TW202103691A

TW202103691A - 口內用藥物及其用於治療或延緩口腔潛在惡性病變的用途

Info

Publication number: TW202103691A
Application number: TW109121933A
Authority: TW
Inventors: 袁行修; 汪硯雲; 吳寶珠; 蕭綾儀
Original assignee: 高雄醫學大學
Priority date: 2019-07-01
Filing date: 2020-06-29
Publication date: 2021-02-01

Abstract

本發明提供一種將龍膽紫(Gentian Violet)或苯扎氯銨(Benzalkonium Chloride)製備成用於治療或延緩口腔潛在惡性病變(oral potentially malignant disorder，OPMD)之口內用藥物，及其在治療或延緩口腔潛在惡性病變上的用途。

Description

口內用藥物及其用於治療或延緩口腔潛在惡性病變的用途

本發明關於一種口內用藥物及其用於治療或延緩口腔潛在惡性病變的用途，特別是可以讓口腔癌前期患者在不需要避免侵入性治療的情況下，治療或延緩口腔潛在惡性病變的口內用藥物及其用途。

口腔癌為台灣十大癌症死因第五位，對於男性而言更是十大癌症死亡原因的第四位，更重要的是在南台灣的口腔癌發生率更是高居全國第一。口腔癌更是少數有癌前口腔潛在惡性病變(oral potentially malignant disorder，OPMD)的癌症，且根據統計具有癌前病變患者進展惡化為口腔癌的風險高。雖然政府提供免費檢測口腔癌前病變之服務，但高危險群的民眾常因恐懼感而降低了篩檢意願，使得口腔癌的篩檢率僅有25%。過去的研究指出約16%至62%的鱗狀上皮細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)來自於口腔白斑(leukoplakia)，即為普遍熟知的口腔潛在惡性病變。

目前針對懷疑是口腔潛在惡性病變的患者，除了常規目視診斷外，口腔病理切片是目前用來確認病灶最有效的方法，而外科手術、雷射及放射療法則是治療口腔潛在惡性病變最常見的方式，但術後除了造成疤痕而影響美觀外，亦會影響咀嚼、發音、甚至是語言的功能。

因此，需要為患者提供一個較簡易便利的治療口腔潛在惡性病變的新穎治療方式，同時也希望研發出可及早治療口腔潛在惡性病變的藥物，以降低口腔潛在惡性病變進展惡化為口腔癌的風險以及提高患者接受治療的意願。

本案申請人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨的精神，終構思出本案，能夠克服先前技術的不足，以下為本案的簡要說明。

本發明的龍膽紫(Gentian Violet)及苯扎氯銨(Benzalkonium Chloride)的新劑型藥物為口內用藥物，施用於口內有口腔潛在惡性病變的位置，可使口腔潛在惡性病變患者避免侵入性(手術切除、雷射、放射性)治療，以免於承受術後的副作用。除此之外，本發明龍膽紫及苯扎氯銨的新劑型藥物為第一個針對治療口腔潛在惡性病變所開發的口腔塗抹藥物，可達到降低口腔癌發生率和死亡率的目標。此外，新劑型藥物塗抹的方便性可提高病患接受治療的意願，不僅可有效達到治療口腔潛在惡性病變目的，同時也可降低復發或惡化進展為口腔癌的機率。

因此，本發明提供一種用於治療或延緩口腔潛在惡性病變(oral potentially malignant disorder，OPMD)的口內用藥物，包括佔該口內用藥物總重2~5% w/w的苯扎氯銨(Benzalkonium Chloride)。

本發明另提出一種用於治療或延緩口腔潛在惡性病變(oral potentially malignant disorder，OPMD)的口內用藥物，包括佔該口內用藥物總重3~10% w/w的龍膽紫(Gentian Violet)。

本發明另提出一種化合物用於製備治療或延緩口腔潛在惡性病變(oral potentially malignant disorder，OPMD)之藥物的用途，其中該化合物為一治療有效量的苯扎氯銨(Benzalkonium Chloride)。

本發明另提出一種化合物用於製備治療或延緩口腔潛在惡性病變(oral potentially malignant disorder，OPMD)之藥物的用途，其中該化合物為一治療有效量的龍膽紫(Gentian Violet)。

本發明的上述目的及優點在參閱以下詳細說明及附隨圖式之後對那些所屬技術領域中具有通常知識者將變得更立即地顯而易見。

第1圖為本發明龍膽紫(GV)對HOK細胞、DOK細胞及SAS細胞有效性的結果圖。

第2圖為本發明以龍膽紫(GV)處理DOK細胞後的細胞週期分佈圖及其統計圖，其中**P<0.005，***P<0.0005。

第3圖為本發明龍膽紫(GV)對DOK細胞進行PI/Annexin V雙染色法的結果圖，其中**P<0.005。

第4圖為本發明以龍膽紫(GV)處理DOK細胞後，細胞凋亡指標基因的表現結果圖，其中β-Actin為內控制組。

第5(a)圖為本發明以龍膽紫(GV)處理DOK細胞後，DCFDA染色結果圖，其中*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005。

