BR112020010213B1

BR112020010213B1 - material substituto de osso

Info

Publication number: BR112020010213B1
Application number: BR112020010213-0A
Authority: BR
Inventors: Claudio ZIHLMANN; Michael Bufler
Original assignee: Geistlich Pharma Ag
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2020-12-22
Also published as: IL275203B2; JP2021506401A; ES2803976T3; CA3083852A1; US20190184059A1; US20200016293A1; IL275203A; RU2020118930A3; TW201936216A; EP3544643A1; US11351287B2; RU2020118930A; JP6880330B2; PT3544643T; WO2019115704A1; PL3544643T3; US10646615B2; CN111465418B; MX2020005846A; KR20200076753A

Abstract

A presente invenção refere-se a: - um material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico que compreende um núcleo de CAP sinterizado e uma camada desenvolvida epitaticamente fechada de HAP nanocristalina depositada sobre a superfície externa do núcleo de CAP sinterizado, em que a camada desenvolvida epitaticamente fechada de HAP nanocristalina depositada sobre a superfície externa do núcleo de CAP sinterizado tem uma superfície externa grossa homogênea que compreende plaquetas de cristal planas, que mostra uma resposta osteogênica realçada, e - um processo de preparação do mesmo que compreende as etapas de a) preparação de um material de núcleo de CAP sinterizado, b) imersão do material de núcleo de CAP sinterizado em uma solução tampão que contém de 10 a 90% de um álcool alifático de cadeia curta a uma temperatura entre 10°C e 50°C para iniciar o processo de transformação de CAP em HAP por meio do qual uma camada desenvolvida epitaticamente fechada de hidróxi apatita nanocristalina será formada sobre a superfície do material de núcleo de CAP sinterizado, por meio do que os nanocristais desenvolvidos epitaticamente têm o mesmo tamanho e morfologia que o mineral do osso humano.

Description

ANTECEDENTES

[0001] A presente invenção refere-se a um novo materialsubstituto de osso bifásico com uma estrutura de bicamada à base de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) que tem uma superfície externa grossa homogênea, um processo para a preparação desse material e o uso do mesmo como implante ou prótese para suportar a formação do osso, a regeneração do osso, o reparo do osso e/ou a substituição do osso em um local de defeito em um ser humano ou um animal.

[0002] Os defeitos na estrutura do osso surgem em uma variedadede circunstâncias, tais como um trauma, uma doença e uma cirurgia, e ainda há uma necessidade quanto ao reparo eficaz de defeitos do osso em vários campos cirúrgicos.

[0003] Numerosos materiais e as composições naturais esintéticos têm sido utilizados para estimular a cura no local de um defeito do osso. Um material substituto do osso osteocondutor natural bem conhecido que promove o crescimento do osso em defeitos ósseos periodontais e maxilo-faciais é o Geistlich Bio-Oss®, comercialmente disponível junto à Geistlich Pharma AG. Esse material é manufaturado a partir de osso natural por um processo descrito na Patente U.S. N°. 5.167.961, que permite a preservação da arquitetura trabecular e da estrutura nanocristalina do osso natural, resultando em uma excelente matriz osteocondutora que não é ressorvida nem é ressorvida muito lentamente.

[0004] Os sistemas de fosfato de tricálcio/hidróxi apatita(TCP/HAP) e seu uso como materiais substitutos de ossos são descritos, por exemplo, na Patente US 6.338.752, que divulga um processo para a preparação de um cimento de α-TCP/HAP bifásicomediante o aquecimento de uma mistura em pó de fosfato de amônio e HAP a 1200 a 1500°C.

[0005] A Patente Europeia EP-285826 descreve um processo paraa produção de uma camada de HAP em corpos metálicos e não metálicos para implantes mediante a aplicação de uma camada de α-TCP e a conversão completa da camada de α-TCP em HAP através da reação com água a um pH de 2 a 7 a 80 a 100°C. O produto obtido é um corpo metálico ou não metálico coberto com uma camada de HAP.

[0006] A Patente WO 97/41273 descreve um processo pararevestir um substrato tal como a hidróxi apatita (HAP) ou outros fosfatos de cálcio (CAP) marcantes com um revestimento de hidróxi apatita carbonatado, isto é, hidróxi apatita em que os íons de fosfato e/ou de hidroxila são substituídos parcialmente por íons de bicarbonato, por um processo que compreende (a) a imersão do substrato em uma solução a um pH de 6,8 a 8,0 contendo íons de cálcio, íons de fosfato e íons de bicarbonato a uma temperatura inferior a 50°C, (b) o aquecimento da porção da solução em contato com o substrato a uma temperatura de 50 a 80°C até atingir um pH maior do que 8, (c) a manutenção do substrato em contato com a solução de álcali obtida na etapa (b) para formar um revestimento de hidróxi apatita carbonatado, e (d) a retirada do substrato da solução e a sujeição do revestimento à secagem. É indicado que os íons de bicarbonato agem como inibidores do crescimento de cristais de hidróxi apatita, resultando em cristais não estequiométricos que contêm defeitos e têm as dimensões bastante pequenas, ou seja, de 10 a 40 nm de comprimento e de 3 a 10 nm de largura (vide a página 7, linhas 1 a 7).

[0007] Os componentes de sistemas de fosfato de cálcio/hidróxiapatita (CAP/HAP), especialmente os sistemas de TCP/HAP, diferem em sua estabilidade termodinâmica. Devido a esta diferença, quando os sistemas de CAP/HAP são implantados em um mamífero, em particular um paciente humano, a solubilidade de TCP e outros fosfatos de cálcio é mais elevada no fluido corpóreo do que a solubilidade de HAP. A diferença na solubilidade entre os fosfatos de cálcio e HAP causa uma quebra da estrutura de sinter não ordenada do sistema de CAP/HAP porque composto de CAP mais bem solúvel (por exemplo, o TCP) é removido mais rapidamente do que a HAP. A interconexão sinterizada entre o CAP e a HAP produzidos a altas temperaturas também irá uma dar contribuição marcante para uma solubilidade maior do dispositivo no ambiente fisiológico. Dois tipos diferentes de reações dominam a degradação in vivo acelerada de tais cerâmicas: Dissolução química e ressorção biológica pelas células. Ambos os processos causam a dissolução do material de cerâmica, o que também causa uma supersaturação local de íons de cálcio, por meio do que há mais íons de cálcio liberados do que íons de cálcio adsorvidos. O equilíbrio natural de íons de cálcio não existe mais, nem na matriz extracelular nem no tecido que circunda o implante. O distúrbio local do equilíbrio de cálcio natural em termos de supersaturação de íons de cálcio conduz a uma atividade osteoclástica aumentada e, portanto, uma ressorção mal- controlada acelerada do material de cerâmica e um risco de reações de inflamação adversas, especialmente ao usar uma grande quantidade de material substituto de osso sintético.

[0008] Quando o material substituto de osso Geistlich Bio-Oss® éimplantado em um paciente humano, o equilíbrio de cálcio natural não é praticamente afetado, e a concentração de íons de cálcio na superfície do material e dentro do seu ambiente local permanece quase constante. A ressorção biológica do material desse modo não ocorre nem prossegue a uma velocidade muito lenta sem o risco de reações de inflamação adversas.

[0009] A Patente EP-B1-2445543 divulga um material substituto deosso de cálcio fosfato/hidróxi apatita (CAP/HAP) altamente vantajoso que, como o material substituto de osso Geistlich Bio-Oss®, após o ajuste in vivo permite que a concentração de íons de cálcio na superfície do material e dentro do seu ambiente local permaneça quase constante e desse modo não conduza a uma atividade osteoclástica aumentada.

[0010] De fato, o equilíbrio de cálcio natural que é necessário paraa regeneração ideal do osso não é perturbado nem destruído. Além disso, o equilíbrio natural da concentração de cálcio é suportado de maneira durável pelo material substituto de osso até que o processo de regeneração esteja encerrado. Quando essas condições são satisfeitas, não há nenhum aumento da atividade osteoclástica, e desse modo nenhum risco de reações de inflamação adversas.

[0011] A invenção da Patente EP-B1-2445543 refere-se a ummaterial substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico que compreende um núcleo de CAP sinterizado e pelo menos uma camada desenvolvida epitaticamente uniforme e fechada de HAP nanocristalina depositada em cima do núcleo de CAP sinterizado, por meio do que os nanocristais desenvolvidos epitaticamente têm o mesmo tamanho e morfologia que o mineral do osso humano, isto é, um comprimento de 30 a 46 nm e uma largura de 14 a 22 nm.

