DE202021004032U1

DE202021004032U1 - Ein steriles Medizinprodukt als Knochenersatz, Zubereitung und Verwendung

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Publication number: DE202021004032U1
Application number: DE202021004032.3U
Authority: DE
Original assignee: Bioscientific Designs d o o; Bioscientific Designs DOO
Current assignee: Bioscientific Designs d o o; Bioscientific Designs DOO
Priority date: 2020-08-29
Filing date: 2021-08-26
Publication date: 2022-10-10
Anticipated expiration: 2031-08-27

Abstract

Ein steriles Medizinprodukt als Knochenersatzzusammensetzung in granulierter Form aus den Bestandteilen A, B und gegebenenfalls C, die sind:
- Bestandteil A - eines der Knochenersatzmaterialien ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: biphasischem Calciumphosphat, reinem Knochenmineral, aufbereitetem Knochen oder einer Kombination aus einem oder mehreren Bestandteilen biphasisches Calciumphosphat, reines Knochenmineral und aufbereitetem Knochen, alle in Form von Granulat, 70-96% w/w,
- Bestandteil B - Natriumhyaluronat, abgeleitet aus linearkettiger Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von 1,4-2,5 MDa, die nicht vernetzt ist, 4-25% w/w,
- Bestandteil C - eine oder mehrere optionale Zutaten, 0-25% w/w, wenn das genannte Medizinprodukt in einem Verfahren gewonnen wird, das aus folgenden Schritten besteht:
(i) Dosierung der zuvor abgewogenen Wirkstoffe A-C oder ihrer zuvor hergestellten Mischung in die vorgeformte Blisterpackung,
(ii) Versiegelung des gefüllten Blisters mit der Ethylenoxid permeablen Folie und
(iii) Das Sterilisationsverfahren mit EO, das die Sterilisation von im Wesentlichen unsterilen Ausgangszutaten A-C oder deren zuvor hergestellter Mischung in granulierter Form ermöglicht, wobei der Sterilisationsprozess in Schritt (iii) einen reduzierten Restgehalt an unerwünschtem toxischem 1,2-Ethylenglykol <EG> Verunreinigung im Medizinendprodukt ergibt, der durch die Durchführung der folgenden Prozessunterschritte (a) -(e) erreicht wird:
a) Vorkonditionierung des Medizinprodukts in einer Kammer bei 30-60 °C und relativer Luftfeuchtigkeit <RH> 45-80% für 10-72 h,
b) Das Vakuum in der Sterilisationskammer bei etwa 100 mbar für 8-60 Minuten einstellen,
c) Behandlung mit gasförmigem EO bei einem Druck von 450 bis 750 mbar und 30 bis 60 °C für 4 bis 24 h,
d) Evakuierung von EO aus der Sterilisationskammer durch Vakuumbehandlungen: 3-6x bei etwa 300-700 mbar, gefolgt von 2-4x bei 150-850 mbar, wobei jede Vakuumbehandlung 30-180 Minuten dauert, und
e) Konditionierung sterilisierter Blisterpackungen bei 30-60 °C für 22-72 h bei >7-fachen Luftaustausch innerhalb der Sterilisationskammer.

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung betrifft ein steriles Medizinprodukt, das zum Knochenaufbau während chirurgischer Behandlungen verschiedener Knochendefekte verwendet wird, sowie die pharmazeutische/medizintechnische Technologie seiner Herstellung und seine medizinische Verwendung.
Technisches Problem
Die durch die vorliegende Erfindung gelöste technische Aufgabe umfasst das Verfahren zur Herstellung eines sterilen Medizinprodukts, das enthält:

A. ein oder mehrere Knochenersatzmaterialien, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
- zweiphasigem Calciumphosphat, reinem Knochenmineral, aufbereitetem Knochen oder einer Kombination aus einem oder mehreren Bestandteilen zweiphasigem Calciumphosphat, reinem Knochenmineral, verarbeitetem Knochen;
B. pulverförmiges Natriumhyaluronat (NaHY) mit einem sehr hohen Molekulargewicht von 1,4-2,5 MDa, das nicht vernetzt ist; und
C. optionalen Zutaten.

Darüber hinaus muss dieses Produkt wie folgt gestaltet sein:

i) das gewünschte hochmolekulare Molekulargewicht, geradkettiger polymerer Hyaluronsäure nach der Ethylenoxid (EO)-Sterilisation des Medizinprodukts zu erhalten; und,
ii) die geringstmögliche Restmenge an unerwünschter toxischer Verunreinigung 1,2-Ethylenglykol (EG) zu enthalten, die sich unvermeidlich aus EO als Sterilisationsmittel, das in dem Verfahren verwendet wird, bildet.

Die vorliegende Erfindung hat dieses technische Problem in einer Weise gelöst, wie sie im Abschnitt Ausführliche Beschreibung der Erfindung beschrieben ist.
Bisheriger Stand der Technik
Knochendefekte können sich aus verschiedenen Ursachen wie Infektion, Tumor, Trauma, Operation, angeborene Ätiologie, Alterung, chronische Krankheiten etc. entwickeln. Seit dem Jahr 2001 werden etwa 500.000 Eingriffe in den USA und etwa 2.000.000 Eingriffe weltweit durchgeführt, dementsprechend sind Knochenaufbauverfahren in der modernen Medizin von großer Bedeutung. Der ideale Knochenersatz, der in der Lage ist, ein Knochengewebe zu ersetzen, sollte präzise Kriterien erfüllen, wie z.B. Biokompatibilität, Bioresorbierbarkeit, Osteokonduktivität, Osteoinduktivität, strukturelle Ähnlichkeit mit Knochen, Porosität, mechanisch resistent, einfach zu bedienen, sicher und kostengünstig. Die Knochenersatzprodukte sind eine Klasse von Medizinprodukten, die als Knochentransplantate für chirurgische Behandlungen verschiedener Knochendefekte verwendet werden. Im Allgemeinen können die Knochenersatzmaterialien in Bezug auf die Typen in vier Hauptgruppen unterteilt werden: Autotransplantate (Autografts), Allotransplantate (Allografts), Xenotransplantate (Xenografts) und synthetische Knochenersatzmaterialien. Autotransplantate sind eine Untergruppe der Knochenersatzmaterialien, die einen Knochen oder verschiedene Knochenderivate umfasst, die von derselben Person übertragen werden, auf die das endgültige Autotransplantat angewendet wird. Allotransplantate stammen von der gleichen Spezies wie ihre Empfänger, z.B. verarbeitete menschliche Knochenderivate für den Einsatz beim Menschen. Xenotransplantate beinhalten die Verwendung verschiedener Knochenderivate als Knochenersatzmaterial von verschiedenen Spezies, z. B. tierische Knochenpräparate für den Einsatz beim Menschen. Unter den synthetischen Knochenersatzmaterialien wird eine Vielzahl anorganischer Substanzen verwendet, z.B. Calciumsulfat (CaSO4), Calciumphosphatzemente, Tricalciumphosphat und speziell Beta-Tricalciumphosphat [β-TCP;β-Ca3(PO4)₂], Dekacalciumtriphosphatdihydroxid, bekannt unter dem Trivialnamen Hydroxylapatit [HA; Ca5(PO4)₃(OH)₂], biphasisches Calciumphosphat, das eine Mischung aus Hydroxylapatit und β-Tricalciumphosphat darstellt, bioaktiven Gläsern polymerbasiertem Knochenersatzprodukte und einigen anderen; siehe Literaturhinweise 1-3:

1) T. T. Roberts, A. J. Rosenbaum: Bone grafts, bone substitutes and orthobiologics: The bridge between basic science and clinical advancements in fracture healing, Organogenesis 8 (2012) 114-124.
2) R. Z. Legeros, S. Lin, R. Rohanizadeh, D. Mijares, J. P. Legeros: Biphasic calcium phosphate bioceramics: preparation, properties and applications, J. Mater. Sci. Mater. Medizinisch. 14 (2003) 201-209.
3) G. Fernandez de Grado, L. Keller, Y. Idoux-Gillet, Q. Wagner, A.-M. Musset, N. Benkirane-Jessel, F. Bornert, D. Offner: Bone substitutes: a review of their characteristics, clinical use, and perspectives for large bone defects management, J. Tissue Eng. 9 (2018) 1-18.

Zihlmann und Bufler zeigen eine neue Form von biphasischem Calciumphosphat, bestehend aus Tricalciumphosphat und Hydroxylapatit, deren Partikel nanokristallines Hydroxylapatit auf der Außenfläche des gesinterten Tricalciumphosphatkerns angelagert haben. Dies ist eines der neuen und innovativen biphasischem Calciumphosphat-Typen. In diesem Dokument wird auch kurz der Stand der Technik in Bezug auf verschiedene Calciumphosphatphasen (kristalline Modifikationen), die als Knochenaufbaumaterialien verwendet wurden, sowie deren Synthesemethoden und Eigenschaften zitiert, siehe Literaturhinweis 4:

4) EP3544643B1 ; C. Zihlmann, M. Bufler: Knochenersatzmaterial; Gesuchsteller: Geistlich Pharma AG (CH).

Dieses Dokument legt nahe, dass eine Vielzahl von Calciumphosphaten als Knochenersatzmaterial verwendet werden kann. Neben diesem spezifischen synthetischen und oberflächenmodifizierten Typ werden auch ältere basische chemische Alternativen und Phasen wie Alpha-Tricalciumphosphat (α-TCP), Beta-Tricalciumphosphat (β-TCP), Hydroxylapatit, biphasisches Calciumphosphat auf Basis von α-TCP/ Hydroxylapatit, biphasischem Calciumphosphat basierend auf β-Tricalciumphosphat / Hydroxylapatit, Tetracalciumphosphat [Ca₄(PO₄)₂ O; TECP] usw. beschrieben, was darauf hindeutet, dass es sich bei allen um mehr oder weniger aktive Knochenersatzmaterialien handelt, dass es jedoch feine Unterschiede in ihren Knochenaufbaueigenschaften gibt.
Missos veröffentlicht eine typische Knochenersatzmaterialzusammensetzung, bestehend aus:

i) einem porösen keramischen Gerüst mit einer bioresorbierbaren Beschichtung; welche
1. a) als Keramisches Gerüst Hydroxylapatit, Korallen Hydroxylapatit, Tricalciumphosphat, andere Calciumphosphate, Calciumcarbonat und Calciumsulfat oder deren Kombinationen verwendet wurden; und
2. b) als bioresorbierbare Beschichtung unter anderem demineralisierte Knochenmatrix, Gelatine, Kollagen, Hyaluronsäure, Chitosan, Polyglykolsäure, Polymilchsäure und Mischungen davon eingesetzt wurden; und
ii) einen Träger, der denaturierten demineralisierten Knochen umfasst; in Form von Knochenpulver, Knochenchips, Knochenspänen und Kombinationen davon; siehe Literaturhinweis 5:
- 5) US2008/0281431A1 ; N. Missos: Absorbable bone graft materials; Applicant: Biomet Manufacturing Corp. (US).

Das Dokument legt nahe, dass eine Kombination aus Hydroxylapatit, Tricalciumphosphat und demineralisierter Knochenmatrix als Knochenersatzmaterialzusammensetzung verwendet werden kann. Demineralisierte Knochenmatrix ist ein hoch verarbeitetes Allotransplantat, das aus Kollagen (>90%) und einigen nicht-kollagenen Knochenproteinen besteht, im Wesentlichen ohne das Knochenmineral Hydroxylapatit. Mit Ausnahme von demineralisierter Knochenmatrix könnte der Begriff „Knochenmaterial“ auf mehrere andere Knochenpräparate hindeuten, darunter: denaturiertes und sterilisiertes Knochenmaterial, teilweise oder vollständig demineralisierte Knochenmatrizen oder schließlich reines Knochenmineral.
Kim und Mitarbeiter beschrieben eine weitere Knochenersatzzusammensetzung, die aus sphärischem Hydroxylapatit und Hyaluronsäure in einer Gelformulierung besteht; siehe Literaturhinweis 6:

6) KR20070025489A S. H. Kim, S. Y. Park, H. L. Kim: Method for preparing bio-implantable organic-inorganic material complex and injectable bio-implantable organic-inorganic material complex prepared by the same; applicant: Codebio Co. Ltd. (KR).

Dieses Dokument schlägt die Verwendung der Kombination von sphärischem Hydroxylapatit und Hyaluronsäure als die wichtigsten Knochenersatz Wirkstoffe vor.
Shin und Mitarbeiter veröffentlichten die Knochenersatzzusammensetzung basierend auf der Kombination von Hyaluronsäure und biphasischem Calciumphosphat, die Tricalciumphosphat und Hydroxylapatit enthält; siehe Literaturhinweis 7:

7) KR20090112967A ; H. I. Shin, E. J. Oh, J. K. Park, J. S. Yeom, S. K. Hahn, H. W. An, D. J. Yang, S. K. Choi, K.B. Park: Knochenfüllkomplex und Verfahren zur Herstellung desselben; Antragsteller: Postech Acad. Ind. Found. (KR), Megagen Implant Co. Ltd. (KR).

Dieses Dokument schlägt offensichtlich die Verwendung der Kombination Hyaluronsäure und biphasischem Calciumphosphat als Knochenersatzmaterial vor.
Nguyen und Mitarbeiter beschreiben eine Knochenersatzmaterialzusammensetzung, die auf biphasischem Calciumphosphat und einem Hyaluronsäure -Gelatine-Hydrogel basiert; siehe Literaturhinweis 8:

8) KR101304949B1 ; T.B. L. Nguyen, D. W. Jang, B. T. Lee: Verfahren zur Herstellung von biphasischem Calciumphosphatgerüst, das Hyaluronsäure-Gelatin-Hydrogel beladen; Antragsteller: University Soonchunhyang Ind. Acad. Coop. Found. (KR).

Dieses Dokument enthält eine Idee, biphasisches Calciumphosphat und Hyaluronsäure und / oder Gelatine in der Knochenersatzmaterialzusammensetzung zu kombinieren.
Alexakis veröffentlichte eine Regenerationshilfe für Knochendefekte, diese besteht aus:

i) 1-10% Kollagen;
ii) 80-99 % Granulat; unter anderem kann es allogenes Knochenmaterial, autogenes Knochenmaterial, xenogenes Knochenmaterial, Calciumphosphat, Tricalciumphosphat, Calciumphosphatkeramik sein; und
iii) 0,01-2% Hyaluronsäure.

Dieses Dokument schlägt die Verwendung der Kombination von Hyaluronsäure und verschiedenen Tricalciumphosphatphasen im Knochenersatzmaterial vor. Dazu gehören letztlich Tricalciumphosphat, basische Tricalciumphosphate, bei denen es sich auch um Hydroxylapatit handeln kann, sowie einige Knochenmaterialien. Letzteres kann schließlich reines Knochenmineral enthalten, was Hydroxylapatit mit verbleibender poröser Kristallstruktur wie im Knochen bedeutet; siehe Literaturhinweis 9:

9) US2014/0335147A1 ; A. Alexakis: Regenerationshilfe bei Knochendefekten; Antragsteller: A. Alexakis (DE).

Ahn und Mitarbeiter veröffentlichten die Methode zur Behandlung von degenerativen Knochen bei Patienten. Ihre injizierbaren Zusammensetzungen umfassen eine feste Komponente, einschließlich Calciumphosphate, ein Kohlenhydrat einschließlich Natriumhyaluronat und eine Flüssigkeit. Die Hyaluronate haben Molekulargewichte von 0,9, 1,7 oder 2,6 MDa. Die feste Komponente und die flüssige Komponente, d.h. das injizierbare Biomaterial und die Behälter sind steril. Kits bestehen aus der festen Komponente, der flüssigen Komponente, z. B. sowohl in Spritzen als auch aus einer Gebrauchsanweisung. Ein beispielhaftes Hyaluronat ist z.B. Natriumhyaluronat mit einem Molekulargewicht von 1,7 MDa; siehe Literaturhinweis 10:

10) WO2017/189733A1 ; Lin, C. D. White: Methods and compositions forthe treatment of degenerative bone; Antragsteller: Anika Therapeutics, Inc. (US).

Bohner und Rizzoli zeigen ein Knochenersatzmaterial, das durch Autoklavieren sterilisiert wird, wobei das Material feste Partikel, einschließlich demineralisiertes oder gereinigtes Knochenmaterial, und quellbare Substanzen einschließlich unverzweigtes Natriumhyaluronat beinhaltet, wobei das Molekulargewicht der quellbaren Substanz vorzugsweise über 1,5 MDa liegt. Das Knochenersatzmaterial umfasst weitere pharmakologisch wirksame Wirkstoffe. Zu den Feststoffpartikeln gehören Hydroxylapatit, β- Tricalciumphosphat usw. Das Dokument offenbart ferner Kits, die das oben genannte Material und eine Flüssigkeit enthalten, die zum Mischen und Umwandeln in eine knetbare Masse für den Knochenersatz geeignet ist; siehe Literaturhinweis 11:

11) WO2008/077257A1 ; M. Bohner, G. Rizzoli: Vorstufe zur Herstellung eines pastösen Knochenersatzmaterials durch Beimischung einer Flüssigkeit; Anmelder: Methys AG (CH) und Erfinder.

Gertzman und Sunwoo zeigten sterile formbare Knochenzusammensetzungen, die demineralisiertes Knochenpulver und einen Träger, einschließlich Natriumhyaluronat mit Molekulargewichten von 0,5 bis 3 MDa, über 1 MDa bzw. 1,2 bis 2,6 MDa umfassen; siehe Literaturhinweis 12:

12) EP1127581A1 ; A. A. Gertzman, M. H. Sunwoo: Formbare Paste zum Füllen von Knochendefekten; Antragsteller: Musculoskeletal Transplant Foundation, Edison, New Jersey (US).

