TW202112404A - 骨替代材料之膠原蛋白基質或顆粒摻合物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於： -  一種特定地用作骨泥、條帶或塞之膠原蛋白基質，其包含雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料之粒子，該等粒子包含經燒結CAP核心及沈積於該經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之封閉磊晶生長層，藉此該等磊晶生長之奈米晶體具有與人類骨礦物質相同之大小及形態，其中沈積於該經燒結CAP核心之該外表面上之奈米結晶HAP之該封閉磊晶生長層具有包含片狀晶體薄片之均質粗糙外表面， -  一種用於製備該膠原蛋白基質之方法，及 -  一種包含此一雙相骨材料之粒子的顆粒摻合物。

Description

骨替代材料之膠原蛋白基質或顆粒摻合物
本發明係關於特定地用作骨泥、條帶或塞(例如，口腔用塞)材料之新的膠原蛋白基質，其包含具有基於磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)且具有均質外表面之雙層結構的雙相骨替代材料之粒子；製備該膠原蛋白基質之方法以及包含此一雙相骨材料粒子之新顆粒摻合物。
在醫學領域、特別地在骨科領域中，骨泥通常定義為具有類似橡皮泥之稠度並具有適宜可模製性及黏結特性之複合物。骨泥材料可易於手動成型且一旦外力去除，維持其形狀。
條帶通常定義為撓性且形狀穩定之材料，其可配合移植部位之解剖學曲率。條帶可經壓縮及摺疊，但一旦去除外力，其便恢復其初始形狀。
塞通常定義為具有不同尺寸之圓柱形或圓錐形材料。該材料具有撓性且可經壓縮，但一旦去除外力，其便恢復其初始形狀。口腔用塞係可用於口腔中之塞。其特別地可在拔牙後用於填充孔或空腔(齒槽)。
骨結構中之缺損係在各種情況下(例如創傷、疾病及外科手術)出現，且在各外科領域中仍需要有效的修復骨缺損。
已使用眾多天然及合成材料及組合物刺激骨缺損位點之癒合。促進牙周及顎面骨缺損中之骨生長之熟知天然骨傳導性骨替代材料係可自Geistlich Pharma AG商業購得之Geistlich Bio-Oss®。該材料係藉由美國專利第5,167,961號中所述之方法自天然骨製造，其能夠保留天然骨之小樑架構及奈米結晶結構，從而獲得不被吸收或吸收極緩慢之優良骨傳導性基質。
磷酸三鈣/羥磷灰石(TCP/HAP)系統及其作為骨替代材料之用途闡述於例如US-6,338,752，其揭示藉由在1200-1500℃下加熱磷酸銨及HAP之粉末混合物製備α-TCP/HAP之雙相水泥之方法。
歐洲專利EP-285826闡述在金屬及非金屬體上產生HAP層用於植入物之方法，該方法係藉由施加α-TCP層並藉由與pH 2至7之水在80-100℃下反應將α-TCP層完全轉化為HAP來實施。所獲得之產物係覆蓋有HAP層之金屬或非金屬體。
WO 97/41273闡述一種利用碳酸化羥磷灰石(即，其中磷酸根及/或氫氧根離子部分地由碳酸氫根離子替代之羥磷灰石)之塗層塗覆基材、例如尤其羥磷灰石(HAP)或其他磷酸鈣(CAP)之方法，其係藉由包含以下之方法實施：(a) 在低於50℃之溫度下將基材浸沒於pH 6.8至8.0且含有鈣離子、磷酸根離子及碳酸氫根離子之溶液中，(b) 將與基材接觸之溶液部分加熱至50至80℃之溫度，直至pH大於8為止，(c) 維持基材與步驟(b)中所獲得鹼性溶液之接觸，以形成碳酸化羥磷灰石塗層，(d) 將基材自溶液取出並使塗層經受乾燥。據揭示，碳酸氫根離子係充當羥磷灰石晶體生長之抑制劑，此導致含有缺陷且具有相當小尺寸(即，長度為10-40 nm且寬度為3-10 nm)之非化學計量晶體(參見第7頁第1-7列)。
磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)系統、尤其TCP/HAP系統之複合物在其熱力學穩定性方面不同。由於此差異，當CAP/HAP系統植入哺乳動物、特定地人類患者中時，TCP及其他磷酸鈣在體液中之溶解度高於HAP之溶解度。磷酸鈣與HAP間之溶解度差異導致CAP/HAP系統之無序燒結結構破壞，此乃因可溶性更佳之化合物CAP (例如TCP)較HAP更快地去除。在高溫下產生之CAP與HAP之間之燒結互連亦將對裝置在生理環境中之較高溶解度做出顯著貢獻。兩種不同類型之反應主導此類陶瓷在活體內之加速降解：化學溶解及細胞之生物吸收。兩個過程均導致陶瓷材料溶解，此進而導致鈣離子之局部過飽和，由此釋放之鈣離子多於吸附之鈣離子。在細胞外基質中及植入物周圍之組織中不再存在鈣離子之天然平衡。就鈣離子之過飽和而言，天然鈣平衡之局部擾動導致增加之破骨細胞活性且因此陶瓷材料之加速失控吸收及不良發炎反應之風險，尤其當使用大量合成骨替代材料時。
當將骨替代材料Geistlich Bio-Oss®植入人類患者時，天然鈣平衡實際上不會受到影響，鈣離子在材料表面上及其局部環境內之濃度幾乎保持恆定。因此，材料之生物吸收不會發生或以極緩慢速率進行，而沒有不利發炎反應之風險。
EP-B1-2445543揭示高度有利之磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料，其類似於骨替代材料Geistlich Bio-Oss®，在活體內凝固後，可使鈣離子在材料表面上及其局部環境內之濃度幾乎保持恆定且因此不會導致破骨細胞活性增加。
實際上，最佳骨再生所必需之天然鈣平衡不會被擾動或破壞。此外，天然鈣濃度平衡由骨骼替代材料持久地支撐，直至再生過程完成。當滿足彼等條件時，破骨細胞活性沒有增加，因此沒有發生不良發炎反應之風險。
EP-B1-2445543之發明係關於雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料，其包含經燒結CAP核心及沈積於該經燒結CAP核心之頂部上之奈米結晶HAP之至少一個均勻且封閉磊晶生長層(closed epitactically grown layer)，藉此磊晶生長之奈米晶體具有與人類骨礦物質相同之大小及形態，即，30至46 nm之長度及14至22 nm之寬度。
經燒結CAP核心可包含磷酸三鈣(TCP)、尤其α-TCP (α-Ca3 (PO4 )2 )或β-TCP (β-Ca3 (PO4 )2 )及/或磷酸四鈣(TTCP) Ca4 (PO4 )2 O。
根據經常使用之實施例，經燒結CAP核心基本上由TCP組成，α-TCP係較佳的。
奈米結晶HAP之磊晶生長層在結構上且化學上與天然人類骨礦物質幾乎相同。
奈米結晶HAP之磊晶生長層通常具有至少15至50 nm、較佳至少20至40 nm、更佳至少25至35 nm之厚度。最小厚度在磊晶定向上相當於一個HAP奈米晶體層。
奈米結晶HAP之磊晶生長層可包含在磊晶定向上之單一或多個HAP奈米晶體層。奈米結晶HAP之磊晶生長層之厚度(其與磊晶定向上之HAP奈米晶體之該等層的數量有關)應根據骨替代材料作為植入物或假體在身體之不同負重部位的預期應用來選擇。實際上，該發明之骨替代材料經設計以在活體內如類活體系統一樣起作用以將經燒結CAP核心逐漸轉變為大小及形態與人類骨礦物質相似之羥磷灰石，該轉變速率取決於經燒結CAP核心釋放鈣之速率，而鈣釋放速率在很大程度上受奈米結晶HAP之磊晶生長層之厚度控制。
CAP/HAP骨替代材料之性質在很大程度上受結晶HAP之磊晶生長層之厚度控制。術語「性質」包括在活體外及活體內CAP/HAP骨替代物釋放恆定濃度之鈣離子至局部環境之能力。
奈米結晶HAP之磊晶生長層之厚度與經燒結CAP核心材料對HAP之比率相關，該比率通常在5:95與95:5之間、較佳10:90至90:10。
CAP/HAP骨替代材料可為具有期望大小及形狀之微粒或顆粒、粒子或細粒。通常，粒子或細粒係近似球形且具有250至5000 µm之直徑。
CAP/HAP骨替代材料亦可為成型體，例如，骨螺釘、骨釘、骨針或具有骨質身體部位(例如特別地髖、鎖骨、肋骨、下頜骨或顱骨部分)輪廓之結構。此一骨螺釘、骨釘或骨針可用於重建矯形外科以將韌帶固定於骨，例如在膝或肘中。具有骨質身體部位輪廓之此一結構可作為假體用於矯形外科以替換缺失或有缺陷之骨或骨部分。
EP-B1-2445543之該CAP/HAP骨替代材料經教示係藉由包含以下步驟之方法獲得 a)     製備經燒結CAP核心材料， b)     在10℃與50℃之間之溫度下將經燒結CAP核心材料浸沒於水溶液中，以開始CAP至HAP之轉變製程，由此在經燒結CAP核心材料表面上形成奈米結晶羥磷灰石之均勻且封閉磊晶生長層，該磊晶生長之奈米晶體具有與人類骨礦物質相同之大小及形態， c)     在存在HAP之至少一個奈米結晶層之均勻且封閉塗層時、但在轉變製程完全完成之前，藉由將固體材料與水溶液分離來停止轉變， d)     視情況將來自步驟c)之經分離材料進行滅菌。
