TW202126631A - 作為klk5/7雙重抑制劑之苯并酮化合物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供用於治療與一或多種KLK蛋白酶之蛋白水解活性相關之皮膚病之化合物及包括該等化合物之醫藥組合物，其中該等化合物係根據式(I)：

Description

作為KLK5/7雙重抑制劑之苯并㗁𠯤酮化合物
遺傳性皮膚病係表現為皮膚病症之遺傳性疾病。該等疾病通常在發生後不久即可偵測。疾病類型取決於影響基因之方式但由此導致之病症可為嚴重、罕見的並藉由導致殘疾、短壽命及其他慢性疾病及癌症之發展嚴重影響病患之生活。存在約400種不同之遺傳性皮膚病及發病率可在6000人中1人至500,000人中1人之間變化。對於可能獲得僅非常有限範圍之昂貴藥品以有助於疾病控制之病患及家庭，該疾病之負擔可為困難的。遺傳性皮膚病可分為單一基因疾患(單基因)，其中皮膚疾患係由單一基因中之異常引起，及多基因疾患，其中數個基因突變(缺陷)影響該病患經歷之疾病類型。該等單一基因疾患包括急性間歇性卟啉、大皰表皮鬆解、魚鱗病、法布裡病、缺水外胚層發育不良，及色素失禁。具有魚鱗病之遺傳性疾病包括納瑟頓症候群(Netherton Syndrome)。
納瑟頓症候群(NS)係罕見之常染色體隱性遺傳性皮膚病，其特徵在於先天性魚鱗狀紅皮病、特應性素質，及特性毛幹畸形(亦稱為套疊脆髮症)。納瑟頓症候群係最嚴重之角質病中之一者。嬰兒通常在出生時出現全身性鱗屑性紅皮病及具有危及生命之併發症諸如高鈉血症性脫水、無法茁壯成長及敗血症之高風險。在年齡較大之兒童中，可出現廣泛之過敏表現，包括嚴重之特應性皮炎、哮喘、花粉症及免疫球蛋白E之顯著高血清含量。在年齡較大之兒童及成人中，剝落可具有獨特之圓形圖案(旋線狀魚鱗病(ichthyosis linearis circumflexa))。但在嬰兒及年幼兒童中，皮膚更通常普遍為紅色及鱗狀的，缺乏獨特之圓形圖案。毛幹由於套疊脆髮症或「竹毛」而脆弱且容易折斷，導致短稀疏髮。納瑟頓症候群之另一特性係過敏、哮喘及濕疹之誘因。除細菌性皮膚及全身性感染外，患有納瑟頓症候群之成人及兒童亦易患皰疹及人類乳頭瘤病毒之病毒性皮膚感染。納瑟頓症候群發病率估計為1/200,000出生人數及盛行率估計為1-9/1,000,000。然而，區域性研究表明盛行率由於在嬰兒及幼兒期間之診斷挑戰可更高，包括與特應性皮炎及其他隱性魚鱗病重疊之特徵。當前，尚無針對NS之特定療法，而僅存在用於控制皮膚感染、減少瘙癢及疼痛之緩和治療。
NS係由絲胺酸蛋白酶抑制劑卡紮爾(Kazal)型5 (SPINK5)(編碼LEKTI (淋巴上皮卡紮爾型抑制劑)之基因)之經截短功能喪失突變引起。LEKTI功能喪失導致不受限制之蛋白酶活性及過度消化表皮結構及屏障蛋白。
LETKI係對激肽釋放素(KLK)絲胺酸蛋白酶家族成員(KLK5、KLK7及KLK14)具特異性之抑制劑(Chavanas等人，Nat Genet 2000, 25: 141-142)。KLK5係表徵為KLK7上游之引發劑。根據當前之假設狀態，pro-KLK在顆粒層中經合成並活化及活性KLK酶係與LEKTI快速複合，因此預防橋粒在角質層/顆粒層界面處過早降解(Borgono等人，J Biol Chem 2007, 282:3640-3652；Deraison等人，Mol Biol Cell 2007, 18:3607-3619；Ovaere等人，Trends Biochem Sci 2009, 34:453-463)。KLK-LEKTI複合物擴散至外角質層，其中角質層之酸性微環境引起自LEKTI釋放活性KLK。接著，該等活性KLK裂解該角質層之最表層中之角膜基質蛋白。此確保脫屑過程之細微平衡調節(Ovaere等人，Trends Biochem Sci 2009, 34:453-463)。
Spink5-/- 小鼠重現NS疾病(Descargues等人，Nat Genet 2005, 37:56-65；Hewett等人，Hum Mol Genet 2005, 14:335-346；Yang等人，Genes Dev 2004, 18:2354-2358)。關鍵發現為與已在患有NS之個體中觀測到者類似，Spink5-/- 小鼠表皮顯示不受限制之KLK5及KLK7蛋白酶活性(Descargues等人，Nat Genet 2005, 37:56-65)。
相反，刪除KLK5挽救Spink5-/- 新生小鼠中新生兒致命率，及逆轉NS之皮膚特徵，包括皮膚屏障缺陷、表皮結構紊亂及皮膚發炎(Furio等人，PLoS Genet 2015, Sep; 11(9): e1005389)。尤其，KLK5喪失導致表皮蛋白水解活性降低，尤其KLK7及KLK14。接著，其恢復橋粒之結構完整性及角質體及正常表皮分化及IL-1β、IL-17A及TSLP (胸腺基質淋巴細胞生成素)之標準化表現。
除動物模型外，器官型3D培養物係用經靶向SPINK5之小干擾RNA (siRNA)及成纖維細胞填充之膠原凝膠轉染之正常人類角質細胞產生及在此等培養模型中觀測到表皮缺陷(Wang等人，Exp Dermatol 2014, Jul;23(7):524-6)。KLK5或KLK7之基因沉默顯著改善由減少之SPINK5表現損害之表皮結構。總之，此等研究證實KLK5及其上游及下游調節劑在NS中之主要作用。
KLK7係由角質細胞表現於顆粒層中並分泌至角質層(即皮膚之最外層)細胞外空間作為酶原，接著由KLK5活化。一經活化，KLK7在皮膚之脫屑過程中發揮主要作用。KLK7之蛋白水解事件對脫屑過程及皮膚之受控再生而言係至關重要的。在產生新角質細胞與脫屑間之緊密平衡對維持皮膚穩態而言係至關重要的。相反，此等兩個過程間之失衡導致受損之皮膚功能並最終導致皮膚病(諸如納瑟頓症候群)。在正常條件下，此平衡係藉由KLK7抵消其蛋白水解活性之內源性蛋白抑制劑(LEKTI)之表現維持。在皮膚疾患中，KLK7過表現及/或活性增加導致過度脫皮。KLK7參與皮膚疾患之進展係由動物模型及人類兩者中之遺傳相關性進一步支持。已顯示過表現人類KLK7之轉基因小鼠發展類似於彼等慢性特應性皮炎病患中可見之皮膚特徵，該等病患與納瑟頓症候群病患具有某些相同特徵。
鑒於KLK5及KLK7在調節脫屑過程中之作用，並結合自組合Spink5-/- /Klk5-/- /Klk7-/- 基因剔除小鼠模型之完全表型挽救之報導結果一起(Kasparek等人，PLoS Genet 2017, Jan; 13(1): e1006566)，因此需有效且選擇性雙重KLK5/KLK7抑制劑，藉由調節此等蛋白酶之蛋白水解活性用於治療遺傳性皮膚病，例如納瑟頓症候群。
在一項態樣中，本發明提供由式(I)表示之化合物：
Figure 02_image001
(I)， 或其醫藥上可接受之複合物；其中R係H或選自由-R1 及-C(O)R1a 組成之群之成員，其中R1 係C1-12 烷基，及R1a 係H或C1-12 烷基。
在第二態樣中，本發明提供包括式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。
在第三態樣中，本發明提供用於治療有需要個體之與一或多種KLK蛋白酶之蛋白水解活性相關聯之皮膚病之方法。該方法包括向該個體投與有效量之式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物，或包括該式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物之醫藥組合物。
在第四態樣中，本發明提供用於測定皮膚中之一或多種KLK蛋白酶之蛋白水解活性之活體外分析。該方法包括1)製備皮膚提取物；2)使受質及式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物曝露於該皮膚提取物；及3)測定該受質蛋白水解裂解之速率。
相關申請案之交互參照
本申請案主張2019年10月01日申請之美國臨時申請案第62/909,006號之優先權，其係出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。 關於根據聯邦政府贊助之研究及研發作出之本發明之權利之聲明
不適用 光碟上呈遞之「序列表」、表格或電腦程式附錄列表之參考
不適用 I. 概述
本發明提供用於治療與一或多種KLK蛋白酶之蛋白水解活性相關聯之皮膚病之式(I)化合物及包括該式(I)化合物之醫藥組合物。特定言之，醫藥組合物可為局部調配物，其等包括局部使用以治療遺傳性皮膚病之式(I)化合物。本發明亦提供藉由投與式(I)化合物或其醫藥組合物治療與一或多種KLK蛋白酶之蛋白水解活性相關聯之皮膚病之方法。特定言之，式(I)化合物或其醫藥組合物可經局部投與。具體言之，該皮膚病為遺傳性皮膚病(諸如納瑟頓症候群)。 II.    定義
本文使用之縮寫具有其等於化學及生物領域內之習知含義。
「烷基」係指具有指示數量之碳原子(即，C1-12 意謂一至十二個碳)之直鏈或分支鏈、飽和、脂族基團。烷基可包括任何數量之碳，諸如C1-2 、C1-3 、C1-4 、C1-5 、C1-6 、C1-7 、C1-8 、C1-9 、C1-10 、C1-11 、C1-12 、C2-3 、C2-4 、C2-5 、C2-6 、C2-7 、C2-8 、C2-9 、C2-10 、C2-11 、C2-12 、C3-4 、C3-5 、C3-6 、C3-7 、C3-8 、C3-9 、C3-10 、C3-11 、C3-12 、C4-5 、C4-6 、C5-6 、C5-7 、C5-8 、C5-9 、C5-10 、C5-11 、C5-12 、C6-7 、C6-8 、C6-9 、C6-10 、C6-11 、C6-12 、C7-8 、C7-9 、C7-10 、C7-11 、C7-12 、C8-9 、C8-10 、C8-11 、C8-12 、C9-10 、C9-11 、C9-12 、C10-11 、C10-12 及C11-12 。例如，C1-12 烷基包括(但不限於)甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一基、正十二基等。烷基亦可為指具有多達20個碳原子之烷基，諸如(但不限於)十三基、十四基、十五基、十六基、十七基及十八基等。
如本文使用之「醫藥上可接受之複合物」係指包括式(I)化合物及至少一種複合劑之複合物。術語「醫藥上可接受」意謂經聯邦或州政府之監管機構批准或在美國藥典或其他公認之藥典中列出用於動物及更特定言之用於人類中。該等複合劑具有通過非共價二級相互作用與該式(I)化合物形成複合物之功能。該等二級相互作用可通過靜電相互作用諸如離子相互作用、H鍵、偶極-偶極相互作用、偶極誘導之偶極相互作用、倫敦分散力、π-π相互作用及疏水相互作用形成。式(I)化合物之醫藥上可接受之複合物包括其醫藥上可接受之鹽及/或溶劑合物。
「溶劑合物」係指本文提供之化合物或其鹽，其進一步包括化學計量或非化學計量量之由非共價分子間力結合之溶劑。當該溶劑係水時，該溶劑合物為水合物。
「水合物」係指與水分子複合之化合物。本發明之化合物可與½水分子或1至10個水分子複合。
如本文使用之「肽-對硝基醯胺苯」或「肽-pNA」係指於C端具有由肽鍵及對硝基醯胺苯基團連接之4至6個胺基酸之肽受質。本發明中肽-pNA受質之實例包括Tyr-Arg-Ser-Arg-pNA及Lys-His-Leu-Tyr-pNA。
如本文使用之「組合物」意欲包含包含規定量之規定成分之產品，及(直接或間接)來自規定量之規定成分之組合之任何產品。「醫藥上可接受」意謂載劑、稀釋劑或賦形劑必須與調配物之其他成分相容且對其受體無害。
「醫藥上可接受之載劑或賦形劑」係指有助於向個體投與活性劑並被個體吸收之物質。適用於本發明之醫藥賦形劑包括(但不限於)黏合劑、填充物、崩解劑、潤滑劑、包衣、甜味劑、調味劑及染料。本發明中適用於透皮/局部遞送之醫藥賦形劑包括(但不限於)增強劑、增溶劑、抗氧化劑、塑化劑、增稠劑、聚合物及壓敏膠。熟習此項技術者應知曉其他醫藥賦形劑亦適用於本發明。
「IC50 」係指特定測試化合物在量測此反應之分析中達成最大反應之50%抑制之量、濃度或劑量。
「抑制(Inhibition、inhibit)」及「抑制劑」係指阻止特定作用或功能之化合物或阻止特定作用或功能之方法。
「投與」係指局部投與，例如作為洗劑、噴霧劑、軟膏、乳膏、凝膠、糊劑或貼劑。
「局部」意謂向皮膚施用合適之化合物(例如，活性劑)或包含化合物(例如，活性劑)之組合物以治療疾病或病症(例如，遺傳性皮膚病)。在一些實施例中，「局部」意謂向皮膚施用合適之化合物(例如，活性劑)或包含化合物(例如，活性劑)之組合物及充分滲透表皮或真皮以治療該遺傳性皮膚病。在局部應用之一些實施例中，該化合物或組合物滲透表皮或真皮而無明顯全身曝露亦無意圖治療或預防另一器官系統之疾病。在局部應用之一些實施例中，該化合物或組合物係經透皮遞送以全身分佈於整個皮膚上。實例包括適用於藥物遞送之透皮貼劑。
「治療(Treat、treating及treatment)」係指成功治療或改善損傷、病理學或病症之任何跡象，包括任何客觀或主觀參數諸如症狀之減輕；緩解；減少或使病患更耐受該損傷、病理學或病症；減緩退化或衰退之速率；使退化之最終點更少衰弱；改善病患之身體或精神健康。症狀之治療或改善可基於客觀或主觀參數；包括身體檢查、神經精神科檢查及/或精神病學評估之結果。
「病患」或「個體」係指罹患或易患可藉由投與如本文提供之醫藥組合物治療之疾病或病症之活生物體。非限制性實例包括人類、其他哺乳動物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、綿羊、母牛、鹿，及其他非哺乳動物。在一些實施例中，該病患為人類。
「治療有效量」係指適用於治療或改善已確定疾病或病症，或適用於顯示可偵測治療或抑制效應之化合物或醫藥組合物之量。精確量將取決於治療目的，及將由熟習此項技術者使用已知技術確定(參見，例如Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (第1至3卷，1992)；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)；Pickar, Dosage Calculations (1999)；及Remington: The Science and Practice of Pharmacy，第20版，2003, Gennaro編，Lippincott, Williams & Wilkins)。
「一」、「一個」或「一種」在參考本文之一組取代基(substituent)或「取代基(substituent group)」時，意謂至少一個。例如，當化合物係經「一個」烷基或芳基取代時，該化合物係視需要經至少一個烷基及/或至少一個芳基取代，其中各烷基及/或芳基係視需要不同的。在另一實例中，當化合物係經「一」取代基取代時，該化合物係經至少一個取代基取代，其中各取代基係視需要不同的。 III.   化合物
在一項態樣中，本發明提供由式(I)表示之化合物：
Figure 02_image001
(I)， 或其醫藥上可接受之複合物；其中R係H或選自由-R1 及-C(O)R1a 組成之群之成員，其中R1 係C1-12 烷基，及R1a 係H或C1-12 烷基。
式(I)中之甲磺醯基(-SO2 CH3 )可相對於7,8-二氫-4H-[1,4]戴奧辛并[2',3':4,5]苯并[1,2-d][1,3]㗁𠯤-4-酮之部分位於鄰位、間位或對位。在一些實施例中，該-SO2 CH3 基團可相對於7,8-二氫-4H-[1,4]戴奧辛并[2',3':4,5]苯并[1,2-d][1,3]㗁𠯤-4-酮之部分位於鄰位。
式(I)中之-CH2 OR基團可相對於7,8-二氫-4H-[1,4]戴奧辛并[2',3':4,5]苯并[1,2-d][1,3]㗁𠯤-4-酮之部分位於鄰位、間位或對位。在一些實施例中，該-CH2 OR基團可相對於7,8-二氫-4H-[1,4]戴奧辛并[2',3':4,5]苯并[1,2-d][1,3]㗁𠯤-4-酮之部分位於間位。在一些實施例中，該-CH2 OR基團可相對於7,8-二氫-4H-[1,4]戴奧辛并[2',3':4,5]苯并[1,2-d][1,3]㗁𠯤-4-酮之部分位於對位。
在一些實施例中，化合物係由式(Ia)表示：
Figure 02_image008
(Ia)， 其中R係如針對式(I)定義及描述。
在式(Ia)之一些實施例中，-CH2 OR基團可相對於-SO2 CH3 基團位於鄰位、間位或對位。在一些實施例中，該-CH2 OR基團係相對於該-SO2 CH3 基團位於間位。在一些實施例中，該-CH2 OR基團係相對於該-SO2 CH3 基團位於對位。
在一些實施例中，化合物係由式(Ib)表示：
Figure 02_image010
(Ib)， 其中R係如針對式(I)定義及描述。
在一些實施例中，化合物係由式(Ic)表示：
Figure 02_image012
(Ic)， 其中R係如針對式(I)定義及描述。
參考式(I)、(Ia)、(Ib)及(Ic)中之任何一者，在一些實施例中，R為H。
在一些實施例中，化合物係由下式表示：
