JP6813716B1

JP6813716B1 - 骨代替材料

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Publication number: JP6813716B1
Application number: JP2020532763A
Authority: JP
Inventors: ツィールマン，クラウディオ; バフラー，ミヒャエル
Original assignee: ガイストリッヒファーマアーゲー
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2021-01-13
Anticipated expiration: 2038-12-13
Also published as: KR102230625B1; TW201927348A; CN111465419B; JP2021506403A; US20190209737A1; US10646619B2; TWI783093B; CN111465419A; WO2019115700A1; EP3544642A1; EP3544642B1; KR20200076754A

Abstract

骨形成を誘導する能力の増大を示す、二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料であって、焼結ＣＡＰコアと、焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの少なくとも１つの閉じたエピタキシャル成長層（ここで、エピタキシャル成長ナノ結晶は、ヒト骨塩と同じサイズと形態を有する）とを有し、焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの閉じたエピタキシャル成長層が、エピタキシャル成長ＨＡＰナノ結晶からなる平らな結晶小板の個々のクラスターと、個々のクラスターの間の粗い領域（ここで、個々のクラスターの間の粗い領域の割合は、ＳＥＭで測定されるとき表面全体の少なくとも２０％である）とを含む不均質な外表面を有する骨代替材料、及びその調製方法。

Description

本発明は、不均質な外表面を有するリン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）に基づく二層構造を持つ新しい二相性骨代替材料、その材料の製造方法、並びにヒト又は動物の欠損部位における骨形成、骨再生、骨修復及び／又は骨置換を支持するためのインプラント又はプロテーゼとしてのこれらの使用に関する。

骨構造の欠損は、外傷、疾患、及び手術のような様々な状況で発生するが、種々の外科分野における骨欠損を効果的に修復する必要が依然として存在する。

骨欠損部位の治癒を刺激するために、数多くの天然及び合成の材料及び組成物が使用されてきた。歯周及び顎顔面骨欠損で骨成長を促進する、周知の天然の骨伝導性の骨代替材料は、Geistlich Pharma AGから市販されているGeistlich Bio-Oss（登録商標）である。その材料は、米国特許第5,167,961号に記載されている方法によって自然骨から製造され、自然骨の小柱構造及びナノ結晶構造の保存を可能にして、吸収されないか又は非常にゆっくりと吸収される優れた骨伝導性マトリックスが得られる。

リン酸三カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＴＣＰ／ＨＡＰ）システム及び骨代替材料としてのこれらの使用は、例えば、US-6,338,752に記載されており、リン酸アンモニウムとＨＡＰとの粉末混合物を１２００〜１５００℃で加熱して、α−ＴＣＰ／ＨＡＰの二相セメントの調製方法を開示している。

欧州特許EP-285826は、インプラント用の金属及び非金属体上のＨＡＰの層を製造する方法であって、α−ＴＣＰの層を適用し、８０〜１００℃でｐＨ２〜７の水との反応によりα−ＴＣＰ層をＨＡＰに完全に変換することによる方法を記載している。得られた生成物は、ＨＡＰの層で覆われた金属又は非金属体である。

WO 97/41273は、特にヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）又は他のリン酸カルシウム（ＣＡＰ）などの基材を炭酸ヒドロキシアパタイト、即ち、リン酸及び／又はヒドロキシルイオンが重炭酸イオンによって部分的に置換されているヒドロキシアパタイトのコーティングでコーティングする方法であって、（ａ）５０℃未満の温度でカルシウムイオン、リン酸イオン及び重炭酸イオンを含有するｐＨ６．８〜８．０の溶液に基材を浸漬し、（ｂ）基材と接触している溶液の部分をｐＨが８を超えるまで５０〜８０℃の温度まで加熱して、（ｃ）基材と工程（ｂ）で得られたアルカリ溶液との接触を維持して、炭酸ヒドロキシアパタイトコーティングを形成し、そして（ｄ）基材を溶液から取り出し、コーティングを乾燥させることを含む方法を記載している。重炭酸イオンは、ヒドロキシアパタイト結晶成長の阻害剤として作用するため、欠損を含み、かつ寸法がかなり小さい、即ち、長さが１０〜４０nm、幅が３〜１０nmの非化学量論的結晶が得られることが開示されている（７ページ、１〜７行目を参照のこと）。

リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）システム、特にＴＣＰ／ＨＡＰシステムの成分は、その熱力学的安定性が異なる。この違いにより、ＣＡＰ／ＨＡＰシステムが哺乳動物、特にヒト患者に埋め込まれると、体液中のＴＣＰ及びその他のリン酸カルシウムの溶解度は、ＨＡＰの溶解度よりも高い。リン酸カルシウムとＨＡＰの間の溶解度の違いにより、ＣＡＰ／ＨＡＰシステムの不規則な焼結構造が崩壊するが、これは、溶解性の高い方の化合物ＣＡＰ（例えば、ＴＣＰ）がＨＡＰよりも速く除去されるためである。高温で生成したＣＡＰとＨＡＰの間の焼結相互接合は、生理環境でのデバイスのより高い溶解度にも大きく貢献しよう。２つの異なるタイプの反応が、このようなセラミックの加速したインビボ分解を支配する：化学溶解及び細胞による生物学的吸収。どちらのプロセスもセラミック材料の溶解を引き起こし、更にはカルシウムイオンの局所的な過飽和を引き起こして、吸着されるカルシウムイオンよりも多くのカルシウムイオンが放出される。カルシウムイオンの自然の平衡は、細胞外マトリックスにも、インプラント周囲の組織にも最早存在しない。カルシウムイオンの過飽和に関する自然のカルシウム平衡の局所的な撹乱は、破骨細胞の活性を上昇させ、ひいてはセラミック材料の制御されない吸収を加速し、特に大量の合成骨代替材料を使用する場合に有害な炎症反応のリスクにつながる。

