TW202043773A - 藉由含有pd-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效性之預測及/或判定標記 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種於藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑治療疾病之前或較早之階段判別有效性之標記。作為用以預測或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效性之生物標記，使用下述(i)及/或(ii)。 (i)血清及/或血漿中之至少一種代謝物，該代謝物係選自由丙胺酸、4-甲酚、半胱胺酸、馬尿酸、油酸、硫酸吲哚酚、核糖、吲哚乙酸酯、尿酸、反式4-咪唑丙烯酸、2-哌啶甲酸、N-乙醯葡萄糖胺、吲哚乳酸、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、胱胺酸、硫酸吲哚酚、葡萄糖酸、瓜胺酸、肌酸酐、N-乙醯天冬胺酸、焦麩胺酸、三甲基離胺酸、非對稱性二甲基精胺酸、對稱性二甲基精胺酸、甲基組胺酸、醯基肉鹼、3-胺基異丁酸、乙醯肌肽、精胺酸、N-乙醯鳥胺酸、3-羥基異戊酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、GSSG、2-羥基丁酸、1,5-脫水-D-山梨糖醇、麩醯胺、甘胺酸、離胺酸、牛磺酸、AMP、乙醯肌肽、3-羥基丁酸、2-羥基異戊酸、乙醯乙酸、色胺酸、2-羥基戊二酸、蘋果酸、喹啉酸、己酸、異白胺酸、GSH及3-OH-犬尿胺酸所組成之群。 (ii)末梢血液中之至少一種細胞標記，該細胞標記係選自由末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC)、末梢血液單核球(PBMC)中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC)、CD8+ T細胞中之初始T細胞之頻率(% of Tnaive among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞中之效應記憶T細胞之頻率(% of Tem among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞之線粒體活化狀態相對於CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之比(例如CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比(Mito SOX CD8/CD4)、CD8+ T細胞之線粒體之體積相對於CD4+ T細胞之線粒體之體積(mass)的比(Mito mass CD8/CD4))、CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現(PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells)、高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率(% of PD-1high among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現FoxP3之CD45RA+ T細胞群之頻率(% of FoxP3low CD45RA+ among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中高表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bethigh among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-betlow among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bet+ among CD8+ T cells)、及CD8+ T細胞中表現T-bet及EOMES之T細胞群之頻率(% of T-bet+ EOMES+ among CD8+ T cells)所組成之群。

Description

藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效性之預測及/或判定標記
本發明係關於一種藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效性之預測及/或判定標記。
根據近年來之臨床試驗之結果，可知抗PD-1抗體治療於各種癌症中比先前之標準治療更有效[非專利文獻1-3]。若與先前之免疫治療法進行比較，則抗PD-1抗體治療之奏效率單獨為20-30%，藉由並用而戲劇性地上升至60-70%。但是，表現出無應答性之患者有約一半左右亦為事實。該等患者對抗PD-1抗體治療無應答之原因仍幾乎不知曉。
目前，美國食品及藥物管理局(Food and Drug Administration；FDA)認可之抗PD-1抗體治療之標記有2個。
一個為癌細胞上之PD-L1之表現為50%以上，帕博利珠單抗可首先適應於50%之患者者[非專利文獻4]。
另一個為癌細胞之變異數，若一定以上之變異數存在於實體癌細胞，則可使納武單抗適應於該等癌症[非專利文獻5]。
FDA所認可之標記聚焦於腫瘤，但本發明者等人發現了宿主之血中代謝物(代謝產物)或著眼於免疫活化之標記(專利文獻1)。 [先前技術文獻] [非專利文獻]
非專利文獻1：Borghaei H, Paz-Ares L, Horn L, et al: Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med, 373:1627-1639, 2015. 非專利文獻2：Hamanishi J, Mandai M, Ikeda T, et al: Safety and Antitumor Activity of Anti-PD-1 Antibody, Nivolumab, in Patients With Platinum-Resistant Ovarian Cancer. J Clin Oncol, 2015. 非專利文獻3：Motzer RJ, Escudier B, McDermott DF, et al: Nivolumab versus Everolimus in Advanced Renal-Cell Carcinoma. N Engl J Med, 373:1803-1813, 2015. 非專利文獻4：Pembrolizumab versus Chemotherapy for PD-L1-Positive Non-Small-Cell Lung Cancer. Martin Reck et al. KEYNOTE-024 Investigators. N Engl J Med. 2016 Nov 10; 375(19):1823-1833. Epub 2016 Oct 8. 非專利文獻5：Tumor Mutational Burden and Response Rate to PD-1 Inhibition. Yarchoan M, Hopkins A, Jaffee EM. N Engl J Med. 2017 Dec 21; 377(25):2500-2501 [專利文獻]
專利文獻1：WO2018/084204
[發明所欲解決之問題]
本發明之目的在於提供一種於藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑治療疾病之前或較早之階段判別(預測及/或判定)有效性的標記。 [解決問題之技術手段]
本發明者等人調查了源自藉由抗PD-1抗體納武單抗治療之前及之後之非小細胞肺癌(NSCLC；non-small cell lung cancer)患者之血液之血漿代謝物及細胞標記(包含線粒體相關標記)。其結果顯示與微生物組、能量代謝及氧化還原相關之代謝物與納武單抗應答性相關。又，亦可知細胞標記與血漿代謝物相關。本發明係根據該等見解而完成者。
本發明之主旨如下所述。 (1)一種檢查方法，其包括以下述(i)及/或(ii)作為指標，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效性之操作。 (i)血清及/或血漿中之至少一種代謝物，該代謝物係選自由丙胺酸、4-甲酚、半胱胺酸、馬尿酸、油酸、硫酸吲哚酚、核糖、吲哚乙酸酯、尿酸、反式4-咪唑丙烯酸、2-哌啶甲酸、N-乙醯葡萄糖胺、吲哚乳酸、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、胱胺酸、硫酸吲哚酚、葡萄糖酸、瓜胺酸、肌酸酐、N-乙醯天冬胺酸、焦麩胺酸、三甲基離胺酸、非對稱性二甲基精胺酸、對稱性二甲基精胺酸、甲基組胺酸、醯基肉鹼、3-胺基異丁酸、乙醯肌肽、精胺酸、N-乙醯鳥胺酸、3-羥基異戊酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、GSSG、2-羥基丁酸、1,5-脫水-D-山梨糖醇、麩醯胺、甘胺酸、離胺酸、牛磺酸、AMP、乙醯肌肽、3-羥基丁酸、2-羥基異戊酸、乙醯乙酸、色胺酸、2-羥基戊二酸、蘋果酸、喹啉酸、己酸、異白胺酸、GSH及3-OH-犬尿胺酸所組成之群 (ii)末梢血液中之至少一種細胞標記，該細胞標記係選自由末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC)、末梢血液單核球(PBMC)中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC)、CD8+ T細胞中之初始T細胞之頻率(% of Tnaive among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞中之效應記憶T細胞之頻率(% of Tem among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞之線粒體活化狀態相對於CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之比(例如CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比(Mito SOX CD8/CD4)、CD8+ T細胞之線粒體之體積相對於CD4+ T細胞之線粒體之體積(mass)的比(Mito mass CD8/CD4))、CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現(PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells)、高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率(% of PD-1high among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現FoxP3之CD45RA+ T細胞群之頻率(% of FoxP3low CD45RA+ among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中高表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bethigh among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-betlow among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bet+ among CD8+ T cells)、及CD8+ T細胞中表現T-bet及EOMES之T細胞群之頻率(% of T-bet+ EOMES+ among CD8+ T cells)所組成之群 (2)如(1)所記載之方法，其係以表4及5所示之時間點(Time point)或2個時間點之比(Ratio of two time points)下之代謝物(Metabolite)及/或細胞標記(Cellular marker)之值較高或較低(Changes in R relative to NR)作為基準，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效性。 (3)如(1)或(2)所記載之方法，其中(i)之代謝物係選自由馬尿酸、阿拉伯糖及醯基肉鹼所組成之群中之至少一種代謝物，(ii)之細胞標記係選自由高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率、CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比、以及CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現所組成之群中的至少一種細胞標記。 (4)如(1)所記載之方法，其中於投予藥劑前之血清及/或血漿中之半胱胺酸之值較高，且投予藥劑前之血清及/或血漿中之馬尿酸之值較高的情形時，預測藉由藥劑之治療有效。 (5)如(1)所記載之方法，其中於第1次投予藥劑後之血清及/或血漿中之阿拉伯糖之值較高，第1次投予藥劑後之血清及/或血漿中之精胺酸之值較高，且第1次投予藥劑後之血清及/或血漿中之丁醯肉鹼之值較低的情形時，判定藉由藥劑之治療有效。 (6)如(1)所記載之方法，其中於投予藥劑前之血清及/或血漿中之馬尿酸之值較高，第1次投予藥劑後之血清及/或血漿中之胱胺酸之值較高，第2次投予藥劑後之血清及/或血漿中之麩胱甘肽二硫醚之值較高，且第2次投予藥劑後之血清及/或血漿中之丁醯肉鹼之值較低的情形時，判定藉由藥劑之治療有效。 (7)如(1)至(6)中任一項所記載之方法，其中於投予藥劑前之末梢血液中之高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率較低，且投予藥劑前之末梢血液中之CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比較高的情形時，預測藉由藥劑之治療有效。 (8)如(1)至(6)中任一項所記載之方法，其中於投予藥劑前之末梢血液中之高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率較低，投予藥劑前之末梢血液中之CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比較高，末梢血液中之CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現之第1次投予藥劑後相對於投予藥劑前之比較低，且末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率之第1次投予藥劑後相對於投予藥劑前之比較高的情形時，判定藉由藥劑之治療有效。 (9)如(1)至(6)中任一項所記載之方法，其中於投予藥劑前之末梢血液中之高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率較低，投予藥劑前之末梢血液中之CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比較高，末梢血液中之CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現之第2次投予藥劑後相對於第1次投予藥劑後之比較高，且末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率之第1次投予藥劑後相對於投予藥劑前之比較高的情形時，判定藉由藥劑之治療有效。 (10)如(1)至(9)中任一項所記載之方法，其中PD-1訊息抑制劑為抗體。 (11)如(10)所記載之方法，其中抗體係選自由抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體及抗PD-L2抗體所組成之群中之至少1種抗體。 (12)如(1)至(11)中任一項所記載之方法，其中含有PD-1訊息抑制劑之藥劑用作抗癌劑、傳染病治療劑或該等之組合中之有效成分。 (13)一種疾病之診斷及治療方法，其包括：以下述(i)及/或(ii)作為指標，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療對受驗者之有效性，於預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效之情形時，投予對於治療該受驗者有效之量之含有PD-1訊息抑制劑之藥劑。 (i)血清及/或血漿中之至少一種代謝物，該代謝物係選自由丙胺酸、4-甲酚、半胱胺酸、馬尿酸、油酸、硫酸吲哚酚、核糖、吲哚乙酸酯、尿酸、反式4-咪唑丙烯酸、2-哌啶甲酸、N-乙醯葡萄糖胺、吲哚乳酸、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、胱胺酸、硫酸吲哚酚、葡萄糖酸、瓜胺酸、肌酸酐、N-乙醯天冬胺酸、焦麩胺酸、三甲基離胺酸、非對稱性二甲基精胺酸、對稱性二甲基精胺酸、甲基組胺酸、醯基肉鹼、3-胺基異丁酸、乙醯肌肽、精胺酸、N-乙醯鳥胺酸、3-羥基異戊酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、GSSG、2-羥基丁酸、1,5-脫水-D-山梨糖醇、麩醯胺、甘胺酸、離胺酸、牛磺酸、AMP、乙醯肌肽、3-羥基丁酸、2-羥基異戊酸、乙醯乙酸、色胺酸、2-羥基戊二酸、蘋果酸、喹啉酸、己酸、異白胺酸、GSH及3-OH-犬尿胺酸所組成之群 (ii)末梢血液中之至少一種細胞標記，該細胞標記係選自由末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC)、末梢血液單核球(PBMC)中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC)、CD8+ T細胞中之初始T細胞之頻率(% of Tnaive among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞中之效應記憶T細胞之頻率(% of Tem among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞之線粒體活化狀態相對於CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之比(例如CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比(Mito SOX CD8/CD4)、CD8+ T細胞之線粒體之體積相對於CD4+ T細胞之線粒體之體積(mass)的比(Mito mass CD8/CD4))、CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現(PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells)、高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率(% of PD-1high among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現FoxP3之CD45RA+ T細胞群之頻率(% of FoxP3low CD45RA+ among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中高表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bethigh among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-betlow among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bet+ among CD8+ T cells)、及CD8+ T細胞中表現T-bet及EOMES之T細胞群之頻率(% of T-bet+ EOMES+ among CD8+ T cells)所組成之群 (14)一種醫藥組合物，其包含用於疾病之診斷及治療方法之含有PD-1訊息抑制劑之藥劑作為有效成分，該疾病之診斷及治療方法包括：以下述(i)及/或(ii)作為指標，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療對受驗者之有效性，於預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效之情形時，投予對於治療該受驗者有效之量之含有PD-1訊息抑制劑之藥劑。 (i)血清及/或血漿中之至少一種代謝物，該代謝物係選自由丙胺酸、4-甲酚、半胱胺酸、馬尿酸、油酸、硫酸吲哚酚、核糖、吲哚乙酸酯、尿酸、反式4-咪唑丙烯酸、2-哌啶甲酸、N-乙醯葡萄糖胺、吲哚乳酸、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、胱胺酸、硫酸吲哚酚、葡萄糖酸、瓜胺酸、肌酸酐、N-乙醯天冬胺酸、焦麩胺酸、三甲基離胺酸、非對稱性二甲基精胺酸、對稱性二甲基精胺酸、甲基組胺酸、醯基肉鹼、3-胺基異丁酸、乙醯肌肽、精胺酸、N-乙醯鳥胺酸、3-羥基異戊酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、GSSG、2-羥基丁酸、1,5-脫水-D-山梨糖醇、麩醯胺、甘胺酸、離胺酸、牛磺酸、AMP、乙醯肌肽、3-羥基丁酸、2-羥基異戊酸、乙醯乙酸、色胺酸、2-羥基戊二酸、蘋果酸、喹啉酸、己酸、異白胺酸、GSH及3-OH-犬尿胺酸所組成之群 (ii)末梢血液中之至少一種細胞標記，該細胞標記係選自由末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC)、末梢血液單核球(PBMC)中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC)、CD8+ T細胞中之初始T細胞之頻率(% of Tnaive among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞中之效應記憶T細胞之頻率(% of Tem among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞之線粒體活化狀態相對於CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之比(例如CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比(Mito SOX CD8/CD4)、CD8+ T細胞之線粒體之體積相對於CD4+ T細胞之線粒體之體積(mass)的比(Mito mass CD8/CD4))、CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現(PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells)、高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率(% of PD-1high among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現FoxP3之CD45RA+ T細胞群之頻率(% of FoxP3low CD45RA+ among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中高表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bethigh among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-betlow among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bet+ among CD8+ T cells)、及CD8+ T細胞中表現T-bet及EOMES之T細胞群之頻率(% of T-bet+ EOMES+ among CD8+ T cells)所組成之群 [發明之效果]
由於使用代表PD-1訊息抑制劑之抗PD-1抗體之治療非常昂貴，故而可於治療前或治療之較早之階段判別治療之有效性會削減治療費。 本說明書包含作為本案之優先權之基礎之日本專利申請案、日本專利特願2019‐000181之說明書及/或圖式所記載之內容。
以下，詳細地說明本發明。
本發明提供一種檢查方法，其包括以下述(i)及/或(ii)作為指標，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效性之操作。 (i)血清及/或血漿中之至少一種代謝物，該代謝物係選自由丙胺酸、4-甲酚、半胱胺酸、馬尿酸、油酸、硫酸吲哚酚、核糖、吲哚乙酸酯、尿酸、反式4-咪唑丙烯酸、2-哌啶甲酸、N-乙醯葡萄糖胺、吲哚乳酸、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、胱胺酸、硫酸吲哚酚、葡萄糖酸、瓜胺酸、肌酸酐、N-乙醯天冬胺酸、焦麩胺酸、三甲基離胺酸、非對稱性二甲基精胺酸、對稱性二甲基精胺酸、甲基組胺酸、醯基肉鹼、3-胺基異丁酸、乙醯肌肽、精胺酸、N-乙醯鳥胺酸、3-羥基異戊酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、GSSG、2-羥基丁酸、1,5-脫水-D-山梨糖醇、麩醯胺、甘胺酸、離胺酸、牛磺酸、AMP、乙醯肌肽、3-羥基丁酸、2-羥基異戊酸、乙醯乙酸、色胺酸、2-羥基戊二酸、蘋果酸、喹啉酸、己酸、異白胺酸、GSH及3-OH-犬尿胺酸所組成之群 (ii)末梢血液中之至少一種細胞標記，該細胞標記係選自由末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC)、末梢血液單核球(PBMC)中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC)、CD8+ T細胞中之初始T細胞之頻率(% of Tnaive among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞中之效應記憶T細胞之頻率(% of Tem among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞之線粒體活化狀態相對於CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之比(例如CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比(Mito SOX CD8/CD4)、CD8+ T細胞之線粒體之體積相對於CD4+ T細胞之線粒體之體積(mass)的比(Mito mass CD8/CD4))、CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現(PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells)、高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率(% of PD-1high among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現FoxP3之CD45RA+ T細胞群之頻率(% of FoxP3low CD45RA+ among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中高表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bethigh among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-betlow among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bet+ among CD8+ T cells)、及CD8+ T細胞中表現T-bet及EOMES之T細胞群之頻率(% of T-bet+ EOMES+ among CD8+ T cells)所組成之群