Die Stand der Technik-Dokumente 10-12 offenbaren sehr ähnliche Zusammensetzungen wie die in der vorliegenden Erfindung verwendete Zusammensetzung. Während Dokument 10 nicht offenbart, welche Sterilisationsmethode verwendet wurde, schlägt das Dokument 11 verschiedene Sterilisationsmethoden vor, einschließlich γ-Bestrahlung, Plasma, Ethylenoxid (EO), Autoklavieren und Heißluft, vorzugsweise Autoklavieren. Die Dokumente 10-12 schweigen jedoch zu einem spezifischen Problem der Bildung von toxischer 1,2-Ethylenglykol (EG)-Verunreinigung im Ethylenoxid (EO)-vermittelten Sterilisationsverfahren von Knochenersatzzusammensetzungen wie den Produkten aus den Stand der Technik-Dokumenten 10-12 und der vorliegenden Erfindung.
Die Frage der Erhaltung des Molekulargewichts von Natriumhyaluronat während Sterilisationsprozessen ist im Stand der Technik allgemein bekannt, aber es ist auch bekannt, dass die EO-vermittelte Sterilisation das Molekulargewicht von NaHY gut konserviert; siehe Literaturhinweise 13 und 14:

13) C. D. O'Connell, C. Onofrillo, S. Duchi, X. Li, Y. Zhang, P. Tian, L. Lu, A. Trengove, A. Quigley, S. Gambhir, A. Khansari, T. Mladenovska, A. O'Connor, C. Di Bella, P. F. Choong, G. G. Wallace: Evaluation of sterilisation methods for bio-ink components: gelatin, gelatin, gelatine methacryloyl, hyaluronic acid and hyaluronic acid methacryloyl, Biofabrication 11 (2019) 035003; doi: 10.1088/1758-5090/ab0b7c.
14) DE202016102375U1 ; Dentales Mittel auf Basis von Hyaluronan und Octenidin dihydrochlorid; Klägerin: Contipro Pharma a.s., Dolni Dobrouc (CZ); Priorität: 05. 05. März 2015.

Pastorello und Pressato zeigen ein Verbundmaterial für ein Knochenersatzmaterial, das besteht aus:

i) Hyaluronsäure, ihre Salze, z. B. Natriumsalz (NaHY), und/oder ihre Derivate, z. B. Ester; mit einem Molekulargewicht von 0,03-1,5 MDa, vorzugsweise zwischen 0,2-0,75 MDa; und
(ii) Hydroxylapatit und/oder Tricalciumphosphat mit nicht näher spezifizierter kristalliner Modifikation; und/oder
iii) Knochengranulate oder teilweise oder vollständig demineralisierte Knochenmatrizen, autologen, allogenen oder tierischen Ursprungs.

Das Dokument zeigt die Knochenersatzmaterialzusammensetzung, die sowohl ein breites Spektrum an Molekulargewicht von Hyaluronsäure als auch Hydroxylapatit und/oder Tricalciumphosphat enthält. Es befasst sich auch mit den Kombinationen von Hyaluronsäure und verschiedenen demineralisierten Knochenmatrizen; siehe Literaturhinweis 15:

15) EP1715900B1 ; A. Pastorello, D. Pressato: Zusammengesetzte Strukturen, die Hyaluronsäure enthalten, deren Derivate als neue Knochenersatzmaterialien und Transplantate; Antragsteller: Fidia Advanced Biopolymers S.r.1. (IT).

Es gibt weitere ähnliche Knochenersatzzusammensetzungen wie in der vorliegenden Erfindung, aber in allen Fällen, in denen solche Zusammensetzungen einem EO-Sterilisationsverfahren unterzogen wurde, erkannte keiner von ihnen, ein verstecktes, aber schwerwiegendes technisches Problem der unerwünschten und toxischen Verunreinigung mit 1,2-Ethylenglykol (EG); siehe Literaturhinweise 16 und 17:

16) WO2009/131323A2 ; K.B. Park, S. K. Choi, D. J. Yang, H. W. An, S. K. Hahn, J. S. Yeom, J. K. Park, E. J. Oh, H. I. Shin: Hyaluronsäure-Knochenfüllkomplex und Herstellungsverfahren davon; Antragsteller: Megagen Implant Co. Ltd. (KR), Postech Academy-Industry Foundation (KR).
17) KR101304949B1 ; B. T. Lee, D. W. Jang, T.B. L. Nguyen: Verfahren zur Herstellung von biphasischem Calciumphosphatgerüst, das Hyaluronsäure-Gelatine-Hydrogel beladen; Antragsteller: Universität Soonchunhyang Ind. Acad. Coop. Found. (KR).

In ähnlicher Weise beschreiben Matkovic und Skaramuca die Knochenersatzmaterialzusammensetzung basierend auf:

i) Hyaluronsäure, ihre Salze, z. B. Natriumsalz, und/oder ihre Derivate, z. B. Ester; mit einem Molekulargewicht von 0,3 bis >1,5 MDa; von 0,1-30% w/w, vorzugsweise von 0,1-20% w/w; und
ii) biphasisches Calciumphosphat; ad 100% der Zusammensetzung; biphasischem Calciumphosphat besteht aus:
1. a) Hydroxylapatit; 60-80% w/w; und
2. b) Beta-Tricalciumphosphat; 20-40% w/w.

Das Produktgranulat wird mit sterilem Wasser, Kochsalzlösung, Ringerlösung, Serum, Blut und ähnlichen rekonstituierenden Lösungen versetzt und zu einem Gel gemischt, das anschließend während des chirurgischen Eingriffs als Knochenersatz aufgetragen wird; siehe Literaturhinweis 18:

18) HRP20150362A2; I. Matković, D. Skaramuca: [Knochenersatz synthetischen Ursprungs (auf Kroatisch)]; Antragsteller: Dental Bio Sciences j.d.o.o.

In diesem Dokument wird die Verwendung von Kombinationen aus Hyaluronsäure in einem weiten Spektrum an Molekulargewicht mit biphasischem Calciumphosphat basierend auf β-Tricalciumphosphat und Hydroxylapatit vorgeschlagen.
In Bezug auf verschiedene Technologien zur Sterilisation von Medizinprodukten umfasst ein spezifischer Typ die Verwendung von gasförmigem Ethylenoxid (EO), das antimikrobielle Aktivität aufweist. Gopal schrieb eine Rezension über den Einsatz verschiedener Sterilisationstechnologien, die auch den EO-basierten Prozess beinhalten. Unter anderem hob er die wichtigsten technologischen Merkmale der EO-Sterilisation sowie die Toxikologie und regulatorischen Fragen hervor. Dieses Dokument schlägt die Möglichkeit vor, EO als Sterilisationshilfsmittel für Arzneimittel zu verwenden; siehe Literaturhinweis 19:

19) N. G. S. Gopal: Strahlensterilisation von Pharmazeutika und Polymeren, Radiat. Phys. Chem. 12 (1978) 35-50.

Zahlreiche Beispiele für das EO-basierte Sterilisationsverfahren bei pulverförmigen Arzneimitteln finden sich im Stand der Technik. So beschrieben Sattig und Mitarbeiter die Sterilisation einer pulverförmigen Knochenzementzusammensetzung, die in einen Behälter mit dem für das Sterilisationsmittel durchlässigen Verschluss verpackt ist; siehe Literaturhinweis 20:

20) WO0134210A1 ; C. Sattig, E. Wuest, E. Dingeldein, H. Wahlig: Sterilisationsverfahren für pulverförmige Substanzen wie Knochenzement; Anmelder: Erfinder und Coripharm Medizinprodukte GmbH & Co. KG (DE); Priorität: 09. 11. 1999.

Dieses Dokument ist ein Beispiel für ein verwandtes Sterilisationsprozesskonzept wie in der vorliegenden Erfindung. Die pulverförmige pharmazeutische Mischung befindet sich im Behälter mit einem Verschluss, der für das gasförmige Sterilisationsmittel, z.B. EO, durchlässig ist. Die Sterilisation des Inhalts erfolgt durch die Behandlung von gasförmigen Sterilisationsmitteln wie EO durch den besagten permeablen Verschluss. Dieses Dokument beschreibt jedoch die Sterilisation von vollständig anorganischen und chemisch stabilen pulverförmigen aktiven pharmazeutischen Wirkstoffen. Dies ist nicht der Fall bei einer Zusammensetzung, die chemisch empfindliche Polymere wie Hyaluronsäure mit hohem Molekulargewicht enthält, wie es in der vorliegenden Erfindung der Fall ist.
Im Gegensatz zu dem oben genannten Dokument umfasst die Knochenersatzzusammensetzung aus der vorliegenden Erfindung nicht nur die Verwendung von stabilen anorganischen Substanzen wie biphasisches Calciumphosphat, sondern auch Natriumhyaluronat (NaHY) mit hohem Molekulargewicht, das sich aus natürlichen, unvernetzten, langkettigen Hyaluronsäure-Ketten ableitet. Ein solcher Wirkstoff ist im Wesentlichen empfindlich gegenüber vielen Verarbeitungsbedingungen, welche zur Degradation von Hyaluronsäure-Polymerketten führen kann. Dies führt zu einer Senkung der Viskosität des resultierenden Gels, das beim Mischen der Knochenersatzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung mit Rekonstitutionslösung, z.B. Kochsalzlösung, erhalten wird. Ein solches Gel weist schlechtere Knochenersatzeigenschaften auf als das ursprüngliche Gel aus der Knochenersatzzusammensetzung mit konservierten polymeren Hyaluronsäure-Ketten.
Zum Beispiel beschrieben O'Connell und Mitarbeiter die Verwendung verschiedener Sterilisationsmethoden für die Verarbeitung verschiedener Hydrokolloidgele. Unter ihnen wurden Hyaluronsäure-Gele getestet. Bestimmte Sterilisationstechniken wie das Autoklavieren erwiesen sich als die destruktivsten, die zum Bruch der Polymerketten und zur Verringerung der Viskosität führten. siehe Literaturhinweis 13.
Der ähnliche Abbau wurde bei der Gamma-Bestrahlungssterilisation beobachtet; siehe Literaturhinweis 21:

21) A. F. Ahmad, H.M. K. Mohd, M. T.M.bin Ayob, N. R. A.M. Rosli, F. Mohamed, S. Radiman, I. A. Rahman: Effect of Gamma Irradiation on Hyaluronic Acid and Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) Interaction, AIP Conference Proceedings 1614, 69 (2014) doi: 10.1063/1.4895173.

Die EO-Sterilisation scheint eine realistische Option für die Sterilisation von pharmazeutischen Produkten auf Basis von pulverförmiger Hyaluronsäure oder Natriumhyaluronat (NaHY) zu sein.
Nach unserem besten Wissen stellen die Literaturdokumente 13 und 18 den nächstliegenden Stand der Technik für die Knochenersatzmaterialzusammensetzung aus der vorliegenden Erfindung dar.
Die vorliegende Erfindung löst das technische Problem der Herstellung eines sterilen Medizinprodukts, das für den Zweck des Knochenaufbaus verwendet werden soll und dass durch ein Ethylenoxid (EO)-Sterilisationsverfahren unter so spezifischen Bedingungen hergestellt wird, dass der Restgehalt an unerwünschten und toxischen 1,2-Ethylenglykol (EG)-Verunreinigungen im Medizinendprodukt deutlich verringert werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein steriles Medizinprodukt in granulierter Form, das als Knochenersatzzusammensetzung verwendet werden soll, dass aus den Bestandteilen A, B und gegebenenfalls C besteht, diese sind:

- Bestandteil A - eines der Knochenersatzmaterialien, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: biphasischem Calciumphosphat, reinem Knochenmineral, aufbereitetem Knochen oder einer Kombination aus einem oder mehreren Bestandteilen biphasisches Calciumphosphat, reines Knochenmineral und aufbereitetem Knochen, alle in Form von Granulat, 70-96% w/w,
- Inhaltsstoff B - Sodiumhyaluronat (NaHY), gewonnen aus linearkettiger Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von 1,4-2,5 MDa, das nicht vernetzt ist, 4-25% w/w,
- Inhaltsstoff C - eine oder mehrere optionale Zutaten, 0-25% w/w,

Das besagte sterile Medizinprodukt wird durch den folgenden Prozess gebildet und besteht aus den Schritten:

i) Dosierung der zuvor abgewogenen Wirkstoffe A-C oder ihrer zuvor hergestellten Mischung in die vorgeformte Blisterpackung,
ii) Abdichtung des gefüllten Blisters mit der Ethylenoxid (EO)-permeablen Folie und
iii) das Sterilisationsverfahren mit EO, das die Sterilisation von im Wesentlichen unsterilen Ausgangszutaten A-C oder deren zuvor hergestellter Mischung in granulierter Form ermöglicht.

Der Sterilisationsprozess in Schritt (iii) führt zu einem reduzierten Restgehalt an unerwünschter toxischer 1,2-Ethylenglykol (EG) Verunreinigung im Medizinendprodukt, der durch die Durchführung der folgenden Prozessunterschritte (a) - (e) erreicht wird:

a) Vorkonditionierung des Medizinprodukts in einer Kammer bei 30-60 °C und relativer Luftfeuchtigkeit (RH) von 45-80 % für 10-72 h,
b) Einstellen des Vakuums in der Sterilisationskammer bei ca. 100 mbar für 8-60 Minuten,
c) Behandlung mit gasförmiger EO bei einem Druck von 450 bis 750 mbar und 30 bis 60 °C für 4 bis 24 h,
d) Evakuierung von EO aus der Sterilisationskammer durch Vakuumbehandlungen: 3-6x bei ca. 300-700 mbar, gefolgt von 2-4x bei 150-850 mbar, wo jede Vakuumbehandlung 30-180 Minuten dauert, und
e) Konditionierung von sterilisierten Blistern bei 30-60 °C während 22-72 h bei >7-fachen Luftaustausch innerhalb der Sterilisationskammer.

Die Knochenersatzzusammensetzung innerhalb des Medizinprodukts aus der vorliegenden Erfindung sorgt für die Bildung einer geleeartigen Paste mit der rekonstituierenden Lösung z.B. einer sterilen Kochsalzlösung und ermöglicht so eine effektive Knochenheilung.
Diese Sterilisationstechnologie weist nicht nur den Vorteil auf, Sterilität und damit maximale Sicherheit für die Patienten zu gewährleisten, sondern auch:

i) die Erhaltung eines vorteilhaften hohen Molekulargewichts von linearen polymeren Ketten von Natriumhyaluronat, die die Bildung von Geleepaste mit der rekonstituierenden Lösung und damit eine einfache Anwendung in den betroffenen Knochenteil während des chirurgischen Eingriffs ermöglicht; und
ii) die Herstellung des genannten sterilen Medizinproduktes mit deutlich reduziertem Restgehalt an unerwünschter und toxischer Verunreinigung 1,2-Ethylenglykol (EG), die mit allen Ethylenoxid (EO)-basierten Sterilisationsprozessen dieser Art von Knochenersatzmaterial-Produkten verbunden ist.

Im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung führt die Standard-Sterilisationsmethode für die Sterilisation von Medizinprodukten, die auf Gammabestrahlung basiert, zu einem starken Abbau von Hyaluronsäure und zu unerwünschten Anwendungseigenschaften der resultierenden Knochenersatzzusammensetzung, und/oder Standardtechnologien für die EO-Sterilisation führen zur Erzeugung erheblicher Mengen des toxischen EG als Verunreinigung in den endgültigen Medizinprodukten, die während des üblichen EO-Vakuum-Verdampfungsschritts aufgrund des hohen Siedepunkts von EG nicht entfernt werden können.
Figurenliste