[0012] O núcleo de CAP sinterizado pode compreender fosfato detricálcio (TCP), principalmente o α-TCP (α-Ca3(PO4)2) ou o β-TCP (β- Ca3(PO4)2), e/ou o fosfato de tetracálcio (TTCP) Ca4(PO4)2O.

[0013] De acordo com uma modalidade normalmente usada, onúcleo de CAP sinterizado consiste essencialmente em TCP, em que o α-TCP é o preferido.

[0014] A camada desenvolvida epitaticamente de HAP nanocristalina é estrutural e quimicamente quase idêntica ao mineral do osso humano natural.

[0015] A camada desenvolvida epitaticamente de HAPnanocristalina tem geralmente uma espessura de pelo menos 15 a 50 nm, de preferência de pelo menos 20 a 40 nm, e com mais preferência de pelo menos 25 a 35 nm. Essa espessura mínima corresponde a uma camada de nanocristais de HAP na orientação epitaxial.

[0016] A camada desenvolvida epitaticamente de HAPnanocristalina pode compreender uma só camada ou múltiplas camadas de nanocristais de HAP na orientação epitaxial. A espessura da camada desenvolvida epitaticamente de HAP nanocristalina, que é relacionada ao número de tais camadas de nanocristais de HAP na orientação epitaxial, será selecionada de acordo com a aplicação pretendida do material substituto de osso como implante ou prótese em partes diferentemente carregadas do corpo. O material substituto de osso da presente invenção é de fato projetado para funcionar in vivo como um sistema do tipo vivo que transforma progressivamente o núcleo de CAP sinterizado em hidróxi apatita de tamanho e morfologia similares ao mineral do osso humano, em que a velocidade dessa transformação é dependente da taxa de liberação pelo núcleo de CAP sinterizado, que é até uma grande extensão controlada pela espessura da camada desenvolvida epitaticamente de HAP nanocristalina.

[0017] As propriedades do material substituto de osso deCAP/HAP são até uma grande extensão controladas pela espessura da camada desenvolvida epitaticamente de HAP cristalina. O termo "propriedades" inclui a capacidade do substituto do osso de CAP/HAP de liberar uma concentração constante de íons de cálcio no ambiente local in vitro e in vivo.

[0018] A espessura da camada desenvolvida epitaticamente deHAP nanocristalina é relacionada à razão entre o material de núcleo de CAP sinterizado e a HAP, em que a dita razão fica geralmente entre 5:95 e 95:5, e de preferência de 10:90 a 90:10.

[0019] O material substituto de osso de CAP/HAP pode ser umparticulado ou um granulado, em que as partículas ou os grânulos têm um tamanho e um formato desejados. Geralmente, as partículas ou os grânulos são mais ou menos esféricos e têm um diâmetro de 250 a 5000 μm.

[0020] O material substituto de osso de CAP/HAP também podeser um corpo moldado, por exemplo, um parafuso, um prego, um pino ou uma estrutura que tem o perfil de uma parte do corpo ósseo tal como principalmente uma anca, uma clavícula, uma nervura, uma mandíbula ou uma parte do crânio. Tal parafuso, prego ou pino pode ser usado na cirurgia ortopédica reconstrutiva para fixar um ligamento a um osso, por exemplo, no joelho ou no cotovelo. Tal estrutura que tem o perfil de uma parte do corpo ósseo pode ser usada na cirurgia ortopédica como uma prótese para substituir um osso ou uma parte do osso em faltante ou com defeito.

[0021] É ensinado que o material substituto de osso de CAP/HAPda Patente EP-B1-2445543 é ser obtido por um processo que compreende as etapas de a) preparação de um material de núcleo de CAP sinterizado, b) imersão do material de núcleo doe CAP sinterizado em uma solução aquosa a uma temperatura entre 10°C e 50°C para iniciar o processo de transformação de CAP em HAP, por meio da qual uma camada desenvolvida epitaticamente fechada uniforme e fechada de hidróxi apatita nanocristalina é formada na superfície do material de núcleo de CAP sinterizado, em que os nanocristais desenvolvidos epitaticamente têm o mesmo tamanho e morfologia que o mineral do osso humano, c) interrupção da transformação mediante a separação do material sólido da solução aquosa em um momento em que um revestimento uniforme e fechado de pelo menos uma camada doe HAP nanocristalina estiver presente, mas antes que o processo de transformação seja encerrado por completo, d) (opcionalmente esterilização do material separado proveniente da etapa c).

[0022] A preparação do material de núcleo de CAP sinterizadopode ser executada pelos métodos conhecidos no estado da técnica que compreendem primeiramente a misturação de pós de fosfato de cálcio hidrogenado (CaHPO4), carbonato de cálcio e/ou hidróxido de cálcio, e a seguir a calcinação e a sinterização da mistura dentro de uma faixa de temperatura apropriada, obtendo desse modo um material de núcleo de CAP sinterizado a granel (vide, por exemplo, Mathew M. et al., 1977, Acta. Cryst. B33: 1325; Dickens B. et al., 1974, J. Solid State Chemistry 10, 232; e Durucan C. et al., 2002, J. Mat. Sci., 37:963).

[0023] Um material de núcleo de TCP sinterizado a granel podedesse modo ser obtido mediante a misturação de pós de fosfato de cálcio hidrogenado (CaHPO4), carbonato de cálcio e/ou do hidróxido de cálcio à razão estequiométrica, calcinação e sinterização da mistura a uma temperatura na faixa de 1200 a 1450°C, de preferência de cerca de 1400°C.

[0024] Um material de núcleo de TTCP sinterizado a graneltambém pode ser obtido pelo processo acima descrito.

[0025] O material de núcleo de CAP sinterizado a granel reparadopor tais métodos pode ser poroso com uma porosidade de 2 a 80% em volume e uma ampla distribuição de poros. Os parâmetros da porosidade serão selecionados de acordo com a aplicação pretendida do material substituto de osso de CAP/HAP.

[0026] O material de núcleo de CAP sinterizado usado na etapa b) pode ser - o material de núcleo de CAP sinterizado a granel preparado tal como descrito acima, - um particulado ou granulado do material de núcleo de CAP sinterizado obtido a partir do material de núcleo de CAP sinterizado a granel preparado tal como descrito acima, ao usar métodos convencionais tais como esmagamento, trituração e/ou moagem, e peneiragem, ou - uma pré-forma do material de núcleo de CAP sinterizado que tem um formato e um tamanho desejados, por exemplo, um parafuso, um prego, um pino ou uma estrutura que tem o perfil de uma parte do corpo ósseo.

[0027] Tal pré-forma de qualquer formato e tamanho desejadospode ser obtida a partir do material de núcleo sinterizado a granel preparado tal como descrito acima, ao usar técnicas de prototipificação bem conhecidas, tais como a fresagem CNC ou a impressão em 3D (vide, por exemplo, Bartolo P. et al., 2008, Bio-Materials and Prototyping Applications in Medicine, Springer Science New York, ISBN 978-0-387-47682-7; Landers R. et al., 2002, Biomaterials 23(23), 4437; Yeong W.-Y. et al., 2004, Trends in Biotechnology, 22 (12), 643; e Seitz H. et al., 2005, Biomed. Mater.Res. 74B (2), 782).

[0028] É ensinado que a solução aquosa da etapa b) é água pura,um fluido corpóreo simulado ou um tampão. É importante que o valor do pH da solução de imersão da etapa b) seja quase neutro e permaneça estável durante todo o processo de transformação, de preferência dentro de uma faixa do pH de 5,5 a 9,0.

[0029] O termo "corpo corpóreo simulado" refere-se a qualquersolução que imita um fluido corpóreo. De preferência, o fluido corpóreo simulado tem uma concentração de íons similar àquela do plasma do sangue.

[0030] O tampão pode ser qualquer tampão na faixa de pH acima,mas é de preferência um tampão de fosfato com ou sem cálcio, magnésio e/ou sódio.

[0031] O tampão usado nos exemplos (vide os Exemplos 4 e 5) éum tampão de fosfato aquoso.

[0032] A faixa de temperatura na etapa b) fica geralmente entre10°C e 50°C, de preferência entre 25 e 45°C, e com mais preferência entre 35°C e 40°C.