第5(b)圖為本發明以龍膽紫(GV)處理DOK細胞後，DHE染色結果圖，其中**P<0.005，***P<0.0005。

第6圖為本發明龍膽紫(GV)與抗氧化劑NAC對DOK細胞存活率的影響結果圖，其中CTL為控制組，***P<0.0005。

第7圖為本發明以龍膽紫(GV)與抗氧化劑NAC處理DOK細胞後的細胞週期分佈圖及其統計圖，其中CTL為控制組，***P<0.0005。

第8(a)圖為本發明以龍膽紫(GV)處理DOK細胞後，p-p53(S15)、p53、p-NFκB及NFκB基因表現的結果圖，其中β-Actin為內控制組。

第8(b)圖為本發明以龍膽紫(GV)處理DOK細胞後，p-p53(S15)與p-NFκB基因表現的比較圖，其中CTL為控制組，*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005。

第9(a)圖為本發明以龍膽紫(GV)與p53抑制劑PFT-α處理DOK細胞後，DOK細胞存活率的結果圖，其中CTL為控制組，**P<0.005，***P<0.0005。

第9(b)圖為本發明以龍膽紫(GV)與p53抑制劑PFT-α處理DOK細胞後，DOK細胞停在sub-G1期的比較結果圖，其中CTL為控制組，**P<0.005，***P<0.0005。

第10(a)圖為本發明以龍膽紫(GV)與NFκB抑制劑BAY 11-7085處理DOK細胞後，DOK細胞存活率的結果圖，其中CTL為控制組，**P<0.005，***P<0.0005。

第10(b)圖為本發明以龍膽紫(GV)與NFκB抑制劑BAY 11-7085處理DOK細胞後，DOK細胞停在sub-G1期的比較結果圖，其中CTL為控制組，**P<0.005，***P<0.0005。

第11(a)圖為本發明的倉鼠頰囊在不同處理條件下，倉鼠頰囊的臨床外觀圖及其切片的H&E染色圖。

第11(b)圖為本發明龍膽紫(GV)口內膏製劑對頰囊腫瘤體積影響的結果圖，其中*P<0.05，***P<0.0005。

第12(a)圖為本發明的C組與D組的p-p53(S15)免疫組織化學染色結果圖，及p-p53(S15)表現的IHC分數，其中*P<0.05。

第12(b)圖為本發明的C組與D組的p-NFκB(S536)免疫組織化學染色結果圖，及p-NFκB(S536)表現的IHC分數，其中***P<0.0005。

第12(c)圖為本發明C組與D組的Ki67免疫組織化學染色結果圖，及Ki67表現的IHC分數，其中***P<0.0005。

第13圖為本發明以苯扎氯銨(BAK)處理DOK細胞後的細胞週期分佈圖及其統計圖，其中CTL為控制組，*P<0.05，***P<0.0005。

第14圖為本發明苯扎氯銨(BAK)對DOK細胞進行PI/Annexin V雙染色法的結果圖，其中*P<0.05，***P<0.0005。

第15圖為本發明以苯扎氯銨(BAK)處理DOK細胞後，細胞凋亡指標基因的表現結果圖，其中β-Actin為內控制組。

第16(a)圖為本發明以苯扎氯銨(BAK)處理DOK細胞後，DHE染色結果圖，其中**P<0.005，***P<0.0005。

第16(b)圖為本發明以苯扎氯銨(BAK)處理DOK細胞後，DCFDA染色結果圖，其中*P<0.05，**P<0.005。

第17圖為本發明以苯扎氯銨(BAK)處理DOK細胞後，p-STAT3(Tyr705)、STAT3、p-Akt(Ser473)及Akt基因表現的結果圖，其中β-Actin為內控制組。

第18圖為本發明以苯扎氯銨(BAK)與STAT3抑制劑Stattic處理DOK細胞後，DOK細胞存活率的結果圖，其中CTL為控制組，*P<0.05，***P<0.0005。

第19圖為本發明以苯扎氯銨(BAK)與Akt抑制劑Wortmannin處理DOK細胞後，DOK細胞存活率的結果圖，其中CTL為控制組，**P<0.005，***P<0.0005。

第20(a)圖為本發明的倉鼠頰囊在不同處理條件下，倉鼠頰囊的臨床外觀圖及其切片的H&E染色圖。

第20(b)圖為本發明苯扎氯銨(BAK)口內膏製劑對頰囊腫瘤體積影響的結果圖，其中***P<0.0005。

以下在實施方式中詳細敘述本發明之詳細特徵以及優點，其內容足以使任何熟習相關技術者了解本發明之技術內容並據以實施，且根據本說明書所揭露之內容、申請專利範圍及圖式，任何熟習相關技術者可輕易地理解本發明相關之目的及優點。以下之實施例係進一步詳細說明本發明之觀點，但非以任何觀點限制本發明之範圍。

本發明通過高通量篩選(High-throughput Screening)平台進行現有臨床藥物篩選動作，篩選出臨床藥物龍膽紫(Gentian Violet)及苯扎氯銨(Benzalkonium Chloride)對口腔潛在惡性病變細胞株(Dysplastic Oral Keratinocyte，DOK)有顯著毒殺性。其中，龍膽紫是衍生自苯胺的陽離子三苯甲烷染料。在治療領域中，龍膽紫一直被用作為抗菌、抗真菌、驅蟲、抗錐蟲及抗病毒的藥物。美國食品藥品監督管理局(FDA)批准的龍膽紫的治療製劑為1~2%的龍膽紫溶液。苯扎氯銨是一種作為陽離子介面活性劑及抗菌防腐劑的季銨化合物，具有三種主要用途：作為殺菌劑、陽離子介面活性劑以及在化學工業中的相轉移劑。此外，苯扎氯銨是眼、鼻及耳用產品中最常見的防腐劑。通常苯扎氯銨的使用量為0.0025~0.1%。然而，從未有研究將龍膽紫及苯扎氯銨製作為口內用藥物的新劑型，以及用來延緩或治療口腔癌前包括增生、白斑病、口腔粘膜下纖維化、黏膜紅斑及黏膜紅白斑至少其中之一的口腔潛在惡性病變。

