TW202120529A - 用於遞送負載物之組合物及顆粒 - Google Patents

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克義 劉
湯瑪士 卡爾 哈德
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Abstract

本發明提供包含顆粒、微米顆粒或奈米顆粒之複合物及組合物，用於將負載物遞送至細胞中或穿過極化上皮細胞。該等組合物可在丸劑或錠劑中包含負載物，以將該負載物遞送至極化上皮細胞中或穿過極化上皮細胞。

Description

用於遞送負載物之組合物及顆粒
大型大分子及/或蛋白質生物藥品不能跨越上皮細胞、呼吸上皮細胞或腸上皮細胞容易地吸收可為開發此等藥劑之商業可行配方中的限制因素。舉例而言，由於此種不能吸收，不穩定物質可保持於腸腔中直至標記酶(resident enzyme)將其降解，且穩定物質可保持於腸腔中直至其自身體傳遞。此外，經肺遞送治療劑可存在挑戰。
儘管評估各種生物活性劑治療疾病，例如癌症、發炎性疾病、免疫疾病、生長缺陷病症等的臨床研究具有有前景的結果，但此等藥劑可能無法發揮最佳潛力。由於固有限制，諸如短生物半衰期(其可妨礙遞送最佳治療有效劑量)，及/或在治療有效劑量下觀測到的有害副作用及毒性，可存在邊際功效或不足的整體功效。此外，此等藥劑可能需要多個給藥方案，其可能必需連續靜脈內投與或頻繁皮下注射，對於患者及照護者可為繁重的。
因此，需要可用於向人類個體投與治療劑之新方法及組合物。亦需要向個體遞送葡萄糖調節劑之改良方法及組合物。
在某些實施例中，本文描述一種組合物，其包含能夠進入極化上皮細胞或胞吞轉運穿過極化上皮細胞之載體；及異源負載物，其中異源負載物與載體之莫耳比為大於1:1。在一些實施例中，該組合物包含過渡金屬陽離子。在一些實施例中，過渡金屬陽離子選自由以下組成之群：Fe2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Ni2+及Cu2+。在一些實施例中，過渡金屬陽離子為Zn2+。
在一些實施例中，該組合物包含聚陽離子。在一些實施例中，聚陽離子為魚精蛋白。
在一些實施例中，載體包含Cholix多肽之一部分。在一些實施例中，載體由假單胞菌外毒素A之一部分組成。在一些實施例中，載體由Cholix多肽之一部分組成。在一些實施例中，Cholix多肽由C端在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置206至425中之任一者處之胺基酸序列組成。在一些實施例中，Cholix多肽由C端在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置150至205中之任一者處之胺基酸序列組成。在一些實施例中，Cholix多肽由C端在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置150至195中之任一者處之胺基酸序列組成。在一些實施例中，Cholix多肽由N端在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置1至41中之任一者處之胺基酸序列組成。在一些實施例中，Cholix多肽由N端在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置35至40中之任一者處之胺基酸序列組成。在一些實施例中，Cholix多肽由SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置40至SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置150至205中之任一者的胺基酸序列組成。在一些實施例中，Cholix多肽具有在SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置150至187中之任一者處之C端。在一些實施例中，Cholix多肽由SEQ ID NO: 8中所闡述之胺基酸序列組成。在一些實施例中，Cholix多肽由SEQ ID NO: 9或SEQ ID: NO: 10中所闡述之胺基酸序列組成。在一些實施例中，胺基酸位置係基於Cholix多肽與SEQ ID NO: 7中闡述之序列的比對而編號，其中胺基酸位置自N端至C端且自N端處之位置1開始編號。
在一些實施例中，異源負載物選自由以下組成之群：大分子、小分子、肽、多肽、核酸、mRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反義分子、抗體、DNA、質體、疫苗、聚合物奈米顆粒及催化活性物質。在一些實施例中，該異源負載物為治療負載物。
在一些實施例中，異源負載物選自由以下組成之群：染料及放射性藥品、激素、細胞介素、抗TNF劑、葡萄糖降低劑、腫瘤相關抗原、肽及多肽。在一些實施例中，異源負載物為多肽，該多肽為胃腸道中之發炎的調節劑。
在一些實施例中，異源負載物為類升糖素肽-2 (GLP-2)類似物。在一些實施例中，GLP-2類似物為替度魯肽(Teduglutide)。
在一些實施例中，異源負載物為細胞介素。在一些實施例中，細胞介素選自由以下組成之群：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29及IL-30。在一些實施例中，細胞介素為IL-10。在一些實施例中，細胞介素為IL-22。在一些實施例中，細胞介素不具有天然分泌信號。在一些實施例中，該治療負載物為激素。在一些實施例中，激素為人類生長激素(hGH)。
在一些實施例中，該異源負載物為葡萄糖降低劑。在一些實施例中，異源負載物為腸促胰島素、升糖素前蛋白、升糖素肽、類升糖素肽1、類升糖素肽2、腸高血糖素、腸高血糖素相關多肽、抑胃多肽前蛋白、抑胃多肽、二肽基肽酶4、葡萄糖轉運體成員4、前升糖素原、胰島素受體受質1、胰島素、胰島素類似物、載脂蛋白A-II、溶質載體家族2、促進葡萄糖轉運體成員1、肝糖合酶1、肝糖合酶2、酪胺酸蛋白磷酸酶非受體1型、RAC-α絲胺酸蘇胺酸蛋白激酶、過氧化體增殖物活化受體γ、己糖激酶3、磷脂醯肌醇-3,4,5-三磷酸3-磷酸酶及雙特異性蛋白、丙酮酸脫氫酶激酶1、含鈣結合域及捲曲螺旋域之蛋白1、Max樣蛋白X、果糖-二磷酸醛縮酶A、類升糖素肽1受體、類升糖素肽2受體、抑胃多肽受體、類胰島素生長因子1受體、類胰島素生長因子2受體、胰島素受體、GLP-1促效劑-艾塞那肽(exenatide)、GLP-1促效劑-利拉魯肽(Liraglutide)、艾塞那肽、腸促胰島素類似物-4、腸促胰島素類似物-3、GIPR促效劑(Des-Ala2-GIP1-30)、GIPR促效劑-截短GIP1-30、GLP-1R促效劑(GIP之aa 1-37)、GLP-1R促效劑(GIP之aa 7-36)、利司那肽(商品名Adlyxin®及Lyxumia®，Sanofi)、利拉魯肽(商品名Victoza®，Novo Nordisk A/S)、司美魯肽(商品名Ozempic®，Novo Nordisk A/S)、阿必魯肽(商品名Tanzeum®，GlaxoSmithKline；與白蛋白融合之GLP-1二聚體)、度拉糖肽(商品名Trulicity®，Eli Lilly)、葡萄糖依賴性促胰島素多肽、多特異性肽促效劑、泰帕肽(Eli Lilly)、SAR425899 (Sanofi)、雙澱粉素降鈣素受體促效劑DACRA-089、甘精胰島素(glargine)/Lantus®、谷賴胰島素(glulisin)/Apidra®、格拉胰島素(glarine)/Toujeo®、insuman®、地特胰島素(detemir)/Levemir®、賴脯胰島素(lispro)/Humalog®/Liprolog®、德谷胰島素(Degludec)/DegludecPlus、門冬胰島素、胰島素及類似物(例如LY-2605541、LY2963016、NN1436)、聚乙二醇化賴脯胰島素、Humulin®、Linjeta、SuliXen®、NN1045、胰島素加SymlinTM、PE0139、速效及短效胰島素(例如Linjeta、PH20、NN1218、HinsBet)、(APC-002)水凝膠、口服、可吸入、經皮及舌下胰島素(例如Exubera®、Nasulin®、Afrezza®、Tregopil®、TPM 02、Capsulin、Oral-lyn®、Cobalamin®、口服胰島素、ORMD-0801、NN1953、NN1954、NN1956、VIAtab及Oshadi口服胰島素)或腸促胰島素類似物-4類似物，其中腸促胰島素類似物-4類似物為desPro36-腸促胰島素類似物-4(1-39)-Lys6NH2；H-des(Pro36, 37)-腸促胰島素類似物-4-Lys4-NH2；H-des(Pro36, 37)-腸促胰島素類似物-4-Lys5-NH2；desPro36[Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14, Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Trp(O2) 26, Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；或desPro36[Trp(O2) 25, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, Asp28 ]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；或desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)。
在一些實施例中，異源負載物為胰島素或胰島素類似物。在一些實施例中，異源負載物為艾塞那肽。在一些實施例中，異源負載物包含螢光標記。在一些實施例中，螢光標記為螢光素。
在一些實施例中，異源負載物為艾塞那肽-螢光素複合物。在一些實施例中，組合物對經胰酶裂解具抗性。在一些實施例中，至少50%之載體在胰酶分析中於2小時處完整，其中胰酶分析包含在37℃下於100 µL磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中將包含100 µg載體之組合物與10 µg胰酶一起培育。在一些實施例中，過渡金屬陽離子與載體之莫耳比為約100:1至約300,000:1。在一些實施例中，過渡金屬陽離子與載體之莫耳比為約1000:1至約30,000:1。在一些實施例中，過渡金屬陽離子與載體之莫耳比為約1000:1至約10,000:1。
在一些實施例中，魚精蛋白與載體之莫耳比為約10:1至約0.01:1。在一些實施例中，異源負載物與載體之莫耳比為約2:1至約6000:1。在一些實施例中，魚精蛋白與載體之莫耳比為約1:1。在一些實施例中，異源負載物與載體之莫耳比為約2:1至約10:1。在一些實施例中，異源負載物與載體之莫耳比為約7:1。在一些實施例中，異源負載物與載體之莫耳比為約7.16:1。
在一些實施例中，異源負載物為包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 14之序列的多肽。在一些實施例中，異源負載物為包含SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 19之序列的多肽。在一些實施例中，異源負載物為包含SEQ ID NO: 20之序列的多肽。在一些實施例中，異源負載物為包含SEQ ID NO: 21之序列的多肽。如技術方案1之組合物，其中異源負載物為包含SEQ ID NO: 22之序列的多肽。
在一些實施例中，組合物經囊封。在一些實施例中，囊封組合物經設計以在第一條件下但不在第二條件下釋放異源負載物。在一些實施例中，囊封組合物經設計以在高pH下但不在低pH下釋放異源負載物。在一些實施例中，囊封組合物包含腸溶衣。在一些實施例中，組合物為顆粒。在一些實施例中，該組合物包含聚陽離子。在一些實施例中，載體能夠在極化上皮細胞中轉運異源負載物或將異源負載物胞吞轉運穿過極化上皮細胞。在一些實施例中，載體偶聯至聚陽離子。在一些實施例中，聚陽離子為魚精蛋白、聚離胺酸、聚鳥胺酸、聚乙烯亞胺(PEI)、醇溶穀蛋白、魚精蛋白、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、聚精胺酸、聚乙烯胺或其組合。在一些實施例中，聚陽離子為魚精蛋白鹽。在一些實施例中，魚精蛋白鹽為硫酸魚精蛋白、乙酸魚精蛋白、溴化魚精蛋白、氯化魚精蛋白、己酸魚精蛋白、三氟乙酸魚精蛋白、魚精蛋白HCO3、丙酸魚精蛋白、乳酸魚精蛋白、甲酸魚精蛋白、硝酸魚精蛋白、檸檬酸魚精蛋白、單氫磷酸魚精蛋白、二氫磷酸魚精蛋白、酒石酸魚精蛋白或過氯酸魚精蛋白。在一些實施例中，魚精蛋白鹽為硫酸魚精蛋白。
在一些實施例中，本文描述能夠進入極化上皮細胞或胞吞轉運穿過極化上皮細胞之載體，其中至少60%之載體在胰酶分析中於0.5小時處完整，其中胰酶分析包含在37℃下於100 µL磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中將包含100 µg載體之組合物與10 µg胰酶一起培育。
在一些實施例中，至少90%之載體在胰酶分析中於2小時處保持完整。如技術方案68之組合物，其進一步包含陽離子。在一些實施例中，陽離子為金屬陽離子或聚陽離子。在一些實施例中，陽離子為金屬陽離子。在一些實施例中，金屬陽離子為過渡金屬陽離子。在一些實施例中，載體由假單胞菌外毒素A之一部分組成。在一些實施例中，載體由Cholix多肽之一部分組成。在一些實施例中，Cholix多肽由C端在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置206至425中之任一者處之胺基酸序列組成。在一些實施例中，Cholix多肽由C端在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置150至205中之任一者處之胺基酸序列組成。在一些實施例中，Cholix多肽由C端在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置150至195中之任一者處之胺基酸序列組成。在一些實施例中，Cholix多肽由N端在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置1至41中之任一者處之胺基酸序列組成。在一些實施例中，Cholix多肽由N端在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置35至40中之任一者處之胺基酸序列組成。
在一些實施例中，Cholix多肽由SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置40至SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置150至205中之任一者的胺基酸序列組成。在一些實施例中，Cholix多肽具有SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置150至187中之任一者處之C端。在一些實施例中，Cholix多肽由SEQ ID NO: 8中所闡述之胺基酸序列組成。在一些實施例中，Cholix多肽由SEQ ID NO: 9或SEQ ID: NO: 10中所闡述之胺基酸序列組成。在一些實施例中，胺基酸位置係基於Cholix多肽與SEQ ID NO: 7中闡述之序列的比對而編號，其中胺基酸位置自N端至C端且自N端處之位置1開始編號。
在一些實施例中，本文描述包含在位置195-347處結束之Cholix變異體及異源負載物之組合物，其中異源負載物為葡萄糖調節劑。在一些實施例中，Cholix變異體之結束位置係相對於SEQ ID NO: 7而確定。在一些實施例中，載體能夠胞吞轉運異源負載物穿過極化上皮細胞。在一些實施例中，葡萄糖調節劑為葡萄糖降低劑。在一些實施例中，葡萄糖降低劑為腸促胰島素、升糖素前蛋白、升糖素肽、類升糖素肽1、類升糖素肽2、腸高血糖素、腸高血糖素相關多肽、抑胃多肽前蛋白、抑胃多肽、二肽基肽酶4、葡萄糖轉運體成員4、前升糖素原、胰島素受體受質1、胰島素、胰島素類似物、載脂蛋白A-II、溶質載體家族2、促進葡萄糖轉運體成員1、肝糖合酶1、肝糖合酶2、酪胺酸蛋白磷酸酶非受體1型、RAC-α絲胺酸蘇胺酸蛋白激酶、過氧化體增殖物活化受體γ、己糖激酶3、磷脂醯肌醇-3,4,5-三磷酸3-磷酸酶及雙特異性蛋白、丙酮酸脫氫酶激酶1、含鈣結合域及捲曲螺旋域之蛋白1、Max樣蛋白X、果糖-二磷酸醛縮酶A、類升糖素肽1受體、類升糖素肽2受體、抑胃多肽受體、類胰島素生長因子1受體、類胰島素生長因子2受體、胰島素受體、GLP-1促效劑-艾塞那肽、GLP-1促效劑-利拉魯肽、艾塞那肽、腸促胰島素類似物-4、腸促胰島素類似物-3、GIPR促效劑(Des-Ala2-GIP1-30)、GIPR促效劑-截短GIP1-30、GLP-1R促效劑(GIP之aa 1-37)、GLP-1R促效劑(GIP之aa 7-36)、利司那肽(商品名Adlyxin®及Lyxumia®，Sanofi)、利拉魯肽(商品名Victoza®，Novo Nordisk A/S)、司美魯肽(商品名Ozempic®，Novo Nordisk A/S)、阿必魯肽(商品名Tanzeum®，GlaxoSmithKline；與白蛋白融合之GLP-1二聚體)、度拉糖肽(商品名Trulicity®，Eli Lilly)、葡萄糖依賴性促胰島素多肽、多特異性肽促效劑、泰帕肽(Eli Lilly)、SAR425899 (Sanofi)、雙澱粉素降鈣素受體促效劑DACRA-089、甘精胰島素/Lantus®、谷賴胰島素/Apidra®、格拉胰島素/Toujeo®、insuman®、地特胰島素/Levemir®、賴脯胰島素/Humalog®/Liprolog®、德谷胰島素/DegludecPlus、門冬胰島素、胰島素及類似物(例如LY-2605541、LY2963016、NN1436)、聚乙二醇化賴脯胰島素、Humulin®、Linjeta、SuliXen®、NN1045、胰島素加SymlinTM、PE0139、速效及短效胰島素(例如Linjeta、PH20、NN1218、HinsBet)、(APC-002)水凝膠、口服、可吸入、經皮及舌下胰島素(例如Exubera®、Nasulin®、Afrezza®、Tregopil®、TPM 02、Capsulin、Oral-lyn®、Cobalamin®、口服胰島素、ORMD-0801、NN1953、NN1954、NN1956、VIAtab及Oshadi口服胰島素)或腸促胰島素類似物-4類似物，其中腸促胰島素類似物-4類似物為desPro36-腸促胰島素類似物-4(1-39)-Lys6NH2；H-des(Pro36, 37)-腸促胰島素類似物-4-Lys4-NH2；H-des(Pro36, 37)-腸促胰島素類似物-4-Lys5-NH2；desPro36[Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14, Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Trp(O2) 26, Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；或desPro36[Trp(O2) 25, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, Asp28 ]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；或desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)。
在一些實施例中，異源負載物包含腸促胰島素。在一些實施例中，異源負載物包含艾塞那肽或胰島素。在一些實施例中，該組合物包含顆粒。在一些實施例中，異源負載物為腸促胰島素類似物-3、埃格納肽(efpeglenatide)、司美魯肽、GLP-1R促效劑(GIP之aa 1-37)、GLP-1R促效劑(GIP之aa 7-36)、泰帕肽、調酸素、GIPR促效劑-截短GIP1-30、雙澱粉素降鈣素受體促效劑、前胰島素原、門冬胰島素、甘精胰島素或賴脯胰島素。
在一些實施例中，本文描述組合物，其包含衍生自能夠進入極化上皮細胞或胞吞轉運穿過極化上皮細胞之細菌毒素的載體；及過渡金屬陽離子或聚陽離子，其中聚陽離子為具有大於2個正電荷之分子或化學複合物。在一些實施例中，該組合物包含過渡金屬陽離子。在一些實施例中，過渡金屬陽離子選自由以下組成之群：Fe2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Ni2+及Cu2+。在一些實施例中，過渡金屬陽離子為Zn2+。在一些實施例中，該組合物包含聚陽離子。
在一些實施例中，聚陽離子為魚精蛋白、聚離胺酸、聚鳥胺酸、聚乙烯亞胺(PEI)、醇溶穀蛋白、魚精蛋白、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、聚精胺酸、聚乙烯胺或其組合。在一些實施例中，聚陽離子為魚精蛋白鹽。在一些實施例中，魚精蛋白鹽為硫酸魚精蛋白、乙酸魚精蛋白、溴化魚精蛋白、氯化魚精蛋白、己酸魚精蛋白、三氟乙酸魚精蛋白、魚精蛋白HCO3、丙酸魚精蛋白、乳酸魚精蛋白、甲酸魚精蛋白、硝酸魚精蛋白、檸檬酸魚精蛋白、單氫磷酸魚精蛋白、二氫磷酸魚精蛋白、酒石酸魚精蛋白或過氯酸魚精蛋白。在一些實施例中，魚精蛋白鹽為硫酸魚精蛋白。在一些實施例中，組合物進一步包含異源負載物。在一些實施例中，異源負載物包含艾塞那肽、胰島素或人類生長激素。
在一些實施例中，載體由假單胞菌外毒素A或假單胞菌外毒素A之一部分組成。在一些實施例中，載體由SEQ ID NO: 69或SEQ ID NO: 69之一部分的多肽組成。在一些實施例中，載體由Cholix多肽之一部分組成。在一些實施例中，Cholix多肽由C端在SEQ ID NO: 1之胺基酸位置206至425中之任一者處之胺基酸序列組成。在一些實施例中，Cholix多肽由C端在SEQ ID NO: 1之胺基酸位置150至205中之任一者處之胺基酸序列組成。在一些實施例中，Cholix多肽由C端在SEQ ID NO: 1之胺基酸150至195中之任一者處之胺基酸序列組成。
在一些實施例中，Cholix多肽由N端在SEQ ID NO: 1之胺基酸位置1至41中之任一者處之胺基酸序列組成。在一些實施例中，Cholix多肽由N端在SEQ ID NO: 1之胺基酸位置35至40中之任一者處之胺基酸序列組成。在一些實施例中，Cholix多肽由SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置40至SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置150至205中之任一者的胺基酸序列組成。在一些實施例中，Cholix多肽具有SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置150至187中之任一者處之C端。在一些實施例中，Cholix多肽由SEQ ID NO: 8中所闡述之胺基酸序列組成。在一些實施例中，Cholix多肽由SEQ ID NO: 9或SEQ ID: NO: 10中所闡述之胺基酸序列組成。在一些實施例中，胺基酸位置係基於Cholix多肽與SEQ ID NO: 7中闡述之序列的比對而編號，其中胺基酸位置自N端至C端且自N端處之位置1開始編號。在一些實施例中，該組合物包含顆粒。
在一些實施例中，本文描述包含胰島素之組合物，其中至少20%之胰島素在胰酶分析中於1小時處完整，該胰酶分析包含在37℃下於PBS中將包含胰島素之組合物與胰酶一起培育。
在一些實施例中，組合物進一步包含衍生自細菌毒素之載體，其中載體能夠轉運至極化上皮細胞中或胞吞轉運穿過極化上皮細胞。在一些實施例中，載體由Cholix多肽之一部分組成。在一些實施例中，該組合物包含過渡金屬陽離子。在一些實施例中，過渡金屬陽離子選自由以下組成之群：Fe2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Ni2+及Cu2+。在一些實施例中，過渡金屬陽離子為Zn2+。在一些實施例中，該組合物包含聚陽離子。在一些實施例中，聚陽離子為魚精蛋白。在一些實施例中，該組合物包含顆粒。在一些具體實例中，顆粒包含微米顆粒。在一些實施例中，微米顆粒係藉由噴霧乾燥形成。在一些實施例中，顆粒之直徑為約50 nm至約20 µm。
在一些實施例中，本文描述包含本文所描述之組合物的醫藥組合物。在一些實施例中，本文描述包含本文所描述之組合物及防腐劑的醫藥組合物。在一些實施例中，本文描述包含本文所描述之組合物及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥組合物。在一些實施例中，本文描述包含向個體投與本文所描述之醫藥組合物的方法。在一些實施例中，個體患有發炎性疾病、自體免疫疾病、癌症或代謝病症。在一些實施例中，個體患有代謝病症。
在一些實施例中，代謝病症為糖尿病、由肥胖所致之糖尿病、高血糖症、血脂異常、高三酸甘油酯血症、症候群X、胰島素抗性、葡萄糖耐受性異常(IGT)、糖尿病性血脂異常、高脂質血症、脂肪肝病、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、肝炎、肥胖、血管疾病、心臟病、中風、葡萄糖耐受性異常、空腹葡萄糖升高、胰島素抗性、尿白蛋白分泌、中心型肥胖、高血壓、三酸甘油酯升高、LDL膽固醇升高及HDL膽固醇降低、高血糖症、高胰島素血症、血脂異常、酮病、高三酸甘油酯血症、症候群X、胰島素抗性、空腹葡萄糖異常、葡萄糖耐受性異常(IGT)、糖尿病性血脂異常、葡糖新生、過量肝糖分解、糖尿病性酮酸中毒、高三酸甘油酯血症、高血壓、糖尿病性腎病、腎機能不全、腎衰竭、攝食過量、肌肉耗損、糖尿病神經病變、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性昏迷、動脈硬化、冠心病、外周動脈疾病或高脂質血症。
在一些實施例中，本文描述包含組合細菌源性載體與異源負載物及陽離子以產生顆粒之方法。在一些實施例中，異源負載物選自由以下組成之群：染料、放射性藥品、激素、細胞介素、抗TNF劑、葡萄糖降低劑、腫瘤相關抗原、肽及多肽。在一些實施例中，該方法進一步包含噴霧乾燥細菌源性載體、異源負載物及陽離子。在一些實施例中，方法包含(a)製備包含經分離載體及負載物之混合物；(b)製備包含硫酸魚精蛋白及NaPO4之混合物；及(c)將(a)之混合物與(b)之混合物組合且允許組合之混合物在室溫下靜置隔夜。在一些實施例中，該方法進一步包含步驟(d)藉由增加來自步驟(c)之經組合混合物之離子強度而使來自步驟(c)之顆粒破裂為較小顆粒。在一些實施例中，步驟(a)之製備物不包含ZnCl2。在一些實施例中，步驟(a)之製備物包含ZnCl2。
本發明之一態樣為一種組合物，其包含能夠進入極化上皮細胞或胞吞轉運穿過極化上皮細胞之載體；及異源負載物，其中異源負載物與載體之莫耳比為大於1:1。
組合物可為顆粒。顆粒可為微米顆粒。微米顆粒可由噴霧乾燥形成。顆粒或微米顆粒之直徑可為約50 nm至約20 µm。
在一些情況下，該組合物包含過渡金屬陽離子。過渡金屬陽離子可選自由以下組成之群：Fe2 + 、Mn2 + 、Zn2 + 、Co2 + 、Ni2 + 及Cu2 + 。過渡金屬陽離子可為Zn2 + 。
在一些情況下，該組合物包含聚陽離子。聚陽離子可為魚精蛋白。
組合物可包含衍生自細菌毒素之載體。在一些情況下，載體能夠進入極化上皮細胞或胞吞轉運穿過極化上皮細胞。在一些情況下，載體可偶聯至聚陽離子。
載體可包含假單胞菌外毒素A之一部分。在一些情況下，載體由假單胞菌外毒素A之一部分組成。載體可包含Cholix多肽之一部分。在一些情況下，載體由Cholix多肽之一部分組成。Cholix多肽可由在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置206至425中之任一者處具有C端截短之胺基酸序列組成。Cholix多肽可由在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置150至205中之任一者處具有C端截短之胺基酸序列組成。Cholix多肽可由在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置150至195中之任一者處具有C端截短之胺基酸序列組成。Cholix多肽可由在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置1至41中之任一者處具有N端截短之胺基酸序列組成。Cholix多肽可由在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置35至40中之任一者處具有C端截短之胺基酸序列組成。Cholix多肽可由SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置40至SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置150至205中之任一者的胺基酸序列組成。Cholix多肽可在SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置150處或胺基酸位置187處終止。Cholix多肽可由SEQ ID NO: 8中所闡述之胺基酸序列組成。Cholix多肽可由SEQ ID NO: 9或SEQ ID: NO: 10中所闡述之胺基酸序列組成。胺基酸可基於Cholix多肽與SEQ ID NO: 7中闡述之序列的比對而編號，其中胺基酸位置可自N端至C端且自N端處之位置1開始編號。
在一些情況下，該組合物包含異源負載物。異源負載物可選自由以下組成之群：大分子、小分子、肽、多肽、核酸、信使RNA (mRNA)、微RNA (miRNA)、小髮夾RNA (shRNA)、小干擾RNA (siRNA)、CRISPR RNA (例如引導RNA，例如單引導RNA(sgRNA))、反義分子、蛋白質、抗體、DNA、質體、疫苗、聚合物奈米顆粒及催化活性物質。
異源負載物可為治療負載物。異源負載物可選自由以下組成之群：染料及放射性藥品、激素、細胞介素、抗TNF劑、葡萄糖降低劑、腫瘤相關抗原、肽及多肽。異源負載物可為多肽，該多肽為胃腸道中之發炎的調節劑。治療負載物可為類升糖素肽-2 (GLP-2)類似物。GLP-2類似物可為替度魯肽。
異源負載物可為細胞介素。細胞介素可選自由以下組成之群：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29及IL-30。細胞介素可為IL-10。細胞介素可為IL-22。細胞介素可不具有其天然分泌信號。
異源負載物可為激素。激素可為人類生長激素(hGH)。
異源負載物可為葡萄糖降低劑。異源負載物可為腸促胰島素、升糖素前蛋白、升糖素肽、類升糖素肽1、類升糖素肽2、腸高血糖素、腸高血糖素相關多肽、抑胃多肽前蛋白、抑胃多肽、二肽基肽酶4、葡萄糖轉運體成員4、前升糖素原、胰島素受體受質1、胰島素、胰島素類似物、載脂蛋白A-II、溶質載體家族2、促進葡萄糖轉運體成員1、肝糖合酶1、肝糖合酶2、酪胺酸蛋白磷酸酶非受體1型、RAC-α絲胺酸蘇胺酸蛋白激酶、過氧化體增殖物活化受體γ、己糖激酶3、磷脂醯肌醇-3,4,5-三磷酸3-磷酸酶及雙特異性蛋白、丙酮酸脫氫酶激酶1、含鈣結合域及捲曲螺旋域之蛋白1、Max樣蛋白X、果糖-二磷酸醛縮酶A、類升糖素肽1受體、類升糖素肽2受體、抑胃多肽受體、類胰島素生長因子1受體、類胰島素生長因子2受體、胰島素受體、GLP-1促效劑-艾塞那肽、GLP-1促效劑-利拉魯肽、艾塞那肽、腸促胰島素類似物-4、腸促胰島素類似物-3、GIPR促效劑(Des-Ala2-GIP1-30)、GIPR促效劑-截短GIP1-30、GLP-1R促效劑(GIP之aa 1-37)、GLP-1R促效劑(GIP之aa 7-36)、利司那肽(商品名Adlyxin®及Lyxumia®，Sanofi)、利拉魯肽(商品名Victoza®，Novo Nordisk A/S)、司美魯肽(商品名Ozempic®，Novo Nordisk A/S)、阿必魯肽(商品名Tanzeum®，GlaxoSmithKline；與白蛋白融合之GLP-1二聚體)、度拉糖肽(商品名Trulicity®，Eli Lilly)、葡萄糖依賴性促胰島素多肽、多特異性肽促效劑、泰帕肽(Eli Lilly)、SAR425899 (Sanofi)、雙澱粉素降鈣素受體促效劑DACRA-089、甘精胰島素/Lantus®、谷賴胰島素/Apidra®、格拉胰島素/Toujeo®、insuman®、地特胰島素/Levemir®、賴脯胰島素/Humalog®/Liprolog®、德谷胰島素/DegludecPlus、門冬胰島素、胰島素及類似物(例如LY-2605541、LY2963016、NN1436)、聚乙二醇化賴脯胰島素、Humulin®、Linjeta、SuliXen®、NN1045、胰島素加SymlinTM、PE0139、速效及短效胰島素(例如Linjeta、PH20、NN1218、HinsBet)、(APC-002)水凝膠、口服、可吸入、經皮及舌下胰島素(例如Exubera®、Nasulin®、Afrezza®、Tregopil®、TPM 02、Capsulin、Oral-lyn®、Cobalamin®、口服胰島素、ORMD-0801、NN1953、NN1954、NN1956、VIAtab及Oshadi口服胰島素)或腸促胰島素類似物-4類似物，其中腸促胰島素類似物-4類似物為desPro36-腸促胰島素類似物-4(1-39)-Lys6NH2；H-des(Pro36, 37)-腸促胰島素類似物-4-Lys4-NH2；H-des(Pro36, 37)-腸促胰島素類似物-4-Lys5-NH2；desPro36[Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14, Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Trp(O2) 26, Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Trp(O2) 25, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, Asp28 ]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；或desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)。異源負載物可為胰島素或胰島素類似物。異源負載物可為艾塞那肽。
異源負載物可包含螢光標記。螢光標記可為螢光素。異源負載物可為艾塞那肽-螢光素複合物。
在一些情況下，組合物對經胰臟酶裂解具抗性。至少50%之載體可在暴露於胰酶2小時之後保持完整。至少50%之載體可在胰酶分析中在2小時之後保持完整，其中胰酶分析包含在37℃下於100 µL磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中將包含100 µg載體之組合物與10 µg胰酶一起培育。
過渡金屬陽離子與載體之莫耳比可為約100:1至約300,000:1。過渡金屬陽離子與載體之莫耳比可為約1000:1至約30,000:1。過渡金屬陽離子與載體之莫耳比可為約1000:1至約10,000:1。
魚精蛋白與載體之莫耳比可為約10:1至約0.01:1。異源負載物與載體之莫耳比可為約2:1至約6000:1。魚精蛋白與載體之莫耳比可為約1:1。
異源負載物與載體之莫耳比可為約2:1至約10:1。異源負載物與載體之莫耳比可為約7:1。異源負載物與載體之莫耳比可為約7.16:1。
異源負載物可為包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 14之序列的多肽。異源負載物可為包含SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 19之序列的多肽。異源負載物可為包含SEQ ID NO: 20之序列的多肽。異源負載物可為包含SEQ ID NO: 21之序列的多肽。異源負載物可為包含SEQ ID NO: 22之序列的多肽。
組合物可經囊封。囊封組合物可經設計以在第一條件下但不在第二條件下釋放異源負載物。囊封組合物可經設計以在高pH下但不在低pH下釋放異源負載物。囊封組合物可包含腸溶衣。
本發明之另一態樣為包含任何本文揭示之組合物的醫藥組合物。
在一些情況下，聚陽離子為魚精蛋白、聚離胺酸、聚鳥胺酸、聚乙烯亞胺(PEI)、醇溶穀蛋白、魚精蛋白、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、聚精胺酸、聚乙烯胺或其組合。在一些情況下，聚陽離子為魚精蛋白鹽。在一些情況下，魚精蛋白鹽為硫酸魚精蛋白、乙酸魚精蛋白、溴化魚精蛋白、氯化魚精蛋白、己酸魚精蛋白、三氟乙酸魚精蛋白、魚精蛋白HCO3、丙酸魚精蛋白、乳酸魚精蛋白、甲酸魚精蛋白、硝酸魚精蛋白、檸檬酸魚精蛋白、單氫磷酸魚精蛋白、二氫磷酸魚精蛋白、酒石酸魚精蛋白或過氯酸魚精蛋白。在一些情況下，魚精蛋白鹽為硫酸魚精蛋白。
本發明之一態樣為包含載體之組合物，其中載體能夠進入極化上皮細胞或胞吞轉運穿過極化上皮細胞，其中至少60%之載體在胰酶分析中於0.5小時處完整，其中胰酶分析包含在37℃下於100 µL磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中將包含100 µg載體之組合物與10 µg胰酶一起培育。在一些情況下，至少90%之載體在胰酶分析中於2小時處保持完整。
