TW202140548A - 結合人ngf的抗體、其製備方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本揭露屬於疼痛治療和生物技術領域,涉及一種結合人NGF的抗體或其抗原結合片段,能夠有效結合人NGF,阻斷NGF-TrKA的信號通路,應用於製備治療NGF過表達的疾病(例如創傷、炎症、慢性疼痛)的藥物,具有良好的臨床應用前景。
Description
本揭露屬於疼痛治療和生物技術領域,涉及一種結合人NGF的抗體、其製備方法和用途。
神經生長因子(NGF)對神經系統的生長發育具有十分重要的作用,為神經元增殖、分化和存活以及功能維持所必需,並能促進神經損傷後的修復和再生。NGF的主要受體是TrkA。NGF有疼痛信號傳遞功能,罕見人體基因變異表明阻斷NGF或其受體TrkA可以終止疼痛信號。大量的動物和人體實驗表明,NGF的表達水平在創傷、炎症和慢性疼痛中都有所升高。阻斷NGF-TrkA信號可顯著抑制疼痛,並且不會對中樞神經系統造成嚴重影響。
疼痛是影響人們生活品質和致殘的主要疾病,是未被滿足的重大醫療需求之一。雖然阿片類止痛藥效果很好,但其成癮性和大規模使用帶來的濫用已成為一個嚴重的社會問題,美國阿片止痛藥濫用已經到了影響人均壽命的程度。但是疼痛也是動物感知環境風險的重要機制,所以高選擇性止痛藥物發現難度極大。臨床試驗結果顯示,NGF中和抗體是少有的療效能和嗎啡類藥物媲美但無成癮風險的止痛藥。
Tanezumab是第一個進入臨床的NGF中和抗體,最早由Rinat Neuroscience開發。由於阿片類和非甾體抗炎類(Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs,NSAIDs)止痛藥的濫用,理論上沒有成癮風險的Tanezumab備受監管機構和業內期待。2017年6月,FDA授予Tanezumab治療骨關節炎、慢性腰背痛的快速通道資格。目前尚無此機制產品上市。然而,仍極待開發新型、特異、高效、無風險的NGF中和抗體滿足臨床治療需求,從而能夠改善患有創傷、炎症和慢性疼痛類疾病人群的生活品質,為患者提供更多、更有效的治療方案。
為了解決上述技術問題,本揭露的發明人進行了大量試驗,從抗原免疫、雜交瘤篩選、抗體表達純化到生物活性鑒定,篩選獲得了特異性結合人NGF的鼠源抗體,並在此基礎上,進一步構建獲得其嵌合抗體以及人源化抗體。
因此,本揭露的目的在於提供一種結合人NGF的抗體或其抗原結合片段;提供編碼所述結合人NGF的抗體或其抗原結合片段的核苷酸分子;提供包含所述核苷酸分子的表達載體;提供所述表達載體的宿主細胞;提供所述結合人NGF的抗體或其抗原結合片段製備方法;提供包含所述結合人NGF的抗體或其抗原結合片段藥物組合物;提供所述結合人NGF的抗體或其抗原結合片段在製備藥物中的應用。
為了實現上述目的,本揭露採用了如下技術方案:
本揭露一方面提供一種結合人NGF的抗體或其抗原結合片段,包括:(a) 重鏈互補決定區H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3,所述的H-CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO:7所示,所述的H-CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO:8所示,所述的H-CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO:9所示,和(b) 輕鏈互補決定區L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3,所述的L-CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO:10所示,所述的L-CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO:11所示,所述的L-CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
本揭露「抗體(Ab)」是約150000道爾頓的異四聚糖蛋白,其由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連,而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH),其後是恆定區。每條輕鏈的一端有可變區(VL),另一端有恆定區;輕鏈的恆定區與重鏈的第一個恆定區相對,輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對。本揭露的抗體包括單株抗體、多株抗體、由至少兩種抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)等。
本揭露「單株抗體」指從一類基本均一的群體獲得的抗體,即該群體中包含的單個抗體是相同的,除少數可能存在的天然發生的突變外。單株抗體高特異性地針對單個抗原位點。而且,與常規多株抗體製劑(通常是具有針對不同決定簇的不同抗體)不同,各單株抗體是針對抗原上的單個表位。除了它們的特異性外,單株抗體的好處還在於它們是通過雜交瘤培養來合成的,不會被其它免疫球蛋白污染。修飾語「單株」表示了抗體的特性,是從基本均一的抗體群中獲得的,這不應被解釋成需要用任何特殊方法來生產抗體。
本揭露「抗原結合片段」是指能夠與人NGF特異性結合的抗體的片段。本揭露的抗原結合片段的例子包括Fab片段、F(ab’)2
片段、Fv片段等。Fab片段是用木瓜蛋白酶消化抗體產生的片段。F(ab’)2
片段是用胃蛋白酶消化抗體產生的片段。Fv片段是由抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區緊密非共價關聯的二聚物組成。
