KR20220066057A - 페이로드 전달용 조성물 및 입자 - Google Patents

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KR20220066057A
KR20220066057A KR1020227008746A KR20227008746A KR20220066057A KR 20220066057 A KR20220066057 A KR 20220066057A KR 1020227008746 A KR1020227008746 A KR 1020227008746A KR 20227008746 A KR20227008746 A KR 20227008746A KR 20220066057 A KR20220066057 A KR 20220066057A
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KR
South Korea
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seq
amino acid
carrier
protamine
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KR1020227008746A
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랜달 제이. 미스니
데렉 맥클린
마이클 세카르
케빈 인
타히르 마흐무드
키이 리우
토마스 칼 헌터
Original Assignee
어플라이드 몰레큘라 트랜스포트 인크.
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Abstract

본 발명은 세포 내로 또는 편광 상피 세포를 가로질러 페이로드를 전달하기 위한 입자, 미세입자 또는 나노입자를 포함하는 복합체 및 조성물을 제공한다. 조성물은 편광 상피 세포 내로 또는 이를 가로질러 페이로드를 전달하기 위한 알약 또는 정제에 페이로드를 포함할 수 있다.

Description

페이로드 전달용 조성물 및 입자
상호 참조
본 출원은 2019년 8월 16일에 출원된 미국 가출원 번호 제 62/888,282호, 2019년 11월 14일에 출원된 미국 가출원 번호 제 62/935,615호, 2020년 5월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 제 63/021,029호, 2020년 6월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 제 63/033,151호, 2019년 8월 16일에 출원된 미국 가출원 번호 제 62/888,400호, 2019년 9월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 제 62/899,064호, 2020년 6월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 제 63/033,180호, 및 2019년 9월 11일에 출원된 PCT 특허 출원 번호 PCT/US19/50708의 이익을 주장하며, 이들 출원은 전체 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 페이로드 전달용 조성물 및 입자에 관한 것이다.
큰 거대분자 및/또는 단백질 바이오의약품이 상피, 호흡기 상피 또는 장 상피를 통해 쉽게 흡수될 수 없다는 것은, 이러한 제제의 상업적으로 실행가능한 제형을 개발하는데 있어 제한 요인이 될 수 있다. 예를 들어, 이러한 흡수 불능으로 인해, 불안정한 물질은 상주 효소(resident enzymes)가 이들을 분해할 때까지 장 내강(intestinal lumen)에 남아 있을 수 있으며, 안정한 물질은 이들이 체내에서 배출될 때까지 장 내강에 남아 있을 수 있다. 또한, 치료제의 폐 전달에 문제가 있을 수 있다.
암, 염증성 질환, 면역 질환, 성장 결핍 장애 등과 같은 질환의 치료를 위한 다양한 생물학적 활성제를 평가하는 임상 연구에서 유망한 결과가 있지만, 이러한 제제는 최적의 잠재력에 도달하지 못할 수 있다. 최적의 치료적 유효 투여량의 전달을 방해할 수 있는 짧은 생물학적 반감기, 및/또는 치료적 유효 용량에서 관찰되는 유해한 부작용 및 독성과 같은 내재적 한계로 인해 전반적인 효능이 미미하거나 또는 불충분할 수 있다. 또한, 이러한 제제는 다중 투여 요법을 필요로 할 수 있으며, 이는 정맥내 또는 빈번한 피하 주사에 의한 지속적인 투여를 필요할 수 있고, 이는 환자 및 간병인(caregivers)에게 부담이 될 수 있다. 따라서, 인간 피험자에게 치료제를 투여하는데 사용될 수 있는 새로운 방법 및 조성물이 필요하다. 또한, 피험자에게 글루코오스 조절제의 전달을 위한 개선된 방법 및 조성물이 필요하다.
특정 실시예에서, 편광 상피 세포에 들어갈 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 통과세포외배출(transcytosing)할 수 있는 담체; 및 이종성 페이로드를 포함하는 조성물이 본 명세서에 기재되며, 여기서 이종성 페이로드 대 담체의 몰비는 1:1보다 크다. 일 실시예에서, 조성물은 전이 금속 양이온을 포함한다. 일 실시예에서, 전이 금속 양이온은 Fe2+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Ni2+, 및 Cu2+로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 전이 금속 양이온은 Zn2+이다.
일 실시예에서, 조성물은 다중양이온을 포함한다. 일 실시예에서, 다중양이온은 프로타민이다.
일 실시예에서, 담체는 콜릭스 폴리펩티드의 일부를 포함한다. 일 실시예에서, 담체는 슈도모나스 외독소 A의 일부로 이루어진다. 일 실시예에서, 담체는 콜릭스 폴리펩티드의 일부로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 206 내지 425 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 150 내지 205 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 150 내지 195 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 1 내지 41 중 어느 하나에서 N-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 35 내지 40 중 어느 하나에서 N-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 40에서 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 150 내지 205 중 어느 하나까지 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 150 내지 187 중 어느 하나에서 C-말단을 가진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 9 또는 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 아미노산 위치는 서열번호: 7에 제시된 서열에 대한 콜릭스 폴리펩티드의 정렬을 기반으로 번호매김되며, 여기서 아미노산 위치는 N-말단에서 위치 1부터 시작하여 N-말단에서 C-말단으로 번호매김된다.
일 실시예에서, 이종성 페이로드는 거대분자, 소분자, 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, mRNA, miRNA, shRNA, siRNA, 안티센스 분자, 항체, DNA, 플라스미드, 백신, 고분자 나노입자, 및 촉매-활성 물질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 이종성 페이로드는 치료용 페이로드이다.
일 실시예에서, 이종성 페이로드는 염료 및 방사성의약품, 호르몬, 사이토카인, 항-TNF 제제, 글루코오스 저하제, 종양 관련 항원, 펩티드, 및 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 이종성 페이로드는 위장관에서 염증의 조절제인 폴리펩티드이다.
일 실시예에서, 이종성 페이로드는 글루카곤-유사 펩티드-2 (GLP-2) 유사체이다. 일 실시예에서, GLP-2 유사체는 테두글루티드(Teduglutide)이다.
일 실시예에서, 이종성 페이로드는 사이토카인이다. 일 실시예에서, 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, 및 IL-30으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 사이토카인은 IL-10 이다. 일 실시예에서, 사이토카인은 IL-22 이다. 일 실시예에서, 사이토카인은 천연 분비 신호가 결여되어 있다. 일 실시예에서, 치료용 페이로드는 호르몬이다. 일 실시예에서, 호르몬은 인간 성장 호르몬 (hGH) 이다.
일 실시예에서, 이종성 페이로드는 글로코오스-저하제이다. 일 실시예에서, 이종성 페이로드는 인크레틴(incretin), 글루카곤 프로단백질(glucagon proprotein), 글루카곤 펩티드, 글루카곤-유사 펩티드 1, 글루카곤-유사 펩티드 2, 글리센틴(glicentin), 글리센틴-관련 폴리펩티드, 위 저해 폴리펩티드 전구단백질 (gastric inhibitory polypeptide preprotein), 위 저해 폴리펩티드, 디펩티딜 펩티다제 4, 글루코오스 수송체 일원(glucose transporter member) 4, 프리프로글루카곤(preproglucagon), 인슐린 수용체 기질(insulin receptor substrate) 1, 인슐린, 인슐린 유사체, 아포지질단백질(apolipoprotein) A-II, 용질 담체 계열(solute carrier family) 2, 촉진된 글루코오스 수송체 일원 1, 글리코겐 합성효소 (glycogen synthase) 1, 글리코겐 합성효소 2, 티로신-단백질 포스파타제 비-수용체 유형(tyrosine-protein phosphatase non-receptor type) 1, RAC-알파 세린 트레오닌-단백질 키나제, 퍼옥시좀 증식체-활성화 수용체 감마(peroxisome proliferator-activated receptor gamma), 헥소키나제(hexokinase) 3, 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트 3-포스파타제 및 이중-특이성 단백질, 피루베이트 탈수소효소 키나제(pyruvate dehydrogenase kinase) 1, 칼슘-결합 및 꼬인-코일 (coiled-coil) 도메인-함유 단백질 1, Max-유사 단백질 X, 프룩토오스-비스포스페이트 아돌라제 A, 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체, 글루카곤-유사 펩티드 2 수용체, 위 저해 폴리펩티드 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 2 수용체, 인슐린 수용체, GLP-1 작용제-엑세나티드(agonist-exenatide), GLP-1 작용제-리라글루티드(Liraglutide), 엑세나티드, 엑센딘(exendin)-4, 엑센딘-3, GIPR 작용제 (Des-Ala2-GIP1-30), GIPR 작용제-절단된 GIP1-30, GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 1-37), GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 7-36), 릭시세나티드(lixisenatide) (상표명 Adlyxin®, 및 Lyxumia®, Sanofi), 리라글루티드 (상표명 Victoza®, Novo Nordisk A/S), 세마글루티드(semaglutide) (상표명 Ozempic®, Novo Nordisk A/S), 알비글루티드(albiglutide) (상표명 Tanzeum®, GlaxoSmithKline; 알부민에 융합된 GLP-1 이량체), 두라글루티드(dulaglutide) (상표명 Trulicity®, Eli Lilly), 글루코오스-의존적 인슐린분비성 폴리펩티드(glucose-dependent insulinotropic polypeptide), 다중-특이적 펩티드 작용제, 티르제파티드 (Tirzepatide) (Eli Lilly), SAR425899 (Sanofi), 이중 아밀린 칼시토닌 수용체 작용제(dual amylin calcitonin receptor agonist) DACRA-089, 글라진 (glargine)/Lantus®, 글루리신(glulisin)/Apidra®, 글라린(glarine)/Toujeo®, insuman®, 데테미르(detemir)/Levemir®, 리스프로(lispro)/Humalog®/Liprolog®, Degludec/DegludecPlus, 인슐린 아스파트(insulin aspart), 인슐린 및 유사체 (예를 들어, LY-2605541, LY2963016, NN1436), 페길화 인슐린 리스프로(PEGylated insulin Lispro), Humulin®, 린제타(Linjeta), SuliXen®, NN1045, 인슐린 + SymlinTM, PE0139, 급속-작용(fast-acting) 및 단기-작용(short-acting) 인슐린 (예를 들어, 린제타, PH20, NN1218, HinsBet), (APC-002) 하이드로겔, 경구, 흡입, 경피 및 설하 인슐린 (예를 들어, Exubera®, Nasulin®, Afrezza®, Tregopil®, TPM 02, 캡슐린(Capsulin), Oral-lyn®, Cobalamin®, 경구 인슐린, ORMD-0801, NN1953, NN1954, NN1956, VIAtab, 및 Oshadi 경구 인슐린), 또는 엑센딘-4 유사체이며, 여기서 엑센딘-4 유사체는 desPro36-엑센딘-4(1-39)-Lys6NH2; H-des(Pro36, 37)-엑센딘-4-Lys4-NH2; H-des(Pro36, 37)-엑센딘-4-Lys5-NH2; desPro36[Asp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14, Asp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Trp(O2) 26, Asp28]엑센딘-4 (1-39); 또는 desPro36[Trp(O2) 25, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, Asp28]엑센딘-4 (1-39); 또는 desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39) 이다.
일 실시예에서, 이종성 페이로드는 인슐린 또는 인슐린 유사체이다. 일 실시예에서, 이종성 페이로드는 엑세나티드이다. 일 실시예에서, 이종성 페이로드는 형광 표지를 포함한다. 일 실시예에서, 형광 표지는 플루오레세인이다.
일 실시예에서, 이종성 페이로드는 엑세나티드-플루오레세인 복합체이다. 일 실시예에서, 조성물은 췌장 효소에 의한 절단에 내성이 있다. 일 실시예에서, 담체의 적어도 50%는 판크레아틴 분석에서 2시간에 온전하며, 여기서 판크레아틴 분석은 37℃에서 100 μL 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 100 μg의 담체를 포함하는 조성물과 10 μg의 판크레아틴을 배양하는 단계를 포함한다. 일 실시예에서, 전이 금속 양이온 대 담체의 몰비는 약 100:1 내지 약 300,000:1 이다. 일 실시예에서, 전이 금속 양이온 대 담체의 몰비는 약 1000:1 내지 약 30,000:1 이다. 일 실시예에서, 전이 금속 양이온 대 담체의 몰비는 약 1000:1 내지 약 10,000:1 이다.
일 실시예에서, 프로타민 대 담체의 몰비는 약 10:1 내지 약 0.01:1 이다. 일 실시예에서, 이종성 페이로드 대 담체의 몰비는 약 2:1 내지 약 6000:1 이다. 일 실시예에서, 프로타민 대 담체의 몰비는 약 1:1 이다. 일 실시예에서, 이종성 페이로드 대 담체의 몰비는 약 2:1 내지 약 10:1 이다. 일 실시예에서, 이종성 페이로드 대 담체의 몰비는 약 7:1 이다. 일 실시예에서, 이종성 페이로드 대 담체의 몰비는 약 7.16:1 이다.
일 실시예에서, 이종성 페이로드는 서열번호: 11 또는 서열번호: 14의 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일 실시예에서, 이종성 페이로드는 서열번호: 18 또는 서열번호: 19의 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일 실시예에서, 이종성 페이로드는 서열번호: 20의 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일 실시예에서, 이종성 페이로드는 서열번호: 21의 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일 실시예에서, 이종성 페이로드는 서열번호: 22의 서열을 포함하는 폴리펩티드이다.
일 실시예에서, 조성물은 캡슐화된다. 일 실시예에서, 캡슐화된 조성물은 제 1 조건 하에서 이종성 페이로드를 방출하나, 제 2 조건 하에서는 방출하지 않도록 구성된다. 일 실시예에서, 캡슐화된 조성물은 높은 pH에서 이종성 페이로드를 방출하나, 낮은 pH에서는 방출하지 않도록 구성된다. 일 실시예에서, 캡슐화된 조성물은 장용성 코팅(enteric coating)을 포함한다. 일 실시예에서, 조성물은 입자이다. 일 실시예에서, 조성물은 다중양이온을 포함한다. 일 실시예에서, 담체는 편광 상피 세포에서 이종성 페이로드를 수송할 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 이종성 페이로드를 통과세포외배출할 수 있다. 일 실시예에서, 담체는 다중양이온에 결합된다. 일 실시예에서, 다중양이온은 프로타민, 폴리-리신, 폴리-오르니틴 (poly-ornithine), 폴리-에틸렌-이민 (PEI), 프롤라민(prolamin), 프로타민, 폴리비닐 피롤리돈 (PVP), 폴리아르기닌, 폴리비닐아민, 또는 이들의 조합이다. 일 실시예에서, 다중양이온은 프로타민 염이다. 일 실시예에서, 프로타민 염은 프로타민 설페이트, 프로타민 아세테이트, 프로타민 브로마이드, 프로타민 클로라이드, 프로타민 카프로에이트, 프로타민 트리플루오로아세테이트, 프로타민 HCO3, 프로타민 프로피오네이트, 프로타민 락테이트, 프로타민 포르메이트, 프로타민 니트레이트, 프로타민 시트레이트, 프로타민 모노히드로겐포스페이트(protamine monohydrogenphosphate), 프로타민 디히드로겐포스페이트, 프로타민 타르트레이트, 또는 프로타민 퍼클로레이트(protamine perchlorate) 이다. 일 실시예에서, 프로타민 염은 프로타민 설페이트이다.
일 실시예에서, 편광 상피 세포에 들어갈 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 통과세포외배출할 수 있는 담체가 본 명세서에 기재되며, 여기서 담체의 적어도 60%는 판크레아틴 분석에서 0.5시간에 온전하고, 판크레아틴 분석은 37℃에서 100 μL 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 100 μg의 담체를 포함하는 조성물과 10 μg의 판크레아틴을 배양하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 담체의 적어도 90%는 판크레아틴 분석에서 2시간에 온전하다. 일 실시예에서, 조성물은 양이온을 더 포함한다. 일 실시예에서, 양이온은 금속 양이온 또는 다중양이온이다. 일 실시예에서, 양이온은 금속 양이온이다. 일 실시예에서, 금속 양이온은 전이 금속 양이온이다. 일 실시예에서, 담체는 슈도모나스 외독소 A의 일부로 이루어진다. 일 실시예에서, 담체는 콜릭스 폴리펩티드의 일부로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 206 내지 425 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 150 내지 205 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 150 내지 195 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 1 내지 41 중 어느 하나에서 N-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 35 내지 40 중 어느 하나에서 N-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 40에서 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 150 내지 205 중 어느 하나까지 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 150 내지 187 중 어느 하나에서 C-말단을 가진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 9 또는 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 아미노산 위치는 서열번호: 7에 제시된 서열에 대한 콜릭스 폴리펩티드의 정렬을 기반으로 번호매김되며, 여기서 아미노산 위치는 N-말단에서 위치 1부터 시작하여 N-말단에서 C-말단으로 번호매김된다.
일 실시예에서, 위치 195-347에서 종료하는 콜릭스 변이체 및 이종성 페이로드를 포함하는 조성물이 본 명세서에 기재되며, 여기서 이종성 페이로드는 글루코오스 조절제이다. 일 실시예에서, 콜릭스 변이체의 종료 위치는 서열번호: 7에 대해 결정된다. 일 실시예에서, 담체는 편광 상피 세포를 가로질러 이종성 페이로드를 통과세포외배출할 수 있다. 일 실시예에서, 글루코오스 조절제는 글로코오스-저하제이다. 일 실시예에서, 글로코오스-저하제는 인크레틴, 글루카곤 프로단백질, 글루카곤 펩티드, 글루카곤-유사 펩티드 1, 글루카곤-유사 펩티드 2, 글리센틴, 글리센틴-관련 폴리펩티드, 위 저해 폴리펩티드 전구단백질, 위 저해 폴리펩티드, 디펩티딜 펩티다제 4, 글루코오스 수송체 일원 4, 프리프로글루카곤, 인슐린 수용체 기질 1, 인슐린, 인슐린 유사체, 아포지질단백질 A-II, 용질 담체 계열 2, 촉진된 글루코오스 수송체 일원 1, 글리코겐 합성효소 1, 글리코겐 합성효소 2, 티로신-단백질 포스파타제 비-수용체 유형 1, RAC-알파 세린 트레오닌-단백질 키나제, 퍼옥시좀 증식체-활성화 수용체 감마, 헥소키나제 3, 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트 3-포스파타제 및 이중-특이성 단백질, 피루베이트 탈수소효소 키나제 1, 칼슘-결합 및 꼬인-코일 도메인-함유 단백질 1, Max-유사 단백질 X, 프룩토오스-비스포스페이트 아돌라제 A, 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체, 글루카곤-유사 펩티드 2 수용체, 위 저해 폴리펩티드 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 2 수용체, 인슐린 수용체, GLP-1 작용제-엑세나티드, GLP-1 작용제-리라글루티드, 엑세나티드, 엑센딘-4, 엑센딘-3, GIPR 작용제 (Des-Ala2-GIP1-30), GIPR 작용제-절단된 GIP1-30, GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 1-37), GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 7-36), 릭시세나티드 (상표명 Adlyxin®, 및 Lyxumia®, Sanofi), 리라글루티드 (상표명 Victoza®, Novo Nordisk A/S), 세마글루티드 (상표명 Ozempic®, Novo Nordisk A/S), 알비글루티드 (상표명 Tanzeum®, GlaxoSmithKline; 알부민에 융합된 GLP-1 이량체), 두라글루티드 (상표명 Trulicity®, Eli Lilly), 글루코오스-의존적 인슐린분비성 폴리펩티드, 다중-특이적 펩티드 작용제, 티르제파티드 (Eli Lilly), SAR425899 (Sanofi), 이중 아밀린 칼시토닌 수용체 작용제 DACRA-089, 글라진/Lantus®, 글루리신/Apidra®, 글라린/Toujeo®, insuman®, 데테미르/Levemir®, 리스프로/Humalog®/Liprolog®, Degludec/DegludecPlus, 인슐린 아스파트, 인슐린 및 유사체 (예를 들어, LY-2605541, LY2963016, NN1436), 페길화 인슐린 리스프로, Humulin®, 린제타, SuliXen®, NN1045, 인슐린 + SymlinTM, PE0139, 급속-작용 및 단기-작용 인슐린 (예를 들어, 린제타, PH20, NN1218, HinsBet), (APC-002) 하이드로겔, 경구, 흡입, 경피 및 설하 인슐린 (예를 들어, Exubera®, Nasulin®, Afrezza®, Tregopil®, TPM 02, 캡슐린, Oral-lyn®, Cobalamin®, 경구 인슐린, ORMD-0801, NN1953, NN1954, NN1956, VIAtab, 및 Oshadi 경구 인슐린), 또는 엑센딘-4 유사체이며, 여기서 엑센딘-4 유사체는 desPro36-엑센딘-4(1-39)-Lys6NH2; H-des(Pro36, 37)-엑센딘-4-Lys4-NH2; H-des(Pro36, 37)-엑센딘-4-Lys5-NH2; desPro36[Asp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14, Asp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Trp(O2) 26, Asp28]엑센딘-4 (1-39); 또는 desPro36[Trp(O2) 25, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, Asp28]엑센딘-4 (1-39); 또는 desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39) 이다.
일 실시예에서, 이종성 페이로드는 인크레틴을 포함한다. 일 실시예에서, 이종성 페이로드는 엑세나티드 또는 인슐린을 포함한다. 일 실시예에서, 조성물은 입자를 포함한다. 일 실시예에서, 이종성 페이로드는 엑센딘-3, 에페글레나티드 (efpeglenatide), 세마글루티드, GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 1-37), GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 7-36), 티르제파티드, 옥시토모듈린(oxyntomodulin), GIPR 작용제-절단된 GIP1-30, 이중 아밀린 칼시토닌 수용체 작용제, 프리프로인슐린, 인슐린 아스파트, 인슐린 글라진, 또는 인슐린 리스프로이다.
일 실시예에서, 편광 상피 세포에 들어갈 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 통과세포외배출할 수 있는 박테리아 독소로부터 유래된 담체; 및 전이 금속 양이온 또는 다중양이온을 포함하는 조성물이 본 명세서에 기재되며, 여기서 다중양이온은 2 이상의 양전하를 갖는 분자 또는 화학적 복합체이다. 일 실시예에서, 조성물은 전이 금속 양이온을 포함한다. 일 실시예에서, 전이 금속 양이온은 Fe2+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Ni2+, 및 Cu2+로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 전이 금속 양이온은 Zn2+이다. 일 실시예에서, 조성물은 다중양이온을 포함한다.
일 실시예에서, 다중양이온은 프로타민, 폴리-리신, 폴리-오르니틴, 폴리-에틸렌-이민 (PEI), 프롤라민, 프로타민, 폴리비닐 피롤리돈 (PVP), 폴리아르기닌, 폴리비닐아민, 또는 이들의 조합이다. 일 실시예에서, 다중양이온은 프로타민 염이다. 일 실시예에서, 프로타민 염은 프로타민 설페이트, 프로타민 아세테이트, 프로타민 브로마이드, 프로타민 클로라이드, 프로타민 카프로에이트, 프로타민 트리플루오로아세테이트, 프로타민 HCO3, 프로타민 프로피오네이트, 프로타민 락테이트, 프로타민 포르메이트, 프로타민 니트레이트, 프로타민 시트레이트, 프로타민 모노히드로겐포스페이트, 프로타민 디히드로겐포스페이트, 프로타민 타르트레이트, 또는 프로타민 퍼클로레이트이다. 일 실시예에서, 프로타민 염은 프로타민 설페이트이다. 일 실시예에서, 조성물은 이종성 페이로드를 더 포함한다. 일 실시예에서, 이종성 페이로드는 엑세나티드, 인슐린, 또는 인간 성장 호르몬을 포함한다.
일 실시예에서, 담체는 슈도모나스 외독소 A 또는 슈도모나스 외독소 A의 일부로 이루어진다. 일 실시예에서, 담체는 서열번호: 69의 폴리펩티드 또는 서열번호: 69의 일부로 이루어진다. 일 실시예에서, 담체는 콜릭스 폴리펩티드의 일부로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 위치 206 내지 425 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 위치 150 내지 205 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 위치 150 내지 195 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 위치 1 내지 41 중 어느 하나에서 N-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 위치 35 내지 40 중 어느 하나에서 N-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 40에서 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 150 내지 205 중 어느 하나까지 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 150 내지 187 중 어느 하나에서 C-말단을 가진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 9 또는 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시예에서, 아미노산 위치는 서열번호: 7에 제시된 서열에 대한 콜릭스 폴리펩티드의 정렬을 기반으로 번호매김되며, 여기서 아미노산 위치는 N-말단에서 위치 1부터 시작하여 N-말단에서 C-말단으로 번호매김된다. 일 실시예에서, 조성물은 입자를 포함한다.
일 실시예에서, 인슐린을 포함하는 조성물이 본 명세서에 기재되며, 여기서 인슐린의 적어도 20%는 37℃에서 PBS에서 인슐린을 포함하는 조성물과 판크레아틴을 배양하는 단계를 포함하는 판크레아틴 분석에서 1시간에 온전하다. 일 실시예에서, 인슐린을 포함하는 조성물이 본 명세서에 기재되며, 여기서 인슐린의 적어도 20%는 14시간 동안 37℃에서 142 ug/ml (인슐린 함량)로 모의 장액(simulated intestinal fluid) USP (Rica Pharmaceuticals R7109000-500A, 4x 희석, pH 6.8)에서 인슐린 함유 입자를 배양하는 단계를 포함하는 모의 장액 분석에서 1시간에 온전하다.
일 실시예에서, 조성물은 박테리아 독소로부터 유래된 담체를 더 포함하며, 여기서 담체는 편광 상피 세포 내로 수송할 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 통과세포외배출할 수 있다. 일 실시예에서, 담체는 콜릭스 폴리펩티드의 일부로 이루어진다. 일 실시예에서, 조성물은 전이 금속 양이온을 포함한다. 일 실시예에서, 전이 금속 양이온은 Fe2+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Ni2+, 및 Cu2+로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 전이 금속 양이온은 Zn2+이다. 일 실시예에서, 조성물은 다중양이온을 포함한다. 일 실시예에서, 다중양이온은 프로타민이다. 일 실시예에서, 조성물은 입자를 포함한다. 일 실시예에서, 입자는 미세입자를 포함한다. 일 실시예에서, 미세입자는 분무 건조에 의해 형성된다. 일 실시예에서, 입자는 약 50 nm 내지 약 20 μm의 직경을 가진다.
일 실시예에서, 본 명세서에 기재된 조성물을 포함하는 약학 조성물이 본 명세서에 기재된다. 일 실시예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 보존제를 포함하는 약학 조성물이 본 명세서에 기재된다. 일 실시예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물이 본 명세서에 기재된다. 일 실시예에서, 본 명세서에 기재된 약학 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 기재된다. 일 실시예에서, 피험자는 염증성 질환, 자가면역 질환, 암, 또는 대사성 장애를 가진다. 일 실시예에서, 피험자는 대사성 장애를 가진다.
일 실시예에서, 대사성 장애는 당뇨병, 비만으로 인한 당뇨병, 고혈당증, 이상지질혈증(dyslipidemia), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), X 증후군, 인슐린 저항성, 내당능 장애(impaired glucose tolerance, IGT), 당뇨병성 이상지질혈증, 고지혈증, 지방간 질환, 비알콜성 지방간염(nonalcoholic steatohepatitis, NASH), 간염, 비만, 혈관 질환(vascular disease), 심장 질환, 뇌졸중, 공복 혈당 상승, 요로 알부민 분비(urinary albumin secretion), 중심성 비만(central obesity), 고혈압, 중성지방 상승, LDL 콜레스테롤 상승 및 HDL 콜레스테롤 감소, 고인슐린혈증(hyperinsulinemia), 케톤증(ketosis), 공복 혈당 장애(impaired fasting glucose), 글루코오스신생합성(gluconeogenesis), 과잉 글리코겐분해 (excess glycogenolysis), 당뇨병성 케톤산증(diabetic ketoacidosis), 당뇨병성 신증(diabetic nephropathy), 신기능부전(renal insufficiency), 신부전(renal failure), 과식증(hyperphagia), 근육 소모, 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 당뇨병성 혼수(diabetic coma), 동맥경화증, 관상 동맥성 심장 질환(coronary heart disease), 또는 말초 동맥 질환(peripheral artery disease)이다.
일 실시예에서, 박테리아 유래 담체를 이종성 페이로드 및 양이온과 조합하여 입자를 생성하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 기재된다. 일 실시예에서, 이종성 페이로드는 염료, 방사성의약품, 호르몬, 사이토카인, 항-TNF 제제, 글루코오스 저하제, 종양 관련 항원, 펩티드, 및 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 방법은 박테리아 유래 담체, 이종성 페이로드 및 양이온을 분무 건조하는 단계를 더 포함한다. 일 실시예에서, 방법은 (a) 분리된 담체 및 페이로드를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; (b) 프로타민 설페이트 및 NaPO4를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; 및 (c) (a)의 혼합물을 (b)의 혼합물에 합하고 합한 혼합물을 실온에서 밤새도록 두는 단계를 포함한다. 일 실시예에서, 방법은 단계 (d) 단계 (c)로부터의 합한 혼합물의 이온 강도를 증가시킴으로써 단계 (c)로부터의 입자를 더 작은 입자로 파괴하는 단계를 더 포함한다. 일 실시예에서, 단계 (a)의 제조는 ZnCl2를 포함하지 않는다. 일 실시예에서, 단계 (a)의 제조는 ZnCl2를 포함한다.
본 발명의 측면은 편광 상피 세포에 들어갈 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 통과세포외배출할 수 있는 담체; 및 이종성 페이로드를 포함하는 조성물이며, 여기서 이종성 페이로드 대 담체의 몰비는 1:1보다 크다.
조성물은 입자일 수 있다. 입자는 미세입자일 수 있다. 미세입자는 분무 건조에 의해 형성될 수 있다. 입자 또는 미세입자는 약 50 nm 내지 약 20 μm의 직경을 가진다.
일부 경우에, 조성물은 전이 금속 양이온을 포함한다. 전이 금속 양이온은 Fe2+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Ni2+, 및 Cu2+로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 전이 금속 양이온은 Zn2+ 일 수 있다.
일부 경우에, 조성물은 다중양이온을 포함한다. 다중양이온은 프로타민일 수 있다.
조성물은 박테리아 독소로부터 유래된 담체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 담체는 편광 상피 세포에 들어갈 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 통과세포외배출할 수 있다. 일부 경우에, 담체는 다중양이온에 결합될 수 있다.
담체는 슈도모나스 외독소 A의 일부를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 담체는 슈도모나스 외독소 A의 일부로 이루어진다. 담체는 콜릭스 폴리펩티드의 일부를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 담체는 콜릭스 폴리펩티드의 일부로 이루어진다. 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 206 내지 425 중 어느 하나에서 C-말단 절단을 갖는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 150 내지 205 중 어느 하나에서 C-말단 절단을 갖는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 150 내지 195 중 어느 하나에서 C-말단 절단을 갖는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 1 내지 41 중 어느 하나에서 N-말단 절단을 갖는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 35 내지 40 중 어느 하나에서 N-말단 절단을 갖는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 40에서 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 150 내지 205 중 어느 하나까지 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 150 또는 아미노산 위치 187에서 종료할 수 있다. 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 9 또는 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 아미노산 위치는 서열번호: 7에 제시된 서열에 대한 콜릭스 폴리펩티드의 정렬을 기반으로 번호매김될 수 있으며, 여기서 아미노산 위치는 N-말단에서 위치 1부터 시작하여 N-말단에서 C-말단으로 번호매김될 수 있다.
일부 경우에, 조성물은 이종성 페이로드를 포함한다. 이종성 페이로드는 거대분자, 소분자, 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, 전령 RNA (mRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 작은 헤어핀 RNA (shRNA), 작은 간섭 RNA (siRNA), CRISPR RNA (예를 들어, 가이드 RNA, 예를 들어, 단일 가이드 RNA (sgRNA)), 안티센스 분자, 단백질, 항체, DNA, 플라스미드, 백신, 고분자 나노입자, 및 촉매-활성 물질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
이종성 페이로드는 치료용 페이로드일 수 있다. 이종성 페이로드는 염료 및 방사성의약품, 호르몬, 사이토카인, 항-TNF 제제, 글루코오스 저하제, 종양 관련 항원, 펩티드, 및 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이종성 페이로드는 위장관에서 염증의 조절제인 폴리펩티드이다. 치료용 페이로드는 글루카곤-유사 펩티드-2 (GLP-2) 유사체일 수 있다. GLP-2 유사체는 테두글루티드이다.
이종성 페이로드는 사이토카인일 수 있다. 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, 및 IL-30으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 사이토카인은 IL-10일 수 있다. 사이토카인은 IL-22일 수 있다. 사이토카인은 천연 분비 신호가 결여될 수 있다.
이종성 페이로드는 호르몬일 수 있다. 호르몬은 인간 성장 호르몬 (hGH)일 수 있다.
이종성 페이로드는 글로코오스-저하제일 수 있다. 이종성 페이로드는 인크레틴, 글루카곤 프로단백질, 글루카곤 펩티드, 글루카곤-유사 펩티드 1, 글루카곤-유사 펩티드 2, 글리센틴, 글리센틴-관련 폴리펩티드, 위 저해 폴리펩티드 전구단백질, 위 저해 폴리펩티드, 디펩티딜 펩티다제 4, 글루코오스 수송체 일원 4, 프리프로글루카곤, 인슐린 수용체 기질 1, 인슐린, 인슐린 유사체, 아포지질단백질 A-II, 용질 담체 계열 2, 촉진된 글루코오스 수송체 일원 1, 글리코겐 합성효소 1, 글리코겐 합성효소 2, 티로신-단백질 포스파타제 비-수용체 유형 1, RAC-알파 세린 트레오닌-단백질 키나제, 퍼옥시좀 증식체-활성화 수용체 감마, 헥소키나제 3, 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트 3-포스파타제 및 이중-특이성 단백질, 피루베이트 탈수소효소 키나제 1, 칼슘-결합 및 꼬인-코일 도메인-함유 단백질 1, Max-유사 단백질 X, 프룩토오스-비스포스페이트 아돌라제 A, 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체, 글루카곤-유사 펩티드 2 수용체, 위 저해 폴리펩티드 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 2 수용체, 인슐린 수용체, GLP-1 작용제-엑세나티드, GLP-1 작용제-리라글루티드, 엑세나티드, 엑센딘-4, 엑센딘-3, GIPR 작용제 (Des-Ala2-GIP1-30), GIPR 작용제-절단된 GIP1-30, GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 1-37), GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 7-36), 릭시세나티드 (상표명 Adlyxin®, 및 Lyxumia®, Sanofi), 리라글루티드 (상표명 Victoza®, Novo Nordisk A/S), 세마글루티드 (상표명 Ozempic®, Novo Nordisk A/S), 알비글루티드 (상표명 Tanzeum®, GlaxoSmithKline; 알부민에 융합된 GLP-1 이량체), 두라글루티드 (상표명 Trulicity®, Eli Lilly), 글루코오스-의존적 인슐린분비성 폴리펩티드, 다중-특이적 펩티드 작용제, 티르제파티드 (Eli Lilly), SAR425899 (Sanofi), 이중 아밀린 칼시토닌 수용체 작용제 DACRA-089, 글라진/Lantus®, 글루리신/Apidra®, 글라린/Toujeo®, insuman®, 데테미르/Levemir®, 리스프로/Humalog®/Liprolog®, Degludec/DegludecPlus, 인슐린 아스파트, 인슐린 및 유사체 (예를 들어, LY-2605541, LY2963016, NN1436), 페길화 인슐린 리스프로, Humulin®, 린제타, SuliXen®, NN1045, 인슐린 + SymlinTM, PE0139, 급속-작용 및 단기-작용 인슐린 (예를 들어, 린제타, PH20, NN1218, HinsBet), (APC-002) 하이드로겔, 경구, 흡입, 경피 및 설하 인슐린 (예를 들어, Exubera®, Nasulin®, Afrezza®, Tregopil®, TPM 02, 캡슐린, Oral-lyn®, Cobalamin®, 경구 인슐린, ORMD-0801, NN1953, NN1954, NN1956, VIAtab, 및 Oshadi 경구 인슐린), 또는 엑센딘-4 유사체일 수 있으며, 여기서 엑센딘-4 유사체는 desPro36-엑센딘-4(1-39)-Lys6NH2; H-des(Pro36, 37)-엑센딘-4-Lys4-NH2; H-des(Pro36, 37)-엑센딘-4-Lys5-NH2; desPro36[Asp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14, Asp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Trp(O2) 26, Asp28]엑센딘-4 (1-39); 또는 desPro36[Trp(O2) 25, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, Asp28]엑센딘-4 (1-39); 또는 desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39) 일 수 있다. 이종성 페이로드는 인슐린 또는 인슐린 유사체일 수 있다. 이종성 페이로드는 엑세나티드일 수 있다.
이종성 페이로드는 형광 표지를 포함할 수 있다. 형광 표지는 플루오레세인일 수 있다. 이종성 페이로드는 엑세나티드-플루오레세인 복합체일 수 있다.
일부 경우에, 조성물은 췌장 효소에 의한 절단에 내성이 있다. 담체의 적어도 50%는 2시간 동안 췌장 효소에 노출된 후에도 온전하게 남아 있을 수 있다. 담체의 적어도 50%는 판크레아틴 분석에서 2시간 후에 온전하게 남아 있을 수 있으며, 여기서 판크레아틴 분석은 37℃에서 100 μL 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 100 μg의 담체를 포함하는 조성물과 10 μg의 판크레아틴을 배양하는 단계를 포함한다.
전이 금속 양이온 대 담체의 몰비는 약 100:1 내지 약 300,000:1 일 수 있다. 전이 금속 양이온 대 담체의 몰비는 약 1000:1 내지 약 30,000:1 일 수 있다. 전이 금속 양이온 대 담체의 몰비는 약 1000:1 내지 약 10,000:1 일 수 있다.
프로타민 대 담체의 몰비는 약 10:1 내지 약 0.01:1 일 수 있다. 이종성 페이로드 대 담체의 몰비는 약 2:1 내지 약 6000:1 일 수 있다. 프로타민 대 담체의 몰비는 약 1:1 일 수 있다.
이종성 페이로드 대 담체의 몰비는 약 2:1 내지 약 10:1 일 수 있다. 이종성 페이로드 대 담체의 몰비는 약 7:1 일 수 있다. 이종성 페이로드 대 담체의 몰비는 약 7.16:1 일 수 있다.
이종성 페이로드는 서열번호: 11 또는 서열번호: 14의 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 이종성 페이로드는 서열번호: 18 또는 서열번호: 19의 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 이종성 페이로드는 서열번호: 20의 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 이종성 페이로드는 서열번호: 21의 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 이종성 페이로드는 서열번호: 22의 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
조성물은 캡슐화될 수 있다. 캡슐화된 조성물은 제 1 조건 하에서 이종성 페이로드를 방출하나, 제 2 조건 하에서는 방출하지 않도록 구성될 수 있다. 캡슐화된 조성물은 높은 pH에서 이종성 페이로드를 방출하나, 낮은 pH에서는 방출하지 않도록 구성될 수 있다. 캡슐화된 조성물은 장용성 코팅을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 임의의 본 명세서에 개시된 조성물을 포함하는 약학 조성물이다.
일부 경우에, 다중양이온은 프로타민, 폴리-리신, 폴리-오르니틴, 폴리-에틸렌-이민 (PEI), 프롤라민, 프로타민, 폴리비닐 피롤리돈 (PVP), 폴리아르기닌, 폴리비닐아민, 또는 이들의 조합이다. 일부 경우에, 다중양이온은 프로타민 염이다. 일부 경우에, 프로타민 염은 프로타민 설페이트, 프로타민 아세테이트, 프로타민 브로마이드, 프로타민 클로라이드, 프로타민 카프로에이트, 프로타민 트리플루오로아세테이트, 프로타민 HCO3, 프로타민 프로피오네이트, 프로타민 락테이트, 프로타민 포르메이트, 프로타민 니트레이트, 프로타민 시트레이트, 프로타민 모노히드로겐포스페이트, 프로타민 디히드로겐포스페이트, 프로타민 타르트레이트, 또는 프로타민 퍼클로레이트이다. 일부 경우에, 프로타민 염은 프로타민 설페이트이다.
본 발명의 측면은 담체를 포함하는 조성물이며, 여기서 담체는 편광 상피 세포에 들어갈 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 통과세포외배출할 수 있으며, 담체의 적어도 60%는 판크레아틴 분석에서 0.5시간에 온전하고, 판크레아틴 분석은 37℃에서 100 μL 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 100 μg의 담체를 포함하는 조성물과 10 μg의 판크레아틴을 배양하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 담체의 적어도 90%는 판크레아틴 분석에서 2시간에 온전하다.
일부 경우에, 조성물은 양이온을 더 포함한다. 일부 경우에, 양이온은 금속 양이온 또는 다중양이온이다. 일부 경우에, 양이온은 금속 양이온이다. 일부 경우에, 금속 양이온은 전이 금속 양이온이다. 일부 경우에, 담체는 슈도모나스 외독소 A의 일부로 이루어진다. 일부 경우에, 담체는 콜릭스 폴리펩티드의 일부로 이루어진다. 일부 경우에, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 206 내지 425 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 경우에, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 150 내지 205 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 경우에, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 150 내지 195 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 경우에, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 1 내지 41 중 어느 하나에서 N-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 경우에, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 35 내지 40 중 어느 하나에서 N-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 경우에, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 40에서 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 150 내지 205 중 어느 하나까지 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 경우에, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 150 내지 187 중 어느 하나에서 C-말단을 가진다. 일부 경우에, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 경우에, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 9 또는 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 경우에, 아미노산 위치는 서열번호: 7에 제시된 서열에 대한 콜릭스 폴리펩티드의 정렬을 기반으로 번호매김되며, 여기서 아미노산 위치는 N-말단에서 위치 1부터 시작하여 N-말단에서 C-말단으로 번호매김된다.