於本發明之一實施態樣中，較佳為以表4及5(下述實施例1)所示之時間點(Time point)或2個時間點之比(Ratio of two time points)下之代謝物(Metabolite)及/或細胞標記(Cellular marker)之值較高或較低(Changes in R relative to NR)作為基準，根據受驗者之測定值，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療對受驗者之有效性。 將其例記載於以下。該等基準可單獨使用，亦可加以組合。表 4( 血清及 / 或血漿中所檢測之代謝物 ) (治療(投予藥劑)前(時間點：1st)) ・於治療(投予藥劑)前(時間點：1st)丙胺酸(代謝物：丙胺酸)之值較高(相對於NR，R中之變化：更高)之情形時，預測藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於治療前4-甲酚之值較高之情形時，預測藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於治療前半胱胺酸之值較高之情形時，預測藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於治療前馬尿酸之值較高之情形時，預測藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於治療前油酸之值較高之情形時，預測藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於治療前硫酸吲哚酚之值較高之情形時，預測藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於治療前核糖之值較高之情形時，預測藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於治療前吲哚乙酸酯之值較高之情形時，預測藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於治療前尿酸之值較高之情形時，預測藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於治療前反式4-咪唑丙烯酸之值較高之情形時，預測藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於治療前2-哌啶甲酸之值較低之情形時，預測藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於治療前N-乙醯葡萄糖胺之值較高之情形時，預測藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 (第1次投予藥劑後(時間點：2nd)) ・・於第1次投予藥劑後(時間點：2nd)尿酸之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後吲哚乙酸之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後阿拉伯糖之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後阿拉伯糖醇之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後馬尿酸之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後胱胺酸之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後硫酸吲哚酚之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後葡萄糖酸之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後瓜胺酸之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後肌酸酐之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後N-乙醯天冬胺酸之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後焦麩胺酸之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後三甲基離胺酸之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後非對稱性二甲基精胺酸之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後對稱性二甲基精胺酸之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後2-哌啶甲酸之值較低之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後甲基組胺酸之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後醯基肉鹼(例如丁醯肉鹼(C4))之值較低之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後3-胺基異丁酸之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後乙醯肌肽之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後丙胺酸之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後精胺酸之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・於第1次投予藥劑後N-乙醯鳥胺酸之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 (第2次投予藥劑後(時間點：3rd)) ・・・於第2次投予藥劑後(時間點：3rd)4-甲酚之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・於第2次投予藥劑後3-羥基異戊酸之值較低之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・於第2次投予藥劑後丙酮酸之值較低之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・於第2次投予藥劑後α-酮戊二酸之值較低之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・於第2次投予藥劑後馬尿酸之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・於第2次投予藥劑後胱胺酸之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・於第2次投予藥劑後硫酸吲哚酚之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・於第2次投予藥劑後GSSG之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・於第2次投予藥劑後尿酸之值較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・於第2次投予藥劑後2-羥基丁酸之值較低之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・於第2次投予藥劑後2-哌啶甲酸之值較低之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・於第2次投予藥劑後醯基肉鹼(例如丁醯肉鹼(C4))之值較低之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 (第1次投予藥劑後之值相對於治療(投予藥劑)前之值之比(兩個時間點之比：2nd /1st)) ・・・・於第1次投予藥劑後之肌酸酐之值相對於治療(投予藥劑)前之肌酸酐之值之比(兩個時間點之比)較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・於第1次投予藥劑後之1,5-脫水-D-山梨糖醇之值相對於治療(投予藥劑)前之1,5-脫水-D-山梨糖醇之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・於第1次投予藥劑後之胱胺酸之值相對於治療(投予藥劑)前之胱胺酸之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・於第1次投予藥劑後之麩醯胺之值相對於治療(投予藥劑)前之麩醯胺之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・於第1次投予藥劑後之甘胺酸之值相對於治療(投予藥劑)前之甘胺酸之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・於第1次投予藥劑後之離胺酸之值相對於治療(投予藥劑)前之離胺酸之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・於第1次投予藥劑後之焦麩胺酸之值相對於治療(投予藥劑)前之焦麩胺酸之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・於第1次投予藥劑後之牛磺酸之值相對於治療(投予藥劑)前之牛磺酸之值之比較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・於第1次投予藥劑後之非對稱性二甲基精胺酸之值相對於治療(投予藥劑)前之非對稱性二甲基精胺酸之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・於第1次投予藥劑後之AMP之值相對於治療(投予藥劑)前之AMP之值之比較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・於第1次投予藥劑後之醯基肉鹼(例如異戊醯肉鹼(C5))之值相對於治療(投予藥劑)前之醯基肉鹼(例如異戊醯肉鹼(C5))之值之比較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・於第1次投予藥劑後之醯基肉鹼(例如己醯肉鹼(C6))之值相對於治療(投予藥劑)前之醯基肉鹼(例如己醯肉鹼(C6))之值之比較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・於第1次投予藥劑後之乙醯肌肽之值相對於治療(投予藥劑)前之乙醯肌肽之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・於第1次投予藥劑後之精胺酸之值相對於治療(投予藥劑)前之精胺酸之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・於第1次投予藥劑後之瓜胺酸之值相對於治療(投予藥劑)前之瓜胺酸之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・於第1次投予藥劑後之N-乙醯鳥胺酸之值相對於治療(投予藥劑)前之N-乙醯鳥胺酸之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 (第2次投予藥劑後之值相對於治療(投予藥劑)前之值之比(兩個時間點之比：3rd /1st)) ・・・・・於第2次投予藥劑後之3-羥基丁酸之值相對於治療(投予藥劑)前之3-羥基丁酸之值之比較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之2-羥基異戊酸之值相對於治療(投予藥劑)前之2-羥基異戊酸之值之比較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之肌酸酐之值相對於治療(投予藥劑)前之肌酸酐之值之比較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之馬尿酸之值相對於治療(投予藥劑)前之馬尿酸之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之油酸之值相對於治療(投予藥劑)前之油酸之值之比較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之乙醯乙酸之值相對於治療(投予藥劑)前之乙醯乙酸之值之比較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之核糖之值相對於治療(投予藥劑)前之核糖之值之比較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之GSSG之值相對於治療(投予藥劑)前之GSSG之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之色胺酸之值相對於治療(投予藥劑)前之色胺酸之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之2-羥基戊二酸之值相對於治療(投予藥劑)前之2-羥基戊二酸之值之比較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之蘋果酸之值相對於治療(投予藥劑)前之蘋果酸之值之比較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之喹啉酸之值相對於治療(投予藥劑)前之喹啉酸之值之比較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・於第1次投予藥劑後之醯基肉鹼(例如丁醯肉鹼(C4))之值相對於治療(投予藥劑)前之醯基肉鹼(例如丁醯肉鹼(C4))之值之比較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 (第2次投予藥劑後之值相對於第1次投予藥劑後之值之比(兩個時間點之比：3rd /2nd )) ・・・・・於第2次投予藥劑後之己酸之值相對於第1次投予藥劑後之己酸之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之4-甲酚之值相對於第1次投予藥劑後之4-甲酚之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之異白胺酸之值相對於第1次投予藥劑後之異白胺酸之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之阿拉伯糖之值相對於第1次投予藥劑後之阿拉伯糖之值之比較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之核糖之值相對於第1次投予藥劑後之核糖之值之比較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之GSH之值相對於第1次投予藥劑後之GSH之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之GSSG之值相對於第1次投予藥劑後之GSSG之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之3-OH-犬尿胺酸之值相對於第1次投予藥劑後之3-OH-犬尿胺酸之值之比較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之馬尿酸之值相對於第1次投予藥劑後之馬尿酸之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・・・・・於第2次投予藥劑後之醯基肉鹼(例如異丁醯肉鹼(C4))之值相對於第1次投予藥劑後之醯基肉鹼(例如異丁醯肉鹼(C4))之值之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。表 5( 末梢血液中之細胞標記 ) ・於第1次投予藥劑後末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC)較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第1次投予藥劑後之末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC)相對於治療(投予藥劑)前之末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC)之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第1次投予藥劑後末梢血液單核球(PBMC)中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC)較高之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第1次投予藥劑後之末梢血液單核球(PBMC)中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC)相對於治療(投予藥劑)前之末梢血液單核球(PBMC)中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC)之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第1次投予藥劑後之CD8+ T細胞中之初始T細胞之頻率(% of Tnaive among CD8+ T cells)相對於治療(投予藥劑)前之CD8+ T細胞中之初始T細胞之頻率(% of Tnaive among CD8+ T cells)之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第1次投予藥劑後之CD4+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD4+ T cells)相對於治療(投予藥劑)前之CD4+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD4+ T cells)之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第1次投予藥劑後之CD8+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD8+ T cells)相對於治療(投予藥劑)前之CD8+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD8+ T cells)之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第2次投予藥劑後之CD8+ T細胞中之效應記憶T細胞之頻率(% of Tem among CD8+ T cells)相對於治療(投予藥劑)前之CD8+ T細胞中之效應記憶T細胞之頻率(% of Tem among CD8+ T cells)之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第1次投予藥劑後之CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells)相對於治療(投予藥劑)前之CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells)之比較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第2次投予藥劑後之CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells)相對於第1次投予藥劑後之CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells)之比較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第1次投予藥劑後之CD8+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD8+ T cells)相對於治療(投予藥劑)前之CD8+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD8+ T cells)之比較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於治療(投予藥劑)前CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比(Mito SOX CD8/CD4)較高的情形時，預測藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第1次投予藥劑後CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比(Mito SOX CD8/CD4)較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第2次投予藥劑後CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比(Mito SOX CD8/CD4)較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第2次投予藥劑後之CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比(Mito SOX CD8/CD4)相對於治療(投予藥劑)前之CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比(Mito SOX CD8/CD4)較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於治療(投予藥劑)前CD8+ T細胞之線粒體之體積相對於CD4+ T細胞之線粒體之體積(mass)之比(Mito mass CD8/CD4)較高的情形時，預測藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第2次投予藥劑後CD8+ T細胞之線粒體之體積相對於CD4+ T細胞之線粒體之體積(mass)之比(Mito mass CD8/CD4)較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第1次投予藥劑後CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現(PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells)較低之情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第1次投予藥劑後之CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現(PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells)相對於治療(投予藥劑)前之CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現(PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells)較低的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第2次投予藥劑後之CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現(PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells)相對於第1次投予藥劑後之CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現(PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells)較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於治療(投予藥劑)前高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率(% of PD-1high among CD8+ T cells)較低之情形時，預測藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於治療(投予藥劑)前CD4+ T細胞中低表現FoxP3之CD45RA+ T細胞群之頻率(% of FoxP3low CD45RA+ among CD4+ T cells)較低之情形時，預測藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第2次投予藥劑後之CD4+ T細胞中高表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bethigh among CD4+ T cells)相對於治療(投予藥劑)前之CD4+ T細胞中高表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bethigh among CD4+ T cells)較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第2次投予藥劑後之CD4+ T細胞中低表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-betlow among CD4+ T cells)相對於治療(投予藥劑)前之CD4+ T細胞中低表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-betlow among CD4+ T cells)較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第2次投予藥劑後之CD8+ T細胞中表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bet+ among CD8+ T cells)相對於第1次投予藥劑後之CD8+ T細胞中表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bet+ among CD8+ T cells)較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。 ・於第2次投予藥劑後之CD8+ T細胞中表現T-bet及EOMES之T細胞群之頻率(% of T-bet+ EOMES+ among CD8+ T cells)相對於第1次投予藥劑後之CD8+ T細胞中表現T-bet及EOMES之T細胞群之頻率(% of T-bet+ EOMES+ among CD8+ T cells)較高的情形時，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。