作為較佳方案,所述的抗體為鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
本揭露「鼠源抗體」是指來源於大鼠或小鼠的抗體,較佳為小鼠。本揭露的鼠源抗體為使用人NGF為抗原免疫小鼠並進行雜交瘤細胞篩選獲得。
本揭露「嵌合抗體」是指包含來源於一個物種的重和輕鏈可變區序列以及來源於另一個物種的恆定區序列的抗體,例如具有與人恆定區連接的鼠重和輕鏈可變區的抗體。較佳的,本揭露的嵌合抗體是由鼠源抗體183C6重鏈可變區和輕鏈可變區序列與人的恆定區拼接獲得。更佳的,本揭露的嵌合抗體選自183C6-Chimeric。
本揭露「人源化抗體」是指其CDR來源於非人物種(較佳為小鼠)抗體,抗體分子中殘餘的部分(包括框架區和恆定區)來源於人抗體。此外,框架區殘基可被改變以維持結合親和性。較佳的,本揭露的人源化抗體由鼠源抗體183C6的CDR區和來源自人抗體的非CDR區重組,增加第四個框架區並對部分有重要影響的殘基進行突變獲得。更佳的,本揭露的人源化抗體選自183C6-Humanized。
作為較佳的方案,所述的抗原結合片段包括Fab片段、F(ab’)2
片段、Fv片段。
作為較佳的方案,所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:4所示,輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示;或所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:13所示,輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
作為較佳的方案,所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段的重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:19所示,輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
本揭露另一方面提供了一種核苷酸分子,所述核苷酸分子編碼上述結合人NGF的抗體或其抗原結合片段。
作為較佳的方案,所述核苷酸分子編碼重鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,編碼輕鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示;或所述核苷酸分子編碼重鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示,編碼輕鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。
作為較佳的方案,所述核苷酸分子編碼重鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示,編碼輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
本揭露所述核苷酸分子的製備方法為本領域常規的製備方法,較佳地包括以下製備方法:通過基因克隆技術例如PCR方法等,獲得編碼上述單株抗體的核苷酸分子,或者通過人工全序列合成的方法得到編碼上述單株抗體的核苷酸分子。
本領域技術人員知曉,編碼上述結合人NGF的抗體或其抗原結合片段的胺基酸序列的核苷酸序列可以適當引入替換、缺失、改變、插入或增加來提供一個多聚核苷酸的同系物。本揭露中多聚核苷酸的同系物可以通過對編碼該結合人NGF的抗體或其抗原結合片段基因的一個或多個堿基在保持抗體活性範圍內進行替換、缺失或增加來製得。
本揭露另一方面提供了一種表達載體,所述表達載體含有上述的核苷酸分子。
其中所述表達載體為本領域常規的表達載體,是指包含適當的調控序列,例如啟動子序列、終止子序列、多腺苷醯化序列、增強子序列、標記基因和/或序列以及其他適當的序列的表達載體。所述表達載體可以是病毒或質粒,如適當的噬菌體或者噬菌粒,更多技術細節請參見例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。許多用於核酸操作的已知技術和方案請參見Current Protocols in Molecular Biology,第二版,Ausubel等編著。本揭露所述表達載體較佳為pDR1,pcDNA3.1(+),pcDNA3.1/ZEO(+),pDHFR,pcDNA4,pDHFF,pGM-CSF或pCHO 1.0。
本揭露另外提供了一種宿主細胞,所述宿主細胞含有上述的表達載體。
本揭露所述的宿主細胞為本領域常規的各種宿主細胞,只要能滿足使上述重組表達載體穩定地自行複製,且所攜帶所述的核苷酸可被有效表達即可。其中所述宿主細胞包括原核表達細胞和真核表達細胞,所述宿主細胞較佳包括:COS、CHO(中國倉鼠卵巢,Chinese H amster Ovary)、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1,更佳地為E.coli TG1、BL21(DE3)細胞(表達單鏈抗體或Fab抗體)或者CHO-K1細胞(表達全長IgG抗體)。將前述表達載體轉化至宿主細胞中,即可得本揭露優選的重組表達轉化體。其中所述轉化方法為本領域常規轉化方法,較佳為化學轉化法,熱激法或電轉法。
本揭露另一方面提供了上述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段的方法,其特徵在於,所述方法包括以下步驟:a)在表達條件下,培養上述的宿主細胞,從而表達所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段;b)分離並純化a)所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段。
