TW202100143A - 修飾碳奈米材料、奈米簇、物質遞輸載體及醫藥組成物 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種經高級烷基或高級烯基修飾之碳奈米材料進行自組織化而成之奈米簇。
Description
本發明係關於一種修飾碳奈米材料、奈米簇、物質遞輸載體及醫藥組成物。
於本說明書中使用以下縮寫符號:
NDc:羧基化奈米鑽石(carboxylated nano diamond)
ND:奈米鑽石(nano diamond)
NDc-ori:未修飾之羧基化奈米鑽石原料
SP:超粒子(super particle)
NDc-SP:經烷基修飾之羧基化奈米鑽石之奈米簇
PEG:聚乙二醇
PEGMEM:聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(polyethylene glycol methyl ether methacrylate)
DSPE:二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(distearoyl phosphatidyl ethanolamine)
F127:Pluronic F127
CPT:喜樹鹼
PTX:紫杉醇
碳奈米鑽石(以下稱為「CND」)除了鑽石固有之性質以外,還具有平均粒徑小,比表面積大之特徵,進而,有相對廉價,容易獲取之優點。CND可藉由爆炸法或高溫高壓法等進行製造(專利文獻1)。CND由於具有低毒性、優異之生物相容性及穩定之螢光特性,故而廣泛地研究於生物醫療領域中之應用。進而,專利文獻2、3揭示一種經修飾之CND及其製造方法。
作為CND於生物醫療領域中之應用之例,於非專利文獻1中報告了:「藉由使作為抗癌劑之順鉑(cisplatin)載持於CND而製作順鉑-CND複合體」、「於pH處於酸性範圍之情形時,可使順鉑自複合體游離」、「自複合體游離之藥劑保持著與游離之順鉑相同程度之細胞毒性」。又,於非專利文獻2中報告了針對癌細胞之藥物集成作用以及功效,其係藉由疏水性相互作用使抗癌劑表柔比星(epirubicin)吸附至CND表面,進而利用鍵結有對大腸癌之表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor;EGFR)具有特異性之抗體(anti-EGFR-PEG)之脂質囊胞來包入該表柔比星-CND複合體,藉此提高溶解性。
使藥物載持於CND而成之習知之複合體存在如下問題:基本而言藥物載持量少,或於形成複合體後水中分散性明顯降低。
為了提高CND對水或極性有機溶劑之溶解性、分散性及分散穩定性,而提出了藉由高分子對CND之表面進行修飾。例如,於專利文獻4中報告了藉由利用包含聚甘油鏈之特定之基來修飾奈米鑽石之表面,而對水或極性有機溶劑之溶解性、分散性及分散穩定性大幅度地提高。然而,於習知技術中,基本而言主要著眼於提高CND之分散性,無任何與利用表面化學修飾後之CND之自組織化能力相關之評價或與以藥物載持為目的之奈米結構控制相關之研究。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2010-202458號公報
[專利文獻2]日本特開2017-186234號公報
[專利文獻3]日本特開2017-186235號公報
[專利文獻4]日本特開2010-248023號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Bo Guan et al., Small 2010, 6, 1514-1519
[非專利文獻2]Laura Moore et al., Adv. Mater. 2013, 25, 3532-3541
[發明所欲解決之課題]
本發明之主要目的在於提供一種能夠有效地載持醫藥品、香料等生理活性物質,且於生理環境下表現優異之溶解性之材料。
[解決課題之技術手段]
本發明提供以下之修飾碳奈米材料、奈米簇、物質遞輸載體及醫藥組成物。
項1. 一種奈米簇,其係經高級烷基或高級烯基修飾之碳奈米材料進行自組織化而成者。
項2. 如項1所記載之奈米簇,其係碳奈米材料進而經聚伸烷基二醇(polyalkylene glycol)修飾而成者。
項3. 如項2所記載之奈米簇,其係經聚乙二醇修飾而成者。
項4. 如項1至3中任一項所記載之奈米簇,其係高級烷基或高級烯基、聚伸烷基二醇經選自由-NH-、-O-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NH-、-NH-CO-、-NH-CO-O-、-O-CO-NH-、-O-CO-O-、及-NH-CO-NH-所組成之群中之任一種連結基連結於碳奈米材料而成者。
項5. 如項1至4中任一項所記載之奈米簇,其係上述碳奈米材料具有選自由OH、COOH及NH2
所組成之群中之至少一種表面基且高級烷基或高級烯基經由上述表面基鍵結於碳奈米材料而成者。
項6. 如項2所記載之奈米簇,其係上述碳奈米材料具有選自由OH、COOH及NH2
所組成之群中之至少一種表面基且聚伸烷基二醇經由上述表面基鍵結於碳奈米材料而成者。
項7. 如項1至5中任一項所記載之奈米簇,其與有效成分複合化。
項8. 如項7所記載之奈米簇,其中,有效成分為生理活性物質、標記物質、香料、精油或有機色素。
項9. 如項1至8中任一項所記載之奈米簇,其中,碳奈米材料為碳奈米鑽石或碳奈米點(carbon nano dot)。
項10. 一種有效成分之遞輸載體,其包含項1至9中任一項所記載之奈米簇。
項11. 一種碳奈米材料,其係經高級烷基及/或高級烯基與聚伸烷基二醇修飾而成者。
項12. 如項11所記載之碳奈米材料,其係高級烷基或高級烯基、以及聚伸烷基二醇經選自由-NH-、-O-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NH-、-NH-CO-、-NH-CO-O-、-O-CO-NH-、-O-CO-O-、及-NH-CO-NH-所組成之群中之任一種連結基連結而成者。
項13. 如項11或12所記載之碳奈米材料,其中,碳奈米材料為碳奈米鑽石。
項14. 一種醫藥組成物,其包含與醫藥複合化之項1所記載之自組織化而成之奈米簇。
[發明之效果]
根據本發明,可提供一種「能夠有效地載持生理活性物質、香料、有機色素等有效成分,且於生理環境下表現優異之溶解性」之表面化學修飾碳奈米材料簇以及包含該奈米簇之醫藥組成物等複合材料。
於本說明書中,碳奈米材料包含碳奈米鑽石、碳奈米點。
用於製造奈米簇之碳奈米材料經高級烷基或高級烯基修飾。有時將經該等官能基修飾之碳奈米材料記載為「修飾碳奈米材料」。
本發明之修飾碳奈米材料包含0.0001~30質量%左右、較佳為0.001~20質量%左右、較佳為0.01~15質量%左右、較佳為0.05~10質量%左右之高級烷基或高級烯基。
高級烷基或高級烯基經二價連結基連結於碳奈米材料。作為二價連結基,可列舉:-NH-、-O-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NH-、-NH-CO-、-NH-CO-O-、-O-CO-NH-、-O-CO-O-、-NH-CO-NH-。
作為高級烷基,可列舉:己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一基、十二基、十三基、十四基、十五基、十六基、異十六基、十七基、十八基、異十八基、十九基、二十基、二十一基、二十二基、二十三基、二十四基等具有直鏈或支鏈之C6
-C24
烷基、較佳為C8
-C18
烷基、更佳為C8
-C14
烷基、進而較佳為C10
-C14
烷基。
作為高級烯基,可列舉:己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基(棕櫚油基(palmitooleyl))、異十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基(油基、Ole)、異十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、二十三碳烯基、二十四碳烯基等具有直鏈或支鏈之C6
