JP2021506401A

JP2021506401A - 骨代替材料

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Publication number: JP2021506401A
Application number: JP2020532744A
Authority: JP
Inventors: ツィールマン，クラウディオ; バフラー，ミヒャエル
Original assignee: ガイストリッヒファーマアーゲー
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2021-02-22
Anticipated expiration: 2038-12-13
Also published as: CN111465418A; IL275203A; HUE050062T2; PT3544643T; WO2019115704A1; US11351287B2; US10646615B2; EP3544643B1; SG11202004726YA; PL3544643T3; ES2803976T3; AU2018382557B2; US20190184059A1; RU2020118930A; JP7249376B2; KR102233325B1; DK3544643T3; JP6880330B2; MX2020005846A; CA3083852A1

Abstract

本発明は、−骨形成反応の増強を示す、二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料であって、焼結ＣＡＰコアと、焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの閉じたエピタキシャル成長層とを含み、焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの閉じたエピタキシャル成長層が、平らな結晶小板を含む均質な粗い外表面を有する、骨代替材料、並びに−その調製方法であって、以下の工程：ａ）焼結ＣＡＰコア材料を調製すること、ｂ）焼結ＣＡＰコア材料を１０℃と０℃の間の温度で〜９０％の短鎖脂肪族アルコールを含有する緩衝液に浸漬して、ＣＡＰからＨＡＰへの変換プロセスを開始し、それによって焼結ＣＡＰコア材料表面上にナノ結晶ヒドロキシアパタイトの閉じたエピタキシャル成長層（ここで、エピタキシャル成長ナノ結晶は、ヒト骨塩と同じサイズと形態を有する）であって、平らな結晶小板を含む均質な粗い外表面を有する、焼結ＣＡＰコア材料表面上に形成されるナノ結晶ＨＡＰの閉じたエピタキシャル成長層が形成されること、ｃ）ＨＡＰの少なくとも１つのナノ結晶層の閉じたコーティングが存在するが、変換プロセスが完全に終わる前の時点で、水溶液から固体材料を分離することによって変換を停止させること、及びｄ）場合により、工程ｃ）からの分離された材料を滅菌することを含む方法に関する。

Description

本発明は、均質な粗い外表面を有するリン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）に基づく二層構造を持つ新しい二相性骨代替材料、その材料の製造方法、並びにヒト又は動物の欠損部位における骨形成、骨再生、骨修復及び／又は骨置換を支持するためのインプラント又はプロテーゼとしてのこれらの使用に関する。

骨構造の欠損は、外傷、疾患、及び手術のような様々な状況で発生するが、種々の外科分野における骨欠損を効果的に修復する必要が依然として存在する。

骨欠損部位の治癒を刺激するために、数多くの天然及び合成の材料及び組成物が使用されてきた。歯周及び顎顔面骨欠損で骨成長を促進する、周知の天然の骨伝導性の骨代替材料は、Geistlich Pharma AGから市販されているGeistlich Bio-Oss（登録商標）である。その材料は、米国特許第5,167,961号に記載されている方法によって自然骨から製造され、自然骨の小柱構造及びナノ結晶構造の保存を可能にして、吸収されないか又は非常にゆっくりと吸収される優れた骨伝導性マトリックスが得られる。

リン酸三カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＴＣＰ／ＨＡＰ）システム及び骨代替材料としてのこれらの使用は、例えば、US-6,338,752に記載されており、リン酸アンモニウムとＨＡＰとの粉末混合物を１２００〜１５００℃で加熱して、α−ＴＣＰ／ＨＡＰの二相セメントの調製方法を開示している。

欧州特許EP-285826は、インプラント用の金属及び非金属体上のＨＡＰの層を製造する方法であって、α−ＴＣＰの層を適用し、８０〜１００℃でｐＨ２〜７の水との反応によりα−ＴＣＰ層をＨＡＰに完全に変換することによる方法を記載している。得られた生成物は、ＨＡＰの層で覆われた金属又は非金属体である。

WO 97/41273は、特にヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）又は他のリン酸カルシウム（ＣＡＰ）などの基材を炭酸ヒドロキシアパタイト、即ち、リン酸及び／又はヒドロキシルイオンが重炭酸イオンによって部分的に置換されているヒドロキシアパタイトのコーティングでコーティングする方法であって、（ａ）５０℃未満の温度でカルシウムイオン、リン酸イオン及び重炭酸イオンを含有するｐＨ６．８〜８．０の溶液に基材を浸漬し、（ｂ）基材と接触している溶液の部分をｐＨが８を超えるまで５０〜８０℃の温度まで加熱して、（ｃ）基材と工程（ｂ）で得られたアルカリ溶液との接触を維持して、炭酸ヒドロキシアパタイトコーティングを形成し、そして（ｄ）基材を溶液から取り出し、コーティングを乾燥させることを含む方法を記載している。重炭酸イオンは、ヒドロキシアパタイト結晶成長の阻害剤として作用するため、欠損を含み、かつ寸法がかなり小さい、即ち、長さが１０〜４０nm、幅が３〜１０nmの非化学量論的結晶が得られることが開示されている（７ページ、１〜７行目を参照のこと）。

リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）システム、特にＴＣＰ／ＨＡＰシステムの成分は、その熱力学的安定性が異なる。この違いにより、ＣＡＰ／ＨＡＰシステムが哺乳動物、特にヒト患者に埋め込まれると、体液中のＴＣＰ及びその他のリン酸カルシウムの溶解度は、ＨＡＰの溶解度よりも高い。リン酸カルシウムとＨＡＰの間の溶解度の違いにより、ＣＡＰ／ＨＡＰシステムの不規則な焼結構造が崩壊するが、これは、溶解性の高い方の化合物ＣＡＰ（例えば、ＴＣＰ）がＨＡＰよりも速く除去されるためである。高温で生成したＣＡＰとＨＡＰの間の焼結相互接合は、生理環境でのデバイスのより高い溶解度にも大きく貢献しよう。２つの異なるタイプの反応が、このようなセラミックの加速したインビボ分解を支配する：化学溶解及び細胞による生物学的吸収。どちらのプロセスもセラミック材料の溶解を引き起こし、更にはカルシウムイオンの局所的な過飽和を引き起こして、吸着されるカルシウムイオンよりも多くのカルシウムイオンが放出される。カルシウムイオンの自然の平衡は、細胞外マトリックスにも、インプラント周囲の組織にも最早存在しない。カルシウムイオンの過飽和に関する自然のカルシウム平衡の局所的な撹乱は、破骨細胞の活性を上昇させ、ひいてはセラミック材料の制御されない吸収を加速し、特に大量の合成骨代替材料を使用する場合に有害な炎症反応のリスクにつながる。

骨代替材料のGeistlich Bio-Ossをヒト患者に埋め込むと、自然のカルシウム平衡は実質的に影響を受けず、材料の表面上及びその局所環境内のカルシウムイオンの濃度はほぼ一定のままである。よって材料の生物学的吸収は起こらないか、又は有害な炎症反応のリスクを伴わない非常に遅い速度で進行する。