經燒結CAP核心材料之製備可藉由此項技術中已知之方法實施，其包含首先混合磷酸氫鈣(CaHPO4 )、碳酸鈣及/或氫氧化鈣之粉末，然後將混合物在適當溫度範圍內煅燒並燒結，由此獲得塊體經燒結CAP核心材料(例如，參見Mathew M.等人，1977, Acta. Cryst. B33: 1325；Dickens B.等人，1974, J. Solid State Chemistry 10, 232；及Durucan C.等人，2002, J. Mat. Sci., 37:963) 。
由此可藉由以下獲得塊體經燒結TCP核心材料：以化學計量比率混合磷酸氫鈣(CaHPO4 )、碳酸鈣及/或氫氧化鈣之粉末，將混合物在1200-1450℃之範圍內、較佳約1400℃之溫度下煅燒及燒結。
塊體經燒結TTCP核心材料亦可藉由上述方法獲得。
藉由該等方法製備之塊體經燒結CAP材料可係多孔的，其具有2至80 vol%之孔隙度及寬孔分佈。孔隙度參數應根據CAP/HAP骨替代材料之預期應用選擇。
用於步驟b)中之經燒結CAP核心材料可為 - 如上所述製備之塊體經燒結CAP核心材料， - 藉由使用習用方法(例如壓碎、碾磨及/或研磨及篩選)自如上所述製備之塊體經燒結CAP核心材料獲得之經燒結CAP核心材料之微粒或顆粒，或 - 具有期望形狀及大小之經燒結CAP核心材料之預成形物，例如骨螺釘、骨釘、骨針或具有骨質身體部位之輪廓的結構。
任何期望形狀及大小之此一預成形物可自如上所述製備之塊體經燒結核心材料藉由使用熟知之原型設計技術(例如CNC銑削或3D打印)獲得(例如，參見Bartolo P.等人，2008, Bio-Materials and Prototyping Applications in Medicine, Springer Science New York, ISBN 978-0-387-47682-7；Landers R.等人，2002, Biomaterials 23(23), 4437；Yeong W.-Y.等人，2004, Trends in Biotechnology, 22 (12), 643；及Seitz H.等人，2005, Biomed. Mater. Res. 74B (2), 782)。
步驟b)之水溶液經教示係純水、模擬體液或緩衝液。重要的是，步驟b)之浸沒溶液的pH值幾乎為中性且在整個轉變製程期間保持穩定，較佳在5.5至9.0之pH範圍內。
術語「模擬體液」係指模擬體液之任何溶液。較佳地，模擬體液具有類似於血漿之離子濃度。
緩衝液可為在以上pH範圍內之任何緩衝液，但較佳為具有或不具有鈣、鎂及/或鈉之磷酸鹽緩衝液。
實例中所用之緩衝液(參見實例4及5)係水性磷酸鹽緩衝液。
步驟b)中之溫度範圍通常在10℃與50℃之間、較佳在25℃與45℃之間、更佳在35℃與40℃之間。
浸沒步驟b)在第一階段中誘導CAP核心材料之一階相變且因此誘導HAP奈米晶體前體之成核。在第二階段期間，來自第一階段之所得HAP前體將生長並建立封閉(即，完全塗覆)之磊晶奈米結晶複合層。第一HAP奈米晶體層必須均勻並封閉，並磊晶地(epitaxially)連接至經燒結CAP核心材料。
在第三階段期間，一階相變可在新形成之雙層複合材料內繼續進行以使經燒結CAP核心材料(TCP或TTCP)進一步轉變為奈米結晶HAP。在此相變之第三步驟期間，鈣離子將藉由緩慢擴散控制過程釋放達可控時間，直至經燒結CAP核心材料之一部分已轉變成奈米結晶HAP為止。HAP層之厚度且因此鈣釋放之速率可藉由轉變時間之變化來控制。
適當厚度之磊晶生長之奈米結晶HAP層將在活體外製備，CAP至HAP之轉變在其完成前停止。
一旦將CAP/HAP骨替代材料設置於活體內，CAP至HAP之轉變製程將藉由與體液接觸而重新激活且骨替代材料將如類活體系統一樣起作用，以形成大小及形態類似於人類骨礦物質之新羥磷灰石。在活體內相轉變製程期間，輸送之鈣離子將釋放至局部環境中以支撐局部鈣平衡，此對於骨再生過程係重要且有益的。
由於在身體之不同負重區域中骨缺損之再生時間不同，因此重要的是可控制鈣釋放之速率。此可藉由改變羥磷灰石之磊晶生長層之厚度來達成。
因此，步驟c)係極關鍵之步驟。在步驟b)之水溶液中之暴露時間係基於所期望HAP層之厚度。在磊晶定向上有至少一個奈米結晶HAP層係必需的。至關重要的是，CAP至HAP之轉變沒有完成。
根據期望厚度之適當暴露時間可藉由使用熟習磷酸鈣、水泥及混凝土化學領域之技術者熟知之若干熱力學微分方程式來計算。
參見例如：Pommersheim, J.C.；Clifton, J.R. (1979) Cem. Conc. Res.；9:765；Pommersheim, J.C.；Clifton, J.R. (1982) Cem. Conc. Res.；12:765；及Schlüssler, K.H. Mcedlov-Petrosjan, O.P.；(1990): Der Baustoff Beton, VEB Verlag Bauwesen, Berlin。
將上述微分方程式之解轉移至CAP/HAP系統使得能夠預測CAP至HAP之相變及層厚度，使得可以穩定及可再現方式製備HAP之磊晶層。
在步驟c)結束時將固體材料自水溶液分離通常使用此項技術中熟知之技術藉由過濾、洗滌並乾燥來實施。
在EP-B1-2445543之實例(即，實例4 [0057]及實例5 [0058])中，洗滌係藉由用純化水將骨替代物之經分離細粒洗滌3次以去除來自緩衝溶液之殘餘物來實施。
可選滅菌步驟d)可藉由此項技術中熟知之技術(例如γ-輻照或X-射線輻射)來實施。
如EP-B1-2445543之實例4及5中所教示，在步驟c)結束時使用用於步驟b)之水溶液之水性磷酸鹽緩衝液及純化水將經分離細粒洗滌3次，獲得包含經燒結CAP核心及沈積於經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之封閉磊晶生長層之雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料，由此磊晶生長之奈米晶體具有與人類骨礦物質相同之大小及形態，其中沈積於經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之封閉磊晶生長層具有非均質外表面，其包含由磊晶生長之HAP奈米晶體組成之片狀晶體薄片之個別(分離的)簇及在片狀晶體薄片之個別簇之間之平滑區，由在片狀晶體薄片之個別簇之間之平滑區所佔據之外表面%取決於在既定轉變條件下之轉變時間。
參見圖1A，其代表轉變時間為30 min之原型1 (1-2 mm細粒)之SEM (掃描電子顯微術)照片，其中平滑區代表總外表面之約70%，如藉由SEM所量測；及圖1B，其代表轉變時間為40 min之原型2 (1-2 mm細粒)的SEM照片，其中平滑區代表總外表面之約50%，如藉由SEM所量測。
WO 2015/009154揭示生產具有經改良骨誘導能力之骨傳導材料的方法，該方法包含在2-4巴(bar)之壓力下在等於或高於125℃之溫度下且在不控制pH之情形下，使具有由晶粒組成之表面形貌的經燒結雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)材料經受水熱處理達足以使起始材料表面上之磷酸鈣晶粒變為直徑10-1500 nm之磷酸鈣針之持續時間。至少125℃之溫度及至少2巴之壓力與EP-B1-2445543中所用使得HAP奈米晶體能夠磊晶生長之(接近人體生理)條件(溫度35-40℃、pH 5.5-9.0、環境壓力)相距甚遠。彼等針並非磊晶生長，而是附接至或沈積於核心材料上且僅部分地(通常40-90%)塗覆核心材料，藉此增加其比表面及容納蛋白質之能力，由此增強其骨誘導潛力。
國際專利申請案第PCT/EP2018/084783號之發明者發現，在根據EP-B1-2445543製備雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料時，藉由添加10至90%、較佳20至60%之短鏈脂肪族醇(包括(但不限於)甲醇、乙醇、丙醇或丁醇)至步驟b)之水性磷酸鹽緩衝液中，沈積於經燒結CAP核心雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料之外表面上之奈米結晶HAP之封閉磊晶生長層的非均質外表面(包含片狀晶體薄片之個別簇及在其間之平滑區)由包含片狀晶體薄片而無片狀晶體薄片之任何個別晶體簇之均質粗糙外表面替換。該均質粗糙外表面通常包含形成薄片之互鎖網路之磊晶生長奈米結晶羥磷灰石薄片，其中個別薄片大小為0.2 µm至20 µm、較佳為0.5至5 µm，如藉由SEM所測定，此取決於所用脂肪族醇之量。