본 발명의 또 다른 측면은 위치 195-347에서 종료하는 콜릭스 변이체 및 이종성 페이로드를 포함하는 조성물이며, 여기서 이종성 페이로드는 글루코오스 조절제이다. 일부 경우에, 콜릭스 변이체의 종료 위치는 서열번호: 7에 대해 결정된다. 일부 경우에, 담체는 편광 상피 세포를 가로질러 이종성 페이로드를 통과세포외배출할 수 있다. 일부 경우에, 글루코오스 조절제는 글로코오스-저하제이다. 일부 경우에, 글로코오스-저하제는 인크레틴, 글루카곤 프로단백질, 글루카곤 펩티드, 글루카곤-유사 펩티드 1, 글루카곤-유사 펩티드 2, 글리센틴, 글리센틴-관련 폴리펩티드, 위 저해 폴리펩티드 전구단백질, 위 저해 폴리펩티드, 디펩티딜 펩티다제 4, 글루코오스 수송체 일원 4, 프리프로글루카곤, 인슐린 수용체 기질 1, 인슐린, 인슐린 유사체, 아포지질단백질 A-II, 용질 담체 계열 2, 촉진된 글루코오스 수송체 일원 1, 글리코겐 합성효소 1, 글리코겐 합성효소 2, 티로신-단백질 포스파타제 비-수용체 유형 1, RAC-알파 세린 트레오닌-단백질 키나제, 퍼옥시좀 증식체-활성화 수용체 감마, 헥소키나제 3, 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트 3-포스파타제 및 이중-특이성 단백질, 피루베이트 탈수소효소 키나제 1, 칼슘-결합 및 꼬인-코일 도메인-함유 단백질 1, Max-유사 단백질 X, 프룩토오스-비스포스페이트 아돌라제 A, 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체, 글루카곤-유사 펩티드 2 수용체, 위 저해 폴리펩티드 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 2 수용체, 인슐린 수용체, GLP-1 작용제-엑세나티드, GLP-1 작용제-리라글루티드, 엑세나티드, 엑센딘-4, 엑센딘-3, GIPR 작용제 (Des-Ala2-GIP1-30), GIPR 작용제-절단된 GIP1-30, GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 1-37), GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 7-36), 릭시세나티드 (상표명 Adlyxin®, 및 Lyxumia®, Sanofi), 리라글루티드 (상표명 Victoza®, Novo Nordisk A/S), 세마글루티드 (상표명 Ozempic®, Novo Nordisk A/S), 알비글루티드 (상표명 Tanzeum®, GlaxoSmithKline; 알부민에 융합된 GLP-1 이량체), 두라글루티드 (상표명 Trulicity®, Eli Lilly), 글루코오스-의존적 인슐린분비성 폴리펩티드, 다중-특이적 펩티드 작용제, 티르제파티드 (Eli Lilly), SAR425899 (Sanofi), 이중 아밀린 칼시토닌 수용체 작용제 DACRA-089, 글라진/Lantus®, 글루리신/Apidra®, 글라린/Toujeo®, insuman®, 데테미르/Levemir®, 리스프로/Humalog®/Liprolog®, Degludec/DegludecPlus, 인슐린 아스파트, 인슐린 및 유사체 (예를 들어, LY-2605541, LY2963016, NN1436), 페길화 인슐린 리스프로, Humulin®, 린제타, SuliXen®, NN1045, 인슐린 + SymlinTM, PE0139, 급속-작용 및 단기-작용 인슐린 (예를 들어, 린제타, PH20, NN1218, HinsBet), (APC-002) 하이드로겔, 경구, 흡입, 경피 및 설하 인슐린 (예를 들어, Exubera®, Nasulin®, Afrezza®, Tregopil®, TPM 02, 캡슐린, Oral-lyn®, Cobalamin®, 경구 인슐린, ORMD-0801, NN1953, NN1954, NN1956, VIAtab, 및 Oshadi 경구 인슐린), 또는 엑센딘-4 유사체이며, 여기서 엑센딘-4 유사체는 desPro36-엑센딘-4(1-39)-Lys6NH2; H-des(Pro36, 37)-엑센딘-4-Lys4-NH2; H-des(Pro36, 37)-엑센딘-4-Lys5-NH2; desPro36[Asp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14, Asp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Trp(O2) 26, Asp28]엑센딘-4 (1-39); 또는 desPro36[Trp(O2) 25, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, Asp28]엑센딘-4 (1-39); 또는 desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39) 이다. 일부 경우에, 이종성 페이로드는 인크레틴을 포함한다. 일부 경우에, 이종성 페이로드는 엑세나티드 또는 인슐린을 포함한다. 일부 경우에, 조성물은 입자를 포함한다. 일부 경우에, 이종성 페이로드는 엑센딘-3, 에페글레나티드, 세마글루티드, GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 1-37), GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 7-36), 티르제파티드, 옥시토모듈린, GIPR 작용제-절단된 GIP1-30, 이중 아밀린 칼시토닌 수용체 작용제, 프리프로인슐린, 인슐린 아스파트, 인슐린 글라진, 또는 인슐린 리스프로이다.
본 발명의 측면은 편광 상피 세포에 들어갈 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 통과세포외배출할 수 있는 박테리아 독소로부터 유래된 담체; 및 전이 금속 양이온 또는 다중양이온을 포함하는 조성물이며, 여기서 다중양이온은 2 이상의 양전하를 갖는 분자 또는 화학적 복합체이다. 일부 경우에, 조성물은 전이 금속 양이온을 포함한다. 일부 경우에, 전이 금속 양이온은 Fe2+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Ni2+, 및 Cu2+로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 전이 금속 양이온은 Zn2+이다. 일부 경우에, 조성물은 다중양이온을 포함한다. 일부 경우에, 다중양이온은 프로타민 염이다. 일부 경우에, 조성물은 이종성 페이로드를 더 포함한다. 일부 경우에, 이종성 페이로드는 엑세나티드, 인슐린, 또는 인간 성장 호르몬을 포함한다. 일부 경우에, 담체는 슈도모나스 외독소 A 또는 슈도모나스 외독소 A의 일부로 이루어진다. 일부 경우에, 담체는 서열번호: 69의 폴리펩티드 또는 서열번호: 69의 일부로 이루어진다. 일부 경우에, 담체는 콜릭스 폴리펩티드의 일부로 이루어진다. 일부 경우에, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 위치 206 내지 425 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 경우에, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 위치 150 내지 205 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 경우에, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 위치 150 내지 195 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 경우에, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 위치 1 내지 41 중 어느 하나에서 N-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 경우에, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 위치 35 내지 40 중 어느 하나에서 N-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 경우에, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 40에서 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 150 내지 205 중 어느 하나까지 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 경우에, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 150 내지 187 중 어느 하나에서 C-말단을 가진다. 일부 경우에, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 경우에, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 9 또는 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 경우에, 아미노산 위치는 서열번호: 7에 제시된 서열에 대한 콜릭스 폴리펩티드의 정렬을 기반으로 번호매김되며, 여기서 아미노산 위치는 N-말단에서 위치 1부터 시작하여 N-말단에서 C-말단으로 번호매김된다. 일부 경우에, 조성물은 입자를 포함한다.
본 발명의 측면은 인슐린을 포함하는 조성물이며, 여기서 인슐린의 적어도 20%는 37℃에서 PBS에서 인슐린을 포함하는 조성물과 판크레아틴을 배양하는 단계를 포함하는 판크레아틴 분석에서 1시간에 온전하다. 일부 경우에, 10 μg의 인슐린은 37℃에서 PBS에서 10 μg의 판크레아틴과 함께 1시간 동안 배양된다. 일부 경우에, 조성물은 박테리아 독소로부터 유래된 담체를 더 포함하며, 여기서 담체는 편광 상피 세포 내로 수송할 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 통과세포외배출할 수 있다. 일부 경우에, 담체는 콜릭스 폴리펩티드의 일부로 이루어진다. 일부 경우에, 조성물은 전이 금속 양이온을 포함한다. 일부 경우에, 전이 금속 양이온은 Fe2+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Ni2+, 및 Cu2+로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 전이 금속 양이온은 Zn2+이다. 일부 경우에, 조성물은 다중양이온을 포함한다. 일부 경우에, 다중양이온은 프로타민이다. 일부 경우에, 조성물은 입자를 포함한다. 일부 경우에, 입자는 미세입자를 포함한다. 일부 경우에, 미세입자는 분무 건조에 의해 형성된다. 일부 경우에, 입자는 약 50 nm 내지 약 20 μm의 직경을 가진다.
본 발명의 다른 측면은 임의의 본 명세서에 기재된 조성물 및 보존제를 포함하는 약학 조성물이다.
본 발명의 또 다른 측면은 임의의 본 명세서에 기재된 조성물 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물이다.
일 측면에서, 본 발명은 임의의 본 명세서에 기재된 약학 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 피험자에서 질환의 치료 방법을 제공한다.
질환은 염증성 질환, 자가면역 질환, 암, 또는 대사성 장애일 수 있다.
질환은 대사성 장애일 수 있다. 대사성 장애는 당뇨병 (T1D 또는 T2D), 비만으로 인한 당뇨병, 고혈당증, 이상지질혈증, 고중성지방혈증, X 증후군, 인슐린 저항성, 공복 혈당 장애, 내당능 장애 (IGT), 당뇨병성 이상지질혈증, 고지혈증, 지방간 질환, 비알콜성 지방간염, 간염, 비만, 혈관 질환, 심장 질환, 뇌졸중, 공복 혈당 상승, 요로 알부민 분비, 중심성 비만, 고혈압, 중성지방 상승, LDL 콜레스테롤 상승 및 HDL 콜레스테롤 감소, 고인슐린혈증, 케톤증, 글루코오스신생합성, 과잉 글리코겐분해, 당뇨병성 케톤산증, 당뇨병성 신증, 신기능부전, 신부전, 과식증, 근육 소모, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 혼수, 동맥경화증, 관상 동맥성 심장 질환, 또는 말초 동맥 질환일 수 있다.
조성물은 입자일 수 있으며, 여기서 조성물은 이종성 페이로드를 포함하고, 조성물은 다중양이온을 포함하며, 담체는 편광 상피 세포에서 이종성 페이로드를 수송할 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 이종성 페이로드를 통과세포외배출할 수 있다.
담체는 다중양이온에 결합될 수 있다. 다중양이온은 프로타민, 폴리-리신, 폴리-오르니틴, 폴리-에틸렌-이민 (PEI), 프롤라민, 프로타민, 폴리비닐 피롤리돈 (PVP), 폴리아르기닌, 폴리비닐아민, 또는 이들의 조합일 수 있다. 다중양이온은 프로타민 염일 수 있다. 프로타민 염은 프로타민 설페이트, 프로타민 아세테이트, 프로타민 브로마이드, 프로타민 클로라이드, 프로타민 카프로에이트, 프로타민 트리플루오로아세테이트, 프로타민 바이카보네이트 (HCO3), 프로타민 프로피오네이트, 프로타민 락테이트, 프로타민 포르메이트, 프로타민 니트레이트, 프로타민 시트레이트, 프로타민 모노히드로겐포스페이트, 프로타민 디히드로겐포스페이트, 프로타민 타르트레이트, 또는 프로타민 퍼클로레이트일 수 있다. 프로타민 염은 프로타민 설페이트일 수 있다.
본 발명의 측면은 임의의 본 명세서에 기재된 입자를 포함하는 약학 조성물이며, 여기서 이종성 페이로드는 글루코오스 저하제이다.
일부 경우에, 글루코오스 저하제는 인슐린 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 캡슐화된 입자는 높은 pH에서 페이로드를 방출하나, 낮은 pH에서는 방출하지 않는다.
본 발명의 다른 측면은 임의의 본 명세서에 기재된 입자 및 보존제를 포함하는 약학 조성물이다. 일부 경우에, 약학 조성물은 등장성 개질제(tonicity modifier)를 더 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 박테리아 독소로부터 유래된 담체를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 담체는 편광 상피 세포 내로 수송할 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 통과세포외배출할 수 있고, 담체의 적어도 30%는 37℃에서 100 μL PBS에서 100 μg의 담체를 포함하는 조성물과 10 μg의 판크레아틴을 배양하는 단계를 포함하는 판크레아틴 분석에서 0.5시간에 온전하다.
담체의 적어도 40%는 37℃에서 100 μL PBS에서 100 μg의 담체를 포함하는 조성물과 10 μg의 판크레아틴을 배양하는 단계를 포함하는 판크레아틴 분석에서 0.5시간에 온전할 수 있다. 담체의 적어도 50%는 37℃에서 100 μL PBS에서 100 μg의 담체를 포함하는 조성물과 10 μg의 판크레아틴을 배양하는 단계를 포함하는 판크레아틴 분석에서 0.5시간에 온전할 수 있다. 담체의 적어도 60%는 37℃에서 100 μL PBS에서 100 μg의 담체를 포함하는 조성물과 10 μg의 판크레아틴을 배양하는 단계를 포함하는 판크레아틴 분석에서 0.5시간에 온전할 수 있다. 담체의 적어도 90%는 37℃에서 100 μL PBS에서 100 μg의 담체를 포함하는 조성물과 10 μg의 판크레아틴을 배양하는 단계를 포함하는 판크레아틴 분석에서 2시간에 온전할 수 있다.
조성물은 양이온을 더 포함할 수 있다. 양이온은 금속 양이온 또는 다중양이온일 수 있다. 양이온은 금속 양이온일 수 있다. 금속 양이온은 전이 금속 양이온일 수 있다.
본 발명의 측면은 (a) 박테리아 독소로부터 유래된 담체 및 (b) 전이 금속 양이온 또는 다중양이온을 포함하는 조성물이며, 여기서 담체는 편광 상피 세포에 들어갈 수 있거나 및/또는 편광 상피 세포를 가로질러 통과세포외배출할 수 있다.
본 발명의 측면은 박테리아 유래 담체를 이종성 페이로드 및 양이온과 조합하여 입자를 생성하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 일부 경우에, 이종성 페이로드는 염료, 방사성의약품, 호르몬, 사이토카인, 항-TNF 제제, 글루코오스 저하제, 종양 관련 항원, 펩티드, 및 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 방법은 박테리아 유래 담체, 이종성 페이로드 및 양이온을 분무 건조하는 단계를 더 포함한다. 일부 경우에, 방법은 (a) 분리된 담체 및 페이로드를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; (b) 프로타민 설페이트 및 NaPO4를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; 및 (c) (a)의 혼합물을 (b)의 혼합물에 합하고 합한 혼합물을 실온에서 밤새도록 두는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 단계 (d) 단계 (c)로부터의 합한 혼합물의 이온 강도를 증가시킴으로써 단계 (c)로부터의 입자를 더 작은 입자로 파괴하는 단계를 더 포함한다. 일부 경우에, 단계 (a)의 제조는 ZnCl2를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 단계 (a)의 제조는 ZnCl2를 포함한다.
하나의 측면에서, 이종성 페이로드와 복합체화된, 서열번호: 75의 아미노산 1-348을 포함하지 않으며 서열번호: 76이 아닌 콜릭스 변이체를 포함하는 전달 구조체가 본 명세서에 제공되며, 여기서 이종성 페이로드는 글루코오스 조절제이고, 담체는 a) 편광 상피 세포를 가로질러 이종성 페이로드를 통과세포외배출할 수 있거나 또는 b) 편광 상피 세포 내로 이종성 페이로드를 수송할 수 있다. 페이로드는 인크레틴 또는 인크레틴 모방체일 수 있다. 페이로드는 GLP-1 수용체 작용제를 포함할 수 있다. 페이로드는 서열번호: 26-34 또는 17 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 페이로드는 서열번호: 15로 이루어질 수 있다. 페이로드는 서열번호: 29로 이루어질 수 있다. 페이로드는 서열번호: 16으로 이루어질 수 있다. 페이로드는 서열번호: 17로 이루어질 수 있다. 페이로드는 서열번호: 33으로 이루어질 수 있다. 페이로드는 서열번호: 34로 이루어질 수 있다. 페이로드는 GIP 수용체 작용제일 수 있다. 페이로드는 서열번호: 33 또는 36-38 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
페이로드는 인슐린일 수 있다. 인슐린은 서열번호: 43 및 서열번호: 44; 서열번호: 45 및 서열번호: 46; 서열번호: 47 및 서열번호: 48; 또는 서열번호: 49 및 서열번호: 50을 포함할 수 있다. 인슐린은 서열번호: 47 및 서열번호: 48을 포함할 수 있다. 인슐린은 서열번호: 49 및 서열번호: 50을 포함할 수 있다. 페이로드는 서열번호: 51-63 중 어느 하나일 수 있다.
콜릭스 변이체는 서열번호: 81에 제시된 서열, 또는 이의 단편 또는 서열 변이체일 수 있다. 담체는 이종성 페이로드에 비공유 결합될 수 있다. 담체는 이종성 페이로드에 공유 결합될 수 있다.
전달 구조체는 단일 폴리펩티드일 수 있다. 전달 구조체는 절단형 링커를 더 포함할 수 있으며, 여기서 링커의 절단은 담체로부터 페이로드를 방출한다. 담체는 폴리펩티드의 C-말단에 위치할 수 있으며, 페이로드는 폴리펩티드의 N-말단에 위치할 수 있다. 담체는 서열번호: 6; 서열번호: 2; 서열번호: 65; 또는 서열번호: 73을 포함할 수 있다. 담체는 서열번호: 1의 C-말단-절단된 변이체와 적어도 90% 아미노산 동일성을 가질 수 있다. 담체는 서열번호: 81의 C-말단-절단된 변이체를 포함할 수 있다. 담체는 서열번호: 1, 서열번호: 12, 또는 서열번호: 81의 처음 195, 206, 244, 250, 266, 386, 또는 415의 아미노산 잔기로 이루어질 수 있다. 이종성 페이로드는 수용체에 결합하도록 구성될 수 있다.
또한, 상기 전달 구조체 중 어느 하나의 유효량을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 피험자의 대사성 장애의 치료 방법이 본 명세서에 제공된다. 대사성 장애는 당뇨병 및/또는 비만일 수 있다.
본 명세서에 개시된 모든 측면 또는 경우는 본 명세서에 개시된 다른 측면 또는 경우와 조합될 수 있다.
참조에 의한 통합
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로, 본 명세서에 참조로 포함된다.
I. 개요
(a) 박테리아 독소로부터 유래된 담체 및 (b) 전이 금속 양이온 또는 다중양이온을 포함할 수 있는 조성물 및 방법이 본 명세서에 제공되며, 여기서 담체는 편광 상피 세포에 들어갈 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 통과세포외배출할 수 있다. 박테리아 독소로부터 유래된 담체는 예를 들어, (예를 들어, 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)로부터 유래된) 콜릭스 폴리펩티드 또는 (예를 들어, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 유래된) 슈도모나스 외독소 (PE) A 일 수 있다. 조성물은 페이로드, 예를 들어 이종성 페이로드 (예를 들어, 페이로드는 담체, 예를 들어 콜릭스 또는 PE가 아님), 예를 들어 치료용 페이로드를 더 포함할 수 있다. 조성물은 입자, 예를 들어 미세입자 또는 나노입자의 형태일 수 있으며, 예를 들어 분무 건조 및/또는 동결건조에 의해 생성될 수 있다. 본 명세서에 제공된 방법은 피험자에게 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 조성물은 위의 산성 환경을 온전하게 통과하도록 제형화될 수 있다 (예를 들어, 입자는 내산성 미세입자일 수 있다). 도 16은 in vivo에서 점액 시료, 배양된 세포 위의 얇은 점액층, 및 상피 세포 위의 건강한 점액층을 통한 입자의 침투를 나타내는 개략도를 제공한다. 입자는 pH 5-7에서 가용성이 될 수 있으며, 예를 들어 배양된 내피 조직 층을 이용하거나 또는 in vitro 또는 in vivo 모델에서 장 조직을 통한 계대 연구에서 평가된 재구성된 점액층에서 결합 또는 수송을 지지할 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 제공된 조성물은 다른 경로, 예를 들어 호흡기 전달(respiratory delivery)에 의해 피험자에게 전달하기 위해 제형화될 수 있다.
또한, 편광 상피 세포에 들어갈 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 통과세포외배출할 수 있는 담체; 및 이종성 페이로드를 포함하는 조성물 및 방법이 본 명세서에 제공되며, 여기서 이종성 페이로드 대 담체의 몰비는 1:1보다 크다.
담체를 포함하는 조성물 및 방법이 본 명세서에 제공되며, 여기서 담체는 편광 상피 세포에 들어갈 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 통과세포외배출할 수 있고, 담체의 적어도 60%는 판크레아틴 분석에서 0.5시간에 온전하며, 판크레아틴 분석은 37℃에서 100 μL 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 100 μg의 담체를 포함하는 조성물과 10 μg의 판크레아틴을 배양하는 단계를 포함한다. 이러한 조성물의 제조 방법 및 이러한 조성물을 피험자에게 투여하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
또한, 위치 195-347에서 종료하는 콜릭스 변이체 및 이종성 페이로드를 포함하는 조성물 및 방법이 본 명세서에 제공되며, 여기서 이종성 페이로드는 글루코오스 조절제이다. 또한, 글루코오스 조절제에 결합된 담체를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
또한, 본 명세서에 제공된 조성물을 포함하는 약학 조성물, 본 명세서에 제공된 조성물의 제조 방법, 및 본 명세서에 제공된 조성물을 피험자, 예를 들어 글루코오스 조절에 결함이 있는 피험자에게 투여하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
II. 입자
본 명세서에 제공된 조성물은 하나 이상의 입자를 포함할 수 있다. 하나 이상의 입자는 하나 이상의 미세입자 또는 나노입자를 포함할 수 있다. 하나 이상의 입자는 하나 이상의 담체, 하나 이상의 페이로드 (예를 들어, 이종성 페이로드), 및/또는 하나 이상의 양이온을 포함할 수 있다. 하나 이상의 양이온은 하나 이상의 다중양이온, 예를 들어, 프로타민일 수 있다. 하나 이상의 양이온은 하나 이상의 금속 양이온일 수 있다. 하나 이상의 금속 양이온은 하나 이상의 전이 금속 양이온일 수 있다. 하나 이상의 금속 양이온은 하나 이상의 2가 금속 양이온일 수 있다. 하나 이상의 전이 금속 양이온은 Fe2+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Ni2+ 및 Cu2+ 일 수 있다. 하나 이상의 전이 금속 양이온은 아연 양이온일 수 있다. 하나 이상의 2가 금속 양이온은 칼슘 (Ca2+), 크롬 (Cr2+), 코발트 (Co2+), 철 (Fe2+), 마그네슘 (Mg2+), 망간 (Mn2+), 니켈 (Ni2+), 구리 (Cu2+), 또는 아연 (Zn2+)일 수 있다. 하나 이상의 양이온은 프로타민, 폴리-리신, 폴리-오르니틴, 폴리-에틸렌-이민 (PEI), 프롤라민, 폴리비닐 피롤리돈 (PVP), 폴리아르기닌, 폴리비닐아민, 또는 이들의 조합일 수 있다. 하나 이상의 양이온은 프로타민 염일 수 있다.
하나 이상의 입자, 예를 들어, 하나 이상의 미세입자 또는 나노입자는 하나 이상의 자기-조립 입자, 예를 들어 안정한 자기-조립 입자, 예를 들어, 미세입자 또는 나노입자일 수 있다.
본 명세서에 제공된 조성물은 하나 이상의 담체 및 하나 이상의 페이로드 및/또는 하나 이상의 양이온, 예를 들어 하나 이상의 다중양이온을 포함할 수 있다. 하나 이상의 담체 및 하나 이상의 페이로드는 직접적으로 또는 간접적으로, 공유 또는 비-공유 결합될 수 있다. 하나 이상의 담체 및 하나 이상의 페이로드는 융합 분자의 형태일 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 담체 및 하나 이상의 페이로드는 융합 분자에 없다. 담체-페이로드 융합 분자는 하나 이상의 페이로드 분자 (예를 들어, 하나 이상의 치료용 페이로드)를 상피 세포 (예를 들어, 편광 장 상피 세포)로 수송할 수 있다. 담체는 내인성 트래피킹 경로를 이용하여 상피 세포 내로 또는 상피 세포를 가로질러 페이로드를 수송할 수 있다. 수동적 확산의 사용과는 대조적으로, 내인성 트래피킹 경로의 이용은 담체가 이러한 세포의 장벽 기능 또는 페이로드의 생물학적 활성을 손상시키지 않고 상피 세포 내로 또는 상피 세포를 가로질러, 페이로드를 빠르게 효율적으로 왕복하도록 허용할 수 있다. 하나 이상의 페이로드는 서열번호: 11 또는 14-64 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나, 이루어지거나, 또는 본질적으로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다 (표 12 참조).
하나 이상의 담체 및 하나 이상의 양이온은 직접적으로 또는 간접적으로, 공유 또는 비-공유 결합될 수 있다. 하나 이상의 담체 및 하나 이상의 양이온은 융합 분자의 형태일 수 있다. 일부 경우에, 융합 분자는 하나 이상의 페이로드와 함께 미세입자 또는 나노입자로 조립될 수 있다. 담체-양이온 융합 분자는 하나 이상의 페이로드 분자 (예를 들어, 하나 이상의 치료용 페이로드)를 상피 세포 (예를 들어, 편광 장 상피 세포)로 수송할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 담체 및 하나 이상의 양이온은 직접적으로 또는 공유적으로 결합되지 않는다. 일부 경우에, 하나 이상의 담체 및 하나 이상의 양이온은 융합 분자의 일부가 아니다.
일부 경우에, 하나 이상의 양이온은 프로타민 또는 프로타민 염이다. 프로타민은 핵산과 염과 같은 조합으로 정자 세포에 존재하는 강염기성 단백질 군을 나타낼 수 있다. 프로타민은 연어 (살민(salmine)), 무지개 송어 (이리딘(iridine)), 청어 (클루페인(clupeine)), 철갑상어 (스투린(sturine)), 또는 스페인어 고등어 (Spanish mackerel) 또는 참치 (티닌)로부터 얻어질 수 있다. 특정 프로타민의 펩티드 조성물은 어류의 과(family), 속(genera) 또는 종(species)에 따라 달라질 수 있다. 프로타민은 4개의 주요 성분, 예를 들어 약 30-32개의 잔기를 함유하는 단일-쇄 펩티드를 함유할 수 있으며, 그 중 약 21-22개는 아르기닌이다. N-말단 잔기는 4개의 주요 성분 각각에 대해 프롤린일 수 있다. 따라서, 특정 염에 의한 프로타민의 화학적 변형은 균질할 것으로 예상할 수 있다. 프로타민 염은 연어로부터 얻어질 수 있다. 프로타민 염은 청어로부터 얻어질 수 있다. 프로타민 염은 무지개 송어로부터 얻어질 수 있다. 프로타민 염은 참치로부터 얻어질 수 있다.
하나 이상의 입자, 예를 들어, 하나 이상의 미세입자 또는 나노입자는 프로타민 설페이트, 프로타민 아세테이트, 프로타민 브로마이드, 프로타민 클로라이드, 프로타민 카프로에이트, 프로타민 트리플루오로아세테이트, 프로타민 바이카보네이트 (HCO3), 프로타민 프로피오네이트, 프로타민 락테이트, 프로타민 포르메이트, 프로타민 니트레이트, 프로타민 시트레이트, 프로타민 모노히드로겐포스페이트, 프로타민 디히드로겐포스페이트, 프로타민 타르트레이트, 프로타민 퍼클로레이트, 및 임의의 2개의 프로타민 염의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 프로타민 염을 포함할 수 있다. 프로타민 염은 예를 들어 침전 또는 분무 건조에 의해, 입자 형성 전에 액체 매질에서 다른 성분과 조합될 수 있다. 입자 형성 전 액체 매질 내 프로타민 염은 약 0.05 mg/mL 내지 약 0.10 mg/mL, 약 0.10 mg/mL 내지 약 0.15 mg/mL, 약 0.15 mg/mL 내지 약 0.20 mg/mL, 약 0.20 mg/mL 내지 약 0.25 mg/mL, 약 0.25 mg/mL 내지 약 0.30 mg/mL, 약 0.30 mg/mL 내지 약 0.35 mg/mL, 약 0.35 mg/mL 내지 약 0.40 mg/mL, 약 0.40 mg/mL 내지 약 0.45 mg/mL, 또는 약 0.45 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL의 농도일 수 있다. 프로타민 염은 2개의 상이한 염의 혼합물일 수 있으며, 여기서 하나의 염은 설페이트이고 다른 염은 프로타민의 아세테이트, 프로피오네이트, 락테이트, 포르메이트, 또는 니트레이트 염이다. 2개의 상이한 염 사이의 몰비는 약 0.1 내지 약 1, 약 0.2 내지 약 1, 약 0.3 내지 약 1, 약 0.4 내지 약 1, 약 0.5 내지 약 1, 약 0.6 내지 약 1, 약 0.7 내지 약 1, 약 0.8 내지 약 1, 및 약 0.9 내지 약 1 일 수 있다.
입자는 2가 금속 이온, 예를 들어, 아연, 코발트, 마그네슘, 또는 칼슘, 또는 이들 이온의 조합을 더 포함할 수 있다. 금속 이온은 아연일 수 있다.
일 예에서, 입자는 약 1:0.001 내지 약 1:2000의 중량비 (담체:양이온)로 담체 및 양이온을 조합함으로써 형성될 수 있다. 일부 경우에, 담체 및 양이온은 약 1:0.01 내지 약 1:500의 중량비로 조합될 수 있다. 일부 경우에, 담체 및 양이온은 약 1:0.08 내지 약 1:173의 중량비로 조합될 수 있다. 일부 경우에, 담체 및 양이온은 약 1:0.1 내지 약 1:200의 중량비로 조합될 수 있다. 일부 경우에, 담체 및 양이온은 약 1:0.1 내지 약 1:5의 중량비로 조합될 수 있다. 일부 경우에, 담체 및 양이온은 약 1:0.08 내지 약 1:1.6의 중량비로 조합될 수 있다. 일부 경우에, 담체 및 양이온은 약 1:8 내지 약 1:180의 중량비로 조합될 수 있다. 다른 예에서, 입자는 약 0.01:1 내지 약 0.2:1의 중량비로 담체 및 양이온을 조합함으로써 형성될 수 있다. 일부 경우에, 담체 및 양이온은 약 1:1의 중량비로 조합될 수 있다. 일부 경우에, 담체 및 양이온은 적어도 약 1:0.001, 1:0.01, 1:0.08, 1:0.1, 1:0.16, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.32, 1:0.4, 1:0.8, 1:1, 1:1.6, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:8.6, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:86, 1:90, 1:100, 1:150, 1:172, 1:200, 또는 1:2000의 중량비로 조합될 수 있다. 일부 경우에, 담체 및 양이온은 약 1:0.001, 1:0.01, 1:0.08, 1:0.1, 1:0.16, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.32, 1:0.4, 1:0.8, 1:1, 1:1.6, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:8.6, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:86, 1:90, 1:100, 1:150, 1:172, 또는 1:200, 1:2000 미만의 중량비로 조합될 수 있다.
일 예에서, 입자는 약 1:0.001 내지 약 1:2000의 중량비 (페이로드 융합 분자:양이온)로 페이로드 융합 분자 및 양이온을 조합함으로써 형성될 수 있다. 일부 경우에, 페이로드 융합 분자 및 양이온은 약 1:0.01 내지 약 1:500의 중량비로 조합될 수 있다. 일부 경우에, 페이로드 융합 분자 및 양이온은 약 1:0.08 내지 약 1:173의 중량비로 조합될 수 있다. 일부 경우에, 페이로드 융합 분자 및 양이온은 약 1:0.1 내지 약 1:200의 중량비로 조합될 수 있다. 일부 경우에, 페이로드 융합 분자 및 양이온은 약 1:0.1 내지 약 1:5의 중량비로 조합될 수 있다. 일부 경우에, 페이로드 융합 분자 및 양이온은 약 1:0.08 내지 약 1:1.6의 중량비로 조합될 수 있다. 일부 경우에, 페이로드 융합 분자 및 양이온은 약 1:8 내지 약 1:180의 중량비로 조합될 수 있다. 다른 예에서, 입자는 약 0.01:1 내지 약 0.2:1의 중량비로 페이로드 융합 분자 및 양이온을 조합함으로써 형성될 수 있다. 일부 경우에, 페이로드 융합 분자 및 양이온은 약 1:1의 중량비로 조합될 수 있다. 일부 경우에, 페이로드 융합 분자 및 양이온은 적어도 약 1:0.001, 1:0.01, 1:0.08, 1:0.1, 1:0.16, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.32, 1:0.4, 1:0.8, 1:1, 1:1.6, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:8.6, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:86, 1:90, 1:100, 1:150, 1:172, 또는 1:200, 1:2000의 중량비로 조합될 수 있다. 일부 경우에, 페이로드 융합 분자 및 양이온은 약 1:0.001, 1:0.01, 1:0.08, 1:0.1, 1:0.16, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.32, 1:0.4, 1:0.8, 1:1, 1:1.6, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:8.6, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:86, 1:90, 1:100, 1:150, 1:172, 또는 1:200, 1:2000 미만의 중량비로 조합될 수 있다.
일 예에서, 입자는 약 0.01:1 내지 약 1:2, 약 0.0116:1 내지 약 1:1, 약 0.2:1 내지 약 1:1의 중량비로 담체 및 페이로드를 조합함으로써 형성될 수 있다. 일부 경우에, 담체 대 페이로드는 적어도 0.01:1, 0.0116:1, 0.02:1, 0.0232:1, 0.03:1, 0.04:1, 0.05:1, 0.06:1, 0.07:1, 0.08:1, 0.09:1, 0.1:1, 0.2:1, 0.232:1, 0.3:1, 0.4:1, 0.5:1, 0.6:1, 0.7:1, 0.8:1, 0.9:1, 1:1, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1 또는 2:1의 중량비로 조합될 수 있다. 일부 경우에, 담체 대 페이로드는 0.01:1, 0.0116:1, 0.02:1, 0.0232:1, 0.03:1, 0.04:1, 0.05:1, 0.06:1, 0.07:1, 0.08:1, 0.09:1, 0.1:1, 0.2:1, 0.232:1, 0.3:1, 0.4:1, 0.5:1, 0.6:1, 0.7:1, 0.8:1, 0.9:1, 1:1, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1 또는 2:1 미만의 중량비로 조합될 수 있다.
일 예에서, 입자 또는 조성물은 약 5:1 내지 약 1:5의 몰비, 약 10:1 내지 약 1:10의 몰비, 약 2:1 내지 약 1:2의 몰비, 약 1:10 내지 약 1:1000의 몰비, 약 1:30 내지 약 1:700의 몰비, 약 1:100 내지 약 1:300,000의 몰비, 또는 약 1:1000 내지 약 1:30,000의 몰비로 담체 및 양이온 (예를 들어, Zn2+ 또는 프로타민)을 포함할 수 있다. 담체 대 양이온의 비는 약 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:500, 1:650, 1:1000, 1:2000, 1:5000, 1:10,000, 1:20,000, 1:30,000, 1:40,000, 1:50,000, 1:75000, 1:100,000, 1:200,000, 또는 1:300,000의 몰비일 수 있다. 일부 경우에, 담체 대 양이온의 비는 적어도 1:300,000, 1:200,000, 1:100000, 1:50000, 1:30000, 1:25000, 1:20000, 1:15000, 1:10000, 1:5000, 1:3000, 1:2800, 1:2000, 1:1500, 1:1000, 1:500, 1:100, 1:50, 1:25, 1:10, 1:5, 1:2, 1:1.12, 1:1 또는 10:1의 몰비이다. 일부 경우에, 담체 대 양이온의 비는 1:300,000, 1:200,000, 1:100000, 1:50000, 1:30000, 1:25000, 1:20000, 1:15000, 1:10000, 1:5000, 1:3000, 1:2800, 1:2000, 1:1500, 1:1000, 1:500, 1:2, 1:1.12, 또는 1:1 미만의 몰비이다. 일부 경우에, 담체는 단량체, 이량체, 삼량체, 또는 기타 복합체로서 입자에 존재할 수 있다. 담체 대 양이온의 비는 담체의 단량체의 몰을 기준으로 계산될 수 있다. 양이온이 염에 있는 경우, 양이온을 함유하는 염의 양 또는 몰보다는 양이온 자체의 양 또는 몰을 사용하여 비를 결정할 수 있다.
입자 또는 조성물은 약 1:1 내지 약 1:10의 몰비, 약 10:1 내지 약 1:1000의 몰비, 약 1:1 내지 약 1:1000의 몰비, 약 1:10 내지 약 1:1000의 몰비, 약 1:10 내지 약 1:6000의 몰비, 약 1:1 내지 약 1:100의 몰비, 약 1:5 내지 약 1:20의 몰비, 약 1:7의 몰비, 또는 약 1:716의 몰비로 담체 및 페이로드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 입자 또는 조성물은 약 1:1, 약 1:2, 약 1:5, 약 1:7, 약 1:10, 약 1:20, 약 1:30, 약 1:60, 약 1:70, 약 1:80, 약 1:90, 약 1:100, 약 1:125, 약 1:150, 약 1:200, 약 1:300, 약 1:400, 약 1:500, 약 1:600, 약 1:750, 약 1:1000, 약 1:2500, 약 1:5000, 약 1:6000, 또는 약 1:50 미만의 몰비로 담체 및 페이로드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 담체 대 페이로드의 비는 적어도 약 1:6000, 1:5000, 1:4000, 1:3000, 1:2000, 1:1000, 1:900, 1:800, 1:700, 1:620, 1:617.06, 1:600, 1:500, 1:400, 1:310, 1:308.53, 1:200, 1:150, 1:125, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:5, 또는 1:1의 몰비이다. 일부 경우에, 담체 대 페이로드의 비는 약 1:6000, 1:5000, 1:4000, 1:3000, 1:2000, 1:1000, 1:900, 1:800, 1:700, 1:620, 1:617.06, 1:600, 1:500, 1:400, 1:310, 1:308.53, 1:200, 1:150, 1:125, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:5, 또는 1:1 미만의 몰비이다. 담체 대 페이로드의 비는 약 1:6000, 1:5000, 1:4000, 1:3000, 1:2000, 1:1000, 1:900, 1:800, 1:700, 1:620, 1:617.06, 1:600, 1:500, 1:400, 1:310, 1:308.53, 1:200, 1:150, 1:125, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2,1:1, 2:1, 5:1, 또는 10:1의 몰비일 수 있다. 일부 경우에, 담체 또는 페이로드, 또는 둘 다는 단량체, 이량체, 삼량체, 또는 기타 복합체로 존재할 수 있다. 몰비는 담체의 단량체와 페이로드의 단량체를 비교하여 계산될 수 있다.
일부 경우에, 담체는 페이로드에 간접적으로 비-공유 결합된다. 이러한 경우에, 입자 (예를 들어, 리포좀, 미세입자, 나노입자, 금속 나노입자, 고분자-기반 나노입자 등)는 페이로드 분자 (예를 들어, IL-10, IL-22, GLP-1 등)로 (예를 들어, 입자의 내부 및/또는 표면에) 로딩될 수 있으며, 담체, 예를 들어 콜릭스 유래 또는 PE 유래 담체 분자(들)은 이러한 나노입자에 (예를 들어, 이의 표면에) 결합될 수 있다. 일부 경우에, 페이로드 분자 및 담체 분자, 예를 들어 콜릭스 유래 또는 PE 유래 분자를 포함하는 입자를 형성할 수 있다.
일부 경우에, 본 명세서에 제공된 조성물 (예를 들어, 입자)에서 페이로드 대 담체의 비 (예를 들어, 몰비)는 적어도 약 15000:1, 10000:1, 5000:1, 2500:1, 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 50:1, 25:1, 10:1, 5:1, 2.5:1, 1:1 일 수 있다. 이 비는 표면에 결합된 담체, 예를 들어, PE 또는 콜릭스 유래 담체를 이용하여 편광 상피 세포 (예를 들어, 편광 장 상피 세포) 내로 또는 이를 가로질러 이러한 페이로드-함유 입자 (예를 들어, 나노입자)의 수송을 허용할 수 있다. 일부 경우에, 입자 (예를 들어, 나노입자)는 통과세포외배출 또는 세포내 전달 후에 페이로드를 방출할 수 있다. 입자 (예를 들어, 나노입자)가 상피 세포를 가로질러 수송되는 경우, 방출된 페이로드는 점막하 조직 (예를 들어, 고유판) 내의 수용체에 결합할 수 있으며 및/또는 전신 순환에 들어갈 수 있으므로 전신적으로 특정 기능 (예를 들어, 치료 또는 진단 기능)을 제공할 수 있다. 다른 경우에, 입자 (예를 들어, 나노입자)가 상피 세포 내부에 페이로드를 방출하는 경우, 페이로드 (예를 들어, 핵산)는 특정 세포내 기능, 예를 들어, 이러한 세포 내에서 형질전환 유전자 (transgenes)의 생산, 유전자 발현의 조절 등을 제공할 수 있다.
입자 또는 조성물, 예를 들어 약학 조성물은 보존제, 예를 들어 페놀, m-크레졸, 메틸 p-히드록시벤조에이트, 프로필 p-히드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 부틸 p-히드록시벤조에이트, 2-페닐에탄올, 벤질 알콜, 클로로부탄올, 또는 티오메로살(thiomerosal), 또는 이들의 혼합물을 더 포함할 수 있다.
조성물, 예를 들어 약학 조성물은 등장성 개질제, 예를 들어, 당 또는 당 알콜, 아미노산 (예를 들어, L-글리신, L-히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌), 알디톨 (예를 들어, 글리세롤 (글리세린), 1,2-프로판디올 (프로필렌글리콜) , 1,3-프로판디올, 1,3-부탄디올), 폴리에틸렌글리콜 (예를 들어, PEG400), 글리세롤, 만니톨, 프로필렌 글리콜, 디메틸 술폰, 메틸 술포닐 메탄, 트레할로오스, 수크로오스, 소르비톨, 사카로오스, 락토오스, 또는 이들의 혼합물을 더 포함할 수 있다.
조성물, 예를 들어 약학 조성물은 완충제, 예를 들어, 소듐 아세테이트, 소듐 카보네이트, 시트레이트, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 리신, 아르기닌, 소듐 디히드로겐 포스페이트(sodium dihydrogen phosphate), 디소듐 히드로겐 포스페이트(disodium hydrogen phosphate), 소듐 포스페이트, 및 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 또는 이들의 혼합물을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 제형은 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985 또는 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995에 기재된 바와 같이 제조될 수 있으며, 여기서 제약 산업의 기법은 원하는 최종 제품을 제공하기 위해 적당히 성분을 용해 및 혼합하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 입자, 예를 들어 미세입자 또는 나노입자, 예를 들어 담체, 페이로드 및 양이온을 함유하는 자기-조립 미세입자 또는 나노입자의 제조 방법이 본 명세서에 제공된다. 담체 및 페이로드는 융합 분자를 형성할 수 있다. 방법은 (a) 분리된 담체 및 페이로드 (예를 들어, 융합 분자로서), 및 임으로, ZnCl2를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; (b) 프로타민 설페이트 및 NaPO4를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; 및 (c) (a)의 혼합물을 (b)의 혼합물에 합하고 합한 혼합물을 실온에서 밤새도록 두는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 단계 (d) 단계 (c)로부터의 합한 혼합물의 이온 강도를 증가시킴으로써 단계 (c)로부터의 입자를 더 작은 입자로 파괴하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 경우에, 단계 (a)의 제조는 ZnCl2를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 단계 (a)의 제조는 ZnCl2를 포함한다.