Zeigt ein steriles Medizinprodukt gemäß der vorliegenden Erfindung. Das Medizinprodukt besteht aus einem Kunststoff, z.B. Polyethylenterephthalat Glykol modifiziert (PETG), Blister (1), der mit dem Ethylenoxid (EO)-permeablen Folie (2) aus fasergesponnenem Polyethylen hoher Dichte (fs-HDPE) versiegelt ist und eine sterile Knochenersatzzusammensetzung (3) in Granulat Form enthält.
Zeigt eine alternative Ausführungsform des Medizinproduktes gemäß der vorliegenden Erfindung, die die primäre Blisterpackung mit der Knochenersatzmaterialzusammensetzung umfasst, die zusätzlich in die sekundäre Blisterpackung des gleichen Typs aufgenommen wird. Dies bietet einen zusätzlichen Sicherheitsgrad in Bezug auf die Sterilität der Knochenersatzzusammensetzung während der chirurgischen Eingriffe.
Zeigt den gesamten Herstellungsprozess zur Herstellung eines sterilen Medizinproduktes gemäß der vorliegenden Erfindung.
Zeigt die möglichen chemischen Reaktionen von Ethylenoxid (EO)-Sterilisationsmittel mit Oberflächengleichgewichtsfeuchtigkeit (Wasser) [H₂O(SE)] auf den Komponenten der Knochenersatzzusammensetzung aus der vorliegenden Erfindung und allen ähnlichen Formulierungen aus dem Stand der Technik.
Zeigt das 1H-NMR-Spektrum von reinem 1,2-Ethylenglykol in Deuteriumoxid (D₂O).
Zeigt das 1H-NMR-Spektrum von reinem Polyethylenglykol 400 (PEG 400) in Deuteriumoxid (D₂O).
Zeigt das 1H-NMR-Spektrum von reinem 1,4-Dioxan (DI) in Deuteriumoxid (D₂O).
Zeigt das 1H-NMR-Spektrum einer Mischung aus 1,2-Ethylenglykol, Polyethylenglykol 400 (PEG 400), 1,4-Dioxan (DI) und Natriumhyaluronat (NaHY) in Deuteriumoxid (D₂O).
Zeigt das 1H-NMR-Spektrum der Probe S1, Produkt aus Beispiel 1, die jedoch mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen in Deuteriumoxid (D₂O) sterilisiert wurde.
Zeigt das 1H-NMR-Spektrum der Probe S2, Produkt aus Beispiel 3, die jedoch mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen in Deuteriumoxid (D₂O) sterilisiert wurde.
Zeigt das 1H-NMR-Spektrum der Probe S3, Produkt aus Beispiel 4, aber sterilisiert mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen in Deuteriumoxid (D₂O).
Zeigt das 1H-NMR-Spektrum der Probe E1, Produkt aus Beispiel 1, in Deuteriumoxid (D₂O).
Zeigt das 1H-NMR-Spektrum von Natriumhyaluronat (ST) in Deuteriumoxid (D₂O).
Zeigt ein vergleichendes 1H-NMR-Spektrum der folgenden Proben, gelöst in 500 µL D₂O: a) 50 µL Ethylenglykol; b) 50 µL Polyethylenglykol 400 (PEG 400); c) 50 µL Dioxan; d) eine Mischung aus 50 µL Ethylenglykol, 50 µL PEG 400, 50 µL Dioxan und 6 mg Natriumhyaluronat; e) 20 mg Probe S1, Produkt aus Beispiel 1, aber mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen sterilisiert; in Deuteriumoxid (D₂O). Der Vergleich der Spektren zeigt, dass das scharfe Signal bei ca. 3,6 ppm im Spektrum der Probe S1 Methylenprotonen von Ethylenglykol zugeordnet ist.
Zeigt ein vergleichendes 1H-NMR-Spektrum der folgenden Proben, gelöst in 500 µL Deuteriumoxid (D₂O): a) 6,2 mg Standard Natriumhyaluronat (NaHY); b) 6,0 mg Probe E1, Produkt aus Beispiel 1; c) 6,0 mg Probe S3, Produkt aus Beispiel 4, aber mit Ethylenoxid unter Standardsterilisationsbedingungen sterilisiert; d) 5,4 mg Probe S3, Produkt aus Beispiel 4, aber mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen sterilisiert Probe S1, Produkt aus Beispiel 1, aber mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen sterilisiert; e) 5,8 mg Probe S2, Produkt aus Beispiel 3, aber mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen sterilisiert; in Deuteriumoxid (D₂O). Ein Unterschied im Signal-Rausch-Verhältnis zwischen den Spektren wird auf unterschiedliche Mengen an wasserlöslichem organischem Anteil in verschiedenen Proben zurückgeführt.
Zeigt das 1H-DOSY-NMR-Spektrum von Natriumhyaluronat (NaHY), das der EO-Sterilisation unter Standard-EO-Sterilisationsbedingungen ausgesetzt wurde. Die Zuordnung eines scharfen Signals bei 3,6 ppm Methylenprotonen des Ethylenglykols (HOCH₂CH₂OH) wird hier dadurch bestätigt, dass es im Vergleich zu anderen Signalen einen sehr unterschiedlichen Diffusionskoeffizienten aufweist und daher nicht zum selben Polymermolekül von Natriumhyaluronat (NaHY) gehört.
Zeigt das 1H-NMR-Spektrum von Deuteriumoxid (D₂O) als Kontrollspektrum für alle in den dargestellten NMR-Spektren der Proben, die in Deuteriumoxid (D₂O) als Lösungsmittel aufgezeichnet wurden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines sterilen Medizinprodukts in granulierter Form, das zur Verwendung für den Knochenaufbau bestimmt ist und aus den Bestandteilen A, B und gegebenenfalls C besteht, die sind:

- Bestandteil A - eine der Knochenersatzmaterialien, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: biphasischem Calciumphosphat, reinem Knochenmineral, aufbereitetem Knochen oder einer Kombination aus einem oder mehreren Bestandteilen biphasischem Calciumphosphat, reinem Knochenmineral und verarbeitetem Knochen, alle in Form von Granulat, 70-96% w/w,
- Inhaltsstoff B - Natriumhyaluronat (NaHY), gewonnen aus linearkettiger Hyaluronsäure mit molekularem Gewicht 1,4-2,5 MDa, die nicht vernetzt ist, 4-25% w/w,
- Inhaltsstoff C - eine oder mehrere optionale Zutaten, 0-25% w/w,

i) Dosierung der zuvor abgewogenen Wirkstoffe A-C oder ihrer zuvor hergestellten Mischung in die vorgeformte Blisterpackung,
ii) Abdichtung des gefüllten Blisters mit der Ethylenoxid permeablen Folie und
iii) das Sterilisationsverfahren mit EO, das die Sterilisation von im Wesentlichen unsterilen Ausgangszutaten A-C oder deren zuvor hergestellter Mischung in granulierter Form ermöglicht,

a) Vorkonditionierung des Medizinprodukts in einer Kammer bei 30-60 °C und relativer Luftfeuchtigkeit (RH) von 45-80 % für 10-72 h,
b) Einstellen des Vakuums in der Sterilisationskammer bei ca. 100 mbar für 8-60 Minuten,
c) Behandlung mit gasförmiger EO bei einem Druck von 450 bis 750 mbar und 30 bis 60 °C für 4 bis 24 h,
d) Evakuierung von EO aus der Sterilisationskammer durch Vakuumbehandlungen: 3-6x bei ca. 300-700 mbar, gefolgt von 2-4x bei 150-850 mbar, wobei jede Vakuumbehandlung 30-180 Minuten dauert, und
e) Konditionierung von sterilisierten Blistern bei 30-60 °C während 22-72 h bei >7 fachen Luftaustausch innerhalb der Sterilisationskammer.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Sterilisationsverfahrens (iii) werden die Schritte (a)-(e) unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

a) bei 45-55 °C und relativer Luftfeuchtigkeit (RH) 45-80% für 10-48 h,
b) bei etwa 100 mbar für 8-60 Minuten,
c) bei einem Druck von 450 bis 750 mbar und 45 bis 55 °C für 4 bis 5 h,
d) 3x bei 300-700 mbar; gefolgt von 2x bei 150-850 mbar, wo jede Vakuumbehandlung 45-165 Minuten dauert, und
e) bei 45-55 °C für 22-54 h.

Das biphasische Calciumphosphat, das im Verfahren zur Herstellung des Medizinproduktes gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, besteht aus:

a) Dekacalciumhexaphosphatdihydroxid [Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂; Hydroxylapatit]; und
b) Beta-Tricalciumphosphat [β-Ca₃(PO₄)₂; β-TCP]; in einem relativen Gewichtsverhältnis (w/w) von:

w (a) :w (b) = 10 : 1 bis 1:10;

³

Eine solche Art von biphasischen Calciumphosphaten wird üblicherweise durch Synthese hergestellt; durch eine kontrollierte Fällung aus wässrigen Lösungen von Alkalimetallphosphaten mit löslichen Calciumsalzen, gefolgt von einer kontrollierten Hochtemperaturbehandlung (Sintern) bei >700 °C; siehe Literaturhinweise 2 und 4.

Typische Beispiele für biphasische Calciumphosphate, die als Wirkstoff A in der Formulierung des Erfindungsgemäßen Knochenersatzmaterials eingesetzt werden können und deren grundlegende Eigenschaften sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1. Typische Produktspezifikation von handelsüblichem biphasischem Calciumphosphat wie Maxresorb^®, Reprobone^® oder Straumann BoneCeramic^®, die als aktiver Bestandteil A in der Granulatzusammensetzung des Knochenersatzmaterials in dem sterilen Medizinprodukt gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.

		Typische kommerziell erhältliche biphasische Calciumphosphate
Nr.	Parameter	Maxresorb ^®	Reprobone ^®	Straumann BoneCeramic ^®
1	Zusammensetzung: Hydroxylapatit: β-TCP	60 : 40	60 : 40	60 : 40
2	Typischer Partikelgrößendurchmesser (mm)	0.5-1.0	0.5-1.0	0.4-0.7
3	Porosität (%)	80	-	80
4	Schüttdichte (g/cm³)	0.46-0.59	0.56	-

Das reine Knochenmineral, das in der Zusammensetzung des Medizinprodukts aus der vorliegenden Erfindung verwendet wird, stellt tatsächlich einen deproteinisierten Knochen dar, der aus spongiösem oder kortikalem Rinder-, Schweine-, Pferde- oder menschlichem Knochen durch die folgenden Schritte gewonnen wird:

a) Fräsen, Sieben und Kalzinieren bei 800-1.300 °C, oder
b) Mahlen, Sieben, Behandeln mit konzentrierter Alkalilösung (NaOH), Waschen mit demineralisiertem Wasser, Sintern bei 300-800 °C, Behandlung mit kochendem Ethanol und Sterilisation, z. B. durch Dampfsterilisation oder Gammabestrahlung;

³

Während einer solchen Behandlung baut sich die gesamte organische Phase des Ausgangsknochenmaterials ab und verflüchtigt sich, was praktisch reines Hydroxylapatit ergibt, dessen Struktur und Porosität jedoch praktisch gleich oder ähnlich der Ausgangsknochenstruktur ist; siehe Literaturhinweise 22 und 23:

22) D. Tadic, M. Epple: A thorough physicochemical characterization of 14 calcium phosphatebased bone substitution materials in comparison to natural bone, Biomaterials 25 (2004) 987-994.
23) J. H. Lee, G. S. Yi, J. W. Lee, D. J. Kim, Physicochemical characterization of porcine bonederived grafting material and comparison with bovine xenografts for dental applications, J. Periodontal Implant Sci. 47 (2017) 388-401.

In diesem alternativen Fall (b) wird das pulverförmige und gesiebte Knochenmaterial einer Behandlung mit starkem Alkali, z.B. konzentrierter Natriumhydroxidlösung (NaOH), unterzogen, wenn die thermische Behandlung keine Kalzinierung bei hoher Temperatur (800-1.300 °C), sondern eine Behandlung bei relativ niedriger Temperatur, z. B. Sintern bei 300 °C, umfasst. Durch die letztgenannte Behandlung wird das gesamte Fettmaterial durch Verseifung entfernt und der größte Teil des Knochenproteins (organische Substanz) hydrolysiert und aufgelöst. Nach der Entfernung des Alkali-Überstands und dem anschließenden Waschen mit entmineralisiertem Wasser werden die Knochenpartikel bei 300 °C thermisch gesintert, wodurch reines Knochenmaterial mit einer minimal degradierten ursprünglichen Struktur des Knochenminerals mit sehr hoher Porosität und großer spezifischer Oberfläche entsteht. Das so behandelte Knochenmineral wird anschließend einer Lösungsmittelextraktion, z. B. mit kochendem Ethanol oder Isopropanol, unterzogen, um etwaige lösungsmittellösliche Spuren von Abbauprodukten der organischen Knochensubstanz zu entfernen und das Produkt zu dehydrieren. Solche alternativen Verfahren zur Herstellung von reinem Knochenmaterial bei niedrigeren Temperaturen, z. B. bei 300 °C, sind in den Literaturhinweisen 24 und 25 beschrieben:

24) Z. Schwartz, T. Weesner, S. van Dijk, D. L. Cochran, J. T. Mellonig, C. H. Lohmann, D. L. Cames, M. Goldstein, D. D. Dean, B. D. Boyan: Ability of Deproteinized Cancellous Bovine Bone to Induce New Bone Formation, J. Periodontol. 71 (2000) 1258-1269.
25) A. Berberi, A. Samarani, N. Nader, Z. Noujeim, M. Dagher, W. Kanj, R. Mearawi, Z. Salemeh, B. Badran: Physicochemical Characteristics of Bone Substitutes Used in Oral Surgery in Comparison to Autogenous Bone, BioMed Res. (2014) 1-9; ID 320790.

Beispiele für solche oben genannten reinen Knochenmaterialien sind die kommerziell erhältlichen Produkte THE Graft und Bio-Oss^®. Typische reine Knochenmaterialien, die als Wirkstoff A in der Knochenersatzzusammensetzung innerhalb der Medizinprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung anwendbar sind, sind die kommerziell erhältliche Xenograftmaterialien Cerabon^®, THE Graft und Bio-Oss^® in Granulatform, deren Spezifikationen der Schlüsselparameter in Tabelle 2 angegeben sind. Tabelle 2. Typische Produktspezifikationen von Cerabone^®, THE Graft und Bio-Oss^® als drei kommerziell gebräuchliche reine Knochenmineralien, die als Wirkstoff A in der Knochenersatzgranulatzusammensetzung innerhalb des sterilen Medizinprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung anwendbar sind; siehe Literaturhinweis 25.

		Typische handelsübliche reine Knochenmineralien
Nein.	Parameter	Cerabone ^®	THE Graft	Bio-Oss ^®
1	Durchschnittlicher Porendurchmesser (µm)	0.49	0.06	0.06
2	Porosität (%)	62.0	78.4	70.5
3	Schüttdichte (g/cm³)	1.20	0.50	0.54
4	Spezifische Oberfläche (m²/g)	0,5±0,1	69,9±23,5	65,4±16,7
5	Calcium (Ca; % w/w)^a	37.6	37.1	38.2
6	Phosphor (P; % w/w)^a	19.8	19.3	19.2
7	Ca/P molares Verhältnis	1.47	1.49	1.54
8	Organische Reststoffe; Nb	Nicht	Nicht	0.109
8	(% w/w)	detektiert	detektiert	0.109
9	Aminosäuren (mg/100 mg)^b	0.0478	0.0158	0.0910

^a Erhalten durch induktiv gekoppeltes Plasma optische Emissionsspektrometrie (ICP-OES).
^b Bestimmung von Stickstoff (N) nach der Kjeldahl-Methode.

Eine alternative Art von Wirkstoff A, der in der Knochenersatzzusammensetzung innerhalb der Medizinprodukte gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist ein verarbeiteter Knochen aus spongiösem oder kortikalem Rinder-, Schweine-, Pferde- oder menschlichem Knochen, der durch die folgenden typischen Schritte erhalten wird:

a) Mahlen des Ausgangsknochenmaterials;
b) Extraktion und Dehydratisierung von Lösungsmitteln (Isopropanol oder Ethanol sieden); gefolgt von Isolierung durch Absaugen und Trocknen aus dem organischen Lösungsmittel;
c) Siebung; und
d) Dampfsterilisation, z. B. bei 2,5 bar, 137 °C für 40 Minuten;

³

Diese und ähnliche typische Technologien für die Knochenverarbeitung zur Gewinnung von menschlichem oder tierischem Knochenersatzmaterial mit den genannten Eigenschaften, bei dem die mineralische und organische (vorwiegend) kollagene Phase erhalten bleibt, sind in den Literaturangaben 22, 25 und 26 beschrieben:

26) G. F. Draenert, M. Delius: The mechanically stable steam sterilization of bone grafts, Biomaterials 28 (2007) 1531-1538.

Typische verarbeitete Knochen, die als alternativer Wirkstoff A in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind handelsübliche Xeno- und Allotransplantate wie MaxGraft^® Granulat, Partikelgröße 0,5-2,0 mm; botiss biomaterials GmbH, Zossen (DE); siehe Literaturhinweis 27:

27) Broschüre: MaxGraft^® verarbeitetes menschliches Allotransplantat; Rev.: Mgen-07/2018-07; botiss biomaterials GmbH, Zossen (DE); https://www.botissdental.com/pdf/botiss_maxgraft_ EN.pdf

Natriumhyaluronat (NaHY), das als Wirkstoff B in der Knochenersatzzusammensetzung innerhalb des Medizinprodukts aus der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann eine kommerziell erhältliche hochreine Qualität sein, die für die Verwendung in Medizinprodukten geeignet ist und aus linearen polymeren Hyaluronsäure-Ketten besteht, die daher nicht vernetzt sind. Natriumhyaluronat wird üblicherweise als feines weißes Pulver geliefert. Typisches Natriumhyaluronat, das verwendet werden kann, ist beispielsweise Natriumhyaluronat P100 von Contipro a.s., Dolni Dobrouč, Tschechische Republik (CZ), dessen Charakterisierung in Tabelle 3 angegeben ist. Tabelle 3. Spezifikation des typischen Natriumhyaluronats, das als Wirkstoff B in der Knochenersatzzusammensetzung innerhalb des Medizinprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. ^a

Nr.	Parameter	Einheit	Spezifikation
1	Aussehen	-	weißes bis fast weißes Pulver
2	Identifizierung - Test A (IR)		entspricht dem Ph. Eur. Referenzspektrum
3	Identifizierung - Test B (Natrium) nach Ph.Eur.	-	bestanden
4	Aussehen der Lösung	-	klar
5	Aussehen der Lösung - Absorption	-	≤ 0,01
6	ph	-	5.0 - 8.5
7	Intrinsische Viskosität	m³/kg	2.0 - 3.0
8	Nukleinsäuren	-	≤ 0,5
9	Protein	%	≤ 0,100
10	Chloride	%	≤ 0,5
11	Eisen	Ppm	≤ 80,0
12	Verlust bei der Trocknung	%	≤ 10.0
13	Mikrobielle Kontamination	KBE/g	≤ 100
14	Bakterielle Endotoxine	IE/mg	< 0.50
15	Natriumhyaluronat	%	95.0 - 105.0
16	Isopropanol-Reste	%	≤ 0,50
17	Molekulargewicht	%	1.9-2.1

^a Natriumhyaluronat P100 von Contipro a.s., Dolní Dobrouč (CZ).

Die allgemeine Rolle von Hyaluronsäure (und Natriumhyaluronat) bei der Geweberegeneration und anderen klinischen Anwendungen ist im Stand der Technik relativ gut bekannt; siehe z.B. literaturhinweise 6-12 und 28:

28) A. Fallacara, E. Baldini, S. Manfredini, S. Vertuani: Hyaluronsäure im dritten Jahrtausend, Polymere 10 (2018) 701; doi: 10.3390/polyml0070701.