骨代替材料のGeistlich Bio-Ossをヒト患者に埋め込むと、自然のカルシウム平衡は実質的に影響を受けず、材料の表面上及びその局所環境内のカルシウムイオンの濃度はほぼ一定のままである。よって材料の生物学的吸収は起こらないか、又は有害な炎症反応のリスクを伴わない非常に遅い速度で進行する。

EP-B1-2445543は、非常に有利なリン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料を開示しているが、これは、骨代替材料のGeistlich Bio-Ossと同様に、体内に設置後、材料の表面上及びその局所環境内のカルシウムイオンの濃度をほぼ一定に維持することができ、よって破骨細胞活性の上昇につながらない。

実際、最適な骨再生に必要な自然のカルシウム平衡は乱されたり破壊されたりしない。更に、自然のカルシウム濃度の平衡は、再生プロセスが完了するまで、骨代替材料によって永続的に支持される。これらの条件が満たされると、破骨細胞活性が上昇しないため、有害な炎症反応のリスクがない。

EP-B1-2445543の発明は、焼結ＣＡＰコアと、焼結ＣＡＰコアの上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの少なくとも１つの均質で閉じたエピタキシャル成長層（ここで、エピタキシャル成長ナノ結晶は、ヒト骨塩と同じサイズと形態、即ち、長さ３０〜４６nm及び幅１４〜２２nmを有する）とを含む、二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料に関する。

焼結ＣＡＰコアは、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、特にα−ＴＣＰ（α−Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）又はβ−ＴＣＰ（β−Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）、及び／又はリン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）Ｃａ_４（ＰＯ_４）_２Ｏを含んでもよい。

頻繁に使用される実施態様では、焼結ＣＡＰコアは、本質的にＴＣＰからなり、α−ＴＣＰが好ましい。

ナノ結晶ＨＡＰのエピタキシャル成長層は、構造的及び化学的に天然のヒト骨塩とほぼ同一である。

ナノ結晶ＨＡＰのエピタキシャル成長層は一般に、少なくとも１５〜５０nm、好ましくは少なくとも２０〜４０nm、更に好ましくは少なくとも２５〜３５nmの厚さを有する。その最小厚さは、エピタキシャル配向のＨＡＰナノ結晶の１つの層に対応する。

ナノ結晶ＨＡＰのエピタキシャル成長層は、エピタキシャル配向のＨＡＰナノ結晶の単層又は多層を含むことができる。エピタキシャル配向のＨＡＰナノ結晶のそのような層の数に関連する、ナノ結晶ＨＡＰのエピタキシャル成長層の厚さは、身体の負荷が異なる部位におけるインプラント又はプロテーゼとしての骨代替材料の意図される用途により選択されよう。その発明の骨代替材料は確かに、焼結ＣＡＰコアをサイズと形態がヒト骨塩に類似したヒドロキシアパタイトへと徐々に変換する生体様システムとしてインビボで機能するように設計されており、その変換速度は、焼結ＣＡＰコアによるカルシウム放出の速度に依存し、そして大部分はナノ結晶ＨＡＰのエピタキシャル成長層の厚さによって制御される。

ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料の特性は、大部分は結晶ＨＡＰのエピタキシャル成長層の厚さによって制御される。「特性」という用語は、ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替品が一定濃度のカルシウムイオンをインビトロ及びインビボで局所環境に放出する能力を含む。

ナノ結晶ＨＡＰのエピタキシャル成長層の厚さは、焼結ＣＡＰコア材料対ＨＡＰの比に関連し、前記比は、一般に５：９５〜９５：５の間、好ましくは１０：９０〜９０：１０である。

ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料は、粒子状又は顆粒状であってよく、この粒子又は顆粒は所望のサイズと形状を有する。一般に、粒子又は顆粒は、ほぼ球形であり、そして直径２５０〜５０００μmである。

ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料はまた、成形体、例えば、ネジ、釘、ピン、又は特に、股関節、鎖骨、肋骨、下顎骨若しくは頭蓋骨のような、骨性身体部分の輪郭を有する構造であってもよい。そのようなネジ、釘、又はピンは、例えば、膝又は肘の骨に靭帯を固定するための整形外科再建手術において使用されてもよい。骨性身体部分の輪郭を有するそのような構造は、消失又は欠損の骨又は骨部分を置換するためのプロテーゼとして整形外科手術において使用されてもよい。