일부 경우에, 담체 및 페이로드는 융합 분자를 형성하지 않는다. 방법은 (a) 분리된 담체 및 분리된 페이로드, 및 임으로, ZnCl2를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; (b) 프로타민 설페이트 및 NaPO4를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; 및 (c) (a)의 혼합물을 (b)의 혼합물에 합하고 합한 혼합물을 실온에서 밤새도록 두는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 단계 (d) 단계 (c)로부터의 합한 혼합물의 이온 강도를 증가시킴으로써 단계 (c)로부터의 입자를 더 작은 입자로 파괴하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 경우에, 단계 (a)의 제조는 ZnCl2를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 단계 (a)의 제조는 ZnCl2를 포함한다. 일부 경우에, (a) 및 (b)의 합한 혼합물을 분무 건조시켜 미세입자 또는 나노입자를 형성할 수 있다. 일부 경우에, 시판되는 분무 건조기를 이용하여 미세입자 또는 나노입자를 형성할 수 있다.
일부 경우에, 담체 및 페이로드는 융합 분자를 형성할 수 있다. 방법은 (a) 분리된 담체 및 양이온 융합 분자, 및 분리된 페이로드, 및 임으로, ZnCl2를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; (b) 분리된 페이로드 및 NaPO4를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; 및 (c) (a)의 혼합물을 (b)의 혼합물에 합하고 합한 혼합물을 실온에서 밤새도록 두는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 단계 (d) 단계 (c)로부터의 합한 혼합물의 이온 강도를 증가시킴으로써 단계 (c)로부터의 입자를 더 작은 입자로 파괴하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 경우에, 단계 (a)의 제조는 ZnCl2를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 단계 (a)의 제조는 ZnCl2를 포함한다. 일부 경우에, (a) 및 (b)의 합한 혼합물을 분무 건조시켜 미세입자 또는 나노입자를 형성할 수 있다. 일부 경우에, 시판되는 분무 건조기를 이용하여 미세입자 또는 나노입자를 형성할 수 있다.
나노 분무 건조기 B-90 (Buchi, 스위스)은 활성 약학 성분의 좁은 크기 분포 및 제어 방출로, 서브 미크론 내지 2 미크론의 단백질 입자를 생성할 수 있다. hGH, 인슐린과 같은 단백질은 연속적인 단일 단계 공정으로 분무 건조될 수 있다. 반대 이온 및 고분자 부형제는 캡슐화 및 활성 약학 성분의 느린 방출을 달성하는 데 사용될 수 있다. 시스템은 수용성 부형제 및 수계 에멀젼과 호환될 수 있다. 시료 공급 속도는 1 ml/min 내지 3 ml/min 일 수 있다. 기체 흐름은 100L/min 내지 160 L/min 일 수 있다. 압력은 대기압일 수 있다.
단백질 농도는 0.02 μmole 내지 1 μmole 일 수 있다. 공급 속도는 약 100 L/min 내지 200 L/min 일 수 있다. 주입구 온도는 약 80 ℃ 내지 140 ℃ 일 수 있다. 헤드 온도는 약 30 ℃ 내지 70 ℃ 일 수 있다. 예를 들어, 카보네이트, 아세테이트, 락테이트, 숙시네이트, 포스페이트 및 트리스 완충제와 같은 많은 상이한 완충 용액이 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 부형제의 예는 히드록시프로필메틸셀룰로오스 (HPMC), 카복시메틸셀룰로오스 (CMC), 알기네이트, 유드라짓, 키토산, 덱스트란, 폴리(락틱-코-글리콜산) (PLGA), 플루로닉, 아라비아 검, 및 폴리소르베이트 20을 포함한다. 반대 이온, 또는 반대 이온을 포함하는 분자의 비-제한적 예는 프로타민, 서열번호: 3 구조체, 양이온성 세포-침투 펩티드, 폴리글루타메이트 및 히알루론산을 포함한다.
입자, 예를 들어, 자기-조립 입자 또는 분무 건조 입자, 예를 들어 프로타민 입자, 아연 입자, 또는 아연 및 프로타민 입자는 약 200 nm 이하, 약 300 nm 이하, 약 400 nm 이하, 약 500 nm 이하, 약 600 nm 이하, 약 700 nm 이하, 약 800 nm 이하, 또는 약 900nm 이하의 크기를 가질 수 있다. 자기-조립 미세입자, 예를 들어 프로타민 미세입자, 아연 입자, 아연 및 프로타민 입자는 약 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 110 nm, 120 nm, 130 nm, 140 nm, 150 nm, 160 nm, 170 nm, 180 nm, 190 nm, 200 nm, 250 nm, 300 nm, 350 nm, 400 nm, 450 nm, 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 1 μm 이하, 약 5 μm 이하, 약 10 μm 이하, 약 15 μm 이하, 약 20 μm 이하, 약 25 μm 이하, 약 30 μm 이하, 약 35 μm 이하, 약 40 μm 이하, 약 45 μm 이하, 약 50 μm 이하, 약 55 μm 이하, 약 60 μm 이하, 약 65 μm 이하, 약 70 μm 이하, 약 75 μm 이하, 약 80 μm 이하, 약 85 μm 이하, 약 90 μm 이하, 약 95 μm 이하, 약 100 μm 이하, 약 105 μm 이하, 약 110 μm 이하, 약 115 μm 이하, 약 120 μm 이하, 약 125 μm 이하, 약 130 μm 이하, 약 135 μm 이하, 약 140 μm 이하, 약 145 μm 이하, 및 약 150 μm 이하의 크기를 가질 수 있다. 일부 경우에, 입자는 약 1 μm 내지 약 20 μm의 크기를 가진다. 일부 경우에, 입자는 약 5 μm ± 2 μm의 평균 크기를 가진다. 일부 경우에, 입자는 약 150 μm ± 50 μm의 평균 크기를 가진다. 일부 경우에, 입자는 약 30 nm 내지 약 6000 nm, 약 60 nm 내지 약 6000 nm, 약 30 nm 내지 약 3000 nm, 약 60 nm 내지 약 3000 nm, 약 100 nm 내지 약 1000 nm, 약 200 nm 내지 약 800 nm, 또는 약 300 nm 내지 약 600 nm의 평균 크기를 가진다. 일부 경우에, 입자는 적어도 약 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 150 nm, 200 nm, 250 nm, 300 nm, 350nm, 400 nm, 450nm, 500 nm, 550nm, 600 nm, 650nm, 700 nm, 750nm, 800 nm, 850nm, 900 nm, 950nm, 1000 nm, 1100 nm, 1200 nm, 1300 nm, 1400 nm, 1500 nm, 2000nm, 3000 nm, 4000 nm, 5000nm, 또는 6000 nm의 평균 크기를 가진다.
입자, 예를 들어, 미세입자 또는 나노입자는 캡슐화될 수 있다. 천연 및 합성 고분자 매트릭스는 약물 캡슐화 및 제어 방출에 사용될 수 있다. 입자 캡슐화에 사용된 고분자 매트릭스는 입자 및 입자 내에 함유된 약물이 원하는 pH, 온도 또는 시간에서 방출되도록 선택될 수 있다. 입자 캡슐화에 사용된 고분자 매트릭스는 입자 및 입자 내에 함유된 약물이 낮은 pH 환경에 있는 동안 보호되며 pH 상승 시 방출되도록, 예를 들어 위에서 보호된 다음 장에서 방출되도록 선택될 수 있다. 또한, 입자 캡슐화에 사용된 고분자 매트릭스는 첫 번째 조직 또는 생물학적 유체, 예를 들어, 위산의 조건으로부터 입자를 보호하도록 선택될 수 있다. 유드라짓은 pH- 및 시간-제어 약물 방출에 사용될 수 있으며, 키토산, HPMC 및 히알루론산은 확산-제어 방출에 사용될 수 있다. 유드라짓은 다양한 범위의 폴리메타크릴레이트-기반 공중합체를 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물과 함께 사용하기에 적합할 수 있는 유드라짓의 예는 유드라짓 RS 30 D: 폴리(에틸 아크릴레이트-코-메틸 메타크릴레이트-코-트리메틸암모니오에틸 메타크릴레이트 클로라이드) 1:2:0.1; 유드라짓 RL 30 D: 폴리(에틸 아크릴레이트-코-메틸 메타크릴레이트-코-트리메틸암모니오에틸 메타크릴레이트 클로라이드) 1:2:0.2; 유드라짓 FS 30D: 폴리(메틸 아크릴레이트-코-메틸 메타크릴레이트-코-메타크릴산) 7:3:1; 및 유드라짓 L 30 D-55: 폴리(메타크릴산-코-에틸 아크릴레이트) 1:1을 포함한다.
입자는 당해 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 캡슐화될 수 있다. 일부 경우에, 입자, 예를 들어, 미세입자 또는 나노입자는 제 1 단계에서 형성될 수 있으며 제 2 단계에서 캡슐화될 수 있다. 예를 들어, 입자는 상기 기재된 바와 같이 침전을 통해 형성된 다음, 분무 건조에 의해 제 2 단계에서 캡슐화될 수 있다. 또 다른 예에서, 입자는 제 1 분무 건조 단계에서 형성된 다음, 제 2 분무 건조 단계에서 캡슐화될 수 있다. 일부 경우에, 입자는 단일 단계에서 형성되고 캡슐화될 수 있다. 예를 들어, 캡슐화 고분자 매트릭스는 분무 건조 단계 전에 하나 이상의 담체, 페이로드 및 양이온을 포함하는 용액과 혼합될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 캡슐화 고분자 매트릭스, 담체, 페이로드 및 양이온을 포함하는 용액을 분무 건조시켜 나노입자 또는 미세입자를 형성할 수 있다.
III. 담체
담체는 단백질 또는 상피 (예를 들어, 피험자의 편광 장 상피)를 가로질러 또는 상피 내로 이종성 페이로드를 수송할 수 있는 다른 유형의 분자일 수 있다.
담체는 박테리아에 의해 분비된 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 이러한 담체는 비브리오 콜레라 또는 녹농균으로부터 분비된 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 비브리오 콜레라에 의해 분비된 폴리펩티드는 콜릭스 폴리펩티드일 수 있다. 녹농균에 의해 분비된 폴리펩티드는 슈도모나스 외독소 (PE) 일 수 있다. 콜릭스 폴리펩티드 또는 PE로부터 유래된 담체는 자연적으로 발생하거나 또는 비-자연적으로 발생할 수 있다. 콜릭스 폴리펩티드 또는 PE로부터 유래된 담체는 자연적으로 발생하는 콜릭스 펩티드 또는 PE의 절단된 변이체 또는 자연적으로 발생하지 않는 돌연변이된 변이체일 수 있다. 돌연변이는 치환, 결실, 첨가를 포함할 수 있다.
A. 콜릭스
본 명세서의 담체는 서열번호: 1에 제시된 담체에 비해 감소된 (예를 들어, 적어도 50% 감소된) 또는 ADP 리보실화 활성 (예를 들어, 신장 인자 2의 리보실화)을 가질 수 있다.
담체는 기준 서열, 예를 들어 서열 번호 1 또는 12 또는 7과 비교하여, 통과세포외배출의 경우 위치 206 내지 415 또는 세포내이입의 경우 위치 151-187 중 어느 하나에서 추가로 절단된 콜릭스로부터 유래된 폴리펩티드 또는 이의 변이체일 수 있다. 또한, 표 14에 나타낸 담체 서열 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이러한 통과세포외배출하는 담체, 또는 표 15에 나타낸 담체 서열 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이러한 세포내이입하는 담체가 본 명세서에서 고려된다. 본 명세서의 담체 중 어느 하나는 V1L 치환을 가질 수 있다. 일부 경우에, 담체는 서열번호: 1 또는 7의 아미노산 206 내지 425, 150 내지 205, 또는 150-195 중 어느 하나에서 C-말단 절단을 갖는 콜릭스 폴리펩티드일 수 있다. 일부 경우에, 담체는 서열번호: 1 또는 7의 아미노산 1 내지 40 또는 35-40 중 어느 하나에서 N-말단 절단을 갖는 콜릭스 폴리펩티드일 수 있다. 일부 경우에, 담체는 서열번호: 7에 제시된 서열의 N-말단 위치 40에서 C-말단 위치 150-205 중 어느 하나까지 아미노산 잔기로 이루어진다. 일부 경우에, 담체는 서열번호: 1 또는 12 또는 7의 아미노산 266에서 N-말단 절단을 갖는 콜릭스 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 담체는 서열번호: 65-67 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어질 수 있다. 다른 경우에, 담체는 서열번호: 7에 제시된 서열의 위치 150 또는 187에서 C-말단을 가질 수 있다. 일부 경우에, 담체는 서열번호: 8, 9, 또는 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 경우에, 콜릭스 담체는 서열번호: 12 또는 13에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다. 위치 번호매김은 서열번호: 7에 제시된 서열에 대한 콜릭스 폴리펩티드의 정렬을 기반으로 할 수 있으며, 여기서 위치는 N-말단에서 위치 1부터 시작하여 N-말단에서 C-말단으로 번호매김된다. 일부 경우에, 담체는 서열번호: 3의 서열을 가질 수 있다.
담체는 자연적으로 발생하는 콜릭스 폴리펩티드의 절단된 변이체 또는 자연적으로 발생하지 않는 돌연변이된 변이체일 수 있다. 돌연변이는 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다. 절단된 콜릭스-유래 담체는, 예를 들어, 서열번호: 1 또는 7의 아미노산 잔기 1-415, 1-386, 1-266 또는 1-206로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 포함할 수 있다. 따라서, 담체는 서열번호: 6 (Cholix1-415의 예), 서열번호: 2 (Cholix1-386의 예), 서열번호: 65 (Cholix1-266의 예), 또는 서열번호: 73 (Cholix1-206의 예)에 제시된 아미노산 서열로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 표 12에 제시되어 있다.
담체는 이의 N-말단에 다양한 미생물 (예를 들어, 박테리아)에서 발현을 촉진하는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 담체는 번역 시작 부위일 수 있는 N-말단 메티오닌을 포함할 수 있다. 이러한 담체는 서열번호: 65 (M+Cholix1-386의 예)에 제시된 아미노산 서열로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서의 담체 중 어느 하나는 서열번호: 2 (V1L Cholix의 예)에 제시된 V1L 치환을 가질 수 있다.
담체는 서열번호: 81의 단편일 수 있으며, 서열번호: 81의 아미노산 서열의 386 이하의 아미노산을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어질 수 있다. 담체는 서열번호: 81의 위치 1-38 중 어느 하나에서 위치 195-347에서의 아미노산 잔기 중 어느 하나까지 아미노산 잔기를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어질 수 있다. 대안적으로, 담체는 서열번호: 81의 위치 1에서 위치 195 내지 347 중 어느 하나에서의 아미노산 잔기 중 어느 하나까지 아미노산 잔기를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어질 수 있다. 담체는 서열번호: 1, 서열번호: 12 또는 서열번호: 81의 아미노산 잔기 1-195, 1-206, 1-244, 1-266, 1-386, 또는 1-415를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어질 수 있다. 마찬가지로, 담체는 서열번호: 1, 서열번호: 12 또는 서열번호: 81의 아미노산 잔기 1-275, 1-266, 1-265, 2-265, 3-265, 4-265, 5-265, 1-250, 2-250, 3-250, 4-250, 5-250, 1-245, 2-245, 3-245, 4-245, 5-245, 1-205, 2-205, 3-205, 4-205, 및 5-205를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어질 수 있다.
또한, 담체는 본 명세서의 서열 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 상기 중 어느 하나의 변이체를 포함한다.
B. 슈도모나스 외독소 A
담체는 슈도모나스 외독소의 일부를 포함할 수 있다. 슈도모나스 외독소 A 또는 "PE"는 3개의 눈에 띄는 구형 도메인 (Ia, II 및 III) 및 도메인 II 및 III를 연결하는 하나의 작은 하위도메인 (Ib)으로 구성된 67 kDa 단백질로서 녹농균에 의해 분비될 수 있다 (참조, 예를 들어, Allured et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:1320 1324, 1986). 성숙한 PE는 613-잔기 단백질일 수 있으며, 이의 서열은 서열번호: 69에 제시되어 있다. 본 명세서에 사용된 성숙한 PE를 인코딩하는 핵산의 예는 서열번호: 68에 제시되어 있다.
PE 외독소 도메인 I (예를 들어, 서열번호: 82)은 서열번호: 69의 아미노산 1-252를 포함할 수 있으며, 세포 표면 수용체에 대한 리간드일 수 있고 세포에 대한 PE의 결합을 매개하는 수용체 결합 도메인일 수 있다. 담체는 서열번호: 82에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 담체는 서열번호: 82에 제시된 서열과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 잇다. 또한, 표 13에 나타낸 서열번호: 69의 담체 서열의 부분 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이러한 담체도 본 명세서에서 고려된다.
일부 경우에, 담체는 서열번호: 7의 아미노산 서열에서 보존적 또는 비-보존적 치환을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 담체는 세포에 결합하는 능력을 유지할 수 있다. 담체는 서열번호: 69의 절단된 버전, 예를 들어 서열번호: 82일 수 있다. 담체는 서열번호: 82의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실된 수용체 결합 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 담체는 서열번호: 82의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 수용체 결합 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
담체 PE 도메인 I은 서열번호: 82의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성 또는 이의 기능적 단편과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 담체는 서열번호: 69의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 1-252 중 하나 이상, 예를 들어, 서열번호: 82의 아미노산 서열에서 결실 또는 돌연변이를 포함할 수 있다. 담체는 서열번호: 69의 1-252의 아미노산 서열 (예를 들어, 서열번호: 82의 아미노산 서열)과 적어도 90% 서열 동일성 또는 이의 기능적 단편과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 담체는 서열번호: 69의 1-252의 아미노산 서열, 예를 들어, 서열번호: 82의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성 또는 이의 기능적 단편과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 담체는 서열번호: 69의 1-252의 아미노산 서열, 예를 들어, 서열번호: 82의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성 또는 이의 기능적 단편과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 담체는 서열번호: 69의 1-252의 아미노산 서열, 예를 들어, 서열번호: 82의 아미노산 서열과 100% 서열 동일성 또는 이의 기능적 단편과 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
담체는 페이로드에 직접적으로 또는 간접적으로, 공유 또는 비-공유 결합될 수 있다. 일부 경우에, 담체 및 페이로드는 융합 단백질을 형성한다. 담체는 양이온에 직접적으로 또는 간접적으로, 공유 또는 비-공유 결합될 수 있다. 일부 경우에, 담체 및 양이온은 융합 단백질 또는 복합체를 형성한다. 다양한 실시예에서, 약학 조성물의 담체, 페이로드, 담체-페이로드 복합체, 또는 융합 분자는 프로모터, 조절 요소, 담체 또는 이러한 담체의 단편 또는 절단된 변이체를 인코딩하는 DNA 서열, 및 페이로드 또는 양이온을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된다. 조절 요소는 인코딩 DNA 서열의 발현을 활성화하거나 또는 억제하는 전사 인자에 대한 전사 결합 부위를 함유할 수 있다. 일부 경우에, 조절 요소는 담체 또는 이러한 담체의 단편 또는 절단된 변이체를 인코딩하는 DNA 서열의 내인성 조절 요소이다. 일부 경우에, 조절 요소는 페이로드를 인코딩하는 DNA 서열의 내인성 조절 요소이다. 일부 경우에, 조절 요소는 담체 또는 이러한 담체의 단편 또는 절단된 변이체를 인코딩하는 DNA 서열, 및 페이로드 또는 양이온을 인코딩하는 DNA 서열 둘 다를 조절한다. 일부 경우에, 담체 및 페이로드는 상이한 핵산 분자에 인코딩된다. 일부 경우에, 담체, 페이로드, 및 양이온은 상이한 핵산 분자에 인코딩된다. 일부 경우에, 담체 및 페이로드는 동일한 핵산 분자에 인코딩된다. 일부 경우에, 담체, 페이로드, 및 양이온은 동일한 핵산 분자에 인코딩된다.
IV. 페이로드
담체 폴리펩티드 이외에, 본 명세서에 제공된 조성물은 피험자에게 전달하기 위한, 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 하나 이상의 이종성 페이로드, 또는 하나 이상의 생물학적-활성 페이로드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 이종성 페이로드는 담체 서열, 예를 들어, 콜릭스 서열 또는 PE 서열을 갖지 않는 하나 이상의 페이로드일 수 있다. 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 이종성 페이로드는 거대분자, 소분자, 작은 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, mRNA, miRNA, shRNA, siRNA, PNA, 안티센스 분자, 항체, DNA, 플라스미드, 다당류, 지질, 항원, 백신, 고분자 나노입자, 또는 촉매-활성 물질일 수 있다. 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 이종성 페이로드는 서열번호: 11 또는 14-64 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나, 이루어지거나, 또는 본질적으로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다 (표 12 참조).
하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 하나 이상의 생물학적 활성 페이로드는 피험자의 혈류에 도입될 때 바람직한 생물학적 활성을 수행할 수 있는 거대분자일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 페이로드는 수용체 결합 활성, 효소 활성, 전령 활성 (즉, 호르몬, 사이토카인, 신경전달물질(neurotransmitter), 응고 인자, 성장 인자, 또는 기타 신호전달 분자로 작용함), 발광성 또는 기타 검출가능한 활성, 또는 조절 활성, 또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다. 다양한 진단 실시예에서, 하나 이상의 페이로드는 인듐 및 테크네튬, 자성 입자, 공기 또는 바륨과 같은 방사선 불투과성(radiopaque) 물질, 및 형광 화합물 (예를 들어, Alexa-488 또는 적색 형광 단백질)을 포함하나 이에 한정되지 않는, 약학적으로 허용가능한 감마-방출 부분에 접합될 수 있거나 또는 그 자체일 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 하나 이상의 생물학적 활성 페이로드는 피험자의 혈류에 들어가지 않는다. 일부 경우에, 하나 이상의 페이로드는 고유판에서 작용한다.
다양한 실시예에서, 하나 이상의 페이로드는 하나 이상의 폴리펩티드 아단위 (subunit)를 포함하는 단백질이다. 예를 들어, 단백질은 이량체, 삼량체, 또는 고차(higher order) 다량체일 수 있다. 다양한 실시예에서, 2 이상의 아단위의 단백질은 예를 들어 이황화 결합과 같은 공유 결합으로 연결될 수 있다. 다른 실시예에서, 아단위의 단백질은 비-공유 상호작용과 함께 유지될 수 있다. 통상의 기술자는 이러한 단백질을 확인하고, 예를 들어, 면역분석법을 이용하여 아단위가 적당히 결합되어 있는지 여부를 결정할 수 있다.
다양한 실시예에서, 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 하나 이상의 치료용 페이로드는 예를 들어, 염료, 방사성의약품, 호르몬, 사이토카인, 항-TNF 제제, 글루코오스 저하제, 또는 종양 관련 항원이다. 일부 경우에, 하나 이상의 치료용 페이로드는 GI 관에서 염증의 조절제인 폴리펩티드이다. 다양한 실시예에서, 전달될 하나 이상의 페이로드는 피험자에게 전달하기 위한 글루코오스-저하제이다. 글루코오스-저하제의 예는 인크레틴, 글루카곤, 글루카곤 프로단백질, 글루카곤 펩티드, 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드 2 (GLP-2), GLP-2 작용제, 테두글루티드, 글리센틴, 글리센틴-관련 폴리펩티드, 위 저해 폴리펩티드 전구단백질, 위 저해 폴리펩티드, 디펩티딜 펩티다제 4, 글루코오스 수송체 일원 4, 프리프로글루카곤, 인슐린 수용체 기질 1, 인슐린, 아포지질단백질 A-II, 용질 담체 계열 2, 촉진된 글루코오스 수송체 일원 1, 글리코겐 합성효소 1, 글리코겐 합성효소 2, 티로신-단백질 포스파타제 비-수용체 유형 1, RAC-알파 세린 트레오닌-단백질 키나제, 퍼옥시좀 증식체-활성화 수용체 감마, 헥소키나제 3, 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트 3-포스파타제 및 이중-특이성 단백질, 피루베이트 탈수소효소 키나제 1, 칼슘-결합 및 꼬인-코일 도메인-함유 단백질 1, Max-유사 단백질 X, 프룩토오스-비스포스페이트 아돌라제 A, 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체, 글루카곤-유사 펩티드 2 수용체, 위 저해 폴리펩티드 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 2 수용체, 인슐린 수용체, GLP-1 작용제-엑세나티드, GLP-1 작용제-리라글루티드, 엑센딘-4, 엑센딘-3, 위 저해 펩티드 (GIP), GIPR 작용제 (Des-Ala2-GIP1-30), GIPR 작용제-절단된 GIP1-30, GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 1-37), GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 7-36), 릭시세나티드 (상표명 Adlyxin®, 및 Lyxumia®, Sanofi), 리라글루티드 (상표명 Victoza®, Novo Nordisk A/S), 세마글루티드 (상표명 Ozempic®, Novo Nordisk A/S), 알비글루티드 (상표명 Tanzeum®, GlaxoSmithKline; 알부민에 융합된 GLP-1 이량체), 두라글루티드 (상표명 Trulicity®, Eli Lilly), 글루코오스-의존적 인슐린분비성 폴리펩티드, 다중-특이적 펩티드 작용제, 티르제파티드 (Eli Lilly), SAR425899 (Sanofi), 이중 아밀린 칼시토닌 수용체 작용제 DACRA-089, 글라진/Lantus®, 글루리신/Apidra®, 글라린/Toujeo®, Insuman®, 데테미르/Levemir®, 리스프로/Humalog®/Liprolog®, degludec/DegludecPlus, 인슐린 아스파트, 인슐린 및 유사체 (예를 들어, LY-2605541, LY2963016, NN1436), 페길화 인슐린 리스프로 (서열번호: 40-41), Humulin®, 린제타, SuliXen®, NN1045, 인슐린 + SymlinTM, PE0139, 급속-작용 및 단기-작용 인슐린 (예를 들어, 린제타, PH20, NN1218, HinsBet), (APC-002) 하이드로겔, 경구, 흡입, 경피 및 설하 인슐린 (예를 들어, Exubera®, Nasulin®, Afrezza®, Tregopil®, TPM 02, 캡슐린, Oral-lyn®, Cobalamin®, 경구 인슐린, ORMD-0801, NN1953, NN1954, NN1956, VIAtab, 및 Oshadi 경구 인슐린), 및 desPro36-엑센딘-4(1-39)-Lys6NH2; H-des(Pro36, 37)-엑센딘-4-Lys4-NH2; H-des(Pro36, 37)-엑센딘-4-Lys5-NH2; desPro36[Asp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14, Asp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Trp(O2) 26, Asp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Trp(O2) 25, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, Asp28]엑센딘-4 (1-39); 및 desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39)로 이루어진 군으로부터 선택된 엑센딘-4 유사체를 포함한다. 본 명세서에 개시된 입자 또는 전달 구조체에 사용하기 위해 고려되는 GLP-1 작용제는, 예를 들어 엑세나티드 (상표명 Byetta®, Amylin/Astrazeneca, 서열번호: 14, 서열번호: 11); 릭시세나티드 (상표명 Adlyxin®, 및 Lyxumia®, Sanofi, 서열번호: 15); 리라글루티드 (상표명 Victoza®, Novo Nordisk A/S, 서열번호: 16); 세마글루티드 (상표명 Ozempic®, Novo Nordisk A/S); 알비글루티드 (상표명 Tanzeum®, GlaxoSmithKline; 알부민에 융합된 GLP-1 이량체); 및 두라글루티드 (상표명 Trulicity®, Eli Lilly, 서열번호: 17)를 포함한다. 페이로드는 인크레틴 수용체, 예를 들어 위장 조직 또는 간문맥계(hepatic portal system)에서 인크레틴 수용체에 결합하는 능력을 가질 수 있다.
일부 경우에, 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 하나 이상의 치료용 페이로드는 서열번호: 11 또는 서열번호: 14 내지 64 중 어느 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열을 가진다.
인크레틴
담체는 하나 이상의 인크레틴에 결합될 수 있다. 인크레틴은 혈당 수준이 상승하기 전이라도, 식후 랑게르한스 섬의 베타 세포로부터 인슐린 방출을 증가시킬 수 있는 위장 호르몬 부류에 속한다. 인크레틴은 위 배출(gastric emptying)을 감소시켜 혈류로의 영양소 흡수 속도를 늦출 수 있으며, 음식 섭취를 줄일 수 있다. 인크레틴은 랑게르한스 섬의 알파 세포로부터 글루카곤 방출을 저해할 수 있다. 인크레틴은 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1) 또는 위 저해 펩티드 (GIP)일 수 있다. GLP-1 및 GIP는 둘 다 효소 디펩티딜 펩티다제 4 (DPP-4)에 의해 빠르게 비활성화될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 인크레틴 또는 인크레틴 모방 펩티드는 자연적으로 발생하는 인크레틴 또는 인크레틴 모방 펩티드 또는 변형된 자연적으로 발생하는 인크레틴 또는 인크레틴 모방 펩티드일 수 있다. 펩티드는 고상 펩티드 합성과 같은 펩티드 합성을 위한 표준 기법을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있거나, 또는 당해 기술분야에 알려진 재조합 DNA 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 이렇게 제조된 펩티드는 자연적으로 발생하는 펩티드와 동일할 수 있거나 또는 동일하지 않을 수 있다. 자연적으로 발생하는 인크레틴 또는 인크레틴 모방 펩티드의 유사체, 단편 및 접합체는 자연적으로 발생하는 인크레틴 또는 인크레틴 모방 펩티드의 생물학적 활성 중 하나 이상을 보유하는 한 본 발명에서 페이로드로서 포함된다.
GLP-1은 프리프로글루카곤의 조직-특이적 번역 후 처리에 의해 장 L-세포에서 합성된 자연적으로 발생하는 인크레틴 호르몬일 수 있다. GLP-1은 식욕 및 포만감(satiety)의 조절과 관련이 있다. GLP-1은 G 단백질-결합 수용체 (GPCR) 슈퍼패밀리의 463 아미노산 일원인, GLP-1 수용체 (GLP-1R)를 통해 작용할 수 있다 (참조, 예를 들어, Drucker DJ et al., Mol Endocrinol, 17(2):161-171, 2003). 생체활성 GLP-1은 의 2개의 등능(equipotent) 분자 형태로 존재할 수 있다: GLP-1(7-37) 및 GLP-1(7-36) 아미드. 생체활성 GLP-1은 디아미노펩티딜 펩티다제-4 (DPP-4)에 의해 빠르게 절단될 수 있으며, 이는 크게 비활성 GLP-1(9-37) 및 GLP-1(9-36) 아미드 분자 형태의 생성을 야기할 수 있다. 일부 경우에, 장 정맥 순환을 떠나는 대부분의 GLP-1은 이미 장 L 세포를 둘러싼 모세혈관에서 발현된 DPP-4에 의해 절단되었다. GLP-1의 in vivo 반감기는 1-2분으로 추정되었다 (참조, 예를 들어, Drucker DJ, Gastroenterology, 122(2):531-544, 2002).
GLP-1은 임의의 공급원으로부터 제조된 분리된, 정제된 및/또는 재조합 GLP-1을 포함하는 임의의 공급원 또는 예를 들어 고상 합성을 이용한 화학 합성으로부터의 글루카곤-유사 펩티드 1을 나타낼 수 있다. 예를 들어, GLP-1은 서열번호: 26의 서열을 가질 수 있다. 또한, 천연 GLP-1의 보존된 아미노산 치환이 본 명세서에 포함된다. 예를 들어, 보존적 아미노산 변화가 단백질 또는 펩티드의 1차 서열을 변경하더라도, 일반적으로 이의 기능을 변경하지 않는 보존적 아미노산 변화가 이루어질 수 있다. GLP-1의 많은 분자 유도체가 개시되었으며, 그 중 일부는 작용제 활성을 가지며 및/또는 천연 GLP-1보다 더 긴 반감기를 갖는 것으로 보고되었다, 참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,358,924; 6,344,180; 6,284,725; 6,277,819; 6,271,241; 6,268,343; 및 6,191,102, 그 내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
또한, GLP-1 관련 분자, 예를 들어, 단백질은 췌장 내분비 분화, 섬 증식 및 β-세포 질량의 증가를 유도할 수 있는 것으로 개시 및 보고되었다 (Parkes et al., Metabolism 50:583, 2001). 엑센딘-4 (이의 예는 서열번호: 14 또는 서열번호: 11이며, 엑세나티드 또는 Byetta®로도 알려짐) 및 엑센딘-3 (이의 예는 서열번호: 28임)는 GLP-1과 약 53% 상동성이며 인슐린분비 활성을 갖는 39 아미노산 펩티드 (잔기 2 및 3에서 상이함)이다. 엑센딘-3 및 엑센딘-4의 많은 분자 유도체가 개시되었으며, 이들 중 일부는 작용제 활성을 갖는 것으로 보고되어 있다, 참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,424,286; 6,268,343; 6,384,016; 6,458,924; 6,858,576; 6,989,366; 7,115,569; 7,153,825; 7,223,725; 7,235,627; 7,297,761; 7,419,952; 7,521,423; 7,696,161; 7,700,549; 8,097,698; 8,853,160; 8,889,619; 9,012,398; US 20120283179; US 20140206608; US 20140206609; 20140221281; US 20140213513; US 20150164997; 및 미국 특허 번호 9,181,305, 그 내용은 참조로 본 명세서에 포함된다. GLP-1 작용제는 GLP-1 및 GIP 수용체 및 임의로 글루카곤 수용체를 강력하게 활성화하는 엑센딘-4 유사체일 수 있으며, 다른 치환 중에서도 위치 1에서 Tyr의 변형 및 위치 12에서 Ile의 변형을 포함한다. 사용에 고려되는 이러한 유사체의 예는 US 20140206608; US 20140206609; 20140221281; 및 US 20140213513에 기재된 것을 포함하며, 각각의 내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
GLP-1 작용제는 예를 들어 엑세나티드 (상표명 Byetta®, Amylin/Astrazeneca, 서열번호: 14, 서열번호: 11); 릭시세나티드 (상표명 Adlyxin®, 및 Lyxumia®, Sanofi, 서열번호: 15); 리라글루티드 (상표명 Victoza®, Novo Nordisk A/S, 서열번호: 16); 세마글루티드 (상표명 Ozempic®, Novo Nordisk A/S, 서열번호: 30); 알비글루티드 (상표명 Tanzeum®, GlaxoSmithKline; 알부민에 융합된 GLP-1 이량체); 및 두라글루티드 (상표명 Trulicity®, Eli Lilly, 서열번호: 17)일 수 있다.
일부 경우에, 페이로드는 글루코오스-의존적 인슐린분비성 폴리펩티드일 수 있다. 글루코오스-의존적 인슐린분비성 폴리펩티드 (위 저해 폴리펩티드라고도 함; GIP)는 인크레틴 부류의 분자의 일원일 수 있다. GIP는 GIP 유전자에 의해 인코딩된 153-아미노산 프로단백질로부터 유래될 수 있으며, 서열번호: 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 생물학적 활성 42-아미노산 펩티드로서 순환한다. GIP는 십이지장(duodenum)의 점막 및 위장관의 공장에서 발견될 수 있는 장(intestinal) K 세포에 의해 합성될 수 있다. GIP 수용체는 췌장의 베타-세포에서 발견되는 7개의 막관통 단백질일 수 있다. 다양한 GIP 길항제는 in vivo에서 인슐린의 GIP-의존적 방출을 저해할 수 있으며, 경구 내당능 검사(oral glucose tolerance test)에서 내당능을 향상시킬 수도 있다. 이와 같이, GIP 길항제는 T2D 치료 방법에 사용될 수 있다 (참조, 예를 들어, US 20070167363, 그 내용은 참조로 본 명세서에 포함된다). 절단된 GIP 유사체의 형태 (GIP의 아미노산 잔기 1-30)이며 서열번호: 38의 위치 2에서 D-알라닌 (Ala)의 치환을 갖는 (D-Ala2-GIP1-30 (D-GIP1-30)라고 함) 및 서열번호: 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 GIP 수용체 (GIPR) 작용제는 비만 촉진 효과(pro-obesity effects) 없이 항-당뇨 작용을 나타낼 수 있다 (참조, 예를 들어, Widenmaier et al, PloS ONE, March 2010 | Volume 5 | Issue 3 | e9590). 글루코오스-조절제, 예를 들어, 글루코오스-저하제는 서열번호: 60에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 GIPR 작용제일 수 있다. 페이로드는 글루카곤일 수 있다.
다중-특이적 펩티드 작용제
일부 경우에, 본 명세서에 제공된 조성물, 예를 들어, 입자 또는 전달 구조체는 예를 들어, 하나의 제제에서 GLP-1과 GIP의 작용을 결합하여 GLP-1 및 GIP 수용체의 이중 활성화를 수행하도록 설계될 수 있다. 전달 구조체의 실시예는 담체를 갖는 조성물, 또는 담체 및 페이로드를 갖는 조성물이다. 이는 시판되는 GLP-1 작용제 리라글루티드에 비해 제 2 형 당뇨병 및 비만이 있는 마우스에서 유의하게 더 우수한 혈당 수준의 감소, 인슐린 분비의 증가 및 체중 감소를 갖는 요법을 야기할 수 있다 (참조, 예를 들어. V A Gault et al., Clin Sci (Lond), 121, 107-117, 2011). 일부 경우에, 본 명세서에 제공된 담체는 이중 작용제, 예를 들어, 티르제파티드 (Eli Lilly, 서열번호: 33) 또는 SAR425899 (Sanofi)에 결합된다.
본 명세서에 제공된 조성물, 예를 들어, 전달 구조체는 GLP-1, GIP 및 글루카곤에 대한 수용체를 활성화할 수 있다. 본 명세서에 제공된 담체는 Eli Lilly에 의해 연구 중인 GGG 트리-작용제(Tri-Agonist)에 결합될 수 있다.
본 명세서에 제공된 담체는 이중 아밀린 칼시토닌 수용체 작용제 DACRA-089 (서열번호: 41, KBP-089로도 알려짐, Sanofi)를 포함하여, 당뇨병 및 비만 치료를 위해 연구 중인 다른 펩티드에 결합될 수 있다.
인슐린 및 인슐린 유사체
본 명세서에 제공된 페이로드는 인슐린, 또는 인슐린 유사체, 또는 인슐린 유도체일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "인슐린 유사체" 또는 "인슐린 유도체"는 자연적으로 발생하는 인슐린에서 발생하는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 결실 및/또는 교환 및/또는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 첨가함으로써, 자연적으로 발생하는 인슐린의 구조, 예를 들어 인간 인슐린의 구조로부터 공식적으로 유도될 수 있는 분자 구조를 갖는 폴리펩티드를 나타낼 수 있다 (이의 예는 인슐린 A-쇄 서열번호: 43 및 인슐린 B-쇄 서열번호: 44이며, 이는 이황화 결합에 의해 연결될 수 있음). 첨가된 및/또는 교환된 아미노산 잔기는 코딩가능한 (codable) 아미노산 잔기 또는 기타 자연적으로 발생하는 잔기 또는 순수하게 합성 아미노산 잔기일 수 있다.
인슐린 및 인슐린 유사체/유도체는 당해 기술분야에 광범위하게 기재되어 있다 (참조, 예를 들어, US20150216981; 미국 특허 번호 9,265,723; 미국 특허 번호 8,633,156; 미국 특허 번호 8,410,048; 미국 특허 번호 8,048,854; 미국 특허 번호 7,713,930; 미국 특허 번호 7,696,162; 미국 특허 번호 7,659,363; 미국 특허 번호 7,291,132; 미국 특허 번호 7,193,035; 및 본 명세서에 인용된 참고문헌들은 모두 참조로 본 명세서에 포함된다). 인슐린은 이황화 결합에 의해 연결된 A 쇄 (서열번호: 43) 및 B 쇄 (서열번호: 44)와 함께, 인간 인슐린의 천연 서열을 가질 수 있다.
특정 실시예에서, 인슐린은 서열번호: 43에 제시된 아미노산 서열을 갖는 A 쇄 및 서열번호: 44에 제시된 아미노산 서열을 갖는 B 쇄를 포함한다. 유익한 급속-작용 또는 지효-작용(slow-acting) (기저) 특성을 갖는 인슐린의 추가 실시예는 서열번호: 45의 A 쇄 및 서열번호: 46의 B 쇄를 갖는 인슐린 아스파트(Insulin Aspart); 서열번호: 47의 A 쇄 및 서열번호: 48의 B 쇄를 갖는 인슐린 글라진; 및 서열번호: 49의 A 쇄 및 서열번호: 50의 B 쇄를 갖는 인슐린 리스프로를 포함한다.
하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 이종성 페이로드는 혈우병(hemophilia), 예를 들어, 혈우병 A 또는 혈우병 B의 치료제일 수 있다. 혈우병 치료제는 응고 인자 VIII (예를 들어, 응고 인자 VIII 농축물), 응고 인자 IX (예를 들어, 응고 인자 IX 농축물), 인자 VIIa, Hemlibra® (ACE 910 또는 에미시주맙(emicizumab)), DDAVP® 또는 Stimate® (데스모프레신 아세테이트), 항섬유소용해제 (antifibrinolytic), 예를 들어, Amicar® (엡실론 아미노 카프로산(Epsilon Amino Caproic Acid)) 또는 Lysteda® (트라넥사민산(tranexamic acid)), ELOCTATE® [항혈우병 인자 (재조합), Fc 융합 단백질] 또는 동결침전물Cryoprecipitate)일 수 있다.
일부 경우에, 페이로드, 예를 들어 이종성 페이로드, 예를 들어 글루코오스 조절제, 예를 들어 글루코오스 저하제는 인슐린 또는 인슐린 유사체이다. 일부 경우에, 페이로드, 예를 들어 이종성 페이로드, 예를 들어 글루코오스 조절제, 예를 들어 글루코오스 저하제는 엑세나티드이다. 엑세나티드 (서열번호: 11)는 C-말단 아민 및 N-말단 H에 의해 안정화된 GLP-1-유사 생물학적 활성을 갖는 펩티드일 수 있다.