Figure 02_image014
。
在一些實施例中，化合物係由下式表示：
Figure 02_image016
。
參考式(I)、(Ia)、(Ib)及(Ic)中之任何一者，在一些實施例中，R係選自由-R1 及-C(O)R1a 組成之群之成員，其中R1 係C1-12 烷基，及R1a 係H或C1-12 烷基。
在式(I)、(Ia)、(Ib)及(Ic)中之任何一者之一些實施例中，R係C1-12 烷基。在一些實施例中，R係甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一基或正十二基。在一些實施例中，R係C1-6 烷基。在一些實施例中，R係甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基或正己基。在一些實施例中，R係甲基或乙基。在一些經選擇之實施例中，R係甲基。
在式(I)、(Ia)、(Ib)及(Ic)中之任何一者之一些實施例中，R係-C(O)R1a ，其中R1a 係H或C1-12 烷基。在一些實施例中，R1a 係H。在一些實施例中，R1a 係C1-12 烷基。在一些實施例中，R1a 係甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一基或正十二基。在一些實施例中，R1a 係C1-6 烷基。在一些實施例中，R1a 係甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基或正己基。在一些實施例中，R1a 係甲基或乙基。在一些經選擇之實施例中，R1a 係甲基。在一些實施例中，R係乙醯基。
在一些實施例中，化合物係由下式表示：
Figure 02_image018
。
在一些實施例中，化合物係由下式表示：
Figure 02_image020
。
表1中列舉例示性式(I)化合物。 表1：式(I)化合物
編號 結構 編號 結構
1.001
Figure 02_image014
 		 1.002
Figure 02_image016
其他形式之化合物
本發明之化合物可作為與至少一種複合劑複合之複合物存在。該等複合劑具有通過非共價二級相互作用與式(I)化合物形成複合結構之功能。該等二級相互作用可通過靜電相互作用諸如離子相互作用、H鍵、偶極-偶極相互作用、偶極誘導之偶極相互作用、倫敦分散力、π-π相互作用及疏水相互作用形成。式(I)化合物之醫藥上可接受之複合物包括其醫藥上可接受之鹽及/或溶劑合物。在一些實施例中，該式(I)化合物之醫藥上可接受之複合物係其醫藥上可接受之鹽及/或溶劑合物。在一些實施例中，該式(I)化合物之醫藥上可接受之複合物係其醫藥上可接受之鹽。在一些實施例中，該式(I)化合物之醫藥上可接受之複合物係其醫藥上可接受之溶劑合物。
本發明之某些化合物可以非溶劑化形式及溶劑化形式，包括水合形式存在。一般而言，該等溶劑化形式等同於非溶劑化形式且包含於本發明之範圍內。本發明之某些化合物可以多種結晶或非晶型形式存在。一般而言，就本發明考慮之用途而言，所有物理形式均為等同的且意欲在本發明之範圍內。
除非本文另有規定，否則本發明之化合物亦可於構成此等化合物之原子中之一或多者處含有非天然比例之原子同位素。例如，本發明之化合物可用放射性或穩定同位素諸如舉例如氘(2 H)、氚(3 H)、碘-125 (125 I)、氟-18 (18 F)、氮-15 (15 N)、氧-17 (17 O)、氧-18 (18 O)、碳-13 (13 C)或碳-14 (14 C)標記。本發明之化合物之所有同位素變化無論是否為放射性均包含於本發明之範圍內。
本發明提供呈前藥形式之化合物。本文描述之化合物之前藥係容易在生理條件下經歷化學變化以提供本發明之化合物之彼等化合物。另外，前藥可藉由化學或生物化學方法在離體環境中轉化為本發明之化合物。例如，前藥可在放置於透皮貼劑庫中時以合適之酶或化學試劑緩慢轉化為本發明之化合物。 IV.    組合物
在第二態樣中，本發明提供包括式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。在一些實施例中，該醫藥組合物包括式(Ia)化合物或其醫藥上可接受之複合物及醫藥上可接受之載劑。在一些實施例中，該醫藥組合物包括式(Ib)化合物或其醫藥上可接受之複合物及醫藥上可接受之載劑。在一些實施例中，該醫藥組合物包括式(Ic)化合物或其醫藥上可接受之複合物及醫藥上可接受之載劑。
式(I)、(Ia)、(Ib)及(Ic)中之任何一者之化合物之醫藥上可接受之複合物係經本文定義及描述。式(I)、(Ia)、(Ib)及(Ic)中之任何一者之化合物之醫藥上可接受之複合物可包括其醫藥上可接受之鹽及/或溶劑合物。
在一些實施例中，式(I)、(Ia)、(Ib)及(Ic)中之任何一者之化合物具有下式：
Figure 02_image014
， 或其醫藥上可接受之複合物。
在一些實施例中，式(I)、(Ia)、(Ib)及(Ic)中之任何一者之化合物具有下式：
Figure 02_image016
， 或其醫藥上可接受之複合物。
本文提供之化合物可使用此項技術中可獲得之方法及彼等本文揭示者調配為醫藥組合物。本文揭示之化合物中之任何一者可提供於適當之醫藥組合物中並藉由合適之投與途徑投與。
向個體投與本文描述之化合物可為局部或非全身性的，例如，局部、皮內或病灶內。在一些實施例中，該化合物可藉由局部投與進行投與。在一些實施例中，該化合物可藉由皮內投與進行投與。在一些實施例中，該化合物可藉由病灶內投與，例如，藉由病灶內注射進行投與。
本文提供之方法包括投與醫藥組合物，其等含有至少一種如本文描述之化合物，包括式(I)化合物，視需要以鹽形式或以複合物形式，單獨使用或與一或多種可相容及醫藥上可接受之載劑(諸如稀釋劑或佐劑)，或與用於治療有需要個體之遺傳性皮膚病之另一藥劑組合之形式使用。
在某些實施例中，第二藥劑可用本文提供之化合物調配或包裝。當然，當根據熟習此項技術者之判斷，此共調配應不干擾投與之藥劑之活性或投與方法時，該第二藥劑將僅用本文提供之化合物調配。在某些實施例中，本文提供之化合物及第二藥劑係經分開調配。為方便熟習此項技術之從業者，其等可包裝在一起或分開包裝。
在臨床實務中，本文提供之活性劑可藉由任何習知途徑投與，特定言之局部、皮內、病灶內、經口、非經腸、經直腸或藉由吸入(例如，以噴霧劑之形式)。在某些實施例中，本文提供之化合物係經局部、皮內或病灶內投與。在某些實施例中，本文提供之化合物係經局部投與。在某些實施例中，本文提供之化合物係經皮內投與。在某些實施例中，本文提供之化合物係經病灶內投與。
作為用於經口投與之固體組合物，可使用錠劑、丸劑、硬質明膠膠囊、粉末或顆粒。在此等組合物中，活性產品係與一或多種惰性稀釋劑或佐劑(諸如蔗糖、乳糖或澱粉)混合。
此等組合物可包含除稀釋劑外之物質，例如潤滑劑，諸如硬脂酸鎂，或意欲控制釋放之包衣。
作為用於經口投與之液體組合物，可使用醫藥上可接受之溶液、懸浮液、乳液、糖漿及酏劑，其等含有惰性稀釋劑，諸如水或液體石蠟。此等組合物亦可包含除稀釋劑外之物質，在某些實施例中，潤濕、增甜或調味產品。
作為洗劑、酊劑、乳膏、乳液、凝膠或軟膏局部投與，可使用組合物。在此等組合物中，活性產品係與一或多種惰性賦形劑，包括水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、丁烷1,3二醇、肉荳蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、礦物油及其混合物混合。
用於非經腸、病灶內或皮內投與之組合物可為乳液或無菌溶液。作為溶劑或媒劑，可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油，特定言之橄欖油，或可注射有機酯，在某些實施例中，油酸乙酯。此等組合物亦可含有佐劑，特定言之潤濕劑、等滲劑、乳化劑、分散劑及穩定劑。殺菌可以數種方式進行，在某些實施例中，使用細菌過濾器，藉由輻射或藉由加熱。其等亦可製備成無菌固體組合物之形式，其等可在使用時溶解於無菌水或任何其他可注射無菌介質中。
用於直腸投與之組合物係栓劑或直腸膠囊，除活性成分外，其等亦含有賦形劑諸如可可脂、半合成甘油酯或聚乙二醇。
組合物亦可為噴霧劑。為以液體噴霧劑之形式使用，該等組合物可為穩定之無菌溶液或在使用時溶解於無熱原無菌水、生理鹽水或任何其他醫藥上可接受之媒劑中之固體組合物。為以意欲直接吸入之乾燥噴霧劑之形式使用，活性成分可經細分並與水溶性固體稀釋劑或媒劑，在某些實施例中，聚葡糖、甘露醇或乳糖組合。
在某些實施例中，本文提供之組合物係醫藥組合物或單一單位劑型。本文提供之醫藥組合物及單一單位劑型包含預防或治療有效量之一或多種預防劑或治療劑(例如，本文提供之化合物，或其他預防劑或治療劑)，及通常一或多種醫藥上可接受之載劑或賦形劑。在一特定實施例中及在此內文中，術語「醫藥上可接受」意謂經聯邦或州政府之監管機構批准或在美國藥典或其他公認之藥典中列出用於動物中，及更特定言之用於人類中。術語「載劑」包括稀釋劑、佐劑(例如，弗氏佐劑(完全及不完全))、賦形劑或媒劑，其可與治療劑一起投與。此等醫藥載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括彼等石油、動物、植物或合成來源者，諸如花生油、豆油、礦物油、芝麻油及類似物。當靜脈內投與醫藥組合物時，可使用水作為載劑。亦可使用生理鹽水溶液及葡萄糖及甘油水溶液作為液體載劑，尤其用於可注射溶液。合適之醫藥載劑之實例係描述於Remington: The Science and Practice of Pharmacy; Pharmaceutical Press；第22版(2012年9月15日)中。
典型醫藥組合物及劑型包含一或多種賦形劑。熟習藥劑學領域者熟知合適之賦形劑，及在某些實施例中，合適之賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及類似物。特定賦形劑是否適用於併入醫藥組合物或劑型內取決於此項技術中熟知的各種因素，包括(但不限於)將向個體投與該劑型之方式及該劑型中之特定活性成分。組合物或單一單位劑型視需要亦可含有少量潤濕劑或乳化劑或pH緩衝劑。
本文提供之無乳糖組合物可包含此項技術中熟知及在某些實施例中列於美國藥典(USP 36-NF 31 S2)中之賦形劑。一般而言，無乳糖組合物包含醫藥上可相容及醫藥上可接受之量之活性成分、黏合劑/填充物及潤滑劑。例示性無乳糖劑型包含活性成分、微晶纖維素、預糊化澱粉及硬脂酸鎂。
本文進一步包含含有活性成分之無水醫藥組合物及劑型，因為水可促進一些化合物降解。例如，添加水(例如，5%)在醫藥領域中被廣泛接受為模擬長期儲存之方式，以確定諸如儲存壽命或調配物之經時穩定性之特性。參見，例如Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice，第2版，Marcel Dekker, New York, 1995，第379 80頁。實際上，水及熱量加速一些化合物分解。因此，水對調配物之影響可非常顯著，因為在調配物之製造、處理、包裝、儲存、運輸及使用期間，通常遭遇水分及/或濕度。
本文提供之無水醫藥組合物及劑型可使用無水或含有低水分之成分及低水分或低濕度條件製備。若預期在製造、包裝及/或儲存期間與水分及/或濕度實質性接觸，則包含一級胺或二級胺之包含乳糖及至少一種活性成分之醫藥組合物及劑型可為無水的。
應製備並儲存無水醫藥組合物使得維持其無水性質。因此，無水組合物可使用已知材料包裝以防止曝露於水，使得其等可包括於合適之調配套組中。在某些實施例中，合適之包裝包括(但不限於)密封箔、塑膠、單位劑量容器(例如，小瓶)、吸塑包裝及條形包裝。
本文進一步提供包含降低活性成分分解速率之一或多種化合物之醫藥組合物及劑型。本文中稱為「穩定劑」之此等化合物包括(但不限於)抗氧化劑(諸如抗壞血酸)、pH緩衝劑或鹽緩衝劑。
醫藥組合物及單一單位劑型可採取溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、粉末、緩釋調配物及類似物之形式。經口調配物可包括標準載劑諸如醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。此等組合物及劑型將含有預防或治療有效量之預防劑或治療劑，在某些實施例中，以純化形式，連同合適量之載劑一起以便於提供適用於向個體投與之形式。該調配物應適合投與模式。在某一實施例中，該等醫藥組合物或單一單位劑型為無菌的且呈適用於向個體，在某些實施例中，動物個體，諸如哺乳動物個體，在某些實施例中，人類個體投與之形式。
醫藥組合物係經調配以與其預期投與途徑相容。在某些實施例中，投與途徑包括(但不限於)非經腸，例如，靜脈內、皮內、皮下、肌內、皮下、經口、經頰、舌下、吸入、鼻內、透皮、局部、透黏膜、腫瘤內、滑膜內及經直腸投與。在某些實施例中，該投與途徑為皮內、局部或病灶內投與。在某些實施例中，該投與途徑為非全身性投與。在一特定實施例中，該組合物係根據例行性程序調配為適用於向人類靜脈內、皮下、肌內、經口、鼻內或局部投與之醫藥組合物。在一實施例中，醫藥組合物係根據例行性程序調配用於向人類皮下投與。通常，用於靜脈內投與之組合物係於無菌等滲水性緩衝劑中之溶液。視需要，該組合物亦可包括增溶劑及局部麻醉劑(諸如利多卡因)以減少注射位點處之疼痛。
在某些實施例中，劑型包括(但不限於)：錠劑；膠囊型錠劑；膠囊，諸如軟質彈性明膠膠囊；扁囊劑；片劑；菱形錠；分散液；栓劑；軟膏；泥罨劑(泥敷劑)；糊劑；粉末；敷料劑；乳膏；硬膏劑；溶液；貼劑；噴霧劑(例如，鼻噴霧劑或吸入器)；凝膠；適用於向個體經口或黏膜投與之液體劑型，包括懸浮液(例如，水性或非水性液體懸浮液、水包油乳液，或油包水液體乳液)、溶液及酏劑；適用於向個體非經腸投與之液體劑型；及可復原以提供適用於非經腸投與個體之液體劑型之無菌固體(例如結晶或非晶型固體)。
本文提供之劑型之組成、形狀及類型將通常取決於其等用途而變化。在某些實施例中，用於遺傳性皮膚病之初始治療中之劑型可含有比用於相同疾患或疾病之維持治療中之劑型較大量之一或多種所包含之活性成分。相似地，非經腸劑型可含有比用於治療相同疾病或疾患之經口劑型較少量之一或多種所包含之活性成分。本文所包含之特定劑型將彼此不同之此等及其他方式為熟習此項技術者輕易知曉。參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy; Pharmaceutical Press；第22版(2012年9月15日)。
一般而言，組合物之成分係分開或混合在一起呈單位劑型，在某些實施例中，呈凍乾粉或無水濃縮物於密閉容器(諸如指示活性劑數量之安瓿或藥包)中供應。在該組合物欲藉由輸注投與之情況下，其可用含有無菌醫藥級水或生理鹽水之輸注瓶分配。在該組合物係藉由注射投與之情況下，可提供注射用無菌水或生理鹽水之安瓿使得成分可在投與前混合。
典型劑型包含本文提供之化合物或其醫藥上可接受之複合物、溶劑合物或水合物，於每天約0.1 mg至約1000 mg之範圍內，以一天一次單劑量在早上給藥或在一天內以分次劑量隨食物一起給藥。特定劑型可具有約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、100、200、250、500或1000 mg之活性化合物。 經口劑型
適用於經口投與之醫藥組合物可呈現為離散劑型，諸如(但不限於)錠劑(例如可咀嚼錠劑)、膠囊型錠劑、膠囊及液體(例如風味糖漿)。此等劑型含有預定量之活性成分，及可藉由熟習此項技術者熟知的藥學方法製備。通常參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy; Pharmaceutical Press；第22版(2012年9月15日)。
在某些實施例中，如本文中詳細描述，經口劑型為固體及在無水疾病或疾患下用無水成分製備。然而，本文提供之組合物之範圍延伸超越無水、固體經口劑型。因此，本文描述其他形式。
典型經口劑型係藉由根據習知醫藥混合技術，將活性成分與至少一種賦形劑組合成緊密混合物製備。取決於投與所需之製劑形式，賦形劑可採取各種形式。在某些實施例中，適用於經口液體或噴霧劑劑型之賦形劑包括(但不限於)水、二醇、油、醇、調味劑、防腐劑及著色劑。在某些實施例中，適用於固體經口劑型(例如，粉末、錠劑、膠囊及膠囊型錠劑)之賦形劑包括(但不限於)澱粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、造粒劑、潤滑劑、黏合劑及崩解劑。
因為錠劑及膠囊易於投與，所以其等代表最有利之經口劑量單位形式，在此情況下採用固體賦形劑。視需要，錠劑可藉由標準水性或非水性技術包覆。此等劑型可藉由藥學方法中之任何一者製備。一般而言，醫藥組合物及劑型係藉由均勻並緊密混合活性成分與液體載劑、細分之固體載劑或兩者，及然後視需要使產品成形為所需呈現製備。
在某些實施例中，錠劑可藉由壓縮或模製製備。壓縮錠劑可藉由在合適之機器中以自由流動之形式(諸如粉末或顆粒)壓縮活性成分，視需要與賦形劑混合製備。模製錠劑可藉由在合適之機器中模製經惰性液體稀釋劑沾濕之粉狀化合物之混合物製得。