於本發明之較佳之一實施態樣中，較佳為(i)之代謝物係選自由馬尿酸、阿拉伯糖及醯基肉鹼所組成之群中之至少一種代謝物，(ii)之細胞標記係選自由高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率、CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比、以及CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現所組成之群中的至少一種細胞標記。
於本說明書中，「PD-1訊息」係指PD-1所擔負之資訊傳遞機制，作為其一，可例示PD-1與作為其配體之PD-L1、PD-L2共同抑制T細胞之活化之資訊傳遞機制。PD-1(Programmed cell death-1，計劃性細胞死亡蛋白1)係於活化之T細胞或B細胞表現之膜蛋白質，作為其配體之PD-L1及PD-L2係於單核球或樹狀細胞等抗原呈現細胞、癌等各種細胞表現。PD-1、PD-L1及PD-L2係作為抑制T細胞之活化之抑制因子發揮作用。某種癌細胞或病毒感染細胞藉由表現PD-1之配體，抑制T細胞之活化，而自宿主之免疫監視中逃避。
PD-1訊息抑制劑係阻斷PD-1訊息之藥劑，藉由阻斷PD-1訊息，T細胞之活化抑制得到解除而提高免疫監視機制，發揮對癌症或病毒感染之治療效果(PD-1阻斷療法)。作為PD-1訊息抑制劑，可列舉與PD-1、PD-L1或PD-L2特異性地結合之物質，作為此種物質，可有蛋白質、多肽、寡肽、核酸(包含天然型核酸、人工核酸)、低分子有機化合物、無機化合物、細胞萃取物、來自動植物或土壤等之萃取物等。物質可為天然物，亦可為合成物。較佳之PD-1訊息抑制劑為抗體，更佳為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體等抗體。抗體只要為可抑制PD-1訊息者即可，可為多株抗體、單株抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、人類型抗體中之任一者。該等抗體之製造方法係公知。抗體可為源自人類、小鼠、大鼠、兔、山羊、豚鼠等任一生物者。又，於本說明書中，抗體係亦包含Fab、F(ab)'2 、ScFv、雙功能抗體、VH 、VL 、Sc(Fv)2 、雙特異性sc(Fv)2 、微型抗體、scFv-Fc單體、scFv-Fc二聚物等經低分子化者之概念。
於本發明中，含有PD-1訊息抑制劑之藥劑可為不包含其他藥效成分之PD-1訊息抑制劑之單劑，亦可為將PD-1訊息抑制劑與其他藥效成分併用之併用藥。
其他藥效成分可為增強、強化PD-1訊息抑制劑之藥效者，亦可為減輕PD-1訊息抑制劑之副作用者，其藥效並無限定。作為目前認可之併用劑，有伊匹單抗、順鉑、卡鉑、紫杉醇、培美曲塞等。開發中之併用藥劑除目前用作標準治療者以外，亦可列舉較多之能量代謝相關等與免疫控制相關之藥劑或血管新生抑制劑等(1-3)。
含有PD-1訊息抑制劑之藥劑可用作抗癌劑、傳染病治療劑或該等之組合中之有效成分。
成為檢查對象之受驗者可已投予其他藥劑(抗癌劑等)，亦可不投予其他藥劑，較佳為已投予其他藥劑。
於本發明中，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效性可於治療開始前、開始後、複數次投予藥劑之間等任一階段進行。
於本發明之較佳之一實施態樣中，較佳為測定受驗者之血清及/或血漿中之選自由馬尿酸、阿拉伯糖及醯基肉鹼所組成之群中之至少一者。
已知馬尿酸係一種源自微生物相之代謝物，由梭菌優先產生(4、5)。
阿拉伯糖係轉換為作為戊糖磷酸循環之中間物之木酮糖-5-磷酸，進入至NADPH或核酸之合成之代謝路徑。尤其於腸內細菌中高表現該轉換酵素，可能亦對微生物相之菌群造成影響(6)。
醯基肉鹼係藉由作為肉鹼依賴性酵素之肉鹼乙醯基轉移酶及肉鹼棕櫚醯基轉移酶I(CPT1)(該等局部存在於線粒體受質)，自短鏈醯基CoA及肉鹼轉換。醯基肉鹼較佳為碳數4～6之醯基肉鹼，具體而言，較佳為丁醯肉鹼、異戊醯肉鹼、己醯肉鹼。作為碳數4之醯基肉鹼之丁醯肉鹼係作為向線粒體之脂肪酸轉運體發揮作用，生成ATP。具有各種碳數之醯基肉鹼種一旦脂肪酸氧化(FAO)功能減弱，則自細胞釋出。
於本發明中，可以血清及/或血漿中之選自由半胱胺酸、胱胺酸、精胺酸及麩胱甘肽二硫醚所組成之群中之至少一者作為(i)之指標。
半胱胺酸係於麩胱甘肽(GSH)之生物合成及代謝中，與L-麩胺酸結合而形成L-γ-麩胺醯半胱胺酸。其次，其與甘胺酸結合而產生GSH。GSH係與活性氧物種(ROS)進行反應後，被氧化而成為氧化型(麩胱甘肽二硫醚(GSSG))(圖10)。
胱胺酸係麩胱甘肽之成分(圖10)。
精胺酸係作為細胞骨架之構成或能量源較為重要。認為於腫瘤局部環境下，巨噬細胞高產生精胺酸酶，發生由精胺酸耗盡所引起之免疫抑制。
丙胺酸、4-甲酚、半胱胺酸、馬尿酸、油酸、硫酸吲哚酚、核糖、吲哚乙酸酯、尿酸、反式4-咪唑丙烯酸、2-哌啶甲酸、N-乙醯葡萄糖胺、吲哚乳酸、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、胱胺酸、硫酸吲哚酚、葡萄糖酸、瓜胺酸、肌酸酐、N-乙醯天冬胺酸、焦麩胺酸、三甲基離胺酸、非對稱性二甲基精胺酸、對稱性二甲基精胺酸、甲基組胺酸、醯基肉鹼、3-胺基異丁酸、乙醯肌肽、精胺酸、N-乙醯鳥胺酸、3-羥基異戊酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、GSSG、2-羥基丁酸、1,5-脫水-D-山梨糖醇、麩醯胺、甘胺酸、離胺酸、牛磺酸、AMP、乙醯肌肽、3-羥基丁酸、2-羥基異戊酸、乙醯乙酸、色胺酸、2-羥基戊二酸、蘋果酸、喹啉酸、己酸、異白胺酸、GSH及3-OH-犬尿胺酸可利用質譜法(例如GC-MS(gas chromatography-mass spectrometry，氣相層析-質譜法)、LC-MS(liquid chromatography-mass spectrometry，液相層析-質譜法))進行測定。
於本發明中，血清及/或血漿中之丙胺酸、4-甲酚、半胱胺酸、馬尿酸、油酸、硫酸吲哚酚、核糖、吲哚乙酸酯、尿酸、反式4-咪唑丙烯酸、2-哌啶甲酸、N-乙醯葡萄糖胺、吲哚乳酸、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、胱胺酸、硫酸吲哚酚、葡萄糖酸、瓜胺酸、肌酸酐、N-乙醯天冬胺酸、焦麩胺酸、三甲基離胺酸、非對稱性二甲基精胺酸、對稱性二甲基精胺酸、甲基組胺酸、醯基肉鹼、3-胺基異丁酸、乙醯肌肽、精胺酸、N-乙醯鳥胺酸、3-羥基異戊酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、GSSG、2-羥基丁酸、1,5-脫水-D-山梨糖醇、麩醯胺、甘胺酸、離胺酸、牛磺酸、AMP、乙醯肌肽、3-羥基丁酸、2-羥基異戊酸、乙醯乙酸、色胺酸、2-羥基戊二酸、蘋果酸、喹啉酸、己酸、異白胺酸、GSH及3-OH-犬尿胺酸可用作用以預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效性之生物標記。
於本發明之一實施態樣中，於投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑前之血清及/或血漿中之半胱胺酸之值較高，且投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑前之血清及/或血漿中之馬尿酸之值較高的情形時，可預測藉由上述藥劑之治療有效。
於本發明之另一實施態樣中，於第1次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後之血清及/或血漿中之阿拉伯糖之值較高，第1次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後之血清及/或血漿中之精胺酸之值較高，且第1次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後之血清及/或血漿中之丁醯肉鹼之值較低的情形時，可判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。
於本發明之再一實施態樣中，於投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑前之血清及/或血漿中之馬尿酸之值較高，第1次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後之血清及/或血漿中之胱胺酸之值較高，第2次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後之血清及/或血漿中之麩胱甘肽二硫醚之值較高，且第2次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後之血清及/或血漿中之丁醯肉鹼之值較低的情形時，可判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。
又，於本發明之較佳之一實施態樣中，可測定受驗者之末梢血液中之選自由高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率、CD8+ T細胞之線粒體活化狀態相對於CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之比、以及CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現所組成之群中之至少一者。
高表現PD-1之CD8+ T細胞群被稱為疲弊之細胞，多次分裂後陷入無應答。本細胞群之頻率較多係疲弊之無應答活細胞之比率較多，認為對癌症之免疫反應變弱。
於本說明書中，「高表現PD-1」係指於利用流式細胞儀檢測PD-1表現時，螢光之強度高於103 。但是，該值可變更。基準值可使用同型對照中染色之患者檢體、無高陽性(較少)之患者檢體、高陽性較多之患者檢體而確定。
CD8+ T細胞之線粒體活化狀態相對於CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之比反映免疫毒殺腫瘤之強度之可能性較高。CD8+ T細胞(殺手T細胞)之線粒體活性與細胞內能量代謝狀態密切相關，可反映毒殺癌細胞之殺手T細胞之毒殺活性。若CD8+ T細胞疲弊而無應答，則其線粒體活性變低(10)。
PGC-1係線粒體新生及線粒體代謝路徑(氧化磷酸化(OXPHOS)及脂肪酸氧化(FAO)等)之主要控制因子(10、11)。PGC-1α、PGC-1β被稱為轉錄共軛因子，與複數個轉錄因子結合，促進線粒體之生物合成、以線粒體為中心之能量代謝、與線粒體活性相關之轉錄(11)。
CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現係反映CD8+ T細胞之線粒體活性，若陷入疲弊或無應答之狀態，則PGC-1之表現降低。反之，若高表現PGC-1，則可恢復CD8+ T細胞之無應答(10)。
末梢血液CD8+ T細胞可以如下方式採取。將自患者採取之血液置於聚蔗糖，以2000 rpm進行離心分離。回收紅血球相與血漿相之間之白細胞層，藉由細胞培養液進行清洗。自該淋巴細胞，使用磁性細胞分離機(Miltenyi Biotec公司)系統單離CD8+ T細胞。
末梢血液CD4+ T細胞亦可藉由利用與末梢血液CD8+ T細胞相同之方法，使用磁性細胞分離機系統單離CD4+ T細胞而採取。
高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率可藉由針對PD-1及CD8之螢光標記抗體對患者末梢血液之白血球進行染色，藉由成像、流式細胞術或微盤分析而進行測定(詳細內容參照實施例之方法)。
CD4+ T細胞或CD8+ T細胞之線粒體活化狀態可以ROS(活性氧物種)、OCR(氧消耗量)、膜電位、線粒體體積等作為指標。
ROS可藉由Mito SOX色素對CD4+ T細胞或CD8+ T細胞進行染色，藉由成像、流式細胞術或微盤分析而進行檢測。
OCR可利用XF96細胞外流量分析儀(Seahorse Biosciences)進行測定。將單離之CD8+ T細胞置於專用細胞培養盤，將感測器盒蓋於培養盤上。於感測器盒之注射口注入寡黴素、FCCP、抗黴素A、魚藤精，安裝於XF96細胞外流量分析儀。測定細胞與感測器之間之半封閉微環境之氧濃度及氫離子濃度。
膜電位可藉由MitoTracker Deep Red色素對CD4+ T細胞或CD8+ T細胞進行染色，藉由成像、流式細胞術或微盤分析而進行檢測。
線粒體體積可藉由MitoTracker Green色素對CD4+ T細胞或CD8+ T細胞進行染色，藉由成像、流式細胞術或微盤分析而進行檢測。
CD8+ T細胞之線粒體活化狀態相對於CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之比可藉由將成為CD8+ T細胞之線粒體活化狀態之指標之測定值除以成為CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之指標之測定值而算出。作為CD8+ T細胞之線粒體活化狀態相對於CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之比，可例示CD8+ 及CD4+ T細胞中之線粒體活性氧表現量(Mito SOX水準)之比(Mito SOX CD8/CD4)、CD8+ T細胞之線粒體之體積相對於CD4+ T細胞之線粒體之體積(mass)的比(Mito mass CD8/CD4)等。
PGC-1α及PGC-1β之表現可使用識別PGC-1α及PGC-1β兩者(之後，亦有時記載為「PGC-1αβ」)之單株抗體而調查。
於本發明中，可以末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率作為(ii)之指標。
末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率可藉由針對CD4之螢光標記抗體對患者末梢血液之白血球進行染色，藉由成像、流式細胞術或微盤分析而進行測定(詳細內容參照實施例之方法)。
末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC)、末梢血液單核球(PBMC)中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC)、CD8+ T細胞中之初始T細胞之頻率(% of Tnaive among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞中之效應記憶T細胞之頻率(% of Tem among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞之線粒體之體積相對於CD4+ T細胞之線粒體之體積(mass)的比(Mito mass CD8/CD4)、CD4+ T細胞中低表現FoxP3之CD45RA+ T細胞群之頻率(% of FoxP3low CD45RA+ among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中高表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bethigh among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-betlow among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bet+ among CD8+ T cells)、及CD8+ T細胞中表現T-bet及EOMES之T細胞群之頻率(% of T-bet+ EOMES+ among CD8+ T cells)可利用公知之方法進行測定。 末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC)意指輔助T細胞之頻率。輔助T細胞產生較多之輔助CD8+ 殺手T細胞之活化之細胞激素。 末梢血液單核球(PBMC)中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC)意指殺傷癌細胞之殺手T細胞之比率。 CD8+ T細胞中之初始T細胞之頻率(% of Tnaive among CD8+ T cells)表示產生癌細胞殺傷能力較高之效應CD8+ T細胞之根本細胞之頻率。其較多意指效應CD8+ T細胞之數量增加之可能性較多。 CD4+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD4+ T cells)表示產生細胞激素產生能力較高之效應CD4+ T細胞之根本細胞之比率。其較多意指效應CD4+ T細胞之數量增加之可能性。 CD8+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD8+ T cells)表示產生癌細胞殺傷能力較高之效應CD8+ T細胞之根本細胞之比率。其較多意指效應CD8+ T細胞之數量增加之可能性。 CD8+ T細胞中之效應記憶T細胞之頻率(% of Tem among CD8+ T cells)意指包含較多之癌細胞殺傷能力較高之CD8+ T細胞之細胞群之頻率。 CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells)表示包含為分化已達到最終階段之狀態，細胞激素產生能力較低之疲弊細胞之群之頻率。 CD8+ T細胞之線粒體之體積相對於CD4+ T細胞之線粒體之體積(mass)的比(Mito mass CD8/CD4)提示CD8+ T細胞之線粒體活化，表示細胞內能量代謝活化。 CD4+ T細胞中低表現FoxP3之CD45RA+ T細胞群之頻率(% of FoxP3low CD45RA+ among CD4+ T cells)表示抗原致敏前活化之CD4+ T細胞之頻率。 CD4+ T細胞中高表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bethigh among CD4+ T cells)表示高效率地輔助CD8+ 殺手T細胞之Th1型輔助T細胞之頻率。 CD4+ T細胞中低表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-betlow among CD4+ T cells)表示輔助能力較弱之Th1型輔助T細胞之頻率。 CD8+ T細胞中表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bet+ among CD8+ T cells)表示癌症殺傷能力較高之CD8+ 殺手T細胞之頻率。 CD8+ T細胞中表現T-bet及EOMES之T細胞群之頻率(% of T-bet+ EOMES+ among CD8+ T cells)表示記憶或疲弊之CD8+ T細胞之頻率。
於本發明中，末梢血液中之末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC)、末梢血液單核球(PBMC)中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC)、CD8+ T細胞中之初始T細胞之頻率(% of Tnaive among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞中之效應記憶T細胞之頻率(% of Tem among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞之線粒體活化狀態相對於CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之比(例如CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比(Mito SOX CD8/CD4)、CD8+ T細胞之線粒體之體積相對於CD4+ T細胞之線粒體之體積(mass)的比(Mito mass CD8/CD4))、CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現(PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells)、高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率(% of PD-1high among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現FoxP3之CD45RA+ T細胞群之頻率(% of FoxP3low CD45RA+ among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中高表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bethigh among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-betlow among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bet+ among CD8+ T cells)、及CD8+ T細胞中表現T-bet及EOMES之T細胞群之頻率(% of T-bet+ EOMES+ among CD8+ T cells)可用作用以預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效性之細胞標記。
於本發明之一實施態樣中，於投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑前之末梢血液中之高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率較低，且投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑前之末梢血液中之CD8+ T細胞之線粒體活化狀態相對於CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之比(例如Mito SOX CD8/CD4)較高的情形時，可預測藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。
於本發明之另一實施態樣中，於投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑前之末梢血液中之高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率較低，投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑前之末梢血液中之CD8+ T細胞之線粒體活化狀態相對於CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之比(例如Mito SOX CD8/CD4)較高，末梢血液中之CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現之第1次投予藥劑後相對於投予藥劑前之比較低，且末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率之第1次投予藥劑後相對於投予藥劑前之比較高的情形時，可判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。
於本發明之再一實施態樣中，於投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑前之末梢血液中之高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率較低，投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑前之末梢血液中之CD8+ T細胞之線粒體活化狀態相對於CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之比(例如Mito SOX CD8/CD4)較高，末梢血液中之CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現之第2次投予藥劑後相對於第1次投予藥劑後之比較高，且末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率之第1次投予藥劑後相對於投予藥劑前之比較高的情形時，可判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效。
於本說明書中，生物標記及細胞標記之值「較高」及「較低」分別指應答者之值與無應答者之值相比「較高」及「較低」。作為成為「較高」及「較低」之判定之基準之值，例如藉由以應答者或無應答者之定量值之95%可靠區間作為基準值，或者根據ROC曲線、LDA分析等統計分析，設定臨界值而獲得。該等值之求出方法係公知。