-C24
烯基、較佳為C8
-C18
烯基、更佳為C12
-C18
烯基、進而較佳為C14
-C18
烯基。
用於製造本發明之奈米簇之碳奈米材料亦可進而經聚伸烷基二醇修飾。作為聚伸烷基二醇,可列舉:聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇、聚乙二醇-聚丙二醇嵌段共聚物等。
利用高級烷基及/或高級烯基與聚伸烷基二醇進行修飾前之碳奈米材料之一次粒子之平均粒徑較佳為10 nm以下,更佳為1~10 nm。
經高級烷基及/或高級烯基與聚伸烷基二醇修飾之碳奈米材料之一次粒子之平均粒徑較佳為12 nm以下,更佳為1~12 nm,進而較佳為3~12 nm。
修飾前或修飾後之碳奈米材料之一次粒子之平均粒徑可藉由動態光散射法進行測定,亦可使用X射線繞射裝置(商品名「Smart Lab」,RIGAKU公司製造)藉由小角度X射線散射測定(SAXS法)來決定。
用於製造本發明之奈米簇之碳奈米材料較佳為使用表面具有大量OH、COOH、NH2
等官能基之碳奈米材料(以下,有時記載為「CNM」)。公知一種表面具有大量OH、COOH、NH2
等基之碳奈米材料,可使用此種材料依據以下流程(1)~(10)而獲得經高級烷基或高級烯基修飾之碳奈米材料。
流程
(式中,X表示Cl、Br或I。CNM表示碳奈米材料。n1表示1以上之整數。n2表示0以上之整數。R表示高級烷基或高級烯基)
上述流程(1)~(10)之反應可依據常規方法進行,相對於具有OH、NH2
或COOH之表面基之碳奈米材料1g,使用1mg~過剩量之R-COX、R-NH2
、R-OH、R-X之任一化合物,於自0℃至溶劑沸騰之溫度內反應1~24小時,藉此可獲得目標產物。作為溶劑,可列舉:氯仿、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷等鹵代烴、甲苯等芳香族烴、四氫呋喃、二乙醚、二異丙醚等。
藉由上述流程(1)~(10)所獲得之化合物(Ia)~(Ij)可進而藉由使未反應之各官能基(OH、COOH、NH2
)與聚伸烷基二醇化試劑(R2
-Y2
-X2
;此處,R2
表示包含聚伸烷基二醇部分之基,Y2
表示單鍵或二價間隔基,X2
表示NH2
、OH、COOH、N-羥基琥珀醯亞胺)反應而利用聚伸烷基二醇進行修飾。作為二價間隔基,可列舉亞甲基、伸乙基、伸丙基、伸丁基、伸苯基(1,2-、1,3-、1,4-)、-CH2
CH2
O-、-CH2
CH2
CH2
O-、-CH2
CH2
CH2
CH2
O-、-CH2
CH2
NH-、-CH2
CH2
CH2
NH-、-CH2
CH2
CH2
CH2
NH-、-CH2
CH2
CONH-、-CH2
CH2
CH2
CONH-、-CH2
CH2
CH2
CH2
CONH-、-CH2
CH2
NHCO-、-CH2
CH2
CH2
NHCO-、-CH2
CH2
CH2
CH2
NHCO-、-CH2
CH2
CO-、-CH2
CH2
CH2
CO-、-CH2
CH2
CH2
CH2
CO-、-CH2
CH2
COO-、-CH2
CH2
CH2
COO-、-CH2
CH2
CH2
CH2
COO-、-CH2
CH2
OCO-、-CH2
CH2
CH2
OCO-、-CH2
CH2
CH2
CH2
OCO-等,可列舉該等之單獨一種或組合兩種以上而成者。導入聚伸烷基二醇之反應可藉由以下方式獲得經高級烷基及/或高級烯基、與經聚伸烷基二醇修飾之目標碳奈米材料,即,相對於化合物(Ia)~(Ij) 1g使用100 mg~過剩量之聚伸烷基二醇化試劑,於0℃至溶劑沸騰之溫度內反應1~24小時。作為溶劑,可列舉:氯仿、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷等鹵代烴、甲苯等芳香族烴、四氫呋喃、二乙醚、二異丙醚等。
本發明之奈米簇可以如下方式製作:使經高級烷基及/或高級烯基、視需要進而經聚伸烷基二醇基修飾之碳奈米材料懸浮於水或緩衝液等適當之水性介質中,藉由超音波照射使其自組織化。可於超音波照射後,藉由離心分離等純化操作將未形成簇之未反應之官能基修飾碳奈米材料去除,而分離自組織化奈米簇。
本發明之奈米簇可藉由使其懸浮於包含有效成分之適當之溶劑,而與有效成分複合化。有效成分存在於奈米簇之表面或內部。作為有效成分,可列舉:生理活性物質、標記物質、精油、香料、有機色素等。
作為標記物質,可列舉:螢光素、俄勒岡綠(oregon green)、曙紅(eosin)、赤藻紅(erythrosine)等螢光素類;四甲基玫瑰紅衍生物、得克薩斯紅(texas red)衍生物、玫瑰紅B基、麗絲胺玫瑰紅B(Lissamine Rhodamine B)、玫瑰紅6G等玫瑰紅類;香豆素類;丹磺醯型(二甲胺基萘磺酸型)螢光色素;NBD型色素;芘;R-藻紅素、藻藍蛋白、別藻藍蛋白等藻膽蛋白;BODIPY衍生物;Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5等Cy(註冊商標)色素;Alexa Fluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、633、647、680、700、750等Alexa(註冊商標)Fluor等。該等可單獨使用一種,亦可併用兩種以上。
作為精油,可列舉甜橙、苦橙、卑檸、檸檬、葡萄柚、萊姆、佛手柑、紅橘、橙花、薄荷(peppermint)、綠薄荷、薰衣草、洋甘菊、迷迭香、桉樹、鼠尾草、羅勒、玫瑰、天竺葵、茉莉、香水樹、大茴香、小茴香、八角茴香、丁香、肉桂、薑、肉豆蔻、豆蔻、啤酒花、柳杉、扁柏、岩蘭草(Vetiveria)、天竺薄荷、勞丹脂(labdanum)等,可使用該等之一種或兩種以上。
作為香料之成分,可列舉l-薄荷腦、α-蒎烯、β-蒎烯、月桂油烯、莰烯、檸檬烯等單萜、瓦倫西亞桔烯(vanlencene)、雪松烯、石竹烯、長葉烯等倍半萜、1,3,5-十一碳三烯、丁醇、戊醇、異戊醇、己醇、異戊烯醇(prenol)、(Z)-3-己烯-1-醇、2,6-壬二烯醇、沉香醇、香葉草醇、香茅醇、四氫香葉烯醇(tetrahydro myrcenol)、菌綠烯醇(farnesol)、橙花叔醇、雪松醇、苄醇、苯基乙基醇、呋喃甲醇、乙醛、異戊醛、己醛、辛醛、壬醛、癸醛、(E)-2-己烯醛、2,4-辛二烯醛、香茅醛、檸檬醛、苯甲醛、肉桂醛、香草醛、乙香草醛、糠醛、向日花香醛、2-庚酮、2-十一酮、1-辛烯-3-酮、乙偶姻、雙乙醯、2,3-戊二酮、麥芽醇、乙基麥芽醇、2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮、羥基酮、香旱芹酮、薄荷酮、諾卡酮等萜烯酮、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、β-突厥烯酮(β-damascenone)、覆盆子酮、玫瑰氧化物、沉香醇氧化物、薄荷呋喃(menthofuran)、茶螺烷(theaspirane)、甲基佳咪酚(methyl chavicol)、大茴香腦、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸沉香酯、乙酸香葉酯、乙酸薰衣草酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸苄酯、水楊酸甲酯、γ-癸內酯(γ-decalactone)、γ-十二內酯(γ-dodecalactone)、δ-癸內酯、δ-十二內酯、7-癸烯-4-內酯(7-decen-4-olide)、2-癸烯-5-內酯(2-decen-5-olide)、丁酸、4-甲基-3-戊烯酸、辛酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、吲哚、糞臭素、吡啶、烷基取代吡、鄰胺苯甲酸甲酯、甲硫醇、糠基硫醇、二甲硫醚、二甲二硫醚、二糠基二硫醚、異硫氰酸烯丙酯等,可將該等之兩種以上組合而使用。