在某些實施例中，可用於經口劑型中之賦形劑包括(但不限於)黏合劑、填充物、崩解劑及潤滑劑。適用於醫藥組合物及劑型中之黏合劑包括(但不限於)玉米澱粉、土豆澱粉或其他澱粉、明膠、天然及合成樹膠(諸如阿拉伯樹膠)、海藻酸鈉、海藻酸、其他海藻酸鹽、粉狀黃蓍膠、瓜爾膠、纖維素及其衍生物(例如，乙基纖維素、乙酸纖維素、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉)、聚乙烯吡咯啶酮、甲基纖維素、預糊化澱粉、羥丙基甲基纖維素(例如，編號2208、2906、2910)、微晶纖維素及其混合物。
在某些實施例中，適用於本文揭示之醫藥組合物及劑型中之填充物包括(但不限於)滑石、碳酸鈣(例如，顆粒或粉末)、微晶纖維素、粉狀纖維素、葡萄糖結合劑、高嶺土、甘露醇、矽酸、山梨醇、澱粉、預糊化澱粉及其混合物。醫藥組合物中之黏合劑或填充物通常以該醫藥組合物或劑型之約50至約99重量%存在。
在某些實施例中，微晶纖維素之合適形式包括(但不限於)作為AVICEL PH 101、AVICEL PH 103 AVICEL RC 581、AVICEL PH 105銷售之材料(購買自FMC公司，American Viscose Division, Avicel Sales, Marcus Hook, PA)及其混合物。特定黏合劑為作為AVICEL RC 581銷售之微晶纖維素及羧甲基纖維素鈉之混合物。合適之無水或低水分賦形劑或添加劑包括AVICEL PH 103™及澱粉1500 LM。
用於組合物中以提供錠劑之崩解劑在曝露於水性環境時崩解。含有過多崩解劑之錠劑可在儲存時崩解，而彼等含有過少崩解劑之錠劑在所需速率或所需條件下可不崩解。因此，既非過多抑或過少以至於不利改變活性成分之釋放之足量之崩解劑應用於形成固體經口劑型。使用之崩解劑之量基於調配物之類型變化，且可由一般技術者容易辨別。典型醫藥組合物包含約0.5至約15重量%之崩解劑，具體言之約1至約5重量%之崩解劑。
可用於醫藥組合物及劑型中之崩解劑包括(但不限於)瓊脂、海藻酸、碳酸鈣、微晶纖維素、交聯羧甲基纖維素鈉、交聚維酮、保拉克裡林鉀(polacrilin potassium)、羥乙酸澱粉鈉、土豆或木薯澱粉、預糊化澱粉、其他澱粉、黏土、其他海藻類、其他纖維素、樹膠及其混合物。
可用於醫藥組合物及劑型中之潤滑劑包括(但不限於)硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、礦物油、輕質礦物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其他二醇、硬脂酸、月桂基硫酸鈉、滑石、氫化植物油(例如，花生油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油及豆油)、硬脂酸鋅、油酸乙酯、月桂酸乙酯、瓊脂及其混合物。額外潤滑劑包括在某些實施例中二氧化矽矽膠(AEROSIL 200，由W.R. Grace Co. of Baltimore, MD製造)、合成二氧化矽之凝結噴霧劑(由Degussa Co. of Plano, TX銷售)、CAB O SIL (由Cabot Co. of Boston, MA銷售之熱解二氧化矽產品)及其混合物。若完全使用，則潤滑劑係通常以小於約1重量%之其中併入其等之醫藥組合物或劑型之量使用。 延遲釋放劑型
活性成分(諸如本文提供之化合物)可由一般技術者熟知的控釋構件或遞送裝置投與。在某些實施例中，但不限於彼等描述於美國專利：第3,845,770號；第3,916,899號；第3,536,809號；第3,598,123號；第4,008,719號；第5,674,533號；第5,059,595號；第5,591,767號；第5,120,548號；第5,073,543號；第5,639,476號；第5,354,556號；第5,639,480號；第5,733,566號；第5,739,108號；第5,891,474號；第5,922,356號；第5,972,891號；第5,980,945號；第5,993,855號；第6,045,830號；第6,087,324號；第6,113,943號；第6,197,350號；第6,248,363號；第6,264,970號；第6,267,981號；第6,376,461號；第6,419,961號；第6,589,548號；第6,613,358號；及第6,699,500號中者；其等中之各者係以全文引用之方式併入本文中。此等劑型可用於提供一或多種活性成分之緩釋或控釋，在某些實施例中，使用羥丙基甲基纖維素、其他聚合物基質、凝膠、滲透膜、滲透系統、多層包衣、微粒、脂質體、微球或其組合以不同比例提供所需釋放曲線。一般技術者已知的合適之控釋調配物(包括彼等本文描述者)可容易選擇用於與本文提供之活性成分一起使用。因此，本文包含適用於經口投與之單一單位劑型，諸如(但不限於)適用於控釋之錠劑、膠囊、明膠膠囊(gel caps)及膠囊型錠劑。
所有控釋醫藥產品具有改善藥物療法以優於由其等非可控相對物達成者之一般目標。理想地，在醫療中使用經最佳化設計之控釋製劑之特徵係在最短時間內採用最少藥物治癒或控制疾病或疾患。控釋調配物之優勢包括藥物之活性延長、劑量頻率降低及個體依從性增加。另外，控釋調配物可用於影響起效時間或其他特性，諸如藥物之血液濃度，且因此可影響副(例如，不利)作用之出現。
大部分控釋調配物係經設計以初始釋放迅速產生所需治療效應之量之藥物(活性成分)，並逐步及持續釋放其他量之藥物以在延長之期間內維持此濃度之治療或預防效應。為在體內維持此恆定濃度之藥物，該藥物必須以將替代自體內代謝及排泄之藥物之量的速率自該劑型釋放。活性成分之控釋可由各種疾病或疾患刺激，包括(但不限於) pH、溫度、酶、水或其他生理疾病或疾患或化合物。
在某些實施例中，藥物可使用靜脈內輸注、植入式滲透泵、透皮貼劑、脂質體或其他投與模式進行投與。在某些實施例中，可使用泵(參見，Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987)；Buchwald等人，Surgery 88:507 (1980)；Saudek等人，N. Engl. J. Med. 321:574 (1989))。在另一實施例中，可使用聚合材料。在又另一實施例中，控釋系統可放置於個體中由熟習從業者確定之適當位點，即，因此僅需全身劑量之一部分(參見，Goodson, Medical Applications of Controlled Release，第2卷，第115至138頁(1984))。其他控釋系統係在Langer (Science 249:1527-1533 (1990))之綜述中討論。可將活性成分分散於固體內部基質中，例如，聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、塑化或非塑化聚氯乙烯、塑化尼龍、塑化聚對苯二甲酸乙二酯、天然橡膠、聚異戊二烯、聚異丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、矽樹脂橡膠、聚二甲基矽氧烷、碳酸矽酯共聚物、親水性聚合物(諸如丙烯酸酯及甲基丙烯酸酯之水凝膠)、膠原、交聯聚乙烯醇及交聯部分水解之聚乙酸乙烯酯，其由外部聚合物膜包圍，例如，聚乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、矽樹脂橡膠、聚二甲基矽氧烷、氯丁橡膠、氯化聚乙烯、聚氯乙烯、與乙酸乙烯酯之氯乙烯共聚物、偏二氯乙烯、乙烯及丙烯、離聚物聚對苯二甲酸乙二醇酯、丁基橡膠表氯醇橡膠、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三元共聚物，及乙烯/乙烯氧基乙醇共聚物，其不溶於體液中。然後活性成分在釋放速率控制步驟中擴散通過外部聚合物膜。活性成分在此等非經腸組合物中之百分率係高度依賴於其特定性質，及個體之需求。 非經腸劑型
在某些實施例中，本文提供非經腸劑型。在某些實施例中，非經腸劑型可藉由各種途徑向個體投與，包括(但不限於)皮下、靜脈內(包括推注)、肌內及動脈內。在某些實施例中，非經腸劑型可藉由各種途徑向個體投與，包括(但不限於)局部、皮內或病灶內。因為其等投與通常繞過個體針對污染物之天然防禦，所以非經腸劑型通常為無菌或可在向個體投與前殺菌。在某些實施例中，非經腸劑型包括(但不限於)準備注射之溶液、準備溶解或懸浮於用於注射之醫藥上可接受之媒劑中之乾燥產品、準備注射之懸浮液及乳液。
可用於提供非經腸劑型之合適之媒劑係為熟習此項技術者熟知。在某些實施例中，合適之媒劑包括(但不限於)：注射用水USP；水性媒劑諸如(但不限於)氯化鈉注射劑、林格氏(Ringer’s)注射劑、葡萄糖注射劑、葡萄糖及氯化鈉注射劑及乳酸林格氏注射劑；可與水混溶之媒劑諸如(但不限於)乙醇、聚乙二醇及聚丙二醇；及非水性媒劑諸如(但不限於)玉米油、棉花籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉荳蔻酸異丙酯及苯甲酸苯甲酯。
增加本文揭示之活性成分中之一或多者之溶解度之化合物亦可併入非經腸劑型內。 透皮、局部及黏膜劑型
本文亦提供透皮、局部及黏膜劑型。透皮、局部及黏膜劑型包括(但不限於)滴眼液、噴霧劑、噴霧劑、乳膏、洗劑、軟膏、凝膠、溶液、乳液、懸浮液或熟習此項技術者已知的其他形式。參見，例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy; Pharmaceutical Press；第22版(2012年9月15日)；及Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第4版，Lea & Febiger, Philadelphia (1985)。適用於治療口腔內之黏膜組織之劑型可調配為漱口水或經口凝膠。此外，透皮劑型包括「儲庫型」或「基質型」貼劑，其等可施用至皮膚並敷用特定之期間以允許所需量之活性成分之滲透。
術語「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥上可接受之材料、組合物或媒劑，諸如液體或固體填充物、稀釋劑、賦形劑、溶劑或囊封材料，涉及攜載或運輸任何標的組合物或其組分。在可與標的組合物及其組分相容之意義上，各載劑必須為「可接受」的且對病患無害。可用於提供本文包含之透皮、局部及黏膜劑型之合適之載劑(例如，賦形劑及稀釋劑)及其他材料係為熟習醫藥領域者熟知，且取決於將施用給定醫藥組合物或劑型之特定組織。考慮到該事實，典型載劑包括(但不限於)水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、丁烷1,3二醇、肉荳蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、礦物油及其混合物以形成洗劑、酊劑、乳膏、乳液、凝膠或軟膏，其等為無毒且醫藥上可接受的。在一些實施例中，可用作醫藥上可接受之載劑之材料包括：(1)糖，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；(2)澱粉，諸如玉米澱粉及土豆澱粉；(3)纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及乙酸纖維素；(4)粉狀黃蓍膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石；(8)賦形劑，諸如可可脂及栓劑蠟；(9)油，諸如花生油、棉花籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及豆油；(10)二醇，諸如丙二醇；(11)多元醇，諸如甘油、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇；(12)酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無熱原水；(17)等滲生理鹽水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩衝溶液；及(21)醫藥調配物中採用之其他無毒可相容物質。視需要，亦可向醫藥組合物及劑型添加保濕劑或濕潤劑。此等額外成分之實例係為此項技術中熟知的。參見，例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy; Pharmaceutical Press；第22版(2012年9月15日)。
取決於待治療之特定組織，額外組分可在使用本文提供之活性成分治療之前、同時或之後使用。在某些實施例中，可使用滲透增強劑以幫助將該等活性成分遞送至該組織。合適之滲透增強劑包括(但不限於)：丙酮；各種醇，諸如乙醇、油醇及四氫呋喃；烷基亞碸，諸如二甲基亞碸；二甲基乙醯胺；二甲基甲醯胺；聚乙二醇；吡咯啶酮，諸如聚乙烯吡咯啶酮；柯利登等級(Kollidon grades) (聚維酮(Povidone、Polyvidone))；尿素；及各種水溶性或不溶性糖酯諸如Tween 80 (聚山梨酯80)及Span 60 (脫水山梨醇單硬脂酸酯)。
亦可調節醫藥組合物或劑型，或施用醫藥組合物或劑型之組織之pH以改善一或多種活性成分之遞送。同樣，可調節溶劑載劑之極性、其離子強度或張力以改善遞送。化合物(諸如硬脂酸酯)亦可添加至醫藥組合物或劑型以有利改變一或多種活性成分之親水性或親油性以便於改善遞送。在此方面，硬脂酸酯可用作調配物之脂質媒劑、用作乳化劑或表面活性劑，及用作遞送增強劑或滲透增強劑。可使用活性成分之不同複合物、鹽、水合物或溶劑合物以進一步調節所得組合物之性質。 劑量及單位劑型
在人類治療中，醫生將根據預防性或療癒性治療及根據年齡、體重、疾患或疾病之階段及針對待治療之個體之其他因素確定其認為最適當之劑量學。在某些實施例中，劑量為針對成人每天約1至約1000 mg，或針對成人每天約5至約250 mg或每天約10至50 mg。在某些實施例中，劑量為每個成人每天約5至約400 mg或每天25至200 mg。在某些實施例中，亦考慮每天約50至約500 mg之劑量率。
在其他態樣中，本文提供藉由向有需要個體投與治療或預防有效量之本文提供之化合物或其醫藥上可接受之複合物治療有需要個體之疾病或疾患及/或治療個體之遺傳性皮膚病之方法。在治療疾患或其一或多種症狀中治療或預防有效之化合物或組合物之量將隨該疾病或病症之性質及嚴重程度及投與活性成分之途徑而變化。頻率及劑量亦將根據針對各個體特定之因素取決於投與之特定療法(例如，治療劑或預防劑)、疾患、疾病或病症之嚴重程度、投與途徑及個體之年齡、身體、體重、反應及既往病史而變化。有效劑量可自來源於活體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線外推。
在某些實施例中，組合物之例示性劑量包括毫克或微克量之活性化合物/公斤個體或樣本重量(例如，約10微克/公斤至約50毫克/公斤、約100微克/公斤至約25毫克/公斤或約100微克/公斤至約10毫克/公斤)。關於本文提供之組合物，在某些實施例中，基於活性化合物之重量，向個體投與之劑量為0.140 mg/kg至3 mg/kg個體之體重。在某些實施例中，向個體投與之劑量為0.20 mg/kg至2.00 mg/kg、0.30 mg/kg至1.50 mg/kg、1 mg/kg至100 mg/kg、5 mg/kg至50 mg/kg、10 mg/kg至50 mg/kg、20 mg/kg至50 mg/kg、15 mg/kg至40 mg/kg、15 mg/kg至35 mg/kg、15 mg/kg至30 mg/kg、25 mg/kg至35 mg/kg、10 mg/kg至30 mg/kg、10 mg/kg至20 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg或約50 mg/kg個體之體重。
在某些實施例中，針對本文描述之疾病或疾患建議之本文提供之組合物之每日劑量範圍在每天約0.1 mg至約1000 mg之範圍內，作為單一一天一次劑量給藥或在一天內作為分次劑量給藥。在某些實施例中，該每日劑量係以等分劑量每天兩次投與。在某些實施例中，每日劑量範圍應為每天約10 mg至約200 mg，在其他實施例中，每天約10 mg至約150 mg，在其他實施例中，每天約25至約100 mg。如一般技術者應知曉，在一些情況下，可有必要使用在本文揭示之範圍外之活性成分之劑量。此外，應注意臨床醫師或主治醫師將已知結合個體反應中斷、調節或終止療法之方式及時間。
如一般技術者容易知曉，不同之治療有效量可應用於不同之疾病及病症。同樣，足以預防、控制、治療或改善此等疾患，但不足以引起，或足以減少，與本文提供之組合物相關聯之副作用之量係包含於本文描述之劑量及劑量頻率時間表內。此外，當向個體投與多個劑量之本文提供之組合物時，非所有劑量均需為相同的。在某些實施例中，可增加向該個體投與之劑量以改善該組合物之預防或治療效應或可將其降低以減少特定個體正經歷之一或多個副作用。
