TW202104585A

TW202104585A - 短乳酸桿菌ProGA28及其代謝物用於治療或改善睡眠障礙之用途

Info

Publication number: TW202104585A
Application number: TW108126440A
Authority: TW
Inventors: 陳威仁; 高炳煌; 陳柏安; 魏鈺珊
Original assignee: 生展生物科技股份有限公司
Priority date: 2019-07-25
Filing date: 2019-07-25
Publication date: 2021-02-01
Also published as: US11510949B2; US20210023148A1; JP2021019580A; TWI731377B; JP7008108B2

Abstract

本發明係揭露一種新穎短乳酸桿菌（Lactobacillus brevis ）ProGA28，寄存於台灣財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910910，寄存日為2019年6月27日。該新穎短乳酸桿菌ProGA2之代謝物係具有提升睡眠質量之能力，能夠有效地減少快速動眼睡眠階段之時間、降低入睡次數，並增加整體睡眠時間及延長單次入睡時間，且能夠使睡眠中腦波之慢波比例提高，而達到治療或改善睡眠障礙及相關併發症，如焦慮症、免疫系統疾病之功效。

Description

短乳酸桿菌ProGA28及其代謝物用於治療或改善睡眠障礙之用途

本發明係有關於一種益生菌及其代謝物之用途，特別係指一種短乳酸桿菌ProGA28及其代謝物用於治療或改善睡眠障礙之用途。

按，根據研究指出，一般成年人平均之睡眠時間約為7～8個小時，當有如睡眠時間過短、難以入眠、睡眠會無故中斷等情形發生時，即是臨床上所謂之睡眠障礙。

睡眠障礙不僅會造成精神不佳、注意力不集中、免疫系統受損等症狀外，更可能會對於健康產生直接性之不良影響，例如會造成血壓上升、提高急性心臟病發作之機會、增加罹癌機率、消化系統障礙、精神疾病之發生等。惟，造成睡眠障礙之原因眾多，例如壓力過大、焦慮、睡眠呼吸終止症、作息習慣改變等，因此，於臨床上要治療睡眠障礙並非一件簡單的事情。

雖然先前有研究認為口服γ-氨基丁酸係能夠抑制中樞神經之神經傳導物質，使大腦能夠放鬆而達到安定大腦、改善睡眠之功效，惟，目前動物實驗證實服用純的γ-氨基丁酸對於睡眠品質改善效果有限。

本發明之主要目的係在於提供一種短乳酸桿菌（Lactobacillus brevis ）ProGA28及其代謝物之用途，具體來說，該短乳酸桿菌ProGA28代謝物係具有提升睡眠質量之能力，能夠有效地減少快速動眼睡眠階段之時間、降低入睡次數，並增加整體睡眠時間及延長單次入睡時間，且能夠使睡眠中腦波之慢波比例提高，而達到治療或改善睡眠障礙及相關併發症，如焦慮症、免疫系統疾病之功效。

緣是，為能達成上述目的，本發明係揭露一種將短乳酸桿菌ProGA28，其係寄存於台灣財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910910，寄存日為2019年6月27日；並寄存於德國國家菌種保藏中心，寄存編號為DSM 33167，寄存日為2019年5月28日。

其中，該短乳酸桿菌ProGA28之16S rRNA序列係如SEQ ID No.1所示。

其中，該短乳酸桿菌ProGA28，其係分離自天然發酵醬菜。

於本發明之一實施例中，該短乳酸桿菌ProGA28於一含有味精之培養基中進行發酵後，移除菌體，得到該短乳酸桿菌ProGA28之代謝物，其係具有用於治療或改善睡眠障礙之用途。

意即，藉由投予一有效量之短乳酸桿菌ProGA28、其代謝物或是含有上述任一物質之組合物至一罹患睡眠障礙或是睡眠品質不佳之患者時，能夠有效地提高該患者之睡眠品質、增長睡眠時間，達到治療或改善睡眠障礙之功效。

於本發明之另一實施例中係揭露該短乳酸桿菌ProGA28或其代謝物係能夠用於製備預防睡眠障礙引起病症之組合物之用途。由於本發明所揭短乳酸桿菌ProGA28或其代謝物係具有改善睡眠品質及穩定腦波之能力，因此投予一有效量之短乳酸桿菌ProGA28、其代謝物、或是含有上述任一物質之組合物至一個體，係能夠使該個體之睡眠品質維持穩定或是提升，以達到預防睡眠障礙所引起之疾病的功效。