EP-B1-2445543は、非常に有利なリン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料を開示しているが、これは、骨代替材料のGeistlich Bio-Ossと同様に、体内に設置後、材料の表面上及びその局所環境内のカルシウムイオンの濃度をほぼ一定に維持することができ、よって破骨細胞活性の上昇につながらない。

実際、最適な骨再生に必要な自然のカルシウム平衡は乱されたり破壊されたりしない。更に、自然のカルシウム濃度の平衡は、再生プロセスが完了するまで、骨代替材料によって永続的に支持される。これらの条件が満たされると、破骨細胞活性が上昇しないため、有害な炎症反応のリスクがない。

EP-B1-2445543の発明は、焼結ＣＡＰコアと、焼結ＣＡＰコアの上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの少なくとも１つの均質で閉じたエピタキシャル成長層（ここで、エピタキシャル成長ナノ結晶は、ヒト骨塩と同じサイズと形態、即ち、長さ３０〜４６nm及び幅１４〜２２nmを有する）とを含む、二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料に関する。

焼結ＣＡＰコアは、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、特にα−ＴＣＰ（α−Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）又はβ−ＴＣＰ（β−Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）、及び／又はリン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）Ｃａ_４（ＰＯ_４）_２Ｏを含んでもよい。

頻繁に使用される実施態様では、焼結ＣＡＰコアは、本質的にＴＣＰからなり、α−ＴＣＰが好ましい。

ナノ結晶ＨＡＰのエピタキシャル成長層は、構造的及び化学的に天然のヒト骨塩とほぼ同一である。

ナノ結晶ＨＡＰのエピタキシャル成長層は一般に、少なくとも１５〜５０nm、好ましくは少なくとも２０〜４０nm、更に好ましくは少なくとも２５〜３５nmの厚さを有する。その最小厚さは、エピタキシャル配向のＨＡＰナノ結晶の１つの層に対応する。

ナノ結晶ＨＡＰのエピタキシャル成長層は、エピタキシャル配向のＨＡＰナノ結晶の単層又は多層を含むことができる。エピタキシャル配向のＨＡＰナノ結晶のそのような層の数に関連する、ナノ結晶ＨＡＰのエピタキシャル成長層の厚さは、身体の負荷が異なる部位におけるインプラント又はプロテーゼとしての骨代替材料の意図される用途により選択されよう。その発明の骨代替材料は確かに、焼結ＣＡＰコアをサイズと形態がヒト骨塩に類似したヒドロキシアパタイトへと徐々に変換する生体様システムとしてインビボで機能するように設計されており、その変換速度は、焼結ＣＡＰコアによるカルシウム放出の速度に依存し、そして大部分はナノ結晶ＨＡＰのエピタキシャル成長層の厚さによって制御される。

ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料の特性は、大部分は結晶ＨＡＰのエピタキシャル成長層の厚さによって制御される。「特性」という用語は、ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替品が一定濃度のカルシウムイオンをインビトロ及びインビボで局所環境に放出する能力を含む。

ナノ結晶ＨＡＰのエピタキシャル成長層の厚さは、焼結ＣＡＰコア材料対ＨＡＰの比に関連し、前記比は、一般に５：９５〜９５：５の間、好ましくは１０：９０〜９０：１０である。

ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料は、粒子状又は顆粒状であってよく、この粒子又は顆粒は所望のサイズと形状を有する。一般に、粒子又は顆粒は、ほぼ球形であり、そして直径２５０〜５０００μmである。

ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料はまた、成形体、例えば、ネジ、釘、ピン、又は特に、股関節、鎖骨、肋骨、下顎骨若しくは頭蓋骨のような、骨性身体部分の輪郭を有する構造であってもよい。そのようなネジ、釘、又はピンは、例えば、膝又は肘の骨に靭帯を固定するための整形外科再建手術において使用されてもよい。骨性身体部分の輪郭を有するそのような構造は、消失又は欠損の骨又は骨部分を置換するためのプロテーゼとして整形外科手術において使用されてもよい。

EP-B1-2445543のそのＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料は、以下の工程：
ａ）焼結ＣＡＰコア材料を調製すること、
ｂ）焼結ＣＡＰコア材料を１０℃と５０℃の間の温度で水溶液に浸漬して、ＣＡＰからＨＡＰへの変換プロセスを開始し、それによって焼結ＣＡＰコア材料表面上にナノ結晶ヒドロキシアパタイトの均質で閉じたエピタキシャル成長層（ここで、エピタキシャル成長ナノ結晶は、ヒト骨塩と同じサイズと形態を有する）が形成されること、
ｃ）ＨＡＰの少なくとも１つのナノ結晶層の均質で閉じたコーティングが存在するが、変換プロセスが完全に終わる前の時点で、水溶液から固体材料を分離することによって変換を停止させること、
ｄ）場合により、工程ｃ）からの分離された材料を滅菌すること
を含むプロセスによって得られることが教示されている。

焼結ＣＡＰコア材料の調製は、最初にリン酸水素カルシウム（ＣａＨＰＯ_４）、炭酸カルシウム及び／又は水酸化カルシウムの粉末を混合し、次に適切な温度範囲内で混合物をか焼及び焼結し、これによってバルク焼結ＣＡＰコア材料が与えられることを含む、当技術分野において公知の方法によって実施され得る（例えば、Mathew M. et al., 1977, Acta. Cryst. B33: 1325; Dickens B. et al., 1974, J. Solid State Chemistry 10, 232; and Durucan C. et al., 2002, J. Mat. Sci., 37:963を参照のこと）。

よってバルク焼結ＴＣＰコア材料を、リン酸水素カルシウム（ＣａＨＰＯ_４）、炭酸カルシウム及び／又は水酸化カルシウムの粉末を化学量論比で混合し、混合物を１２００〜１４５０℃の範囲の温度、好ましくは１４００℃でか焼及び焼結することによって得てもよい。

バルク焼結ＴＴＣＰコア材料もまた、上記プロセスによって得てもよい。

そのような方法によって調製されたバルク焼結ＣＡＰ材料は、２〜８０体積％の空隙率及び細孔の幅広い分布を有する多孔質であってよい。空隙率パラメーターは、ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料の意図される用途に応じて選択されよう。

工程ｂ）に使用される焼結ＣＡＰコア材料は、
−上記のとおり調製されたバルク焼結ＣＡＰコア材料であるか、
−上記のとおり調製されたバルク焼結ＣＡＰコア材料から、破砕、磨砕及び／又は粉砕、並びに篩い分けのような従来の方法を使用して得られた、焼結ＣＡＰコア材料の粒子又は顆粒であるか、あるいは
−所望の形状とサイズ、例えば、ネジ、釘、ピン、又は骨性身体部分の輪郭を有する構造を有する焼結ＣＡＰコア材料のプリフォームであってもよい。