本發明新劑型的口內用藥物可以延緩或治療口腔癌前的口腔潛在惡性病變，且口內用藥物包括粉狀、膏狀、凝膠狀等可以施用於口腔內部的藥物，較佳地，本發明的口內用藥物為口內膏，且施用於罹患口腔潛在惡性病變的患者的口腔中。本發明的口內用藥物包括具有治療有效量的龍膽紫或苯扎氯銨、增稠劑及乳化劑。龍膽紫及苯扎氯銨分別具有結構式1及結構式2如下：

n為8、10、12、14、16、18

增稠劑包括羥丙甲纖維素、甲基纖維素、羥乙基纖維素、卡波姆、二氧化鈦、磷酸鋅、氧化鋅、二氧化矽、矽鋁酸鹽、氧化鋁及磷酸鈣至少其中之一。乳化劑包括乙醇、丙二醇、1,5-戊二醇及卡必醇至少其中之一。

在一實施例中，本發明的口內用藥物包括佔口內用藥物總重3~10% w/w的龍膽紫、佔口內用藥物總重5% w/w的HPMC 4000、以及佔口內用藥物總重10% w/w的乙醇。

在另一實施例中，本發明的口內用藥物包括佔口內用藥物總重2~5% w/w的苯扎氯銨、佔口內用藥物總重5% w/w的HPMC 4000、佔口內用藥物總重10% w/w的乙醇、以及佔口內用藥物總重10% w/w的卡必醇。

本發明利用以下實驗證明龍膽紫及苯扎氯銨在治療及延緩口腔潛在惡性病變上的功效。

實驗材料及方法

細胞培養

本發明使用正常人類口腔角質細胞(Human Oral Keratinocytes，HOK)、作為的人類口腔癌前細胞的發育障礙口腔角質細胞(Dysplasia Oral Keratinocyte，DOK)及作為人口腔癌細胞的人類舌頭鱗狀上皮癌細胞(Tongue squamous cell earcinoma，SAS)。將HOK細胞培養於預包覆2μg/cm²多聚-L-離胺酸(poly-L-lysine)的口腔角質形成細胞培養基(Oral Keratinocyte Medium，OKM)中。DOK細胞及SAS細胞培養於補充有10%胎牛血清、100U/mL青黴素、100μg/mL鏈黴素、1%的L-麩醯胺酸及1%非必需氨基酸的DMEM/F12培養基。所有細胞株均在37℃下培養。

XTT分析法

將DOK細胞以5×10³細胞/孔的密度接種於96孔盤中，使其附著過夜。使用不同濃度的藥物處理DOK細胞48小時後，並使用XTT分析法經由習用的步驟分析DOK細胞增生狀況。

細胞週期分析

龍膽紫(GV)：將1.5×10⁵個DOK細胞接種於6孔盤中，使其附著過夜。使用GV、乙醯半胱胺酸(NAC)、PFT-α及/或BAY 11-7085處理24小時後，收集DOK細胞並用碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液(0.02mg/mL PI、0.2g/mL RNaseA及0.05% Triton-X 100於PBS中)在室溫下染色10分鐘。最後使用流式細胞儀(Flow Cytometer)分析DOK細胞的細胞週期分佈。

苯扎氯銨(BAK)：將1.5×10⁵個DOK細胞接種於6孔盤中，培養過夜，以使細胞附著。使用不同劑量的BAK(5、10和 15μM)處理DOK細胞24小時後，收集DOK細胞並用碘化丙啶染色液(0.02mg/mL PI、0.2g/mL RNaseA及0.05% Triton-X 100於PBS中)在室溫下染色10分鐘。最後使用流式細胞儀分析DOK細胞的細胞週期分佈。

細胞凋亡檢測實驗(PI/Annexin V雙染色法)

龍膽紫(GV)：將1.5×10⁵個DOK細胞接種於6孔盤中，使其附著過夜。使用GV、NAC、PFT-α及/或BAY 11-7085處理24小時後，收集DOK細胞，並在室溫下用Annexin V-FITC及PI染色20分鐘。最後使用流式細胞儀分析樣品。

苯扎氯銨(BAK)：將1.5×10⁵個DOK細胞接種於6孔盤中，培養過夜。使用BAK處理DOK細胞2、8及24小時後，收集DOK細胞，並在黑暗環境中用PI及Annexin V-FITC染色20分鐘。最後使用流式細胞儀分析樣品。

西方墨點法(Western blotting)

