CN114761048A - 骨替代材料的胶原基质或颗粒共混物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及：‑一种特别是用作油灰、条带或塞子的包含双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料的颗粒的胶原基质，所述颗粒包括烧结的CAP芯和沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层，由此外延生长的纳米晶体具有与人骨矿物质相同的尺寸和形貌，其中，沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层具有包含扁平晶体片的均匀的粗糙外表面，‑制备该胶原基质的方法，和‑包含这种双相骨材料的颗粒的颗粒共混物。

Description

骨替代材料的胶原基质或颗粒共混物
本发明涉及一种新的胶原基质、制备该胶原基质的方法以及包含这种双相骨材料的颗粒的新型颗粒共混物，所述胶原基质特别是用作油灰、条带或塞子(例如口腔塞)材料，其包含具有均匀的外表面的具备基于磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)的双层结构的双相骨替代材料的颗粒。
在医学领域，特别是在整形外科领域，油灰通常定义为具有橡皮泥状稠度且具有合适的成型性和内聚性特征的化合物。油灰材料可以很容易地手动成形并在外力去除后保持其形状。
条带通常被定义为可以适应移植部位的解剖曲度的柔韧且形状稳定的材料。条带可以被压缩和折叠，但在去除外力后会恢复到其原来的形状。
塞子通常定义为具有不同尺寸的圆柱形或锥形材料。这种材料是柔韧的，可以被压缩，但在去除外力后会恢复到其原来的形状。口腔塞是一种可以用于口腔的塞子。它尤其可用于在拔牙后填充孔洞或空腔，例如牙槽窝。
背景技术
在诸如外伤、疾病和手术等多种情况下会产生骨结构缺损，各种外科领域仍需要有效修复骨缺损。
许多天然和合成材料和组合物已被用于刺激骨缺损部位的愈合。一种公知的促进牙周和颌面骨缺损的骨生长的天然骨传导性骨替代材料是由Geistlich Pharma AG市售的Geistlich
Figure BDA0003390772230000011
该材料是通过美国专利第5,167,961号中描述的方法由天然骨制成的，该方法能够保留天然骨的小梁结构和纳米晶体结构，从而形成不会再吸收或非常缓慢再吸收的优良骨传导性基质。
磷酸三钙/羟磷灰石(TCP/HAP)系统及其作为骨替代材料的用途记载于例如US-6,338,752，其公开了一种通过在1200-1500℃加热磷酸铵和HAP的粉末混合物来制备α-TCP/HAP的双相水门汀。
欧洲专利EP-285826记载了一种在金属和非金属植入体上产生HAP层的方法，其通过施加α-TCP层并通过与pH为2至7的水在80-100℃的反应将α-TCP层完全转化为HAP来实施。获得的产品是覆盖有HAP层的金属或非金属体。
WO 97/41273记载了一种用碳酸化羟磷灰石(即其中磷酸根和/或氢氧根离子被碳酸氢根离子部分替代的羟磷灰石)的涂层涂覆例如特别是羟磷灰石(HAP)或其他磷酸钙(CAP)等基材的方法，其通过包括以下步骤的方法进行：(a)在低于50℃的温度下将基材浸入pH为6.8至8.0的含有钙离子、磷酸根离子和碳酸氢根离子的溶液中，(b)将溶液与基材接触的部分加热至50至80℃的温度，直到pH大于8，(c)保持基材与步骤(b)中获得的碱溶液接触以形成碳酸化羟磷灰石涂层，以及(d)将基材从溶液中取出并对涂层进行干燥。公开了碳酸氢根离子用作羟磷灰石晶体生长的抑制剂，产生包含缺陷并具有相当小的尺寸(即长度为10-40nm且宽度为3-10nm)的非化学计量晶体(参见第7页，1-7行)。
磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)体系、尤其是TCP/HAP体系的成分的热力学稳定性不同。由于这种差异，当CAP/HAP体系被植入哺乳动物、特别是人类患者时，TCP和其他磷酸钙在体液中的溶解度高于HAP的溶解度。磷酸钙与HAP的溶解度的差异导致CAP/HAP体系的无序烧结结构的破坏，因为溶解性更好的化合物CAP(例如TCP)比HAP更快地被去除。在高温下产生的CAP和HAP之间的烧结互连也将为器件在生理环境中的更高溶解度做出显著贡献。两种不同类型的反应主导此类陶瓷在体内的加速降解：化学溶解和细胞的生物再吸收。这两种过程都会导致陶瓷材料溶解，进而导致钙离子的局部过饱和，从而使释放出的钙离子多于吸附的钙离子。在细胞外基质和植入物周围的组织中，钙离子的天然动态平衡都不再存在。就钙离子的过饱和而言，天然钙动态平衡的局部紊乱会导致破骨细胞活性增加，从而导致陶瓷材料病态再吸收的加速和不良炎症反应的风险，尤其是在使用大量的合成骨替代材料时。
当将骨替代材料Geistlich
Figure BDA0003390772230000021
植入人类患者体内时，天然钙动态平衡几乎不会受到影响，材料表面及其局部环境中钙离子的浓度几乎保持恒定。因此，该材料的生物再吸收不会发生或以非常慢的速度进行，没有不良炎症反应的风险。
EP-B1-2445543公开了一种非常有利的磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料，与骨替代材料Geistlich
Figure BDA0003390772230000022
一样，其设置在体内后，能够使材料表面及其局部环境中的钙离子浓度保持几乎恒定，因此不会导致破骨细胞活性增加。
最佳骨再生所需的天然钙动态平衡实际上没有受到干扰或破坏。此外，骨替代材料持久地支持天然钙浓度动态平衡，直到再生过程完成。当满足这些条件时，破骨细胞活性不会增加，因此没有不良炎症反应的风险。
EP-B1-2445543的发明涉及一种双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料，其包含烧结的CAP芯和在烧结的CAP芯上沉积的至少一个均匀且封闭的外延生长的纳米晶体HAP层，由此外延生长的纳米晶体与人类骨矿物质的尺寸和形貌相同，即长30至46nm且宽14至22nm。
烧结的CAP芯可以包含磷酸三钙(TCP)，特别是α-TCP(α-Ca3(PO4)2)或β-TCP(β-Ca3(PO4)2)，和/或磷酸四钙(TTCP)Ca4(PO4)2O。
根据常用实施方式，烧结的CAP芯基本上由TCP组成，优选α-TCP。
外延生长的纳米晶体HAP层在结构和化学上与天然人骨矿物质几乎相同。
外延生长的纳米晶体HAP层的厚度通常为至少15至50nm，优选至少20至40nm，更优选至少25至35nm。该最小厚度对应于外延取向的一层HAP纳米晶体。
外延生长的纳米晶体HAP层可以包括外延取向的单层或多层HAP纳米晶体。外延生长的纳米晶体HAP层的厚度与外延取向的HAP纳米晶体的这些层的数量有关，将根据骨替代材料作为植入物或假体在身体的不同负载部位的预期用途进行选择。该发明的骨替代材料实际上被设计为在体内作为活体样系统起作用，其将烧结的CAP芯逐渐转变为尺寸和形态与人骨矿物质相似的羟磷灰石，该转变的速率取决于烧结的CAP芯释放钙的速率，这在很大程度上受外延生长的纳米晶体HAP层的厚度的控制。
CAP/HAP骨替代材料的性质在很大程度上受外延生长的晶体HAP层的厚度的控制。术语“性质”包括CAP/HAP骨替代物在体外和体内释放恒定浓度的钙离子到局部环境的能力。
外延生长的纳米晶体HAP层的厚度与烧结的CAP芯材与HAP的比例有关，所述比例通常为5:95至95:5，优选10:90至90:10。
CAP/HAP骨替代材料可以是颗粒或团粒，所述颗粒或团粒具有所需的尺寸和形状。通常，所述颗粒或团粒是近似球形的，并且直径为250至5000μm。
CAP/HAP骨替代材料也可以是成形体，例如螺丝、钉子、销或具有身体骨质部分(例如特别是髋骨、锁骨、肋骨、下颌骨或颅骨部分)轮廓的结构。这样的螺丝、钉子或销可用于重塑性矫形外科手术中，以将韧带固定到例如膝盖或肘部的骨头上。这种具有身体骨质部分的轮廓的结构可以在矫形外科手术中用作假体，以置换缺失或缺损的骨或骨部分。
据教导，EP-B1-2445543的CAP/HAP骨替代材料通过包括以下步骤的方法获得：