[0033] A etapa de imersão b) induz em uma primeira fase umatransição de fase de primeira ordem do material do núcleo de CAP e, portanto, a nucleação de precursores de nanocristais de HAP. Durante a segunda fase, os precursores de HAP resultantes da primeira fase irão crescer e estabelecer uma camada de compósito nanocristalina epitática fechada (isto é, revestindo completamente).A primeira camada de nanocristal de HAP deve ser uniforme e fechada e conectada epitaxialmente ao material de núcleo de CAP sinterizado.

[0034] Durante uma terceira fase, a transição de fase de primeiraordem pode prosseguir dentro do compósito de bicamada recentemente formado para transformar ainda o material de núcleo de CAP sinterizado (TCP ou TTCP) em HAP nanocristalina. Durante essa terceira etapa de transição de fase, os íons de cálcio serão liberados por um tempo controlável por um processo controlado de difusão lenta até que uma parte do material de núcleo de CAP sinterizado esteja transformada em HAP nanocristalina. A espessura da camada de HAP e, portanto, a velocidade de liberação de cálcio pode ser controlada pela variação do tempo de transformação.

[0035] A camada de HAP desenvolvida epitaticamentenanocristalina de espessura apropriada será preparada in vitro, e a transformação de CAP em HAP é interrompida antes que ela esteja encerrada.

[0036] Assim que o material substituto de osso de CAP/HAP éajustado em vivo, o processo de transformação de CAP em HAP será reativado pelo contato com os fluidos corpóreos e o material substituto do osso irá funcionar como um sistema do tipo vivo, formando uma nova hidróxi apatita similar no tamanho e na morfologia ao mineral do osso humano. Durante o processo de transformação de fase in vivo, os íons de cálcio transportados serão liberados no ambiente local que suporta o equilíbrio de cálcio local que é importante e vantajoso para os processos de regeneração do osso.

[0037] Devido aos tempos de regeneração diferentes de defeitosdo osso em regiões diferentemente carregadas do corpo, é importante que a velocidade de liberação de cálcio possa ser controlada. Isto pode ser obtido pela variação da espessura da camada desenvolvida epitaticamente de hidróxi apatita.

[0038] A etapa c), portanto, é uma etapa muito crítica. O tempo deexposição na solução aquosa da etapa b) é baseado na espessura da camada de HAP desejada. Pelo menos uma camada de HAP nanocristalina na orientação epitaxial é necessária. É essencial que a transformação de CAP em HAP não seja encerrada.

[0039] O tempo apropriado de exposição de acordo com aespessura desejada pode ser calculado ao usar várias equações diferenciais termodinâmicas bem conhecidas de um elemento versado no estado da técnica de fosfatos de cálcio, cimento e química do concreto.

[0040] Vide, por exemplo: Pommersheim, J. C.; Clifton, J. R.(1979) Cem. Conc. Res.; 9:765; Pommersheim, J. C.; Clifton, J. R. (1982) Cem. Conc. Res.; 12:765; e Schlüssler, K. H. Mcedlov- Petrosjan, O. P.; (1990): Der Baustoff Beton, VEB Verlag Bauwesen, Berlim.

[0041] A transferência da solução das equações diferenciais acima mencionadas ao sistema de CAP/HAP permite a predição da transição de fase de CAP em HAP e da espessura da camada de maneira tal que a camada epitática de HAP pode ser preparada de uma maneira estável e reproduzível.

[0042] A separação do material sólido da solução aquosa no finalda etapa c) é normalmente executada por meio de filtração, lavagem e secagem, ao usar técnicas bem conhecidas no estado da técnica.

[0043] Nos exemplos da Patente EP-B1-2445543 (ou seja,

[0044] A etapa de esterilização opcional d) pode ser executada por técnicas bem conhecidas no estado da técnica, tais como a irradiação gama ou a radiação de raios X.

[0045] Ao usar tal como ensinado nos Exemplos 4 e 5 da PatenteEP-B1-2445543 um tampão de fosfato aquoso para a solução aquosa da etapa b) e água purificada para lavar 3 vezes os grânulos separados no final da etapa c), é obtido um material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico que compreende um núcleo de CAP sinterizado e uma camada desenvolvida epitaticamente fechada de HAP nanocristalina depositada sobre a superfície externa do núcleo de CAP sinterizado, por meio do que os nanocristais desenvolvidos epitaticamente têm o mesmo tamanho e morfologia que o mineral do osso humano, isto é, um comprimento de 30 a 46 nm e uma largura de 14 a 22 nm, em que a camada desenvolvida epitaticamente fechada de HAP nanocristalina depositada sobre a superfície externa do núcleo de CAP sinterizado tem uma superfície externa não homogênea que compreende aglomerados individuais (separados) de plaquetas de cristal planas que consistem em nanocristais de HAP desenvolvidos epitaticamente e áreas lisas entre os aglomerados individuais de plaquetas de cristal planas, em que a % da superfície externa ocupada pelas áreas lisas entre os conjuntos individuais de plaquetas de cristal planas depende do tempo de transformação nas condições de transformação indicadas.

[0046] Vide a Figura 1A, que representa uma imagem de SEM(microscopia eletrônica de varredura) do protótipo 1 (grânulo de 1 a 2 mm) que tem um tempo de transformação de 30 minutos em que as áreas lisas representam cerca de 70% da superfície externa total, tal como medido por SEM, e a Figura 1B, que representa uma imagem de SEM do protótipo 2 (grânulo de 1 a 2 mm) que tem um tempo de transformação de 40 minutos em que as áreas lisas representam cerca de 50% da superfície externa total, tal como medido por SEM.

[0047] A Patente WO 2015/009154 divulga um método para aprodução de um material osteocondutor com capacidade osteoindutiva incrementada, o qual compreende a sujeição de um material de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico sinterizado que tem uma um topografia de superfície que consiste em grãos a um tratamento hidrotérmico sob uma pressão de 2 a 4 barras a uma temperatura igual a ou mais alta do que 125°C sem controlar o pH por uma duração suficiente para mudar os grãos de fosfato de cálcio sobre a superfície do material de partida em agulhas de fosfato de cálcio com um diâmetro de 10 a 1500 nm. Uma temperatura de pelo menos 125°C e uma pressão de pelo menos 2 barras ficam longe das condições (perto das condições fisiológicas do corpo humano) usadas na Patente EP- B1-2445543 (temperatura de 35 a 40°C, pH de 5,5 a 9,0, pressão ambiente) que permitem o crescimento epitático de nanocristais de HAP. Essas agulhas não são desenvolvidas epitaticamente, mas unidas a ou depositadas sobre o material de núcleo base e revestem somente parcialmente (geralmente 40 a 90%) este último, desse modo aumentando a sua superfície específica e capacidade de abrigar proteínas, realçando desse modo o seu potencial osteoindutor.

[0048] Foi verificado agora que, mediante a adição de 10 a 90%,de preferência de 20 a 60%, de um álcool alifático de cadeia curta que inclui, mas sem ficar a eles limitado, metanol, etanol, propanol ou butanol, ao tampão de fosfato aquoso da etapa b) na preparação do material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico de acordo com a Patente EP-B1-2445543, a superfície externa não homogênea da camada desenvolvida epitaticamente fechada de HAP nanocristalina depositada sobre a superfície externa do material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico de núcleo de CAP sinterizado, que compreende aglomerados individuais de plaquetas de cristal planas e áreas lisas intermediárias, é substituída por uma superfície externa grossa homogênea que compreende plaquetas de cristal planas sem quaisquer aglomerados de cristais individuais de plaquetas de cristal planas. Essa superfície externa grossa homogênea compreende geralmente plaquetas de hidróxi apatita nanocristalinas desenvolvidas epitaticamente que formam uma rede bloqueada de plaquetas com tamanhos individuais de plaquetas de 0,2 a 20 μm, e de preferência de 0,5 a 5 μm, tal como determinado por SEM, dependendo da quantidade de álcool alifático usada.

[0049] Tal como mostrado nos testes in vitro de diferenciaçãoosteogênica de células tronco mesenquimais humanas fetais (hMSCs), a resposta osteogênica in vivo provavelmente é mais forte para o material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico ter do que a superfície externa grossa homogênea que compreende plaquetas de cristal planas do que para o material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico ensinado pela Patente EP-B1-2445543 que tem uma superfície externa não homogênea que compreende aglomerados individuais de plaquetas de cristal planas e áreas lisas intermediárias. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0050] A invenção refere-se desse modo a um material substitutode osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico que compreende um núcleo de CAP sinterizado e uma camada desenvolvida epitaticamente fechada de HAP nanocristalina depositada sobre a superfície externa do núcleo de CAP sinterizado, por meio do que os nanocristais desenvolvidos epitaticamente têm o mesmo tamanho e morfologia que o mineral do osso humano, em que a camada desenvolvida epitaticamente fechada de HAP nanocristalina depositada na superfície externa do núcleo de CAP sinterizado tem uma superfície externa grossa homogênea que compreende plaquetas de cristal planas.