EP-B1-2445543のそのＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料は、以下の工程：
ａ）焼結ＣＡＰコア材料を調製すること、
ｂ）焼結ＣＡＰコア材料を１０℃と５０℃の間の温度で水溶液に浸漬して、ＣＡＰからＨＡＰへの変換プロセスを開始し、それによって焼結ＣＡＰコア材料表面上にナノ結晶ヒドロキシアパタイトの均質で閉じたエピタキシャル成長層（ここで、エピタキシャル成長ナノ結晶は、ヒト骨塩と同じサイズと形態を有する）が形成されること、
ｃ）ＨＡＰの少なくとも１つのナノ結晶層の均質で閉じたコーティングが存在するが、変換プロセスが完全に終わる前の時点で、水溶液から固体材料を分離することによって変換を停止させること、
ｄ）場合により、工程ｃ）からの分離された材料を滅菌すること
を含むプロセスによって得られることが教示されている。

焼結ＣＡＰコア材料の調製は、最初にリン酸水素カルシウム（ＣａＨＰＯ_４）、炭酸カルシウム及び／又は水酸化カルシウムの粉末を混合し、次に適切な温度範囲内で混合物をか焼及び焼結し、これによってバルク焼結ＣＡＰコア材料が与えられることを含む、当技術分野において公知の方法によって実施され得る（例えば、Mathew M. et al., 1977, Acta. Cryst. B33: 1325; Dickens B. et al., 1974, J. Solid State Chemistry 10, 232; and Durucan C. et al., 2002, J. Mat. Sci., 37:963を参照のこと）。

よってバルク焼結ＴＣＰコア材料を、リン酸水素カルシウム（ＣａＨＰＯ_４）、炭酸カルシウム及び／又は水酸化カルシウムの粉末を化学量論比で混合し、混合物を１２００〜１４５０℃の範囲の温度、好ましくは１４００℃でか焼及び焼結することによって得てもよい。

バルク焼結ＴＴＣＰコア材料もまた、上記プロセスによって得てもよい。

そのような方法によって調製されたバルク焼結ＣＡＰ材料は、２〜８０体積％の空隙率及び細孔の幅広い分布を有する多孔質であってよい。空隙率パラメーターは、ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料の意図される用途に応じて選択されよう。

工程ｂ）に使用される焼結ＣＡＰコア材料は、
−上記のとおり調製されたバルク焼結ＣＡＰコア材料であるか、
−上記のとおり調製されたバルク焼結ＣＡＰコア材料から、破砕、磨砕及び／又は粉砕、並びに篩い分けのような従来の方法を使用して得られた、焼結ＣＡＰコア材料の粒子又は顆粒であるか、あるいは
−所望の形状とサイズ、例えば、ネジ、釘、ピン、又は骨性身体部分の輪郭を有する構造を有する焼結ＣＡＰコア材料のプリフォームであってもよい。

このような任意の所望の形状とサイズのプリフォームを、ＣＮＣフライス加工又は３Ｄ印刷のような周知のプロトタイピング技術を使用して、上記のとおり調製されたバルク焼結コア材料から得てもよい（例えば、Bartolo P. et al., 2008, Bio-Materials and Prototyping Applications in Medicine, Springer Science New York, ISBN 978-0-387-47682-7; Landers R. et al., 2002, Biomaterials 23(23), 4437; Yeong W.-Y. et al., 2004, Trends in Biotechnology, 22 (12), 643; and Seitz H. et al., 2005, Biomed. Mater. Res. 74B (2), 782を参照のこと）。

工程ｂ）の水溶液は、純水、人工体液又は緩衝液であると教示されている。重要なのは、工程ｂ）の浸漬溶液のｐＨ値がほぼ中性であり、変換プロセス全体を通じて、好ましくは５．５〜９．０のｐＨ範囲内で安定を保つことである。

「人工体液」という用語は、体液を模倣する任意の溶液のことをいう。好ましくは、人工体液は、血漿のそれと同様のイオン濃度を有する。

緩衝液は、上記のｐＨ範囲の任意の緩衝液であり得るが、好ましくは、カルシウム、マグネシウム及び／又はナトリウムを含むか含まないリン酸緩衝液である。

実施例で使用される緩衝液（実施例４及び５を参照のこと）は、水性リン酸緩衝液である。

工程ｂ）の温度範囲は、一般に１０℃〜５０℃、好ましくは２５〜４５℃、更に好ましくは３５℃〜４０℃である。

浸漬工程ｂ）は、第１段階でＣＡＰコア材料の一次相転移を誘導し、したがってＨＡＰナノ結晶前駆体の核形成を誘導する。第２段階中に、第１段階から得られたＨＡＰ前駆体は成長して、閉じた（即ち、完全にコーティングしている）エピタキシャルナノ結晶複合層を確立する。最初のＨＡＰナノ結晶層は、均質で閉じており、かつ焼結ＣＡＰコア材料にエピタキシャルに接合されている必要がある。

第３段階中に、新しく形成された二重複合層内で一次相転移が進行して、焼結ＣＡＰコア材料（ＴＣＰ又はＴＴＣＰ）をナノ結晶ＨＡＰに更に変換し得る。相転移のこの第３工程中に、焼結ＣＡＰコア材料の一部がナノ結晶ＨＡＰに変換されるまで、遅延拡散制御プロセスによって制御可能な時間、カルシウムイオンが放出されよう。ＨＡＰ層の厚さ、したがってカルシウム放出の速度は、変換時間の変動によって制御され得る。