a)制备烧结的CAP芯材，
b)将烧结的CAP芯材在10℃至50℃的温度下浸入水溶液中以启动CAP到HAP的转化过程，由此在烧结的CAP芯材表面上形成均匀且封闭的外延生长的纳米晶体羟磷灰石层，外延生长的纳米晶体与人类骨矿物质尺寸和形态相同，
c)在存在至少一个HAP纳米晶体层的均匀且封闭的涂层时，但在完全完成转化过程之前，通过从水溶液中分离出固体材料而停止转化，
d)可选地对来自步骤c)的分离的材料进行灭菌。
烧结的CAP芯材的制备可以通过本领域已知的方法来进行，包括首先混合磷酸氢钙(CaHPO4)、碳酸钙和/或氢氧化钙的粉末，然后在适当的温度范围内煅烧和烧结该混合物，从而得到块状烧结的CAP芯材(参见例如Mathew M.等,1977,Acta.Cryst.B33:1325；Dickens B.等,1974,J.Solid State Chemistry 10,232；Durucan C.等,2002,J.Mat.Sci.,37:963)。
因此，可以通过以化学计量比混合磷酸氢钙(CaHPO4)、碳酸钙和/或氢氧化钙的粉末并在1200至1450℃的温度(优选约1400℃)下煅烧和烧结混合物来获得块状烧结的TCP芯材。
也可以通过上述方法获得块状烧结的TTCP芯材。
通过这种方法制备的块状烧结的CAP材料可以是多孔的，其孔隙率为2至80体积％，并且孔的分布较宽。孔隙率参数将根据CAP/HAP骨替代材料的预期用途进行选择。
步骤b)中使用的烧结的CAP芯材可以是
-如上所述制备的块状烧结的CAP芯材，
-使用常规方法(例如压碎、磨碎和/或研磨和筛分)由如上所述制备的块状烧结的CAP芯材获得的烧结的CAP芯材的颗粒或团粒，或
-具有所需的形状和尺寸的烧结的CAP芯材的预成型件，例如螺丝、钉子、销或具有身体骨质部分的轮廓的结构。
具有任何所需的形状和尺寸的这种预成型件可以使用公知的原型制作技术(例如CNC铣削或3D打印)从如上所述制备的块状烧结的芯材获得(参见例如Bartolo P.等,2008,Bio-Materials and Prototyping Applications in Medicine,Springer ScienceNewYork,ISBN 978-0-387-47682-7；Landers R.等,2002,Biomaterials 23(23),4437；Yeong W.-Y.等,2004,Trends in Biotechnology,22(12),643；Seitz H.等,2005,Biomed.Mater.Res.74B(2),782)。
据教导，步骤b)的水溶液是纯水、模拟体液或缓冲液。重要的是步骤b)的浸渍溶液的pH值是几乎中性的并且在整个转化过程中保持稳定，优选在5.5至9.0的pH范围内。
术语“模拟体液”是指模仿体液的任何溶液。优选地，模拟体液的离子浓度类似于血浆的离子浓度。
缓冲液可以是上述pH范围内的任何缓冲液，但是优选是具有或不具有钙、镁和/或钠的磷酸盐缓冲液。
实施例中使用的缓冲液(参见实施例4和5)是水性磷酸盐缓冲液。
步骤b)中的温度范围通常为10℃至50℃，优选25℃至45℃，更优选35℃至40℃。
浸入步骤b)在第一阶段引起CAP芯材的一阶相变，并因此引起HAP纳米晶体前体的成核。在第二阶段，从第一阶段得到的HAP前体将生长并建立封闭的(即，完全包覆的)外延纳米晶体复合层。第一HAP纳米晶体层必须均匀且封闭，并外延连接到烧结的CAP芯材。
在第三阶段，一阶相变可在新形成的双层复合物内进行，以进一步将烧结的CAP芯材(TCP或TTCP)转变为纳米晶体HAP。在此相变的第三步骤中，钙离子将通过缓慢扩散控制过程释放可控的时间，直到一部分烧结的CAP芯材已转变为纳米晶体HAP。可以通过改变转化时间来控制HAP层的厚度，并因此控制钙的释放速率。
具有适当厚度的外延生长的纳米晶体HAP层将在体外制备，CAP到HAP的转化在其完成之前停止。
CAP/HAP骨替代材料一旦设置在体内，CAP到HAP的转化过程就会因与体液的接触而重新激活，并且骨替代材料将发挥活体样系统的作用，形成与人骨矿物质的尺寸和形态相似的新羟磷灰石。在体内相转化过程中，所运输的钙离子将被释放到局部环境中，支持局部钙动态平衡，这对于骨再生过程非常重要和有益。
由于在身体的不同负载区域中骨缺陷的再生时间不同，因此重要的是能够控制钙的释放速率。这可以通过改变外延生长的羟磷灰石层的厚度来实现。
因此，步骤c)是非常关键的步骤。步骤b)的水溶液中的暴露时间基于所需的HAP层厚度。至少一层外延取向的纳米晶体HAP是必需的。必要的是没有完成CAP到HAP的转化。
可以通过使用磷酸钙、水泥和混凝土化学领域的技术人员公知的几个热力学微分方程来计算根据所需厚度的合适的暴露时间。
参见例如：Pommersheim,J.C.；Clifton,J.R.(1979)Cem.Conc.Res.；9:765；Pommersheim,J.C.；Clifton,J.R.(1982)Cem.Conc.Res.；12:765；Schlüssler,K.H.Mcedlov-Petrosjan,O.P.；(1990):Der Baustoff Beton,VEB Verlag Bauwesen,Berlin。
将上述微分方程的解转移到CAP/HAP体系使得能够预测CAP到HAP的相变以及层的厚度，从而可以以稳定且可重现的方式制备HAP的外延层。
在步骤c)结束时，通常使用本领域公知的技术通过过滤、洗涤和干燥来从水溶液中分离出固体材料。
在EP-B1-2445543的实施例(即实施例4[0057]和实施例5[0058])中，通过用纯化水洗涤分离的骨替代材料的团粒3次以从缓冲溶液中除去残留物来进行洗涤。
可选的灭菌步骤d)可以通过本领域公知的技术进行，例如伽马射线照射或X射线辐射。
如在EP-B1-2445543的实施例4和5中教导的，将水性磷酸盐缓冲液用于步骤b)的水溶液和使用纯化水在步骤c)结束时将分离出的团粒洗涤3次，会得到双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料，其包括烧结的CAP芯和沉积在该烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层，由此该外延生长的纳米晶体与人类骨矿物质具有相同的尺寸和形貌，其中，沉积在烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层具有不均匀的外表面，该外表面包括：由外延生长的HAP纳米晶体组成的扁平晶体片的单独(分离)的簇，和位于扁平晶体片的单独的簇之间的光滑区域，位于扁平晶体片的单独的簇之间的光滑区域所占据的表面的百分比取决于给定转化条件下的转化时间。
参见图1A，其表示原型1(1-2mm团粒)的SEM(扫描电子显微术)照片，其转化时间为30分钟，其中，经SEM测量，光滑区域约占总外表面的70％；图1B表示原型2(1-2mm团粒)的SEM照片，其转化时间为40分钟，其中，经SEM测量，光滑区域约占总外表面的50％。
WO 2015/009154公开了一种生产具有改善的骨诱导能力的骨传导材料的方法，该方法包括将具有由晶粒组成的表面形貌的烧结双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)材料不控制pH的情况下在等于或高于125℃的温度、2-4巴的压力下进行水热处理，持续足以将起始材料表面上的磷酸钙颗粒变成直径10-1500nm的磷酸钙针状物的时间。至少125℃的温度和至少2巴的压力与EP-B1-2445543中使用的(接近人体生理)条件(温度35-40℃，pH 5.5-9.0，环境压力)相去甚远，能够使HAP纳米晶体外延生长。这些针状物不是外延生长，而是附着或沉积在芯材上，仅部分(通常为40-90％)包覆后者，从而增加其比表面积和携带蛋白质的能力，从而增强其骨诱导潜力。