このような任意の所望の形状とサイズのプリフォームを、ＣＮＣフライス加工又は３Ｄ印刷のような周知のプロトタイピング技術を使用して、上記のとおり調製されたバルク焼結コア材料から得てもよい（例えば、Bartolo P. et al., 2008, Bio-Materials and Prototyping Applications in Medicine, Springer Science New York, ISBN 978-0-387-47682-7; Landers R. et al., 2002, Biomaterials 23(23), 4437; Yeong W.-Y. et al., 2004, Trends in Biotechnology, 22 (12), 643; and Seitz H. et al., 2005, Biomed. Mater. Res. 74B (2), 782を参照のこと）。

工程ｂ）の水溶液は、純水、人工体液又は緩衝液であると教示されている。重要なのは、工程ｂ）の浸漬溶液のｐＨ値がほぼ中性であり、変換プロセス全体を通じて、好ましくは５．５〜９．０のｐＨ範囲内で安定を保つことである。

「人工体液」という用語は、体液を模倣する任意の溶液のことをいう。好ましくは、人工体液は、血漿のそれと同様のイオン濃度を有する。

緩衝液は、上記のｐＨ範囲の任意の緩衝液であり得るが、好ましくは、カルシウム、マグネシウム及び／又はナトリウムを含むか含まないリン酸緩衝液である。

実施例で使用される緩衝液（実施例４及び５を参照のこと）は、水性リン酸緩衝液である。

工程ｂ）の温度範囲は、一般に１０℃〜５０℃、好ましくは２５〜４５℃、更に好ましくは３５℃〜４０℃である。

浸漬工程ｂ）は、第１段階でＣＡＰコア材料の一次相転移を誘導し、したがってＨＡＰナノ結晶前駆体の核形成を誘導する。第２段階中に、第１段階から得られたＨＡＰ前駆体は成長して、閉じた（即ち、完全にコーティングしている）エピタキシャルナノ結晶複合層を確立する。最初のＨＡＰナノ結晶層は、均質で閉じており、かつ焼結ＣＡＰコア材料にエピタキシャルに接合されている必要がある。

第３段階中に、新しく形成された二重複合層内で一次相転移が進行して、焼結ＣＡＰコア材料（ＴＣＰ又はＴＴＣＰ）をナノ結晶ＨＡＰに更に変換し得る。相転移のこの第３工程中に、焼結ＣＡＰコア材料の一部がナノ結晶ＨＡＰに変換されるまで、遅延拡散制御プロセスによって制御可能な時間、カルシウムイオンが放出されよう。ＨＡＰ層の厚さ、したがってカルシウム放出の速度は、変換時間の変動によって制御され得る。

適切な厚さのエピタキシャル成長ナノ結晶ＨＡＰ層は、インビトロで調製されるが、ここでＨＡＰへのＣＡＰの変換は、完了する前に停止させる。

ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料がインビボに設置されると直ぐに、ＨＡＰへのＣＡＰの変換プロセスは、体液との接触により再活性化され、骨代替材料は、ヒト骨塩にサイズと形態が類似する新しいヒドロキシアパタイトを形成する生体様システムとして機能しよう。インビボ相変態プロセス中に、輸送されたカルシウムイオンは、骨再生プロセスにとって重要かつ有益である局所カルシウム平衡を支持する局所環境へと放出されよう。

身体の負荷が異なる部位では骨欠損の再生時間が異なるため、カルシウム放出の速度を制御できることが重要である。これは、ヒドロキシアパタイトのエピタキシャル成長層の厚さを変えることによって達成され得る。

したがって工程ｃ）は非常に重要な工程である。工程ｂ）の水溶液における曝露時間は、所望のＨＡＰ層の厚さに基づく。エピタキシャル配向のナノ結晶ＨＡＰの少なくとも１つの層が必要である。ＣＡＰからＨＡＰへの変換が完了していないことは不可欠である。

所望の厚さによる適切な曝露時間は、リン酸カルシウム、セメント及びコンクリート化学の分野の当業者に周知の幾つかの熱力学的微分方程式を使用することによって計算され得る。

例えば：Pommersheim, J.C.; Clifton, J.R. (1979) Cem. Conc. Res.; 9:765; Pommersheim, J.C.; Clifton, J.R. (1982) Cem. Conc. Res.; 12:765; and Schlussler, K.H. Mcedlov-Petrosjan, O.P.; (1990): Der Baustoff Beton, VEB Verlag Bauwesen, Berlinを参照のこと。

上記の微分方程式の解をＣＡＰ／ＨＡＰシステムに代入すると、ＣＡＰのＨＡＰへの相転移及び層の厚さを予測できるため、ＨＡＰのエピタキシャル層を安定で再現性あるやり方で調製することができる。

工程ｃ）の最後の水溶液からの固体材料の分離は、当技術分野で周知の技術を使用して、濾過、洗浄及び乾燥によって通常実施される。

EP-B1-2445543の実施例（即ち、実施例４［００５７］及び実施例５［００５８］）において、洗浄は、分離した顆粒を精製水で３回洗浄することによって実施され、緩衝液から残留物を取り出す。

オプションの滅菌工程ｄ）は、ガンマ線照射又はＸ線照射のような当技術分野で周知の手法によって実施され得る。

EP-B1-2445543の実施例４及び５に教示されているとおり、工程ｂ）の水溶液用の水性リン酸緩衝剤と精製水とを使用して、工程ｃ）の最後に分離した顆粒を３回洗浄すると、焼結ＣＡＰコアと、焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの閉じたエピタキシャル成長層（ここで、エピタキシャル成長ナノ結晶は、ヒト骨塩と同じサイズと形態、即ち、長さ３０〜４６nm及び幅１４〜２２nmを有する）とを含む、二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料が得られるが、ここで、焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの閉じたエピタキシャル成長層は、エピタキシャル成長ＨＡＰナノ結晶からなる平らな結晶小板の個々の（分離した）クラスターと、平らな結晶小板の個々のクラスターの間の滑らかな領域とを含む、不均質な外表面を有しており、平らな結晶小板の個々のクラスターの間の滑らかな領域が占める外表面の％は、所与の変換条件での変換時間に依存する。

図１ａ［滑らかな領域が、ＳＥＭで測定されるとき外表面全体の約７０％に相当する、３０分の変換時間を有する、プロトタイプ１（１〜２mm顆粒）のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）写真を表す］；及び図１ｂ［滑らかな領域が、ＳＥＭで測定されるとき外表面全体の約５０％に相当する、４０分の変換時間を有する、プロトタイプ２（１〜２mm顆粒）のＳＥＭ写真を表す］を参照のこと。