於下述實施例中，藉由調查投予納武單抗(抗PD-1抗體)之前及之後之60名非小細胞肺癌患者之血液中之血漿代謝物及細胞標記之濃度的結果、LDA分析，導入下述計算式。若成為分析對象之群發生變化，則該等式可變化。式1～6之*意指乘法。 ・細胞標記之組合(Cellular combination)I(臨界值0) -0.3023987485021*[PD-1 high 1st]＋2.94519844381265*[Mito SOX CD8/CD4 1st]－1.87379126258675(式1) ・細胞標記之組合(Cellular combination)II(臨界值0) -0.2522084377427*[PD-1 high 1st]＋3.58270233554892*[Mito SOX CD8/CD4 1st]＋1.92950430842982*[CD4(%)2nd/1st]－1.2170886788589*[PGC1ab of CD8 2nd/1st]－3.29839771768711(式2) ・細胞標記之組合(Cellular combination)III(臨界值0) -0.2808914943715*[PD-1 high 1st]＋3.29512762046372*[Mito SOX CD8/CD4 1st]＋1.55202212350758*[CD4(%)2nd/1st]＋2.00254807664124*[PGC1ab of CD8 3rd/2nd]－5.97495334069991(式3) ・代謝物之組合(Metabolite combination)I(臨界值0) 9.92415868963082*[Cysteine 1st]＋0.00000054083199*[Hippuric acid (LC-MS) 1st]－44.661430966258*[Unk8 1st]－1.46007680395094(式4) ・代謝物之組合(Metabolite combination)II(臨界值0) 207.062010223744*[Arabinose 2nd]＋0.00000031741819*[Arginine 2nd]－0.0000003768213*[Butyrylcarnitine 2nd]－1.95925442024969(式5) ・代謝物之組合(Metabolite combination)III(臨界值0) 0.00000044275294*[Hippuric acid (LC-MS) 1st]＋12.0744069146569*[Cystine 2nd]＋0.00003552481124*[GSSG 3rd]-0.00000008812702408*[Butyrylcarnitine 3rd]－2.67048929974173(式6) PD-1high 1st：投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑前之末梢血液中之高表現PD-1之CD8+ T細胞群的頻率 Mito SOX CD8/CD4 1st：投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑前之末梢血液中之CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量的比 CD4(%)2nd/1st：第1次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後之末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率相對於投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑前之末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率的比(若大於1，則可謂於第1次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後，末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率高於投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑前) PGC1ab of CD8 2nd/1st：第1次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後之末梢血液中之CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現量相對於投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑前之末梢血液中之CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現量的比(若小於1，則可謂於第1次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後，末梢血液中之CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現低於投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑前) PGC1ab of CD8 3rd/2nd：第2次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後之末梢血液中之CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現量相對於第1次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後之末梢血液中之CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現量的比(若大於1，則可謂於第2次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後，末梢血液中之CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現高於第1次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後) Cysteine 1st：投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑前之血漿半胱胺酸之值(藉由GC-MS所獲得之測定值) Hippuric acid (LC-MS) 1st：投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑前之血漿馬尿酸之值(藉由LC-MS所獲得之測定值) Unk8 1st：投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑前之血漿Unk8(未鑑定物質)之值(藉由GC-MS所獲得之測定值) Arabinose 2nd：第1次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後之血漿阿拉伯糖之值(藉由GC-MS所獲得之測定值) Arginine 2nd：第1次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後之血漿精胺酸之值(藉由GC-MS所獲得之測定值) Butyrylcarnitine 2nd：第1次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後之血漿丁醯肉鹼之值(藉由GC-MS所獲得之測定值) Cystine 2nd：第1次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後之血漿胱胺酸之值(藉由GC-MS所獲得之測定值) GSSG 3rd：第2次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後之血漿麩胱甘肽二硫醚之值(藉由GC-MS所獲得之測定值) Butyrylcarnitine 3rd：第2次投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑後之血漿丁醯肉鹼之值(藉由GC-MS所獲得之測定值)
於利用本發明之方法，預測藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效之情形時，較佳為開始藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療。
於利用本發明之方法，判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效之情形時，較佳為繼續藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療。
本發明提供一種疾病之診斷及治療方法，其包括：以下述(i)及/或(ii)作為指標，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療對受驗者之有效性，於預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效之情形時，投予對於治療該受驗者有效之量之含有PD-1訊息抑制劑之藥劑。 (i)血清及/或血漿中之至少一種代謝物，該代謝物係選自由丙胺酸、4-甲酚、半胱胺酸、馬尿酸、油酸、硫酸吲哚酚、核糖、吲哚乙酸酯、尿酸、反式4-咪唑丙烯酸、2-哌啶甲酸、N-乙醯葡萄糖胺、吲哚乳酸、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、胱胺酸、硫酸吲哚酚、葡萄糖酸、瓜胺酸、肌酸酐、N-乙醯天冬胺酸、焦麩胺酸、三甲基離胺酸、非對稱性二甲基精胺酸、對稱性二甲基精胺酸、甲基組胺酸、醯基肉鹼、3-胺基異丁酸、乙醯肌肽、精胺酸、N-乙醯鳥胺酸、3-羥基異戊酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、GSSG、2-羥基丁酸、1,5-脫水-D-山梨糖醇、麩醯胺、甘胺酸、離胺酸、牛磺酸、AMP、乙醯肌肽、3-羥基丁酸、2-羥基異戊酸、乙醯乙酸、色胺酸、2-羥基戊二酸、蘋果酸、喹啉酸、己酸、異白胺酸、GSH及3-OH-犬尿胺酸所組成之群 (ii)末梢血液中之至少一種細胞標記，該細胞標記係選自由末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC)、末梢血液單核球(PBMC)中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC)、CD8+ T細胞中之初始T細胞之頻率(% of Tnaive among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞中之效應記憶T細胞之頻率(% of Tem among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞之線粒體活化狀態相對於CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之比(例如CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比(Mito SOX CD8/CD4)、CD8+ T細胞之線粒體之體積相對於CD4+ T細胞之線粒體之體積(mass)的比(Mito mass CD8/CD4))、CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現(PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells)、高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率(% of PD-1high among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現FoxP3之CD45RA+ T細胞群之頻率(% of FoxP3low CD45RA+ among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中高表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bethigh among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-betlow among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bet+ among CD8+ T cells)、及CD8+ T細胞中表現T-bet及EOMES之T細胞群之頻率(% of T-bet+ EOMES+ among CD8+ T cells)所組成之群
又，本發明提供一種醫藥組合物，其包含用於疾病之診斷及治療方法之含有PD-1訊息抑制劑之藥劑作為有效成分，該疾病之診斷及治療方法包括：以下述(i)及/或(ii)作為指標，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療對受驗者之有效性，於預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效之情形時，投予對於治療該受驗者有效之量之含有PD-1訊息抑制劑之藥劑。 (i)血清及/或血漿中之至少一種代謝物，該代謝物係選自由丙胺酸、4-甲酚、半胱胺酸、馬尿酸、油酸、硫酸吲哚酚、核糖、吲哚乙酸酯、尿酸、反式4-咪唑丙烯酸、2-哌啶甲酸、N-乙醯葡萄糖胺、吲哚乳酸、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、胱胺酸、硫酸吲哚酚、葡萄糖酸、瓜胺酸、肌酸酐、N-乙醯天冬胺酸、焦麩胺酸、三甲基離胺酸、非對稱性二甲基精胺酸、對稱性二甲基精胺酸、甲基組胺酸、醯基肉鹼、3-胺基異丁酸、乙醯肌肽、精胺酸、N-乙醯鳥胺酸、3-羥基異戊酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、GSSG、2-羥基丁酸、1,5-脫水-D-山梨糖醇、麩醯胺、甘胺酸、離胺酸、牛磺酸、AMP、乙醯肌肽、3-羥基丁酸、2-羥基異戊酸、乙醯乙酸、色胺酸、2-羥基戊二酸、蘋果酸、喹啉酸、己酸、異白胺酸、GSH及3-OH-犬尿胺酸所組成之群 (ii)末梢血液中之至少一種細胞標記，該細胞標記係選自由末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC)、末梢血液單核球(PBMC)中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC)、CD8+ T細胞中之初始T細胞之頻率(% of Tnaive among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞中之效應記憶T細胞之頻率(% of Tem among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞之線粒體活化狀態相對於CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之比(例如CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比(Mito SOX CD8/CD4)、CD8+ T細胞之線粒體之體積相對於CD4+ T細胞之線粒體之體積(mass)的比(Mito mass CD8/CD4))、CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現(PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells)、高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率(% of PD-1high among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現FoxP3之CD45RA+ T細胞群之頻率(% of FoxP3low CD45RA+ among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中高表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bethigh among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-betlow among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bet+ among CD8+ T cells)、及CD8+ T細胞中表現T-bet及EOMES之T細胞群之頻率(% of T-bet+ EOMES+ among CD8+ T cells)所組成之群
本發明之醫藥組合物可以抗癌劑、傳染病治療劑或該等之組合之形式使用。
於投予本發明之醫藥組合物作為抗癌劑之情形時，作為成為對象之癌或腫瘤，可例示：白血病、淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤等)、多發性骨髓瘤、腦腫瘤、乳癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌、食道癌、胃癌、闌尾癌、大腸癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、腎上腺癌、胃腸道間質腫瘤、間皮瘤、頭頸癌(喉頭癌等)、口腔癌(口底癌等)、牙齦癌、舌癌、口腔黏膜癌、唾液腺癌、鼻竇癌(上頜竇癌、額竇癌、篩竇癌、蝶竇癌等)、甲狀腺癌、腎癌、肺癌、骨肉瘤、前列腺癌、睪丸腫瘤(睾丸癌)、腎細胞癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、皮膚癌(基底細胞癌、鱗狀細胞癌、惡性黑色素瘤(黑色素瘤)、日光性角化症、鮑溫病、佩吉特氏病等)、肛門癌等，但並不限定於該等。
於投予本發明之醫藥組合物作為傳染病治療劑之情形時，作為成為對象之傳染病，可例示：細菌傳染病(由鏈球菌(A組β鏈球菌、肺炎球菌等)、金黃色葡萄球菌(MSSA、MRSA)、表皮葡萄球菌、腸球菌、李氏菌、腦膜炎球菌、淋球菌、病原性大腸桿菌(0157:H7等)、克雷伯氏菌(肺炎桿菌)、變形桿菌、百日咳桿菌、綠膿桿菌、沙雷氏菌、檸檬酸桿菌、不動菌、腸桿菌、黴漿菌、梭菌等所引起之各種傳染病、結核、霍亂、瘟疫、白喉、桿菌性痢疾、猩紅熱、炭疽、梅毒、破傷風、麻風病、退伍軍人肺炎(退伍軍人病)、鉤端螺旋體病、萊姆病、兔熱病、Q熱等)、立克次體傳染病(斑疹傷寒、恙蟲病、日本斑疹熱等)、披衣菌傳染病(沙眼、生殖器披衣菌傳染病、鸚鵡病等)、真菌傳染病(麴菌病、念珠菌症、隱球菌病、毛髮菌病、組織胞漿菌病、肺囊蟲肺炎等)、寄生性原蟲傳染病(阿米巴痢疾、瘧疾、弓形蟲病、利什曼原蟲病、隱胞子蟲病等)、寄生性蠕蟲傳染病(包蟲病、日本血吸蟲病、絲蟲病、蛔蟲病、裂頭絛蟲病等)、病毒傳染病(流行性感冒、病毒性肝炎、病毒性腦膜炎、後天性免疫缺乏症候群(AIDS)、成人T細胞白血病、埃博拉出血熱、黃熱、感冒症候群、狂犬病、巨細胞病毒傳染病、嚴重急性呼吸道症候群(SARS)、進行性多部腦白質病、水痘、帶狀疱疹、手足口病、登革熱、傳染性紅斑、傳染性單核細胞增多症、痘瘡、風疹、急性脊髓灰白質炎(poliomyelitis)、麻疹、咽結膜熱(pharyngoconjunctival fever)、馬爾堡出血熱、漢他病毒腎出血熱、拉薩熱、流行性腮腺炎、西尼羅河熱、疱疹性咽峽炎、基孔肯雅熱等)等，但並不限定於該等。
本發明之醫藥組合物係於全身或局部，藉由經口或非經口而投予至受驗者或受驗動物。
PD-1訊息抑制劑(例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體)較佳為溶解於PBS等緩衝液、生理食鹽水、殺菌水等中，視需要利用過濾器等進行過濾並殺菌後，藉由注射或點滴而投予至受驗者或受驗動物。又，於該溶液中，亦可添加添加劑(例如著色劑、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、增溶劑、穩定劑、保存劑、抗氧化劑、緩衝劑、等張劑等)等。作為投予路徑，可為靜脈、肌肉、腹腔、皮下、皮內投予等。
PD-1訊息抑制劑(例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體)於製劑中之含量根據製劑之種類而不同，通常為1～100 重量%，較佳為50～100 重量%。製劑較佳為製劑化為單位投予製劑。
PD-1訊息抑制劑(例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體)之投予量、投予之次數及頻率根據受驗者或受驗動物之症狀、年齡、體重、投予方法、投予形態等而不同，例如較佳為通常對每個成人，換算為有效成分之量，以可確認所需之效果之頻率至少1次投予0.1～100 mg/kg體重、較佳為1～10 mg/kg體重。可基於使用上述生物標記及/或細胞標記之檢查結果，確定PD-1訊息抑制劑之投予之開始、繼續、停止等。
又，本發明提供一種用以測定下述(i)及/或(ii)之生物標記之試劑之用途，其用於製造用以確定投予含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之診斷製品。 (i)血清及/或血漿中之至少一種代謝物，該代謝物係選自由丙胺酸、4-甲酚、半胱胺酸、馬尿酸、油酸、硫酸吲哚酚、核糖、吲哚乙酸酯、尿酸、反式4-咪唑丙烯酸、2-哌啶甲酸、N-乙醯葡萄糖胺、吲哚乳酸、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、胱胺酸、硫酸吲哚酚、葡萄糖酸、瓜胺酸、肌酸酐、N-乙醯天冬胺酸、焦麩胺酸、三甲基離胺酸、非對稱性二甲基精胺酸、對稱性二甲基精胺酸、甲基組胺酸、醯基肉鹼、3-胺基異丁酸、乙醯肌肽、精胺酸、N-乙醯鳥胺酸、3-羥基異戊酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、GSSG、2-羥基丁酸、1,5-脫水-D-山梨糖醇、麩醯胺、甘胺酸、離胺酸、牛磺酸、AMP、乙醯肌肽、3-羥基丁酸、2-羥基異戊酸、乙醯乙酸、色胺酸、2-羥基戊二酸、蘋果酸、喹啉酸、己酸、異白胺酸、GSH及3-OH-犬尿胺酸所組成之群 (ii)末梢血液中之至少一種細胞標記，該細胞標記係選自由末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC)、末梢血液單核球(PBMC)中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC)、CD8+ T細胞中之初始T細胞之頻率(% of Tnaive among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞中之效應記憶T細胞之頻率(% of Tem among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞之線粒體活化狀態相對於CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之比(例如CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比(Mito SOX CD8/CD4)、CD8+ T細胞之線粒體之體積相對於CD4+ T細胞之線粒體之體積(mass)的比(Mito mass CD8/CD4))、CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現(PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells)、高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率(% of PD-1high among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現FoxP3之CD45RA+ T細胞群之頻率(% of FoxP3low CD45RA+ among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中高表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bethigh among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-betlow among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bet+ among CD8+ T cells)、及CD8+ T細胞中表現T-bet及EOMES之T細胞群之頻率(% of T-bet+ EOMES+ among CD8+ T cells)所組成之群 診斷製品係包含套組、裝置(質譜裝置、成像系統、流式細胞儀、微盤、其他分析裝置)等之概念。診斷製品較佳為亦包含分析用程式、操作說明書等。 作為用以測定生物標記之試劑，於生物標記為代謝物之情形時，可例示：內部標準、用以進行衍生物化之試劑(例如GC/MS用衍生物化試劑)、萃取用有機溶劑、該等之組合等，於生物標記為細胞標記之情形時，可例示：用以單離細胞之試劑(編碼針對細胞標記(CD4、CD8、CD45RA)蛋白質之抗體之珠粒等)、針對檢測對象之蛋白質(PGC-1α、PGC-1β、FoxP3、T-bet、EOMES)之抗體、用以對檢測對象之蛋白質進行檢測之抗體(較佳為藉由酵素等進行標記)、用作標記之酵素之受質(與酵素進行反應，產生顯色、螢光、發光等者)、標準試樣、該等之組合等。 [實施例]
以下，藉由實施例更詳細地說明本發明。 [實施例1]非小細胞肺癌患者對PD-1阻斷療法之治療應答性之組合生物標記 (摘要) 為了鑑定宿主免疫側之有用之生物標記，我們調查了投予納武單抗之前及之後之非小細胞肺癌患者之血液中之血漿代謝物及免疫細胞之細胞標記。對統計學上選擇出之組合生物標記之使用機器學習之驗證試驗顯示源自腸內細菌、脂肪酸氧化及氧化還原之4個代謝物之組合帶來較高之預測值(AUC＝0.91)。包含線粒體活化相關以及CD8+ PD-1high 及CD4+ T細胞之頻率之4個T細胞標記之組合顯示出更高之預測值(AUC＝0.96)。自所有標記之混合物，統計學上選擇預測值最高之組合，結果選擇出上述4個T細胞標記，並不包含代謝物。認為其原因在於代謝物與T細胞標記之間存在較強之關聯。該等觀察結果，顯示反映宿主免疫活性之生物標記之組合對於應答者之預測非常有益。
(序論) PD-1及CTLA-4係於對腫瘤增殖之免疫抑制中發揮最重要之作用(12-15)。於小鼠及人類中，若個別或一起阻斷該等分子，則可活化免疫監視機制，誘發較強之抗腫瘤活性(12-14、16、17)。基於使用該等免疫檢查點阻斷單株抗體之臨床試驗中之良好之結果，FDA認可各種人類癌症之治療中針對CTLA-4、PD-1或作為其配體之PD-L1之抗體(3、15)。但是，儘管PD-1阻斷免疫療法之極佳之臨床效果，但某一定比率之癌症患者對該療法無應答(3、15-17)。因此，就節約該等患者之費用及時間之意義而言，亦必需判別應答者與無應答者之治療效果預測生物標記。