作為有機色素,可列舉:胭脂樹紅色素、胭脂蟲紅色素、紅麹色素、β-胡蘿蔔素、木槿屬色素、硫黃色(sulfur yellow)、可可色素、核黃素、葉綠素、焦糖、婀娜多(Annatto)、洋紅、蟲漆酸、巴西蘇木素、藏花素、紫草素、紫蘇素、芸香苷等。
與有效成分複合化之本發明之奈米簇於投予或應用於哺乳動物(人、小鼠、大鼠、倉鼠、馬、牛、豬、山羊、綿羊、兔、犬、貓等)之生物體內或皮膚之情形時,緩慢地釋出有效成分。因此,與有效成分複合化之本發明之奈米簇作為醫藥品或醫藥組成物、化妝品、口腔用組成物有用。作為化妝品,可列舉:粉底、密粉、洗劑、乳液、口紅、化妝水、美容液、按摩膏、保濕霜、面膜、洗面乳、洗髮精、潤絲精、生髮劑、身體香粉等。作為口腔用組成物,可列舉:漱口液(mouthwash)、漱口水(mouth rinse)、牙膏、潔牙粉、口香糖、糖、軟糖、彈珠汽水(ramune)等。作為醫藥品之劑型,可列舉:錠劑、膠囊劑、口含劑、丸劑、咀嚼錠、注射劑、栓劑、糖漿劑、軟膏劑、硬膏劑等。又,本發明之奈米簇會緩慢地釋出有效成分,因此作為有效成分之遞輸載體有用。
生理活性物質包含醫藥、核酸、蛋白質。作為醫藥,可列舉:抗腫瘤劑、抗高血壓劑、抗低血壓劑、抗精神病劑、鎮痛劑、抗抑鬱劑、抗躁狂劑、抗焦慮劑、鎮靜劑、催眠劑、抗癲癇劑、類鴉片促效劑、哮喘治療劑、麻醉劑、抗心律不整劑、關節炎治療劑、鎮痙劑、ACE(angiotensin converting enzyme,血管緊張素轉換酶)抑制劑、鬱血去除劑、抗生素、抗心絞痛劑、利尿劑、抗帕金森氏症劑、支氣管擴張劑、抗利尿劑、利尿劑、抗高脂血症劑、免疫抑制劑、免疫調節劑、止吐劑、抗感染病劑、抗贅生物劑、抗真菌劑、抗病毒劑、抗糖尿病劑、抗過敏劑、退熱劑、抗痛風劑、抗組織胺劑、止癢劑、骨調節劑、心血管劑、降膽固醇劑、抗瘧疾劑、鎮咳劑、祛痰劑、黏液溶解劑、鼻塞用藥劑、多巴胺促效劑、消化道用藥劑、肌肉鬆弛劑、神經肌肉阻斷劑、副交感神經促效劑、前列腺素、興奮劑、食慾抑制劑、甲狀腺劑或抗甲狀腺劑、激素、抗偏頭痛劑、抗肥胖劑、抗炎劑等。較佳之醫藥為抗腫瘤劑。作為抗腫瘤劑,可列舉激素療法劑(例如磷雌酚(fosfestrol)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、氯烯雌醚(chlorotrianiserine)、醋酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、醋酸氯地孕酮(clorumazinone acetate)、醋酸環丙孕酮(cyproterone acetate)、達那唑(danazol)、烯丙雌醇(allylestrenol)、三烯高諾酮(gestrinone)、美帕曲星(mepartricin)、雷洛昔芬(raloxifene)、奧美昔芬(olmeroxifene)、左美洛昔芬(levormeloxifene)、抗雌激素(例如檸檬酸他莫昔芬(tamoxifen citrate)、檸檬酸托瑞米芬(toremifene citrate)等)、丸劑製劑、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testrolactone)、氨魯米特(aminoglutethimide)、LH-RH促效劑(例如醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、布舍瑞林(buserelin)、亮丙瑞林(leuprorelin)等)、屈洛昔芬(droloxifene)、環硫雄醇(epitiostanol)、磺酸乙炔雌二醇(ethinylestradiol sulfonate)、芳香酶(aromatase)抑制劑(例如鹽酸法倔唑(fadrozole)、阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(retrozole)、依西美坦(exemestane)、伏羅唑(vorozole)、福美斯坦(formestane)等)、抗雄激素(例如氟他胺(flutamide)、比卡魯胺(bicartamide)、尼魯米特(nilutamide)等)、5α-還原酶抑制劑(例如非那雄胺(finasteride)、愛普列特(epristeride)等)、腎上腺皮質激素系藥劑(例如地塞米松(dexamethasone)、潑尼松龍(prednisolone)、倍他米松(betamethasone)、去炎松(triamcinolone)等)、雄激素合成抑制劑(例如阿比特龍(abiraterone)等)、類視黃醇及延遲類視黃醇之代謝之藥劑(例如利阿唑(liarozole)等)等,其中,可列舉:LH-RH促效劑(例如醋酸戈舍瑞林、布舍瑞林、亮丙瑞林等))、烷化劑(例如氮芥、鹽酸氮芥-N-氧化物、氯芥苯丁酸(chlorambutyl)、環磷醯胺、異環磷醯胺(ifosfamide)、噻替派(thiotepa)、卡波醌(carboquone)、英丙舒凡對甲苯磺酸鹽(improshlfan tosylate)、白消安(busulfan)、鹽酸尼莫司汀(nimustine)、二溴甘露醇(mitobronitol)、美法侖(melphalan)、達卡巴仁(dacarbazine)、雷莫司汀(ranimustine)、雌莫司汀磷酸鈉(sodium estramustine phosphate)、三伸乙基三聚氰胺、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、鏈佐星(streptozocin)、哌泊溴烷(pipobroman)、伊托格魯(etoglucid)、卡鉑(carboplatin)、順鉑、米帕(miboplatin)、奈達鉑(nedaplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、六甲蜜胺(altretamine)、氨莫司汀(ambamustine)、鹽酸二溴螺氯銨(dibrospidium hydrochloride)、福莫司汀(fotemustine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、嘌嘧替哌(pumitepa)、苯達莫司汀(ribomustin)、替莫唑胺(temozolomide)、蘇消安(treosulphan)、曲磷胺(trophosphamide)、淨司他丁斯酯(zinostatin stimalamer)、卡波醌、阿多來新(adozelesin)、半胱胺亞硝脲(cystemustine)、比折來新(bizelesin))、代謝拮抗劑(例如巰嘌呤、6-巰基嘌呤核苷(6-mercaptopurine riboside)、硫代肌苷(thioinosine)、甲胺喋呤(methotrexate)、依諾他濱(enocitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽(cytarabine ocfosfate)、鹽酸環胞苷(ancitabine)、5-FU系藥劑(例如氟尿嘧啶(fluorouracil)、替加氟(tegafur)、UFT(Tegafur-Uracil,優福定)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、卡莫氟(carmofur)、加洛他濱(gallocitabine)、乙嘧替氟(emmitefur)等)、胺基喋呤(aminopterine)、亞葉酸鈣(leucovorine calcium)、硫鳥嘌呤(tabloid)、布縮宮素(butocine)、亞葉酸鈣(calcium folinate)、左亞葉酸鈣(levofolinate