本揭露所述的宿主細胞的培養方法、所述抗體的分離和純化方法為本領域常規方法,具體操作方法請參考相應的細胞培養技術手冊以及抗體分離純化技術手冊。本揭露中公開的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段的製備方法包括:在表達條件下,培養上述的宿主細胞,從而表達所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段;分離和純化所述的所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段。利用上述方法,可以將重組蛋白純化為基本均一的物質,例如在SDS-PAGE電泳上為單一條帶。
可以利用親和層析的方法對本揭露公開的所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段進行分離純化,根據所利用的親和柱的特性,可以使用常規的方法例如高鹽緩衝液、改變pH等方法洗脫結合在親和柱上的所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段。本揭露的發明人對所得所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段進行了檢測實驗,實驗結果表明該所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段能很好地與抗原結合,具有較高的親和力。
本揭露另一方面提供了一種組合物,所述組合物含有上述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段和藥學上可接受的載體。
本揭露提供的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段,可以和藥學上可以接受的載體一起組成藥物製劑組合物從而更穩定地發揮療效,這些製劑可以保證本揭露公開的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段的構像完整性,同時還保護蛋白質的多官能團防止其降解(包括但不限於凝聚、脫胺或氧化)。通常情況下,對於液體製劑,通常可以在2°C-8°C條件下保存至少穩定一年,對於凍乾製劑,在30°C至少六個月保持穩定。所述雙特異性抗體製劑可為製藥領域常用的混懸、水針、凍乾等製劑。
對於本揭露公開的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段水針或凍乾製劑,藥學上可以接受的載體較佳包括但不限於:表面活性劑、溶液穩定劑、等滲透壓調節劑和緩衝液之一或其組合。其中表面活性劑較佳包括但不限於:非離子型表面活性劑如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐溫20或80);poloxamer(如poloxamer 188);Triton;十二烷基硫酸鈉(SDS);月桂硫酸鈉;十四烷基、亞油基或十八烷基肌胺酸;Pluronics;MONAQUATTM等,其加入量應使結合人NGF的抗體或其抗原結合片段的顆粒化趨勢最小。溶液穩定劑較佳包括但不限於以下列舉之一或其組合:醣類,例如,還原性糖和非還原性醣;胺基酸類,例如,谷胺酸單鈉或組胺酸;醇類,例如:三元醇、高級醣醇、丙二醇、聚乙二醇等,溶液穩定劑的加入量應該使最後形成的製劑在本領域的技術人員認為達到穩定的時間內保持穩定狀態。等滲透壓調節劑較佳包括但不限於氯化鈉、甘露醇之一或其組合。緩衝液較佳地包括但不限於:Tris、組胺酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液之一或其組合。
本揭露另一方面提供了上述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段或藥物組合物在製備治療創傷、炎症、慢性疼痛藥物中的應用。
本揭露所述的慢性疼痛較佳地包括但不限於:關節炎或癌症引發的疼痛、慢性腰背痛。
本揭露結合人NGF的抗體或其抗原結合片段及其組合物在對包括人在內的動物給藥時,給藥劑量因病人的年齡和體重,疾病特性和嚴重性,以及給藥途徑而異,可以參考動物實驗的結果和種種情況,總給藥量不能超過一定範圍。具體講靜脈注射的劑量是1-1800mg/天。
在符合本領域常識的基礎上,上述各較佳的條件,可任意組合,即得本揭露各較佳實例。
本揭露所用試劑和原料均市售可得。
本揭露的積極進步效果在於:
目前臨床上亟待開發新型、特異、高效、無成癮風險的止痛藥,從而能夠改善患有創傷、炎症和慢性疼痛類疾病人群的生活品質,為患者提供更多、更有效的治療方案。本揭露的183C6-Humanized對人NGF具有很高的親和力,能夠有效地中和人NGF,具有良好的臨床應用前景。
以下實施例是對本揭露進行進一步的說明,不應理解為是對本揭露的限制。實施例不包括對傳統方法的詳細描述,如那些用於構建載體和質粒的方法,將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質粒的方法或將質粒引入宿主細胞的方法。這樣的方法對本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的,並且在許多出版物中都有所描述,包括Sambrook, J., Fritsch,E.F. and Maniais,T. (1989)Molecular Cloning :A LaboratoryManual, 2nd edition, Cold spring Harbor Laboratory Press.