龍膽紫(GV)：將6×10⁵個DOK細胞接種於6-公分盤中，並使其附著過夜。使用GV、PFT-α或BAY 11-7085處理0.5小時、2小時、4小時或24小時後，收集DOK細胞，並在含有蛋白酶抑製劑的放射免疫沉澱法(RIPA)緩衝液中裂解。通過SDS-PAGE分離裂解物，轉印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，並用一級抗體及二級抗體進行印跡。接著，以ECL進行顯色，並由電泳膠體影像系統(如ChemiDoc XRS+System)進行成像。使用的一級抗體包括抗pp53(Ser15)、抗p53、抗γH2AX、抗Ki67、抗β-肌動蛋白(β-Actin)、抗GAPDH、抗NFκB、抗切割的caspase-3、抗切割的caspase-9、抗切割的caspase-7、抗切割的PARP及抗pNFκB(Ser536)。

苯扎氯銨(BAK)：將6×10⁵個DOK細胞接種到6-公分盤中，並使其附著過夜。使用BAK、Stattic或渥曼青黴素(Wortmannin)處理DOK細胞後，收集DOK細胞，並在含有蛋白酶抑製劑的放射免疫沉澱法(RIPA)緩衝液中裂解。通過SDS-PAGE分離裂解物，然後將蛋白質轉印到PVDF膜上，並用一級抗體及二級抗體進行印跡。最後，以ECL進行顯色，由冷光CCD電泳膠體影像系統(ChemiDoc XRS+System)進行成像，並由Image Lab軟體定量。使用的一級抗體包括抗pSTAT3(Tyr705)、抗STAT3、抗pAkt(Ser473)、抗Akt、抗切割的caspase-3、抗切割的caspase-9、抗切割的caspase-7、抗切割的PARP、抗γH2AX及抗β-Actin。

活性氧類(Reactive Oxygen Species，ROS)檢測

龍膽紫(GV)：將DOK細胞以1.5×105細胞/孔的密度接種在6孔盤中，並使其附著過夜。將DOK細胞以3.5μM GV處理1小時後，使用10μM DCFDA和DHE螢光染料在黑暗中染色30分鐘。最後使用貝克曼流式細胞儀測量平均熒光強度，並使用Flow Jo軟體分析細胞內的ROS含量。

苯扎氯銨(BAK)：將1.5×10⁵個DOK細胞接種到6孔盤中，並使其附著過夜。將DOK細胞用不同劑量的BAK(5、10及15μM)處理4小時候，使用10μM DCFDA和DHE螢光染料在黑暗中染色30分鐘。最後使用貝克曼流式細胞儀測量平均熒光強度，並使用Flow Jo軟體分析細胞內的ROS含量。

口內膏製劑的製備方法

龍膽紫(GV)：羥丙基甲基纖維素4000(HPMC 4000)用作龍膽紫的口內膏配方的增稠劑、粘合劑、成膜劑及親水性基質材料。以HPMC 4000(5% w/w)、乙醇(10% w/w)、GV(3% w/w及10% w/w)及蒸餾水製備龍膽紫的口內膏製劑。將稱量的GV溶解在蒸餾水中並混合至少12小時。接著，將5% w/w的HPMC 4000及10% w/w的乙醇依次加入到混合物中，以得到龍膽紫的口內膏製劑。最後將龍膽紫的口內膏製劑儲存在密閉的棕色瓶中。

苯扎氯銨(BAK)：以HPMC 4000(5% w/w)、乙醇(10% w/w)、卡必醇(10% w/w)，苯扎氯銨(2% w/w及5% w/w)及蒸餾水製備苯扎氯銨的口內膏製劑。首先，將苯扎氯銨溶解在蒸餾水中並混合至少12小時，接著依次將5% w/w HPMC 4000、10% w/w乙醇及10% w/w卡必醇添加到混合物中，以得到苯扎氯銨的口內膏製劑。最後將苯扎氯銨的口內膏製劑儲存在密閉的棕色瓶中。

動物臨床實驗

倉鼠頰囊粘膜是口腔癌發生最廣泛接受的實驗模型之一，因為倉鼠的頰囊易於散佈並用藥物治療。在本發明中，將0.5% 7,12-二甲基苯並[a]蒽(DMBA)施用於倉鼠頰囊9週以誘發口腔癌前病變，再對經DMBA處理的倉鼠每週進行龍膽紫或苯扎氯銨治療。

龍膽紫(GV)：將每隻重80~100g的16隻雄性敘利亞金倉鼠(Mesocricatus auratus)隨機分為以下四組：(1)未經處理組(A組，n=2)：倉鼠未經任何處理；(2)GV治療組(B組，n=2)：倉鼠僅接受3% GV口內膏製劑治療；(3)DMBA處理組(C組，n=3)：倉鼠頰囊用0.5% DMBA(溶於礦物油中)塗抹10次，每週3次，持續9週；以及(4)DMBA+GV治療組(D組，n=9)：倉鼠先接受如C組的DMBA處理，然後每週進行3% GV口內膏製劑治療，每週1次，持續3週。在第13週將倉鼠安樂死，然後進行CO₂窒息。每週測量一次腫瘤大小，並根據標準公式計算腫瘤體積：(寬度²×長度)/2。

苯扎氯銨(BAK)：將每隻重80~100g的16隻雄性敘利亞金倉鼠(Mesocricatus auratus)隨機分為以下四組：(1)未經處理組(A組，n=2)：倉鼠未經任何處理；(2)BAK治療組(B組，n=2)：倉鼠僅接受2% BAK口內膏製劑治療；(3)DMBA處理組(C組，n=3)：倉鼠頰囊用0.5% DMBA(溶於礦物油中)塗抹10次，每週3次，持續9週；以及(4)DMBA+GAK治療組(D組，n=9)：倉鼠先接受如C組的DMBA處理，然後每週進行2% BAK口內膏製劑治療，每週1次，持續3週。在第13週將倉鼠安樂死，然後進行CO₂窒息。每週測量一次腫瘤大小，並根據標準公式計算腫瘤體積：(寬度²×長度)/2。