在某些實施例中，基於活性化合物之重量，經投與以預防、治療、控制或改善個體之疾患或其一或多種症狀之本文提供之組合物之劑量係0.1 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、10 mg/kg或15 mg/kg或更多個體之體重。在另一實施例中，經投與以預防、治療、控制或改善個體之疾患或其一或多種症狀之組合物或本文提供之組合物之劑量係0.1 mg至200 mg、0.1 mg至100 mg、0.1 mg至50 mg、0.1 mg至25 mg、0.1 mg至20 mg、0.1 mg至15 mg、0.1 mg至10 mg、0.1 mg至7.5 mg、0.1 mg至5 mg、0.1至2.5 mg、0.25 mg至20 mg、0.25至15 mg、0.25至12 mg、0.25至10 mg、0.25 mg至7.5 mg、0.25 mg至5 mg、0.5 mg至2.5 mg、1 mg至20 mg、1 mg至15 mg、1 mg至12 mg、1 mg至10 mg、1 mg至7.5 mg、1 mg至5 mg或1 mg至2.5 mg之單位劑量。
在某些實施例中，治療或預防可用一或多個負荷劑量之本文提供之化合物或組合物，接著一或多個維持劑量開始。在此等實施例中，該負荷劑量可為(例如)每天約60至約400 mg或每天約100至約200 mg，歷時一天至五週。該負荷劑量可在(例如)一或多個維持劑量之後。在某些實施例中，各維持劑量(獨立地)係每天約10 mg至約200 mg、每天約25 mg至約150 mg或每天約25至約80 mg。維持劑量可每天投與及可作為單一劑量或作為分次劑量投與。
在某些實施例中，本文提供之化合物或組合物之劑量可經投與以達成活性成分在個體之血液或血清中之穩態濃度。該穩態濃度可藉由量測根據熟習此項技術者可獲得之技術或可基於個體之身體特性諸如身高、體重及年齡測定。在某些實施例中，足量之本文提供之化合物或組合物係經投與以在個體之血液或血清中達成約300至約4000 ng/mL、約400至約1600 ng/mL、約600至約1200 ng/mL之穩態濃度。在某些實施例中，足量之本文提供之化合物或組合物係經局部投與以在個體之血液或血清中達成約0.01至約300 ng/mL、約0.01至約100 ng/mL、約0.01至約10 ng/mL、約0.01至約1 ng/mL、約0.01至約0.1 ng/mL或約0.01至約0.05 ng/mL之穩態濃度。在一些實施例中，負荷劑量可經投與以達成約1200至約8000 ng/mL或約2000至約4000 ng/mL之穩態血液或血清濃度，歷時一至五天。在一些實施例中，負荷劑量可經局部投與以達成約0.05至約1200 ng/mL、約0.05至約100 ng/mL、約0.05至約10 ng/mL、約0.05至約1 ng/mL、約0.05至約0.5 ng/mL或約0.05至約0.1 ng/mL之穩態血液或血清濃度，歷時一至五天。在某些實施例中，維持劑量可經投與以在個體之血液或血清中達成約300至約4000 ng/mL、約400至約1600 ng/mL或約600至約1200 ng/mL之穩態濃度。在某些實施例中，維持劑量可經局部投與以在個體之血液或血清中達成約0.01至約300 ng/mL、約0.01至約100 ng/mL、約0.01至約10 ng/mL、約0.01至約1 ng/mL、約0.01至約0.1 ng/mL，或約0.01至約0.05 ng/mL之穩態濃度。
在某些實施例中，相同組合物之投與可重複及該等投與可間隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2個月、75天、3個月或6個月。在其他實施例中，相同預防劑或治療劑之投與可重複及該等投與可間隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2個月、75天、3個月或6個月。
在某些態樣中，本文提供呈適用於投與之形式之包含化合物或其醫藥上可接受之複合物之單位劑量。本文中詳細描述此等形式。在某些實施例中，該單位劑量包含1至1000 mg、5至250 mg或10至50 mg活性成分。在特定實施例中，該等單位劑量包含約1、5、10、25、50、100、125、250、500或1000 mg活性成分。此等單位劑量可根據熟習此項技術者熟悉之技術製備。
取決於採用之劑型及利用之投與途徑，劑量可於一定範圍內變化。關於任何化合物，治療有效劑量最初可自細胞培養分析評估。劑量可在動物模型中調配以在患有病變之皮膚(例如，納瑟頓症候群，或由KLK蛋白酶介導之皮膚病)中達成一定濃度，其包括如在細胞培養物中測定之IC50 (即，達成症狀之半最大抑制之測試化合物之濃度)。此等資訊可用於更精確確定人類中之有用劑量。另外，血漿中之濃度可(例如)藉由高效液相層析術量測，以確定全身性曝露。
亦應瞭解用於任何特定病患之特定劑量及治療方案將取決於各種因素，包括採用之特定化合物之活性、年齡、病變大小、病變數量、一般健康、性別、飲食、投與時間、藥物組合及主治醫師之判斷及治療中之特定疾病之嚴重程度。本文描述之式(I)化合物在該組合物中之量亦將取決於該組合物中之特定式(I)化合物。
在一些實施例中，局部劑量係約0.01 μg/cm2 、約0.05 μg/cm2 、約0.1 μg/cm2 、約0.15 μg/cm2 、約0.2 μg/cm2 、約0.3 μg /cm2 、約0.4 μg/ cm2 、約0.5 μg/cm2 、約0.6 μg/cm2 、約0.7 μg/cm2 、約0.8 μg/cm2 或約0.9 μg/cm2 ；或係於約0.01至0.03 μg/cm2 、約0.03至0.05 μg/cm2 、約0.05至0.1 μg/cm2 、約0.1至0.3 μg/cm2 、約0.3至0.5 μg/cm2 、約0.5至0.8 μg/cm2 、約0.8至1.0 μg/cm2 、約1至10 μg/cm2 、約10至20 μg/cm2 、約20至30 μg/cm2 、約30至40 μg/cm2 、約40至50 μg/cm2 、約50至60 μg/cm2 、約60至70 μg/cm2 、約70至80 μg/cm2 、約80至90 μg/cm2 、約90至100 μg/cm2 、約100至125 μg/cm2 、約125至150 μg/cm2 、約150至175 μg/cm2 、約175至200 μg/cm2 、約200至250 μg/cm2 、約250至300 μg/cm2 、約300至350 μg/cm2 、約350至400 μg/cm2 、約400至450 μg/cm2 、約450至500 μg/cm2 、約500至550 μg/cm2 、約550至600 μg/cm2 、約600至650 μg/cm2 、約650至700 μg/cm2 、約700至750 μg/cm2 、約750至800 μg/cm2 、約800至850 μg/cm2 、約850至900 μg/cm2 、約900至950 μg/cm2 或約950至1000 μg/cm2 。
在一些實施例中，局部劑量係於約0.5至1.0 mg/cm2 、1.0至1.5 mg/cm2 、1.5至2.0 mg/cm2 、2.5至2.5 mg/cm2 、3.0至3.5 mg/cm2 、3.5至5.0 mg/cm2 、5.0至7.5 mg/cm2 、7.5至10 mg/cm2 、1至10 mg/cm2 、約10至20 mg/cm2 、約20至30 mg/cm2 、約30至40 mg/cm2 、約40至50 mg/cm2 、約50至60 mg/cm2 、約60至70 mg/cm2 、約70至80 mg/cm2 、約80至90 mg/cm2 、約90至100 mg/cm2 、約100至125 mg/cm2 、約125至150 mg/cm2 、約150至175 mg/cm2 、約175至200 mg/cm2 、約200至250 mg/cm2 、約250至300 mg/cm2 、約300至350 mg/cm2 、約350至400 mg/cm2 、約400至450 mg/cm2 、約450至500 mg/cm2 、約500至550 mg/cm2 、約550至600 mg/cm2 、約600至650 mg/cm2 、約650至700 mg/cm2 、約700至750 mg/cm2 、約750至800 mg/cm2 、約800至850 mg/cm2 、約850至900 mg/cm2 、約900至950 mg/cm2 或約950至1000 mg/cm2 內。 V. 方法
在第三態樣中，本文提供用於治療有需要個體之與一或多種KLK蛋白酶之蛋白水解活性相關聯之皮膚病之方法。該方法包括向該個體投與治療有效量之式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物，或包括該式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物之醫藥組合物。
在一些實施例中，式(I)化合物具有下式：
Figure 02_image014
， 或其醫藥上可接受之複合物。
在一些實施例中，式(I)化合物具有下式：
Figure 02_image016
， 或其醫藥上可接受之複合物。
式(I)化合物之醫藥上可接受之複合物係經本文定義及描述。式(I)化合物之醫藥上可接受之複合物可包括其醫藥上可接受之鹽，及/或溶劑合物。
在一些實施例中，皮膚病為遺傳性皮膚病。在一些實施例中，該遺傳性皮膚病為納瑟頓症候群。
在一些實施例中，個體具有絲胺酸蛋白酶抑制劑卡紮爾型5 (SPINK5)之經截短功能喪失突變。在一些實施例中，該個體具有LEKTI (淋巴上皮卡紮爾型抑制劑)功能喪失。在一些實施例中，該個體具有一或多種激肽釋放素(KLK)絲胺酸蛋白酶之過表現。在一些實施例中，該個體具有一或多種KLK5、KLK7及KLK14蛋白酶之過表現。在一些實施例中，該個體具有KLK5蛋白酶之過表現。在一些實施例中，該個體具有KLK7蛋白酶之過表現。在一些實施例中，該個體具有KLK14蛋白酶之過表現。在一些實施例中，該個體具有KLK5及KLK7蛋白酶之過表現。在一些實施例中，該個體具有KLK5、KLK7及KLK14蛋白酶之過表現。在一些實施例中，該個體具有一或多種激肽釋放素(KLK)絲胺酸蛋白酶之升高蛋白水解活性。在一些實施例中，該個體具有一或多種KLK5、KLK7及KLK14蛋白酶之升高蛋白水解活性。在一些實施例中，該個體具有KLK5蛋白酶之升高蛋白水解活性。在一些實施例中，該個體具有KLK7蛋白酶之升高蛋白水解活性。在一些實施例中，該個體具有KLK14蛋白酶之升高蛋白水解活性。在一些實施例中，該個體具有KLK5及KLK7蛋白酶之升高蛋白水解活性。在一些實施例中，該個體具有KLK5、KLK7及KLK14蛋白酶之升高蛋白水解活性。
在一些實施例中，本文提供用於治療有需要個體之納瑟頓症候群之方法。該方法包括向該個體投與治療有效量之式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物，或包括該式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物之醫藥組合物。
在一些實施例中，本文提供用於治療有需要個體之遺傳性皮膚病之方法及該遺傳性皮膚病係由一或多種KLK蛋白酶介導。該方法包括向該個體投與治療有效量之式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物，或包括該式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物之醫藥組合物。在一些實施例中，該遺傳性皮膚病係由KLK5蛋白酶、KLK7蛋白酶、KLK14蛋白酶或其組合介導。在一些實施例中，該遺傳性皮膚病係由KLK5蛋白酶介導。在一些實施例中，該遺傳性皮膚病係由KLK7蛋白酶介導。在一些實施例中，該遺傳性皮膚病係由KLK14蛋白酶介導。在一些實施例中，該遺傳性皮膚病係由KLK5及KLK7蛋白酶兩者介導。在一些實施例中，該遺傳性皮膚病係由KLK5、KLK7及KLK14蛋白酶介導。在一些實施例中，該遺傳性皮膚病為納瑟頓症候群。
在一些實施例中，本文提供藉由抑制一或多種KLK蛋白酶之蛋白水解活性治療個體之遺傳性皮膚病之方法。該方法包括向該個體投與治療有效量之式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物，或包括該式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物之醫藥組合物。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制一或多種KLK蛋白酶之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制KLK5蛋白酶、KLK7蛋白酶、KLK14蛋白酶或其組合之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制KLK5蛋白酶之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制KLK7蛋白酶之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制KLK14蛋白酶之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制KLK5及KLK7蛋白酶之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制KLK5、KLK7及KLK14蛋白酶之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物係KLK5抑制劑。在一些實施例中，該式(I)化合物係KLK7抑制劑。在一些實施例中，該式(I)化合物係KLK14抑制劑。在一些實施例中，該式(I)化合物係雙重KLK5/KLK7抑制劑。在一些實施例中，該遺傳性皮膚病為納瑟頓症候群。
在一些實施例中，本文提供藉由抑制一或多種KLK蛋白酶之蛋白水解活性治療個體之納瑟頓症候群之方法。該方法包括向該個體投與治療有效量之式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物，或包括該式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物之醫藥組合物。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制一或多種KLK蛋白酶之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制KLK5蛋白酶、KLK7蛋白酶、KLK14蛋白酶或其組合之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制KLK5蛋白酶之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制KLK7蛋白酶之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制KLK14蛋白酶之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制KLK5及KLK7蛋白酶之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制KLK5、KLK7及KLK14蛋白酶之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物係KLK5抑制劑。在一些實施例中，該式(I)化合物係KLK7抑制劑。在一些實施例中，該式(I)化合物係KLK14抑制劑。在一些實施例中，該式(I)化合物係雙重KLK5/KLK7抑制劑。
本發明之化合物適用於藉由抑制一或多種KLK蛋白酶之蛋白水解活性及促進健康之皮膚發育保護皮膚。因此，在另一態樣中，本文提供用於治療有需要個體之皮膚病之方法及該皮膚病係由一或多種KLK蛋白酶介導。該方法包括向該個體投與治療有效量之式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物，或包括該式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物之醫藥組合物。在一些實施例中，該皮膚病係由KLK5蛋白酶、KLK7蛋白酶、KLK14蛋白酶或其組合介導。在一些實施例中，該皮膚病係由KLK5蛋白酶介導。在一些實施例中，該皮膚病係由KLK7蛋白酶介導。在一些實施例中，該皮膚病係由KLK14蛋白酶介導。在一些實施例中，該皮膚病係由KLK5及KLK7蛋白酶兩者介導。在一些實施例中，該皮膚病係由KLK5、KLK7及KLK14蛋白酶介導。在一些實施例中，該皮膚病為KLK介導之疾病，其選自由以下組成之群：納瑟頓症候群、脫皮症候群、酒渣性痤瘡、牛皮癬、濕疹及特應性皮炎。在一些實施例中，該KLK介導之疾病為納瑟頓症候群。