以下實施例中使用的實驗材料和來源以及實驗試劑的配製方法具體說明如下。
實驗材料:
HEK293F細胞:購自Thermo Fisher Scientific。
人NGF:購買自Sino Biological,貨號:11050-HNAC。
Balb/c小鼠:購自上海靈暢生物科技有限公司。
雜交瘤sp2/0細胞:購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。
逆轉錄試劑盒:購自Takara。
TF-1細胞系:購自ATCC,貨號CRL-2003TM
。
羊抗鼠二抗:購自Sigma,貨號SAB3701283。
小鼠NGF:購自Sino Biological,貨號50385-MNAC。
大鼠NGF:購自R&D systems,貨號7815-NG-025。
實驗試劑:
碳酸鈉緩衝液:1.59g Na2
CO3
和2.93g NaHCO3
溶於1L純水中。
磷酸鹽緩衝液:簡寫為PBST,配方為:KH2
PO4
0.2g,Na2
HPO4
·12H2
O 2.9g,NaCl 8.0g,KCl 0.2g,Tween-20 0.5mL,加純水至1L。
顯色液:底物顯色A液:醋酸鈉·三水13.6g,檸檬酸·一水1.6g,30%雙氧水0.3mL,純水500mL;底物顯色B液:乙二胺四乙酸二鈉0.2g,檸檬酸·一水0.95g,甘油50mL,TMB0.15g溶於3mL DMSO中,純水500mL;使用前A和B液等體積混勻。
終止液:2M硫酸溶液。
RPMI-1640培養基:購自Thermo Fisher Scientific。
Free Style 293 Expression Medium:購自Thermo Fisher Scientific。
pcDNA4:購自Thermo Fisher Scientific。
電融合儀ECM2001和細胞融合緩衝液:購自BTX。
胎牛血清:購自Thermo Fisher Scientific。
HAT:購自Thermo Fisher Scientific。
Hybridoma-SFM:購自Thermo Fisher Scientific。
Trizol:購自Thermo Fisher Scientific。
GM-CSF:購自廈門特寶生物工程股份有限公司。
CCK-8:購自Dojindo。
實驗儀器:
酶標儀:購自Molecular Devices,型號SpectraMax 190。
Biacore 8K:購自GE healthcare。
CO2
振盪培養箱:購自INFORS。
實施例1:陽性對照抗體的製備
本揭露實施例中所述的陽性對照抗體E3的重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列分別來自美國專利中US20170342143A1的SEQ ID NO 1和2,即本揭露的SEQ ID NO 1和2。
由上海生工生物工程有限公司合成編碼陽性對照重鏈可變區和輕鏈可變區的DNA。將合成的陽性對照重鏈可變區基因與人IgG1重鏈恆定區基因相連,獲得全長的重鏈基因,命名為E3-HC-IgG1;將上述輕鏈可變區基因與人Kappa鏈恆定區基因相連,獲得全長的輕鏈基因,命名為E3-LC。將E3-HC-IgG1和E3-LC基因分別構建到pcDNA4表達載體中,利用PEI轉染法將所得重鏈和輕鏈表達載體一起轉入HEK293F細胞中以表達抗體,HEK293F細胞用Free Style 293 Expression Medium培養。轉染後的HEK293F細胞置於CO2振盪培養箱中培養5天,離心收集細胞上清,利用Protein A親和層析法純化上清中的抗體,所得抗體命名為E3-IgG1。
實施例2:鼠源抗人NGF單株抗體的製備和篩選
步驟1:抗原免疫小鼠
將作為抗原的人NGF用生理鹽水稀釋成到合適的濃度,與等體積的弗氏完全佐劑混合,並經超聲乳化完全後對4-5週齡的Balb/c小鼠進行皮下多點注射,每隻小鼠注射50µg抗原/100µL。三週後,等量蛋白與等體積弗氏不完全佐劑混合,超聲乳化完全後對小鼠進行皮下多點免疫,兩週後再次重複此免疫步驟。所有小鼠在第三次免疫後的第七天取一滴血,分離血清,利用ELISA進行血清滴度的檢測。對於血清抗體效價>100000的小鼠,在滴度測定後一週進行衝擊免疫:尾靜脈注射10µg抗原蛋白/100µL生理鹽水/鼠。