calcium)、克拉屈濱(cladribine)、乙嘧替氟(emitefur)、氟達拉濱(fludarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲(hydroxycarbamide)、噴司他丁(pentostatin)、吡曲克辛(piritrexim)、碘苷(idoxuridine)、米托胍腙(mitoguazone)、噻唑呋林(thiazophrine)、氨莫司汀(ambamustine))、抗癌性抗生素(例如放射菌素D(actinomycin-D)、放射菌素C、絲裂黴素C(mitomycin-C)、色黴素A3(chromomycin-A3)、鹽酸博來黴素(bleomycin)、硫酸博來黴素、硫酸培洛黴素(peplomycin sulfate)、鹽酸柔紅黴素(daunorubicin)、鹽酸阿黴素(doxorubicin)、鹽酸阿克拉黴素(aclarubicin)、鹽酸吡柔比星(pirarubicin)、鹽酸表柔比星、新抑癌素(neocarzinostatin)、光輝黴素(mithramycin)、殺寇黴素(sarcomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、密妥坦(mitotane)、鹽酸佐柔比星(zorubicin)、鹽酸米托蒽醌(mitoxantrone)、鹽酸艾達黴素(idarubicin))、源自植物之抗癌劑(例如依託泊苷(etoposide)、磷酸依託泊苷、硫酸長春花鹼(vinblastine sulfate)、硫酸長春新鹼(vincristine sulfate)、硫酸長春地辛(vindesine sulfate)、替尼泊苷(teniposide)、紫杉醇、多西他賽(docetaxel)、長春瑞賓(vinorelbine)、喜樹鹼、鹽酸伊立替康)、免疫療法劑(BRM)(例如必醫你舒(picibanil)、克速鎮(krestin)、裂褶多糖(sizofiran)、香菇多醣(lentinan)、烏苯美司(ubenimex)、干擾素、介白素、巨噬細胞菌落刺激因子、粒細胞菌落刺激因子、紅血球生成素、淋巴毒素、BCG(Bacille Calmette-Guerin,卡介苗)疫苗、短棒菌苗(Corynebacterium parvum)、左旋咪唑(levamisole)、多醣K、丙考達唑(procodazole))、抑制細胞生長因子以及其受體之作用之藥劑(例如曲妥珠單抗(賀癌平(商標);抗HER2抗體)、ZD1839(易瑞沙)、基利克(GLEEVEC)等抗體醫藥)。作為成為抗腫瘤劑之對象之腫瘤之種類,可列舉結腸/直腸癌、肝癌、腎癌、頭頸部腫瘤、食道癌、胃癌、膽道癌、膽囊/膽管癌、胰腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮體癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸瘤、骨肉瘤/軟組織肉瘤、白血病、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、皮膚癌、腦腫瘤等,較佳可列舉:結腸/直腸癌、胃癌、頭頸部腫瘤、肺癌、乳癌、胰腺癌、膽道癌、肝癌。
作為核酸,並無特別限制,可為DNA、RNA、DNA與RNA之嵌合核酸、DNA/RNA之雜合體等任何者。又,核酸可使用1~3條鏈之任一者,較佳為單鏈或雙鏈。核酸亦可為作為嘌呤或嘧啶鹼基之N-糖苷之其他類型之核苷酸、或者具有非核苷酸骨架之其他低聚物(例如市售之肽核酸(PNA)等)或含有特殊鍵之其他低聚物(其中,該低聚物含有具有容許如在DNA或RNA中發現之鹼基之成對或鹼基之附著之配置的核苷酸)等。進而,亦可為附加有公知之修飾而成者、例如具有該領域中所知之標記者、加帽(cap)者、經甲基化而成者、將1個以上之天然核苷酸取代為類似物而成者、進行分子內核苷酸修飾而成者、例如具有不帶電鍵(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯(phosphoramidate)、胺基甲酸酯等)者、具備具有電荷之鍵或含硫之鍵(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)者、例如具有蛋白質(核酸酶、核酸酶抑制劑、毒素、抗體、訊息肽等)或糖(例如單醣等)等側鏈基者、具有插入(intercalate)化合物(例如吖啶、補骨脂素等)者、含有螯合化合物(例如金屬、具有放射活性之金屬、硼、氧化性金屬等)者、含有烷化劑者、具有經修飾之鍵者(例如α變旋異構型核酸等)。作為較佳之核酸,可列舉siRNA等RNA。
所謂siRNA係指標的基因之mRNA或由與初級轉錄產物之核苷酸序列或其部分序列(較佳為編碼區域內)(於初級轉錄產物之情形時包含內含子部分)相同之核苷酸序列及其互補鏈所構成之雙鏈低聚RNA。siRNA中所含之與標的核苷酸序列相同之部分之長度通常為約18個鹼基以上、例如約20個鹼基左右(代表性而言為約21~23個鹼基長)之長度,但只要可引起RNA干擾,便無特別限定。又,siRNA之總長亦通常為約18個鹼基以上、例如約20個鹼基左右(代表性而言為約21~23個鹼基長)之長度,但只要可引起RNA干擾,便無特別限定。
關於標的核苷酸序列、和siRNA中所含之與其相同之序列之關係,可100%一致,亦可存在鹼基之變異(可在至少70%、較佳為80%、更佳為90%、最佳為95%以上之同一性之範圍內)。
siRNA亦可於5'或3'末端具有由5個鹼基以下、較佳為2個鹼基所構成之未形成鹼基對之附加性鹼基。該附加性鹼基可為DNA亦可為RNA,但若使用DNA,則可使siRNA之穩定性提高。作為此種附加性鹼基之序列,例如可列舉ug-3'、uu-3'、tg-3'、tt-3'、ggg-3'、guuu-3'、gttt-3'、ttttt-3'、uuuuu-3'等序列,但並不限於其。
siRNA可為針對任意標的基因者。siRNA較佳為以其表現亢進會影響對象疾病之發病及/或惡化之基因為標的者,更具體而言,可列舉針對該基因之反義核酸以進行至臨床或臨床前階段之基因或新獲知之基因作為標的者等。
siRNA可僅使用一種,亦可組合兩種以上使用。
作為蛋白質,可列舉:酵素、受體、抗體、抗原、干擾素、介白素等細胞激素等。
本發明之奈米簇之平均粒徑為1~1000 nm左右、較佳為3~800 nm左右、更佳為5~500 nm左右、進而較佳為10~300 nm左右、尤其是30~250 nm左右。
作為奈米簇之ζ電位,較佳為5~30 mV左右,更佳為10~25 mV左右。
於本發明之奈米簇與有效成分複合化之情形時,相對於奈米簇100質量份包含有效成分5~50質量份左右、較佳為10~20質量份左右。
[實施例]
以下,基於實施例更詳細地說明本發明,但當然本發明並不限於該等實施例。
實施例1
<實驗方法>
1.利用羧基化奈米鑽石之超粒子複合體之合成
羧基化奈米鑽石(NDc)(粒徑:4-5 nm)係依據日本特開2017-202940或日本特開2016-113333之記載,藉由爆轟法而製備。藉由硝酸對所合成之NDc進行純化,並於氫氣環境下進行焙燒。藉由有機元素分析裝置(Micro Corder JM10;J-Science Lab Co., Ltd, Kyoto, Japan)對NDc之元素分析進行解析,結果可知為C(86.92%)、H(0.44%)、N(2.29%)。藉由珠磨機(Sand Grinder LSG-4U;Aimex Co., Ltd, Tokyo, Japan)使所純化之NDc分散於蒸餾水中。繼而,對NDc分散水溶液施以離心分離,而去除不溶於水之ND。將所獲得之上清溶液(NDc-ori)用於後續之實驗。將1 ml之NDc-ori分散水溶液(ND濃度=56 mg ml-1
