WO2023127543A1 - 免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象の発生の予測を補助する方法、予測補助装置 - Google Patents

免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象の発生の予測を補助する方法、予測補助装置 Download PDF

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幸太 岩堀
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • Tumor immunotherapy is a method of treating tumors that utilizes the tumor patient's own immune response against tumor cells.
  • anti-CTLA-4 antibodies, anti-PD-1 antibodies, etc. that bind to proteins on T cells are used to activate the cytotoxic T cells of tumor patients themselves, and their function is to kill cancer cells.
  • Patent Document 1 describes a method for predicting the effect of tumor immunotherapy.
  • Section 1 A method for assisting prediction of the occurrence of serious adverse events due to immune checkpoint inhibitors, wherein the number of CD4 positive T cells in peripheral blood collected from candidate patients for administration of immune checkpoint inhibitors CD4 positive, CD25 obtaining a value reflecting the number of positive and CD45RA-positive T cells, wherein the patient causes a serious adverse event due to an immune checkpoint inhibitor when the value is outside a predetermined reference range.
  • Section 2. The method of paragraph 1, wherein said value is the ratio of the number of CD4-positive, CD25-positive and CD45RA-positive T cells to the number of CD4-positive T cells.
  • peripheral blood is the peripheral blood of the administration candidate patient who underwent an efficacy evaluation test of treatment with an immune checkpoint inhibitor and was suggested to be effective in the treatment.
  • the efficacy evaluation test is the tumor cytotoxic activity of peripheral blood mononuclear cells
  • the treatment is effective when the tumor cytotoxic activity value of peripheral blood mononuclear cells is equal to or higher than a predetermined reference value.
  • / or when the efficacy evaluation test is the percentage of PD-L1 positive cells in tumor tissue
  • the treatment is effective when the percentage of PD-L1 positive cells in tumor tissue is greater than or equal to a reference value 4.
  • a prediction aid device for assisting in predicting the occurrence of serious adverse events caused by an immune checkpoint inhibitor comprising a controller, the controller controlling administration of the immune checkpoint inhibitor Obtaining a value that reflects the number of CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA-positive T cells relative to the number of CD4-positive T cells in peripheral blood collected from a candidate patient, and if the value is outside a predetermined reference range, Said device indicating that the patient may experience serious adverse events from immune checkpoint inhibitors.
  • a method for assisting the prediction of overall survival in patients who are candidates for administration of immune checkpoint inhibitors comprising CD4 positive T in peripheral blood collected from patients scheduled to be administered immune checkpoint inhibitors obtaining a value reflective of CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA-positive T cell count relative to cell count, wherein said patient has poor overall survival if said value is outside a predetermined reference range.
  • the above method suggesting possibilities.
  • Item 8. A value reflecting the number of CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA-positive T cells relative to the number of CD4-positive T cells in peripheral blood collected from a candidate patient for administration of an immune checkpoint inhibitor is within a predetermined reference range. An immune checkpoint inhibitor for administration to a candidate patient.
  • the administration control patient is a patient with interstitial lung disease, a patient with a history of interstitial lung disease, a patient with an autoimmune disease, a patient with a chronic autoimmune disease, or a history of an autoimmune disease.
  • the immune checkpoint of paragraph 8 wherein the immune checkpoint is selected from patients with cancer, patients who have undergone organ transplantation, patients with tuberculosis infection, patients with a history of tuberculosis infection, and carriers of risk factors for interstitial lung disease. inhibitor.
  • Item 10 A value reflecting the number of CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA-positive T cells relative to the number of CD4-positive T cells in peripheral blood collected from a candidate patient for administration of an immune checkpoint inhibitor is outside the predetermined reference range.
  • the present invention it is possible to assist in predicting the occurrence of serious adverse events in tumor immunotherapy using immune checkpoint inhibitors. In addition, it is possible to predict the quality of the overall survival time of administration candidate patients. Furthermore, for patients who may experience serious adverse events, measures can be taken to prevent the occurrence of serious adverse events caused by immune checkpoint inhibitors.