国际PCT专利申请WO-2019/115704的发明人发现，通过向根据EP-B1-2445543制备双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料的步骤b)的磷酸盐缓冲水溶液中加入10％至90％、优选20％至60％的短链脂肪醇(包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇或丁醇)，沉积在烧结的CAP芯材双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料的外表面上的纳米晶体HAP的封闭的外延生长层的不均匀外表面(包括扁平晶体片的单独簇和其间的光滑区域)被包含扁平晶体片(而没有扁平晶体片)的任何单独晶体簇的均匀粗糙外表面代替。该均匀的粗糙外表面通常包含外延生长的纳米晶体羟磷灰石片，形成片的互锁网络，取决于所使用的脂肪醇的量，通过SEM测定的单独的片尺寸为0.2至20μm，优选0.5至5μm。
如由胎儿人间充质干细胞(hMSC)的成骨分化体外试验所示，与EP-B1-2445543教导的具有不均匀外表面(包括扁平晶体片的单独簇和其间的光滑区域)的双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料相比，具有该均匀的粗糙外表面(包括扁平晶体片)的双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料的体内成骨反应可能更强。
因此，国际PCT专利申请WO-2019/115704的发明涉及一种双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料，其包括烧结的CAP芯和沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层，由此外延生长的纳米晶体具有与人骨矿物质相同的尺寸和形貌，其中，沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层具有包含扁平晶体片的均匀的粗糙外表面。
这种双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料显示出胎儿人间充质干细胞(hMSC)的成骨分化增强，这是体内成骨反应增强的强烈迹象。
术语“沉积在烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层”是指外延生长的纳米晶体HAP层完全覆盖烧结的CAP芯的整个外表面。
术语“包括扁平晶体片的均匀的粗糙外表面”是指宏观上由扁平晶体片引起的外表面的粗糙度在统计上均匀地分布在CAP芯的表面上，而没有扁平晶体片的单独晶体簇。参见图2，其表示具有粗糙度不同的均匀的粗糙外表面的本发明的双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料的原型3至7的SEM照片。
术语“扁平晶体片”是指对于三个垂直方向，高度(厚度)远小于宽度和长度的晶体组装体。这种扁平晶体片在图3B中清晰可见。
通常，该均匀的粗糙外表面包含外延生长的纳米晶体羟磷灰石片，形成经SEM测定的尺寸(宽度和长度)为0.2至20μm的片的互锁网络。片的尺寸越大，外表面的粗糙度越高。
优选地，该均匀的粗糙外表面包含外延生长的纳米晶体羟磷灰石片，形成经SEM测定的尺寸为0.5至5μm的片的互锁网络。
通常，该均匀的粗糙外表面包含外延生长的羟磷灰石片，形成包含由压汞法(MIP)测定的0.03至2μm的孔的互锁网络。0.03至2μm的孔体积越大，外表面的粗糙度越高。
通常，该均匀的粗糙外表面可以通过AFM(原子力显微术)用下述特征来表征：源自AFM的均方根粗糙度(Rq)为50至400nm，并且轮廓的平均最大高度(Rz)为500至2000nm。
优选地，该均匀的粗糙外表面可以用下述特征来表征：源自AFM的均方根粗糙度(Rq)为110至150nm，并且轮廓的平均最大高度(Rz)为550至750nm。
通常，在双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料中通过XRD测量的HAP的百分比为1至90％。
优选地，通过XRD测量的百分比为1.5％至30％，更优选为2％至15％。
烧结的CAP芯可以包含磷酸三钙(TCP)，特别是α-TCP(α-Ca3(PO4)2)或β-TCP(β-Ca3(PO4)2)，和/或磷酸四钙(TTCP)Ca4(PO4)2O。
根据常用实施方式，烧结的CAP芯基本上由TCP组成，优选α-TCP。
外延生长的纳米晶体HAP层在结构上与天然人骨矿物质几乎相同。
CAP/HAP骨替代材料可以是颗粒或团粒，所述颗粒或团粒具有所需的尺寸和形状。通常，颗粒或团粒的尺寸为250至5000μm，优选1000至2000μm。
CAP/HAP骨替代材料也可以是成形体，例如螺丝、钉子、销或具有身体骨质部分(例如特别是髋骨、锁骨、肋骨、下颌骨或颅骨部分)轮廓的结构。这样的螺丝、钉子或销可用于重塑性矫形外科手术中，以将韧带固定到例如膝盖或肘部的骨头上。这种具有身体骨质部分的轮廓的结构可以在矫形外科手术中用作假体，以置换缺失或缺损的骨或骨部分。
国际PCT专利申请WO-2019/115704的发明还涉及一种油灰，其在合适的基质(通常包含天然或合成聚合物)中包含上述定义的CAP/HAP骨替代物的颗粒或团粒。通常，颗粒或团粒的尺寸为250至5000μm，优选1000至2000μm。
国际PCT专利申请WO-2019/115704的发明还涉及一种制备上述定义的CAP/HAP骨替代材料的方法，其包括以下步骤：
a)制备烧结的CAP芯材，
b)将烧结的CAP芯材在10℃至50℃的温度下浸入包含10％至90％的短链脂肪族醇的缓冲溶液中以启动CAP到HAP的转化过程，由此在烧结的CAP芯材表面上将形成封闭的外延生长的纳米结晶羟磷灰石层，由此该外延生长的纳米晶体与人类骨矿物质的尺寸和形态相同，其中，在所述烧结的CAP芯材表面上形成的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层具有包含扁平晶体片的均匀外表面，
c)在存在至少一个HAP纳米晶体层的封闭的涂层时，但在完全完成转化过程之前，通过从水溶液中分离出固体材料而停止转化，并且
d)可选地对来自步骤c)的分离的材料进行灭菌。
合适的短链脂肪醇可选自由甲醇、乙醇、丙醇和丁醇组成的组。
优选地，短链脂肪醇是乙醇。
优选地，步骤b)的缓冲溶液含有20-60％、更优选30-50％的短链脂肪醇。
沉积在烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层的均匀粗糙外表面的粗糙度参数，特别是：
-AFM参数：源自AFM的均方根粗糙度(Rq)和轮廓的平均最大高度(Rz)，
-经SEM测定的外延生长的纳米晶体羟磷灰石片的尺寸，以及
-由MIP测定的0.03至2μm的孔的体积
可以通过改变转化溶液的缓冲溶液中短链脂肪醇的百分比来方便地调节。
该百分比越高，源自AFM的均方根粗糙度(Rq)和轮廓的平均最大高度(Rz)越低，经SEM测定的外延生长的纳米晶体羟磷灰石片的尺寸越小，由MIP测定的0.03至2μm的孔的体积越小。
通过将水性缓冲溶液与不同量的短链脂肪醇混合，获得步骤b)的包含10-90％短链脂肪醇的缓冲溶液。选择水性缓冲溶液，使得还包含10至90％的短链脂肪醇的步骤b)的浸渍溶液的pH值接近中性并且在整个转化过程中保持稳定，其优选在5.5至9.0的pH范围内，更优选7.0至8.0。
缓冲液可以是上述pH范围内的任何缓冲液，但是优选是具有或不具有钙、镁和/或钠的磷酸盐缓冲液。
合适的缓冲溶液是例如0.05-0.3M的磷酸二氢钠(NaH2PO4)水溶液，pH值为7.3至7.6。
步骤b)中的温度范围通常为10℃至50℃，优选25℃至45℃，更优选35℃至40℃。
优选地，步骤b)在35至40℃的温度下在包含20至60％的短链脂肪醇的pH为7.0至8.0的磷酸盐缓冲溶液中进行。
烧结的CAP芯材的制备可以通过本领域已知的方法来进行，包括首先混合磷酸氢钙(CaHPO4)、碳酸钙和/或氢氧化钙的粉末，然后在适当的温度范围内煅烧和烧结该混合物，从而得到块状烧结的CAP芯材(参见例如Mathew M.等,1977,Acta.Cryst.B33:1325；Dickens B.等,1974,J.Solid State Chemistry 10，232；Durucan C.等,2002,J.Mat.Sci.,37:963)。