更進一步來說，於本發明之實施例中，該組合物係得為一醫藥組合物、一營養補充品或一食品。舉例來說，當該組合物為一醫藥組合物時，該組合物係至少包含有一有效量之短乳酸桿菌ProGA28或/及其代謝物、以及一藥學上能接受之載體；當該組合物為一營養補充品時，該組合物係至少包含有一有效量之短乳酸桿菌ProGA28或/及其代謝物、以及一食品加工上能接受之載體。

此外，該組合物係能夠依據需求而被製備為各種型態，例如錠劑、液體、粉劑等。

於本發明之實施例中，該短乳酸桿菌ProGA28於人體之投予劑量至少為1.6mg/kg。

本發明所揭新穎短乳酸桿菌ProGA28其16S rRNA序列係如SEQ ID No.1所示，經BLAST比對NCBI Nucleotide collection (nr/nt)資料庫得知其係屬於短乳酸桿菌（Lactobacillus brevis ）之新穎菌株，寄存於台灣財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910910，寄存日期為：2019年6月27日，並且寄存於德國國家菌種保藏中心，寄存編號為DSM 33167，寄存日為2019年5月28日。

更進一步來說，該新穎短乳酸桿菌ProGA28係分離自天然發酵醬菜，而得以MRS培養基培養。如第一圖所示，該新穎短乳酸桿菌ProGA28為格蘭氏陽性菌，在顯微鏡下觀察為單一或串聯短桿菌，可在有氧或無氧下於30℃或37℃生長，較佳為30℃；如第二圖所示，在以MRS為培養基時，可耐受8%MSG，仍具生長與生產GABA能力；以含8~12% MSG、1~3%葡萄糖、1.5~3%酵母抽出物、0.01~0.08%硫酸鎂之培養基培養時， pH範圍為pH4~pH7，30~37℃培養2~4天，GABA含量約60~110 mg/mL。

本發明所揭新穎短乳酸桿菌ProGA28之代謝物係指將該新穎短乳酸桿菌ProGA28置於添加味精之培養基中，進行發酵培養後，移除菌體所得者。

以下，將茲舉若干實例，並搭配圖式，對本發明所揭技術特徵及其功效作更詳細說明如後。

下列實例中所使用之試驗品投予劑量，係以人體一天食用劑量為8.3mg/kg為基礎，依據體表面積模式的係數為6.2換算出大鼠標準餵食劑量：52mg/kg，並將此設定下列實例中所投予之一倍劑量（1.0x）。

下列實例中所使用之動物為原發性高血壓大鼠（下稱SHR大鼠），其具有睡眠容易中斷、片段化，以及睡眠時交感神經活性高於正常大鼠之特性。

下列實例中所謂之睡眠階段包含有以下三階段：清醒（Awake，AW）；安靜睡眠（Quiet sleep，QS）：相當於人的非快速動眼睡眠（NREM，non-Rapid Eye Movement sleep）與弔詭睡眠（Paradoxical sleep， PS）：相當於人的快速動眼睡眠（REM，Rapid Eye Movement sleep）。

下列實例中所使用之分析技術說明如下：

腦電波與肌電波之頻域分析：將腦波訊號擷取每段16 秒（1024點）稱為一個分析時間窗（windows 或epoch），並與下一個時間窗之前8 秒（50%）重疊來作分析。利用快速傅立葉轉換估算功率密度頻譜（power spectral density），評估不同頻帶腦波活性強弱。

睡眠結構分析與判斷方法：利用腦波平均頻譜功率之閾值（TMPF），與肌電波之功率作為睡眠狀態之判斷基準，具體來說，當腦波頻率大於肌電波之閾值（TEMG），則定義為清醒階段；若腦波頻率較低，且合併較低肌電波功率EMG，則定義為安靜睡眠階段；當腦波頻率較高且合併EMG 也較小時，則定義為奇異睡眠階段。

睡眠時間估算：針對不同需求設定不同時間窗進行運算分析，再由專業人士進行手動細微調整使睡眠分期之分析達到正確率95% 以上。搭配睡眠分期之定義，相關參數可獲得大鼠清醒與安眠時間（QS+PS）與估算時間內進入睡眠之次數和單次進入睡眠平均長度（mins/number），用以評估動物睡眠之穩定度。

而各頻帶腦波界定如下，alpha：10-13 Hz；beta：13-32 Hz；theta：6-10 Hz；delta：0.5-4 Hz，以上腦波參數再經過標準化的比例分配，可以評估大鼠睡眠品質。