利用免疫染色法之腫瘤組織中之PD-L1高表現係用作非小細胞肺癌(NSCLC)之治療效果預測生物標記(18、19)。又，最近，FDA認可小形隨體不穩定性較高(MSI-H)或DNA錯配修復缺陷(dMMR)作為各種實體癌中之共通之治療效果預測生物標記(20、21)。但是，該等生物標記無法覆蓋所有應答性患者。其原因在於腫瘤反應性殺手T細胞之應答不僅受腫瘤之特性影響，亦受宿主免疫活性影響。一些組藉由腫瘤部位或末梢血液中之細胞成分之分析而鑑定治療效果預測生物標記之候補。視為候補之生物標記係CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、嗜酸性球、嗜中性球、抑制性巨噬細胞之子集及T細胞之子集之頻率等(22)。又，亦列出特定之細胞激素或趨化因子等免疫控制因子作為生物標記之候補(22)。但是，該等單一標記各者之預測值並不高而足以臨床應用。
如我們使用IgA缺陷或PD-1缺陷小鼠模型所示，已知腸內細菌與免疫活性相互影響(23、24)。關於腫瘤免疫，近年來報告腸內細菌及其代謝物與免疫檢查點抑制劑之效果相關(22、25、26)。報告有尤其是作為特定之腸內細菌之嗜黏蛋白艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)或腸內細菌群之多樣性係與PD-1阻斷療法之應答性相關(26)。雖機制之詳細內容幾乎未知，但認為該等腸內細菌群使自然免疫活化，於末梢上調抗腫瘤免疫之基線(26-28)。但是，未知上述腸內細菌或與其相關之因子是否可成為PD-1阻斷療法之治療效果預測生物標記。
最近，T細胞能量代謝與免疫活性之密切關係變得明確(29、30)。我們調查了T細胞之能量代謝如何控制抗腫瘤免疫(31、32)。根據可成為線粒體活性之指標之氧消耗速度之測定結果、以及線粒體之體積(mass)、活性氧物種(ROS)及膜電位之染色結果，發現於PD-1阻斷療法期間腫瘤反應性T細胞之線粒體得到活化。進而，我們報告源自線粒體之ROS之增加表示增強PD-1阻斷療法之效果，其係由過氧化物酶體增殖因子活化受體γ共軛因子1α(PGC-1α)之活化而介導(31)。自以前以來已知ROS訊息之水準與T細胞活化或細胞激素產生密切相關(33)。因此，我們研究了該等線粒體相關因子是否可成為宿主免疫活性之預測生物標記。
於使用60名NSCLC患者之血液樣本之本研究中，我們示出數個血漿代謝物之組合可成為良好之生物標記(AUC＝0.91：藉由使用機器學習之驗證試驗)。該等代謝物係與腸內細菌(馬尿酸)、脂肪酸氧化(丁醯肉鹼)及氧化還原(胱胺酸及麩胱甘肽二硫醚)相關之代謝物。進而示出數個T細胞標記之組合可作為更良好之生物標記發揮作用(AUC＝0.96：藉由使用機器學習之驗證試驗)。T細胞標記係與CD8+ 殺手T細胞中之抑制功能(PD-1high 群之頻率)及線粒體活性(PGC-1α及ROS之表現)相關之標記。該等T細胞標記係與上述代謝物密切相關。該等結果顯示腸內細菌與T細胞能量代謝之組合可成為PD-1阻斷療法之高度治療效果預測生物標記。
(結果)與腸內細菌及能量代謝相關之代謝物與對 PD-1 阻斷癌症免疫療法之治療應答性相關。 根據迄今為止之報告，可知免疫應答與腸內細菌之間有較大之關聯(30)。但是，未知特定之代謝物是否可成為人類中之PD-1阻斷療法之治療效果預測生物標記。為了調查代謝物如何與抗腫瘤免疫相關，我們分析了投予納武單抗之前及之後之60名NSCLC患者之血漿及PBMC中之各代謝物及T細胞功能標記(圖1a及表1-3)。於第0、2及4週之即將注射納武單抗之前採取血液樣本，分別稱為第1、第2及第3樣本(圖1a)。我們按照NSCLC患者之第III相臨床試驗之無進展生存期(PFS)資料，以PFS＞3個月或PFS≦3個月作為基準，規定應答性患者與非應答性患者(圖6)(34、35)。於迄今為止之報告中，頻繁使用PFS＞6個月作為應答者基準，但本研究之分析之結果為，表現出與兩個基準(PFS＞3個月及PFS＞6個月)均類似之總生存曲線(圖6a及b)。進而，於腫瘤部位之PD-L1表現水準下，無法明確地判別治療效果(圖6c及d)。我們測定60名患者之247個代謝物。該等患者中之6名發生脫落，進而7名因嚴重之副作用而停止治療，故而我們對剩餘之47名之資料進行分析。於該等代謝物之火山圖(volcano plot)分析中，與無應答者相比，於應答者中，第1樣本中之馬尿酸以及第3樣本中之馬尿酸、硫酸吲哚酚、4-甲酚及麩胱甘肽二硫醚(GSSG)顯著增加(圖1b)。另一方面，第3樣本中之α-酮戊二酸及丁醯肉鹼之水準於應答者中顯著較低。於第2樣本中，所有項目均未見有意義差(圖1b)。報告有馬尿酸、硫酸吲哚酚及4-甲酚於哺乳類中幾乎獨佔性地由腸內細菌產生(36)，該情況與投予納武單抗前3個月以內藉由抗生素治療之患者之該等3個代謝物之水準更低的本研究之結果不矛盾(圖7a)。於應答者中源自腸內細菌之代謝物高於無應答者之情況係暗示源自腸內細菌之代謝物與末梢之抗腫瘤免疫相關(圖1c及圖7b)。GSSG水準、尤其是第3樣本中之GSSG水準於應答者中顯著高於無應答者(圖1b及圖1d左面板)。GSSG為麩胱甘肽(GSH)之氧化型，其係於細胞內適當地控制活性氧物種(ROS)之水準(37)。丁醯肉鹼之水準於無應答者中高於應答者(圖1b及圖1d)。作為碳數4之醯基肉鹼之丁醯肉鹼係作為向線粒體之脂肪酸轉運體發揮作用，生成ATP。具有各種碳數之醯基肉鹼種若脂肪酸氧化(FAO)功能減弱，則自細胞釋出(7-9)。丁醯肉鹼及其他醯基肉鹼種(異戊醯肉鹼及己醯肉鹼)於無應答者中表現出於治療後增大之傾向(圖7c)。α-酮戊二酸有於無應答者中高於應答者之傾向(圖1b及圖1d)。α-酮戊二酸係線粒體中之用以產生ATP之三羧酸(TCA)循環之中心代謝物，於血中，因被活化T細胞消耗而減少(31、38)。因此，該等資料顯示藉由PD-1阻斷療養之抗腫瘤免疫應答與腸內細菌及能量代謝密切相關。
血漿代謝物之組合可成為治療效果預測生物標記。 我們藉由使用直線回歸之接收者動作特性曲線(ROC)分析而研究了圖1b所列出之各預測生物標記候補之概率，但各曲線下面積(AUC)不足以臨床應用(圖1b、表之右列)。因此，其次，我們為了闡明基於代謝物之組合之更優異之生物標記，使用逐步回歸法。首先，自合計1482個項目(247個項目×3個時間點＋247個項目×3者之比)中，選擇於各時間點之值或不同之時間點之比(倍率變化)下應答者與無應答者之間存在有意義差者(表4)。利用使用赤池資訊量基準(AIC)之逐步回歸法對表4所列出之標記進行分析，分別將第1樣本、第1＋第2樣本及第1＋第2＋第3樣本中之最佳組合稱為代謝物組合I、II及III(圖2a及圖8a-c)。線性判別分析(LDA)顯示代謝物組合I以23%之錯誤率判別出應答者與無應答者(圖2b)。為了對代謝物組合I之可靠性進行試驗，我們基於LDA臨界值，將47個樣本分為「應答者(LDA-R)」及「無應答者(LDA-NR)」(圖2b)。如圖2c所示，藉由代謝物組合I判別之LDA-R及LDA-NR於PFS表現出有意義差。其次，代謝物組合II以22%之錯誤率更佳地判別出應答者與無應答者(圖2d)。進而，藉由代謝物組合II所判別之LDA-R與LDA-NR於PFS及OS兩者中表現出有意義差(圖2e)。最後，代謝物組合III最佳地判別應答者與無應答者(錯誤率19.6%)(圖2f及2g)。我們由於使用同一同屬性群(cohort)進行驗證試驗，故而使用機器學習，實施藉由邏輯回歸分析之5折交叉驗證。於5折交叉驗證中，我們將同屬性群分割成5個組，以1組之最初之20%(first 20% fold)作為試驗資料，使用剩餘80%訓練預測模型而預測試驗。我們對各組反覆進行該程序5次，使用AUC之平均值評價模型性能。該交叉驗證分析之結果為關於代謝物組合I、II及III，平均AUC值分別為0.77、0.83及0.91(圖2h)。
於對於NSCLC之現行之臨床方案中，若考慮患者每2週接受納武單抗投予，則代謝物組合I及II作為治療效果預測標記有用，但表現出最高可靠性之代謝物之組合III可能於臨床上並不那麼有用。
包含 CD8+ T 細胞之線粒體活性之細胞標記之組合可判別應答者與無應答者。 以前，我們表示T細胞中之線粒體活化及能量代謝與對PD-1阻斷療法之應答密切相關(31、32)。因此，我們調查患者之PBMC中之T細胞中之效應功能、能量代謝、線粒體之狀態及免疫活化之細胞標記。自表3所示之合計52個標記及各時間點間之該等之比(倍率變化)中，我們抽選應答者與無應答者之間存在有意義差之26個項目(表5)。進而，自該26個項目，我們使用與代謝物之項所敍述者相同之逐步回歸法，選擇治療效果預測生物標記之最佳之組合。如圖3a所示，將第1樣本、第1＋第2樣本及第1＋第2＋第3樣本中預測應答者之最佳之組合分別稱為細胞標記組合I、II及III。該等分別成為2個、4個及4個標記之組合。我們發現第1樣本之CD8+ T細胞中之PD-1high 群之頻率於應答者中顯著較低，又，該標記包含於細胞標記之組合I、II及III之全部(圖3a及3b)。再者，總PD-1+ CD8+ T細胞之頻率於應答者與無應答者之間不存在有意義差(圖9a)。於PD-1high CD8+ T細胞之功能分析中，Ki67頻率與其他2群(PD-1低或PD-1-)相比，於PD-1high 下較高，表現出較高之增殖力，但PD-1high 之顆粒酶B及IFN-γ產生比其他2群少(圖9b)。進而，PD-1high 之表現T-bet比其他2群低，但EOMES表現比其他2群高(圖9b)。該等資料提示PD-1high CD8+ T細胞幾次分裂之結果為可能「疲弊」。換言之，為了保持穩固之抗腫瘤應答及效應功能，疲弊度更低之CD8+ T細胞較為重要。線粒體ROS(藉由Mito SOX色素進行測定)係線粒體活化指標之一(31)。我們發現第1樣本之CD8+ 及CD4+ T細胞中之Mito SOX水準之比(Mito SOX CD8/CD4)於應答者中顯著較高，又，該標記與PD-1high CD8+ T細胞標記同樣地包含於所有標記組合(圖3a及3c)。該結果顯示線粒體活化狀態於治療前之時間點於CD8+ T細胞中高於CD4+ T細胞係對PD-1抗體之治療應答較為重要(圖3c)。PGC-1係線粒體新生及線粒體代謝路徑(氧化磷酸化(OXPHOS)及脂肪酸氧化(FAO)等)之主要控制因子(10、11)。我們使用識別PGC-1α及PGC-1β兩者(之後記載為「PGC-1αβ」)之抗體研究PGC-1表現。CD8+ T細胞中之PGC-1αβ表現係於應答者中於第1樣本與第2樣本之間降低，但於第2樣本與第3樣本之間增加(圖3a及3d上段)。即，第1樣本與第2樣本中之PGC-1αβ表現之倍率變化於應答者中顯著較低，但第2樣本與第3樣本之倍率變化顯著較高(圖3a及3d下段)。可知應答者於第2樣本中之PGC-1αβ表現之暫時降低可能原因在於由Akt訊息傳遞及OXPHOS之暫時抑制所引起之解糖之促進(10、31、32、39)，該主要之線粒體控制因子至少於第3時間點之前恢復。提示Mito SOX及PGC-1αβ標記與治療應答性之較強之關聯如以前之小鼠模型中所示(31、32)，CD8+ T細胞中之線粒體活化對藉由PD-1阻斷之抗腫瘤免疫應答較為重要。又，我們亦發現如其他研究者組已報告，於應答者中治療後CD4+ T細胞之頻率增大(圖3a及3e)(40、41)。進一步進行分析，結果可知投予納武單抗於應答者中增加CD4+ CD45RO+ CCR7+(中央記憶體：Tcm)群，而且，減少CD4+ CD45RO-CCR7-(終末分化之效應記憶CD45RA+ T細胞：Temra)群(圖9c)。
T 細胞標記之組合表現出較高之預測值。 我們利用上述方法評價細胞標記組合I、II及III之錯誤率。LDA之結果為細胞標記組合I之錯誤率為19.1%(圖4a)。與代謝物同樣地，基於LDA基準規定應答者與無應答者，結果藉由細胞標記組合I判別之LDA-R及LDA-NR於PFS及OS兩者中表現出有意義差(圖4b)。又，LDA之結果為細胞標記組合II及III兩者均錯誤率為4.3%，LDA-R及LDA-NR於PFS及OS兩者中表現出p＜0.01之有意義差(圖4c-f)。同一同屬性群內使用藉由邏輯回歸分析之5折交叉驗證之驗證試驗之結果為對細胞標記組合I、II及III之平均AUC分別為0.85、0.96及0.93(圖4g)。該等資料顯示藉由第2次治療之前所獲得之細胞生物標記之組合，足以判定治療效果。
代謝物與細胞標記有相關。 其次，我們為了自應答者與無應答者之間表現出有意義差之所有代謝物及細胞標記中選擇最佳之組合，進行逐步回歸法(表4及表5)。意外地，所選擇之標記均為細胞標記，成為與圖3及圖4所示者完全相同之組合。因此，我們認為代謝物與細胞標記之間有較強之關聯，其係將代謝物自所有組合排除。如上所述，細胞標記組合II表現出優異之判別能力，於臨床上較實用，故而我們聚焦於細胞標記組合II，調查與代謝物之關聯。為了評價細胞標記與代謝物之關聯，使用Spearman相關係數(r)。一般認為|r|＞0.4具有相對較強之關聯。我們發現CD8+ T細胞中之PGC-1αβ表現與腸內細菌相關代謝物相關，PD-1high CD8+ T細胞之頻率與FAO相關代謝物相關，而且，T細胞Mito SOX標記與氧化還原相關代謝物相關(圖5a)。再者，胱胺酸及焦麩胺酸如圖10所示，為麩胱甘肽之成分。
聚類分析之結果為細胞標記與代謝物大致分為3個組(圖5b)。3個組可分為1)腸內細菌相關代謝物、2)FAO相關代謝物、及3)氧化還原相關代謝物。將細胞標記與代謝標記之間之關聯之詳細內容歸納並示於圖5c。作為結論，認為所有標記中之逐步回歸法不選擇代謝物之任一者之原因在於可成為治療預測生物標記之代謝物與具有稍大於該等之預測能力之細胞標記密切相關。該等資料表現出腸內細菌與T細胞能量代謝之間之較強之關聯，該兩者有助於對抗腫瘤免疫及PD-1阻斷免疫療法之治療應答性。
(探討) 抗腫瘤免疫係由腫瘤及免疫活性兩者控制。如我們於本研究所示，殺手T細胞之功能活性如腸內細菌或能量代謝，與不同之高次功能系統之網絡相關。因此，單一生物標記不充分，為了獲得更佳之預測精度，要求複數個標記之組合。關於目前之臨床生物標記，於NSCLC或子宮頸癌、食道癌等中，FDA認可PD-L1之高表現，又，針對各種實體癌，FDA認可MSI-H及/或dMMR。但是，於PD-L1之表現較低之NSCLC患者中亦以相當之比率存在治療應答性患者，又，具有MSI-H及/或dMMR之患者數非常稀少(NSCLC患者之約1%)(35、42)。於本研究中，根據腫瘤之PD-L1之表現無法顯著判定應答者與無應答者，亦可謂僅基於腫瘤側之因子之目前之生物標記作為PD-1阻斷療法之治療效果預測生物標記不完全。又，於腫瘤側之因子之探索中，至少必需活檢標本，對患者造成較大之負擔，免疫細胞特性或代謝物可藉由採血而調查，簡便得多，且對患者之負擔較小。亦報告有與宿主免疫相關之一些標記(例如PBMC中之嗜酸性球、嗜中性球、腫瘤相關巨噬細胞、CD4+ T細胞之頻率、及腫瘤部位之浸潤之CD8+ T細胞或PD-1+ CD8+ T細胞之頻率)與治療應答性相關，但該等單一之免疫相關標記之預測精度不充分(22、43)。於本研究中，我們發現對包含T細胞之線粒體之活性狀態之T細胞活化之複數個細胞標記之組合顯示出可以較高之精度預測應答者與無應答者，成為較佳之生物標記之可能性。相關分析之結果提示與腸內細菌、能量代謝及氧化還原相關之代謝物反映末梢之殺手T細胞之抗腫瘤活化狀態。
迄今為止，已知宿主之免疫活性與腸內細菌相互影響(23)。進而，可知腸內細菌與各種疾病相關，亦研究源自腸內細菌之血中代謝物與疾病之原因之關係(5、44、45)。於本研究中，源自腸內細菌之代謝物與作為末梢CD8+ T細胞中之線粒體控制之主要分子之PGC-1αβ之變動相關係應特別記載之結果(10、11)。報告有作為一種源自腸內細菌之代謝物之馬尿酸為腸內細菌之多樣性之指標，或者由梭菌目(Clostridiales)之細菌產生較多(4、5)。最近，報告有腸內細菌之多樣性或腸內細菌中梭菌目細菌較多與PD-1阻斷療法之治療應答性相關(25)。於本研究中，於治療應答性患者中，以馬尿酸作為代表之源自腸內細菌之代謝物表現出高值。其可能反映具有活化免疫之作用之特定之腸內細菌種之增加或腸內細菌之多樣性。雖幾乎不知腸內細菌控制抗腫瘤免疫之機制(26)，但本研究結果提示腸內細菌及源自腸內細菌之代謝物與末梢CD8+ T細胞之線粒體活化狀態有密切之關聯。
醯基肉鹼之變動與PD-1high CD8+ T細胞之頻率表現出相關。醯基肉鹼係藉由作為位於線粒體之受質之肉鹼依賴性酵素之肉鹼乙醯基轉移酶或肉鹼棕櫚醯基轉移酶I(CPT1)，自短鏈醯基CoA及肉鹼轉換。即，肉鹼具有將醯基CoA自細胞質轉運至線粒體內部之作用(7-9)。若促進FAO，則較多醯基肉鹼進入至線粒體受質中，血漿醯基肉鹼水準降低(7-9、46、47)。因此，醯基肉鹼種之血漿水準可成為線粒體活性或炎症反應下之FAO之指標(48-50)。於本研究中，醯基肉鹼種(丁醯肉鹼、異戊醯肉鹼及己醯肉鹼)於PD-1抗體治療後之非應答性患者中上升，提示殺手T細胞中之FAO之降低(47)。於非應答性患者中可見醯基肉鹼水準之上升及PD-1high CD8+ T細胞之增加，該等2個標記有相關關係。其顯示於非應答性患者中存在FAO降低之大量之疲弊殺手T細胞。該等結果與為了藉由PD-1阻斷之強力之抗腫瘤活性，效應殺手T細胞中之FAO路徑較為重要這一過去之報告不矛盾(32)。
線粒體之ROS之增加對T細胞之活化及細胞激素產生而言不可缺少(31、51)。但是，極高濃度之ROS對細胞有毒性，故而細胞使用GSH/GSSG系統，適當地控制ROS水準(37)。氧化GSH(GSSG)釋出至細胞外，經過複雜之排出系統進入至血漿(52、53)。因此，已知血漿中之GSSG水準成為細胞之氧化狀態或各種免疫相關疾病之指標(52、53)。於本研究中，於應答性患者中治療前之殺手T細胞之線粒體之ROS增加，治療後之血漿中之GSSG及GSH之成分(胱胺酸與焦麩胺酸)表現出高值。說明該等標記亦有相關關係是根據ROS與GSH/GSSG系統之機制(37)。
認為迄今為止，PBMC中之PD-1high CD8+ T細胞之Ki-67頻率極高，包含腫瘤特異性T細胞(54、55)。於我們之結果中，PD-1high CD8+ T細胞之顆粒酶B及IFN-γ之產生降低。其提示幾次分裂之結果為該細胞群疲弊。實際上PD-1high CD8+ T細胞之T-bet之表現降低，但視為疲弊標記之EOMES之表現較高。報告有PD-1high CD8+ T細胞於應答性患者之腫瘤組織內較多(56)，但於我們之結果中，於應答性患者之末梢血液中PD-1high CD8+ T細胞較少。認為該矛盾有以下之2個原因。1)應答性患者中具有腫瘤反應性之PD-1high CD8+ T細胞優先游走於腫瘤部位，故而末梢之數量變少。2)PD-1high CD8+ T細胞之功能或疲弊之程度於腫瘤部位及末梢血液之間不同。但是，為了闡明該矛盾，必需進一步之詳細之分析。
於本研究之結果中，於檢查之所有代謝物及細胞標記中，數個細胞標記之組合表現出最高之治療效果預測精度。又，其關係到有治療效果預測之代謝物與細胞標記密切相關。但是，與測定代謝物之簡便性相比，細胞標記難以於不同之設施間穩定地測定，故而可能複數個代謝物之組合適於臨床應用。根據本研究，提示組合生物標記對癌症免疫治療之實用性。藉由確立此種生物標記，可對對抗PD-1抗體單劑治療為非應答性之患者選擇不同之治療選項，期待提高治療效果。
方法 (Methods) 研究設計及參加者 於本研究中，以如下患者作為對象：於京都大學醫院接受納武單抗(抗PD-1抗體)之投予之NSCLC患者中同意於治療中採取及保存血液樣本，又，允許利用彼等之關於過去之病史、癌症腫瘤類型、毒性評價、臨床應答、生存時間及檢查值之診斷記錄之患者。本研究由京都大學倫理委員會認可。我們登記60名NSCLC患者。所有患者係於以前接受過其他化學療法。患者係於疾病惡化之前，或者於出現無法容許之副作用之前，每2週接受納武單抗(3 mg/kg)之投予。於即將第1、第2及第3次投予納武單抗之前，自患者採取血液樣本。於登記之60名患者中，6名發生脫落，進而7名因嚴重之副作用而必須中斷治療，故而我們對剩餘之47名之資料進行分析。藉由CT測定腫瘤尺寸，使用「實體癌中之應答評價基準1.1」(RECIST 1.1)對應答進行評價。
關於PD-1high CD8+ T細胞群之功能分析，我們登記與接受納武單抗或帕博利珠單抗之投予之上述不同之12名NSCLC患者。
製備用以測定血漿代謝組之樣本 將末梢血液樣本收集於裝有7 ml之EDTA之採血管(Venoject II，VP-NA070K，Terumo，東京，日本)中，立即保管於CubeCooler(Forte Grow Medical Co. Ltd., 櫪木，日本)中，於進行離心分離(4℃，3000 rpm，15分鐘)之前保持為4℃。其次，於用於分析之前，於-80℃下保管所採取之所有血漿樣本。為了進行GCMS分析，將50 μl之血漿與256 μl之溶劑混合物(甲醇：氯仿：水＝2.5：1：1，包含2.34 μg/ml之2-異丙基蘋果酸(Sigma-Aldrich))進行混合，使用其作為內部標準。將所獲得之混合物以1200 rpm於37℃下攪拌30分鐘(Maximizer MBR-022UP，Taitec)。以16000×g於25℃下離心5分鐘後，回收150 μl之上清液，與140 μl之純化水進行混合，其次進行5秒旋渦混合。以16000×g於25℃下離心5分鐘後，藉由離心蒸發器(CVE-3100，東京理化器械股份有限公司)使180 μl之上清液乾燥。將乾燥之樣本溶解於80 μl之甲氧基胺溶液(吡啶中20 mg/ml)中，以1200 rpm於37℃下攪拌30分鐘。加入40 μl之N-甲基-N-三甲基矽烷基三氟乙醯胺溶液(GL science)進行三甲基矽烷基化，以1200 rpm於37℃下攪拌30分鐘。離心後，將50 μl之上清液轉移至玻璃製小瓶中，用於GCMS測定。為了進行LCMS分析，稍微改變代謝物萃取方案。將50 μl之血漿與256 μl之甲醇進行混合，以1200 rpm於37℃下攪拌10分鐘。以16000×g於25℃下離心30分鐘後，將150 μl之上清液與90 μl之1%乙酸水溶液及120 μl之氯仿進行混合，其次進行15秒旋渦混合。以2000×g於25℃下離心10分鐘後，使150 μl之上層乾燥，溶解於50 μl之0.1%甲酸水溶液中，用於LCMS分析。
血漿代謝物分析 GCMS分析係使用GCMS-QP2010 Ultra(島津製作所)實施。衍生物化代謝物係使用DB-5管柱(內徑30 m×0.25 mm，膜厚度1.0 μm，Agilent Technologies)分離。將氦載氣設置為流速39 cm/秒。注射口之溫度為280℃，管柱溫度最初2分鐘保持為80℃，其次以15℃/分鐘之比率使之上升直至達到330℃，保持6分鐘。
以掃描模式實施GC-MS測定。代謝物之波峰係藉由光譜庫一致進行鑑定，使用內部標準進行半定量化。將1 μl之樣本以分離模式(分離比1：3)注入至GCMS。於以下之條件下獲得質譜。於電子離子化(離子化電壓70 eV)、離子源溫度200℃、m/z 85-500之範圍內以全掃描模式、掃描速度0.3秒/掃描進行掃描。層析波峰之鑑定係使用NIST庫或島津GC/MS資料庫實施，進而，使用可靠之市售之標準品確認。關於半定量分析，計算各代謝物波峰之面積，除以內部標準波峰之面積。LC分離係藉由Nexera UHPLC系統(島津製作所)，使用Shim-pack GIST C18-AQ管柱(3 μm，150 mm×2.1 mm內徑，Shimadzu Glc)實施。流動相包含0.1%甲酸水溶液(A)及0.1%甲酸之乙腈溶液(B)。梯度程式如下所述：0-3分鐘，0% B；3-15分鐘，自直線梯度至60% B；15-17.5分鐘，95% B；17.5-20分鐘，自直線梯度至0% B；保持4分鐘；流速0.2 ml/分鐘。管柱烘箱溫度維持為40℃。將LC系統與三重四極質譜儀LCMS-8060(島津製作所)連結。LCMS-8060係於電灑離子化及多重反應監控模式下進行操作。所有離子躍遷及碰撞能量係使用各代謝物之可靠之標準品，以實驗之方式最佳化。將3 μl之樣本注入至LCMS系統中。將品質管理(QC、經混合之血漿)樣本附於同一製備方案，將每10個及每5個樣本分別注入至GCMS系統及LCMS系統中。利用基於使用平滑樣條算法之QC之修正法將各代謝物之訊息進行標準化(57-59)。將與所測定之所有代謝物相關之資訊(包含保持時間、m/z及離子躍遷)歸納於補充表1及2。
流式細胞儀 自血液利用Ficoll密度梯度離心法單離PBMC。使用以下之抗體立即對PMBC進行染色：抗-CD8a(RPA-T8)、-CD8(SK1)、-CD4(RPA-T4、SK3)、-CD45RA(HI100)、-CD45RO(UCHL1)、-CCR7(3D12)、-PD-1(EH12.2H7)、-Tim3(F38-2E2)、-KLRG1(13F12F2)、-CD25(BC96)、-CXCR3(G025H7)、-CCR6(G034E3)、-T-bet(4B10)、-EOMES(WD1928)、-Ki-67(SolA15)、-CTLA-4(BNI3)、-p-mTOR(MRRBY)、-p-Akt1(Ser473)(SDRNR)、-顆粒酶B(GB11)、-IFN-γ(4S.B3)及-FOXP3(236A/E7)抗體。使用識別PGC-1α及PGC-1β兩者之抗PGC-1αβ(兔多株，Abcum，ab72230)檢測PGC-1表現，其次，使用山羊抗兔IgG(Santa Cruz Biotech，sc-3739)進行二次染色。死細胞判別係使用7-AAD染色溶液(TONBO，13-6993)實施。細胞內染色係使用FOXP3固定套組(Fixation Kit)(eBioscience)實施。於細胞內磷酸化蛋白質之染色時，於染色前使用0.5% Triton-X使細胞為透過性，藉由1.5%多聚甲醛進行固定。樣本係使用BD Canto II流式細胞儀(BD Bioscience)進行測定，資料係使用BD FACS Diva Software version 6.1.3取得。進而，使用FlowJo 10.4(Tree Star Inc.)進行分析。於資料分析時，對活細胞(7AAD陰性)及單細胞設門。線粒體體積、膜電位、線粒體超氧化物及細胞ROS之測定係分別使用MitoTracker Green、MitoTracker Deep Red、MitoSOX Red及CellROX Green試劑實施(所有試劑均為Life Technologies製造)。將該等色素添加至細胞中，於5% CO2 加濕培養箱中於37℃下培養30分鐘，繼而進行表面染色。對投予納武單抗後之樣本，將抗PD-1(EH12.2H7，APC-鍵)抗體加入至細胞中，於5% CO2 加濕培養箱中於37℃下培養60分鐘，繼而進行其他表面染色。
統計分析 資料係由中央值及四分位距表示。2群間之比較係實施Wilcoxon秩和檢定。多重間之比較係實施Kruskal-Wallis檢定，繼而實施用於多重比較之Dunn之多重比較檢定。利用使用AIC之逐步回歸法，選擇最佳之標記組合。其次，使用推定之生物標記之組合實施LDA，預測可靠性。使用5折交叉驗證評價預測模型。使用Kaplan-Meier檢定，計算患者不同之群之生存率，作為生存曲線以圖表之形式呈現。藉由Gehan-Breslow-Wilcoxon檢定而分析2個群之間之生存曲線之比較。為了計算細胞標記與代謝標記之間之關聯，使用Spearman相關係數。於資料管理及統計分析中，使用JMP software(Version 12.0.0; SAS Institute Inc.; Cary, NC, USA)、R software(Version 3.4.4)、DataRobot(Version 4.3.0)及Prism software(Version 6.0h; GraphPad Software)。對所有檢定，顯著水準設定為0.05。
[表1] 藉由GC-MS所測定之代謝物.
