶解並成功地將石蓴多醣滲透至皮膚內。

上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。

綜上所述，本案所揭露之技術特徵已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請　貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。

1:母模板 20:液態聚二甲基矽氧烷(PDMS) 21:聚二甲基矽氧烷(PDMS)負向模具 211:微針部模具 2111:針尖部模具 2112:針底部模具 212:背板部模具 3:石蓴多醣溶液 4:聚乙烯吡咯烷酮(PVP)/羧甲基纖維素鈉(CMC)混合液 5:石蓴多醣微針貼片 51:微針部 52:背板部

圖 1 所示為石蓴多醣微針貼片的製備流程。

圖 2 所示為以解剖顯微鏡以不同角度觀察不同濃度的石蓴多醣溶液製備的微針貼片的外觀之結果；圖2A-1、圖2A-2、圖2A-3所示分別為以0度角、45度角、90度角觀察以4% (w/v)石蓴多醣溶液製備的微針貼片的外觀；圖2B-1、圖2B-2、圖2B-3所示分別為以0度角、45度角、90度角觀察以5% (w/v)石蓴多醣溶液製備的微針貼片的外觀；圖2C-1、圖2C-2、圖2C-3所示分別為以0度角、45度角、90度角觀察以6% (w/v)石蓴多醣溶液製備的微針貼片的外觀。

圖 3 所示為以掃描式電子顯微鏡以不同角度觀察不同濃度的石蓴多醣溶液製備的微針貼片的外觀之結果；圖3A-1、圖3A-2所示分別為以0度角、90度角觀察以4% (w/v)石蓴多醣溶液製備的微針貼片的外觀；圖3B-1、圖3B-2所示分別為以0度角、90度角觀察以5% (w/v)石蓴多醣溶液製備的微針貼片的外觀；圖3C-1、圖3C-2所示分別為以0度角、90度角觀察以6% (w/v)石蓴多醣溶液製備的微針貼片的外觀。

圖 4 所示為石蓴多醣微針的機械強度曲線圖。

圖 5 所示為以石蓴多醣微針進行豬皮穿刺試驗10秒的結果；圖5A所示為試驗後豬皮的外觀；圖5B為圖5A的放大圖；圖5C為試驗後石蓴多醣微針的外觀；圖5D為圖5C的放大圖。

圖 6 所示為以石蓴多醣微針穿刺豬皮不同時間後，石蓴多醣微針的外觀變化；圖6A所示為進行穿刺試驗10秒後的石蓴多醣微針的外觀；圖6B所示為進行穿刺試驗30秒後的石蓴多醣微針的外觀；圖6C所示為進行穿刺試驗60秒後的石蓴多醣微針的外觀；圖6D所示為進行穿刺試驗120秒後的石蓴多醣微針的外觀。

圖 7 所示為不同濃度的石蓴多醣微針在水中60分鐘內的石蓴多醣溶出率。

圖 8 所示為以雷射掃描共軛焦顯微鏡觀察包覆螢光染劑羅丹明6G (Rhodamine 6G, R6G)的石蓴多醣微針穿刺豬皮10分鐘後，石蓴多醣微針在豬皮內的擴散深度；圖8A所示為豬皮的3D重建圖像；圖8B所示為豬皮在不同的z軸高度下進行掃描所顯示之螢光染劑擴散的結果；1~27分別表示Z軸深度為0、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520 µm。

圖 9 所示為以石蓴多醣微針穿刺豬皮3小時，於不同時間點上分析石蓴多醣滲透豬皮的結果；圖9A所示為石蓴多醣的累積釋放含量曲線圖；圖9B所示為石蓴多醣的累積釋放率曲線圖。

Claims

石蓴多醣用於製備滲透皮膚用的微針之用途。
一種可溶性石蓴多醣微針，係以石蓴多醣所製成。
如請求項2所述之可溶性石蓴多醣微針，其中該可溶性石蓴多醣微針係以約3.5~6.5% (w/v)的石蓴多醣溶液所製成。
一種製備可溶性石蓴多醣微針的方法，包含下列步驟： (i) 提供一微針模具，該微針模具包含一微針部模具，該微針部模具包含一針尖部模具以及一針底部模具； (ii) 將一包含約3.5~6.5% (w/v)石蓴多醣的溶液加至該微針部模具中，使該包含約3.5~6.5% (w/v)石蓴多醣的溶液乾燥形成一微針部；以及 (iii) 將該微針部與該微針模具分離，以得到該可溶性石蓴多醣微針。
一種可溶性石蓴多醣微針貼片，包含一微針部以及一背板部，該微針部係以石蓴多醣所製成。
如請求項5所述之可溶性石蓴多醣微針貼片，其中該微針部係以約3.5~6.5% (w/v)的石蓴多醣溶液所製成。
如請求項5所述之可溶性石蓴多醣微針貼片，其中該背板部係以由下列材料所組成之群組所製成：一澱粉與明膠之組合材料、一聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)與蔗糖之組合材料、一幾丁聚醣，以及一聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone, PVP)與羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose,CMC)之組合材料。
如請求項7所述之可溶性石蓴多醣微針貼片，其中該背板部係以一包含約1:10至約10:1 (w/w)的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)與羧甲基纖維素鈉(CMC)之組合物材料所製成。
一種製備可溶性石蓴多醣微針貼片的方法，包含下列步驟： (i) 提供一微針模具，該微針模具包含一微針部模具以及一背板部模具，該微針部模具包含一針尖部模具以及一針底部模具，該背板部模具與該針底部模具相連； (ii) 將一包含約3.5~6.5% (w/v)石蓴多醣的溶液加至該微針部模具中，使該包含約3.5~6.5% (w/v)石蓴多醣的溶液乾燥形成一微針部； (iii) 將一包含約1:10至約10:1 (w/w)的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)與羧甲基纖維素鈉(CMC)的組合物溶液加至該微針模具的該背板部模型中，使該包含聚乙烯吡咯烷酮(PVP)與羧甲基纖維素鈉(CMC)的組合物溶液乾燥形成一背板部；以及 (iv) 將該微針部連同該背板部與該微針模具分離，以得到該可溶性石蓴多醣微針貼片。