WO 2015/009154は、骨誘導能が改善された骨伝導性材料を製造する方法を開示しているが、この方法は、粒子からなる表面トポグラフィーを有する焼結二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）材料を、２〜４barの圧力下で１２５℃以上の温度でｐＨを制御することなく、出発物質の表面上のリン酸カルシウム粒子を直径１０〜１５００nmのリン酸カルシウム針状物に変えるのに十分な時間、水熱処理に付すことを含む。少なくとも１２５℃の温度及び少なくとも２barの圧力は、ＨＡＰナノ結晶のエピタキシャル成長を可能にする、EP-B1-2445543で使用されている（人体生理学に近い）条件（温度３５〜４０℃、ｐＨ５．５〜９．０、常圧）からは遠い。これらの針状物はエピタキシャルに成長していないが、コア材料ベースに付着又は堆積し、そして部分的に（通常は４０〜９０％）後者をコーティングするだけであるが、それによってその比表面積とタンパク質保持力を増加させ、その骨誘導能を高める。

EP-B1-2445543の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料の調製において、１０〜９０％、好ましくは２０〜６０％のメタノール、エタノール、プロパノール又はブタノールを含むがこれらに限定されない短鎖脂肪族アルコールを、工程ｂ）の水性リン酸緩衝液に加えることにより、焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの閉じたエピタキシャル成長層の不均質な外表面である、二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料（平らな結晶小板の個々のクラスターとその間の滑らかな領域とを含む）は、平らな結晶小板の個々の結晶クラスターを伴わない、平らな結晶小板を含む均質な粗い外表面で置き換えられることが今や見い出された。その均質な粗い外表面は一般に、使用される脂肪族アルコールの量に応じて、ＳＥＭで測定されるとき、０．２〜２０μm、好ましくは０．５〜５μmの個々の小板サイズを持つ小板の連結ネットワークを形成するエピタキシャル成長ナノ結晶のヒドロキシアパタイト小板を含む。

ヒト胎児間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の骨形成分化のインビトロ試験で示されているとおり、インビボ骨形成反応は、平らな結晶小板を含むその均質な粗い外表面を有する二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料の方が、EP-B1-2445543により教示された、平らな結晶小板の個々のクラスターとその間の滑らかな領域とを含む不均質な外表面を有する、二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料よりも強い可能性が高い。

発明の要約
よって本発明は、焼結ＣＡＰコアと、焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの閉じたエピタキシャル成長層（ここで、エピタキシャル成長ナノ結晶は、ヒト骨塩と同じサイズと形態を有する）とを含む、二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料に関するが、ここで、焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの閉じたエピタキシャル成長層は、平らな結晶小板を含む均質な粗い外表面を有する。

その二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料は、ヒト胎児間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の骨形成分化の増加を示しており、そしてこれは、インビボ骨形成反応の増強のはっきりした兆候である。

「焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの閉じたエピタキシャル成長層」という用語は、ナノ結晶ＨＡＰのエピタキシャル成長層が、焼結ＣＡＰコアの外表面全体を被覆していることを意味する。

「平らな結晶小板を含む均質な粗い外表面」という用語は、巨視的には、平らな結晶小板に起因する外表面の粗さが、平らな結晶小板の個々の結晶クラスターを伴わずにＣＡＰコアの表面上に統計的に均等に分布していることを意味する。種々の程度の粗さの均質な粗い外表面を持つ、本発明の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料のプロトタイプ３〜７のＳＥＭ写真を表す、図２を参照のこと。

「平らな結晶小板」という用語は、３つの垂直方向に関して高さ（厚さ）が幅及び長さよりもかなり小さい結晶集合を意味する。このような平らな結晶小板は、図３ｂにおいてはっきりと見える。

一般に、均質な粗い外表面は、ＳＥＭで測定されるとき０．２〜２０μmのサイズ（幅と長さ）を持つ小板の連結ネットワークを形成する、エピタキシャル成長ナノ結晶ヒドロキシアパタイト小板を含む。小板のサイズが大きいほど、外表面の粗さが高まる。

好ましくは、均質な粗い外表面は、ＳＥＭで測定されるとき０．５〜５μmのサイズを持つ小板の連結ネットワークを形成する、エピタキシャル成長ナノ結晶ヒドロキシアパタイト小板を含む。

通常は、その均質な粗い外表面は、水銀圧入ポロシメトリー（ＭＩＰ）で測定されるとき０．０３〜２μmの細孔を含む連結ネットワークを形成する、エピタキシャル成長ヒドロキシアパタイト小板を含む。０．０３〜２μmの細孔容積が大きいほど、外表面の粗さが高まる。

一般に、その均質な粗い外表面は、ＡＦＭ（原子間力顕微鏡法（Atomic Force Microscopy））で得た５０〜４００nmの範囲の二乗平均平方根粗度（Ｒ_ｑ）及び５００〜２０００nmの範囲の輪郭の平均最大高さ（Ｒ_ｚ）を用い、ＡＦＭにより特徴付けられ得る。

好ましくは、均質な粗い外表面は、ＡＦＭで得た１１０〜１５０nmの範囲の二乗平均平方根粗度（Ｒ_ｑ）及び５５０〜７５０nmの範囲の輪郭の平均最大高さ（Ｒ_ｚ）により特徴付けられ得る。

一般に、二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料中のＨＡＰの割合は、ＸＲＤにより測定されるとき１〜９０％である。

好ましくは、その割合は、ＸＲＤにより測定されるとき１．５〜３０％、更に好ましくは２〜１５％である。

焼結ＣＡＰコアは、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、特にα−ＴＣＰ（α−Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）又はβ−ＴＣＰ（β−Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）、及び／又はリン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）Ｃａ_４（ＰＯ_４）_２Ｏを含む。

ナノ結晶ＨＡＰのエピタキシャル成長層は、構造的に天然のヒト骨塩とほぼ同一である。

ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料は、粒子状又は顆粒状であってよく、この粒子又は顆粒は所望のサイズ及び形状を有する。一般に、粒子又は顆粒は、２５０〜５０００μm、好ましくは１０００〜２０００μmのサイズを有する。

ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料はまた、成形体、例えば、ネジ、釘、ピン、又は特に、股関節、鎖骨、肋骨、下顎骨若しくは頭蓋骨のような、骨性身体部分の輪郭を有する構造であってもよい。そのようなネジ、釘又はピンは、例えば、膝又は肘の骨に靭帯を固定するための整形外科再建手術において使用されてもよい。骨性身体部分の輪郭を有するそのような構造は、消失又は欠損の骨又は骨部分を置換するためのプロテーゼとして整形外科手術において使用されてもよい。

本発明はまた、一般に天然又は合成ポリマーを含む、適切なマトリックス中に上記のＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替品の粒子又は顆粒を含むパテに関する。一般に、粒子又は顆粒は、２５０〜５０００μm、好ましくは１０００〜２０００μmのサイズを有する。