在一些情況下，組合物進一步包含陽離子。在一些情況下，陽離子為金屬陽離子或聚陽離子。在一些情況下，陽離子為金屬陽離子。在一些情況下，金屬陽離子為過渡金屬陽離子。在一些情況下，載體由假單胞菌外毒素A之一部分組成。在一些情況下，載體由Cholix多肽之一部分組成。在一些情況下，Cholix多肽由在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置206至425中之任一者處具有C端之胺基酸序列組成。在一些情況下，Cholix多肽由在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置150至205中之任一者處具有C端之胺基酸序列組成。在一些情況下，Cholix多肽由在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置150至195中之任一者處具有C端之胺基酸序列組成。在一些情況下，Cholix多肽由在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置1至41中之任一者處具有C端之胺基酸序列組成。在一些情況下，Cholix多肽由在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置35至40中之任一者處具有C端之胺基酸序列組成。在一些情況下，Cholix多肽由SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置40至SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置150至205中之任一者的胺基酸序列組成。在一些情況下，Cholix多肽具有在SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置150至187中之任一者處之C端。在一些情況下，Cholix多肽由SEQ ID NO: 8中所闡述之胺基酸序列組成。在一些情況下，Cholix多肽由SEQ ID NO: 9或SEQ ID: NO: 10中所闡述之胺基酸序列組成。在一些情況下，胺基酸位置係基於Cholix多肽與SEQ ID NO: 7中闡述之序列的比對而編號，其中胺基酸位置自N端至C端且自N端處之位置1開始編號。
本發明之另一態樣為包含在位置195-347處結束之Cholix變異體及異源負載物之組合物，其中異源負載物為葡萄糖調節劑。在一些情況下，Cholix變異體之結束位置係相對於SEQ ID NO: 7而確定。在一些情況下，載體能夠胞吞轉運異源負載物穿過極化上皮細胞。在一些情況下，葡萄糖調節劑為葡萄糖降低劑。在一些情況下，葡萄糖降低劑為腸促胰島素、升糖素前蛋白、升糖素肽、類升糖素肽1、類升糖素肽2、腸高血糖素、腸高血糖素相關多肽、抑胃多肽前蛋白、抑胃多肽、二肽基肽酶4、葡萄糖轉運體成員4、前升糖素原、胰島素受體受質1、胰島素、胰島素類似物、載脂蛋白A-II、溶質載體家族2、促進葡萄糖轉運體成員1、肝糖合酶1、肝糖合酶2、酪胺酸蛋白磷酸酶非受體1型、RAC-α絲胺酸蘇胺酸蛋白激酶、過氧化體增殖物活化受體γ、己糖激酶3、磷脂醯肌醇-3,4,5-三磷酸3-磷酸酶及雙特異性蛋白、丙酮酸脫氫酶激酶1、含鈣結合域及捲曲螺旋域之蛋白1、Max樣蛋白X、果糖-二磷酸醛縮酶A、類升糖素肽1受體、類升糖素肽2受體、抑胃多肽受體、類胰島素生長因子1受體、類胰島素生長因子2受體、胰島素受體、GLP-1促效劑-艾塞那肽、GLP-1促效劑-利拉魯肽、艾塞那肽、腸促胰島素類似物-4、腸促胰島素類似物-3、GIPR促效劑(Des-Ala2-GIP1-30)、GIPR促效劑-截短GIP1-30、GLP-1R促效劑(GIP之aa 1-37)、GLP-1R促效劑(GIP之aa 7-36)、利司那肽(商品名Adlyxin®及Lyxumia®，Sanofi)、利拉魯肽(商品名Victoza®，Novo Nordisk A/S)、司美魯肽(商品名Ozempic®，Novo Nordisk A/S)、阿必魯肽(商品名Tanzeum®，GlaxoSmithKline；與白蛋白融合之GLP-1二聚體)、度拉糖肽(商品名Trulicity®，Eli Lilly)、葡萄糖依賴性促胰島素多肽、多特異性肽促效劑、泰帕肽(Eli Lilly)、SAR425899 (Sanofi)、雙澱粉素降鈣素受體促效劑DACRA-089、甘精胰島素/Lantus®、谷賴胰島素/Apidra®、格拉胰島素/Toujeo®、insuman®、地特胰島素/Levemir®、賴脯胰島素/Humalog®/Liprolog®、德谷胰島素/DegludecPlus、門冬胰島素、胰島素及類似物(例如LY-2605541、LY2963016、NN1436)、聚乙二醇化賴脯胰島素、Humulin®、Linjeta、SuliXen®、NN1045、胰島素加SymlinTM、PE0139、速效及短效胰島素(例如Linjeta、PH20、NN1218、HinsBet)、(APC-002)水凝膠、口服、可吸入、經皮及舌下胰島素(例如Exubera®、Nasulin®、Afrezza®、Tregopil®、TPM 02、Capsulin、Oral-lyn®、Cobalamin®、口服胰島素、ORMD-0801、NN1953、NN1954、NN1956、VIAtab及Oshadi口服胰島素)或腸促胰島素類似物-4類似物，其中腸促胰島素類似物-4類似物為desPro36-腸促胰島素類似物-4(1-39)-Lys6NH2；H-des(Pro36, 37)-腸促胰島素類似物-4-Lys4-NH2；H-des(Pro36, 37)-腸促胰島素類似物-4-Lys5-NH2；desPro36[Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14, Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Trp(O2) 26, Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；或desPro36[Trp(O2) 25, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, Asp28 ]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；或desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)。在一些情況下，異源負載物包含腸促胰島素。在一些情況下，異源負載物包含艾塞那肽或胰島素。在一些情況下，該組合物包含顆粒。在一些情況下，異源負載物為腸促胰島素類似物-3、埃格納肽、司美魯肽、GLP-1R促效劑(GIP之aa 1-37)、GLP-1R促效劑(GIP之aa 7-36)、泰帕肽、調酸素、GIPR促效劑-截短GIP1-30、雙澱粉素降鈣素受體促效劑、前胰島素原、門冬胰島素、甘精胰島素或賴脯胰島素。
本發明之一態樣為一種組合物，其包含衍生自能夠進入極化上皮細胞或胞吞轉運穿過極化上皮細胞之細菌毒素的載體；及過渡金屬陽離子或聚陽離子，其中聚陽離子為具有大於2個正電荷之分子或化學複合物。在一些情況下，該組合物包含過渡金屬陽離子。在一些情況下，過渡金屬陽離子選自由以下組成之群：Fe2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Ni2+及Cu2+。在一些情況下，過渡金屬陽離子為Zn2+。在一些情況下，該組合物包含聚陽離子。在一些情況下，聚陽離子為魚精蛋白鹽。在一些情況下，組合物進一步包含異源負載物。在一些情況下，異源負載物包含艾塞那肽、胰島素或人類生長激素。在一些情況下，載體由假單胞菌外毒素A或假單胞菌外毒素A之一部分組成。在一些情況下，載體由SEQ ID NO: 69或SEQ ID NO: 69之一部分的多肽組成。在一些情況下，載體由Cholix多肽之一部分組成。在一些情況下，Cholix多肽由在SEQ ID NO: 1之胺基酸位置206至425中之任一者處具有C端之胺基酸序列組成。在一些情況下，Cholix多肽由在SEQ ID NO: 1之胺基酸位置150至205中之任一者處具有C端之胺基酸序列組成。在一些情況下，Cholix多肽由在SEQ ID NO: 1之胺基酸位置150至195中之任一者處具有C端之胺基酸序列組成。在一些情況下，Cholix多肽由在SEQ ID NO: 1之胺基酸位置1至41中之任一者處具有C端之胺基酸序列組成。在一些情況下，Cholix多肽由在SEQ ID NO: 1之胺基酸位置35至40中之任一者處具有C端之胺基酸序列組成。在一些情況下，Cholix多肽由SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置40至SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置150至205中之任一者的胺基酸序列組成。在一些情況下，Cholix多肽具有在SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置150至187中之任一者處之C端。在一些情況下，Cholix多肽由SEQ ID NO: 8中所闡述之胺基酸序列組成。在一些情況下，Cholix多肽由SEQ ID NO: 9或SEQ ID: NO: 10中所闡述之胺基酸序列組成。在一些情況下，胺基酸位置係基於Cholix多肽與SEQ ID NO: 7中闡述之序列的比對而編號，其中胺基酸位置自N端至C端且自N端處之位置1開始編號。在一些情況下，該組合物包含顆粒。
本發明之一態樣為包含胰島素之組合物，其中至少20%之胰島素在胰酶分析中於1小時處完整，該胰酶分析包含在37℃下將包含胰島素之組合物與胰酶一起培育。在一些情況下，在37℃下將10 µg胰島素與10 µg胰酶一起培育1小時。在一些情況下，組合物進一步包含衍生自細菌毒素之載體，其中載體能夠轉運至極化上皮細胞中或胞吞轉運穿過極化上皮細胞。在一些情況下，載體由Cholix多肽之一部分組成。在一些情況下，該組合物包含過渡金屬陽離子。在一些情況下，過渡金屬陽離子選自由以下組成之群：Fe2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Ni2+及Cu2+。在一些情況下，過渡金屬陽離子為Zn2+。在一些情況下，該組合物包含聚陽離子。在一些情況下，聚陽離子為魚精蛋白。在一些情況下，該組合物包含顆粒。在一些情況下，顆粒包含微米顆粒。在一些情況下，微米顆粒係藉由噴霧乾燥形成。在一些情況下，顆粒之直徑為約50 nm至約20 µm。
本發明之另一態樣為包含任何本文揭示之組合物及防腐劑的醫藥組合物。
本發明之另一態樣為包含任何本文揭示之組合物及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥組合物。
在一態樣中，本發明提供一種治療個體之疾病的方法，其包含向該個體投與任何本文揭示之醫藥組合物。
疾病可為發炎性疾病、自體免疫疾病、癌症或代謝病症。
疾病可為代謝病症。代謝病症可為糖尿病(T1D或T2D)、由肥胖所致之糖尿病、高血糖症、血脂異常、高三酸甘油酯血症、症候群X、胰島素抗性、葡萄糖耐受性異常(IGT)、糖尿病性血脂異常、高脂質血症、脂肪肝病、非酒精性脂肪變性肝炎、肝炎、肥胖、血管疾病、心臟病、中風、葡萄糖耐受性異常、空腹葡萄糖升高、胰島素抗性、尿白蛋白分泌、中心型肥胖、高血壓、三酸甘油酯升高、LDL膽固醇升高及HDL膽固醇降低、高血糖症、高胰島素血症、血脂異常、酮病、高三酸甘油酯血症、症候群X、胰島素抗性、空腹葡萄糖異常、葡萄糖耐受性異常(IGT)、糖尿病性血脂異常、葡糖新生、過量肝糖分解、糖尿病性酮酸中毒、高三酸甘油酯血症、高血壓、糖尿病性腎病、腎機能不全、腎衰竭、攝食過量、肌肉耗損、糖尿病神經病變、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性昏迷、動脈硬化、冠心病、外周動脈疾病或高脂質血症。
組合物可為顆粒，其中組合物包含異源負載物，且其中組合物包含聚陽離子，其中載體能夠在極化上皮細胞中轉運異源負載物或胞吞轉運異源負載物穿過極化上皮細胞。
載體可偶聯至聚陽離子。聚陽離子可為魚精蛋白、聚離胺酸、聚鳥胺酸、聚乙烯亞胺(PEI)、醇溶穀蛋白、魚精蛋白、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、聚精胺酸、聚乙烯胺或其組合。聚陽離子可為魚精蛋白鹽。魚精蛋白鹽可為硫酸魚精蛋白、乙酸魚精蛋白、溴化魚精蛋白、氯化魚精蛋白、己酸魚精蛋白、三氟乙酸魚精蛋白、魚精蛋白碳酸氫鹽(HCO3 )、丙酸魚精蛋白、乳酸魚精蛋白、甲酸魚精蛋白、硝酸魚精蛋白、檸檬酸魚精蛋白、單氫磷酸魚精蛋白、二氫磷酸魚精蛋白、酒石酸魚精蛋白或過氯酸魚精蛋白。魚精蛋白鹽可為硫酸魚精蛋白。
本發明之一態樣為包含任何本文揭示之顆粒的醫藥組合物，且其中異源負載物為葡萄糖降低劑。
在一些情況下，葡萄糖降低劑選自由胰島素及胰島素類似物組成之群。在一些情況下，囊封顆粒在高pH下但不在低pH下釋放負載物。
本發明之另一態樣為包含任何本文揭示之顆粒及防腐劑的醫藥組合物。在一些情況下，醫藥組合物進一步包含張力調節劑。
在一態樣中，本發明提供包含衍生自細菌毒素之載體的組合物，其中載體能夠轉運至極化上皮細胞中或胞吞轉運穿過極化上皮細胞，其中至少30%之載體在胰酶分析中於0.5小時處完整，該胰酶分析包含在37℃下於100 µL PBS中將包含100 µg載體之組合物與10 µg胰酶一起培育。
至少40%之載體可在胰酶分析中於0.5小時處完整，該胰酶分析包含在37℃下於100 µL PBS中將包含100 µg載體之組合物與10 µg胰酶一起培育。至少50%之載體可在胰酶分析中於0.5小時處完整，該胰酶分析包含在37℃下於100 µL PBS中將包含100 µg載體之組合物與10 µg胰酶一起培育。至少60%之載體可在胰酶分析中於0.5小時處完整，該胰酶分析包含在37℃下於100 µL PBS中將包含100 µg載體之組合物與10 µg胰酶一起培育。至少90%之載體可在胰酶分析中於2小時處完整，該胰酶分析包含在37℃下於100 µL PBS中將包含100 µg載體之組合物與10 µg胰酶一起培育。
組合物可進一步包含陽離子。陽離子可為金屬陽離子或聚陽離子。陽離子可為金屬陽離子。金屬陽離子可為過渡金屬陽離子。
本發明之一態樣為包含以下之組合物：(a)衍生自細菌毒素之載體及(b)過渡金屬陽離子或聚陽離子，其中載體能夠進入極化上皮細胞及/或胞吞轉運穿過極化上皮細胞。
本發明之一態樣包括一種包含組合細菌源性載體與異源負載物及陽離子以產生顆粒之方法。在一些情況下，異源負載物選自由以下組成之群：染料、放射性藥品、激素、細胞介素、抗TNF劑、葡萄糖降低劑、腫瘤相關抗原、肽及多肽。在一些情況下，該方法進一步包含噴霧乾燥細菌源性載體、異源負載物及陽離子。在一些情況下，方法包含(a)製備包含經分離載體及負載物之混合物；(b)製備包含硫酸魚精蛋白及NaPO4之混合物；及(c)將(a)之混合物與(b)之混合物組合且允許組合之混合物在室溫下靜置隔夜。在一些情況下，該方法進一步包含步驟(d)藉由增加來自步驟(c)之經組合混合物之離子強度而使來自步驟(c)之顆粒破裂為較小顆粒。在一些情況下，步驟(a)之製備物不包含ZnCl2。在一些情況下，步驟(a)之製備物包含ZnCl2。
在一個態樣中，本文提供一種遞送構築體，其包含與異源負載物錯合之Cholix變異體，該Cholix變異體不包含SEQ ID NO: 75之胺基酸1-348，且不為SEQ ID NO: 76，其中異源負載物為葡萄糖調節劑，且其中載體能夠a)胞吞轉運異源負載物穿過極化上皮細胞或b)將異源負載物轉運至極化上皮細胞中。負載物可為腸促胰島素或腸促胰島素模擬劑。負載物可包含GLP-1受體促效劑。負載物可包含SEQ ID NO: 26-34或17中之任一者。負載物可由SEQ ID NO: 15組成。負載物可由SEQ ID NO: 29組成。負載物可由SEQ ID NO: 16組成。負載物可由SEQ ID NO: 17組成。負載物可由SEQ ID NO: 33組成。負載物可由SEQ ID NO: 34組成。負載物可為GIP受體促效劑。負載物可包含SEQ ID NO: 33或36-38中之任一者。
負載物可為胰島素。胰島素可包含SEQ ID NO: 43及SEQ ID NO: 44；SEQ ID NO: 45及SEQ ID NO: 46；SEQ ID NO: 47及SEQ ID NO: 48；或SEQ ID NO: 49及SEQ ID NO: 50。胰島素可包含SEQ ID NO: 47及SEQ ID NO: 48。胰島素可包含SEQ ID NO: 49及SEQ ID NO: 50。負載物可為SEQ ID NO: 51-63中之任一者。
Cholix變異體可為SEQ ID NO: 81中闡述之序列，或其片段或序列變異體。載體可非共價結合至異源負載物。載體可共價結合至異源負載物。
遞送構築體可為單一多肽。遞送構築體可進一步包含可裂解連接子，其中連接子之裂解自載體釋放負載物。載體可位於多肽之C端且負載物可處於多肽之N端。載體可包含SEQ ID NO: 6；SEQ ID NO: 2；SEQ ID NO: 65；或SEQ ID NO: 73。載體可與SEQ ID NO: 1之C端截短變異體具有至少90%胺基酸一致性。載體可包含SEQ ID NO: 81之C端截短變異體。載體可由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 81之前195、206、244、250、266、386或415個胺基酸殘基組成。異源負載物可經設計以結合受體。
本文亦提供一種治療個體之代謝病症的方法，其包含向該個體投與有效量的以上遞送構築體中之任一者。代謝病症可為糖尿病及/或肥胖。
本文揭示之任何態樣或案例可與本文揭示之任何其他態樣或案例組合。  參考文獻併入
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用的程度如各單獨的公開案、專利或專利申請案經特定及單獨地指示以引用的方式併入一般。
交叉引用
本申請案主張以下各者之權益：2019年8月16日申請之美國臨時申請案第62/888,282號、2019年11月14日申請之美國臨時申請案第62/935,615號、2020年5月6日申請之美國臨時申請案第63/021,029號、2020年6月1日申請之美國臨時申請案第63/033,151號、2019年8月16日申請之美國臨時專利申請案第62/888,400號、2019年9月11日申請之美國臨時專利申請案第62/899,064號、2020年6月1日申請之美國臨時專利申請案第63/033,180號及2019年9月11日申請之PCT專利申請案第PCT/US19/50708號，該等申請案以全文引用之方式併入本文中。I. 概述
本文提供可包含以下之方法及組合物：(a)衍生自細菌毒素之載體及(b)過渡金屬陽離子或聚陽離子，其中載體能夠進入極化上皮細胞或胞吞轉運穿過極化上皮細胞。衍生自細菌毒素之載體可為例如Cholix多肽(例如來自霍亂弧菌)或假單胞菌外毒素(PE) A，例如來自綠膿桿菌。組合物可進一步包含負載物，例如異源負載物(例如負載物不為載體，例如Cholix或PE)，例如治療負載物。組合物可呈顆粒，例如微米顆粒或奈米顆粒形式，且可例如藉由噴霧乾燥及/或凍乾產生。本文提供之方法包括向個體投與組合物。在一些情況下，組合物可經調配以完整地穿過胃之酸性環境(例如顆粒可為耐酸性微米顆粒)。圖 16 提供說明顆粒活體內穿透黏液樣品、經培養細胞上之薄黏液層及上皮細胞上之健康黏液層的示意圖。顆粒可在pH 5-7處變得可溶且例如可支持在使用經培養內皮組織層之繼代研究中評估之復原黏液層中結合或轉運，或在活體外或活體內模型中穿過腸組織。在一些情況下，本文所提供之組合物可經調配以藉由其他途徑向個體遞送，例如呼吸遞送。
本文亦提供方法及組合物組合物，其包含能夠進入極化上皮細胞或胞吞轉運穿過極化上皮細胞之載體，及異源負載物，其中異源負載物與載體之莫耳比為大於1:1。
本文提供包含載體之方法及組合物，其中載體能夠進入極化上皮細胞或胞吞轉運穿過極化上皮細胞，其中至少60%之載體在胰酶分析中於0.5小時處完整，其中胰酶分析包含在37℃下於100 µL磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中將包含100 µg載體之組合物與10 µg胰酶一起培育。本文提供製備此等組合物之方法及向個體投與此等組合物之方法。
本文亦提供方法及組合物，其包含在位置195-347處結束之Cholix變異體及異源負載物，其中異源負載物為葡萄糖調節劑。本文亦提供組合物，其包含與葡萄糖調節劑偶聯之載體。
本文亦提供包含本文所提供之組合物的醫藥組合物、製造本文所提供之組合物的方法及向個體，例如具有葡萄糖調節缺陷之個體投與本文所提供之組合物的方法。II. 顆粒
本文所提供之組合物可包含一或多個顆粒。一或多個顆粒可包含一或多個微米顆粒或奈米顆粒。一或多個顆粒可包含一或多個載體、一或多個有效負載(例如異源有效負載)及/或一或多個陽離子。一或多個陽離子可為一或多個聚陽離子，例如魚精蛋白。一或多個陽離子可為一或多個金屬陽離子。一或多個金屬陽離子可為一或多個過渡金屬陽離子。一或多個金屬陽離子可為一或多個二價金屬陽離子。一或多個過渡金屬陽離子可為Fe2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Ni2+及Cu2+。一或多個過渡金屬陽離子可為鋅陽離子。一或多個二價金屬陽離子可為鈣(Ca2+)、鉻(Cr2+)、鈷(Co2+)、鐵(Fe2+)、鎂(Mg2+)、錳(Mn2+)、鎳(Ni2+)、銅(Cu2+)或鋅(Zn2+)。一或多個陽離子可為魚精蛋白、聚離胺酸、聚鳥胺酸、聚乙烯亞胺(PEI)、醇溶穀蛋白、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、聚精胺酸、聚乙烯胺或其組合。一或多個陽離子可為魚精蛋白鹽。
一或多個顆粒，例如一或多個微米顆粒或奈米顆粒可為一或多個自裝配顆粒，例如穩定自裝配顆粒，例如微米顆粒或奈米顆粒。
本文所提供之組合物可包含一或多個載體及一或多個有效負載及/或一或多個陽離子，一或多個聚陽離子。一或多個載體及一或多個有效負載可直接或間接地、共價或非共價地偶聯。一或多個載體及一或多個有效負載可呈融合分子形式。在一些情況下，一或多個載體及一或多個有效負載不在融合分子中。載體-負載物融合分子可將一或多個負載物分子(例如一或多個治療負載物)轉運至上皮細胞(例如極化腸上皮細胞)中。載體可能夠使用內源運輸路徑將負載物轉運至上皮細胞中或穿過上皮細胞。與使用被動擴散相反，利用內源運輸路徑可允許載體快速穿梭負載物且有效地進入或穿過上皮細胞，而不損害此等細胞之障壁功能或負載物之生物活性。一或多個負載物可為多肽，該多肽包含SEQ ID NO: 11或14-64中之任一者中闡述之序列、由其組成或基本上由其組成(參見表 12 )。
一或多個載體及一或多個陽離子可直接或間接地、共價或非共價地偶聯。一或多個載體及一或多個陽離子可呈融合分子形式。在一些情況下，融合分子可裝配為具有一或多個負載物之微米顆粒或奈米顆粒。載體-陽離子融合分子可將一或多個負載物分子(例如一或多個治療負載物)轉運至上皮細胞(例如極化腸上皮細胞)中。在一些情況下，一或多個載體及一或多個陽離子不直接偶聯或共價連接。在一些情況下，一或多個載體及一或多個陽離子不為融合分子之一部分。
在一些情況下，一或多個陽離子為魚精蛋白或魚精蛋白鹽。魚精蛋白可指以與核酸之鹽樣組合存在於精子細胞中之一組強鹼性蛋白質。魚精蛋白可獲自鮭魚(salmine)、虹鱒魚(虹鱒精蛋白)、鯡魚(鯡精蛋白)、鱘魚(鱘精蛋白)或西班牙鯖魚或鮪魚(鮪精蛋白)。特定魚精蛋白之肽組成可取決於獲得該魚精蛋白之魚類的科、屬或種。魚精蛋白可含有四種主要組分，例如含有約30-32個殘基之單鏈肽，該等殘基中之約21-22個為精胺酸。N端殘基可為四種主要組分中之每一者的脯胺酸。因此，可預期藉由特定鹽化學修飾魚精蛋白為均質的。魚精蛋白鹽可來自鮭魚。魚精蛋白鹽可來自鯡魚。魚精蛋白鹽可來自虹鱒魚。魚精蛋白鹽可來自鮪魚。
一或多個顆粒，例如一或多個微米顆粒或奈米顆粒可包含選自由以下組成之群的魚精蛋白鹽：硫酸魚精蛋白、乙酸魚精蛋白、溴化魚精蛋白、氯化魚精蛋白、己酸魚精蛋白、三氟乙酸魚精蛋白、魚精蛋白碳酸氫鹽(HCO3 )、丙酸魚精蛋白、乳酸魚精蛋白、甲酸魚精蛋白、硝酸魚精蛋白、檸檬酸魚精蛋白、單氫磷酸魚精蛋白、二氫磷酸魚精蛋白、酒石酸魚精蛋白、過氯酸魚精蛋白，及任何兩種魚精蛋白鹽之混合物。魚精蛋白鹽可在顆粒形成之前與液體介質中之其他組分組合，例如藉由沈澱或噴霧乾燥。在顆粒形成之前的液體介質中之魚精蛋白鹽之濃度可為約0.05 mg/mL至約0.10 mg/mL、約0.10 mg/mL至約0.15 mg/mL、約0.15 mg/mL至約0.20 mg/mL、約0.20 mg/mL至約0.25 mg/mL、約0.25 mg/mL至約0.30 mg/mL、約0.30 mg/mL至約0.35 mg/mL、約0.35 mg/mL至約0.40 mg/mL、約0.40 mg/mL至約0.45 mg/mL或約0.45 mg/mL至約0.5 mg/mL。魚精蛋白鹽可為兩種不同鹽之混合物，其中一種鹽為硫酸鹽且另一種鹽為魚精蛋白之乙酸鹽、丙酸鹽、乳酸鹽、甲酸鹽或硝酸鹽。兩種不同鹽之間的莫耳比可為約0.1至約1、約0.2至約1、約0.3至約1、約0.4至約1、約0.5至約1、約0.6至約1、約0.7至約1、約0.8至約1及約0.9至約1。
顆粒可進一步包含二價金屬離子，例如鋅、鈷、鎂或鈣，或此等離子之組合。金屬離子可為鋅。
在一些實例中，顆粒可由以按重量計約1:0.001至約1:2000(載體:陽離子)之比率組合載體及陽離子而形成。在一些情況下，載體及陽離子可以按重量計約1:0.01至約1:500之比率組合。在一些情況下，載體及陽離子可以按重量計約1:0.08至約1:173之比率組合。在一些情況下，載體及陽離子可以按重量計約1:0.1至約1:200之比率組合。在一些情況下，載體及陽離子可以按重量計約1:0.1至約1:5之比率組合。在一些情況下，載體及陽離子可以按重量計約1:0.08至約1:1.6之比率組合。在一些情況下，載體及陽離子可以按重量計約1:8至約1:180之比率組合。在其他實例中，顆粒可由以按重量計約0.01:1至約0.2:1之比率組合載體及陽離子而形成。在一些情況下，載體及陽離子可以按重量計約1:1之比率組合。在一些情況下，載體及陽離子可以按重量計至少約1:0.001、1:0.01、1:0.08、1:0.1、1:0.16、1:0.2、1:0.3、1:0.32、1:0.4、1:0.8、1:1、1:1.6、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:8.6、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70、1:80、1:86、1:90、1:100、1:150、1:172、1:200或1:2000之比率組合。在一些情況下，載體及陽離子可以按重量計小於約1:0.001、1:0.01、1:0.08、1:0.1、1:0.16、1:0.2、1:0.3、1:0.32、1:0.4、1:0.8、1:1、1:1.6、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:8.6、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70、1:80、1:86、1:90、1:100、1:150、1:172或1:200、1:2000之比率組合。
在一些實例中，顆粒可由以按重量計約1:0.001至約1:2000之比率組合負載物融合分子及陽離子(負載物融合分子:陽離子)而形成。在一些情況下，負載物融合分子及陽離子可以按重量計約1:0.01至約1:500之比率組合。在一些情況下，負載物融合分子及陽離子可以按重量計約1:0.08至約1:173之比率組合。在一些情況下，負載物融合分子及陽離子可以按重量計約1:0.1至約1:200之比率組合。在一些情況下，負載物融合分子及陽離子可以按重量計約1:0.1至約1:5之比率組合。在一些情況下，負載物融合分子及陽離子可以按重量計約1:0.08至約1:1.6之比率組合。在一些情況下，負載物融合分子及陽離子可以按重量計約1:8至約1:180之比率組合。在其他實例中，顆粒可由以按重量計約0.01:1至約0.2:1之比率組合負載物融合分子及陽離子而形成。在一些情況下，負載物融合分子及陽離子可以按重量計約1:1之比率組合。在一些情況下，負載物融合分子及陽離子可以按重量計至少約1:0.001、1:0.01、1:0.08、1:0.1、1:0.16、1:0.2、1:0.3、1:0.32、1:0.4、1:0.8、1:1、1:1.6、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:8.6、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70、1:80、1:86、1:90、1:100、1:150、1:172或1:200、1:2000之比率組合。在一些情況下，負載物融合分子及陽離子可以按重量計小於約1:0.001、1:0.01、1:0.08、1:0.1、1:0.16、1:0.2、1:0.3、1:0.32、1:0.4、1:0.8、1:1、1:1.6、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:8.6、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70、1:80、1:86、1:90、1:100、1:150、1:172或1:200、1:2000之比率組合。
在一些實例中，顆粒可由以按重量計約0.01:1至約1:2、約0.0116:1至約1:1、約0.2:1至約1:1之比率組合載體及負載物而形成。在一些情況下，載體與負載物可以按重量計至少0.01:1、0.0116:1、0.02:1、0.0232:1、0.03:1、0.04:1、0.05:1、0.06:1、0.07:1、0.08:1、0.09:1、0.1:1、0.2:1、0.232:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1或2:1之比率組合。在一些情況下，載體與負載物可以按重量計小於0.01:1、0.0116:1、0.02:1、0.0232:1、0.03:1、0.04:1、0.05:1、0.06:1、0.07:1、0.08:1、0.09:1、0.1:1、0.2:1、0.232:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1或2:1之比率組合。
在一些實例中，顆粒或組合物可以按莫耳計約5:1至約1:5、按莫耳計約10:1至1:10、按莫耳計約2:1至約1:2、按莫耳計約1:10至約1:1000、按莫耳計約1:30至約1:700、按莫耳計約1:100至約1:300,000或按莫耳計1:1000至約1:30,000之載體:陽離子之比率包含載體及陽離子(例如Zn2+或魚精蛋白)。載體與陽離子之比率可為按莫耳計約10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:25、1:50、1:100、1:500、1:650、1:1000、1:2000、1:5000、1:10,000、1:20,000、1:30,000、1:40,000、1:50,000、1:75000、1:100,000、1:200,000或1:300,000。在一些情況下，載體與陽離子之比率為按莫耳計至少1:300,000、1:200,000、1:100000、1:50000、1:30000、1:25000、1:20000、1:15000、1:10000、1:5000、1:3000、1:2800、1:2000、1:1500、1:1000、1:500、1:100、1:50、1:25、1:10、1:5、1:2、1:1.12、1:1或10:1。在一些情況下，載體與陽離子之比率為按莫耳計小於1:300,000、1:200,000、1:100000、1:50000、1:30000、1:25000、1:20000、1:15000、1:10000、1:5000、1:3000、1:2800、1:2000、1:1500、1:1000、1:500、1:2、1:1.12或1:1。在一些情況下，載體可以單體、二聚體、三聚體或其他複合物形式存在於顆粒中。可基於載體之單體之莫耳數計算載體與陽離子之比率。若陽離子在鹽中，則陽離子自身之量或莫耳，而非含有陽離子之鹽的量或莫耳可用於確定比率。
顆粒或組合物可以按莫耳計約1:1至約1:10、按莫耳計約10:1至約1:1000、按莫耳計約1:1至約1:1000、按莫耳計約1:10至約1:1000、按莫耳計約1:10至約1:6000、按莫耳計約1:1至約1:100、按莫耳計約1:5至約1:20、按莫耳計約1:7或按莫耳計約1:716之載體:負載物之比率包含載體及負載物。在一些情況下，顆粒或組合物可以按莫耳計小於約1:1、約1:2、約1:5、約1:7、約1:10、約1:20、約1:30、約1:60、約1:70、約1:80、約1:90、約1:100、約1:125、約1:150、約1:200、約1:300、約1:400、約1:500、約1:600、約1:750、約1:1000、約1:2500、約1:5000、約1:6000或約1:50之載體:負載物之比率包含載體及負載物。在一些情況下，載體與負載物之比率為按莫耳計至少約1:6000、1:5000、1:4000、1:3000、1:2000、1:1000、1:900、1:800、1:700、1:620、1:617.06、1:600、1:500、1:400、1:310、1:308.53、1:200、1:150、1:125、1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:5或1:1。在一些情況下，載體與負載物之比率為按莫耳計小於約1:6000、1:5000、1:4000、1:3000、1:2000、1:1000、1:900、1:800、1:700、1:620、1:617.06、1:600、1:500、1:400、1:310、1:308.53、1:200、1:150、1:125、1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:5或1:1。載體與負載物之比率可為按莫耳計約1:6000、1:5000、1:4000、1:3000、1:2000、1:1000、1:900、1:800、1:700、1:620、1:617.06、1:600、1:500、1:400、1:310、1:308.53、1:200、1:150、1:125、1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、5:1或10:1。在一些情況下，載體或負載物或兩者可以單體、二聚體、三聚體或其他複合物形式存在。可藉由比較載體之單體與負載物之單體來計算莫耳比。
在一些情況下，載體間接且非共價偶聯至負載物。在此類情況下，顆粒(例如脂質體、微米顆粒、奈米顆粒、金屬奈米顆粒、基於聚合物之奈米顆粒等)可負載(例如在顆粒內部及/或表面上)有負載物分子(例如IL-10、IL-22、GLP-1等)，且載體(例如Cholix衍生或PE衍生之載體分子)可偶聯至此類奈米顆粒(例如偶聯至其表面上)。在一些情況下，可形成包含負載物分子及載體分子，例如cholix衍生或PE衍生之分子的顆粒。
在一些情況下，本文所提供之組合物(例如顆粒)中之負載物與載體之比率(例如莫耳比)可為至少約15000:1、10000:1、5000:1、2500:1、1000:1、500:1、250:1、100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、2.5:1、1:1。此比率可允許使用連接至表面之載體，例如PE或Cholix衍生之載體將此類含負載物之顆粒(例如奈米顆粒)轉運至極化上皮細胞(例如極化腸上皮細胞)中或穿過極化上皮細胞。在一些情況下，顆粒(例如奈米顆粒)可在胞吞轉運或細胞內遞送之後釋放負載物。在顆粒(例如奈米顆粒)轉運穿過上皮細胞之情況下，釋放之負載物可與黏膜下層組織(例如固有層)內之受體結合，且/或可進入全身循環且因此全身性地提供某一功能(例如治療或診斷功能)。在其他情況下，其中顆粒(例如奈米顆粒)在上皮細胞內部釋放負載物，負載物(例如核酸)可提供某些細胞內功能，例如在此等細胞內產生轉殖基因、調節基因表現等。
顆粒或組合物，例如醫藥組合物可進一步包含防腐劑，例如酚、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、對羥基苯甲酸丁酯、2-苯乙醇、苯甲醇、氯丁醇或硫柳汞，或其混合物。
組合物，例如醫藥組合物可進一步包含張力調節劑，例如糖或糖醇、胺基酸(例如L-甘胺酸、L-組胺酸、精胺酸、離胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、色胺酸、蘇胺酸)、醛醇(例如甘油(glycerol/glycerine)、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)、甘油、甘露糖醇、丙二醇、二甲基碸、甲基磺醯甲烷、海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、蔗糖、乳糖或其混合物。
組合物，例如醫藥組合物可進一步包含緩衝劑，例如乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘胺醯甘胺酸、組胺酸、甘胺酸、離胺酸、精胺酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉及參(羥甲基)-胺基甲烷，或其混合物。
本發明之配方可例如如Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985或Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995中所述地製備，其中醫藥工業之技術涉及適當地溶解及混合成分以得到所需最終產物。
在另一態樣中，本文提供製備含有載體、負載物及陽離子之顆粒，例如微米顆粒或奈米顆粒，例如自組裝微米顆粒或奈米顆粒的方法。載體及負載物可形成融合分子。方法可包含：(a)製備包含經分離載體及負載物(例如呈融合分子形式)且視情況包含ZnCl2 之混合物；(b)製備包含硫酸魚精蛋白及NaPO4 之混合物；及(c)將(a)之混合物與(b)之混合物組合且允許組合之混合物在室溫下靜置隔夜。方法可進一步包含步驟(d)藉由增加來自步驟(c)之經組合混合物之離子強度而使來自步驟(c)之顆粒破裂為較小顆粒。在一些情況下，步驟(a)之製備物不包含ZnCl2 。在一些情況下，步驟(a)之製備物包含ZnCl2 。
在一些情況下，載體及負載物不形成融合分子。方法可包含：(a)製備包含經分離載體及經分離負載物且視情況包含ZnCl2 之混合物；(b)製備包含硫酸魚精蛋白及NaPO4 之混合物；及(c)將(a)之混合物與(b)之混合物組合且允許組合之混合物在室溫下靜置隔夜。方法可進一步包含步驟(d)藉由增加來自步驟(c)之經組合混合物之離子強度而使來自步驟(c)之顆粒破裂為較小顆粒。在一些情況下，步驟(a)之製備物不包含ZnCl2 。在一些情況下，步驟(a)之製備物包含ZnCl2 。在一些情況下，(a)及(b)之經組合混合物可經噴霧乾燥以形成微米顆粒或奈米顆粒。在一些情況下，微米顆粒或奈米顆粒可使用市售噴霧乾燥器形成。
在一些情況下，載體及陽離子可形成融合分子。方法可包含：(a)製備包含經分離載體及陽離子融合分子，及經分離負載物，且視情況包含ZnCl2 之混合物；(b)製備包含經分離負載物及NaPO4之混合物；及(c)將(a)之混合物與(b)之混合物組合且允許組合之混合物在室溫下靜置隔夜。方法可進一步包含步驟(d)藉由增加來自步驟(c)之經組合混合物之離子強度而使來自步驟(c)之顆粒破裂為較小顆粒。在一些情況下，步驟(a)之製備物不包含ZnCl2 。在一些情況下，步驟(a)之製備物包含ZnCl2 。在一些情況下，(a)及(b)之經組合混合物可經噴霧乾燥以形成微米顆粒或奈米顆粒。在一些情況下，微米顆粒或奈米顆粒可使用市售噴霧乾燥器形成。