如由人類胎兒間質幹細胞(hMSC)之骨原性分化的活體外測試所示，具有包含片狀晶體薄片之均質粗糙外表面的雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料之活體內骨原性反應可能強於由EP-B1-2445543所教示具有包含片狀晶體薄片之個別簇及其間之平滑區之均質外表面之雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料。
因此，國際專利申請案第PCT/EP2018/084783號之發明係關於包含經燒結CAP核心及沈積於經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之磊晶生長層之雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料，藉此磊晶生長之奈米晶體具有與人類骨礦物質相同之大小及形態，其中沈積於經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之封閉磊晶生長層具有包含片狀晶體薄片之均質粗糙外表面。
該雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料顯示人類胎兒間質幹細胞(hMSC)之增加的骨原性分化，此係增強之活體內骨原性反應的強烈指示。
術語「沈積於經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之封閉磊晶生長層」意指奈米結晶HAP之磊晶生長層完全覆蓋經燒結CAP核心之整個外表面。
術語「包含片狀晶體薄片之均質粗糙外表面」意指宏觀上由片狀晶體薄片造成之外表面之粗粒度統計上均勻地分佈於CAP核心之表面上，而沒有片狀晶體薄片之個別晶體簇。參見圖2，其代表具有均質粗糙外表面以及不同粗粒度之本發明雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料之原型3至7的SEM照片。
術語「片狀晶體薄片」意指關於三個垂直方向，高度(厚度)明顯小於寬度及長度的晶體組裝體。該等片狀晶體薄片在圖3B中清晰可見。
通常，均質粗糙外表面包含形成薄片之互鎖網路之磊晶生長的奈米結晶羥磷灰石薄片，其大小(寬度及長度)為0.2 µm至20 µm，如藉由SEM所測定。薄片之大小越大，外表面之粗粒度越高。
較佳地，均質粗糙外表面包含形成薄片之互鎖網路之磊晶生長之奈米結晶羥磷灰石薄片，其大小為0.5至5 µm，如藉由SEM所測定。
通常，該均質粗糙外表面包含磊晶生長之羥磷灰石薄片，其形成互鎖網路且含有介於0.03 µm與2 µm之間之孔，如藉由壓汞法(MIP)所測定。在0.03 µm與2 µm間之孔的體積越高，外表面之粗粒度越高。
通常，該均質粗糙外表面可由AFM (原子力顯微術)表徵，其中AFM源均方根粗糙度(Rq )在50 nm至400 nm之範圍內且輪廓之平均最大高度(Rz )在500 nm至2000 nm之範圍內。
較佳地，均質粗糙外表面之特徵可在於在110至150 nm範圍內之AFM源均方根粗糙度(Rq )及在550至750 nm範圍內之輪廓之平均最大高度(Rz )。
通常，雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料中之HAP百分比係1至90%，如藉由XRD所量測。
較佳地，該百分比係1.5至30%、更佳2至15%，如藉由XRD所量測。
經燒結CAP核心包含磷酸三鈣(TCP)、尤其α-TCP (α-Ca3 (PO4 )2 )或β-TCP (β-Ca3 (PO4 )2 )、及/或磷酸四鈣(TTCP) Ca4 (PO4 )2 O。
根據經常使用之實施例，經燒結CAP核心基本上由TCP組成，α-TCP係較佳的。
奈米結晶HAP之磊晶生長層在結構上幾乎與天然人類骨礦物質相同。
CAP/HAP骨替代材料可為具有期望大小及形狀之微粒或顆粒、粒子或細粒。通常，粒子或細粒具有250至5000 µm、較佳1000至2000 µm之大小。
CAP/HAP骨替代材料亦可為成型體，例如，骨螺釘、骨釘、骨針或具有骨質身體部位(例如特別地髖、鎖骨、肋骨、下頜骨或顱骨部分)輪廓之結構。此一骨螺釘、骨釘或骨針可用於重建矯形外科以將韌帶固定於骨，例如在膝或肘中。具有骨質身體部位輪廓之此一結構可作為假體用於矯形外科以替換缺失或有缺陷之骨或骨部分。
所述國際專利申請案之發明亦係關於骨泥，其在適宜基質(通常包含天然或合成聚合物)中包含上文所定義CAP/HAP骨替代物之粒子或細粒。通常，粒子或細粒具有250至5000 µm、較佳1000至2000 µm之大小。
國際專利申請案第PCT/EP2018/084783號之發明進一步係關於製備以上所定義CAP/HAP骨替代材料之方法，其包含以下步驟 a)     製備經燒結CAP核心材料， b)     在10℃與50℃之間之溫度下將經燒結CAP核心材料浸沒於含有10至90%短鏈脂肪族醇之緩衝溶液中，以開始CAP至HAP之轉變製程，由此將在經燒結CAP核心材料表面上形成奈米結晶羥磷灰石之封閉磊晶生長層，由此該磊晶生長之奈米晶體具有與人類骨礦物質相同之大小及形態，其中形成於經燒結CAP核心材料表面上之該奈米結晶HAP之封閉磊晶生長層具有包含片狀晶體薄片之均質外表面， c)     在存在HAP之至少一個奈米結晶層之封閉塗層時、但在轉變製程完全完成之前，藉由將固體材料與水溶液分離來停止轉變，及 d)     視情況將來自步驟c)之經分離材料進行滅菌。
適宜短鏈脂肪族醇可選自由以下組成之群：甲醇、乙醇、丙醇及丁醇。
較佳地，短鏈脂肪族醇係乙醇。
較佳地，步驟b)之緩衝溶液含有20至60%、更佳30至50%之短鏈脂肪族醇。
沈積於經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之封閉磊晶生長層之均質粗糙外表面的粗粒度參數、特別地 -  AFM參數：AFM源均方根粗糙度(Rq )及輪廓之平均最大高度(Rz )， -  磊晶生長之奈米結晶羥磷灰石薄片的大小，如藉由SEM所測定，及 -  在0.03 µm與2 µm間之孔的體積，如藉由MIP所測定 可便捷地藉由改變轉變溶液之緩衝溶液中短鏈脂肪族醇之百分比來調整。
該百分比越高，AFM源均方根粗糙度(Rq )及輪廓之平均最大高度(Rz )越低，磊晶生長之奈米結晶羥磷灰石薄片之大小越小(如藉由SEM所測定)，且在0.03 µm與2 µm間之孔的體積越小(如藉由MIP所測定)。
含有10至90%短鏈脂肪族醇之步驟b)的緩衝溶液係藉由將水性緩衝溶液與不同量之短鏈脂肪族醇混合獲得。水性緩衝溶液經選擇，使得進一步含有10至90%短鏈脂肪族醇之步驟b)之浸沒溶液的pH值幾乎為中性且在整個轉變製程期間保持穩定、較佳在5.5至9.0、更佳7.0至8.0之pH範圍內。
緩衝液可為在以上pH範圍內之任何緩衝液，但較佳為具有或不具有鈣、鎂及/或鈉之磷酸鹽緩衝液。
適宜緩衝溶液係(例如) pH值為7.3至7.6之磷酸二氫鈉(NaH2 PO4 )之0.05-0.3 M水溶液。
步驟b)中之溫度範圍通常在10℃與50℃之間、較佳在25℃與45℃之間、更佳在35℃與40℃之間。
較佳地，步驟b)係在35℃至40℃之溫度下在pH為7.0至8.0且含有20至60%短鏈脂肪族醇之磷酸鹽緩衝溶液中實施。
經燒結CAP核心材料之製備可藉由此項技術中已知之方法實施，其包含首先混合磷酸氫鈣(CaHPO4 )、碳酸鈣及/或氫氧化鈣之粉末，然後將混合物在適當溫度範圍內煅燒並燒結，由此獲得塊體經燒結CAP核心材料(例如，參見Mathew M.等人，1977, Acta. Cryst. B33: 1325；Dickens B.等人，1974, J. Solid State Chemistry 10, 232；及Durucan C.等人，2002, J. Mat. Sci., 37:963)。
因此，塊體經燒結TCP核心材料可藉由以下獲得：以化學計量比率混合磷酸氫鈣(CaHPO4 )、碳酸鈣及/或氫氧化鈣之粉末，將混合物在1200-1450℃範圍內、較佳約1400℃之溫度下煅燒並燒結。
塊體經燒結TTCP核心材料亦可藉由上述方法獲得。
藉由該等方法製備之塊體經燒結CAP材料可係多孔的，其具有2至80 vol%之孔隙度及寬孔分佈。孔隙度參數應根據CAP/HAP骨替代材料之預期應用選擇。