Optionale Bestandteile, die für die Herstellung der Knochenersatzzusammensetzung aus der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus: demineralisierte Knochenmatrix, die von Rinder-, Schweine-, Pferde- oder menschlichen Knochen stammt; Kollagen, das von Rindern, Schweinen oder Pferden stammt; Gelatine, die von Rindern, Schweinen oder Pferden stammt; Seidenfibroin (SF); Chitosan; Chondroitinsulfat; Natriumalginat; Polymilchsäure (PLA); Polyglykolsäure (PGA); Copolymer aus Milch- und Glykolsäure (PLGA); Polyvinylalkohol (PVA); Polycaprolacton (PCL); Cellulose (CE); Methylcellulose (MC); 2-Hydroxyethylcellulose (HEC); Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC); Natriumcarboxymethylcellulose (NaCMC); oder Mischungen dieser Stoffe.
Im Falle der demineralisierten Knochenmatrix in der Knochenersatzzusammensetzung aus der vorliegenden Erfindung handelt es sich um verschiedene Knochenpräparate, die üblicherweise wie folgt hergestellt werden:

a) Mahlen des Ausgangsknochenmaterials;
b) Siebung auf die gewünschte Partikelgröße, z. B. auf 0,1-2,0 mm;
c) Behandlung mit Säuren, z. B. 6 M Salzsäure (HCl), um alle Calciumphosphat (Mineral) Knochenphasen unterhalb von 0,5 Gew.-% Calcium (Ca)-Gehalt oder darunter aufzulösen
d) Spülen mit demineralisiertem Wasser; und
e) ein Sterilisationsverfahren; siehe Literaturhinweise 29-31:

29) M.M. Morone, S. D. Boden: Experimental Posterolateral Lumbar Spinal Fusion With a Demineralized Bone Matrix Gel, Spine 23 (1998) 159-167.
30) G. I. Drosos, K. I. Kazakos, P. Kouzoumpasis, D.-A. Verettas: Safety and efficacy of commercially available demineralized bone matrix preparations: A critical review of clinical studies , Injury, Int. J. Care Injured 38S4 (2007) S13 - S21.
31) S. T. Moore, J. D. Katz, R.M. Zhukauskas, R.M. Hernandez, C. S. Lewis, P. R. Supronowicz, E. Gill, S.M. Grover, N. S. Long, R. R. Cobb: Osteoconductivity and Osteoinductivity of Puros DBM Putty, ^®J. Biomater. Appl. 26 (2011) 151-171.

Die Verwendung anderer optionaler Inhaltsstoffe wie SF, Chitosan, PLA, PGA, PLGA, PVA und PCL erfolgt in Übereinstimmung mit den Literaturdaten, die eine solche Verwendung in verschiedenen Knochenersatzmaterialzusammensetzungen anerkannten; siehe Literaturhinweise 32 und 33:

32) C. Shi, Z. Yuan, F. Han, C. Zhu, B. Li: Polymeric biomaterials for bone regeneration, Ann. Joint 1:27 (2016) 1-14.
33) R. Song, M. Murphy, C. Li, K. Ting, C. soo, Z. Zheng: Current development of biodegradable polymeric materials for biomedical applications, Drug Design Dev. Ther. 12 (2018) 3117-3145.

Darüber hinaus ist die Verwendung von Cellulose (CE) und löslichen Hydrokolloiden auf Cellulosebasis wie Methylcellulose (MC), 2-Hydroxyethylcellulose (HEC), Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) und Natriumcarboxymethylcellulose (NaCMC) in der Technik bekannt, siehe Literaturhinweis 34:

34) S. D. Dutta, D. K. Patel, K.-T. Lim: Funktionelle Cellulose-basierte Hydrogele als extrazelluläre Matrizen für das Tissue Engineering, J. Biol. 13 (2019) 55; doi: 10.1186/s13036-019-0177-0.

Die Knochenersatzzusammensetzung wird entweder durch direkte Zugabe von separat gewichteten Wirkstoffen A-C in die Kunststoffblister oder durch vorherige Homogenisierung von Granulat und pulverförmigen Bestandteilen A-C in einer geeigneten Homogenisierungsvorrichtung wie Behälter oder V-Mixer gebildet. So erhält man homogene Knochenersatzzusammensetzung in einer Granulatform in besagte Kunststoffblister.
Letzteres wird zuvor aus einer oder mehreren Kunststofffolien vorgeformt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Polyethylen (PE), Polypropylen (PP), Polystyrol (PS), Polyvinylchlorid (PVC), Polyvinylidendichlorid (PVDC), Polymethylacrylat (PMA), Polyethylacrylat (PEA), Polybutylacrylat (PBA), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polyethylmethacrylat (PEMA), Polybutylmethacrylat (PBMA), Polyethylenterephthalat (PET) und Polyethylenterephthalatglykol-modifiziert (PETG).
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird der Blister aus Polyethylen hoher Dichte (HD-PE), Polyethylenterephthalat (PET) oder Polyethylenterephthalatglykol-modifiziert (PETG) vorgeformt. Die typische Dicke der Blisterfolie beträgt 800 µm und die Abmessungen sind wie folgt: B × L × H = 50-55 × 80-85 × 20-25 mm für typische Knochenersatzmaterial-Dosierungen zwischen 500-2.000 mg.
Die Blisterpackung mit gefüllter Knochenersatzmaterialzusammensetzung ist mit einer Ethylenoxid (EO)-permeablen Folie versiegelt. Eine solche Folie besteht aus dem Kunststoffmaterial, das aus der Gruppe bestehend aus fasergesponnenem Polyethylen hoher Dichte (fs-HDPE) ausgewählt wurde, das sich auszeichnet durch: eine mikrobielle Barriereeigenschaft nach ASTM F1608 von mindestens 5,0 log Reduktionswert (LRV) und Dicke >100 µm. Das typische EO-durchlässige Folienmaterial, das in der vorliegenden Erfindung anwendbar ist, ist Tyvek 1073B von Du Pont de Nemours Inc., Wilmington, DE (US); ^®siehe Literaturhinweis 35:

35) DuPontTM Tyvek: DuPont technical Reference Guide for Medical and Pharmaceutical Packaging (2017);^® https://www.dupontdenemours.be/content/dam/dupont/amer/us/en/safety/public/documents/fr/ DPT_MPP_Technical_Reference_Guide.pdf

So sind die vorbereiteten versiegelten Blister mit der Knochenersatzzusammensetzung in Granulatform im Wesentlichen unsteril, mit einer mikrobiologischen Belastung (MB), die ungefähr der MB-Belastung der Ausgangsrohstoffe, der Bestandteile A-C, entspricht, wie sie im Handel erhältlich sind. Die wichtigste Anforderung an die MD-Produkte der Klasse III mit dem höchsten Risiko für die Patienten ist ihre Sterilität, um eventuelle unerwünschte Infektionen zu vermeiden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das technische Problem der Sterilisation von empfindlichem hochmolekularem, geradkettigem (nicht vernetztem) Natriumhyaluronat (NaHY) durch die Ethylenoxid (EO)-Behandlung der fertigen Blister mit bereits verpackter Knochenersatzzusammensetzung durch die EO-permeable Barriere gelöst. Ein solches Verfahren bietet eine effektive Herstellungsmethode für sterile, NaHY-haltige Medizinprodukte aus der Klasse der Knochenersatzmaterialien.
In einer anderen Ausführungsform offenbart die vorliegende Erfindung ein steriles Medizinprodukt selbst, das die Bestandteile A und B und optional C, in dem mit der EO-durchlässigen Folie versiegelten Blister enthält, der durch die Behandlung der fertig versiegelten Blister mit EO sterilisiert wird.
Der endgültige Blister des Medizinprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung ist in seiner grundlegenden und stilisierten Form schematisch in dargestellt.
Zusätzlich wird in einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung die primäre Blisterpackung in eine sekundäre (zweite) Blisterpackung gegeben und anschließend mit einer weiteren EO-durchlässigen Folie versiegelt. Die Materialien des zweiten Blisters und der EO-durchlässigen Folie sind die gleichen, die für die Bildung des Primärblisters verwendet werden. Dies führt zu einem primären Blister innerhalb der sekundären Blisterverpackung, der die Sterilität des Knochenersatzgranulat, das in den primären Blister eingebracht wird, maximal bewahrt. So wird das hergestellte Medizinprodukt dem erfindungsgemäßen EO-Sterilisationsverfahren unterzogen, das im Wesentlichen ein steriles Produkt mit minimaler Menge an unerwünschter und toxischer Restverunreinigung 1,2-Ethylenglykol (EG) ergibt.
Der fertige Blister des Medizinprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung in seiner weiterentwickelten, doppelt geblisterten und stilisierten Form ist schematisch in dargestellt.
Das gesamte Verfahren zur Herstellung eines sterilen Medizinprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung ist in schematisch dargestellt.
Herstellung des sterilen Medizinprodukts aus der vorliegenden Erfindung
Das Verfahren zur Herstellung des sterilen Medizinprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst:

i) Vorformen der Blisterpackungen aus einer oder mehreren Kunststofffolien, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Polyethylen (PE), Polypropylen (PP), Polystyrol (PS), Polyvinylchlorid (PVC), Polyvinylidendichlorid (PVDC), Polymethylacrylat (PMA), Polyethylacrylat (PEA), Polybutylacrylat (PBA), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polyethylmethacrylat (PEMA), Polybutylmethacrylat (PBMA), Polyethylenterephthalat (PET) und Polyethylenterephthalatglykol-modifiziert (PETG);
ii) Die Dosierung der genau gewichteten oder volumetrisch definierten Menge der zuvor homogenisierten Mischung von Wirkstoffen A-C:
1. A. einer der Knochenersatzmaterialien, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: biphasischem Calciumphosphat; reinem Knochenmineral; aufbereitetem Knochen; oder einer Kombination aus einem oder mehreren Bestandteilen biphasisches Calciumphosphat, reines Knochenmineral und aufbereitetem Knochen; in Form von Granulat; 70-96% w/w;
2. B. Natriumhyaluronat (NaHY); abgeleitet von linearkettiger Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von 1,4-2,5 MDa, die nicht vernetzt ist; 4-25% w/w; und
C.eine oder mehrere optionale Zutaten; 0-25% w/w der Knochenersatzzusammensetzung, in die vorgeformten Blasen;
iii) Versiegelung der gefüllten Blister mit der Ethylenoxid permeablen Folie; und
iv) Das Sterilisationsverfahren mit EO, das die Sterilisation von im Wesentlichen unsterilen Ausgangszutaten A-C oder ihrer zuvor hergestellten Mischung in granulierter Form durch folgende Phasen ermöglicht:
1. a) Vorkonditionierung des Medizinprodukts in einer Kammer bei 30-60 °C und relativer Luftfeuchtigkeit (RH) von 45-80 % für 10-72 h,
2. b) Einstellen des Vakuums in der Sterilisationskammer bei ca. 100 mbar für 8-60 Minuten,
3. c) Behandlung mit gasförmiger EO bei einem Druck von 450 bis 750 mbar und 30 bis 60 °C für4 bis 24 h,
4. d) Evakuierung von EO aus der Sterilisationskammer durch Vakuumbehandlungen: 3-6x bei ca. 300-700 mbar, gefolgt von 2-4x bei 150-850 mbar, wobei jede Vakuumbehandlung 30-180 Minuten dauert, und
5. e) Konditionierung von sterilisierten Blistern bei 30-60 °C für 22-72 h bei >7 fachen Luftaustausch innerhalb der Sterilisationskammer.

Ein solcher veröffentlichter Prozess bietet:

i) eine vollständige Konservierung des Molekulargewichts von NaHY-Polymerketten bei 1,4-2,5 MDa während des Sterilisationsprozesses, was für die Gelierungseigenschaften der Knochenersatzzusammensetzung aus der vorliegenden Erfindung wichtig ist; und gleichzeitig
ii) eine deutlich verringerte Bildung der unerwünschten und toxischen Verunreinigung 1,2-Ethylenglykol (EG), die bei der EO Sterilisation von Knochenersatzprodukten dieser Art unter den üblichen EO-Sterilisationsbedingungen immer unvermeidlich gebildet wird.

Im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung führen die Standard-Sterilisationsverfahren zur Sterilisation von Medizinprodukten:

i) die auf Gammabestrahlung beruhen zu einem starken Abbau der Hyaluronsäure, was unerwünschte Anwendungseigenschaften der resultierenden Knochenersatzzusammensetzung verursacht, oder
(ii) durch Ethylenoxid Sterilisation, welche zur Bildung signifikanter Mengen des toxischen Ethylenglykols EG als Verunreinigung in den endgültigen Medizinprodukten, die während des üblichen EO-Vakuum-Verdampfungsschritts aufgrund des hohen Siedepunkts von Ethylenglykols EG, der unter normalen Bedingungen bei Raumtemperatur und normalem Atmosphärendruck 197,3 °C beträgt, nicht entfernt werden können.

Das Herstellungsverfahren zur Herstellung eines sterilen Medizinprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung ist in 3 schematisch dargestellt.
In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung wird die primäre Blisterpackung in eine andere (zweite) Blisterpackung gegeben und diese anschließend mit einer weiteren EO-durchlässigen Folie versiegelt. Die Materialien des zweiten Blisters und der EO-durchlässigen Folie sind die gleichen, die für die Bildung des Primärblisters verwendet werden. Dies führt zu einem primären Blister innerhalb der sekundären Blisterverpackung, der die Sterilität des Knochenersatzgranulats, das in den primären Blister eingebracht wird, maximal bewahrt. So wird das hergestellte Medizinprodukt dem EO-Sterilisationsprozess unterzogen, wodurch ein im Wesentlichen steriles Produkt mit minimaler Menge an unerwünschten und toxischen Restverunreinigungen EG entsteht.
Die endgültige Blisterpackung des Medizinproduktes gemäß der vorliegenden Erfindung in ihrer fortgeschrittenen, doppelt geblisterten und stilisierten Form ist in 2 schematisch dargestellt.
Die Ethylenoxid (EO) Sterilisation und die entsprechenden mikrobiologischen Analysen zur Qualitätskontrolle (QC) wurden gemäß den allgemeinen Richtlinien für die Art der Sterilisationsprozesse entwickelt, wie sie in internationalen Normen beschrieben sind. siehe Literaturhinweise 36-38:

36) ISO 11737-1:2018 Sterilisation von Gesundheitsprodukten - Mikrobiologische Methoden - Teil 1: Bestimmung einer Population von Mikroorganismen auf Produkten.
37) ISO 11138-2:2017 Sterilisation von Gesundheitsprodukten - Biologische Indikatoren - Teil 2: Biologische Indikatoren für Ethylenoxid-Sterilisationsprozesse.
38) ISO 11135:2014 Sterilisation von Gesundheitsprodukten - Ethylenoxid - Anforderungen an die Entwicklung, Validierung und Routinekontrolle eines Sterilisationsprozesses für Medizinprodukte.

Illustrative Beispiele des Verfahrens zur Herstellung eines sterilen Medizinprodukts aus der vorliegenden Erfindung sind in den experimentellen Beispielen 1 und 3-5, 7 und 8 beschrieben. Die Herstellung eines sterilen Medizinprodukts in seiner doppelt geblisterten Form ist in Beispiel 6 beschrieben.
Die Herstellung der Kontrolle, die im Wesentlichen die gleiche Knochenersatzzusammensetzung wie das Produkt in Beispiel 1 enthält, jedoch unter Verwendung alternativer Gammabestrahlungssterilisationstechnologie, wird in Beispiel 2 beschrieben.
Die Bildung von 1,2-Ethylenglykol (EG) während des Ethylenoxid (EO)-Sterilisationsprozesses des Medizinprodukts wurde mit Hilfe der 1H-NMR-Spektrometrie festgestellt und untersucht; siehe nachstehenden Abschnitt.
Untersuchung der Bildung unerwünschter Verunreinigungen während der Ethylenoxid Sterilisation des Medizinprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung
Die Untersuchung der Bildung unerwünschter Verunreinigungen während der EO-Sterilisation wurde an den folgenden Proben (S1-3, E1 und ST) durchgeführt:

i) S1: Produkt aus Beispiel 1, aber mit EO unter Standard-Sterilisationsbedingungen sterilisiert; stellt eine Lösung aus dem Stand der Technik dar;
(ii) S2: Produkt aus Beispiel 3, aber mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen sterilisiert; stellt eine Lösung aus dem Stand der Technik dar;
(iii) S3: Produkt aus Beispiel 4, aber mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen sterilisiert; stellt eine Lösung aus dem Stand der Technik dar;
iv) E1: Erzeugnis aus Beispiel 1, eine Lösung aus der vorliegenden Erfindung; und
v) ST: Standard für reines Natriumhyaluronat [Hyaluronsäure P100, Natriumsalz, Pulver, Medizinproduktequalität; Contipro a.s., Dolni Dobrouč (CZ)].

Die Standardsterilisation mit Ethylenoxid, die als Stand der Technik (klassische) Bedingungen für die Ethylenoxidsterilisation angesehen werden kann, wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

a) Vorkonditionierung des Medizinprodukts in einer Kammer bei 45 °C und relativer Luftfeuchtigkeit (RH) von 50 % für 60 Minuten;
b) Erzeugung des Vakuums in der Sterilisationskammer bei etwa 200 mbar für 30 Minuten;
c) Behandlung mit gasförmigem EO (rein; Klasse 3,0; 99,9 %) bei einem Druck von 2,5 bis 3,0 bar und 50 °C für 300 Minuten;
d) Evakuierung von EO aus der Sterilisationskammer durch Vakuumbehandlungen: 6x bei 300 mbar; bei einer Dauer jeder Vakuumbehandlung von 180 Minuten; und
e) Konditionierung sterilisierter Blisterpackungen bei 45-55 °C für 48 h bei einem >7 fachen Luftaustausch innerhalb der Sterilisationskammer; an der kroatischen Abteilung für Transfusionsmedizin in Zagreb, Kroatien.