Nano Spray Dryer B-90 (Buchi, Switzerland)可產生亞微米至2微米之蛋白質顆粒，其具有窄粒度分佈及活性醫藥成分之控制釋放。蛋白質，諸如hGH、胰島素可在連續、單步製程中噴霧乾燥。相對離子及聚合物賦形劑可用於囊封且達成活性醫藥成分之緩慢釋放。系統可與水溶性賦形劑及水基乳液相容。
蛋白質濃度可為約0.02 µmol至1 µmol。進料速率可為約100 L/min至200 L/min。入口溫度可為約80℃至140℃。頭端溫度可為約30℃至70℃。可使用許多不同緩衝溶液，諸如碳酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、丁二酸鹽、磷酸鹽及tris緩衝劑。可使用之賦形劑之實例包括羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羧甲基纖維素(CMC)、海藻酸鹽、Eudragits、聚葡萄胺糖、聚葡萄糖、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、普洛尼克(pluronic)、阿拉伯膠及聚山梨醇酯20。相對離子或包括相對離子之分子的非限制性實例包括魚精蛋白、SEQ ID NO: 3構築體、陽離子細胞穿透肽、聚麩胺酸鹽及玻尿酸。
顆粒，例如自裝配顆粒或噴霧乾燥顆粒，例如魚精蛋白顆粒、鋅顆粒或鋅及魚精蛋白顆粒之粒度可為不超過約200 nm、不超過約300 nm、不超過約400 nm、不超過約500 nm、不超過約600 nm、不超過約700 nm、不超過約800 nm或不超過約900 nm。自裝配微米顆粒，例如魚精蛋白微米顆粒、鋅顆粒、鋅及魚精蛋白顆粒之粒度可為不超過約10 nm、20 nm、30 nm、40 nm、50 nm、60 nm、70 nm、80 nm、90 nm、100 nm、110 nm、120 nm、130 nm、140 nm、150 nm、160 nm、170 nm、180 nm、190 nm、200 nm、250 nm、300 nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm、600 nm、700 nm、800 nm、900 nm、1 µm、不超過約5 µm、不超過約10 µm、不超過約15 µm、不超過約20 µm、不超過約25 µm、不超過約30 µm、不超過約35 µm、不超過約40 µm、不超過約45 µm、不超過約50 µm、不超過約55 µm、不超過約60 µm、不超過約65 µm、不超過約70 µm、不超過約75 µm、不超過約80 µm、不超過約85 µm、不超過約90 µm、不超過約95 µm、不超過約100 µm、不超過約105 µm、不超過約110 µm、不超過約115 µm、不超過約120 µm、不超過約125 µm、不超過約130 µm、不超過約135 µm、不超過約140 µm、不超過約145 µm及不超過約150 µm。在一些情況下，顆粒之粒度為約1 µm至約20 µm。在一些情況下，顆粒之平均粒度為約5 µm±2 µm。在一些情況下，顆粒之平均粒度為約150 µm±50 µm。在一些情況下，顆粒之平均粒度為約30 nm至約6000 nm、約60 nm至約6000 nm、約30 nm至約3000 nm、約60 nm至約3000 nm、約100 nm至約1000 nm、約200 nm至約800 nm或約300 nm至約600 nm。在一些情況下，顆粒之平均粒度為至少約30 nm、40 nm、50 nm、60 nm、70 nm、80 nm、90 nm、100 nm、150 nm、200 nm、250 nm、300 nm、350nm、400 nm、450nm、500 nm、550nm、600 nm、650nm、700 nm、750nm、800 nm、850nm、900 nm、950nm、1000 nm、1100 nm、1200 nm、1300 nm、1400 nm、1500 nm、2000nm、3000 nm、4000 nm、5000nm或6000 nm。
顆粒，例如微米顆粒及奈米顆粒可經囊封。天然及合成聚合物基質可用於藥物囊封及控制釋放。可選擇用於顆粒囊封之聚合物基質以使得顆粒，及顆粒內所含之藥物在所需pH、溫度或時間處釋放。可選擇用於顆粒囊封之聚合物基質以使得顆粒，及顆粒內所含之藥物在低pH環境中時受保護且在pH升高時釋放，例如在胃中受保護且接著在腸中釋放。亦可選擇用於顆粒囊封之聚合物基質以保護顆粒免受第一組織或生物體液，例如胃酸中之條件侵害。Eudragits可用於pH及時間控制藥物釋放，且聚葡萄胺糖、HPMC及玻尿酸可用於擴散控制釋放。Eudragits包括多種多樣的基於聚甲基丙烯酸酯之共聚物。可適合與本發明之方法及組合物一起使用之Eudragits之實例包括Eudragit RS 30 D：聚(丙烯酸乙酯-共-甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸三甲基銨基乙酯氯化物) 1:2:0.1；Eudragit RL 30 D：聚(丙烯酸乙酯-共-甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸三甲基銨基乙酯氯化物) 1:2:0.2；Eudragit FS 30D：聚(丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸) 7:3:1；及Eudragit L 30 D-55：聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯) 1:1。
顆粒可藉由此項技術中已知之任何方法囊封。在一些情況下，顆粒，例如微米顆粒或奈米顆粒可在第一步驟中形成且在第二步驟中囊封。舉例而言，顆粒可經由如上文所述之沈澱形成且接著在第二步驟中藉由噴霧乾燥進行囊封。在另一實例中，顆粒可在第一噴霧乾燥步驟中形成且接著在第二噴霧乾燥步驟中囊封。在一些情況下，顆粒可在單一步驟中形成及囊封。舉例而言，可在噴霧乾燥步驟之前將囊封聚合物基質與包含一或多種載體、負載物及陽離子之溶液混合。在一些情況下，包含一或多種囊封聚合物基質、載體、負載物及陽離子之溶液可經噴霧乾燥以形成奈米顆粒或微米顆粒。III. 載體
載體可為能夠將異源負載物轉運穿過上皮細胞(例如個體之極化腸上皮細胞)或轉運至上皮細胞中之蛋白質或另一類型之分子。
載體可衍生自藉由細菌分泌之多肽。此類載體可衍生自由霍亂弧菌或綠膿桿菌分泌之多肽。藉由霍亂弧菌分泌之多肽可為Cholix多肽。藉由綠膿桿菌分泌之多肽可為假單胞菌外毒素(PE)。衍生自Cholix多肽或PE之載體可為天然存在或非天然存在的。衍生自Cholix多肽或PE之載體可為天然存在之Cholix肽或PE之截短變異體，或非天然存在之突變變異體。突變可包括取代、缺失、添加。
A. Cholix
相對於SEQ ID NO: 1中所闡述之載體，本文中之載劑可具有經降低(例如降低至少50%)或削磨之ADP核糖基化活性(例如延長因子2之核糖基化)。
載體可為衍生自Cholix之多肽或其變異體，其相比於參考序列，諸如SEQ ID NO: 1或12或7在位置206至415中之任一者處進一步截短以用於胞吞轉運，或在位置151-187中之任一者處進一步截短以用於內吞作用。本文亦涵蓋與表 14 中所示之載體序列中之任一者具有至少約80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之胞吞轉運載體，或與表 15 中所示之載體序列中之任一者具有至少約80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性之胞吞載體。本文中之載體中之任一者可具有V1L取代。在一些情況下，載體可為在SEQ ID NO: 1或7之胺基酸206至425、150至205或150-195中之任一者處具有C端截短之Cholix多肽。在一些情況下，載體可為在SEQ ID NO: 1或7之胺基酸1至40或35-40中之任一者處具有N端截短之Cholix多肽。在一些情況下，載體由SEQ ID NO: 7中闡述之序列之N端位置40至C端位置150-205中之任一者的胺基酸殘基組成。在一些情況下，載體可為在SEQ ID NO: 1或12或7之胺基酸266處具有N端截短之Cholix多肽。此類載體可包含以下各者、基本上由其組成或由其組成：SEQ ID NO: 65-67中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在其他情況下，載體可在SEQ ID NO: 7中闡述之序列之位置150或187處具有C端。在一些情況下，載體由SEQ ID NO: 8、9或10中所闡述之胺基酸序列組成。在一些情況下，Cholix載體由SEQ ID NO: 12或13中所闡述之胺基酸序列組成。位置編號可基於Cholix多肽與SEQ ID NO: 7中闡述之序列的比對，其中位置自N端至C端、自N端處之位置1開始編號。在一些情況下，載體可具有SEQ ID NO: 3之序列。
載體可為天然存在之Cholix多肽之截短變異體，或非天然存在之突變變異體。突變可包括取代、缺失或添加。截短之Cholix源性載體可例如由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：SEQ ID NO: 1或7之胺基酸殘基1-415、1-386、1-266或1-206。因此，載體可由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：SEQ ID NO: 6 (Cholix1 - 415 之實例)、SEQ ID NO: 2 (Cholix1 - 386 之實例)、SEQ ID NO: 65 (Cholix1 - 266 之實例)或SEQ ID NO: 73 (Cholix1 - 206 之實例)中所闡述之胺基酸序列。胺基酸序列呈現於表 12 中。
載體可在其N端處包括一或多個促進在各種微生物(例如細菌)中之表現的胺基酸。舉例而言，載體可包括N端甲硫胺酸，其可為轉譯起始位點。此類載體可由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：SEQ ID NO: 65中所闡述之胺基酸序列(M+Cholix1-386 之實例)。另外，本文中之載體中之任一者可具有如SEQ ID NO: 2中所述之V1L取代(V1L Cholix之實例)。
載體可為SEQ ID NO: 81之片段且可包含以下各者、基本上由其組成或由其組成：SEQ ID NO: 81之胺基酸序列的不超過386個胺基酸。載體可包含以下各者、基本上由其組成或由其組成：SEQ ID NO: 81之位置1-38中之任一者之胺基酸殘基至位置195-347處之胺基酸殘基中之任一者。或者，載體可包含以下各者、基本上由其組成或由其組成：SEQ ID NO: 81之位置1之胺基酸殘基至位置195至347中之任一者處之胺基酸殘基中之任一者。
載體可包含以下各者、基本上由其組成或由其組成：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 81之胺基酸殘基1-195、1-206、1-244、1-266、1-386或1-415。同樣，載體可包含以下各者、基本上由其組成或由其組成：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 81之胺基酸殘基1-275、1-266、1-265、2-265、3-265、4-265、5-265、1-250、2-250、3-250、4-250、5-250、1-245、2-245、3-245、4-245、5-245、1-205、2-205、3-205、4-205及5-205。
載體亦包括與本文中之序列中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的以上中之任一者之變異體。
B. 假單胞菌外毒素 A
載體可包含假單胞菌外毒素之一部分。假單胞菌外毒素A或「PE」可由綠膿桿菌分泌，形式為由三個顯著球狀域(Ia、II及III)及一個連接域II及III之小型子域(Ib)構成之67 kDa蛋白質(參見例如Allured等人, Proc. Natl. Acad. Sci. 83:1320 1324, 1986)。成熟PE可為613個殘基之蛋白質，其序列闡述於SEQ ID NO: 69中。如本文所用之編碼成熟PE之核酸的實例闡述於SEQ ID NO: 68中。
PE外毒素域I (例如SEQ ID NO: 82)可包含SEQ ID NO:69 之胺基酸1-252，且可為受體結合域，其可為細胞表面受體之配位體且介導PE與細胞之結合。載體可具有SEQ ID NO: 82或84中所闡述之胺基酸序列。載體可包含與SEQ ID NO: 82或84中闡述之序列具有大於50%、大於60%、大於70%、大於80%、大於90%、大於95%或大於99%序列同源性或序列一致性的胺基酸序列。本文亦涵蓋與表 13 中所示之SEQ ID NO: 69之載體序列的任何部分具有至少約80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的載體。
在一些情況下，載體包含在SEQ ID NO: 7之胺基酸序列中具有保守或非保守取代之多肽。載體可維持結合細胞之能力。載體可為SEQ ID NO: 69之截短型，例如SEQ ID NO: 82或84。載體可包含受體結合域多肽，其中SEQ ID NO: 82或84之一或多個胺基殘基經缺失。載體可包含受體結合域多肽，其中SEQ ID NO: 82或84之一或多個胺基殘基經另一胺基酸取代。
載體PE域I可包含與SEQ ID NO: 82或84之胺基酸序列至少80%具有一致性或與其功能片段具有至少80%一致性的胺基酸序列。載體可包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之胺基酸殘基1-252中之一或多者的缺失或突變，例如SEQ ID NO: 82或84之胺基酸序列。載體可包含與SEQ ID NO: 69之胺基酸序列1-252 (例如SEQ ID NO: 82之胺基酸序列)具有至少90%序列一致性或與其功能片段具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。載體可包含與SEQ ID NO: 69之胺基酸序列1-252，例如SEQ ID NO: 82之胺基酸序列具有至少95%序列一致性或與其功能片段具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。載體可包含與SEQ ID NO: 69之胺基酸序列1-252，例如SEQ ID NO: 82之胺基酸序列具有至少99%序列一致性或與其功能片段具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。載體可包含與SEQ ID NO: 69之胺基酸序列1-252，例如SEQ ID NO: 82之胺基酸序列具有至少100%序列一致性或與其功能片段具有至少100%序列一致性之胺基酸序列。載體PE域I可包含與SEQ ID NO: 84之胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、98%或99%一致性或與其功能片段具有至少85%、90%、95%、98%或99%一致性之胺基酸序列。
載體可直接或間接地、共價或非共價地偶聯至負載物。在一些情況下，載體及負載物形成融合蛋白。載體可直接或間接地、共價或非共價地偶聯至陽離子。在一些情況下，載體及陽離子形成融合蛋白或複合物。在各種實施例中，醫藥組合物之載體、負載物、載體-負載物複合物或融合分子係由包含啟動子、調節元件、編碼載體或此類載體之片段或截短變異體之DNA序列及編碼負載物或陽離子之DNA序列的核酸編碼。調節元件可含有活化或抑制編碼DNA序列之表現的轉錄因子之轉錄結合位點。在一些情況下，調節元件為編碼載體或此類載體之片段或截短變異體之DNA序列的內源性調節元件。在一些情況下，調節元件為編碼負載物之DNA序列的內源性調節元件。在一些情況下，調節元件調節編碼載體或此類載體之片段或截短變異體的DNA序列，及編碼負載物或陽離子的DNA序列。在一些情況下，載體及負載物係在不同核酸分子上編碼。在一些情況下，載體、負載物及陽離子係在不同核酸分子上編碼。在一些情況下，載體及負載物係在相同核酸分子上編碼。在一些情況下，載體、負載物及陽離子係在相同核酸分子上編碼。IV. 負載物
除了載體多肽以外，本文所提供之組合物可包含一或多個負載物，例如一或多個異源負載物，或一或多個生物活性負載物，以用於向個體遞送。一或多個異源負載物可為一或多個不具有載體序列，例如Cholix序列或PE序列之負載物。一或多個負載物，例如異源負載物可為大分子、小分子、小有機分子、肽、多肽、核酸、mRNA、miRNA、shRNA、siRNA、PNA、反義分子、抗體、DNA、質體、多醣、脂質、抗原、疫苗、聚合物奈米顆粒或催化活性物質。一或多個負載物，例如異源負載物可為包含以下各者、由其組成或基本上由其組成之多肽：SEQ ID NO: 11或14-64中之任一者中闡述之序列(參見表 12 )。
一或多個負載物，例如一或多個生物活性負載物可為當引入至個體之血流中時可執行所需生物活性之大分子。舉例而言，一或多個負載物可具有受體結合活性、酶活性、信使活性(亦即，充當激素、細胞介素、神經傳遞質、凝血因子、生長因子或其他信號傳導分子)、發光或其他可偵測活性或調節活性，或其任何組合。在各種診斷實施例中，一或多個負載物可結合至醫藥學上可接受之γ發射部分或其自身可為醫藥學上可接受之γ發射部分，包括但不限於銦及鎝、磁性顆粒、不透射線物質(空氣或鋇)及螢光化合物(例如Alexa-488或紅色螢光蛋白)。在一些情況下，一或多個負載物，例如一或多個生物活性負載物不進入個體之血流。在一些情況下，一或多個負載物在固有層處起作用。
在各種實施例中，一或多個負載物為包含超過一個多肽次單位之蛋白質。舉例而言，蛋白質可為二聚體、三聚體或更高階多聚體。在各種實施例中，蛋白質之兩個或更多個次單位可與共價鍵，諸如二硫鍵連接。在其他實施例中，蛋白質之次單位可藉由非共價相互作用保持在一起。熟習此項技術者可使用例如免疫分析來鑑別此類蛋白質及判定次單位是否恰當相關。
在各種實施例中，一或多個負載物，例如一或多個治療負載物例如為染料、放射性藥品、激素、細胞介素、抗TNF劑、葡萄糖降低劑或腫瘤相關抗原。在一些情況下，一或多個治療負載物為多肽，該多肽為胃腸道中之發炎的調節劑。在各種實施例中，待遞送之一或多個負載物為用於向個體遞送之葡萄糖降低劑。葡萄糖降低劑之實例包括腸促胰島素、升糖素、升糖素前蛋白、升糖素肽、類升糖素肽1 (GLP-1)、類升糖素肽2 (GLP-2)、GLP-2促效劑、替度魯肽、腸高血糖素、腸高血糖素相關多肽、抑胃多肽前蛋白、抑胃多肽、二肽基肽酶4、葡萄糖轉運體成員4、前升糖素原、胰島素受體受質1、胰島素、載脂蛋白A-II、溶質載體家族2、促進葡萄糖轉運體成員1、肝糖合酶1、肝糖合酶2、酪胺酸蛋白磷酸酶非受體1型、RAC-α絲胺酸蘇胺酸蛋白激酶、過氧化體增殖物活化受體γ、己糖激酶3、磷脂醯肌醇-3,4,5-三磷酸3-磷酸酶及雙特異性蛋白、丙酮酸脫氫酶激酶1、含鈣結合域及捲曲螺旋域之蛋白1、Max樣蛋白X、果糖-二磷酸醛縮酶A、類升糖素肽1受體、類升糖素肽2受體、抑胃多肽受體、類胰島素生長因子1受體、類胰島素生長因子2受體、胰島素受體、GLP-1促效劑-艾塞那肽、GLP-1促效劑-利拉魯肽、艾塞那肽、腸促胰島素類似物-4、腸促胰島素類似物-3、GIPR促效劑(Des-Ala2-GIP1-30)、GIPR促效劑-截短GIP1-30、GLP-1R促效劑(GIP之aa 1-37)、GLP-1R促效劑(GIP之aa 7-36)、利司那肽(商品名Adlyxin®及Lyxumia®，Sanofi)、利拉魯肽(商品名Victoza®，Novo Nordisk A/S)、司美魯肽(商品名Ozempic®，Novo Nordisk A/S)、阿必魯肽(商品名Tanzeum®，GlaxoSmithKline；與白蛋白融合之GLP-1二聚體)、度拉糖肽(商品名Trulicity®，Eli Lilly)、葡萄糖依賴性促胰島素多肽、多特異性肽促效劑、泰帕肽(Eli Lilly)、SAR425899 (Sanofi)、雙澱粉素降鈣素受體促效劑DACRA-089、甘精胰島素/Lantus®、谷賴胰島素/Apidra®、格拉胰島素/Toujeo®、Insuman®、地特胰島素/Levemir®、賴脯胰島素/Humalog®/Liprolog®、德谷胰島素/DegludecPlus、門冬胰島素、胰島素及類似物(例如LY-2605541、LY2963016、NN1436)、聚乙二醇化賴脯胰島素(SEQ ID NO: 40-41)、Humulin®、Linjeta、SuliXen®、NN1045、胰島素加SymlinTM、PE0139、速效及短效胰島素(例如Linjeta、PH20、NN1218、HinsBet)、(APC-002)水凝膠、口服、可吸入、經皮及舌下胰島素(例如Exubera®、Nasulin®、Afrezza®、Tregopil®、TPM 02、Capsulin、Oral-lyn®、Cobalamin®、口服胰島素、ORMD-0801、NN1953、NN1954、NN1956、VIAtab及Oshadi口服胰島素)及選自由以下組成之群的腸促胰島素類似物-4類似物：desPro36-腸促胰島素類似物-4(1-39)-Lys6NH2；H-des(Pro36, 37)-腸促胰島素類似物-4-Lys4-NH2；H-des(Pro36, 37)-腸促胰島素類似物-4-Lys5-NH2；desPro36[Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14, Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Trp(O2) 26, Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；或desPro36[Trp(O2) 25, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, Asp28 ]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；及desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)。預期用於本文所揭示之顆粒或遞送構築體的GLP-1促效劑包括例如艾塞那肽(商品名Byetta®，Amylin/Astrazeneca，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO: 11)；利司那肽(商品名Adlyxin®及Lyxumia®，Sanofi，SEQ ID NO: 15)；利拉魯肽(商品名Victoza®，Novo Nordisk A/S，SEQ ID NO: 16)；司美魯肽(商品名Ozempic®，Novo Nordisk A/S)；阿必魯肽(商品名Tanzeum®，GlaxoSmithKline；與白蛋白融合之GLP-1二聚體)；及度拉糖肽(商品名Trulicity®，Eli Lilly，SEQ ID NO: 17)。負載物可能夠結合腸促胰島素受體，例如胃腸組織或肝門脈系統中之腸促胰島素受體。
在一些情況下，一或多個負載物，例如一或多個治療負載物具有SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 14至64中之任何一或多者的胺基酸序列。腸促胰島素
載體可偶聯至一或多種腸促胰島素。腸促胰島素屬於一類胃腸道激素，其可在進食之後，甚至在血糖含量升高之前增加胰島素自胰島(islets of Langerhans)之β細胞的釋放。腸促胰島素可藉由減少胃排空而減緩營養物吸收至血流中之速率且可減少食物攝入。腸促胰島素可抑制升糖素自胰島之α細胞的釋放。腸促胰島素可為升糖類素肽-1 (GLP-1)或抑胃肽(GIP)。GLP-1及GIP均可藉由酶二肽基肽酶4 (DPP-4)快速不活化。
可用於本發明中之腸促胰島素或腸促胰島素模擬肽可為天然存在之腸促胰島素或腸促胰島素模擬肽或經修飾之天然存在之腸促胰島素或腸促胰島素模擬肽。肽可使用肽合成之標準技術，諸如固相肽合成以化學方式合成，或可使用此項技術中已知之重組DNA技術製備。因此產生之肽可或可不與天然存在之肽相同。天然存在之腸促胰島素或腸促胰島素模擬肽之類似物、片段及結合物作為負載物涵蓋於本發明中，只要其保留天然存在之腸促胰島素或腸促胰島素模擬肽之生物活性中之一或多者。
GLP-1可為藉由前升糖素原之組織特異性轉譯後加工在腸L-細胞中合成之天然存在之腸促胰島素激素。GLP-1已與控制食慾及飽腹感有關。GLP-1可經由GLP-1受體(GLP-1R)，G蛋白偶聯受體(GPCR)超家族之463個胺基酸的成員起作用(參見例如Drucker DJ等人, Mol Endocrinol, 17(2):161-171, 2003)。生物活性GLP-1可以兩種等效分子形式存在：GLP-1(7-37)及GLP-1(7-36)醯胺。生物活性GLP-1可藉由二胺基肽基肽酶-4 (DPP-4)快速裂解，其可使得產生在很大程度上非活性的GLP-1(9-37)及GLP-1(9-36)醯胺分子形式。在一些情況下，大部分離開腸靜脈循環之GLP-1已藉由表現於腸L細胞周圍之毛細血管中之DPP-4裂解。已將GLP-1之活體內半衰期估計為1-2分鐘(參見例如Drucker DJ, Gastroenterology, 122(2):531-544, 2002)。
GLP-1可指來自任何來源之類升糖素肽1，包括由任何來源或化學合成，例如使用固相合成產生之經分離、經純化及/或重組GLP-1。舉例而言，GLP-1可具有SEQ ID NO: 26之序列。本文中亦包括天然GLP-1之保守胺基酸取代。舉例而言，可進行保守胺基酸改變，儘管該等胺基酸改變改變了蛋白質或肽之一級序列，但通常不改變其功能。已揭示許多GLP-1之分子衍生物，包括據報導具有促效活性及/或具有比天然GLP-1更長之半衰期的其中一些，參見例如美國專利第6,358,924號；第6,344,180號；第6,284,725號；第6,277,819號；第6,271,241號；第6,268,343號；及第6,191,102號，其內容係以引用的方式併入本文中。
亦已揭示及報導GLP-1相關分子(例如蛋白質)能夠誘導胰臟內分泌分化、胰島增殖及β-細胞塊增加(Parkes等人, Metabolism 50:583, 2001)。腸促胰島素類似物-4 (其實例為SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 11，亦稱為艾塞那肽或Byetta®)及腸促胰島素類似物-3 (其實例為SEQ ID NO: 28)為39個胺基酸之肽(在殘基2及3處不同)，其與GLP-1大約53%同源且具有促胰島素活性。已揭示腸促胰島素類似物-3及腸促胰島素類似物-4之許多分子衍生物，包括據報導具有促效活性之其中一些，參見例如美國專利第5,424,286號；第6,268,343號；第6,384,016號；第6,458,924號；第6,858,576號；第6,989,366號；第7,115,569號；第7,153,825號；第7,223,725號；第7,235,627號；第7,297,761號；第7,419,952號；第7,521,423號；第7,696,161號；第7,700,549號；第8,097,698號；第8,853,160號；第8,889,619號；第9,012,398號；第US 20120283179號；第US 20140206608號；第US 20140206609號；第20140221281號；第US 20140213513號；第US 20150164997號；及美國專利第9,181,305號，其內容係以引用的方式併入本文中。GLP-1促效劑可為腸促胰島素類似物-4類似物，其強力地活化GLP-1及GIP受體且視情況活化升糖素受體，且包含位置1處之Tyr之修飾及位置12處之Ile之修飾，以及其他取代。預期使用之此類類似物之實例包括例如US 20140206608；US 20140206609；20140221281；及US 20140213513中所述之彼等，該等專利之內容各自以引用的方式併入本文中。
GLP-1促效劑可為例如艾塞那肽(商品名Byetta®，Amylin/Astrazeneca，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO: 11)；利司那肽(商品名Adlyxin®及Lyxumia®，Sanofi，SEQ ID NO: 15)；利拉魯肽(商品名Victoza®，Novo Nordisk A/S，SEQ ID NO: 16)；司美魯肽(商品名Ozempic®，Novo Nordisk A/S，SEQ ID NO: 30)；阿必魯肽(商品名Tanzeum®，GlaxoSmithKline；與白蛋白融合之GLP-1二聚體)；及度拉糖肽(商品名Trulicity®，Eli Lilly，SEQ ID NO: 17)。
在一些情況下，負載物可為葡萄糖依賴性促胰島素多肽。葡萄糖依賴性促胰島素多肽(亦稱為抑胃多肽；GIP)可為分子之腸促胰島素類別成員。GIP可衍生自由GIP基因編碼之153個胺基酸之前蛋白，且以包含SEQ ID NO: 36中所闡述之胺基酸序列的生物活性42個胺基酸之肽的形式循環。GIP可藉由腸K細胞合成，腸K細胞可見於胃腸道之十二指腸及空腸的黏膜中。GIP受體可為胰臟中之β細胞上發現之七跨膜蛋白。各種GIP拮抗劑可抑制胰島素在活體內之GIP依賴性釋放，且亦可增強口服葡萄糖耐受性測試中之葡萄糖耐受性。因此，GIP拮抗劑可用於治療T2D之方法中(參見例如US 20070167363，其內容以引用之方式併入本文中)。呈截短GIP類似物(GIP之胺基酸殘基1-30)形式且在SEQ ID NO: 38之2位置處具有D-丙胺酸(Ala)取代之GIP受體(GIPR)促效劑(稱為D-Ala2-GIP1-30 (D-GIP1-30)且包含SEQ ID NO: 37中所闡述之胺基酸序列)可展現抗糖尿病作用而無促肥胖效應(參見例如Widenmaier等人, PloS ONE, 2010年3月|第5卷|第3期| e9590)。葡萄糖調節劑，例如葡萄糖降低劑可為包含SEQ ID NO: 60中所闡述之胺基酸序列的GIPR促效劑。負載物可為升糖素。多特異性肽促效劑
在一些情況下，本文所提供之組合物，例如顆粒或遞送構築體可經設計以實現GLP-1及GIP受體之雙重活化，例如藉由在一個製劑中組合GLP-1及GIP之作用。遞送構築體之實施例為與載體之組合物，或與載體及負載物之組合物。此可產生如下療法：相比於市售之GLP-1促效劑利拉魯肽，血糖含量顯著更好地降低、胰島素分泌增加且患有2型糖尿病及肥胖之小鼠的體重減輕(參見例如V A Gault等人, Clin Sci (Lond), 121, 107-117, 2011)。
在一些情況下，本文提供之載體偶聯至雙重促效劑，例如泰帕肽(Eli Lilly，SEQ ID NO: 33)或SAR425899 (Sanofi)。
本文提供之組合物，例如遞送構築體可活化GLP-1、GIP及升糖素之受體。本文提供之載體可偶聯至Eli Lilly之正在調查研究中之GGG Tri-Agonist。
本文提供之載體可偶聯至正在調查研究中之用於治療糖尿病及肥胖之其他肽，包括雙澱粉素降鈣素受體促效劑DACRA-089 (SEQ ID NO: 41，亦稱為KBP-089，Sanofi)。胰島素及胰島素類似物
本文提供之負載物可為胰島素，或胰島素類似物，或胰島素之衍生物。如本文所使用，術語「胰島素類似物」或「胰島素衍生物」可指具有藉由缺失及/或交換天然存在之胰島素中存在之至少一個胺基酸殘基及/或添加至少一個胺基酸殘基而在形式上可衍生自天然存在之胰島素之結構，例如人類胰島素之結構(其實例為可藉由二硫鍵連接之胰島素A鏈SEQ ID NO: 43及胰島素B鏈SEQ ID NO: 44)的分子結構的多肽。添加及/或交換之胺基酸殘基可為可編碼胺基酸殘基或其他天然存在之殘基或純粹合成胺基酸殘基。
胰島素及胰島素類似物/衍生物已廣泛描述於此項技術中(參見例如US20150216981；美國專利第9,265,723號；美國專利第8,633,156號；美國專利第8,410,048號；美國專利第8,048,854號；美國專利第7,713,930號；美國專利第7,696,162號；美國專利第7,659,363號；美國專利第7,291,132號；美國專利第7,193,035號；及其中所引用之參考文獻，其全部)。胰島素可具有人類胰島素之原生序列，其中A鏈(SEQ ID NO: 43)及B鏈(SEQ ID NO: 44)藉由二硫鍵連接。
在某些實施例中，胰島素包含具有SEQ ID NO: 43中闡述之胺基酸序列之A鏈及具有SEQ ID NO: 44中闡述之胺基酸序列之B鏈。具有有益的速效或短效(基礎)特性之胰島素之其他實施例包括具有SEQ ID NO: 45之A鏈及SEQ ID NO: 46之B鏈的門冬胰島素；具有SEQ ID NO: 47之A鏈及SEQ ID NO: 48之B鏈的甘精胰島素；及具有SEQ ID NO: 49之A鏈及SEQ ID NO: 50之B鏈的賴脯胰島素。
一或多個負載物，例如異源負載物可為用於治療血友病，例如A型血友病或B型血友病之藥劑。用於治療血友病之藥劑可為凝血因子VIII (例如凝血因子VIII濃縮物)、凝血因子IX (例如凝血因子IX濃縮物)、因子VIIa、Hemlibra® (ACE 910或艾美賽珠單抗(emicizumab))、DDAVP®或Stimate® (乙酸去胺加壓素)、抗纖維蛋白溶解劑，例如Amicar® (ε胺基己酸)或Lysteda® (胺甲環酸)、ELOCTATE® [抗血友病因子(重組)、Fc融合蛋白]或冷沈澱物。
在一些情況下，負載物，例如異源負載物，例如葡萄糖調節劑，例如葡萄糖降低劑為胰島素或胰島素類似物。在一些情況下，負載物，例如異源負載物，例如葡萄糖調節劑，例如葡萄糖降低劑為艾塞那肽。艾塞那肽(SEQ ID NO: 11)可為藉由C端胺及N端H穩定的具有GLP-1樣生物活性之肽。
在一些情況下，本文所用之一或多個負載物，例如一或多種異源負載物可包括抗腫瘤化合物(諸如化療或抗腫瘤劑)，諸如亞硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、鏈脲佐菌素(strepzotocin)；甲基肼，例如丙卡巴肼(procarbazine)、達卡巴嗪(dacarbazine)；類固醇激素，例如糖皮質激素、雌激素、孕激素、雄激素、四氫脫氧皮質酮(tetrahydrodesoxycaricosterone)；免疫活性化合物，諸如免疫抑制劑，例如乙胺嘧啶、三甲喋呤、青黴胺、環孢靈、硫唑嘌呤；及免疫刺激劑，例如左旋咪唑、二硫代胺基甲酸二乙酯、腦啡肽、內啡肽；抗微生物化合物，諸如抗生素，例如β-內醯胺、青黴素、頭孢菌素、碳青黴烯類及單醯胺菌素、β-內醯胺酶抑制劑、胺基糖苷類、巨環內酯、四環素、大觀黴素；抗瘧疾藥、抗阿米巴藥；抗原蟲藥；抗真菌劑，例如兩性黴素-β，抗病毒劑，例如阿昔洛韋(acyclovir)、碘苷、利巴韋林(ribavirin)、曲氟尿苷、阿糖腺苷(vidarbine)、更昔洛韋(gancyclovir)；殺寄生蟲劑；驅蟲藥劑；放射藥劑；胃腸道藥物；血液學化合物；免疫球蛋白；凝血蛋白，例如抗嗜血因子、因子IX複合物；抗凝血劑，例如雙香豆素、肝素Na；纖維蛋白溶酶(fibrolysin)抑制劑，例如胺甲環酸；心血管系藥；外周抗腎上腺素能藥；中樞作用抗高血壓藥，例如甲基多巴、鹽酸甲基多巴；抗高血壓劑直接血管擴張劑，例如二氮嗪、鹽酸聯胺肼；影響腎素-血管緊張素系統之藥物；外周血管擴張劑，例如芬托拉明(phentolamine)；抗心絞痛藥物；強心苷；強心擴張劑，例如氨利酮、米利酮、依諾昔酮、芬諾昔酮、伊馬唑旦、硫馬唑；抗節律紊亂藥；鈣進入阻斷劑；影響血脂之藥物，例如雷尼替丁(ranitidine)、波生坦(bosentan)、瑞株林(rezulin)；呼吸藥物；擬交感神經藥物，例如沙丁胺醇、甲磺酸比托特羅、鹽酸多巴酚丁胺、鹽酸多巴胺、麻黃素So、腎上腺素、鹽酸氟苯丙胺、鹽酸異丙腎上腺素、鹽酸美速胺、酒石酸氫去甲腎上腺素、鹽酸苯腎上腺素、鹽酸利托君；擬膽鹼藥物，例如鹽酸乙醯膽鹼；抗膽鹼酯酶，例如騰喜憂Cl；膽鹼酯酶活化藥；腎上腺素能阻斷藥物，例如鹽酸醋丁洛爾、阿替洛爾、鹽酸艾司洛爾、鹽酸拉貝洛爾、美托洛爾、納多洛爾、甲磺酸酚妥拉明、鹽酸普萘洛爾；抗毒蕈鹼藥物，例如甲基溴化辛托品、阿托品、克利溴銨(clinidium Br)、格隆溴銨、異丙托溴銨(ipratropium Br)、氫溴酸莨菪鹼；肌神經阻斷藥物；去極化藥物，例如苯磺酸阿曲庫銨、己茀溴銨、碘二甲箭毒、琥珀醯膽鹼Cl、管箭毒素Cl、維庫溴銨(vecuronium Br)；中樞作用肌肉鬆弛劑，例如氯苯胺丁酸；神經傳遞質及神經傳遞質藥劑，例如乙醯膽鹼、腺苷、三磷酸腺苷；胺基酸神經傳遞質，例如興奮性胺基酸、GABA、甘胺酸；生物胺神經傳遞質，例如多巴胺、腎上腺素、組織胺、去甲腎上腺素、章魚胺、血清素、酪胺；神經肽、一氧化氮、K.sup.+通道毒素；抗帕金森藥物，例如鹽酸金剛烷胺(amaltidine HC1)、甲磺酸苯紮托品、卡比多巴；利尿藥物，例如二氯苯磺胺、醋甲唑胺、苄氟甲噻嗪、多噻嗪；抗偏頭痛藥物，例如卡前列素緩血酸胺甲磺酸鹽、小紅莓、絲裂黴素、順鉑、道諾黴素、博萊黴素、放線菌素D、新抑癌蛋白及順丁烯二酸二甲麥角新鹼。
在一些情況下，預期用於本發明方法之一或多個負載物，例如一或多種異源負載物包括淋巴介質抑制因子、巨噬細胞群落刺激因子、血小板衍生生長因子、幹細胞因子、腫瘤生長因子-β、腫瘤壞死因子、淋巴毒素、Fas、顆粒球群落刺激因子、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、生長因子及蛋白質激素，諸如紅血球生成素、血管生成素、肝細胞生長因子、纖維母細胞生長因子、角質細胞生長因子、神經生長因子、腫瘤生長因子-α、血小板生成素、甲狀腺刺激因子、甲狀腺釋放激素、神經營養蛋白、表皮生長因子、VEGF、睫狀神經營養因子、LDL、促生長因子、胰島素生長因子、類胰島素生長因子I及II、趨化因子，諸如ENA-78、ELC、GRO-α、GRO-β、GRO-γ、HRG、LEF、IP-10、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIP-1-α、MIP-1-β、MG、MDC、NT-3、NT-4、SCF、LIF、瘦素、RANTES、淋巴細胞趨化因子、伊紅趨素-1、伊紅趨素-2、TARC、TECK、WAP-1、WAP-2、GCP-1、GCP-2；α-趨化因子受體，例如CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7；及β-趨化因子受體，例如CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6及CCR7。負載物之其他實例包括調節T細胞(Tregs)之抑制劑，諸如表現CD4、CD25及Foxp3之Tregs，及諸如Tr1、Th3、CD8+CD28-、Qa-1限制T細胞及IL-17 Treg細胞之Tregs。