適切な厚さのエピタキシャル成長ナノ結晶ＨＡＰ層は、インビトロで調製されるが、ここでＨＡＰへのＣＡＰの変換は、完了する前に停止させる。

ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料がインビボに設置されると直ぐに、ＨＡＰへのＣＡＰの変換プロセスは、体液との接触により再活性化され、骨代替材料は、ヒト骨塩にサイズと形態が類似する新しいヒドロキシアパタイトを形成する生体様システムとして機能しよう。インビボ相変態プロセス中に、輸送されたカルシウムイオンは、骨再生プロセスにとって重要かつ有益である局所カルシウム平衡を支持する局所環境へと放出されよう。

身体の負荷が異なる部位では骨欠損の再生時間が異なるため、カルシウム放出の速度を制御できることが重要である。これは、ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長層の厚さを変えることによって達成され得る。

したがって工程ｃ）は非常に重要な工程である。工程ｂ）の水溶液における曝露時間は、所望のＨＡＰ層の厚さに基づく。エピタキシャル配向のナノ結晶ＨＡＰの少なくとも１つの層が必要である。ＣＡＰからＨＡＰへの変換が完了していないことは不可欠である。

所望の厚さによる適切な曝露時間は、リン酸カルシウム、セメント及びコンクリート化学の分野の当業者に周知の幾つかの熱力学的微分方程式を使用することによって計算され得る。

例えば：Pommersheim, J.C.; Clifton, J.R. (1979) Cem. Conc. Res.; 9:765; Pommersheim, J.C.; Clifton, J.R. (1982) Cem. Conc. Res.; 12:765; and Schlussler, K.H. Mcedlov-Petrosjan, O.P.; (1990): Der Baustoff Beton, VEB Verlag Bauwesen, Berlinを参照のこと。

上記の微分方程式の解をＣＡＰ／ＨＡＰシステムに代入すると、ＣＡＰのＨＡＰへの相転移及び層の厚さを予測できるため、ＨＡＰのエピタキシャル層を安定で再現性あるやり方で調製することができる。

工程ｃ）の最後の水溶液からの固体材料の分離は、当技術分野で周知の技術を使用して、濾過、洗浄及び乾燥によって通常実施される。

EP-B1-2445543の実施例（即ち、実施例４［００５７］及び実施例５［００５８］）において、洗浄は、緩衝液から残留物を取り出すために骨代替材料の分離した顆粒を精製水で３回洗浄することによって実施される。

オプションの滅菌工程ｄ）は、ガンマ線照射又はＸ線照射のような当技術分野で周知の手法によって実施され得る。

EP-B1-2445543の実施例４及び５に教示されているとおり、工程ｂ）の水溶液用の水性リン酸緩衝剤と精製水とを使用して、工程ｃ）の最後に分離した顆粒を３回洗浄すると、焼結ＣＡＰコアと、焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの一様で閉じたエピタキシャル成長層（ここで、エピタキシャル成長ナノ結晶は、ヒト骨塩と同じサイズと形態を有する）とを含む、二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料が得られるが、ここで、焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの閉じたエピタキシャル成長層は、エピタキシャル成長ＨＡＰナノ結晶からなる平らな結晶小板の個々の（分離した）クラスターと、平らな結晶小板の個々のクラスターの間の滑らかな領域とを含む、不均質な外表面を有しており、平らな結晶小板の個々のクラスターの間の滑らかな領域が占める表面の％は、所与の変換条件での変換時間に依存する。

図１Ａ［滑らかな領域が、ＳＥＭ（走査型電子顕微鏡法）で測定されるとき外表面全体の約７０％に相当する、３０分の変換時間を有する、プロトタイプ１（１〜２mm顆粒）のＳＥＭ写真を表す］；及び図１Ｂ［滑らかな領域が、ＳＥＭで測定されるとき外表面全体の約５０％に相当する、４０分の変換時間を有する、プロトタイプ２（１〜２mm顆粒）のＳＥＭ写真を表す］を参照のこと。

EP-B1-2445543に開示された二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料の調製において、骨移植片代替品の調製の工程ｃ）において分離した顆粒に特定の洗浄プロトコールを適用することにより、平らな結晶小板の個々のクラスターの間の不均質な外表面の滑らかな領域が、粗い領域によって置き換えられることが今や見い出された。特定の洗浄プロトコールは、最初に純水による規定の洗浄プロトコールと、直後の短鎖脂肪族アルコールによる規定の洗浄プロトコールとを含む。平らな結晶小板の個々のクラスターの間のこれらの粗い領域は一般に、ＳＥＭで測定されるとき個々の小板サイズが０．２〜５μmの小板の連結ネットワークを形成するエピタキシャル成長ヒドロキシアパタイト小板を含む。

平らな結晶小板の個々のクラスターの間の粗い領域が、ＳＥＭで測定されるとき外表面全体の少なくとも２０％に相当する場合、EP-B1-2445543に開示された、同じ条件下で変換されたが、異なる洗浄プロトコールで洗浄されて、平らな結晶小板の個々のクラスターの間に滑らかな領域が得られる骨代替材料と比較して、骨刺激（新骨形成を誘導する骨代替材料の能力）が有意に増強されていることが更に見い出された。これは、特に移植３週間後のウサギモデルにおける大腿顆の骨面密度の測定によって示される。