用於步驟b)中之經燒結CAP核心材料可為 -如上所述製備之塊體經燒結CAP核心材料， -藉由使用習用方法(例如壓碎、碾磨及/或研磨及篩選)自如上所述製備之塊體經燒結CAP核心材料獲得之經燒結CAP核心材料之微粒或顆粒，或 -具有期望形狀及大小之經燒結CAP核心材料之預成形物，例如骨螺釘、骨釘、骨針或具有骨質身體部位之輪廓的結構。
任何期望形狀及大小之此一預成形物可自如上所述製備之塊體經燒結核心材料藉由使用熟知之原型設計技術(例如CNC銑削或3D打印)獲得(例如，參見Bartolo P.等人，2008, Bio-Materials and Prototyping Applications in Medicine, Springer Science New York, ISBN 978-0-387-47682-7；Landers R.等人，2002, Biomaterials 23(23), 4437；Yeong W.-Y.等人，2004, Trends in Biotechnology, 22 (12), 643；及Seitz H.等人，2005, Biomed. Mater. Res. 74B (2), 782)。
浸沒步驟b)在第一階段中誘導CAP核心材料之一階相變且因此誘導HAP奈米晶體前體之成核。在第二階段期間，來自第一階段之所得HAP前體將生長並建立封閉(即，完全塗覆)之磊晶奈米結晶複合層。第一HAP奈米晶體層必須均勻並封閉，並磊晶地連接至經燒結CAP核心材料。
在第三階段期間，一階相變可在新形成之雙層複合材料內繼續進行以使經燒結CAP核心材料(TCP或TTCP)進一步轉變為奈米結晶HAP。在此相變之第三步驟期間，鈣離子將藉由緩慢擴散控制過程釋放達可控時間，直至經燒結CAP核心材料之一部分已轉變成奈米結晶HAP為止。HAP層之厚度且因此鈣釋放之速率可藉由轉變時間之變化來控制。
適當厚度之磊晶生長之奈米結晶HAP層將在活體外製備，CAP至HAP之轉變在其完成前停止。
一旦將CAP/HAP骨替代材料設置於活體內，CAP至HAP之轉變製程將藉由與體液接觸而重新激活且骨替代材料將如類活體系統一樣起作用，以形成大小及形態類似於人類骨礦物質之新羥磷灰石。
在活體內相轉變製程期間，輸送之鈣離子將釋放至局部環境中以支撐局部鈣平衡，此對於骨再生過程係重要且有益的。
由於在身體之不同負重區域中骨缺損之再生時間不同，因此重要的是可控制鈣釋放之速率。此可藉由改變羥磷灰石之磊晶生長層之厚度來達成。
因此，步驟c)係極關鍵之步驟。在步驟b)之水溶液中之暴露時間係基於所期望HAP層之厚度。在磊晶定向上有至少一個奈米結晶HAP層係必需的。至關重要的是，CAP至HAP之轉變沒有完成。
根據期望厚度之適當暴露時間可藉由使用熟習磷酸鈣及水泥化學領域之技術者熟知之若干熱力學微分方程式來計算。
參見例如：Pommersheim, J.C.；Clifton, J.R. (1979) Cem. Conc. Res.；9:765；Pommersheim, J.C.；Clifton, J.R. (1982) Cem. Conc. Res.；12:765；及Schlüssler, K.H. Mcedlov-Petrosjan, O.P.；(1990): Der Baustoff Beton, VEB Verlag Bauwesen, Berlin。
將上述微分方程式之解轉移至CAP/HAP系統使得能夠預測CAP至HAP之相變及層厚度，使得可以穩定及可再現方式製備HAP之磊晶層。
固體材料自水溶液之分離通常使用此項技術中熟知之技術藉由過濾並乾燥來實施。
可選滅菌步驟d)可藉由此項技術中熟知之技術(例如γ-輻照或X-射線輻射)來實施。
國際專利申請案第 PCT/EP2018/0984783 號之專利 CAP/HAP 骨替代材料的優點及其製備方法 .
與由EP-B1-2445543所教示具有包含片狀晶體薄片之個別簇及在其間之平滑區之非均質外表面雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料相比，包含片狀晶體薄片之均質粗糙外表面之該發明的該雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料顯示人類胎兒間質幹細胞(hMSC)之增加的骨原性分化，特定而言分化標誌物骨橋蛋白(OPN)及骨鈣化素(OCN)之較高表現。此係增強之活體內骨原性反應的強烈指示。
這與R.A. Gittens等人在Biomaterials 2011年5月, 32(13): 3395-3403中發佈之結果一致，其顯示引入結合奈米級結構與微米-亞微米級粗糙度之組合改良成骨細胞分化及局部因子產生，此進而指示改良活體內植入物骨整合之潛力。
本發明之製備雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料之方法允許便捷地藉由調整轉變溶液之緩衝溶液中短鏈脂肪族醇之百分比調整沈積於經燒結CAP核心外表面上之奈米結晶HAP之封閉磊晶生長層之均質粗糙外表面之粗粒度參數、特別地 -  AFM參數：AFM源均方根粗糙度(Rq )及輪廓之平均最大高度(Rz )， -  磊晶生長之奈米結晶羥磷灰石薄片的大小，如藉由SEM所測定，及 -  在0.03 µm與2 µm間之孔的體積，如藉由MIP所測定。
該百分比越高，AFM源均方根粗糙度(Rq )及輪廓之平均最大高度(Rz )越低，磊晶生長之奈米結晶羥磷灰石薄片之大小越小(如藉由SEM所測定)，且在0.03 µm與2 µm間之孔的體積越小(如藉由MIP所測定)。
如上所述，國際專利申請案第PCT/EP2018/084783號揭示骨泥材料，其在適宜基質(通常包含天然或合成聚合物)中包含上文所定義CAP/HAP骨替代物之粒子或細粒。通常，粒子或細粒具有250至5000 µm、較佳1000至2000 µm之大小。未教示用於骨泥基質之特定合成或天然聚合物。
彼國際申請案並未提及CAP/HAP骨替代物之任何條帶、任何塞或任何顆粒摻合物。
申請者已發現如何製備具有適宜處置性質且在膠原蛋白基質中包含上文所定義CAP/HAP骨替代材料之粒子或細粒之骨泥，且此一骨泥已在兔脊椎後外側融合(PLF)模型中測試。
申請者亦已發現如何製備於膠原蛋白基質中之該CAP/HAP骨替代材料之條帶及塞及該CAP/HAP骨替代材料之新顆粒摻合物。
因此，本發明涉及膠原蛋白基質，其包含雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料之粒子，該等粒子包含經燒結CAP核心及沈積於該經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之封閉磊晶生長層，由此磊晶生長之奈米晶體具有與人類骨礦物質相同之大小及形態，其中沈積於經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之封閉磊晶生長層具有包含片狀晶體薄片之均質粗糙外表面。
該膠原蛋白基質可特定用於形成骨泥、條帶或塞材料。
膠原蛋白可為已藉由酸性溶液、通常在2至5之pH處理之天然經交聯膠原蛋白。此一處理可用於膠原蛋白之濕研磨，以獲得均質漿液，該漿液然後可在通常2至5之pH之酸性環境中或在通常11至13之pH之鹼性環境中與CAP/HAP骨替代材料之粒子混合。上述程序允許使膠原蛋白基質具有骨泥所需之可模製性及黏結性特徵。
具有高天然活性度(degree of nativity)之適宜天然經交聯膠原蛋白闡述於美國專利第5,837,278號中。此一膠原蛋白係以名稱Geistlich Bio-Gide ® (Geistlich Pharma AG, Switzerland)商業購得。
膠原蛋白亦可為藉由原生之天然經交聯膠原蛋白利用蛋白水解酶(例如胰蛋白酶或胃蛋白酶)之酶消化獲得之端肽膠原蛋白。
當膠原蛋白基質用作條帶或塞時，膠原蛋白通常係天然經交聯膠原蛋白，其已藉由使用去水熱處理(DHT)之物理交聯或另一選擇藉由化學交聯(例如，使用EDC/NHS)硬化。
通常，膠原蛋白基質包含60-97 w/w%骨替代材料及3-40 w/w%膠原蛋白，較佳75-85 w/w%骨替代材料及15-25 w/w%膠原蛋白。
如國際專利申請案第PCT/EP2018/084783號中所教示，以上定義之雙相CAP/HAP骨替代材料顯示優良促進骨形成之能力。
通常，均質粗糙外表面包含形成薄片之互鎖網路之磊晶生長之奈米結晶羥磷灰石薄片，其大小(寬度及長度)為0.2 µm至20 µm，如藉由SEM所測定。薄片之大小越大，外表面之粗粒度越高。
較佳地，均質粗糙外表面包含形成薄片之互鎖網路之磊晶生長之奈米結晶羥磷灰石薄片，其大小為0.5至5 µm，如藉由SEM所測定。