在一些情況下，一或多個負載物，例如一或多種異源負載物可為大腸桿菌不耐熱腸毒素(Etx)。
在一些情況下，用於本文之方法及組合物的一或多個負載物，例如一或多種異源負載物可為染料或放射性藥品。一或多種染料及放射性藥品可為Alexa488、螢光化合物、銦、鎝、磁性顆粒、不透射線物質及紅色螢光蛋白(RFP)。
在一些情況下，用於本文所揭示之方法及組合物的一或多個負載物，例如一或多種異源負載物可為激素。激素之實例包括但不限於人類生長激素、NUTROPIN® (Genentech)、HUMATROPE® (Lilly)、GENOTROPIN® (Pfizer)、NORDITROPIN® (Novo)、SAIZEN® (Merck Serono)、OMNITROPE® (Sandoz)、SEROSTIM® (EMD Serono)、ZORBITIVE® (Merck Serono)、TEV-TROPIN® (Teva)、垂體激素，例如絨膜促性腺激素、人工合成促腎上腺皮質素(cosyntropin)、促生育素、促生長素、促皮質素(iorticotropin)、促甲狀腺素釋放激素、促甲狀腺激素、升壓素、賴加壓素(lypressin)；腎上腺激素，例如二丙酸倍氯米松、倍他米松、地塞米松(dexarnethasone)、曲安西龍；胰臟激素，例如升糖素、胰島素；副甲狀腺激素，例如二氫育脂醇(dihydrochysterol)；甲狀腺激素，例如降鈣素依替膦酸二鈉、左旋甲狀腺素Na、碘塞羅甯Na、複方甲狀腺素(liotrix)、甲狀腺球蛋白、乙酸特立帕肽；抗甲狀腺藥物；雌激素；孕激素及拮抗劑；激素避孕藥；睪丸激素；胃腸道激素，例如膽囊收縮素、腸高血糖素(enteroglycan)、甘丙胺素、抑胃多肽、表皮生長因子-尿抑胃素、抑胃多肽、胃泌素釋放肽、胃泌素、五肽胃泌素、四肽胃泌素、腸動素、肽YY、腸泌素、血管活性腸肽或辛卡利特(sincalide)、促生長素、合成人類生長激素、合成人類生長激素部分、合成人類生長激素部分、人類生長激素2、促生長素釋放素、食慾調節激素、瘦素、生長激素受體、生長激素釋放激素受體、生長激素促泌素受體、生長激素釋放激素受體形式a及生長激素受體。
在其他實例中，一或多個負載物，例如一或多種異源負載物可為細胞介素。一或多種細胞介素可為趨化因子、介白素，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29及IL-30。
在其他實例中，一或多個負載物，例如一或多種異源負載物可為抗TNF劑。可使用之抗TNF劑之實例包括抗TNF抗體、英利昔單抗(Remicade)、阿達木單抗(Humira)、依那西普(ENBREL®)、腫瘤壞死因子-a (TNF-a)；NP_000585.2、淋巴毒素-a (「LT-a」)、淋巴毒素-b (「LT-b」)、CD30配位體、CD40配位體、CD70配位體、OX40配位體、41BB配位體、Apo1配位體(或FasL或CD95L)、Apo2配位體(或TRAIL、AIM-1或AGP-1)、Apo3配位體(或TWEAK)、APRIL、LIGHT、OPG配位體(或RANK配位體)、BlyS (或THANK)、BCMA、TACI、TNFR1、TNFR2、淋巴毒素-bR、CD40、CD95 (或FAS或APO-1)、OPG、RANK、CD30、CD27、OX40 (或CD134)、41BB、NGFR、BCMA、TAC1、EDA2R、TROY、DR6、DR5 (或TRAILR2)、DR4、DR3、HVEM、LTβR、GITR、DcR3、Fn14 (或TWEAKR)、BAFF、小模組免疫藥物(SMIP)、四環素(例如四環素、多西環素、賴甲環素、土黴素、二甲胺四環素)、化學修飾四環素(例如去二甲胺基-四環素)、氧肟酸化合物、碳環酸及衍生物、拉紮洛依(lazaroids)、配妥西菲林(pentoxifylline)、萘并哌喃(napthopyrans)、氨利酮、匹莫苯、維司力農(vesnarinone)、磷酸二酯酶抑制劑及小分子激酶抑制劑。小分子激酶抑制劑包括但不限於p38MAPK、COT、MK2、P13K、IKKa,b,g、MEKK1,2,3、IRAK1,4及Akt激酶之小分子抑制劑。
在一些情況下，一或多個負載物，例如一或多種異源負載物可為腫瘤相關抗原。腫瘤相關抗原之實例包括Her2/neu、Her3、Her4、EGF、EGFR、CD2、CD3、CD5、CD7、CD13、CD19、CD20、CD21、CD23、CD30、CD33 、CD34、CD38、CD46、CD55、CD59、CD69、CD70、CD71、CD97、CD117、CD127、CD134、CD137、CD138、CD146、CD147、CD152、CD154、CD195、CD200、CD212、CD223、CD253、CD272、CD274、CD276、CD278、CD279、CD309 (VEGFR2)、DR6、PD-L1、Kv1.3、5.00E+10、MUC1、uPA、SLAMF7 (CD319)、MAGE 3、MUC 16 (CA-125)、KLK3、K-ras、間皮素、p53、存活素、G250 (腎細胞癌抗原)及PSMA。
在一些情況下，一或多個負載物，例如一或多種異源負載物可為酶，諸如玻尿酸酶、鏈激酶、組織纖維蛋白溶酶原活化因子、尿激酶、PGE-腺苷去胺酶；靜脈內麻醉劑，諸如氟哌啶、依託咪酯、檸檬酸芬太尼(fetanyl citrate)/氟哌利多(droperidol)、六巴比妥鹽(hexobarbital)、鹽酸氯胺酮、美索比妥鈉、硫戊巴比妥鈉、硫噴妥鈉；抗癲癇劑，例如卡馬西平(carbamazepine)、可那氮平(clonazepam)、雙丙戊酸鈉、乙琥胺、美芬妥英(mephenyloin)、甲乙雙酮、苯妥英(phenyloin)、普里米酮(primidone)。在各種實施例中，生物活性貨物為選自以下之酶：玻尿酸酶、鏈激酶、組織纖維蛋白溶酶原活化因子、尿激酶或PGE-腺苷去胺酶。V . 負載物或陽離子與載體偶聯
在一些情況下，本文所提供之組合物包含與負載物，例如異源負載物偶聯之載體。負載物，例如異源負載物可藉由熟習此項技術者已知之任何方法無限制地與載體偶聯。負載物可藉由非共價相互作用，諸如離子相互作用與載體結合，或裝配為奈米顆粒。負載物可經由共價相互作用與載體化學交聯。在一些情況下，一或多個負載物與載體融合。在融合分子中，融合分子之一或多個負載物或一或多個陽離子可藉由熟習此項技術者已知之任何方法無限制地與融合分子之其餘部分連接。負載物或陽離子可引入至不破壞載體之細胞結合或胞吞轉運活性的融合分子之任何部分中。在各種實施例中，負載物或陽離子與載體之N端或C端直接偶聯。在各種實施例中，負載物或陽離子可與載體之胺基酸之側鏈連接。負載物可經由間隔子或連接子間接偶聯至載體。在各種實施例中，負載物或陽離子經由可裂解連接子偶聯至載體，以使得可裂解連接子處之裂解將負載物或陽離子與融合分子之其餘部分分離。在各種實施例中，負載物或陽離子為亦可包含在可裂解連接子裂解之後保持與多肽連接之短前導肽的多肽。舉例而言，負載物或陽離子可包含大於1個胺基酸、大於5個胺基酸、大於10個胺基酸、大於15個胺基酸、大於20個胺基酸、大於25個胺基酸、大於30個胺基酸、大於50個胺基酸或大於100個胺基酸之短前導肽。在一些情況下，生物活性負載物可包含小於100個胺基酸、小於50個胺基酸、小於30個胺基酸、小於25個胺基酸、小於20個胺基酸、小於15個胺基酸、小於10個胺基酸或小於5個胺基酸之短前導肽。在一些情況下，負載物或陽離子可包含1-100個胺基酸、5-10個胺基酸、10-50個胺基酸或20-80個胺基酸之短前導肽。
在負載物或陽離子與另一序列一起表現為融合蛋白之實施例中，負載物或陽離子可藉由熟習此項技術者已知之任何方法無限制地插入至融合分子中。舉例而言，編碼對應於負載物或陽離子之胺基酸的核酸可在缺失或不缺失天然胺基酸序列之情況下直接插入至編碼其他部分或融合分子之核酸中。
在負載物或陽離子不在一起表現為融合蛋白之實施例中，負載物或陽離子可藉由熟習此項技術者已知之任何適合之方法無限制地連接。更特定言之，關於將受體結合域與分子之其餘部分連接在上文所述之例示性方法同樣適用於將負載物或陽離子與分子之其餘部分連接。VI. 編碼載體及 / 或負載物之核酸的生成
在各種實施例中，使用例如各自以全文引用的方式併入本文中之美國專利第9,090,691號及第7,713,737號中所述之方法製備本發明之載體、負載物及/或非天然存在之遞送構築體，例如融合分子。
在各種實施例中，使用重組DNA方法合成載體、負載物及/或非天然存在之融合分子。總體上，此可涉及產生編碼載體、負載物及/或融合分子之DNA序列、將DNA置於處於特定啟動子控制下之表現卡匣中、在宿主中表現分子、分離表現之分子及在必要時將分子摺疊為活性構形形式。
編碼本文所述之載體、負載物及/或融合分子的DNA可藉由任何適合之方法製備，包括例如藉由以下方法選殖及限制適當序列或直接化學合成：諸如Narang等人 (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99之磷酸三酯方法；Brown等人 (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151之磷酸二酯方法；Beaucage等人 (1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862)之二乙基亞磷醯胺方法；美國專利第4,458,066號之固體支撐物方法，及其類似方法。
化學合成可產生單股寡核苷酸。此可藉由與互補序列雜交或藉由與DNA聚合酶聚合(使用單股作為模板)而轉化為雙股DNA。化學合成可用於產生約100個鹼基之DNA序列。可藉由連接較短序列獲得較長序列。
或者，可使用適當限制酶選殖子序列及裂解適當子序列。片段可接著經連接以產生所需DNA序列。
在各種實施例中，可使用DNA擴增方法，諸如聚合酶鏈反應(PCR)來選殖編碼本發明之載體、負載物及/或融合分子的DNA。因此，舉例而言使用含有用於例如NdeI之限制位點的正義引子及含有用於HindIII之限制位點的反義引子對一或多個負載物，例如一或多個生物活性負載物之一或多個基因進行PCR擴增。此可產生編碼一或多個負載物序列且具有末端限制位點之一或多個核酸。具有「互補」限制位點之載體可類似地選殖且接著連接至編碼一或多個負載物之一或多個核酸及/或連接至與編碼一或多個負載物之一或多個核酸連接的連接子。核酸序列連接及插入至載體中產生編碼與一或多個載體接合之一或多個負載物的載體。VII. 可裂解連接子
在各種實施例中，向個體遞送之一或多個負載物，例如異源負載物係使用一或多個可裂解連接子與載體偶聯。存在於融合分子中之可裂解連接子之數目至少部分取決於一或多個負載物相對於載體之位置及生物活性負載物之性質。當一或多個負載物可藉由單一連接子處之裂解與融合分子之其餘部分分離時，融合分子可包含單一可裂解連接子。另外，當一或多個負載物為例如二聚體或其他多聚體時，一或多個負載物之各次單位可藉由可裂解連接子處之裂解與融合分子之其餘部分及/或一或多個負載物之其他次單位分離。
在各種實施例中，可裂解連接子係藉由上皮細胞之底外側膜處或附近存在之裂解酶裂解。藉由選擇經此類酶裂解之可裂解連接子，一或多個負載物可在胞吞轉運穿過黏膜之後自融合分子之其餘部分釋放且自上皮細胞釋放至膜之底外側上的細胞基質中。另外，可使用存在於上皮細胞內部之裂解酶，使得可裂解連接子在融合分子自底外側膜釋放之前裂解，只要裂解酶不在融合分子進入極化上皮細胞中之運輸路徑之前裂解融合分子，否則導致融合分子及一或多個負載物自細胞之底外側膜釋放。
在各種實施例中，相比於遞送構築體之其餘部分，可裂解連接子展現更大的裂解傾向。如熟習此項技術者所瞭解，許多肽及多肽序列可藉由肽酶及蛋白酶裂解。在各種實施例中，可裂解連接子經選擇以使其相對於在投與遞送構築體期間存在於遞送構築體中之其他胺基酸序列將優先裂解。在各種實施例中，在將遞送構築體遞送至個體之血流中之後，受體結合域基本上(例如約99%、約95%、約90%、約85%、約80或約75%)完整。在各種實施例中，在將遞送構築體遞送至個體之血流中之後，胞吞轉運活性基本上(例如約99%、約95%、約90%、約85%、約80或約75%)完整。在各種實施例中，在將遞送構築體遞送至個體之血流中之後，大分子基本上(例如約99%、約95%、約90%、約85%、約80或約75%)完整。在各種實施例中，在將遞送構築體遞送至個體之血流中之後，可裂解連接子基本上(例如約99%、約95%、約90%、約85%、約80或約75%)完整。
在其他實施例中，個體血漿中發現之裂解酶可用於裂解可裂解連接子。熟習此項技術者已知存在於個體血漿中之任何裂解酶可用於裂解可裂解連接子。
在各種實施例中，可裂解連接子係藉由個體血漿中發現之裂解酶來裂解。熟習此項技術者已知存在於個體血漿中之任何裂解酶可用於裂解可裂解連接子。在一些情況下，血漿裂解酶可用於裂解遞送構築體。在其他實施例中，可裂解連接子包含核酸，諸如RNA或DNA。在其他實施例中，可裂解連接子包含碳水化合物，諸如二醣或三醣。
在各種實施例中，可裂解連接子可為在融合分子之環境改變之後裂解的可裂解連接子。舉例而言，可裂解連接子可為pH敏感性可裂解連接子且係藉由在融合分子自極化上皮細胞之底外側膜釋放時經歷的pH變化裂解。舉例而言，腸腔可為強鹼性的，而儘管血漿可為基本上中性的。因此，可裂解連接子可為在自鹼性pH轉變為中性pH時裂解的部分。裂解可裂解連接子之融合分子的環境變化可為熟習此項技術者已知的融合分子自極化上皮細胞之底外側膜釋放時經歷的任何環境變化(無限制)。VIII .不可裂解連接子
在各種實施例中，載體及一或多個負載物可由連接子分離。當使用連接子時，連接子可包括一或多個胺基酸。本文中涵蓋之連接子之實例包括序列，諸如S、(GS)x、(GGS)x、(GGGS)x、(GGGGS)x或(GGGGGS)x，其中x=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些情況下，連接子不包括末端S殘基，例如SEQ ID NO: 4 (GGGGSGGGGSGGGG)。一般而言，除了接合蛋白質或在其之間保留一些最小距離或其他空間關係以外，連接子可不具有特定生物活性。然而，在各種實施例中，連接子之構成胺基酸可經選擇以影響分子之某種特性，諸如摺疊、淨電荷或疏水性。
在各種實施例中，連接子能夠與載體及生物活性負載物兩者形成共價鍵。適合之連接子包括直鏈或分支鏈碳連接子、雜環碳連接子或肽連接子。在各種實施例中，連接子可經由其側基接合至載體及/或一或多個負載物之構成胺基酸(例如經由二硫鍵接合至半胱胺酸)。在各種實施例中，連接子接合至載體及/或生物活性負載物之末端胺基酸的α碳胺基及/或羧基。
具有與載體上之一個基團反應且與一或多個負載物上之另一基團反應之一個官能基的雙官能連接子可用以形成所需結合物。或者，衍生作用可涉及靶向部分之化學處理。用於產生例如多肽，諸如抗體或抗體片段上之游離巰基的程序為吾人所知(參見美國專利第4,659,839號)。
用於將各種化合物，包括放射性核種金屬螯合物、載體及藥物連接至諸如抗體之蛋白質的許多程序及連接分子為吾人所知。參見例如歐洲專利申請案第188,256號；美國專利第4,671,958號、第4,659,839號、第4,414,148號、第4,699,784號；第4,680,338號；第4,569,789號；第4,589,071號；及Borlinghaus等人 (1987) Cancer Res. 47: 4071-4075。IX. 負載物或陽離子與載體之化學結合或錯合
在各種實施例中，待向個體遞送之負載物係化學結合至載體。化學結合分子之方法已為熟習此項技術者所熟知。
結合兩個分子之程序根據藥劑之化學結構而變化。多肽通常含有多個官能基；例如羧酸(COOH)或游離胺(--NH2)基團，該等基團可用於與其他肽或連接子上之適合之官能基反應，以將分子與其接合。
在本發明之各種實施例中，經分離載體係藉由細菌醱酵製備且藉由已確立之方法純化。經純化載體接著在其C端處經修飾，以允許經由位於蛋白質C端附近的游離巰基殘基直接化學偶聯。C端修飾可包括半胱胺酸受限環，其具有用於來自菸草蝕刻病毒(TEV)之高選擇性蛋白酶的共同裂解序列ENLFQS；第二半胱胺酸；及六組胺酸(His6)標籤(例如SEQ ID NO: 77及SEQ ID NO: 78)。包括第二Cys以與最終用於偶聯之Cys形成二硫橋鍵。將His6序列添加至蛋白質可簡化純化，且TEV裂解序列提供在輕度還原之後選擇性移除末端Cys殘基之機制。無毒細菌毒素構築體之表現及分離之後的TEV裂解及輕度還原(藉由0.1 mM二硫蘇糖醇)允許經由作為貨物連接之通用機制的基於順丁烯二醯亞胺之反應將葡萄糖調節劑，例如葡萄糖降低劑直接化學偶聯。在TEV蛋白酶裂解、還原及經由順丁烯二醯亞胺與游離巰基之反應進行貨物偶聯之後，藉由第二Ni2+管柱層析步驟來達成經釋放C端序列之移除。
在某些實施例中，遞送構築體包含經載體共價裝飾之顆粒，且其中負載物係整合至顆粒中。在某些實施例中，顆粒之直徑可小於約150 nm、小於約100 nm或小於約50 nm。胞吞轉運測試
可基於使載體或與載體相關之負載物(例如在顆粒中)穿過上皮膜之能力來測試載體之功能。由於胞吞轉運可能首先需要與細胞結合，此等分析亦可用於評估細胞識別域之功能。
可藉由熟習此項技術者已知之任何方法無限制地測試胞吞轉運活性。可藉由評估組合物、顆粒進入與其結合之非極化細胞的能力來測試胞吞轉運活性。允許載體穿過極化上皮細胞之相同特性亦可允許攜帶載體之分子進入非極化細胞。因此，可例如藉由偵測組合物(例如載體或負載物)於細胞內部之實體存在來評估組合物進入細胞之能力。舉例而言，組合物可用例如螢光標記來標記，且該遞送暴露於細胞。接著，細胞可經洗滌，從而移除任何組合物(例如載體或負載物，例如尚未進入細胞之遞送構築體，且測定剩餘的標記之量。在此牽引中偵測到標記指示組合物已進入細胞。
可藉由評估載體或負載物(例如遞送構築體)穿過極化上皮細胞之能力來測試組合物之胞吞轉運能力。舉例而言，組合物可用例如螢光標記來標記且與一層上皮細胞之頂端膜接觸。在由上皮細胞形成之膜之底外側上偵測到的螢光指示載體適當地起作用。可裂解連接子裂解測試
一般可在裂解分析中測試可裂解連接子之功能。熟習此項技術者已知之任何適合之裂解分析(無限制)可用於測試可裂解連接子。基於細胞之分析及無細胞分析均可用於測試酶裂解可裂解連接子之能力。
用於測試可裂解連接子之裂解的例示性無細胞分析包含製備極化上皮細胞之提取物且將攜有可裂解連接子之經標記融合分子暴露於與膜相關酶對應之萃取物部分。在此類分析中，標記可連接至待遞送之葡萄糖調節劑，例如葡萄糖降低劑，或連接至融合分子之其餘部分。在此等酶中包括在極化上皮細胞之底外側膜附近發現的裂解酶，如上文所述。可例如藉由將融合分子與例如抗體結合及洗除未結合分子來偵測裂解。若標記連接至待遞送之葡萄糖調節劑，例如葡萄糖降低劑，則應在與抗體結合之分子上觀測到極少標記或無標記。或者，分析中所用之結合劑可對葡萄糖調節劑，例如葡萄糖降低劑具有特異性，且構築體之其餘部分可經標記。在任一情況下，可評估裂解。
亦可使用基於細胞之分析來測試裂解，該等分析藉由裝配至膜中之極化上皮細胞來測試裂解。舉例而言，經標記融合分子，或包含可裂解連接子之融合分子部分可在准許連接子裂解之條件下與適合之上皮細胞，諸如Coco-2細胞之單層的頂側或底外側接觸。可藉由使用特異性結合融合分子或其部分之試劑偵測標記之存在或不存在來偵測裂解。舉例而言，對融合分子具有特異性之抗體可用於將結合融合分子，該融合分子包含相對於與該抗體結合之融合分子部分遠離可裂解連接子的標記。可接著藉由偵測與該抗體結合之分子上之標記的存在來評估裂解。若發生裂解，則應在與該抗體結合之分子上觀測到極少標記或無標記。藉由進行此類實驗，可鑑別優先在底外側膜而非頂端膜處裂解之酶，且另外可確認此類酶裂解融合分子中之可裂解連接子的能力。
另外，亦可使用如美國專利第6,759,207號中所述之螢光報導分析來測試裂解。簡言之，在此類分析中，螢光報告子可在允許裂解酶裂解報告子之條件下與適合之上皮細胞之單層的底外側接觸。報導子之裂解改變螢光報導子之結構，將其自非螢光組態變為螢光組態。觀測到的螢光之量可指示底外側膜處存在之裂解酶的活性。
另外，亦可使用分子內淬滅之分子探針，諸如美國專利第6,592,847號中所述之彼等來測試裂解。此類探針一般包含在由適當波長之光激發時發射光子的螢光部分，及在非常接近於螢光部分時吸收此類光子的淬滅部分。探針裂解將淬滅部分與螢光部分分離，使得可偵測到螢光，由此指示已發生裂解。因此，此類探針可用於藉由使適合之上皮細胞之單層的底外側與探針在允許裂解酶裂解探針之條件下接觸來鑑別及評估藉由特定裂解酶之裂解。觀測到的螢光之量指示測試之裂解酶的活性。X . 使用方法
本發明之方法及組合物，例如醫藥組合物可用於治療疾病或病況，例如醫學病況。方法及組合物可經受經口及/或鼻內配方及遞送檢驗。疾病或病況可為免疫疾病、代謝疾病或中樞神經系統(CNS)疾病。「代謝疾病或病症」可指當在一起發生時增加糖尿病及動脈粥樣硬化性血管疾病，例如心臟病及中風之風險的醫學病症之組合。代謝症候群之界定醫學參數包括糖尿病、葡萄糖耐受性異常、空腹葡萄糖升高、胰島素抗性、尿白蛋白分泌、中心型肥胖、高血壓、三酸甘油酯升高、LDL膽固醇升高及HDL膽固醇降低。
本文提供之方法及組合物，例如醫藥組合物可用於治療神經病況、涉及免疫學之病況及涉及內分泌學之病況、涉及免疫神經學之病況、涉及神經內分泌學之病況或涉及免疫內分泌學之病況。本文提供之方法及組合物，例如醫藥組合物可用於治療心臟血管病況、罕見病、肝病、發炎性腸病、呼吸病況、神經病況或胃腸道病況。本文所提供之組合物可為疫苗。疾病或病況包括例如病毒性疾病或感染、癌症、代謝疾病、肥胖、自體免疫疾病、發炎性疾病、過敏、移植物抗宿主疾病、全身性微生物感染、貧血、心血管疾病、精神病、遺傳病、神經退化性疾病、造血細胞病症、內分泌系統或生殖系統疾病、胃腸道疾病。疾病之其他實例包括但不限於糖尿病、由肥胖所致之糖尿病、高血糖症、血脂異常、高三酸甘油酯血症、症候群X、胰島素抗性、葡萄糖耐受性異常(IGT)、糖尿病性血脂異常、高脂質血症、脂肪肝病、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、肝炎、肥胖、血管疾病、心臟病、中風、葡萄糖耐受性異常、空腹葡萄糖升高、胰島素抗性、尿白蛋白分泌、中心型肥胖、高血壓、三酸甘油酯升高、LDL膽固醇升高及HDL膽固醇降低、高血糖症、高胰島素血症、血脂異常、酮病、高三酸甘油酯血症、症候群X、胰島素抗性、空腹葡萄糖異常、葡萄糖耐受性異常(IGT)、糖尿病性血脂異常、葡糖新生、過量肝糖分解、糖尿病性酮酸中毒、高三酸甘油酯血症、高血壓、糖尿病性腎病、腎機能不全、腎衰竭、攝食過量、肌肉耗損、糖尿病神經病變、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性昏迷、動脈硬化、冠心病、外周動脈疾病、纖維化及高脂質血症。疾病或病況可為潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病、儲袋炎、牛皮癬性關節炎、類風濕性關節炎或牛皮癬。疾病或病況可為胃腸病況，例如短腸侯症群(SBS)。疾病或病況可為生長激素缺乏。在一些情況下，本文所提供之組合物包含GLP-2，且組合物係例如經口向患有胃腸病況，例如短腸侯症群(SBS)之個體投與。在一些情況下，本文所提供之組合物包含GLP-1，且例如經口向個體投與組合物以治療代謝疾病；組合物可經調配以針對局部胃腸道及/或全身暴露進行經口遞送。在一些情況下，本文所提供之組合物包含GLP-1或GLP-1類似物，且例如經口向個體提供組合物以治療代謝病症(例如糖尿病、肥胖)，或非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)，或中樞神經系統(CNS)病況。組合物可經調配以經口遞送。在一些情況下，本文所提供之組合物包含人類生長激素，且向患有生長激素缺乏或相關病症之個體提供組合物以治療生長激素缺乏或相關病症。組合物可調配以用於經口遞送，且負載物之目標位置可為全身暴露。在一些情況下，負載物可到達肝臟。在一些情況下，本文所提供之組合物包含腸促胰島素。在一些情況下，向個體投與本文所提供之組合物以調節血糖功能。
在許多慢性疾病中，本發明之經口及/或鼻內配方可為特別適用的，因為其可允許經由家庭投與進行長期患者護理及治療，而不依賴於注射治療或藥物方案。本發明之配方可藉由經口投與、經肺投與、鼻內投與、頰內投與或舌下投與來投與。因此，在另一態樣中，本發明係關於醫藥組合物之用途，該醫藥組合物為自組裝顆粒，例如在丸劑或錠劑中含有載體、負載物(例如異源負載物)及/或非天然存在之融合分子作為藥物物質的微米顆粒，用於經口遞送一或多個負載物以治療疾病及病況，指示將此類配方中所含之一或多個負載物用於該等疾病及病況。
相比於習知技術，包含本發明之載體、負載物(例如異源負載物)及/或融合分子的醫藥組合物(其為顆粒，例如微米顆粒)可提供關於向個體局部或全身遞送大分子之若干優勢。首先，在此類優勢中包括在不使用針刺穿個體皮膚之情況下向個體遞送一或多個負載物之能力。許多個體需要重複、常規劑量之大分子。若可在不注射之情況下，藉由避免與此相關之疼痛或潛在併發症而完成大分子遞送，則此類個體之生活品質將極大地改善。
另外，藉由在上皮細胞之底外側膜處存在之酶裂解之連接子將一或多個負載物與融合分子之其餘部分偶聯可允許一或多個負載物在胞吞轉運穿過上皮膜之後不久自融合分子釋放且自融合分子之其餘部分釋放。此類釋放可降低誘導針對負載物，例如生物活性負載物之免疫反應的機率。其亦可允許一或多個負載物與脫離融合分子之其餘部分之其目標相互作用。
此外，一旦轉運穿過GI上皮細胞，本發明之融合分子將在血清中展現延長之半衰期，亦即，相比於呈非融合狀態之一或多個負載物，融合分子之一或多個負載物可展現延長之血清半衰期，且相比於個體之血漿所觀測之有效濃度，經口投與融合分子可向個體之肝臟遞送更高有效濃度之所遞送之一或多個負載物。
本發明之構築體可降低負載物對蛋白水解破壞之敏感性、幫助嵌合體再摺疊且改良嵌合體在儲存期間之穩定性。因此，融合分子可用於製備新穎類別之醫藥組合物以經口投與生物活性治療劑。
如本文所用，術語「共投藥」、「共投與」及「組合」當涉及本發明之微米顆粒或奈米顆粒及一或多種其他治療劑時可包括：將本發明之微米顆粒或奈米顆粒及治療劑之此類組合同時投與至需要治療之患者，此時此類組分一起調配為單一劑型以使該等組分基本上同時釋放至該患者；將本發明之微米顆粒或奈米顆粒與治療劑之此類組合基本上同時投與至需要治療之患者，此時此類組分彼此分開調配為各別劑型以由該患者基本上同時攝取，藉此使該等組分基本上同時釋放至該患者；將本發明之微米顆粒或奈米顆粒與治療劑之此類組合依序投與至需要治療之患者，此時此類組分彼此分開調配為各別劑型以由該患者在連續的時間攝取，每次投藥之間具有顯著時間間隔，藉此使該等組分在基本上不同的時間釋放至該患者；及將本發明之微米顆粒與治療劑之此類組合依序投與至需要治療之患者，此時此類組分一起調配為單一劑型以使該等組分以可控方式釋放，藉此使其以同時、連續及/或重疊方式，在相同及/或不同的時間釋放至該患者，其中各部分可以相同或不同途徑投與。
在各種實施例中，組合療法包含在相同醫藥組合物或獨立醫藥組合物中同時投與經分離微米顆粒或奈米顆粒組合物及第二藥劑組合物。在各種實施例中，依序投與經分離微米顆粒或奈米顆粒組合物及第二藥劑組合物，亦即，在投與第二藥劑組合物之前或之後投與經分離微米顆粒或奈米顆粒組合物。
在各種實施例中，同時投與顆粒，例如微米顆粒或奈米顆粒組合物及第二藥劑組合物，亦即經分離顆粒，例如微米顆粒或奈米顆粒組合物與第二藥劑組合物之投與時段彼此重疊。
在各種實施例中，不同時投與顆粒，例如微米顆粒或奈米顆粒組合物及第二藥劑組合物。舉例而言，在各種實施例中，在投與第二藥劑組合物之前終止投與經分離顆粒，例如微米顆粒或奈米顆粒組合物。在各種實施例中，在投與經分離顆粒，例如微米顆粒或奈米顆粒組合物之前終止投與第二藥劑組合物。
在各種實施例中，治療有效量的本文所述之微米顆粒或奈米顆粒將與一或多種其他治療劑組合投與。此類治療劑可此項技術中公認的用於如本文所述之特定疾病病狀，諸如代謝病症、脂肪肝病、發炎性疾病、自體免疫疾病、癌症或生長激素(GH)缺乏性生長障礙的標準治療。所涵蓋之例示性治療劑包括但不限於細胞介素、生長因子、類固醇、NSAID、DMARD、消炎劑、化學治療劑、放射線治療劑或其他活性及輔助劑。
在另一態樣中，本發明係關於治療分類為肥胖(例如身體質量指數(BMI)為30 kg/m2 或更大)之個體的方法，其包含向該個體投與治療有效量之本發明組合物，例如包含載體及負載物之顆粒(例如遞送構築體)。
在另一態樣中，本發明係關於治療診斷患有1型糖尿病(T1D)之個體的方法，其包含在不補充胰島素的情況下以足以治療該疾病之量經口投與本發明組合物，例如包含載體及負載物之顆粒(例如遞送構築體)。
在另一態樣中，本發明係關於治療診斷患有1型糖尿病(T1D)之個體的方法，其包含(a)以足以治療該疾病之量經口投與本發明組合物，例如包含載體及負載物之顆粒(例如遞送構築體)，及(b)補充胰島素。在某些實施例中，補充胰島素包含投與胰島素之劑量，該劑量可為胰島素之正常每日劑量的約70%-90%、約50%-70%、約30%-50%、約15%-30%、約10-15%、約5-10%及0-5%，包括4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.5%、1%、.5%、.4%、.3%、.2%或.1%。
在另一態樣中，本發明係關於治療診斷患有2型糖尿病(T2D)之個體的方法，其包含以足以治療該疾病之量經口投與本發明組合物，例如包含載體及負載物之顆粒(例如遞送構築體)。
在另一態樣中，本發明提供治療患有脂肪肝病(例如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)；非酒精性脂肪變性肝炎(NASH))、胃腸道疾病或神經退化性疾病之個體的方法，該方法包含以足以治療該疾病之量經口投與本發明組合物，例如包含載體及負載物之顆粒(例如遞送構築體)。XI. 編碼載體、負載物及融合分子之聚核苷酸
在另一態樣中，本發明提供聚核苷酸，其包含編碼載體、負載物(例如異源負載物)及非天然存在之融合分子的核苷酸序列。此等聚核苷酸例如適用於製備載體、負載物(例如異源負載物)及融合分子。在另一態樣中，本發明提供表現系統，其包含編碼載體，例如Cholix載體或PE之重組聚核苷酸序列，及用於編碼負載物，例如葡萄糖調節劑，例如葡萄糖降低劑或陽離子之聚核苷酸序列的多連接子插入位點。在各種實施例中，表現系統可包含編碼可裂解連接子之聚核苷酸序列，以使得可裂解連接子處之裂解將負載物，例如由插入至多連接子插入位點中之核酸編碼之葡萄糖降低劑與經編碼融合分子之其餘部分分離。因此，在多連接子插入位點位於經編碼構築體之一端的實施例中，聚核苷酸包含一個編碼多連接子插入位點與聚核苷酸之其餘部分之間的可裂解連接子之核苷酸序列。在多連接子插入位點不位於經編碼構築體之一端的實施例中，多連接子插入位點可側接由各自編碼可裂解連接子之核苷酸序列。
可用於製備編碼本發明之載體(例如Cholix載體或PE)、負載物或融合分子之聚核苷酸的各種活體外方法包括但不限於反轉錄、聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、基於轉錄之擴增系統(TAS)、自主序列複製系統(3SR)及QP複製酶擴增系統(QB)。
使用此等選殖及活體外擴增方法之指南描述於例如美國專利第4,683,195號；Mullis等人, 1987, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263；及Erlich編, 1989, PCR Technology, Stockton Press, NY中。編碼融合分子或其部分之聚核苷酸亦可藉由在嚴格、適度嚴格或高度嚴格的雜交條件下用選自所需聚核苷酸之序列的探針篩選基因體或cDNA庫而分離。
可藉由將用於編碼葡萄糖降低劑之核酸的插入位點引入至構築體中來促進編碼本發明之載體、負載物或融合分子之核酸的構築。
另外，聚核苷酸亦可編碼位於經編碼載體、負載物或融合分子之胺基末端處的分泌序列。此類構築體適用於在哺乳動物細胞中產生載體、負載物或融合分子，因為其簡化免疫原分離。
此外，本發明之聚核苷酸亦涵蓋編碼載體、負載物或融合分子之聚核苷酸的衍生型式。舉例而言，可藉由位點特異性突變誘發，包括編碼融合分子之聚核苷酸之一個、兩個、三個、五個、十個或更多個核苷酸的取代、插入或缺失而製得衍生物。或者，可藉由隨機突變誘發製得衍生物。
因此，在各種實施例中，本發明提供編碼載體、負載物或融合分子之聚核苷酸。載體、負載物或融合分子可包含待向個體遞送之經修飾載體及負載物，例如葡萄糖調節劑，例如葡萄糖降低劑；且視情況包含可裂解連接子。可裂解連接子處之裂解可將負載物，例如葡萄糖調節劑，例如葡萄糖降低劑與融合分子之其餘部分分離。可裂解連接子可藉由存在於個體之極化上皮細胞之底外側膜處或存在於個體血漿中的酶裂解。
在各種實施例中，聚核苷酸在嚴格雜交條件下雜交為本發明之任何聚核苷酸。在其他實施例中，聚核苷酸在嚴格條件下雜交為編碼本發明之任何載體、負載物或融合分子的核酸。
在另一態樣中，本發明提供用於表現載體、負載物或融合分子之表現載體。一般而言，表現載體可為包含表現控制序列之重組聚核苷酸分子，該等表現控制序列以可操作方式連接於編碼多肽之核苷酸序列。藉由包括適當啟動子、複製序列、可選標記等以產生穩定轉錄及轉譯或mRNA，表現載體可容易地適於在原核生物或真核生物中起作用。構築表現載體及在包含表現載體之細胞中表現基因之技術為此項技術中熟知的。參見例如Sambrook等人, 2001, Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 第3增補版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.，及Ausubel等人編, 現行版, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY。
表現載體可含有表現及複製信號，其與表現載體、負載物或融合分子之細胞相容。表現載體可藉由熟習此項技術者已知之任何方法(無限制)引入至細胞中以用於表現載體、負載物或融合分子。表現載體亦可含有簡化載體、負載物或融合分子分離之純化部分。
在另一態樣中，本發明提供包含用於表現載體、負載物或融合分子或其部分之表現載體的細胞。可關於表現高濃度之載體、負載物或融合分子之能力選擇細胞，以促進蛋白質純化。在各種實施例中，細胞為原核細胞，例如大腸桿菌。如例如在實例中所描述，當表現於大腸桿菌中時，載體、負載物及融合分子可經恰當摺疊且可包含適當二硫鍵。
在其他實施例中，細胞為真核細胞。適用之真核細胞包括酵母及哺乳動物細胞。熟習此項技術者已知適用於表現重組多肽之任何哺乳動物細胞(無限制)可用於表現載體、負載物或融合分子。舉例而言，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞可用於表現載體、負載物或融合分子。
如下所述，本發明之載體、負載物或融合分子可藉由重組產生。然而，載體、負載物或融合分子亦可藉由使用熟習此項技術者已知之方法進行化學合成而產生。
用於表現及純化本發明之載體、負載物及融合分子的方法廣泛描述於本文中，例如以下實例中。一般而言，方法可依賴於將編碼載體、負載物及/或融合分子之表現載體引入至可自載體表現載體、負載物及/或融合分子的細胞。載體、負載物及/或融合分子可接著經純化以向個體投與，例如治療疾病及病況，指示將此類配方中所含之一或多個負載物用於該等疾病及病況。XII. 使用微米顆粒或奈米顆粒醫藥組合物進行經肺遞送
本文所揭示之顆粒組合物，例如微米顆粒醫藥組合物可用作經肺遞送負載物，例如生物活性負載物的藥物物質。經肺遞送方法可包括噴霧或乾燥粉末吸入。
顆粒，例如微米顆粒或奈米顆粒醫藥組合物可經調配以用於經肺遞送。調配用於經肺投與之醫藥組合物可易於霧化或氣溶膠化。在一些情況下，調配用於經肺投與之醫藥組合物利用載體介導胞吞轉運穿過肺上皮細胞的能力。鼻內投與可用於經肺遞送且可包括燙吸或嗅吸粉末。XIII. 使用組合物進行經口遞送
本文所揭示之組合物，例如顆粒，例如微米顆粒或奈米顆粒組合物，例如微米顆粒醫藥組合物可用作丸劑或錠劑中之藥物物質以將負載物，例如生物活性負載物經口遞送至個體，例如以治療疾病及病況，指示將此類配方中所含之一或多個負載物用於該等疾病及病況。
組合物，例如微米顆粒或奈米顆粒醫藥組合物可經調配以用於經口遞送。調配用於經口投與之醫藥組合物可對在消化道中降解具抗性。
在一些情況下，調配用於經口投與之醫藥組合物利用載體介導胞吞轉運穿過胃腸道(GI)上皮細胞的能力。經口投與此等醫藥組合物可引起經由消化黏膜，例如腸黏膜之極化上皮細胞吸收載體及負載物(例如以融合分子形式)，接著在黏膜之底外側釋放負載物，例如一或多個負載物。經肺投與此等醫藥組合物可引起經由肺及氣管之極化上皮細胞吸收載體及負載物。上皮細胞可為鼻上皮細胞、口腔上皮細胞、腸上皮細胞、直腸上皮細胞、陰道上皮細胞或肺上皮細胞。本發明之醫藥組合物可包括添加胞吞轉運強化子以促進轉移融合蛋白穿過GI上皮細胞或肺上皮細胞。此類強化子為此項技術中已知的，參見例如Xia等人, (2000) J. Pharmacol. Experiment. Therap., 295:594-600；及Xia等人 (2001) Pharmaceutical Res., 18(2):191-195，其各自以全文引用的方式併入本文中。
一旦轉運穿過上皮細胞，本發明之組合物，例如微米顆粒或奈米顆粒醫藥組合物可展現延長之血清半衰期，亦即，相比於呈非融合狀態之負載物，例如生物活性負載物，(例如融合分子之)負載物，例如生物活性負載物可展現延長之血清半衰期。本發明之醫藥組合物之口服配方可經製備以使其適合於轉運至GI上皮細胞且保護胃中之載體、負載物或融合分子。此類配方可包括載體及分散劑組分且可呈任何適合之形式，包括氣溶膠(用於經口或經肺遞送)、糖漿、酏劑、錠劑(包括咀嚼錠)、硬或軟膠囊、糖衣錠、口含錠、水性或油性懸浮液、乳液、扁囊劑或丸粒、及可分散散劑。在各種實施例中，醫藥組合物係以適合於簡單地經口投與精確劑量的固體劑型，例如錠劑、膠囊或其類似劑型採用。
在各種實施例中，口服配方包含微米顆粒醫藥組合物及一或多種化合物，當載體、負載物或融合分子，或未融合之載體及負載物分子在胃中時，該一或多種化合物可對其進行保護。舉例而言，保護化合物應能夠防止分子之酸及/或酶水解。在各種實施例中，口服配方包含微米顆粒醫藥組合物及一或多種化合物，該一或多種化合物可促進將構築體自胃轉運至小腸。在各種實施例中，可保護載體、負載物或融合分子免於在胃中降解之一或多種化合物亦可促進將構築體自胃轉運至小腸。舉例而言，包括碳酸氫鈉可適用於促進胃內遞送物質自胃快速移動至十二指腸，如Mrsny等人, Vaccine 17:1425-1433, 1999中所述。用於調配配方以使得載體、負載物或融合分子可穿過胃且接觸小腸中之極化上皮膜的其他方法包括但不限於如DeYoung, Int J Pancreatol, 第5增刊:31-6, 1989中所述之腸溶衣技術，及各自以全文引用的方式併入本文中之美國專利第6,613,332號、第6,174,529號、第6,086,918號、第5,922,680號及第5,807,832號中提供之方法。