實例一：製備新穎短乳酸桿菌ProGA28代謝物

取一本發明所揭新穎短乳酸桿菌ProGA28，置於MRS培養基於30～37℃下培養8～16小時，進行活化及增殖程序後，將之培養於添加8~12% MSG、1~3%葡萄糖、1.5~3%酵母抽出物、0.01~0.08%硫酸鎂之MRS培養基中，於pH範圍為pH4~pH7、溫度30～37℃下進行發酵48-72小時，使GABA產量達110mg/ml以上後，以活性碳處理，將菌體及活性碳移除，進行濃縮及噴霧乾燥，得到之產物即為本發明所揭益生菌代謝物，並經檢測得知其內含約有20％γ-氨基丁酸。

實例二：新穎短乳酸桿菌ProGA28代謝物之分析結果

取市售短乳酸桿菌，以實例一所揭方法製備出市售短乳酸桿菌之代謝物，分別以薄層層析法及HPLC分析市售短乳酸桿菌之代謝物與市售短乳酸桿菌之代謝物，結果如第三圖及第四圖所示，其中，薄層層析法以體積比為15/1/1之n-BuOH/AcOH/水展開，再以ninhydrin顯色；HPLC分析條件為C8 column，5μm/4.6x250 mm，以0.1% TFA沖提20分鐘，分析波長214 nm。

由第三圖與第四圖之結果可知，以本發明所揭新穎短乳酸桿菌ProGA28發酵培養所得之代謝物係與市售短乳酸桿菌進行發酵所得之代謝物不相同，自此可推知本發明所揭新穎短乳酸桿菌ProGA28雖然屬於短乳酸桿菌，但是其為新穎菌株，具有不同於現有短乳酸桿菌菌株之特性。

實例三：動物試驗（一）

取複數隻9週齡雄性SHR大鼠，飼養於光照週期為12：12小時、室溫維持於22±2℃、濕度為40～70％之生長環境；而各SHR大鼠需於試驗前10天進行無線生理感測器之埋設手術，以記錄後續腦波、肌電波、心電波、三軸向加速度訊號。

將經之SHR大鼠隨機分組，分別投予A或B試驗品，而投予劑量分別為：0.5x倍及1.0x倍，其中：：

A試驗品：以實例一所述方法製備之短乳酸桿菌ProGA28代謝物；

B試驗品：短乳酸桿菌ProGA28代謝物+20%Tryptophan；

而各試驗品係溶於飲用水中，以管餵方式投予，投予時間為光亮前一小時，並於光亮開始時記錄各組大鼠之生理資訊，以作為睡眠評估之依據。

此外，另以純γ-氨基丁酸投予大鼠，亦如同上述說明，檢測和紀錄大鼠之生理資訊，以作為睡眠評估之依據。

實例四：睡眠質量評估結果

以於各試驗品餵食後之24小時中的睡眠質與量作為睡眠評估之範圍：

睡眠的量：包含睡眠與清醒的時間總時間、入睡的次數和各睡眠階段之平均時間（duration）等指標，並針對各睡眠階段進行量之評估；而將餵食飲水之睡眠定位為100%，比較餵食試驗品後在各睡眠階段之差異。

睡眠的質：針對安靜睡眠之腦波，由頻率快到慢（beta: 13-32 Hz；alpha: 10-13 Hz; theta: 6-10 Hz; delta: 0.5-4 Hz）進行成分比例高低之分析，作為睡眠品質的指標。睡眠中慢波比例越高表示睡眠品質越好。

請參第五圖，其係顯示投予純的γ-氨基丁酸係對於大鼠睡眠質量增加沒有幫助，並且無法增加睡眠時間；而如第六圖至第十三圖、表一之結果可知：投予A試驗品0.5x劑量時，係呈現促進SHR大鼠進入安靜睡眠階段之效果，並減少弔詭睡眠時間，且提昇整體睡眠時間、降低入睡次數、延長單次入睡時間，而腦波上也有明顯提升慢波睡眠之比例；而雖然投予B試驗品於1.0x劑量時有些微增加安靜睡眠階段之時間，但是對於睡眠穩定和自律神經活性皆無影響。

比對第三圖至第十三圖之結果可知，單獨投予純的GABA對於睡眠品質之提升是沒有幫助的，而投予本發明所揭揭益生菌代謝物（A試驗品）確實具有提高睡眠品質並且促進睡眠之功效。