其中,利用ELISA進行血清滴度檢測的方法說明如下:用碳酸鈉緩衝液將人NGF稀釋至100ng/mL,然後100μL每孔加入ELISA板中,室溫孵育2小時;用含0.05% Tween-20的PBST洗板;每孔加入含有1%牛血清白蛋白(BSA)的PBST進行封閉,室溫孵育1小時;用PBST洗板兩遍,加入梯度稀釋的小鼠血清,孵育半小時;用PBST洗板兩遍,加入適當稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗,孵育半小時;洗板後加入顯色液進行顯色,用終止液終止顯色反應;用酶標儀讀取OD450;用GraphPad Prism6進行資料分析,作圖並計算血清滴度。
步驟2:雜交瘤的製備和篩選
小鼠衝擊免疫三天后取脾細胞進行融合。生長狀態良好的雜交瘤sp2/0細胞在37°C、5% CO2
孵箱中培養,融合前一天換液。融合與篩選過程如下:取小鼠脾臟,研磨洗滌後計數;按照脾細胞:sp2/0細胞=2:1混合兩種細胞,離心後棄掉上清液;然後加入20mL細胞融合緩衝液洗滌細胞三次;細胞沉澱以1×107
個/mL的密度懸浮於細胞融合緩衝液中;加2mL細胞懸液於融合池中,置於電融合儀ECM2001上,30秒內按一定條件(AC 60V,30S;DC 1700V,40μS,3X;POST AC 60V,3S)進行電融合;電融合後輕輕地將融合細胞轉移至37°C預熱的含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中,室溫繼續放置60min;將細胞按104
個/孔接種入96孔板,100μL/孔。次日每孔補加100μL的含有2×HAT和10%血清的RPMI-1640培養基。於融合後第四天用新鮮的含有1×HAT和RPMI-1640培養基置換一半舊培養液。於融合後第七天用新鮮的含有1×HAT和RPMI-1640培養基置換大部分舊培養液。於融合後第九天取樣進行ELISA檢測,方法如上述實施例2步驟1中所述。挑選出陽性雜交瘤克隆於24孔板中擴大培養並通過有限稀釋法進行亞克隆。通過前述方法獲得穩定表達目的抗體的雜交瘤株,對這些克隆進行擴增和細胞凍存。用Hybridoma-SFM培養前述雜交瘤株7天,然後用Protein A/G親和層析柱從培養上清中純化鼠源抗人NGF單株抗體。經過純化後獲得7株能夠結合人NGF的鼠源單抗,它們的名稱分別是183C6、211D3、27F4、215F9、147F10、151G6和181H6,用紫外分光光度法測定所得抗體濃度。
用ELISA方法檢測上述鼠源抗人NGF單抗對人NGF的相對親和力。實驗方法參見實施例2步驟1。
結果如第1圖所示,183C6、211D3、27F4、215F9、147F10、151G6和181H6均能夠有效結合人NGF,它們的EC50分別是0.09205nM、0.2433nM、0.3459nM、0.3355nM、0.8581nM、0.409nM和0.2988nM。EC50越小表示相對親和力越高,上述結果顯示183C6單抗的相對親和力最高,因此選擇183C6進行下一步開發。
實施例3:鼠源抗人NGF單株抗體的人源化
步驟1:鼠源抗人NGF單株抗體可變區序列的確定
使用Trizol從183C6雜交瘤單克隆細胞株中提取總RNA,用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄成cDNA,通過文獻報導的組合引物(《Antibody Engineering》Volume 1,Edited by Roland Kontermann and Stefan Dübel,組合引物的序列來自第323頁)用PCR擴增183C6的輕鏈可變區和重鏈可變區基因,然後將PCR產物克隆入pMD18-T載體,測序並分析可變區基因序列。鼠源183C6可變區序列資訊如下:重鏈可變區基因序列全長357bp,編碼119個胺基酸殘基,核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,胺基酸序列如SEQ ID NO:4所示;輕鏈可變區基因序列全長321bp,編碼107個胺基酸殘基,核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示,胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
步驟2:鼠源抗人NGF單株抗體的人源化
通對鼠源183C6抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區胺基酸序列進行分析,依據Kabat規則分別確定183C6單抗重鏈和輕鏈的抗原互補決定區(CDR)和框架區(FR)。183C6抗體重鏈CDR的胺基酸序列為H-CDR1:SEQ ID NO:7、H-CDR2:SEQ ID NO:8和H-CDR3:SEQ ID NO:9,輕鏈CDR的胺基酸序列為L-CDR1:SEQ ID NO:10、L-CDR2:SEQ ID NO:11和L-CDR3:SEQ ID NO:12。