Die so erhaltenen Proben S1-S3, E1 und ST wurden 1H-NMR-Experimenten unterzogen, um zu untersuchen, welche Art von möglichen Verunreinigungen tatsächlich gebildet werden. Die 1H-NMR-Experimente wurden im NMR-Servicezentrum am „Ruder Bošković“ Institut (IRB) in Zagreb, Kroatien, mit dem Bruker Avance 600-Spektrometer (600,13 MHz, 1H) unter den in den Abschnitten Allgemeine Informationen zur experimentellen Arbeit und in Beispiel 9 beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
Theoretische Bewertung möglicher Nebenreaktionen von Ethylenoxid (EO) mit den Komponenten des Knochenersatzes gemäß der vorliegenden Erfindung
EO könnte eine Hydrolysereaktion mit der Restfeuchtigkeit auf der Oberfläche der erfindungsgemäßen Knochenersatzstoffzusammensetzung eingehen, wobei giftiges 1,2-Ethylenglykol (EG) als Endprodukt entsteht.
Aus 1,2-Ethylenglykol könnte ein weiteres Produkt, Diethylenglykol (DG), entstehen, das möglicherweise durch eine Zyklisierungsreaktion zu giftigem 1,4-Dioxan (DI) wird.
Alternativ könnte 1,2-Ethylenglykol, sobald es gebildet wurde, mit einem Überschuss an EO einige Polyethylenglykole (PEG) ergeben. Das nächste bekannte Produkt ist PEG 400, das einen PEG-Octamer mit geringen Mengen an verwandtem Heptamer und Nonamer darstellt.
Die Reaktionen, die die Bildung möglicher EO-Abbauprodukte während des EO-Sterilisationsprozesses beschreiben, sind in dargestellt.
Die entsprechenden ¹H-NMR-Spektren reiner Kontrollsubstanzen sind in den folgenden Abbildungen dargestellt:

EG in , in und PEG 400 in sowie deren Mischung mit Standard (ST) Natriumhyaluronat (NaHY) in .

Die Ergebnisse aus ¹H-NMR-Spektren zeigen, dass:

(i) EG ist durch ein Signal von HOCH2CH2QH-Protonen bei etwa 3,6 ppm gekennzeichnet. siehe ;
(ii) PEG 400 ist gekennzeichnet durch ein Signal von HO(CH2CH2O)_nH (n= 7-9) Protonen bei etwa 3,66-3,70 ppm, siehe ;
(iii) DI ist durch ein Signal von CH2CH2-Protonen bei etwa 3,66-3,70 ppm gekennzeichnet, siehe ;

Zusätzlich wurden die Proben S1-S3, E1 und ST (NaHY) unter den gleichen Bedingungen ¹H-NMR-Experimenten unterzogen, die die entsprechenden ¹H-NMR-Spektren ergaben für:

i) S1: Produkt aus Beispiel 1, aber mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen sterilisiert, siehe ;
(ii) S2: Produkt aus Beispiel 3, aber mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen sterilisiert, siehe ;
(iii) S3: Produkt aus Beispiel 4, aber mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen sterilisiert, siehe ;
iv) E1: Erzeugnis aus Beispiel 1, jedoch mit EO unter den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Bedingungen sterilisiert, siehe ; und zur Kontrolle
v) ST: Standard für reines Natriumhyaluronat [NaHY; Hyaluronsäure P100, Natriumsalz, Pulver, Medizinproduktequalität; Contipro a.s., Dolni Dobrouč (CZ)], siehe .

Aus der quantitativen Analyse der genannten 1H-NMR-Spektren durch Bestimmung des Verhältnisses der Integralwerte des Signals der 1,2-Ethylenglykol (EG)-Protonen HOCH2CH2OH bei 3,6 ppm zum Integralwert des Singulett-Signals der Methylgruppe in der N-Acetamido-Gruppe des Natriumhyaluronats (NaHY) bei 1,9 ppm ergibt sich der Parameter, der den quantitativen Gehalt an EG in jeder untersuchten Knochenersatz-Probe darstellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4. Die Ergebnisse der quantitativen Bestimmung des Gehalts an 1,2-Restethylenglykol (EG) in verschiedenen Knochenersatzproben S1-3 (Stand der Technik) und E1 (diese Erfindung) erhalten durch quantitative 1H-NMR-Analyse; siehe Beispiel 9.

Nr.	Muster ^a	I	I	Verhältnis	Relativer Gehalt an Rest-EG ^e
Nr.	Muster ^a	(3,6 ppm) ^b	(1,9 Ppm) ^c	(I _3.5 /I _1.9 ) ^d	Relativer Gehalt an Rest-EG ^e
Stand der Technik:
1	S1	0,87	3.0	0,29	4,6 x
2	S2	0,93	3.0	0,31	4,9 x
3	S3	4.00	3.0	1.33	21,1 x

Diese Erfindung:
4	E1	0,19	3.0	0.063	1

Kontrolle (reines Natriumhyaluronat):
5	ST	-	3.0	0	0%

^a Muster von Knochenersatz: S1: Produkt aus Beispiel 1, aber mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen sterilisiert, siehe ; S2: Produkt aus Beispiel 3, aber mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen sterilisiert, siehe ; S3: Produkt aus Beispiel 4, aber mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen sterilisiert, siehe ; E1: Produkt aus Beispiel 1, siehe ; ST: Standard von reinem Natriumhyaluronat (NaHY).
^b Integralwert (_I3.5) von 3.6 ppm 1H-NMR-Signale, die HOCH2CH2OH-Protonen von 1,2-Ethylenglykol entsprechen, die als Verunreinigung in einer bestimmten Probe vorhanden sind. cIntegraler Wert (I1.₉) von 1,9 ppm 1H-NMR-Signalen, die CH3CONH-Protonen aus Natriumhyaluronat entsprechen, die in einer bestimmten Probe vorhanden sind.
^d Das Verhältnis I_3,5/I_1,9 entspricht dem quantitativen Gehalt an toxischer Verunreinigung EG in einer gegebenen Probe (S1-S3, E1).
^e Der relative Gehalt an Rest-EG innerhalb einer gegebenen Probe ist ein Parameter, der durch Division des Verhältnisses I_3,5/I_1,9 einer gegebenen Probe (S1-3) und des gleichen Verhältnisses für die Stichprobe E1 erhalten wird. Das Ergebnis stellt ein Maß für die Wirksamkeit des EO-Sterilisationsverfahrens aus der vorliegenden Erfindung (Probe E1) gegenüber dem Verfahren aus dem Stand der Technik (Proben S1-3) dar. Proben S1-S3, die durch den klassischen EO-Sterilisationsprozess erhalten wurden, ergaben 4,6x (S1), 4. 9x (S2) oder 21x (S3) höherer Restgehalt an toxischem 1,2-Ethylenglykol (EG) als die Probe E1, erhalten durch das EO-Sterilisationsverfahren aus der vorliegenden Erfindung.

Vergleichende Darstellung von ¹H-NMR-Spektren von:

i) EG, PEG 400, DI und S1 sind in dargestellt; und
ii) Proben S1-S3, E1 und ST (NaHY) mit dem entsprechenden Restgehalt an toxischer 1,2-Ethylenglykol (EG)-Verunreinigung in .

Ein weiterer Nachweis für die Identität des scharfen Signals bei 3,5 ppm in allen Proben der Knochenersatzzusammensetzung, die dem EO-Sterilisationsprozess ausgesetzt waren, wurde durch diffusionsbestellte NMR-Spektrometrie (1H DOSY NMR) mit der Probe von Natriumhyaluronat (NaHY) erzielt, die der EO-Sterilisation unter Standardsterilisationsbedingungen ausgesetzt war. Die Zuweisung eines scharfen Signals bei 3.6 ppm Methylenprotonen aus 1,2-Ethylenglykol (EG; HOCH2CH2OH) wird hier dadurch bestätigt, dass es im Vergleich zu anderen Signalen einen sehr unterschiedlichen Diffusionskoeffizienten aufweist und daher nicht zum selben Polymermolekül von NaHY gehört, siehe . Die entsprechenden Diffusionskoeffizienten aus ^1H DOSY NMR, die in diesem Teil der Studie ermittelt wurden, sind in Tabelle 5 aufgeführt. Tabelle 5. Die Diffusionskoeffizienten aus dem ^1H DOSY NMR Spektrum einer Probe von Natriumhyaluronat (ST; NaHY) unter klassischen Bedingungen der Ethylenoxid (EO)-Sterilisation ausgesetzt, siehe Abbildung 16.

Peak Nr.	δ [ppm]	D [m2/s]	Fehler
1	4,39	2.74E-12	3.7E-13
2	4,31	2.41E-12	4.4E-13
3	3.68	2.61E-12	1.2E-13
4	3,67	2.26E-12	1.9E-13
5	3,56	2.78E-12	1,0E-13
6	3,51	8.04E-10	7.1E-12
7	3,42	2.54E-12	1.4E-13
8	3.38	2.31E-12	7,4E-13
9	3,36	2.64E-12	1,5E-13
10	3,35	2.69E-12	1.9E-13
11	3,33	2.30E-12	1.8E-13
12	3,19	3.82E-12	1.9E-13
13	1,91	3.05E-12	2.8E-13
14	1,87	2.53E-12	1.7E-14
15	1,76	5,64E-10	9.5E-11

Δ = chemische Verschiebung des entsprechenden Peaks innerhalb des 1H DOSY NMR Spektrums;
D = Differenzierungskoeffizient.

Zusätzlich ist in ein 1H-NMR-Spektrum von Deuteriumoxid (D₂O) als Kontrollspektrum für alle in den dargestellten NMR-Spektren der Proben dargestellt, die in D₂O als Lösungsmittel aufgezeichnet wurden. Die Studie zeigt deutlich, dass:

(i) die einzige identifizierte Verunreinigung, die wirklich in allen Knochenersatzmaterialien gebildet wird, die einem Ethylenoxid (EO)-Sterilisationsprozess ausgesetzt waren, war toxisches 1,2-Ethylenglykol (EG); es wurden keine anderen vorläufig erwarteten Verunreinigungen, weder DI noch PEG, gefunden;
ii) der quantitative Rest-EG-Gehalt in den Proben S1-S3 signifikant höher ist als in der Probe E1, die ein Produkt aus Beispiel 1 darstellt, das durch das Verfahren aus dieser Erfindung erhalten wird.

„Signifikant höher“ bedeutet, dass der Rest-EO-Gehalt in den endgültigen Knochenersatz-Proben S1 - S3 für 4,6x (S1; 460%), 4,9x (S2; 490%) oder sogar 21x (S3; 2.100%) höher war als in der Probe E1 (100%), die durch das EO-Sterilisationsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.
Das detaillierte Verfahren zur Durchführung der Studie wurde in Beispiel 9 beschrieben.
Die Untersuchung der Anwendungseigenschaften des Medizinprodukts während der Simulation des Operationsverfahrens
Die Proben des Medizinprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung wurden auf ihre Anwendungseigenschaften geprüft, um die endgültige Viskosität des resultierenden Gels zu beurteilen. Bei jeder Probe des getesteten Medizinprodukts-Blisters wurde die obere Ethylenoxid (EO)-durchlässige Folie geöffnet (entfernt), um das sterile Granulat der Knochenersatzzusammensetzung zu erreichen. Dann wurde eine sterile Kochsalzlösung in einer Menge von 1 mL pro 1 g der Probe (1:1, w/w) hinzugefügt. Die so erhaltene Mischung wurde mit einem sterilen Spatel einige Augenblicke lang gründlich gerührt, um eine viskose Paste zu erhalten. Die Paste darf keine Anzeichen von Synärese aufweisen, d. h. eine Abtrennung einer flüssigen Phase aus dem Knochenersatz-Granulat, sondern muss das Granulat in der pastösen und gelartigen Konsistenz halten.

In einem Kontrollexperiment wurde das analoge Medizinprodukt, das die gleiche Knochenersatzzusammensetzung enthielt, aber durch Gammabestrahlung als Sterilisationsmethode gewonnen wurde, ebenfalls nach demselben Verfahren getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt. Tabelle 6. Die Anwendungseigenschaften des Medizinprodukts aus der vorliegenden Erfindung.

Nr.	Beispiel der Knochenersatzzusammensetzung	Aussehen des Knochenersatzgranulats im Blister	Ergebnis der Anwendungseigenschaft
1	Beispiel 1, vor dem EO-Sterilisationsprozess	weiß-zu-weiß- Granulat^b	Geleepaste gebildet, keine Anzeichen von Synerese
2	Beispiel 1	weiß-zu-weiß- Granulat^b	Geleepaste gebildet, keine Anzeichen von Synerese
3	Beispiel 2, vor dem EO-Sterilisationsprozess	weiß-zu-weiß- Granulat^b	Geleepaste gebildet, keine Anzeichen von Synerese
4	Kontrolle, Beispiel 2	braunes bis dunkelbraunes Granulat^b	keine Geleepaste gebildet, intensive Synese aufgetreten
5	Beispiel 7	weiß-zu-weiß- Granulat^b	Geleepaste gebildet, keine Anzeichen von Synerese
6	Beispiel 8	weiß-zu-weiß- Granulat^b	Geleepaste gebildet, keine Anzeichen von Synerese

^a Die Proben der Knochenersatzmaterialien wurden mit einer sterilen Kochsalzlösung in der Menge von 1 ml pro 1 g der Probe (1:1, w/w) rekonstituiert. So wurde die erhaltene Mischung für einige Augenblicke gründlich mit einem sterilen Spatel gerührt. Die Konsistenz des so erhaltenen Gemisches wurde beobachtet und beschrieben.
^b Typisches Aussehen der Knochenersatzzusammensetzung innerhalb des Medizinprodukts mit Ethylenoxid (EO) gemäß der vorliegenden Erfindung sterilisiert.
^C Typisches Aussehen der Knochenersatzzusammensetzung innerhalb des durch Gammabestrahlung unter Standardbedingungen sterilisierten Medizinprodukts.

Diese einfache Untersuchung der Anwendungseigenschaften zeigte, dass die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, z. B. die Produkte aus den Beispielen 1, 7 und 8, zeigen, dass das Natriumhyaluronat (NaHY) in der Knochenersatzzusammensetzung nach der Ethylenoxid (EO)-Sterilisation vollständig erhalten blieb; siehe die Ergebnisse in Tabelle 5, Versuch 2 im Vergleich zu Versuch 1.
Im Gegensatz dazu verursachte die Gammabestrahlung als Sterilisationsmethode einen starken chemischen Abbau von NaHY, was zur Bildung des Knochenersatzmaterials in Form eines braunen bis dunkelbraunen Granulats führte, das nicht in der Lage war, die Gelee-Paste zu bilden. In diesem Fall trat eine Synärese auf und die flüssige Phase wurde vollständig von der Granulatphase des Knochenersatzmaterials getrennt; siehe Tabelle 5, Versuch 4 gegenüber Versuch 3.
Alle Chargen der Medizinprodukte aus der vorliegenden Erfindung zeigten eine gute Viskosität der resultierenden Geleepaste bei Zugabe der sterilen Kochsalzlösung zum Knochenersatzgranulat. Dies deutet direkt auf eine vollständige Erhaltung des ursprünglichen Molekulargewichts der polymeren, geradkettigen (nicht vernetzten) Hyaluronsäure und damit auf eine erhaltene Geliereigenschaft hin.
Im Gegensatz dazu erwies sich eine alternative Sterilisationstechnologie mittels Gammabestrahlung als völlig erfolglos für die Verarbeitung solcher Art von Medizinprodukten, die einen schweren chemischen Abbau der Hyaluronsäure verursachen, was mit einem Bruch der Polymerketten, der Entwicklung von Abbauprodukten mit einer braunen bis tiefbraunen Farbe und der wesentlichen Unfähigkeit einhergeht, bei der Rekonstitution mit einer sterilen Kochsalzlösung ein Gel zu bilden.
Verwendung der Knochenersatzzusammensetzung aus der vorliegenden Erfindung
Die Knochenersatzzusammensetzung, die in den Blisterpackungen des Medizinprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten ist, wird für die Knochenwiederaufbaubehandlungen verwendet, wobei sie die folgenden Schritte umfasst (Benutzerhandbuch):

a) öffnen einer oder mehrerer Ethylenoxid (EO)-permeable Folien, um das sterile Knochenersatzgranulatgemisch zu erreichen;
b) Zusatz von steriler Rekonstituierungslösung zum Inhalt der Blisterpackung im Gewichtsverhältnis (w/w): $w (Knochenersatzzusammensetzung) :w (SRS) = 1 : 1 bis 1:3$
wenn die steriler Rekonstituierungslösung aus Kochsalzlösung, Ringer-Lösung, Ringer-Laktatlösung oder sogar dem Blut des Patienten besteht; und
c) eine kurze Homogenisierung der so erhaltenen Mischung mit einem sterilen Spatel, der eine endgültige viskose Paste ergibt, die anschließend als Knochenersatzmaterial während der chirurgischen Eingriffe des Knochenaufbaus ein- und/oder aufgetragen wird.

Alternativ liegt das Medizinprodukt aus der vorliegenden Erfindung in Form eines Kits vor, das in einer Packung beides enthält:

a) ein steriles Medizinprodukt gemäß der oben genannten Beschreibung; und
b) ein Behälter mit genau gewichteter steriler Rekonstitutionslösung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Kochsalzlösung, Ringer-Lösung oder Ringer-Laktatlösung; die für die Vermischung mit der Knochenersatzzusammensetzung erforderlich ist, um eine viskose Paste zu erhalten, die für die Verwendung als Knochenersatz geeignet ist.