本発明は更に、上記のＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料の調製方法であって、以下の工程：
ａ）焼結ＣＡＰコア材料を調製すること、
ｂ）焼結ＣＡＰコア材料を１０℃と５０℃の間の温度で１０〜９０％の短鎖脂肪族アルコールを含有する緩衝液に浸漬して、ＣＡＰからＨＡＰへの変換プロセスを開始し、それによって焼結ＣＡＰコア材料表面上にナノ結晶ヒドロキシアパタイトの閉じたエピタキシャル成長層（ここで、エピタキシャル成長ナノ結晶は、ヒト骨塩と同じサイズと形態を有する）であって、平らな結晶小板を含む均質な外表面を有する、焼結ＣＡＰコア材料表面上に形成されるナノ結晶ＨＡＰの閉じたエピタキシャル成長層が形成されること、
ｃ）ＨＡＰの少なくとも１つのナノ結晶層の閉じたコーティングが存在するが、変換プロセスが完全に終わる前の時点で、水溶液から固体材料を分離することによって変換を停止させること、及び
ｄ）場合により、工程ｃ）からの分離された材料を滅菌すること
を含む方法に関する。

適切な短鎖脂肪族アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール及びブタノールからなる群より選択され得る。

好ましくは短鎖脂肪族アルコールは、エタノールである。

好ましくは、工程ｂ）の緩衝液は、２０〜６０％、更に好ましくは３０〜５０％の短鎖脂肪族アルコールを含有する。

焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの閉じたエピタキシャル成長層の均質な粗い外表面の粗さのパラメーター、特に
−ＡＦＭパラメーター：ＡＦＭで得た二乗平均平方根粗度（Ｒ_ｑ）及び輪郭の平均最大高さ（Ｒ_ｚ）、
−ＳＥＭで測定されるエピタキシャル成長ナノ結晶ヒドロキシアパタイト小板のサイズ、並びに
−ＭＩＰで測定される０．０３〜２μmの細孔容積
は、便利には変換溶液の緩衝液中の短鎖脂肪族アルコールの割合を変えることにより調整され得る。

その割合が高いほど、ＡＦＭで得た二乗平均平方根粗度（Ｒ_ｑ）及び輪郭の平均最大高さ（Ｒ_ｚ）が低く、ＳＥＭで測定されるエピタキシャル成長ナノ結晶ヒドロキシアパタイト小板のサイズが小さく、そしてＭＩＰで測定される０．０３〜２μmの細孔容積が小さい。

１０〜９０％の短鎖脂肪族アルコールを含有する工程ｂ）の緩衝液は、水性緩衝液を種々の量の短鎖脂肪族アルコールと混合することによって得られる。水性緩衝液は、１０〜９０％の短鎖脂肪族アルコールを更に含有する工程ｂ）の浸漬溶液のｐＨ値が、ほぼ中性であり、そして変換プロセス全体を通じて、好ましくは５．５〜９．０、更に好ましくは７．０〜８．０のｐＨ範囲内で安定を保つように、選択される。

緩衝剤は、上記ｐＨ範囲内の任意の緩衝剤であってよいが、好ましくはカルシウム、マグネシウム及び／又はナトリウムを含むか又は含まないリン酸緩衝剤である。

適切な緩衝液は、例えば、７．３〜７．６のｐＨ値を持つリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４）の０．０５〜０．３M水溶液である。

工程ｂ）の温度範囲は一般に、１０℃と５０℃の間、好ましくは２５℃と４５℃の間、更に好ましくは３５℃と４０℃の間である。

好ましくは工程ｂ）は、３５〜４０℃の温度で、２０〜６０％の短鎖脂肪族アルコールを含有するｐＨ７．０〜８．０のリン酸緩衝液中で行われる。

よってバルク焼結ＴＣＰコア材料を、リン酸水素カルシウム（ＣａＨＰＯ_４）、炭酸カルシウム及び／又は水酸化カルシウムの粉末を化学量論比で混合し、混合物を１２００〜１４５０℃の範囲の温度、好ましくは約１４００℃でか焼及び焼結することによって得てもよい。

第３段階中に、新しく形成された二重複合層内で一次相転移が進行して、焼結ＣＡＰコア材料（ＴＣＰ又はＴＴＣＰ）をナノ結晶ＨＡＰに更に変換することができる。相転移のこの第３工程中に、焼結ＣＡＰコア材料の一部がナノ結晶ＨＡＰに変換されるまで、遅延拡散制御プロセスによって制御可能な時間、カルシウムイオンが放出されよう。ＨＡＰ層の厚さ、ひいてはカルシウム放出の速度は、変換時間の変動によって制御され得る。

したがって工程ｃ）は非常に重要な工程である。工程ｂ）の水溶液中の曝露時間は、所望のＨＡＰ層の厚さに基づく。エピタキシャル配向のナノ結晶ＨＡＰの少なくとも１つの層が必要である。ＣＡＰからＨＡＰへの変換が完了していないことは不可欠である。

所望の厚さによる適切な曝露時間は、リン酸カルシウム並びにセメント及びコンクリート化学の分野の当業者に周知の幾つかの熱力学的微分方程式を使用することによって計算され得る。

例えば、Pommersheim, J.C.; Clifton, J.R. (1979) Cem. Conc. Res.; 9:765; Pommersheim, J.C.; Clifton, J.R. (1982) Cem. Conc. Res.; 12:765; and Schlussler, K.H. Mcedlov-Petrosjan, O.P.; (1990): Der Baustoff Beton, VEB Verlag Bauwesen, Berlinを参照のこと。

水溶液からの固体材料の分離は、当技術分野で周知の技術を使用して、濾過及び乾燥によって通常実施される。

本発明はまた、一般に粒子、パテ又は成形体の形の、ヒト又は動物の欠損部位における骨形成、骨再生、骨修復及び／又は骨置換を支持するためのインプラント又はプロテーゼとしての上記ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料の使用に関する。

本発明はまた、一般に粒子、パテ又は成形体の形の、上記ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料を移植することによる、ヒト又は動物の欠損部位における骨形成、骨再生及び／又は骨修復を促進する方法に関する。

本発明のＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料及びその調製方法の利点
平らな結晶小板を含む均質な粗い外表面を有する、本発明の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料は、平らな結晶小板の個々のクラスターとその間の滑らかな領域とを含む不均質な外表面を有するEP-B1-2445543により教示された二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料と比較して、ヒト胎児間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の骨形成分化の増加、特に分化マーカーであるオステオポンチン（ＯＰＮ）及びオステオカルシン（ＯＣＮ）のより高い発現を示す。これは、インビボ骨形成反応の増強のはっきりした兆候である。

これは、R.A. GittensらがBiomaterials 2011 May, 32(13): 3395-3403に発表した結果と一致しているが、この文献は、マイクロ−サブマイクロスケールの粗度と組合せたナノスケール構造の導入により骨芽細胞の分化と局所因子の産生が改善されることを示しており、これにより、インビボでのインプラントのオッセオインテグレーション（osseointegration）の改善の可能性が示唆される。