発明の要約
よって本発明は、焼結ＣＡＰコアと、焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの少なくとも１つの閉じたエピタキシャル成長層（ここで、エピタキシャル成長ナノ結晶は、ヒト骨塩と同じサイズと形態を有する）とを含む、二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料に関するが、ここで、焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの閉じたエピタキシャル成長層は、平らな結晶小板（エピタキシャル成長ＨＡＰナノ結晶の凝集体からなる）の個々のクラスターと、平らな結晶小板の個々のクラスターの間の粗い領域（ここで、平らな結晶小板の個々のクラスターの間の粗い領域の割合は、ＳＥＭで測定されるとき外表面全体の少なくとも２０％である）とを含む不均質な外表面を有する。

その二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料は、骨形成を誘導する能力の増大を示す。

一般に、個々のクラスターの間の粗い領域は、ＳＥＭで測定されるとき０．２〜５μmの個々の小板サイズのＨＡＰナノ結晶のエピタキシャル成長小板からなる。

好ましくは個々の結晶クラスターの間の粗い領域の割合は、ＳＥＭで測定されるとき表面全体の少なくとも３０％、更に好ましくは外表面全体の少なくとも４０％である。

一般に、ＸＲＤで測定されるとき上記二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料におけるＨＡＰの割合は、多くとも１０％である。実際、その割合が１０％を超える場合、エピタキシャル成長ＨＡＰナノ結晶の平らな結晶小板の個々のクラスターは一般に、外表面に過度の空間を占め過ぎて、ＳＥＭで測定されるとき個々の結晶クラスターの間の粗い領域の割合が表面全体の２０％を下回る。

好ましくはＸＲＤで測定されるときＨＡＰの割合は、１〜５％、更に好ましくは１．５〜３．５％である。

焼結ＣＡＰコアは、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、特にα−ＴＣＰ（α−Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）又はβ−ＴＣＰ（β−Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）、及び／又はリン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）Ｃａ_４（ＰＯ_４）_２Ｏを含む。

ナノ結晶ＨＡＰのエピタキシャル成長層は、構造的に天然のヒト骨塩とほぼ同一である。

ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料は、粒子状又は顆粒状であってよく、この粒子又は顆粒は所望のサイズ及び形状を有する。一般に、粒子又は顆粒は、２５０〜５０００μm、好ましくは１０００〜２０００μmのサイズを有する。

ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料はまた、成形体、例えば、ネジ、釘、ピン、又は特に、股関節、鎖骨、肋骨、下顎骨若しくは頭蓋骨のような、骨性身体部分の輪郭を有する構造であってもよい。そのようなネジ、釘又はピンは、例えば、膝又は肘の骨に靭帯を固定するための整形外科再建手術において使用されてもよい。骨性身体部分の輪郭を有するそのような構造は、消失又は欠損の骨又は骨部分を置換するためのプロテーゼとして整形外科手術において使用されてもよい。

本発明はまた、一般に天然又は合成ポリマーを含む、適切なマトリックス中に上記のＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替品の粒子又は顆粒を含むパテに関する。一般に、粒子又は顆粒は、２５０〜５０００μm、好ましくは１０００〜２０００μmのサイズを有する。

本発明は更に、上記のＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料の調製方法であって、以下の工程：
ａ）焼結ＣＡＰコア材料を調製すること、
ｂ）焼結ＣＡＰコア材料を１０℃と５０℃の間の温度で水性緩衝液に浸漬して、ＣＡＰからＨＡＰへの変換プロセスを開始し、それによって焼結ＣＡＰコア材料表面上にナノ結晶ヒドロキシアパタイトの一様で閉じたエピタキシャル成長層（ここで、エピタキシャル成長ナノ結晶は、ヒト骨塩と同じサイズと形態を有する）が形成されること、
ｃ）ＨＡＰの少なくとも１つのナノ結晶層の一様で閉じたコーティングが存在するが、変換プロセスが完全に終わる前の時点で、水性緩衝液から固体材料を分離することによって変換を停止させること、洗浄液として純水及び短鎖脂肪族アルコール溶液を含む特定の洗浄プロトコールを適用することにより、分離した固体材料を洗浄すること、並びに
ｄ）場合により、工程ｃ）からの分離された材料を滅菌すること
を含む方法に関する。

分離した固体材料の工程ｃ）の特定の洗浄プロトコールは、純水による１〜１０洗浄工程、更に好ましくは３〜７洗浄工程と、直後の脂肪族アルコール溶液による少なくとも１洗浄工程、更に好ましくは少なくとも２洗浄工程を含む。

適切な短鎖脂肪族アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール及びブタノールからなる群より選択され得る。

好ましくは短鎖脂肪族アルコールは、エタノールである。

工程ｂ）に使用される水性緩衝液は、工程ｂ）の浸漬溶液のｐＨ値が、ほぼ中性であり、そして変換プロセス全体を通じて、好ましくは５．５〜９．０、更に好ましくは７．０〜８．０のｐＨ範囲内で安定を保つように選択される。

緩衝剤は、上記ｐＨ範囲内の任意の緩衝剤であってよいが、好ましくはカルシウム、マグネシウム及び／又はナトリウムを含むか又は含まないリン酸緩衝剤である。適切な緩衝液は、例えば、７．４５±０．１のｐＨ値を持つリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４）の０．４M水溶液である。