)、末端胺基化烷基分子(50 μl之正辛胺(Oct(C8))、50 μl之油胺(Ole(C18))、10 mg之十二胺(Dod(C12))之任一者(均自FUJIFILM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan購入))、10 mg之1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(WSC)(FUJIFILM Wako Pure Chemical)加入至9 ml之2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)緩衝液(pH值6.0,100 mM),使用浴型超音波照射裝置(輸出=80 W,振動數=40 kHz)(USD-2R;AS ONE, Osaka, Japan)照射5分鐘。於室溫下使用攪拌器激烈地攪拌1.5小時後,對混合物施以離心分離,利用Milli-Q水清洗3次。將10 ml之Milli-Q水加入至藉由離心分離所獲得之沈澱物,藉由脈衝型超音波照射裝置(VCX-600;Sonics, Danbury, CT, USA)照射10分鐘超音波,藉此使其再次分散。將該羧基化奈米鑽石超粒子(NDc-SP)分散液用於後續之實驗。所獲得之羧基化奈米鑽石超粒子(NDc-SP)分散液為Oct(C8)-NDc-SP、Dod(C12)-NDc-SP、Ole(C18)-NDc-SP三種,該等均構成奈米簇(圖2(b)、圖2(c))。藉由紫外線-可見光-近紅外光譜儀(V-730 BIO;Jasco, Tokyo, Japan)而判明最終產物中之ND濃度為約5.6 mg ml-1
。又,藉由熱重分析(Q 500;TA Instruments, New Castle, DE, USA)可知NDc-SP(簇)中之Oct(C8)、Dod(C12)、Ole(C18)分別為約13%, w/w、約17%, w/w、約35%, w/w。
CPT@Oct(C8)-NDc-SP與CPT@Dod(C12)-NDc-SP複合體係藉由以下方法而製備。將藉由離心分離所清洗之由Oct(C8)-NDc-SP或Dod(C12)-NDc-SP所構成之沈澱物與10 mg之CPT(FUJIFILM Wako Pure Chemical)於10 ml之Milli-Q水中進行混合,照射10分鐘脈衝超音波。CPT@NDc-ori係藉由將10 mg之CPT、1 ml之NDc-or水溶液、9 ml之Milli-Q水進行混合,照射10分鐘脈衝超音波而製備。CPT@Oct(C8)-NDc-SP與CPT@Dod(C12)-NDc-SP複合體均構成奈米簇(圖4(b)、圖4(c)、圖4(d))。CPT@PEGMEM、CPT@F127、CPT@DSPE-PEG係使用56 mg之聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate,PEGMEM)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)、56 mg之pluronic F127(F127)(FUJIFILM Wako Pure Chemical)、或56 mg之N-(胺基丙基聚乙二醇)胺甲醯基-二硬脂醯磷脂醯-乙醇胺(N-(aminopropyl polyethyleneglycol)carbamyl-distearoylphosphatidyl-ethanolamine,DSPE-PEG)(Sunbright DSPE-020PA; Yuka Sangyo, Tokyo, Japan)代替ND沈澱物,藉由相同之方法而製備。
2.利用胺基化奈米鑽石之超粒子複合體之合成
胺基化奈米鑽石(NDa)(粒徑:4-5 nm)係依據已報道之製備法合成(V. V. Danilenko, Combust., Explos. Shock Waves 2005, 41, 577; V. Y. Dolmatov, J. Superhard Mater. 2008, 30, 233; V. Y. Dolmatov, V. Myllymaki and A. Vehanen, J. Superhard Mater. 2013, 35, 143.)。利用硝酸對所合成之NDa進行純化,於氫氣環境下進行焙燒。NDa之元素分析[內含C(92.20 %)、H(0.74%)、及N(2.30%)]係藉由有機元素分析裝置(Micro Corder JM10;J-Science Lab Co., Ltd, Kyoto, Japan)來解析。藉由珠磨機(Sand Grinder LSG-4U;Aimex Co., Ltd, Tokyo, Japan)使所純化之NDa分散於蒸餾水中。繼而,對該NDa分散液施以離心,而將不溶於水之ND去除。將所獲得之上清分散液(NDa-ori)用於進一步之實驗。對於1 ml之NDa-ori分散液(ND濃度=30 mg ml-1
)、10 mg之羧基末端烷基鏈(辛酸鈉(NaOc(C8))、月桂酸鈉(NaLA(C12))、或油酸鈉(sodium oleate,NaOle(C18))(均自FUJIFILM Wako Pure Chemical購入)、10 mg之WSC,藉由使用浴型超音波照射裝置(輸出:80 W,振盪頻率:40 kHz)(USD-2R;AS ONE, Osaka, Japan)進行5分鐘超音波照射而使其溶解於9 ml之MES緩衝液(pH值6.0, 100 mM)。進而將該混合物於室溫下利用攪拌器激烈地攪拌1.5小時後,利用離心分離,使用Mill-Q水清洗3次而去除未反應物質。對於藉由離心分離所獲得之顆粒,藉由使用脈衝型超音波照射裝置照射10分鐘超音波而使其再次分散於10 ml之Mill-Q水中。所獲得之胺基化奈米鑽石超粒子(NDa-SP)分散液為NaOc(C8)-NDa-SP、NaLA(C12)-NDa-SP、NaOle(C18)-NDa-SP此三種,該等均構成奈米簇(圖6(c)、圖6(d))。
將該NDa-SP分散液繼續用於實驗。又,NDa-SP分散液中之ND濃度(~3 mg ml-1
)係藉由UV-Vis-NIR分光光度計而測定(圖7(a))。又,NDa-SP中之NaOc(C8)(~8%, w/w)、NaLA(C12)(~17%, w/w)、NaOle(C18)(~24%, w/w)係使用熱重分析測定(TGA)(Q 500;TA Instruments, New Castle, DE, USA)而測算。
ND表面上之胺基係使用Kaiser test kit(60017-1EA;Sigma-Aldrich)依據已報道之方法(Yue Yu et al. Nanoscale 10, 8969-8978 (2018).)來定量(圖7(c))。
各種NDa-SP之表面張力係藉由Mitsui Chemical Analysis & Consulting Service (Tokyo, Japan),使用表面張力計(surface tensiometer)(CBVP-Z;Kyowa Interface Science Co.)而測定(圖7(c))。
經PEG修飾之NDa-SP(PEG-NDa-SP)係藉由以下方法而合成(圖8)。將1 ml之MES緩衝液(pH值6.0,500 mM)加入至10 ml之NaOc(C8)-NDa-SP水溶液或10 ml之NaLA(C12)-NDa-SP中。施以離心分離(15000 rpm,10分鐘),非常注意地去除透明之上清溶液。繼而,向離心分離後之顆粒加入包含20 mg之α-琥珀醯亞胺氧基戊二醯基-ω-甲氧基(α-succinimidyloxyglutaryl-ω-methoxy),聚氧乙烯(polyoxyethylene ,SUNBRIGHT ME-050GS;Yuka Sangyo, Tokyo, Japan)(050GS)或20 mg之六聚甘油八(琥珀醯亞胺氧基戊二醯基)聚氧乙烯(hexaglycerol octa(succinimidyloxyglutaryl) polyoxyethylene,8-ArmPEG-SCM;Funakoshi, Tokyo, Japan)(8Arm)之5 ml之DMSO(FUJIFILM Wako Pure Chemical)。對混合物進行30分鐘超音波照射後,於室溫下激烈地攪拌一夜。最後,將1 ml之MES緩衝液(pH值6.0,100 mM)加入至反應液中,使用Milli-Q水與離心分離清洗3次。對於所獲得之顆粒,藉由照射10分鐘脈衝超音波而使其再次分散於10 ml之Milli-Q水中。將合成所得之050GS被覆NaOc(C8)-NDa-SP(050GS-NaOc(C8)-NDa-SP)水溶液(ND濃度:~3 mg ml-1