Das Medizinprodukt in Form von Blistern mit einer sterilen Knochenersatzzusammensetzung oder dem oben definierten Kit wird für Knochenaufbaubehandlungen in der Parodontologie, Implantologie, Mund-, Kiefer- und Schädelmaxillofazialchirurgie, Orthopädie, Onkologie sowie in der allgemeinen und plastischen Chirurgie verwendet.
Genauer gesagt werden das Medizinprodukt oder das oben beschriebene Kit für Knochenaufbaubehandlungen in der Parodontologie verwendet, bei denen die Indikationen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus intraossären Defekten (1-3 Wänden), Furkationsdefekten (Klasse I-II) und Reparatur von intraossäre Parodontaldefekte besteht.
Darüber hinaus werden das Medizinprodukt oder das oben genannte Kit für Knochenaufbaubehandlungen in der Implantologie und mund- und kraniomaxillofazialen Chirurgie verwendet, wobei die Indikationen aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus: Sinusbodenerhöhung, horizontale Augmentation, vertikale Augmentation, Kammerhaltung oder - augmentation, periimplantäre Defekte, Socket-Erhaltung, Knochendefekt-Augmentation, Augmentation von intraossäre und knöcherne Defekte sowie Ober- und Unterkieferchirurgie oder - wiederherstellung.
Beispiele
Allgemeine Informationen über die experimentellen Arbeiten
Alle Prozentwerte (%) der Materialien werden als Gewichtsanteile (% w/w) ausgedrückt. Der Begriff „Raumtemperatur“ bezieht sich auf einen Temperaturbereich von 20-25 °C. Die Mischgeschwindigkeit wird als Anzahl der Umdrehungen des Behälters pro Minute (rpm.) ausgedrückt. Der Begriff KBE bedeutet koloniebildende Einheiten, d.h. die Anzahl der lebensfähigen Zellen in einer bestimmten Probe.
Folgende Ausgangsrohstoffe wurden eingekauft:

(i) Biphasisches Calciumphosphat (alloplastische, synthetische Knochenersatzmaterialien):
- - Maxresorb^®-Granulat, synthetisches biphasisches Calciumphosphat, Partikelgröße 0,5-1,0 mm; Schüttdichte: 0,46-0,59 g/cm³; botiss biomaterials GmbH, Zossen (DE);
- - ReproBone^®-Granulat, synthetisches biphasisches Calciumphosphat, Partikelgröße 0,5-1,0 mm; Schüttdichte 0,56 g/cm3;Ceramisys Ltd, Sheffield (Großbritannien);
- - Straumann BoneCeramic Granules, 0,4-0,7 mm Partikelgröße; Institut Straumann AG, Basel (CH);
(ii) Reines Knochenmineral (Xenograft-Materialien):
- - Cerabone^®, gesintertes (1.200 °C) Rinderrind, Partikelgröße 0,5-1,0 mm; botiss biomaterials GmbH, Zossen (DE);
- - Geistlich Bio-Oss^® Spongiosa (cancellous) Granulat 0,2-1,0 mm; Geistlich Biomaterials GmbH, Baden-Baden (DE);
(iii) Aufbereitetem Knochen (Xenotransplantat- und Allotransplantatmaterialien):
- - MaxGraft^®-Granulat, Partikelgröße 0,5-2,0 mm; botiss biomaterials GmbH, Zossen (DE);und
(iv) Natriumhyaluronat (NaHY)
- - Hyaluronsäure P100, Natriumsalz, Pulver, Medizinproduktqualität; Contipro a.s., Dolni Dobrouč (CZ), oder alternativ von GfN Herstellung von naturextrakten GmbH, Straßburg (DE).

Als Ethylenoxid (EO)-permeable Folie für die Blisterversiegelung wurde die Folie Tyvek^®1073B, Du Pont de Nemours Inc., Wilmington, DE (US) eingesetzt. Alle anderen Ausgangsrohstoffe und Laborverbrauchsmaterialien wurden von einem lokalen Lieferanten bezogen.
Alle NMR-Experimente wurden im NMR-Servicezentrum am „Ruder Bošković“ Institut (IRB) in Zagreb, Kroatien, mit dem Bruker Avance 600 Spektrometer (600,13 MHz, ¹H) durchgeführt. Spektren von Proben in D₂O-Lösungen wurden in 5 mm NMR-Röhrchen bei 298 K mit einer breitbandig beobachteten Sonde (BBO; BB, ¹H; innere Spule abgestimmt auf ¹³C) mit einer eingebauten z- Gradient-Spule aufgenommen. Die verbleibende ¹H-Resonanz aus deuteriertem Lösungsmittel (D₂O bei 4,7 ppm) wird verwendet, um das ¹H-Spektrum zu referenzieren ^{· 1}H-Spektren bei einer Spektralbreite von 8.400 Hz und einer digitalen Auflösung von 0,51 Hz pro Punkt wurden mit 512 Scans gemessen. Die Lösungsmittelunterdrückung mittels f1-Vorsättigung mit Spoil gradient wurde in ¹H-Spektren von Proben mit Hyaluronat eingesetzt. Alle experimentellen Daten wurden mit null gefüllt, um die Anzahl der experimentellen Punkte zu verdoppeln, und dann mit automatischer Baseline-Korrektur korrigiert.
1H-NMR-DOSY-Spektren wurden mit einer ledbpgppr2s-Pulssequenz mit Vorsättigung zur Lösungsmittelunterdrückung, 160 Scans, 8,4 kHz Spektralbreite, 10 s Relaxationsverzögerung, 1 ms Spoil-Gradienten, 32 K Zeitbereich, 200 µs Gradientenerholung und 5 ms Wirbelstromverzögerung durchgeführt. Die Sonde liefert 58,0 G/cmA oder 5,80 G/mm bei 10 A Maximalleistung des Gradientenverstärkers (100 % Gradientenamplitude). Die Gradientenstärke wurde in 24 Schritten von 2 % bis 95 % variiert, während sowohl das kleine (5,0 ms) als auch das große (2,0 s) Delta konstant gehalten wurden
Beispiel 1. Herstellung des Medizinprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung mit Ethylenoxid (EO)-Sterilisationsverfahren

Eine Knochenersatzzusammensetzung (für 10 Blisterpackungen):

A.	89,29% w/w (10x 1.000,00 mg) biphasisches Calciumphosphat vom Typ Maxresorb^® Granulat, Partikelgröße 0,5-1,0 mm^a
B.	10,71% w/w (10x 120,00 mg) Natriumhyaluronat (NaHY) vom Typ Hyaluronsäure P100, Natriumsalz, Pulver^b

Gesamt: 100% w/w (10x 1.120,00 mg pro Einzelblister)

^a Produkt der botiss biomaterials GmbH, Zossen (DE); ^b Produkt von Contipro a.s., Dolni Dobrouč (CZ).
Herstellung: Die Blister (10x) wurden aus PETG-Folie Polyethylenterephthalat-Glykol-modifiziert (PETG) mit einer Dicke von 800 µm und Abmessungen: B × L × H = 50 × 80 × 20 mm vorgeformt. Zu diesen vorgeformten Blistern wurden die zuvor abgewogenen Wirkstoffe A (1.000,00 mg in jeder Blisterpackung) und B (120,00 mg in jeder Blisterpackung) zugegeben. Die gefüllten Blister wurden mit ausreichenden Stücken der EO-durchlässigen Folie Tyvek^® 1073B abgedeckt und mit einer Hochtemperatur-Versiegelungsmaschine entlang des Randes der Blister Öffnung versiegelt.
Zwei (2) gefüllte und versiegelte Blister wurden für die Prüfung der Anwendungseigenschaften als Kontrollproben, die nicht dem Sterilisationsprozess unterzogen wurden, beiseitegelegt; siehe Tabelle 6.
Der Rest der gefüllten und versiegelten Blister wurde in die Sterilisationskammer gegeben und den folgenden Sterilisationsphasen unterzogen:

a) Vorkonditionierung des Medizinprodukts in einer Kammer bei 45-55 °C und relativer Luftfeuchtigkeit (RH) von 45-80 % während 48 h;
b) Herstellen des Vakuums in der Sterilisationskammer auf etwa 100 mbar für 60 Minuten;
c) Behandlung mit gasförmigem EO (rein; Klasse 3,0; 99,9 %) bei einem Druck von 450 bis 750 mbar und 45 bis 55 °C für 24 h;
d) Evakuierung von EO aus der Sterilisationskammer durch Vakuumbehandlungen: 3x bei 300-700 mbar; gefolgt von 2x bei 150-850 mbar; wobei jede Vakuumbehandlung 180 Minuten dauert; und
e) Konditionierung sterilisierter Blisterpackungen bei 45-55 °C während 48 h bei >7 fachen Luftaustauschinnerhalb der Sterilisationskammer.

So hergestellte Medizinprodukte enthalten eine sterile Knochenersatzzusammensetzung in Granulatform, was nach den mikrobiologischen Tests gegen die internationale Norm ISO 11737-1:2018 nachgewiesen wurde; siehe Literaturhinweis 36. Die Anwendungseigenschaften des Produkts wurden gemäß dem Benutzerhandbuchprotokoll für die Herstellung einer Geleepaste mit steriler Kochsalzlösung (SS) getestet, siehe Tabelle 5.
Beispiel 2. Herstellung des Medizinprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung mit Gammabestrahlungssterilisationsverfahren. Das Kontrollbeispiel.

Eine Knochenersatzzusammensetzung (für 10 Blisterpackungen):

Gesamt: 100% w/w (10x 1.120,00 mg pro Einzelblister)

^a Produkt der botiss biomaterials GmbH, Zossen (DE); ^b Produkt von Contipro a.s., Dolni Dobrouč (CZ).
Herstellung: Die Blister (10x) wurden aus PETG-Folie Polyethylenterephthalat-Glykol-modifiziert (PETG) mit einer Dicke von 800 µm und Abmessungen: B × L × H = 50 × 80 × 20 mm vorgeformt. Zu diesen vorgeformten Blistern wurden die zuvor abgewogenen Wirkstoffe A (1.000,00 mg in jeder Blisterpackung) und B (120,00 mg in jeder Blisterpackung) zugegeben. Die gefüllten Blister wurden mit ausreichenden Stücken der EO-durchlässigen Folie Tyvek^® 1073B abgedeckt und mit einer Hochtemperatur-Versiegelungsmaschine entlang des Randes der Blister Öffnung versiegelt.
Zwei (2) gefüllte und versiegelte Blister wurden für die Prüfung der Anwendungseigenschaften als Kontrollproben, die nicht dem Sterilisationsprozess unterzogen wurden, beiseitegelegt; siehe Tabelle 6.
Der Rest der gefüllten und versiegelten Blister wurde in die Sterilisationskammer gegeben und dem Gamma-Bestrahlungssterilisationsprozess gemäß dem Standardarbeitsverfahren unterzogen.
So hergestellte Medizinprodukte enthalten eine sterile Knochenersatzzusammensetzung in Granulatform, was nach den mikrobiologischen Tests gegen die internationale Norm ISO 11737-1:2018 nachgewiesen wurde; siehe Literaturhinweis 36. Die Anwendungseigenschaften des Produkts wurden gemäß dem Benutzerhandbuchprotokoll für die Herstellung einer Geleepaste mit steriler Kochsalzlösung (SS) getestet; siehe Tabelle 6.
Beispiel 3. Herstellung des Medizinprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung mit Ethylenoxid (EO)-Sterilisationsverfahren

Eine Knochenersatzzusammensetzung (für 10 Blisterpackungen):

A.	93,46% w/w (10x 1.000,00 mg) reines Knochenmineral vom Typ Cerabone, ^® gesinterter (1.200 °C) Rinderknochen, Partikelgröße 0,5-1,0 mm^a
B.	6,54% w/w (10x 70,00 mg) Natriumhyaluronat (NaHY) vom Typ Hyaluronsäure P100, Natriumsalz’ Pulver^b

Gesamt: 100% w/w (10x 1.070,00 mg pro Einzelblister)

^a Produkt der botiss biomaterials GmbH, Zossen (DE); ^b Produkt von Contipro a.s., Dolni Dobrouč (CZ).
Herstellung: Die Blister (10x) wurden aus PETG-Folie Polyethylenterephthalat-Glykol-modifiziert (PETG) mit einer Dicke von 800 µm und Abmessungen: B × L × H = 50 × 80 × 20 mm vorgeformt. Zu diesen vorgeformten Blistern wurden die zuvor abgewogenen Wirkstoffe A (1.000,00 mg in jeder Blisterpackung) und B (70,00 mg in jeder Blisterpackung) zugegeben. Die gefüllten Blister wurden mit ausreichenden Stücken der EO-durchlässigen Folie Tyvek^® 1073B abgedeckt und mit einer Hochtemperatur-Versiegelungsmaschine entlang des Randes der Blister Öffnung versiegelt.
Die gefüllten und versiegelten Blister wurden in die Sterilisationskammer gegeben und folgenden Sterilisationsphasen unterzogen:

a) Vorkonditionierung des Medizinprodukts in einer Kammer bei 30-40 °C und relativer Luftfeuchtigkeit (RH) von 45-80 % für 48 h;
b) Herstellen des Vakuums in der Sterilisationskammer auf etwa 100 mbar für 60 Minuten;
c) Behandlung mit gasförmigem EO (rein; Klasse 3,0; 99,9 %) bei einem Druck von 450 bis 750 mbar und 30 bis 40 °C für 24 h;
d) Evakuierung von EO aus der Sterilisationskammer durch Vakuumbehandlungen: 6x bei 300-700 mbar; gefolgt von 4x bei 150-850 mbar; wobei jede Vakuumbehandlung 180 Minuten dauert; und
e) Konditionierung sterilisierter Blisterpackungen bei 30-40 °C für 72 h bei >7 fachen Luftaustausch innerhalb der Sterilisationskammer.

So hergestellte Medizinprodukte enthalten eine sterile Knochenersatzzusammensetzung in Granulatform, was nach den mikrobiologischen Tests gegen die internationale Norm ISO 11737-1:2018 nachgewiesen wurde; siehe Literaturhinweis 36. Die Anwendungseigenschaften des Produkts wurden gemäß dem Benutzerhandbuchprotokoll für die Herstellung einer Geleepaste mit steriler Kochsalzlösung (SS) getestet und die Geleepaste mit einer guten Konsistenz und Viskosität wurde sofort ohne Anzeichen von Synerese gebildet.
Beispiel 4. Herstellung des Medizinprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung mit Ethylenoxid (EO)-Sterilisationsverfahren

Eine Knochenersatzzusammensetzung (für 10 Blisterpackungen):

A.	90,91% w/w (10x 1.000,00 mg) verarbeiteter Knochen vom Typ MaxGraft^® Granulat, Partikelgröße 0,5-2,0 mm^a
B.	9,09% w/w (10x 100,00 mg) Natriumhyaluronat (NaHY) vom Typ Hyaluronsäure P100, Natriumsalz, Pulver^b

Gesamt: 100% w/w (10x 1.100,00 mg pro Einzelblister)

^a Produkt der botiss biomaterials GmbH, Zossen (DE); ^b Produkt von Contipro a.s., Dolni Dobrouč (CZ).
Herstellung: Die Blister (10x) wurden aus PETG-Folie Polyethylenterephthalat-Glykol-modifiziert (PETG) mit einer Dicke von 800 µm und Abmessungen: B × L × H = 50 × 80 × 20 mm vorgeformt. Zu diesen vorgeformten Blistern wurden die zuvor abgewogenen Wirkstoffe A (pro 1.000,00 mg in jeder Blisterpackung) und B (100,00 mg in jeder Blisterpackung) zugegeben. Die gefüllten Blister wurden mit ausreichenden Stücken der EO-durchlässigen Folie Tyvek^® 1073B abgedeckt und mit einer Hochtemperatur-Versiegelungsmaschine entlang des Randes der Blister Öffnung versiegelt.
Die gefüllten und versiegelten Blister wurden in die Sterilisationskammer gegeben und folgenden Sterilisationsphasen unterzogen:

a) Vorkonditionierung des Medizinprodukts in einer Kammer bei 45-55 °C und relativer Luftfeuchtigkeit (RH) von 45-80 % für 10 h;
b) Herstellen des Vakuums in der Sterilisationskammer bei etwa 100 mbar während 8 Minuten;
c) Behandlung mit gasförmigem EO (rein; Typ 3,0; 99,9 %) bei einem Druck von 450 bis 750 mbar und 45 bis 55 °C für 4 h;
d) Evakuierung von EO aus der Sterilisationskammer durch Vakuumbehandlungen: 3x bei 300-700 mbar; gefolgt von 2x bei 150-850 mbar; wobei jede Vakuumbehandlung 45 Minuten dauert; und
e) Konditionierung sterilisierter Blisterpackungen bei 45-55 °C für 22 h bei >7 fachen Luftaustausch innerhalb der Sterilisationskammer.

So hergestellte Medizinprodukte enthalten eine sterile Knochenersatzzusammensetzung in Granulatform, was nach den mikrobiologischen Tests gegen die internationale Norm ISO 11737-1:2018 nachgewiesen wurde; siehe Literaturhinweis 36. Die Anwendungseigenschaften des Produkts wurden gemäß dem Benutzerhandbuchprotokoll für die Herstellung einer Geleepaste mit steriler Kochsalzlösung (SS) getestet und die Geleepaste mit einer guten Konsistenz und Viskosität wurde sofort ohne Anzeichen von Synerese gebildet.
Beispiel 5. Herstellung des Medizinprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung mit Ethylenoxid (EO)-Sterilisationsverfahren

Eine Knochenersatzzusammensetzung (für 10 Blisterpackungen):

A1.	44.64% w/w (10x 500,00 mg) reines Knochenmineral vom Typ Cerabone^®, gesinterter (1.200 °C) Rinderknochen, Partikelgröße 0,5-1,0 mm^a
A2.	44.64% w/w (10x 500.00 mg) verarbeiteter Knochen vom Typ MaxGraft^® Granulat, Partikelgröße 0,5-2,0 mm^a

B.	10,72% w/w (10x 120,00 mg) Natriumhyaluronat (NaHY) vom Typ Hyaluronsäure P100, Natriumsalz, Pulver^b

Gesamt: 100% w/w (10x 1.120,00 mg pro Einzelblister)

^a Produkt der botiss biomaterials GmbH, Zossen (DE); ^b Produkt von Contipro a.s., Dolni Dobrouč (CZ).
Herstellung: Die Blister (10x) wurden aus PETG-Folie Polyethylenterephthalat-Glykol-modifiziert (PETG) mit einer Dicke von 800 µm und Abmessungen: B × L × H = 50 × 80 × 20 mm vorgeformt. Zu so vorgeformten Blistern wurden die zuvor gewichteten Wirkstoffe A1 (pro 500,00 mg), A2 (pro 500,00 mg in jeder Blisterpackung) und B (pro 120,00 mg in jeder Blisterpackung) zugegeben. Die gefüllten Blister wurden mit ausreichenden Stücken der EO-durchlässigen Folie Tyvek^® 1073B abgedeckt und mit einer Hochtemperatur-Versiegelungsmaschine entlang des Randes des Blister Öffnung versiegelt.
Die gefüllten und versiegelten Blister wurden in die Sterilisationskammer gegeben und folgenden Sterilisationsphasen unterzogen:

a) Vorkonditionierung des Medizinprodukts in einer Kammer bei 45-55 °C und relativer Luftfeuchtigkeit (RH) von 45-80 % für 72 h;
b) Herstellen des Vakuums in der Sterilisationskammer auf etwa 100 mbar für 60 Minuten;
c) Behandlung mit gasförmigem EO (rein; Klasse 3,0; 99,9 %) bei einem Druck von 450 bis 750 mbar und 45 bis 55 °C für 5 h;
d) Evakuierung von EO aus der Sterilisationskammer durch Vakuumbehandlungen: 3x bei 300-700 mbar; gefolgt von 2x bei 150-850 mbar; wobei jede Vakuumbehandlung 180 Minuten dauert; und
e) Konditionierung sterilisierter Blisterpackungen bei 45-55 °C für 48 h bei >7 fachen Luftaustausch innerhalb der Sterilisationskammer.