在一些實施例中，本文提供藉由抑制一或多種KLK蛋白酶之蛋白水解活性治療個體之皮膚病之方法。該方法包括向該個體投與治療有效量之式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物，或包括該式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物之醫藥組合物。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制一或多種KLK蛋白酶之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制KLK5蛋白酶、KLK7蛋白酶、KLK14蛋白酶或其組合之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制KLK5蛋白酶之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制KLK7蛋白酶之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制KLK14蛋白酶之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制KLK5及KLK7蛋白酶之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物抑制KLK5、KLK7及KLK14蛋白酶之蛋白水解活性。在一些實施例中，該式(I)化合物係KLK5抑制劑。在一些實施例中，該式(I)化合物係KLK7抑制劑。在一些實施例中，該式(I)化合物係KLK14抑制劑。在一些實施例中，該式(I)化合物係雙重KLK5/KLK7抑制劑。在一些實施例中，該皮膚病選自由以下組成之群：納瑟頓症候群、脫皮症候群、酒渣性痤瘡、牛皮癬、濕疹及特應性皮炎。在一些實施例中，該皮膚病為納瑟頓症候群。
式(I)化合物或包括本發明之式(I)化合物之醫藥組合物可用於預防性及治療性治療個體之皮膚病或病理學，或其他非所需之皮膚病症。例如，本發明之組合物可用於預防皮膚刺激、預防皮疹、在已出現皮疹或刺激後促進皮膚組織之癒合(即，建立皮膚之表皮及/或真皮層)、預防及/或延緩皮膚萎縮、預防及/或延緩皮膚上出現蛛形血管及/或紅色斑點、預防及/或延緩皮膚脫皮、預防及/或緩解皮膚瘙癢、調節皮膚肌理(例如，改善脫皮、粗糙度、腫脹及酸痛)，及改善膚色(例如，減少泛紅)。
個體之遺傳性皮膚病或皮膚病之預防性或治療性治療可藉由以皮膚洗劑、乳膏、凝膠、泡沫、軟膏、糊劑、乳液、噴霧劑、調節劑、補劑、貼劑或較佳預期留在皮膚上之類似物之形式施用式(I)化合物或其醫藥組合物實踐。在向皮膚施用該組合物後，其可在皮膚上保留至少約15分鐘、或至少約30分鐘、或至少約1小時、或至少數小時，例如，至少約2小時、3小時、6小時、12小時或24小時。
本發明之化合物亦適用於藉由在細胞/組織培養程序中抑制一或多種KLK蛋白酶之蛋白酶活性活體外調節脫屑。因此，在一額外態樣中，本發明提供用於活體外分解細胞或組織之方法，該方法包括使該等細胞或組織曝露於KLK蛋白酶(例如，KLK5、KLK7及/或KLK14)，接著曝露於本發明之式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物之步驟。
應知曉此方法一般已應用於細胞培養程序，在該情況下，該方法可用於離解及分離細胞用於傳代。此外，此方法可用於培養人造皮膚，其中由KLK蛋白酶(例如，KLK5、KLK7及/或KLK14)選擇性裂解細胞-細胞黏附蛋白結合由式(I)化合物、其醫藥上可接受之複合物調節此裂解導致更適用於後續治療用途之細胞/組織。
在另一態樣中，本文提供用於確定一或多種KLK蛋白酶在皮膚中之蛋白水解活性之活體外分析。該方法包括1)製備皮膚提取物；2)使受質及式(I)化合物或其醫藥上可接受之複合物曝露於該皮膚提取物；及3)測定該受質之蛋白水解裂解之速率。在一些實施例中，該受質係肽-對硝基醯胺苯(亦稱為肽-pNA)。在一些實施例中，該受質係二肽-pNA、三肽-pNA、四肽-pNA、五肽-pNA或六肽-pNA。在一些實施例中，該受質係四肽-pNA。在一些實施例中，該受質係Tyr-Arg-Ser-Arg-pNA或Lys-His-Leu-Tyr-pNA。在一些實施例中，該受質係Tyr-Arg-Ser-Arg-pNA。在一些實施例中，該受質係Lys-His-Leu-Tyr-pNA。該皮膚提取物可為人類皮膚提取物或動物皮膚提取物(例如，小鼠)。在一些實施例中，該皮膚提取物為人類皮膚提取物。 VI.   實例 一般合成方法
如本文使用，此等方法、方案及實例中使用之符號及慣例，無論特定縮寫是否經特定定義，均與彼等當代科學文獻例如，the Journal of the American Chemical Society or the Journal of Biological Chemistry中使用者一致。具體言之(但不限於)，下列縮寫可用於實例及整個說明書中：eq. (當量)；g (公克)；mg (毫克)；mL (毫升)；μL (微升)；mM (毫莫耳)；μM (微莫耳)；Hz (赫茲)；MHz (兆赫)；mmol (毫莫耳)；hr或hrs (小時)；min (分鐘)；RT (室溫)；MS (質譜)；ESI (電噴霧電離)；TLC (薄層層析術)；HPLC (高壓液相層析術)；THF (四氫呋喃)；CDCl3 (氘化氯仿)；AcOH (乙酸)；DCM (二氯甲烷)；DMW (去礦質水)；DME (二甲氧基乙烷)；DMF (N,N-二甲基甲醯胺)；DMSO (二甲基亞碸)；DMSO-d6 (氘化二甲基亞碸)；EtOAc (乙酸乙酯)；及MeOH (甲醇)。
關於下列實例中之所有，可利用熟習此項技術者已知的標準檢查及純化方法。除非本文另有指示，否則所有溫度均以℃ (攝氏度)表示。除非本文另有注釋，否則所有反應均在室溫下進行。本文闡述之合成方法論意欲通過使用特定實例例示可適用之化學且非指示本發明之範圍。 實例1：2-(4-(羥甲基)-2-(甲磺醯基)苯基)-7,8-二氫-4H-[1,4]戴奧辛并[2',3':4,5]苯并[1,2-d][1,3]㗁𠯤-4-酮(化合物1.001)
Figure 02_image014
圖1中顯示化合物1.001之合成。圖3中闡述中間物100之合成。步驟 1 ： 4- 溴 -2- 巰基苯甲酸 ( 中間物 102)
Figure 02_image028
以使得反應溫度維持在3至6℃之速率將濃HCl (280.0 mL)及冰冷的水(280.0 mL)之混合物緩慢添加至2-胺基-4-溴苯甲酸(101) (200.0 g，926.0 mmol，1.0當量)、NaOH (37.0 g，926.0 mmol，1.0當量)及亞硝酸鈉(63.90 g，926.0 mmol，1.0當量)於DMW (4.0 L)中之經攪拌溶液。添加後，在0℃將該反應混合物攪拌30 min，及然後用乙酸鉀(454.0 g，4.63 mol，5.0當量)中和。將此溶液添加至O-乙基黃原酸鉀(445.0 g，2.78 mol，3.0當量)於DMW (4.0 L)中之預熱溶液，加熱至90℃。在90℃將該反應混合物攪拌30 min，冷卻至0℃，及用濃HCl (600.0 mL)酸化。該反應混合物用20% NaOH (1750 ml)鹼化，及加熱至85℃，歷時2 h。向此混合物少量添加NaHSO3 (96.30 g，926.0 mmol，1.0當量)，及將該反應混合物加熱至85℃，歷時10 min。將該反應混合物過濾，冷卻至0℃，及用濃HCl (650.0 mL)酸化。沈澱固體係藉由過濾收集，用DMW (500 mL)及然後用正己烷洗並風乾以獲得呈淺灰色固體之中間物102 (216.0 g，100.0%)。1 HNMR (300 MHz, DMSO-d6 ): δ 7.88 ppm (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.81 ppm (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.38 ppm (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H)。MS (ESI): m/z 232.8 (M-1)。步驟 2 ： 4- 溴 -2-( 甲硫基 ) 苯甲酸甲酯 ( 中間物 103)
Figure 02_image030
在室溫下將碳酸鉀(896.0 g，6.49 mol，7.0當量)及碘甲烷(231.0 mL，3.71 mol，4.0當量)添加至4-溴-2-巰基苯甲酸(102) (216.0 g，927.0 mol，1.0當量)於DMF (3.24 L)中之經攪拌溶液。將該反應混合物加熱至80℃並在80℃下攪拌，歷時20 h。反應進展藉由TLC (10% EtOAc於正己烷中)監測以確保該反應完成。添加DMW (2.5 L)及產物用乙酸乙酯(2 x 2.5 L)萃取。經組合之EtOAc萃取物用DMW (2 x 2.5 L)，鹽水(2.5 L)洗，經硫酸鈉乾燥，過濾並在真空下濃縮濾液以提供呈棕色油之中間物103 (180 g，74.40%)。1 HNMR (300 MHz, DMSO-d6 ): δ 7.83 ppm (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.51 - 7.39 ppm (m, 2H), 3.83 ppm (s, 3H), 2.46 ppm (s, 3H)。步驟 3 ： 4- 溴 -2-( 甲磺醯基 ) 苯甲酸甲酯 ( 中間物 104)
Figure 02_image032
在0℃將過氧單磺酸鉀(oxone) (1.17 kg，3.79 mol，5.50當量)於DMW (4.50 L)中之溶液添加至4-溴-2-(甲硫基)苯甲酸甲酯(103) (180.0 g，589 mmol，1.0當量)於甲醇(3.60 L)中之經攪拌溶液。在60℃將該反應混合物攪拌歷時16 h。反應進展藉由TLC (30% EtOAc於正己烷中)監測。藉由蒸餾移除約40%之溶劑，然後將冷凍DMW (4.50 L)添加至該反應混合物並攪拌15分鐘。藉由過濾收集沈澱固體以提供濕產物104。在真空烘箱中在低於50℃乾燥該濕產物以提供呈灰白色固體之乾燥中間物104 (200 g，99.0%)。1 HNMR (300 MHz, DMSO-d6 ): δ 8.19 - 8.02 ppm (m, 2H), 7.73 ppm (d, J = 8.1 Hz, 1H), 3.87 ppm (s, 3H), 3.42 ppm (s, 3H)。MS (ESI): m/z 311.5 (M+18)。步驟 4 ： 4- 溴 -2-( 甲磺醯基 ) 苯甲酸 ( 中間物 105)
Figure 02_image034
將NaOH (192.0 g，4.80 mol，7.0當量)於水(2.01 L)中之溶液添加至4-溴-2-(甲磺醯基)苯甲酸甲酯(104) (201.0 g，0.68 mol，1.0當量)於甲醇(2.01 L)中之經攪拌溶液。在室溫下將該反應混合物攪拌3.0 h。反應進展藉由TLC (20% MeOH於DCM中)監測。在減壓下移除溶劑。將冰冷DMW (1.5 L)添加至殘餘物並添加5N HCl以將pH調節至~5。藉由過濾收集沈澱固體，用冷凍水(1000 mL)洗，乾燥以提供呈灰白色固體之中間物105 (155.0 g，81.0%)。1 H NMR (300 MHz, DMSO-d6 ): 8.09 ppm (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.04 ppm (dd, J = 8.2, 2.0 Hz, 1H), 7.70 ppm (d, J = 8.2 Hz, 1H), 3.44 ppm (s, 3H)。MS (ESI): m/z 278.8 (M-1)。步驟 5 ： 4- 溴 -2-( 甲磺醯基 ) 苯甲醯氯 ( 中間物 106)
Figure 02_image036
在室溫下將亞硫醯氯(68.4 mL，940.0 mmol，2.50當量)添加至4-溴-2-(甲磺醯基)苯甲酸(105) (105.0 g，376.0 mmol，1.0當量)於THF (1.05 L)中之經攪拌溶液，接著添加DMF (1.37 mL，18.80 mmol，0.05當量)。將該反應混合物加熱至80℃並攪拌2 h。反應進展藉由TLC (50% EtOAc於正己烷中)監測以確保該反應完成。在真空下移除溶劑以獲得中間物106 (112.0 g)。中間物106之粗材料直接用於步驟6中。步驟 6 ： 7-(4- 溴 -2-( 甲磺醯基 ) 苯甲醯胺基 )-2,3- 二氫苯并 [b][1,4] 二噁英 -6- 羧酸 ( 中間物 107)
Figure 02_image038
在0℃將三乙胺(103.0 mL，753.0 mmol，2.0當量)添加至7-胺基-2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸(100) (60.20 g，309.0 mmol，0.82當量)於THF (1.68 L)中之經攪拌溶液中，然後在0℃添加4-溴-2-(甲磺醯基)苯甲醯氯(106) (60.20 g，309 mmol，1.0當量)於THF (1.68 L)中之溶液。在0℃將該反應混合物攪拌10分鐘及然後在室溫攪拌2.5 h。反應進展藉由TLC (10% MeOH於DCM中)監測。添加1N HCl以將pH調節至7。藉由蒸餾移除約70%之THF及剩餘之殘餘物用乙醚(250 mL)研磨以沈澱固體產物。藉由過濾收集該固體，用乙醚(50 mL)洗並乾燥，提供呈淺棕色固體之中間物107 (120.0 g，69.90%)。
中間物100 (7-胺基-2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸)係經由如本文描述之步驟A至E合成。
步驟A：3,4-二羥基苯甲酸甲酯(中間物100B)
Figure 02_image040
將硫酸(138.0 mL，2.60 mol，2.0當量)添加至3,4-二羥基苯甲酸(100A) (200.0 g，1.30 mol，1.0當量)於甲醇(2.0 L)中之經攪拌溶液中。在80℃將該反應混合物攪拌15 h。反應進展藉由TLC (50% EtOAc於正己烷中)監測。藉由在真空下蒸餾移除溶劑，然後添加DMW (1500 mL)，及產物用乙酸乙酯(3 x 1.5 L)萃取。合併之有機萃取物用碳酸氫鈉(2000 mL)、鹽水(1500 mL)之飽和溶液洗，經硫酸鈉乾燥並在真空下濃縮，獲得呈灰白色固體之中間物100B (198.0 g，90.70%)。1 H NMR (300 MHz, DMSO): δ 9.78 ppm (s, 1H), 9.37 ppm (s, 1H), 7.36 - 7.23 ppm (m, 2H), 6.81 ppm (d, J = 8.2 Hz, 1H), 3.76 ppm (s, 3H)。
步驟B：2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸甲酯(中間物100C)
Figure 02_image042
將碳酸鉀(405 g，2.93 mol，2.50當量)及1,2-二溴乙烷(152.0 mL，1.76 mol，1.50當量)添加至3,4-二羥基苯甲酸甲酯(100B) (197.0 g，1.17 mol，1.0當量)於DMF (2.96 L)中之經攪拌溶液。將該反應混合物加熱至90℃並攪拌25 h。反應進展藉由TLC (TLC分析60%乙酸乙酯於正庚烷中)監測。將該反應冷卻至室溫，然後添加DMW (7.50 L)，然後用EtOAc (2 x 3.50 L)萃取。經組合之有機萃取物用DMW (2 x 3.5 L)及鹽水(3.5 L)洗，經硫酸鈉乾燥並在真空下濃縮以獲得呈淺棕色油之中間物100C (214.0 g，94.10%)。1 H NMR (300 MHz, CDCl3 ): δ 7.63 - 7.51 ppm (m, 2H), 6.89 ppm (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.35 - 4.24 ppm (m, 4H), 3.88 ppm (s, 3H)。
步驟C：7-硝基-2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸甲酯(中間物100D)
Figure 02_image044