在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/,將鼠源183C6單抗的重鏈可變區與人IgG胚系序列進行同源性比較,選擇IGHV1-46*01為重鏈CDR移植範本,將鼠源的183C6抗體的重鏈CDR移植入IGHV1-46*01骨架區,並在H-CDR3之後加入WGQGTLVTVSS作為第四個框架區,獲得CDR移植重鏈可變區序列。同樣地,將鼠源183C6抗體的輕鏈可變區與人IgG胚系序列同源性比較,選擇IGKV1-39*01為輕鏈CDR移植範本,將鼠源183C6抗體的輕鏈CDR移植入IGKV1-39*01的骨架區,並在L-CDR3之後加入FGQGTKVEIK作為第四個框架區,獲得CDR移植輕鏈可變區序列。在CDR移植可變區的基礎上,對一些框架區的胺基酸位點進行突變。在進行突變時,將胺基酸序列進行Kabat編碼,位點的位置由Kabat碼指示。較佳的,對於CDR移植重鏈可變區,根據Kabat編碼,將第30位的T突變為S,將第37位的V突變為I,將第48位的M突變為I,將第67位的V突變為A,將第69位的M突變為L,將第71位的R突變為A,將第73位的T突變為Q。對於CDR移植輕鏈可變區,將第43位的A突變為T,將第44位的P突變為V,將第71位的F突變為Y,第87位的Y突變為F。上述帶有突變位點的重鏈可變區和輕鏈可變區分別定義為人源化的重鏈可變區和輕鏈可變區,分別命名為183C6-Hu-VH(SEQ ID NO:13)和183C6-Hu-VL(SEQ ID NO:14)。
由上海生工生物工程有限公司合成編碼上述人源化的重鏈和輕鏈可變區的DNA。將合成的人源化重鏈可變區基因(SEQ ID NO:15)與人IgG1重鏈恆定區相連,獲得全長的人源化重鏈基因(SEQ ID NO:16),命名為183C6-Hu-HC;將人源化輕鏈可變區基因(SEQ ID NO:17)與人Kappa鏈恆定區相連,獲得全長的人源化輕鏈基因(SEQ ID NO:18),命名為183C6-Hu-LC。將183C6-Hu-HC和183C6-Hu-LC基因分別構建到pcDNA4表達載體中,利用上述實施例中描述的方法表達並純化抗體,其重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO:19,輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO:20,所得抗體命名為183C6-Humanized。
另外,將鼠源183C6重鏈可變區與人IgG1重鏈恆定區相連,獲得嵌合重鏈基因,命名為183C6-Chi-HC;將鼠源183C6輕鏈可變區與人Kappa鏈恆定區相連,獲得嵌合輕鏈基因,命名為183C6-Chi-LC。將183C6-Chi-HC和183C6-Chi-LC基因分別構建到pcDNA4表達載體中,利用上述實施例中描述的方法表達並純化抗體,所得抗體命名為183C6-Chimeric。
實施例4:酶聯免疫吸附法(ELISA)測定183C6-Chimeric和183C6-Humanized對抗原的親和力
用ELISA方法檢測183C6-Chimeric和183C6-Humanized對人NGF的相對親和力實驗方法參見實施例2步驟1。不同之處在於,此處使用的是HRP標記的羊抗人二抗。
結果如第2圖所示,E3-IgG1、183C6-Chimeric和183C6-Humanized均能有效結合人NGF,它們的EC50分別是0.1118 nM、0.07049 nM和0.06848 nM。EC50越小表示相對親和力越高,上述結果顯示183C6-Chimeric和183C6-Humanized的相對親和力相當,並且兩者明顯高於E3-IgG1。
實施例5: Biacore 8K測定183C6-Chimeric和183C6-Humanized對抗原的親和力
本實施例利用Biacore 8K檢測抗NGF抗體與NGF之間的結合和解離動力學參數,以及平衡解離常數。在Biacore 8K上,使用偶聯有Protein A的晶片捕獲抗NGF抗體,被捕獲的抗體稱為固化配體,再將人NGF作為分析物進樣,得到結合-解離曲線,用6M鹽酸胍再生緩衝液洗脫後重複下一個循環;利用Biacore 8K Evaluation Software對資料進行分析。結果如表1所示。
表1. 檢測抗NGF抗體與人NGF之間的結合和解離動力學參數
注:Kon表示結合常數;Koff表示解離常數;KD=Koff/Kon,表示平衡解離常數。
抗體名稱 | Kon (1/Ms) | Koff (1/s) | KD(M) |