對龍膽紫(GV)治療的倉鼠進行免疫組織化學染色及蘇木精-伊紅染色(H&E Staining)

取出倉鼠頰囊的口腔粘膜組織，固定在10%中性福爾馬林溶液中24小時，然後進行組織學處理和石蠟包埋。將石蠟包埋的組織進行組織切片並將切片固定於玻片上進行免疫組織化學染色及蘇木精-伊紅染色。為了量化免疫組織化學染色中p-p53(ser21)、p-NFκB(ser536)及Ki67的染色表現，根據以下類別對陽性染色的腫瘤細胞的百分比進行分級：0(0~4%)、1(5~24%)、2(25~49%)、3(50~74%)或4(75~100%)。另外，整體染色強度被分級為0(負)、1(弱)、2(中)或3(強)。總免疫染色(IHC)分數=陽性染色細胞的百分比分數×整體染色強度分數。

對苯扎氯銨(BAK)治療的倉鼠進行蘇木精-伊紅染色(H&E Staining)

取出倉鼠的頰袋，將頰袋固定於10%中性福馬林溶液中，並包埋石蠟中。將包覆頰袋的石蠟進行組織切片並將切片固定於玻片上進行蘇木精-伊紅染色。將玻片在蒸餾水中沖洗，並在蘇木精溶液中染色10分鐘，然後依序在流動的自來水中洗滌5分鐘、在1%的酸中洗滌30秒、在流動的自來水中洗滌1分鐘、以及在0.2%的氨水洗滌30秒，然後重複上述洗滌步驟一次。將玻片在95%的酒精中漂洗，在伊紅-四溴螢光素(eosin-phloxine)溶液中復染30秒，然後在95%的酒精中脫水兩次，每次5分鐘，最後用二甲苯處理後進行封片。

藥物殘留試驗

龍膽紫(GV)：以Franz擴散槽進行實驗，藥物接收室(Donor Compartment)中先加入20mL接收相(pH 7.4的磷酸鹽緩衝液(PBS))，溫度保持在37±0.5℃，轉速維持在600rpm。以SD鼠的腹部皮作為穿透障壁，將1g的10% GV口內膏製劑置於接收室中。經時取樣分析，計算GV口內膏製劑之穿透量。實驗結束後，將SD鼠皮自Franz擴散槽取下，使用二次水沾濕棉花擦拭10次，剪下給藥面積範圍，並剪碎放置於棕色螺旋管中，加入4mL PBS，水平震搖14小時，分析GV口內膏製劑殘存於皮膚內之含量，並與市售GV製劑比較。

苯扎氯銨(BAK)：以Franz擴散槽進行實驗，藥物接收室(Donor Compartment)中先加入20mL接收相(pH 7.4的磷酸鹽緩衝液(PBS))，溫度保持在37±0.5℃，轉速維持在600rpm。以SD鼠的腹部皮作為穿透障壁，將1g的5% BAK口內膏製劑置於接收室中。經時取樣分析，計算BAK口內膏製劑藥物之穿透量。實驗結束後，將SD鼠皮自Franz擴散槽取下，使用二次水沾濕棉花擦拭10次，剪下給藥面積範圍，並剪碎放置於棕色螺旋管中，加入4mL PBS，水平震搖14小時，分析BAK口內膏製劑殘存於皮膚內之含量，並與市售BAK製劑比較。

統計分析

所有實驗至少進行了3次，所有觀察結果均由這至少3次實驗證實，數據表示為平均值±標準誤差(SE)。實驗組之間的差異是通過採用事後圖凱檢驗(Tukey’s test)進行多次比較的單向方差分析(ANOVA)確定。獨立的t-檢驗用於兩組數據之間的比較。P<0.05表具有統計學意義。

龍膽紫(GV)在治療或延緩口腔癌前的口腔潛在惡性病變上的活性

1.GV對HOK細胞、DOK細胞及SAS細胞的有效性：

本發明測試GV對HOK正常上皮細胞、DOK口腔癌前細胞及SAS口腔癌細胞的IC₅₀，以驗證GV對HOK細胞、DOK細胞及SAS細胞的有效性。使用多種濃度的GV處理HOK正常上皮細胞、DOK口腔癌前細胞及SAS口腔癌細胞，再以XTT分析法評估細胞存活率，結果如第1圖所示。第1圖顯示GV對DOK細胞的IC₅₀約為3.5μM，而對HOK細胞及SAS細胞的IC₅₀分別為5μM和9μM。由此可知，GV對DOK細胞有顯著毒殺性。