在低於20℃將濃HNO3 (832.0 mL，14.50 mol，17.0當量)緩慢添加至2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸甲酯(100C) (214.0 g，1.10 mol，1.0當量)於乙酸(832.0 mL，14.50 mol，13.2當量)中之經攪拌溶液。在室溫將該反應混合物攪拌2 h，同時藉由TLC (溶析液：60%乙酸乙酯於正庚烷中)監測反應進展。將該反應混合物倒入冰水(5.0 L)內並劇烈攪拌。藉由過濾收集沈澱固體，用DMW (1100 mL)洗並乾燥以獲得呈淺黃色固體之中間物100D (261 g，99.0%)。1 H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 7.65 ppm (s, 1H), 7.30 ppm (s, 1H), 4.47 - 4.34 ppm (m, 1H), 4.39 ppm (s, 4H), 3.80 ppm (s, 3H)。
步驟D：7-胺基-2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸甲酯(中間物100E)
Figure 02_image046
將甲基-7-硝基-2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸酯(100D) (260 g，1.09 mol，1.0當量)、鐵粉(217.0 g，2.72 mol，2.5當量；網格尺寸為300至400)於乙醇(1.69 L，6.50份體積當量)、水(585 mL)及乙酸(1.69 L)之混合物加熱至80℃並在此溫度攪拌45 min。反應進展藉由TLC (溶析液：60%乙酸乙酯於正庚烷中)監測。將該反應混合物冷卻至室溫並濾過矽藻土床及床用乙酸乙酯(500 mL)洗。將水(5.0 L)添加至濾液並混合。分離水層並用乙酸乙酯(3 x 2.0 L)反萃取。經組合之有機萃取物用飽和碳酸氫鈉(3 x 3.0 L)及鹽水(5.0 L)洗，然後經硫酸鈉乾燥並過濾。在真空下濃縮濾液以獲得呈淺棕色固體之中間物100E (226 g，99.40%)。1 H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 7.14 ppm (s, 1H), 6.27 ppm (s, 2H), 6.24 ppm (s, 1H), 4.28 - 4.19 ppm (m, 2H), 4.16 - 4.06 ppm (m, 2H), 3.73 ppm (s, 3H)。
步驟E：7-胺基-2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸(中間物100)
Figure 02_image048
向甲基-7-胺基-2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸酯(100E) (225.0 g，1.08 mol，1.0當量)於THF (1.58 mL)中之經攪拌溶液添加於水(1.58 mL)中之NaOH溶液(237.0 g，5.92 mol，5.50當量)及將該反應混合物加熱至80℃並攪拌15 h。反應進展藉由TLC (10% MeOH於DCM中)監測以確保該反應完成。將該反應混合物冷卻至室溫並在減壓下蒸發THF。接著，將經冷卻之DMW (1500 mL)添加至殘餘物並使用5N HCl將pH調節至~ 6.0。藉由過濾收集沈澱固體，用DMW (300 mL)洗並乾燥以提供呈淺黃色固體之中間物100 (152.50 g，72.5%)。1 H NMR (300 MHz, DMSO): δ 8.17 ppm (s, 2H), 7.13 ppm (s, 1H), 6.20 ppm (s, 1H), 4.27 - 4.17 ppm (m, 2H), 4.17 - 4.02 ppm (m, 2H)。步驟 7 ： 2-(4- 溴 -2-( 甲磺醯基 ) 苯基 )-7,8- 二氫 -4H-[1,4] 二噁英 [2',3':4,5] 苯并 [1,2-d][1,3] 㗁 𠯤 -4- 酮 ( 中間物 108) 之合成
Figure 02_image050
將7-(4-溴-2-(甲磺醯基)苯甲醯胺基)-2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸(107) (120.0 g，263.0 mmol，1.0當量)於乙酸酐(960 mL)中之溶液加熱至140℃並攪拌1.5 h。反應進展藉由TLC (50% EtOAc於正己烷中)監測以確保該反應完成。藉由真空蒸餾移除約70%溶劑。將剩餘之殘餘物冷卻至室溫，然後添加DMW (1000 mL)並將該混合物攪拌40 min。藉由過濾收集沈澱固體，用DMW (1000 mL)洗並乾燥至呈灰白色固體之中間物108 (85.4 g，74.1%)。1 H NMR (300 MHz, DMSO-d6 ): δ 8.29 - 8.12 ppm (m, 2H), 7.91 ppm (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.59 ppm (s, 1H), 7.26 ppm (s, 1H), 4.55 - 4.32 ppm (m, 4H), 3.57 ppm (s, 3H)。MS(ESI): m/z 439.6 (M+1)。步驟 8 ： 2-(2-( 甲磺醯基 )-4- 乙烯基苯基 )-7,8- 二氫 -4H-[1,4] 二噁英 [2',3':4,5] 苯并 [1,2-d][1,3] 㗁 𠯤 -4- 酮 ( 中間物 109) 之合成
Figure 02_image052
藉由施用交替真空將2-(4-溴-2-(甲磺醯基)苯基)-7,8-二氫-4H-[1,4]戴奧辛并[2',3':4,5]苯并[1,2-d][1,3]㗁𠯤-4-酮(108) (84.0 g，192.0 mmol，1.0當量)於1,4-二噁烷(1.68 L)中之溶液脫氣三次並再填充氮以移除氧。在氮下添加碳酸氫鈉(56.40 g，671.0 mmol，3.5當量)、乙烯基三氟硼酸鉀(64.20 g，479.0 mmol，2.5當量)、三(鄰甲苯基)-膦(14.60 g，47.90 mmol，0.25當量)及Pd(OAc)2 (1.51 g，6.71 mmol，0.035當量)及用交替真空將反應燒瓶再脫氣兩次並再填充氮。在70℃加熱該反應混合物並攪拌3.5 h。反應進展藉由TLC (40% EtOAc於正己烷中)監測以確保該反應完成。將該反應混合物冷卻至室溫，用1N HCl (1000 mL)淬滅並濾過矽藻土(hyflo)墊。在減壓下蒸發溶劑並將DMW (2.5 L)添加至殘餘物。產物用乙酸乙酯(3 x 2 L)萃取及經組合之EtOAc萃取物用鹽水(2.5 L)洗，經硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮以提供粗產物。將粗產物攪拌於乙醚(150 mL)中並過濾以提供呈淺黃色固體之中間物109 (72.0 g，97.50%)。1 H NMR (300 MHz, DMSO-d6 ): δ 8.19 - 8.10 ppm (m, 1H), 8.06 - 8.00 ppm (m, 1H), 7.93 ppm (dd, J = 7.9, 3.5 Hz, 1H), 7.58 ppm (s, 1H), 7.24 ppm (s, 1H), 6.96 ppm (dd, J = 17.7, 11.0 Hz, 1H), 6.10 ppm (t, J = 17.7 Hz, 1H), 5.56 ppm (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.55 - 4.26 ppm (m, 4H), 3.56 - 3.46 ppm (m, 3H)。步驟 9 ： 3-( 甲磺醯基 )-4-(4- 側氧基 -7,8- 二氫 -4H-[1,4] 戴奧辛并 [2',3':4,5] 苯并 [1,2-d][1,3] 㗁 𠯤 -2- 基 ) 苯甲醛 ( 中間物 110) 之合成
Figure 02_image054
在室溫下將碳載釕(10%) (5.66 g，5.60 mmol，0.03當量)添加至2-(2-(甲磺醯基)-4-乙烯基苯基)-7,8-二氫-4H-[1,4]戴奧辛并[2',3':4,5]苯并[1,2-d][1,3]㗁𠯤-4-酮(109) (72.0 g，187.0 mmol，1.0當量)於乙腈(1.44 L)、EtOAc (1.44 L)及DMW (1.08 L)中之溶液。在0℃添加偏過碘酸鈉(130.0 g，607.0 mmol，3.25當量)。在0℃將該反應混合物攪拌3.0 h。反應進展藉由TLC (50% EtOAc於正己烷中)監測。使該反應混合物濾過矽藻土床。固體用乙酸乙酯(4 x 1.5 L)洗。濾液用水(3.0 L)洗及水層用乙酸乙酯(800 mL)反萃取。經組合之有機萃取物用鹽水(2.0 L)洗，經硫酸鈉乾燥並過濾。在真空下濃縮濾液以獲得呈棕色固體之粗產物110 (65.0，95.30%)。中間物110之粗材料直接用於下列步驟10中。步驟 10 ： 2-(4-( 羥甲基 )-2-( 甲磺醯基 ) 苯基 )-7,8- 二氫 -4H-[1,4] 戴奧辛并 [2',3':4,5] 苯并 [1,2-d][1,3] 㗁 𠯤 -4- 酮 ( 化合物 1.001) 之合成
Figure 02_image056
將硼氫化鈉(8.0 g，1.0當量)緩慢添加至3-(甲磺醯基)-4-(4-側氧基-7,8-二氫-4H-[1,4]戴奧辛并[2',3':4,5]苯并[1,2-d][1,3]㗁𠯤-2-基)苯甲醛(110) (82.0 g，212.0 mmol，1.0當量)於THF (1.23 mL)及乙醇(1.23 L)中之經攪拌溶液，歷時1.0 h。在0℃將該反應混合物攪拌2 h。反應進展藉由TLC (70% EtOAc於正己烷中)監測以確保該反應完成。該反應混合物用氯化銨(100 mL)之飽和溶液淬滅及產物用乙酸乙酯(3 x 1500 mL)萃取。經組合之有機萃取物用鹽水(500 mL)洗，經硫酸鈉乾燥並在真空下濃縮以獲得粗產物。該粗產物係藉由管柱層析術於矽膠(230至400網格尺寸)上使用梯度溶劑(20至40% [(10% MeOH於EtOAc中)]於正己烷中)純化以提供呈灰白色固體之化合物1.001 (15.50 g，18.80%)。1 H NMR (300 MHz, DMSO-d6 ): δ 8.08 ppm (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.91 ppm (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.83 ppm (dd, J = 7.9, 1.6 Hz, 1H), 7.58 ppm (s, 1H), 7.24 ppm (s, 1H), 5.64 ppm (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.70 ppm (d, J = 5.7 Hz, 2H), 4.47 - 4.35 ppm (m, 4H), 3.50 ppm (s, 3H)。 實例2：2-(5-(羥甲基)-2-(甲磺醯基)苯基)-7,8-二氫-4H-[1,4]戴奧辛并[2',3':4,5]苯并[1,2-d][1,3]㗁𠯤-4-酮(化合物1.002)
Figure 02_image016
圖2中顯示化合物1.002之合成。圖3中闡述中間物100之合成。步驟 1 ： 5- 溴 -2- 巰基苯甲酸 ( 中間物 202)
Figure 02_image059
藉由將內部溫度維持在3至6℃將濃HCl (28.0 mL)及冷凍水(34 mL)之混合物滴加至2-胺基-5-溴苯甲酸(201) (20.0 g，92.6 mmol，1.0當量)、NaOH (3.70 g，92.6 mmol，1.0當量)及亞硝酸鈉(6.39 g，92.6 mmol，1.0當量)於DMW (400.0 mL)中之經攪拌溶液。在0℃將該反應混合物攪拌30 min，及然後用乙酸鉀(30.0 g，306.0 mmol，3.3當量)中和。將此溶液添加至O-乙基黃原酸鉀(44.6 g，278.0 mmol，3.0當量)於DMW (223 mL)中之溶液，其已預先加熱至90℃。在相同溫度將該混合物攪拌30 min，冷卻至0℃，並用濃HCl (100 mL)酸化。該反應混合物用10% NaOH (200 ml)鹼化，並加熱至85℃，歷時2 h。向此混合物滴加NaHSO3 (9.81 g，92.6 mmol)，並將該混合物加熱至85℃，歷時10 min。將該混合物過濾，冷卻至0℃，並用濃HCl (100 mL)酸化。藉由過濾收集沈澱並用H2 O及然後正己烷洗以獲得呈淡棕色固體之中間物202 (20.2 g，93.6%)。MS (ESI): m/z 230.8 (M-1)。步驟 2 ： 5- 溴 -2-( 甲硫基 ) 苯甲酸甲酯 ( 中間物 203)
Figure 02_image061
在室溫將碳酸鉀(83.0 g，601 mmol，7.0當量)及碘乙烷(21.4 mL，343 mmol，4.0當量) 0℃添加至5-溴-2-巰基苯甲酸(202) (20 g，85.8 mmol，1當量)於DMF (600 mL)中之經攪拌溶液。在80℃將該反應混合物攪拌4 h。反應進展藉由TLC (10% EtOAc於正己烷中)監測以確保該反應完成。添加DMW (500 mL)及產物用乙酸乙酯(3 x 500 mL)萃取。經組合之EtOAc萃取物用鹽水(300 mL)洗，經硫酸鈉乾燥，過濾並在真空下濃縮濾液以獲得粗化合物。粗產物係藉由管柱層析術於矽膠(230至400網格尺寸)上及梯度溶劑(0至5% EtOAc於正己烷中)純化以提供呈灰白色固體之中間物203 (20 g，89.3%)。步驟 3 ： 5- 溴 -2-( 甲磺醯基 ) 苯甲酸甲酯 ( 中間物 204)
Figure 02_image063
在0℃將過氧單磺酸鉀(40.8 g，268 mmol，5.0當量)於DMW (280 mL)中之溶液添加至5-溴-2-(甲硫基)苯甲酸甲酯(203) (14.0 g，53.6 mmol，1.0當量)於甲醇(350 mL)中之經攪拌溶液。在50℃將該反應混合物攪拌16 h。反應進展藉由TLC (30% EtOAc於正己烷中)監測以確保該反應完成。產物用EtOAc (4 x 500 mL)萃取。經組合之有機萃取物用鹽水(2 x 300 mL)洗，經硫酸鈉乾燥並在真空下濃縮以獲得粗產物。該粗產物係藉由管柱層析術於矽膠(230至400網格尺寸)上及梯度溶劑(5至20% EtOAc於正己烷中)純化以提供呈灰白色固體之中間物204 (13.2 g，84.0%)。1 H NMR (300 MHz, DMSO): δ 8.08 - 7.98 ppm (m, 2H), 7.93 ppm (dd, J = 7.9, 0.9 Hz, 1H), 3.87 ppm (s, 3H), 3.44 - 3.35 ppm (m, 3H)。MS (ESI): m/z 292.8 (M-1)。步驟 4 ： 2-( 甲磺醯基 )-5- 乙烯基苯甲酸甲酯 ( 中間物 205)
Figure 02_image065
用交替真空將5-溴-2-(甲磺醯基)苯甲酸甲酯(204) (5.0 g，17.1 mmol，1.0當量)於DME (100.0 mL，20份體積當量)中之溶液脫氣三次及藉由交替真空及氮將再填充氮脫氣兩次。在氮下添加碳酸鉀(4.71 g，34.1 mmol，2.0當量)、乙烯基三氟硼酸鉀(4.57 g，34.1 mmol，2.0當量)及Pd(PPh3 )4 (591 mg，512 μmol，0.03當量)及用交替真空將反應燒瓶再脫氣兩次並再填充氮。在80℃加熱該反應混合物並攪拌4 h (當溫度上升至40至45℃時移除N2 )。反應進展藉由TLC (30% EtOAc於正己烷中)監測以確保該反應完成。將該反應混合物冷卻至室溫及濾過矽藻土墊。將DMW (300 mL)添加至濾液及產物用乙酸乙酯(2 x 100 mL)萃取。經組合之有機萃取物用鹽水(2 x 100 mL)洗，經硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮以提供粗產物。該粗產物係藉由管柱層析術於矽膠(230至400網格尺寸)上使用梯度溶劑(5至20% EtOAc於正己烷中)作為溶析液純化以提供呈淡黃色膠之中間物205 (3.36 g，82.0%)。步驟 5 ： 2-( 甲磺醯基 )-5- 乙烯基苯甲酸 ( 中間物 206)
Figure 02_image067