名稱 Kegg ID HMDB ID 甲基肟/TMS衍生物 m/z 保持時間(min) 名稱 Kegg ID HMDB ID 甲基肟/TMS衍生物 m/z 保持時間(min)
1,5-脫水-D-山梨糖醇 1,6-脫水葡萄糖 1-十六烷醇 2-胺基己二酸 2-胺基丁酸 2-胺基乙醇 2-脫氧季酮酸 2-羥基丁酸 2-羥基異丁酸 2-羥基異戊酸 2-羥基吡啶 2-氧代丁酸 2-氧代戊二酸(α-酮戊二酸) 2-氧代異己酸 3-(3-羥基苯基)-3-羥基丙酸 3-胺基異丁酸 3-羥基丁酸 3-羥基異丁酸 3-羥基異戊酸 3-吲哚丙酸 3-甲基-2-氧代丁酸 3-甲基-2-氧代戊酸 3-甲基組胺酸 4-甲酚 4-羥基脯胺酸 乙醯乙酸 烏頭酸 丙胺酸 丙胺酸 阿洛糖 阿拉伯酸 阿拉伯糖 阿拉伯糖醇 天冬醯胺
Figure 02_image001
天冬胺酸 苯甲酸 β-丙胺酸 硼酸 咖啡因 己酸 檸檬酸 瓜胺酸 肌酸酐 半胱胺酸 半胱胺醯甘胺酸 胱胺酸 癸酸 反油酸 赤藻糖醇 果糖 海藻糖 反丁烯二酸 葡萄糖酸 葡萄糖 葡糖醛酸 麩胺酸 麩醯胺 戊二酸 甘油酸 甘油 甘胺酸 乙醇酸 馬尿酸 組胺酸		 C07326 - C00823 C00956 C02356 C00189 - C05984 - - C02502 C00109 C00026 C00233 - C05145 C01089 C06001 - - C00141 C00671 C01152 C01468 C01157 C00164 C02341 C00041 C00041 C01487 - C00259 C01904 C00152 C00049 C00180 C00099 C12486 C07481 C01585 C00158 C00327 C00791 C00097 C01419 C00491 C01571 C01712 C00503 C00095 C01019 C00122 C00257 C00031 C00191 C00025 C00064 C00489 C00258 C00116 C00037 C00160 C01586 C00135 HMDB0002712 HMDB0000640 HMDB0003424 HMDB0000510 HMDB0000452 HMDB0000149 HMDB0000337 HMDB0000008 HMDB0000729 HMDB0000407 HMDB0013751 HMDB0000005 HMDB0000208 HMDB0000695 HMDB0002643 HMDB0003911 HMDB0000357 HMDB0000023 HMDB0000754 HMDB0002302 HMDB0000019 HMDB0000491 HMDB0000479 HMDB0001858 HMDB0000725 HMDB0000060 HMDB0000958 HMDB0000161 HMDB0000161 HMDB0001151 HMDB0000539 HMDB0000646 HMDB0000568 HMDB0000168 HMDB0000191 HMDB0001870 HMDB0000056 HMDB0035731 HMDB0001847 HMDB0000535 HMDB0000094 HMDB0000904 HMDB0000562 HMDB0000574 HMDB0000078 HMDB0000192 HMDB0000511 HMDB0000573 HMDB0002994 HMDB0000660 HMDB0000174 HMDB0000134 HMDB0000625 HMDB0000122 HMDB0000127 HMDB0000148 HMDB0000641 HMDB0000661 HMDB0000139 HMDB0000131 HMDB0000123 HMDB0000115 HMDB0000714 HMDB0000177 1,5-脫水-D-山梨糖醇-4TMS 1,6-脫水-β-D-葡萄糖-3TMS 1-十六烷醇-TMS 2-胺基己二酸-3TMS 2-胺基丁酸-2TMS 2-胺基乙醇-3TMS 2-脫氧季酮酸-3TMS 2-羥基丁酸-2TMS 2-羥基異丁酸-2TMS 2-羥基異戊酸-2TMS 2-羥基吡啶-TMS 2-氧代丁酸-甲基肟-TMS 2-氧代戊二酸-甲基肟-2TMS 2-氧代異己酸-甲基肟-TMS 3-(3-羥基苯基)-3-羥基丙酸-3TMS 3-胺基異丁酸-3TMS 3-羥基丁酸-2TMS 3-羥基異丁酸-2TMS 3-羥基異戊酸-2TMS 3-吲哚丙酸-2TMS 3-甲基-2-氧代丁酸-甲基肟-TMS 3-甲基-2-側氧戊酸-甲基肟-TMS 3-甲基組胺酸-2TMS 4-甲酚-TMS 4-羥基脯胺酸-3TMS 乙醯乙酸-甲基肟-TMS 烏頭酸-3TMS 丙胺酸-2TMS 丙胺酸-3TMS 阿洛糖-甲基肟-5TMS 阿拉伯酸-5TMS 阿拉伯糖-甲基肟-4TMS 阿拉伯糖醇-5TMS 天冬醯胺-3TMS 天冬胺酸-3TMS 苯甲酸-TMS β-丙胺酸-3TMS 硼酸-3TMS 咖啡因 己酸-TMS 檸檬酸-4TMS 瓜胺酸-4TMS 肌酸酐-3TMS 半胱胺酸-3TMS 半胱胺醯甘胺酸-3TMS 胱胺酸-4TMS 癸酸-TMS 反油酸-TMS 赤藻糖醇-4TMS 果糖-甲基肟-5TMS 海藻糖-甲基肟-5TMS 反丁烯二酸-2TMS 葡萄糖酸-甲基肟-5TMS 葡萄糖-甲基肟-5TMS 葡糖醛酸-甲基肟-5TMS 麩胺酸-3TMS 麩醯胺-3TMS 戊二酸-2TMS 甘油酸-3TMS 甘油-3TMS 甘胺酸-3TMS 乙醇酸-2TMS 馬尿酸-TMS 組胺酸-3TMS 259.0 204.0 299.0 260.0 130.0 174.0 321.0 131.0 131.0 145.0 152.0 188.0 198.0 200.0 267.0 304.0 191.0 177.0 131.0 202.0 89.0 200.0 168.0 180.0 140.0 203.0 375.0 218.0 188.0 205.0 292.0 307.0 217.0 231.0 232.0 179.0 290.0 263.0 194.0 173.0 363.0 256.0 115.0 218.0 220.0 411.0 229.0 93.0 217.0 307.0 117.0 245.0 292.0 229.0 423.0 246.0 362.0 261.0 292.0 218.0 174.0 205.0 236.0 371.0 14.77 13.70 15.37 13.62 8.69 9.77 11.20 8.17 7.46 8.61 7.22 7.86 12.47 9.10 14.68 11.67 8.51 8.51 9.09 16.50 7.96 8.97 15.1 8.56 12.15 8.1 13.81 7.91 10.77 15.00 14.23 13.26 13.75 13.32 12.03 9.60 11.31 6.49 15.05 7.52 14.45 14.48 12.58 12.44 16.14 17.67 11.47 17.11 11.92 14.92 13.89 10.37 15.94 15.32 15.47 12.85 14.11 10.94 10.28 9.69 10.20 7.53 14.75 15.28 亞牛磺酸 次黃嘌呤 吲哚乙酸 吲哚乳酸 硫酸吲哚酚 異檸檬酸 異白胺酸 犬尿胺酸 乳酸 月桂酸 白胺酸 亞麻油酸 離胺酸 蘋果酸 麥芽糖 甘露糖 珠光子酸 甲硫胺酸 肌醇 肉豆蔻酸 辛酸 油酸 O-磷酸乙醇胺 鳥胺酸 草酸 棕櫚酸 棕櫚油酸 副黃嘌呤 苯酚 苯丙胺酸 磷甘油 磷酸 2-哌啶甲酸 脯胺酸 焦麩胺酸 焦磷酸鹽 丙酮酸 核糖醇 核糖 核酮糖 鯊肌醇 絲胺酸 硬脂酸 丁二酸 蔗糖 牛磺酸 蘇糖醇 蘇阿糖酸 蘇胺酸 色胺酸 酪胺酸 Unk12* Unk3* Unk4* Unk6* Unk8* Unk9* 脲 尿酸 尿苷 纈胺酸 黃嘌呤 木糖醇 木糖 C00519 C00262 C00954 C02043 - C00311 C16434 C00328 C00186 C02679 C00123 C01595 C00047 C00711 C00208 C00159 - C00073 C00137 C06424 C06423 C00712 C00346 C00077 C00209 C00249 C08362 C13747 C00146 C00079 C03189 C00009 C00408 C00148 C01879 - C00022 C00474 C00121 C00309 C06153 C00065 C01530 C00042 C00089 C00245 C16884 C01620 C00188 C00078 C00082 - - - - - - C00086 C00366 C00299 C00183 C00385 C00379 C00181 HMDB0000965 HMDB0000157 HMDB0000197 HMDB0000671 HMDB0000682 HMDB0000193 HMDB0000172 HMDB0000684 HMDB0000190 HMDB0000638 HMDB0000687 HMDB0000673 HMDB0000182 HMDB0000156 HMDB0000163 HMDB0000169 HMDB0002259 HMDB0000696 HMDB0000211 HMDB0000806 HMDB0000482 HMDB0000207 HMDB0000224 HMDB0000214 HMDB0002329 HMDB0000220 HMDB0003229 HMDB0001860 HMDB0000228 HMDB0000159 HMDB0000126 HMDB0002142 HMDB0000070 HMDB0000162 HMDB0000267 HMDB0000250 HMDB0000243 HMDB0000508 HMDB0000283 HMDB0000621 HMDB0006088 HMDB0000187 HMDB0000827 HMDB0000254 HMDB0000258 HMDB0000251 HMDB0004136 HMDB0000943 HMDB0000167 HMDB0000929 HMDB0000158 - - - - - - HMDB0000294 HMDB0000289 HMDB0000296 HMDB0000883 HMDB0000292 HMDB0002917 HMDB0000098 亞牛磺酸-3TMS 次黃嘌呤-2TMS 吲哚-3-乙酸-2TMS 吲哚乳酸-3TMS 硫酸吲哚酚-2TMS 異檸檬酸-4TMS 異白胺酸-2TMS 犬尿胺酸-3TMS 乳酸-2TMS 月桂酸-TMS 白胺酸-2TMS 亞麻油酸-TMS 離胺酸-4TMS 蘋果酸-3TMS 麥芽糖-甲基肟-8TMS 甘露糖-甲基肟-5TMS 珠光子酸-TMS 甲硫胺酸-2TMS 肌醇-6TMS 肉豆蔻酸-TMS 辛酸-TMS 油酸-TMS O-磷酸乙醇胺-4TMS 鳥胺酸-4TMS 草酸-2TMS 棕櫚酸 TMS 棕櫚油酸-TMS 副黃嘌呤-TMS 苯酚-TMS 苯丙胺酸-2TMS 磷酸甘油-4TMS 磷酸-3TMS 2-哌啶甲酸-TMS 脯胺酸-2TMS 5-側氧脯胺酸-2TMS 焦磷酸鹽-4TMS 丙酮酸-甲基肟-TMS 核糖醇-5TMS 核糖-甲基肟-4TMS 核酮糖-甲基肟-4TMS 鯊肌醇-6TMS 絲胺酸-3TMS 硬脂酸-TMS 丁二酸-2TMS 蔗糖-8TMS 2-胺基乙磺酸-3TMS 蘇糖醇-4TMS 蘇阿糖酸-4TMS 蘇胺酸-3TMS 色胺酸-3TMS 酪胺酸-3TMS - - - - - - 脲-2TMS 尿酸-4TMS 尿苷-4TMS 纈胺酸-2TMS 黃嘌呤-3TMS 木糖醇-5TMS 木糖-甲基肟-4TMS 188.1 265.0 202.0 202.0 277.0 245.0 232.0 307.0 219.0 257.0 232.0 337.0 174.0 233.0 204.0 319.0 117.0 250.0 432.0 285.0 201.0 339.0 299.0 420.0 219.0 313.0 311.0 237.0 166.0 192.0 445.0 225.0 156.0 216.0 258.0 451.0 174.0 319.0 307.0 263.0 318.0 306.0 341.0 247.0 361.0 326.0 217.0 292.0 291.0 291.0 382.0 196.0 170.0 319.0 320.0 116.0 217.0 204.0 367.0 245.0 218.0 353.0 217.0 307.0 12.92 14.50 15.68 17.08 13.84 14.41 9.99 17.7 7.39 13.11 9.74 17.06 15.23 11.73 20.64 15.05 16.58 12.14 16.54 14.60 9.62 17.08 14.29 14.52 8.13 15.95 15.85 15.77 7.45 13.12 14.00 9.76 10.44 10.12 12.21 13.32 7.23 13.81 13.38 13.38 16.11 10.58 17.18 10.10 19.79 13.50 11.84 12.38 10.86 17.34 15.39 14.50 8.98 9.56 11.66 13.96 14.04 9.29 16.40 18.54 9.19 15.92 13.66 13.21
高半胱胺酸 C00155 HMDB0000742 高半胱胺酸-3TMS 234.0 13.33                  
* 'Unk'意指該等代謝物於分析時尚未識別
[表2]
藉由LC-MS所測定之代謝物.
名稱 Kegg ID HMDB ID 離子躍遷 保持 時間(min) 名稱 Kegg ID HMDB ID 離子躍遷 保持 時間(min)
4-羥基脯胺酸 C01157 HMDB0000725 132.10＞68.05 1.89 纈胺酸 C00183 HMDB0000883 118.10＞55.10 3.15
乙醯丙胺酸 - HMDB0000766 132.10＞90.10 4.00 黃苷 C01762 HMDB0000299 285.10＞153.20 8.61
乙醯甘胺酸 - HMDB0000532 118.00＞76.10 3.53 黃尿酸 C02470 HMDB0000881 206.00＞160.00 9.75
腺苷 C00212 HMDB0000050 268.10＞136.10 8.35 非對稱性二甲基精胺酸 C03626 HMDB0001539 203.10＞46.10 2.47
腺苷高半胱胺酸 C00021 HMDB0000939 385.10＞136.10 8.23 對稱性二甲基精胺酸    HMDB0003334 203.10＞172.20 2.57
腺苷甲硫胺酸 C00019 HMDB0001185 399.10＞250.10 2.18 反式4-咪唑丙烯酸 C00785 HMDB0000301 139.10＞93.10 4.70
2-胺基己二酸 C00956 HMDB0000510 162.10＞98.20 2.35 2-羥基-3-甲基戊酸    HMDB0000317 131.10＞85.15 11.52
精胺基丁二酸 C03406 HMDB0000052 291.10＞70.10 2.08 2-羥基丁酸 C05984 HMDB0000008 103.00＞57.20 7.95
天冬醯胺 C00152 HMDB0000168 133.10＞74.05 1.85 2-羥基戊二酸 C01087 HMDB0000606 147.00＞129.05 4.27
天冬胺酸 C00049 HMDB0000191 134.10＞88.00 1.85 2-羥基異戊酸    HMDB0000407 117.10＞71.10 9.89
甜菜鹼 C00719 HMDB0000043 118.10＞42.05 2.07 2-氧代戊二酸(α-酮戊二酸) C00026 HMDB0000208 145.10＞57.10 3.24
肌酸 C00300 HMDB0000064 132.10＞44.05 2.30 3-羥基丁酸 C01089 HMDB0000357 103.00＞59.10 6.64
肌酸酐 C00791 HMDB0000562 114.10＞86.10 2.18 3-羥基異戊酸    HMDB0000754 117.10＞59.10 8.89
胱硫醚 C00542 HMDB0000099 223.10＞88.00 1.84 3-甲基戊烯二酸    HMDB0000522 143.00＞99.05 10.07
半胱胺酸 C00097 HMDB0000574 122.00＞59.00 2.04 4-羥基苯甲酸 C00156 HMDB0000500 137.00＞93.00 10.98
胱胺酸 C00491 HMDB0000192 241.00＞74.10 1.83 AMP    HMDB0000045 346.10＞79.05 4.14
GSH C00051 HMDB0000125 308.10＞179.20 4.32 烏頭酸 C02341 HMDB0000958 173.00＞85.15 8.17
GSSG C00127 HMDB0003337 613.20＞231.00 8.17 阿拉伯酸    HMDB0000539 165.00＞75.05 2.01
麩胺酸 C00025 HMDB0000148 148.10＞102.05 1.98 檸檬酸 C00158 HMDB0000094 191.00＞87.10 4.59
麩醯胺 C00064 HMDB0000641 147.10＞130.05 1.92 反丁烯二酸 C00122 HMDB0000134 115.00＞71.10 5.93
甘胺酸 C00037 HMDB0000123 76.00＞30.10 1.84 戊二酸 C00489 HMDB0000661 131.00＞87.15 8.71
鳥苷 C00387 HMDB0000133 284.10＞152.10 8.39 馬尿酸 C01586 HMDB0000714 178.10＞134.05 11.14
組胺酸 C00135 HMDB0000177 156.10＞83.20 1.84 硫酸吲哚酚    HMDB0000682 212.00＞132.20 10.58
吲哚乙酸 C00954 HMDB0000197 176.10＞130.10 13.67 異檸檬酸 C00311 HMDB0000193 191.00＞73.10 2.96
吲哚乳酸 C02043 HMDB0000671 206.10＞118.10 12.62 乳酸 C00186 HMDB0000190 89.00＞43.10 3.67
吲哚丙酮酸 C00331 HMDB0060484 204.10＞130.10 12.41 蘋果酸 C00711 HMDB0000156 133.00＞115.00 2.89
肌苷 C00294 HMDB0000195 269.10＞110.10 8.40 苯基乳酸 C05607 HMDB0000748 165.10＞147.05 12.32
犬尿喹酸 C01717 HMDB0000715 190.10＞144.00 10.13 吡啶酸 C00847 HMDB0000017 182.00＞108.05 8.56
犬尿胺酸 C00328 HMDB0000684 209.10＞192.05 9.00 丁二酸 C00042 HMDB0000254 117.00＞73.05 5.90
3-羥基犬尿胺酸 C02794 HMDB0000732 225.10＞110.15 7.49 cAMP C00575 HMDB0000058 328.00＞134.20 8.36
N'-甲醯基犬尿胺酸 C02700 HMDB0001200 237.20＞146.05 9.02 甲狀腺素 C01829 HMDB0000248 777.70＞731.50 15.07
白胺酸 C00123 HMDB0000687 132.10＞43.10 7.06 2-哌啶甲酸 C00408 HMDB0000070 130.10＞84.30 3.41
異白胺酸 C16434 HMDB0000172 132.10＞69.10 6.50 3-吲哚丙酸    HMDB0002302 190.10＞130.10 14.73
離胺酸 C00047 HMDB0000182 147.10＞84.10 1.64 喹啉酸 C03722 HMDB0000232 168.10＞78.05 4.40
甲硫胺酸 C00073 HMDB0000696 150.10＞104.00 3.93 3-甲基組胺酸 C01152 HMDB0000479 170.10＞81.10 1.85
S-甲基甲硫胺酸 C05319 HMDB0038670 165.10＞59.20 9.54 肉鹼 C00318 HMDB0000062 162.10＞85.10 2.13
N-乙醯基-Asp-Glu C12270 HMDB0001067 305.10＞148.00 8.17 乙醯肉鹼 C02571 HMDB0000201 204.10＞85.10 4.16
N-乙醯基天冬胺酸 C01042 HMDB0000812 176.10＞134.00 4.08 丙醯肉鹼 C03017 HMDB0000824 218.10＞85.10 8.49
N-乙醯基組胺酸 C02997 HMDB0032055 198.10＞110.10 2.81 異丁醯肉鹼    HMDB0000736 232.20＞85.15 9.38
菸鹼醯胺 C00153 HMDB0001406 123.10＞80.05 5.13 丁醯肉鹼 C02862 HMDB0002013 232.20＞85.05 9.51
苯丙胺酸 C00079 HMDB0000159 166.10＞103.10 8.94 2-甲基丁醯肉鹼    HMDB0000378 246.20＞85.10 10.44
磷酸膽鹼 C00588 HMDB0001565 184.10＞125.00 1.85 異戊醯肉鹼 C20826 HMDB0000688 246.20＞85.15 10.58
脯胺酸 C00148 HMDB0000162 116.10＞70.10 2.28 己醯肉鹼    HMDB0000705 260.20＞85.15 11.88
焦麩胺酸 C01879 HMDB0000267 130.00＞56.10 5.16 戊二醯基肉鹼    HMDB0013130 276.10＞85.05 8.48
核黃素 C00255 HMDB0000244 377.10＞243.20 10.59 己二醯基肉鹼    HMDB0061677 290.20＞85.00 8.96
絲胺酸 C00065 HMDB0000187 106.10＞60.00 1.85 2-胺基丁酸 C02356 HMDB0000452 104.10＞41.05 2.19
血清素 C00780 HMDB0000259 177.10＞160.20 8.73 膽鹼 C00114 HMDB0000097 104.10＞60.00 1.99
腐胺 C00134 HMDB0001414 89.10＞72.10 1.60 3-胺基異丁酸 C05145 HMDB0003911 104.10＞86.10 2.31
亞精胺 C00315 HMDB0001257 146.20＞129.20 1.39 乙醯肌肽    HMDB0012881 269.10＞110.10 4.25
精胺 C00750 HMDB0001256 203.20＞112.20 1.33 丙胺酸 C00041 HMDB0000161 90.00＞44.10 1.91
牛磺酸 C00245 HMDB0000251 126.00＞44.05 1.87 鳥胺酸 C00077 HMDB0000214 133.10＞116.05 1.65
蘇胺酸 C00188 HMDB0000167 120.10＞84.10 1.94 精胺酸 C00062 HMDB0000517 175.10＞70.10 1.83
葫蘆巴鹼 C01004 HMDB0000875 138.00＞94.10 2.39 瓜胺酸 C00327 HMDB0000904 176.10＞159.05 2.05
三甲基離胺酸 C03793 HMDB0001325 189.20＞60.25 1.82 葡糖醛酸 C00191 HMDB0000127 193.00＞103.00 1.95
色胺酸 C00078 HMDB0000929 205.10＞115.20 9.84 葡萄糖酸 C00257 HMDB0000625 195.10＞129.00 1.96
酪胺酸 C00082 HMDB0000158 182.10＞136.20 7.30 N-乙醯葡萄糖胺 C00140 HMDB0000215 222.10＞138.00 2.33
脲 C00086 HMDB0000294 61.00＞44.05 2.05 N-乙醯基神經胺糖酸 C00270 HMDB0000230 310.10＞274.10 2.17
尿酸 C00366 HMDB0000289 169.00＞126.05 5.26 4-胍基丁酸 C01035 HMDB0003464 146.10＞86.15 3.82
尿苷 C00299 HMDB0000296 245.10＞113.10 7.51 N-乙醯基鳥胺酸 C00437 HMDB0003357 175.10＞70.05 2.67
[表3]
利用流式細胞儀所測定之細胞標記.