일부 경우에, 본 명세서에서 사용된 하나 이상의 페이로드, 예를 들어 하나 이상의 이종성 페이로드는 (화학요법제 또는 항종양제와 같은) 항종양성 화합물, 예를 들어 니트로소우레아, 예를 들어 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 스트렙조토신; 메틸히드라진, 예를 들어 프로카바진, 다카바진; 스테로이드 호르몬, 예를 들어, 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 프로게스틴, 안드로겐, 테트라히드로데옥시카리코스테론(tetrahydrodesoxycaricosterone); 면역억제제 (예를 들어, 피리메타민, 트리메토프테린, 페니실라민, 시클로스포린, 아자티오프린), 및 면역자극제 (예를 들어, 레바미솔, 디에틸 디티오카바메이트, 엔케팔린, 엔돌핀)와 같은 면역활성 화합물; 항생제와 같은 항균성 화합물, 예를 들어, 베타-락탐, 페니실린, 세팔로스포린, 카바페님 및 모노박탐, 베타-락타마제 저해제, 아미노글리코시드, 마크로라이드(macrolides), 테트라사이클린, 스펙티노마이신; 항말라리아제, 항아메바제; 항원생동물제(antiprotazoals); 항진균제, 예를 들어, 암포테리신-베타, 항바이러스제, 예를 들어, 아시클로버, 이독수리딘, 리바비린, 트리플루리딘, 비다르빈(vidarbine), 간시클로버(gancyclovir); 구충제(parasiticides); 장내 구충제 (antihalmintics); 방사성의약품; 위장 약물; 혈액학적 화합물(hematologic compounds); 면역글로불린; 혈액 응고 단백질, 예를 들어, 항-혈우병 인자, 인자 IX 복합체; 항응고제, 예를 들어, 디쿠마롤(dicumarol), 헤파린 Na; 피브로리신 저해제, 예를 들어, 트라넥사민산; 심장혈관 약물(cardiovascular drugs); 말초 항-아드레날린 약물; 중추작용 항고혈압 약물, 예를 들어, 메틸도파, 메틸도파 HCl; 항고혈압 직접 혈관확장제(antihypertensive direct vasodilators), 예를 들어, 디아족사이드(diazoxide), 히드랄라진 HCl; 레닌-안지오텐신 시스템에 영향을 미치는 약물; 말초 혈관확장제, 예를 들어, 펜토라민; 항-협심증 약물(anti-anginal drugs); 심장 글리코시드(cardiac glycosides); 심근수축 혈관확장제 (inodilators), 예를 들어, 암리논(amrinone), 밀리논(milrinone), 에녹시몬 (enoximone), 페녹시몬(fenoximone), 이마조단(imazodan), 술마졸(sulmazole); 항부정맥제(antidysrhythmics); 칼슘 진입 차단제(calcium entry blockers); 혈액 지질에 영향을 미치는 약물, 예를 들어, 라니티딘, 보센탄, 레줄린; 호흡기계 약물 (respiratory drugs); 교감신경유사 약물(sypathomimetic drugs), 예를 들어, 알부테롤, 비톨테롤 메실레이트, 도부타민 HCl, 도파민 HCl, 에페드린 So, 에피네프린, 펜플루라민 HCl, 이소프로테레놀 HCl, 메톡사민 HCl, 노르에피네프린 비타르트레이트(norepinephrine bitartrate), 페닐에프린 HCl, 리토드린 HCl; 콜린유사 약물 (cholinomimetic drugs), 예를 들어, 아세틸콜린 HCl; 항콜린에스터라제, 예를 들어, 에드로포늄(edrophonium) 클로라이드 (Cl); 콜린에스터라제 재활성제 (cholinesterase reactivators); 아드레날린 차단 약물(adrenergic blocking drugs), 예를 들어, 아세부톨롤 HCl, 아테놀롤, 에스몰롤 HCl, 라베탈롤 HCl, 메토프롤롤, 나돌롤, 펜토라민 메실레이트, 프로파놀롤 HCl; 항무스카린 약물 (antimuscarinic drugs), 예를 들어, 아니소트로핀 메틸브로마이드, 아트로핀, 클리니듐 Br, 글리코피롤레이트, 이프라트로피움 Br, 스코폴라민 HBr; 신경근 차단 약물(neuromuscular blocking drugs); 탈편광 약물(depolarizing drugs), 예를 들어, 아트라큐리움 베실레이트, 헥사플루오레늄 Br, 메토큐린 요오드, 숙시닐콜린 Cl, 투보큐라린 Cl, 베큐로늄 Br; 중추작용 근육이완제, 예를 들어, 바클로펜; 신경전달물질 및 신경전달물질 제제, 예를 들어, 아세틸콜린, 아데노신, 아데노신 트리포스페이트; 아미노산 신경전달물질, 예를 들어, 흥분성(excitatory) 아미노산, GABA, 글리신; 생체아민(biogenic amine) 신경전달물질, 예를 들어, 도파민, 에피네프린, 히스타민, 노르에피네프린, 옥토파민, 세로토닌, 티라민; 신경펩티드, 산화질소, K+ 채널 독소; 항파킨슨 약물, 예를 들어, 아말티딘 HCl, 벤즈트로핀 메실레이트, 카르비도파; 이뇨제, 예를 들어, 디클로르펜아미드, 메타졸아미드, 벤드로플루메티아지드, 폴리티아지드; 항편두통 약물, 예를 들어, 카르보프로스트 트로메타민 메실레이트, 독소루비신, 미토마이신, 시스플라틴, 다우노루비신, 블레오마이신, 악티노마이신 D, 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin), 및 메틸세르지드 말레에이트를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본 발명의 방법과 함께 사용되는 것으로 고려되는 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 하나 이상의 이종성 페이로드는 림포카인 저해 인자, 대식세포 콜로니 자극 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 줄기세포 인자, 종양 성장 인자-β, 종양 괴사 인자, 림프독소, Fas, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ; 에리트로포이에틴, 안지오제닌, 간세포 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 각질형성세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 종양 성장 인자-α, 트롬보포이에틴, 갑상선 자극 인자, 갑상선 방출 호르몬, 뉴로트로핀, 표피 성장 인자, VEGF, 섬모 향신경성 인자(ciliary neurotrophic factor), LDL, 소마토메딘(somatomedin), 인슐린 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 I 및 II, ENA-78, ELC, GRO-α, GRO-β, GRO-γ, HRG, LEF, IP-10, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIP-1-α, MIP-1-β, MG, MDC, NT-3, NT-4, SCF, LIF, 렙틴, RANTES, 림포탁틴(lymphotactin), 에오탁신(eotaxin)-1, 에오탁신-2, TARC, TECK, WAP-1, WAP-2, GCP-1, GCP-2와 같은 케모카인; α-케모카인 수용체, 예를 들어, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7; 및 β-케모카인 수용체, 예를 들어, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7을 포함한다. 페이로드의 추가 예는 CD4, CD25 및 Foxp3를 발현하는 Tregs와 같은 조절 T 세포 (Tregs) 및 Tr1, Th3, CD8+CD28-, Qa-1 제한 T 세포, 및 IL-17 Treg 세포와 같은 Tregs의 저해제를 포함한다.
일부 경우에, 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 하나 이상의 이종성 페이로드는 E. coli 열-불안정성 장독소(heat-labile enterotoxin) (Etx)일 수 있다.
일부 경우에, 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물과 함께 사용되는 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 하나 이상의 이종성 페이로드는 염료 또는 방사성의약품일 수 있다. 하나 이상의 염료 및 방사성의약품은 Alexa488, 형광 화합물, 인듐, 테크네튬, 자성 입자, 방사선 불투과성 물질, 및 적색 형광 단백질 (RFP)일 수 있다.
일부 경우에, 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물과 함께 사용되는 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 하나 이상의 이종성 페이로드는 호르몬일 수 있다. 호르몬의 예는 인간 성장 호르몬, NUTROPIN® (Genentech), HUMATROPE® (Lilly), GENOTROPIN® (Pfizer), NORDITROPIN® (Novo), SAIZEN® (Merck Serono, OMNITROPE® (Sandoz), SEROSTIM® (EMD Serono), ZORBITIVE® (Merck Serono), TEV-TROPIN® (Teva), 뇌하수체 호르몬, 예를 들어, 융모성 생식선 자극 호르몬 (chorionic gonadotropin), 코신트로핀(cosyntropin), 메노트로핀(menotropins), 소마토트로핀(somatotropin), 이오르티코트로핀(iorticotropin), 프로티렐린 (protirelin), 티로트로핀(thyrotropin), 바소프레신(vasopressin), 리프레신 (lypressin); 부신 호르몬(adrenal hormones), 예를 들어, 베클로네타손 디프로프리오네이트(beclomethasone dipropionate), 베타메타손(betamethasone), 덱사메타손(dexamethasone), 트리암시놀론(triamcinolone); 췌장 호르몬, 예를 들어, 글루카곤, 인슐린; 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone), 예를 들어, 디히드로타키스테롤(dihydrotachysterol); 갑상선 호르몬(thyroid hormones), 예를 들어, 칼시토닌 에티드로네이트 디소듐(calcitonin etidronate disodium), 레보티록신 (levothyroxine) Na, 리오티로닌(liothyronine) Na, 리오트릭스(liotrix), 티로글로불린(thyroglobulin), 테리파라티드 아세테이트(teriparatide acetate); 항갑상선 약물(antithyroid drugs); 에스트로겐 약물(estrogenic hormones); 프로게스틴 (progestins) 및 길항제; 호르몬 피임제(hormonal contraceptives); 고환 호르몬 (testicular hormones); 위장 호르몬(gastrointestinal hormones), 예를 들어, 콜레시스토키닌(cholecystokinin), 엔테로글리칸(enteroglycan), 갈라닌(galanin), 위산 저해 폴리펩티드, 표피성장인자-유로가스트론(epidermal growth factor-urogastrone), 가스트린-방출 펩티드(gastrin-releasing peptide), 가스트린(gastrins), 펜타가스트린(pentagastrin), 테트라가스트린(tetragastrin), 모틸린(motilin), 펩티드 YY, 세크레틴(secretin), 혈관활성 장 펩티드(vasoactive intestinal peptide), 또는 신칼리드(sincalide), 소마트로핀, 합성 인간 성장 호르몬, 합성 인간 성장 호르몬 일부, 인간 성장 호르몬 2, 소마토리베린 (somatoliberin), 식욕-조절 호르몬, 렙틴, 성장 호르몬 수용체, 성장 호르몬-방출 호르몬 수용체, 성장 호르몬 분비촉진 수용체(growth hormone secretagogue receptor), 성장 호르몬-방출 호르몬 수용체 형태 a, 및 성장 호르몬 수용체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
추가 예에서, 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 하나 이상의 이종성 페이로드는 사이토카인일 수 있다. 하나 이상의 사이토카인은 케모카인, 인터루킨, 예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, 및 IL-30 일 수 있다.
추가 예에서, 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 하나 이상의 이종성 페이로드는 항-TNF 제제일 수 있다. 사용될 수 있는 항-TNF 제제의 예는 항-TNF 항체, 인플릭시맙 (Remicade®), 아달리무맙 (Humira®), 에타너셉트(etanercept) (ENBREL®), 종양 괴사 인자-a ("TNF-a"); NP_000585.2, 림포독소-a ("LT-a"), 림포독소-b ("LT-b"), CD30 리간드 , CD40 리간드, CD70 리간드, OX40 리간드, 41BB 리간드, Apo1 리간드 (또는 FasL 또는 CD95L) , Apo2 리간드 (또는 TRAIL, AIM-1 또는 AGP-1), Apo3 리간드 (또는 TWEAK), APRIL, LIGHT, OPG 리간드 (또는 RANK 리간드), BlyS (또는 THANK), BCMA, TACI, TNFR1, TNFR2, 림포독소-bR, CD40, CD95 (또는 FAS 또는 APO-1), OPG, RANK, CD30, CD27, OX40 (또는 CD134), 41BB, NGFR, BCMA, TAC1, EDA2R, TROY, DR6, DR5 (또는 TRAILR2), DR4, DR3, HVEM, LT
Figure pct00001
R, GITR, DcR3, Fn14 (또는 TWEAKR), BAFF, 소형 모듈형 면역-의약품(Small Modular Immuno-Pharmaceuticals; SMIP), 테트라사이클린계 (예를 들어, 테트라사이클린, 독시사이클린, 리메사이클린, 옥시테트라사이클린, 미노사이클린), 화학적으로 변형된 테트라사이클린계 (예를 들어, 데디메틸아미노-테트라사이클린), 히드록삼산 (hydroxamic acid) 화합물, 카보시클릭 산 및 유도체, 라자로이드, 펜톡시필린, 나프토피란, 암리논, 피모벤단, 베스나리논, 포스포디에스터라제 저해제, 및 소분자 키나제 저해제를 포함한다. 소분자 키나제 저해제는 p38MAPK, COT, MK2, P13K, IKKa,b,g, MEKK1,2,3, IRAK1,4 및 Akt 키나제의 소분자 저해제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 경우에, 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 하나 이상의 이종성 페이로드는 종양 관련 항원일 수 있다. 종양 관련 항원의 예는 Her2/neu, Her3, Her4, EGF, EGFR, CD2, CD3, CD5, CD7, CD13, CD19, CD20, CD21, CD23, CD30, CD33 , CD34, CD38, CD46, CD55, CD59, CD69, CD70, CD71, CD97, CD117, CD127, CD134, CD137, CD138, CD146, CD147, CD152, CD154, CD195, CD200, CD212, CD223, CD253, CD272, CD274, CD276, CD278, CD279, CD309 (VEGFR2), DR6, PD-L1, Kv1.3, 5.00E+10, MUC1, uPA, SLAMF7 (CD319), MAGE 3, MUC 16 (CA-125), KLK3, K-ras, 메소텔린(Mesothelin), p53, 서바이빈(Survivin), G250 (신장 세포 암종 항원(Renal Cell Carcinoma Antigen)), 및 PSMA를 포함한다.
일부 경우에, 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 하나 이상의 이종성 페이로드는 히알루로니다제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제(tissue plasminogen activator), 유로키나제(urokinase), PGE-아데노신 데아미나제 (adenosine deaminase)와 같은 효소; 드로페리돌(droperidol), 에토미데이트(etomidate), 펜타닐 시트레이트(fentanyl citrate)/드로페리돌, 헥소바비탈 (hexobarbital), 케타민 HCl, 메토헥시탈(methohexital) Na, 티아밀랄(thiamylal) Na, 티오펜탈(thiopental) Na와 같은 정맥 마취제; 항간질제(antiepileptics), 예를 들어, 카바마제핀(carbamazepine), 클로나제팜(clonazepam), 디발프로엑스 (divalproex) Na, 에토숙시미드(ethosuximide), 메페닐로인(mephenyloin), 파라메타디온(paramethadione), 페닐로인(phenyloin), 프리미돈(primidone)일 수 있다. 다양한 실시예에서, 생물학적 활성 화물은 히알루로니다제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 유로키나제, 또는 PGE-아데노신 데아미나제로부터 선택된 효소이다.
V. 담체에 페이로드 또는 양이온의 결합
일부 경우에, 본 명세서에 제공된 조성물은 페이로드, 예를 들어, 이종성 페이로드에 결합된 담체를 포함한다. 페이로드, 예를 들어, 이종성 페이로드는 제한 없이 통상의 기술자에게 알려진 임의의 방법에 의해 담체에 결합될 수 있다. 페이로드는 이온성 상호작용 또는 나노-입자로의 조립과 같은 비-공유 상호작용에 의해 담체와 결합할 수 있다. 페이로드는 공유 상호작용을 통해 담체에 화학적으로 가교결합될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 페이로드는 담체에 융합된다. 융합 분자에서 융합 분자의 하나 이상의 페이로드 또는 하나 이상의 양이온은 제한 없이 통상의 기술자에게 알려진 임의의 방법에 의해 융합 분자의 나머지에 결합될 수 있다. 페이로드 또는 양이온은 담체의 세포-결합 또는 통과세포외배출 활성을 방해하지 않는 융합 분자의 임의의 부분으로 도입될 수 있다. 다양한 실시예에서, 페이로드 또는 양이온은 담체의 N-말단 또는 C-말단에 직접 결합된다. 다양한 실시예에서, 페이로드 또는 양이온은 담체의 아미노산의 측쇄와 연결될 수 있다. 페이로드는 스페이서 또는 링커를 통해 담체에 간접적으로 결합될 수 있다. 다양한 실시예에서, 페이로드 또는 양이온은 절단형 링커(들)에서의 절단이 융합 분자의 나머지로부터 페이로드 또는 양이온을 분리하도록 절단형 링커로 담체에 결합된다. 다양한 실시예에서, 페이로드 또는 양이온은 절단형 링커의 절단 후에 폴리펩티드에 결합된 채로 남아 있는 짧은 리더 펩티드를 또한 포함할 수 있는 폴리펩티드이다. 예를 들어, 페이로드 또는 양이온은 1 이상의 아미노산, 5 이상의 아미노산, 10 이상의 아미노산, 15 이상의 아미노산, 20 이상의 아미노산, 25 이상의 아미노산, 30 이상의 아미노산, 50 이상의 아미노산, 또는 100 이상의 아미노산의 짧은 리더 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 생물학적 활성 페이로드는 100 미만의 아미노산, 50 미만의 아미노산, 30 미만의 아미노산, 25 미만의 아미노산, 20 미만의 아미노산, 15 미만의 아미노산, 10 미만의 아미노산, 또는 5 미만의 아미노산의 짧은 리더 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 페이로드 또는 양이온은 1-100 아미노산, 5-10 아미노산, 10 내지 50의 아미노산, 또는 20 내지 80의 아미노산의 짧은 리더 펩티드를 포함할 수 있다.
페이로드 또는 양이온이 융합 단백질로서 다른 서열과 함께 발현되는 실시예에서, 페이로드 또는 양이온은 제한 없이 통상의 기술자에게 알려진 임의의 방법에 의해 융합 분자 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 페이로드 또는 양이온에 상응하는 아미노산을 코딩하는 핵산은 천연 아미노산 서열의 결실과 함께 또는 결실 없이, 다른 부분 또는 융합 분자를 코딩하는 핵산 내로 직접 삽입될 수 있다.
페이로드 또는 양이온이 융합 단백질로서 함께 발현되지 않는 실시예에서, 페이로드 또는 양이온은 제한 없이 통상의 기술자에게 알려진 임의의 적당한 방법에 의해 연결될 수 있다. 더 구체적으로, 수용체-결합 도메인을 분자의 나머지에 연결하기 위해 상기 기재된 예시적인 방법은 페이로드 또는 양이온을 분자의 나머지에 연결하는데 동일하게 적용가능하다.
VI. 담체 및/또는 페이로드를 인코딩하는 핵산의 제조
다양한 실시예에서, 담체, 페이로드, 및/또는 비-자연적으로 발생하는 전달 구조체, 예를 들어, 본 발명의 융합 분자는 예를 들어, 미국 특허 번호 제 9,090,691호 및 제 7,713,737호 (각각 전체 참조로 본 명세서에 포함됨)에 기재된 방법을 이용하여 제조된다.
다양한 실시예에서, 담체, 페이로드, 및/또는 비-자연적으로 발생하는 융합 분자는 재조합 DNA 방법을 이용하여 합성된다. 일반적으로, 이것은 담체, 페이로드, 및/또는 융합 분자를 인코딩하는 DNA 서열을 생성하는 단계, 특정 프로모터의 제어 하에서 발현 카세트에 DNA를 배치하는 단계, 숙주에서 분자를 발현하는 단계, 발현된 분자를 분리하는 단계, 및 필요한 경우, 분자를 활성 형태로 접는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 담체, 페이로드, 및/또는 융합 분자를 인코딩하는 DNA는 예를 들어, 적당한 서열의 클로닝 및 제한 또는 포스포트리에스터 방법 [Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99]; 포스포디에스터 방법 [Brown et al. [(1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151]; 디에틸포스포라미다이트 방법 [Beaucage et al. [(1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862]; 고체 지지체 방법 [미국 특허 번호 제 4,458,066호] 등과 같은 방법에 의한 직접적인 화학 합성을 포함하여, 임의의 적당한 방법에 의해 제조될 수 있다.
화학 합성은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 이것은 상보적 서열과의 혼성화에 의해 또는 주형으로 단일 가닥을 이용한 DNA 폴리머라제와의 중합에 의해 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있다. 화학 합성을 사용하여 약 100 염기의 DNA 서열을 생성할 수 있다. 더 긴 서열은 더 짧은 서열의 결찰에 의해 얻어질 수 있다.
대안적으로, 하위서열을 클로닝하고 적당한 제한 효소를 이용하여 적당한 하위서열을 절단할 수 있다. 그 다음, 단편을 결찰하여 원하는 DNA 서열을 생성할 수 있다.
다양한 실시예에서, 본 발명의 DNA 인코딩 담체, 페이로드, 및/또는 융합 분자는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)과 같은 DNA 증폭 방법을 이용하여 클로닝될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 하나 이상의 페이로드, 예를 들어, 하나 이상의 생물학적 활성 페이로드에 대한 유전자 또는 유전자들은 예를 들어, NdeI에 대한 제한 부위를 함유하는 센스 프라이머 및 HindIII에 대한 제한 부위를 함유하는 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭된다. 이것은 하나 이상의 페이로드 서열을 인코딩하고 말단 제한 부위를 갖는 하나 이상의 핵산을 생성할 수 있다. "상보적" 제한 부위를 갖는 담체는 유사하게 클로닝된 다듬, 하나 이상의 페이로드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 및/또는 하나 이상의 페이로드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산에 결합된 링커에 결찰될 수 있다. 핵산 서열의 결찰 및 벡터 내로의 삽입은 담체(들)에 결합된 하나 이상의 페이로드를 인코딩하는 벡터를 생성한다.
VII. 절단형 링커
다양한 실시예에서, 피험자에게 전달될 하나 이상의 페이로드, 예를 들어 이종성 페이로드는 하나 이상의 절단형 링커를 이용하여 담체에 결합된다. 융합 분자에 존재하는 절단형 링커의 수는 적어도 부분적으로 담체와 관련하여 하나 이상의 페이로드의 위치 및 생물학적 활성 페이로드의 특성에 의존한다. 하나 이상의 페이로드가 단일 링커에서 절단과 함께 융합 분자의 나머지로부터 분리될 수 있는 경우, 융합 분자는 단일 절단형 링커를 포함할 수 있다. 또한, 하나 이상의 페이로드가 예를 들어, 이량체 또는 다른 다량체인 경우, 하나 이상의 페이로드의 각 아단위(subunit)는 절단형 링커에서의 절단에 의해 융합 분자의 나머지 및/또는 하나 이상의 페이로드의 다른 아단위로부터 분리될 수 있다.
다양한 실시예에서, 절단형 링커는 상피 세포의 기저측 막(basolateral membrane)에 또는 그 근처에 존재하는 절단 효소에 의해 절단된다. 이러한 효소에 의해 절단될 절단형 링커를 선택함으로써, 하나 이상의 페이로드는 점막을 가로질러 통과세포외배출 후 융합 분자의 나머지로부터 유리될 수 있으며 상피 세포로부터 막의 기저측면 상의 세포 기질(cellular matrix)로 방출될 수 있다. 또한, 융합 분자가 세포의 기저측 막으로부터 융합 분자 및 하나 이상의 페이로드의 방출을 야기하는 편광 상피 세포의 트래피킹(trafficking) 경로에 들어가기 전에 절단 효소가 융합 분자를 절단하지 않는 한, 절단형 링커가 기저측 막으로부터 융합 분자의 방출 전에 절단되도록, 상피 세포 내부에 존재하는 절단 효소가 사용될 수 있다.
다양한 실시예에서, 절단형 링커는 전달 구조체의 나머지보다 더 큰 절단 경향을 나타낸다. 통상의 기술자가 알고 있는 바와 같이, 많은 펩티드 및 폴리펩티드 서열은 펩티다제 및 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 다양한 실시예에서, 절단형 링커는 전달 구조체의 투여 동안 전달 구조체에 존재하는 다른 아미노산 서열에 비해 우선적으로 절단되도록 선택된다. 다양한 실시예에서, 수용체-결합 도메인은 피험자의 혈류에 전달 구조체의 전달 후 실질적으로 (예를 들어, 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 또는 약 75%) 온전하다. 다양한 실시예에서, 통과세포외배출 활성은 피험자의 혈류에 전달 구조체의 전달 후 실질적으로 (예를 들어, 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 또는 약 75%) 온전하다. 다양한 실시예에서, 거대분자는 피험자의 혈류에 전달 구조체의 전달 후 실질적으로 (예를 들어, 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 또는 약 75%) 온전하다. 다양한 실시예에서, 절단형 링커는 피험자의 혈류에 전달 구조체의 전달 후 실질적으로 (예를 들어, 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 또는 약 75%) 절단된다.
다른 실시예에서, 피험자의 혈장에서 발견되는 절단 효소를 사용하여 절단형 링커를 절단할 수 있다. 피험자의 혈장에 존재하는 것으로 통상의 기술자에게 알려진 임의의 절단 효소를 사용하여 절단형 링커를 절단할 수 있다.
다양한 실시예에서, 절단형 링커는 피험자의 혈장에서 발견되는 절단 효소에 의해 절단된다. 피험자의 혈장에 존재하는 것으로 통상의 기술자에게 알려진 임의의 절단 효소를 사용하여 절단형 링커를 절단할 수 있다. 일부 경우에, 혈장 절단 효소를 사용하여 전달 구조체를 절단할 수 있다. 다른 실시예에서, 절단형 링커는 핵산, 예를 들어 RNA 또는 DNA를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 절단형 링커는 탄수화물, 예를 들어 이당류 또는 삼당류를 포함한다.
다양한 실시예에서, 절단형 링커는 융합 분자의 환경 변화 후에 절단되는 절단형 링커일 수 있다. 예를 들어, 절단형 링커는 pH 민감성이며 융합 분자가 편광 상피 세포의 기저측 막으로부터 방출될 때 경험되는 pH의 변화에 의해 절단되는 절단형 링커일 수 있다. 예를 들어, 장 내강은 강한 알칼리성일 수 있는 반면, 혈장은 본질적으로 중성일 수 있다. 따라서, 절단형 링커는 알칼리성에서 중성 pH로의 이동 시 절단되는 부분일 수 있다. 절단형 링커를 절단하는 융합 분자의 환경 변화는, 융합 분자가 제한 없이 통상의 기술자에게 알려진 편광 상피 세포의 기저측 막으로부터 방출될 때 경험되는 임의의 환경 변화일 수 있다.
VIII. 비-절단형 링커
다양한 실시예에서, 담체 및 하나 이상의 페이로드는 링커에 의해 분리될 수 있다. 링커가 사용되는 경우, 링커는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 링커의 예는 S, (GS)x, (GGS)x, (GGGS)x, (GGGGS)x, 또는 (GGGGGS)x와 같은 서열을 포함하며, 여기서 x = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 이다. 일부 경우에, 링커는 말단 S 잔기, 예를 들어 서열번호: 4 (GGGGSGGGGSGGGG)를 포함하지 않는다. 일반적으로, 링커는 단백질을 결합하거나 또는 단백질 사이의 약간의 최소 거리 또는 기타 공간 관계를 보존하는 것 이외에 특정 생물학적 활성을 가질 수 없다. 그러나, 다양한 실시예에서, 링커의 구성 아미노산은 접힘, 순 전하(net charge), 또는 소수성과 같은 분자의 일부 특성에 영향을 미치도록 선택될 수 있다.
다양한 실시예에서, 링커는 담체 및 생물학적 활성 페이로드 둘 다에 공유 결합을 형성할 수 있다. 적당한 링커는 직쇄 또는 분지쇄 탄소 링커, 이종고리형 탄소 링커, 또는 펩티드 링커를 포함한다. 다양한 실시예에서, 링커(들)은 이의 측기(side groups)를 통해 (예를 들어, 시스테인에 이황화 결합을 통해) 담체 및/또는 하나 이상의 페이로드의 구성 아미노산에 결합될 수 있다. 다양한 실시예에서, 링커는 담체 및/또는 생물학적 활성 페이로드의 말단 아미노산의 알파 탄소 아미노기 및/또는 카복실기에 결합된다.
담체 상의 기와 반응적인 하나의 작용기 및 하나 이상의 페이로드 상의 기와 반응적인 또 다른 기를 갖는 이작용성 링커를 사용하여 원하는 접합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 유도체화는 표적 부분의 화학적 처리를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항체 단편과 같은 폴리펩티드 상의 유리 설프히드릴 기의 생성 방법은 알려져 있다 (참조, 미국 특허 번호 제 4,659,839호).
항체와 같은 단백질에 방사성핵종 금속 킬레이트, 담체 및 약물을 포함하여 다양한 화합물의 결합을 위한 많은 방법 및 링커 분자가 알려져 있다. 참조, 예를 들어, 유럽 특허 출원 번호 제 188,256호; 미국 특허 번호 제 4,671,958호, 제 4,659,839호, 제 4,414,148호, 제 4,699,784호; 제 4,680,338호; 제 4,569,789호; 및 제 4,589,071호; 및 Borlinghaus et al. (1987) Cancer Res. 47: 4071-4075.
IX. 담체에 페이로드 또는 양이온의 화학적 접합 또는 착물화
다양한 실시예에서, 피험자에게 전달될 페이로드는 담체에 화학적으로 접합된다. 분자를 화학적으로 접합하는 방법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
2개의 분자를 접합하는 방법은 제제의 화학 구조에 따라 다르다. 폴리펩티드는 일반적으로 다양한 작용기; 예를 들어, 다른 펩티드 상 또는 거기의 분자와 결합하는 링커 상의 적당한 작용기와의 반응에 이용할 수 있는, 카복실산 (COOH) 기 또는 유리 아민 (NH2) 기를 함유한다.
본 발명의 다양한 실시예에서, 분리된 담체는 박테리아 발효에 의해 제조되며 확립된 방법에 의해 정제된다. 정제된 담체는 이의 C-말단에서 변형된 다음, 단백질의 C-말단 근처에 위치한 유리 설프히드릴 잔기를 통해 직접적인 화학 결합을 허용할 수 있다. C-말단 변형은 담배 에칭 바이러스 (TEV)의 고도의 선택적인 프로테아제에 대한 공통 절단 서열 ENLFQS을 숨겨주는(harboring) 시스테인-구속 루프, 제 2 시스테인, 및 헥사-히스티딘 (His6) 태그 (예를 들어, 서열번호: 77 및 서열번호: 78)를 포함할 수 있다. 제 2 Cys은 궁극적으로 결합에 사용되는 Cys와 함께 이황화 다리를 형성하기 위해 포함된다. 단백질에 His6 서열의 첨가는 정제를 단순화할 수 있으며, TEV 절단 서열은 약한 환원(mild reduction) 후에 말단 Cys 잔기를 선택적으로 제거하는 메커니즘을 제공한다. 비-독성 박테리아 구조체의 발현 및 분리 후에 0.1 mM 디티오트레이톨을 이용한 TEV 절단 및 약한 환원은, 화물 결합의 일반적인 메커니즘으로서 말레이미드-기반 반응을 통해 글루코오스 조절제, 예를 들어, 글루코오스 저하제의 직접적인 화학 결합을 허용한다. TEV 프로테아제 절단, 환원, 및 유리 설프히드릴과의 말레이미드 반응을 통한 화물 결합 후에, 유리된 C-말단 서열의 제거는 제 2 Ni2+ 컬럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성되었다.
특정 실시예에서, 전달 구조체는 담체와 공유적으로 장식된 입자를 포함하며, 여기서 페이로드는 입자에 통합된다. 특정 실시예에서, 입자는 직경이 ~150 nm보다 작거나, ~100 nm보다 작거나, 또는 ~50 nm보다 작을 수 있다.
통과세포외배출 시험
담체의 기능은 예를 들어, 입자에서 담체 또는 담체와 관련된 페이로드를 상피 막을 통해 통과시키는 능력을 기반으로 시험할 수 있다. 통과세포외배출은 먼저 세포에 대한 결합을 필요로 할 수 있기 때문에, 이러한 분석을 사용하여 세포 인식 도메인의 기능도 평가할 수 있다.
통과세포외배출 활성은 제한 없이, 통상의 기술자에게 알려진 임의의 방법에 의해 시험될 수 있다. 통과세포외배출 활성은 조성물, 입자가 결합하는 비-편광 세포에 들어가는 능력을 평가함으로써 시험될 수 있다. 또한, 담체가 편광 상피 세포를 통과할 수 있게 하는 동일한 특성은 담체를 함유하는 분자가 비-편광 세포에 들어갈 수 있도록 할 수 있다. 따라서, 세포에 들어가는 조성물의 능력은 예를 들어, 세포 내부에서 조성물 (예를 들어, 담체 또는 페이로드)의 물리적 존재를 검출함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 예를 들어, 형광 마커로 표지될 수 있으며 전달은 세포에 노출된다. 그 다음, 세포를 세척하고, 임의의 조성물 (예를 들어, 담체 또는 페이로드), 예를 들어, 세포에 들어가지 않은 전달 구조체를 제거하며, 남아 있는 표지의 양을 결정할 수 있다. 이 견인(traction)에서 표지의 검출은 조성물이 세포에 들어갔음을 나타낸다.
조성물의 통과세포외배출 능력은 편광 상피 세포를 통과하는 담체 또는 페이로드 (예를 들어, 전달 구조체의) 능력을 평가하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 예를 들어, 형광 마커로 표지될 수 있으며 상피 세포 층의 정단 막에 접촉될 수 있다. 상피 세포에 의해 형성된 막의 기저측면에서 검출된 형광은 담체가 적당히 기능하고 있음을 나타낸다.
절단형 링커 절단 시험
절단형 링커의 기능은 일반적으로 절단 분석에서 시험될 수 있다. 통상의 기술자에게 알려진 임의의 적당한 절단 분석을 제한 없이 사용하여 절단형 링커를 시험할 수 있다. 세포-기반 및 무세포 분석 모두 절단형 링커를 절단하는 효소의 능력을 시험하는데 사용될 수 있다.
절단형 링커의 절단을 시험하기 위한 예시적인 무세포 분석은 편광 상피 세포의 추출물을 제조하는 단계 및 막-관련 효소에 상응하는 추출물의 분획에 절단형 링커를 함유하는 표지된 융합 분자를 노출시키는 단계를 포함한다. 이러한 분석에서, 표지는 전달될 글루코오스 조절제, 예를 들어, 글루코오스 저하제 또는 융합 분자의 나머지에 결합될 수 있다. 이러한 효소 중에는, 상기 기재된 바와 같이 편광 상피 세포의 기저측 막 근처에서 발견되는 절단 효소가 있다. 절단은 예를 들어, 융합 분자를 예를 들어, 항체와 결합시키고 미결합된 분자를 세척함으로써 검출될 수 있다. 만일 표지가 전달될 글루코오스 조절제, 예를 들어, 글루코오스 저하제에 결합되면, 그 다음 항체에 결합된 분자 상에 표지가 거의 또는 전혀 관찰되지 않아야 한다. 대안적으로, 분석에서 사용된 결합제는 글루코오스 조절제, 예를 들어, 글루코오스 저하제에 대해 특이적일 수 있으며, 구조체의 나머지는 표지될 수 있다. 두 경우 모두, 절단을 평가할 수 있다.
또한, 절단은 막으로 모인 편광 상피 세포에 의한 절단을 시험하는 세포-기반 분석을 이용하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 표지된 융합 분자, 또는 절단형 링커를 포함하는 융합 분자의 일부는 링커의 절단을 허용하는 조건 하에서, 적당한 상피 세포, 예를 들어, Caco-2 세포의 단층의 정단 또는 기저측 면에 접촉될 수 있다. 절단은 융합 분자, 또는 이의 일부에 특이적으로 결합하는 시약을 이용하여 표지의 존재 또는 부재를 검출함으로써 검출될 수 있다. 예를 들어, 융합 분자에 특이적인 항체는 항체에 의해 결합된 융합 분자의 부분과 관련하여 절단형 링커의 원위(distal)에 표지를 포함하는 융합 분자를 결합시키는데 사용될 수 있다. 그 다음, 절단은 항체에 결합된 분자 상의 표지의 존재를 검출함으로써 평가될 수 있다. 만일 절단이 발생하면, 항체에 결합된 분자 상에 표지가 거의 또는 전혀 관찰되지 않아야 한다. 이러한 실험을 수행함으로써, 정단 막보다는 기저측 막에서 우선적으로 절단하는 효소가 확인될 수 있으며, 또한, 융합 분자에서 절단형 링커를 절단하는 이러한 효소의 능력이 확인될 수 있다.
또한, 절단은 미국 특허 번호 제 6,759,207호에 기재된 형광 리포터 분석을 이용하여 시험될 수도 있다. 간단하게, 이러한 분석에서, 형광 리포터는 절단 효소가 리포터를 절단할 수 있게 하는 조건 하에 적당한 상피 세포의 단층의 기저측면에 접촉될 수 있다. 리포터의 절단은 형광 리포터의 구조를 변화시켜, 비-형광 구성에서 형광 구성으로 변화시킨다. 관찰된 형광의 양은 기저측 막에 존재하는 절단 효소의 활성을 나타낼 수 있다.
또한, 절단은 미국 특허 번호 제 6,592,847호에 기재된 것과 같은 분자내 소광 분자 프로브(intra-molecularly quenched molecular probe)를 이용하여 시험될 수도 있다. 이러한 프로브는 일반적으로 적당한 파장의 빛으로 여기될 때 광자를 방출하는 형광 부분 및 형광 부분에 가까이 근접할 때 이러한 광자를 흡수하는 소광제 부분(quencher moiety)을 포함한다. 프로브의 절단은 형광이 검출될 수 있도록 형광 부분으로부터 소광 부분을 분리함으로써, 절단이 발생하였음을 나타낸다. 따라서, 이러한 프로브는 절단 효소가 프로브를 절단할 수 있도록 하는 조건 하에 적당한 상피 세포의 단층의 기저측면을 프로브와 접촉시킴으로써 특정 절단 효소에 의한 절단을 확인하고 평가하는데 사용될 수 있다. 관찰된 형광의 양은 시험되는 절단 효소의 활성을 나타낸다.
X. 사용 방법
본 발명의 방법 및 조성물, 예를 들어, 약학 조성물은 질환 또는 질병, 예를 들어, 의학적 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 방법 및 조성물은 경구 및/또는 비강내 제형 및 전달에 적합할 수 있다. 질환 또는 질병은 면역학적 질환, 대사성 질환, 또는 중추신경계 (CNS) 질환일 수 있다. "대사성 질환 또는 장애"는 함께 발생하는 경우, 당뇨병 및 동맥경화성 혈관 질환(atherosclerotic vascular disease), 예를 들어, 심장 질환 및 뇌졸중의 위험을 증가시키는 의학적 장애의 조합을 나타낼 수 있다. 대사 증후군에 대한 의학적 매개변수의 정의는 당뇨병, 내당능 장애, 공복 혈당 상승, 인슐린 저항성, 요로 알부민 분비, 중심성 비만, 고혈압, 중성지방 상승, LDL 콜레스테롤 상승 및 HDL 콜레스테롤 감소를 포함한다.
본 명세서에 제공된 방법 및 조성물, 예를 들어, 약학 조성물은 신경 질병, 면역학 관련 질병, 및 내분비학 관련 질병, 면역-신경학 관련 질병, 신경-내분비학 관련 질병, 또는 면역-내분비학 관련 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물, 예를 들어, 약학 조성물은 심혈관 질환, 희귀 질환, 간 질환, 염증성 장 질환, 호흡기 질병, 신경계 질병, 또는 위장 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 제공된 조성물은 백신일 수 있다. 질환 또는 질병은 예를 들어, 바이러스성 질환 또는 감염, 암, 대사성 질환, 비만, 자가면역 질환, 염증성 질환, 알러지, 이식편-대-숙주병, 전신 미생물 감염, 빈혈, 심혈관 질환, 정신병, 유전 질환, 신경퇴행성 질환, 조혈세포 장애, 내분비계 또는 생식계 질환, 위장 질환을 포함한다. 질환의 추가 예는 당뇨병, 비만으로 인한 당뇨병, 고혈당증, 이상지질혈증, 고중성지방혈증, X 증후군, 인슐린 저항성, 내당능 장애 (IGT), 당뇨병성 이상지질혈증, 고지혈증, 지방간 질환, 비알콜성 지방간염 (NASH), 간염, 비만, 혈관 질환, 심장 질환, 뇌졸중, 공복 혈당 상승, 요로 알부민 분비, 중심성 비만, 고혈압, 중성지방 상승, LDL 콜레스테롤 상승 및 HDL 콜레스테롤 감소, 고인슐린혈증, 케톤증, 공복 혈당 장애, 글루코오스신생합성, 과잉 글리코겐분해, 당뇨병성 케톤산증, 당뇨병성 신증, 신기능부전, 신부전, 과식증, 근육 소모, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 혼수, 동맥경화증, 관상 동맥성 심장 질환, 말초 동맥 질환, 및 섬유증(fibrosis)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 질환 또는 질병은 궤양성 대장염, 크론병, 주머니염(pouchitis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 류마티스성 관절염, 또는 건선일 수 있다. 질환 또는 질병은 소화기내과 질병(gastroenterological condition), 예를 들어, 단장 증후군(short bowel syndrome, SBS)일 수 있다. 질환 또는 질병은 성장 호르몬 결핍증일 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 제공된 조성물은 GLP-2를 포함하며, 조성물은 소화기내과 질병, 예를 들어, 단장 증후군 (SBS)을 갖는 피험자에게 예를 들어, 경구로 투여된다. 일부 경우에, 본 명세서에 제공된 조성물은 GLP-1을 포함하며, 조성물은 피험자에게 예를 들어, 경구로 투여되어 대사성 질환을 치료한다; 조성물은 국소 위장 및/또는 전신 노출을 위한 경구 전달용으로 제형화될 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 제공된 조성물은 GLP-1 또는 GLP-1 유사체를 포함하며, 조성물은 피험자에게 예를 들어, 경구로 제공되어 대사성 장애 (예를 들어, 당뇨병, 비만), 또는 비알콜성 지방간염 (NASH), 또는 중추신경계 (CNS) 질병을 치료한다. 조성물은 경구 전달용으로 제형화될 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 제공된 조성물은 인간 성장 호르몬을 포함하며, 조성물은 성장 호르몬 결핍증 또는 관련 장애를 갖는 피험자에게 제공되어 성장 호르몬 결핍증 또는 관련 장애를 치료한다. 조성물은 경구 전달용으로 제형화될 수 있으며, 페이로드에 대한 표적 위치는 전신 노출일 수 있다. 일부 경우에, 페이로드는 간에 도달할 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 제공된 조성물은 인크레틴을 포함한다. 일부 경우에, 본 명세서에 제공된 조성물은 피험자에게 투여되어 혈당 기능을 조절한다.