因此，可以通过以化学计量比混合磷酸氢钙(CaHPO4)、碳酸钙和/或氢氧化钙的粉末并在1200至1450℃的温度(优选约1400℃)下煅烧和烧结混合物来获得块状烧结的TCP芯材。
也可以通过上述方法获得块状烧结的TTCP芯材。
通过这种方法制备的块状烧结的CAP材料可以是多孔的，其孔隙率为2至80体积％，并且孔的分布较宽。孔隙率参数将根据CAP/HAP骨替代材料的预期用途进行选择。
步骤b)中使用的烧结的CAP芯材可以是
-如上所述制备的块状烧结的CAP芯材，
-使用常规方法(例如压碎、磨碎和/或研磨和筛分)由如上所述制备的块状烧结的CAP芯材获得的烧结的CAP芯材的颗粒或团粒，或
-具有所需的形状和尺寸的烧结的CAP芯材的预成型件，例如螺丝、钉子、销或具有身体骨质部分的轮廓的结构。
具有任何所需的形状和尺寸的这种预成型件可以使用公知的原型制作技术(例如CNC铣削或3D打印)从如上所述制备的块状烧结的芯材获得(参见例如Bartolo P.等,2008,Bio-Materials and Prototyping Applications in Medicine,Springer ScienceNewYork,ISBN 978-0-387-47682-7；Landers R.等,2002,Biomaterials 23(23),4437；Yeong W.-Y.等,2004,Trends in Biotechnology,22(12),643；Seitz H.等,2005,Biomed.Mater.Res.74B(2),782)。
浸入步骤b)在第一阶段引起CAP芯材的一阶相变，并因此引起HAP纳米晶体前体的成核。在第二阶段，从第一阶段得到的HAP前体将生长并建立封闭的(即，完全包覆的)外延纳米晶体复合层。第一HAP纳米晶体层必须均匀且封闭，并外延连接到烧结的CAP芯材。
在第三阶段，一阶相变可在新形成的双层复合物内进行，以进一步将烧结的CAP芯材(TCP或TTCP)转变为纳米晶体HAP。在此相变的第三步骤中，钙离子将通过缓慢扩散控制过程释放可控的时间，直到一部分烧结的CAP芯材已转变为纳米晶体HAP。可以通过改变转化时间来控制HAP层的厚度，并因此控制钙的释放速率。
具有适当厚度的外延生长的纳米晶体HAP层将在体外制备，CAP到HAP的转化在其完成之前停止。
CAP/HAP骨替代材料一旦设置在体内，CAP到HAP的转化过程就会因与体液的接触而重新激活，并且骨替代材料将发挥活体样系统的作用，形成与人骨矿物质的尺寸和形态相似的新羟磷灰石。
在体内相转化过程中，所运输的钙离子将被释放到局部环境中，支持局部钙动态平衡，这对于骨再生过程非常重要和有益。
由于在身体的不同负载区域中骨缺陷的再生时间不同，因此重要的是能够控制钙的释放速率。这可以通过改变外延生长的羟磷灰石层的厚度来实现。
因此，步骤c)是非常关键的步骤。步骤b)的水溶液中的暴露时间基于所需的HAP层厚度。至少一层外延取向的纳米晶体HAP是必需的。必要的是没有完成CAP到HAP的转化。
可以通过使用磷酸钙以及水泥和混凝土化学领域的技术人员公知的几个热力学微分方程来计算根据所需厚度的合适的暴露时间。
参见例如：Pommersheim,J.C.；Clifton,J.R.(1979)Cem.Conc.Res.；9:765；Pommersheim,J.C.；Clifton,J.R.(1982)Cem.Conc.Res.；12:765；Schlüssler,K.H.Mcedlov-Petrosjan,O.P.；(1990):Der Baustoff Beton,VEB Verlag Bauwesen,Berlin。
将上述微分方程的解转移到CAP/HAP体系使得能够预测CAP到HAP的相变以及层的厚度，从而可以以稳定且可重现的方式制备HAP的外延层。
通常使用本领域公知的技术通过过滤和干燥来从水溶液中分离出固体材料。
可选的灭菌步骤d)可以通过本领域公知的技术进行，例如伽马射线照射或X射线辐射。
国际PCT专利申请WO-2019/115704的发明的CAP/HAP骨替代材料及其制备方法的优点。
具有包含扁平晶体片的均匀的粗糙外表面的本发明的双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料显示出，与EP-B1-2445543教导的具有不均匀外表面(包括扁平晶体片的单独簇和其间的光滑区域)的双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料相比，胎儿人间充质干细胞(hMSC)的成骨分化增加，特别是分化标志物骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)的表达更高。这是体内成骨反应增强的强烈迹象。
这与R.A.Gittens等在Biomaterials 2011年5月,32(13):3395-3403中发表的结果一致，该文献显示，引入纳米级结构与微米-亚微米级粗糙度相结合改善了成骨细胞的分化和局部因子的产生，进而表明改善植入物的体内骨整合的潜力。
本发明的双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料的制备方法允许方便地调节沉积在烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层的均匀的粗糙外表面的粗糙度参数，特别是：
-AFM参数：源自AFM的均方根粗糙度(Rq)和轮廓的平均最大高度(Rz)，
-经SEM测定的外延生长的纳米晶体羟磷灰石片的尺寸，以及
-由MIP测定的0.03至2μm的孔的体积，
可以通过调节转化溶液的缓冲溶液中短链脂肪醇的百分比来进行。
该百分比越高，源自AFM的均方根粗糙度(Rq)和轮廓的平均最大高度(Rz)越低，经SEM测定的外延生长的纳米晶体羟磷灰石片的尺寸越小，由MIP测定的0.03至2μm的孔的体积越小。
发明内容
如上所述，国际PCT专利申请WO-2019/115704公开了一种油灰材料，其在合适的基质(通常包含天然或合成聚合物)中包含上述定义的CAP/HAP骨替代物的颗粒或团粒。通常，颗粒或团粒的尺寸为250至5000μm，优选1000至2000μm。对于油灰基质没有教导具体的合成或天然聚合物。
该国际申请未提及该CAP/HAP骨替代物的任何条带、任何塞子或任何团粒混合物。
申请人现在已经发现如何制备在胶原基质中包含上述定义的CAP/HAP骨替代材料的颗粒或团粒的具有合适的处理特性的油灰，并且已经在兔后外侧脊柱融合(PLF)模型中测试了这样的油灰。
申请人还发现了如何制备处于胶原基质中的该CAP/HAP骨替代材料的条带和塞子以及该CAP/HAP骨替代材料的新团粒混合物。
因此本发明涉及一种包含双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料的颗粒的胶原基质，所述颗粒包括烧结的CAP芯和沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层，由此外延生长的纳米晶体具有与人骨矿物质相同的尺寸和形貌，其中，沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层具有包含扁平晶体片的均匀的粗糙外表面。
该胶原基质特别适用于形成油灰、条带或塞子材料。
所述胶原可以是用酸性溶液(pH通常为2至5)处理过的天然交联的胶原。这种处理可用于胶原的湿式研磨以获得均匀的浆料，然后在酸性环境中(通常在2至5的pH下)或在碱性环境中(通常在11至13的pH下)，将其与CAP/HAP骨替代材料的颗粒混合。上述程序允许为胶原基质赋予油灰所需的成型性和内聚性特性。
在美国专利第5,837,278号中记载了具有高度原生性(nativity)的合适的天然交联胶原。这种胶原以名字Geistlich
Figure BDA0003390772230000131
(Geistlich Pharma AG，瑞士)市售。
胶原还可以是去端肽(atelopeptide)胶原，其通过用如胰蛋白酶或胃蛋白酶等蛋白水解酶对原生的天然交联胶原进行酶消化而获得。
当胶原基质用作条带或塞子时，胶原通常是通过使用脱水热处理(DHT)进行物理交联或通过例如使用EDC/NHS进行化学交联而已经刚性化的天然交联胶原。