E3-IgG1 | 8.76E+05 | 1.64E-04 | 1.87E-10 |
183C6-Chimeric | 1.51E+07 | 3.57E-05 | 2.37E-12 |
183C6-Humanized | 1.55E+07 | 3.71E-05 | 2.39E-12 |
實驗結果顯示,E3-IgG1、183C6-Chimeric和183C6-Humanized均能夠有效結合人NGF,但183C6-Chimeric和183C6-Humanized結合NGF的速率(Kon)明顯快於E3-IgG1,並且解離速率明顯慢於E3-IgG1,因此183C6-Chimeric和183C6-Humanized的平衡解離常數明顯小於E3-IgG1,這表明183C6-Chimeric和183C6-Humanized的親和力明顯高於E3-IgG1。
實施例6: 183C6-Chimeric和183C6-Humanized中和NGF生物活性的能力
TF-1細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基在37°C、5% CO2
孵箱中培養,培養基中需要添加5ng/mL的GM-CSF;具體培養和傳代方法參照https://www.atcc.org/products/all/CRL-2003.aspx。人NGF能夠誘導TF-1細胞增殖,本實施例採用TF-1細胞檢測上述抗NGF單抗對NGF誘導TF-1細胞增殖的抑制作用。
用37°C預熱的RPMI-1640培養基將處於對數生長期的TF-1細胞洗滌2遍,每次300g離心5min;對TF-1細胞計數,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基懸浮到適當密度,接種到96孔細胞培養板中,10000個/150μL/孔;在RPMI-1640完全培養基中加入人NGF使其濃度達到80ng/mL;用添加人NGF的培養基將上述抗體稀釋到適當濃度,按照適當倍率連續稀釋9個梯度;將稀釋過的抗原和抗體混合物加入96孔細胞培養板中,50μL/孔;96孔板周圍添加蒸餾水,200μL/孔;在37°C、5%CO2
孵箱中孵育3天;3天後在96孔板中每孔加入20μL CCK-8溶液,在孵箱中繼續培養8hr;震盪混勻後用酶標儀讀取OD450值;GraphPad Prism6進行資料分析,作圖並計算IC50。
第3A圖和第3B圖是兩次獨立重複實驗的結果。第3A圖和第3B圖顯示,E3-IgG1、183C6-Chimeric和183C6-Humanized均能夠有效抑制NGF誘導TF-1細胞增殖,第3A圖中它們的IC50分別為0.145nM、0.1623nM和0.1373nM;第3B圖中它們的IC50分別為0.1162nM、0.1273nM和0.1104nM,它們中和NGF生物活性的能力基本相當。其中同型對照抗體為不結合NGF的人IgG1單抗。
實施例7: 183C6-Humanized的種屬交叉能力
用ELISA方法檢測上述抗人NGF單抗對其它種屬NGF的識別能力。實驗方法參見實施例2步驟1。不同之處在於,此處使用的是HRP標記的羊抗人二抗。
結果如第4圖所示,183C6-Humanized均能夠有效結合小鼠和大鼠的NGF,它們的EC50分別是0.2041nM和0.5310nM。其中同型對照抗體為不結合NGF的人IgG1單抗。
無
第1圖為:ELISA檢測鼠源抗人NGF單株抗體對人NGF的相對親和力。
第2圖為:ELISA檢測183C6-Chimeric和183C6-Humanized對人NGF的相對親和力。
第3A圖為:檢測183C6-Chimeric和183C6-Humanized對人NGF誘導的TF-1細胞增殖的抑制。
第3B圖為:檢測183C6-Chimeric和183C6-Humanized對人NGF誘導的TF-1細胞增殖的抑制。
第4圖為:ELISA檢測183C6-Humanized結合小鼠和大鼠NGF的能力。
國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記)
無
國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記)
無
Claims (13)