工程ｂ）の温度範囲は一般に、１０℃と５０℃の間、好ましくは２５℃と４５℃の間、更に好ましくは３５℃と４０℃の間である。

好ましくは工程ｂ）は、３５〜４０℃の温度で、ｐＨ７．０〜８．０のリン酸緩衝液中で行われる。

よってバルク焼結ＴＣＰコア材料を、リン酸水素カルシウム（ＣａＨＰＯ_４）、炭酸カルシウム及び／又は水酸化カルシウムの粉末を化学量論比で混合し、混合物を１２００〜１４５０℃の範囲の温度、好ましくは約１４００℃でか焼及び焼結することによって得てもよい。

第３段階中に、新しく形成された二重複合層内で一次相転移が進行して、焼結ＣＡＰコア材料（ＴＣＰ又はＴＴＣＰ）をナノ結晶ＨＡＰに更に変換することができる。相転移のこの第３工程中に、焼結ＣＡＰコア材料の一部がナノ結晶ＨＡＰに変換されるまで、遅延拡散制御プロセスによって制御可能な時間、カルシウムイオンが放出されよう。ＨＡＰ層の厚さ、ひいてはカルシウム放出の速度は、変換時間の変動によって制御され得る。

したがって工程ｃ）は非常に重要な工程である。工程ｂ）の水溶液中の曝露時間は、所望のＨＡＰ層の厚さに基づく。エピタキシャル配向のナノ結晶ＨＡＰの少なくとも１つの層が必要である。ＣＡＰからＨＡＰへの変換が完了していないことは不可欠である。

所望の厚さによる適切な曝露時間は、リン酸カルシウム並びにセメント及びコンクリート化学の分野の当業者に周知の幾つかの熱力学的微分方程式を使用することによって計算され得る。

例えば、Pommersheim, J.C.; Clifton, J.R. (1979) Cem. Conc. Res.; 9:765; Pommersheim, J.C.; Clifton, J.R. (1982) Cem. Conc. Res.; 12:765; and Schlussler, K.H. Mcedlov-Petrosjan, O.P.; (1990): Der Baustoff Beton, VEB Verlag Bauwesen, Berlinを参照のこと。

水溶液からの固体材料の分離は、当技術分野で周知の技術を使用して、濾過及び乾燥によって通常実施される。

本発明はまた、一般に粒子又は成形体の形の、ヒト又は動物の欠損部位における骨形成、骨再生、骨修復及び／又は骨置換を支持するためのインプラント又はプロテーゼとしての上記ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料の使用に関する。

本発明はまた、一般に粒子又は成形体の形の、上記ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料を移植することによる、ヒト又は動物の欠損部位における骨形成、骨再生及び／又は骨修復を促進する方法に関する。

本発明のＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料の利点
移植３週間後のウサギモデルにおける大腿顆の骨面密度の測定によって示されるとおり、エピタキシャル成長ＨＡＰナノ結晶からなる平らな結晶小板の個々の（分離した）クラスターと、平らな結晶小板の個々のクラスターの間の粗い領域とを含む不均質な外表面を有する、本発明の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料は、平らな結晶小板の個々のクラスターと、平らな結晶小板の個々のクラスターの間の滑らかな領域とを含む不均質な外表面を呈するEP-B1-2445543に開示された骨代替材料と比較して、骨形成を誘導する能力の増大を示す。

これは、R.A. GittensらがBiomaterials 2011 May, 32(13): 3395-3403に発表した結果と一致しているが、この文献は、マイクロ−サブマイクロスケールの粗度と組合せたナノスケール構造の導入により骨芽細胞の分化と局所因子の産生が改善されることを示しており、これにより、インビボでのインプラントのオッセオインテグレーション（osseointegration）の改善の可能性が示唆される。

本発明は、本発明の好ましい実施態様の説明例及び添付の図面を参照して、本明細書の以下に更に詳細に記載される。
図１Ａは、EP-B1-2445543の開示の実施例１で調製された、平らな結晶小板の個々のクラスターの間の滑らかな領域が、ＳＥＭで測定されるとき外表面全体の約７０％に相当する、３０分の変換時間を有する先行技術の骨代替品のプロトタイプ１のＳＥＭ写真を表す。図１Ｂは、EP-B1-2445543の開示の実施例１で調製された、平らな結晶小板の個々のクラスターの間の滑らかな領域が、ＳＥＭで測定されるとき外表面全体の約５０％に相当する、４０分の変換時間を有する骨代替品のプロトタイプ２のＳＥＭ写真を表す。図２Ａは、実施例２で調製された、平らな結晶小板の個々のクラスターの間の粗い領域が、ＳＥＭで測定されるとき外表面全体の約７０％に相当する、３０分の変換時間を有する本発明の骨代替材料のプロトタイプ３のＳＥＭ写真を表す。図２Ｂは、実施例２で調製された、平らな結晶小板の個々のクラスターの間の粗い領域が、ＳＥＭで測定されるとき外表面全体の約５０％に相当する、４０分の変換時間を有する本発明の骨代替材料のプロトタイプ４のＳＥＭ写真を表す。図３は、本発明の実施例２の骨代替材料（プロトタイプ３）、EP-B1-2445543の実施例１の骨代替材料（プロトタイプ１及び２）並びに２種の周知の市販骨代替材料：ACTIFUSE（登録商標）及びNOVABONE（登録商標）の移植３週間後のウサギモデルにおける大腿顆の骨面密度の測定を示す図を表す。