많은 만성 질환에서, 본 발명의 경구 및/또는 비강내 제형은 이들이 주사가능한 치료 또는 약물 프로토콜에 의존하지 않고 가정 투여를 통해 장기간 환자 간호 및 요법을 허용할 수 있기 때문에 특히 유용할 수 있다. 본 발명의 제형은 경구 투여, 폐 투여, 비강내 투여, 협측 투여, 또는 설하 투여에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 이러한 제형에 함유된 하나 이상의 페이로드의 용도를 나타내는 질환 및 질병의 치료에서 하나 이상의 페이로드의 경구 전달을 위한 알약 또는 정제의 약물 물질로서, 자기-조립 입자, 예를 들어, 담체, 페이로드 (예를 들어, 이종성 페이로드), 및/또는 비-자연적으로 발생하는 융합 분자를 함유하는 미세입자인 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 담체, 페이로드 (예를 들어, 이종성 페이로드), 및/또는 융합 분자를 포함하는 입자, 예를 들어 미세입자인 약학 조성물은 피험자에게 거대분자의 국소 또는 전신 전달을 위한 통상적인 기법에 비해 여러 이점을 제공할 수 있다. 이러한 이점 중 가장 중요한 것은 피험자의 피부에 구멍을 뚫기 위해 바늘을 사용하지 않고 피험자에게 하나 이상의 페이로드를 전달하는 능력이다. 많은 피험자들은 반복적이고 규칙적인 거대분자 용량을 필요로 한다. 이러한 피험자들의 삶의 질은 거대분자의 전달이 통증 또는 이와 관련된 잠재적인 합병증을 피함으로써 주사 없이 달성될 수 있다면, 크게 개선될 것이다.
또한, 상피 세포의 기저측 막에 존재하는 효소에 의해 절단되는 링커를 이용하여 융합 분자의 나머지에 하나 이상의 페이로드의 결합은, 하나 이상의 페이로드가 융합 분자로부터 유리되며 상피 막을 가로질러 통과세포외배출 직후 융합 분자의 나머지로부터 방출되도록 할 수 있다. 이러한 유리는 페이로드, 예를 들어 생물학적 페이로드에 대한 면역 반응의 유도 가능성을 감소시킬 수 있다. 또한, 하나 이상의 페이로드가 융합 분자의 나머지에서 없는 이의 표적과 상호작용하도록 할 수 있다.
또한, 일단 GI 상피를 가로질러 수송되면, 본 발명의 융합 분자는 혈청에서 연장된 반감기를 나타낼 것이다, 즉, 융합 분자의 하나 이상의 페이로드는 이의 비-융합된 상태의 하나 이상의 페이로드에 비해 연장된 혈청 반감기를 나타낼 수 있으며, 융합 분자의 경구 투여는 피험자의 혈장에서 관찰되는 것보다 더 높은 유효 농도의 전달된 하나 이상의 페이로드를 피험자의 간에 전달할 수 있다.
본 발명의 구조체는 단백질분해 파괴에 대한 페이로드의 민감성을 감소시키며, 키메라 재접힘을 돕고, 저장 동안 키메라 안정성을 개선할 수 있다. 이와 같이, 융합 분자는 생물학적 활성 치료제의 경구 투여를 위한 새로운 부류의 약학 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 미세입자 또는 나노입자 및 하나 이상의 다른 치료제를 나타내는, 용어 "공동-투여", "공동-투여된" 및 "병용하여"는, 이러한 성분들이 함께 실질적으로 동일한 시간에 환자에게 상기 성분을 방출하는 단일 제형으로 제형화 될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 미세입자 또는 나노입자 및 치료제(들)의 이러한 조합의 동시 투여; 이러한 성분들이 실질적으로 동시에 환자에 의해 취해진 별도의 제형으로 서로 별도로 제형화하여 상기 성분이 상기 환자에게 실질적으로 동시에 방출될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 미세입자 또는 나노입자 및 치료제(들)의 이러한 조합의 실질적으로 동시 투여; 이러한 성분들이 각 투여 사이의 상당한 시간 간격으로 환자에 의해 연속하여 취해진 별도의 제형으로 서로 별도로 제형화하여 상기 성분이 상기 환자에게 실질적으로 상이한 시간에 방출될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 미세입자 또는 나노입자 및 치료제(들)의 이러한 조합의 순차적인 투여; 및 이러한 성분들이 함께 조절된 방식으로 상기 성분을 방출하는 단일 제형으로 제형화하여 이들이 상기 환자에게 동일한 시간 및/또는 상이한 시간에 동시, 연속 및/또는 중첩하는 방식으로 방출되며, 여기서 각 부분이 동일하거나 또는 상이한 경로에 의해 투여될 때, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 미세입자 또는 나노입자 및 치료제(들)의 이러한 조합의 순차적인 투여를 포함할 수 있다.
다양한 실시예에서, 병용 요법은 동일한 약학 조성물 또는 별개의 약학 조성물로, 분리된 미세입자 또는 나노입자 조성물 및 제 2 제제 조성물을 동시에 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 실시예에서, 분리된 미세입자 또는 나노입자 조성물 및 제 2 제제 조성물은 순차적으로 투여된다, 즉, 분리된 미세입자 또는 나노입자 조성물은 제 2 제제 조성물의 투여 전 또는 후에 투여된다.
다양한 실시예에서, 입자, 예를 들어, 미세입자 또는 나노입자 조성물 및 제 2 제제 조성물의 투여는 동시적이다, 즉, 분리된 입자, 예를 들어, 미세입자 또는 나노입자 조성물 및 제 2 제제 조성물의 투여 기간은 서로 중복된다.
다양한 실시예에서, 입자, 예를 들어, 미세입자 또는 나노입자 조성물 및 제 2 제제 조성물의 투여는 비-동시적이다. 예를 들어, 다양한 실시예에서, 분리된 입자, 예를 들어, 미세입자 또는 나노입자 조성물의 투여는 제 2 제제 조성물이 투여되기 전에 종료된다. 다양한 실시예에서, 제 2 제제 조성물의 투여는 분리된 입자, 예를 들어, 미세입자 또는 나노입자 조성물이 투여되기 전에 종료된다.
다양한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 미세입자 또는 나노입자의 치료적 유효량은 하나 이상의 다른 치료제와 병용하여 투여될 것이다. 이러한 치료제는 염증성 질환, 자가면역 질환, 암 또는 성장 호르몬 (GH) 결핍 성장 장애와 같은 본 명세서에 기재된 바와 같은 특정 질환 상태에 대한 표준 치료제로서 당해 기술분야에서 용인될 수 있다. 고려되는 예시적인 치료제는 사이토카인, 성장 인자, 스테로이드, NSAIDs, DMARDs, 항-염증제, 화학요법제, 방사선 치료제, 또는 기타 활성제 및 보조제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물, 예를 들어, 담체 및 페이로드 (예를 들어, 전달 구조체)를 포함하는 입자의 치료적 유효량을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 비만으로 분류된 (예를 들어, 30 kg/m2 이상의 체질량 지수 (BMI)를 갖는) 피험자의 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인슐린 보충 없이, 상기 질환을 치료하기에 충분한 양으로 본 발명의 조성물, 예를 들어, 담체 및 페이로드 (예를 들어, 전달 구조체)를 포함하는 입자를 경구 투여하는 단계를 포함하는 제 1 형 당뇨병 (T1D)으로 진단된 피험자의 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 상기 질환을 치료하기에 충분한 양으로 본 발명의 조성물, 예를 들어, 담체 및 페이로드 (예를 들어, 전달 구조체)를 포함하는 입자를 경구 투여하는 단계, 및 (b) 인슐린 보충을 포함하는 제 1 형 당뇨병 (T1D)으로 진단된 피험자의 치료 방법에 관한 것이다. 특정 실시예에서, 인슐린 보충은 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, .5%, .4%, .3%, .2%, 또는 .1%의 인슐린의 정상적인 일일 투여량을 포함하여, 약 70%-90%, 약 50%-70%, 약 30%-50%, 약 15%-30%, 약 10-15%, 약 5-10%, 및 0 내지 5%일 수 있는 인슐린의 용량을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 질환을 치료하기에 충분한 양으로 본 발명의 조성물, 예를 들어, 담체 및 페이로드 (예를 들어, 전달 구조체)를 포함하는 입자를 경구 투여하는 단계를 포함하는 제 2 형 당뇨병 (T2D)으로 진단된 피험자의 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 지방간 질환 (예를 들어, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD); 비알콜성 지방간염 (NASH)), 위장 질환, 또는 신경퇴행성 질환을 갖는 피험자의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 질환을 치료하기에 충분한 양으로 본 발명의 조성물, 예를 들어, 담체 및 페이로드 (예를 들어, 전달 구조체)를 포함하는 입자를 경구 투여하는 단계를 포함한다.
XI. 담체, 페이로드, 및 융합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드
또 다른 측면에서, 본 발명은 담체, 페이로드 (예를 들어, 이종성 페이로드), 및 비-자연적으로 발생하는 융합 분자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 담체, 페이로드 (예를 들어, 이종성 페이로드), 및 융합 분자를 제조하는데 유용하다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 담체, 예를 들어, 콜릭스 담체 또는 PE를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 서열, 및 페이로드, 예를 들어, 글루코오스 조절제, 예를 들어, 글루코오스 저하제 또는 양이온을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 폴리링커 삽입 부위를 포함하는 발현 시스템을 제공한다. 다양한 실시예에서, 발현 시스템은 절단형 링커에서의 절단이 인코딩된 융합 분자의 나머지로부터 폴리링커 삽입 부위에 삽입된 핵산에 의해 인코딩된 페이로드, 예를 들어, 글루코오스 저하제를 분리하도록 절단형 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 폴리링커 삽입 부위가 인코딩된 구조체의 말단에 있는 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리링커 삽입 부위와 폴리뉴클레오티드의 나머지 사이의 절단형 링커를 인코딩하는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 폴리링커 삽입 부위가 인코딩된 구조체의 말단에 없는 실시예에서, 폴리링커 삽입 부위는 절단형 링커를 각각 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 측면에 있을 수 있다.
본 발명의 담체, 예를 들어, 콜릭스 담체 또는 PE, 페이로드, 또는 융합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조하는데 사용될 수 있는 다양한 in vitro 방법은, 역전사, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 전사-기반 증폭 시스템 (transcription-based amplification system, TAS), 자가-유지 서열 복제 시스템 (self-sustained sequence replication system) (3SR) 및 QP 복제효소 증폭 시스템 (replicase amplification system) (QB)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
이러한 클로닝 및 in vitro 증폭 방법을 이용하기 위한 지침은 예를 들어, 미국 특허 번호 제 4,683,195호; Mullis et al., 1987, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; 및 Erlich, ed., 1989, PCR Technology, Stockton Press, NY에 기재되어 있다. 또한, 융합 분자 또는 이의 일부를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 가혹한, 적당히 가혹한, 또는 매우 가혹한 혼성화 조건 하에 원하는 폴리뉴클레오티드의 서열로부터 선택된 프로브로 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 분리될 수 있다.
본 발명의 담체, 페이로드, 또는 융합 분자를 인코딩하는 핵산의 구축은, 글루코오스 저하제를 인코딩하는 핵산의 삽입 부위를 구조체에 도입함으로써 촉진시킬 수 있다.
또한, 폴리뉴클레오티드는 인코딩된 담체, 페이로드, 또는 융합 분자의 아미노 말단에서 분비 서열을 인코딩할 수도 있다. 이러한 구조체는 면역원의 분리를 단순화하기 때문에, 포유류 세포에서 담체, 페이로드, 또는 융합 분자를 생성하는데 유용하다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 담체, 페이로드, 또는 융합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유도체 버전도 포함한다. 예를 들어, 유도체는 융합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1, 2, 3, 5, 10 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입, 또는 결실을 포함하는, 부위-특이적 돌연변이유발(site-specific mutagenesis)에 의해 제조될 수 있다.
따라서, 다양한 실시예에서, 본 발명은 담체, 페이로드, 또는 융합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 담체, 페이로드, 또는 융합 분자는 피험자에게 전달될 변형된 담체 및 페이로드, 예를 들어, 글루코오스 조절제, 예를 들어, 글루코오스 저하제; 및 임의로, 절단형 링커를 포함할 수 있다. 절단형 링커에서의 절단은 융합 분자의 나머지로부터 페이로드, 예를 들어, 글루코오스 조절제, 예를 들어, 글루코오스 저하제를 분리할 수 있다. 절단형 링커는 피험자의 편광 상피 세포의 기저측 막에 또는 피험자의 혈장에 존재하는 효소에 의해 절단될 수
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다.
다양한 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 가혹한 혼성화 조건 하에 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드에 혼성화한다. 추가 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 가혹한 혼성화 조건 하에 본 발명의 임의의 담체, 페이로드, 또는 융합 분자를 인코딩하는 핵산에 혼성화한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 담체, 페이로드, 또는 융합 분자를 발현하기 위한 발현 벡터를 제공한다. 일반적으로, 발현 벡터는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 분자일 수 있다. 발현 벡터는 적당한 프로모터, 복제 서열, 선택가능한 마커 등을 포함시킴으로써 원핵생물 또는 진핵생물에서의 기능에 용이하게 적응하여 안정한 전사 및 번역 또는 mRNA를 야기할 수 있다. 발현 벡터의 구축 및 발현 벡터를 포함하는 세포에서 유전자의 발현을 위한 기법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 참조, 예를 들어, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 3.sup.rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., and Ausubel et al., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY.
발현 벡터는 담체, 페이로드, 또는 융합 분자가 발현되는 세포에 적합한 발현 및 복제 신호를 함유할 수 있다. 발현 벡터는 제한 없이 통상의 기술자에게 알려진 임의의 방법에 의해 담체, 페이로드, 또는 융합 분자의 발현을 위해 세포 내로 도입될 수 있다. 또한, 발현 벡터는 담체, 페이로드, 또는 융합 분자의 분리를 단순화시키는 정제 부분을 함유할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 담체, 페이로드, 또는 융합 분자, 또는 이의 일부의 발현을 위한 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 세포는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해 고농도의 담체, 페이로드, 또는 융합 분자를 발현하는 능력에 대해 선택될 수 있다. 다양한 실시예에서, 세포는 원핵 세포, 예를 들어, E. coli이다. 실시예에 기재된 바와 같이, 담체, 페이로드, 또는 융합 분자는 적당히 접힐 수 있으며, E. coli에서 발현될 때 적당한 이황화 결합을 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 세포는 진핵 세포이다. 유용한 진핵 세포는 효모 및 포유류 세포를 포함한다. 재조합 폴리펩티드를 발현하는데 유용한 통상의 기술자에게 알려진 임의의 포유류 세포는 제한 없이 담체, 페이로드, 또는 융합 분자를 발현하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포는 담체, 페이로드, 또는 융합 분자를 발현하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 담체, 페이로드, 또는 융합 분자는 하기에 기재된 바와 같이 재조합에 의해 제조될 수 있다. 그러나, 담체, 페이로드, 또는 융합 분자는 통상의 기술자에게 알려진 방법을 이용하여 화학 합성에 의해 제조될 수도 있다.
본 발명의 담체, 페이로드, 및 융합 분자를 발현 및 정제하는 방법은 본 명세서에서, 예를 들어, 하기의 실시예에서 광범위하게 기재된다. 일반적으로, 방법은 벡터로부터 담체, 페이로드, 및/또는 융합 분자를 발현할 수 있는 세포에 담체, 페이로드, 및/또는 융합 분자를 인코딩하는 발현 벡터의 도입에 의존한다. 그 다음, 담체, 페이로드, 및/또는 융합 분자는 예를 들어, 이러한 제형에 함유된 하나 이상의 페이로드의 용도를 나타내는 질환 및 질병의 치료에서 피험자에게 투여하기 위해 정제될 수 있다.
XII. 폐 전달을 위한 미세입자 또는 나노입자 약학 조성물의 용도
본 명세서에 개시된 입자 조성물, 예를 들어, 미세입자 약학 조성물은 페이로드, 예를 들어, 생물학적 활성 페이로드의 폐 전달을 위한 약물 물질로서 사용될 수 있다. 폐 전달 방법은 분무 또는 건조 분말 흡입을 포함할 수 있다.
입자, 예를 들어, 미세입자 또는 나노입자 약학 조성물은 폐 전달용으로 제형화될 수 있다. 폐 투여용으로 제형화된 약학 조성물은 쉽게 분무되거나 또는 에어로졸화될 수 있다. 일부 경우에, 폐 투여용으로 제형화된 약학 조성물은 폐 상피를 가로질러 통과세포외배출을 매개하는 담체의 능력을 이용한다. 비강내 투여는 폐 전달에 사용될 수 있으며, 분말의 코흡입(snorting) 또는 냄새 맡기(sniffing)를 포함할 수 있다.
XIII. 경구 전달용 조성물의 용도
본 명세서에 개시된 조성물, 예를 들어, 입자, 예를 들어, 미세입자 또는 나노입자 조성물, 예를 들어, 미세입자 약학 조성물은 이러한 제형에 함유된 하나 이상의 페이로드의 용도를 나타내는 질환 및 질병의 치료에서, 개체에게, 페이로드, 예를 들어, 생물학적 활성 페이로드의 경구 전달을 위한 알약 또는 정제의 약물 물질로서 사용될 수 있다.
조성물, 예를 들어, 미세입자 또는 나노입자 약학 조성물은 경구 전달용으로 제형화될 수 있다. 경구 투여용으로 제형화된 약학 조성물은 소화관에서의 분해에 대해 내성일 수 있다.
일부 경우에, 경구 투여용으로 제형화된 약학 조성물은 위장 (GI) 상피를 가로질러 통과세포외배출을 매개하는 담체의 능력을 이용한다. 이러한 약학 조성물의 경구 투여는 소화 점막, 예를 들어, 장 점막의 편광 상피 세포를 통해 담체 및 페이로드 (예를 들어, 융합 분자)를 흡수한 다음, 점막의 기저측면에서 페이로드, 예를 들어, 하나 이상의 페이로드의 방출을 야기할 수 있다. 이러한 약학 조성물의 폐 투여는 폐 및 기도의 편광 상피 세포를 통해 담체 및 페이로드의 흡수를 야기할 수 있다. 상피 세포는 비강 상피 세포, 구강 상피 세포, 장 상피 세포, 직장 상피 세포, 질 상피 세포, 또는 폐 상피 세포일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 GI 상피 또는 폐 상피를 가로질러 융합 단백질의 전달을 용이하게 하기 위해 통과세포외배출 인핸서의 첨가를 포함할 수 있다. 이러한 인핸서는 당해 기술분야에 알려져 있다, 참조, 예를 들어, Xia et al., (2000) J. Pharmacol. Experiment. Therap., 295:594-600; and Xia et al. (2001) Pharmaceutical Res., 18(2):191-195, 각각은 본 명세서에 전체 참조로 포함된다.
일단 상피를 가로질러 수송되면, 본 발명의 조성물, 예를 들어, 미세입자 또는 나노입자 약학 조성물은 혈청에서 연장된 반감기를 나타낼 수 있다, 즉, (예를 들어, 융합 분자의) 페이로드, 예를 들어, 생물학적 활성 페이로드는 이의 비-융합된 상태의 페이로드, 예를 들어, 생물학적 활성 페이로드에 비해 연장된 혈청 반감기를 나타낼 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 경구 제형은 이들이 GI 상피로의 수송 및 위(stomach)에서 담체, 페이로드, 또는 융합 분자의 보호에 적합하도록 제조될 수 있다. 이러한 제형은 담체 및 분산제 성분을 포함할 수 있으며, 에어로졸 (경구 또는 폐 전달용), 시럽, 에릭시르제, 츄잉정(chewable tablets)을 포함하는 정제, 경질 또는 연질 캡슐, 트로키(troches), 로렌지, 수성 또는 유성 현탁액, 에멀젼, 카세제(cachets) 또는 펠렛 과립, 및 분산형 분말을 포함하여 임의의 적당한 형태일 수 있다. 다양한 실시예에서, 약학 조성물은 정확한 투여량의 간단한 경구 투여에 적합한 고체 제형, 예를 들어, 정제, 캡슐 등으로 사용된다.
다양한 실시예에서, 경구 제형은 위에 있는 동안, 미세입자 약학 조성물 및 담체, 페이로드, 또는 융합 분자, 또는 비융합된 담체 및 페이로드 분자를 보호할 수 있는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 예를 들어, 보호 화합물은 분자의 산 및/또는 효소적 가수분해를 방지할 수 있어야 한다. 다양한 실시예에서, 경구 제형은 미세입자 약학 조성물 및 위에서 소장으로 구조체(들)의 수송을 용이하게 할 수 있는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 다양한 실시예에서, 위에서 분해로부터 담체, 페이로드, 또는 융합 분자를 보호할 수 있는 하나 이상의 화합물은 위에서 소장으로 구조체의 수송도 촉진할 수 있다. 예를 들어, 소듐 바이카보네이트(sodium bicarbonate)의 함유는 [Mrsny et al., Vaccine 17:1425-1433, 1999]에 기재된 바와 같이 위에서 십이지장으로 위내(intra-gastric) 전달된 물질의 빠른 이동을 촉진하는데 유용할 수 있다. 담체, 페이로드, 또는 융합 분자가 위를 통과하고 소장 내 편광 상피 막을 접촉할 수 있도록 제형을 제형화하는 다른 방법은 [DeYoung, Int J Pancreatol, 5 Suppl:31-6, 1989]에 기재된 장용성-코팅 기술 및 [미국 특허 번호 제 6,613,332호, 제 6,174,529호, 제 6,086,918호, 제 5,922,680호, 및 제 5,807,832호]에 제공된 방법을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 각각은 본 명세서에 전체 참조로 포함된다.
일부 경우에, 보호 화합물은 내산성 미세입자 또는 나노입자를 안정화시키는 양이온이다. 일부 경우에, 담체, 양이온, 및 이종성 페이로드를 포함하는 입자는 장용성 코팅 또는 기타 안정화 화합물의 필요 없이 췌장 효소에 대해 내성일 수 있다. 예를 들어, 도 11은 양이온 (아연 또는 프로타민) 및 이종성 페이로드 (엑세나티드)와 함께, 담체 단백질 (서열번호: 3)을 함유하는 제형에 대해 수행된 판크레아틴 소화 분석의 결과를 나타낸다. 도 11a 레인 1-4는 0, 30, 60 및 120분 후 서열번호: 3의 단백질 조성물의 판크레아틴 분해를 나타내며, 120분 후 단백질은 완전히 분해된다. 그러나, 레인 5-8은 1:1 비 (w/w 담체:아연 염)로 성분들을 혼합하여 제조된, 서열번호: 3의 단백질 및 아연 염의 제형을 나타낸다. 도 11a의 레인 8은 이 제형이 판크레아틴과 함께 120분의 배양 후에 부분적으로만 분해됨을 나타낸다. 1:1:1 비 또는 1:2:1 비로 제외된 서열번호: 3, 아연 및 엑세나티드의 제형에서 유사한 결과가 나타난다. 도 11b는 아연보다 양이온으로서 프로타민을 이용한 유사한 결과를 나타낸다. 도 11c는 서열번호: 3이 없는 엑세나티드 및 아연을 함유하는 제형에 대한 판크레아틴 처리 결과를 나타낸다. 일부 경우에, 본 명세서에 기재된 조성물은 판크레아틴 절단에 대해 내성일 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 기재된 조성물은 이종성 페이로드 및/또는 담체 단백질의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%가 37℃에서 30분 동안 판크레아틴과 함께 조성물을 배양한 후 온전하도록, 판크레아틴 절단에 대해 내성일 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 기재된 조성물은 이종성 페이로드 및/또는 담체 단백질의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%가 37℃에서 60분 동안 판크레아틴과 함께 조성물을 배양한 후 온전하도록, 판크레아틴 절단에 대해 내성일 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 기재된 조성물은 이종성 페이로드 및/또는 담체 단백질의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%가 37℃에서 120분 동안 판크레아틴과 함께 조성물을 배양한 후 온전하도록, 판크레아틴 절단에 대해 내성일 수 있다. 일부 경우에, 치료용 단백질의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 판크레아틴 분석에서 0.5시간, 1시간, 또는 2시간에 온전하며; 여기서 판크레아틴 분석은 37℃에서 100 μL PBS에서 100 μg의 치료용 단백질을 포함하는 조성물과 10 μg의 판크레아틴을 배양하는 단계를 포함한다.
경구용 약학 조성물은 약학 조성물의 제조를 위해 당해 기술분야에 알려진 임의의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 이러한 제형은 약학적으로 우아하고 맛이 좋은 제제를 제공하기 위하여 감미제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 제제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 경구 전달가능한 정제를 제조하기 위해, 약학 조성물을 적어도 하나의 약학적 부형제와 혼합하고, 고체 제형을 압축하여 위장관으로 전달하기 위해 알려진 방법에 따라 정제를 형성한다. 정제 조성물은 일반적으로 첨가제, 예를 들어 당류(saccharide) 또는 셀룰로오스 담체, 전분 풀(starch paste) 또는 메틸 셀룰로오스와 같은 결합제, 충전제, 붕해제, 또는 의료 제제의 제조에 통상적으로 사용되는 기타 첨가제로 제형화된다. 경구 전달가능한 캡슐을 제조하기 위해, DHEA를 적어도 하나의 약학적 부형제와 혼합하고, 고체 제형을 위장관으로 전달하기에 적합한 캡슐 용기에 넣는다. 담체, 페이로드, 또는 융합 분자를 포함하는 제형은 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton Pa. 18042) at Chapter 89]에 일반적으로 기재된 바와 같이 제조될 수 있으며, 참조로 본 명세서에 포함된다.
다양한 실시예에서, 약학 조성물은 정제의 제조에 적합한 비-독성 약학적으로 허용가능한 부형제와의 혼합물에서 미세입자 약학 조성물을 함유하는 경구 전달가능한 정제로 제형화된다. 이들 부형제는 불활성 희석제, 예를 들어 칼슘 카보네이트, 소듐 카보네이트, 락토오스, 칼슘 포스페이트 또는 소듐 포스페이트; 과립화제 및 붕해제, 예를 들어, 옥수수 전분, 젤라틴 또는 아카시아, 및 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 또는 탈크일 수 있다. 정제는 코팅되지 않을 수 있거나 또는 위장관에서의 붕해 및 흡수를 지연시켜 장기간에 걸쳐 지속 작용(sustained action)을 제공하는 알려진 기법으로 코팅될 수 있다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질을 단독으로 또는 왁스와 함께 사용할 수 있다.
다양한 실시예에서, 약학 조성물은 담체, 페이로드, 또는 융합 분자가 불활성 고체 희석제, 예를 들어, 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 또는 카올린과 혼합한 경질 젤라틴 캡슐로, 또는 담체, 페이로드, 또는 융합 분자가 수성 또는 유성 매질, 예를 들어, 아라키스유(arachis oil), 낙화생유(peanut oil), 유동 파라핀 (liquid paraffin) 또는 올리브유와 혼합한 연질 젤라틴 캡슐로 제형화된다.
다양한 실시예에서, 수성 현탁액은 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와의 혼합물에서 미세입자 약학 조성물을 함유할 수 있다. 이러한 부형제는 현탁화제, 예를 들어, 소듐 카복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 소듐 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검이며; 분산제 또는 습윤제는 자연적으로 발생하는 포스파티드(phosphatide), 예를 들어, 레시틴, 또는 지방산과 알킬렌 옥사이드의 축합체(condensation products), 예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 장쇄 지방족 알콜과 에틸렌 옥사이드의 축합체, 예를 들어, 헵타데실에틸옥시세타놀(heptadecylethyloxycetanol), 또는 지방산으로부터 유도된 부분 에스터 및 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트와 같은 헥시톨과 에틸렌 옥사이드의 축합체, 또는 지방산으로부터 유도된 부분 에스터 및 헥시톨 무수물(hexitol anhydrides)과 에틸렌 옥사이드의 축합체, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다. 수성 현탁액은 하나 이상의 보존제, 예를 들어, 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미제, 및 하나 이상의 감미제, 예를 들어 수크로오스 또는 사카린을 함유할 수도 있다.
다양한 실시예에서, 유성 현탁액은 식물성유, 예를 들어, 아라키스유, 올리브유, 참기름 또는 코코넛유, 또는 유동 파라핀과 같은 광유(mineral oil)에 미세입자 약학 조성물을 현탁시켜 제형화될 수 있다. 유성 현탁액은 증점제, 예를 들어, 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜을 함유할 수 있다. 상기에 제시된 바와 같은 감미제, 및 향미제를 첨가하여 맛이 좋은 경구 제제를 제공할 수 있다. 이러한 제형은 아스코르브산과 같은 항산화제의 첨가에 의해 보존될 수 있다.
다양한 실시예에서, 약학 조성물은 수중유(oil-in-water) 에멀젼의 형태일 수 있다. 유상은 식물성유, 예를 들어, 올리브유 또는 아라키스유, 또는 광유, 예를 들어 아카시아 검 또는 트라가칸트 검, 자연적으로-발생하는 포스파티드, 예를 들어 대두 레시틴, 및 에스터 또는 지방산으로부터 유도된 부분 에스터 및 헥시톨 무수물, 예를 들어 소르비탄 모노올레에이트, 및 에틸렌 옥사이드와 동일한 부분 에스터의 축합체, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다. 에멀젼은 감미제 및 향미제를 함유할 수도 있다.
하나 이상의 페이로드를 층별(layer-by-layer) 방법으로 방출하여 위장관을 따라 움직이는 동안 미리-결정된 시간 프레임 동안 하나 이상의 페이로드를 방출하는 캡슐화된 또는 코팅된 정제를 사용할 수 있다. 또한, 하나 이상의 페이로드를 포함하는 정제는 더 큰 정제 내에 배치될 수 있으며, 이에 의해 환경 및 처리 조건, 예를 들어 온도, 화학 물질 (예를 들어, 용매), pH, 및 수분으로부터 내부 정제를 보호할 수 있다. 또한, 외부 정제 및 코팅은 위 환경(gastric environment)에서 하나 이상의 페이로드를 보호하는 역할을 한다. 일부 경우에, 캡슐화된 입자는 더 큰 정제 또는 캡슐이 제 1 환경에서 용해되며 캡슐화된 입자가 제 2 환경에서 용해되도록 캡슐화된 더 큰 정제 또는 캡슐 내에 배치될 수 있다. 일부 경우에, 캡슐화된 입자는 제 1 조건 하에서 페이로드를 방출하나, 제 2 조건 하에서는 그렇지 않다. 예를 들어, 캡슐화된 입자는 높은 pH에서 페이로드를 방출할 수 있으나, 낮은 pH에서는 그렇지 않다. 일부 경우에, 캡슐화된 입자는 장용성 코팅을 가진다.
표면활성제 또는 계면활성제는 점막 또는 라이닝(lining)을 통해 폴리펩티드의 흡수를 촉진한다. 유용한 표면활성제 또는 계면활성제는 지방산 및 이의 염, 담즙산염, 인지질, 또는 알킬 당류(alkyl saccharide)를 포함한다. 지방산 및 이의 염의 예는 카프릴레이트 (C8), 카프레이트 (C10), 라우레이트 (C12) 및 미리스테이트 (C14)의 나트륨, 칼륨 및 리신 염을 포함한다. 담즙산염의 예는 콜산(cholic acid), 케노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid), 글리코콜산(glycocholic acid), 타우로콜산(taurocholic acid), 글리코케노데옥시콜산(glycochenodeoxycholic acid), 타우로케노데옥시콜산(taurochenodeoxycholic acid), 데옥시콜산(deoxycholic acid), 글리코데옥시콜산(glycodeoxycholic acid), 타우로데옥시콜산(taurodeoxycholic acid), 리토콜산(lithocholic acid), 및 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid)을 포함한다. 인지질의 예는 단일-쇄 인지질, 예를 들어 리소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine), 리소포스파티딜글리세롤(lysophosphatidylglycerol), 리소포스파티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine), 리소포스파티딜이노시톨(lysophosphatidylinositol) 및 리소포스파티딜세린(lysophosphatidylserine); 또는 이중-쇄 인지질, 예를 들어 디아실포스파티딜콜린 (diacylphosphatidylcholines), 디아실포스파티딜글리세롤 (diacylphosphatidylglycerols), 디아실포스파티딜에탄올아민 (diacylphosphatidylethanolamines), 디아실포스파티딜이노시톨 (diacylphosphatidylinositols) 및 디아실포스파티딜세린 (diacylphosphatidylserines)을 포함한다. 알킬 당류의 예는 알킬 글루코시드 (alkyl glucosides) 또는 알킬 말토시드(alkyl maltosides), 예를 들어 데실 글루코시드 및 도데실 말토시드를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물을 경구 투여하는 방법에 관한 것이다. 미세입자 약학 조성물의 경구 투여는 소화 점막, 예를 들어, 장 점막의 편광 상피 세포를 통해 담체, 페이로드, 또는 융합 분자를 흡수한 다음, (일부 경우에) 점막의 기저측면에서 융합 분자의 절단 및 하나 이상의 페이로드의 방출을 야기할 수 있다. 그 다음, 하나 이상의 페이로드는 간문맥을 통해 간으로 직접 수송될 수 있다. 따라서, 하나 이상의 페이로드가 간에서 생물학적 활성을 발휘할 때, 예를 들어, 이의 동족(cognate) 수용체에 하나 이상의 페이로드를 결합시켜 매개되는 활성을 발휘할 때, 하나 이상의 페이로드는 피험자에서 관찰되는 혈장 농도를 기준으로 하여 예상되는 것 이상의 효과를 발휘한다고 생각된다, 즉, 담체, 페이로드, 또는 융합 분자의 경구 투여는 피험자의 혈장에서 관찰되는 것보다 더 높은 유효 농도의 전달된 하나 이상의 페이로드를 피험자의 간으로 전달할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물을 경구 투여하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 환자 또는 간병인에 의해 제형을 경구 투여하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 투여 단계는 담체, 페이로드, 또는 융합 분자, 질환 또는 환자 상태 또는 개별 환자에 따라 1일 1회 또는 2회와 같은 간격 투여를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 방법은 개별 담체, 페이로드, 또는 융합 분자의 다양한 투여량의 투여를 포함한다. 예를 들어, 약학 조성물의 초기 투여량은 혈당 수준의 감소와 같은 원하는 효과를 유도하기 위해 더 높은 수준일 수 있다. 그 다음, 일단 원하는 효과가 달성되면, 이후의 투여량을 줄일 수 있다. 이러한 투여 프로토콜에 대한 변화 또는 변형은 주치의(attending physician) 또는 의료 종사자(health care worker)에 의해 수행될 수 있다.
이러한 약학 조성물은 적당한 용량으로 피험자에게 투여될 수 있다. 용량 용법은 특정 임상 인자에 기초하여 주치의에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 환자의 체격, 체표면적, 연령, 성별, 및 일반 건강뿐만 아니라, 투여될 특정 화합물, 투여 시간 및 투여 경로, 및 동시에 투여되는 기타 약물을 포함하여, 많은 인자에 의존한다. 주어진 상황에 대한 치료적 유효량은 일상적인 실험에 의해 쉽게 결정될 것이며, 일반 임상의 또는 의사의 기술 및 판단 내에 있다. 통상의 기술자는 개인에게 투여되는 약학 조성물의 유효량이 특히 생물학적 활성 페이로드의 특성에 의존할 것임을 알고 있다. 변화를 관찰하는데 필요한 치료 기간 및 반응이 일어나기 위한 치료 후 간격은 원하는 효과에 따라 다르다. 특정 양은 통상의 기술자에게 잘 알려진 통상적인 시험에 의해 결정될 수 있다.
하나 이상의 페이로드의 양은 특정 활성제의 목적을 달성하는데 효과적인 양이다. 조성물의 양은 일반적으로 약리학적, 생물학적, 치료적, 또는 화학적 유효량이다. 그러나, 상기 양은 조성물이 캡슐, 정제 또는 액체와 같은 단위 제형에 사용될 때 약리학적, 생물학적, 치료적, 또는 화학적 유효량 미만일 수 있으며, 이는 단위 제형이 다수의 담체/생물학적 또는 화학적 활성제 제형을 함유할 수 있거나 또는 나누어진 약리학적, 생물학적, 치료적, 또는 화학적 유효량을 함유할 수 있기 때문이다. 그 다음, 총 유효량은 생물학적 활성 페이로드의 총 약리학적, 생물학적, 치료적 또는 화학적 활성 양을 함유하는 누적 단위로 투여될 수 있다.
일부 경우에, 10μg의 엑세나티드를 포함하는 본 발명의 조성물의 장 투여는 약 15 ng/mL 이상, 또는 약 30 ng/mL 이상의 최대 혈장 농도를 야기할 수 있다. 일부 경우에, 10μg의 엑세나티드를 포함하는 본 발명의 조성물의 장 투여는 약 17.3 ng/mL, 또는 약 35.7 ng/mL의 최대 혈장 농도를 야기할 수 있다. 일부 경우에, 10μg의 엑세나티드를 포함하는 본 발명의 조성물의 장 투여는 약 60분, 또는 약 45분의 최대 혈장 농도에 이르는 시간을 야기할 수 있다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학 기술 용어는 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥에 의해 별도로 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이며 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 이들의 기법은 당해 기술분야에서 상용되고 잘 알려진 것들이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약"은 그 용어가 나타내는 숫자의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 또는 10%를 더하거나 또는 빼는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 아미노산 서열의 문맥에서, 용어 "퍼센트 (%) 서열 동일성" 및 이와 관련된 용어는, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 필요한 경우 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후 선택된 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율이며, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않는다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당해 기술분야의 기술 내에 있는 다양한 방식, 예를 들어, Clustal Omega, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공공용(publicly available) 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전장(full-length)에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적당한 매개변수를 결정할 수 있다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 컬러 도면(들)이 있는 이 특허 또는 특허 출원 간행물의 사본은 요청 및 필요한 비용 지불시 특허청에 의해 제공될 것이다. 본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 제시되어 있다. 본 발명의 특징 및 이점에 대한 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 실시예를 제시하는 하기의 상세한 설명, 및 첨부 도면을 참조하여 얻어질 것이다:
도 1a는 낮은 이온 강도 완충제 (0.05 M)에 현탁된, 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된, 자기-조립 융합 분자-프로타민 미세입자를 나타내는 디지털 영상이다. 도 1b는 높은 이온 강도 완충제 (> 1 M)에 현탁된, 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된, 자기-조립 융합 분자-프로타민 미세입자를 나타내는 디지털 영상이다. 도 1c는 낮은 이온 강도 완충제 (0.05 M)로 돌아온 도 1b의 미세입자를 나타내는 디지털 영상이다. 고출력 (10X) 명시야(bright field) 모드에서 GE Cytel 시스템을 이용하여 입자를 영상화하였다.
도 2a는 명시야 모드에서, 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조된, 자기-조립 인슐린-프로타민 미세입자를 나타내는 디지털 영상이다. 도 2b는 청색시야(blue field) 모드에서 FITC 형광을 나타내는, 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조된, 자기-조립 인슐린-프로타민 미세입자를 나타내는 디지털 영상이다. 도 2c는 도 2a 및 2b에 나타낸 명시야 및 청색시야 영상의 병합된 영상을 나타내는 디지털 영상이다. 병합된 영상은 인슐린 미세입자의 FITC 형광을 나타낸다. 고출력 (10X) 명시야 또는 청색시야 모드에서 GE Cytel 시스템을 이용하여 입자를 영상화하였다. 381 nm에서 시료를 여기시키고 435 nm에서 형광 방출을 기록함으로써 FITC-형광을 영상화하였다. 청색 화살표는 약 150 μM 입자를 나타낸다.
도 3a는 적색시야 모드에서, 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된, 자기-조립 융합 분자-프로타민-아연 미세입자를 나타내는 디지털 영상이다.
도 3b는 명시야 모드에서 동일한 융합 분자-프로타민-아연 미세입자의 디지털 영상이다. 고출력 (10X) 명시야 또는 적색시야 모드에서 GE Cytel 시스템을 이용하여 입자를 영상화하였다. 481 nm에서 시료를 여기시키고 535 nm에서 형광 방출을 기록함으로써 적색-형광을 영상화하였다.
도 4a는 명시야 모드에서, 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된, 자기-조립 융합 분자-프로타민 (아연 없이) 미세입자를 나타내는 디지털 영상이다. 도 4b는 적색시야 모드에서 동일한 입자의 디지털 영상이다. 고출력 (10X) 명시야 또는 적색시야 모드에서 GE Cytel 시스템을 이용하여 입자를 영상화하였다. 481 nm에서 시료를 여기시키고 535 nm에서 형광 방출을 기록함으로써 적색-형광을 영상화하였다.
도 5a는 pH 2 및 pH 7에서, 및 pH 2 - pH 7에서 pH의 상승 시 제형 37-156에 대한 용해 프로파일을 나타낸다.
도 5b는 pH 2 및 pH 7에서, 및 pH 2 - pH 7에서 pH의 상승 시 제형 37-167에 대한 용해 프로파일을 나타낸다.
도 5c는 pH 2 및 pH 7에서, 및 pH 2 - pH 7에서 pH의 상승 시 제형화된 나노입자에 대한 용해 프로파일을 나타낸다.
도 6은 판크레아틴에 대한 상이한 나노입자 제형의 노출 시 인슐린 안정성을 나타낸다.
도 7a는 37-49 hGH/서열번호: 3/유드라짓 FS 입자의 관내(intraluminal) 주사 후 15분에 랫트 소장의 절편을 나타낸다. hGH는 녹색으로 표시되며, 서열번호: 3은 적색으로 표시된다. 도 7b는 37-49 hGH/서열번호: 3/유드라짓 FS 입자의 관내 주사 후 30분에 랫트 소장의 절편을 나타낸다. hGH는 녹색으로 표시되며, 서열번호: 3은 적색으로 표시된다.
도 7c는 37-49 hGH/서열번호: 3/유드라짓 FS 입자의 관내 주사 후 45분에 랫트 소장의 절편을 나타낸다. hGH는 녹색으로 표시되며, 서열번호: 3은 적색으로 표시된다.
도 7d는 37-49 hGH/서열번호: 3/유드라짓 FS 입자의 관내 주사 후 60분에 랫트 소장의 절편을 나타낸다. hGH는 녹색으로 표시되며, 서열번호: 3은 적색으로 표시된다.
도 8은 경구 위관영양법(oral gavage)에 의해 hGH 함유 입자를 투여받은 랫트에서 hGH의 혈청 수준을 나타낸다.
도 9는 상이한 제형으로 전달될 때 Caco-2 세포를 통해 수송된 hGH의 수준을 나타낸다.
도 10a는 표시된 시점의 pH 5, pH 7, pH 7.5 및 pH 10에서 표 3의 5개 입자로부터, 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC)에 의해 분석된, 엑세나티드의 in vitro 방출을 나타낸다.
도 10b는 표시된 시점의 pH 5, pH 7, pH 7.5 및 pH 10에서 표 3의 5개 추가 입자로부터, RPLC에 의해 분석된, 엑세나티드의 in vitro 방출을 나타낸다.
도 10c는 표시된 시점의 pH 5, pH 7, pH 7.5 및 pH 10에서 표 3의 5개 입자로부터, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 분석된, 엑세나티드의 in vitro 방출을 나타낸다.
도 10d는 표시된 시점의 pH 5, pH 7, pH 7.5 및 pH 10에서 표 3의 5개 추가 입자로부터, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 분석된, 엑세나티드의 in vitro 방출을 나타낸다.