通常，胶原基质包含60-97重量％的骨替代材料和3-40重量％的胶原，优选75-85重量％的骨替代材料和15-25重量％的胶原。
正如国际PCT专利申请WO-2019/115704所教导的，上述定义的双相CAP/HAP骨替代材料显示出优异的促进骨形成的能力。
通常，该均匀的粗糙外表面包含外延生长的纳米晶体羟磷灰石片，形成经SEM测定的尺寸(宽度和长度)为0.2至20μm的片的互锁网络。片的尺寸越大，外表面的粗糙度越高。
优选地，该均匀的粗糙外表面包含外延生长的纳米晶体羟磷灰石片，形成经SEM测定的尺寸为0.5至5μm的片的互锁网络。
通常，该均匀的粗糙外表面包含外延生长的羟磷灰石片，形成包含由压汞法(MIP)测定的0.03至2μm的孔的互锁网络。0.03至2μm的孔体积越大，外表面的粗糙度越高。
通常，该均匀的粗糙外表面可以通过AFM(原子力显微术)用下述特征来表征：源自AFM的均方根粗糙度(Rq)为50至400nm，并且轮廓的平均最大高度(Rz)为500至2000nm。
优选地，该均匀的粗糙外表面可以用下述特征来表征：源自AFM的均方根粗糙度(Rq)为110至150nm，并且轮廓的平均最大高度(Rz)为550至750nm。
优选地，通过XRD测量的HAP的百分比为1.0％至10.0％，或2.0％至5.0％。
烧结的CAP芯可以包含磷酸三钙(TCP)，特别是α-TCP(α-Ca3(PO4)2)或β-TCP(β-Ca3(PO4)2)，和/或磷酸四钙(TTCP)Ca4(PO4)2O。
根据常用实施方式，烧结的CAP芯基本上由TCP组成，优选α-TCP。
外延生长的纳米晶体HAP层在结构上与天然人骨矿物质几乎相同。
CAP/HAP骨替代材料可以是颗粒或团粒，所述颗粒或团粒具有所需的尺寸和形状。通常，颗粒或团粒的尺寸为250至5000μm，优选500至2000μm。
上述胶原基质可以包括以下颗粒的混合物：上述根据国际PCT专利申请WO-2019/115704的双相CAP/HAP骨替代材料的颗粒(HAP含量低(最多6.0％)，可快速吸收，从而促进新骨形成)，和根据EP-B1-2445543的双相CAP/HAP骨替代材料的颗粒(HAP含量高(至少10.0％)，可缓慢吸收)，或源自天然骨的材料的颗粒(可缓慢吸收，这种可缓慢吸收的材料具有骨传导作用)。
一种公知的源自天然骨的可缓慢吸收的材料是Geistlich
Figure BDA0003390772230000151
它是通过美国专利第5,167,961号中描述的工艺由天然骨制造的，提供基本上保留天然骨的原始晶体结构和矿物微结构同时有机杂质含量低于150ppm且蛋白质含量低于135ppm的骨矿物质。
本发明因此涉及一种胶原基质，其包含：
-双相(CAP/HAP)骨替代材料(A)的颗粒，其包括烧结的CAP芯和沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层，由此外延生长的纳米晶体具有与人骨矿物质相同的尺寸和形貌，其中，沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层具有包含扁平晶体片的均匀的粗糙外表面，其中通过XRD测量的HAP的百分比为2.0％至6.0％，和
-骨替代材料(B)的颗粒，其选自由以下材料组成的组：
-双相CAP/HAP骨替代材料，其包括烧结的CAP芯和沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的至少一个封闭的外延生长的纳米晶体HAP层，由此外延生长的纳米晶体具有与人骨矿物质相同的尺寸和形貌，其中通过XRD测量的HAP的百分比为10％至40％，或
-骨矿物质，其源自天然骨并且基本上保留天然骨的原始晶体结构和矿物微结构，同时有机杂质含量低于150ppm，蛋白质含量低于135ppm。
优选地，当该胶原基质用作后外侧脊柱融合术(PLF)的油灰材料时：
-在CAP/HAP骨替代材料(A)的颗粒中，通过XRD测量的HAP的百分比为2.0％至6.0％，并且
-骨替代材料(B)的颗粒是双相CAP/HAP骨替代材料的颗粒，其包括烧结的CAP芯和沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的至少一个封闭的外延生长的纳米晶体HAP层，由此外延生长的纳米晶体具有与人骨矿物质相同的尺寸和形貌，其中通过XRD测量的HAP的百分比为30％至40％。
通常，当该胶原基质用作口腔塞材料时：
-在CAP/HAP骨替代材料(A)的颗粒中，通过XRD测量的HAP的百分比为2.0％至6.0％，并且
-骨替代材料(B)的颗粒是源自天然骨的骨矿物质的颗粒，其基本上保留天然骨的原始晶体结构和矿物微结构，同时有机杂质含量低于150ppm，蛋白质含量低于135ppm。
通常，CAP/HAP骨替代材料(A)的颗粒与骨替代材料(B)的颗粒的重量比为0.1至9.9。
优选地，当该胶原基质用作PLF用油灰材料时，CAP/HAP骨替代材料(A)的颗粒与骨替代材料(B)的颗粒的重量比为0.4至1.0。
优选地，当该胶原基质用作口腔塞材料时，CAP/HAP骨替代材料(A)的颗粒与骨替代材料(B)的颗粒的重量比为0.8至4。
通常，该胶原基质通过包括以下步骤的方法制备：将原生的天然交联胶原的胶原纤维分散到pH为2至5的酸性溶液或pH为11至13的碱性溶液中以产生胶原浆料，将该胶原浆料与上述双相CAP/HAP骨替代材料混合并均化。
然后通常将胶原–CAP/HAP浆料冷冻干燥，并通过伽马射线或X射线照射或环氧乙烷处理进行灭菌。
在植入之前，经冻干和灭菌的油灰通常用血液或等渗盐水溶液再水化。
本发明还涉及一种制备用作油灰材料的上述胶原基质的方法，其包括将原生的天然交联胶原的胶原纤维分散到pH为2至5的酸性溶液中以产生胶原浆料，将该胶原浆料与上述双相CAP/HAP骨替代材料的颗粒混合并均化以制备胶原/CAP/HAP浆料，将该浆料冷冻干燥并通过伽马射线或X射线照射或环氧乙烷处理进行灭菌。
优选地，将酸性胶原浆料在胶体磨、混合磨或切割磨中进行湿式研磨。
本发明还涉及一种特别是用作骨替代材料的颗粒共混物，其包括下述颗粒的混合物：上述根据国际PCT专利申请WO-2019/115704的双相CAP/HAP骨替代材料的颗粒(HAP含量低(最多6.0％)，可快速吸收，从而促进新骨形成)，和根据EP-B1-2445543的双相CAP/HAP骨替代材料的颗粒(HAP含量高(至少10.0％)，可缓慢吸收)，或源自天然骨的材料的颗粒(可缓慢吸收，这种可缓慢吸收的材料具有骨传导作用)。
一种公知的源自天然骨的可缓慢吸收的材料是Geistlich
Figure BDA0003390772230000161
它是通过美国专利第5,167,961号中描述的工艺由天然骨制造的，提供基本上保留天然骨的原始晶体结构和矿物微结构同时有机杂质含量低于150ppm且蛋白质含量低于135ppm的骨矿物质。
因此本发明涉及一种颗粒共混物，其包含：
-双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料的颗粒，其包括烧结的CAP芯和沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层，由此外延生长的纳米晶体具有与人骨矿物质相同的尺寸和形貌，其中，沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层具有包含扁平晶体片的均匀的粗糙外表面，其中通过XRD测量的HAP的百分比为2.0％至6.0％，和
-骨替代材料(B)的颗粒，其选自由以下材料组成的组：
-双相CAP/HAP骨替代材料，其包括烧结的CAP芯和沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的至少一个封闭的外延生长的纳米晶体HAP层，由此外延生长的纳米晶体具有与人骨矿物质相同的尺寸和形貌，其中通过XRD测量的HAP的百分比为10％至40％，或
-骨矿物质，其源自天然骨并且基本上保留天然骨的原始晶体结构和矿物微结构，同时有机杂质含量低于150ppm，蛋白质含量低于135ppm。
优选地，在该颗粒共混物中：
-在CAP/HAP骨替代材料(A)的颗粒中，通过XRD测量的HAP的百分比为2.0％至6.0％，并且