- 一種結合人NGF的抗體或其抗原結合片段,包括: (a) 複數個重鏈互補決定區,該些重鏈互補決定區包括一H-CDR1、一H-CDR2以及一H-CDR3,該H-CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO:7所示,該H-CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO:8所示,該H-CDR3的胺基酸序列如SEQ IDNO:9所示;以及 (b) 複數個輕鏈互補決定區,該些輕鏈互補決定區包括一L-CDR1、一L-CDR2以及一L-CDR3,該L-CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO:10所示,該L-CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO:11所示,該L-CDR3的胺基酸序列如SEQ IDNO:12所示。
- 如請求項1所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體為鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
- 如請求項1所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段,其中該抗原結合片段包括Fab片段、F(ab’)2 片段以及Fv片段。
- 如請求項1所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段,其中該結合人NGF的抗體或其抗原結合片段的一重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:4所示,一輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示;或 該結合人NGF的抗體或其抗原結合片段的一重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:13所示,一輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
- 如請求項1所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段,其中該結合人NGF的抗體或其抗原結合片段的一重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:19所示,一輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
- 一種核苷酸分子,其中該核苷酸分子編碼如請求項1至請求項5中任一項所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項6所述的核苷酸分子,其中該核苷酸分子的一編碼重鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,一編碼輕鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示;或 該核苷酸分子的一編碼重鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示,一編碼輕鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。
- 如請求項6所述的核苷酸分子,其中該核苷酸分子的一編碼重鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示,一編碼輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
- 一種表達載體,其中該表達載體含有如請求項6至請求項8中任一項所述的核苷酸分子。
- 一種宿主細胞,其中該宿主細胞含有如請求項9所述的表達載體。
- 一種製備如請求項1至請求項5中任一項所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段的方法,該方法包括以下步驟: a) 在表達條件下,培養如請求項10所述的宿主細胞,從而表達該結合人NGF的抗體或其抗原結合片段; b) 分離並純化a)所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段。
- 一種組合物,其中該組合物含有如請求項1至請求項5中任一項所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段和藥學上可接受的一載體。
- 一種如請求項1至請求項5中任一項所述的結合人NGF的抗體或其抗原結合片段或如請求項12所述的藥物組合物,用於製備治療創傷、炎症、慢性疼痛藥物的用途。
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