도 11a-c는 본 명세서에 기재된 상이한 제형에서 서열번호: 3 및/또는 엑세나티드의 판크레아틴 안정성을 나타낸다. 도 11a는 아연-함유 제형에서 서열번호: 3 및/또는 엑세나티드의 판크레아틴 안정성을 나타내며, 도 11b는 프로타민-함유 제형에서 서열번호: 3 및/또는 엑세나티드의 판크레아틴 안정성을 나타내고, 도 11c는 아연 및 엑세나티드의 제형에서 엑세나티드의 판크레아틴 안정성을 나타낸다.
도 12a는 시각화된 FITC-엑세나티드와 함께, 서열번호: 3, FITC-엑세나티드 및 아연의 제형의 공초점 현미경 영상을 나타낸다.
도 12b는 Alexa 647 표지된 항 서열번호: 3 항체에 의해 시각화된 서열번호: 3과 함께, 서열번호: 3, FITC-엑세나티드 및 아연의 제형의 공초점 현미경 영상을 나타낸다.
도 12c는 도 12a 및 도 12b의 병합된 영상을 나타낸다.
도 13은 도 12a-c의 제형의 입자 크기 분포를 나타낸다.
도 14는 SMI-100 세포를 통한 본 명세서에 기재된 제형의 수송을 나타낸다.
도 15는 콜릭스 담체, 아연 및 엑세나티드를 포함하는 내산성(acid resistant) 입자의 제조 방법의 개략적인 예를 나타낸다.
도 16은 in vitro 또는 in vivo 방법을 이용하여 상이한 점액 및 상피층을 통한 미세입자의 통과를 검출할 수 있는 방법을 나타낸다.
도 17a는 본 명세서에 기재된 상이한 제형에서 서열번호: 3 및/또는 엑세나티드의 판크레아틴 안정성을 나타낸다.
도 17b는 본 명세서에 기재된 상이한 제형에서 서열번호: 3 및/또는 FITC-엑세나티드의 판크레아틴 안정성을 나타낸다.
도 18은 6.8분의 머무름 시간(retention time)에서 서열번호: 3 및 7.5분에서 엑세나티드의 존재를 나타내는 역상 크로마토그램 (RPLC)을 나타낸다.
도 19는 37℃에서 표시된 시점의 pH 1, pH 5, 및 pH 7에서 제형 E0, E14, E18, E0-FITC, E14-FITC, 및 E18-FITC로부터 RPLC에 의해 분석된, 엑세나티드의 in vitro 방출을 나타낸다.
도 20은 제형 E0, E14 및 E18을 관내 투여한 랫트에서 엑세나티드의 혈청 농도를 나타낸다.
도 21은 엑세나티드를 정맥내 투여한 랫트에서 엑세나티드의 혈청 농도를 나타낸다.
도 22는 쿠마씨 블루(Coomassie Blue)-염색된 SDS-PAGE 겔에서 실행된 서열번호: 70-엑세나티드 (엑세나티드에 가교결합된 서열번호: 70)의 순도를 나타낸다.
도 23은 스프라그 돌리 랫트의 공장(jejunum)을 가로질러 서열번호: 80 또는 서열번호: 70의 담체에 가교결합된 엑세나티드의 in vivo 통과세포외배출을 나타낸다. 장 조직을 가로질러 수송된 엑세나티드의 양 (pM)은 처리 후 10분 및 40분에 측정되었다. 자료는 서열번호: 80-엑세나티드 및 서열번호: 70-엑세나티드 둘 다 10분 및 40분에 엑세나티드 단독보다 더 높은 속도로 수송할 수 있음을 나타낸다.
도 24는 글루코오스 공격(challenge) 후 혈당의 시간-농도 프로파일을 나타낸다. 경구 위관영양법으로 투여된 서열번호: 70-엑세나티드의 효과를 음성-대조군 (경구 완충제) 및 양성 대조군으로 복강내 주사로 투여된 엑세나티드와 비교하였다. 이러한 결과는 서열번호: 70-엑세나티드가 글루코오스 공격 후 혈당 수준의 상승을 감소시킨다는 것을 나타낸다.
도 25는 서열번호: 11이 GLP-1 수용체에 결합할 수 있음을 나타낸다.
실시예
실시예 1
이 실시예는 생물학적 활성 페이로드의 경구 전달용 알약 또는 정제의 약물 물질로 사용하기 위한, 비-자연적으로 발생하는 융합 분자를 함유하는 안정한, 자기-조립 미세입자의 제조를 기재한다. 구체적으로, 하기에 기재된 프로타민-아연 코아세르베이트 시스템을 이용하여, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 인간 성장 호르몬 ("hGH") 분자에 결합된 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 콜릭스 담체 분자를 포함하는 비-자연적으로 발생하는 융합 분자를 제조하였다.
서열번호: 2 분자 및 hGH 분자를 포함하는 예시적인 융합 분자 발현 벡터를 하기와 같이 구축하였다: 먼저, 폴리펩티드 유전자를 PCR에 의해 증폭시키고, PCR 산물의 양 끝에서 NdeI 및 EcoRI, PstI 및 PstI, AgeI 및 EcoRI, 또는 PstI 및 EcoRI 부위의 제한 효소 쌍을 포함한다. 제한 효소 분해 후, PCR 산물을 세포 발현을 위한 적당한 플라스미드에 클로닝시키고, 이를 상응하는 제한 효소 쌍으로 분해하였다. 결과로 생성된 구조체는 서열번호: 2 및 hGH를 인코딩하며, 또한 폴리펩티드의 N-말단에서 6-His 모티프로 태깅하여 정제를 용이하게 한다. 제한 효소 분해 및 DNA 시퀀싱으로 최종 플라스미드를 확인하였다.
융합 분자는 하기와 같이 발현되었다: E. coli BL21(DE3) pLysS 컴피턴트 세포(competent cells) (Novagen, Madison, Wis.)는 적당한 플라스미드의 존재 하에 표준 열-충격 방법을 이용하여 형질전환시켜 암피실린-함유 배지에서 선택된 융합 분자 발현 세포를 생성하였으며, 항생제와 함께 루리아-베르타니 배양액(Luria-Bertani broth) (Difco; Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.)에서 분리 및 성장시킨 다음, OD 0.6에서 1 mM 이소프로필-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. IPTG 유도 후 2시간에, 세포를 10분 동안 5,000 rpm에서 원심분리하여 수확하였다. 세포 용해 후에 봉입체를 분리하고, 단백질을 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 2 mM EDTA, 6 M 구아니딘 HCl, 및 65 mM 디티오트레이톨을 함유하는 완충제에 가용화시켰다. 가용화된 융합 분자를 0.1 M Tris, pH=7.4, 500 mM L-아르기닌, 0.9 mM GSSG, 2 mM EDTA의 존재 하에 재접힘시켰다. 재접힌 단백질을 Q 세파로오스 이온 교환 및 Superdex 200 겔 여과 크로마토그래피 (Amersham Biosciences, Inc., Sweden)로 정제하였다. 단백질의 순도는 SDS-PAGE 및 분석 HPLC (Agilent, Inc. Palo Alto, Calif.)로 평가하였다. 결과로 생성된 융합 분자를 1 mg/mL의 농도로 제조하고 -80℃에서 PBS에 저장하였다.
프로타민-기반 미세입자의 생성은 하기와 같이 수행되었다: (a) 서열번호: 2 및 서열번호: 5를 포함하는 융합 분자를 1.5 mL 마이크로퓨지 튜브에서 0.1N HCl에 첨가하여 융합 분자의 최종 농도가 1 mg/mL가 되도록 한 다음, 0.02 mL ZnCl2 (H20 내 10 mg/mL)를 융합 분자 용액에 첨가하였다; (b) 2.0 mL 프로타민 설페이트 (0.6 mg/mL)를 2.0 mL 0.1M NaPO4에 첨가하였다; (c) 단계 (a)의 혼합물을 단계 (b)의 혼합물과 합하고, 합한 혼합물을 실온에서 밤새도록 방치하였다. 투명에서 뿌연으로의 전이로 입증된 바와 같이, (a) 및 (b)의 혼합 즉시 침전물이 형성되었다.
다음날 아침, 고출력 (10X) 명시야 모드에서 GE Cytel 시스템을 이용하여 입자를 영상화하였다. 입자는 크기가 약 50 μM이었으며, 시약의 혼합 후 실온에서 자발적으로 형성되었다 (도 1a 참조). 이러한 입자는 5M NaCl을 한 방울씩 첨가하여 용액의 이온 강도를 증가시키면 약 5 μM의 더 작은 단위로 분열될 수 있다 (도 1b 참조). 응집체는 Milli-Q 제조된 물을 한 방울씩 첨가하여 이온 강도를 감소시켜 다시 결합할 수 있다 (도 1c 참조).
이러한 자료는 프로타민-아연 코아세르베이트 시스템을 사용하여 담체-유래 융합 분자를 함유하는 안정한, 자기-조립 미세입자를 제조할 수 있으며, 시스템이 완충제의 이온 강도에 따라 상이한 종류의 입자로 조립될 것이고, 결합 및 해리 과정이 이러한 특정 분자 조립에 대해 가역적임을 나타낸다. 이 "조정가능한 (tunable)" 시스템을 이용하여 제조된 자기-조립 미세입자는 생물학적 활성 페이로드의 경구 전달용 알약 또는 정제의 제조를 위한 약물 물질로 사용될 수 있다.
실시예 2
실시예 1의 방법을 이용하여, 안정한 인슐린-함유 미세입자 및 인슐린-FITC-함유 미세입자를 제조하고 하기에 기재된 바와 같이 평가하였다.
하나의 제제에서, 인슐린 및 인슐린-FITC를 1.5 mL 마이크로퓨지 튜브에서 1.0 mL 0.1N HCl에 2:1 비로 첨가하여 최종 농도가 5 mg/mL가 되도록 한 다음, 0.02 mL ZnCl2 (H20 내 10 mg/mL)를 인슐린 용액에 첨가하였다. 2.0 mL 프로타민 설페이트 (0.6 mg/mL)를 2.0 mL 0.1M NaPO4에 첨가하였다. 제 2 제제에서, 인슐린-FITC를 1.5 mL 마이크로퓨지 튜브에서 1.0 mL 0.1N HCl에 2:1 비로 첨가하여 최종 농도가 5 mg/mL가 되도록 한 다음, 0.02 mL ZnCl2 (H20 내 10 mg/mL)를 인슐린 용액에 첨가하였다. 별도의 단계에서, 2.0 mL 프로타민 설페이트 (1 mg/mL)를 2.0 mL 0.1M NaPO4에 첨가하였다. 그 다음, 프로타민 용액을 인슐린을 함유하는 용액 및 인슐린-FITC를 함유하는 용액에 첨가하고, 각각의 합한 혼합물을 실온에서 밤새도록 방치하였다. 투명에서 뿌연으로의 전이로 입증된 바와 같이, 혼합 즉시 침전물이 형성되었다.
다음날 아침, 고출력 (10X) 명시야 모드에서 GE Cytel 시스템을 이용하여 인슐린 및/또는 인슐린-FITC를 함유하는 입자를 영상화하였다. 입자는 크기가 약 50 - 150 μM이었으며, 시약의 혼합 후 실온에서 자발적으로 형성되었다. 도 2a 및 도 2b는 각각 밝은 및 청색 여과기 영상을 나타낸다. 청색 화살표는 약 150 μM 입자를 나타낸다. 도 2c는 미세입자의 병합된 청색시야 및 명시야 영상을 나타낸다. 관찰된 청색 형광은 인슐린-FITC가 입자에 포함되었음을 나타낸다. 이러한 미세입자로부터의 형광 방출의 특성은 단백질-기반 조성물과 일치한다.
실시예 3
이 실시예에서, 하기에 기재된 프로타민-아연 코아세르베이트 시스템을 이용하여, 적색 형광 단백질 ("RFP") 분자에 결합된 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 콜릭스 담체 분자를 포함하는 비-자연적으로 발생하는 융합 분자를 제조하고 평가하였다.
적색 형광 단백질 ("RFP")에 결합된 서열번호: 6을 포함하는 융합 분자를 하기와 같이 제조하였다: 서열번호: 6을 인코딩하는 플라스미드 구조체를 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조하였다. 적당한 플라스미드로 열-충격 (42℃에서 1분)에 의한 형질전환 후 E. coli DH5α 세포 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 단백질 발현을 달성하였으며, 항생제-함유 배지에서 선택된 형질전환된 세포를 분리하고 루리아-베르타니 배양액 (Difco)에서 성장시켰고; 1 mM 이소프로필-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)의 첨가에 의해 단백질 발현을 유도하였으며; IPTG 유도 후 2시간에, 세포를 4℃에서 10분 동안 5,000 xg에서 원심분리하여 수확하였고; 세포 용해 후에 봉입체를 분리하고, 단백질을 6 M 구아니딘 HCl 및 2 mM EDTA (pH 8.0) + 65 mM 디티오트레이톨에서 가용화시켰으며; 재접힘 및 정제 후, 단백질을 -80℃에서 Ca2+ 및 Mg2+가 결여된 PBS (pH 7.4)에서 ~5 mg/mL로 저장하였다. 이 연구에 사용된 모든 단백질은 크기 배제 크로마토그래피에 기초하여 >90% 순도인 것으로 확인되었다.
그 다음, 서열번호: 6에 제시된 단백질을 단백질의 C-말단 근처에 위치한 유리 설프히드릴 잔기를 통한 직접적인 화학 결합을 허용하도록 이의 C-말단에서 변형하였다. C-말단 변형은 담배 에칭 바이러스 (TEV)의 고도의 선택적인 프로테아제에 대한 공통 절단 서열을 숨겨주는 시스테인-구속 루프, 제 2 시스테인, 및 헥사-히스티딘 (His6) 태그를 포함한다. 제 2 Cys은 궁극적으로 결합에 사용되는 Cys와 함께 이황화 다리를 형성하기 위해 포함된다. 단백질에 His6 서열의 첨가는 정제를 단순화하며, TEV 절단 서열은 약한 환원 후에 말단 Cys 잔기를 선택적으로 제거하는 메커니즘을 제공한다. 서열번호: 6 구조체의 발현 및 분리 후에 0.1 mM 디티오트레이톨을 이용한 TEV 절단 및 약한 환원은, 페이로드 결합의 일반적인 메커니즘으로서 말레이미드-기반 반응을 통해 하나 이상의 페이로드의 직접적인 화학 결합을 허용하였다. TEV 프로테아제 절단, 환원, 및 유리 설프히드릴과의 말레이미드 반응을 통한 RFP 결합 후에, 유리된 C-말단 서열의 제거는 제 2 Ni2+ 컬럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성되었다. 융합 분자는 이하에서 FM001로 언급될 것이다.
프로타민-기반 미세입자의 생성은 하기와 같이 수행되었다: (a) FM001을 1.5 mL 마이크로퓨지 튜브에서 0.1N HCl에 첨가하여 최종 농도가 1 mg/mL FM001이 되도록 한 다음, 0.02 mL ZnCl2 (H20 내 10 mg/mL)를 FM001 용액에 첨가하였다; 제 2 제제에서, ZnCl2는 제외되었다; (b) 2.0 mL 프로타민 설페이트 (0.6 mg/mL)를 2.0 mL 0.1M NaPO4에 첨가하였다; (c) 단계 (a)의 2개의 혼합물을 단계 (b)의 혼합물과 각각 합하고, 합한 혼합물을 실온에서 밤새도록 방치하였다. 투명에서 뿌연으로의 전이로 입증된 바와 같이, (a) 및 (b)의 혼합 즉시 침전물이 형성되었다.
다음날 아침, GE Cytel 시스템을 이용하여 입자의 디지털 영상을 수집하였다. 481 nm에서 시료를 여기시키고 535 nm에서 형광 방출을 기록함으로써 적색 형광을 영상화하였다. 4X 배율에서, 프로타민, 아연, 및 FM001을 함유하는 입자는 약 150 μM에서 크기가 균일하다 (도 3a). 481nm 광으로 여기될 때, 입자는 적색 형광을 방출한다 (도 3b). 관찰된 적색 형광은 FM001이 입자에 포함되었음을 나타낸다. 형광은 분포가 균일하여 FM001이 균일하게 분포되었으며 입자 형성 동안 단백질 구조가 파괴되지 않았음을 나타낸다. 10X 배율에서, 코아세르베이트로부터 아연의 제외는 유사한 크기 (~150μM)를 갖는 입자의 형성을 야기하였으나, 입자는 형태가 더 난형(ovoid)이었다 (도 4a). 이들 입자는 아연을 함유한 입자와 유사한 형광 특성을 가졌으며 (도 4b), 이는 아연이 코아세르베이션 동안 단백질 구조를 유지하는데 필요하지 않으며, 코아세르베이트의 조성물이 입자의 형태를 결정할 수 있음을 나타낸다.
실시예 4
이 실시예에서, 원하는 특성을 갖는 분무 건조된 입자를 제조하기 위해 다양한 조건 및 제형을 시험하였다. 이 실시예에서, 다수의 상이한 입자 제형을 제조하였다. 이러한 입자는 일반적으로 담체, 약물, 고분자 매트릭스, PEG, 계면활성제, 및 아연으로 구성되었다.
hGH/서열번호: 3/유드라짓 FS30D/폴리소르베이트 20/ZnCl2를 포함하는 제형 37-49에 대한 상세한 프로토콜의 예는 하기에 제공된다. 15 μL의 폴리소르베이트를 팔콘(Falcon) 튜브에 첨가한 다음, 7.6 mL의 서열번호: 3 용액 (9.5 mg, 0.27 μmole)을 첨가하였다. 그 다음, hGH 분말 3.0 mg (0.14 μmole)을 별도의 20 mL 유리 섬광 바이알에서 4.0 mL의 탈이온수(DI water)에 용해시켜 투명한 용액을 생성한 다음, 팔콘 튜브에 있는 상기 용액으로 옮겼다. 15 uL의 ZnCl2 저장 용액 (5 mg/ml) (0.075 mg, 0.55 μmole)을 혼합물에 첨가한 다음, 82 mg의 유드라짓 FS 30D 현탁액을 첨가하였다. 현탁액을 로티세리 진탕기(rotisserie shaker)에서 20분 동안 진탕한 다음, 50 mM 암모늄 바이카보네이트 용액으로 총 부피 25 mL로 희석하였다. 용액을 Buchi B-90 나노 분무 건조기에서 분무 건조하기 전에 Pall 실험실에 의해 0.4 um 디스크 여과기를 통해 여과하였다.
하기 조건을 이용하여 분무 건조를 수행하였다: 분무/원자화 (spray/atomization)를 위한 중간 노즐, 주입구 온도 110℃, 배출구 온도 49℃, 기체 유량(gas flow) 130 리터/분, 펌프 속도 12%, 및 분무비(spray ratio) 100%. 분무 건조는 2시간 만에 완료되었다. 생성물을 백색 및 자유-유동성(free-flowing) 분말로 수집하였다. 수율은 약 56 중량% 이었다. 입자 크기는 기계 분광법에 의해 300-600 nm로 추정되었다. 다른 입자도 유사하게 제조하였다.
상이한 제형 조건에 의해 제조된 입자를 먼저 겔 전기영동으로 스크리닝하여 분무 건조 공정 후 단백질 품질을 확인하였다. 이를 위해 입자를 용해하고 방출된 단백질을 웨스턴 블롯으로 분석하여 단백질이 손상되지 않았는지 확인하였다.
그 다음, 생리학적 pH에서 캡슐화 및 방출 효율에 대해 상이한 입자를 스크리닝하였다. 도 5a는 인슐린, 서열번호: 3 및 유드라짓 FS를 포함하는 입자 (37-156)에 대한 용해 분석 결과를 나타낸다. 이 제형은 pH 2에서 낮은 약물 방출 속도 및 pH 7에서 점진적인 약물 방출 속도를 갖는 입자를 제조하였다. pH 2에서 pH 7로 pH의 상승은 이전에 캡슐화된 약물의 제어 방출을 유도하였다. 일부 경우에, 원하는 캡슐화 및 방출 특성을 나타낼 수 있다. 도 5b는 인슐린, 서열번호: 3 및 유드라짓 L30을 포함하는 입자 (37-167)에 대한 용해 결과를 나타낸다. 이 제형은 pH 2 및 pH 7 둘 다에서 약물 방출이 빠른 입자를 제조하였다. 일부 경우에, 이것은 원하는 캡슐화 및 방출 특성이 아닐 수 있다. 도 5c는 hGH 및 유드라짓 FS를 포함하는 추가 입자 제형에 대한 용해 분석 결과를 나타낸다. 이 제형은 pH 2에서 낮은 약물 방출, pH 7에서 점진적인 약물 방출 및 pH 2에서 pH 7로 pH의 상승 시 약물 방출의 조절된 유도를 야기하였다. 이 방출 프로파일은 제형이 예를 들어 경구 위관영양법에 의한 경구 투여에 잠재적으로 적합할 수 있음을 나타낸다.
그 다음, 판크레아틴을 함유한 모의 장액(simulated intestinal fluid)에서 안정성에 대해 제형을 시험하였다. 판크레아틴을 함유한 모의 장액에 상이한 입자를 노출시키고, 1시간 및 14시간 후에 약물 잔여량을 평가하였다. 도 6은 인슐린 표준 용액 및 5개의 상이한 제형에 대한 1시간 및 14시간 후 남은 약물의 백분율을 나타낸다. 도 6의 제형의 상세한 내용은 표 1에 열거되어 있다. 도 6에서 모든 5개의 분무 건조 입자는 판크레아틴으로부터 장기간 약물 보호를 제공하였다. 2개의 상이한 제형인, 37-166 (인슐린/PEG8K/서열번호: 3/유드라짓 FS/Tween-20/ZnCl2) 및 37-224 (인슐린/서열번호: 3/2x 유드라짓 L30/ZnCl2)는, 인슐린 단독으로 볼 때보다 1시간 시점에서 더 높은 인슐린 농도를 야기하였다.
도 6에서 평가된 제형
제형명 분무 건조 제형 약물 함량 (w/w)
인슐린 인슐린 표준 용액 100%
37-166 인슐린/PEG8K/서열번호: 3/Eud FS/Tw20/ZnCl2 1.54%
37-186 인슐린/서열번호: 3/Eud FS/Tw20 1.42%
37-188 인슐린/PEG8K/서열번호: 3/Eud L30/Tw20 3.17%
37-219 인슐린/서열번호: 3/Eud L30/ ZnCl2 6.17%
37-224 인슐린/서열번호: 3/2X Eud L30/ ZnCl2 4.97%
실시예 5
이 실시예에서, 상이한 입자 조성물로부터 약물의 in vivo 흡수를 평가할 것이다. 장내 약물 보유는 약물 흡수와 상관관계가 있으며 입자 조성물에 의해 조절될 것이라는 가설이 있다. 형광-표지된 약물은 상기 기재된 대로 입자로 제형화될 것이다. 입자는 경구 위관영양법에 의한 투여에 적합한 용액에 현탁될 것이다. 일부 경우에, 용액은 물일 수 있다. 경구 위관영양법으로 랫트에게 입자 현탁액을 투여할 것이다. 각각 상이한 형광-표지된 약물 및 제형 조합을 4마리의 랫트에게 투여할 것이다. 추가로 4마리의 랫트에게 입자로 제형화하지 않고 형광 표지된 약물의 동일한 총량을 함유하는 용액을 투여할 것이다. 형광 표지된 약물의 투여 전 및 투여 후 0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 및 24시간에, 각 4마리 중 2마리의 랫트에 대해 전신 영상 스캔을 수행할 것이다. 각 처리군의 나머지 2마리의 랫트를 4시간 및 12시간에 희생시키고, 장을 수집하여 약물 농도를 확인할 것이다.
실시예 6
이 실시예에서, 제형 37-49 (hGH/서열번호: 3/유드라짓 FS)의 입자를 in vivo 모델에 주사하여 in vivo 통과세포외배출을 평가하였다. 제형 37-49 입자를 34 μg/Kg의 용량으로 관내 주사에 의해 랫트에게 투여하였다.
수컷 위스타(Wistar) 랫트를 12/12시간 명/암 주기로 케이지당 3-5마리 수용하였으며, 연구에 배치될 때 225-275 g (약 6-8 주령)이었다. 모든 실험은 연속 이소플루란 마취를 사용한 비-회복 프로토콜을 이용하여 가벼운 단계에서 수행되었다. 4-5 cm 중간선 복부 절개는 중간-공장 영역을 노출시켰다. 3.86×10-5 M의 제형 37-49 입자의 저장 용액을 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 제조하였으며, (250 g 랫트당) 50 μL를 29-게이지 바늘을 이용하여 관내 주사 (ILI)로 투여하였다. 주사 부위 장간막을 영구 마커로 표시하였다. 연구 종료시, 현미경 평가를 위해 표시된 장 분절(segment)을 포집한 3-5 mm 영역을 분리하고 처리하였다.
주사된 동물을 주사 후 다양한 시점에서 희생시켰으며, 장을 적츨하고 절단하였다. 장의 주사된 영역의 절편을 제조하고 면역형광법으로 시각화하였다. 콜릭스 구조체에 대해 나타난 1-5분에 비해, 입자의 흡수는 15분에 시작되는 것으로 나타났다. 도 7a에 나타낸 바와 같이, hGH (녹색) 및 콜릭스 (적색)은 주사 후 15분에 초기에 대부분 공동-국소화 (황색)되며, 더 많은 유리 hGH는 주사 후 각각 30분, 45분, 및 60분에 도 7b-d에 나타낸 바와 같이 나중 시점에서 나타난다.
약물 전달을 더 평가하기 위해, hGH 서열번호: 3 나노입자를 1.93 nmol/Kg의 용량으로 공장내 주사에 의해 3마리의 랫트 (동물 A, B 및 C)에게 전달하였으며, 랫트당 hGH의 약 43 μg/Kg의 용량 및 hGH의 11 μg의 총량을 야기하였다. 주사 후 0, 30, 45, 60, 75, 90, 105 및 120분에 혈청 시료를 수집하였다. 120분 후 동물을 희생시키고, 장 및 간을 수집하였다. 도 8은 동물 A에서 hGH의 혈청 농도를 나타낸다. 혈청 hGH 농도의 급격한 상승이 관찰되었으며, 4 ng/mL 투여 후 약 40분에 최고조에 달하였고, 투여 후 적어도 75분까지 3.5 ng/mL 이상으로 유지되었다. 동물 B 및 C는 혈청에서 검출가능한 수준의 hGH가 없었다. hGH는 동물 A의 혈청 및 장에서, 동물 B의 장에서 검출되었지만, 혈청에서는 검출되지 않았다. hGH는 동물 C의 혈청 또는 장에서 검출되지 않았으며, 120분 시점에서 동물의 간에서도 검출되지 않았다.
실시예 7
이 실시예에서, hGH 함유 입자를 Caco-2 세포에 적용하여 세포를 통한 수송을 평가하였다. Caco-2 세포는 약물 및 기타 화합물의 인간 장 흡수 모델로 사용될 수 있는 인간 결장 상피암 세포주이다. 단층으로 배양될 때 Caco-2 세포는 분화되며, 단층으로 배양될 때 세포 사이에 융합막(tight junctions)을 형성한다. 이 단층은 화합물의 세포주위(paracellular) 이동에 대한 모델로 사용될 수 있다. Caco-2 세포는 다양한 세포간 경로를 모델링하기 위해 수송체 단백질, 유출 단백질 (efflux proteins), 및 II 상 접합 효소를 발현한다. 일부 경우에, Caco-2 세포 단층은 인간 장 상피의 모방체로 사용될 수 있다.
Caco-2 세포를 트랜스웰에 1.5x105 cells/mL로 씨딩하였다. 배양 배지를 정점 (0.5 mL) 및 기저측 (1.5 mL) 챔버 둘 다에서 2일마다 교환하였다. 세포를 21일 동안 성장시킨 후 실험을 수행하였으며, 경-상피 전기 저항(trans-epithelial electric resistance, TEER)에 의해 평가된 바와 같이 기능적으로 단단한 단층을 형성하였다. 21일째에, 트랜스웰을 PBS로 1회 세척하였다. hGH 입자를 함유하는 현탁액 100 uL를 정점 챔버에 첨가하였다. 기저 챔버에 0.5 mL의 PBS를 첨가하였다. 37℃에서 2시간 후, 기저측 챔버의 용액을 수집하고 농축하였다. 웨스턴 블롯팅을 이용하여, 조직을 가로질러 수송된 hGH를 평가하였다. 4-12% NuPAGE 겔 (BioRad, cat. # 5678095)에서 1D 겔 전기영동으로 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 막 (BioRad, cat. # 1704157)으로 옮기고, 염소 항-hGH 다클론 항체 (1:1000, R&D AF1067)와 함께 배양한 다음, AP-접합된 이차 토끼 항-염소 항체 (1:10000, Abcam ab6742)와 함께 배양하였다. AP 웨스턴 블롯팅 기질 (Promega S3841)을 이용하여 단백질 밴드를 시각화하였다.
도 9에 나타낸 입자 조성물
제형 번호 분무 건조 제형 약물 함량 (w/w)
37-49 hGH/유드라짓 FS/서열번호: 3/Tween20/ZnCl2 0.34%
37-155 *hGH/유드라짓 FS/서열번호: 3/Tween20/ZnCl2 0.38%
37-168 37-49 Batch 2 0.30%
37-233 hGH/유드라짓 FS/서열번호: 3/Tween20/ZnCl2 1.77%
실시예 8
이 실시예에서, 표 3 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 서열번호: 3, 양이온 및 엑세나티드를 혼합하여 여러 상이한 마이크로입자를 제조하였다. 이렇게 제조된 입자를 HPLC로 분석하여 미세입자 내 각 성분의 실제 양을 결정하였다.
입자 제조용 성분, 및 입자 분석
제형
코드 		서열번호: 3 (mg) 엑세나티드 (mg) 양이온
(mg) 		% 서열번호: 3의 함량 % 엑세나티드의 함량 서열번호: 3 (몰비) 엑세나티드
(몰비)		 양이온
(몰비)
1 019-08-E1 5 5 아연1 65.1 4.5 1 7.16 32.68
2 019-08-E2 5 5 아연2 68.9 5.4 1 7.16 65.36
3 019-08-E3 5 5 아연5 59.0 11.3 1 7.16 163.39
4 019-08-E4 5 5 아연10 72.2 0.0 1 7.16 326.79
5 019-08-E5 5 5 아연20 57.5 3.4 1 7.16 653.57
6 019-08-E6 2.5 2.5 프로타민0.2 19.7 2.1 1 7.16 0.04
7 019-08-E7 2.5 2.5 프로타민0.4 7.3 2.8 1 7.16 0.09
8 019-08-E8 2.5 2.5 프로타민0.8 23.5 5.2 1 7.16 0.18
9 019-08-E9 2.5 2.5 프로타민2 17.1 3.1 1 7.16 0.45
10 019-08-E10 2.5 2.5 프로타민4 4.9 1.0 1 7.16 0.89
입자 제조용 성분, 및 입자 분석
제형
코드 		서열번호: 3의 양 (mg) 엑세나티드의 양 (mg) Zn/Pro의 양 (mg) 서열번호: 3의 % 엑세나티드의 % 서열번호: 3 (몰비) 엑세나티드
(몰비) 		Zn / 프로타민 (몰비)
11 019-08-E11 0.058 5 아연10 0.42 13.58 1 617.06 28171.33
12 019-08-E12 0.116 5 아연10 0.61 12.75 1 308.53 14085.67
13 019-08-E13 0.29 5 아연10 1.42 14.25 1 123.41 5634.27
14 019-08-E14 0.58 5 아연10 19.08 27.83 1 61.71 2817.13
15 019-08-E15 1.16 5 아연10 11.67 12.25 1 30.85 1408.57
16 019-08-E16 0.058 5 프로타민10 20.75 14.11 1 617.05 1.12
17 019-08-E17 0.116 5 프로타민10 0.43 12.00 1 14.32 1.12
18 019-08-E18 0.29 5 프로타민10 3.25 19.75 1 14.32 1.12
19 019-08-E19 0.58 5 프로타민10 0.90 11.17 1 14.32 1.12
20 019-08-E20 1.16 5 프로타민10 17.83 9.17 1 14.32 1.12
상기 제조된 입자로부터 엑세나티드의 In vitro 방출은 입자를 최대 18시간 동안 상이한 pH 용액에서 배양하여 평가하였다. 방출된 엑세나티드의 양은 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC, 도 10a 및 10b) 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC, 도 10c 및 10d)에 의해 정량화하였다. 도 10a-d에 나타낸 바와 같이, 조성물은 pH 안정한 혼합물을 형성하였다.
실시예 9
상이한 서열번호: 3 및 엑세나티드 복합체의 판크레아틴 안정성을 결정하기 위해 이전에 기재된 바와 같이 판크레아틴 효소와 함께 0, 30, 60 또는 120분 동안 배양하였다. 도 11a-c는 상이한 시점에서 상이한 조성물에 대해 남아 있는 서열번호: 3 (~30,162 da), 엑세나티드 (~7,000 da) 및 프로타민 (~4,186 da)의 양을 나타낸다. 하기의 표 5, 표 6, 및 표 7은 도 11a-c에서 각 레인의 제형 및 시점을 나타낸다.
도 11a에서 레인의 설명
레인 제형:
담체:아연:엑세나티드의 비		 시점
(분)		 레인 제형:
담체:아연:엑세나티드의 비		 시점
(분)
1 1:0:0 0 9 1:1:1 0
2 30 10 30
3 60 11 60
4 120 12 120
5 1:1:0 0 13 1:2:1 0
6 30 14 30
7 60 15 60
8 120 16 120
도 11b에서 레인의 설명
레인 제형:
담체:프로타민:엑세나티드의 비		 시점
(분)		 레인 제형:
담체:프로타민:엑세나티드의 비		 시점
(분)
1 0:0:1 0 9 1:0.16:1 0
2 30 10 30
3 60 11 60
4 120 12 120
5 0:1:1 0 13 1:0.8:1 0
6 30 14 30
7 60 15 60
8 120 16 120
도 11c에서 레인의 설명
레인 제형:
담체:아연:엑세나티드의 비		 시점
(분)
1 0:1:1 0
2 30
3 60
4 120
도 12a-c는 콜릭스, FITC-표지된 엑세나티드 및 아연으로부터 제조된 미세입자의 공초점 영상을 나타낸다. 각 영상에 20 μm 눈금 막대(scale bar)를 나타낸다. 도 13에 약 100개의 입자의 크기 분포를 나타낸다. 미세입자의 평균 크기는 ~5 μm ± 2μm 이었다.
인간 SMI-100 세포를 가로질러 통과세포외배출하는 입자의 능력을 결정하기 위해, 입자를 표 8에 요약된 바와 같이 제조하였다. 결과로 생성된 입자를 10 mL의 PBS에 용해시키고, 100 uL의 용액을 세포의 정점 측면에 첨가하고 500 uL의 PBS를 기저 챔버에 첨가하였다. 37℃에서 1시간 후 기저 용액 내 단백질을 농축하고 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 기저 용액 내 엑세나티드를 HPLC로 정량화하였다. 도 14에 나타내고 표 8에 요약된 바와 같이, 시험된 6개의 제형에서 통과세포외배출이 관찰되었다. E0은 단백질이 없는 대조군이며, EP9는 PBS에 용해되지 않았다. 프로타민이 아닌 아연을 포함하는 입자 (E11, E13, 및 E14)에서 더 높은 수준의 엑세나티드 수송이 나타났다.
통과세포외배출 분석에 사용된 제형
제형 서열번호: 3
(mg) 		엑세나티드
(mg) 		양이온 (mg) 서열번호: 3의 % 엑세나티드의 % 엑세나티드의 기저측 농도
(ng/mL)
E0 0 35 아연2 0 35 0
E9 2.5 2.5 프로타민2 17.1 3.1 0
E6 2.5 2.5 프로타민0.2 19.7 2.1 0
E16 0.058 5 프로타민
10		 20.8 14.1 3
E18 0.29 5 프로타민10 3.25 19.8 3
E11 0.058 5 아연10 0.42 13.6 4
E13 0.29 5 아연10 1.42 14.3 7
E14 0.58 5 아연10 19.1 27.8 8
실시예 10: In vivo 연구
in vivo 시험을 위해 제형을 선택하였다. 이러한 제형은 대규모로 제조되었으며, 이전과 같이 함량 및 순도에 대해 시료를 분석하였다. 제형의 상세한 설명 및 분석 시험 결과를 표 9에 나타내었다. 일반적인 제제에서, 콜릭스 담체 서열번호: 3을 포함하는 용액 (또는 콜릭스가 없는 경우, 물로 치환됨)을 교반기 플레이트 상에서 1분 동안 엑세나티드 용액과 혼합하였다. 교반된 용액에 아연 또는 프로타민 용액을 한 방울씩 첨가하였다. 15분 동안 교반한 후, 전체 용액/현탁액을 동결건조시켰다. 플루오레세인 태깅된 엑세나티드를 이용하여 동일한 방법으로 3개의 추가 제형을 제조하였다; 이는 표 10에 요약되어 있다. 리신의 측쇄 상의 플루오레세인을 고상 펩티드 합성에 의해 엑세나티드의 N-말단에 첨가하였다.
엑세나티드, 콜릭스 (서열번호: 3), 및 양이온의 제형
제형 코드 서열번호: 3의 양 (mg) 엑세나티드의 양 (mg) Zn/Pro의 양 (mg) % 서열번호: 3 % 엑세나티드 % 순도
0 019-08-E10 0 10 아연20 0 13.45 >95
13 019-08-E13 0.58 10 아연20 3.10 37.68 >95
14 019-08-E14 1.16 10 아연20 4.57 24.7 >95
18 019-08-E18 0.58 10 프로타민20 2.75 35.65 >95
10 019-08-E10 0 10 아연20
엑세나티드-플루오레세인으로 제조된 제형
제형
 성분 % 서열번호: 3 % 엑세나티드
019-10-E0 FITC Exe-플루오레세인 + Zn (1:2) 0 13.45
019-10-E14 FITC 서열번호: 3 + Exe-플루오레세인 + Zn (0.116:1:2) 4.57 24.7
019-10-E18 FITC 서열번호: 3 + Exe-플루오레세인 + Pro (0.058:1:2) 2.75 35.65
제형의 제조에 사용된 각 분말의 순도는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에서 관찰된 % 상대 피크 면적을 계산하여 결정된, 엑세나티드 % 함량 ~ 89.0% 및 서열번호: 3 % 함량 ~ 71.8% 이었다.
판크레아틴 분석을 수행하여 상이한 제형의 안정성을 결정하였다; 결과는 도 17a 및 17b에서 볼 수 있다. 4-20% Citerion TGX 얼룩-없는 프리캐스트 겔 (Bio-Rad, 5678094), Precision Plus 비염색 표준(unstained standard) (Bio-Rad, 161-0375) 및 ThermoFisher Gel Scanner를 이용하여 시료를 분석하였다. 제형 E14, E18, E14-FITC, 및 E18-FITC는 모두 판크레아틴 효소에 2시간의 노출 후에도 서열번호: 3의 매우 적은 분해를 나타내었다. 도 18은 6.8분의 머무름 시간에서 서열번호: 3 및 7.5분에서 엑세나티드의 존재를 나타내는 역상 크로마토그램 (RPLC)을 나타낸다. 또한, 다양한 pH 값에서 수용해도에 대해 이러한 제형을 평가하였다. 도 19에서 알 수 있는 바와 같이, FITC 제형은 비(non) FITC 제형보다 덜 가용성이었다. 제형 E14는 pH 1에서 낮은 용해도 및 pH 7 이상에서 높은 용해도를 나타내었다. 또한, 제형 E0은 pH 1에서 낮은 용해도 및 pH 5 이상에서 높은 용해도를 나타내었다.
in vivo 약동학(pharmacokinetics) 및 약력학(pharmacodynamics)을 평가하기 위해, 입자를 PBS에 현탁시키고, 100 μL의 각 현탁액을 랫트 장 내강에 주사하였다. 각 제형에 대해 4마리의 랫트를 사용하였으며, 제형을 현탁하여 E14 및 E18에 대해 10 μg의 엑세나티드 및 E0에 대해 0 μg의 엑세나티드를 제조하였다. 주사 후 15, 30, 45, 60 및 90분에 100 μL 혈액 시료를 채취하였다. 혈액을 응고시킨 다음 원심분리하여 혈청을 제조하였으며, 엑세나티드 농도를 ELISA로 측정하였다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 엑세나티드는 E14 및 E18 둘 다를 주사한 동물의 혈청에서 검출되었다. E18 제형은 더 높은 최대 혈청 농도 및 더 높은 곡선하면적을 야기하였다. E14 제형에 대한 Cmax는 17.3 ng/mL 이었으며, E18 제형에 대한 Cmax는 35.7 ng/mL 이었다. Tmax는 E14의 경우 60분, E18의 경우 45분이었다. 모든 동물의 혈당 수준에서 기준선으로부터의 변화가 관찰되지 않았다. 비교로서, 등가량의 엑세나티드를 랫트에게 정맥내 주사하고 혈청 농도를 평가하였다 (도 21 참조). 장내 전달된 E14, E18 및 정맥내 전달된 엑세나티드의 약동학을 표 11에서 비교하였다.
약동학
제형 Cmax (ng/mL) AUC (ng/mL x min) 상대 이용율(Relative availability) (%)
IV 465.0 27250 100
E14 20.2 996.3 3.66
E18 40.6 1386 5.09
실시예 11: 엑세나티드를 포함하는 조성물의 제조
엑세나티드 (서열번호: 11)는 C-말단 아민 및 N-말단 H에 의해 안정화되는 GLP-1-유사 생물학적 활성을 갖는 펩티드이다. 이 실시예에서, 1) 서열번호: 70을 갖는 담체에 처리되고 서열번호: 11에 가교결합된 서열번호: 78을 갖는 담체 및 2) 서열번호: 80을 갖는 담체에 처리되고 서열번호: 11에 가교결합된 서열번호: 77을 갖는 담체를 포함하는 2개의 비-자연적으로 발생하는 분리된 구조체를 제조하고, in vivo에서 장 상피 수송에 대해 시험하였다. 서열번호: 80 및 서열번호: 70을 갖는 담체를 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조하였으며, 엑세나티드 (서열번호: 11) (Cat# HOR-246)는 ProSpec-Tany Technogene Ltd. PO Box 6591, East Brunswick, NJ 08816에서 구입하였다. Sulfo-SMCC 가교결합제를 포함하는 PierceTM 제어된 단백질-단백질 가교결합 키트 (Cat# 23456)는 ThermoFisher에서 구입하였다.