細胞標記
CD4+ T細胞中表現CCR6之細胞之頻率(% of CCR6+ cells among CD4+ T cells)
CD4+ T細胞中表現CD25之細胞之頻率(% of CD25+ cells among CD4+ T cells)
PBMC中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC)
PBMC中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC)
CD4+ T細胞中表現CTLA4之細胞之頻率(% of CTLA4+ cells among CD4+ T cells)
CD4+ T細胞中表現CXCR3之細胞之頻率(% of CXCR3+ cells among CD4+ T cells)
CD4+ T細胞中表現FoxP3*之細胞之頻率(% of FoxP3* cells among CD4+ T cells)
CD4+ T細胞中高表現FoxP3之細胞之頻率(% of FoxP3high cells among CD4+ T cells)
CD4+ T細胞中低表現FoxP3之細胞之頻率(% of FoxP3low cells among CD4+ T cells)
CD4+ T細胞中表現FoxP3及CD25之細胞之頻率(% of FoxP3+ CD25+ cells among CD4+ T cells)
CD4+ T細胞中低表現FoxP3之CD45RA+ 細胞之頻率(% of FoxP3low CD45RA+ cells among CD4+ T cells)
CD4+ T細胞中表現FoxP3及CTLA4之細胞之頻率(% of FoxP3+ CTLA4+ cells among CD4+ T cells)
CD4+ T細胞中表現IFNy之細胞之頻率(% of IFNy+ cells among CD4+ T cells)
CD8+ T細胞中表現IFNy之細胞之頻率(% of IFNy+ cells among CD8+ T cells)
CD4+ T細胞中表現KLRG1之細胞之頻率(% of KLRG1+ cells among CD4+ T cells)
CD4+ T細胞中表現KLRG1及CCR6之細胞之頻率(% of KLRG1+ CCR6+ cells among CD4+ T cells)
CD8+ T細胞中表現KLRG1之細胞之頻率(% of KLRG1+ cells among CD8+ T cells)
CD4+ T細胞中表現PD-1之細胞之頻率(% of PD-1+ cells among CD4+ T cells)
CD4+ T細胞中表現PD-1及CD45之細胞之頻率(% of PD-1+ CD45+ cells among CD4+ T cells)
CD4+ T細胞中表現PD-1及FoxP3之細胞之頻率(% of PD-1+ FoxP3+ cells among CD4+ T cells)
CD8+ T細胞中表現PD-1之細胞之頻率(% of PD-1+ cells among CD8+ T cells)
CD8+ T細胞中高表現PD-1之細胞之頻率(% of PD-1high cells among CD8+ T cells)
CD4+ T細胞中表現T-bet之細胞之頻率(% of T-bet+ cells among CD4+ T cells)
CD4+ T細胞中高表現T-bet之細胞之頻率(% of T-bethigh cells among CD4+ T cells)
CD4+ T細胞中表現T-bet及KLRG1之細胞之頻率(% of T-bet+ KLRG1+ cells among CD4+ T cells)
CD8+ T細胞中表現T-bet之細胞之頻率(% of T-bet+ cells among CD8+ T cells)
CD8+ T細胞中高表現T-bet之細胞之頻率(% of T-bethigh cells among CD8+ T cells)
CD8+ T細胞中表現EOMES之細胞之頻率(% of EOMES+ cells among CD8+ T cells)
CD8+ T細胞中表現T-bet且不表現EOMES之細胞之頻率(% of T-bet+ EOMES- cells among CD8+ T cells)
CD8+ T細胞中表現T-bet及EOMES之細胞之頻率(% of T-bet+ EOMES+ cells among CD8+ T cells)
CD8+ T細胞中不表現T-bet且表現EOMES之細胞之頻率(% of T-bet- EOMES+ cells among CD8+ T cells)
CD4+ T細胞中之初始T細胞之頻率(% of Tnaive among CD4+ T cells)
CD4+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD4+ T cells)
CD4+ T細胞中之效應記憶T細胞之頻率(% of Tem among CD4+ T cells)
CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells)
CD8+ T細胞中之初始T細胞之頻率(% of Tnaive among CD8+ T cells)
CD8+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD8+ T cells)
CD8+ T細胞中之效應記憶T細胞之頻率(% of Tem among CD8+ T cells)
CD8+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD8+ T cells)
CD4+ T細胞中表現Tim3之細胞之頻率(% of Tim3+ cells among CD4+ T cells)
CD8+ T細胞中表現Tim3之細胞之頻率(% of Tim3+ cells among CD8+ T cells)
CD4+ T細胞之Cell ROX Green(Cell ROX Green(MFI)of CD4+ T cells)
CD8+ T細胞之Cell ROX Green(Cell ROX Green(MFI)of CD8+ T cells)
CD4+ T細胞之Mito SOX Red(Mito SOX Red(MFI)of CD4+ T cells)
CD8+ T細胞之Mito SOX Red(Mito SOX Red(MFI)of CD8+ T cells)
CD4+ T細胞之Mito Tracker Deep Red(Mito Tracker Deep Red(MFI)of CD4+ T cells)
CD8+ T細胞之Mito Tracker Deep Red(Mito Tracker Deep Red(MFI)of CD8+ T cells)
CD4+ T細胞之Mito Tracker Green(Mito Tracker Green(MFI)of CD4+ T cells)
CD8+ T細胞之Mito Tracker Green(Mito Tracker Green(MFI)of CD8+ T cells)
CD8+ T細胞之p-Akt(MFI)(p-Akt(MFI)of CD8+ T cells)
CD8+ T細胞之p-mTOR(MFI)(p-mTOR(MFI)of CD8+ T cells)
CD8+ T細胞之PGC-1αβ(MFI)(PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells)
[表4]
代謝物於應答者(R)與無應答者(NR)之間表現出顯著差異.  
代謝物 時間點 相對於NR，R中之變化 模態 p值 代謝物 兩個時間點之比 相對於NR，R中之變化 模態 p值  
丙胺酸 1st 更高 GC 0.0474     
4-甲酚 半胱胺酸 馬尿酸 油酸 硫酸吲哚酚 核糖 Unk8 吲哚乙酸酯 尿酸 反式4-咪唑丙烯酸 2-哌啶甲酸 N-乙醯葡萄糖胺 尿酸 吲哚乳酸 阿拉伯糖 阿拉伯糖醇 馬尿酸 胱胺酸 硫酸吲哚酚 葡萄糖酸 瓜胺酸 肌酸酐 N-乙醯天冬胺酸 焦麩胺酸 三甲基離胺酸
Figure 02_image002
非對稱性二甲基精胺酸 對稱性二甲基精胺酸 2-哌啶甲酸 甲基組胺酸 丁醯肉鹼 3-胺基異丁酸 乙醯肌肽 丙胺酸 精胺酸 N-乙醯鳥胺酸 4-甲酚 3-羥基異戊酸 丙酮酸 α-酮戊二酸 馬尿酸 胱胺酸 硫酸吲哚酚 Unk13 GSSG 尿酸 2-羥基丁酸 2-哌啶甲酸 丁醯肉鹼		 1st 1st 1st 1st 1st 1st 1st 1st 1st 1st 1st 1st 2nd 2nd 2nd 2nd 2nd 2nd 2nd 2nd 2nd 2nd 2nd 2nd 2nd 2nd 2nd 2nd 2nd 2nd 2nd 2nd 2nd 2nd 2nd 3rd 3rd 3rd 3rd 3rd 3rd 3rd 3rd 3rd 3rd 3rd 3rd 3rd 更高 更高 更高 更高 更高 更高 更低 更高 更高 更高 更低 更高 更高 更高 更高 更高 更高 更高 更高 更高 更高 更高 更高 更高 更高 更高 更高 更低 更高 更低 更高 更高 更高 更高 更高 更高 更低 更低 更低 更高 更高 更高 更高 更高 更高 更低 更低 更低 GC GC GC/LC GC GC/LC GC GC LC LC LC LC LC GC/LC GC GC GC GC GC GC/LC GC GC/LC LC LC LC LC LC LC LC LC LC LC LC LC LC LC GC GC/LC GC GC GC/LC GC GC/LC GC LC LC LC LC LC 0.0238 0.0474 0.0062/0.0056 0.0281 0.0313/0.0225 0.0081 0.0273 0.018 0.0126 0.0498 0.0252 0.0281 0.0114/0.0176 0.0387 0.0186 0.0089 0.0323 0.0043 0.0454/0.0348 0.0454 0.0312/0.0122 0.0198 0.0311 0.0064 0.0408 0.0028 0.0078 0.0329 0.0176 0.0101 0.0122 0.0367 0.0348 0.0114 0.0387 0.0023 0.0213/0.0119 0.0348 0.0238 0.0002/0.0003 0.0201 0.0049/0.0011 0.0451 0.0068 0.0348 0.0281 0.0348 0.0015 肌酸酐 1,5-脫水-D-山梨糖醇 胱胺酸 麩醯胺 甘胺酸 離胺酸 焦麩胺酸 牛磺酸 非對稱性二甲基精胺酸 AMP 異戊醯肉鹼 己醯肉鹼 乙醯肌肽 精胺酸 瓜胺酸 N-乙醯鳥胺酸 3-羥基丁酸 2-羥基異戊酸 肌酸酐 馬尿酸 油酸 乙醯乙酸 核糖 GSSG 色胺酸 2-羥基戊二酸 蘋果酸 喹啉酸 丁醯肉鹼 己酸 4-甲酚 異白胺酸 阿拉伯糖 核糖 GSH GSSG 3-OH-犬尿胺酸 馬尿酸 異丁醯肉鹼 2nd/1st 2nd/1st 2nd/1st 2nd/1st 2nd/1st 2nd/1st 2nd/1st 2nd/1st 2nd/1st 2nd/1st 2nd/1st 2nd/1st 2nd/1st 2nd/1st 2nd/1st 2nd/1st 3rd/1st 3rd/1st 3rd/1st 3rd/1st 3rd/1st 3rd/1st 3rd/1st 3rd/1st 3rd/1st 3rd/1st 3rd/1st 3rd/1st 3rd/1st 3rd/2nd 3rd/2nd 3rd/2nd 3rd/2nd 3rd/2nd 3rd/2nd 3rd/2nd 3rd/2nd 3rd/2nd 3rd/2nd 更低 更高 更高 更高 更高 更高 更高 更低 更高 更低 更低 更低 更高 更高 更高 更高 更低 更低 更低 更高 更低 更低 更低 更高 更高 更低 更低 更低 更低 更高 更高 更高 更低 更低 更高 更高 更低 更高 更高 GC GC GC LC LC LC LC LC LC LC LC LC LC LC LC LC GC/LC GC/LC GC GC GC GC GC LC LC LC LC LC LC GC GC GC GC GC LC LC LC LC LC 0.0329 0.0367 0.0419 0.0114 0.0095 0.0329 0.0095 0.0348 0.0176 0.0198 0.0454 0.0367 0.0264 0.0329 0.0348 0.0037 0.0330/0.0281 0.0040/0.0028 0.0099 0.0016 0.0252 0.0483 0.0008 0.0367 0.0367 0.0099 0.0266 0.0407 0.0043 0.0408 0.0138 0.0408 0.0114 0.0028 0.0089 0.0008 0.0408 0.0165 0.0095  
  
*：R與NR之間之差異之p值(Wilcoxon秩和檢定).  
[表5]
於應答者(R)與無應答者(NR)之間表現出顯著差異之細胞標記.
細胞標記 時間點或兩個時間點之比 相對於NR，R中之變化 p值*
PBMC中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC) 2nd 更高 0.0107
PBMC中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC) 2nd/1st 更高 0.0001
PBMC中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC) 2nd 更高 0.0478
PBMC中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC) 2nd/1st 更高 0.0348
CD8+ T細胞中之初始T細胞之頻率(% of Tnaive among CD8+ T cells) 2nd/1st 更高 0.0176
CD4+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD4+ T cells) 2nd/1st 更高 0.0095
CD8+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD8+ T cells) 2nd/1st 更高 0.0138
CD8+ T細胞中之效應記憶T細胞之頻率(% of Tem among CD8+ T cells) 3rd/1st 更高 0.0213
CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells) 2nd/1st 更低 0.0107
CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells) 3rd/2nd 更高 0.0081
CD8+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD8+ T cells) 2nd/1st 更低 0.0009
Mito SOX CD8/CD4 1st 更高 0.0028
Mito SOX CD8/CD4 2nd 更高 0.0089
Mito SOX CD8/CD4 3rd 更高 0.018
Mito SOX CD8/CD4 3rd/1st 更低 0.019
Mito mass CD8/CD4 1st 更高 0.0451
Mito mass CD8/CD4 3rd 更高 0.0348
CD8+ T細胞之PGC-1αβ(MFI) (PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells) 2nd 更低 0.0176
CD8+ T細胞之PGC-1αβ(MFI) (PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells) 2nd/1st 更低 0.0052
CD8+ T細胞之PGC-1αβ(MFI)(PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells) 3rd/2nd 更高 0.0001
高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率(% of PD-1high among CD8+ T cells) 1st 更低 0.013
CD4+ T細胞中低表現FoxP3之CD45RA+ T細胞群之頻率(% of FoxP3low CD45RA+ among CD4+ T cells) 1st 更低 0.027
CD4+ T細胞中高表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bethigh among CD4+ T cells) 3rd/1st 更高 0.03
CD4+ T細胞中低表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-betlow among CD4+ T cells) 3rd/1st 更高 0.0214
CD8+ T細胞中表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bet+ among CD8+ T cells) 3rd/2nd 更高 0.0295
CD8+ T細胞中表現T-bet及EOMES之T細胞群之頻率(% of T-bet+ EOMES+ among CD8+ T cells) 3rd/2nd 更高 0.0408
*：R與NR之間之差異之p值(Wilcoxon秩和檢定).