本発明の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料の調製方法によって、焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの閉じたエピタキシャル成長層の均質な粗い外表面の粗さパラメーターを、特に
−ＡＦＭパラメーター：ＡＦＭで得た二乗平均平方根粗度（Ｒ_ｑ）及び輪郭の平均最大高さ（Ｒ_ｚ）を、
−ＳＥＭで測定されるエピタキシャル成長ナノ結晶ヒドロキシアパタイト小板のサイズを、並びに
−ＭＩＰで測定される０．０３〜２μmの細孔容積を
変換溶液の緩衝液中の短鎖脂肪族アルコールの割合を調整することにより、便利に調整することができる。

本発明は、本発明の好ましい実施態様の説明例及び添付の図面を参照して、本明細書の以下に更に詳細に記載されよう。
図１ａは、EP-B1-2445543により開示され、３０分の変換時間を有する実施例１で調製された、滑らかな領域が、ＳＥＭで測定されるとき外表面全体の約７０％に相当する、骨代替材料のプロトタイプ１（１〜２mm顆粒）のＳＥＭ写真を表す。図１ｂは、EP-B1-2445543により開示され、４０分の変換時間を有する実施例１で調製された、滑らかな領域が、ＳＥＭで測定されるとき外表面全体の約５０％に相当する、骨代替材料のプロトタイプ２（１〜２mm顆粒）のＳＥＭ写真を表す。図２ａ〜２ｅは、本発明の骨代替材料のプロトタイプ３（図２ａ）：２０％エタノール、１〜２mm顆粒、プロトタイプ４（図２ｂ）：３０％エタノール、１〜２mm顆粒、プロトタイプ５（図２ｃ）：４０％エタノール、１〜２mm顆粒、プロトタイプ６（図２ｄ）：５０％エタノール、１〜２mm顆粒、及びプロトタイプ７（図２ｅ）：６０％エタノール、１〜２mm顆粒のＳＥＭ写真を表す。図１及び図２ａ〜２ｅの全てのＳＥＭ写真は、倍率３５００倍を有する。図３ａは、低倍率（１０００×）でのプロトタイプ５（４０％エタノール、１〜２mm顆粒）の断面のＳＥＭ写真を表す。右下隅は顆粒の外面を示し、顆粒の中心は左上隅寄りに位置する。図３ｂは、高倍率（１４，０００×）でのプロトタイプ５（４０％エタノール、１〜２mm顆粒）の断面のＳＥＭ写真を表す。図４は、実施例２で調製された本発明の骨代替材料の無孔質ディスクのプロトタイプ３ａ（左：２０％エタノール）及び６ａ（右：５０％エタノール）のＳＥＭ写真（上の２つの写真）及びＡＦＭ写真（他の４つの写真）を表す。図５ａ〜５ｂは、インビトロ試験において先行技術の骨代替材料と比較しての、本発明の骨代替材料と接触したヒト胎児間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）のオステオカルシン（ＯＣＮ、図５ａ）及びオステオポンチン（ＯＰＮ、図５ｂ）反応を表す。図６は、実施例２で調製された本発明の骨代替材料のプロトタイプ３（２０％エタノール）、５（４０％エタノール）及び７（６０％エタノール）並びに実施例１に記載されたとおり製造された純粋なα−ＴＣＰの１〜２mm顆粒のＭＩＰ図を表す。

詳細な説明
以下の実施例により、本発明の範囲を限定することなく本発明を説明する。

EP-B1-2445543の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料の調製。
EP-B1-2445543の実施例１、２及び４と同様に、α−ＴＣＰのバルク焼結材料、１．０〜２．０mmの粒径のその多孔質顆粒、及びエピタキシャル成長ＨＡＰコーティングを有する変換顆粒を調製した。
実験室用撹拌機を用いて、３６４ｇリン酸二カルシウム無水物粉末、１３６ｇ炭酸カルシウム粉末、及び２２０ml 脱イオン水を７００rpmで５分間混合した。混合プロセスからのスラリーを、直ちに高温安定なプラチナカップに移した。充填プラチナカップを低温炉に入れた。１時間当たり１００℃の加熱速度を使用して、炉を１４００℃に加熱した。この温度を１２時間保持し、そして炉を１時間当たり５００℃の冷却速度で８００℃まで冷却し、次に１時間当たり１２５℃の冷却速度で３００℃まで冷却し、最後に炉の切り替えにより室温まで冷却した。バルク焼結材料（相純粋なα−Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）を炉及びプラチナカップから取り出した。相純度の制御は、粉末Ｘ線回折分析法を用いて実施された。
ジョークラッシャーを使用してバルク生成物を粉砕した（ジョー距離は１０〜１mmで変動した）。生成した顆粒を、２mm及び１mmのメッシュ開口を有する篩い機及び篩いインサートを使用して篩い分けした。篩い分け後、顆粒をエタノールで濯いで、顆粒に吸着した微粉末残留物を分離した。多孔質顆粒をキャビネット乾燥機で８０℃で１時間乾燥させた。濯ぎ後の粒子表面の清浄度は、走査型電子顕微鏡法を用いる表面観察によって制御された。
０．４mol/l リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４）を蒸留水に溶解して、コーティング及び相変態プロセスに適した緩衝液を調製した。水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を使用して、溶液のｐＨを室温で７．４５に調整した。前の段落で生成した顆粒を調製溶液中に浸漬し、温かい水浴（４０℃）内でそれぞれ３０分間（プロトタイプ１）及び４０分間（プロトタイプ２）保存した。浸漬後、顆粒を蒸留水で３回濯ぎ、相変態プロセスを停止させ、緩衝液から残留物を取り出した。多孔質顆粒を、キャビネット乾燥機内で１００℃で２時間乾燥させた。
プロトタイプ１及びプロトタイプ２の顆粒に対して、倍率３５００×のＳＥＭを実施した。
プロトタイプ１及び２のＳＥＭ写真を表す図１ａ及び１ｂから明らかなように、顆粒の外表面は、エピタキシャル成長ＨＡＰナノ結晶からなる平らな結晶小板の個々の（分離した）クラスターと結晶間の滑らかな領域を含む不均質なものである。
プロトタイプ１及びプロトタイプ２の各々についてＳＥＭ写真上で個々のクラスターと滑らかな領域とが占める表面を測定することにより、滑らかな領域がプロトタイプ１では外表面の約７０％、プロトタイプ２では外表面の約５０％に相当することが判定された。