詳細な説明
以下の実施例により、本発明の範囲を限定することなく本発明を説明する。

EP-B1-2445543の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料の調製。
EP-B1-2445543の実施例１、２及び４と同様に、α−ＴＣＰのバルク焼結材料、１．０〜２．０mmの粒径のその多孔質顆粒、及びエピタキシャル成長ＨＡＰコーティングを有する変換顆粒を調製した。
実験室用撹拌機を用いて、３６４ｇリン酸二カルシウム無水物粉末、１３６ｇ炭酸カルシウム粉末、及び２２０ml 脱イオン水を７００rpmで５分間混合した。混合プロセスからのスラリーを、直ちに高温安定なプラチナカップに移した。充填プラチナカップを低温炉に入れた。１時間当たり１００℃の加熱速度を使用して、炉を１４００℃に加熱した。この温度を１２時間保持し、そして炉を１時間当たり５００℃の冷却速度で８００℃まで冷却し、次に１時間当たり１２５℃の冷却速度で３００℃まで冷却し、最後に炉の切り替えにより室温まで冷却した。バルク焼結材料（相純粋なα−ＴＣＰ、即ち、α−Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）を炉及びプラチナカップから取り出した。相純度の制御は、粉末Ｘ線回折分析法を用いて実施された。
ジョークラッシャーを使用してバルク生成物を粉砕した（ジョー距離は１０〜１mmで変動した）。生成したα−ＴＣＰ顆粒を、２mm及び１mmのメッシュ開口を有する篩い機及び篩いインサートを使用して篩い分けした。篩い分け後、顆粒をエタノールで濯いで、顆粒に吸着した微粉末残留物を分離した。多孔質顆粒をキャビネット乾燥機で８０℃で１時間乾燥させた。濯ぎ後の粒子表面の清浄度は、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を用いる表面観察によって制御された。
０．４mol/l リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４）を蒸留水に溶解して、コーティング及び相変態プロセスに適した緩衝液を調製した。水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を使用して、溶液のｐＨを室温で７．４５に調整した。前の段落で生成した顆粒を調製溶液中に浸漬し、温かい水浴（４０℃）内でそれぞれ３０分間（プロトタイプ１）及び４０分間（プロトタイプ２）保存した。浸漬後、顆粒を蒸留水で３回濯ぎ、相変態プロセスを停止させ、緩衝液から残留物を取り出した。多孔質顆粒を、キャビネット乾燥機内で１００℃で２時間乾燥させた。
プロトタイプ１及び２のコーティング及び相変態プロセス後の結晶クラスターの表面形態及び表面被覆度は、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）によって観測した（図１Ａ及び図１Ｂを参照のこと）。
図１Ａ及び１Ｂから明らかなように、顆粒の外表面は、エピタキシャル成長ＨＡＰナノ結晶からなる平らな結晶小板の個々のクラスターとクラスター間の滑らかな領域を含む不均質なものである。
プロトタイプ１及びプロトタイプ２の各々についてＳＥＭ写真上で個々のクラスターとその間の滑らかな領域とが占める表面を測定することにより、滑らかな領域がプロトタイプ１では外表面の約７０％、そしてプロトタイプ２では外表面の約５０％に相当することが判定された。

本発明の二相性リン酸カルシウム/ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料の調製。
上記の実施例１のとおり、相純粋なα−ＴＣＰの１〜２mmサイズの多孔質顆粒を製造した。
相変態及びコーティング工程は、４０℃に設定された水浴に入れたガラスフラスコ中で実施された。変換緩衝液は、ｐＨ値７．４５±０．１のリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４）の０．４M 水溶液とした。
ガラスフラスコに変換緩衝液を充填し、α−ＴＣＰ顆粒を１：４０（顆粒対変換溶液）の比で加えた。顆粒を変換溶液に４０℃で３０分間（プロトタイプ３）又は４０分間（プロトタイプ４）浸漬した。浸漬後、顆粒を脱イオン水（顆粒対水の比は重量で１：１０）で５回濯ぎ、エタノール（９９．９％、顆粒対エタノールの比は重量で１：１０）で２回濯いで、相変態プロセスを停止させ、粗い領域の形成を誘導して、緩衝液から残留物を取り出した。多孔質顆粒を、キャビネット乾燥機内で１００℃で２時間乾燥させた。
プロトタイプ３及び４のコーティング及び相変態プロセス後の結晶クラスターの表面形態及び表面被覆度を、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）によって観察した（図２Ａ及び図２Ｂを参照のこと）。
図２Ａ及び２Ｂから明らかなように、顆粒の外表面は、エピタキシャル成長ＨＡＰナノ結晶からなる平らな結晶小板の個々の（分離した）クラスターとクラスター間の粗い領域を含む不均質なものである。
プロトタイプ３及びプロトタイプ４の各々についてＳＥＭ写真上で個々のクラスターとクラスター間の粗い領域とが占める表面を測定することにより、粗い領域がプロトタイプ３では外表面の約７０％、そしてプロトタイプ４では外表面の約５０％に相当することが判定された。