  • FIG. 4 shows the flow of processing by the prediction assistant program 1042.
  • FIG. 4 shows the flow of processing by the prediction assistant program 1042.
  • FIG. 2 shows the relationship between peripheral blood T cells and the tumor shrinkage effect of anti-PD-1 therapy.
  • Fig. 2 shows an ROC curve that validates the ability of the PeriCyto method to predict the efficacy of anti-PD-1 therapy. Shows progression-free survival in all patients who received anti-PD-1 therapy (including first-line and second-line and beyond). indicates progression-free survival in patients on second and subsequent anti-PD-1 therapy.
  • FIG. 3 shows the results of comparing the ratio of CD4+CD25+CD45RA+ T cells in peripheral blood CD4+ T cells between the non-severe AE group and the severe AE group.
  • Fig. 2 shows the results of comparing the ratio of effector Treg cells between the Non-severe AE group and the Severe AE group.
  • FIG. 4 shows the results of ROC curve analysis for determining the cutoff value of (CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+.
  • Patients with PeriCyto (%) ⁇ 17% were divided into groups with (CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+ ⁇ 6% and (CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+ ⁇ 6%. shows the results of the comparison.
  • Patients with PeriCyto (%) of 17% or more were divided into a group with (CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+ of 6% or more and a group with (CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+ of less than 6%. The results of the comparison are shown.
  • Immune checkpoint inhibitors may include anti-PD1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-CCR4 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-Tim3 antibody, anti-LAG3 antibody, anti-CCR8 antibody, or a mixture thereof as an active ingredient.
  • Pharmaceutical names include nivolumab, pembrolizumab, ipilimumab, durvalumab, atezolizumab, and avelumab.
  • Candidate patients for administration of immune checkpoint inhibitors are patients with tumors or patients who may have tumors.
  • a patient who may have a tumor is, for example, a patient whose primary tumor was treated with surgical resection, radiation therapy, etc., and there is a possibility that tumor cells have metastasized or disseminated to other than the primary tumor.
  • Tumors include malignant tumors and benign tumors, preferably malignant tumors.
  • Tumors include epithelial tumors and non-epithelial tumors, preferably epithelial tumors.
  • the tumor is most preferably an epithelial malignant tumor.
  • Malignant tumors include, for example, respiratory system malignant tumors arising from the trachea, bronchi, lungs, etc.; or gastrointestinal malignant tumors arising from the anus; liver cancer; pancreatic cancer; urinary system malignant tumors arising from the bladder, ureter or kidney; Breast cancer: prostate cancer; skin cancer; endocrine malignant tumors such as hypothalamus, pituitary gland, thyroid, parathyroid gland, and adrenal gland; central nervous system malignant tumors; syndrome, acute lymphocytic leukemia, acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic myeloid leukemia, acute myelomonocytic leukemia, chronic myelomonocytic leukemia, acute monocytic leukemia, chronic monocytic leukemia, acute whole Myeloid leukemia, acute megakaryocytic leukemia, erythroleukemia, eosinophilic leukemia, chronic eosinophil
  • respiratory epithelial malignant tumors such as lung cancer (squamous cell carcinoma, small cell carcinoma, large cell carcinoma, adenocarcinoma); gastric cancer, duodenal cancer, colon cancer (superior colon cancer, rectal cancer, etc.) gastrointestinal epithelial malignancies; liver cancer; pancreatic cancer; bladder cancer; thyroid cancer; Most preferred is lung cancer.
  • lung cancer non-small cell carcinoma is preferred.
  • Candidate patients for administration are preferably patients who have undergone efficacy evaluation studies of treatment with immune checkpoint inhibitors.
  • the patient is a patient for whom the efficacy of the treatment has been suggested based on the results of the efficacy evaluation test.