將NaOH (3.92 g，97.9 mmol，7.0當量)於水(67.2 mL)中之溶液添加至2-(甲磺醯基)-5-乙烯基苯甲酸甲酯(205) (3.36 g，14.0 mmol，1.0當量)於甲醇(67.2 mL)中之經攪拌溶液。在60℃將該反應混合物攪拌2 h。反應進展藉由TLC (70% EtOH於正己烷中)監測以確保該反應完成。將反應混合物冷卻至室溫，使用3N HCl將pH調節至~ 6及水層用乙酸乙酯(4 x 500 mL)萃取。經組合之有機萃取物用鹽水洗，經硫酸鈉乾燥，過濾並在真空下濃縮濾液以獲得呈灰白色固體之所需中間物206 (1.48 g，46.8%)。1 H NMR (300 MHz, DMSO): δ 7.93 ppm (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.88 - 7.78 ppm (m, 2H), 6.87 ppm (dd, J = 17.7, 11.0 Hz, 1H), 6.13 ppm (d, J = 17.6 Hz, 1H), 5.53 ppm (d, J = 10.9 Hz, 1H), 3.37 ppm (s, 3H)。MS (ESI): m/z 224.95 (M-1)。步驟 6 ： 2-( 甲磺醯基 )-5- 乙烯基苯甲醯氯 ( 中間物 207)
Figure 02_image069
在室溫將草醯氯(2.66 mL，30.9 mmol，5.0當量)添加至2-(甲磺醯基)-5-乙烯基苯甲酸(206) (1.4 g，6.19 mmol，1.0當量)於DCM (70 mL)中之經攪拌溶液，接著添加2滴DMF。將該反應混合物回流2 h。反應進展藉由TLC (50% EtOAc於正己烷中)監測以確保該反應完成。在真空下移除溶劑以獲得中間物207之所需產物(540 mg，83.2%)。中間物207之粗材料直接用於下列步驟7中。步驟 7 ： 7-(2-( 甲磺醯基 )-5- 乙烯基苯甲醯胺基 )-2,3- 二氫苯并 [b][1,4] 二噁英 -6- 羧酸 ( 中間物 208)
Figure 02_image071
在0℃將三乙胺(1.93 mL，13.8 mmol，3.0當量)及2-(甲磺醯基)-5-乙烯基苯甲醯氯(207) (1.35 mg，5.53 mmol，1.2當量)於THF (36 mL)中之溶液添加至7-胺基-2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸(100) (900 mg，4.61 mmol，1.0當量)於THF (36.0 mL)中之經攪拌溶液。在相同溫度將該反應混合物攪拌10 min及然後在室溫攪拌1.5 h。反應進展藉由TLC (20% EtOAc於正己烷中)監測以確保該反應完成。在真空下移除溶劑。將DMW添加至殘餘物及產物用EtOAc (9 x 200 mL)萃取。經組合之EtOAc萃取物用鹽水(200 mL)洗，經硫酸鈉乾燥並在真空下濃縮以提供呈棕色固體之中間物208 (1.6 g，86.0%)。MS(ESI): m/z 404.10 (M+1), m/z 401.90 (M-1)。
中間物100 (7-胺基-2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸)係經由如本文描述之步驟A至E合成。
步驟A：3,4-二羥基苯甲酸甲酯(中間物100B)
Figure 02_image073
在室溫向3,4-二羥基苯甲酸(100A) (97%，10.0 g，62.9 mmol，1.0當量)於MeOH (500 mL)中之經攪拌溶液添加硫酸(96%，7.0 mL，126.0 mmol，2.0當量)。將該反應混合物回流整夜。檢查TLC以確保反應完成。在真空下移除溶劑及然後添加水(500 mL)。水層用EtOAc (3 x 100 mL)萃取。經組合之有機層用飽和NaHCO3 溶液(250 mL)、鹽水(250 mL)洗，經硫酸鈉乾燥並在真空下濃縮以獲得呈灰白色固體之所需中間物100B (8.72 g，82.4%)。1 H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 9.81 ppm (d, J = 131.1 Hz, 2H), 7.41 - 7.19 ppm (m, 2H), 6.81 ppm (d, J = 8.2 Hz, 1H), 3.77 ppm (s, 3H)。
步驟B：2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸甲酯(中間物100C)
Figure 02_image075
向3,4-二羥基苯甲酸甲酯(100B) (10.0 g，59.5 mmol，1.0當量)於丙酮(200.0 mL)中之經攪拌溶液添加碳酸鉀(20.5 g，149 mmol，2.50當量)，接著添加1,2-二溴乙烷(7.72 mL，89.2 mmol，1.50當量)並將該反應混合物回流整夜。檢查TLC以確保反應完成。在真空下移除溶劑及然後添加水。水層用1N HCl中和及然後用EtOAc (2 x 250 mL)萃取。經組合之有機萃取物用鹽水(500 mL)洗，經硫酸鈉乾燥並在真空下濃縮。粗產物係藉由combiflash使用於正己烷(0至10%)中之乙酸乙酯純化以獲得呈無色油之所需中間物100C (9.0 g，77.9%)。1 H NMR (300 MHz, CDCl3 ): δ 7.54 - 7.42 ppm (m, 2H), 6.85 - 6.75 ppm (m, 1H), 4.27 - 4.14 ppm (m, 4H), 3.79 ppm (s, 3H)。
步驟C：7-硝基-2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸甲酯(中間物100D)
Figure 02_image077
在低於20℃向2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸甲酯100C (9.0 g，46.3 mmol，1.0當量)於乙酸(35.0 mL，612 mmol，13.2當量)中之經攪拌溶液滴加濃HNO3 (47.0 mL，788 mmol，17.0當量)及容許在室溫將該反應混合物攪拌2 h。檢查TLC以確保反應完成。將該反應混合物倒入冰水內並劇烈攪拌及水層用EtOAc (3 x 500 mL)萃取。經組合之有機萃取物用NaHCO3 ，鹽水洗，經硫酸鈉乾燥並在真空下濃縮以獲得呈淺黃色固體之中間物100D之所需產物(9.7 g，87.5%)。1 H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 7.65 ppm (s, 1H), 7.30 ppm (s, 1H), 4.47 - 4.34 ppm (m, 1H), 4.39 ppm (s, 4H), 3.80 ppm (s, 3H)。
步驟D：7-胺基-2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸甲酯(中間物100E)
Figure 02_image079
在70℃將甲基-7-硝基-2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸酯(100D) (25.0 g，105.0 mmol，1.0當量)、鐵(20.4 g，366.0 mmol，3.5當量)、乙醇(625 mL)、水(163 mL)及乙酸(500 mL)之混合物攪拌45 min。檢查TLC以確保反應完成。將該反應混合物冷卻至室溫並濾過矽藻土墊。濾液用水(1000 mL)稀釋及水層用乙酸乙酯(3 x 700 mL)萃取。經組合之有機萃取物用飽和碳酸氫鈉(2 x 1000 mL)、鹽水(1000 mL)洗，經硫酸鈉乾燥並過濾。在真空下濃縮濾液以提供呈棕色固體之中間物100E之標題化合物(21.8 g，99.7%)。1 H NMR (300 MHz, DMSO): δ 7.14 ppm (s, 1H), 6.25 ppm (d, J = 7.6 Hz, 3H), 4.26 - 4.19 ppm (m, 2H), 4.17 - 4.08 ppm (m, 2H), 3.73 ppm (s, 3H)。MS (ESI): m/z 210.10 (M+1)。
步驟E：7-胺基-2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸(中間物100)
Figure 02_image081
向甲基-7-胺基-2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸酯(100E) (22.0 g，105 mmol，1.0當量)於THF (440.0 mL)中之經攪拌溶液添加於水(440.0 mL)中之NaOH溶液(23.1 g，578 mmol，5.5當量)並在80℃將該反應混合物攪拌20 h。反應進展藉由TLC (10% MeOH於DCM中)監測以確保該反應完成。將反應混合物冷卻至室溫，使用3N HCl將pH調節至6及水層用乙酸乙酯(5 x 500 mL)萃取。經組合之有機層用鹽水洗，經硫酸鈉乾燥，過濾並在真空下濃縮濾液以獲得固體棕色粗產物。該粗產物用正己烷純化以獲得呈棕色固體之所需中間物100 (18.6 g，90.6%)。1 H NMR (300 MHz, DMSO): δ 8.27 ppm (s, 2H), 7.13 ppm (s, 1H), 6.20 ppm (s, 1H), 4.27 - 4.19 ppm (m, 2H), 4.18 - 4.08 ppm (m, 2H)。步驟 8 ： 2-(2-( 甲磺醯基 )-5- 乙烯基苯基 )-7,8- 二氫 -4H-[1,4] 戴奧辛并 [2',3':4,5] 苯并 [1,2-d][1,3] 㗁 𠯤 -4- 酮 ( 中間物 209)
Figure 02_image083
在140℃將7-(2-(甲磺醯基)-5-乙烯基苯甲醯胺基)-2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁英-6-羧酸(208) (1.60 mg，3.97 mmol，1.0當量)於乙酸酐(40 mL)中之溶液攪拌1.5 h。反應進展藉由TLC (50% EtOH於正己烷中)監測以確保該反應完成。將該反應混合物冷卻至室溫，然後添加DMW (100 mL)。該產物用EtOAc (4 x 200 mL)萃取。經組合之EtOAc萃取物用鹽水(2 x 200 mL)洗，經硫酸鈉乾燥並在真空下濃縮以獲得粗產物。該粗產物係藉由管柱層析術於矽膠(230至400網格尺寸)上及梯度溶劑(20至50% EtOAc於正己烷中)純化以提供呈黃色固體之中間物209 (700 mg，45.8%)。1 H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.15 ppm (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.90 ppm (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.77 - 7.68 ppm (m, 2H), 7.16 ppm (s, 1H), 6.82 ppm (dd, J = 17.5, 10.9 Hz, 1H), 6.01 ppm (d, J = 17.5 Hz, 1H), 5.57 ppm (d, J = 10.9 Hz, 1H), 4.40 ppm (dd, J = 11.8, 5.3 Hz, 5H), 3.52 ppm (d, J = 3.0 Hz, 3H)。MS(ESI): m/z 385.80 (M+1)。步驟 9 ： 3-( 甲磺醯基 )-4-(4- 側氧基 -7,8- 二氫 -4H-[1,4] 戴奧辛并 [2',3':4,5] 苯并 [1,2-d][1,3] 㗁 𠯤 -2- 基 ) 苯甲醛 ( 中間物 210)
Figure 02_image085
在室溫將碳載釕(10%) (50 mg，0.049 mmol，0.03當量)添加至2-(2-(甲磺醯基)-5-乙烯基苯基)-7,8-二氫-4H-[1,4]戴奧辛并[2',3':4,5]苯并[1,2-d][1,3]㗁𠯤-4-酮(209) (0.630 g，1.63 mmol，1.0當量)於乙腈(12.6 mL)、EtOAc (12.6 mL)及DMW (12.6 mL)中之溶液。在0℃添加偏過碘酸鈉(1.05 g，4.9 mmol，3.0當量)。在室溫將該反應混合物攪拌1 h。反應進展藉由TLC (30% EtOAc於正己烷中)監測以確保該反應完成。使該反應混合物濾過矽藻土床。濾液用水(100 mL)稀釋及水層用乙酸乙酯(3 x 200 mL)萃取。經組合之有機萃取物用飽和碳酸氫鈉、鹽水洗，經硫酸鈉乾燥並過濾。在真空下濃縮濾液以獲得粗中間物210。中間物210之粗產物直接用於下列步驟10中。 步驟10：2-(4-(羥甲基)-2-(甲磺醯基)苯基)-7,8-二氫-4H-[1,4]戴奧辛并[2',3':4,5]苯并[1,2-d][1,3]㗁𠯤-4-酮(化合物1.002)
Figure 02_image087
在-10℃在1 h內將硼氫化鈉(9.77 mg，0.258 mmol，0.5當量)添加至4-(甲磺醯基)-3-(4-側氧基-7,8-二氫-4H-[1,4]戴奧辛并[2',3':4,5]苯并[1,2-d][1,3]㗁𠯤-2-基)苯甲醛(210) (0.20 g，0.52 mmol，1.0當量)於THF (10.0 mL)中之經攪拌溶液。在0℃相同溫度將該反應混合物攪拌30 min。反應進展藉由TLC (70% EtOAc於正己烷中)監測以確保該反應完成。該反應混合物用氯化銨之飽和溶液(50 mL)淬滅及產物用乙酸乙酯(3 x 100 mL)萃取。經組合之有機萃取物用鹽水(500 mL)洗，經硫酸鈉乾燥並在真空下濃縮以獲得粗產物。該粗產物係藉由管柱層析術於矽膠(230至400網格尺寸)上使用梯度溶劑(20至40% [(10% MeOH於EtOAc中)]於正己烷中)純化以提供呈灰白色固體之化合物1.002(70 mg，34.80%)。1 H NMR (300 MHz, DMSO): δ 8.07 ppm (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.88 ppm (s, 1H), 7.79 ppm (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.58 ppm (s, 1H), 7.24 ppm (s, 1H), 5.63 ppm (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.69 ppm (d, J = 5.6 Hz, 2H), 4.52 - 4.31 ppm (m, 4H), 3.48 ppm (s, 3H)。MS(ESI): m/z 390.0 (M+1)。 實例3：活體外活性分析
人類激肽釋放素蛋白：表現於HEK293中之重組人類KLK5係自SpeedBio (Gaithersburg, MD)獲得。均表現於小鼠骨髓瘤細胞中之重組酶原KLK-7及重組酶原KLK-14係購買自R&D Biosystems (Minneapolis, MN)。胞漿素及凝血酶係購買自Haematologic Technologies (Essex Junction, VT)。胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶係購買自Worthington Biochemical公司(Lakewood, NJ)及血漿激肽釋放素係購買自Prospec (East Brunswick, NJ)。嗜中性球彈性蛋白酶係獲自Innovative Research (Peary Court, MI)。表現於大腸桿菌中之牛重組腸激酶係購買自Sigma (St. Louis, MI)。表現於大腸桿菌中之蛋白裂解酶係購買自Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)。對照抑制劑甲磺酸萘莫司他(Nafamostat mesylate)係購買自Sigma (St. Louis, MI)及(2-(2-氟苯基)-5,6,7,8-四氫-4H-苯并[4,5]噻吩并[2,3-d][1,3]㗁𠯤-4-酮係購買自Interbioscreen (Moskow, Russia)。
受質：S-2288 (D-Ile-Pro-Arg-pNA)、CS-PSA (MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA)、S-2266 (H-D-Val-Leu-Arg-pNA)及S-2288 (H-D-lle-Pro-Arg-pNA)係購買自Diapharma (West Chester, OH)。MeOSuccAla-Ala-Pro-Val-pNA係購買自Sigma (St Louis, MI)。該等受質以10 mM溶解於水中並在-20℃等分冷凍。
KLK-7及KLK-14之活化：將KLK-7或KLK-14之酶原於50 mM Tris、10 mM CaCl2 、150 mM NaCl、0.05%(w/v) Brij-35，pH 7.5中之150 µL 8 µM溶液與在相同緩衝液中之150 µL 10 µg/mL牛腸激酶混合並在37℃針對KLK-7培養2 h及針對KLK-14培養1 h。在培養週期後，活化藉由添加6 µL 0.5 M EDTA pH 8.0停止。