[0051] Esse material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxiapatita (CAP/HAP) bifásico exibe uma diferenciação osteogênica aumentado de células tronco mesenquimais humanas fetais (hMSCs), o que é uma forte indicação de uma resposta osteogênica in vivo realçada.

[0052] O termo "camada desenvolvida epitaticamente fechada deHAP nanocristalina depositada sobre a superfície externa do núcleo de CAP sinterizado" significa que a camada desenvolvida epitaticamente de HAP nanocristalina cobre completamente toda a superfície externa do núcleo de CAP sinterizado.

[0053] O termo "superfície externa grossa homogênea quecompreende plaquetas de cristal planas" significa que, macroscopicamente, a aspereza da superfície externa causada pelas plaquetas de cristal planas é estatisticamente distribuída uniformemente sobre a superfície do núcleo de CAP sem os aglomerados de cristal individuais de plaquetas de cristal planas. Vide a Figura 2, que representa imagens de SEM dos protótipos 3 a 7 do material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico da invenção com uma superfície externa grossa homogênea com um grau variado de aspereza.

[0054] O termo "plaquetas de cristal planas" significa osaglomerados de cristal onde a altura (espessura) é consideravelmente menor do que a largura e o comprimento com respeito às três direções perpendiculares. Tais plaquetas de cristal planas são claramente visíveis na Figura 3B.

[0055] De modo geral, a superfície externa grossa homogêneacompreende plaquetas de hidróxi apatita nanocristalinas desenvolvidas epitaticamente que formam uma rede bloqueada de plaquetas com tamanhos (largura e comprimento) de 0,2 a 20 μm tal como determinado por SEM. Quanto maiores os tamanhos de plaquetas, mais elevada a aspereza da superfície externa.

[0056] De preferência, a superfície externa grossa homogêneacompreende plaquetas de hidróxi apatita nanocristalinas desenvolvidas epitaticamente que formam uma rede bloqueada de plaquetas com tamanhos de 0,5 a 5 μm tal como determinado por SEM.

[0057] De maneira geral, essa superfície externa grossahomogênea compreende plaquetas de hidróxi apatita desenvolvidas epitaticamente que formam uma rede bloqueada que contém poros entre 0,03 e 2 μm tal como determinado por Porosimetria com Intrusão de Mercúrio (MIP). Quanto mais elevado o volume de poro entre 0,03 e 2 μm, mais elevada a aspereza da superfície externa.

[0058] De maneira geral, essa superfície externa grossahomogênea pode ser caracterizada por AFM (Microscopia de Força Atômica) com uma aspereza do quadrado médio da raiz (Rq) derivada de AFM em uma faixa de 50 a 400 nm e uma altura máxima média do perfil (Rz) em uma faixa de 500 a 2000 nm.

[0059] De preferência, a superfície externa grossa homogêneapode ser caracterizada por uma aspereza do quadrado médio da raiz (Rq) derivada de AFM em uma faixa de 110 a 150 nm e uma altura máxima média do perfil (Rz) em uma faixa de 550 a 750 nm.

[0060] De modo geral, a porcentagem de HAP no materialsubstituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico é de 1 a 90%, tal como medido por XRD.

[0061] De preferência, essa porcentagem é 1,5 a 30%, e com maispreferência de 2 a 15%, tal como medido por XRD.

[0062] O núcleo de CAP sinterizado compreende fosfato detricálcio (TCP), principalmente o α-TCP (α-Ca3(PO4)2) ou o β-TCP (β- Ca3(PO4)2), e/ou o fosfato de tetracálcio (TTCP) Ca4(PO4)2O.

[0063] De acordo com uma modalidade frequentemente usada, onúcleo de CAP sinterizado consiste essencialmente em TCP, em que o α-TCP é o preferido.

[0064] A camada desenvolvida epitaticamente de HAPnanocristalina é estruturalmente quase idêntica ao mineral do osso humano natural.

[0065] O material substituto de osso de CAP/HAP pode ser umparticulado ou um granulado, em que as partículas ou grânulos têm um tamanho e um formato desejados. De maneira geral, as partículas ou os grânulos têm um tamanho de 250 a 5000 μm, de preferência de 1000 a 2000 μm.

[0066] O material substituto de osso de CAP/HAP também podeser um corpo moldado, por exemplo, um parafuso, um prego, um pino ou uma estrutura que tem o perfil de uma parte do corpo ósseo, tal como principalmente uma anca, uma clavícula, uma nervura, uma mandíbula ou uma parte do crânio. Tal parafuso, prego ou pino pode ser usado na cirurgia ortopédica reconstrutiva para fixar um ligamento a um osso, por exemplo, no joelho ou no cotovelo. Tal estrutura que tem o perfil de uma parte do corpo ósseo pode ser usada na cirurgia ortopédica como uma prótese para substituir um osso ou uma parte do osso em falta ou com defeito.

[0067] A invenção também se refere a um mástique quecompreende partículas ou grânulos do substituto do osso de CAP/HAP definido acima em uma matriz apropriada, e em geral compreende polímeros naturais ou sintéticos. De maneira geral, as partículas ou os grânulos têm um tamanho de 250 a 5000 μm, de preferência de 1000 a 2000 μm.

[0068] A invenção também se refere a um processo de preparaçãodo material substituto de osso de CAP/HAP definido acima, o qual compreende as etapas de a) preparação de um material de núcleo de CAP sinterizado, b) imersão do material d núcleo de CAP sinterizado em uma solução tampão que contém de 10 a 90% de um álcool alifático de cadeia curta a uma temperatura entre 10°C e 50°C para iniciar o processo de transformação de CAP em HAP por meio do qual uma camada desenvolvida epitaticamente fechada de hidróxi apatita nanocristalina será formada sobre a superfície do material de núcleo de CAP sinterizado, por meio do que os nanocristais desenvolvidos epitaticamente têm o mesmo tamanho e morfologia que o mineral do osso humano, em que a camada desenvolvida epitaticamente fechada de HAP nanocristalina formada sobre a superfície material de núcleo de CAP sinterizado tem uma superfície externa homogênea que compreende plaquetas de cristal planas, c) interrupção da transformação mediante a separação do material sólido da solução aquosa em um momento em que um revestimento fechado de pelo menos uma camada do nanocristalina de HAP estiver presente, mas antes que o processo de transformaçãoseja encerrado por completo, e d) opcionalmente, esterilização do material separado proveniente da etapa c).

[0069] Um álcool alifático de cadeia curta apropriado pode serselecionado do grupo que consiste em metanol, etanol, propanol e butanol.

[0070] De preferência, o álcool alifático de cadeia curta é o etanol.

[0071] De preferência, a solução tampão da etapa b) contém de 20a 60%, e com mais preferência de 30 a 50%, de um álcool alifático de cadeia curta.

[0072] Os parâmetros da aspereza da superfície externa grossahomogênea da camada desenvolvida epitaticamente fechada de HAP nanocristalina depositada sobre a superfície externa do núcleo de CAP sinterizado, principalmente - os parâmetros de AFM: a aspereza do quadrado médio da raiz (Rq) derivada de AFM e a altura máxima média do perfil (Rz), - os tamanhos das plaquetas de hidróxi apatita nanocristalinas desenvolvidas epitaticamente tal como determinado por SEM, e - o volume dos poros entre 0,03 e 2 μm tal como determinado por MIP, podem ser ajustados de maneira conveniente ao alterar a porcentagem de álcool alifático de cadeia curta na solução tampão da solução de transformação.

[0073] Quanto maior a porcentagem, mais baixas a aspereza doquadrado médio da raiz (Rq) derivada de AFM e a altura máxima média do perfil (Rz), menores os tamanhos das plaquetas de hidróxi apatita nanocristalinas desenvolvidas epitaticamente tal como determinado por SEM e menor o volume dos poros entre 0,03 e 2 μm tal como determinado por MIP.