通常，均質粗糙外表面包含磊晶生長之羥磷灰石薄片，其形成互鎖網路且含有在0.03 µm與2 µm之間之孔，如藉由壓汞法(MIP)所測定。在0.03 µm與2 µm間之孔的體積越高，外表面之粗粒度越高。
通常，均質粗糙外表面可由AFM (原子力顯微術)表徵，其中AFM源均方根粗糙度(Rq )在50 nm至400 nm之範圍內且輪廓之平均最大高度(Rz )在500 nm至2000 nm之範圍內。
較佳地，均質粗糙外表面之特徵可在於在110至150 nm範圍內之AFM源均方根粗糙度(Rq )及在550至750 nm範圍內之輪廓之平均最大高度(Rz )。
較佳地，藉由XRD量測之HAP之百分比係1.0%至10.0%、或2.0至5.0%。
經燒結CAP核心包含磷酸三鈣(TCP)、特別地α-TCP (α-Ca3 (PO4 )2 )或β-TCP (β-Ca3 (PO4 )2 )及/或磷酸四鈣(TTCP) Ca4 (PO4 )2 O。
根據經常使用之實施例，經燒結CAP核心基本上由TCP組成，α-TCP係較佳的。
奈米結晶HAP之磊晶生長層在結構上幾乎與天然人類骨礦物質相同。
CAP/HAP骨替代材料可為具有期望大小及形狀之微粒或顆粒、粒子或細粒。通常，粒子或細粒具有250至5000 µm、較佳500至2000 µm之大小。
上述膠原蛋白基質可包含以下粒子之混合物：根據國際專利申請案第PCT/EP2018/084783號具有低HAP含量(至多6.0%)之上述雙相CAP/HAP骨替代材料之粒子，其可快速吸收，由此促進新骨形成；及根據EP-B1-2445543具有高HAP含量(至少10.0%)之雙相CAP/HAP骨替代材料之粒子，其可緩慢吸收；或源自天然骨之材料之粒子，其可緩慢吸收，此一可緩慢吸收材料具有骨傳導效應。
源自天然骨之已知可緩慢吸收材料係Geistlich Bio-Oss®，其係自天然骨藉由美國專利第5,167,961號中所述之方法製備，其獲得實質上保持天然骨之原始晶體結構及礦物微結構、同時具有低於150百萬分率之有機雜質含量及低於135百萬分率之蛋白質含量之骨礦物質。
因此，本發明係關於膠原蛋白基質，其包含： -  雙相(CAP/HAP)骨替代材料之粒子(A)，其包含經燒結CAP核心及沈積於該經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之封閉磊晶生長層，藉此該等磊晶生長之奈米晶體具有與人類骨礦物質相同之大小及形態，其中沈積於經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之封閉磊晶生長層具有包含片狀晶體薄片之均質粗糙外表面，其中如藉由XRD所量測，HAP%係2.0%至6.0%，及 -  骨替代材料之粒子(B)，其選自由以下組成之群： -  雙相CAP/HAP骨替代材料，其包含經燒結CAP核心及沈積於經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之至少一個封閉磊晶生長層，藉此該等磊晶生長之奈米晶體具有與人類骨礦物質相同之大小及形態，其中如藉由XRD所量測，HAP%係10%至40%，或 -  骨礦物質，其源自天然骨且實質上保持天然骨之原始晶體結構及礦物微結構，同時具有低於150百萬分率之有機雜質含量及低於135百萬分率之蛋白質含量。
較佳地，當膠原蛋白基質作為骨泥材料用於脊椎後外側融合(PLF)時： -在CAP/HAP骨替代材料之粒子(A)中，如藉由XRD所量測，HAP%係2.0%至6.0%，且 -骨替代材料之粒子(B)係雙相CAP/HAP骨替代材料之粒子，其包含經燒結CAP核心及沈積於經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之至少一個封閉磊晶生長層，藉此該等磊晶生長之奈米晶體具有與人類骨礦物質相同之大小及形態，其中如藉由XRD所量測，HAP%係30至40%。
通常，當膠原蛋白基質用作口腔用塞材料時： -在CAP/HAP骨替代材料之粒子(A)中，如藉由XRD所量測，HAP%係2.0%至6.0%，且 -骨替代材料之粒子(B)係骨礦物質之粒子，其源自天然骨且實質上保持天然骨之原始晶體結構及礦物微結構、同時具有低於150百萬分率之有機雜質含量及低於135百萬分率之蛋白質含量。
通常，CAP/HAP骨替代材料之粒子(A)與骨替代材料之粒子(B)之w/w比率係0.1至9.9。
較佳地，當膠原蛋白基質作為骨泥材料用於PLF時，CAP/HAP骨替代材料之粒子(A)與骨替代材料之粒子(B)之w/w比率係0.4至1.0。
較佳地，當膠原蛋白基質用作口腔用塞材料時，CAP/HAP骨替代材料之粒子(A)與骨替代材料之粒子(B)之w/w比率係0.8至4。
通常，膠原蛋白基質係藉由包含以下之方法製備：將原生之天然經交聯膠原蛋白之膠原蛋白纖維分散於pH為2至5之酸性溶液或pH為11至13之鹼性溶液例如以產生膠原蛋白漿液，將膠原蛋白漿液與上述雙相CAP/HAP骨替代材料混合並均質化。
然後將膠原蛋白-CAP/HAP漿液冷凍乾燥並藉由γ-射線或X-射線輻照或環氧乙烷處理滅菌。
在植入之前，經凍乾並滅菌之骨泥通常利用血液或等滲鹽水溶液再水合。
本發明亦係關於製備上述膠原蛋白基質以用作骨泥材料之方法，其包含將原生之天然經交聯膠原蛋白之膠原蛋白纖維分散於pH為2至5之酸性溶液中，例如以產生膠原蛋白漿液，將膠原蛋白漿液與上述雙相CAP/HAP骨替代材料之粒子混合並均質化，例如以產生膠原蛋白-CAP/HAP漿液，冷凍乾燥該漿液並藉由γ-射線或X-射線輻照或環氧乙烷處理滅菌。
較佳地，將酸性膠原蛋白漿液在膠體磨機、摻和磨機或切割磨機中濕研磨。
本發明亦係關於特別地用於骨替代材料之顆粒摻合物，其係以下粒子之混合物：具有低HAP含量(至多6.0%)之上述雙相CAP/HAP骨替代材料之粒子，其可快速吸收，由此促進新骨形成；及根據EP-B1-2445543具有高HAP含量(至少10.0%)之雙相CAP/HAP骨替代材料之粒子，其可緩慢吸收；或源自天然骨之材料之粒子，其可緩慢吸收，此一可緩慢吸收材料具有骨傳導效應。
源自天然骨之已知可緩慢吸收材料係Geistlich Bio-Oss®，其係自天然骨藉由美國專利第5,167,961號中所述之方法製備，其獲得實質上保持天然骨之原始晶體結構及礦物微結構、同時具有低於150百萬分率之有機雜質含量及低於135百萬分率之蛋白質含量之骨礦物質。
因此，本發明係關於顆粒摻合物，其包含： -  雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料之粒子(A)，其包含經燒結CAP核心及沈積於該經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之封閉磊晶生長層，藉此該等磊晶生長之奈米晶體具有與人類骨礦物質相同之大小及形態，其中沈積於經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之該封閉磊晶生長層具有包含片狀晶體薄片之均質粗糙外表面，其中如藉由XRD所量測，HAP%係2.0%至6.0%，及 -  骨替代材料之粒子(B)，其選自由以下組成之群： -  雙相CAP/HAP骨替代材料，其包含經燒結CAP核心及沈積於經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之至少一個封閉磊晶生長層，藉此該等磊晶生長之奈米晶體具有與人類骨礦物質相同之大小及形態，其中如藉由XRD所量測，HAP%係10%至40%，或 -  骨礦物質，其源自天然骨且實質上保持天然骨之原始晶體結構及礦物微結構，同時具有低於150百萬分率之有機雜質含量及低於135百萬分率之蛋白質含量。
較佳地，在該顆粒摻合物中： -在CAP/HAP骨替代材料之粒子(A)中，如藉由XRD所量測，HAP%係2.0%至6.0%，且 -骨替代材料之粒子(B)係雙相CAP/HAP骨替代材料之粒子，其包含經燒結CAP核心及至少一個沈積於經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之封閉磊晶生長層，藉此該等磊晶生長之奈米晶體具有與人類骨礦物質相同之大小及形態，其中如藉由XRD所量測，HAP%係30至40%。
通常，CAP/HAP骨替代材料之粒子(A)與骨替代材料之粒子(B)之w/w比率係0.1至9.9。
以下實例說明本發明，而非限制其範圍。
實例 1 雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料根據EP-B1-2445543之製備.