本発明の二相性リン酸カルシウム/ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料の調製。
１）骨代替材料の顆粒の調製
上記の実施例１に記載されるとおり、相純粋なα−ＴＣＰの１〜２mmサイズの多孔質顆粒を製造した。
相変態及びコーティング工程は、４０℃に設定された水浴に入れたガラスフラスコ中で実施された。変換緩衝液は、様々な割合のエタノールと混合したリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４）の水溶液とした。リン酸二水素ナトリウムの水溶液のモル濃度は０．０５M〜０．３Mの間で変動し、エタノールの含量は２０〜６０w/w％の間で変動した。変換溶液のｐＨは７．３〜７．６の間であった。
ガラスフラスコに変換緩衝液を充填し、α−ＴＣＰ顆粒を１：４０〜１：８０（顆粒対変換溶液）の比で加えた。顆粒を変換溶液に４０℃で２４〜７２時間の期間、浸漬した。浸漬後、顆粒を脱イオン水（顆粒対水の比は重量で１：１０）で５回濯ぎ、エタノール（９９．９％、顆粒対エタノールの比は重量で１：１０）で２回濯いで、相変態プロセスを停止させ、緩衝液から残留物を取り出した。多孔質顆粒を、キャビネット乾燥機内で１００℃で２時間乾燥させた。
コーティング及び相変態プロセス後の表面形態を、ＳＥＭを使用して観察した。
図２は、本発明の骨代替材料のプロトタイプ３（２０％エタノール）、プロトタイプ４（３０％エタノール）、プロトタイプ５（４０％エタノール）、プロトタイプ６（５０％エタノール）及びプロトタイプ７（６０％エタノール）の倍率３５００×のＳＥＭ写真を表す。図１ａ及び１ｂを図２に対して比較することにより、平らな結晶小板の個々のクラスターとその間の滑らかな領域を有するプロトタイプ１及び２の不均質な外表面が、個々の結晶クラスターのない均質な粗い外表面によって置き換えられることが分かる。均質な粗い外表面は、エピタキシャル成長ヒドロキシアパタイト小板の連結ネットワークでできている。ＳＥＭ分析で観察されるとおり、個々の小板のサイズは、変換溶液のエタノール含量を増加させると減少し、そして外表面の粗さ又は粗度を減少させる。
図３ａは、低倍率（１０００×）でのプロトタイプ５（４０％エタノール、１〜２mm顆粒）の断面のＳＥＭ写真を表す。右下隅は顆粒の外面を示し、顆粒の中心は左上隅寄りに位置する。
図３ｂは、高倍率（１４，０００×）でのプロトタイプ５（４０％エタノール、１〜２mm顆粒）の断面のＳＥＭ写真を表しており、粗い表面の構成単位である個々の平らな結晶小板をはっきりと見ることができる。顆粒の中心の粗い外表面と顆粒の外面の粗い外表面との間に違いはない。

水銀圧入ポロシメトリー（ＭＩＰ）による細孔径分布の測定
顆粒の細孔径分布は、水銀圧入ポロシメトリー（ＭＩＰ）を使用して測定された。ＭＩＰは、多孔質材料の細孔径分布を測定するために使用される標準的な特性評価手法である。この手法は当技術分野において周知であり、例えば、Gregg, S. J. and Sing, K.S.W., Adsorption, Surface Area and Porosity, 2nd ed., Academic Press Inc. (1982), 173-190に記載されている。
図６は、純粋なα−ＴＣＰ（実施例１により製造され、そしてプロトタイプ３、５及び７のコア材料）と比較した本発明の骨代替材料のプロトタイプ３、５及び７のＭＩＰ図を表す。全ての測定は、１〜２mm顆粒を用いて実施された。
純粋なα−ＴＣＰ試料は、その表面が滑らかであるため０．０３〜２μmの範囲の細孔を持たないことが分かる。本発明の全ての骨代替材料は、エピタキシャル成長ヒドロキシアパタイト小板の連結ネットワークでできている均質な粗い外表面の多孔性のため、０．０３〜２μmの範囲の細孔を含有する。０．０３〜２μmの範囲のＭＩＰ曲線下の面積に対応する粗い外表面の細孔容積は、連結ネットワークの個々の小板サイズに依存する。個々の小板が大きいほど、連結ネットワークに含まれる細孔容積が高値になる。よって、連結ネットワークに含まれる細孔容積は、表面の粗さに直接相関させることができる。ＭＩＰ図で０．０３〜２μmの範囲の細孔容積が高値であるほど、表面の粗さが高くなる。プロトタイプ３は、示されたプロトタイプの０．０３〜２μmの範囲で最大の細孔容積（曲線下の面積）を持ち、プロトタイプ５及び７がそれに続く。図２ａ〜２ｅでのＳＥＭ分析によって、プロトタイプの粗さがプロトタイプ３からプロトタイプ５及び７へと減少していることが確認される。

２）骨代替材料の無孔質ディスクの調製
上記実施例１に記載されたとおり製造された相純粋なα−ＴＣＰの１〜２mmサイズ顆粒を１５０rpmで２０時間遊星ミルで粉砕して、微粉末を得た。微粉末をプレス型に充填し、ハンドプレスで１トンの荷重で圧縮した。グリーン成形体を型から取り出し、高温炉に移した。１時間当たり２５０℃の加熱速度を用いて、炉を１４５０℃まで加熱した。この温度を２４時間保持し、次に炉を１時間当たり５００℃の冷却速度で８００℃まで冷却し、次いで１時間当たり１５０℃の冷却速度で室温まで冷却した。バルク焼結無孔質材料（相純粋なα−Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）を炉から取り出した。相純度の制御は粉末Ｘ線回折分析法を用いて実施され、表面特性はＳＥＭを用いて分析された。
調製ディスクの相変態及びコーティングは、１）の下に上記されたとおり実施されたが、唯一の違いは、α−ＴＣＰ対変換溶液の重量比が１〜３．５であったことである。
本発明の骨代替材料のプロトタイプ３ａ（２０％エタノール）及び６ａ（５０％エタノール）は、このように調製された。
コーティング及び相変態プロセス後の表面形態を、ＳＥＭを使用して観察した。対応する粗度パラメーターは、原子間力顕微鏡法ＡＦＭを使用して測定された。
図４のＳＥＭ画像によって、無孔質ディスクの均質な粗い外表面の形態が、実施例２の段落１からの対応するエタノール含量で製造された顆粒の粗い外表面と同一であることが確認される（プロトタイプ３と３ａ及びプロトタイプ６と６ａ）。

原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）
ナノスケールでの表面測定は、タッピングモードで原子間力顕微鏡法（ＴＴ−ＡＦＭ、AFM Workshop）を使用して評価された。ＡＦＭ分析は、直径１１mm、高さ１mmの無孔質円筒ディスクを使用して、周囲雰囲気下で行われた。１９０kHzの共振周波数及び最大１０nmの先端半径を使用した。各ＡＦＭ分析は５０μm×５０μmの面積で実施され、各群３試料が走査された。数値補正を適用することにより、元のデータを水平にして傾きを除去し、二乗平均平方根粗度（Ｒ_ｑ）及び輪郭の平均最大高さ（Ｒ_ｚ）の平均値をGwyddionソフトウェアを使用して決定した。
表面の同様の表面特性評価法は、例えば、US-2013-0045360-A1に記載されている。
図４は、本発明により調製された無孔質ディスクのプロトタイプ３ａ（２０％エタノール、左側）及び６ａ（５０％エタノール、右側）のＡＦＭ写真を表す。プロトタイプ３ａ及び６ａのＡＦＭで得た粗度値を、以下の表１に見い出すことができる。