[0074] A solução tampão da etapa b) que contém de 10 a 90% deum álcool alifático de cadeia curta é obtida ao misturar uma solução tampão aquosa com quantidades variadas de um álcool alifático de cadeia curta. A solução tampão aquosa é escolhida de maneira tal que o valor do pH da solução de imersão da etapa b) que também contém de 10 a 90% de um álcool alifático de cadeia curta é quase neutro e permanece estável durante todo o processo de transformação, de preferência dentro de uma faixa do pH de 5,5 a 9,0, e com mais preferência de 7,0 a 8,0.

[0075] O tampão pode ser qualquer tampão na faixa de pH acima,mas é de preferência um tampão de fosfato com ou sem cálcio, magnésio e/ou sódio.

[0076] Uma solução tampão apropriada é, por exemplo, umasolução aquosa de 0,05 a 0,3 M de fosfato de sódio diidrogenado (NaH2PO4) com um valor de pH de 7,3 a 7,6.

[0077] A faixa de temperatura na etapa b) fica geralmente entre10°C e 50°C, de preferência entre 25 e 45°C, e com mais preferência entre 35°C e 40°C.

[0078] A etapa b) é de preferência executada a uma temperaturade 35 a 40°C em uma solução tampão de fosfato a um pH de 7,0 a 8,0 contendo de 20 a 60% de um álcool alifático de cadeia curta.

[0079] A preparação do material de núcleo de CAP sinterizadopode ser executada pelos métodos conhecidos no estado da técnica que compreendem primeiramente a misturação de pós de fosfato de cálcio hidrogenado (CaHPO4), carbonato de cálcio e/ou hidróxido de cálcio, a seguir a calcinação e a sinterização da mistura dentro de uma faixa de temperatura apropriada, obtendo desse modo um material de núcleo de CAP sinterizado a granel (vide, por exemplo, Mathew M. et al., 1977, Acta. Cryst. B33: 1325; Dickens B. et al., 1974, J. Solid State Chemistry 10, 232; e Durucan C. et al., 2002, J. Mat. Sci., 37:963).

[0080] Um material de núcleo de TCP sinterizado a granel podedesse modo ser obtido mediante a misturação de pós de fosfato de cálcio hidrogenado (CaHPO4), carbonato de cálcio e/ou hidróxido de cálcio em uma razão estequiométrica, a calcinação e a sinterização da mistura a uma temperatura na faixa de 1200 a 1450°C, de preferência de cerca de 1400C.

[0081] Um material de núcleo de TTCP sinterizado a granel também pode ser obtido pelo processo descrito acima.

[0082] O material de CAP sinterizado a granel preparado por taismétodos pode ser poroso com uma porosidade de 2 a 80% em volume e uma ampla distribuição de poros. Os parâmetros da porosidade serão selecionados de acordo com a aplicação pretendida do material substituto de osso de CAP/HAP.

[0083] O material de núcleo de CAP sinterizado usado na etapa b)pode ser - o material de núcleo de CAP sinterizado a granel preparado tal como descrito acima, - um particulado ou granulado do material de núcleo de CAP sinterizado obtido a partir do material de núcleo de CAP sinterizado a granel preparado tal como descrito acima, ao usar métodos convencionais tais como esmagamento, trituração e/ou moagem, e peneiragem, ou - uma pré-forma do material de núcleo de CAP sinterizado que tem um formato e um tamanho desejados, por exemplo, um parafuso, um prego, um pino ou uma estrutura que tem o perfil de uma parte do corpo ósseo.

[0084] Tal pré-forma de qualquer formato e tamanho desejadopode ser obtida a partir do material de núcleo sinterizado a granel preparado tal como descrito acima, ao usar técnicas de prototipificação bem conhecidas tais como a fresagem CNC ou a impressão em 3D (vide, por exemplo, Bartolo P. et al., 2008, Bio-Materials and De prototipificação Applications in Medicine, Springer Science New York, ISBN 978-0-387-47682-7; Landers R. et al., 2002, Biomaterials 23(23), 4437; Yeong W. -Y. et al., 2004, Trends in Biotechnology, 22 (12), 643; e Seitz H. et al., 2005, Biomed. Mater.Res. 74B (2), 782).

[0085] A etapa de imersão b) induz em uma primeira fase umatransição de fase de primeira ordem do material do núcleo de CAP e, portanto, a nucleação de precursores de nanocristais de HAP. Durante a segunda fase, os precursores de HAP resultantes da primeira fase irão crescer e estabelecer uma camada de compósito nanocristalina epitática fechada (isto é, que reveste completamente).A primeira camada de nanocristais de HAP deve ser uniforme e fechada e conectada epitaticamente ao material de núcleo de CAP sinterizado.

[0086] Durante uma terceira fase, a transição da fase de primeiraordem pode prosseguir dentro do compósito de bicamada recentemente formado para transformar ainda o material de núcleo de CAP sinterizado (TCP ou TTCP) em HAP nanocristalina. Durante essa terceira etapa de transição de fase, os íons de cálcio serão liberados por um tempo controlável por um processo controlado de difusão lenta até que uma parte do material de núcleo de CAP sinterizado tenha sido transformada em HAP nanocristalina. A espessura da camada de HAP e, portanto, a velocidade de liberação de cálcio, pode ser controlada pela variação do tempo de transformação.

[0087] A camada de HAP nanocristalina desenvolvidaepitaticamente de espessura apropriada será preparada in vitro, e a transformação de CAP em HAP é interrompida antes que seja encerrada.

[0088] Assim que o material substituto de osso de CAP/HAP éajustado in vivo, o processo de transformação de CAP em HAP é reativado pelo contato com os fluidos corpóreos e o material substituto de osso irá funcionar como um sistema do tipo vivo que forma uma nova hidróxi apatita similar no tamanho e na morfologia ao mineral do osso humano. Durante o processo de transformação de fase in vivo, os íons de cálcio transportados serão liberados no ambiente local que suporta o equilíbrio local do cálcio, o que é importante e vantajoso para processos de regeneração do osso.

[0089] Devido aos tempos diferentes de regeneração de defeitosdo osso em regiões distintamente carregadas do corpo, é importante que a velocidade de liberação de cálcio possa ser controlada. Isto pode ser obtido pela variação da espessura da camada desenvolvida epitaticamente de hidróxi apatita.

[0090] Portanto, a etapa c) é uma etapa muito crítica. O tempo deexposição na solução aquosa da etapa b) é baseado na espessura da camada de HAP desejada. Pelo menos uma camada de HAP nanocristalina na orientação epitaxial é necessária. É essencial que a transformação de CAP em HAP não seja encerrada.

[0091] O tempo apropriado de exposição de acordo com aespessura desejada pode ser calculado ao usar várias equações diferenciais termodinâmicas bem conhecidas de um elemento versado no estado da técnica de fosfatos de cálcio e química do cimento e do concreto.

[0092] Vide, por exemplo: Pommersheim, J. C.; Clifton, J. R. (1979)Cem. Conc. Res.; 9:765; Pommersheim, J. C.; Clifton, J. R. (1982) Cem. Conc. Res.; 12:765; e Schlüssler, K. H. Mcedlov-Petrosjan, O. P.; (1990): Der Baustoff Beton, VEB Verlag Bauwesen, Berlim.

[0093] A transferência da solução das equações diferenciais acimamencionadas ao sistema de CAP/HAP permite a predição da transição de fase de CAP em HAP e da espessura da camada de maneira tal que a camada epitática de HAP pode ser preparada de uma maneira estável e reproduzível.

[0094] A separação do material sólido da solução aquosa é normalmente executada por meio de filtração e secagem, ao usar as técnicas bem conhecidas no estado da técnica.

[0095] A etapa de esterilização opcional d) pode ser executadapelas técnicas bem conhecidas no estado da técnica tais como a irradiação gama ou a radiação de raios X.

[0096] A invenção também se refere ao uso do material substitutode osso de CAP/HAP definido acima, geralmente na forma de um particulado, um mástique ou um corpo moldado tal como um implante ou uma prótese para suportar a formação do osso, a regeneração do osso, o reparo do osso e/ou a substituição do osso em um local de defeito em um ser humano ou um animal.

[0097] A invenção também se refere a um método de promoção daformação do osso, da regeneração do osso e/ou do reparo do osso em um local de defeito em um ser humano ou um animal, mediante o implante do material substituto do osso de CAP/HAP definido acima, geralmente na forma de um particulado, um mástique ou um corpo moldado.