  • the method includes a step of contacting peripheral blood mononuclear cells collected from a patient to be treated for malignant tumors with tumor cells in vitro in the presence of an engager; determining whether tumor cells in contact with nuclear cells are injured; and if determined that the tumor cells are injured, tumor immunotherapy is effective against the patient's malignant tumor.
  • the tumor cytotoxic activity of peripheral blood mononuclear cells collected from a candidate patient for administration is the result, and based on this result, if the tumor cells are determined to be injured, the It is suggested that tumor immunotherapy is effective against malignant tumors in patients.
  • Reference values for determining whether tumor cells are injured can be determined using, for example, the ROC curve Receiver Operating Characteristic curve.
  • Engagers are, for example, bispecific molecules.
  • the bispecific molecule binds to a T cell surface antigen and to a tumor cell surface antigen.
  • Bispecific molecules include bispecific T cell engagers, bispecific antibodies, and the like.
  • Bispecific T cell engagers include those targeting EphA2 and CD3, those targeting CD19 and CD3, and the like.
  • Bispecific antibodies also include antibodies targeting EpCAM and CD3.
  • the percentage of PD-L1 positive cells in tumor tissue can be increased.
  • Detection of PD-L1-positive cells in tumor tissue can be performed by immunostaining according to a known method.
  • immunostaining for example, PD-L1 IHC 22C3 pharmDx "Dako" (Agilent Technologies) or the like can be used.
  • a known reference value for the proportion of PD-L1-positive cells in tumor tissue a known reference value set for each immune checkpoint inhibitor can be used. If the percentage of PD-L1 positive cells in the tumor tissue (ie result) is equal to or higher than the reference value, it is suggested that the tumor immunotherapy is effective against the malignant tumor that the patient has.
  • the indication criteria for initial treatment with pembrolizumab is 1% or more PD-L1 positive cells in tumor tissue.
  • Peripheral blood is not limited as long as mononuclear cells including T cells can be obtained.
  • Peripheral blood may be arterial blood or venous blood, but is preferably venous blood.
  • Peripheral blood collection can be performed, for example, from blood vessels in the extremities. Also, blood may be collected from blood vessels other than limbs at the time of surgery or biopsy.
  • the method of collecting peripheral blood is not limited as long as mononuclear cells can be obtained, but it is preferable to collect blood using an anticoagulant.
  • anticoagulants include ethylenediaminetetraacetate, citrate, heparin salt, and the like. Heparin is preferred.
  • mononuclear cell fractions In order to analyze the surface antigens of T cells in peripheral blood, it is preferable to collect mononuclear cell fractions from blood collected from patients. Methods for collecting mononuclear cell fractions are known. For example, it can be obtained by centrifugation using a specific gravity liquid for human lymphocyte separation (having a density of about 1.077 ⁇ 0.001 g/ml). Nucleated cells obtained by hemolyzing red blood cells in peripheral blood using a hemolytic agent may also be used.
  • a method for analyzing surface antigens of T cells in peripheral blood and a method for counting the number of cells having a given surface antigen are known, and can be analyzed, for example, by flow cytometry.
  • Surface antigens to be analyzed include, for example, CD3, CD4, CD8, CD25, and CD45RA. Surface antigens may further include ICOS, CD27.
  • When the expression of the surface antigen to be analyzed is positive, it may be expressed as "+”.
  • the expression of the surface antigen to be analyzed is strongly positive, it may be expressed as "++”. If the expression of the surface antigen to be analyzed is below the detection limit, it may be expressed as "-”.
  • Commercially available antibodies can be used as antibodies for staining surface antigens.
  • values that reflect the number of CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA-positive T cells relative to CD4-positive T cell counts are used to predict, or assist in predicting, the occurrence of serious adverse events. .
  • CD3 can be mentioned as a surface antigen for distinguishing peripheral blood T cells from other cells. That is, in the present specification, T cells mean CD3-positive cells.
  • CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA-positive T cells can include naive regulatory T cells. Naive regulatory T cells are known to express the transcription factor FOXP3.
  • the CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA-positive T cells may be ICOS (CD278)-positive and/or CD27-positive in addition to the surface antigen profile.
  • a value calculated based on the following formula can be increased: (1) (Number of CD4 + CD25 + CD45RA + T cells) / (Number of CD4 positive T cells) (2) (Number of CD4 positive T cells) / (Number of CD4 + CD25 + CD45RA + T cells) (3) (Number of CD4 positive T cells) - (Number of CD4 + CD25 + CD45RA + T cells) ) (4) (number of CD4 + CD25 + CD45RA + T cells) - (number of CD4 positive T cells).
  • the value calculated based on the formula (1) if it is less than the predetermined reference value, it is within the reference range, and if it is equal to or greater than the predetermined reference value, it is out of the reference range.
  • the value calculated based on the formula (2) if it is less than the predetermined reference value, it is out of the reference range, and if it is equal to or greater than the predetermined reference value, it is within the reference range.
  • the value calculated based on the formula (3) if it is less than the predetermined reference value, it is out of the reference range, and if it is equal to or greater than the predetermined reference value, it is within the reference range.
  • the value calculated based on the formula (4) a value less than a predetermined reference value is considered within the reference range, and a value greater than or equal to the predetermined reference value is considered outside the reference range.
  • a value calculated based on formula (1) that is, a value indicating the ratio of the number of CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA-positive T cells to the number of CD4-positive T cells.
  • the value indicating the ratio may be a division value calculated by Equation (1), and the division value may be expressed as a percentage.
  • the reference value is not limited as long as it is a value that can determine whether the patient will cause serious adverse events due to immune checkpoint inhibitors.
  • baseline values are CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA for CD4-positive T-cell counts in peripheral blood of negative control patients who did not experience serious adverse events when treated with an immune checkpoint inhibitor.
  • the method for measuring said value in negative control patients and said value in positive control patients is the same as the method for measuring said value in candidate administration patients.
  • the reference value can be the median, mean, mode, etc. of said value of negative control patients and said value of positive control patients.
  • the reference value may be calculated by an ROC curve, discriminant analysis method, modal method, Kittler method, 3 ⁇ method, p-tile method, or the like.
  • Prediction Aid System 1000 One embodiment of the present invention relates to a prediction aid system 1000 (hereinafter simply “prediction aid system 1000") to help predict the occurrence of serious adverse events from immune checkpoint inhibitors.
  • the prediction aid system 1000 includes a prediction aid 10 (hereinafter simply referred to as "prediction aid 10") for assisting prediction of the occurrence of serious adverse events due to immune checkpoint inhibitors. and a cell analysis device 300 communicably connected to the prediction aid device 10 .
  • Cell analysis device 300 is, for example, a flow cytometer.
  • FIG. 1 shows a form in which the prediction aid device 10 and the cell analysis device 300 are directly connected, the prediction aid device 10 and the cell analysis device 300 are connected via a network 99 in a wired or wireless manner. may be
  • the prediction aid device 10 may be communicably connected to the electronic medical record system 500 via the network 99 .
  • Network 99 may be wired or wireless.
  • the prediction aid device 10 includes a control unit 100 , an input device 111 and an output device 112 .
  • the control unit 100 includes a CPU (Central Processing Unit 101 ) that performs arithmetic processing, a memory 102 , a ROM 103 , a storage device 104 and an interface 105 .
  • Each component in the control unit 100 is communicably connected by a bus 109 .
  • the storage device 104 includes an operating system (OS) 1041 and a prediction aid program 1042 (hereinafter simply referred to as "prediction aid program 1042") for assisting in predicting the occurrence of serious adverse events caused by immune checkpoint inhibitors.