α-TCP之塊體經燒結材料、其粒徑為1.0-2.0 mm之多孔細粒及具有磊晶生長之HAP塗層之經轉變細粒係類似於EP-B1-2445543之實例1、2及4製備。
將364 g磷酸二鈣無水粉末、136 g碳酸鈣粉末及220 ml去離子水在700 rpm下使用實驗室攪拌器混合5 min。來自混合製程之漿液立即轉移至高溫穩定之鉑杯。將充滿之鉑杯置於冷爐中。使用100℃/小時之加熱速率將爐加熱至1400℃。將此溫度保持12小時且之後以500℃/小時之冷卻速率將爐冷卻至800℃，然後以125℃/小時之冷卻速率冷卻至300℃且最後藉由關閉爐冷卻至室溫。自爐及鉑杯去除塊體經燒結材料(相純淨α-Ca3 (PO4 )2 )。相純度之控制係使用粉末X射線繞射分析實施。
藉由使用顎式壓碎機(顎距離在10至1 mm變化)將塊體產物壓碎。藉由使用篩分機及具有2 mm及1 mm之篩孔之篩插入件篩分產生之細粒。篩分後，將細粒用乙醇沖洗，以分離吸附至細粒上之細粉末殘餘物。將多孔細粒在80℃下在箱式乾燥機中乾燥1 h。沖洗後粒子表面之清潔度係藉由使用掃描電子顯微術進行表面觀察來控制。
適合於塗覆及相轉變製程之緩衝溶液係藉由將0.4 mol/l磷酸二氫鈉(NaH2 PO4 )溶於蒸餾水中來製備。在室溫下藉由使用氫氧化鈉(NaOH)將溶液之pH調整至7.45。將根據前面段落產生之細粒浸沒於所製備之溶液中並在充分調整之水浴(40℃)中分別儲存30 min (原型1)及40 min (原型2)。浸沒之後，將細粒用蒸餾水洗滌3次以停止相轉變製程並去除來自緩衝溶液之殘餘物。將多孔細粒在100℃下在箱式乾燥機中乾燥2小時。
對原型1及原型2之細粒實施放大率為3500 x之SEM。
如自代表原型1及2之SEM照片之圖1A及1B明顯看出，細粒之外表面係非均質的，其包含由磊晶生長之HAP奈米晶體組成之片狀晶體薄片的個別(分離的)簇及在該等晶體之間之平滑區。
藉由對原型1及原型2中之每一者量測SEM照片上由個別簇及平滑區所佔據之表面，測定原型1之平滑區代表外表面之約70%且原型2代表外表面之約50%。
實例 2 根據國際專利申請案第PCT/EP2018/084783號之專利製備雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料.
1) 製備骨替代材料之細粒 1-2 mm大小之相純淨α-TCP之多孔細粒係如以上實例1中所述產生。 相轉變及塗覆步驟係在放置於設定為40℃之水浴中的玻璃燒瓶中實施。轉變緩衝液係磷酸二氫鈉(NaH2 PO4 )與不同比例之乙醇混合之水溶液。磷酸二氫鈉水溶液之莫耳濃度係在0.05 M與0.3M之間變化且乙醇之含量係在20與60 w/w%之間。轉變溶液之pH係在7.3與7.6之間。
玻璃燒瓶填充有轉變緩衝液並以1:40至1:80之間之比率(細粒對轉變溶液)添加α-TCP細粒。將細粒在轉變溶液中於40℃下浸沒24與72小時之間之時段。浸沒之後，將細粒用去離子水沖洗5次(細粒對水比率關於重量係1:10)並用乙醇(99.9%, 細粒對乙醇比率關於重量係1:10)沖洗2次，以停止相轉變製程並去除來自緩衝溶液之殘餘物。將多孔細粒在100℃下在箱式乾燥機中乾燥2小時。
塗覆及相轉變製程後之表面形態係使用SEM觀察。
圖2代表根據本發明之骨替代材料之原型3 (20%乙醇)、原型4 (30%乙醇)、原型5 (40%乙醇)、原型6 (50%乙醇)及原型7 (60%乙醇)之3500 x放大率的SEM照片。藉由將圖1A及1B與圖2比較可看出，具有片狀晶體薄片之個別簇及其間之平滑區之原型1及2的非均質外表面由沒有任何個別晶體簇之均質粗糙外表面替換。均質粗糙外表面係由磊晶生長之羥磷灰石薄片之互鎖網路構建。個別薄片大小藉由增加轉變溶液中之乙醇含量而降低(如藉由SEM分析所觀察)，由此降低外表面之粗粒度或粗糙度。
圖3A代表原型5 (40%乙醇, 1-2 mm細粒)在低放大率(1000 x)下之橫截面之SEM照片。右下角顯示細粒之外表面且細粒之中心位於左上角。
圖3B代表原型5 (40%乙醇, 1-2 mm細粒)在較高放大率(14’000 x)下之橫截面之SEM照片，其中可清晰地看出作為粗糙表面之構建塊之個別片狀晶體薄片。細粒中心中之粗糙外表面與細粒外表面上之粗糙外表面之間沒有差別。
藉由壓汞法 (MIP) 測定孔徑分佈 細粒之孔徑分佈係使用壓汞法(MIP)測定。MIP係用於測定多孔材料之孔徑分佈之標準表徵技術。該技術已為此項技術熟知且闡述於例如Gregg, S. J.及Sing, K.S.W., Adsorption, Surface Area and Porosity, 第2版, Academic Press Inc. (1982), 173-190中。
圖6代表根據本發明之骨替代材料之原型3、5及7與純淨α-TCP (根據實例1產生及原型3、5及7之核心材料)相比較之MIP圖表。所有量測均利用1-2 mm細粒實施。
可看出，純淨α-TCP樣品由於其平滑表面不具有在0.03至2 µm範圍內之任何孔。由於構建磊晶生長之羥磷灰石薄片之互鎖網路之均質粗糙外表面之多孔性質，所有根據本發明之骨替代材料含有在0.03至2 µm範圍內之孔。粗糙外表面之孔體積(其對應於在0.03至2 µm範圍內之MIP曲線下面積)取決於互鎖網路之個別薄片大小。個別薄片越大，互鎖網路之所包括孔體積越高。因此，互鎖網路之所包括孔體積可直接與表面之粗粒度相關。在MIP圖表中在0.03至2 µm範圍內之孔體積越高，表面之粗粒度越高。原型3具有在所示原型之0.03至2 µm範圍內之最大孔體積(曲線下面積)，隨後係原型5及7。圖2A-2E中之SEM分析證實，原型之粗粒度自原型3降至原型5及7。
2) 製備骨替代材料之無孔圓盤 將如以上實例1中所述產生之1-2 mm大小之相純淨α-TCP細粒利用行星式磨機以150 rpm研磨20小時以獲得細粉末。將細粉末填充於壓模中並用手動壓機以1噸之載荷壓實。將生坯自模具移出，並轉移至高溫爐中。藉由使用250℃/小時之加熱速率將爐加熱至1450℃。將此溫度保持24小時且之後以500℃/小時之冷卻速率將爐冷卻至800℃且然後以150℃/小時之冷卻速率冷卻至室溫。自爐去除塊體經燒結無孔材料(相純淨α-Ca3 (PO4 )2 )。相純度之控制係使用粉末X射線繞射分析實施且表面特徵係藉由使用SEM分析。
所製備圓盤之相轉變及塗覆係如上文在1)下所述製備，其中唯一差異係α-TCP與轉變溶液之重量比係1至3.5。
由此製備本發明之骨替代材料的原型3a (20%乙醇)及6a (50%乙醇)。
塗覆及相轉變製程後之表面形態係使用SEM觀察。相應粗糙度參數係使用原子力顯微術AFM測定。
圖4中之SEM影像證實，無孔圓盤之均質粗糙外表面之形態與利用自實例2段落1之相應乙醇含量製備之細粒之粗糙外表面相同(原型3及3a及原型6及6a)。
原子力顯微術 (AFM) 奈米級之表面量測係使用原子力顯微術鏡(TT-AFM, AFM Workshop)以輕敲模式評估。AFM分析係在周圍氣氛下使用直徑為11 mm且高度為1 mm之無孔圓柱形盤實施。使用190 kHz之共振頻率及最高10 nm之尖端半徑。每一AFM分析均在50 µm x 50 µm區域上實施且掃描每一組之三個樣品。原始資料藉由應用數值校正經平面平整化(plane-leveled)以去除傾斜，並使用Gwyddion軟體測定均方根粗糙度(Rq )及輪廓之平均最大高度(Rz )之平均值。
表面之類似表面表徵係闡述於例如US-2013-0045360-A1中。
圖4代表根據本發明製備之無孔圓盤之原型3a (20%乙醇, 左手側)及6a (50%乙醇, 右手側)的AFM照片。原型3a及6a之AFM源粗糙度值可見於下表1中。表 1 原型3a及6a之AFM源粗糙度值.