So hergestellte Medizinprodukte enthalten eine sterile Knochenersatzzusammensetzung in Granulatform, was nach den mikrobiologischen Tests gegen die internationale Norm ISO 11737-1:2018 nachgewiesen wurde; siehe Literaturhinweis 36. Die Anwendungseigenschaften des Produkts wurden gemäß dem Benutzerhandbuchprotokoll für die Herstellung einer Geleepaste mit steriler Kochsalzlösung (SS) getestet und die Geleepaste mit einer guten Konsistenz und Viskosität wurde sofort ohne Anzeichen von Synerese gebildet.
Beispiel 6. Herstellung des Medizinprodukts in einem Doppel Blister Form gemäß der vorliegenden Erfindung mit Ethylenoxid (EO)-Sterilisationsverfahren

Eine Knochenersatzzusammensetzung (100 g Skala):

A.	70,00% w/w (70,00 g) biphasisches Calciumphosphat vom Typ ReproBone^® Granulat^a, Partikelgröße 0,5-1,0 mm; Schüttdichte 0,56 g/cm3
B.	5,00% w/w (5,00 g) Natriumhyaluronat (NaHY) vom Typ Hyaluronsäure P100, Natriumsalz, Pulver^b
C.	25,00% w/w (25,00 g) Kollagen, Rinderkollagen Typ I^c

Gesamt: 100% w/w (100.00 g)

^a Produkt von Ceramisys Ltd, Sheffield (UK); ^b Produkt von Contipro a.s., Dolni Dobrouč (CZ); ^c Produkt von Symatese, Chaponost (FR).
Vorbereitung:
Die gewogenen Wirkstoffe A-C wurden in den V-Mixer gegeben und 15 Minuten lang bei 12 U/min homogenisiert. Das so gewonnene Knochenersatzmaterialgranulat wurde als Ausgangsmaterial für die Befüllung der vorgeformten Blister verwendet.
Die Blister wurden aus einer mit Polyethylenterephthalatglykol modifizierten PETG-Folie mit einer Dicke von 800 µm und den folgenden Abmessungen vorgeformt: b × 1 × h = 50 × 80 × 20 mm.
Jedem Blister wurden je 1.500 mg der Knochenersatzzusammensetzung hinzugefügt, und die gefüllten Blister wurden mit geeigneten Stücken der EO-durchlässigen Folie Tyvek^® 1073B abgedeckt und mit Hilfe einer Hochtemperatursiegelmaschine entlang des Siegeldeckels des Blisters versiegelt.
Die so erhaltenen gefüllten und versiegelten Blister werden in einen anderen (zweiten) Blister gelegt und dieser wird anschließend mit einer weiteren EO-durchlässigen Folie versiegelt. Die Materialien des zweiten Blisters und der EO-durchlässigen Folie sind die gleichen wie bei der Herstellung des ersten Blisters. Das Ergebnis ist ein Primärblister innerhalb der Sekundärblisterverpackung, der die Sterilität des in den Primärblister eingebrachten Knochenersatzmaterialgranulats maximal bewahrt.
Die gefüllten und versiegelten Blister wurden in die Sterilisationskammer gegeben und folgenden Sterilisationsphasen unterzogen:

a) Vorkonditionierung des Medizinprodukts in einer Kammer bei 45-55 °C und relativer Luftfeuchtigkeit (RH) von 45-80 % für 10 h;
b) Herstellen des Vakuums in der Sterilisationskammer auf etwa 100 mbar für 60 Minuten;
c) Behandlung mit gasförmigem EO (rein; Klasse 3,0; 99,9 %) bei einem Druck von 450 bis 750 mbar und 45 bis 55 °C für 5 h;
d) Evakuierung von EO aus der Sterilisationskammer durch Vakuumbehandlungen: 3x bei 300-700 mbar; gefolgt von 2x bei 150-850 mbar; wobei jede Vakuumbehandlung 60 Minuten dauert; und
e) Konditionierung sterilisierter Blisterpackungen bei 45-55 °C für 24 h bei >7 fachen Luftaustausch innerhalb der Sterilisationskammer.

Dieser Prozess führt zu einem im Wesentlichen sterilen Produkt, das eine sterile Knochenersatzzusammensetzung, in granulierter Form, innerhalb der primären Blisterpackung enthält, obwohl die Ausgangsrohstoffe, Zutaten A-C, von üblicher mikrobiologischer (MB) Belastung waren, wie sie von den Lieferanten gekauft wurden.
Die endgültige Verblisterung des erfindungsgemäßen Medizinprodukts in ihrer weiteren, doppelt verblisterten und stilisierten Form ist in schematisch dargestellt.
So hergestellte Medizinprodukte enthalten eine sterile Knochenersatzzusammensetzung in Granulatform, was nach den mikrobiologischen Tests gegen die internationale Norm ISO 11737-1:2018 nachgewiesen wurde; siehe Literaturhinweis 36. Die Anwendungseigenschaften des Produkts wurden gemäß dem Benutzerhandbuchprotokoll für die Herstellung einer Geleepaste mit steriler Kochsalzlösung (SS) getestet und die Geleepaste mit einer guten Konsistenz und Viskosität wurde sofort ohne Anzeichen von Synerese gebildet.
Beispiel 7. Herstellung des Medizinprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung mit Ethylenoxid (EO)-Sterilisationsverfahren

Eine Knochenersatzzusammensetzung (für 100 Blisterpackungen):

A.	95,41% w/w (100x 520,00 mg) biphasisches Calciumphosphat vom Typ Maxresorb^® Granulat, Partikelgröße 0,5-1,0 mm^a
B.	4,59% w/w (100x 25,00 mg) Natriumhyaluronat (NaHY) vom Typ Hyaluronsäure P100, Natriumsalz, Pulver^b

Gesamt: 100% w/w (10x 545,00 mg pro Einzelne Blisterpackung)

^a Produkt der botiss biomaterials GmbH, Zossen (DE); ^b Produkt von Contipro a.s., Dolní Dobrouč (CZ).
Herstellung: Die Blister (100x) wurden aus PETG-Folie Polyethylenterephthalat-Glykol-modifiziert (PETG) mit einer Dicke von 800 µm und Abmessungen: B × L × H = 50 × 80 × 20 mm vorgeformt. Zu so vorgeformten Blistern wurden die zuvor gewichteten Wirkstoffe A (pro 520,00 mg in jeder Blisterpackung) und B (pro 25,00 mg in jeder Blisterpackung) zugegeben. Die gefüllten Blister wurden mit ausreichenden Stücken der EO-durchlässigen Folie Tyvek^® 1073B abgedeckt und mit einer Hochtemperatur-Versiegelungsmaschine entlang des Randes der Blister Öffnung versiegelt.
Die gefüllten und versiegelten Blister wurden in die Sterilisationskammer gegeben und folgenden Sterilisationsphasen unterzogen:

a) Vorkonditionierung des Medizinprodukts in einer Kammer bei 45-55 °C und relativer Luftfeuchtigkeit (RH) von 45-80 % für 48 h;
b) Herstellen des Vakuums in der Sterilisationskammer auf etwa 100 mbar während 60 Minuten;
c) Behandlung mit gasförmigem EO (rein; Klasse 3,0; 99,9 %) bei einem Druck von 450 bis 750 mbar und 45 bis 55 °C für 24 h;
a) Evakuierung von EO aus der Sterilisationskammer durch Vakuumbehandlungen: 3x bei 300-700 mbar; gefolgt von 2x bei 150-850 mbar; wobei jede Vakuumbehandlung 180 Minuten dauert; und
d) Konditionierung sterilisierter Blisterpackungen bei 45-55 °C für 48 h bei >7 fachen Luftaustausch innerhalb der Sterilisationskammer.

So hergestellte Medizinprodukte enthalten eine sterile Knochenersatzzusammensetzung in Granulatform, was nach den mikrobiologischen Tests gegen die internationale Norm ISO 11737-1:2018 nachgewiesen wurde; siehe Literaturhinweis 36. Die Anwendungseigenschaften des Produkts wurden gemäß dem Benutzerhandbuchprotokoll für die Herstellung einer Geleepaste mit steriler Kochsalzlösung (SS) getestet und die Geleepaste mit einer guten Konsistenz und Viskosität wurde sofort ohne Anzeichen von Synerese gebildet; siehe Tabelle 6.
Beispiel 8. Herstellung des Medizinprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung mit Ethylenoxid (EO)-Sterilisationsverfahren

Eine Knochenersatzzusammensetzung (für 100 Blisterpackungen):

A.	91,23% w/w (100x 520,00 mg) biphasisches Calciumphosphat vom Typ Maxresorb^® Granulat, Partikelgröße 0,5-1,0 mm^a
B.	8,77% w/w (100x 50,00 mg) Natriumhyaluronat (NaHY) vom Typ Hyaluronsäure P100, Natriumsalz, Pulver^b

Gesamt: 100% w/w (10x 570,00 mg pro Einzelne Blisterpackung)

^b Produkt der botiss biomaterials GmbH, Zossen (DE); ^b Produkt von Contipro a.s., Dolní Dobrouč (CZ).
Herstellung: Die Blister (100x) wurden aus PETG-Folie Polyethylenterephthalat-Glykol-modifiziert (PETG) mit einer Dicke von 800 µm und Abmessungen: B × L × H = 50 × 80 × 20 mm vorgeformt. Zu so vorgeformten Blistern wurden die zuvor gewichteten Wirkstoffe A (pro 520,00 mg in jeder Blisterpackung) und B (pro 50,00 mg in jeder Blisterpackung) zugegeben. Die gefüllten Blister wurden mit ausreichenden Stücken der EO-durchlässigen Folie Tyvek^® 1073B abgedeckt und mit einer Hochtemperatur-Versiegelungsmaschine entlang des Randes der Blister Öffnung versiegelt.
Die gefüllten und versiegelten Blister wurden in die Sterilisationskammer gegeben und folgenden Sterilisationsphasen unterzogen:

a) Vorkonditionierung des Medizinprodukts in einer Kammer bei 45-55 °C und relativer Luftfeuchtigkeit (RH) von 45-80 % während 48 h;
b) Herstellen des Vakuums in der Sterilisationskammer auf etwa 100 mbar während 60 Minuten;
c) Behandlung mit gasförmigem EO (rein; Klasse 3,0; 99,9 %) bei einem Druck von 450 bis 750 mbar und 45 bis 55 °C während 24 h;
b) (d)Evakuierung von EO aus der Sterilisationskammer durch Vakuumbehandlungen: 3x bei 300-700 mbar; geschleudert von, 2x bei 150-850 mbar; wobei jede Vakuumbehandlung 180 Minuten dauert; und
d) Konditionierung sterilisierter Blisterpackungen bei 45-55 °C für 48 h bei >7 fachen Luftaustausch innerhalb der Sterilisationskammer.

So hergestellte Medizinprodukte enthalten eine sterile Knochenersatzzusammensetzung in Granulatform, was nach den mikrobiologischen Tests gegen die internationale Norm ISO 11737-1:2018 nachgewiesen wurde; siehe Literaturhinweis 36. Die Anwendungseigenschaften des Produkts wurden gemäß dem Benutzerhandbuchprotokoll für die Herstellung einer Geleepaste mit steriler Kochsalzlösung (SS) getestet und die Geleepaste mit einer guten Konsistenz und Viskosität wurde sofort ohne Anzeichen von Synerese gebildet; siehe Tabelle 6.
Beispiel 9. Untersuchung der Bildung unerwünschter Verunreinigungen während der Ethylenoxid (EO)-Sterilisation des Medizinprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung
Die Untersuchung der Bildung unerwünschter Verunreinigungen während der EO-Sterilisation wurde an den folgenden Proben (S1-3, E1 und ST) durchgeführt:

i) S1: Produkt aus Beispiel 1, aber mit EO unter Standard-Sterilisationsbedingungen sterilisiert;
(ii) S2: Produkt aus Beispiel 3, jedoch mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen sterilisiert;
iii) S3: Produkt aus Beispiel 4, jedoch mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen sterilisiert;
iv) E1: Produkt aus Beispiel 1; und
v) ST: Bestände an reinem Natriumhyaluronat.

Die Standardsterilisation mit EO, die als Stand der Technik (klassische) Bedingungen für die EO-Sterilisation angesehen werden kann, wurde in der Abteilung für Transfusionsmedizin in Zagreb, Kroatien unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

a) Vorkonditionierung des Medizinprodukts in einer Kammer bei 45 °C und relativer Luftfeuchtigkeit (RH) von 50 % für 60 Minuten;
b) Feststellung des Vakuums in der Sterilisationskammer bei etwa 200 mbar für 30 Minuten;
c) Behandlung mit gasförmigem EO (rein; Klasse 3,0; 99,9 %) bei einem Druck von 2,5 bis 3,0 bar und 50 °C während 300 Minuten;
d) Evakuierung von EO aus der Sterilisationskammer durch Vakuumbehandlungen: 6x bei 300 mbar; wobei jede Vakuumbehandlung 180 Minuten dauert; und
e) Konditionierung sterilisierter Blisterpackungen bei 45-55 °C für 48 h bei >7 fachen Luftaustausch innerhalb der Sterilisationskammer;

Die so erhaltenen Proben S1-S3, E1 und ST wurden 1H-NMR-Experimenten unterzogen, um zu untersuchen, welche Art von möglichen Verunreinigungen tatsächlich gebildet werden.
Vorbereitung der Proben für NMR-Experimente
Die Proben wurden aus dem sterilen Zustand in hermetisch verschlossenen Boxen entnommen und in Glasfläschchen mit Plastikdeckel gefüllt. Nach zwei Wochen wurden ca. 20 mg jeder Probe gleichzeitig in ein entsprechendes NMR-Röhrchen gegeben und in 500 1 D2O (99,9 % D, Merck Uvasol) durch zweistündiges Mischen im Ultraschallbad bei 60 C aufgelöst.
Die 1H-NMR-Experimente wurden im NMR-Servicezentrum am „Ruder Bošković“ Institut (IRB) in Zagreb, Kroatien, mit einem Bruker Avance 600-Spektrometer (600,13 MHz, 1H) unter den im Abschnitt Allgemeine Informationen zur experimentellen Arbeit beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
Die entsprechenden ¹H-NMR-Spektren der Kontrollsubstanzen sind in den Abbildungen dargestellt: reines EG ( ), DI ( ) und PEG 400 ( ) sowie deren Mischung mit Natriumhyaluronat-Standard (NaHY; ). Die Ergebnisse der ¹H-NMR-Spektren zeigen, dass:

(i) EG ist gekennzeichnet durch ein Signal von HOCH₂CH₂OH-Protonen bei etwa 3,55-3,58 ppm, siehe ;
(ii) PEG 400 ist gekennzeichnet durch ein Signal von HO(CH₂CH₂O)_nH (n= 7-9) Protonen bei etwa 3,66-3,70 ppm, siehe ;
(iii) DI ist durch ein Signal von CH₂CH₂-Protonen bei etwa 3,66-3,70 gekennzeichnet, siehe ;

Zusätzlich wurden die Proben S1-S3, E1 und ST unter den gleichen Bedingungen ¹H-NMR-Experimenten unterzogen, die die entsprechenden ¹H-NMR-Spektren ergaben für:

i) S1: Produkt aus Beispiel 1, aber mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen sterilisiert, siehe ;
ii) S2: Produkt aus Beispiel 3, aber mit EO unter Standard-Sterilisationsbedingungen sterilisiert, siehe ;
iii) S3: Produkt aus Beispiel 4, jedoch mit EO unter Standard-Sterilisationsbedingungen sterilisiert, siehe ;
iv) E1: Produkt aus Beispiel 1, siehe ; und für die Kontrolle
v) ST: Standard für reines Natriumhyaluronat, siehe .

Vergleichende Darstellung von ¹H-NMR-Spektren von:

i) EG, PEG 400, DI und S1 sind in dargestellt; und
ii) Proben S1-S3, E1 und ST (Natriumhyaluronat) mit dem entsprechenden Restgehalt an toxischer 1,2-Ethylenglykol (EG)-Verunreinigung in .