表一：安眠效果綜合測試結果

試驗品	睡眠時間	睡眠穩定度	睡眠腦波	安眠效果
A	促進	促進	促進	促進
B	效果不顯著	效果不顯著	效果不顯著	效果不顯著

實例五：動物實驗（二）

本實例將檢測A試驗品（即本發明所揭短乳酸桿菌ProGA28之代謝物）於不同劑量：0.2x、0.5x、1.0x、2.0x和5.0x之安眠效果，結果如第十四圖至第十六圖、下表二所示。

由表二結果可知，投予本發明所揭短乳酸桿菌ProGA28之代謝物於最低劑量(0.2x）就能夠使大鼠清醒時間降低，並提昇睡眠總時數與睡眠品質。由數據顯示，本發明所揭短乳酸桿菌ProGA28代謝物之較佳投予劑量應為0.2x~1.0x。

再者，以另一組大鼠進行餵食時間點變化之試驗，意即於提早餵食12小時（於睡眠紀錄前12小時光暗開始之前），於該提早時間點投予A試驗品、劑量為0.5x，檢測該組大鼠之睡眠品質與腦波變化，結果如第十五及十六圖所示。

由第十五圖及第十六圖之結果可知，餵食時間改變係不會影響大鼠之睡眠階段，但是由腦波之變化可知，將投予時間提早係能夠有效地提昇睡眠中慢波的比例（Delta:0.5-4 Hz）。

表二：不同劑量對於睡眠品質之影響

A試驗品劑量	睡眠時間	睡眠穩定度	睡眠腦波	安眠效果
0.2x	促進	促進	促進	促進
0.5x	促進	促進	促進	促進
1.0x	促進	促進	促進	促進
2.0x	促進	促進	促進	促進
5.0x	促進	促進	促進	促進

藉由上述各實例之結果可知，藉由本發明所揭短乳酸桿菌ProGA28發培養之代謝物確實具有提升睡眠品質及促進睡眠之能力，並且，必須要加以強調者，此所謂提昇睡眠品質，係指本發明所揭短乳酸桿菌ProGA28代謝物不僅能夠延長個體之睡眠時間，更可以增加腦中慢波比例，達到提高睡眠品質之功效。據此可知，本發明所揭短乳酸桿菌ProGA28及其代謝物係用以作為改善或治療睡眠障礙或其相關疾病之組合物之有效成份，而組合物係能依據需求被製備為醫藥組合物、營養補充品或食品，並且其中所含之劑量係以低劑量為佳，如以60公斤成年人來說，劑量約為至少1.6mg/kg。

無

第一圖係顯示本發明所揭新穎短乳酸桿菌ProGA28格蘭氏染色為陽性之結果。第二圖係顯示本發明所揭新穎短乳酸桿菌ProGA28於不同酸鹼度之培養基中，其生長GABA之能力。第三圖係為本發明所揭新穎短乳酸桿菌ProGA28代謝物與市售短乳酸桿菌經薄層層析法分析之結果。第四圖係為本發明所揭新穎短乳酸桿菌ProGA28代謝物與市售短乳酸桿菌經HPLC分析之結果第五圖係顯示投予純γ-氨基丁酸後，分別於三個睡眠階段中，紀錄單次階段總時間、次數與長度之結果。第六圖係為餵食0.5x劑量A試驗品後，分別於三個睡眠階段中，紀錄單次階段總時間、次數與長度之結果。第七圖係以進行餵食飲水後之睡眠作為100%之標準化評估單位，分別比較三個睡眠階段和總體睡眠(QS+PS) 於餵食0.5x劑量A試驗品後之改變百分比(%)。第八圖係為餵食1.0x劑量A試驗品後，分別於三個睡眠階段中，紀錄單次階段總時間、次數與長度之結果。第九圖係以進行餵食飲水後之睡眠作為100%之標準化評估單位，分別比較三個睡眠階段和總體睡眠(QS+PS) 於餵食1.0x劑量A試驗品後之改變百分比(%)。第十圖為餵食0.5x劑量B試驗品後，分別於三個睡眠階段中，紀錄單次階段總時間、次數與長度之結果。第十一圖係以進行餵食飲水後之睡眠作為100%之標準化評估單位，分別比較三個睡眠階段和總體睡眠(QS+PS) 於餵食0.5x劑量B試驗品後之改變百分比(%)。第十二圖為餵食1.0x劑量B試驗品後，分別於三個睡眠階段中，紀錄單次階段總時間、次數與長度之結果。第十三圖係以進行餵食飲水後之睡眠作為100%之標準化評估單位，分別比較三個睡眠階段和總體睡眠(QS+PS) 於餵食1.0x劑量B試驗品後之改變百分比(%)。第十四圖係為A試驗品以不同劑量投予大鼠後，分別比較各睡眠階段之變化結果。第十五圖比較提早餵食0.5x劑量A試驗品後，三個睡眠階段分別於單次階段總時間、次數、與長度之變化。第十六圖係為分別比較不同劑量A試驗品於記錄前12小時提早餵食與餵食飲水控組比較之結果，包含於安靜睡眠時之腦波於24 小時、光亮期、光暗期之四種腦波頻帶（beta: 13-32 Hz；alpha: 10-13 Hz; theta: 6-10 Hz; delta: 0.5-4 Hz）於腦波所占比例，其中，數值以平均數±標準誤方式呈現。