ウサギ試験。
新しく開発された骨代替材料のインビボ性能を評価するために、ウサギの大腿顆モデルが選択された。大腿顆欠損ウサギモデルは、代替生体材料を試験するために最も一般的に使用される動物モデルの１つである（Li Y. et al. Bone defect animal models for testing efficacy of bone substitute biomaterials, Journal of Orthopaedic Translation (2015) 3, 94-104）。
プロトタイプ１、２及び３、更には競合材料のACTIFUSE及びNOVABONEを、ニュージーランドホワイトウサギ（２８週齢）の大腿顆の臨界サイズの欠損部（５mm×１０mm）に埋め込んだ。移植の３週間後、様々なプロトタイプについて欠損部の骨面密度、インプラント面密度、線維面密度及び骨髄面密度を測定することにより、様々な生体材料の性能を分析した。定量分析を行うために、試料を１０％中性緩衝ホルマリン液（ＮＢＦ）中に固定し、ＰＭＭＡに包埋し、EXACTシステムを使用して切断して、変性Paragonで染色した。
図３に示されるとおり、移植３週間後にウサギ大腿顆モデルで新しく形成された骨の量は、プロトタイプ１及び２並びに競合材料ACTIFUSE及びNOVABONEと比較して、プロトタイプ３の方が有意に多かった。

Claims

二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料であって、焼結ＣＡＰコアと、焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの少なくとも１つの閉じたエピタキシャル成長層（ここで、エピタキシャル成長ナノ結晶は、ヒト骨塩と同じサイズと形態を有する）とを含み、焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの閉じたエピタキシャル成長層が、エピタキシャル成長ＨＡＰナノ結晶からなる平らな結晶小板の個々のクラスターと、個々のクラスターの間の粗い領域（ここで、個々のクラスターの間の粗い領域の割合は、ＳＥＭで測定されるとき表面全体の少なくとも２０％である）とを含む不均質な外表面を有する、骨代替材料。
個々のクラスターの間の粗い領域が、ＳＥＭで測定されるとき０．２〜５μmの個々の小板サイズである、ＨＡＰナノ結晶の小板からなる、請求項１記載の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料。
個々の結晶クラスターの間の粗い領域の割合が、ＳＥＭで測定されるとき表面全体の少なくとも３０％である、請求項１又は２記載の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料。
個々の結晶クラスターの間の粗い領域の割合が、ＳＥＭで測定されるとき表面全体の少なくとも４０％である、請求項１〜３のいずれか一項記載の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料。
焼結ＣＡＰコアが、本質的にα−ＴＣＰからなる、請求項１〜４のいずれか一項記載の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料。
ＨＡＰの％が、ＸＲＤにより測定されるとき１〜１０％である、請求項１〜５のいずれか一項記載の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料。
ＨＡＰの％が、ＸＲＤにより測定されるとき１．５〜３．５％である、請求項１〜５のいずれか一項記載の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料。
顆粒の形状である、請求項１〜８のいずれか一項記載の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料。
成形体の形状である、請求項１〜８のいずれか一項記載の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料。
ポリマーマトリックス中に請求項１記載の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料の顆粒を含有するパテ。
顆粒が、２５０〜５０００μmのサイズを有する、請求項１０記載のパテ。
請求項１〜９のいずれか一項記載のＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料の調製方法であって、以下の工程：
ａ）焼結ＣＡＰコア材料を調製すること、
ｂ）焼結ＣＡＰコア材料を１０℃と５０℃の間の温度で水性緩衝液に浸漬して、ＣＡＰからＨＡＰへの変換プロセスを開始し、焼結ＣＡＰコア材料表面上にナノ結晶ヒドロキシアパタイトの一様で閉じたエピタキシャル成長層（ここで、エピタキシャル成長ナノ結晶は、ヒト骨塩と同じサイズと形態を有する）を形成すること、
ｃ）ＨＡＰの少なくとも１つのナノ結晶層の一様で閉じたコーティングが存在するが、変換プロセスが完全に終わる前の時点で、水性緩衝液から固体材料を分離することによって変換を停止させること、洗浄液として純水及び短鎖脂肪族アルコール溶液を含む洗浄プロトコールを適用することにより、分離した固体材料を洗浄して、焼結ＣＡＰコアの外表面が、エピタキシャル成長ＨＡＰナノ結晶からなる平らな結晶小板の個々のクラスターと、個々のクラスターの間の粗い領域（ここで、個々のクラスターの間の粗い領域の割合は、ＳＥＭで測定されるとき表面全体の少なくとも２０％である）とを含む不均質な外表面を有する、ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料を形成すること、並びに
ｄ）場合により、工程ｃ）からの分離された材料を滅菌すること
を含む方法。
短鎖脂肪族アルコールが、エタノールである、請求項１２記載の方法。
分離した固体材料の洗浄が、純水による２〜１０洗浄工程と、直後の短鎖脂肪族アルコールによる少なくとも１洗浄工程とを伴う、請求項１２又は１３記載の方法。
工程ｂ）が、３５〜４０℃の温度で、ｐＨ７．０〜８．０のリン酸緩衝液中で行われる、請求項１２〜１４のいずれか一項記載の方法。