Ein weiterer Nachweis für die Identität des scharfen Signals bei 3,5 ppm in allen Proben der Knochenersatzzusammensetzung, die dem EO-Sterilisationsprozess ausgesetzt waren, wurde durch diffusionsbestellte NMR-Spektrometrie (1H DOSY NMR) mit der Probe von Natriumhyaluronat (NaHY) erzielt, die einer EO-Sterilisation unter Standardsterilisationsbedingungen ausgesetzt wurde. Die Zuordnung eines scharfen Signals bei 3,5 ppm Methylenprotonen aus 1,2-Ethylenglykol (EG; HOCH2CH2OH) wird hier dadurch bestätigt, dass es im Vergleich zu anderen Signalen einen sehr unterschiedlichen Diffusionskoeffizienten aufweist und daher nicht zum selben Polymermolekül von NaHY gehört, siehe . Die entsprechenden Diffusionskoeffizienten aus ¹H DOSY NMR, die in dieser Studie ermittelt wurden, sind in Tabelle 5 aufgeführt.
Zusätzlich ist in ein 1H-NMR-Spektrum von Deuteriumoxid (D₂O) als Kontrollspektrum für alle in den als Lösungsmittel aufgezeichneten NMR-Spektren der Proben dargestellt.
Die Ergebnisse des quantitativen Gehalts an 1,2-Ethylenglykol (EG) in jeder untersuchten Probe (S1-3, E1) wurden in Tabelle 4 dargestellt.
Beispiel 10. Die Untersuchung der Anwendungseigenschaften des Medizinprodukts während der Simulation des Operationsverfahrens
Die Proben des erfindungsgemäßen Medizinprodukts wurden auf ihre Anwendungseigenschaften geprüft, um die Endviskosität des resultierenden Gels zu beurteilen. Jede Probe der getesteten Medizinprodukte-Blister [aus: Beispiel 1, vor und nach der EO-Sterilisation; Beispiel 2, vor und nach der Sterilisation durch Gammabestrahlung; und Beispiele 7 und 8 nach der EO-Sterilisation wurde durch Entfernen der oberen ethylenoxiddurchlässigen Folie geöffnet, um das sterile Granulat der Knochenersatzmaterialzusammensetzung zu erreichen. Dann wurde eine sterile Kochsalzlösung in einer Menge von 1 mL pro 1 g der Probe (1:1, w/w) hinzugefügt. Die so erhaltene Mischung wurde mit einem sterilen Spatel einige Augenblicke lang gründlich gerührt, um eine viskose Paste zu erhalten. Die Paste darf keine Anzeichen von Synärese aufweisen, was bedeutet, dass sich eine flüssige Phase aus dem Knochenersatzgranulat herauslöst, sondern muss das Granulat in der pastösen und gelartigen Konsistenz halten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt.
Schlussfolgerung
Die vorliegende Erfindung löst das technische Problem der Herstellung eines sterilen Medizinprodukts auf der Grundlage einer granulierten Zusammensetzung aus pulverförmigem, sehr hochmolekularem und nicht vernetztem Natriumhyaluronat (NaHY) von 1,4-2,5 MDa und biphasischem Kalziumphosphat und/oder reinem Knochenmineral und/oder aufbereitetem Knochen in einem Granulat und einer unsterilen Form, das in Blister gefüllt und mit einer ethylenoxiddurchlässigen Folie versiegelt wird. Die so erhaltene Knochenersatzmaterialzusammensetzung in versiegelten Blistern wird dem EO-Sterilisationsprozess unter speziellen Bedingungen der EO-Druck-, Temperatur- und Zeitbehandlung unterzogen, was ein steriles Medizinprodukt ergibt, das die Knochenersatzzusammensetzung in einer sterilen Form enthält, mit:

i. vollständig konserviertem Natriumhyaluronat (NaHY), dass die wünschenswerten Anwendungseigenschaften (Gelierung) der vorliegenden Knochenersatzzusammensetzung ermöglicht; und,
ii. deutlich verringertem Restgehalt an unerwünschter und toxischer Verunreinigung 1,2-Ethylenglykol (EG), das aus EO gebildet wird und bei der normalen EO-Vakuum-Eliminierung, die routinemäßig während des EO-Sterilisationsprozesses solcher Knochenersatzprodukte durchgeführt wird, nicht aus dem Medizinprodukt entfernt werden kann.

Nach dem Stand der Technik würde der Fachmann die EO-Sterilisationstechnologie für die Herstellung eines sterilen Medizinprodukts dieser Art anwenden. Alle gängigen EO-Sterilisationsverfahren würden jedoch zu einem drastisch (460-2,100%) erhöhten Restgehalt an unerwünschten und toxischen Verunreinigungen wie 1,2-Ethylenglykol (EG) führen. Letzteres würde ein erhebliches Gesundheitsrisiko für den Patienten darstellen, dem ein solches Medizinprodukt verabreicht wird. Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem auf eine neue und erfinderische Weise, wie dargestellt.
Auf diese Weise ermöglichen die Bedingungen der EO-Sterilisation gemäß der vorliegenden Erfindung die Herstellung eines Medizinprodukts der Klasse III, welches den Anforderungen der Vorschriften in Bezug auf Sterilität, nachfolgende Endotoxizität sowie Zytotoxizität entspricht und nicht zur Bildung von schädlichen und toxischen Nebenprodukten einschließlich des toxischen 1,2-Ethylenglykols (EG) führt, dessen Bildung im Vergleich zu solchen Verfahren aus dem Stand der Technik vernachlässigbar ist und in für den menschlichen Gebrauch unschädlichen Mengen erfolgt.
Industrielle Anwendbarkeit
Das Medizinprodukt und die Knochenersatzmaterialzusammensetzung der vorliegenden Erfindung werden in der Chirurgie zur Behandlung verschiedener Knochendefekte eingesetzt. Daher ist die industrielle Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung offensichtlich.
Bezugszeichenliste

1: der vorgeformte Blister aus einer geeigneten Kunststofffolie, z. B. aus mit Polyethylenterephthalat-Glykol modifiziertem (PETG) mit einer Dicke von 800 µm.
2: die Ethylenoxid (EO)-durchlässige Folie aus fasergesponnenem Polyethylen hoher Dichte (fs-HDPE); sie gewährleistet: (a) das Eindringen von gasförmigem EO in den versiegelten Blister während des Sterilisationsprozesses; auf diese Weise ermöglicht sie die Sterilisation der Knochenersatzmaterialzusammensetzung in Granulatform, bestehend aus den Wirkstoffen A-C, innerhalb des versiegelten Blisters, die dem Blister vor dem Versiegeln in im Wesentlichen unsteriler Form zugesetzt wurden; und, (b) auch einen dichten Verschluss der Knochenersatzzusammensetzung innerhalb des Blisters und damit eine langfristige Erhaltung ihrer Sterilität.
3: die Knochenersatzzusammensetzung in Granulatform; zeigt sie in einer stilisierten Form.
EG: 1,2-Ethylenglykol
EO: Ethylenoxid
DI: 1,4-Dioxan
PEG 400: Polyethylenglykol 400
ST: Natriumhyaluronat (NaHY)
S1: Probe des Produkts aus Beispiel 1, jedoch mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen sterilisiert.
S2: Probe des Produkts aus Beispiel 3, jedoch mit EO unter Standardsterilisationsbedingungen sterilisiert.
S3: Probe des Produkts aus Beispiel 4, jedoch mit EO unter Standard-Sterilisationsbedingungen sterilisiert.
E1: Probe des Produkts aus Beispiel 1, erhalten durch das EO-Sterilisationsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung.
1H-NMR: 1H-Kernspinresonanz (Spektrometrie)
DOSY: diffusionsgeordnete NMR-Spektrometrie
H2O(SE): Oberflächengleichgewichtsfeuchtigkeit (Wasser), die auf den Bestandteilen der Knochenersatzmaterialzusammensetzung vorhanden ist.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 3544643 B1 [0006]
US 2008/0281431 A1 [0008]
KR 20090112967 A [0012]
KR 101304949 B1 [0014, 0025]
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WO 2017/189733 A1 [0018]
WO 2008/077257 A1 [0019]
EP 1127581 A1 [0020]
DE 202016102375 U1 [0022]
EP 1715900 B1 [0024]
WO 2009/131323 A2 [0025]
WO 0134210 A1 [0030]

Claims

Ein steriles Medizinprodukt als Knochenersatzzusammensetzung in granulierter Form aus den Bestandteilen A, B und gegebenenfalls C, die sind: - Bestandteil A - eines der Knochenersatzmaterialien ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: biphasischem Calciumphosphat, reinem Knochenmineral, aufbereitetem Knochen oder einer Kombination aus einem oder mehreren Bestandteilen biphasisches Calciumphosphat, reines Knochenmineral und aufbereitetem Knochen, alle in Form von Granulat, 70-96% w/w, - Bestandteil B - Natriumhyaluronat, abgeleitet aus linearkettiger Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von 1,4-2,5 MDa, die nicht vernetzt ist, 4-25% w/w, - Bestandteil C - eine oder mehrere optionale Zutaten, 0-25% w/w, wenn das genannte Medizinprodukt in einem Verfahren gewonnen wird, das aus folgenden Schritten besteht: (i) Dosierung der zuvor abgewogenen Wirkstoffe A-C oder ihrer zuvor hergestellten Mischung in die vorgeformte Blisterpackung, (ii) Versiegelung des gefüllten Blisters mit der Ethylenoxid permeablen Folie und (iii) Das Sterilisationsverfahren mit EO, das die Sterilisation von im Wesentlichen unsterilen Ausgangszutaten A-C oder deren zuvor hergestellter Mischung in granulierter Form ermöglicht, wobei der Sterilisationsprozess in Schritt (iii) einen reduzierten Restgehalt an unerwünschtem toxischem 1,2-Ethylenglykol <EG> Verunreinigung im Medizinendprodukt ergibt, der durch die Durchführung der folgenden Prozessunterschritte (a) -(e) erreicht wird: a) Vorkonditionierung des Medizinprodukts in einer Kammer bei 30-60 °C und relativer Luftfeuchtigkeit <RH> 45-80% für 10-72 h, b) Das Vakuum in der Sterilisationskammer bei etwa 100 mbar für 8-60 Minuten einstellen, c) Behandlung mit gasförmigem EO bei einem Druck von 450 bis 750 mbar und 30 bis 60 °C für 4 bis 24 h, d) Evakuierung von EO aus der Sterilisationskammer durch Vakuumbehandlungen: 3-6x bei etwa 300-700 mbar, gefolgt von 2-4x bei 150-850 mbar, wobei jede Vakuumbehandlung 30-180 Minuten dauert, und e) Konditionierung sterilisierter Blisterpackungen bei 30-60 °C für 22-72 h bei >7-fachen Luftaustausch innerhalb der Sterilisationskammer.
Steriles Medizinprodukt als Knochenersatzzusammensetzung in granulierter Form nach Anspruch 1, wobei die Teilschritte (a)-(e) innerhalb des Sterilisationsverfahrens unter folgenden Bedingungen durchgeführt werden: a) bei 45-55 °C und relativer Luftfeuchtigkeit <RH> 45-80% für 10-48 h, b) bei etwa 100 mbar für 8-60 Minuten, c) bei einem Druck von 450 bis 750 mbar und 45 bis 55 °C für 4 bis 5 h, d) 3x bei 300-700 mbar; gefolgt von 2x bei 150-850 mbar, wobei jede Vakuumbehandlung 45-165 Minuten dauert, und e) bei 45-55 °C für 22-54 h.
Steriles Medizinprodukt als Knochenersatzzusammensetzung in granulierter Form nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das ausgewählte biphasische Calciumphosphat besteht, aus: (a) Dekacalciumhexaphosphatdihydroxid [Ca₁₀<PO₄>₆<OH>₂; Hydroxylapatit] und (b) Beta-Tricalciumphosphat [β-Ca₃<PO₄>₂; β-TCP], in einem relativen Gewichtsverhältnis <w/w> von: $w<a>:w<b> = 10 : 1 bis 1:10$
die ferner gekennzeichnet ist durch: eine Partikelgröße: 0,1-2,0 mm, eine Schüttdichte: 0,3-1,2 g/cm3, eine durchschnittliche Porengröße: 50-1.000 µm und eine Porosität von: 40-90%.
Steriles Medizinprodukt als Knochenersatzzusammensetzung in granulierter Form nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das in dem Medizinprodukt verwendete reine Knochenmineral ein deproteinisierter Knochen ist, der aus spongiösem oder kortikalem Rinder-, Schweine-, Pferde- oder menschlichem Knochen durch die folgenden Schritte gewonnen wird: (a) Mahlen, Sieben und Kalzinieren bei 800-1.300 °C, oder (b) Mahlen, Sieben, Behandlung mit einer konzentrierten Alkalilösung <NaOH>, Waschen mit entmineralisiertem Wasser, Sintern bei 300-800 °C, Behandlung mit kochendem Ethanol und Sterilisieren, und besteht aus im Wesentlichen reinem Hydroxylapatit, das gekennzeichnet ist durch: eine Teilchengröße: 0,1-2,0 mm, eine Schüttdichte: 0,3-1,2 g/cm3, eine durchschnittliche Porengröße: 50-1.000 µm und eine Porosität: 40-90%.
Das sterile Medizinprodukt als Knochenersatzzusammensetzung in granulierter Form nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der verarbeitete Knochen durch Mahlen, Lösungsmittelextraktion und Dehydratisierung, Siebung und Dampfsterilisation erhalten wird, das zu einem im Wesentlichen sterilen Produkt führt, das gekennzeichnet ist durch: die Zusammensetzung aus 60-80% mineralischer Knochenphase und 20-40% organischer Knochenphase, eine Partikelgröße: 0,1-2,0 mm, eine Schüttdichte: 0,3-1,2 g/cm3, eine durchschnittliche Porengröße: 50-1.000 µm und eine Porosität: 40-90%.
Das sterile Medizinprodukt als Knochenersatzzusammensetzung in granulierter Form nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die optionalen Bestandteile ausgewählt sind aus: demineralisierte Knochenmatrix, die von Rinder-, Schweine-, Pferde- oder menschlichen Knochen stammt; Kollagen, das von Rindern, Schweinen oder Pferden stammt; Gelatine, die von Rindern, Schweinen oder Pferden stammt; Seidenfibroin <SF>; Chitosan; Chondroitinsulfat; Natriumalginat; Polymilchsäure <PLA>; Polyglykolsäure <PGA>; Copolymer aus Milchsäure und Glykolsäure <PLGA>; Polyvinylalkohol <PVA>; Polycaprolacton <PCL>; Cellulose <CE>; Methylcellulose <MC>; 2-Hydroxyethylcellulose <HEC>; Hydroxypropylmethylcellulose <HPMC>; Natriumcarboxymethylcellulose <NaCMC>; oder Mischungen dieser Stoffe.
Das sterile Medizinprodukt als Knochenersatzzusammensetzung in granulierter Form nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der verwendete Blister aus einer oder mehreren Kunststofffolien ausgewählt ist, aus der Gruppe bestehend aus: Polyethylen <PE>, Polypropylen <PP>, Polystyrol <PS>, Polyvinylchlorid <PVC>, Polyvinylidendichlorid <PVDC>, Polymethylacrylat <PMA>, Polyethylacrylat <PEA>, Polybutylacrylat <PBA>, Polymethylmethacrylat <PMMA>, Polyethylmethacrylat <PEMA>, Polybutylmethacrylat <PBMA>, Polyethylenterephthalat <PET> und mit Glykol modifiziertes Polyethylenterephthalat <PETG>.
Das sterile Medizinprodukt als Knochenersatzzusammensetzung in granulierter Form nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ethylenoxid <EO>-durchlässige Folie in Anspruch 1, Schritt (ii), aus der Kunststofffolie hergestellt ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus fasergesponnenem Polyethylen hoher Dichte <fs-HDPE> besteht, das gekennzeichnet ist durch: eine mikrobielle Barriereeigenschaft gemäß ASTM F1608 von mindestens 5,0 log-Reduktionswert <LRV> und Dicke >100 µm.
Steriles Medizinprodukt als Knochenersatzzusammensetzung in granulierter Form nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Herstellungsschritt (i) in Anspruch 1 die Dosierung einer genau gewichteten oder volumetrisch definierten Menge einer zuvor homogenisierten Mischung der Wirkstoffe A-C in den vorgeformten Blister umfasst.
Verwendung des Medizinprodukts nach einem der Ansprüche 1 bis 9 für knochenaufbauende Behandlungen, wobei die folgenden Schritte durchgeführt werden: (a) Öffnen einer oder mehrerer für Ethylenoxid <EO> durchlässiger Folien, um das sterile Granulat der Knochenersatzmaterialzusammensetzung zu erreichen, (b) Zugabe von steriler Rekonstitutionslösung <SRL> zum Inhalt des Blisters im Gewichtsverhältnis <w/w>: $w < Knochenersatzzzusammensetzung>:w<SRL>1:1 bis = 1 : 1 bis 1:3$
wobei die SRL aus Kochsalzlösung, Ringerlösung, Ringerlactatlösung oder Patientenblut besteht, und, (c) eine kurze Homogenisierung der so erhaltenen Mischung mit einem sterilen Spatel, die eine viskose Paste ergibt, die anschließend als Knochenersatzmaterial während der chirurgischen Verfahren zum Knochenaufbau verwendet wird.
Ein Kit, bestehend aus: (a) einem sterilen Medizinprodukt nach einem der Ansprüche 1-9 und, (b) einem Behälter mit genau gewichteter steriler Rekonstitutionslösung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Kochsalzlösung, Ringerlösung oder Ringerlactatlösung, die zum Mischen mit der Knochenersatzmaterialzusammensetzung im Medizinprodukt erforderlich ist, um eine viskose Paste zu ergeben, die für die Verwendung als Knochenersatzstoff geeignet ist.
Verwendung des Medizinprodukts nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder des in Anspruch 11 definierten Kits für Knochenaufbaubehandlungen in der Parodontologie, Implantologie, Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie, Orthopädie, Onkologie sowie in der allgemeinen und plastischen Chirurgie.
Verwendung des Medizinprodukts nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder des in Anspruch 11 definierten Kits für knochenaufbauende Behandlungen in der Parodontologie, wobei die Indikationen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: intraossäre Defekte <1-3 Wände>, Furkationsdefekte <Klasse I-II> und Reparatur von intraossären parodontalen Defekten.
Verwendung des Medizinprodukts nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder des in Anspruch 11 definierten Kits für knochenaufbauende Behandlungen in der Implantologie und der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie, wobei die Indikationen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Sinusbodenelevation, horizontale Augmentation, vertikale Augmentation, Kieferkammerhaltung oder -augmentation, periimplantäre Defekte, Socket Preservation, Knochendefektaugmentation, Augmentation intraossärer und knöcherner Defekte und Ober- und Unterkieferchirurgie oder -wiederherstellung.