   Rq [nm] Rz [nm]
原型3a (20%乙醇) 237 ± 31 1391 ± 194
原型6a (50%乙醇) 130 ± 13 630 ± 82
如在表1中可看出，藉由將乙醇含量自20%增加至50%，均方根粗糙度(Rq )之平均值自237 nm降至130 nm且輪廓之平均最大高度(Rz )自1391 nm降至630 nm。
實例 3 人類胎兒間質幹細胞(hMSC)之骨原性分化的活體外測試。
為評價實例1及2中所製備之骨替代材料原型是否支援骨原性分化，將約200’000個自妊娠22週後之人類胎兒股骨分離之hMSC (自ScienCell商業獲得：目錄編號7500, 批次編號6890)種於320 mg彼等骨替代材料原型之細粒上並培養三週。在培養的前七天，使用市售hMSC擴增培養基(MSCM培養基, 目錄編號7501, ScienCell)以最佳地支援細胞增殖。對於隨後14天，將培養基更換為補充有10% FBS及青黴素(Penicillin)/鏈黴素(Streptomycin)之DMEM。未向細胞培養培養基中添加額外骨原性試劑。在hMSC培養三週後，分離總mRNA，轉錄為cDNA並實施即時定量PCR。基因表現係使用GAPDH作為看家基因(house-keeping gene)在ΔΔCT方法之後計算(參見Livak K.J.及Schmittgen T.D., Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method, 2001, Methods 25, 第402-408頁)。針對實例1及2中所製備之呈粒狀形式(1-2 mm)之所有骨替代材料原型量測骨原性分化標誌物骨橋蛋白(OPN)及骨鈣化素(OCN)之表現。
彼等量測顯示，實例2之本發明骨替代材料原型之骨原性分化標誌物OPN及OCN之表現顯著高於實例1之先前技術骨替代材料原型(參見圖5A-5B)。
基於該等活體外結果，預期本發明骨替代材料原型在活體內之經增強骨原性反應。
實例4 比較國際專利申請案第PCT/EP2018/084783號之發明的雙相CAP/HAP骨替代材料之HAP奈米晶體與人類骨礦物質之晶體大小及形態.
晶體大小分析係如EP-B1-2445543中一樣藉由對原型3之樣品及天然人類骨礦物質應用布拉格法(Bragg method)使用X-射線繞射資料之精修來實施。
本發明的雙相CAP/HAP骨替代材料與人類骨礦物質具有相同形態及相同晶體大小。 參見下表2。表 2 該發明之 CAP/HAP 骨替代物及人類骨礦物質之 HAP 晶體大小及形態的比較
結晶軸 (六方晶系空間群P63 /m) 所製備之本發明CAP/HAP在生理溫度下. 晶體大小+ [nm] 天然人類骨礦物質 晶體大小+ [nm]
a (1,0,0) 18 (±4) 15-21
b (0,1,0) 18 (±4) 15-21
c (0,0,1) 38 (±8) 34-45
實例 5 製備本發明之膠原蛋白基質，其包含根據PCT/EP2018/084783含有3.0 w/w%HAP之CAP/HAP骨替代材料之粒子.
1)製備含有 3.0 w/w% HAP 之快速吸收雙相 CAP/HAP 骨替代材料 0.5 - 2 mm大小之雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料之多孔細粒係根據國際專利申請案第PCT/EP2018/084783號藉由類似於以上實例2中所述之製程產生。轉變緩衝液係含有50%乙醇之0.1M磷酸二氫鈉(NaH2 PO4 )溶液。如藉由XRD所量測，來自表面轉變之HAP之含量係3.0 w/w%。
2)製備用作骨泥之本發明膠原蛋白基質 將所選量之膠原蛋白纖維(3 w/w%)分散於去離子水中。用於產生骨泥材料之膠原蛋白纖維之來源係與來自Geistlich Pharma AG之市售產品Geistlich Bio-Gide®相同。隨後，利用2M鹽酸溶液將漿液之pH值調整至pH = 3.5。然後，將漿液用膠體磨機濕研磨。在下一步驟中，將在以上1)中製備之雙相CAP/HAP骨替代材料之細粒以80 w/w%骨替代材料及20 w/w%膠原蛋白之比率添加至膠原蛋白漿液。添加骨替代材料之後，將漿液用刮勺手動均質化。然後，將漿液填充於金屬模具(23 mm x 23 mm x 6 mm)中且之後凍乾(冷凍至-40℃，在-5℃及300微巴(µbar)下一次乾燥24 h，在20℃及10微巴下二次乾燥11 h)。經凍乾材料利用x-射線輻射滅菌。
藉由利用血液或等滲鹽水溶液再水合獲得具有良好處置性質之骨泥原型。
用於評價骨泥原型之處置性質之程序： 使骨泥材料與特定量之肝素化血液接觸且之後測試方案包括以下步驟： 1.     濕潤性：發泡體可用肝素化血液在4 min內潤濕(無操縱)。 2.     擠壓：可將額外血液擠出。 3.     膠黏性：骨泥團塊不會黏至手套或儀器。 4.     黏結性：骨泥有黏性且不會破碎。 5.     可模製性：可模製之骨泥可容易地形成為期望形狀(球係最具挑戰性之形式)。 6.          耐壓性：施加壓力時，材料不會被推至一側。
3) 製備用作條帶或塞之本發明膠原蛋白基質 使在以上此實例之2)中獲得之凍乾材料在0.1-10毫巴及80-140℃下進行去水熱處理(DHT)達12-96小時。為獲得塞材料，此實例之2)中之金屬模具具有直徑為8至12 mm且深度為8至16 mm之圓柱形或圓錐形形狀。
實例6 製備包含根據國際專利申請案第PCT/EP2018/084783號含有3.0 w/w% HAP之CAP/HAP骨替代材料之粒子及根據EP-B1-2445543含有35 w/w% HAP之CAP/HAP骨替代材料之粒子之混合物之膠原蛋白基質
1)製備 根據 EP-B1-2445543 含有 35%HAP 之 緩慢吸收之雙相 CAP/HAP 骨替代材料 0.5 - 2 mm大小之雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料之多孔細粒係根據EP-B1-2445543中所述之製程產生。轉變緩衝液係0.15M磷酸二氫鈉(NaH2 PO4 )溶液，其中pH為7.45 ± 0.1。將α-TCP細粒在轉變溶液中在40℃下浸沒24小時。在表面轉變之後，將細粒洗滌並在箱式乾燥機中乾燥。如藉由XRD所量測，來自表面轉變之HAP的含量係35 w/w%。
2)製備顆粒摻合物，快速吸收及緩慢吸收之雙相骨替代材料之粒子的混合物 將在實例5之1)下製備之0.5 - 2 mm大小之含有3.0 w/w% HAP之雙相CAP/HAP骨替代材料之多孔粒子及在以上此實例之1)下製備之0.5 - 2 mm大小之根據EP-B1-2445543含有35% w/w HAP之雙相CAP/HAP骨替代材料之多孔粒子以40:60之w/w比率混合。在湍流振動混合器(turbula shaker mixer)中將顆粒摻合物均質化。
3)製備用作骨泥之本發明膠原蛋白基質 將所選量之Geistlich Bio-Gide®之膠原蛋白纖維(3 w/w%)分散於去離子水中。隨後，利用2M鹽酸溶液將漿液之pH值調整至pH = 3.5。然後，將漿液用膠體磨機濕研磨。在下一步驟中，將在以上此實例之2)下製備之雙相CAP/HAP骨替代材料之顆粒摻合物以80 w/w%骨替代材料及20 w/w%膠原蛋白之比率添加至膠原蛋白漿液。添加骨替代材料之後，將漿液用刮勺手動均質化。然後，將漿液填充於金屬模具(23 mm x 23 mm x 6 mm)中且之後凍乾(冷凍至-40℃，在-5℃及300微巴下一次乾燥24 h，在20℃及10微巴下二次乾燥11 h)。然後將材料利用X-射線輻射滅菌滅菌。
4)製備用作條帶或塞之本發明膠原蛋白基質 使在以上此實例之3)中獲得之凍乾材料在0.1-10毫巴及80-140℃下進行去水熱處理(DHT)達12-96小時。為獲得塞材料，此實例之3)中之金屬模具具有直徑為8至12 mm且深度為8至16 mm之圓柱形或圓錐形形狀。
實例7 在兔脊椎後外側融合(PLF)模型中測試本發明之骨泥
將以上在實例6 3)中獲得之膠原蛋白基質作為骨泥相對於Mastergraft™骨泥(於膠原蛋白基質中之雙相磷酸鈣細粒，由Medtronic出售)及Actifuse ABX骨泥(泊洛沙姆(poloxamer)基質中之Si取代羥磷灰石，由Baxter出售)在由W.R. Walsh等人(2009, Eur. Spine J. 18:1610-1620)揭示之兔PLF模型中進行測試。 -  植入後12週，該等骨泥中之每一者均在放射學上清晰可見融合之團塊。Mastergraft骨泥顯示較高降解速率。 參見圖7，其中對於本發明之骨泥，融合團塊清晰可見。 -  如圖8中所示，含有3.0 w/w% HAP之雙相CAP/HAP骨替代材料之粒子較含有35% w/w HAP之雙相CAP/HAP骨替代材料之粒子吸收快(其在圖8中看起來大小更大且形狀更均勻)，此為新骨之向內生長提供空間。 -  在圖8中可觀察到跨越缺損之新骨形成。