Vantagens do material substituto de osso de CAP/HAP dainvenção e do processo de preparação do mesmo.

[0098] Esse material substituto de osso de fosfato decálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico da invenção com uma superfície externa grossa homogênea que compreende plaquetas de cristal planas exibe uma maior diferenciação osteogênica de células tronco mesenquimais humanas fetais (hMSCs), em particular uma expressão maior dos marcadores de diferenciação osteopontina (OPN) e osteocalcina (OCN), em comparação com o material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico ensinado pela Patente EP-B1-2445543 que tem uma superfície externa não homogênea que compreende aglomerados individuais de plaquetas de cristal planas e áreas lisas intermediárias.

Esta é uma forte indicação de uma resposta osteogênica in vivo realçada.

[0099] Isto é consistente com os resultados publicados por R. A.Gittens et al. Em Biomaterials em maio de 2011, 32(13): 3395-3403, que mostram que a introdução de estruturas em nanoescala em combinação com uma aspereza na micro- submicro-escala melhora a diferenciação de osteoblasto e a produção do fator local, o que indica por sua vez o potencial para uma melhor osseointegração do implante in vivo.

[0100] O processo de preparação do material substituto de ossode fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico da invenção permite ajustar de maneira conveniente os parâmetros da aspereza da superfície externa grossa homogênea da camada desenvolvida epitaticamente fechada de HAP nanocristalina depositada sobre a superfície externa do núcleo de CAP sinterizado, principalmente - os parâmetros de AFM: aspereza do quadrado médio da raiz (Rq) derivada de AFM e altura máxima média do perfil (Rz), - os tamanhos das plaquetas de hidróxi apatita nanocristalinas desenvolvidas epitaticamente tal como determinado por SEM, e - o volume dos poros entre 0,03 e 2 μm tal como determinado por MIP, mediante o ajuste da porcentagem do álcool alifático de cadeia curta na solução tampão da solução de transformação.

[0101] Quanto maior a porcentagem, menores a aspereza doquadrado médio da raiz (Rq) derivada de AFM e a altura máxima média do perfil (Rz), menores os tamanhos das plaquetas de hidróxi apatita nanocristalinas desenvolvidas epitaticamente tal como determinado por SEM e menor o volume dos poros entre 0,03 e 2 μm tal como determinado por MIP.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0102] A invenção será descrita em mais detalhes a seguir comreferência aos exemplos ilustrativos de modalidades preferidas da invenção e das figuras dos desenhos anexos, nos quais:

[0103] A Figura 1A representa uma imagem de SEM do protótipo 1(grânulo de 1 a 2 mm) de um material substituto de osso divulgado pela Patente EP-B1-2445543 e preparado no Exemplo 1 que tem um tempo de transformação de 30 minutos em que as áreas lisas representam cerca de 70% da superfície externa total tal como medido por SEM.

[0104] A Figura 1B representa uma imagem de SEM do protótipo 2 (grânulo de 1 a 2 mm) de um material substituto de osso divulgado pela Patente EP-B1-2445543 e preparado no Exemplo 1 que tem um tempo de transformação de 40 minutos em que as áreas lisas representam cerca de 50% da superfície externa total tal como medido por SEM.

[0105] As Figuras 2A a 2E representam imagens de SEM doprotótipo 3 (Figura 2A): 20% de etanol, grânulo de 1 a 2 mm), protótipo 4 (Figura 2B): 30% de etanol, grânulo de 1 a 2 mm), protótipo 5 (Figura 2C): 40% de etanol, grânulo de 1 a 2 mm), protótipo 6 (Figura 2D): 50% de etanol, grânulo de 1 a 2 mm) e o protótipo 7 (Figura 2E): 60% de etanol, grânulo de 1 a 2 mm) de materiais substitutos de osso de acordo com a invenção.

[0106] Todas as imagens de SEM da Figura 1 e das Figuras 2A a2E têm uma ampliação de 3500.

[0107] A Figura 3A representa uma imagem SEM de uma seçãotransversal do protótipo 5 (40% de etanol, grânulo de 1 a 2 mm) a uma ampliação menos (x) de 1000. O canto inferior à direita mostra a superfície externa do grânulo e o centro do grânulo é localizado na direção do canto superior à esquerda.

[0108] A Figura 3B representa uma imagem de SEM de umaseção transversal do protótipo 5 (40% de etanol, grânulo de 1 a 2 mm) em uma ampliação maior (14'000 x).

[0109] A Figura 4 representa imagens de SEM (as duas imagenssuperiores) e imagens de AFM (as quatro outras imagens) dos protótipos 3a (à esquerda: 20% de etanol) e 6a (à direita: 50% de etanol) de discos não porosos de materiais substitutos de osso de acordo com a invenção preparados no Exemplo 2.

[0110] As Figuras 5A e 5B representam as respostas daosteocalcina (OCN, Figura 5A) e da osteopontina (OPN, Figura 5B) de células tronco mesenquimais humanas fetais (hMSCs) em contato com os materiais substitutos de osso de acordo com a invenção em comparação aos materiais substitutos de osso da técnica anterior no teste in vitro.

[0111] A Figura 6 representa diagramas de MIP de grânulos de 1 a 2 mm dos protótipos 3 (20% de etanol), 5 (40% de etanol) e 7 (60% de etanol) dos grânulos de 1 a 2 mm de materiais substitutos de osso de acordo com a invenção preparados no Exemplo 2 e α-TCP puro produzido tal como descrito no Exemplo 1.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0112] Os exemplos a seguir ilustram a invenção sem limitar oâmbito da mesma.

Exemplo 1 Preparação de materiais substitutos de osso de fosfatode cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásicos de acordo com a Patente EP-B1-2445543.

[0113] Um material sinterizado a granel de alfa-TCP, com os seusgrânulos porosos com um tamanho de partícula de 1,0 a 2,0 mm e grânulos transformados que têm um revestimento de HAP epitaticamente desenvolvido foi preparado similarmente aos Exemplos 1, 2 e 4 da Patente EP-B1-2445543.

[0114] 364 g de um pó anidro de fosfato de dicálcio, 136 g decarbonato de cálcio e 220 ml de água deionizada foram misturados por 5 minutos a 700 rpm ao usar um agitador de laboratório. A pasta do processo de misturação foi transferida imediatamente a um copo de platina estável à alta temperatura. O copo de platina cheio foi colocado em um forno frio. O forno foi aquecido até 1400°C ao usar uma taxa de aquecimento de 100°C por hora. Esta temperatura foi mantida por 12 horas e a seguir o forno foi resfriado até 800°C com uma taxa de resfriamento de 500°C por hora, a seguir resfriado até 300°C com uma taxa de resfriamento de 125°C por hora, e por fim resfriado até a temperatura ambiente ao comutar o forno. O material sinterizado a granel (α-Ca3(PO4)2 de fase pura) foi removido do forno e do copo de platina. O controle da pureza da fase foi executado ao usar a análise de difração de raios X em pó.

[0115] O produto a granel foi esmagado ao usar um esmagador demandíbulas (as distâncias das mandíbulas variaram de 10 a 1 mm). Os grânulos produzidos foram peneirados ao usar uma máquina de peneiragem e implementos de peneira com aberturas de malha de 2 mm e 1 mm. Após a peneiragem, os grânulos foram enxaguados com etanol para separar os resíduos finos do pó adsorvido aos grânulos. Os grânulos porosos foram secados por uma hora a 80°C em um secador de gabinete. A limpeza das superfícies das partículas após o enxague foi controlada pela observação da superfície ao usar microscopia eletrônica de varredura.

[0116] Uma solução tamponada adequada para o processo derevestimento e transformação de fase foi preparada ao dissolver 0,4 mol/l de fosfato de sódio diidrogenado (NaH2PO4) em água destilada. O pH da solução foi ajustado em 7,45 à temperatura ambiente ao usar hidróxido de sódio (NaOH). Os grânulos produzidos de acordo com os parágrafos precedentes foram imersos na solução preparada e foramarmazenados dentro de um banho de água bem moderado (40°C) por 30 minutos (protótipo 1) e respectivamente por 40 minutos (protótipo 2). Após a imersão, os grânulos foram enxaguados 3 vezes com água destilada para interromper o processo de transformação de fase e remover os resíduos da solução tamponada. Os grânulos porosos foram secados a 100°C em um secador de gabinete por duas horas.