페이로드 및 담체 활성화 및 가교결합:
엑세나티드 (10 mg)를 5 mL H20에 용해시켜 2 mg/mL 용액을 형성하였다. Sulfo-SMCC (2 mg)를 2 mL의 PBS에 용해시켰다. 그 직후, 0.088 mL (~5배 몰 과량)의 Sulfo-SMCC 용액을 1.0 mL 엑세나티드 용액에 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하였다. 1.0 mL의 말레이미드-엑세나티드 반응 혼합물을 PBS로 평형화된 탈염 컬럼에 적용하고, PBS로 용리하고, 0.5 mL 분획을 수집하여 미반응된 Sulfo-SMCC를 제거하였다. 각 분획의 280nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 피크를 찾았다. 대부분의 단백질을 함유하는 피크 분획을 풀링하였다. 풀링된 활성화된 엑세나티드의 농도를 280 nm에서의 흡광도와 원래 단백질 용액의 흡광도를 비교하여 결정하였다.
서열번호: 77 및 서열번호: 78을 갖는 담체는 이황화 결합을 형성하는 2개의 시스테인 잔기가 측면에 있는 TEV 절단 부위를 포함하는 C-말단 확장 및 C-말단 His6 태그를 가진다. 표준 방법을 이용하여 HisTrap 컬럼에서 서열번호: 77 및 서열번호: 78을 갖는 담체를 정제하였다. pH 7.4에서 PBS 내 2 mg 단백질 (10 mg/ml의 200 μL)을 30℃에서 2시간 동안 2 μl의 0.1M 디티오트레이톨 및 5 μl의 TEV 프로테아제로 처리하여 활성화시켰다. 절단된 및 환원된 단백질을 PBS로 평형화된 1-ml HisTrap 컬럼에 적용하였다. 컬럼에 결합된 C-말단 단편 및 이의 C-말단 근처에 유리 시스테인이 있는 활성화된 N-말단 서열번호: 80 또는 서열번호: 70 생성물을 통과액(flow through)에 수집하였다.
말레이미드-활성화 엑세나티드 및 담체 (설프히드릴-서열번호: 80 단백질 또는 설프히드릴-서열번호: 70 단백질)를 동일한 몰량으로 혼합한 다음, 실온에서 60분 동안 배양하였다. SMCC-가교결합된 서열번호: 70 - 엑세나티드 복합체의 순도를 쿠마씨-염색된 SDS 겔에서 평가하였다. 복합체는 대략 정확한 분자량이었으며, >90% 순도를 가졌다 (도 22). 그 다음, 가교결합된 전달 구조체를 4℃에서 저장하였다.
실시예 12: 엑세나티드 전달 구조체의 In vivo 통과세포외배출 :
실시예 11로부터의 전달 구조체를 하기와 같이 장 상피 수송에 대해 시험하였다: 야생형 스프라그 돌리(Sprague Dawley)® 랫트 (~200 - 250 grams, ~ 6 주령, Charles River에서 구입함)를 밤새도록 금식시켜 장을 청소하였다. 하기 물질을 준비하였다: 4% 포름알데히드를 함유한 마이크로퓨지 튜브, 조직 보존용 튜브, 혈액 수집용 마이크로퓨지 튜브, 혈청 수집용 마이크로퓨지 튜브, PBS, 및 시험 물품. 동물을 이소플루란으로 마취시키고 복부를 면도하여 실험을 준비하였다. 각 동물에 대해 4개의 주사제를 준비하였다 (공장당 2개 및 결장당 2개). 복강을 열었다. 주사 부위를 찾아내고 구별되는 색상으로 표시하였다. 시험 물품을 결장에 대해 10분 및 공장에 대해 40분에 걸쳐 내강으로 천천히 주사하였다. 동물은 1 μg/μL의 농도로 주사당 35 μg의 단백질을 받았다. 동물을 50분에 안락사시켰다. 심장 천자를 통해 말단 혈액을 수집하였다. 공장 및 결장을 제거하고, 플라스틱-라이닝된 작업대에 놓았다. 공장 및 결장의 내용물을 PBS를 이용하여 세척하고 버렸다. 주사 부위에서 1 cm 길이의 장을 잘라내었다. 잘라낸 조직을 반으로 절단하였다. 하나의 절편을 4% 포름알데히드에 넣었다. 나머지 조직을 세로로 얇게 썬 다음, 즉시 마이크로퓨지 튜브에 넣고 동결시켰다. 이 과정을 모든 주사 부위에 대해 반복하였다. 간 (~1cm3)을 제거하고, 2 조각으로 나누었다. 저장을 위해, 간의 하나의 절편을 포름알데히드에 넣었으며, 2번째 절편을 즉시 동결시켰다. 주사 후 40분에 장, 간 및 혈청 시료를 수집하였다. 혈액 시료를 원심분리하고, 결과로 생성된 혈청을 저장용 용기로 옮겼다. 시료를 드라이아이스로 수송하고 -80℃에서 저장하였다. 투여 방법은 하기와 같았다:
서열번호: 70-엑세나티드 100 μL, 490 pmol / 29.4 μg (4.9 μM)
서열번호: 80-엑세나티드 100 μL, 490 pmol / 30.9 μg (4.9 μM)
서열번호: 11 100 μL, 490 pmol / 2 μg (4.9 μM)
서열번호: 70-엑세나티드, 서열번호: 80-엑세나티드 및 서열번호: 11 (엑세나티드)의 장 상피 수송의 생체분석적 분석(Bioanalytical analysis)을 엑센딘-4 ELISA 키트 (Phoenix Pharma, Cat# EK-070-94)를 이용하여 하기와 같이 수행하였다: 조직 시료를 Brains On-line으로부터 얻었다; 300 μL 분석 완충제 (1X)를 조직 시료를 함유하는 각 튜브에 첨가하였다; 조직을 분석 완충제로부터 제거하고, 멸균되고 깨끗한 세포 배양 뚜껑 플레이트에 놓았다; 장간막의 수집을 피하기 위해 조심하면서, 세포 스크래퍼로 장 시료를 부드럽게 긁어내었다; 추가 침연 (maceration) 및 균질화와 유사한 방식으로 간 시료를 처리하였다; 결과로 생성된 세포 균질액(homogenate)을 원래의 튜브로 다시 옮겼다; 나머지 조직 시료 및 작업 영역을 100 μL 완충제 (2x)로 헹구었다; 세포 균질액 용액을 5분 동안 최대 힘으로 원심분리하였다; 상청액을 제조사의 지시에 따라 처리한 ELISA 플레이트에 적용하였다; 남은 상층액은 나중에 사용하기 위해 -20℃에서 저장하였다.
도 23에 나타낸 바와 같이, 장 상피 세포를 가로질러 서열번호: 70-엑세나티드 및 서열번호: 80-엑세나티드의 수송은 10분 및 40분에 관찰되었다. 또한, 서열번호: 70-엑세나티드 및 서열번호: 80-엑세나티드는 둘 다 서열번호: 11 (엑세나티드) 단독보다 더 높은 속도로, 특히 40분에 수송되었다.
실시예 13: 엑세나티드 페이로드를 갖는 전달 구조체의 글루코오스 조절 활성
서열번호: 70-엑세나티드를 시험하는데 사용된 글루코오스 공격 모델을 설계하여, 글루코오스 변동(excursion)으로부터 회복 속도를 향상시키는 GLP-1-유사 활성의 능력을 시험하였다. 글루코오스의 IP 주사를 사용하여 글루코오스 변동 결과를 유발하였으며, IP 주사에 의해 전달된 엑세나티드를 가짜(sham) IP 주사 대조군에 대해 관찰된 것과 비교하여 효과의 시기 및 정도에 대한 양성 대조군으로 사용하였다.
글루코오스 공격 시험에 사용된 수컷 CD1 마우스는 9-16 주령이었다. 혈장 글루코오스는 처리 스트레스에 반응할 수 있기 때문에, 처리로 인한 스트레스를 최소화하기 위해, 동물을 실험 시작 전 1주일 동안 환경, 혈액 샘플링, 및 투여 절차에 순응시켰다. 마우스를 연구 전에 18시간 동안 금식시켰다. 연구 전에 동물의 체중을 재었다. 모든 동물은 복강내 (IP) 주사에 의해 2 mg/kg 용량의 D-글루코오스 용액 (50 μL 멸균 PBS 내)을 받기 전에 기준선 혈당 판독값을 얻었다. 그 다음, 동물은 10 mg의 서열번호: 14 (양성 대조군)의 IP 주사, 200 μl의 0.2 M NaHCO3 (pH 8.5) 내 10 mg의 서열번호: 14를 함유한 시험 치료제의 경구 위관영양법, 또는 200 μl의 0.2 M NaHCO3 (음성 대조군)의 경구 위관영양법을 받았다. t=0, 15, 30, 45, 60 분; 2, 3, 및 4 시간에 혈액 시료를 채취하였다. 연구 시작 전에 글루코오스 표준으로 보정된 시판용 혈당측정기(glucometer)로 꼬리에서 채취한 5 μL 혈액 시료를 이용하여 혈당 측정을 하였다.
3가지 상이한 처리를 받은 동물에 대한 혈당 수준의 시간-농도 프로파일을 도 24에 나타내었다. 혈당 변동의 교정은 시판용 엑세나티드 (1-40)-Gly의 10 μg IP 주사 후 15분에 시작되었으며, 교정 프로파일은 120분에 완료되었다. 서열번호: 70-엑세나티드 (10 mg)의 경구 위관영양법은 혈당의 유사한 시간-농도 패턴을 야기하였다. 이에 비해, 음성 대조군 마우스는 기준선으로 완전히 회복하는데 ~4시간이 필요한 2배 더 높은 혈당 수준을 달성하였다. 이러한 결과는 서열번호: 70 담체 서열이 이 글루코오스 공격 모델에서 약력학적 결과를 얻기에 충분한 생물학적 활성 엑세나티드의 상피 세포 통과세포외배출을 촉진할 수 있음을 시사한다.
실시예 14: 엑세나티드 페이로드를 갖는 전달 구조체에 의한 GLP-1 수용체 활성화
서열번호: 71은 N-말단 엑센딘-4 (서열번호: 14) 도메인, 스페이서 (서열번호: 79) 및 C-말단 담체 (서열번호: 73)를 포함하는 융합 단백질 전달 구조체이다. 서열번호: 83은 N-말단 담체 (서열번호: 67), 스페이서 (서열번호: 79) 및 C-말단 엑센딘-4 (서열번호: 14) 도메인을 포함하는 융합 단백질 전달 구조체이다. PathHunter® β-아레스틴 G-단백질 결합 수용체 (GPCR) 분석 (DiscoverRx)을 사용하여 서열번호: 71, 서열번호: 11 (엑세나티드), 및 M+서열번호: 65의 GLP-1 수용체에 결합하는 능력을 분석하였다. PathHunter 분석에서, 리간드 결합은 GLP-1 수용체를 활성화하며, 수용체에 β-아레스틴 보충(recruitment)을 야기한다. 효소 단편 보완(Enzyme Fragment Complementation)을 기반으로 한 신호 이득 분석(gain-of-signal)을 이용하여 수용체의 활성화 상태를 검출한다. β-갈락토시다제 효소 (β-gal)는 효소 공여자 (enzyme donor, ED) 및 효소 수여자 (enzyme acceptor, EA)의 두 부분으로 나뉜다. 독립적으로, 이러한 단편은 활성이 없다. 그러나, 이들은 서로를 보완하여 단백질 복합체의 조립에 의해 결합될 때 활성 β-gal 효소를 형성한다. GLP-1 수용체는 ED 단편으로 태깅되었으며, EA로 태깅된 β-아레스틴을 안정적으로 발현하는 세포에서 공동-발현되었다. 활성화된 ED-태깅된 GLP-1 수용체에 의한 EA-태깅된 β-아레스틴의 보충은 EA 및 ED 도메인을 결합하여 β-gal 효소 활성을 재구성하며, 이는 발광 생성물의 방출에 의해 검출될 수 있다. 도 25는 서열번호: 11 및 서열번호: 71이 수용체에 결합할 수 있음을 나타낸다. 서열번호: 83은 서열번호: 71에 비해 감소된 활성을 나타내었다.
본 발명의 바람직한 실시예가 본 명세서에 나타내고 기재되었지만, 이러한 실시예는 단지 예로서 제공된다는 것이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 수많은 변형, 변화 및 치환은 이제 본 발명으로부터 벗어나지 않고 통상의 기술자에게 발생할 것이다. 본 명세서에 기재된 발명의 실시예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있음을 이해해야 한다. 하기의 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고, 이러한 청구범위 및 이의 균등물의 범위 내의 방법 및 구조는 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
[표 12]
서열
Figure pct00003
Figure pct00004
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Figure pct00033
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Figure pct00035
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Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
서열번호: 69의 아미노산 잔기를 확인하는 예시적인 통과세포외배출 담체
AA 잔기 AA 잔기 AA 잔기
1-252 1-291 1-330
1-253 1-292 1-331
1-254 1-293 1-332
1-255 1-294 1-333
1-256 1-295 1-334
1-257 1-296 1-335
1-258 1-297 1-336
1-259 1-298 1-337
1-260 1-299 1-338
1-261 1-300 1-339
1-262 1-301 1-340
1-263 1-302 1-341
1-264 1-303 1-342
1-265 1-304 1-343
1-266 1-305 1-344
1-267 1-306 1-345
1-268 1-307 1-346
1-269 1-308 1-347
1-270 1-309 1-348
1-271 1-310 1-349
1-272 1-311 1-350
1-273 1-312 1-350
1-274 1-313 1-351
1-275 1-314 1-352
1-276 1-315 1-353
1-277 1-316 1-354
1-278 1-317 1-355
1-279 1-318 1-356
1-280 1-319 1-357
1-281 1-320 1-358
1-282 1-321 1-359
1-283 1-322 1-360
1-284 1-323 1-361
1-285 1-324 1-362
1-286 1-325 1-363
1-287 1-326 1-364
1-288 1-327 1-365
1-289 1-328 1-366
1-290 1-329 1-367
서열번호: 7의 아미노산 잔기를 확인하는 예시적인 통과세포외배출 담체
AA 잔기 AA 잔기 AA 잔기
1-195 1-246 1-297
1-196 1-247 1-298
1-197 1-248 1-299
1-198 1-249 1-300
1-199 1-250 1-301
1-200 1-251 1-302
1-201 1-252 1-303
1-202 1-253 1-304
1-203 1-254 1-305
1-204 1-255 1-306
1-205 1-256 1-307
1-206 1-257 1-308
1-207 1-258 1-309
1-208 1-259 1-310
1-209 1-260 1-311
1-210 1-261 1-312
1-211 1-262 1-313
1-212 1-263 1-314
1-213 1-264 1-315
1-214 1-265 1-316
1-215 1-266 1-317
1-216 1-267 1-318
1-217 1-268 1-319
1-218 1-269 1-320
1-219 1-270 1-321
1-220 1-271 1-322
1-221 1-272 1-323
1-222 1-273 1-324
1-223 1-274 1-325
1-224 1-275 1-326
1-225 1-276 1-327
1-226 1-277 1-328
1-227 1-278 1-329
1-228 1-279 1-330
1-229 1-280 1-331
1-230 1-281 1-332
1-231 1-282 1-333
1-232 1-283 1-334
1-233 1-284 1-335
1-234 1-285 1-336
1-235 1-286 1-337
1-236 1-287 1-338
1-237 1-288 1-339
1-238 1-289 1-340
1-239 1-290 1-341
1-240 1-291 1-342
1-241 1-292 1-343
1-242 1-293 1-344
1-243 1-294 1-345
1-244 1-295 1-346
1-245 1-296 1-347
서열번호: 7의 콜릭스 담체의 예시적인 아미노산 잔기
콜릭스 AA 잔기 콜릭스 AA 잔기
1-150 1-178
1-151 1-179
1-152 1-180
1-153 1-181
1-154 1-182
1-155 1-183
1-156 1-184
1-157 1-185
1-158 1-186
1-159 1-187
1-160 22-187
1-161 23-187
1-162 24-187
1-163 25-187
1-164 26-187
1-165 27-187
1-166 28-187
1-167 29-187
1-168 30-187
1-169 31-187
1-170 32-187
1-171 33-187
1-172 34-187
1-173 35-187
1-174 38-187
1-175 39-187
1-176 40-187
1-177 41-187
SEQUENCE LISTING <110> APPLIED MOLECULAR TRANSPORT INC. <120> COMPOSITIONS AND PARTICLES FOR PAYLOAD DELIVERY <130> 40566-725.601 <140> PCT/US2020/046547 <141> 2020-08-14 <150> 63/033,180 <151> 2020-06-01 <150> 63/033,151 <151> 2020-06-01 <150> 63/021,029 <151> 2020-05-06 <150> 62/935,615 <151> 2019-11-14 <150> PCT/US2019/050708 <151> 2019-09-11 <150> 62/899,064 <151> 2019-09-11 <150> 62/888,400 <151> 2019-08-16 <150> 62/888,282 <151> 2019-08-16 <160> 94 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 634 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Cholix polypeptide <400> 1 Val Glu Glu Ala Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser 1 5 10 15 Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro 20 25 30 Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile 35 40 45 Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile 50 55 60 Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val 65 70 75 80 Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu 85 90 95 Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala 100 105 110 Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys 115 120 125 Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro 130 135 140 Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys 145 150 155 160 Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile 165 170 175 Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly 180 185 190 Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys 195 200 205 Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn 210 215 220 Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala 225 230 235 240 Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro 245 250 255 Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu 260 265 270 Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser 275 280 285 Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala 290 295 300 Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His 305 310 315 320 Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val 325 330 335 Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly 340 345 350 Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr 355 360 365 Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala 370 375 380 Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser 385 390 395 400 Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile Glu Ser Arg 405 410 415 Ser Gly Arg Ser Tyr Leu Pro Glu Asn Arg Ala Val Ile Thr Pro Gln 420 425 430 Gly Val Thr Asn Trp Thr Tyr Gln Glu Leu Glu Ala Thr His Gln Ala 435 440 445 Leu Thr Arg Glu Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Asn His 450 455 460 Val Ala Ala Gln Thr Ile Val Asn Arg Ile Ala Pro Val Pro Arg Gly 465 470 475 480 Asn Asn Thr Glu Asn Glu Glu Lys Trp Gly Gly Leu Tyr Val Ala Thr 485 490 495 His Ala Glu Val Ala His Gly Tyr Ala Arg Ile Lys Glu Gly Thr Gly 500 505 510 Glu Tyr Gly Leu Pro Thr Arg Ala Glu Arg Asp Ala Arg Gly Val Met 515 520 525 Leu Arg Val Tyr Ile Pro Arg Ala Ser Leu Glu Arg Phe Tyr Arg Thr 530 535 540 Asn Thr Pro Leu Glu Asn Ala Glu Glu His Ile Thr Gln Val Ile Gly 545 550 555 560 His Ser Leu Pro Leu Arg Asn Glu Ala Phe Thr Gly Pro Glu Ser Ala 565 570 575 Gly Gly Glu Asp Glu Thr Val Ile Gly Trp Asp Met Ala Ile His Ala 580 585 590 Val Ala Ile Pro Ser Thr Ile Pro Gly Asn Ala Tyr Glu Glu Leu Ala 595 600 605 Ile Asp Glu Glu Ala Val Ala Lys Glu Gln Ser Ile Ser Thr Lys Pro 610 615 620 Pro Tyr Lys Glu Arg Lys Asp Glu Leu Lys 625 630 <210> 2 <211> 386 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Cholix polypeptide <400> 2 Val Glu Glu Ala Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser 1 5 10 15 Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro 20 25 30 Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile 35 40 45 Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile 50 55 60 Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val 65 70 75 80 Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu 85 90 95 Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala 100 105 110 Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys 115 120 125 Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro 130 135 140 Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys 145 150 155 160 Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile 165 170 175 Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly 180 185 190 Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys 195 200 205 Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn 210 215 220 Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala 225 230 235 240 Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro 245 250 255 Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu 260 265 270 Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser 275 280 285 Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala 290 295 300 Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His 305 310 315 320 Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val 325 330 335 Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly 340 345 350 Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr 355 360 365 Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala 370 375 380 Gln Ala 385 <210> 3 <211> 319 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Met Val Glu Glu Ala Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys 1 5 10 15 Ser Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile 20 25 30 Pro Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr 35 40 45 Ile Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser 50 55 60 Ile Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr 65 70 75 80 Val Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr 85 90 95 Glu Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe 100 105 110 Ala Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile 115 120 125 Lys Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val 130 135 140 Pro Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp 145 150 155 160 Lys Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn 165 170 175 Ile Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu 180 185 190 Gly Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu 195 200 205 Cys Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln 210 215 220 Asn Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val 225 230 235 240 Ala Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys 245 250 255 Pro Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Ser Gly Gly Ser Gly 260 265 270 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Ser 275 280 285 Ser Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg Pro Arg Val Ser Arg Arg Arg 290 295 300 Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg His His His His His His 305 310 315 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 192 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu 1 5 10 15 Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe 20 25 30 Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn 35 40 45 Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn 50 55 60 Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser 65 70 75 80 Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser 85 90 95 Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr 100 105 110 Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln 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Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val 325 330 335 Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly 340 345 350 Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr 355 360 365 Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala 370 375 380 Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser 385 390 395 400 Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile Glu Ser 405 410 415 <210> 7 <211> 649 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> V or L <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> E or D <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> A or E <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> N or K <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> S or L <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> P or L <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> P or Q <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> S or F <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> S or G <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> K or M <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(59) <223> D or G <220> <221> MOD_RES <222> (67)..(67) <223> I or F <220> <221> MOD_RES <222> (73)..(73) <223> V or I <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(81) <223> N or S <220> <221> MOD_RES <222> (90)..(90) <223> H or N <220> <221> MOD_RES <222> (101)..(101) <223> T or M <220> <221> MOD_RES <222> (104)..(104) <223> Y or F <220> <221> MOD_RES <222> (108)..(108) <223> E or D <220> <221> MOD_RES <222> (109)..(109) <223> G or S <220> <221> MOD_RES <222> (112)..(112) <223> A or T <220> <221> MOD_RES <222> (114)..(114) <223> N or H <220> <221> MOD_RES <222> (118)..(118) <223> P or I <220> <221> MOD_RES <222> (119)..(119) <223> I or P <220> <221> MOD_RES <222> (131)..(131) <223> V or I <220> <221> MOD_RES <222> (134)..(134) <223> L or I <220> <221> MOD_RES <222> (137)..(137) <223> Q or K <220> <221> MOD_RES <222> (160)..(160) <223> K or E <220> <221> MOD_RES <222> (161)..(161) <223> T or N <220> <221> MOD_RES <222> (166)..(166) <223> S or F <220> <221> MOD_RES <222> (168)..(168) <223> S or A <220> <221> MOD_RES <222> (174)..(174) <223> H or Q <220> <221> MOD_RES <222> (175)..(185) <223> This region may encompass one of the following sequences: "N", "S", "SIAKQS", or "SIAKQSIAKQS" <220> <221> MOD_RES <222> (196)..(196) <223> K or N <220> <221> MOD_RES <222> (199)..(199) <223> Q, E, or H <220> <221> MOD_RES <222> (201)..(201) <223> E, N, or D <220> <221> MOD_RES <222> (203)..(203) <223> S or A <220> <221> MOD_RES <222> (210)..(210) <223> H or N <220> <221> MOD_RES <222> (212)..(212) <223> H, L, F, or R <220> <221> MOD_RES <222> (214)..(214) <223> G or T <220> <221> MOD_RES <222> (215)..(215) <223> L or S <220> <221> MOD_RES <222> (216)..(216) <223> A or P <220> <221> MOD_RES <222> (217)..(217) <223> L, E, or K <220> <221> MOD_RES <222> (218)..(218) <223> C or V <220> <221> MOD_RES <222> (219)..(219) <223> W, V, or T <220> <221> MOD_RES <222> (221)..(221) <223> V or absent <220> <221> MOD_RES <222> (222)..(222) <223> P or absent <220> <221> MOD_RES <222> (223)..(223) <223> M, I, L, or absent <220> <221> MOD_RES <222> (224)..(224) <223> D or absent <220> <221> MOD_RES <222> (225)..(225) <223> A or absent <220> <221> MOD_RES <222> (226)..(226) <223> I or absent <220> <221> MOD_RES <222> (227)..(227) <223> Y or C <220> <221> MOD_RES <222> (228)..(228) <223> N or F <220> <221> MOD_RES <222> (229)..(229) <223> Y or F <220> <221> MOD_RES <222> (230)..(230) <223> I or E <220> <221> MOD_RES <222> (231)..(231) <223> T or D <220> <221> MOD_RES <222> (232)..(232) <223> Q or P <220> <221> MOD_RES <222> (233)..(233) <223> Q, E, or A <220> <221> MOD_RES <222> (234)..(234) <223> N, L, or Q <220> <221> MOD_RES <222> (237)..(237) <223> L or Y <220> <221> MOD_RES <222> (239)..(239) <223> D or E <220> <221> MOD_RES <222> (240)..(240) <223> N or D <220> <221> MOD_RES <222> (242)..(242) <223> F, H, or Y <220> <221> MOD_RES <222> (245)..(245) <223> S or A <220> <221> MOD_RES <222> (247)..(247) <223> E or K <220> <221> MOD_RES <222> (252)..(252) <223> T or I <220> <221> MOD_RES <222> (254)..(254) <223> K, E, or G <220> <221> MOD_RES <222> (255)..(255) <223> V or A <220> <221> MOD_RES <222> (257)..(257) <223> T or M <220> <221> MOD_RES <222> (262)..(262) <223> I or M <220> <221> MOD_RES <222> (266)..(266) <223> P, T, or A <220> <221> MOD_RES <222> (275)..(275) <223> K, Q, or N <220> <221> MOD_RES <222> (276)..(276) <223> G or K <220> <221> MOD_RES <222> (279)..(279) <223> M or I <220> <221> MOD_RES <222> (280)..(280) <223> S or E <220> <221> MOD_RES <222> (281)..(281) <223> A or T <220> <221> MOD_RES <222> (298)..(298) <223> S or G <220> <221> MOD_RES <222> (303)..(303) <223> D or Y <220> <221> MOD_RES <222> (305)..(305) <223> T, P, or Q <220> <221> MOD_RES <222> (309)..(309) <223> S or Q <220> <221> MOD_RES <222> (311)..(311) <223> A or V <220> <221> MOD_RES <222> (313)..(313) <223> Q or N <220> <221> MOD_RES <222> (316)..(316) <223> N or Q <220> <221> MOD_RES <222> (322)..(322) <223> V or L <220> <221> MOD_RES <222> (326)..(326) <223> I or M <220> <221> MOD_RES <222> (329)..(329) <223> S or T <220> <221> MOD_RES <222> (331)..(331) <223> L or I <220> <221> MOD_RES <222> (334)..(334) <223> V or I <220> <221> MOD_RES <222> (340)..(340) <223> D, E, or H <220> <221> MOD_RES <222> (341)..(341) <223> E or G <220> <221> MOD_RES <222> (343)..(343) <223> E or A <220> <221> MOD_RES <222> (345)..(345) <223> E or A <220> <221> MOD_RES <222> (347)..(347) <223> A or T <220> <221> MOD_RES <222> (351)..(351) <223> S, D, or T <220> <221> MOD_RES <222> (352)..(352) <223> D or A <220> <221> MOD_RES <222> (353)..(353) <223> L or I <220> <221> MOD_RES <222> (355)..(355) <223> R or Q <220> <221> MOD_RES <222> (359)..(359) <223> N or D <220> <221> MOD_RES <222> (363)..(363) <223> M or V <220> <221> MOD_RES <222> (365)..(365) <223> T or I <220> <221> MOD_RES <222> (370)..(370) <223> V or I <220> <221> MOD_RES <222> (381)..(381) <223> H or E <220> <221> MOD_RES <222> (384)..(384) <223> G or L <220> <221> MOD_RES <222> (386)..(386) <223> T or I <220> <221> MOD_RES <222> (393)..(393) <223> G or S <220> <221> MOD_RES <222> (403)..(403) <223> F or L <220> <221> MOD_RES <222> (404)..(404) <223> C or Y <220> <221> MOD_RES <222> (407)..(407) <223> A or T <220> <221> MOD_RES <222> (409)..(409) <223> K, E, or G <220> <221> MOD_RES <222> (410)..(410) <223> S, P, or H <220> <221> MOD_RES <222> (414)..(414) <223> S or L <220> <221> MOD_RES <222> (415)..(415) <223> N or D <220> <221> MOD_RES <222> (416)..(416) <223> N or S <220> <221> MOD_RES <222> (423)..(423) <223> I or V <220> <221> MOD_RES <222> (433)..(433) <223> P or L <220> <221> MOD_RES <222> (441)..(441) <223> P or Q <220> <221> MOD_RES <222> (453)..(453) <223> E or D <220> <221> MOD_RES <222> (454)..(454) <223> A or T <220> <221> MOD_RES <222> (455)..(455) <223> T or K <220> <221> MOD_RES <222> (458)..(458) <223> A or T <220> <221> MOD_RES <222> (461)..(461) <223> R or Q <220> <221> MOD_RES <222> (463)..(463) <223> G or D <220> <221> MOD_RES <222> (475)..(475) <223> V or A <220> <221> MOD_RES <222> (479)..(479) <223> T, S, or N <220> <221> MOD_RES <222> (485)..(485) <223> A, S, or T <220> <221> MOD_RES <222> (491)..(491) <223> N or S <220> <221> MOD_RES <222> (492)..(492) <223> N or D <220> <221> MOD_RES <222> (495)..(495) <223> N, S, or K <220> <221> MOD_RES <222> (497)..(497) <223> E, R, or K <220> <221> MOD_RES <222> (498)..(498) <223> K, A, or E <220> <221> MOD_RES <222> (502)..(502) <223> L or V <220> <221> MOD_RES <222> (505)..(505) <223> A or S <220> <221> MOD_RES <222> (507)..(507) <223> H or D <220> <221> MOD_RES <222> (509)..(509) <223> E or S <220> <221> MOD_RES <222> (510)..(510) <223> V or L <220> <221> MOD_RES <222> (511)..(511) <223> A or N <220> <221> MOD_RES <222> (512)..(512) <223> H or Y <220> <221> MOD_RES <222> (513)..(513) <223> G or R <220> <221> MOD_RES <222> (515)..(515) <223> A or T <220> <221> MOD_RES <222> (517)..(517) <223> I or L <220> <221> MOD_RES <222> (518)..(518) <223> K or Q <220> <221> MOD_RES <222> (519)..(519) <223> E or K <220> <221> MOD_RES <222> (522)..(522) <223> G or A <220> <221> MOD_RES <222> (523)..(523) <223> E, D, or N <220> <221> MOD_RES <222> (524)..(524) <223> Y, G, A, or N <220> <221> MOD_RES <222> (525)..(525) <223> G or E <220> <221> MOD_RES <222> (526)..(526) <223> L or G <220> <221> MOD_RES <222> (527)..(527) <223> P or L <220> <221> MOD_RES <222> (529)..(529) <223> R, P, or T <220> <221> MOD_RES <222> (530)..(530) <223> A or E <220> <221> MOD_RES <222> (531)..(531) <223> E or K <220> <221> MOD_RES <222> (532)..(532) <223> R, Q, or K <220> <221> MOD_RES <222> (533)..(533) <223> D, K, or E <220> <221> MOD_RES <222> (534)..(534) <223> A, T, or S <220> <221> MOD_RES <222> (540)..(540) <223> R or K <220> <221> MOD_RES <222> (543)..(543) <223> I or L <220> <221> MOD_RES <222> (544)..(544) <223> P or H <220> <221> MOD_RES <222> (545)..(545) <223> R or Q <220> <221> MOD_RES <222> (554)..(554) <223> T or I <220> <221> MOD_RES <222> (556)..(556) <223> T, A, or I <220> <221> MOD_RES <222> (557)..(557) <223> P or D <220> <221> MOD_RES <222> (560)..(560) <223> N or K <220> <221> MOD_RES <222> (561)..(561) <223> A or E <220> <221> MOD_RES <222> (562)..(562) <223> E, R, or D <220> <221> MOD_RES <222> (563)..(563) <223> E, N, or R <220> <221> MOD_RES <222> (564)..(564) <223> H or L <220> <221> MOD_RES <222> (565)..(565) <223> I or V <220> <221> MOD_RES <222> (566)..(566) <223> T or E <220> <221> MOD_RES <222> (567)..(567) <223> Q, R, H, or D <220> <221> MOD_RES <222> (572)..(572) <223> S or P <220> <221> MOD_RES <222> (583)..(583) <223> P or T <220> <221> MOD_RES <222> (584)..(584) <223> E or D <220> <221> MOD_RES <222> (585)..(585) <223> S, A, or R <220> <221> MOD_RES <222> (586)..(586) <223> A, E, or V <220> <221> MOD_RES <222> (587)..(587) <223> G, E, or D <220> <221> MOD_RES <222> (589)..(589) <223> E or S <220> <221> MOD_RES <222> (590)..(590) <223> D or N <220> <221> MOD_RES <222> (593)..(593) <223> V or A <220> <221> MOD_RES <222> (598)..(598) <223> M or I <220> <221> MOD_RES <222> (601)..(601) <223> H or Y <220> <221> MOD_RES <222> (602)..(602) <223> A or G <220> <221> MOD_RES <222> (613)..(613) <223> A or S <220> <221> MOD_RES <222> (615)..(615) <223> E or A <220> <221> MOD_RES <222> (616)..(616) <223> E, A, Q, G, V, or R <220> <221> MOD_RES <222> (618)..(618) <223> A, P, or T <220> <221> MOD_RES <222> (619)..(619) <223> I, T, or P <220> <221> MOD_RES <222> (620)..(620) <223> D or A <220> <221> MOD_RES <222> (624)..(629) <223> This region may encompass one of the following sequences: "V" or "VVKEAI" <220> <221> MOD_RES <222> (631)..(631) <223> K or E <220> <221> MOD_RES <222> (637)..(637) <223> T, A, or P <220> <221> MOD_RES <222> (644)..(644) <223> R, Q, or H <220> <221> MOD_RES <222> (645)..(645) <223> K or absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 7 Xaa Glu Xaa Xaa Leu Xaa Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Xaa 1 5 10 15 Leu Thr Pro Glu Xaa Gly Lys Xaa Ile Gln Ser Lys Leu Xaa Ile Pro 20 25 30 Xaa Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile 35 40 45 Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Xaa Asp Glu Xaa Lys Gly Glu Ser Ile 50 55 60 Ile Thr Xaa Gly Glu Phe Ala Thr Xaa Arg Ala Thr Arg His Tyr Val 65 70 75 80 Xaa Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile Xaa Leu Asp Ile Thr Thr Glu 85 90 95 Asn Gly Thr Lys Xaa Tyr Ser Xaa Asn Arg Lys Xaa Xaa Glu Phe Xaa 100 105 110 Ile Xaa Trp Leu Val Xaa Xaa Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys 115 120 125 Ile Ser Xaa Asp Glu Xaa Asp Gln Xaa Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro 130 135 140 Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Xaa 145 150 155 160 Xaa Gln Gly Asn Val Xaa Phe Xaa Val Thr Arg Pro Glu Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Ala Ile Ser Trp Pro Ser 180 185 190 Val Ser Tyr Xaa Ala Ala Xaa Lys Xaa Gly Xaa Arg His Lys Arg Trp 195 200 205 Ala Xaa Trp Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Thr Xaa Gly Xaa Xaa 225 230 235 240 Trp Xaa Gly Gly Xaa Tyr Xaa Thr Val Ala Gly Xaa Pro Xaa Xaa Ile 245 250 255 Xaa Val Lys Gln Gly Xaa Glu Gln Lys Xaa Val Glu Gln Arg Ile His 260 265 270 Phe Ser Xaa Xaa Asn Ala Xaa Xaa Xaa Leu Ala Ala His Arg Val Cys 275 280 285 Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Xaa Arg Lys Pro Arg Xaa Leu 290 295 300 Xaa Asp Asp Leu Xaa Cys Xaa Tyr Xaa Ala Gln Xaa Ile Val Ser Leu 305 310 315 320 Phe Xaa Ala Thr Arg Xaa Leu Phe Xaa His Xaa Asp Ser Xaa Phe Thr 325 330 335 Leu Asn Leu Xaa Xaa Gln Xaa Pro Xaa Val Xaa Glu Arg Leu Xaa Xaa 340 345 350 Xaa Arg Xaa Ile Asn Glu Xaa Asn Pro Gly Xaa Val Xaa Gln Val Leu 355 360 365 Thr Xaa Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr Val Thr Xaa His Pro Xaa 370 375 380 Leu Xaa Pro Glu Gln Thr Ser Ala Xaa Ala Gln Ala Ala Asp Ile Leu 385 390 395 400 Ser Leu Xaa Xaa Pro Asp Xaa Asp Xaa Xaa Cys Val Ala Xaa Xaa Xaa 405 410 415 Asp Gln Ala Asn Ile Asn Xaa Glu Ser Arg Ser Gly Arg Ser Tyr Leu 420 425 430 Xaa Glu Asn Arg Ala Val Ile Thr Xaa Gln Gly Val Thr Asn Trp Thr 435 440 445 Tyr Gln Glu Leu Xaa Xaa Xaa His Gln Xaa Leu Thr Xaa Glu Xaa Tyr 450 455 460 Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Asn His Xaa Ala Ala Gln Xaa Ile 465 470 475 480 Val Asn Arg Ile Xaa Pro Val Pro Arg Gly Xaa Xaa Thr Glu Xaa Glu 485 490 495 Xaa Xaa Trp Gly Gly Xaa Tyr Val Xaa Thr Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa 500 505 510 Xaa Tyr Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Gly Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 515 520 525 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Gly Val Met Leu Xaa Val Tyr Xaa Xaa 530 535 540 Xaa Ala Ser Leu Glu Arg Phe Tyr Arg Xaa Asn Xaa Xaa Leu Glu Xaa 545 550 555 560 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Ile Gly His Xaa Leu Pro Leu Arg 565 570 575 Asn Glu Ala Phe Thr Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Glu Thr 580 585 590 Xaa Ile Gly Trp Asp Xaa Ala Ile Xaa Xaa Val Ala Ile Pro Ser Thr 595 600 605 Ile Pro Gly Asn Xaa Tyr Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Glu Glu Ala Xaa 610 615 620 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Glu Gln Ser Ile Ser Xaa Lys Pro Pro 625 630 635 640 Tyr Lys Glu Xaa Xaa Asp Glu Leu Lys 645 <210> 8 <211> 147 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Cholix polypeptide <400> 8 Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys 1 5 10 15 Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr 20 25 30 Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val 35 40 45 Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr 50 55 60 Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly 65 70 75 80 Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln 85 90 95 Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp 100 105 110 Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser 115 120 125 Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser 130 135 140 Tyr Lys Ala 145 <210> 9 <211> 166 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Cholix polypeptide <400> 9 Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile 1 5 10 15 Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala 20 25 30 Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly 35 40 45 Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser 50 55 60 Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile 65 70 75 80 Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp 85 90 95 Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu 100 105 110 Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe 115 120 125 Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val 130 135 140 Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly Ser Arg His Lys Arg Trp Ala 145 150 155 160 His Trp His Thr Gly Leu 165 <210> 10 <211> 151 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Cholix polypeptide <400> 10 Val Glu Glu Ala Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser 1 5 10 15 Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro 20 25 30 Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile 35 40 45 Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile 50 55 60 Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val 65 70 75 80 Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu 85 90 95 Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala 100 105 110 Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys 115 120 125 Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro 130 135 140 Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu 145 150 <210> 11 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 11 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 12 <211> 634 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Cholix polypeptide <400> 12 Leu Glu Glu Ala Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser 1 5 10 15 Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro 20 25 30 Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile 35 40 45 Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile 50 55 60 Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val 65 70 75 80 Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu 85 90 95 Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala 100 105 110 Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys 115 120 125 Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro 130 135 140 Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys 145 150 155 160 Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile 165 170 175 Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly 180 185 190 Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu Cys 195 200 205 Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln Asn 210 215 220 Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ala 225 230 235 240 Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys Pro 245 250 255 Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Asn Ala Met Ser Ala Leu 260 265 270 Ala Ala His Arg Val Cys Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Ser 275 280 285 Arg Lys Pro Arg Asp Leu Thr Asp Asp Leu Ser Cys Ala Tyr Gln Ala 290 295 300 Gln Asn Ile Val Ser Leu Phe Val Ala Thr Arg Ile Leu Phe Ser His 305 310 315 320 Leu Asp Ser Val Phe Thr Leu Asn Leu Asp Glu Gln Glu Pro Glu Val 325 330 335 Ala Glu Arg Leu Ser Asp Leu Arg Arg Ile Asn Glu Asn Asn Pro Gly 340 345 350 Met Val Thr Gln Val Leu Thr Val Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr 355 360 365 Val Thr His His Pro Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr Ser Ala Gly Ala 370 375 380 Gln Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Phe Cys Pro Asp Ala Asp Lys Ser 385 390 395 400 Cys Val Ala Ser Asn Asn Asp Gln Ala Asn Ile Asn Ile Glu Ser Arg 405 410 415 Ser Gly Arg Ser Tyr Leu Pro Glu Asn Arg Ala Val Ile Thr Pro Gln 420 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PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Cholix polypeptide <400> 13 Leu Glu Glu Ala Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Ser 1 5 10 15 Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile Pro 20 25 30 Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile 35 40 45 Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser Ile 50 55 60 Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr Val 65 70 75 80 Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr Glu 85 90 95 Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe Ala 100 105 110 Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys 115 120 125 Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro 130 135 140 Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Lys 145 150 155 160 Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn Ile 165 170 175 Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu Gly 180 185 190 Ser Arg His Lys 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 14 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 15 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 40 <210> 16 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> gamma-E-palmitoyl <400> 16 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 17 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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Unknown: Insulin lispro A chain sequence <400> 49 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 50 <211> 30 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Insulin lispro B chain sequence <400> 50 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 20 25 30 <210> 51 <211> 1242 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Insulin receptor substrate 1 sequence <400> 51 Met Ala Ser Pro Pro Glu Ser Asp Gly Phe Ser Asp Val Arg Lys Val 1 5 10 15 Gly Tyr Leu Arg Lys Pro Lys Ser Met His Lys Arg Phe Phe Val Leu 20 25 30 Arg Ala Ala Ser Glu Ala Gly Gly Pro Ala Arg Leu Glu Tyr Tyr Glu 35 40 45 Asn Glu Lys Lys Trp Arg His Lys Ser Ser Ala Pro Lys Arg Ser Ile 50 55 60 Pro Leu Glu Ser Cys Phe Asn Ile Asn Lys Arg Ala Asp Ser Lys Asn 65 70 75 80 Lys His Leu Val Ala Leu Tyr Thr Arg Asp Glu His Phe Ala Ile Ala 85 90 95 Ala Asp Ser Glu Ala Glu 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Unknown: Phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate 3-phosphatase and dual-specificity protein sequence <400> 59 Met Thr Ala Ile Ile Lys Glu Ile Val Ser Arg Asn Lys Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Gln Glu Asp Gly Phe Asp Leu Asp Leu Thr Tyr Ile Tyr Pro Asn Ile 20 25 30 Ile Ala Met Gly Phe Pro Ala Glu Arg Leu Glu Gly Val Tyr Arg Asn 35 40 45 Asn Ile Asp Asp Val Val Arg Phe Leu Asp Ser Lys His Lys Asn His 50 55 60 Tyr Lys Ile Tyr Asn Leu Cys Ala Glu Arg His Tyr Asp Thr Ala Lys 65 70 75 80 Phe Asn Cys Arg Val Ala Gln Tyr Pro Phe Glu Asp His Asn Pro Pro 85 90 95 Gln Leu Glu Leu Ile Lys Pro Phe Cys Glu Asp Leu Asp Gln Trp Leu 100 105 110 Ser Glu Asp Asp Asn His Val Ala Ala Ile His Cys Lys Ala Gly Lys 115 120 125 Gly Arg Thr Gly Val Met Ile Cys Ala Tyr Leu Leu His Arg Gly Lys 130 135 140 Phe Leu Lys Ala Gln Glu Ala Leu Asp Phe Tyr Gly Glu Val Arg Thr 145 150 155 160 Arg Asp Lys Lys Gly Val Thr Ile Pro Ser Gln Arg Arg Tyr Val Tyr 165 170 175 Tyr Tyr Ser Tyr Leu Leu Lys Asn His Leu Asp Tyr Arg Pro Val Ala 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MOD_RES <222> (365)..