TW中華民國台灣財團法人食品工業發展研究所 2019/06/27 BCRC 910910

DE德國德國國家菌種保藏中心 2019/05/28 DSM 33167

序列表 >110> 生展生物科技股份有限公司 >120> 短乳酸桿菌ProGA28及其代謝物用於治療或改善睡眠障礙之用途 >130> none >160> 1 >170> PatentIn version 3.5 >210> 1 >211> 1518 >212> DNA >213> Lactobacillus brevis >400> 1 gacgaacgct ggcggcatgc ctaatacatg caagtcgaac gagcttccgt tgaatgacgt 60 gcttgcactg atttcaacaa tgaagcgagt ggcgaactgg tgagtaacac gtgggaaatc 120 tgcccagaag caggggataa cacttggaaa caggtgctaa taccgtataa caacaaaatc 180 cgcatggatt ttgtttgaaa ggtggcttcg gctatcactt ctggatgatc ccgcggcgta 240 ttagttagtt ggtgaggtaa aggcccacca agacgatgat acgtagccga cctgagaggg 300 taatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga 360 atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaatgccgc gtgagtgaag aagggtttcg 420 gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac acctttgaga gtaactgttc aagggttgac 480 ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 540 gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat 600 gtgaaagcct tcggcttaac cggagaagtg catcggaaac tgggagactt gagtgcagaa 660 gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg gaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt 720 ggcgaaggcg gctgtctagt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac 780 aggattagat accctggtag tccatgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tggagggttt 840 ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag 900 gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960 gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcttct gccaatctta gagataagac 1020 gttcccttcg gggacagaat gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1080 tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattatc agttgccagc attcagttgg 1140 gcactctggt gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc 1200 atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cggtacaacg agtcgcgaag 1260 tcgtgaggct aagctaatct cttaaagccg ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg 1320 cctacatgaa gttggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc 1380 cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg taacacccaa agccggtgag 1440 ataaccttcg ggagtcagcc gtctaaggtg ggacagatga ttagggtgaa gtcgtaacaa 1500 ggtagccgta ggagaacc 1518

Claims

一種新穎短乳酸桿菌（Lactobacillus brevis）ProGA28，其寄存編號為BCRC910910，寄存日為2019年6月27日，寄存於台灣財團法人食品工業發展研究所，並寄存於德國國家菌種保藏中心，寄存編號為DSM 33167，寄存日為2019年5月28日。。
依據申請專利範圍第1項所述新穎短乳酸桿菌ProGA28，其16S rRNA序列係如SEQ ID No.1所示。
依據申請專利範圍第1項所述新穎短乳酸桿菌ProGA28，其係分離自一天然發酵醬菜。
一種如申請專利範圍第1、2或3項所述新穎短乳酸桿菌ProGA28之代謝物用以作為治療或改善睡眠障礙之組合物之用途，其中，該新穎短乳酸桿菌ProGA28之代謝物係由該新穎短乳酸桿菌ProGA28於一含有味精之培養基中進行發酵後，移除菌體所得者。
一種如申請專利範圍第1、2或3項所述新穎短乳酸桿菌ProGA28之代謝物用以預防睡眠障礙引起病症之用途，其中，新穎短乳酸桿菌ProGA28之代謝物係由該新穎短乳酸桿菌ProGA28於一含有味精之培養基中進行發酵後，移除菌體所得者。
依據申請專利範圍第2或3項所述用途，其中，該新穎短乳酸桿菌ProGA28之代謝物之劑量為至少1.6mg/kg。