[0117] A análise SEM com uma ampliação de 3500 x foi executadaem grânulos do protótipo 1 e do protótipo 2.

[0118] Tal como aparente das Figuras 1A e 1B, que representamas imagens de SEM dos protótipos 1 e 2, a superfície externa dos grânulos são não homogêneas e compreende aglomerados individuais (separados) de plaquetas de cristal planas que consistem em nanocristais de HAP desenvolvidos epitaticamente e áreas lisas entre os cristais.

[0119] Ao medir a superfície ocupada pelos aglomerados individuais e as áreas lisas nas imagens de SEM para cada um do protótipo 1 e do protótipo 2, foi determinado que as áreas lisas representam cerca de 70% da superfície externa para o protótipo 1 e cerca de 50% da superfície externa para o protótipo 2.

Exemplo 2 Preparação de materiais substitutos de osso de fosfatode cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico de acordo com a invenção. 1) Preparação dos grânulos de material substituto de osso

[0120] Grânulos porosos com tamanhos de 1 a 2 mm de α-TCP defase pura foram produzidos tal como descrito no Exemplo 1 acima.

[0121] A etapa de transformação da fase e revestimento foiexecutada em frascos de vidro colocados em um banho de água ajustado a 40°C. O tampão de transformação era uma solução aquosa de fosfato de sódio diidrogenado (NaH2PO4) misturada com proporções diferentes de etanol. A molaridade da solução aquosa de fosfato de sódio diidrogenado foi variada entre 0,05 M e 0,3 M e o teor de etanol entre 20 e 60% em peso/peso. O pH da solução de transformação ficou entre 7,3 e 7,6.

[0122] Os frascos de vidro foram preenchidos com o tampão detransformação e os grânulos de alfa-TCP foram adicionados com uma razão entre 1:40 a 1:80 (entre os grânulos e a solução detransformação). Os grânulos foram imersos na solução detransformação a 40°C por um período entre 24 e 72 horas. Após a imersão, os grânulos foram enxaguados 5 vezes com água deionizada (a razão entre os grânulos e a água é de 1:10 com respeito ao peso) e 2 vezes com etanol (99,9%, a razão entre os grânulos e o etanol é de 1:10 com respeito ao peso) para interromper o processo de transformação de fase e remover os resíduos da solução tamponada. Os grânulos porosos foram secados a 100°C em um secador de gabinete por duas horas.

[0123] A morfologia de superfície após o processo detransformação de fase e revestimento foi observada ao usar a análise de SEM.

[0124] A Figura 2 representa imagens de SEM com umaampliação de 3500 x do protótipo 3 (20% de etanol), do protótipo 4 (30% de etanol), do protótipo 5 (40% de etanol), do protótipo 6 (50% de etanol) e do protótipo 7 (60% de etanol) de materiais substitutos de osso de acordo com a invenção. Pode ser visto, ao comparar as Figuras 1A e 1B à Figura 2, que a superfície externa não homogênea dos protótipos 1 e 2 com os aglomerados individuais de plaquetas de cristal planas e áreas lisas intermediárias é substituída por uma superfície externa grossa homogênea sem nenhum aglomerado de cristais individuais. A superfície externa grossa homogênea é constituída de uma rede bloqueada de plaquetas de hidróxi apatita desenvolvidas epitaticamente. Os tamanhos individuais das plaquetas são diminuídos ao aumentar o teor de etanol na solução de transformação tal como observado pela análise de SEM, diminuindo desse modo a rudeza ou a aspereza da superfície externa.

[0125] A Figura 3A representa uma imagem de SEM de umaseção transversal do protótipo 5 (40% de etanol, grânulo de 1 a 2 mm) a uma ampliação menor (x) de 1000. O canto inferior à direita mostra que a superfície externa do grânulo e do centro do grânulo fé localizada na direção do canto superior à esquerda.

[0126] A Figura 3B representa uma imagem SEM de uma seçãotransversal do protótipo 5 (40% de etanol, grânulo de 1 a 2 mm) em uma ampliação maior (14000 x) onde se pode ver claramente as plaquetas de cristal planas individuais que são os blocos de construção da superfície grossa. Não há nenhuma diferença entre a superfície externa grossa no centro do grânulo e a superfície externa grossa na superfície externa do grânulo.

Determinação da distribuição de tamanho de poros pela porosimetria com intrusão de mercúrio (MIP)

[0127] A distribuição de tamanho de poro dos grânulos foideterminada ao usar a porosimetria com intrusão de mercúrio (MIP). A MIP é uma técnica de caracterização padrão usada para determinar a distribuição de tamanho de poro de materiais porosos. A técnica é bem conhecida no estado da técnica e, por exemplo, é descrita em Gregg, S. J. and Sing, K. S. W., Adsorption, Surface Área and Porosity, 2a ed., Academic Press Inc. (1982), 173-190.

[0128] A Figura 6 representa diagramas de MIP dos protótipos 3, 5e 7 de materiais substitutos de osso de acordo com a invenção em comparação a α-TCP puro (produzido de acordo com o Exemplo 1 e o material de núcleo dos protótipos 3, 5 e 7). Todas as medições foram feitos com os grânulos de 1 a 2 mm.

[0129] Pode ser observado que a amostra de α-TCP puro não tem nenhum poro na faixa de 0,03 a 2 μm por causa de sua superfície lisa. Todos os materiais substitutos de osso de acordo com a invenção contêm poros na faixa de 0,03 a 2 μm devido à natureza porosa da superfície externa grossa homogênea que é constituída de uma rede bloqueada de plaquetas de hidróxi apatita desenvolvidas epitaticamente. O volume de poro da superfície externa grossa, que corresponde à área sob a curva de MIP na faixa de 0,03 a 2 μm, depende dos tamanhos individuais das plaquetas da rede bloqueada. Quanto maiores as plaquetas individuais, maior o volume de poro incluso da rede bloqueada. Desse modo, o volume de poro incluso da rede bloqueada pode ser diretamente correlacionado à aspereza da superfície. Quanto maior o volume de poro na faixa de 0,03 a 2 μm no diagrama de MIP, maior a aspereza da superfície. O protótipo 3 tem um volume de poro maior (área sob a curva) na faixa de 0,03 a 2 μm dos protótipos mostrados, seguido pelos protótipos 5 e 7. É confirmado pela análise de SEM nas Figuras 2A a 2E que a aspereza dos protótipos diminui do protótipo 3 aos protótipos 5 e 7.

2) Preparação de discos não porosos de material substituto de osso

[0130] Os grânulos com tamanhos de 1 a 2 mm de α-TCP de fasepura produzidos tal como descrito no Exemplo 1 acima foram moídos com um moinho planetário durante 20 horas a 150 rpm para obter um pó fino. O pó fino foi carregado em um molde de prensagem e comprimido com uma prensa manual com uma carga de uma tonelada. O corpo verde foi removido do molde e transferido a um forno de alta temperatura. O forno foi aquecido até 1450°C ao usar uma taxa de aquecimento de 250°C por hora. Esta temperatura foi mantida por 24 horas e o forno foi a seguir resfriado até 800°C com uma taxa de resfriamento de 500°C por hora e em seguida resfriado até a temperatura ambiente com uma taxa de resfriamento de 150°C por hora. O material não poroso sinterizado a granel (α-Ca3(PO4)2 de fase pura)) foi removido do forno. O controle da pureza de fase foi executado ao usar a análise com difração de raios X em pó e as características de superfície foram analisadas ao usar a análise de SEM.

[0131] A transformação de fase e o revestimento dos discospreparados foram executados tal como descrito acima sob 1), com a única diferença que a razão de peso entre o α-TCP e a solução de transformação era de 1 para 3,5.

[0132] O protótipo 3a (20% de etanol) e 6a (50% de etanol) demateriais substitutos de osso de acordo com a invenção foram desse modo preparados.

[0133] A morfologia de superfície após o processo detransformação fase e revestimento foi observada ao usar a análise de SEM. Os parâmetros correspondentes da aspereza foram determinados ao usar a microscopia de força atômica AFM.

[0134] As imagens de SEM na Figura 4 confirmam que amorfologia da superfície externa grossa homogênea dos discos não porosos é idêntica àquela da superfície externa grossa dos grânulos produzidos com o teor correspondente de etanol do parágrafo 1 do Exemplo 2 (protótipos 3 e 3a e protótipos 6 e 6a).