表１に見られるとおり、エタノール含量を２０％から５０％へと増加させると、二乗平均平方根粗度（Ｒ_ｑ）の平均値は２３７nmから１３０nmに減少し、そして輪郭の平均最大高さ（Ｒ_ｚ）は１３９１nmから６３０nmに減少した。

ヒト胎児間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の骨形成分化のインビトロ試験。
実施例１及び２で調製された骨代替材料プロトタイプが骨形成分化を支持するかどうかを評価するために、妊娠２２週後にヒト胎児大腿骨から分離された約２００，０００個のｈＭＳＣ（ScienCellから市販：Cat＃7500、Lot＃6890）をその骨代替材料プロトタイプの顆粒３２０mgに播種して、３週間培養した。培養の最初の７日間は、市販のｈＭＳＣ増殖培地（MSCM培地、Cat＃7501、ScienCell）を使用して、細胞増殖を最適に支持した。次の１４日間、培地を１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭに交換した。細胞培養培地に追加の骨形成剤を添加しなかった。３週間のｈＭＳＣ培養の後、全ｍＲＮＡを単離して、ｃＤＮＡに転写し、そしてリアルタイム定量ＰＣＲ（Real Time Quantitative PCR）を実施した。遺伝子発現は、ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として使用するΔΔＣＴ法（Livak K.J. and Schmittgen T.D., Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method, 2001, Methods 25, pp. 402-408を参照のこと）を経て計算された。骨形成分化マーカーであるオステオポンチン（ＯＰＮ）及びオステオカルシン（ＯＣＮ）の発現は、実施例１及び２で調製された顆粒形（１〜２mm）の全ての骨代替材料プロトタイプについて測定された。
これらの測定は、実施例１の先行技術の骨代替材料プロトタイプよりも、実施例２の本発明の骨代替材料プロトタイプでは、骨形成分化マーカーのＯＰＮ及びＯＣＮの有意に高い発現を示した（図５ａ〜５ｂを参照のこと）。
このインビトロ結果に基づいて、本発明の骨代替材料プロトタイプに対する骨形成反応の増強がインビボで予想される。

本発明の二相性ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料のＨＡＰナノ結晶とヒト骨塩との結晶サイズ及び形態の比較。
結晶サイズ分析は、プロトタイプ３の試料及び天然のヒト骨塩にブラッグ法を適用することにより、EP-B1-2445543の場合と同様にＸ線回折データの精密化を使用して実施された。
よって、本発明の二相性ＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料及びヒト骨塩が同じ形態及び同じ結晶サイズを有することが示された。
以下の表２を参照のこと。

Claims

二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料であって、焼結ＣＡＰコアと、焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの閉じたエピタキシャル成長層（ここで、エピタキシャル成長ナノ結晶は、ヒト骨塩と同じサイズと形態を有する）とを含み、焼結ＣＡＰコアの外表面上に堆積したナノ結晶ＨＡＰの閉じたエピタキシャル成長層が、平らな結晶小板を含む均質な粗い外表面を有する、骨代替材料。
粗い表面が、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）で測定されるとき、０．２〜２０μmのサイズを持つ小板の連結ネットワークを形成するエピタキシャル成長ナノ結晶のヒドロキシアパタイト小板を含む、請求項１記載の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料。
粗い表面が、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）で測定されるとき、０．５〜５μmのサイズを持つ小板の連結ネットワークを形成するエピタキシャル成長ナノ結晶のヒドロキシアパタイト小板を含む、請求項１記載の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料。
均質な粗い外表面が、水銀圧入ポロシメトリー（ＭＩＰ）で測定されるとき、０．０３〜２μmの細孔を含有する連結ネットワークを形成するエピタキシャル成長ヒドロキシアパタイト小板を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料。
均質な粗い外表面が、ＡＦＭ（原子間力顕微鏡法（Atomic Force Microscopy））で得た５０〜４００nmの範囲の二乗平均平方根粗度Ｒ_ｑ及び５００〜２０００nmの範囲の輪郭の平均最大高さＲ_ｚを用い、ＡＦＭにより特徴付けられる、請求項１〜４のいずれか一項記載の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料。
均質な粗い外表面が、ＡＦＭ（原子間力顕微鏡法）で得た１１０〜１５０nmの範囲の二乗平均平方根粗度（Ｒ_ｑ）及び５５０〜７５０nmの範囲の輪郭の平均最大高さ（Ｒ_ｚ）を用い、ＡＦＭにより特徴付けられる、請求項１〜４のいずれか一項記載の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料。
焼結ＣＡＰコアが、本質的にα−ＴＣＰからなる、請求項１〜６のいずれか一項記載の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料。
ＨＡＰの割合が、ＸＲＤにより測定されるとき、１．５〜３０％である、請求項１〜７のいずれか一項記載の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料。
粒子状又は顆粒状である、請求項１〜８のいずれか一項記載の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料。
成形体である、請求項１〜８のいずれか一項記載の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料。
適切なマトリックス中に請求項１〜９のいずれか一項記載の二相性リン酸カルシウム／ヒドロキシアパタイト（ＣＡＰ／ＨＡＰ）骨代替材料の顆粒を含有するパテ。
請求項１〜１０のいずれか一項記載のＣＡＰ／ＨＡＰ骨代替材料の調製方法であって、以下の工程：
ａ）焼結ＣＡＰコア材料を調製すること、
ｂ）焼結ＣＡＰコア材料を１０℃と５０℃の間の温度で１０〜９０％の短鎖脂肪族アルコールを含有する緩衝液に浸漬して、ＣＡＰからＨＡＰへの変換プロセスを開始し、それによって焼結ＣＡＰコア材料表面上にナノ結晶ヒドロキシアパタイトの閉じたエピタキシャル成長層（ここで、エピタキシャル成長ナノ結晶は、ヒト骨塩と同じサイズと形態を有する）であって、平らな結晶小板を含む均質な粗い外表面を有する、焼結ＣＡＰコア材料表面上に形成されるナノ結晶ＨＡＰの閉じたエピタキシャル成長層が形成されること、
ｃ）ＨＡＰの少なくとも１つのナノ結晶層の閉じたコーティングが存在するが、変換プロセスが完全に終わる前の時点で、水溶液から固体材料を分離することによって変換を停止させること、及び
ｄ）場合により、工程ｃ）からの分離された材料を滅菌すること
を含む方法。
短鎖脂肪族アルコールが、エタノールである、請求項１２記載の方法。
工程ｂ）の緩衝液が、３０〜５０％の短鎖脂肪族アルコールを含有する、請求項１２又は１３記載の方法。
工程ｂ）が、３５〜４０℃の温度で、２０〜６０％の短鎖脂肪族アルコールを含有するｐＨ７．０〜８．０のリン酸緩衝液中で行われる、請求項１２〜１４のいずれか一項記載の方法。