-骨替代材料(B)的颗粒是双相CAP/HAP骨替代材料的颗粒，其包括烧结的CAP芯和沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的至少一个封闭的外延生长的纳米晶体HAP层，由此外延生长的纳米晶体具有与人骨矿物质相同的尺寸和形貌，其中通过XRD测量的HAP的百分比为30％至40％。
通常，CAP/HAP骨替代材料(A)的颗粒与骨替代材料(B)的颗粒的重量比为0.1至9.9。
具体实施方式
附图说明
下面将参照本发明的优选实施方式的说明性实例和附图进一步详细说明本发明，其中：
图1A表示EP-B1-2445543公开并在实施例1中制备的转化时间为30分钟的骨替代材料的原型1(1-2mm团粒)的SEM照片，其中，经SEM测量，光滑区域占总外表面的约70％。
图1B表示EP-B1-2445543公开并在实施例1中制备的转化时间为40分钟的骨替代材料的原型2(1-2mm团粒)的SEM照片，其中，经SEM测量，光滑区域占总外表面的约50％。
图2A-2E表示本发明的骨替代材料的原型3(图2A：20％乙醇，1-2mm团粒)、原型4(图2B：30％乙醇，1-2mm团粒)、原型5(图2C：40％乙醇，1-2mm团粒)、原型6(图2D：50％乙醇，1-2mm团粒)和原型7(图2E：60％乙醇，1-2mm团粒)的SEM照片。
图1和图2A-2E的所有SEM照片的放大倍数为3500。
图3A表示原型5(40％乙醇，1-2mm团粒)的截面在低放大倍数(1000倍)下的SEM照片。右下角显示团粒的外表面，颗粒的中心位于左上角。
图3B表示原型5(40％乙醇，1-2mm团粒)的截面在较高放大倍数(14000倍)下的SEM照片。
图4表示实施例2中制备的本发明的骨替代材料的无孔盘的原型3a(左：20％乙醇)和6a(右：50％乙醇)的SEM照片(上面两张照片)和AFM照片(其他四张照片)。
图5A-5B表示在体外试验中，与现有技术骨替代材料相比，与本发明的骨替代材料接触的胎儿人间充质干细胞(hMSC)的骨钙素(OCN，图5A)和骨桥蛋白(OPN，图5B)反应。
图6表示在实施例2中制备的本发明的骨替代材料的1-2mm团粒的原型3(20％乙醇)、5(40％乙醇)和7(60％乙醇)的1-2mm团粒和如实施例1中所述制造的纯α-TCP的MIP图。
图7表示植入实施例6 3)中制备的本发明的胶原基质油灰原型后12周的兔脊柱放射显影图。
图8表示植入后12周的使用实施例6中制备的本发明的胶原基质油灰原型的兔中的PLF过程的树脂组织学荧光显微照片。
下列实施例说明本发明而不限制其范围。
实施例1制备EP-B1-2445543的双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料
类似于EP-B1-2445543的实施例1、2和4，制备了α-TCP的块状烧结材料、其多孔团粒(粒径为1.0-2.0mm)以及具有外延生长的HAP涂层的转化的团粒。
使用实验室搅拌器将364g无水磷酸二钙粉末、136g碳酸钙粉末和220ml去离子水在700rpm下混合5分钟。立即将来自混合过程的浆料转移到高温稳定的铂杯中。将装满的铂杯放入冷炉中。使用100℃/小时的加热速率将炉加热到1400℃。保持该温度12小时，然后以500℃/小时的冷却速率将炉冷却至800℃，然后以125℃/小时的冷却速率冷却至300℃，最后通过关闭炉来冷却到室温。从炉和铂杯中取出块状烧结材料(相纯α-Ca3(PO4)2)。使用粉末X射线衍射分析进行相纯度的控制。
使用颚式破碎机(颚距为10到1mm)将块状产品破碎。使用筛分机和网孔为2mm和1mm的筛片对所产生的团粒进行筛分。筛分后，用乙醇冲洗团粒，以分离出吸附到团粒上的细粉残余物。将多孔团粒在箱式干燥机中于80℃下干燥1小时。冲洗后的颗粒表面的清洁度通过用扫描电子显微镜表面观察来控制。
通过将0.4mol/l磷酸二氢钠(NaH2PO4)溶解在蒸馏水中，制备适合于涂覆和相转化过程的缓冲溶液。使用氢氧化钠(NaOH)在室温下将溶液的pH调至7.45。将根据前述段落产生的团粒浸入制备的溶液中，并在调温的水浴(40℃)中分别储存30分钟(原型1)和40分钟(原型2)。浸渍后，用蒸馏水将团粒冲洗3次以停止相转化过程，并从缓冲溶液中除去残留物。将多孔团粒在箱式干燥机中于100℃干燥2小时。
对原型1和原型2的团粒进行放大倍数为3500倍的SEM。
从表示原型1和2的SEM照片的图1A和1B可以看出，团粒的外表面是不均匀的，包括由外延生长的HAP纳米晶体和晶体之间的光滑区域组成的扁平晶体片的单独(分离)的簇。
通过在原型1和原型2各自的SEM图片上测量单独的簇和光滑区域所占据的表面，由此确定光滑区域占原型1的外表面的约70％，占原型2的外表面的约50％。
实施例2制备国际PCT专利申请WO-2019/115704的发明的双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料
1)制备骨替代材料颗粒
如以上实施例1中所述的制造1-2mm尺寸的相纯α-TCP的多孔团粒。
相转化和涂覆步骤在放入设定为40℃的水浴中的玻璃烧瓶中进行。转化缓冲液是磷酸二氢钠(NaH2PO4)与不同比例乙醇混合的水溶液。磷酸二氢钠水溶液的摩尔浓度在0.05M至0.3M之间变化，乙醇含量为20至60重量％。转化溶液的pH为7.3至7.6。
用转化缓冲液填充玻璃烧瓶，并以1:40至1:80(颗粒:转化溶液)的比例加入α-TCP团粒。将团粒浸入40℃的转化溶液中24至72小时的时间。浸渍后，用去离子水冲洗5次(团粒与水的重量比为1:10)并用乙醇(99.9％，团粒与乙醇的重量比为1:10)冲洗2次来停止相转化过程，并从缓冲溶液中取出残留物。将多孔团粒在箱式干燥机中于100℃干燥2小时。
使用SEM观察涂覆和相转化过程后的表面形貌。
图2表示本发明的骨替代材料的原型3(20％乙醇)、原型4(30％乙醇)、原型5(40％乙醇)、原型6(50％乙醇)和原型7(60％乙醇)的放大3500倍的SEM照片。通过对比图1A和1B与图2可以看出，原型1和2的具有扁平晶体片的单独簇和其间的光滑区域的不均匀外表面被没有任何单独晶体簇的均匀粗糙外表面代替。该均匀的粗糙外表面由外延生长的羟磷灰石片的互锁网络构建。如通过SEM分析所观察到的，通过增加转化溶液中的乙醇含量可减小个体片晶尺寸，从而降低外表面的粗糙度。
图3A表示原型5(40％乙醇，1-2mm团粒)的截面在低放大倍数(1000倍)下的SEM照片。右下角显示团粒的外表面，颗粒的中心位于左上角。
图3B表示原型5(40％乙醇，1-2mm团粒)的截面在更高放大倍数(14000倍)下的SEM照片，其中可以清楚地看到作为粗糙表面的构建块的单独的扁平晶体片。团粒中心的粗糙外表面与团粒外表面的粗糙外表面没有区别。
通过压汞法(MIP)测定孔径分布
使用压汞法(MIP)测定团粒的孔径分布。MIP是一种用于测定多孔材料的孔径分布的标准表征技术。该技术是本领域公知的，例如记载于Gregg,S.J.and Sing,K.S.W.,Adsorption,Surface Area and Porosity,第2版,Academic Press Inc.(1982),173-190中。
图6表示本发明的骨替代材料的原型3、5和7与纯α-TCP(根据实施例1制造，原型3、5和7的芯材)相比的MIP图。所有测量均使用1-2mm团粒进行。
可以看出，纯α-TCP样品由于其表面光滑，在0.03至2μm范围内没有任何孔隙。由于由外延生长的羟磷灰石片的互锁网络构建的均匀的粗糙外表面的多孔性质，本发明的所有骨替代材料都含有0.03至2μm范围内的孔。粗糙外表面的孔体积对应于在0.03至2μm的范围内的MIP曲线下的面积，取决于互锁网络的单个片尺寸。单个片越大，互锁网络包含的孔体积越高。因此，互锁网络包含的孔体积可以直接与表面的粗糙度相关。MIP图中0.03至2μm范围内的孔体积越大，表面的粗糙度越高。原型3在所示原型的0.03至2μm范围内具有最大的孔体积(曲线下方的面积)，其次是原型5和7。由图2A-2E中的SEM分析确认，原型的粗糙度从原型3到原型5和7不断降低。
2)制备骨替代材料的无孔盘