(365) <223> T or I <220> <221> MOD_RES <222> (370)..(370) <223> V or I <220> <221> MOD_RES <222> (381)..(381) <223> H or E <220> <221> MOD_RES <222> (384)..(384) <223> G or L <220> <221> MOD_RES <222> (386)..(386) <223> T or I <220> <221> MOD_RES <222> (393)..(393) <223> G or S <220> <221> MOD_RES <222> (403)..(403) <223> F or L <220> <221> MOD_RES <222> (404)..(404) <223> C or Y <220> <221> MOD_RES <222> (407)..(407) <223> A or T <220> <221> MOD_RES <222> (409)..(409) <223> K, E, or G <220> <221> MOD_RES <222> (410)..(410) <223> S, P, or H <220> <221> MOD_RES <222> (414)..(414) <223> S or L <220> <221> MOD_RES <222> (415)..(415) <223> N or D <220> <221> MOD_RES <222> (416)..(416) <223> N or S <220> <221> MOD_RES <222> (423)..(423) <223> I or V <220> <221> MOD_RES <222> (433)..(433) <223> P or L <220> <221> MOD_RES <222> (441)..(441) <223> P or Q <220> <221> MOD_RES <222> (453)..(453) <223> E or D <220> <221> MOD_RES <222> (454)..(454) <223> A or T <220> <221> MOD_RES <222> (455)..(455) <223> T or K <220> <221> MOD_RES <222> (458)..(458) <223> A or T <220> <221> MOD_RES <222> (461)..(461) <223> R or Q <220> <221> MOD_RES <222> (463)..(463) <223> G or D <220> <221> MOD_RES <222> (475)..(475) <223> V or A <220> <221> MOD_RES <222> (479)..(479) <223> T, S, or N <220> <221> MOD_RES <222> (485)..(485) <223> A, S, or T <220> <221> MOD_RES <222> (491)..(491) <223> N or S <220> <221> MOD_RES <222> (492)..(492) <223> N or D <220> <221> MOD_RES <222> (495)..(495) <223> N, S, or K <220> <221> MOD_RES <222> (497)..(497) <223> E, R, or K <220> <221> MOD_RES <222> (498)..(498) <223> K, A, or E <220> <221> MOD_RES <222> (502)..(502) <223> L or V <220> <221> MOD_RES <222> (505)..(505) <223> A or S <220> <221> MOD_RES <222> (507)..(507) <223> H or D <220> <221> MOD_RES <222> (509)..(509) <223> E or S <220> <221> MOD_RES <222> (510)..(510) <223> V or L <220> <221> MOD_RES <222> (511)..(511) <223> A or N <220> <221> MOD_RES <222> (512)..(512) <223> H or Y <220> <221> MOD_RES <222> (513)..(513) <223> G or R <220> <221> MOD_RES <222> (515)..(515) <223> A or T <220> <221> MOD_RES <222> (517)..(517) <223> I or L <220> <221> MOD_RES <222> (518)..(518) <223> K or Q <220> <221> MOD_RES <222> (519)..(519) <223> E or K <220> <221> MOD_RES <222> (522)..(522) <223> G or A <220> <221> MOD_RES <222> (523)..(523) <223> E, D, or N <220> <221> MOD_RES <222> (524)..(524) <223> Y, G, A, or N <220> <221> MOD_RES <222> (525)..(525) <223> G or E <220> <221> MOD_RES <222> (526)..(526) <223> L or G <220> <221> MOD_RES <222> (527)..(527) <223> P or L <220> <221> MOD_RES <222> (529)..(529) <223> R, P, or T <220> <221> MOD_RES <222> (530)..(530) <223> A or E <220> <221> MOD_RES <222> (531)..(531) <223> E or K <220> <221> MOD_RES <222> (532)..(532) <223> R, Q, or K <220> <221> MOD_RES <222> (533)..(533) <223> D, K, or E <220> <221> MOD_RES <222> (534)..(534) <223> A, T, or S <220> <221> MOD_RES <222> (540)..(540) <223> R or K <220> <221> MOD_RES <222> (543)..(543) <223> I or L <220> <221> MOD_RES <222> (544)..(544) <223> P or H <220> <221> MOD_RES <222> (545)..(545) <223> R or Q <220> <221> MOD_RES <222> (554)..(554) <223> T or I <220> <221> MOD_RES <222> (556)..(556) <223> T, A, or I <220> <221> MOD_RES <222> (557)..(557) <223> P or D <220> <221> MOD_RES <222> (560)..(560) <223> N or K <220> <221> MOD_RES <222> (561)..(561) <223> A or E <220> <221> MOD_RES <222> (562)..(562) <223> E, R, or D <220> <221> MOD_RES <222> (563)..(563) <223> E, N, or R <220> <221> MOD_RES <222> (564)..(564) <223> H or L <220> <221> MOD_RES <222> (565)..(565) <223> I or V <220> <221> MOD_RES <222> (566)..(566) <223> T or E <220> <221> MOD_RES <222> (567)..(567) <223> Q, R, H, or D <220> <221> MOD_RES <222> (572)..(572) <223> S or P <220> <221> MOD_RES <222> (583)..(583) <223> P or T <220> <221> MOD_RES <222> (584)..(584) <223> E or D <220> <221> MOD_RES <222> (585)..(585) <223> S, A, or R <220> <221> MOD_RES <222> (586)..(586) <223> A, E, or V <220> <221> MOD_RES <222> (587)..(587) <223> G, E, or D <220> <221> MOD_RES <222> (589)..(589) <223> E or S <220> <221> MOD_RES <222> (590)..(590) <223> D or N <220> <221> MOD_RES <222> (593)..(593) <223> V or A <220> <221> MOD_RES <222> (598)..(598) <223> M or I <220> <221> MOD_RES <222> (601)..(601) <223> H or Y <220> <221> MOD_RES <222> (602)..(602) <223> A or G <220> <221> MOD_RES <222> (613)..(613) <223> A or S <220> <221> MOD_RES <222> (615)..(615) <223> E or A <220> <221> MOD_RES <222> (616)..(616) <223> E, A, Q, G, V, or R <220> <221> MOD_RES <222> (618)..(618) <223> A, P, or T <220> <221> MOD_RES <222> (619)..(619) <223> I, T, or P <220> <221> MOD_RES <222> (620)..(620) <223> D or A <220> <221> MOD_RES <222> (624)..(629) <223> This region may encompass one of the following sequences: "V" or "VVKEAI" <220> <221> MOD_RES <222> (631)..(631) <223> K or E <220> <221> MOD_RES <222> (637)..(637) <223> T, A, or P <220> <221> MOD_RES <222> (644)..(644) <223> R, Q, or H <220> <221> MOD_RES <222> (645)..(645) <223> K or absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 81 Val Glu Xaa Xaa Leu Xaa Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys Xaa 1 5 10 15 Leu Thr Pro Glu Xaa Gly Lys Xaa Ile Gln Ser Lys Leu Xaa Ile Pro 20 25 30 Xaa Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr Ile 35 40 45 Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Xaa Asp Glu Xaa Lys Gly Glu Ser Ile 50 55 60 Ile Thr Xaa Gly Glu Phe Ala Thr Xaa Arg Ala Thr Arg His Tyr Val 65 70 75 80 Xaa Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile Xaa Leu Asp Ile Thr Thr Glu 85 90 95 Asn Gly Thr Lys Xaa Tyr Ser Xaa Asn Arg Lys Xaa Xaa Glu Phe Xaa 100 105 110 Ile Xaa Trp Leu Val Xaa Xaa Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile Lys 115 120 125 Ile Ser Xaa Asp Glu Xaa Asp Gln Xaa Arg Asn Ile Ile Glu Val Pro 130 135 140 Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp Xaa 145 150 155 160 Xaa Gln Gly Asn Val Xaa Phe Xaa Val Thr Arg Pro Glu Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Ala Ile Ser Trp Pro Ser 180 185 190 Val Ser Tyr Xaa Ala Ala Xaa Lys Xaa Gly Xaa Arg His Lys Arg Trp 195 200 205 Ala Xaa Trp Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Thr Xaa Gly Xaa Xaa 225 230 235 240 Trp Xaa Gly Gly Xaa Tyr Xaa Thr Val Ala Gly Xaa Pro Xaa Xaa Ile 245 250 255 Xaa Val Lys Gln Gly Xaa Glu Gln Lys Xaa Val Glu Gln Arg Ile His 260 265 270 Phe Ser Xaa Xaa Asn Ala Xaa Xaa Xaa Leu Ala Ala His Arg Val Cys 275 280 285 Gly Val Pro Leu Glu Thr Leu Ala Arg Xaa Arg Lys Pro Arg Xaa Leu 290 295 300 Xaa Asp Asp Leu Xaa Cys Xaa Tyr Xaa Ala Gln Xaa Ile Val Ser Leu 305 310 315 320 Phe Xaa Ala Thr Arg Xaa Leu Phe Xaa His Xaa Asp Ser Xaa Phe Thr 325 330 335 Leu Asn Leu Xaa Xaa Gln Xaa Pro Xaa Val Xaa Glu Arg Leu Xaa Xaa 340 345 350 Xaa Arg Xaa Ile Asn Glu Xaa Asn Pro Gly Xaa Val Xaa Gln Val Leu 355 360 365 Thr Xaa Ala Arg Gln Ile Tyr Asn Asp Tyr Val Thr Xaa His Pro Xaa 370 375 380 Leu Xaa Pro Glu Gln Thr Ser Ala Xaa Ala Gln Ala Ala Asp Ile Leu 385 390 395 400 Ser Leu Xaa Xaa Pro Asp Xaa Asp Xaa Xaa Cys Val Ala Xaa Xaa Xaa 405 410 415 Asp Gln Ala Asn Ile Asn Xaa Glu Ser Arg Ser Gly Arg Ser Tyr Leu 420 425 430 Xaa Glu Asn Arg Ala Val Ile Thr Xaa Gln Gly Val Thr Asn Trp Thr 435 440 445 Tyr Gln Glu Leu Xaa Xaa Xaa His Gln Xaa Leu Thr Xaa Glu Xaa Tyr 450 455 460 Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Asn His Xaa Ala Ala Gln Xaa Ile 465 470 475 480 Val Asn Arg Ile Xaa Pro Val Pro Arg Gly Xaa Xaa Thr Glu Xaa Glu 485 490 495 Xaa Xaa Trp Gly Gly Xaa Tyr Val Xaa Thr Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa 500 505 510 Xaa Tyr Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Gly Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 515 520 525 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Gly Val Met Leu Xaa Val Tyr Xaa Xaa 530 535 540 Xaa Ala Ser Leu Glu Arg Phe Tyr Arg Xaa Asn Xaa Xaa Leu Glu Xaa 545 550 555 560 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Ile Gly His Xaa Leu Pro Leu Arg 565 570 575 Asn Glu Ala Phe Thr Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Glu Thr 580 585 590 Xaa Ile Gly Trp Asp Xaa Ala Ile Xaa Xaa Val Ala Ile Pro Ser Thr 595 600 605 Ile Pro Gly Asn Xaa Tyr Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Glu Glu Ala Xaa 610 615 620 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Glu Gln Ser Ile Ser Xaa Lys Pro Pro 625 630 635 640 Tyr Lys Glu Xaa Xaa Asp Glu Leu Lys 645 <210> 82 <211> 252 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 82 Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys Val 1 5 10 15 Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp Pro 20 25 30 Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met Val 35 40 45 Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala Leu 50 55 60 Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val Glu 65 70 75 80 Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly Ser 85 90 95 Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser Asn 100 105 110 Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser His 115 120 125 Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala Lys 130 135 140 Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn Glu 145 150 155 160 Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val Met 165 170 175 Ala Gln Ala Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala Ser 180 185 190 Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn Tyr 195 200 205 Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys Ile 210 215 220 Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile Lys 225 230 235 240 Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Glu 245 250 <210> 83 <211> 321 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 83 Met Val Glu Glu Ala Leu Asn Ile Phe Asp Glu Cys Arg Ser Pro Cys 1 5 10 15 Ser Leu Thr Pro Glu Pro Gly Lys Pro Ile Gln Ser Lys Leu Ser Ile 20 25 30 Pro Ser Asp Val Val Leu Asp Glu Gly Val Leu Tyr Tyr Ser Met Thr 35 40 45 Ile Asn Asp Glu Gln Asn Asp Ile Lys Asp Glu Asp Lys Gly Glu Ser 50 55 60 Ile Ile Thr Ile Gly Glu Phe Ala Thr Val Arg Ala Thr Arg His Tyr 65 70 75 80 Val Asn Gln Asp Ala Pro Phe Gly Val Ile His Leu Asp Ile Thr Thr 85 90 95 Glu Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Ser Tyr Asn Arg Lys Glu Gly Glu Phe 100 105 110 Ala Ile Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly Glu Asp Ser Pro Ala Ser Ile 115 120 125 Lys Ile Ser Val Asp Glu Leu Asp Gln Gln Arg Asn Ile Ile Glu Val 130 135 140 Pro Lys Leu Tyr Ser Ile Asp Leu Asp Asn Gln Thr Leu Glu Gln Trp 145 150 155 160 Lys Thr Gln Gly Asn Val Ser Phe Ser Val Thr Arg Pro Glu His Asn 165 170 175 Ile Ala Ile Ser Trp Pro Ser Val Ser Tyr Lys Ala Ala Gln Lys Glu 180 185 190 Gly Ser Arg His Lys Arg Trp Ala His Trp His Thr Gly Leu Ala Leu 195 200 205 Cys Trp Leu Val Pro Met Asp Ala Ile Tyr Asn Tyr Ile Thr Gln Gln 210 215 220 Asn Cys Thr Leu Gly Asp Asn Trp Phe Gly Gly Ser Tyr Glu Thr Val 225 230 235 240 Ala Gly Thr Pro Lys Val Ile Thr Val Lys Gln Gly Ile Glu Gln Lys 245 250 255 Pro Val Glu Gln Arg Ile His Phe Ser Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ser 260 265 270 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Gly Glu Gly Thr Phe 275 280 285 Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe 290 295 300 Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro 305 310 315 320 Ser <210> 84 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 84 Met Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys 1 5 10 15 Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp 20 25 30 Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met 35 40 45 Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala 50 55 60 Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val 65 70 75 80 Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly 85 90 95 Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser 100 105 110 Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser 115 120 125 His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala 130 135 140 Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn 145 150 155 160 Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val 165 170 175 Met Ala Gln Ala Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala 180 185 190 Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn 195 200 205 Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys 210 215 220 Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile 225 230 235 240 Lys Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Glu Gly 245 250 <210> 85 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> This sequence may encompass 1-15 "Gly Ser" repeating units <400> 85 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 20 25 30 <210> 86 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(45) <223> This sequence may encompass 1-15 "Gly Gly Ser" repeating units <400> 86 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 <210> 87 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(60) <223> This sequence may encompass 1-15 "Gly Gly Gly Ser" repeating units <400> 87 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 50 55 60 <210> 88 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(75) <223> This sequence may encompass 1-15 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units <400> 88 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 65 70 75 <210> 89 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(90) <223> This sequence may encompass 1-15 "Gly Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units <400> 89 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser 85 90 <210> 90 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 90 Glu Asn Leu Phe Gln Ser 1 5 <210> 91 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 91 His His His His His His 1 5 <210> 92 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 92 Ser Ile Ala Lys Gln Ser 1 5 <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 93 Ser Ile Ala Lys Gln Ser Ile Ala Lys Gln Ser 1 5 10 <210> 94 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 94 Val Val Lys Glu Ala Ile 1 5

Claims (145)

  1. 편광 상피 세포에 들어갈 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 통과세포외배출할 수 있는 담체; 및
    이종성 페이로드
    를 포함하는 조성물로서,
    이종성 페이로드 대 담체의 몰비는 1:1보다 큰 것을 특징으로 하는, 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 조성물은 전이 금속 양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 전이 금속 양이온은 Fe2+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Ni2+, 및 Cu2+로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 전이 금속 양이온은 Zn2+인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 조성물은 다중양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 다중양이온은 프로타민인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 담체는 콜릭스 폴리펩티드의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 담체는 슈도모나스 외독소 A의 일부로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  9. 제 7항에 있어서, 담체는 콜릭스 폴리펩티드의 일부로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  10. 제 8항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 206 내지 425 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  11. 제 8항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 150 내지 205 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  12. 제 8항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 150 내지 195 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  13. 제 8항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 1 내지 41 중 어느 하나에서 N-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  14. 제 8항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 35 내지 40 중 어느 하나에서 N-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  15. 제 8항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 40에서 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 150 내지 205 중 어느 하나까지 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  16. 제 8항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 150 내지 187 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  17. 제 8항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  18. 제 8항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 9 또는 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  19. 제 10항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 위치는 서열번호: 7에 제시된 서열에 대한 콜릭스 폴리펩티드의 정렬을 기반으로 번호매김되며, 여기서 아미노산 위치는 N-말단에서 위치 1부터 시작하여 N-말단에서 C-말단으로 번호매김되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  20. 제 1항에 있어서, 이종성 페이로드는 거대분자, 소분자, 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, mRNA, miRNA, shRNA, siRNA, 안티센스 분자, 항체, DNA, 플라스미드, 백신, 고분자 나노입자, 및 촉매-활성 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  21. 제 20항에 있어서, 이종성 페이로드는 치료용 페이로드인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  22. 제 1항에 있어서, 이종성 페이로드는 염료 및 방사성의약품, 호르몬, 사이토카인, 항-TNF 제제, 글루코오스 저하제, 종양 관련 항원, 펩티드, 및 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  23. 제 1항에 있어서, 이종성 페이로드는 위장관에서 염증의 조절제인 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  24. 제 1항에 있어서, 이종성 페이로드는 글루카곤-유사 펩티드-2 (GLP-2) 유사체인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  25. 제 24항에 있어서, GLP-2 유사체는 테두글루티드(Teduglutide)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  26. 제 1항에 있어서, 이종성 페이로드는 사이토카인인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  27. 제 26항에 있어서, 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, 및 IL-30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  28. 제 27항에 있어서, 사이토카인은 IL-10인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  29. 제 28항에 있어서, 사이토카인은 IL-22인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  30. 제 26항에 있어서, 사이토카인은 천연 분비 신호가 결여되어 있는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  31. 제 21항에 있어서, 치료용 페이로드는 호르몬인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  32. 제 31항에 있어서, 호르몬은 인간 성장 호르몬 (hGH)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  33. 제 1항에 있어서, 이종성 페이로드는 글로코오스-저하제인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  34. 제 1항에 있어서, 이종성 페이로드는 인크레틴(incretin), 글루카곤 프로단백질(glucagon proprotein), 글루카곤 펩티드, 글루카곤-유사 펩티드 1, 글루카곤-유사 펩티드 2, 글리센틴(glicentin), 글리센틴-관련 폴리펩티드, 위 저해 폴리펩티드 전구단백질(gastric inhibitory polypeptide preprotein), 위 저해 폴리펩티드, 디펩티딜 펩티다제 4, 글루코오스 수송체 일원(glucose transporter member) 4, 프리프로글루카곤(preproglucagon), 인슐린 수용체 기질(insulin receptor substrate) 1, 인슐린, 인슐린 유사체, 아포지질단백질(apolipoprotein) A-II, 용질 담체 계열(solute carrier family) 2, 촉진된 글루코오스 수송체 일원 1, 글리코겐 합성효소(glycogen synthase) 1, 글리코겐 합성효소 2, 티로신-단백질 포스파타제 비-수용체 유형(tyrosine-protein phosphatase non-receptor type) 1, RAC-알파 세린 트레오닌-단백질 키나제, 퍼옥시좀 증식체-활성화 수용체 감마(peroxisome proliferator-activated receptor gamma), 헥소키나제(hexokinase) 3, 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트 3-포스파타제 및 이중-특이성 단백질, 피루베이트 탈수소효소 키나제(pyruvate dehydrogenase kinase) 1, 칼슘-결합 및 꼬인-코일 (coiled-coil) 도메인-함유 단백질 1, Max-유사 단백질 X, 프룩토오스-비스포스페이트 아돌라제 A, 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체, 글루카곤-유사 펩티드 2 수용체, 위 저해 폴리펩티드 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 2 수용체, 인슐린 수용체, GLP-1 작용제-엑세나티드(agonist-exenatide), GLP-1 작용제-리라글루티드(Liraglutide), 엑세나티드, 엑센딘(exendin)-4, 엑센딘-3, GIPR 작용제 (Des-Ala2-GIP1-30), GIPR 작용제-절단된 GIP1-30, GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 1-37), GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 7-36), 릭시세나티드(lixisenatide) (상표명 Adlyxin®, 및 Lyxumia®, Sanofi), 리라글루티드 (상표명 Victoza®, Novo Nordisk A/S), 세마글루티드(semaglutide) (상표명 Ozempic®, Novo Nordisk A/S), 알비글루티드(albiglutide) (상표명 Tanzeum®, GlaxoSmithKline; 알부민에 융합된 GLP-1 이량체), 두라글루티드(dulaglutide) (상표명 Trulicity®, Eli Lilly), 글루코오스-의존적 인슐린분비성 폴리펩티드(glucose-dependent insulinotropic polypeptide), 다중-특이적 펩티드 작용제, 티르제파티드 (Tirzepatide) (Eli Lilly), SAR425899 (Sanofi), 이중 아밀린 칼시토닌 수용체 작용제(dual amylin calcitonin receptor agonist) DACRA-089, 글라진 (glargine)/Lantus®, 글루리신(glulisin)/Apidra®, 글라린(glarine)/Toujeo®, insuman®, 데테미르(detemir)/Levemir®, 리스프로(lispro)/Humalog®/Liprolog®, Degludec/DegludecPlus, 인슐린 아스파트(insulin aspart), 인슐린 및 유사체 (예를 들어, LY-2605541, LY2963016, NN1436), 페길화 인슐린 리스프로(PEGylated insulin Lispro), Humulin®, 린제타(Linjeta), SuliXen®, NN1045, 인슐린 + SymlinTM, PE0139, 급속-작용(fast-acting) 및 단기-작용(short-acting) 인슐린 (예를 들어, 린제타, PH20, NN1218, HinsBet), (APC-002) 하이드로겔, 경구, 흡입, 경피 및 설하 인슐린 (예를 들어, Exubera®, Nasulin®, Afrezza®, Tregopil®, TPM 02, 캡슐린(Capsulin), Oral-lyn®, Cobalamin®, 경구 인슐린, ORMD-0801, NN1953, NN1954, NN1956, VIAtab, 및 Oshadi 경구 인슐린), 또는 엑센딘-4 유사체이며, 여기서 엑센딘-4 유사체는 desPro36-엑센딘-4(1-39)-Lys6NH2; H-des(Pro36, 37)-엑센딘-4-Lys4-NH2; H-des(Pro36, 37)-엑센딘-4-Lys5-NH2; desPro36[Asp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14, Asp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Trp(O2) 26, Asp28]엑센딘-4 (1-39); 또는 desPro36[Trp(O2) 25, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, Asp28]엑센딘-4 (1-39); 또는 desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  35. 제 1항에 있어서, 이종성 페이로드는 인슐린 또는 인슐린 유사체인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  36. 제 1항에 있어서, 이종성 페이로드는 엑세나티드인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  37. 제 1항에 있어서, 이종성 페이로드는 형광 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  38. 제 37항에 있어서, 형광 표지는 플루오레세인인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  39. 제 38항에 있어서, 이종성 페이로드는 엑세나티드-플루오레세인 복합체인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  40. 제 1항에 있어서, 조성물은 췌장 효소에 의한 절단에 내성이 있는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  41. 제 40항에 있어서, 담체의 적어도 50%는 판크레아틴 분석에서 2시간에 온전하며, 여기서 판크레아틴 분석은 37℃에서 100 μL 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 100 μg의 담체를 포함하는 조성물과 10 μg의 판크레아틴을 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  42. 제 2항에 있어서, 전이 금속 양이온 대 담체의 몰비는 100:1 내지 300,000:1 인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  43. 제 2항에 있어서, 전이 금속 양이온 대 담체의 몰비는 1000:1 내지 30,000:1 인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  44. 제 2항에 있어서, 전이 금속 양이온 대 담체의 몰비는 1000:1 내지 10,000:1 인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  45. 제 6항에 있어서, 프로타민 대 담체의 몰비는 10:1 내지 0.01:1 인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  46. 제 1항에 있어서, 이종성 페이로드 대 담체의 몰비는 2:1 내지 6000:1 인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  47. 제 6항에 있어서, 프로타민 대 담체의 몰비는 1:1 인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  48. 제 1항에 있어서, 이종성 페이로드 대 담체의 몰비는 2:1 내지 10:1 인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  49. 제 1항에 있어서, 이종성 페이로드 대 담체의 몰비는 7:1 인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  50. 제 1항에 있어서, 이종성 페이로드 대 담체의 몰비는 7.16:1 인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  51. 제 1항에 있어서, 이종성 페이로드는 서열번호: 11 또는 서열번호: 14의 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  52. 제 1항에 있어서, 이종성 페이로드는 서열번호: 18 또는 서열번호: 19의 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  53. 제 1항에 있어서, 이종성 페이로드는 서열번호: 20의 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  54. 제 1항에 있어서, 이종성 페이로드는 서열번호: 21의 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  55. 제 1항에 있어서, 이종성 페이로드는 서열번호: 22의 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  56. 제 1항에 있어서, 조성물은 캡슐화되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  57. 제 56항에 있어서, 캡슐화된 조성물은 제 1 조건 하에서 이종성 페이로드를 방출하나, 제 2 조건 하에서는 방출하지 않도록 구성되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  58. 제 56항에 있어서, 캡슐화된 조성물은 높은 pH에서 이종성 페이로드를 방출하나, 낮은 pH에서는 방출하지 않도록 구성되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  59. 제 56항에 있어서, 캡슐화된 조성물은 장용성 코팅(enteric coating)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  60. 제 1항에 있어서, 조성물은 입자인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  61. 제 1항에 있어서, 조성물은 다중양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  62. 제 1항에 있어서, 담체는 편광 상피 세포에서 이종성 페이로드를 수송할 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 이종성 페이로드를 통과세포외배출할 수 있는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  63. 제 61항에 있어서, 담체는 다중양이온에 결합되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  64. 제 61항에 있어서, 다중양이온은 프로타민, 폴리-리신, 폴리-오르니틴 (poly-ornithine), 폴리-에틸렌-이민 (PEI), 프롤라민, 프로타민, 폴리비닐 피롤리돈 (PVP), 폴리아르기닌, 폴리비닐아민, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  65. 제 61항에 있어서, 다중양이온은 프로타민 염인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  66. 제 65항에 있어서, 프로타민 염은 프로타민 설페이트, 프로타민 아세테이트, 프로타민 브로마이드, 프로타민 클로라이드, 프로타민 카프로에이트, 프로타민 트리플루오로아세테이트, 프로타민 HCO3, 프로타민 프로피오네이트, 프로타민 락테이트, 프로타민 포르메이트, 프로타민 니트레이트, 프로타민 시트레이트, 프로타민 모노히드로겐포스페이트(protamine monohydrogenphosphate), 프로타민 디히드로겐포스페이트, 프로타민 타르트레이트, 또는 프로타민 퍼클로레이트(protamine perchlorate)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  67. 제 66항에 있어서, 프로타민 염은 프로타민 설페이트인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  68. 담체를 포함하는 조성물로서,
    담체는 편광 상피 세포에 들어갈 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 통과세포외배출할 수 있으며, 여기서 담체의 적어도 60%는 판크레아틴 분석에서 0.5시간에 온전하고, 판크레아틴 분석은 37℃에서 100 μL 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 100 μg의 담체를 포함하는 조성물과 10 μg의 판크레아틴을 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  69. 제 68항에 있어서, 담체의 적어도 90%는 판크레아틴 분석에서 2시간에 온전한 것을 특징으로 하는, 조성물.
  70. 제 68항에 있어서, 조성물은 양이온을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  71. 제 70항에 있어서, 양이온은 금속 양이온 또는 다중양이온인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  72. 제 71항에 있어서, 양이온은 금속 양이온인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  73. 제 72항에 있어서, 금속 양이온은 전이 금속 양이온인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  74. 제 68항에 있어서, 담체는 슈도모나스 외독소 A의 일부로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  75. 제 68항에 있어서, 담체는 콜릭스 폴리펩티드의 일부로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  76. 제 74항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 206 내지 425 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  77. 제 74항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 150 내지 205 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  78. 제 74항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 150 내지 195 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  79. 제 74항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 1 내지 41 중 어느 하나에서 N-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  80. 제 74항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 위치 35 내지 40 중 어느 하나에서 N-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  81. 제 74항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 40에서 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 150 내지 205 중 어느 하나까지 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  82. 제 74항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 150 내지 187 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  83. 제 74항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  84. 제 74항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 9 또는 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  85. 제 76항 내지 제 84항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 위치는 서열번호: 7에 제시된 서열에 대한 콜릭스 폴리펩티드의 정렬을 기반으로 번호매김되며, 여기서 아미노산 위치는 N-말단에서 위치 1부터 시작하여 N-말단에서 C-말단으로 번호매김되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  86. 위치 195-347에서 종료하는 콜릭스 변이체 및 이종성 페이로드를 포함하는 조성물로서, 이종성 페이로드는 글루코오스 조절제인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  87. 제 86항에 있어서, 콜릭스 변이체의 종료 위치는 서열번호: 7에 대해 결정되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  88. 제 86항에 있어서, 담체는 편광 상피 세포를 가로질러 이종성 페이로드를 통과세포외배출할 수 있는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  89. 제 86항에 있어서, 글루코오스 조절제는 글로코오스-저하제인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  90. 제 89항에 있어서, 글로코오스-저하제는 인크레틴, 글루카곤 프로단백질, 글루카곤 펩티드, 글루카곤-유사 펩티드 1, 글루카곤-유사 펩티드 2, 글리센틴, 글리센틴-관련 폴리펩티드, 위 저해 폴리펩티드 전구단백질, 위 저해 폴리펩티드, 디펩티딜 펩티다제 4, 글루코오스 수송체 일원 4, 프리프로글루카곤, 인슐린 수용체 기질 1, 인슐린, 인슐린 유사체, 아포지질단백질 A-II, 용질 담체 계열 2, 촉진된 글루코오스 수송체 일원 1, 글리코겐 합성효소 1, 글리코겐 합성효소 2, 티로신-단백질 포스파타제 비-수용체 유형 1, RAC-알파 세린 트레오닌-단백질 키나제, 퍼옥시좀 증식체-활성화 수용체 감마, 헥소키나제 3, 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트 3-포스파타제 및 이중-특이성 단백질, 피루베이트 탈수소효소 키나제 1, 칼슘-결합 및 꼬인-코일 도메인-함유 단백질 1, Max-유사 단백질 X, 프룩토오스-비스포스페이트 아돌라제 A, 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체, 글루카곤-유사 펩티드 2 수용체, 위 저해 폴리펩티드 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 2 수용체, 인슐린 수용체, GLP-1 작용제-엑세나티드, GLP-1 작용제-리라글루티드, 엑세나티드, 엑센딘-4, 엑센딘-3, GIPR 작용제 (Des-Ala2-GIP1-30), GIPR 작용제-절단된 GIP1-30, GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 1-37), GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 7-36), 릭시세나티드 (상표명 Adlyxin®, 및 Lyxumia®, Sanofi), 리라글루티드 (상표명 Victoza®, Novo Nordisk A/S), 세마글루티드 (상표명 Ozempic®, Novo Nordisk A/S), 알비글루티드 (상표명 Tanzeum®, GlaxoSmithKline; 알부민에 융합된 GLP-1 이량체), 두라글루티드 (상표명 Trulicity®, Eli Lilly), 글루코오스-의존적 인슐린분비성 폴리펩티드, 다중-특이적 펩티드 작용제, 티르제파티드 (Eli Lilly), SAR425899 (Sanofi), 이중 아밀린 칼시토닌 수용체 작용제 DACRA-089, 글라진/Lantus®, 글루리신/Apidra®, 글라린/Toujeo®, insuman®, 데테미르/Levemir®, 리스프로/Humalog®/Liprolog®, Degludec/DegludecPlus, 인슐린 아스파트, 인슐린 및 유사체 (예를 들어, LY-2605541, LY2963016, NN1436), 페길화 인슐린 리스프로, Humulin®, 린제타, SuliXen®, NN1045, 인슐린 + SymlinTM, PE0139, 급속-작용 및 단기-작용 인슐린 (예를 들어, 린제타, PH20, NN1218, HinsBet), (APC-002) 하이드로겔, 경구, 흡입, 경피 및 설하 인슐린 (예를 들어, Exubera®, Nasulin®, Afrezza®, Tregopil®, TPM 02, 캡슐린, Oral-lyn®, Cobalamin®, 경구 인슐린, ORMD-0801, NN1953, NN1954, NN1956, VIAtab, 및 Oshadi 경구 인슐린), 또는 엑센딘-4 유사체이며, 여기서 엑센딘-4 유사체는 desPro36-엑센딘-4(1-39)-Lys6NH2; H-des(Pro36, 37)-엑센딘-4-Lys4-NH2; H-des(Pro36, 37)-엑센딘-4-Lys5-NH2; desPro36[Asp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14, Asp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Trp(O2) 26, Asp28]엑센딘-4 (1-39); 또는 desPro36[Trp(O2) 25, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39); desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, Asp28]엑센딘-4 (1-39); 또는 desPro36[Met(O)14 Trp(O2)25, IsoAsp28]엑센딘-4 (1-39)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  91. 제 86항에 있어서, 이종성 페이로드는 인크레틴을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  92. 제 86항에 있어서, 이종성 페이로드는 엑세나티드 또는 인슐린을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  93. 제 86항에 있어서, 조성물은 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  94. 제 86항에 있어서, 이종성 페이로드는 엑센딘-3, 에페글레나티드 (efpeglenatide), 세마글루티드, GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 1-37), GLP-1R 작용제 (GIP의 aa 7-36), 티르제파티드, 옥시토모듈린(oxyntomodulin), GIPR 작용제-절단된 GIP1-30, 이중 아밀린 칼시토닌 수용체 작용제, 프리프로인슐린, 인슐린 아스파트, 인슐린 글라진, 또는 인슐린 리스프로인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  95. 편광 상피 세포에 들어갈 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 통과세포외배출할 수 있는 박테리아 독소로부터 유래된 담체; 및
    전이 금속 양이온 또는 다중양이온
    을 포함하는 조성물로서,
    다중양이온은 2 이상의 양전하를 갖는 분자 또는 화학적 복합체인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  96. 제 95항에 있어서, 조성물은 전이 금속 양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  97. 제 96항에 있어서, 전이 금속 양이온은 Fe2+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Ni2+, 및 Cu2+로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  98. 제 95항에 있어서, 전이 금속 양이온은 Zn2+인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  99. 제 95항에 있어서, 조성물은 다중양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  100. 제 99항에 있어서, 다중양이온은 프로타민, 폴리-리신, 폴리-오르니틴, 폴리-에틸렌-이민 (PEI), 프롤라민, 프로타민, 폴리비닐 피롤리돈 (PVP), 폴리아르기닌, 폴리비닐아민, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  101. 제 99항에 있어서, 다중양이온은 프로타민 염인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  102. 제 99항에 있어서, 프로타민 염은 프로타민 설페이트, 프로타민 아세테이트, 프로타민 브로마이드, 프로타민 클로라이드, 프로타민 카프로에이트, 프로타민 트리플루오로아세테이트, 프로타민 HCO3, 프로타민 프로피오네이트, 프로타민 락테이트, 프로타민 포르메이트, 프로타민 니트레이트, 프로타민 시트레이트, 프로타민 모노히드로겐포스페이트, 프로타민 디히드로겐포스페이트, 프로타민 타르트레이트, 또는 프로타민 퍼클로레이트인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  103. 제 99항에 있어서, 프로타민 염은 프로타민 설페이트인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  104. 제 95항에 있어서, 조성물은 이종성 페이로드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  105. 제 103항에 있어서, 이종성 페이로드는 엑세나티드, 인슐린, 또는 인간 성장 호르몬을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  106. 제 95항에 있어서, 담체는 슈도모나스 외독소 A 또는 슈도모나스 외독소 A의 일부로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  107. 제 104항에 있어서, 담체는 서열번호: 69의 폴리펩티드 또는 서열번호: 69의 일부로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  108. 제 95항에 있어서, 담체는 콜릭스 폴리펩티드의 일부로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  109. 제 95항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 위치 206 내지 425 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  110. 제 95항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 위치 150 내지 205 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  111. 제 95항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 위치 150 내지 195 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  112. 제 95항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 위치 1 내지 41 중 어느 하나에서 N-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  113. 제 95항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 위치 35 내지 40 중 어느 하나에서 N-말단을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  114. 제 95항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 40에서 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 150 내지 205 중 어느 하나까지 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  115. 제 95항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 7에 제시된 서열의 아미노산 위치 150 내지 187 중 어느 하나에서 C-말단을 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  116. 제 95항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  117. 제 95항에 있어서, 콜릭스 폴리펩티드는 서열번호: 9 또는 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  118. 제 107항 내지 제 115항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 위치는 서열번호: 7에 제시된 서열에 대한 콜릭스 폴리펩티드의 정렬을 기반으로 번호매김되며, 여기서 아미노산 위치는 N-말단에서 위치 1부터 시작하여 N-말단에서 C-말단으로 번호매김되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  119. 제 95항에 있어서, 조성물은 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  120. 인슐린을 포함하는 조성물로서, 인슐린의 적어도 20%는 37℃에서 PBS에서 인슐린을 포함하는 조성물과 판크레아틴을 배양하는 단계를 포함하는 판크레아틴 분석에서 1시간에 온전한 것을 특징으로 하는, 조성물.
  121. 제 118항에 있어서, 조성물은 박테리아 독소로부터 유래된 담체를 더 포함하며, 여기서 담체는 편광 상피 세포 내로 수송할 수 있거나 또는 편광 상피 세포를 가로질러 통과세포외배출할 수 있는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  122. 제 119항에 있어서, 담체는 콜릭스 폴리펩티드의 일부로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
  123. 제 118항에 있어서, 조성물은 전이 금속 양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  124. 제 121항에 있어서, 전이 금속 양이온은 Fe2+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Ni2+, 및 Cu2+로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  125. 제 121항에 있어서, 전이 금속 양이온은 Zn2+인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  126. 제 118항에 있어서, 조성물은 다중양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  127. 제 125항에 있어서, 다중양이온은 프로타민인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  128. 제 1항 내지 제 125항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  129. 제 126항에 있어서, 입자는 미세입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  130. 제 127항에 있어서, 미세입자는 분무 건조에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  131. 제 126항에 있어서, 입자는 50 nm 내지 20 μm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  132. 제 1항 내지 제 129항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 약학 조성물.
  133. 제 1항 내지 제 129항 중 어느 한 항의 조성물 및 보존제를 포함하는 약학 조성물.
  134. 제 1항 내지 제 130항 중 어느 한 항의 조성물 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  135. 제 130항 내지 제 132항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  136. 제 133항에 있어서, 피험자는 염증성 질환, 자가면역 질환, 암, 또는 대사성 장애를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  137. 제 134항에 있어서, 피험자는 대사성 장애를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  138. 제 135항에 있어서, 대사성 장애는 당뇨병, 비만으로 인한 당뇨병, 고혈당증, 이상지질혈증(dyslipidemia), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), X 증후군, 인슐린 저항성, 내당능 장애(impaired glucose tolerance, IGT), 당뇨병성 이상지질혈증, 고지혈증, 지방간 질환, 비알콜성 지방간염(nonalcoholic steatohepatitis, NASH), 간염, 비만, 혈관 질환(vascular disease), 심장 질환, 뇌졸중, 공복 혈당 상승, 요로 알부민 분비(urinary albumin secretion), 중심성 비만(central obesity), 고혈압, 중성지방 상승, LDL 콜레스테롤 상승 및 HDL 콜레스테롤 감소, 고인슐린혈증(hyperinsulinemia), 케톤증(ketosis), 공복 혈당 장애 (impaired fasting glucose), 글루코오스신생합성(gluconeogenesis), 과잉 글리코겐분해(excess glycogenolysis), 당뇨병성 케톤산증(diabetic ketoacidosis), 당뇨병성 신증(diabetic nephropathy), 신기능부전(renal insufficiency), 신부전 (renal failure), 과식증(hyperphagia), 근육 소모, 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 당뇨병성 혼수(diabetic coma), 동맥경화증, 관상 동맥성 심장 질환(coronary heart disease), 또는 말초 동맥 질환(peripheral artery disease)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  139. 박테리아 유래 담체를 이종성 페이로드 및 양이온과 조합하여 입자를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  140. 제 137항에 있어서, 이종성 페이로드는 염료, 방사성의약품, 호르몬, 사이토카인, 항-TNF 제제, 글루코오스 저하제, 종양 관련 항원, 펩티드, 및 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  141. 제 137항에 있어서, 방법은 박테리아 유래 담체, 이종성 페이로드 및 양이온을 분무 건조하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  142. 제 137항에 있어서, 방법은 (a) 분리된 담체 및 페이로드를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; (b) 프로타민 설페이트 및 NaPO4를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; 및 (c) (a)의 혼합물을 (b)의 혼합물에 합하고 합한 혼합물을 실온에서 밤새도록 두는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  143. 제 140항에 있어서, 방법은 단계 (d) 단계 (c)로부터의 합한 혼합물의 이온 강도를 증가시킴으로써 단계 (c)로부터의 입자를 더 작은 입자로 파괴하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  144. 제 140항에 있어서, 단계 (a)의 제조는 ZnCl2를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
  145. 제 140항에 있어서, 단계 (a)의 제조는 ZnCl2를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
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