2.確定GV誘導的細胞死亡和細胞週期分佈：

使用1μM、3.5μM及5μM的GV處理DOK細胞，再使用PI染色並以流式細胞儀評估細胞週期分佈，結果如第2圖所示。第2圖中，當GV的濃度從1μM增加到5μM時，DOK細胞停在sub-G1期的比例從3%增加到32%，表示GV的濃度愈高，GOK細胞存活率愈低。為了證明停在sub-G1期是來自細胞凋亡還是壞死，本發明利用PI/Annexin V雙染色法來確定DOK細胞的死亡類型。使用3.5μM GV處理DOK細胞2、8及24小時，再使用PI/Annexin V染色並以流式細胞儀分析，結果如第3圖所示。在第3圖中，用3.5μM GV處理DOK細胞24小時後，PI⁺/Annexin V⁺的DOK細胞顯著增加。此外，當使用3.5μM GV處理DOK細胞2小時至24小時時，檢查細胞凋亡指標基因的表現，結果如第4圖所示。在第4圖中，細胞凋亡的活化形式的指標基因(包括切割的PARP、切割的Caspase-3、切割的Caspase-9及切割的Caspase-7)的表現量依時間增加而顯著增加。此外，磷酸化的H2AX(γH2AX)為細胞凋亡DNA片段的指標基因，從第4圖中可以看出γH2AX的表現量也依時間增加而顯著增加。從上述可知，GV會導致口腔癌前細胞的細胞凋亡。

3.GV誘導口腔癌前細胞凋亡的潛在機制：

活性氧類(ROS)會誘導DNA斷裂及H2AX的磷酸化。本發明使用兩種對氧化還原敏感的螢光指示劑DCFDA及DHE來確定DOK細胞內ROS的量。使用1μM、3.5μM及5μM的GV處理DOK細胞1小時，再以DCFDA或DHE染色並以流式細胞儀確定ROS的量，結果如第5(a)~5(b)圖所示。在第5(a)~5(b)圖中，DCFDA⁺細胞和DHE⁺細胞的螢光強度均隨著GV的濃度增加而增加。為了驗證ROS是否與GV誘導的細胞死亡有關，本發明使用抗氧化劑NAC研究細胞存活率和細胞週期分佈。針對細胞存活率，使用3.5μM GV、10μM NAC及3.5μM GV+10μM NAC處理DOK細胞24小時，再以XTT分析法評估細胞存活率，結果如第6圖所示。在第6圖中，用3.5μM GV處理後，DOK細胞的細胞存活率降低至50%，但與NAC共同處理時，DOK細胞的細胞存活率則提高至70%。針對細胞週期分佈，使用3.5μM GV及3.5μM GV+10μM NAC處理DOK細胞24小時，再使用PI染色並以流式細胞儀評估細胞週期分佈，結果如第7圖所示。在第7圖中，相較於僅以GV處理，當DOK細胞以GV與NAC共同處理時，DOK細胞停在sub-G1期的比例從20%下降至5%。由上述可知，GV能夠藉由產生ROS誘導DOK口腔癌前細胞的細胞死亡。

4.GV在DOK細胞中調控的訊號路徑：

DNA受損可能藉由Ser15磷酸化而活化p53，導致細胞週期停滯、凋亡或DNA修復。因此，本發明檢查經GV處理的DOK細胞中p-p53(Ser15)的表現量。使用3.5μM GV處理DOK細胞0.5小時、2小時及4小時，再分析p-p53(S15)、p53及p-NFκB的表現量，結果如第8(a)~8(b)圖所示。在第8(a)~8(b)圖中，p-p53(S15)及p-NFκB的表現量隨著GV處理時間愈長表現量愈低。為了測試p53是否參與GV誘導的細胞死亡，使用p53抑制劑PFT-α抑制p53活性。使用5μM、10μM及50μM的PFT-α及PFT-α+3.5μM GV處理DOK細胞24小時，再評估DOK細胞的細胞存活率及細胞週期分佈，結果如第9(a)~9(b)圖所示。在第9(a)~9(b)圖中，在用GV處理的DOK細胞中，細胞死亡率約為50%，DOK細胞停在sub-G1期的比例約為12%，而GV與PFT-α共同處理的DOK細胞，細胞死亡率增加至約70%，停在sub-G1期的比例增加至約35%。儘管p53的活化通常與細胞凋亡有關，但NFκB轉錄因子也有抗細胞凋亡的作用。因此，使用NFκB抑制劑BAY 11-7085抑制NFκB活性。使用1μM、2.5μM及5μM的BAY 11-7085及BAY 11-7085+3.5μM GV處理DOK細胞24小時，再評估DOK細胞的細胞存活率及細胞週期分佈，結果如第10(a)~10(b)圖所示。在第10(a)~10(b)圖中，GV與BAY11-7085共同處理會導致DOK細胞的細胞死亡率及sub-G1期的比例增加。上述實驗顯示GV誘導的細胞凋亡會伴隨著p-p53(Ser15)及p-NFκB(Ser536)的表現量降低，這表明p53及NFκB在口腔癌前細胞(GOK細胞)中的作用是致癌的，而GV可以抑制GOK細胞中p53及NFκB的磷酸化來使DOK細胞走向細胞凋亡，進而治療口腔癌前的口腔潛在惡性病變。