Microscopia de Força Atômica (AFM)

[0135] As medições de superfície em nanoescala foram avaliadasao usar a microscopia de força atômica (TT-AFM, AFM Workshop) no modo de esvaziamento por punção. As análises de AFM foram realizadas sob a atmosfera ambiente ao usar discos cilíndricos não porosos com um diâmetro de 11 mm e uma altura de 1 mm. Uma frequência de ressonância de 190 kHz e um raio da ponta de até 10 nm foram usados. Cada análise de AFM foi executada em uma área de 50 μm x 50 μm e três amostras de cada grupo foram submetidas à varredura. Os dados originais foram nivelados para remover a inclinação com a aplicação de uma correção numérica, e os valores médios da aspereza do quadrado médio da raiz (Rq) e da altura máxima média do perfil (Rz) foram determinados ao usar software Gwyddion.

[0136] Uma caracterização de superfície similar da superfície édescrita, por exemplo, na Patente US-2013-0045360-A1.

[0137] A Figura 4 representa imagens de AFM dos protótipos 3a(20% de etanol, lado esquerdo) e 6a (50% de etanol, lado direito) dos discos não porosos preparados de acordo com a invenção. Os valores da aspereza derivados de AFM para os protótipos 3a e 6a podem ser encontrados na Tabela 1 a seguir.Tabela 1Valores da aspereza derivados de AFM para os protótipos 3a e 6a

[0138] Tal como visto na Tabela 1, o valor médio da aspereza doquadrado médio da raiz (Rq) diminuída de 237 nm a 130 nm e a altura máxima média do perfil (Rz) diminuiu de 1391 nm para 630 nm ao aumentar o teor de etanol de 20% para 50%.

Exemplo 3 Teste in vitro da diferenciação osteogênica de células tronco mesenquimais humanas fetais (hMSCs).

[0139] Para avaliar se os protótipos do material substituto de ossopreparados nos Exemplos 1 e 2 suportam a diferenciação osteogênica, cerca de 200000 hMSCs isoladas de um fêmur fetal humano depois de 22 semanas de gestação (comercialmente disponível junto à ScienCell: Cat # 7500, lote # 6890) foram semeadas em grânulos de 320 mg desses protótipos de materiais de substituição do osso e cultivadas por três semanas. Nos primeiros sete dias da cultura, ummeio de expansão de hMSCs comercialmente disponível (meio MSCM, Cat # 7501, ScienCell) foi usado para suportar idealmente a proliferação das células. Para os 14 dias seguintes, o meio foi trocado por DMEM complementado com 10% de FBS e Penicilina/Estreptomicina. Nenhum agente osteogênico adicional foi adicionado ao meio de cultura de células. Depois de três semanas de cultivo das hMSCs, o mRNA total foi isolado, transcrito no DNA e a PCR Quantitativa em Tempo Real foi executada. A expressão do gene foi calculada depois que o método de ΔΔCT (vide Livak K. J. and Schmittgen T. D., Analyisis of gene expression data using real time PCR quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method, 2001, Methods 25, páginas 402-408) ao usar GAPDH como um gene doméstico. A expressão dos marcadores de diferenciação osteogênica osteopontina (OPN) e osteocalcina (OCN) foi medida para todos os protótipos do material substituto de osso na forma granular (1 a 2 mm) preparada nos Exemplos 1 e 2.

[0140] Essas medições mostraram uma expressãosignificativamente mais elevada dos marcadores de diferenciação osteogênica OPN e OCN para os protótipos do material substituto de osso de acordo com a invenção do Exemplo 2 do que para os protótipos do material substituto de osso da técnica anterior do Exemplo 1 (vide as Figuras 5A e 5B).

[0141] Com base nesses resultados in vitro, uma respostaosteogênica realçada para os protótipos do material substituto de osso de acordo com a presente invenção deve ser esperada in vivo.

Exemplo 4 Comparação do tamanho e da morfologia de cristal para os nanocristais de HAP do material substituto de osso de CAP/HAP bifásico da invenção e o mineral de osso humano.

[0142] A análise de tamanho de cristal foi executada ao usar, talcomo na Patente EP-B1-2445543, um refino de dados de difração de raios X ao aplicar o método de Bragg em amostras do protótipo 3 e no mineral de osso humano natural.

[0143] Foi mostrado desse modo que o material substituto de ossode CAP/HAP bifásico da invenção e o mineral do osso humano têm a mesma morfologia e o mesmo tamanho de cristal.Vide a Tabela 2 a seguir.Tabela 2Comparação do tamanho e da morfologia de cristais de HAP para o substituto do osso de CAP/HAP da invenção e o mineral de osso humano

Claims

1. Material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico, caracterizado pelo fato de que compreende um núcleo de CAP sinterizado e uma camada desenvolvida epitaticamente fechada de HAP nanocristalina depositada sobre a superfície externa do núcleo de CAP sinterizado, por meio do que os nanocristais desenvolvidos epitaticamente têm o mesmo tamanho e morfologia que o mineral do osso humano, em que a camada desenvolvida epitaticamente fechada de HAP nanocristalina depositada sobre a superfície externa do núcleo de CAP sinterizado tem uma superfície externa grossa homogênea que compreende plaquetas de cristal planas.

2. Material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a superfície grossa compreende plaquetas de hidróxi apatita nanocristalinas desenvolvidas epitaticamente que formam uma rede bloqueada de plaquetas com tamanhos de 0,2 a 20 μm tal como determinado por Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM).

3. Material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a superfície grossa compreende plaquetas de hidróxi apatita nanocristalinas desenvolvidas epitaticamente que formam uma rede bloqueada de plaquetas com tamanhos de 0,5 a 5 μm tal como determinado por Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM).

4. Material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a superfície externa grossa homogênea compreende plaquetas de hidróxi apatita desenvolvidas epitaticamente que formam uma rede bloqueada que contém poros entre 0,03 e 2 μm tal como determinado por Porosimetria com Intrusão de Mercúrio (MIP).

5. Material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a superfície externa grossa homogênea é definida através de Microscopia de Força Atômica (AFM) com uma aspereza do quadrado médio da raiz derivada de AFM Rq em uma faixa de 50 a 400 nm e uma altura máxima média do perfil Rz em uma faixa de 500 a 2000 nm.

6. Material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a superfície externa grossa homogênea é definida através de Microscopia de Força Atômica (AFM) com uma aspereza do quadrado médio da raiz derivada de AFM (Rq) em uma faixa de 110 a 150 nm e uma altura máxima média do perfil (Rz) em uma faixa de 550 a 750 nm.

7. Material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o núcleo de CAP sinterizado consiste essencialmente em α-TCP.

8. Material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a porcentagem de HAP é 1,5 a 30%, tal como medido por XRD.

9. Material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é um particulado ou um granulado.

10. Material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico, de acordo com acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é um corpo moldado.

11. Mástique, caracterizado pelo fato de que contém grânulos de um material substituto de osso de fosfato de cálcio/hidróxi apatita (CAP/HAP) bifásico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em uma matriz apropriada.

12. Processo de preparação do material substituto de osso de CAP/HAP, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) preparação de um material de núcleo de CAP sinterizado, b) imersão do material de núcleo de CAP sinterizado em uma solução tampão que contém de 10 a 90% de um álcool alifático de cadeia curta a uma temperatura entre 10°C e 50°C para iniciar o processo de transformação de CAP em HAP por meio do qual uma camada desenvolvida epitaticamente fechada de hidróxi apatita nanocristalina será formada na superfície do material de núcleo de CAP sinterizado, por meio do que os nanocristais desenvolvidos epitaticamente têm o mesmo tamanho e morfologia que o mineral do osso humano, em que a camada desenvolvida epitaticamente fechada de HAP nanocristalina formada sobre a superfície do material de núcleo de CAP sinterizado tem uma superfície externa grossa homogênea que compreende plaquetas de cristal planas, c) interrupção da transformação mediante a separação do material sólido da solução aquosa em um momento no qual um revestimento fechado de pelo menos uma camada nanocristalina de HAP estiver presente, mas antes que o processo de transformação seja encerrado por completo, e d) opcionalmente, esterilização do material separado proveniente da etapa c).

13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o álcool alifático de cadeia curta é o etanol.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a solução tampão da etapa b) contém de 30 a 50% de um álcool alifático de cadeia curta.

15. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que a etapa b) é realizada a uma temperatura de 35 a 40°C em uma solução tampão de fosfato a um pH de 7,0 a 8,0 contendo de 20 a 60% de um álcool alifático de cadeia curta.