在一些情況下，保護化合物為陽離子，其使耐酸性微米顆粒或奈米顆粒穩定。在一些情況下，包含載體、陽離子及異源負載物之顆粒可在不需要腸溶衣或其他穩定化合物的情況下對胰酶具抗性。舉例而言，圖 11 展示對含有載體蛋白(SEQ ID NO: 3)，以及陽離子(鋅或魚精蛋白)及異源負載物(艾塞那肽)之配方進行之胰酶消化分析的結果。圖 11A 通道1-4展示SEQ ID NO: 3之蛋白質之組合物在0、30、60及120分鐘之後的胰酶降解，在120分鐘之後，蛋白質完全降解。然而，通道5-8展示藉由以1:1比率(w/w載體:鋅鹽)混合組分製備之SEQ ID NO. 3之蛋白質及鋅鹽的配方。圖 11A 之通道8展示此配方在與胰酶一起培育120分鐘之後僅部分降解。在SEQ ID NO: 3之配方的情況下可見類似結果，鋅及艾塞那肽在1:1:1比率或1:2:1比率處丟失。圖 11B 展示使用魚精蛋白而非鋅作為陽離子的類似結果。圖 11C 展示對含有艾塞那肽及鋅，不含SEQ ID NO: 3之配方進行胰酶處理的結果。在一些情況下，本文所述之組合物可對胰酶裂解具抗性。在一些情況下，如本文所述之組合物可對胰酶裂解具抗性，以使得在將組合物與胰酶一起於37℃下培育30分鐘之後，至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%之異源負載物及/或載體蛋白保持完整。在一些情況下，如本文所述之組合物可對胰酶裂解具抗性，以使得在將組合物與胰酶一起於37℃下培育60分鐘之後，至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%之異源負載物及/或載體蛋白保持完整。在一些情況下，如本文所述之組合物可對胰酶裂解具抗性，以使得在將組合物與胰酶一起於37℃下培育120分鐘之後，至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%之異源負載物及/或載體蛋白保持完整。在一些情況下，至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%之治療蛋白在胰酶分析中於0.5小時、1小時或2小時處保持完整；其中胰酶分析包含在37℃下於100 µL PBS中將包含100 µg治療蛋白之組合物與10 µg胰酶一起培育。
可根據此項技術中已知用於製造醫藥組合物之任何方法來製備意圖用於經口使用之醫藥組合物，且此類配方可含有選自由甜味劑組成之群的一或多種藥劑，以提供醫藥學上雅致及適口的製劑。舉例而言，為了製備可經口遞送之錠劑，將微米顆粒醫藥組合物與至少一種醫藥賦形劑混合，且根據已知方法壓縮固體配方以形成錠劑，用於遞送至胃腸道。錠劑組合物通常用添加劑調配，例如醣或纖維素載體、黏合劑(諸如澱粉糊或甲基纖維素)、填充劑、崩解劑或製造醫藥製劑中典型地通常使用之其他添加劑。為了製備可經口遞送之膠囊，將DHEA與至少一種醫藥賦形劑混合，且將固體配方置於適合於遞送至胃腸道之囊狀容器中。可如以引用的方式併入本文中之Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版 1990 (Mack Publishing Co. Easton Pa. 18042) 於第89章中總體上描述地製備包含載體、負載物或融合分子之配方。
在各種實施例中，醫藥組合物係調配為含有與無毒醫藥學上可接受之賦形劑(其適合於製造錠劑)摻合之微米顆粒醫藥組合物的可經口遞送之錠劑。此等賦形劑可為惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；粒化劑及崩解劑，例如玉米澱粉、明膠或阿拉伯膠，及潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。錠劑可未經包覆，或其可藉由已知技術包覆以延遲在胃腸道中之崩解及吸收，且因此提供在更長時間段內之持續作用。舉例而言，諸如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯之時間延遲材料可單獨採用或與蠟一起採用。
在各種實施例中，醫藥組合物係調配為硬明膠膠囊，其中將載體、負載物及融合分子與惰性固體稀釋劑，例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合，或調配為軟明膠膠囊，其中將載體、負載物或融合分子與水性或油性介質，例如花生油(arachis oil/peanut oil)、液體石蠟或橄欖油混合。
在各種實施例中，水性懸浮液可含有與適合於製造水性懸浮液之賦形劑摻合的微米顆粒醫藥組合物。此類賦形劑為懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯啶酮、黃蓍膠以及阿拉伯膠；分散劑或濕潤劑可為天然存在之磷脂，例如卵磷脂，或環氧烷與脂肪酸的縮合產物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或氧化乙烯與長鏈脂族醇的縮合產物，例如十七基乙氧基十六醇，或氧化乙烯與衍生自脂肪酸及己糖醇之偏酯的縮合產物，諸如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，或氧化乙烯與衍生自脂肪酸及己糖醇酐之偏酯的縮合產物，例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。水性懸浮液亦可含有一或多種防腐劑，例如對羥基苯甲酸乙酯或對羥基苯甲酸正丙酯；一或多種著色劑；一或多種調味劑；以及一或多種甜味劑，諸如蔗糖或糖精。
在各種實施例中，油性懸浮液可藉由將微米顆粒醫藥組合物懸浮於植物油，例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油，或礦物油，諸如液體石蠟中來調配。油性懸浮液可含有增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇。可添加甜味劑(諸如上述甜味劑)及調味劑，以提供適口之口服製劑。此等配方可藉由添加抗氧化劑(諸如抗壞血酸)來保存。
在各種實施例中，醫藥組合物可呈水包油乳液形式。油相可為植物油，例如橄欖油或花生油；或礦物油，例如阿拉伯膠或黃蓍膠；天然存在之磷脂，例如大豆卵磷脂；及衍生自脂肪酸及己糖醇酐之酯或偏酯，例如脫水山梨糖醇單油酸酯；及相同偏酯與氧化乙烯之縮合產物，例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。乳液亦可含有甜味劑及調味劑。
可使用囊封或包衣錠劑，其以逐層方式釋放一或多種負載物，由此在預定時間範圍內，在沿胃腸道移動時釋放一或多個負載物。另外，包含一或多個負載物之錠劑可置於較大錠劑內，由此保護內部錠劑免受環境及處理條件，諸如溫度、化學試劑(例如溶劑)、pH及水分侵害。外部錠劑及包衣進一步用於在胃環境中保護一或多個負載物。在一些情況下，囊封顆粒可置於較大錠劑或膠囊內，其經囊封以使得較大錠劑或膠囊溶解於第一環境中且囊封之顆粒溶解於第二環境中。在一些情況下，囊封顆粒在第一條件下但不在第二條件下釋放負載物。舉例而言，囊封顆粒可在高pH下但不在低pH下釋放負載物。在一些情況下，囊封顆粒具有腸溶衣。
表面活性劑或界面活性劑促進經由黏膜或黏膜表層吸收多肽。適用之表面活性劑或界面活性劑包括脂肪酸及其鹽、膽汁鹽、磷脂或烷基醣。脂肪酸及其鹽之實例包括辛酸鹽(C8)、癸酸鹽(C10)、月桂酸鹽(C12)及豆蔻酸鹽(C14)之鈉、鉀及離胺酸鹽。膽汁鹽之實例包括膽酸、鵝膽酸、甘膽酸、牛磺膽酸、鵝去氧甘膽酸、牛磺鵝去氧膽酸、去氧膽酸、甘胺去氧膽酸、牛去氧膽酸、石膽酸及熊去氧膽酸。磷脂之實例包括單鏈磷脂，諸如溶血磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯甘油、溶血磷脂醯乙醇胺、溶血磷脂醯肌醇及溶血磷脂醯絲胺酸；或雙鏈磷脂，諸如二醯基磷脂醯膽鹼、二醯基磷脂醯甘油、二醯基磷脂醯乙醇胺、二醯基磷脂醯肌醇及二醯基磷脂醯絲胺酸。烷基醣之實例包括烷基葡糖苷或烷基麥芽糖苷，諸如癸基葡糖苷及十二烷基麥芽糖苷。
在另一態樣中，本發明係關於經口投與本發明之醫藥組合物之方法。經口投與微米顆粒醫藥組合物可引起經由消化黏膜，例如腸黏膜之極化上皮細胞吸收載體、負載物或融合分子，接著(在一些情況下)裂解融合分子且在黏膜之底外側釋放一或多個負載物。一或多個負載物可接著經由肝門靜脈直接轉運至肝臟。因此，當一或多個負載物在肝臟中發揮生物活性，諸如由與其同源受體結合之一或多個負載物介導的活性時，咸信一或多個負載物發揮超過基於個體中觀測之血漿濃度將預期的效應，亦即相比於個體之血漿中所觀測之有效濃度，經口投與載體、負載物或融合分子可將更高有效濃度之所遞送之一或多個負載物遞送至個體肝臟。
在另一態樣中，本發明係關於經口投與本發明之醫藥組合物之方法。此類方法可包括但不限於由患者或照護者經口投與配方之步驟。此類投與步驟可包括取決於載體、負載物或融合分子、疾病或患者狀況或個別患者而以諸如每天一次或兩次的間隔投與。此類方法亦包括投與不同劑量之個別載體、負載物或融合分子。舉例而言，醫藥組合物之初始劑量可處於較高含量，以誘導所需效應，諸如血糖含量降低。一旦達成所需效應，可接著降低後續劑量。對投與方案之此類改變或修改可由主治醫師或健康照護工作者執行。
可以合適劑量向個體投與此等醫藥組合物。給藥方案將由主治醫師基於特定臨床因素確定。如醫學領域中所熟知，任一個患者之劑量取決於許多因素，包括患者之身材、體表面積、年齡、性別及一般健康，以及待投與之特定化合物、投藥之時間及途徑以及同時投與之其他藥物。給定情形之治療有效量將易於藉由常規實驗確定，且在一般臨床醫師或醫師的技能及判斷內。熟練人士知曉向個體投與之醫藥組合物的有效量將尤其取決於生物活性負載物之性質。觀測改變所需之治療時長及治療後出現反應之時間間隔取決於所需效應而變化。特定量可藉由習知測試來確定，其已為熟習此項技術者所熟知。
一或多個負載物之量為有效實現特定活性劑之目的之量。組合物中之量通常為藥理學、生物學、治療學或化學有效量。然而，當組合物用於單位劑型，諸如膠囊、錠劑或液體時，該量可小於藥理學、生物學、治療學或化學有效量，因為單位劑型可含有多重的載體/生物學或化學活性劑配方，或可含有分開的藥理學、生物學、治療學或化學有效量。總有效量可接著在總計含有藥理學、生物學、治療或化學有效量之生物活性負載物的累積單位中投與。
在一些情況下，經腸投與包含10 µg艾塞那肽之本發明組合物可產生大於約15 ng/mL，或大於約30 ng/mL的最大血漿濃度。在一些情況下，經腸投與包含10 µg艾塞那肽之本發明組合物可產生約17.3 ng/mL或約35.7 ng/mL之最大血漿濃度。在一些情況下，經腸投與包含10 µg艾塞那肽之本發明組合物可產生約60分鐘或約45分鐘之達至最大血漿濃度之時間。
除非本文另外定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語將具有一般技術者通常理解的含義。此外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。一般而言，本文中所描述之與細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白與核酸化學及雜交結合使用的命名法及其技術為此項技術中熟知且常用者。
如本文所用之術語「約」可意謂加或減該術語所指代之數字的1%、2%、3%、4%、5%或10%。
如本文所述，在胺基酸序列的情況下，術語「序列一致性百分比(%)」及與其相關之術語為在比對序列且必要時引入間隙以獲得最大序列一致性百分比且不將任何保守取代考慮為序列一致性之部分之後，候選序列中之胺基酸殘基與所選序列中之胺基酸殘基一致之百分比。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以此項技術內之各種方式達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，諸如Clustal Omega、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於量測比對之適當參數，包括用於達成所比較序列之全長內之最大比對所需的任何演算法。  實例實例 1
此實例描述製備在丸劑或錠劑中含有用作藥物物質之非天然存在之融合分子的穩定、自組裝微米顆粒，用於經口遞送生物活性負載物。特定言之，使用如下所述之魚精蛋白-鋅凝聚體系統製備非天然存在之融合分子，其包含具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的Cholix載體分子，該載體分子與具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的人類生長激素(「hGH」)分子偶聯。
如下地構築包含SEQ ID NO: 2分子及hGH分子之例示性融合分子表現載體：首先，藉由PCR擴增多肽基因，在PCR產物之兩個末端處併入NdeI及EcoRI、PstI及PstI、AgeI及EcoRI或PstI及EcoRI位點之限制酶對。在限制酶消化之後，將PCR產物選殖至用於細胞表現之適當質體中，該質體用對應限制酶對消化。所得構築體編碼SEQ ID NO: 2及hGH，且亦在多肽之N端處用6-His模體標記以促進純化。藉由限制酶消化及DNA定序來檢驗最終質體。
如下地表現融合分子：將大腸桿菌BL21(DE3) pLysS勝任細胞(Novagen, Madison, Wis.)在適當質體存在下使用標準熱休克法(heat-shock method)轉形以產生融合分子表現細胞，在含安比西林之培養基上選擇，且分離且使用抗生素在Luria-Bertani培養液(Difco; Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.)中生長，隨後藉由在OD 0.6下添加1 mM異丙基-D-硫代哌喃半乳糖苷(IPTG)來誘導蛋白質表現。在IPTG誘導之後兩小時，藉由以5,000 rpm離心10分鐘來收集細胞。在細胞溶解之後分離包涵體，且將蛋白質溶解於含有100 mM Tris-HCl (pH 8.0)、2 mM EDTA、6 M鹽酸胍及65 mM二硫蘇糖醇之緩衝液中。溶解之融合分子在0.1 M Tris，pH=7.4、500 mM L-精胺酸、0.9 mM GSSG、2 mM EDTA存在下再摺疊。再摺疊之蛋白質係藉由Q瓊脂糖離子交換及Superdex 200凝膠過濾層析(Amersham Biosciences, Inc., Sweden)來純化。藉由SDS-PAGE及分析型HPLC (Agilent, Inc. Palo Alto, Calif.)來評估蛋白質之純度。所得融合分子係以1 mg/mL之濃度製備且在-80℃下儲存於PBS中。
如下地進行基於魚精蛋白之微米顆粒的產生：(a)將包含SEQ ID NO: 2及SEQ ID NO: 5之融合分子添加至0.1 N HCl中，直至1.5 mL微量離心管中之融合分子的最終濃度為1 mg/mL，且接著將0.02 mL ZnCl2 (10 mg/mL於H20中)添加至融合分子溶液中；(b)將2.0 mL硫酸魚精蛋白(0.6 mg/mL)添加至2.0 mL 0.1 M NaPO4 中；及(c)將步驟(a)之混合物與步驟(b)之混合物組合且使組合之混合物在室溫下靜置隔夜。在混合(a)及(b)後立即形成沈澱物，如由澄清轉變為混濁證明。
次日上午，使用GE Cytel系統以高功率(10×)明視場模式對顆粒成像。顆粒之粒度為大約50 µM，且在混合試劑之後於室溫下自發形成(參見圖 1A )。在藉由逐滴添加5 M NaCl來增加溶液之離子強度後，此等顆粒可破裂為大約5 µM之較小單元(參見圖 1B )。可藉由逐滴添加Milli-Q製備水降低離子強度而使聚集體再結合(參見圖 1C )。
此等資料展示魚精蛋白-鋅凝聚體系統可用於製備含有載體源性融合分子之穩定、自組裝微米顆粒，且該系統將取決於緩衝液之離子強度而裝配為不同顆粒物種，且此等特定分子總成之結合及解離過程為可逆的。使用此「可調諧」系統製備之自裝配微米顆粒可用作製備丸劑或錠劑以經口遞送生物學活性負載物之藥物物質。實例 2
使用實例1之方法，製備穩定的含有胰島素之微米顆粒及含有胰島素-FITC之微米顆粒，且如下所述地評估。
在一個製備中，將胰島素及胰島素-FITC以2:1比率添加至1.0 mL 0.1 N HCl，直至1.5 mL微量離心管中之最終濃度為5 mg/mL，且接著將0.02 mL ZnCl2 (10 mg/mL於H2 0中)添加至胰島素溶液中。在第二製備中，將胰島素-FITC以2:1比率添加至1.0 mL 0.1 N HCl，直至1.5 mL微量離心管中之最終濃度為5 mg/mL，且接著將0.02 mL ZnCl2 (10 mg/mL於H2 0中)添加至胰島素溶液中。在獨立步驟中，將2.0 mL硫酸魚精蛋白(1 mg/mL)添加至2.0 mL 0.1 M NaPO4 中。接著將魚精蛋白溶液添加至含有胰島素之溶液及含有胰島素-FITC之溶液中，且使各組合之混合物在室溫下靜置隔夜。在混合後立即形成沈澱物，如由澄清轉變為混濁證明。
次日上午，使用GE Cytel系統以高功率(10×)明視場模式對含有胰島素及/或胰島素-FITC之顆粒成像。顆粒之粒度為大約50-150 µM，且在混合試劑之後於室溫下自發形成。圖 2A 及圖 2B 分別展示明亮及藍色濾光器影像。藍色箭頭指示大約150 µM顆粒。圖 2C 展示微米顆粒之經合併藍色及明視場影像。觀測之藍色螢光指示胰島素-FITC併入至顆粒中。自此等微米顆粒發射之螢光的性質與基於蛋白質之組合物一致。實例 3
在此實例中，製備含有非天然存在之融合分子的穩定微米顆粒，該融合分子包含與紅色螢光蛋白(「RFP」)分子偶聯的具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的Cholix載體分子，且使用如下所述之魚精蛋白-鋅凝聚體系統評估。
如下地製備包含與紅色螢光蛋白(「RFP」)偶聯之SEQ ID NO: 6的融合分子：如本文所述地製備編碼SEQ ID NO: 6之質體構築體。使用大腸桿菌DH5α細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA)在適當質體下藉由熱休克(1分鐘於42℃下)進行轉形之後達成蛋白質表現；在含抗生素之培養基上選擇之轉形細胞在Luria-Bertani培養液(Difco)中分離及生長；藉由添加1 mM異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導蛋白質表現；在IPTG誘導之後兩小時，藉由在4℃下以5,000 xg離心10分鐘收集細胞；在細胞溶解之後分離包涵體且將蛋白質溶解於6 M鹽酸胍及2 mM EDTA (pH 8.0)加上65 mM二硫蘇糖醇中；在再摺疊及純化之後，將蛋白質在-80℃下以約5 mg/mL儲存於不含Ca2 + 及Mg2 + 之PBS (pH 7.4)中。基於尺寸排阻層析，確認此等研究中所用之所有蛋白質的純度為＞90%。
如SEQ ID NO: 6中所述之蛋白質接著在其C端處經修飾以允許經由位於蛋白質C端附近的游離巰基殘基直接化學偶聯。C端修飾包括半胱胺酸受限環，其具有用於來自菸草蝕刻病毒(TEV)之高選擇性蛋白酶的共同裂解序列；第二半胱胺酸；及六組胺酸(His6)標籤。包括第二Cys以與最終用於偶聯之Cys形成二硫橋鍵。將His6序列添加至蛋白質簡化了純化，且TEV裂解序列提供在輕度還原之後選擇性移除末端Cys殘基之機制。SEQ ID NO: 6構築體之表現及分離之後的TEV裂解及輕度還原(藉由0.1 mM二硫蘇糖醇)允許經由作為負載物連接之通用機制的基於順丁烯二醯亞胺之反應將一或多個負載物直接化學偶聯。在TEV蛋白酶裂解、還原及經由順丁烯二醯亞胺與游離巰基之反應進行RFP偶聯之後，藉由第二Ni2+管柱層析步驟來達成經釋放C端序列之移除。融合分子將在下文中稱作FM001。
如下進行基於魚精蛋白之微米顆粒的生成：(a)將FM001添加至0.1N HCl中，直至1.5 mL微量離心管中1 mg/mL FM001之最終濃度，且接著將0.02 mL ZnCl2 (10 mg/mL於H20中)添加至FM001溶液中；在第二製備中，省去ZnCl2 ；(b)將2.0 mL硫酸魚精蛋白(0.6 mg/mL)添加至2.0 mL 0.1M NaPO4 中；及(c)將步驟(a)之兩種混合物各自與步驟(b)之混合物組合，且使組合之混合物在室溫下靜置隔夜。在混合(a)及(b)後立即形成沈澱物，如由澄清轉變為混濁證明。
次日上午，使用GE Cytel系統收集顆粒之數位影像。藉由在481 nm處激發樣品而對紅色螢光成像，且在535 nm處記錄螢光發射。在4×放大率下，含有魚精蛋白、鋅及FM001之顆粒之粒度均一地為大約150 µM (圖 3A )。當用481 nm光激發時，顆粒發射紅色螢光(圖 3B )。觀測之紅色螢光指示FM001併入至顆粒中。螢光分佈均一，指示FM001均勻分佈且蛋白質結構在顆粒形成期間未破壞。在10×放大率下，自凝聚體省略鋅致使形成具有類似粒度(約150 µM)之顆粒，然而，該等顆粒之形狀為更卵形(圖 4A )。此等顆粒與含有鋅之顆粒具有類似的螢光特性(圖 4B )，指示不需要鋅以在凝聚期間維持蛋白質結構，且凝聚體之組成可決定顆粒之形狀。實例 4
在此實例中，測試一系列不同條件及配方以產生具有所需特性之噴霧乾燥顆粒。在此實例中，產生多種不同顆粒配方。此等顆粒一般由載體、藥物、聚合物基質、PEG、界面活性劑及鋅製成。
包含hGH/SEQ ID NO: 3/Eudragit FS30D/聚山梨醇酯20/ZnCl2 之配方37-49之詳細方案的實例提供於下。將15 µL體積之聚山梨醇酯添加至離心管(Falcon tube)中，接著添加7.6 mL SEQ ID NO: 3溶液(9.5 mg，0.27 µmol)。隨後，在獨立的20 mL玻璃閃爍瓶中將hGH Powder 3.0 mg (0.14 µmol)溶解於4.0 mL去離子水中以產生澄清溶液，且接著轉移至以上離心管中之溶液。將15 μL體積之ZnCl2 儲備溶液(5 mg/ml)(0.075 mg，0.55 µmol)添加至混合物中，接著添加82 mg Eudragit FS 30D懸浮液。將懸浮液在烤肉架振盪器上振盪20分鐘，接著用50 mM碳酸氫銨溶液稀釋為25 mL總體積。由Pall實驗室將溶液經由0.4 μm盤式過濾器過濾，隨後在Buchi B-90奈米噴霧乾燥器上噴霧乾燥。
使用以下條件進行噴霧乾燥：中型噴嘴用於噴霧/霧化，入口溫度110℃，出口溫度49℃，氣流130公升/分鐘，泵速12%，及噴霧比100%。噴霧乾燥在2小時內完成。以白色及自由流動粉末形式收集產物。產率為按重量計約56%。藉由機器光譜法估計粒度在300-600 nm處。類似地製備其他顆粒。
首先藉由凝膠電泳來篩選由不同配方條件產生之顆粒，以確認噴霧乾燥過程之後的蛋白質品質。為此，將顆粒溶解且藉由西方墨點來分析釋放之蛋白質，以確保蛋白質未受損。
在此之後，針對生理pH下之囊封及釋放效率篩選不同顆粒。圖 5A 展示包含胰島素、SEQ ID NO: 3及Eudragit FS之顆粒(37-156)的溶解分析結果。此配方產生在pH 2處以低速率釋放藥物且在pH 7處逐漸釋放藥物之顆粒。將pH自pH 2升高至pH 7誘導先前囊封藥物之控制釋放。在一些情況下，此可表示所需的囊封及釋放特性。圖 5B 展示包含胰島素、SEQ ID NO: 3及尤特奇L30之顆粒(37-167)的溶解結果。此配方產生在pH 2及pH值7處均快速釋放藥物的顆粒。在一些情況下，此可並非所需的囊封及釋放特性。圖 5C 展示包含hGH及Eudragit FS之另一顆粒配方的溶解分析結果。此配方引起pH 2處之低藥物釋放、pH 7處之逐漸藥物釋放及pH自pH 2升至pH 7時藥物釋放之受控誘導。此釋放曲線指示該配方可潛在地適合於經口投與，例如藉由經口管飼。
隨後測試配方在具有胰酶之模擬腸液中的穩定性。將不同顆粒暴露於具有胰酶之模擬腸液，且在1小時及14小時之後評估剩餘之藥物的量。圖 6 展示胰島素標準溶液及五種不同配方在1小時及14小時之後剩餘之藥物的百分比。在表 1 中列出圖 6 中之配方的細節。圖 6 中之所有五種噴霧乾燥顆粒均提供針對胰酶的長期藥物保護。兩種不同配方，相比於在單獨的胰島素之情況下所見之胰島素濃度，37-166 (胰島素/PEG8K/SEQ ID NO: 3/Eudragit FS/Tween-20/ZnCl2 )及37-224 (胰島素/SEQ ID NO: 3/2× Eudragit L30/ZnCl2 )在1小時時間點處產生更高的胰島素濃度。表 1 ：圖 6 中評估之配方。
配方名稱 噴霧乾燥配方 藥物含量(w/w)
胰島素 胰島素標準溶液 100%
37-166 胰島素/PEG8K/SEQ ID NO. 3/Eud FS/Tw20/ZnCl2 1.54%
37-186 胰島素/SEQ ID NO. 3/Eud FS/Tw20 1.42%
37-188 胰島素/PEG8K/SEQ ID NO: 3/Eud L30/Tw20 3.17%
37-219 胰島素/SEQ ID NO: 3/Eud L30/ ZnCl2 6.17%
37-224 胰島素/SEQ ID NO: 3/2× Eud L30/ ZnCl2 4.97%
實例 5
在此實例中，將評估來自不同顆粒組合物之藥物的活體內吸收。假設腸藥物保留率將與藥物吸收相關，且將由顆粒組合物調節。螢光標記之藥物將如上文所述地調配為顆粒。顆粒將懸浮於適合之溶液中以藉由經口管飼投與。在一些情況下，溶液可為水。將藉由經口管飼向大鼠投與顆粒懸浮液。將向四隻大鼠投與各不同螢光標記之藥物及配方組合。將向另外四隻大鼠投與含有相同總量的未調配為顆粒之螢光標記之藥物的溶液。在投與螢光標記之藥物之前及投藥之後0.5小時、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時及24小時處，將對各四隻大鼠中之兩隻進行全身成像掃描。各治療組中之其餘的兩隻大鼠將在4小時及12小時處處死且將收集腸以確認藥物濃度。實例 6
在此實例中，將來自配方37-49 (hGH/SEQ ID NO: 3/Eudragit FS)之顆粒注射至活體內模型中以評估活體內胞吞轉運。藉由腔內注射以34 µg/Kg之劑量向大鼠投與配方37-49顆粒。
使用12/12小時光/暗循環在每籠圈養3-5隻雄性威斯塔大鼠(Wistar rat)，且該等雄性威斯塔大鼠在置於研究中時為225-275 g (大致6-8週大)。在光照階段期間使用非恢復方案進行所有實驗，該方案使用連續異氟醚麻醉。4-5 cm腹正中切口暴露空腸中段區域。在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中製備呈3.86×10- 5 M之配方37-49顆粒的儲備溶液，其中藉由使用29規格針頭腔內注射(ILI)來投與50 µL (每250 g大鼠)。用永久性標記來標記注射部位腸系膜。在研究終止時，將捕獲經標記腸區段之3-5 mm區域分離且處理以用於顯微評估。
在注射之後的一系列時間點處處死注射動物且收集腸且切片。製備腸之注射區域的切片且藉由免疫螢光法來觀測。在15分鐘處開始可見顆粒吸收，相比之下，對於cholix構築體在1-5分鐘可見。如圖 7A 中所見，hGH (綠色)及cholix (紅色)起初在注射後15分鐘處在很大程度上共定位(黃色)，在隨後的時間點可見更多游離hGH，如在圖 7B - D 中，分別在注射之後30分鐘、45分鐘及60分鐘所見。
為了進一步評估藥物遞送，藉由空腸內注射以1.93 nmol/Kg之劑量向三隻大鼠(動物A、B及C)遞送hGH SEQ ID NO: 3奈米顆粒，產生約43 µg/Kg hGH之劑量，及每隻大鼠11 µg hGH之總量。在注射後0、30、45、60、75、90、105及120分鐘處收集血清樣品。在120分鐘之後，處死動物且收集腸及肝臟。圖 8 展示動物A之血清hGH濃度。可見血清hGH濃度快速上升，在投藥之後約40分鐘達到4 ng/mL之峰值，且保持高於3.5 ng/mL直至投藥後至少75分鐘。動物B及C不具有可偵測含量之血清hGH。在動物一之血清及腸中偵測到hGH，且在動物B之腸中但未在血清中偵測到hGH。在動物C之血清或腸中均未偵測到hGH，且在120分鐘時間點處在任一隻動物之肝臟中均未偵測到hGH。實例 7
在此實例中，將含有hGH之顆粒施加至Caco-2細胞以評估轉運穿過細胞。Caco-2細胞為人類結腸上皮癌細胞株，其可用作人類腸道之藥物及其他化合物吸收的模型。當以單層形式培養時，Caco-2細胞分化且在以單層形式培養時在細胞之間形成緊密連接。此單層可用作化合物之細胞旁移動的模型。Caco-2細胞表現轉運蛋白、流出蛋白及II期結合酶以模擬多種跨細胞路徑。在一些情況下，Caco-2細胞單層可用作人類腸上皮細胞之模擬物。
將Caco-2細胞以1.5×105 個細胞/毫升接種於跨孔(transwell)中。在頂室(0.5 mL)及底外側室(1.5 mL)中每2天更換培養基。在細胞生長21天之後進行實驗且形成功能緊密的單層，如藉由跨上皮電阻(TEER)所評估。在第21天，用PBS洗滌跨孔一次。將100 μL含有hGH顆粒之懸浮液添加至頂室中。向底室添加0.5 mL PBS。在37℃下2小時之後，收集來自底外側室之溶液且濃縮。使用西方墨點法評估轉運穿過組織之hGH。藉由1D凝膠電泳在4-12% NuPAGE凝膠(BioRad，目錄號5678095)中分離蛋白質。將分離之蛋白質轉移至PVDF膜(BioRad，目錄號1704157)，與山羊抗hGH多株抗體(1:1000，R&D AF1067)，接著與AP結合之二次兔抗山羊抗體(1:10000，Abcam ab6742)一起培育。使用AP西方墨點法受質(Promega S3841)觀測到蛋白帶。表 2 ：圖 9 中描繪之顆粒組合物
配方編號 噴霧乾燥配方 藥物含量(w/w)
37-49 hGH/Eudragit FS/SEQ ID NO: 3/Tween20/ZnCl2 0.34%
37-155 *hGH/Eudragit FS/SEQ ID NO: 3/Tween20/ZnCl2 0.38%
37-168 37-49 Batch 2 0.30%
37-233 hGH/Eudragit FS/SEQ ID NO: 3/Tween20/ZnCl2 1.77%
實例 8
在此實例中，藉由混合如表 3 及表 4 中所指示之SEQ ID NO: 3、陽離子及艾塞那肽產生若干不同微米顆粒。藉由HPLC分析由此產生之顆粒以確定微米顆粒中之各組分的實際量。表 3 ： 用於產生顆粒之組分，及顆粒分析
   配方代碼 SEQ ID NO: 3(mg) 艾塞那肽(mg) 陽離子 (mg) SEQ ID NO: 3之含量% 艾塞那肽之含量 % SEQ ID NO: 3 (莫耳比) 艾塞那肽(莫耳比) 陽離子(莫耳比)
1 019-08-E1 5   5 鋅 1 65.1 4.5 1 7.16 32.68
2 019-08-E2 5  5 鋅 2 68.9 5.4 1 7.16 65.36
3 019-08-E3 5   5 鋅 5 59.0 11.3 1 7.16 163.39
4 019-08-E4 5  5 鋅 10 72.2 0.0 1 7.16 326.79
5 019-08-E5 5  5 鋅 20 57.5 3.4 1 7.16 653.57
6 019-08-E6 2.5  2.5 魚精蛋白 0.2 19.7 2.1 1 7.16 0.04
7 019-08-E7 2.5  2.5 魚精蛋白 0.4 7.3 2.8 1 7.16 0.09
8 019-08-E8 2.5  2.5 魚精蛋白 0.8 23.5 5.2 1 7.16 0.18
9 019-08-E9 2.5  2.5 魚精蛋白 2 17.1 3.1 1 7.16 0.45
10 019-08-E10 2.5  2.5 魚精蛋白 4 4.9 1.0 1 7.16 0.89
表 4 ： 用於產生顆粒之組分，及顆粒分析
   配方代碼 SEQ ID NO: 3之量(mg) 艾塞那肽之量(mg) Zn/Pro 之量(mg) SEQ ID NO: 3 之% % Exe SEQ ID NO: 3 (莫耳比) 艾塞那肽 ( 莫耳比) Zn / 魚精蛋白( 莫耳比)
11 019-08-E11 0.058 5 鋅 10 0.42 13.58 1 617.06 28171.33
12 019-08-E12 0.116 5 鋅 10 0.61 12.75 1 308.53 14085.67
13 019-08-E13 0.29 5 鋅 10 1.42 14.25 1 123.41 5634.27
14 019-08-E14 0.58 5 鋅 10 19.08 27.83 1 61.71 2817.13
15 019-08-E15 1.16 5 鋅 10 11.67 12.25 1 30.85 1408.57
16 019-08-E16 0.058 5 魚精蛋白 10 20.75 14.11 1 617.05 1.12
17 019-08-E17 0.116 5 魚精蛋白 10 0.43 12.00 1 14.32 1.12
18 019-08-E18 0.29 5 魚精蛋白 10 3.25 19.75 1 14.32 1.12
19 019-08-E19 0.58 5 魚精蛋白 10 0.90 11.17 1 14.32 1.12
20 019-08-E20 1.16 5 魚精蛋白 10 17.83 9.17 1 14.32 1.12
藉由在不同pH溶液中培育顆粒至多18小時來評估艾塞那肽自以上產生之顆粒的活體外釋放。藉由逆相液相層析(RPLC，圖 10A 及圖 10B )或尺寸排阻層析(SEC，圖 10C 及圖 10D )來定量釋放之艾塞那肽的量。如圖 10A - D 中所見，組合物形成pH穩定混合物。實例 9
為了確定不同SEQ ID NO: 3及艾塞那肽之胰酶穩定性，將複合物與胰酶一起培育0、30、60或120分鐘，如先前所描述。圖 11A - C 展示不同組合物在不同時間點處剩餘的SEQ ID NO: 3(約30,162 da)、艾塞那肽(約7,000 da)及魚精蛋白(約4,186 da)之量。下表 5 、表 6 及表 7 展示圖 11A - C 中之各通道的配方及時間點。表 5 ：圖 11A 中之通道的描述
通道 配方：載體:鋅:艾塞那肽之比 時間點(分鐘) 通道 配方：載體:鋅:艾塞那肽之比 時間點(分鐘)
1 1:0:0 0 9 1:1:1 0
2 30 10 30
3 60 11 60
4 120 12 120
5 1:1:0 0 13 1:2:1 0
6 30 14 30
7 60 15 60
8 120 16 120
表 6 ：圖 11B 中之通道的描述
通道 配方：載體:魚精蛋白:艾塞那肽之比 時間點(分鐘) 通道 配方：載體:魚精蛋白:艾塞那肽之比 時間點(分鐘)
1 0:0:1 0 9 1:0.16:1 0
2 30 10 30
3 60 11 60
4 120 12 120
5 0:1:1 0 13 1:0.8:1 0
6 30 14 30
7 60 15 60
8 120 16 120
表 7 ：圖 11C 中之通道的描述
通道 配方：載體:鋅:艾塞那肽之比 時間點(分鐘)
1 0:1:1 0
2 30
3 60
4 120
圖 12A - C 展示自cholix、FITC標記之艾塞那肽及鋅產生之微米顆粒的共聚焦影像。在各影像上展示20 µm比例尺。在圖 13 中示出大約100個顆粒之尺寸分佈。微米顆粒之平均尺寸為約5 µm±2µm。
為了確定顆粒胞吞轉運穿過人類SMI-100細胞之能力，如表 8 中所概述地製備顆粒。將所得顆粒溶解於10 mL PBS中，且將100 μL溶液添加至細胞的頂面上，且將500 μL PBS添加至底室中。在37℃下1小時之後，基底溶液中之蛋白質經濃縮且藉由西方墨點法進行分析。藉由HPLC定量基底溶液中之艾塞那肽。如圖 14 中所見，及表 8 中所概述，在6個測試之配方中觀測到胞吞轉運。E0為不具有蛋白質之對照，且EP9不溶解於PBS中。在包含鋅且不包含魚精蛋白在顆粒(E11、E13及E14)中可見較高含量之艾塞那肽轉運。表 8 ： 胞吞轉運分析中所用之配方
配方 SEQ ID NO: 3 (mg) 艾塞那肽 (mg) 陽離子(mg) SEQ ID NO: 3 之% 艾塞那肽之 % 艾塞那肽之底外側濃度 (ng/mL)
E0 0 35 鋅 2 0 35 0
E9 2.5 2.5 魚精蛋白 2 17.1 3.1 0
E6 2.5 2.5 魚精蛋白 0.2 19.7 2.1 0
E16 0.058 5 魚精蛋白 10 20.8 14.1 3
E18 0.29 5 魚精蛋白 10 3.25 19.8 3
E11 0.058 5 鋅 10 0.42 13.6 4
E13 0.29 5 鋅 10 1.42 14.3 7
E14 0.58 5 鋅 10 19.1 27.8 8
實例 10 ：活體內研究
選擇配方用於活體內測試。以更大規模製備此等配方且如前所述地分析樣品之含量及純度。在表 9 中示出配方細節及分析測試結果。在典型製備中，將包含Cholix載體SEQ ID NO: 3 (或若無Cholix，則用水替代)之溶液與艾塞那肽溶液在攪拌器盤上混合一分鐘。將鋅或魚精蛋白溶液逐滴添加至攪拌溶液。在攪拌15分鐘之後，將整體溶液/懸浮液凍乾。藉由相同方法使用螢光素標記之艾塞那肽製備三個額外配方；此等配方概述於表10 中。藉由固相肽合成將離胺酸側鏈上之螢光素添加至艾塞那肽之N端。表 9 ： 艾塞那肽、Cholix (SEQ ID NO: 3)及陽離子之配方
   配方代碼 SEQ ID NO: 3之量(mg) 艾塞那肽之量 (mg) Zn/Pro 之量(mg) % SEQ ID NO: 3 %艾塞那肽 %純度
0 019-08-E10 0 10 鋅 20 0 13.45 ＞95
13 019-08-E13 0.58 10 鋅 20 3.10 37.68 ＞95
14 019-08-E14 1.16 10 鋅 20 4.57 24.7 ＞95
18 019-08-E18 0.58 10 魚精蛋白 20 2.75 35.65 ＞95
10 019-08-E10 0 10 鋅 20         
表 10 ：用艾塞那肽-螢光素製備之配方
配方    組分 % SEQ ID NO: 3 %艾塞那肽
019-10-E0 FITC 艾塞那肽-螢光素+ Zn (1:2) 0 13.45
019-10-E14 FITC SEQ ID NO: 3 + 艾塞那肽-螢光素 + Zn (0.116:1:2) 4.57 24.7
019-10-E18 FITC SEQ ID NO: 3 + 艾塞那肽-螢光素 + Pro (0.058:1:2) 2.75 35.65
製備配方中所用之各粉末的純度為：艾塞那肽含量%約89.0%且SEQ ID NO: 3含量%約71.8%，其藉由計算自尺寸排阻層析(SEC)觀測之相對峰面積%來確定。