)與8Arm被覆NaLA(C12)-NDa-SP(8Arm-NaLA(C12)-NDa-SP)(ND濃度:~3 mg ml-1
)用於後續之實驗。該等構成奈米簇(圖10(b)、圖11(a)、圖11(b))。
PTX@050GS-NaOc(C8)-NDa-SP與PTX@8Arm-NaLA(C12)-NDa-SP複合體係藉由以下方法而製備。向藉由離心分離所清洗之050GS-NaOc(C8)-NDa-SP或8Arm-NaLA(C12)-NDa-SP之顆粒加入含10 mg之paclitaxel(PTX)(FUJIFILM Wako Pure Chemical)之10 ml之Milli-Q水,照射10分鐘脈衝超音波。所獲得之混合物於使用前以4℃保存。Abraxane係自Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.購入,不實施化學修飾等處理而直接用於實驗。該等構成奈米簇(圖10(b)、圖11(a)、圖11(b))。
3.ND-SP之物性解析
所合成之ND-SP之結構以及形態係使用高解析穿透式電子顯微鏡(TEM)(加速電壓:120 kV)(EM-002B;Topcon, Tokyo, Japan)來解析(圖2(c)、圖6(c)、圖6(d)、圖11(a))。
ND-SP之粒徑(流體力學直徑)係藉由動態光散射法(DLS)(Photal FPAR-1000;Otsuka Electronics, Osaka, Japan)來求出(圖2(b)、圖6(b)、圖10(b))。
ND-SP之分光學解析以及ND-SP複合體中之ND、CPT、PTX濃度係藉由紫外線-可見光-近紅外光譜儀(V-730 BIO;Jasco, Tokyo, Japan)來估算(圖2(a)、圖3(a)、圖4(b)、圖6(a)、圖7(a)、圖7(b)、圖9(a)、圖9(b)、圖10(a)、圖10(c)、圖11(b))。
4.細胞培養與細胞毒性評價
人骨肉瘤細胞(U2OS)、人卵巢腺癌細胞(SKOV3)、人正常二倍體纖維母細胞(TIG3)由日本研究生物資源細胞庫(the Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank)(Tokyo, Japan)分售,於含有10% 胎牛血清、2 mM L-穀胺醯胺、1 mM 丙酮酸鈉、健他黴素、青黴素-鏈黴素(100 IU ml-1
)、Hank's平衡鹽溶液(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)之Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)(Gibco, Grand Island, NY, USA)中進行培養。將細胞於37℃、5%之CO2
環境下之加濕培養箱中進行培養。
細胞存活率係使用結晶紫染色(FUJIFILM Wako Pure Chemical)與細胞計數試劑盒(CCK)-8(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan),依據其等之手冊而評價。將細胞播種至96孔板(5×103
cells well-1
),培養一夜。繼而,使細胞暴露於藥物或奈米複合體分散溶液,利用新鮮之培養液進行清洗後,於CCK-8溶液中進行培養。最後,利用微盤讀取器(Infinite M200 PRO;Tecan, Mannedorf, Switzerland)測定450 nm之吸光度,藉此算出細胞存活比率(圖4(a)、圖4(c)、圖4(d)、圖7(d)、圖12(a)、圖12(b)、圖12(c))。
5.血液檢查
全血細胞計數(CBC)以及生化參數係由Japan SLC and Oriental Yeast Co.(Tokyo, Japan)測定。具體而言,對10週齡之雌性BALB/cSlc小鼠(n=5;平均體重=21 g;Japan SLC)自尾靜脈投予200 μl之各種樣品[含有ND-SP之滅菌水(NDc-SP:1.12 mg kg-1
;NDa-SP:30 mg kg-1
)、PBS緩衝液或滅菌水]。血液樣品係於投予奈米複合體後4週後進行採血(表1~4)。
6.資料之統計解析
資料中之±表示標準偏差,n表示所使用之樣品數量。資料之統計解析使用Student's t-test。*、**、***分別表示<0.05、<0.005、<0.001之p值。
[表1]
注射了PBS或Dod(C12)-NDc-SP之4週後之小鼠之血液檢查結果
項目 | 單位 | PBS(n=5) | Dod(C12)-NDc-SP(n=5) | p值 |
WBC | ×102 /μL | 85.3±13.4 | 92.0±16.7 | >0.05 |
RBC | ×104 /μL | 923.8±21.9 | 938.4±49.7 | >0.05 |
HGB | g/dl | 13.9±0.6 | 14.3±0.8 | >0.05 |
HCT | % | 41.4±1.9 | 43.0±2.5 | >0.05 |
MCV | fl | 45.7±0.5 | 45.9±0.5 | >0.05 |
MCH | pg | 15.3±0.2 | 15.2±0.1 | >0.05 |
MCHC | g/dl | 33.5±0.6 | 33.2±0.5 | >0.05 |
PLT | ×104 /μL | 64.5±11.0 | 70.1±2.7 | >0.05 |
[表2]
注射了PBS或Dod(C12)-NDc-SP之4週後之小鼠之生化檢查結果
縮寫符號:WBC,白血球;RBC,紅血球;HGB,血紅素;HCT,血容比;MCV,平均紅血球容積;MCH,平均紅血球血紅素量;MCHC,平均紅血球血紅素濃度;PLT,血小板;CRP,C-反應蛋白;TP,總蛋白;ALB,白蛋白;BUN,血尿素氮;CRE,肌酸酐;AST,天冬胺酸轉胺酶;ALT,丙胺酸轉移酶;LDH,乳酸脫氫酶;AMY,澱粉酶;CK,肌酸激酶。
項目 | 單位 | PBS(n=5) | Dod(C12)-NDc-SP(n=5) | p值 |
CRP | μg/mL | 1.2±0.2 | 0.9±0.2 | >0.05 |
TP | g/dL | 3.9±0.2 | 4.1±0.1 | >0.05 |
ALB | g/dL | 2.6±0.2 | 2.8±0.0 | >0.05 |
BUN | mg/dL | 21.6±0.6 | 23.5±3.1 | >0.05 |
CRE | mg/dL | 0.13±0.02 | 0.12±0.01 | >0.05 |
Na | mEq/L | 145.6±1.4 | 148.6±0.5 | >0.05 |
K | mEq/L | 3.9±0.4 | 3.4±0.2 | >0.05 |
Cl | mEq/L | 113.6±1.0 | 117.0±0.9 | >0.05 |
AST | IU/L | 59.4±11.0 | 70.5±11.0 | >0.05 |
ALT | IU/L | 31.2±5.0 | 39.0±7.2 | >0.05 |
LDH | IU/L | 230.0±41.0 | 272.5±44.8 | >0.05 |
AMY | IU/L | 1597.0±133.9 | 1624.2±75.7 | >0.05 |
CK | IU/L | 158.8±45.4 | 166.4±59.1 | >0.05 |
將Dod(C12)-NDc-SP分散液或PBS投予至小鼠之尾靜脈後,調查4週後之全血細胞計數(CBC)以及生化參數,結果於樣品間未見有意義之差。該結果意指Dod(C12)-NDc-SP具有高生物相容性。
[表3]
注射了PBS或PEG-NDa-SP之4週後之小鼠之血液檢查結果
項目 | 單位 | 滅菌水(n=5) | 050GS-NaOc(C8)-NDa-SP(n=5) | 8Arm-NaLA(C12)-NDa-SP(n=5) | p值vs水 |