5.GV抑制體內口腔癌前病變的發展：GV口內膏製劑對倉鼠頰囊的臨床實驗結果如第11(a)~11(b)圖所示。在第11(a)~11(b)圖中，GV口內膏製劑的臨床表現表明未經處理組(A組)的倉鼠及GV治療組(B組)的倉鼠之間沒有顯著差異。雖然B組的頰囊上皮沒有異常增生，但經GV治療後上皮的固有層變得略微增厚。在DMBA處理組(C組)的倉鼠中可觀察到腫瘤產生，而在DMBA+GV治療組(D組)的倉鼠中，觀察到用3% GV口內膏製劑治療後的頰囊腫瘤體積顯著減小(請見第11(b)圖)。此外，C組頰囊組織病變的組織學表現出帶有中度至重度的上皮增生，而D組頰囊組織的組織學表現則與正常上皮相似。值得注意的是，在C組和D組之間的血液生物醫學參數(如下表1)中未觀察到顯著差異。另外，在免疫組織化學染色結果中(如第12(a)~12(c)圖所示)，D組中p-p53(S15)及p-NFκB(S536)的表現量皆降低，與體外結果一致。從第12(a)~12(b)圖可觀察到D組中，p-p53(S15)及p-NFκB(S536)的表現量顯著低於C組。此外，第12(c)圖觀察到與C組相比，D組中增生細胞的基因指標Ki67的表現量明顯降低。因此，本發明的新穎的GV口內膏製劑可延緩倉鼠口腔頰囊袋癌前病變的惡化及有效地抑制口腔癌前病變的發展。

6.GV口內膏製劑使用後的藥物殘存量：實驗結果如表2所示，表2顯示GV口內膏製劑在皮內殘留量為20.8±9.4μg/cm²，而市售GV製劑的皮內殘留量則為8.4±1.3μg/cm²。在口腔疾病的治療中，黏膜黏著劑和持續釋放的技術進步可以通過維持藥物在口腔黏膜上的黏附並增加患者的依從性來增強治療效果並減少藥物浪費。由此可知，本發明的新穎GV口內膏製劑的治療效果優於市售GV製劑。

苯扎氯銨(BAK)在治療或延緩口腔癌前的口腔潛在惡性病變上的活性

1.確定BAK誘導的細胞死亡和細胞週期分佈：

使用5μM、10μM及15μM的BAK處理DOK細胞，再使用PI染色並以流式細胞儀評估細胞週期分佈，結果如第13圖所示。第13圖中，當BAK的濃度從5μM增加到15μM時，DOK細胞停在sub-G1期的比例從5%增加到30%，表示BAK的濃度愈高，GOK細胞存活率愈低。為了證明停在sub-G1期是來自細胞凋亡還是壞死，本發明利用PI/Annexin V染色法來確定DOK細胞的死亡類型。使用10μM BAK處理DOK細胞2、8及24小時，再使用PI/Annexin V染色並以流式細胞儀分析，結果如第14圖所示。在第14圖中，隨著BAK處理時間增加，10μM BAK可以顯著增加了PI⁺/Annexin V⁺的DOK細胞的數量。此外，當使用10μM BAK處理DOK細胞2小時至24小時時，檢查細胞凋亡指標基因的表現，結果如第15圖所示。在第15圖中，活性切割形式的Caspase-7、Caspase-9、Caspase-3及PARP的表現量依時間增加而顯著增加。此外，磷酸化的H2AX(γH2AX)(DNA斷裂的指標基因)的表現量也依時間增加而顯著增加。從上述可知，BAK會導致口腔癌前細胞的細胞凋亡。

2.BAK誘導口腔癌前細胞凋亡的潛在機制：

活性氧類(ROS)的堆積可藉由引起DNA斷裂而導致γH2AX的表現量升高。由於本發明發現BAK處理的DOK細胞中γH2AX的表現量升高，因此使用DCFDA及DHE來確定DOK細胞內ROS的量。使用5μM、10μM及15μM的BAK處理DOK細胞4小時，再以DCFDA或DHE染色並以流式細胞儀確定ROS的量，結果如第16(a)~16(b)圖所示。在第16(a)~16(b)圖中，DCFDA⁺細胞和DHE⁺細胞的螢光強度均隨著BAK的濃度增加而增加。在先前的研究已發現，ROS會透過抑制肝細胞癌中STAT3的磷酸化來誘導細胞凋亡，故本發明進一步檢測以BAK處理後的DOK細胞中p-STAT3(Tyr705)的表現量。請見第17圖，在BAK處理後，p-STAT3(Tyr705)的表現量降低。為了驗證STAT3是否在BAK誘導的細胞死亡中發揮作用，使用STAT3抑制劑Stattic來抑制STAT3的活性。使用2μM Stattic、10μM BAK及2μM Stattic+10μM BAK處理DOK細胞48小時，再以XTT分析法評估細胞存活率，結果如第18圖所示。在第18圖中，用10μM BAK處理後，DOK細胞的細胞存活率為50%，但與Stattic共同處理時，DOK細胞的細胞存活率則降低至30%。此外，還已知PI3K/Akt是細胞存活的重要訊號路徑，故檢測以BAK處理後的DOK細胞中p-Akt(Ser473)的表現量。請見第17圖，在BAK處理後，p-Akt(Ser473)的表現量亦隨著BAK的濃度增加而降低。為了確認PI3K/Akt在BAK誘導的細胞死亡中的作用，使用PI3K/Akt抑制劑Wortmannin來抑制Akt的活性。使用0.1mM Wortmannin、10μM BAK及0.1mM Wortmannin+10μM BAK處理DOK細胞48小時，再以XTT分析法評估細胞存活率，結果如第19圖所示。在第19圖中，Wortmanninr及BAK共同處理後，會導致DOK細胞死亡率增加。上述實驗顯示BAK誘導的細胞凋亡會伴隨著p-STAT3(Tyr705)及p-Akt(Ser473)的表現量降低，這表明p53及NFκB在口腔癌前細胞(DOK細胞)中的作用是致癌的，故經由本實驗可以證實苯扎氯銨(BAK)藉由產生活性氧類(ROS)及抑制PI3K及STAT3訊息傳遞使DOK細胞表現出細胞凋亡活性，進而治療口腔癌前的口腔潛在惡性病變。