  • OS operating system
  • prediction aid program 1042 prediction aid program 1042
  • the reference value database DB1 (hereinafter simply referred to as "reference value DB1") is stored.
  • the prediction aid device 10 is a computer, and the OS 1041 and the prediction aid program 1042 work together to make the computer function as the prediction aid device 10 .
  • the reference value DB1 records the reference value of the value reflecting the number of CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA-positive T cells relative to the number of CD4-positive T cells.
  • the input device 111 is a mouse, keyboard, or the like.
  • the output device 112 is a display or the like. A printer may also be provided as one of the output devices 112 .
  • the input device 111 and the output device 112 may be integrated like a touch panel.
  • the interface 105 is communicably connected to the control unit 100 , the input device 111 , the output device 112 , and the cell analysis device 300 .
  • Predictive assistant program 1042 The processing of the prediction assistant program 1042 will be described with reference to FIGS. 2 and 3.
  • FIG. The terms used in this section are defined in 1. above. Terms that overlap with the above 1. The description in is hereby incorporated by reference.
  • step S11 shown in FIG. 2 the control unit 100 receives a processing start request input from the input device 111 by the operator, starts the prediction assistance processing, A value is obtained that reflects the number of CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA-positive T cells relative to the number of CD4-positive T cells.
  • step S13 the control unit 100 reads the reference value recorded in the reference value DB1, and compares the value acquired in step S11 with the reference value. If it is determined in step S13 that the value is outside the reference range ("YES"), the controller 100 proceeds to step S15. If it is determined in step S13 that the value is within the reference range (“NO”), the controller 100 proceeds to step S15.
  • step S15 the control unit 100 outputs to the output device 112 a label indicating that the immune checkpoint inhibitor may cause serious adverse events, and ends the process.
  • a label may be cautionary text, a symbol, or the like.
  • step S17 the control unit 100 outputs to the output device 112 a label indicating that there is no possibility of serious adverse events caused by the immune checkpoint inhibitor, and ends the process.
  • a label may be cautionary text, a symbol, or the like.
  • the process ends without outputting any labels related to the possibility of serious adverse events caused by immune checkpoint inhibitors.
  • step S21 shown in FIG. 3 the control unit 100 receives a processing start request input from the input device 111 by the operator, and acquires the results of the effectiveness evaluation test of the administration candidate patient's treatment with the immune checkpoint inhibitor.
  • the results of the efficacy evaluation test can be obtained from the electronic medical chart system 500 via the network 99 .
  • the information of administration candidate patients stored in the electronic medical record system 500 can be obtained by collating patient identification numbers and the like.
  • the operator may input from the input device 111 the result of the efficacy evaluation test of the administration candidate patient's treatment with the immune checkpoint inhibitor, and the control unit 100 may acquire the results by accepting them.
  • step S23 the control unit 100 acquires the reference value corresponding to the result of the efficacy evaluation test of the treatment from the reference value DB1, and compares the result obtained in step S21 with the reference value. If the result is greater than or equal to the reference value ("YES"), the controller 100 proceeds to step S11 described above. In step S23, if it is determined that the result is less than the reference value ("NO"), the control unit 100 determines that the immune checkpoint inhibitor is ineffective for the administration candidate patient of the immune checkpoint inhibitor. Output a label indicating the possibility. The label can be text, a symbol, etc. that suggests invalidity.
  • the prediction assistant program 1042 may be readable and provided on a storage medium or the like. That is, the prediction auxiliary program 1042 is stored in a storage medium such as a hard disk, a semiconductor memory device such as a flash memory, or an optical disc.
  • the storage format of the program in the storage medium is not limited as long as the presentation device can read the program.
  • the storage in the storage medium is preferably non-volatile.
  • An embodiment of the present invention relates to a method of aiding prediction of quality of overall survival in a candidate patient for administration of an immune checkpoint inhibitor.