下文將參照本發明之較佳實施例之說明性實例及附圖進一步詳細地闡述本發明，其中： 圖1A代表由EP-B1-2445543所揭示且在實例1中所製備轉變時間為30 min之骨替代材料之原型1 (1-2 mm細粒)的SEM照片，其中平滑區代表總外表面之約70%，如藉由SEM所量測。 圖1B代表由EP-B1-2445543所揭示且在實例1中所製備轉變時間為40 min之骨替代材料之原型2 (1-2 mm細粒)的SEM照片，其中平滑區代表總外表面之約50%，如藉由SEM所量測。 圖2A-2E代表根據本發明之骨替代材料之各原型之SEM照片：原型3 (圖2A)：20%乙醇, 1-2 mm細粒)、原型4 (圖2B)：30%乙醇, 1-2 mm細粒)、原型5 (圖2C)：40%乙醇, 1-2 mm細粒)、原型6 (圖2D)：50%乙醇, 1-2 mm細粒)及原型7 (圖2E)：60%乙醇, 1-2 mm細粒)。 圖1及圖2A-2E之所有SEM照片均具有3500之放大率。 圖3A代表原型5 (40%乙醇, 1-2 mm細粒)在低放大率(1000 x)下之橫截面之SEM照片。右下角顯示細粒之外表面且細粒之中心位於左上角。 圖3B代表原型5 (40%乙醇, 1-2 mm細粒)在較高放大率(14’000 x)下之橫截面之SEM照片。 圖4代表在實例2中製備之本發明骨替代材料之無孔圓盤之原型3a (左側：20%乙醇)及6a (右側：50%乙醇)的SEM照片(上面兩張照片)及AFM照片(其餘四張照片)。 圖5A-5B代表在活體外測試中，與先前骨替代材料相比，人類胎兒間質幹細胞(hMSC)與根據本發明之骨替代材料接觸時之骨鈣化素(OCN, 圖5A)及骨橋蛋白(OPN, 圖5B)反應。 圖6代表在實例2中製備之本發明骨替代材料之1-2 mm細粒之原型3 (20%乙醇)、5 (40%乙醇)及7 (60%乙醇)之1-2 mm細粒及如實例1中所述產生之純α-TCP之MIP圖表。 圖7代表在植入在實例6 3)中所製備之本發明膠原蛋白基質骨泥原型12週後之兔脊柱放射照片。 圖8代表在植入12週後具有在實例6 3)中所製備之本發明膠原蛋白基質骨泥原型之兔中PLF手術之樹脂組織學螢光顯微鏡術相片。

Claims (15)

  1. 一種膠原蛋白基質，其包含雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料之粒子，該等粒子包含經燒結CAP核心及沈積於該經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之封閉磊晶生長層，藉此該等磊晶生長之奈米晶體具有與人類骨礦物質相同之大小及形態，其中沈積於該經燒結CAP核心之該外表面上之奈米結晶HAP之該封閉磊晶生長層具有包含片狀晶體薄片之均質粗糙外表面。
  2. 如請求項1之膠原蛋白基質，其中該膠原蛋白係已藉由酸性溶液處理之天然經交聯膠原蛋白。
  3. 如請求項1之膠原蛋白基質，其中該膠原蛋白係已藉由去水熱處理(DHT)物理交聯或化學交聯之天然經交聯膠原蛋白。
  4. 如請求項1至3中任一項之膠原蛋白基質，其包含60-97 w/w%骨替代材料及3-40 w/w%膠原蛋白。
  5. 如請求項1至4中任一項之膠原蛋白基質，其中在該雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料中，該粗糙表面包含形成薄片之互鎖網路之磊晶生長之奈米結晶羥磷灰石薄片，該等薄片具有0.2 µm至20 µm之大小，如藉由掃描電子顯微術(SEM)所測定。
  6. 如請求項1至5中任一項之膠原蛋白基質，其中在該雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料中，該均質粗糙外表面包含磊晶生長之羥磷灰石薄片，其形成互鎖網路且含有在0.03 µm與2 µm之間之孔，如藉由壓汞法(MIP)所測定。
  7. 如請求項1至6中任一項之膠原蛋白基質，其中在該雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料中，該均質粗糙外表面係藉由原子力顯微術(AFM)表徵，其中AFM源均方根粗糙度Rq 在50 nm至400 nm之範圍內且輪廓之平均最大高度Rz 在500 nm至2000 nm之範圍內。
  8. 如請求項1至7中任一項之膠原蛋白基質，其中在該雙相磷酸鈣/羥磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料中，HAP之百分比係1.0%至10.0%，如藉由XRD所量測。
  9. 如請求項1至8中任一項之膠原蛋白基質，其包含： CAP/HAP骨替代材料之粒子(A)，其包含經燒結CAP核心及沈積於該經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之封閉磊晶生長層，藉此該等磊晶生長之奈米晶體具有與人類骨礦物質相同之大小及形態，其中沈積於該經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之該封閉磊晶生長層具有包含片狀晶體薄片之均質粗糙外表面，其中如藉由XRD所量測，HAP%係2.0%至6.0%，及 骨替代材料之粒子(B)，其選自由以下組成之群： 雙相CAP/HAP骨替代材料，其包含經燒結CAP核心及沈積於該經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之至少一個封閉磊晶生長層，藉此該等磊晶生長之奈米晶體具有與人類骨礦物質相同之大小及形態，其中如藉由XRD所量測，HAP%係10%至40%，及 骨礦物質，其源自天然骨且實質上保持天然骨之原始晶體結構及礦物微結構，同時具有低於150百萬分率之有機雜質含量及低於135百萬分率之蛋白質含量。
  10. 如請求項9之膠原蛋白基質，其中 如藉由XRD所量測，在該等CAP/HAP骨替代材料之粒子(A)中之HAP%係2.0%至6.0%，且 該等骨替代材料之粒子(B)係雙相CAP/HAP骨替代材料之粒子，其包含經燒結CAP核心及沈積於該經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之至少一個封閉磊晶生長層，藉此該等磊晶生長之奈米晶體具有與人類骨礦物質相同之大小及形態，其中如藉由XRD所量測，HAP%係30至40%。
  11. 如請求項9之膠原蛋白基質，其中 在該等CAP/HAP骨替代材料之粒子(A)中，如藉由XRD所量測，HAP%係2.0%至6.0%，且 該等骨替代材料之粒子(B)係骨礦物質之粒子，該骨礦物質源自天然骨且實質上保持天然骨之原始晶體結構及礦物微結構，同時具有低於150百萬分率之有機雜質含量及低於135百萬分率之蛋白質含量。
  12. 如請求項9至11中任一項之膠原蛋白基質，其中該等CAP/HAP骨替代材料之粒子(A)與該等骨替代材料之粒子(B)之w/w比率係0.1至9.9。
  13. 一種製備如請求項1、2及4至12中任一項之膠原蛋白基質用作骨泥之方法，其包含將原生之天然經交聯膠原蛋白之膠原蛋白纖維分散於pH為2至5之酸性溶液以例如產生膠原蛋白漿液，將該膠原蛋白漿液與上述雙相CAP/HAP骨替代材料之粒子混合並均質化，以例如產生膠原蛋白/CAP/HAP漿液，冷凍乾燥並藉由γ-射線或X-射線輻照或環氧乙烷處理使該漿液滅菌。
  14. 一種顆粒摻合物，其包含以下各項之混合物： 雙相(CAP/HAP)骨替代材料之粒子(A)，其包含經燒結CAP核心及沈積於該經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之封閉磊晶生長層，藉此該等磊晶生長之奈米晶體具有與人類骨礦物質相同之大小及形態，其中沈積於該經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之該封閉磊晶生長層具有包含片狀晶體薄片之均質粗糙外表面，其中如藉由XRD所量測，HAP%係2.0%至6.0%，及 骨替代材料之粒子(B)，其選自由以下組成之群： 雙相CAP/HAP骨替代材料，其包含經燒結CAP核心及沈積於該經燒結CAP核心之外表面上之奈米結晶HAP之至少一個封閉磊晶生長層，藉此該等磊晶生長之奈米晶體具有與人類骨礦物質相同之大小及形態，其中如藉由XRD所量測，HAP%係10%至40%，及 骨礦物質，其源自天然骨且實質上保持天然骨之原始晶體結構及礦物微結構，同時具有低於150百萬分率之有機雜質含量及低於135百萬分率之蛋白質含量。
  15. 如請求項14之顆粒摻合物，其中該等CAP/HAP骨替代材料之粒子(A)與該等骨替代材料之粒子(B)之w/w比率係0.1至9.9。
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