進行胰酶分析以確定不同配方之穩定性；結果在圖 17A 及圖 17B 中可見。樣品係使用4-20% Citerion TGX免染預製凝膠(Bio-Rad，5678094)、Precision Plus未染色標準物(Bio-Rad，161-0375)分析且藉由ThermoFisher Gel Scanner分析。配方E14、E18、E14-FITC及E18-FITC全部顯示SEQ ID NO: 3極少降解，甚至在暴露於胰酶2小時之後亦如此。圖 18 展示逆相層析圖(RPLC)，該層析圖展示在6.8分鐘之滯留時間處存在SEQ ID NO: 3且在7.5分鐘處存在艾塞那肽。亦在一系列不同pH值處評估此等配方之水溶性。如圖 19 中所見，FITC配方之可溶性低於非FITC配方。配方E14在pH 1處展示低溶解度且在pH 7及更大pH處展示高溶解度。配方E0亦在pH 1處展示低溶解度且在pH 5及更大pH處展示高溶解度。
為了評估活體內藥物動力學及藥效動力學，將顆粒懸浮於PBS中且將100 µL之各懸浮液注射至大鼠腸腔中。四隻大鼠用於各配方，且配方經懸浮以對於E14及E18產生10 µg劑量之艾塞那肽，且對於E0產生0 µg艾塞那肽。在注射之後15、30、45、60及90分鐘處獲取100 µL血液樣品。使血液凝塊且接著離心以製備血清，藉由ELISA來量測艾塞那肽濃度。如圖 20 中所見，在注射E14及E18二者之動物的血清中偵測到艾塞那肽。E18配方產生更高的最大血清濃度及更高的曲線下面積。E14配方之Cmax為17.3 ng/mL，且E18配方之Cmax為35.7 ng/mL。E14之Tmax為60分鐘，且E18之Tmax為45分鐘。任何動物之血糖量中均未見到相對於基線之變化。作為比較，將等效量之艾塞那肽靜脈內注射至大鼠中且評估血清濃度，參見圖 21 。在表 11 中比較經腸遞送之E14、E18及靜脈內遞送之艾塞那肽的藥物動力學。表 11 . 藥物動力學。
配方 Cmax (ng/mL) AUC (ng/mL × min) 相對可用性 ( % )
IV 465.0 27250 100
E14 20.2 996.3 3.66
E18 40.6 1386 5.09
實例 11 ：製備包含艾塞那肽之組合物
艾塞那肽(SEQ ID NO: 11)為藉由C端胺及N端H穩定的具有GLP-1樣生物活性之肽。在此實例中，製備兩種非天然存在之經分離構築體，其包含：1)具有SEQ ID NO: 78之載體，其加工為具有SEQ ID NO: 70之載體且交聯至SEQ ID NO: 11，及2)具有SEQ ID NO: 77之載體，其加工為具有SEQ ID NO: 80之載體且交聯至SEQ ID NO: 11，且測試活體內腸上皮轉運。如本文所述地製備具有SEQ ID NO: 80及SEQ ID NO: 70之載體，且艾塞那肽(SEQ ID NO: 11) (目錄號HOR-246)係購自ProSpec-Tany Technogene Ltd. PO Box 6591, East Brunswick, NJ 08816。自ThermoFisher購得包含Sulfo-SMCC交聯劑之PierceTM 可控蛋白質-蛋白質交聯套組(目錄號23456)。負載物及載體活化及交聯：
將艾塞那肽(10 mg)溶解於5 mL H2 0中以形成2 mg/mL溶液。將Sulfo-SMCC (2 mg)溶解於2 mL之PBS中。緊隨其後，將0.088 mL (約5倍莫耳過量)之Sulfo-SMCC溶液添加至1.0 mL艾塞那肽溶液，且在室溫下培育30分鐘。藉由將1.0 mL之順丁烯二醯亞胺艾塞那肽反應混合物施加至藉由PBS平衡之去鹽管柱來移除未反應之Sulfo-SMCC，用PBS溶離，且收集0.5 mL溶離份。量測在280nm之各溶離份下之吸收以定位蛋白質峰值。混合含有大部分蛋白質之峰值溶離份。混合活化艾塞那肽之濃度藉由將其在280 nm下之吸收與原始蛋白質溶液之吸收進行比較來測定。
具有SEQ ID NO: 77及SEQ ID NO: 78之載體具有C端延長，該C端延長包含由形成二硫鍵及C端His6 標籤之兩個半胱胺酸殘基側接的TEV裂解位點。使用標準方法在HisTrap管柱上純化具有SEQ ID NO: 77及SEQ ID NO: 78之載體。在pH 7.4下，藉由在30℃下用2 μl之0.1M二硫蘇糖醇及5 μl之TEV蛋白酶處理兩小時來活化PBS中之2 mg蛋白質(10 mg/ml之200 μL)。將裂解及降低之蛋白質施加至藉由PBS平衡之1-ml HisTrap管柱。C端片段結合至管柱，且在流通物中收集在C端附近具有游離半胱胺酸之活化N端SEQ ID NO: 80或SEQ ID NO: 70產物。
以相等莫耳量將順丁烯二醯亞胺活化之艾塞那肽與載體(巰基-SEQ ID NO: 80蛋白質或巰基-SEQ ID NO: 70蛋白質)混合，且隨後在室溫下培育60分鐘。在經Coomassie染色之SDS凝膠上評估SMCC交聯之SEQ ID NO: 70-艾塞那肽複合物之純度。複合物大約為恰當分子量且具有＞90%純度(圖22)。隨後在4℃下儲存交聯遞送構築體。實例 12 ： 艾塞那肽遞送構築體之活體內胞吞轉運 ：
如下地測試來自實例11之遞送構築體的腸上皮轉運：使野生型Sprague Dawley®大鼠(約200-250公克，約6週齡，購自Charles River)禁食隔夜以將其腸清空。製備以下材料：含有4%甲醛之微量離心套管、用於組織保藏之套管、用於血液收集之微量離心套管、用於血清收集之微量離心套管、PBS及測試物品。藉由使用異氟醚麻醉且剃削其腹部來準備動物以用於實驗。為各動物製備四次注射液(每空腸2次且每結腸2次)。打開腹腔。用區別性顏色定位且標記注射部位。將測試物品緩慢注射至內腔中，對於結腸在10分鐘內，且空腸40分鐘。動物每次注射接受35 μg之呈1 μg/μL之濃度的蛋白質。在50分鐘時將動物安樂死。經由心臟穿刺收集最終血液。將空腸及結腸移除，且置於塑膠襯裡工作表面上。使用PBS沖洗空腸及結腸之內容物且捨棄。自注射部位切除1 cm長度之腸道。將所切除組織切割一半。將一個區段置於4%甲醛中。隨後縱向切開殘留組織且立即置於微量離心套管中並冷凍。對所有注射部位重複此過程。移除肝(約1cm3 )且分割為2片。對於儲存，將肝之一個區段置於甲醛中且立即冷凍第二區段。在注射之後40分鐘收集腸、肝與血清樣品。離心血液樣品，且將所得血清轉移至容器以用於儲存。將樣品轉運於乾冰上且在-80℃下儲存。給藥策略如下：  SEQ ID NO: 70-艾塞那肽    100 µL，490 pmol / 29.4 µg (4.9 μM) SEQ ID NO: 80-艾塞那肽   100 µL，490 pmol / 30.9 µg (4.9 μM) SEQ ID NO: 11                 100 µL，490 pmol / 2 µg (4.9 μM)
使用腸促胰島素類似物-4 ELISA套組(Phoenix Pharma，目錄號EK-070-94)如下地進行SEQ ID NO: 70-艾塞那肽、SEQ ID NO: 80-艾塞那肽及SEQ ID NO: 11 (艾塞那肽)之腸上皮轉運的生物分析性分析：自Brains On-line獲得組織樣品；將300 μL分析緩衝液(1×)添加至含有組織樣品之各管中；將組織自分析緩衝液移除且置於無菌、清潔的細胞培養蓋盤上；用細胞刮刀輕輕地刮下腸樣品，注意避免收集腸系膜；以類似方式處理肝樣品，另外進行浸解及均質化；將所得細胞勻漿轉移回初始管中；其餘的組織樣品及操作區域用100 μL緩衝液(2×)沖洗；將細胞勻漿溶液在最大力下離心5分鐘；將上清液施加至ELISA盤，其係根據製造商說明書處理；將其餘的上清液儲存於-20℃下以便後續使用。
如圖23中所描繪，在10分鐘及40分鐘處觀測到SEQ ID NO: 70-艾塞那肽及SEQ ID NO: 80-艾塞那肽均轉運穿過腸上皮細胞。此外，以比單獨的SEQ ID NO: 11 (艾塞那肽)更高的速率轉運SEQ ID NO: 70-艾塞那肽及SEQ ID NO: 80-艾塞那肽兩者，尤其在40分鐘時。實例 13 ： 具有艾塞那肽負載物之遞送構築體的葡萄糖調節活性
用於測試SEQ ID NO: 70-艾塞那肽之葡萄糖刺激模型經設計以檢查GLP-1樣活性增強自葡萄糖漂移恢復之速率的能力。IP注射之葡萄糖用於激發葡萄糖漂移事件且藉由IP注射遞送之艾塞那肽用作陽性對照，該陽性對照關於與針對假IP注射對照所觀測的作用時序及程度相對的作用時序及程度。
葡萄糖刺激測試中所用之雄性CD1小鼠為9-16週齡。為了最小化由處理所致之應激，使動物在實驗開始之前的1週內適應環境、血液取樣及給藥程序，因為血漿葡萄糖可對處理應激起反應。小鼠在研究之前禁食18小時。在研究之前對動物稱重。所有動物均在藉由腹膜內(IP)注射接受2 mg/kg劑量之D-葡萄糖溶液(於50 µL無菌PBS中)之前獲取基線血糖讀數。動物接著接受IP注射之10 mg SEQ ID NO: 14 (陽性對照)、經口管飼之於200 µl 0.2 M NaHCO3 (pH 8.5)中含有10 mg SEQ ID NO: 14之測試治療劑或經口管飼之200 µl 0.2 M NaHCO3 (陰性對照)。在t=0、15、30、45、60分鐘；2、3及4小時處獲取血液樣品。使用5 µL獲自尾部之血液樣品，用商業血糖儀進行血糖量測，該商業血糖儀在研究開始之前用葡萄糖標準物校正。
在圖24中示出接受三種不同治療之動物之血糖含量的時間-濃度分佈。血糖漂移之校正在早至10 µg IP注射之商業艾塞那肽(1-40)-Gly之後15分鐘開始，截至120分鐘完成校正輪廓。經口管飼之SEQ ID NO: 70-艾塞那肽(10 mg)產生類似的血糖時間-濃度模式。相比之下，陰性對照小鼠達成高2倍的血糖含量，其需要約4小時以完全恢復至基線。此等結果表明SEQ ID NO: 70載體序列能夠促進生物活性艾塞那肽之上皮細胞胞吞轉運，足以在此葡萄糖刺激模型中獲得藥效學結果。實例 14 ： 藉由具有艾塞那肽負載物之遞送構築體進行 GLP - 1 受體 活化
SEQ ID NO: 71為包含N端腸促胰島素類似物-4 (SEQ ID NO: 14)域、間隔子(SEQ ID NO: 79)及C端載體(SEQ ID NO: 73)的融合蛋白遞送構築體。SEQ ID NO: 83為包含N端載體(SEQ ID NO: 67)、間隔子(SEQ ID NO: 79)及C端腸促胰島素類似物-4 (SEQ ID NO: 14)域的融合蛋白遞送構築體。PathHunter® β-抑制蛋白G蛋白偶合受體(GPCR)分析(DiscoverRx)係用於分析SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 11 (艾塞那肽)及M+SEQ ID NO: 65結合GLP-1受體之能力。在PathHunter分析中，配體結合活化GLP-1受體且使得將β-抑制蛋白募集至受體。使用基於酶片段互補之信號增益分析來偵測受體之活化狀態。將β-半乳糖苷酶(β-Gal)分成兩個片段，酶供體(ED)及酶受體(EA)。獨立地，此等片段不具有活性。然而，當藉由蛋白複合物裝配結合在一起時，其彼此互補以形成活性β-Gal酶。GLP-1受體用ED片段標記且共表現於穩定表現用EA標記之β-抑制蛋白的細胞中。藉由活化之經ED標記之GLP-1受體募集經EA標記之β-抑制蛋白將EA及ED域結合在一起以復原β-Gal酶活性，其可藉由發光產物釋放來偵測。圖25說明SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 71結合受體。相對於SEQ ID NO: 71，SEQ ID NO: 83展示降低的活性。
雖然已在本文中展示並描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見，此等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不背離本發明之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文所述之本發明之實施例之各種替代方案可在實踐本發明時使用。預期以下申請專利範圍界定本發明之範圍，且因此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範圍內的方法及結構。表 12. 序列
SEQ ID NO 序列  
1    VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK  
2    VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQA  
3    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGSGGSGGGGSGGGGSPRRRRSSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRRHHHHHH  
4    GGGGSGGGGSGGGG  
5    MFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF  
6    VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIES  
7    X1-E-X3-X4-L-X6-I-F-D-E-C-R-S-P-C-X16-L-T-P-E-X21-G-K-X24-I-Q-S-K-L-X30-I-P-X33-D-V-V-L-D-E-G-V-L-Y-Y-S-M-T-I-N-D-E-Q-N-D-I-X56-D-E-X59-K-G-E-S-I-I-T-X67-G-E-F-A-T-X73-R-A-T-R-H-Y-V-X81-Q-D-A-P-F-G-V-I-X90-L-D-I-T-T-E-N-G-T-K-X101-Y-S-X104-N-R-K-X108-X109-E-F-X112-I-X114-W-L-V-X118-X119-G-E-D-S-P-A-S-I-K-I-S-X131-D-E-X134-D-Q-X137-R-N-I-I-E-V-P-K-L-Y-S-I-D-L-D-N-Q-T-L-E-Q-W-X160-X161-Q-G-N-V-X166-F-X168-V-T-R-P-E-X174-X175-I-A-I-S-W-P-S-V-S-Y-X186-A-A-X189-K-X191-G-X193-R-H-K-R-W-A-X200-W-X202-T-X204-X205-X206-X207-X208-X209-L-X211-X212-X213-X214-X215-X216-X217-X218-X219-X220-X221-X222-X223-X224-C-T-X227-G-X229-X230-W-X232-G-G-X235-Y-X237-T-V-A-G-X242-P-X244-X245-I-X247-V-K-Q-G-X252-E-Q-K-X256-V-E-Q-R-I-H-F-S-X265-X266-N-A-X269-X270-X271-L-A-A-H-R-V-C-G-V-P-L-E-T-L-A-R-X288-R-K-P-R-X293-L-X295-D-D-L-X299-C-X301-Y-X303-A-Q-X306-I-V-S-L-F-X312-A-T-R-X316-L-F-X319-H-X321-D-S-X324-F-T-L-N-L-X330-X331-Q-X333-P-X335-V-X337-E-R-L-X341-X342-X343-R-X345-I-N-E-X349-N-P-G-X353-V-X355-Q-V-L-T-X360-A-R-Q-I-Y-N-D-Y-V-T-X371-H-P-X374-L-X376-P-E-Q-T-S-A-X383-A-Q-A-A-D-I-L-S-L-X393-X394-P-D-X397-D-X399-X400-C-V-A-X404-X405-X406-D-Q-A-N-I-N-X413-E-S-R-S-G-R-S-Y-L-X423-E-N-R-A-V-I-T-X431-Q-G-V-T-N-W-T-Y-Q-E-L-X443-X444-X445-H-Q-X448-L-T-X451-E-X453-Y-V-F-V-G-Y-H-G-T-N-H-X465-A-A-Q-X469-I-V-N-R-I-X475-P-V-P-R-G-X481-X482-T-E-X485-E-X487-X488-W-G-G-X492-Y-V-X495-T-X497-A-X499-X500-X501-X502-X503-Y-X505-R-X507-X508-X509-G-T-X512-X513-X514-X515-X516-X517-T-X519-X520-X521-X522-X523-X524-R-G-V-M-L-X530-V-Y-X533-X534-X535-A-S-L-E-R-F-Y-R-X544-N-X546-X547-L-E-X550-X551-X552-X553-X554-X555-X556-X557-V-I-G-H-X562-L-P-L-R-N-E-A-F-T-G-X573-X574-X575-X576-X577-G-X579-X580-E-T-X583-I-G-W-D-X588-A-I-X591-X592-V-A-I-P-S-T-I-P-G-N-X603-Y-X605-X606-L-X608-X609-X610-E-E-A-X614-A-X616-E-Q-S-I-S-X622-K-P-P-Y-K-E-X629-X630-D-E-L-K；其中X1選自由V及L組成之群；X3選自由E及D組成之群；X4選自由A及E組成之群；X6選自由N及K組成之群；X16選自由S及L組成之群；X21選自由P及L組成之群；X24選自由P及Q組成之群；X30選自由S及F組成之群；X33選自由S及G組成之群；X56選自由K及M組成之群；X59選自由D及G組成之群；X67選自由I及F組成之群；X73選自由V及I組成之群；X81選自由N及S組成之群；X90選自由H及N組成之群；X101選自由T及M組成之群；X104選自由Y及F組成之群；X108選自由E及D組成之群；X109選自由G及S組成之群；X112選自由A及T組成之群；X114選自由N及H組成之群；X118選自由P及I組成之群；X119選自由I及P組成之群；X131選自由V及I組成之群；X134選自由L及I組成之群；X137選自由Q及K組成之群；X160選自由K及E組成之群；X161選自由T及N組成之群；X166選自由S及F組成之群；X168選自由S及A組成之群；X174選自由H及Q組成之群；X175選自由N、S、SIAKQS及SIAKQSIAKQS組成之群；X186選自由K及N組成之群；X189選自由Q、E及H組成之群；X191選自由以下E、N及D之群；X193選自由S及A組成之群；X200選自由H及N組成之群；X202選自由H、L、F及R組成之群；X204選自由G及T組成之群；X205選自由L及S組成之群；X206選自由A及P組成之群；X207選自由L、E及K組成之群；X208選自由C及V組成之群；X209選自由W、V及T組成之群；X211選自由V及無胺基酸組成之群；X212選自由P及無胺基酸組成之群；X213選自由M、I、L及無胺基酸組成之群；X214選自由D及無胺基酸組成之群；X215選自由A及無胺基酸組成之群；X216選自由I及無胺基酸組成之群；X217選自由Y及C組成之群；X218選自由N及F組成之群；X219選自由Y及F組成之群；X220選自由I及E組成之群；X221選自由T及D組成之群；X222選自由Q及P組成之群；X223選自由Q、E及A組成之群；X224選自由N、L及Q組成之群；X227選自由L及Y組成之群；X229選自由D及E組成之群；X230選自由N及D組成之群；X232選自由F、H及Y組成之群；X235選自由S及A組成之群；X237選自由E及K組成之群；X242選自由T及I組成之群；X244選自由K、E及G組成之群；X245選自由V及A組成之群；X247選自由T及M組成之群；X252選自由I及M組成之群；X256選自由P、T及A組成之群；X265選自由K、Q及N組成之群；X266選自由G及K組成之群；X269選自由M及I組成之群；X270選自由S及E組成之群；X271選自由A及T組成之群；X288選自由S及G組成之群；X293選自由D及Y組成之群；X295選自由T、P及Q組成之群；X299選自由S及Q組成之群；X301選自由A及V組成之群；X303選自由Q及N組成之群；X306選自由N及Q組成之群；X312選自由V及L組成之群；X316選自由I及M組成之群；X319選自由S及T組成之群；X321選自由L及I組成之群；X324選自由V及I組成之群；X330選自由D、E及H組成之群；X331選自由E及G組成之群；X333選自由E及A組成之群；X335選自由E及A組成之群；X337選自由A及T組成之群；X341選自由S、D及T組成之群；X342選自由D及A組成之群；X343選自由L及I組成之群；X345選自由R及Q組成之群；X349選自由N及D組成之群；X353選自由M及V組成之群；X355選自由T及I組成之群；X360選自由V及I組成之群；X371選自由H及E組成之群；X374選自由G及L組成之群；X376選自由T及I組成之群；X383選自由G及S組成之群；X393選自由F及L組成之群；X394選自由C及Y組成之群；X397選自由A及T組成之群；X399選自由K、E及G組成之群；X400選自由S、P及H組成之群；X404選自由S及L組成之群；X405選自由N及D組成之群；X406選自由N及S組成之群；X413選自由I及V組成之群；X423選自由P及L組成之群；X431選自由P及Q組成之群；X443選自由E及D組成之群；X444選自由A及T組成之群；X445選自由T及K組成之群；X448選自由A及T組成之群；X451選自由R及Q組成之群；X453選自由G及D組成之群；X465選自由V及A組成之群；X469選自由T、S及N組成之群；X475選自由A、S及T組成之群；X481選自由N及S組成之群；X482選自由N及D組成之群；X485選自由N、S及K組成之群；X487選自由E、R及K組成之群；X488選自由K、A及E組成之群；X492選自由L及V組成之群；X495選自由A及S下組成之群；X497選自由H及D組成之群；X499選自由E及S組成之群；X500選自由V及L組成之群；X501選自由A及N組成之群；X502選自由H及Y組成之群；X503選自由G及R組成之群；X505選自由A及T組成之群；X507選自由I及L組成之群；X508選自由K及Q組成之群；X509選自由E及K組成之群；X512選自由G及A組成之群；X513選自由E、D及N組成之群；X514選自由Y、G、A及N組成之群；X515選自由G及E組成之群；X516選自由L及G組成之群；X517選自由P及L組成之群；X519選自由R、P及T組成之群；X520選自由A及E組成之群；X521選自由E及K組成之群；X522選自由R、Q及K組成之群；X523選自由D、K及E組成之群；X524選自由A、T及S組成之群；X530選自由R及K組成之群；X533選自由I及L組成之群；X534選自由P及H組成之群；X535選自由R及Q組成之群；X544選自由T及I組成之群；X546選自由T、A及I組成之群；X547選自由對及D組成之群；X550選自由N及K組成之群；X551選自由A及E組成之群；X552選自由E、R及D組成之群；X553選自由E、N及R組成之群；X554選自由H及L組成之群；X555選自由I及V組成之群；X556選自由T及E組成之群；X557選自由Q、R H及D組成之群；X562選自由S及P組成之群；X573選自由P及T組成之群；X574選自由E及D組成之群；X575選自由S、A及R組成之群；X576選自由A、E及V組成之群；X577選自由G、E及D組成之群；X579選自由E及S組成之群；X580選自由D及N組成之群；X583選自由V及A組成之群；X588選自由M及I組成之群；X591選自由H及Y組成之群；X592選自由A及G組成之群；X603選自由A及S組成之群；X605選自由E及A組成之群；X606選自由E、A、Q、G、V及R組成之群；X608選自由A、P及T組成之群；X609選自由I、T及P組成之群；X610選自由D及A組成之群；X614選自由V及VVKEAI組成之群；X616選自由K及E組成之群；X622選自由T、A及P組成之群；且X629選自由R、Q及H組成之群；且X630選自由K及無胺基酸組成之群。  
8    VLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKA  
9    GVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGL  
10    VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDL  
11 艾塞那肽(Byetta) H-HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnMetGluGluGluAlaValArgLeuPheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyProSerSerGlyAlaProProProSer-NH2  
12    LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK  
13    LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQA  
14 腸促胰島素類似物-4 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS  
15 利司那肽(Adlyxin) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK  
16 利拉魯肽 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEEFIAWLVRGRG (E21處之γ-E-棕櫚醯基)  
17 度拉糖肽 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG  
18 替度魯肽 HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD  
19 替度魯肽 H-HisGlyAspGlySerPheSerAspGluMetAsnThrIleLeuAspAsnLeuAlaAlaArgAspPheIleAsnTrpLeuIleGlnThrLysIleThrAsp-OH  
20 hGH FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF  
21 IL-22 APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI  
22 IL-10 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN  
23 前升糖素原 MKSIYFVAGLFVMLVQGSWQRSLQDTEEKSRSFSASQADPLSDPDQMNEDKRHSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIAKRHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELGRRHADGSFSDEMNTILD NLAARDFINWLIQTKITDRK  
24 升糖素前蛋白 RSLQDTEEKSRSFSASQADPLSDPDQMNEDKRHSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIAKRHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELGRRHADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDRK  
25 升糖素肽 HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT  
26 類升糖素肽1 (GLP-1) HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR  
27 類升糖素肽2 (GLP-2) HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD  
28 腸促胰島素類似物-3 HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS  
29 埃格納肽 4-咪唑并乙醯基-GEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWL-(K-PEG-Fc)-NGGPSSGAPPPS-NH2  
30 司美魯肽(Ozempic) HXEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG (acylated)  
31 GLP-1R促效劑(GIP之aa 1-37) YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWK  
32 GLP-1R促效劑(GIP之aa 7-36) ISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDW  
33 泰帕肽 YXEGTFTSDYSIXLDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS  
34 調酸素 HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNKNNIA  
35 抑胃多肽前蛋白 MVATKTFALLLLSLFLAVGLGEKKEGHFSALPSLPVGSHAKVSSPQPRGPRYAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQREARALELASQANRKEEEAVEPQSSPAKNPSDEDLLRDLLIQELLACLLDQTNLCRLRSR  
36 抑胃多肽(GIP) YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ  
37 GIPR促效劑(Des-Ala2-GIP1-30) YEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK  
38 GIPR促效劑-截短GIP1-30 YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK  
39 腸高血糖素 RSLQDTEEKSRSFSASQADPLSDPDQMNEDKRHSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA  
40 腸高血糖素相關多肽 RSLQDTEEKSRSFSASQADPLSDPDQMNED  
41 雙澱粉素降鈣素受體促效劑 Ac-CSNLSTCMLGRLSQDLHRLQTYPKTDVGANAP  
42 前胰島素原 MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN  
43 胰島素A鏈 GIVEQCCTSICSLYQLENYCN  
44 胰島素B鏈 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT  
45 門冬胰島素A鏈 GIVEQCCTSICSLYQLENYCN  
46 門冬胰島素B鏈 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT  
47 甘精胰島素A鏈 GIVEQCCTSICSLYQLENYCG  
48 甘精胰島素B鏈 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRR  
49 賴脯胰島素A鏈 GIVEQCCTSICSLYQLENYCN  
50 賴脯胰島素B鏈 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT  
51 胰島素受體受質1    MASPPESDGFSDVRKVGYLRKPKSMHKRFFVLRAASEAGGPARLEYYENEKKWRHKSSAPKRSIPLESCFNINKRADSKNKHLVALYTRDEHFAIAADSEAEQDSWYQALLQLHNRAKGHHDGAAALGAGGGGGSCSGSSGLGEAGEDLSYGDVPPGPAFKEVWQVILKPKGLGQTKNLIGIYRLCLTSKTISFVKLNSEAAAVVLQLMNIRRCGHSENFFFIEVGRSAVTGPGEFWMQVDDSVVAQNMHETILEAMRAMSDEFRPRSKSQSSSNCSNPISVPLRRHHLNNPPPSQVGLTRRSRTESITATSPASMVGGKPGSFRVRASSDGEGTMSRPASVDGSPVSPSTNRTHAHRHRGSARLHPPLNHSRSIPMPASRCSPSATSPVSLSSSSTSGHGSTSDCLFPRRSSASVSGSPSDGGFISSDEYGSSPCDFRSSFRSVTPDSLGHTPPARGEEELSNYICMGGKGPSTLTAPNGHYILSRGGNGHRCTPGTGLGTSPALAGDEAASAADLDNRFRKRTHSAGTSPTITHQKTPSQSSVASIEEYTEMMPAYPPGGGSGGRLPGHRHSAFVPTRSYPEEGLEMHPLERRGGHHRPDSSTLHTDDGYMPMSPGVAPVPSGRKGSGDYMPMSPKSVSAPQQIINPIRRHPQRVDPNGYMMMSPSGGCSPDIGGGPSSSSSSSNAVPSGTSYGKLWTNGVGGHHSHVLPHPKPPVESSGGKLLPCTGDYMNMSPVGDSNTSSPSDCYYGPEDPQHKPVLSYYSLPRSFKHTQRPGEPEEGARHQHLRLSTSSGRLLYAATADDSSSSTSSDSLGGGYCGARLEPSLPHPHHQVLQPHLPRKVDTAAQTNSRLARPTRLSLGDPKASTLPRAREQQQQQQPLLHPPEPKSPGEYVNIEFGSDQSGYLSGPVAFHSSPSVRCPSQLQPAPREEETGTEEYMKMDLGPGRRAAWQESTGVEMGRLGPAPPGAASICRPTRAVPSSRGDYMTMQMSCPRQSYVDTSPAAPVSYADMRTGIAAEEVSLPRATMAAASSSSAASASPTGPQGAAELAAHSSLLGGPQGPGGMSAFTRVNLSPNRNQSAKVIRADPQGCRRRHSSETFSSTPSATRVGNTVPFGAGAAVGGGGGSSSSSEDVKRHSSASFENVWLRPGELGGAPKEPAKLCGAAGGLENGLNYIDLDLVKDFKQCPQECTPEPQPPPPPPPHQPLGSGESSSTRRSSEDLSAYASISFQKQPEDRQ  
52 載脂蛋白A-II  MKLLAATVLLLTICSLEGALVRRQAKEPCVESLVSQYFQTVTDYGKDLMEKVKSPELQAEAKSYFEKSKEQLTPLIKKAGTELVNFLSYFVELGTQPATQ  
53 肝糖合酶1 MPLNRTLSMSSLPGLEDWEDEFDLENAVLFEVAWEVANKVGGIYTVLQTKAKVTGDEWGDNYFLVGPYTEQGVRTQVELLEAPTPALKRTLDSMNSKGCKVYFGRWLIEGGPLVVLLDVGASAWALERWKGELWDTCNIGVPWYDREANDAVLFGFLTTWFLGEFLAQSEEKPHVVAHFHEWLAGVGLCLCRARRLPVATIFTTHATLLGRYLCAGAVDFYNNLENFNVDKEAGERQIYHRYCMERAAAHCAHVFTTVSQITAIEAQHLLKRKPDIVTPNGLNVKKFSAMHEFQNLHAQSKARIQEFVRGHFYGHLDFNLDKTLYFFIAGRYEFSNKGADVFLEALARLNYLLRVNGSEQTVVAFFIMPARTNNFNVETLKGQAVRKQLWDTANTVKEKFGRKLYESLLVGSLPDMNKMLDKEDFTMMKRAIFATQRQSFPPVCTHNMLDDSSDPILTTIRRIGLFNSSADRVKVIFHPEFLSSTSPLLPVDYEEFVRGCHLGVFPSYYEPWGYTPAECTVMGIPSISTNLSGFGCFMEEHIADPSAYGIYILDRRFRSLDDSCSQLTSFLYSFCQQSRRQRIIQRNRTERLSDLLDWKYLGRYYMSARHMALSKAFPEHFTYEPNEADAAQGYRYPRPASVPPSPSLSRHSSPHQSEDEEDPRNGPLEEDGERYDEDEEAAKDRRNIRAPEWPRRASCTSSTSGSKRNSVDTATSSSLSTPSEPLSPTSSLGEERN  
54 肝糖合酶2 MLRGRSLSVTSLGGLPQWEVEELPVEELLLFEVAWEVTNKVGGIYTVIQTKAKTTADEWGENYFLIGPYFEHNMKTQVEQCEPVNDAVRRAVDAMNKHGCQVHFGRWLIEGSPYVVLFDIGYSAWNLDRWKGDLWEACSVGIPYHDREANDMLIFGSLTAWFLKEVTDHADGKYVVAQFHEWQAGIGLILSRARKLPIATIFTTHATLLGRYLCAANIDFYNHLDKFNIDKEAGERQIYHRYCMERASVHCAHVFTTVSEITAIEAEHMLKRKPDVVTPNGLNVKKFSAVHEFQNLHAMYKARIQDFVRGHFYGHLDFDLEKTLFLFIAGRYEFSNKGADIFLESLSRLNFLLRMHKSDITVMVFFIMPAKTNNFNVETLKGQAVRKQLWDVAHSVKEKFGKKLYDALLRGEIPDLNDILDRDDLTIMKRAIFSTQRQSLPPVTTHNMIDDSTDPILSTIRRIGLFNNRTDRVKVILHPEFLSSTSPLLPMDYEEFVRGCHLGVFPSYYEPWGYTPAECTVMGIPSVTTNLSGFGCFMQEHVADPTAYGIYIVDRRFRSPDDSCNQLTKFLYGFCKQSRRQRIIQRNRTERLSDLLDWRYLGRYYQHARHLTLSRAFPDKFHVELTSPPTTEGFKYPRPSSVPPSPSGSQASSPQSSDVEDEVEDERYDEEEEAERDRLNIKSPFSLSHVPHGKKKLHGEYKN  