WBC | ×102 /μL | 59.0±10.7 | 61.0±4.8 | 59.6±12.0 | >0.05 |
RBC | ×104 /μL | 916.8±11.7 | 890.8±21.3 | 901.4±7.1 | >0.05 |
HGB | g/dl | 14.5±0.2 | 14.0±0.4 | 14.1±0.2 | >0.05 |
HCT | % | 42.8±0.5 | 41.5±0.9 | 41.8±0.4 | >0.05 |
MCV | fl | 46.7±0.3 | 46.6±0.2 | 46.3±0.4 | >0.05 |
MCH | pg | 15.8±0.1 | 15.7±0.1 | 15.7±0.1 | >0.05 |
MCHC | g/dl | 33.9±0.3 | 33.7±0.2 | 33.8±0.3 | >0.05 |
PLT | ×104 /μL | 59.5±4.8 | 64.1±5.2 | 58.2±1.9 | >0.05 |
[表4]
注射了PBS或PEG-NDa-SP之4週後之小鼠之生化檢查結果
縮寫符號:WBC,白血球;RBC,紅血球;HGB,血紅素;HCT,血容比;MCV,平均紅血球容積;MCH,平均紅血球血紅素量;MCHC,平均紅血球血紅素濃度;PLT,血小板;CRP,C-反應蛋白;TP,總蛋白;ALB,白蛋白;BUN,血尿素氮;CRE,肌酸酐;AST,天冬胺酸轉胺酶;ALT,丙胺酸轉移酶;LDH,乳酸脫氫酶;AMY,澱粉酶;CK,肌酸激酶。
項目 | 單位 | 滅菌水(n=5) | 050GS-NaOc(C8)-NDa-SP(n=5) | 8Arm-NaLA(C12)-NDa-SP(n=5) | p值vs水 |
CRP | μg/mL | 1.2±0.2 | 1.0±0.1 | 1.1±0.1 | >0.05 |
TP | g/dL | 4.1±0.3 | 4.1±0.1 | 4.1±0.2 | >0.05 |
ALB | g/dL | 2.7±0.2 | 2.8±0.1 | 2.8±0.1 | >0.05 |
BUN | mg/dL | 22.0±4.6 | 23.1±2.6 | 21.7±1.8 | >0.05 |
CRE | mg/dL | 0.14±0.03 | 0.12±0.01 | 0.11±0.01 | >0.05 |
Na | mEq/L | 148.2±0.8 | 149.8±1.1 | 150.0±1.1 | >0.05 |
K | mEq/L | 3.7±0.3 | 3.8±0.1 | 3.5±0.2 | >0.05 |
Cl | mEq/L | 112.2±1.0 | 113.0±1.4 | 115.0±0.9 | >0.05 |
AST | IU/L | 60.8±14.3 | 67.2±14.8 | 64.8±6.4 | >0.05 |
ALT | IU/L | 40.0±13.0 | 39.0±7.3 | 36.6±7.0 | >0.05 |
LDH | IU/L | 266.2±90.1 | 296.2±38.6 | 265.4±51.4 | >0.05 |
AMY | IU/L | 1852.4±181.2 | 1683.4±95.5 | 1823.8±74.3 | >0.05 |
CK | IU/L | 232.2±63.2 | 219.2±68.4 | 202.0±55.6 | >0.05 |
將分散有PEG-NDc-SP之滅菌水或僅將滅菌水投予至小鼠之尾靜脈後,調查4週後之全血細胞計數(CBC)以及生化參數,結果於樣品間未見有意義之差。該結果意指PEG-NDc-SP具有高生物相容性。
無
[圖1]係利用具有羧基之奈米鑽石(NDc)之超粒子(SP)(NDc-SP)之合成方法。藉由縮合反應將NDc-ori(由NDc所構成之原料)之羧基與胺基末端烷基分子之胺基進行共價鍵結,進行超音波照射,藉此可製備自組織化NDc-SP奈米簇。
[圖2]a)為導入有烷基鏈長不同之胺基末端烷基分子(C8-NH2
、C12-NH2
、C18-NH2
)之各種NDc-SP水溶液之照片。ND濃度均為5.6 mg ml-1
。
b)為各種NDc-SP之藉由DLS測定所獲得之粒徑之結果。已判明粒徑隨烷基鏈之鏈長而變大。認為若鏈長變長則NDc表面之疏水性變高,結果NDc粒子間之相互作用變高,結果變成較大之粒徑。
c)為各種NDc-SP之TEM影像。將高倍率影像顯示於各影像之左上方。可知與DLS(動態光散射)之結果同樣地,若烷基鏈長變大則實際之粒徑亦增大。
Oct(C8)及Oct(C8)-NDc-SP表示經辛基修飾之NDc進行自組織化而成之奈米簇,Dod(C12)及Dod(C12)-NDc-SP表示經十二烷基修飾之NDc進行自組織化而成之奈米簇,Ole(C18)及Ole(C18)-NDc-SP表示經油基(oleyl group)修飾之NDc進行自組織化而成之奈米簇。
[圖3]a)為各種NDc-SP及作為製造原料之NDc-ori之UV-Vis-NIR吸收光譜。ND濃度統一為56 μg ml-1
。
b)為NDc-ori以及各種NDc-SP之熱重分析術(TGA)測定結果。自本測定結果可知,NDc-SP中之Oct(C8)、Dod(C12)、Ole(C18)在簇中之比率分別為約13%, w/w、約17%, w/w、約35%, w/w。
[圖4]a)為各種NDc-SP之細胞毒性評價。測定使各種NDc-SP暴露於人骨肉瘤細胞(U2OS)24小時後之存活率。
b)為將喜樹鹼(CPT)封入至Dod(C12)-NDc-SP前後之UV-Vis-NIR吸收光譜。於CPT封入後,由於可確認源自CPT之明確之波峰,故而提示已將CPT順利地導入至NDc-SP。
c)為CPT@NDc-ori、CPT@Oct(C8)-NDc-SP、CPT@Dod(C12)-NDc-SP之抗癌活性。示出使用人U2OS細胞並使各種奈米複合體暴露24小時後之細胞存活率。可知CPT@Dod(C12)-NDc-SP與其他奈米複合體相比具有高10%之抗癌活性。認為藉由源自Dod(C12)之較長之烷基鏈,使得與癌細胞之親和性進一步變高,而表現較高之抗癌活性。
d)為導入有CPT之普通奈米醫學(PEGMEM、F127、DSPE-PEG)與CPT@Dod(C12)-NDc-SP之對U2OS暴露24小時後之抗癌活性之比較試驗。於使用CPT@Dod(C12)-NDc-SP之情形時,大約90%之癌細胞死亡。其結果為,與PEGMEM(約34%死亡)、F127(約33%死亡)、DSPE-PEG(約46%死亡)相比亦可見最大為57%之藥理活性之改善。以上結果強烈提示了NDc-SP作為抗癌劑之奈米載體有用。
[圖5]係利用具有胺基官能基之奈米鑽石(NDa)之奈米簇(NDa-SP)之合成方法。藉由縮合反應使NDa-ori之胺基及具有羧基末端烷基鏈之化合物(NaOc(C8)、NaLA(C12)、NaOle(C18))之羧基與胺基官能基進行共價鍵結,進行超音波照射,藉此可製備自組織化NDa-SP奈米簇。
[圖6]a)為具有與原料NDa-ori不同之烷基鏈之各種NDa-SPs(NaOc(C8)、NaLA(C12)、NaOle(C18))水溶液之照片。各水溶液中之ND濃度為3 mg ml-1
。
b)為Nda-ori以及各種NDa-SPs之藉由DLS測定所獲得之粒徑。可知可隨烷基鏈長而控制粒徑。
c)為各種NDa-SPs之TEM影像。可知雖然粒徑隨烷基鏈長而增大,但對DLS之結果互補對應。
d)為Nda-ori以及各種NDa-SP之高倍率TEM影像。
NaOc(C8)-NDa-SP表示經辛基修飾之NDa進行自組織化而成之奈米簇,NaLA(C12)-NDa-SP表示經十二烷基修飾之NDa進行自組織化而成之奈米簇,NaOle(C18)-NDa-SP表示經油基修飾之NDa進行自組織化而成之奈米簇。
[圖7]a)為Nda-ori以及各種NDa-SPs(NaOc(C8)-NDa-SP、NaLA(C12)-NDa-SP、NaOle(C18)-NDa-SP)之UV-Vis-NIR吸收光譜。各水溶液中之ND濃度為30 μg ml-1