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[實施例2]PD-1high 之定義 對年齡符合之30人健康者之CD8+ T細胞設門，重疊PD-1染色資料(圖11A上)。X軸係PD-1表現水準，Y軸係相對細胞數。豎線表示PD-1表現平均值之50th 、90th 、97th 及99th 百分位數。於表格(圖11A下)中示出各百分位數下之患者(實施例1之患者)之PD-1high CD8+ T細胞之%與CD8+ T細胞之疲弊標記之基因表現(CTLA-4、Tim-3及Lag-3)之相關係數(r)之值，於右側面板(圖11B)表示該等之相關圖。於97th 百分位數下任一疲弊標記之基因表現均關聯較高，故而將97th 百分位數確定為PD-1high 之臨界值。
[實施例3] 有於肺癌細胞發生EGFR變異之情形時，PD-1抗體治療難以生效之已知之事實。對我們之細胞標記組合II(細胞標記組合II)是否亦可辨別有EGFR變異之無應答性進行LDA分析(實施例1之患者中發生EGFR變異之8名)。其結果可知錯誤率為0%，亦可辨別由EGFR變異所引起之無應答性(圖12)。
[實施例4] 為了研究Cellular marker combination II(細胞標記組合II)是否亦可於其他癌種中判別有效性，於11人頭頸部腫瘤患者(於京都大學醫院與肺癌同樣地於2次治療以後，投予納武單抗(之前)之患者)檢體中亦進行相同之染色，進行LDA分析。其結果為錯誤率為9.1%之比率，可判定有效性(圖13)。 將本說明書中所引用之所有出版物、專利及專利申請案直接以參考之形式併入至本說明書中。 [產業上之可利用性]
藉由使用本發明之生物標記及/或細胞標記，可於藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑治療疾病之前或較早之階段預測及/或判定治療之有效性，故而可提高治療之效率，削減治療費。
圖1係特定之血漿代謝物與對投予納武單抗之治療應答性相關。a)本研究之模式圖。b)以火山圖表示各時間點之無應答者與應答者之間之247個代謝物之比較。將log2 |倍率變化|＞1.0及-log10(p值)＞1.3之代謝物視為顯著。將於應答者與無應答者之間表現出有意義差之代謝物示於表中。模態(modality)係表示代謝物測定中所使用之分析平台(GC-MS或LC-MS)。將與應答性相關之各代謝物之根據單變量邏輯回歸分析所計算之曲線下面積(AUC)示於表中右端之列。c)表示無應答者(NR)及應答者(R)中之腸內細菌相關代謝物之藉由GC-MS或LC-MS所測定之峰面積。d)表示氧化還原/能量代謝相關代謝物之峰面積。各點表示1名患者。誤差條表示中央值及四分位距。*p＜0.05、**p＜0.01(藉由Kruskal-Wallis檢定及隨後之Dunn多重比較檢定)(c及d)。 圖2係血漿代謝物之組合預測對投予納武單抗之治療應答性。a)利用使用赤池資訊量基準(AIC)之逐步回歸法，選擇僅第1樣本、第1及第2樣本、進而第1、第2及第3樣本之預測性最佳之代謝物組合I、II及III。將各代謝物之詳細資料示於圖8。b)使用線性判別分析(LDA)，評價作為預測生物標記之代謝物組合I之準確性。表示用以確定LDA-R及LDA-NR之LDA之典型圖(canonical plot)。各點表示1名患者。縱向點線表示臨界值。c)由代謝物組合I所判別之LDA-R及LDA-NR之無進展生存期(PFS)及總生存期(OS)之Kaplan-Meier圖。d)基於代謝物之組合II之LDA之典型圖。e)由代謝物組合II所確定之LDA-R及LDA-NR之PFS及OS之Kaplan-Meier圖。f)基於代謝物組合III之LDA之典型圖。g)由代謝物組合III所確定之LDA-R及LDA-NR患者之PFS及OS之Kaplan-Meier圖。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001(藉由Gehan-Breslow-Wilcoxon檢定)(c、e及g)。h)代謝物組合I、II及III之5折交叉驗證之ROC曲線。 圖3係選擇包含線粒體之狀態之特定之細胞標記，選擇組合預測標記。a)利用使用AIC之逐步回歸法，選擇僅第1樣本、第1及第2樣本、進而第1、第2及第3樣本之預測性最佳之細胞標記組合I、II及III。b)對CD8+ PBMC設門後之代表性之NSCLC樣本2例(無應答者及應答者)(左側面板)。X軸為CCR7，Y軸表示PD-1。第1樣本中之無應答者與應答者之PD-1high CD8+ T細胞之頻率(右側面板)。c)設門後之CD4+ 及CD8+ T細胞之Mito SOX之代表性柱狀圖(左側面板)。第1樣本中之無應答者與應答者之CD4+ 及CDD8+ T細胞中之Mito SOX水準的比((Mito SOX CD8/CD4)(右側面板)。d)CD8+ PBMC之第1、第2及第3樣本之PGC-1αβ(左上面板)。第1、第2及第3樣本之PGC-1αβ之MFI之變動(右上面板)。實線與點線分別表示應答者與無應答者。無應答者與應答者之間之第1樣本與第2樣本之PGC-1αβ表現之倍率變化(左下面板)及第2樣本與第3樣本之PGC-1αβ表現之倍率變化(右下面板)。e)表示第1及第2樣本中之PBMC中之CD4+ T細胞之頻率(左面板)。實線與點線分別表示應答者與無應答者。無應答者與應答者之間之第1樣本與第2樣本之CD4+ T細胞頻率之倍率變化(右面板)。各點表示1名患者。誤差條表示中央值及四分位距。*p＜0.05、**p＜0.01、****p＜0.0001(藉由Wilcoxon秩和檢定)。 圖4係細胞標記之組合可更準確地預測生存時間。a)使用LDA，評價細胞標記組合I之準確性。表示用以確定LDA-R及LDA-NR之LDA之典型圖。各點表示1名患者。縱向點線表示臨界值。b)由細胞標記組合I所確定之LDA-R及LDA-NR之PFS及OS之Kaplan-Meier圖。c)基於細胞標記組合II之LDA之典型圖。d)由細胞標記組合II所確定之LDA-R及LDA-NR之PFS及OS之Kaplan-Meier圖。e)基於細胞標記組合III之LDA之典型圖。f)由細胞標記組合III所判別之LDA-R及LDA-NR之PFS及OS之Kaplan-Meier圖。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001(藉由Gehan-Breslow-Wilcoxon檢定)(b、d及f)。g)細胞標記組合I、II及III之5折交叉驗證之ROC曲線。 圖5係特定之細胞標記與代謝物之間之較強之關聯將代謝物自組合生物標記之候補排除。a)細胞標記(X軸)與代謝物(Y軸)之間之散佈圖。黑點表示應答者，白圈表示無應答者。r：Spearman相關係數。b)對上述a)中所檢測之所有標記對之絕對相關係數之聚類熱圖。(使用Spearman相關距離及完全連結法)。較暗之部分表示較高之關聯(|r|接近1)，較亮之部分表示較低之關聯(|r|接近0)。各標記聚類而成為3個組。將各者稱為代謝範疇1、2及3。c)Spearman相關分析之摘要。代謝範疇1(腸內細菌相關代謝物)與CD8+ T細胞之PGC-1αβ相關；代謝範疇2(FAO相關代謝物)與PD-1high CD8+ T細胞之頻率相關；而且，代謝範疇3(氧化還原相關代謝物)與T細胞Mito SOX標記相關。 圖6係於組間，基於不同之基準比較生存曲線。a)由PFS＞3個月(實線)及PFS≦3個月(點線)所分類之患者之PFS及OS之Kaplan-Meier圖。b)由PFS＞6個月(實線)及PFS≦6個月(點線)所分類之患者之PFS及OS之Kaplan-Meier圖。**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001(藉由Gehan-Breslow-Wilcoxon檢定)。c)由腫瘤上之PD-L1表現頻率所分類之患者之PFS及OS之Kaplan-Meier圖。虛線、實線及點線表示具有PD-L1高表現(＞50%)、PD-L1低表現(1-50%)、及稀少之PD-L1表現(＜1%)之患者。d)實線及點線表示具有PD-L1之陽性表現(＞1%)及陰性表現(＜1%)之患者。 圖7係源自腸內細菌之代謝物及醯基肉鹼種之變動。a)表示預先未經抗生素治療之患者(ATB(-))及經抗生素治療之患者(ATB(+))中之腸內細菌相關代謝物之藉由GC-MS或LC-MS所測定的峰面積。該等圖表表示第1、第2及第3樣本之資料。**p＜0.01、****p＜0.0001(藉由Wilcoxon秩和檢定)。b)表示無應答者(NR)及應答者(R)中之馬尿酸及硫酸吲哚酚之藉由GC-MS所測定之峰面積。各點表示1名患者。誤差條表示中央值及四分位距。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001(藉由Kruskal-Wallis檢定及隨後之Dunn多重比較檢定)。c)表示第1、第2及第3樣本中之醯基肉鹼種之峰面積之變動。實線及點線分別表示應答者及無應答者。*p＜0.05、**p＜0.01(藉由Wilcoxon秩和檢定)。 圖8係藉由逐步回歸法所選擇之代謝物之詳細資料。a-c)圖表係表示藉由逐步回歸法所選擇之代謝物之峰面積於無應答者與應答者之間之比較。各點表示1名患者。誤差條表示中央值及四分位距。*p＜0.05、**p＜0.01(藉由Wilcoxon秩和檢定)。 圖9係CD8+ 及CD4+ T細胞中之細胞標記陽性子集之詳細資料 a)圖表係表示第1樣本中之無應答者與應答者之CD8+ T細胞中之PD-1陽性頻率之比較。b)FACS資料係表示PBMC中之CD8+ T細胞中之PD-1、Ki67、顆粒酶B、IFN-γ、T-bet及EOMES之表現水準。將代表性之NSCLC樣本示於左側面板。右側面板表示PD-1hi、POD-1low及PD-1(-)CD8+ T細胞中之Ki67+、顆粒酶B+、IFN-γ+、T-bet+及EOMES+細胞之頻率。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001(藉由Kruskal-Wallis檢定及隨後之Dunn多重比較檢定)。c)按照CD45RO及CCR7之表現，將CD4+ T細胞分為naive、Tcm、Tem及Temra子集(左側面板)。表示無應答者及應答者中之CD4+ Tcm及CD4+ Temra之頻率(右側面板)。**p＜0.01(藉由Wilcoxon秩和檢定)。 圖10係表示麩胱甘肽之生物合成及代謝之模式圖。L-麩胺酸與半胱胺酸結合而形成L-γ-麩胺醯半胱胺酸，其次，其與甘胺酸結合而產生GSH。GSH與活性氧物種(ROS)進行反應後，成為氧化型(GSSG)。 圖11係PD-1high 之定義。A)對30人之年齡符合之健康者之CD8+ T細胞設門，重疊PD-1染色資料。X軸係PD-1表現水準，Y軸係相對細胞數。豎線表示PD-1表現平均之50th 、90th 、97th 及99th 百分位數。於表格中示出各百分位數下之患者之PD-1high CD8+ T細胞之%及CD8+ T細胞之疲弊標記之基因表現(CTLA-4、Tim-3及Lag-3)之相關係數(r)之值，B)於右側面板示出該等之相關圖。於97th 百分位數下，任一疲弊標記之基因表現均關聯較高，故而將97th 百分位數確定為PD-1high 之臨界值。 圖12係有於肺癌細胞出現EGFR變異之情形時，PD-1抗體治療難以生效之已知之事實。對我們之細胞標記組合II是否亦可辨別有EGFR變異之無應答性而進行LDA分析。其結果可知錯誤率為0%，亦可辨別由EGFR變異所引起之無應答性。 圖13係為了研究細胞標記組合II於其他癌種中是否亦可判別有效性，於11人頭頸部腫瘤患者檢體中亦進行相同之染色，進行LDA分析。其結果為錯誤率為9.1%之比率，可判定有效性。

Claims (14)

  1. 一種檢查方法，其包括以下述(i)及/或(ii)作為指標，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效性； (i)血清及/或血漿中之至少一種代謝物，該代謝物係選自由丙胺酸、4-甲酚、半胱胺酸、馬尿酸、油酸、硫酸吲哚酚、核糖、吲哚乙酸酯、尿酸、反式4-咪唑丙烯酸、2-哌啶甲酸、N-乙醯葡萄糖胺、吲哚乳酸、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、胱胺酸、硫酸吲哚酚、葡萄糖酸、瓜胺酸、肌酸酐、N-乙醯天冬胺酸、焦麩胺酸、三甲基離胺酸、非對稱性二甲基精胺酸、對稱性二甲基精胺酸、甲基組胺酸、醯基肉鹼、3-胺基異丁酸、乙醯肌肽、精胺酸、N-乙醯鳥胺酸、3-羥基異戊酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、GSSG、2-羥基丁酸、1,5-脫水-D-山梨糖醇、麩醯胺、甘胺酸、離胺酸、牛磺酸、AMP、乙醯肌肽、3-羥基丁酸、2-羥基異戊酸、乙醯乙酸、色胺酸、2-羥基戊二酸、蘋果酸、喹啉酸、己酸、異白胺酸、GSH及3-OH-犬尿胺酸所組成之群； (ii)末梢血液中之至少一種細胞標記，該細胞標記係選自由末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC)、末梢血液單核球(PBMC)中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC)、CD8+ T細胞中之初始T細胞之頻率(% of Tnaive among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞中之效應記憶T細胞之頻率(% of Tem among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞之線粒體活化狀態相對於CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之比(例如CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比(Mito SOX CD8/CD4)、CD8+ T細胞之線粒體之體積相對於CD4+ T細胞之線粒體之體積(mass)的比(Mito mass CD8/CD4))、CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現(PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells)、高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率(% of PD-1high among CD8+ T cells)、於CD4+ T細胞中低表現FoxP3之CD45RA+ T細胞群之頻率(% of FoxP3low CD45RA+ among CD4+ T cells)、於CD4+ T細胞中高表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bethigh among CD4+ T cells)、於CD4+ T細胞中低表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-betlow among CD4+ T cells)、於CD8+ T細胞中表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bet+ among CD8+ T cells)、及於CD8+ T細胞中表現T-bet及EOMES之T細胞群之頻率(% of T-bet+ EOMES+ among CD8+ T cells)所組成之群。
  2. 如請求項1之方法，其係以表4及5所示之時間點(Time point)或2個時間點之比(Ratio of two time points)下之代謝物(Metabolite)及/或細胞標記(Cellular marker)之值較高或較低(Changes in R relative to NR)作為基準，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效性。
  3. 如請求項1或2之方法，其中(i)之代謝物係選自由馬尿酸、阿拉伯糖及醯基肉鹼所組成之群中之至少一種代謝物，(ii)之細胞標記係選自由高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率、CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比、以及CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現所組成之群中的至少一種細胞標記。
  4. 如請求項1之方法，其中於投予藥劑前之血清及/或血漿中之半胱胺酸之值較高，且投予藥劑前之血清及/或血漿中之馬尿酸之值較高的情形時，預測藉由藥劑之治療有效。
  5. 如請求項1之方法，其中於第1次投予藥劑後之血清及/或血漿中之阿拉伯糖之值較高，第1次投予藥劑後之血清及/或血漿中之精胺酸之值較高，且第1次投予藥劑後之血清及/或血漿中之丁醯肉鹼之值較低的情形時，判定藉由藥劑之治療有效。
  6. 如請求項1之方法，其中於投予藥劑前之血清及/或血漿中之馬尿酸之值較高，第1次投予藥劑後之血清及/或血漿中之胱胺酸之值較高，第2次投予藥劑後之血清及/或血漿中之麩胱甘肽二硫醚之值較高，且第2次投予藥劑後之血清及/或血漿中之丁醯肉鹼之值較低的情形時，判定藉由藥劑之治療有效。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中於投予藥劑前之末梢血液中之高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率較低，且投予藥劑前之末梢血液中之CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比較高的情形時，預測藉由藥劑之治療有效。
  8. 如請求項1至6中任一項之方法，其中於投予藥劑前之末梢血液中之高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率較低，投予藥劑前之末梢血液中之CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比較高，末梢血液中之CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現之第1次投予藥劑後相對於投予藥劑前之比較低，且末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率之第1次投予藥劑後相對於投予藥劑前之比較高的情形時，判定藉由藥劑之治療有效。
  9. 如請求項1至6中任一項之方法，其中於投予藥劑前之末梢血液中之高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率較低，投予藥劑前之末梢血液中之CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比較高，末梢血液中之CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現之第2次投予藥劑後相對於第1次投予藥劑後之比較高，且末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率之第1次投予藥劑後相對於投予藥劑前之比較高的情形時，判定藉由藥劑之治療有效。
  10. 如請求項1至9中任一項之方法，其中PD-1訊息抑制劑為抗體。
  11. 如請求項10之方法，其中抗體係選自由抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體及抗PD-L2抗體所組成之群中之至少1種抗體。
  12. 如請求項1至11中任一項之方法，其中含有PD-1訊息抑制劑之藥劑用作抗癌劑、傳染病治療劑或該等之組合中之有效成分。
  13. 一種疾病之診斷及治療方法，其包括：以下述(i)及/或(ii)作為指標，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療對受驗者之有效性，於預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效之情形時，投予對於治療該受驗者有效之量之含有PD-1訊息抑制劑之藥劑； (i)血清及/或血漿中之至少一種代謝物，該代謝物係選自由丙胺酸、4-甲酚、半胱胺酸、馬尿酸、油酸、硫酸吲哚酚、核糖、吲哚乙酸酯、尿酸、反式4-咪唑丙烯酸、2-哌啶甲酸、N-乙醯葡萄糖胺、吲哚乳酸、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、胱胺酸、硫酸吲哚酚、葡萄糖酸、瓜胺酸、肌酸酐、N-乙醯天冬胺酸、焦麩胺酸、三甲基離胺酸、非對稱性二甲基精胺酸、對稱性二甲基精胺酸、甲基組胺酸、醯基肉鹼、3-胺基異丁酸、乙醯肌肽、精胺酸、N-乙醯鳥胺酸、3-羥基異戊酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、GSSG、2-羥基丁酸、1,5-脫水-D-山梨糖醇、麩醯胺、甘胺酸、離胺酸、牛磺酸、AMP、乙醯肌肽、3-羥基丁酸、2-羥基異戊酸、乙醯乙酸、色胺酸、2-羥基戊二酸、蘋果酸、喹啉酸、己酸、異白胺酸、GSH及3-OH-犬尿胺酸所組成之群； (ii)末梢血液中之至少一種細胞標記，該細胞標記係選自由末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC)、末梢血液單核球(PBMC)中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC)、CD8+ T細胞中之初始T細胞之頻率(% of Tnaive among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞中之效應記憶T細胞之頻率(% of Tem among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞之線粒體活化狀態相對於CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之比(例如CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比(Mito SOX CD8/CD4)、CD8+ T細胞之線粒體之體積相對於CD4+ T細胞之線粒體之體積(mass)的比(Mito mass CD8/CD4))、CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現(PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells)、高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率(% of PD-1high among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現FoxP3之CD45RA+ T細胞群之頻率(% of FoxP3low CD45RA+ among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中高表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bethigh among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-betlow among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bet+ among CD8+ T cells)、及CD8+ T細胞中表現T-bet及EOMES之T細胞群之頻率(% of T-bet+ EOMES+ among CD8+ T cells)所組成之群。
  14. 一種醫藥組合物，其包含用於疾病之診斷及治療方法之含有PD-1訊息抑制劑之藥劑作為有效成分，該疾病之診斷及治療方法包括：以下述(i)及/或(ii)作為指標，預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療對受驗者之有效性，於預測及/或判定藉由含有PD-1訊息抑制劑之藥劑之治療有效之情形時，投予對於治療該受驗者有效之量之含有PD-1訊息抑制劑之藥劑： (i)血清及/或血漿中之至少一種代謝物，該代謝物係選自由丙胺酸、4-甲酚、半胱胺酸、馬尿酸、油酸、硫酸吲哚酚、核糖、吲哚乙酸酯、尿酸、反式4-咪唑丙烯酸、2-哌啶甲酸、N-乙醯葡萄糖胺、吲哚乳酸、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、胱胺酸、硫酸吲哚酚、葡萄糖酸、瓜胺酸、肌酸酐、N-乙醯天冬胺酸、焦麩胺酸、三甲基離胺酸、非對稱性二甲基精胺酸、對稱性二甲基精胺酸、甲基組胺酸、醯基肉鹼、3-胺基異丁酸、乙醯肌肽、精胺酸、N-乙醯鳥胺酸、3-羥基異戊酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、GSSG、2-羥基丁酸、1,5-脫水-D-山梨糖醇、麩醯胺、甘胺酸、離胺酸、牛磺酸、AMP、乙醯肌肽、3-羥基丁酸、2-羥基異戊酸、乙醯乙酸、色胺酸、2-羥基戊二酸、蘋果酸、喹啉酸、己酸、異白胺酸、GSH及3-OH-犬尿胺酸所組成之群； (ii)末梢血液中之至少一種細胞標記，該細胞標記係選自由末梢血液單核球(PBMC)中之CD4+ T細胞之頻率(% of CD4+ T cells among PBMC)、末梢血液單核球(PBMC)中之CD8+ T細胞之頻率(% of CD8+ T cells among PBMC)、CD8+ T細胞中之初始T細胞之頻率(% of Tnaive among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之中央記憶T細胞之頻率(% of Tcm among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞中之效應記憶T細胞之頻率(% of Tem among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中之最終分化效應記憶T細胞之頻率(% of Temra among CD8+ T cells)、CD8+ T細胞之線粒體活化狀態相對於CD4+ T細胞之線粒體活化狀態之比(例如CD8+ T細胞之線粒體活性氧表現量相對於CD4+ T細胞之線粒體活性氧表現量之比(Mito SOX CD8/CD4)、CD8+ T細胞之線粒體之體積相對於CD4+ T細胞之線粒體之體積(mass)的比(Mito mass CD8/CD4))、CD8+ T細胞之PGC-1α及PGC-1β之表現(PGC-1αβ(MFI)of CD8+ T cells)、高表現PD-1之CD8+ T細胞群之頻率(% of PD-1high among CD8+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現FoxP3之CD45RA+ T細胞群之頻率(% of FoxP3low CD45RA+ among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中高表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bethigh among CD4+ T cells)、CD4+ T細胞中低表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-betlow among CD4+ T cells)、CD8+ T細胞中表現T-bet之T細胞群之頻率(% of T-bet+ among CD8+ T cells)、及CD8+ T細胞中表現T-bet及EOMES之T細胞群之頻率(% of T-bet+ EOMES+ among CD8+ T cells)所組成之群。
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