55 酪胺酸蛋白磷酸酶非受體1型 MEMEKEFEQIDKSGSWAAIYQDIRHEASDFPCRVAKLPKNKNRNRYRDVSPFDHSRIKLHQEDNDYINASLIKMEEAQRSYILTQGPLPNTCGHFWEMVWEQKSRGVVMLNRVMEKGSLKCAQYWPQKEEKEMIFEDTNLKLTLISEDIKSYYTVRQLELENLTTQETREILHFHYTTWPDFGVPESPASFLNFLFKVRESGSLSPEHGPVVVHCSAGIGRSGTFCLADTCLLLMDKRKDPSSVDIKKVLLEMRKFRMGLIQTADQLRFSYLAVIEGAKFIMGDSSVQDQWKELSHEDLEPPPEHIPPPPRPPKRILEPHNGKCREFFPNHQWVKEETQEDKDCPIKEEKGSPLNAAPYGIESMSQDTEVRSRVVGGSLRGAQAASPAKGEPSLPEKDEDHALSYWKPFLVNMCVATVLTAGAYLCYRFLFNSNT  
56 RAC-α絲胺酸蘇胺酸-蛋白激酶 MSDVAIVKEGWLHKRGEYIKTWRPRYFLLKNDGTFIGYKERPQDVDQREAPLNNFSVAQCQLMKTERPRPNTFIIRCLQWTTVIERTFHVETPEEREEWTTAIQTVADGLKKQEEEEMDFRSGSPSDNSGAEEMEVSLAKPKHRVTMNEFEYLKLLGKGTFGKVILVKEKATGRYYAMKILKKEVIVAKDEVAHTLTENRVLQNSRHPFLTALKYSFQTHDRLCFVMEYANGGELFFHLSRERVFSEDRARFYGAEIVSALDYLHSEKNVVYRDLKLENLMLDKDGHIKITDFGLCKEGIKDGATMKTFCGTPEYLAPEVLEDNDYGRAVDWWGLGVVMYEMMCGRLPFYNQDHEKLFELILMEEIRFPRTLGPEAKSLLSGLLKKDPKQRLGGGSEDAKEIMQHRFFAGIVWQHVYEKKLSPPFKPQVTSETDTRYFDEEFTAQMITITPPDQDDSMECVDSERRPHFPQFSYSASGTA  
57 過氧化體增殖物活化受體γ MGETLGDSPIDPESDSFTDTLSANISQEMTMVDTEMPFWPTNFGISSVDLSVMEDHSHSFDIKPFTTVDFSSISTPHYEDIPFTRTDPVVADYKYDLKLQEYQSAIKVEPASPPYYSEKTQLYNKPHEEPSNSLMAIECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRLKLIYDRCDLNCRIHKKSRNKCQYCRFQKCLAVGMSHNAIRFGRMPQAEKEKLLAEISSDIDQLNPESADLRALAKHLYDSYIKSFPLTKAKARAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKSIPGFVNLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKSLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKLLQKMTDLRQIVTEHVQLLQVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLY  
58 己糖激酶3 MDSIGSSGLRQGEETLSCSEEGLPGPSDSSELVQECLQQFKVTRAQLQQIQASLLGSMEQALRGQASPAPAVRMLPTYVGSTPHGTEQGDFVVLELGATGASLRVLWVTLTGIEGHRVEPRSQEFVIPQEVMLGAGQQLFDFAAHCLSEFLDAQPVNKQGLQLGFSFSFPCHQTGLDRSTLISWTKGFRCSGVEGQDVVQLLRDAIRRQGAYNIDVVAVVNDTVGTMMGCEPGVRPCEVGLVVDTGTNACYMEEARHVAVLDEDRGRVCVSVEWGSFSDDGALGPVLTTFDHTLDHESLNPGAQRFEKMIGGLYLGELVRLVLAHLARCGVLFGGCTSPALLSQGSILLEHVAEMEDPSTGAARVHAILQDLGLSPGASDVELVQHVCAAVCTRAAQLCAAALAAVLSCLQHSREQQTLQVAVATGGRVCERHPRFCSVLQGTVMLLAPECDVSLIPSVDGGGRGVAMVTAVAARLAAHRRLLEETLAPFRLNHDQLAAVQAQMRKAMAKGLRGEASSLRMLPTFVRATPDGSERGDFLALDLGGTNFRVLLVRVTTGVQITSEIYSIPETVAQGSGQQLFDHIVDCIVDFQQKQGLSGQSLPLGFTFSFPCRQLGLDQGILLNWTKGFKASDCEGQDVVSLLREAITRRQAVELNVVAIVNDTVGTMMSCGYEDPRCEIGLIVGTGTNACYMEELRNVAGVPGDSGRMCINMEWGAFGDDGSLAMLSTRFDASVDQASINPGKQRFEKMISGMYLGEIVRHILLHLTSLGVLFRGQQIQRLQTRDIFKTKFLSEIESDSLALRQVRAILEDLGLPLTSDDALMVLEVCQAVSQRAAQLCGAGVAAVVEKIRENRGLEELAVSVGVDGTLYKLHPRFSSLVAATVRELAPRCVVTFLQSEDGSGKGAALVTAVACRLAQLTRV  
59 磷脂醯肌醇-3,4,5-三磷酸3-磷酸酶及雙特異性蛋白 MTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKV  
60 丙酮酸脫氫酶激酶1 MRLARLLRGAALAGPGPGLRAAGFSRSFSSDSGSSPASERGVPGQVDFYARFSPSPLSMKQFLDFGSVNACEKTSFMFLRQELPVRLANIMKEISLLPDNLLRTPSVQLVQSWYIQSLQELLDFKDKSAEDAKAIYDFTDTVIRIRNRHNDVIPTMAQGVIEYKESFGVDPVTSQNVQYFLDRFYMSRISIRMLLNQHSLLFGGKGKGSPSHRKHIGSINPNCNVLEVIKDGYENARRLCDLYYINSPELELEELNAKSPGQPIQVVYVPSHLYHMVFELFKNAMRATMEHHANRGVYPPIQVHVTLGNEDLTVKMSDRGGGVPLRKIDRLFNYMYSTAPRPRVETSRAVPLAGFGYGLPISRLYAQYFQGDLKLYSLEGYGTDAVIYIKALSTDSIERLPVYNKAAWKHYNTNHEADDWCVPSREPKDMTTFRSA  
61 含鈣結合域及捲曲螺旋域之蛋白1 MEESPLSRAPSRGGVNFLNVARTYIPNTKVECHYTLPPGTMPSASDWIGIFKVEAACVRDYHTFVWSSVPESTTDGSPIHTSVQFQASYLPKPGAQLYQFRYVNRQGQVCGQSPPFQFREPRPMDELVTLEEADGGSDILLVVPKATVLQNQLDESQQERNDLMQLKLQLEGQVTELRSRVQELERALATARQEHTELMEQYKGISRSHGEITEERDILSRQQGDHVARILELEDDIQTISEKVLTKEVELDRLRDTVKALTREQEKLLGQLKEVQADKEQSEAELQVAQQENHHLNLDLKEAKSWQEEQSAQAQRLKDKVAQMKDTLGQAQQRVAELEPLKEQLRGAQELAASSQQKATLLGEELASAAAARDRTIAELHRSRLEVAEVNGRLAELGLHLKEEKCQWSKERAGLLQSVEAEKDKILKLSAEILRLEKAVQEERTQNQVFKTELAREKDSSLVQLSESKRELTELRSALRVLQKEKEQLQEEKQELLEYMRKLEARLEKVADEKWNEDATTEDEEAAVGLSCPAALTDSEDESPEDMRLPPYGLCERGDPGSSPAGPREASPLVVISQPAPISPHLSGPAEDSSSDSEAEDEKSVLMAAVQSGGEEANLLLPELGSAFYDMASGFTVGTLSETSTGGPATPTWKECPICKERFPAESDKDALEDHMDGHFFFSTQDPFTFE  
62 Max樣蛋白X MTEPGASPEDPWVKASPVGAHAGEGRAGRARARRGAGRRGASLLSPKSPTLSVPRGCREDSSHPACAKVEYAYSDNSLDPGLFVESTRKGSVVSRANSIGSTSASSVPNTDDEDSDYHQEAYKESYKDRRRRAHTQAEQKRRDAIKRGYDDLQTIVPTCQQQDFSIGSQKLSKAIVLQKTIDYIQFLHKEKKKQEEEVSTLRKDVTALKIMKVNYEQIVKAHQDNPHEGEDQVSDQVKFNVFQGIMDSLFQSFNASISVASFQELSACVFSWIEEHCKPQTLREIVIGVLHQLKNQLY  
63 果糖-二磷酸醛縮酶A MPYQYPALTPEQKKELSDIAHRIVAPGKGILAADESTGSIAKRLQSIGTENTEENRRFYRQLLLTADDRVNPCIGGVILFHETLYQKADDGRPFPQVIKSKGGVVGIKVDKGVVPLAGTNGETTTQGLDGLSERCAQYKKDGADFAKWRCVLKIGEHTPSALAIMENANVLARYASICQQNGIVPIVEPEILPDGDHDLKRCQYVTEKVLAAVYKALSDHHIYLEGTLLKPNMVTPGHACTQKFSHEEIAMATVTALRRTVPPAVTGITFLSGGQSEEEASINLNAINKCPLLKPWALTFSYGRALQASALKAWGGKKENLKAAQEEYVKRALANSLACQGKYTPSGQAGAAASESLFVSNHAY  
64 二肽基肽酶4 MKTPWKVLLGLLGAAALVTIITVPVVLLNKGTDDATADSRKTYTLTDYLKNTYRLKLYSLRWISDHEYLYKQENNILVFNAEYGNSSVFLENSTFDEFGHSINDYSISPDGQFILLEYNYVKQWRHSYTASYDIYDLNKRQLITEERIPNNTQWVTWSPVGHKLAYVWNNDIYVKIEPNLPSYRITWTGKEDIIYNGITDWVYEEEVFSAYSALWWSPNGTFLAYAQFNDTEVPLIEYSFYSDESLQYPKTVRVPYPKAGAVNPTVKFFVVNTDSLSSVTNATSIQITAPASMLIGDHYLCDVTWATQERISLQWLRRIQNYSVMDICDYDESSGRWNCLVARQHIEMSTTGWVGRFRPSEPHFTLDGNSFYKIISNEEGYRHICYFQIDKKDCTFITKGTWEVIGIEALTSDYLYYISNEYKGMPGGRNLYKIQLSDYTKVTCLSCELNPERCQYYSVSFSKEAKYYQLRCSGPGLPLYTLHSSVNDKGLRVLEDNSALDKMLQNVQMPSKKLDFIILNETKFWYQMILPPHFDKSKKYPLLLDVYAGPCSQKADTVFRLNWATYLASTENIIVASFDGRGSGYQGDKIMHAINRRLGTFEVEDQIEAARQFSKMGFVDNKRIAIWGWSYGGYVTSMVLGSGSGVFKCGIAVAPVSRWEYYDSVYTERYMGLPTPEDNLDHYRNSTVMSRAENFKQVEYLLIHGTADDNVHFQQSAQISKALVDVGVDFQAMWYTDEDHGIASSTAHQHIYTHMSHFIKQCFSLP  
65 Cholix1-266 載體 VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKG  
66 Cholix1-266 載體 LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKG  
67 Cholix1-266 載體 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKG  
68 假單胞菌外毒素A基因 GTCGAAGAAGCTTTAAACATCTTTGATGAATGCCGTTCGCCATGTTCGTTGACCCCGGAACCGGGTAAGCCGATTCAATCAAAACTGTCTATCCCTAGTGATGTTGTTCTGGATGAAGGTGTTCTGTATTACTCGATGACGATTAATGATGAGCAGAATGATATTAAGGATGAGGACAAAGGCGAGTCCATTATCACTATTGGTGAATTTGCCACAGTACGCGCGACTAGACATTATGTTAATCAAGATGCGCCTTTTGGTGTCATCCATTTAGATATTACGACAGAAAATGGTACAAAAACGTACTCTTATAACCGCAAAGAGGGTGAATTTGCAATCAATTGGTTAGTGCCTATTGGTGAAGATTCTCCTGCAAGCATCAAAATCTCCGTTGATGAGCTCGATCAGCAACGCAATATCATCGAGGTGCCTAAACTGTATAGTATTGATCTCGATAACCAAACGTTAGAGCAGTGGAAAACCCAAGGTAATGTTTCTTTTTCGGTAACGCGTCCTGAACATAATATCGCTATCTCTTGGCCAAGCGTGAGTTACAAAGCAGCGCAGAAAGAGGGTTCACGCCATAAGCGTTGGGCTCATTGGCATACAGGCTTAGCACTGTGTTGGCTTGTGCCAATGGATGCTATCTATAACTATATCACCCAGCAAAATTGTACTTTAGGGGATAATTGGTTTGGTGGCTCTTATGAGACTGTTGCAGGCACTCCGAAGGTGATTACGGTTAAGCAAGGGATTGAACAAAAGCCAGTTGAGCAGCGCATCCATTTCTCCAAGGGGAATGCGATGAGCGCACTTGCTGCTCATCGCGTCTGTGGTGTGCCATTAGAAACTTTGGCGCGCAGTCGCAAACCTCGTGATCTGACGGATGATTTATCATGTGCCTATCAAGCGCAGAATATCGTGAGTTTATTTGTCGCGACGCGTATCCTGTTCTCTCATCTGGATAGCGTATTTACTCTGAATCTTGACGAACAAGAACCAGAGGTGGCTGAACGTCTAAGTGATCTTCGCCGTATCAATGAAAATAACCCGGGCATGGTTACACAGGTTTTAACCGTTGCTCGTCAGATCTATAACGATTATGTCACTCACCATCCGGGCTTAACTCCTGAGCAAACCAGTGCGGGTGCACAAGCTGCCGATATCCTCTCTTTATTTTGCCCAGATGCTGATAAGTCTTGTGTGGCTTCAAACAACGATCAAGCCAATATCAACATCGAGTCTCGTTCTGGCCGTTCATATTTGCCTGAAAACCGTGCGGTAATCACCCCTCAAGGCGTCACAAATTGGACTTACCAGGAACTCGAAGCAACACATCAAGCTCTGACTCGTGAGGGTTATGTGTTCGTGGGTTACCATGGTACGAATCATGTCGCTGCGCAAACCATCGTGAATCGCATTGCCCCTGTTCCGCGCGGCAACAACACTGAAAACGAGGAAAAGTGGGGCGGGTTATATGTTGCAACTCACGCTGAAGTTGCCCATGGTTATGCTCGCATCAAAGAAGGGACAGGGGAGTATGGCCTTCCGACCCGTGCTGAGCGCGACGCTCGTGGGGTAATGCTGCGCGTGTATATCCCTCGTGCTTCATTAGAACGTTTTTATCGCACGAATACACCTTTGGAAAATGCTGAGGAGCATATCACGCAAGTGATTGGTCATTCTTTGCCATTACGCAATGAAGCATTTACTGGTCCAGAAAGTGCGGGCGGGGAAGACGAAACTGTCATTGGCTGGGATATGGCGATTCATGCAGTTGCGATCCCTTCGACTATCCCAGGGAACGCTTACGAAGAATTGGCGATTGATGAGGAGGCTGTTGCAAAAGAGCAATCGATTAGCACAAAACCACCTTATAAAGAGCGCAAAGATGAACTTAAG  
69 假單胞菌外毒素A AEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVRSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVLEGGNDALKLAIDNALSITSDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHEKPSNIKVFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLARDATFFVRAHESNEMQPTLAISHAGVSVVMAQAQPRREKRWSEWASGKVLCLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLDIKPTVISHRLHFPEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAASADVVSLTCPVAAGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTGLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK   
70 Cholix變異體TEV裂解產物 MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPM DAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQACENLFQ  
71 艾塞那肽-Cholix變異體 MHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGGSGGGGSVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLA  
72 天然Cholix變異體之N端 VEDE  
73 Cholix變異體 VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLA  
74 Cholix變異體 MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQA  
75 Cholix變異體 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK  
76 Cholix變異體 VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYNAQQIVSLFLATRILFTHIDSIFTLNLDGQEPEVAERLDDLRRINENNPGMVIQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNSDQANINIES  
77 Cholix變異體TEV MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESCENLFQSGTCHHHHHH  
78 Cholix變異體TEV MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQACENLFQSGTCHHHHHH  
79 (G5S)(G4S)2間隔子 GGGGGSGGGGSGGGGS  
80 Cholix變異體TEV裂解產物 MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESCENLFQ  
81 Cholix變異體 V-E-X3-X4-L-X6-I-F-D-E-C-R-S-P-C-X16-L-T-P-E-X21-G-K-X24-I-Q-S-K-L-X30-I-P-X33-D-V-V-L-D-E-G-V-L-Y-Y-S-M-T-I-N-D-E-Q-N-D-I-X56-D-E-X59-K-G-E-S-I-I-T-X67-G-E-F-A-T-X73-R-A-T-R-H-Y-V-X81-Q-D-A-P-F-G-V-I-X90-L-D-I-T-T-E-N-G-T-K-X101-Y-S-X104-N-R-K-X108-X109-E-F-X112-I-X114-W-L-V-X118-X119-G-E-D-S-P-A-S-I-K-I-S-X131-D-E-X134-D-Q-X137-R-N-I-I-E-V-P-K-L-Y-S-I-D-L-D-N-Q-T-L-E-Q-W-X160-X161-Q-G-N-V-X166-F-X168-V-T-R-P-E-X174-X175-I-A-I-S-W-P-S-V-S-Y-X186-A-A-X189-K-X191-G-X193-R-H-K-R-W-A-X200-W-X202-T-X204-X205-X206-X207-X208-X209-L-X211-X212-X213-X214-X215-X216-X217-X218-X219-X220-X221-X222-X223-X224-C-T-X227-G-X229-X230-W-X232-G-G-X235-Y-X237-T-V-A-G-X242-P-X244-X245-I-X247-V-K-Q-G-X252-E-Q-K-X256-V-E-Q-R-I-H-F-S-X265-X266-N-A-X269-X270-X271-L-A-A-H-R-V-C-G-V-P-L-E-T-L-A-R-X288-R-K-P-R-X293-L-X295-D-D-L-X299-C-X301-Y-X303-A-Q-X306-I-V-S-L-F-X312-A-T-R-X316-L-F-X319-H-X321-D-S-X324-F-T-L-N-L-X330-X331-Q-X333-P-X335-V-X337-E-R-L-X341-X342-X343-R-X345-I-N-E-X349-N-P-G-X353-V-X355-Q-V-L-T-X360-A-R-Q-I-Y-N-D-Y-V-T-X371-H-P-X374-L-X376-P-E-Q-T-S-A-X383-A-Q-A-A-D-I-L-S-L-X393-X394-P-D-X397-D-X399-X400-C-V-A-X404-X405-X406-D-Q-A-N-I-N-X413-E-S-R-S-G-R-S-Y-L-X423-E-N-R-A-V-I-T-X431-Q-G-V-T-N-W-T-Y-Q-E-L-X443-X444-X445-H-Q-X448-L-T-X451-E-X453-Y-V-F-V-G-Y-H-G-T-N-H-X465-A-A-Q-X469-I-V-N-R-I-X475-P-V-P-R-G-X481-X482-T-E-X485-E-X487-X488-W-G-G-X492-Y-V-X495-T-X497-A-X499-X500-X501-X502-X503-Y-X505-R-X507-X508-X509-G-T-X512-X513-X514-X515-X516-X517-T-X519-X520-X521-X522-X523-X524-R-G-V-M-L-X530-V-Y-X533-X534-X535-A-S-L-E-R-F-Y-R-X544-N-X546-X547-L-E-X550-X551-X552-X553-X554-X555-X556-X557-V-I-G-H-X562-L-P-L-R-N-E-A-F-T-G-X573-X574-X575-X576-X577-G-X579-X580-E-T-X583-I-G-W-D-X588-A-I-X591-X592-V-A-I-P-S-T-I-P-G-N-X603-Y-X605-X606-L-X608-X609-X610-E-E-A-X614-A-X616-E-Q-S-I-S-X622-K-P-P-Y-K-E-X629-X630-D-E-L-K；其中X3選自由E及D組成之群；X4選自由A及E組成之群；X6選自由N及K組成之群；X16選自由S及L組成之群；X21選自由P及L組成之群；X24選自由P及Q組成之群；X30選自由S及F組成之群；X33選自由S及G組成之群；X56選自由K及M組成之群；X59選自由D及G組成之群；X67選自由I及F組成之群；X73選自由V及I組成之群；X81選自由N及S組成之群；X90選自由H及N組成之群；X101選自由T及M組成之群；X104選自由Y及F組成之群；X108選自由E及D組成之群；X109選自由G及S組成之群；X112選自由A及T組成之群；X114選自由N及H組成之群；X118選自由P及I組成之群；X119選自由I及P組成之群；X131選自由V及I組成之群；X134選自由L及I組成之群；X137選自由Q及K組成之群；X160選自由K及E組成之群；X161選自由T及N組成之群；X166選自由S及F組成之群；X168選自由S及A組成之群；X174選自由H及Q組成之群；X175選自由N、S、SIAKQS及SIAKQSIAKQS組成之群；X186選自由K及N組成之群；X189選自由Q、E及H組成之群；X191選自由以下E、N及D之群；X193選自由S及A組成之群；X200選自由H及N組成之群；X202選自由H、L、F及R組成之群；X204選自由G及T組成之群；X205選自由L及S組成之群；X206選自由A及P組成之群；X207選自由L、E及K組成之群；X208選自由C及V組成之群；X209選自由W、V及T組成之群；X211選自由V及無胺基酸組成之群；X212選自由P及無胺基酸組成之群；X213選自由M、I、L及無胺基酸組成之群；X214選自由D及無胺基酸組成之群；X215選自由A及無胺基酸組成之群；X216選自由I及無胺基酸組成之群；X217選自由Y及C組成之群；X218選自由N及F組成之群；X219選自由Y及F組成之群；X220選自由I及E組成之群；X221選自由T及D組成之群；X222選自由Q及P組成之群；X223選自由Q、E及A組成之群；X224選自由N、L及Q組成之群；X227選自由L及Y組成之群；X229選自由D及E組成之群；X230選自由N及D組成之群；X232選自由F、H及Y組成之群；X235選自由S及A組成之群；X237選自由E及K組成之群；X242選自由T及I組成之群；X244選自由K、E及G組成之群；X245選自由V及A組成之群；X247選自由T及M組成之群；X252選自由I及M組成之群；X256選自由P、T及A組成之群；X265選自由K、Q及N組成之群；X266選自由G及K組成之群；X269選自由M及I組成之群；X270選自由S及E組成之群；X271選自由A及T組成之群；X288選自由S及G組成之群；X293選自由D及Y組成之群；X295選自由T、P及Q組成之群；X299選自由S及Q組成之群；X301選自由A及V組成之群；X303選自由Q及N組成之群；X306選自由N及Q組成之群；X312選自由V及L組成之群；X316選自由I及M組成之群；X319選自由S及T組成之群；X321選自由L及I組成之群；X324選自由V及I組成之群；X330選自由D、E及H組成之群；X331選自由E及G組成之群；X333選自由E及A組成之群；X335選自由E及A組成之群；X337選自由A及T組成之群；X341選自由S、D及T組成之群；X342選自由D及A組成之群；X343選自由L及I組成之群；X345選自由R及Q組成之群；X349選自由N及D組成之群；X353選自由M及V組成之群；X355選自由T及I組成之群；X360選自由V及I組成之群；X371選自由H及E組成之群；X374選自由G及L組成之群；X376選自由T及I組成之群；X383選自由G及S組成之群；X393選自由F及L組成之群；X394選自由C及Y組成之群；X397選自由A及T組成之群；X399選自由K、E及G組成之群；X400選自由S、P及H組成之群；X404選自由S及L組成之群；X405選自由N及D組成之群；X406選自由N及S組成之群；X413選自由I及V組成之群；X423選自由P及L組成之群；X431選自由P及Q組成之群；X443選自由E及D組成之群；X444選自由A及T組成之群；X445選自由T及K組成之群；X448選自由A及T組成之群；X451選自由R及Q組成之群；X453選自由G及D組成之群；X465選自由V及A組成之群；X469選自由T、S及N組成之群；X475選自由A、S及T組成之群；X481選自由N及S組成之群；X482選自由N及D組成之群；X485選自由N、S及K組成之群；X487選自由E、R及K組成之群；X488選自由K、A及E組成之群；X492選自由L及V組成之群；X495選自由A及S下組成之群；X497選自由H及D組成之群；X499選自由E及S組成之群；X500選自由V及L組成之群；X501選自由A及N組成之群；X502選自由H及Y組成之群；X503選自由G及R組成之群；X505選自由A及T組成之群；X507選自由I及L組成之群；X508選自由K及Q組成之群；X509選自由E及K組成之群；X512選自由G及A組成之群；X513選自由E、D及N組成之群；X514選自由Y、G、A及N組成之群；X515選自由G及E組成之群；X516選自由L及G組成之群；X517選自由P及L組成之群；X519選自由R、P及T組成之群；X520選自由A及E組成之群；X521選自由E及K組成之群；X522選自由R、Q及K組成之群；X523選自由D、K及E組成之群；X524選自由A、T及S組成之群；X530選自由R及K組成之群；X533選自由I及L組成之群；X534選自由P及H組成之群；X535選自由R及Q組成之群；X544選自由T及I組成之群；X546選自由T、A及I組成之群；X547選自由對及D組成之群；X550選自由N及K組成之群；X551選自由A及E組成之群；X552選自由E、R及D組成之群；X553選自由E、N及R組成之群；X554選自由H及L組成之群；X555選自由I及V組成之群；X556選自由T及E組成之群；X557選自由Q、R H及D組成之群；X562選自由S及P組成之群；X573選自由P及T組成之群；X574選自由E及D組成之群；X575選自由S、A及R組成之群；X576選自由A、E及V組成之群；X577選自由G、E及D組成之群；X579選自由E及S組成之群；X580選自由D及N組成之群；X583選自由V及A組成之群；X588選自由M及I組成之群；X591選自由H及Y組成之群；X592選自由A及G組成之群；X603選自由A及S組成之群；X605選自由E及A組成之群；X606選自由E、A、Q、G、V及R組成之群；X608選自由A、P及T組成之群；X609選自由I、T及P組成之群；X610選自由D及A組成之群；X614選自由V及VVKEAI組成之群；X616選自由K及E組成之群；X622選自由T、A及P組成之群；且X629選自由R、Q及H組成之群；且X630選自由K及無胺基酸組成之群。  
82 假單胞菌外毒素A變異體 AEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVRSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVLEGGNDALKLAIDNALSITSDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHEKPSNIKVFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLARDATFFVRAHESNEMQPTLAISHAGVSVVMAQAQPRREKRWSEWASGKVLCLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLDIKPTVISHRLHFPE  
83    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGGGGGSGGGGSGGGGSHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS  
84    MAEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVRSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVLEGGNDALKLAIDNALSITSDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHEKPSNIKVFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLARDATFFVRAHESNEMQPTLAISHAGVSVVMAQAQPRREKRWSEWASGKVLCLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLDIKPTVISHRLHFPEG     
表 13 - 鑑別 SEQ ID NO : 69 之胺基酸殘基的例示性胞吞轉運載體
胺基酸殘基 胺基酸殘基 胺基酸殘基 胺基酸殘基 胺基酸殘基
1-252 1-325 1-397 1-470 1-543
1-253 1-326 1-398 1-471 1-544
1-254 1-327 1-399 1-472 1-545
1-255 1-328 1-400 1-473 1-546
1-256 1-329 1-401 1-474 1-547
1-257 1-330 1-402 1-475 1-548
1-258 1-331 1-403 1-476 1-549
1-259 1-332 1-404 1-477 1-550
1-260 1-333 1-405 1-478 1-551
1-261 1-334 1-406 1-479 1-552
1-262 1-335 1-407 1-480 1-553
1-263 1-336 1-408 1-481 1-554
1-264 1-337 1-409 1-482 1-555
1-265 1-338 1-410 1-483 1-556
1-266 1-339 1-411 1-484 1-557
1-267 1-340 1-412 1-485 1-558
1-268 1-341 1-413 1-486 1-559
1-269 1-342 1-414 1-487 1-560
1-270 1-343 1-415 1-488 1-561
1-271 1-344 1-416 1-489 1-562
1-272 1-345 1-417 1-490 1-563
1-273 1-346 1-418 1-491 1-564
1-274 1-347 1-419 1-492 1-565
1-275 1-348 1-420 1-493 1-566
1-276 1-349 1-421 1-494 1-567
1-277 1-350 1-422 1-495 1-568
1-278 1-350 1-423 1-496 1-569
1-279 1-351 1-424 1-497 1-570
1-280 1-352 1-425 1-498 1-571
1-281 1-353 1-426 1-499 1-572
1-282 1-354 1-427 1-500 1-573
1-283 1-355 1-428 1-501 1-574
1-284 1-356 1-429 1-502 1-575
1-285 1-357 1-430 1-503 1-576
1-286 1-358 1-431 1-504 1-577
1-287 1-359 1-432 1-505 1-578
1-288 1-360 1-433 1-506 1-579
1-289 1-361 1-434 1-507 1-580
1-290 1-362 1-435 1-508 1-581
1-291 1-363 1-436 1-509 1-582
1-292 1-364 1-437 1-510 1-583
1-293 1-365 1-438 1-511 1-584
1-294 1-366 1-439 1-512 1-585
1-295 1-367 1-440 1-513 1-586
1-296 1-368 1-441 1-514 1-587
1-297 1-369 1-442 1-515 1-588
1-298 1-370 1-443 1-516 1-589
1-299 1-371 1-444 1-517 1-590
1-300 1-372 1-445 1-518 1-591
1-301 1-373 1-446 1-519 1-592
1-302 1-374 1-447 1-520 1-593
1-303 1-375 1-448 1-521 1-594
1-304 1-376 1-449 1-522 1-595
1-305 1-377 1-450 1-523 1-596
1-306 1-378 1-451 1-524 1-597
1-307 1-379 1-452 1-525 1-598
1-308 1-380 1-453 1-526 1-599
1-309 1-381 1-454 1-527 1-600
1-310 1-382 1-455 1-528 1-601
1-311 1-383 1-456 1-529 1-602
1-312 1-384 1-457 1-530 1-603
1-313 1-385 1-458 1-531 1-604
1-314 1-386 1-459 1-532 1-605
1-315 1-387 1-460 1-533 1-606
1-316 1-388 1-461 1-534 1-607
1-317 1-389 1-462 1-535 1-608
1-318 1-390 1-463 1-536 1-609
1-319 1-391 1-464 1-537 1-610
1-320 1-392 1-465 1-538 1-611
1-321 1-393 1-466 1-539 1-612
1-322 1-394 1-467 1-540 1-613
1-323 1-395 1-468 1-541   
1-324 1-396 1-469 1-542   
表 14 - 鑑別 SEQ ID NO : 7 之胺基酸殘基的例示性胞吞轉運載體
胺基酸殘基 胺基酸殘基 胺基酸殘基
1-195 1-246 1-297
1-196 1-247 1-298
1-197 1-248 1-299
1-198 1-249 1-300
1-199 1-250 1-301