分析：所有分析係在4℃於用0.1% Tween 20塗佈整夜之384孔聚苯乙烯盤中進行。然後該等盤用100 µL水洗兩次並乾燥。對於測定IC50 值，以50倍預期最終濃度在該等分析中以1:3間隔之連續稀釋將抑制劑稀釋於純DMSO內。通常，製備八個抑制劑稀釋物及一個DMSO對照。以2.2倍最終濃度在分析混合物中將該等受質稀釋於水中。該盤之孔以兩倍預期濃度用稀釋於2x分析緩衝液(100 mM Tris、200 mM NaCl、0.2% PEG、0.01% Tween、2 mM EDTA，pH 8.0)中之50 µL酶填充。然後添加5 uL DMSO、2.2 uL抑制劑及45 uL受質以開始反應。在37℃在多孔盤讀數器中在405 nm之波長下(Molecular Devices, San Jose, CA)將該等分析監測1 h。使用10 uM最大濃度之工具抑制劑萘莫司他下作為胰蛋白酶、凝血酶、KLK-5及KLK-14之對照及5 uM之(2-(2-氟苯基)-5,6,7,8-四氫-4H-苯并[4,5]噻吩并[2,3-d][1,3]㗁𠯤-4-酮作為KLK-7之對照。 下表匯總用於個別酶之分析條件：
酶 酶濃度(nM) 受質 受質濃度 (µM)
KLK-7 20 CS-PSA 500
KLK-5 10 S-2288 500
KLK-14 5 S-2288 500
血漿激肽釋放素 5 S-2266 200
胰蛋白酶 0.1 S-2288 500
胰凝乳蛋白酶 0.2 CS-PSA 500
胞漿素 1 S-2288 500
凝血酶 0.5 S-2288 200
蛋白裂解酶 0.015 U/µL S-2288 200
資料分析：受質水解之進展曲線係由反應之最終20 min之線性回歸分析。將所得速率之劑量反應擬合至下式產生IC50 ：
Figure 02_image089
及1) c：在最高抑制劑濃度下之背景速率；2) d：對照反應之速率；3) IC50 ：抑制劑之IC50 ；4) x：抑制劑濃度；及5) b：斜率。 實例4：人類皮膚中之蛋白酶活性
材料：肽受質PS-01 (YRSR-pNA Tyr-Arg-Ser-Arg-pNA，SEQ ID NO:1)及PS-02 (Lys-His-Leu-Tyr-pNA，SEQ ID NO:2)係由Zamboni Chemical Solutions (Montreal, Canada)合成。人類表皮樣本係獲自Biopredic (Saint-Grégoire, France)。BCA蛋白分析套組係購買自VWR。
皮膚提取物之製備：將表皮冷凍並凍乾。將15 mg凍乾表皮之樣本浸漬於1 mL高鹽緩衝液(100 mM Tris、5 mM EDTA、2M KCl，pH 8)中，在乾冰中冷凍兩次並解凍。在4℃培養整夜並添加六個2.4 mm金屬珠後，在Bertin Precellys均質器(Atkinson, NH)中以5000 Hz將該樣本均質化三次，每次20秒並在兩次均質化間冷卻30秒。在桌上型迷你離心機(desktop minifuge)中以最大速度離心後，上清液之蛋白濃度係藉由BCA分析(~ 0.5 mg/mL)測定。
皮膚提取物中蛋白酶活性之抑制：製備測試化合物於DMSO中之200、66、22及0 µM之儲備溶液。1100 µM PS-01及PS-02之受質儲備液係藉由溶解於水中製備。384孔盤之孔用50 µL 2x分析緩衝液(參見上文)填充及然後添加45 µL受質儲備液及5 µL測試化合物。反應藉由針對受質PS-02添加10 µL皮膚提取物及針對受質PS-01添加5 µL皮膚提取物開始。在多孔盤讀數器中在405 nm下監測受質水解。 實例5：測試化合物之分析結果
化合物1.001及1.002及已知化合物14係根據實例3及4之分析方案測試。測試結果闡述於表2中。化合物14揭示於WO 2015/112081中且具有下式：
Figure 02_image091
。 表2：測試化合物之分析結果
   濃度 化合物14 化合物1.001 化合物1.002
重組KLK5酶(IC50 )    0.24 μM 0.21 μM 1.57 μM
重組KLK7酶(IC50 )    0.13 μM 0.34 μM 0.22 μM
皮膚分析中之速率    0.14* 0.004* 0.009*
受質消耗速率常數 1 μM 0.1* 0.02* 0.06*
   3.3 μM 0.08* 0.04* 0.05*
蛋白水解活性之初始速率 1 μM 0.13* 0.04* 0.1*
   3.3 μM 0.11* 0.07* 0.09*
*吸光度405 /min
化合物1.001、1.002及14之發色受質裂解進展係根據實例4之人類角質層提取物分析使用KLK5及KLK7較佳之發色肽受質(PS-01及PS-02)測試。KLK5選擇性受質在皮膚提取物中由化合物1.001、1.002及14蛋白水解裂解係經比較並顯示於圖4A至4D中。NSK係指新鮮製備之皮膚提取物；及OSK係指解凍後之皮膚提取物。
如自圖4A至4D (NSK)可見，關於化合物1.001，曲線之初始線性部分之速率(斜率)似乎低於其他兩種化合物，指示受質裂解之更高抑制。化合物1.001之可見蛋白水解活性之更低初始速率亦與可見之曲線下截距一致。如自圖4A至4D (NSK)可見，受質裂解之速率隨受質消耗呈指數減緩。化合物1.001之較低指數速率常數指示化合物1.001似乎具有蛋白水解活性之更有效抑制。
與使用經純化之重組KLK 5之結果相反，基於三個參數(速率、受質消耗及蛋白水解活性之初始速率)，相較於已知化合物14，化合物1.001似乎係皮膚提取物之蛋白水解活性之更有效抑制劑。 實例6：發色分析
新生兒人類表皮角質細胞裂解物之製備：儲集的人類表皮角質細胞(HEK)係購買自Invitrogen (目錄號# A13401)。細胞係在以商業補充劑S7 (ThermoFisher，目錄號# SO0175)補充之商業培養基EpiLife (ThermoFisher，目錄號# MEPI500CA)中在缺乏血清之情況下生長。組織培養係在37℃，在具有5%二氧化碳之加濕室中進行。HEK裂解緩衝液組合物：100 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1%氚核、5mM EDTA，最終pH 7.6。兩次傳代後，細胞係使用HEK裂解緩衝液在不添加蛋白酶及磷酸酶抑制劑之情況下裂解及蛋白濃度係使用二辛可寧酸分析(BCA) (ThermoFisher，目錄號# 23225)測定。
健康人類志願者角質層提取物之製備：角質層片係購買自Biopredic (目錄號#STR0020)。提取物製備：角質層裂解物係使用針對脂肪組織之微量總蛋白提取套組(InventBiotech，目錄號# AT-022)在均質化後按照製造商之說明書製備。整體蛋白濃度係使用BCA分析(ThermoFisher，目錄號# 23225)測定。將該等提取物速凍並儲存在-80℃下直至使用。
角質層提取物中KLK5之濃度：角質層提取物中KLK5之濃度係藉由1)來自Abcam之ELISA (目錄號# ab131555)；及2)比較選擇性發色受質PS-01 (YRSR-pNA Tyr-Arg-Ser-Arg-pNA)之水解速率與已知濃度之經純化之KLK5 (Speed Bio)之水解速率測定。此外，未知樣本中KLK5之濃度係藉由自已知樣本之速率之線性圖內插自選擇性受質之水解速率測定。
大分子受質由內源性及外源性激肽釋放素5裂解：用等體積之角質層提取物或蛋白酶在緩衝液中在37℃下培養10 ug HEK裂解物1.5 h。反應藉由在100℃以上樣緩衝液在還原條件(50 mM DTT)下沸騰5 min淬滅。蛋白質係藉由電泳在bis-tris凝膠上以4至12%丙烯醯胺梯度分離，其等在200V下運行22分鐘。在將該等蛋白質轉移至PVDF膜後，在室溫使用Intercept阻斷緩衝液(Licor)將非特異性結合阻斷一小時。印跡上之信號係由GAPDH標準化。
下文匯總用於偵測特定蛋白質之條件：
橋體芯蛋白 1 ：橋體芯蛋白抗體sc-137164 (Santa Cruz Biochemicals)係經1/750稀釋並在40℃培養18 h。洗後，在1/20000稀釋儲備溶液後添加二級抗小鼠抗體(Licor)。缺乏KLK5之對照係用蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物(Cell Signalling, #5872)處理。
橋體芯膠蛋白 1 ：抗橋體芯膠蛋白1抗體(Abcam, 150382)係經1:1000稀釋。二級抗體係經1:15000稀釋。洗後， 1:15000稀釋後，添加二級抗兔。
絲聚合蛋白 ：抗絲聚合蛋白(LS-Bio, 1561)係經1:400稀釋。二級抗體係經1:10000稀釋。
發色分析結果：
蛋白酶 ：KLK5 (SpeedBioSystems)；KLK7 (R&Dsystems)在分析前用腸激酶(2小時，37℃)活化；胰蛋白酶(Sigma Aldrich)；胰凝乳蛋白酶(Sigma Aldrich)；因子Xa (Haematologic Technologies)；胞漿素(Haematologic Technologies)；KLK14 (R&Dsystems)在分析前用腸激酶(1小時，37℃)活化；凝血酶(Haematologic Technologies)；嗜中性球彈性蛋白酶(Athens Research&Technology)；及KLK1 (Prospec)。
化合物 408 ：由化合物1.001之4-喹唑啉酮部分水解開環產生之產物，由下式表示：
Figure 02_image093
。
分析結果闡述於表3中。 表3：化合物1.001及化合物408之發色分析結果。
蛋白酶 受質 化合物1.001 化合物408
名稱 測試濃度 名稱 測試濃度 最高濃度 IC50 (μM) IC50
KLK5 10 nM S-2288 500 μM 10 μM 0.176 μM (n=2)； 0.188 μM (n=2) 無抑制
KLK7 20 nM CS-PSA 500 μM 20 μM 0.693 μM (n=2)； 0.647 μM (n=2) 無抑制
胰蛋白酶 0.1 nM S-2288 500 μM 50 μM 1.664 μM (n=2)； 1.363 μM (n=2)； 2.204 μM (n=2) 無抑制
胰凝乳蛋白酶 0.2 nM CS-PSA 500 μM 50 μM 0.249 μM (n=2)； 0.317 μM (n=2) 無抑制
因子Xa 0.5 nM S-2288 500 μM 20 μM 3.217 μM (n=2)； 10.40 μM (n=2)； 3.935 μM (n=2) 無抑制
胞漿素 1.0 nM S-2288 500 μM 50 μM 3.357 μM (n=2)； 4.196 μM (n=2) 無抑制
KLK14 5 nM，1 nM S-2288 500 μM 50 μM 0.633 μM (5 nM)a ； 0.442 μM (1 nM)b 無抑制
凝血酶 0.5 nM S-2288 500 μM 100 μM ＞10 μM (n=2)； ＞10 μM (n=2)； ＞10 μM (n=2) 無抑制
嗜中性球彈性蛋白酶 0.5 nM 彈性蛋白酶受質1 200 μM 100 μM ＞50 μM (n=2)； ＞50 μM (n=2) ＞ 500 μM
KLK1 10 nM S-2266 200 μM 50 μM 無抑制 無抑制
S-2288、S-2266及CS-PSA係購買自Diapharma並在10 mM溶液下溶解於水中；及 彈性蛋白酶受質1係購買自Sigma並在0.8 mM溶液下溶解於水中。 a：在5 nM KLK14之濃度下之IC50 ；及b：在1 nM KLK14之濃度下之IC50 。
結論：可得出結論，化合物1.001係KLK5、KLK7及胰凝乳蛋白酶之抑制劑。相反，缺乏4-喹唑啉酮部分(即，化合物1.001之藥效團)之化合物408無法抑制蛋白酶。
圖1顯示用於製備化合物1.001之方案。
圖2顯示用於製備化合物1.002之方案。
圖3顯示用於製備用於製備化合物1.001及1.002之中間物100之方案。
圖4A至4D顯示在皮膚提取物分析中化合物1.001、1.002或已知化合物14蛋白水解裂解KLK5選擇性受質之速率。圖4A：對照；圖4B：化合物14；圖4C：化合物1.001；及圖4D：化合物1.002。NSK係指新鮮製備之皮膚提取物；及OSK係指解凍後之皮膚提取物。
 
𠯤
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 109134275-A0101-11-0002-3

Claims (22)

  1. 一種由式(I)表示之化合物：
    Figure 03_image001
    (I)， 或其醫藥上可接受之複合物；其中R係H或選自由-R1 及-C(O)R1a 組成之群之成員，其中R1 係C1-12 烷基，及R1a 係H或C1-12 烷基。
  2. 如請求項1之化合物，由式(Ia)表示：
    Figure 03_image008
    (Ia)， 或其醫藥上可接受之複合物。
  3. 如請求項1之化合物，由式(Ib)表示：
    Figure 03_image010
    (Ib)， 或其醫藥上可接受之複合物。
  4. 如請求項1之化合物，由式(Ic)表示：
    Figure 03_image012
    (Ic)， 或其醫藥上可接受之複合物。
  5. 如請求項1之化合物，由下式表示：
    Figure 03_image014
    ， 或其醫藥上可接受之複合物。
  6. 如請求項1之化合物，由下式表示：
    Figure 03_image016
    ， 或其醫藥上可接受之複合物。
  7. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至6中任一項之化合物，及醫藥上可接受之載劑。
  8. 如請求項7之醫藥組合物，其中該化合物具有下式：
    Figure 03_image014
    ， 或其醫藥上可接受之複合物。
  9. 如請求項7之醫藥組合物，其中該化合物具有下式：
    Figure 03_image016
    ， 或其醫藥上可接受之複合物。
  10. 如請求項7至9中任一項之醫藥組合物，其經製備用於局部投與。
  11. 一種治療有需要個體與一或多種KLK蛋白酶之蛋白水解活性相關之皮膚病之方法，其包括向該個體投與有效量之具有式(I)之化合物：
    Figure 03_image001
    (I)， 或其醫藥上可接受之複合物；其中R係H或選自由-R1 及-C(O)R1a 組成之群之成員，其中R1 係C1-12 烷基，及R1a 係H或C1-12 烷基。
  12. 如請求項11之方法，其中該化合物具有式(Ia)：
    Figure 03_image008
    (Ia) 或其醫藥上可接受之複合物。
  13. 如請求項11之方法，其中該化合物具有選自由以下組成之群之式：
    Figure 03_image014
    及
    Figure 03_image016
    ， 或其醫藥上可接受之複合物。
  14. 如請求項11至13中任一項之方法，其中該皮膚病為遺傳性皮膚病(genodermatosis)。
  15. 如請求項14之方法，其中該遺傳性皮膚病為納瑟頓症候群(Netherton Syndrome)。
  16. 如請求項11至15中任一項之方法，其中該一或多種KLK蛋白酶係KLK5及/或KLK7。
  17. 如請求項11至16中任一項之方法，其中該化合物係經局部投與。
  18. 一種用於測定一或多種KLK蛋白酶之蛋白水解活性之活體外分析，其包括： a)製備皮膚提取物； b)使受質及式(I)化合物：
    Figure 03_image001
    (I)， 或其醫藥上可接受之複合物曝露於該皮膚提取物；及 c)測定該受質之蛋白水解裂解之速率， 其中： 該受質為肽-對硝基醯胺苯；及 R係H或選自由-R1 及-C(O)R1a 組成之群之成員，其中R1 係C1-12 烷基，及R1a 係H或C1-12 烷基。
  19. 如請求項18之分析，其中該受質為Tyr-Arg-Ser-Arg-pNA或Lys-His-Leu-Tyr-pNA。
  20. 如請求項18之分析，其中該化合物具有式(Ia)：
    Figure 03_image008
    (Ia) 或其醫藥上可接受之複合物。
  21. 如請求項18之分析，其中該化合物具有選自由以下組成之群之式：
    Figure 03_image014
    及
    Figure 03_image016
    ， 或其醫藥上可接受之複合物。
  22. 如請求項18之分析，其中該皮膚提取物為人類皮膚提取物。
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