4.BAK抑制體內口腔癌前病變的發展：

BAK口內膏製劑對倉鼠頰囊的臨床實驗結果如第20(a)~20(b)圖所示。在第20(a)~20(b)圖中，BAK口內膏製劑的臨床表現表明未經處理組(A組)的倉鼠及BAK治療組(B組)的倉鼠之間的頰囊的外觀特徵相似，沒有顯著差異。儘管在DMBA處理組(C組)中可見口腔損傷，但在DMBA+BAK治療組(D組)中未發現明顯的病變。另外，C組頰囊組織病變的組織學檢查顯示具有中度至重度的上皮增生。相反的，D組的頰囊組織的組織學檢查顯示，上皮的固有層僅稍增厚。此外，使用BAK治療3週後，發現D組的腫瘤體積積顯小於C組(請見第11(b)圖)。值得注意的是，C組和D組之間的血液生物醫學參數(如下表3)中未觀察到顯著差異。因此，本發明的新穎的BAK口內膏製劑可延緩倉鼠口腔頰囊袋癌前病變的惡化及有效地抑制口腔癌前病變的發展。

5.BAK口內膏製劑使用後的藥物殘存量：

實驗結果表4所示，表4顯示口內膏製劑在皮內殘留量為1765±191μg/cm²，而市售BAK製劑的皮內殘留量則為55±16μg/cm²。在口腔疾病的治療中，黏膜黏著劑和持續釋放的技術進步可以通過維持藥物在口腔黏膜上的黏附並增加患者的依從性來增強治療效果並減少藥物浪費。由此可知，本發明的新穎BAK口內膏製劑的治療效果遠優於市售BAK製劑。

綜合上述，在口腔疾病的治療領域中，具有黏膜黏附特性的緩釋藥物製劑可以提高治療效果、減少藥物浪費、減少全身副作用並提高患者依從性。已知口腔潛在惡性病變(OPMD)是口腔中的局部病變，因此，本發明製備口內膏形式的龍膽紫(GV)口內用藥物及苯扎氯銨(BAK)口內用藥物，以局部非侵入性治療OPMD病灶，以達到降低口腔癌發生率和死亡率的目標。

本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由所屬技術領域中具有通常知識者做任何修改，但不脫離如所附申請專利範圍所要保護的範圍。

Claims

一種化合物用於製備治療或延緩口腔潛在惡性病變(oral potentially malignant disorder，OPMD)之藥物的用途，其中該化合物為一治療有效量的龍膽紫(Gentian Violet)。
一種化合物用於製備治療或延緩口腔潛在惡性病變(oral potentially malignant disorder，OPMD)之藥物的用途，其中該化合物為一治療有效量的苯扎氯銨(Benzalkonium Chloride)。
如申請專利範圍第1或2項所述之用途，其中該藥物為一口內用藥物，且施用於罹患該口腔潛在惡性病變的一患者的一口腔中。
如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該口內用藥物為一口內膏劑型。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該龍膽紫在該藥物中的含量為3~10% w/w。
如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該苯扎氯銨在該藥物中的含量為2~5% w/w。
如申請專利範圍第1或2項所述之用途，其中該藥物更包括一增稠劑及一乳化劑，其中該增稠劑選自由羥丙甲纖維素、甲基纖維素、羥乙基纖維素、卡波姆、二氧化鈦、磷酸鋅、氧化鋅、二氧化矽、矽鋁酸鹽、氧化鋁及磷酸鈣所組成之群組至少其中之一，且該乳化劑選自由乙醇、丙二醇、1,5-戊二醇及卡必醇所組成之群組至少其中之一。
如申請專利範圍第1或2項所述之用途，其中該口腔潛在惡性病變包括增生、白斑病、口腔粘膜下纖維化、黏膜紅斑及黏膜紅白斑至少其中之一。
一種用於治療或延緩口腔潛在惡性病變(oral potentially malignant disorder，OPMD)的口內用藥物，包括佔該口內用藥物總重3~10% w/w的龍膽紫(Gentian Violet)。
一種用於治療或延緩口腔潛在惡性病變(oral potentially malignant disorder，OPMD)的口內用藥物，包括佔該口內用藥物總重2~5% w/w的苯扎氯銨(Benzalkonium Chloride)。
如申請專利範圍第9或10項所述之口內用藥物，更包括一增稠劑及一乳化劑，其中該增稠劑選自由羥丙甲纖維素、甲基纖維素、羥乙基纖維素、卡波姆、二氧化鈦、磷酸鋅、氧化鋅、二氧化矽、矽鋁酸鹽、氧化鋁及磷酸鈣所組成之群組至少其中之一，且該乳化劑選自由乙醇、丙二醇、1,5-戊二醇及卡必醇所組成之群組至少其中之一。
如申請專利範圍第9或10項所述之口內用藥物，其中該口腔潛在惡性病變包括增生、白斑病、口腔粘膜下纖維化、黏膜紅斑及黏膜紅白斑至少其中之一。