1-200 1-251 1-302
1-201 1-252 1-303
1-202 1-253 1-304
1-203 1-254 1-305
1-204 1-255 1-306
1-205 1-256 1-307
1-206 1-257 1-308
1-207 1-258 1-309
1-208 1-259 1-310
1-209 1-260 1-311
1-210 1-261 1-312
1-211 1-262 1-313
1-212 1-263 1-314
1-213 1-264 1-315
1-214 1-265 1-316
1-215 1-266 1-317
1-216 1-267 1-318
1-217 1-268 1-319
1-218 1-269 1-320
1-219 1-270 1-321
1-220 1-271 1-322
1-221 1-272 1-323
1-222 1-273 1-324
1-223 1-274 1-325
1-224 1-275 1-326
1-225 1-276 1-327
1-226 1-277 1-328
1-227 1-278 1-329
1-228 1-279 1-330
1-229 1-280 1-331
1-230 1-281 1-332
1-231 1-282 1-333
1-232 1-283 1-334
1-233 1-284 1-335
1-234 1-285 1-336
1-235 1-286 1-337
1-236 1-287 1-338
1-237 1-288 1-339
1-238 1-289 1-340
1-239 1-290 1-341
1-240 1-291 1-342
1-241 1-292 1-343
1-242 1-293 1-344
1-243 1-294 1-345
1-244 1-295 1-346
1-245 1-296 1-347
表 15 - SEQ ID NO : 7 之 Cholix 載體的例示性胺基酸殘基
Cholix 胺基酸殘基 Cholix 胺基酸殘基
1-150 1-178
1-151 1-179
1-152 1-180
1-153 1-181
1-154 1-182
1-155 1-183
1-156 1-184
1-157 1-185
1-158 1-186
1-159 1-187
1-160 22-187
1-161 23-187
1-162 24-187
1-163 25-187
1-164 26-187
1-165 27-187
1-166 28-187
1-167 29-187
1-168 30-187
1-169 31-187
1-170 32-187
1-171 33-187
1-172 34-187
1-173 35-187
1-174 38-187
1-175 39-187
1-176 40-187
1-177 41-187
本專利或申請案檔案含有至少一張彩製圖。在申請且支付必要費用後，專利局將提供具有彩色圖式之本專利或專利申請公開案之複本。本發明之新穎特徵在所附申請專利範圍中細緻闡述。將參考闡述利用本發明原理之說明性實施例及其隨附圖式的以下詳細描述來獲得對本發明之特徵及優勢的更好理解，在隨附圖式中：
圖 1A 為描繪懸浮於低離子強度緩衝液(0.05 M)中的如實例1中所描述製備之自裝配融合分子-魚精蛋白微米顆粒的數位影像。圖 1B 為描繪懸浮於高離子強度緩衝液(＞1 M)中的如實例1中所描述製備之自裝配融合分子-魚精蛋白微米顆粒的數位影像。圖 1C 為描繪返回至低離子強度緩衝液(0.05 M)之圖 1B 之微米顆粒的數位影像。顆粒係使用GE Cytel系統以高功率(10×)明視場模式成像。
圖 2A 為描繪處於明視場模式下的如實例2中所描述製備之自裝配胰島素-魚精蛋白微米顆粒的數位影像。圖 2B 為描繪在藍色場模式下展現FITC螢光的如實例2中所描述製備之自裝配胰島素-魚精蛋白微米顆粒的數位影像。圖 2C 為描繪圖 2A 及圖 2B 中所示之明視場及藍色場影像之合併影像的數位影像。合併影像展示胰島素微米顆粒之FITC螢光。顆粒係使用GE Cytel系統以高功率(10×)明視場或藍色場模式成像。藉由在381 nm處激發樣品而對FITC-螢光成像，且在435 nm處記錄螢光發射。藍色箭頭指示大約150 µM顆粒。
圖 3A 為描繪處於紅色場模式下的如實例3中所描述製備之自裝配融合分子-魚精蛋白-鋅微米顆粒的數位影像。
圖 3B 為處於明視場模式下之相同融合分子-魚精蛋白-鋅微米顆粒的數位影像。顆粒係使用GE Cytel系統以高功率(10×)明視場或紅色場模式成像。藉由在481 nm處激發樣品而對紅色-螢光成像，且在535 nm處記錄螢光發射。
圖 4A 為描繪處於明視場模式下的如實例3中所描述製備之自裝配融合分子-魚精蛋白(無ZnCl2 )微米顆粒的數位影像。圖 4B 為處於紅色場模式下之相同顆粒之數位影像。顆粒係使用GE Cytel系統以高功率(10×)明視場或紅色場模式成像。藉由在481 nm處激發樣品而對紅色-螢光成像，且在535 nm處記錄螢光發射。
圖 5A 展示配方37-156在pH 2及pH 7處，及pH自pH 2升高至pH 7時的溶解曲線。
圖 5B 展示配方37-167在pH 2及pH 7處，及pH自pH 2升高至pH 7時的溶解曲線。
圖 5C 展示調配之奈米顆粒在pH 2及pH 7處，及pH自pH 2升高至pH 7時的溶解曲線。
圖 6 展示在將不同奈米顆粒配方暴露於胰酶時的胰島素穩定性。
圖 7A 展示在腔內注射37-49 hGH/SEQ ID NO: 3/Eudragit FS顆粒之後15分鐘的大鼠小腸切片。hGH以綠色可見且SEQ ID NO: 3以紅色可見。圖 7B 展示在腔內注射37-49 hGH/SEQ ID NO: 3/Eudragit FS顆粒之後30分鐘的大鼠小腸切片。hGH以綠色可見且SEQ ID NO: 3以紅色可見。
圖 7C 展示在腔內注射37-49 hGH/SEQ ID NO: 3/Eudragit FS顆粒之後45分鐘的大鼠小腸切片。hGH以綠色可見且SEQ ID NO: 3以紅色可見。
圖 7D 展示在腔內注射37-49 hGH/SEQ ID NO: 3/Eudragit FS顆粒之後60分鐘的大鼠小腸切片。hGH以綠色可見且SEQ ID NO: 3以紅色可見。
圖 8 展示在藉由經口管飼投與含hGH之顆粒之大鼠中之hGH的血清含量。
圖 9 展示當在不同配方中遞送時，轉運穿過Caco-2細胞之hGH的含量。
圖 10A 展示藉由逆相液相層析(RPLC)分析的艾塞那肽在指定時間點，在pH 5、pH 7、pH 7.5及pH 10下自表 3 之5種顆粒的活體外釋放。
圖 10B 展示藉由RPLC分析的艾塞那肽在指定時間點，在pH 5、pH 7、pH 7.5及pH 10下自表 3 之另5種顆粒的活體外釋放。
圖 10C 展示藉由尺寸排阻層析(SEC)分析的艾塞那肽在指定時間點，在pH 5、pH 7、pH 7.5及pH 10下自表 3 之5種顆粒的活體外釋放。
圖 10D 展示藉由尺寸排阻層析(SEC)分析的艾塞那肽在指定時間點，在pH 5、pH 7、pH 7.5及pH 10下自表 3 之另5種顆粒的活體外釋放。
圖 11A - C 展示SEQ ID NO: 3及/或艾塞那肽於本文所描述之不同配方中的胰酶穩定性。圖 11A 展示SEQ ID NO: 3及/或艾塞那肽於含鋅配方中的胰酶穩定性，圖 11B 展示SEQ ID NO: 3及/或艾塞那肽於含魚精蛋白之配方中的胰酶穩定性，且圖11C展示艾塞那肽於鋅及艾塞那肽之配方中的胰酶穩定性。
圖 12A 展示SEQ ID NO: 3、FITC-艾塞那肽及鋅之配方的共聚焦顯微鏡影像，其中觀測到FITC-艾塞那肽。
圖 12B 展示SEQ ID NO: 3、FITC-艾塞那肽及鋅之配方的共聚焦顯微鏡影像，其中藉由Alexa 647標記之抗SEQ ID NO: 3抗體觀測到SEQ ID NO: 3。
圖 12C 展示圖 12A 及圖 12B 之合併影像。
圖 13 展示圖 12A - C 中之配方的粒度分佈。
圖 14 展示本文所描述之配方轉運穿過SMI-100細胞。
圖 15 展示生產包含Cholix載體、鋅及艾塞那肽之耐酸性顆粒之方法的示意性實例。
圖 16 展示可使用活體外或活體內方法偵測到微米顆粒穿過不同黏液及上皮層之方法。
圖 17A 展示SEQ ID NO: 3及/或艾塞那肽於本文所描述之不同配方中的胰酶穩定性。
圖 17B 展示SEQ ID NO: 3及/或FITC-艾塞那肽於本文所描述之不同配方中的胰酶穩定性。
圖 18 展示逆相層析圖(RPLC)，其展示在6.8分鐘之滯留時間處存在SEQ ID NO: 3且在7.5分鐘處存在艾塞那肽。
圖 19 展示藉由RPLC分析的艾塞那肽在37℃下在指定時間點，在pH 1、pH 5及pH 7下自配方E0、E14、E18、E0-FITC、E14-FITC及E18-FITC的活體外釋放。
圖 20 展示艾塞那肽在腔內投與配方E0、E14及E18之大鼠中的血清濃度。
圖 21 展示艾塞那肽在靜脈內投與艾塞那肽之大鼠中的血清濃度。
圖 22 展示在考馬斯藍染色之SDS-PAGE凝膠上運行之SEQ ID NO: 70-艾塞那肽(與艾塞那肽交聯之SEQ ID NO: 70)的純度。
圖 23 展示與載體SEQ ID NO: 80或SEQ ID NO: 70交聯之艾塞那肽穿過史泊格多利大鼠(Sprague Dawley Rat)之空腸的活體內胞吞轉送。在處理後10分鐘及40分鐘時量測轉運穿過腸組織之艾塞那肽的量(以pM為單位)。資料展示，SEQ ID NO: 80-艾塞那肽及SEQ ID NO: 70-艾塞那肽均能夠在10分鐘以及在40分鐘時以比單獨的艾塞那肽更高的速率轉運。
圖24 展示葡萄糖刺激之後的血糖之時間-濃度分佈。將藉由經口管飼投與之SEQ ID NO: 70-艾塞那肽之效應相比於陰性對照治療(經口緩衝液)及作為陽性對照的藉由腹膜內注射投與之艾塞那肽。此等結果表明SEQ ID NO: 70-艾塞那肽降低葡萄糖刺激之後的血糖含量上升。
圖25 展示SEQ ID NO: 11可結合至GLP-1受體。

Claims (145)

  1. 一種組合物，其包含 能夠進入極化上皮細胞或胞吞轉運穿過極化上皮細胞之載體；及 異源負載物，其中該異源負載物與該載體之莫耳比為大於1:1。
  2. 如請求項1之組合物，其中該組合物包含過渡金屬陽離子。
  3. 如請求項2之組合物，其中該過渡金屬陽離子選自由以下組成之群：Fe2 + 、Mn2 + 、Zn2 + 、Co2 + 、Ni2 + 及Cu2 + 。
  4. 如請求項3之組合物，其中該過渡金屬陽離子為Zn2 + 。
  5. 如請求項1之組合物，其中該組合物包含聚陽離子。
  6. 如請求項5之組合物，其中該聚陽離子為魚精蛋白。
  7. 如請求項1至6中任一項之組合物，其中該載體包含Cholix多肽之一部分。
  8. 如請求項7之組合物，其中該載體由假單胞菌外毒素A之一部分組成。
  9. 如請求項7之組合物，其中該載體由Cholix多肽之一部分組成。
  10. 如請求項8之組合物，其中該Cholix多肽由C端在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置206至425中之任一者處之胺基酸序列組成。
  11. 如請求項8之組合物，其中該Cholix多肽由C端在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置150至205中之任一者處之胺基酸序列組成。
  12. 如請求項8之組合物，其中該Cholix多肽由C端在SEQ ID NO: 7之胺基酸150至195中之任一者處之胺基酸序列組成。
  13. 如請求項8之組合物，其中該Cholix多肽由N端在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置1至41中之任一者處之胺基酸序列組成。
  14. 如請求項8之組合物，其中該Cholix多肽由N端在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置35至40中之任一者處之胺基酸序列組成。
  15. 如請求項8之組合物，其中該Cholix多肽由SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置40至SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置150至205中之任一者的胺基酸序列組成。
  16. 如請求項8之組合物，其中該Cholix多肽之C端在SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置150至187中之任一者處。
  17. 如請求項8之組合物，其中該Cholix多肽由SEQ ID NO: 8中所闡述之胺基酸序列組成。
  18. 如請求項8之組合物，其中該Cholix多肽由SEQ ID NO: 9或SEQ ID: NO: 10中所闡述之胺基酸序列組成。
  19. 如請求項10至14中任一項之組合物，其中胺基酸位置係基於該Cholix多肽與SEQ ID NO: 7中闡述之序列的比對而編號，其中胺基酸位置自N端至C端且自該N端處之位置1開始編號。
  20. 如請求項1之組合物，其中該異源負載物選自由以下組成之群：大分子、小分子、肽、多肽、核酸、mRNA、miRNA、shRNA、siRNA、反義分子、抗體、DNA、質體、疫苗、聚合物奈米顆粒及催化活性物質。
  21. 如請求項20之組合物，其中該異源負載物為治療負載物。
  22. 如請求項1之組合物，其中該異源負載物選自由以下組成之群：染料及放射性藥品、激素、細胞介素、抗TNF劑、葡萄糖降低劑、腫瘤相關抗原、肽及多肽。
  23. 如請求項1之組合物，其中該異源負載物為多肽，該多肽為胃腸道中之發炎的調節劑。
  24. 如請求項1之組合物，其中該異源負載物為類升糖素肽-2 (GLP-2)類似物。
  25. 如請求項24之組合物，其中該GLP-2類似物為替度魯肽(Teduglutide)。
  26. 如請求項1之組合物，其中該異源負載物為細胞介素。
  27. 如請求項26之組合物，其中該細胞介素選自由以下組成之群：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29及IL-30。
  28. 如請求項27之組合物，其中該細胞介素為IL-10。
  29. 如請求項28之組合物，其中該細胞介素為IL-22。
  30. 如請求項26之組合物，其中該細胞介素不具有天然分泌信號。
  31. 如請求項21之組合物，其中該治療負載物為激素。
  32. 如請求項31之組合物，其中該激素為人類生長激素(hGH)。
  33. 如請求項1之組合物，其中該異源負載物為葡萄糖降低劑。
  34. 如請求項1之組合物，其中該異源負載物為腸促胰島素、升糖素前蛋白、升糖素肽、類升糖素肽1、類升糖素肽2、腸高血糖素、腸高血糖素相關多肽、抑胃多肽前蛋白、抑胃多肽、二肽基肽酶4、葡萄糖轉運體成員4、前升糖素原、胰島素受體受質1、胰島素、胰島素類似物、載脂蛋白A-II、溶質載體家族2、促進葡萄糖轉運體成員1、肝糖合酶1、肝糖合酶2、酪胺酸蛋白磷酸酶非受體1型、RAC-α絲胺酸蘇胺酸蛋白激酶、過氧化體增殖物活化受體γ、己糖激酶3、磷脂醯肌醇-3,4,5-三磷酸3-磷酸酶及雙特異性蛋白、丙酮酸脫氫酶激酶1、含鈣結合域及捲曲螺旋域之蛋白1、Max樣蛋白X、果糖-二磷酸醛縮酶A、類升糖素肽1受體、類升糖素肽2受體、抑胃多肽受體、類胰島素生長因子1受體、類胰島素生長因子2受體、胰島素受體、GLP-1促效劑-艾塞那肽、GLP-1促效劑-利拉魯肽、艾塞那肽、腸促胰島素類似物-4、腸促胰島素類似物-3、GIPR促效劑(Des-Ala2-GIP1-30)、GIPR促效劑-截短GIP1-30、GLP-1R促效劑(GIP之aa 1-37)、GLP-1R促效劑(GIP之aa 7-36)、利司那肽(商品名Adlyxin®及Lyxumia®，Sanofi)、利拉魯肽(商品名Victoza®，Novo Nordisk A/S)、司美魯肽(商品名Ozempic®，Novo Nordisk A/S)、阿必魯肽(商品名Tanzeum®，GlaxoSmithKline；與白蛋白融合之GLP-1二聚體)、度拉糖肽(商品名Trulicity®，Eli Lilly)、葡萄糖依賴性促胰島素多肽、多特異性肽促效劑、泰帕肽(Eli Lilly)、SAR425899 (Sanofi)、雙澱粉素降鈣素受體促效劑DACRA-089、甘精胰島素/Lantus®、谷賴胰島素/Apidra®、格拉胰島素/Toujeo®、insuman®、地特胰島素/Levemir®、賴脯胰島素/Humalog®/Liprolog®、德谷胰島素/DegludecPlus、門冬胰島素、胰島素及類似物(例如LY-2605541、LY2963016、NN1436)、聚乙二醇化賴脯胰島素、Humulin®、Linjeta、SuliXen®、NN1045、胰島素加SymlinTM、PE0139、速效及短效胰島素(例如Linjeta、PH20、NN1218、HinsBet)、(APC-002)水凝膠、口服、可吸入、經皮及舌下胰島素(例如Exubera®、Nasulin®、Afrezza®、Tregopil®、TPM 02、Capsulin、Oral-lyn®、Cobalamin®、口服胰島素、ORMD-0801、NN1953、NN1954、NN1956、VIAtab及Oshadi口服胰島素)或腸促胰島素類似物-4類似物，其中該腸促胰島素類似物-4類似物為desPro36-腸促胰島素類似物-4(1-39)-Lys6NH2；H-des(Pro36, 37)-腸促胰島素類似物-4-Lys4-NH2；H-des(Pro36, 37)-腸促胰島素類似物-4-Lys5-NH2；desPro36[Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14, Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Trp(O2) 26, Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；或desPro36[Trp(O2) 25, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, Asp28 ]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；或desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)。
  35. 如請求項1之組合物，其中該異源負載物為胰島素或胰島素類似物。
  36. 如請求項1之組合物，其中該異源負載物為艾塞那肽。
  37. 如請求項1之組合物，其中該異源負載物包含螢光標記。
  38. 如請求項37之組合物，其中該螢光標記為螢光素。
  39. 如請求項38之組合物，其中該異源負載物為艾塞那肽-螢光素複合物。
  40. 如請求項1之組合物，其中該組合物對經胰酶裂解具抗性。
  41. 如請求項40之組合物，其中至少50%之該載體在胰酶分析中於2小時處完整，其中該胰酶分析包含在37℃下於100 µL磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中將包含100 µg該載體之該組合物與10 µg胰酶一起培育。
  42. 如請求項2之組合物，其中該過渡金屬陽離子與該載體之莫耳比為約100:1至約300,000:1。
  43. 如請求項2之組合物，其中該過渡金屬陽離子與該載體之莫耳比為約1000:1至約30,000:1。
  44. 如請求項2之組合物，其中該過渡金屬陽離子與該載體之莫耳比為約1000:1至約10,000:1。
  45. 如請求項6之組合物，其中該魚精蛋白與該載體之莫耳比為約10:1至約0.01:1。
  46. 如請求項1之組合物，其中該異源負載物與該載體之莫耳比為約2:1至約6000:1。
  47. 如請求項6之組合物，其中該魚精蛋白與該載體之莫耳比為約1:1。
  48. 如請求項1之組合物，其中該異源負載物與該載體之莫耳比為約2:1至約10:1。
  49. 如請求項1之組合物，其中該異源負載物與該載體之莫耳比為約7:1。
  50. 如請求項1之組合物，其中該異源負載物與該載體之莫耳比為約7.16:1。
  51. 如請求項1之組合物，其中該異源負載物為包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 14之序列的多肽。
  52. 如請求項1之組合物，其中該異源負載物為包含SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 19之序列的多肽。
  53. 如請求項1之組合物，其中該異源負載物為包含SEQ ID NO: 20之序列的多肽。
  54. 如請求項1之組合物，其中該異源負載物為包含SEQ ID NO: 21之序列的多肽。
  55. 如請求項1之組合物，其中該異源負載物為包含SEQ ID NO: 22之序列的多肽。
  56. 如請求項1之組合物，其中該組合物經囊封。
  57. 如請求項56之組合物，其中該囊封組合物經設計以在第一條件下但不在第二條件下釋放該異源負載物。
  58. 如請求項56之組合物，其中該囊封組合物經設計以在高pH下但不在低pH下釋放該異源負載物。
  59. 如請求項56之組合物，其中該囊封組合物包含腸溶衣。
  60. 如請求項1之組合物，其中該組合物為顆粒。
  61. 如請求項1之組合物，其中該組合物包含聚陽離子。
  62. 如請求項1之組合物，其中該載體能夠在該極化上皮細胞中轉運該異源負載物或將該異源負載物胞吞轉運穿過極化上皮細胞。
  63. 如請求項61之組合物，其中該載體偶聯至該聚陽離子。
  64. 如請求項61之組合物，其中該聚陽離子為魚精蛋白、聚離胺酸、聚鳥胺酸、聚乙烯亞胺(PEI)、醇溶穀蛋白、魚精蛋白、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、聚精胺酸、聚乙烯胺或其組合。
  65. 如請求項61之組合物，其中該聚陽離子為魚精蛋白鹽。
  66. 如請求項65之組合物，其中該魚精蛋白鹽為硫酸魚精蛋白、乙酸魚精蛋白、溴化魚精蛋白、氯化魚精蛋白、己酸魚精蛋白、三氟乙酸魚精蛋白、魚精蛋白HCO3 、丙酸魚精蛋白、乳酸魚精蛋白、甲酸魚精蛋白、硝酸魚精蛋白、檸檬酸魚精蛋白、單氫磷酸魚精蛋白、二氫磷酸魚精蛋白、酒石酸魚精蛋白或過氯酸魚精蛋白。
  67. 如請求項66之組合物，其中該魚精蛋白鹽為硫酸魚精蛋白。
  68. 一種包含載體之組合物，其中該載體能夠進入極化上皮細胞或胞吞轉運穿過極化上皮細胞，其中至少60%之該載體在胰酶分析中於0.5小時處完整，其中該胰酶分析包含在37℃下於100 µL磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中將包含100 µg該載體之該組合物與10 µg胰酶一起培育。
  69. 如請求項68之組合物，其中至少90%之該載體在該胰酶分析中於2小時處保持完整。
  70. 如請求項68之組合物，其進一步包含陽離子。
  71. 如請求項70之組合物，其中該陽離子為金屬陽離子或聚陽離子。
  72. 如請求項71之組合物，其中陽離子為金屬陽離子。
  73. 如請求項72之組合物，其中該金屬陽離子為過渡金屬陽離子。
  74. 如請求項68之組合物，其中該載體由假單胞菌外毒素A之一部分組成。
  75. 如請求項68之組合物，其中該載體由Cholix多肽之一部分組成。
  76. 如請求項74之組合物，其中該Cholix多肽由C端在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置206至425中之任一者處之胺基酸序列組成。
  77. 如請求項74之組合物，其中該Cholix多肽由C端在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置150至205中之任一者處之胺基酸序列組成。
  78. 如請求項74之組合物，其中該Cholix多肽由C端在SEQ ID NO: 7之胺基酸150至195中之任一者處之胺基酸序列組成。
  79. 如請求項74之組合物，其中該Cholix多肽由N端在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置1至41中之任一者處之胺基酸序列組成。
  80. 如請求項74之組合物，其中該Cholix多肽由N端在SEQ ID NO: 7之胺基酸位置35至40中之任一者處之胺基酸序列組成。
  81. 如請求項74之組合物，其中該Cholix多肽由SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置40至SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置150至205中之任一者的胺基酸序列組成。
  82. 如請求項74之組合物，其中該Cholix多肽之C端在SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置150至187中之任一者處。
  83. 如請求項74之組合物，其中該Cholix多肽由SEQ ID NO: 8中所闡述之胺基酸序列組成。
  84. 如請求項74之組合物，其中該Cholix多肽由SEQ ID NO: 9或SEQ ID: NO: 10中所闡述之胺基酸序列組成。
  85. 如請求項76至84中任一項之組合物，其中胺基酸位置係基於該Cholix多肽與SEQ ID NO: 7中闡述之序列的比對而編號，其中胺基酸位置自N端至C端且自該N端處之位置1開始編號。
  86. 一種組合物，其包含在位置195-347處結束之Cholix變異體及異源負載物，其中該異源負載物為葡萄糖調節劑。
  87. 如請求項86之組合物，其中該Cholix變異體之結束位置係相對於SEQ ID NO: 7而確定。
  88. 如請求項86之組合物，其中該載體能夠胞吞轉運該異源負載物穿過極化上皮細胞。
  89. 如請求項86之組合物，其中該葡萄糖調節劑為葡萄糖降低劑。
  90. 如請求項89之組合物，其中該葡萄糖降低劑為腸促胰島素、升糖素前蛋白、升糖素肽、類升糖素肽1、類升糖素肽2、腸高血糖素、腸高血糖素相關多肽、抑胃多肽前蛋白、抑胃多肽、二肽基肽酶4、葡萄糖轉運體成員4、前升糖素原、胰島素受體受質1、胰島素、胰島素類似物、載脂蛋白A-II、溶質載體家族2、促進葡萄糖轉運體成員1、肝糖合酶1、肝糖合酶2、酪胺酸蛋白磷酸酶非受體1型、RAC-α絲胺酸蘇胺酸蛋白激酶、過氧化體增殖物活化受體γ、己糖激酶3、磷脂醯肌醇-3,4,5-三磷酸3-磷酸酶及雙特異性蛋白、丙酮酸脫氫酶激酶1、含鈣結合域及捲曲螺旋域之蛋白1、Max樣蛋白X、果糖-二磷酸醛縮酶A、類升糖素肽1受體、類升糖素肽2受體、抑胃多肽受體、類胰島素生長因子1受體、類胰島素生長因子2受體、胰島素受體、GLP-1促效劑-艾塞那肽、GLP-1促效劑-利拉魯肽、艾塞那肽、腸促胰島素類似物-4、腸促胰島素類似物-3、GIPR促效劑(Des-Ala2-GIP1-30)、GIPR促效劑-截短GIP1-30、GLP-1R促效劑(GIP之aa 1-37)、GLP-1R促效劑(GIP之aa 7-36)、利司那肽(商品名Adlyxin®及Lyxumia®，Sanofi)、利拉魯肽(商品名Victoza®，Novo Nordisk A/S)、司美魯肽(商品名Ozempic®，Novo Nordisk A/S)、阿必魯肽(商品名Tanzeum®，GlaxoSmithKline；與白蛋白融合之GLP-1二聚體)、度拉糖肽(商品名Trulicity®，Eli Lilly)、葡萄糖依賴性促胰島素多肽、多特異性肽促效劑、泰帕肽(Eli Lilly)、SAR425899 (Sanofi)、雙澱粉素降鈣素受體促效劑DACRA-089、甘精胰島素/Lantus®、谷賴胰島素/Apidra®、格拉胰島素/Toujeo®、insuman®、地特胰島素/Levemir®、賴脯胰島素/Humalog®/Liprolog®、德谷胰島素/DegludecPlus、門冬胰島素、胰島素及類似物(例如LY-2605541、LY2963016、NN1436)、聚乙二醇化賴脯胰島素、Humulin®、Linjeta、SuliXen®、NN1045、胰島素加SymlinTM、PE0139、速效及短效胰島素(例如Linjeta、PH20、NN1218、HinsBet)、(APC-002)水凝膠、口服、可吸入、經皮及舌下胰島素(例如Exubera®、Nasulin®、Afrezza®、Tregopil®、TPM 02、Capsulin、Oral-lyn®、Cobalamin®、口服胰島素、ORMD-0801、NN1953、NN1954、NN1956、VIAtab及Oshadi口服胰島素)或腸促胰島素類似物-4類似物，其中該腸促胰島素類似物-4類似物為desPro36-腸促胰島素類似物-4(1-39)-Lys6NH2；H-des(Pro36, 37)-腸促胰島素類似物-4-Lys4-NH2；H-des(Pro36, 37)-腸促胰島素類似物-4-Lys5-NH2；desPro36[Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14, Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Trp(O2) 26, Asp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；或desPro36[Trp(O2) 25, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, Asp28 ]腸促胰島素類似物-4 (1-39)；或desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, IsoAsp28]腸促胰島素類似物-4 (1-39)。
  91. 如請求項86之組合物，其中該異源負載物包含腸促胰島素。
  92. 如請求項86之組合物，其中該異源負載物包含艾塞那肽或胰島素。
  93. 如請求項86之組合物，其中該組合物包含顆粒。
  94. 如請求項86之組合物，其中該異源負載物為腸促胰島素類似物-3、埃格納肽、司美魯肽、GLP-1R促效劑(GIP之aa 1-37)、GLP-1R促效劑(GIP之aa 7-36)、泰帕肽、調酸素、GIPR促效劑-截短GIP1-30、雙澱粉素降鈣素受體促效劑、前胰島素原、門冬胰島素、甘精胰島素或賴脯胰島素。
  95. 一種組合物，其包含 衍生自能夠進入極化上皮細胞或胞吞轉運穿過極化上皮細胞之細菌毒素的載體；及 過渡金屬陽離子或聚陽離子，其中該聚陽離子為具有大於2個正電荷之分子或化學複合物。
  96. 如請求項95之組合物，其中該組合物包含過渡金屬陽離子。
  97. 如請求項96之組合物，其中該過渡金屬陽離子選自由以下組成之群：Fe2 + 、Mn2 + 、Zn2 + 、Co2 + 、Ni2 + 及Cu2 + 。
  98. 如請求項95之組合物，其中該過渡金屬陽離子為Zn2 + 。
  99. 如請求項95之組合物，其中該組合物包含該聚陽離子。
  100. 如請求項99之組合物，其中該聚陽離子為魚精蛋白、聚離胺酸、聚鳥胺酸、聚乙烯亞胺(PEI)、醇溶穀蛋白、魚精蛋白、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、聚精胺酸、聚乙烯胺或其組合。
  101. 如請求項99之組合物，其中該聚陽離子為魚精蛋白鹽。
  102. 如請求項99之組合物，其中該魚精蛋白鹽為硫酸魚精蛋白、乙酸魚精蛋白、溴化魚精蛋白、氯化魚精蛋白、己酸魚精蛋白、三氟乙酸魚精蛋白、魚精蛋白HCO3 、丙酸魚精蛋白、乳酸魚精蛋白、甲酸魚精蛋白、硝酸魚精蛋白、檸檬酸魚精蛋白、單氫磷酸魚精蛋白、二氫磷酸魚精蛋白、酒石酸魚精蛋白或過氯酸魚精蛋白。
  103. 如請求項99之組合物，其中該魚精蛋白鹽為硫酸魚精蛋白。
  104. 如請求項95之組合物，其進一步包含異源負載物。
  105. 如請求項103之組合物，其中該異源負載物包含艾塞那肽、胰島素或人類生長激素。
  106. 如請求項95之組合物，其中該載體由假單胞菌外毒素A或假單胞菌外毒素A之一部分組成。
  107. 如請求項104之組合物，其中該載體由SEQ ID NO: 69或SEQ ID NO: 69之一部分的多肽組成。
  108. 如請求項95之組合物，其中該載體由Cholix多肽之一部分組成。
  109. 如請求項95之組合物，其中該Cholix多肽由C端在SEQ ID NO: 1之胺基酸位置206至425中之任一者處之胺基酸序列組成。
  110. 如請求項95之組合物，其中該Cholix多肽由C端在SEQ ID NO: 1之胺基酸位置150至205中之任一者處之胺基酸序列組成。
  111. 如請求項95之組合物，其中該Cholix多肽由C端在SEQ ID NO: 1之胺基酸150至195中之任一者處之胺基酸序列組成。
  112. 如請求項95之組合物，其中該Cholix多肽由N端在SEQ ID NO: 1之胺基酸位置1至41中之任一者處之胺基酸序列組成。
  113. 如請求項95之組合物，其中該Cholix多肽由N端在SEQ ID NO: 1之胺基酸位置35至40中之任一者處之胺基酸序列組成。
  114. 如請求項95之組合物，其中該Cholix多肽由SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置40至SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置150至205中之任一者的胺基酸序列組成。
  115. 如請求項95之組合物，其中該Cholix多肽之C端在SEQ ID NO: 7中闡述之序列之胺基酸位置150至187中之任一者處。
  116. 如請求項95之組合物，其中該Cholix多肽由SEQ ID NO: 8中所闡述之胺基酸序列組成。
  117. 如請求項95之組合物，其中該Cholix多肽由SEQ ID NO: 9或SEQ ID: NO: 10中所闡述之胺基酸序列組成。
  118. 如請求項107至115中任一項之組合物，其中胺基酸位置係基於該Cholix多肽與SEQ ID NO: 7中闡述之序列的比對而編號，其中胺基酸位置自N端至C端且自該N端處之位置1開始編號。
  119. 如請求項95之組合物，其中該組合物包含顆粒。
  120. 一種包含胰島素之組合物，其中至少20%之該胰島素在胰酶分析中於1小時處完整，該胰酶分析包含在37℃下於PBS中將該包含胰島素之組合物與胰酶一起培育。
  121. 如請求項118之組合物，其進一步包含衍生自細菌毒素之載體，其中該載體能夠轉運至極化上皮細胞中或胞吞轉運穿過極化上皮細胞。
  122. 如請求項119之組合物，其中該載體由Cholix多肽之一部分組成。
  123. 如請求項118之組合物，其中該組合物包含過渡金屬陽離子。
  124. 如請求項121之組合物，其中該過渡金屬陽離子選自由以下組成之群：Fe2 + 、Mn2 + 、Zn2 + 、Co2 + 、Ni2 + 及Cu2 + 。
  125. 如請求項121之組合物，其中該過渡金屬陽離子為Zn2 + 。
  126. 如請求項118之組合物，其中該組合物包含聚陽離子。
  127. 如請求項125之組合物，其中該聚陽離子為魚精蛋白。
  128. 如請求項1至125中任一項之組合物，其中該組合物包含顆粒。
  129. 如請求項126之組合物，其中該顆粒包含微米顆粒。
  130. 如請求項127之組合物，其中該微米顆粒係藉由噴霧乾燥形成。
  131. 如請求項126之組合物，其中該顆粒之直徑為約50 nm至約20 µm。
  132. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至129中任一項之組合物。
  133. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至129中任一項之組合物及防腐劑。
  134. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至130中任一項之組合物及醫藥學上可接受之賦形劑。
  135. 一種方法，其包含向個體投與如請求項130至132中任一項之醫藥組合物。
  136. 如請求項133之方法，其中該個體患有發炎性疾病、自體免疫疾病、癌症或代謝病症。
  137. 如請求項134之方法，其中該個體患有代謝病症。
  138. 如請求項135之方法，該代謝病症為糖尿病、由肥胖所致之糖尿病、高血糖症、血脂異常、高三酸甘油酯血症、症候群X、胰島素抗性、葡萄糖耐受性異常(IGT)、糖尿病性血脂異常、高脂質血症、脂肪肝病、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、肝炎、肥胖、血管疾病、心臟病、中風、葡萄糖耐受性異常、空腹葡萄糖升高、胰島素抗性、尿白蛋白分泌、中心型肥胖、高血壓、三酸甘油酯升高、LDL膽固醇升高及HDL膽固醇降低、高血糖症、高胰島素血症、血脂異常、酮病、高三酸甘油酯血症、症候群X、胰島素抗性、空腹葡萄糖異常、葡萄糖耐受性異常(IGT)、糖尿病性血脂異常、葡糖新生、過量肝糖分解、糖尿病性酮酸中毒、高三酸甘油酯血症、高血壓、糖尿病性腎病、腎機能不全、腎衰竭、攝食過量、肌肉耗損、糖尿病神經病變、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性昏迷、動脈硬化、冠心病、外周動脈疾病或高脂質血症。
  139. 一種方法，其包含組合細菌源性載體與異源負載物及陽離子以產生顆粒。
  140. 如請求項137之方法，其中該異源負載物選自由以下組成之群：染料、放射性藥品、激素、細胞介素、抗TNF劑、葡萄糖降低劑、腫瘤相關抗原、肽及多肽。
  141. 如請求項137之方法，其進一步包含噴霧乾燥該細菌源性載體、該異源負載物及該陽離子。
  142. 如請求項137之方法，其中該方法包含(a)製備包含經分離載體及負載物之混合物；(b)製備包含硫酸魚精蛋白及NaPO4 之混合物；及(c)將(a)之該混合物與(b)之該混合物組合且允許該經組合混合物在室溫下靜置隔夜。
  143. 如請求項140之方法，其中該方法進一步包含步驟(d)藉由增加來自步驟(c)之該經組合混合物之離子強度而使來自步驟(c)之顆粒破裂為較小顆粒。
  144. 如請求項140之方法，其中步驟(a)之製備物不包含ZnCl2 。
  145. 如請求項140之方法，其中步驟(a)之製備物包含ZnCl2 。
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