将如以上实施例1中所述制造的1-2mm尺寸的相纯α-TCP的团粒用行星式磨机以150rpm研磨20小时以获得细粉末。将细粉末装入压模中，用手动压机以1吨的负荷压实。将生坯从模具中取出并转移到高温炉中。使用250℃/小时的加热速率将炉加热到1450℃。保持该温度24小时，之后以500℃/小时的冷却速率将炉冷却至800℃，然后以150℃/小时的冷却速率冷却至室温。从炉中取出块状烧结的无孔材料(相纯α-Ca3(PO4)2)。使用粉末X射线衍射分析进行相纯度的控制，并使用SEM分析表面特性。
按上述1)所述进行制备的盘的相转化和涂覆，唯一的区别在于α-TCP与转化溶液的重量比为1:3.5。
由此制备了本发明的骨替代材料的原型3a(20％乙醇)和6a(50％乙醇)。
使用SEM观察涂覆和相转化过程后的表面形貌。相应的粗糙度参数使用原子力显微术AFM测定。
图4中的SEM图像证实，无孔盘的均匀的粗糙外表面的形貌与使用实施例2第1段的相应乙醇含量制造的团粒的粗糙外表面相同(原型3和3a以及原型6和6a)。
原子力显微术(AFM)
在轻敲模式下使用原子力显微镜(TT-AFM，AFM Workshop)评估纳米级的表面测量。AFM分析是在环境气氛下使用直径为11mm且高度为1mm的无孔圆柱形盘进行的。使用了190kHz的共振频率和至多10nm的尖端半径。每次AFM分析都在50μm×50μm区域上进行，并扫描每组的三个样品。通过应用数值校正对原始数据进行面平整以消除倾斜度，并使用Gwyddion软件确定均方根粗糙度(Rq)的平均值和轮廓的平均最大高度(Rz)。
表面的类似表面表征例如记载于US-2013-0045360-A1。
图4表示根据本发明制备的无孔盘的原型3a(20％乙醇，左侧)和6a(50％乙醇，右侧)的AFM照片。原型3a和6a的源自AFM的粗糙度值可以在下表1中找到。
表1.原型3a和6a的源自AFM的粗糙度值
R<sub>q</sub>[nm] R<sub>z</sub>[nm]
原型3a(20％乙醇) 237±31 1391±194
原型6a(50％乙醇) 130±13 630±82
如表1所示，通过将乙醇含量从20％增加到50％，均方根粗糙度(Rq)的平均值从237nm减少至130nm，轮廓的平均最大高度(Rz)从1391nm减少至630nm。
实施例3胎儿人间充质干细胞(hMSC)的成骨分化的体外试验。
为了评估在实施例1和2中制备的骨替代材料原型是否支持成骨分化，在这些骨替代材料原型的320mg团粒上接种了从妊娠22周后从人胎儿股骨中分离的约200000个hMSC(由ScienCell市售：Cat#7500，Lot#6890)并培养三周。培养的前7天使用市售hMSC扩增培养基(MSCM培养基，Cat#7501，ScienCell)来最佳地支持细胞增殖。对于接下来的14天，将培养基更换为补充有10％FBS和青霉素/链霉素的DMEM。没有向细胞培养基中添加其他成骨剂。hMSC培养三周后，分离出全部mRNA，转录成cDNA，并进行实时定量PCR。在ΔΔCT方法(参见Livak K.J.and Schmittgen T.D.,Analysis of relative gene expression data usingreal time quantitative PCR and the2-ΔΔCT method,2001,Methods 25,pp.402-408)之后使用GAPDH作为管家基因(house-keeping gene)计算基因表达。测量了实施例1和2中制备的所有团粒形式(1-2mm)的骨替代材料原型的成骨分化标志物骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)的表达。
那些测量表明，与实施例1的现有技术骨替代材料原型相比，实施例2的本发明的骨替代材料原型的成骨分化标志物OPN和OCN的表达显著更高(参见图5A-5B)。
基于这些体外结果，预期在体内对本发明的骨替代材料原型的成骨反应增强。
实施例4国际PCT专利申请WO-2019/115704的发明的双相CAP/HAP骨替代材料与人骨矿物质的HAP纳米晶体的晶体尺寸和形貌比较。
晶体尺寸分析通过如EP-B1-2445543中那样使用X射线衍射数据(通过对原型3的样品和天然人骨矿物质应用布拉格方法)的精修来进行。
本发明与人骨矿物质具有相同的形貌和相同的晶体尺寸。
参见下表2。
表2.本发明的CAP/HAP骨替代物与人骨矿物质的HAP晶体尺寸和形貌的比较
Figure BDA0003390772230000231
实施例5制备本发明的胶原基质，其包含根据国际PCT专利申请WO-2019/115704的含有3.0重量％HAP的CAP/HAP骨替代材料的颗粒。
1)制备含有3.0重量％HAP的快速吸收双相CAP/HAP骨替代材料
根据国际PCT专利申请WO-2019/115704，通过与上述实施例2所述接近的方法制造0.5-2mm尺寸的双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料的多孔颗粒。转化缓冲液是含有50％乙醇的0.1M的磷酸二氢钠(NaH2PO4)溶液。通过XRD测量的来自表面转化的HAP含量为3.0重量％。
2)制备用作油灰的本发明的胶原基质
将选定量的胶原纤维(3重量％)分散在去离子水中。用于生产油灰材料的胶原纤维的来源与来自Geistlich Pharma AG的市售产品Geistlich
Figure BDA0003390772230000232
相同。随后，用2M盐酸溶液将浆料的pH值调节至pH＝3.5。然后，使用胶体磨机对浆料进行湿式研磨。下一步，将上述1)中制备的双相CAP/HAP骨替代材料颗粒以80重量％骨替代材料和20重量％胶原的比例加入到胶原浆料中。在加入骨替代材料后，用抹刀手动将浆料均化。然后，将浆料填充到金属模具(23mm×23mm×6mm)中，然后冻干(冷冻至-40℃，在-5℃和300μbar下进行24小时的一次干燥，在20℃和10μbar下进行11小时的二次干燥)。冻干的材料用X射线照射灭菌。
通过用血液或等渗盐水溶液再水合获得具有良好处理特性的油灰原型。
评估油灰原型的处理特性的程序：
将油灰材料与特定量的肝素化血液接触，然后测试方案包括以下步骤：
1.润湿性：泡沫可以在4分钟内用肝素化血液润湿(无需操作)。
2.挤压：可以挤出额外的血液。
3.粘性：油灰不会粘在手套或仪器上。
4.内聚性：油灰具有内聚性，不会散开。
5.成型性：可成型油灰可以很容易地形成所需的形状(球形是最具挑战性的形式)。
6.耐压性：在施加压力时，材料没有被推到边上。
3)制备用作条带或塞子的本发明的胶原基质
将上述实施例的2)中获得的冻干材料在0.1-10mbar和80-140℃下进行12-96小时的脱水热处理(DHT)。为得到塞子材料，本实施例的2)中的金属模具是直径为8至12mm且深度为8至16mm的圆柱形或圆锥形。
实施例6制备胶原基质，其包含根据国际PCT专利申请WO-2019/115704的含有3.0重量％HAP的CAP/HAP骨替代材料的颗粒和根据EP-B1-2445543的含有35重量％HAP的CAP/HAP骨替代材料的颗粒的混合物。
1)制备根据EP-B1-2445543的含有35％HAP的慢吸收双相CAP/HAP骨替代材料
根据EP-B1-2445543中记载的方法，制造0.5-2mm尺寸的双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料的多孔颗粒。转化缓冲液是pH为7.45±0.1的0.15M的磷酸二氢钠(NaH2PO4)溶液。将α-TCP团粒浸入40℃的转化溶液中24小时。在表面转化后，将团粒洗涤并在箱式干燥机中干燥。通过XRD测量的来自表面转化的HAP含量为35重量％。
2)制备颗粒共混物，双相骨替代材料的快吸收和慢吸收颗粒的混合物
将上面在实施例5的1)中制备的根据国际PCT专利申请WO-2019/115704的含有3.0重量％HAP的双相CAP/HAP骨替代材料的0.5-2mm尺寸的多孔颗粒和在本实施例的1)中制备的根据EP-B1-2445543的含有35重量％HAP的双相CAP/HAP骨替代材料的0.5-2mm尺寸的多孔颗粒以40:60的重量比混合。将颗粒共混物在湍流摇床混合器中均化。
3)制备用作油灰的本发明的胶原基质