。
b)為NDa-ori以及各種NDa-SPs(NaOc(C8)-NDa-SP、NaLA(C12)-NDa-SP、NaOle(C18)-NDa-SP)之TGA測定。可知NDa-SPs中之NaOc(C8)、NaLA(C12)、NaOle(C18)分別為約8%, w/w、約17%, w/w、約24%, w/w。
c)為NDa-ori以及各種NDa-SPs中之胺基量(NH2
loading)與界面張力。胺基之定量係使用凱撒測試(Kaiser test),將NDa-ori設為100%而算出各奈米粒子中之胺基量。表面張力係於水溫25℃下測定ND濃度為3 mg ml-1
之樣品。可知由於導入烷基鏈,故而NDa-SPs中之胺基減少。又,與NDa-ori相比,NDa-SPs均觀察到表面張力之降低。該結果意指藉由導入烷基鏈,而NDa-SP帶有界面活性劑類之性質。
d)為各種NDa-SPs之細胞毒性評價。於本試驗中,藉由WST-8測定使用U2OS細胞並使各種奈米粒子暴露24小時後之細胞存活率。其結果可知任何NDa-SPs(NaOc(C8)-NDa-SP、NaLA(C12)-NDa-SP、NaOle(C18)-NDa-SP)其細胞毒性均較低。
[圖8]係經聚乙二醇(PEG)被覆之NDa-SP(PEG coated-NDa-SP或PEG-NDa-SP)之合成與利用非共價鍵之向PEG-NDa-SP內之藥物封入。
於本研究中之PEG修飾中,未利用粒徑較大之NaOle(C18)-NDa-SP(平均粒徑167 nm)。其原因在於:據說奈米粒子之EPR(enhanced permeability and retention,高滲透長滯留)效果之表現最佳為100 nm以下,而考慮100 nm以上之NaOle(C18)-NDa-SP不適於實驗。
[圖9]a)為導入有紫杉醇(PTX)之050GS-NaLA(C12)-NDa-SP之剛合成後與24小時後之照片。奈米複合體中之ND與PTX濃度分別為0.3、0.1 mg ml-1
。於24小時後,形成沈澱,難說是分散穩定性高,因此不將050GS-NaLA(C12)-NDa-SP用於以下之實驗。再者,050GS表示使用作為市售品之SUNBRIGHT(註冊商標)ME-050GS來導入PEG。
b)為8Arm-NaOc(C8)-NDa-SP與8Arm-NaLA(C12)-NDa-SP之剛合成後與24小時後之照片。任一奈米複合體均使用ND濃度為3 mg ml-1
之NDa-SP。若運用8Arm,則可使NDa-SP之分散性提高。但,最終產物之8Arm-NaOc(C8)-NDa-SP由於分散性變得過高,故而可藉由離心分離來回收之奈米粒子之濃度較低。基於以上結果,於以下試驗中將8Arm-NaLA(C12)-NDa-SP用於實驗。再者,8-Arm表示藉由作為市售品之8-ArmPEG-SCM將PEG基導入至NDa。
[圖10]a)為導入有PTX之經PEG修飾之NDa-SPs(050GS-NaOc(C8)-NDa-SP與8Arm-NaLA(C12)-NDa-SP)與未經PEG修飾之NDa-SPs(NaOc(C8)-NDa-SP與NaLA(C12)-NDa-SP)之24小時後之水中分散性。奈米複合體中之NDa與PTX濃度分別為3 mg ml-1
、1 mg ml-1
。可知經050GS與8Arm被覆之NDa-SP於PTX導入後亦具有較高之水中分散性。基於以上藥物導入後之水中分散性之結果,本研究決定將050GS-NaOc(C8)-NDa-SP與8Arm-NaLa(C12)-NDa-SP作為藥物載體用於以後之實驗。
b)為PEG-NDa-SP之PTX導入前後之平均粒徑之變化。
c)為導入有PTX之PEG-NDa-SPs(050GS-NaOc(C8)-NDa-SP與8Arm-NaLA(C12)-NDa-SP)之歷時5天之水中分散穩定性之評價。資料示出了PTX@050GS-NaOc(C8)-NDa-SP(左)與PTX@8Arm-NaLA(C12)-NDa-SP水溶液(右)之經時性DLS測定值(粒徑)。內部之照片係剛合成後與5天後之情況。可知完全不見凝聚物。
[圖11]a)為050GS-NaOc(C8)-NDa-SP與8Arm-NaLA(C12)-NDa-SP之TEM影像。
b)為PTX@050GS-NaOc(C8)-NDa-SP、PTX@8Arm-NaLA(C12)-NDa-SP、PTX之UV-Vis-NIR吸收光譜。由於在各奈米複合體中可確認源自PTX之波峰,故而可確認如概念圖般PTX被順利地封入。
[圖12]為導入有PTX之PEG-NDa-SP之抗癌活性評價。
a)為050GS-NaOc(C8)-NDa-SP(左)與8Arm-NaLA(C12)-NDa-SP(右)之對SKOV3、U2OS、TIG3暴露24小時後之細胞毒性評價。
b)為PTX@050GS-NaOc(C8)-NDa-SP以及PTX@8Arm-NaLA(C12)-NDa-SP與經FDA認可之PTX製劑Abraxane之抗癌活性比較試驗。利用SKOV3細胞,使各種奈米複合體暴露,而調查24小時後(左)以及48小時後(右)。
c)為使各種奈米複合體暴露了24小時之SKOV3細胞之相位差影像(phase)以及結晶紫(crystal violet)染色影像(CV staining)。050GS-NaOc(C8)-NDa-SP與8Arm-NaLA(C12)-NDa-SP中之ND濃度為30 μg ml-1
。PTX@050GS-NaOc(C8)-NDa-SP與PTX@8Arm-NaLA(C12)-NDa-SP中之PTX以及ND濃度分別為10 ng ml-1
、30 ng ml-1
。自影像可知,PTX@050GS-NaOc(C8)-NDa-SP與PTX@8Arm-NaLA(C12)-NDa-SP之抗癌活性明顯較高。
Claims (14)
- 一種奈米簇,其係經高級烷基或高級烯基修飾之碳奈米材料進行自組織化而成者。
- 如請求項1之奈米簇,其係碳奈米材料進而經聚伸烷基二醇(polyalkylene glycol)修飾而成者。
- 如請求項2之奈米簇,其係經聚乙二醇修飾而成者。
- 如請求項1至3中任一項之奈米簇,其係高級烷基或高級烯基、聚伸烷基二醇經選自由-NH-、-O-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NH-、-NH-CO-、-NH-CO-O-、-O-CO-NH-、-O-CO-O-、及-NH-CO-NH-所組成之群中之任一種連結基連結於碳奈米材料而成者。
- 如請求項1至4中任一項之奈米簇,其係上述碳奈米材料具有選自由OH、COOH及NH2 所組成之群中之至少一種表面基且高級烷基或高級烯基經由上述表面基鍵結於碳奈米材料而成者。
- 如請求項2之奈米簇,其係上述碳奈米材料具有選自由OH、COOH及NH2 所組成之群中之至少一種表面基且聚伸烷基二醇經由上述表面基鍵結於碳奈米材料而成者。
- 如請求項1至5中任一項之奈米簇,其與有效成分複合化。
- 如請求項7之奈米簇,其中,有效成分為生理活性物質、標記物質、香料、精油或有機色素。
- 如請求項1至8中任一項之奈米簇,其中,碳奈米材料為碳奈米鑽石或碳奈米點(carbon nano dot)。
- 一種有效成分之遞輸載體,其包含請求項1至9中任一項之奈米簇。
- 一種碳奈米材料,其係經高級烷基及/或高級烯基與聚伸烷基二醇修飾而成者。
- 如請求項11之碳奈米材料,其係高級烷基或高級烯基、以及聚伸烷基二醇經選自由-NH-、-O-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NH-、-NH-CO-、-NH-CO-O-、-O-CO-NH-、-O-CO-O-、及-NH-CO-NH-所組成之群中之任一種連結基連結而成者。
- 如請求項11或12之碳奈米材料,其中,碳奈米材料為碳奈米鑽石。
- 一種醫藥組成物,其包含與醫藥複合化之請求項1之自組織化而成之奈米簇。
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