将选定量的Geistlich
Figure BDA0003390772230000241
的胶原纤维(3重量％)分散在去离子水中。随后，用2M盐酸溶液将浆料的pH值调节至pH＝3.5。然后，使用胶体磨机对浆料进行湿式研磨。下一步，将上面在本实施例的2)中制备的双相CAP/HAP骨替代材料的颗粒共混物以80重量％骨替代材料和20重量％胶原的比例加入到胶原浆料中。在加入骨替代材料后，用抹刀手动将浆料均化。然后，将浆料填充到金属模具(23mm×23mm×6mm)中，然后冻干(冷冻至-40℃，在-5℃和300μbar下进行24小时的一次干燥，在20℃和10μbar下进行11小时的二次干燥)。然后将材料用X射线照射灭菌。
4)制备用作条带或塞子的本发明的胶原基质
将上面在本实施例的3)中获得的冻干材料在0.1-10mbar和80-140℃下进行12-96小时的脱水热处理(DHT)。为得到塞子材料，本实施例的3)中的金属模具是直径为8至12mm且深度为8至16mm的圆柱形或圆锥形。
实施例7在兔后外侧脊柱融合(PLF)模型中测试本发明的油灰
将上面在实施例6的3)中获得的胶原基质作为油灰在W.R.Walsh等,2009,Eur.Spine J.18:1610-1620公开的兔PLF模型中进行测试，与MastergraftTM油灰(处于胶原基质中的双相磷酸钙颗粒，由Medtronic销售)和Actifuse ABX油灰(处于泊洛沙姆基质中的硅取代羟磷灰石，由Baxter销售)进行比较。
·植入后12周，对于这些油灰中的每一种，融合块在放射学上清晰可见。Mastergraft油灰表现出更高的降解速率。
参见图7，其中对于本发明的油灰，融合块清晰可见。
·如图8所示，含有3.0重量％HAP的双相CAP/HAP骨替代材料的颗粒比含有35重量％HAP的双相CAP/HAP骨替代材料的颗粒吸收更快(在图8中出现尺寸更大，形状更均匀)，这为新骨的向内生长提供空间。
·在图8中可以观察到跨越缺损处的新骨形成。

Claims (15)

1.一种胶原基质，其包含双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料的颗粒，所述颗粒包括烧结的CAP芯和沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层，由此外延生长的纳米晶体具有与人骨矿物质相同的尺寸和形貌，其中，沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层具有包含扁平晶体片的均匀的粗糙外表面。
2.如权利要求1所述的胶原基质，其中，所述胶原是用酸性溶液处理过的天然交联的胶原。
3.如权利要求1所述的胶原基质，其中，所述胶原是通过脱水热处理(DHT)而物理交联的天然交联的胶原，或者是化学交联的天然交联的胶原。
4.如权利要求1至3中任一项所述的胶原基质，其包含60-97重量％的骨替代材料和3-40重量％的胶原。
5.如权利要求1至4中任一项所述的胶原基质，其中，在所述双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料中，所述粗糙表面包含外延生长的纳米晶体羟磷灰石片，其形成由扫描电子显微术(SEM)测定的尺寸为0.2至20μm的片的互锁网络。
6.如权利要求1至5中任一项所述的胶原基质，其中，在所述双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料中，所述均匀的粗糙外表面包含外延生长的羟磷灰石片，其形成包含由压汞法(MIP)测定的0.03至2μm的孔的互锁网络。
7.如权利要求1至6中任一项所述的胶原基质，其中，在所述双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料中，所述均匀的粗糙外表面通过原子力显微术(AFM)表征，其中源自AFM的均方根粗糙度Rq为50至400nm，并且轮廓的平均最大高度Rz为500至2000nm。
8.如权利要求1至7中任一项所述的胶原基质，其中，在所述双相磷酸钙/羟磷灰石(CAP/HAP)骨替代材料中，通过XRD测量的HAP的百分比为1.0％至10.0％。
9.如权利要求1至8中任一项所述的胶原基质，其包含：
-CAP/HAP骨替代材料(A)的颗粒，其包括烧结的CAP芯和沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层，由此外延生长的纳米晶体具有与人骨矿物质相同的尺寸和形貌，其中，沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层具有包含扁平晶体片的均匀的粗糙外表面，其中通过XRD测量的HAP的百分比为2.0％至6.0％，和
-骨替代材料(B)的颗粒，其选自由以下材料组成的组：
-双相CAP/HAP骨替代材料，其包括烧结的CAP芯和沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的至少一个封闭的外延生长的纳米晶体HAP层，由此外延生长的纳米晶体具有与人骨矿物质相同的尺寸和形貌，其中通过XRD测量的HAP的百分比为10％至40％，和
-骨矿物质，其源自天然骨并且基本上保留天然骨的原始晶体结构和矿物微结构，同时有机杂质含量低于150ppm，蛋白质含量低于135ppm。
10.如权利要求9所述的胶原基质，其中
-在CAP/HAP骨替代材料(A)的颗粒中，通过XRD测量的HAP的百分比为2.0％至6.0％，并且
-骨替代材料(B)的颗粒是双相CAP/HAP骨替代材料的颗粒，其包括烧结的CAP芯和沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的至少一个封闭的外延生长的纳米晶体HAP层，由此外延生长的纳米晶体具有与人骨矿物质相同的尺寸和形貌，其中通过XRD测量的HAP的百分比为30％至40％。
11.如权利要求9所述的胶原基质，其中
-在CAP/HAP骨替代材料(A)的颗粒中，通过XRD测量的HAP的百分比为2.0％至6.0％，并且
-骨替代材料(B)的颗粒是骨矿物质的颗粒，其源自天然骨并且基本上保留天然骨的原始晶体结构和矿物微结构，同时有机杂质含量低于150ppm，蛋白质含量低于135ppm。
12.如权利要求9至11中任一项所述的胶原基质，其中，CAP/HAP骨替代材料(A)的颗粒与骨替代材料(B)的颗粒的重量比为0.1至9.9。
13.一种制备用作油灰的权利要求1、2和4至12中任一项所述的胶原基质的方法，其包括将原生的天然交联胶原的胶原纤维分散到pH为2至5的酸性溶液中以产生胶原浆料，将所述胶原浆料与上述双相CAP/HAP骨替代材料的颗粒混合并均化以制备胶原/CAP/HAP浆料，将所述浆料冷冻干燥并通过伽马射线或X射线照射或环氧乙烷处理进行灭菌。
14.一种包含以下材料的混合物的颗粒共混物：
-双相(CAP/HAP)骨替代材料(A)的颗粒，其包括烧结的CAP芯和沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层，由此外延生长的纳米晶体具有与人骨矿物质相同的尺寸和形貌，其中，沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的封闭的外延生长的纳米晶体HAP层具有包含扁平晶体片的均匀的粗糙外表面，其中通过XRD测量的HAP的百分比为2.0％至6.0％，和
-骨替代材料(B)的颗粒，其选自由以下材料组成的组：
-双相CAP/HAP骨替代材料，其包括烧结的CAP芯和沉积在所述烧结的CAP芯的外表面上的至少一个封闭的外延生长的纳米晶体HAP层，由此外延生长的纳米晶体具有与人骨矿物质相同的尺寸和形貌，其中通过XRD测量的HAP的百分比为10％至40％，和
-骨矿物质，其源自天然骨并且基本上保留天然骨的原始晶体结构和矿物微结构，同时有机杂质含量低于150ppm，蛋白质含量低于135ppm。
15.如权利要求14所述的颗粒共混物，其中，CAP/HAP骨替代材料(A)的颗粒与骨替代材料(B)的颗粒的重量比为0.1至9.9。
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