  • the number of CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA-positive T cells relative to the number of CD4-positive T cells in peripheral blood collected from a patient scheduled to be administered an immune checkpoint inhibitor (candidate patient) obtaining a value that reflects the
  • the value is outside a predetermined reference range, it indicates a likely poor overall survival for the patient. If the value is within a predetermined reference range, it is indicative of good overall survival for the patient.
  • Immune Checkpoint Inhibitor An embodiment of the present invention is the above 1.
  • a value reflecting the number of CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA-positive T cells relative to the number of CD4-positive T cells in peripheral blood collected from a candidate patient for administration of an immune checkpoint inhibitor is predetermined
  • the immune checkpoint inhibitor administered to the administration candidate patient who is within the reference range of For the description of the immune checkpoint inhibitor, the description in 1 above is used.
  • Immune checkpoint inhibitors have dosage restrictions. In general, immune checkpoint inhibitors are not administered to such dose-restricted patients. However, the above 1.
  • Candidate patients for administration suggested that the value reflecting the number of CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA-positive T cells relative to the number of CD4-positive T cells in peripheral blood is within a predetermined reference range by the method described in With regard to, even if the administration candidate patient falls under the administration restriction subject, there may be room for administration of an immune checkpoint inhibitor.
  • Patients subject to administration restrictions include, for example, patients with interstitial lung disease, patients with a history of interstitial lung disease, patients with autoimmune diseases, patients with chronic autoimmune diseases, and patients with autoimmune diseases.
  • patients who have undergone organ transplantation including hematopoietic stem cell transplantation
  • patients with tuberculosis infection patients with a history of tuberculosis infection
  • risk factors for interstitial lung disease previous lung surgery, decreased respiratory function
  • oxygen administration irradiation of the lungs, etc.
  • An embodiment of the present invention is an immune check consisting of a corticosteroid and/or an immunosuppressant
  • the present invention relates to a preventive agent for serious adverse events caused by point inhibitors (hereinafter also simply referred to as "preventive agent").
  • the prophylactic agent has a predetermined standard that reflects the number of CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA-positive T cells relative to the number of CD4-positive T cells in peripheral blood collected from a candidate patient for administration of an immune checkpoint inhibitor. Administered to said candidate patients who are out of range.
  • the above 1. can be determined by the method described in Corticosteroids include prednisolone, methylprednisolone, betamethasone, dexamethasone, hydrocortisone, and the like.
  • Immunosuppressants include cyclosporine, tacrolimus, cyclophosphamide, and the like.

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Abstract

免疫チェックポイント阻害剤を用いた腫瘍免疫療法における重篤な有害事象の発生の予測を補助する方法を提供することを一課題とする。　免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象の発生の予測を補助する方法であって、免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者から採取された末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞の数を反映する値を取得する工程を含み、前記値が所定の基準範囲外である場合に、前記患者が免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象を引き起こす可能性があることを示唆する、前記方法、により、課題を解決する

Description

免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象の発生の予測を補助する方法、予測補助装置
　本明細書には、免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象の発生の予測を補助する方法、予測補助装置、免疫チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象の予防剤が開示される。
　腫瘍免疫療法は、腫瘍患者自身の腫瘍細胞に対する免疫応答を利用した腫瘍の治療方法である。腫瘍免疫療法の一例では、Ｔ細胞上の蛋白質に結合する抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－１抗体等を使って、腫瘍患者自身の細胞傷害性Ｔ細胞を活性化し、その機能によりがん細胞を殺傷する（非特許文献１及び非特許文献２）。
　特許文献１には、腫瘍免疫療法の効果を予測するための方法が記載されている。
国際公開第２０１９／００４４１５号
PD1/PD-L1 Combination Therapies, 2015, Evaluate Ltd. ONCOIMMUNOLOGY, 2016, VOL. 5, NO. 2, e1062969
　免疫チェックポイント阻害剤を用いた腫瘍免疫療法では、治療を中止せざるを得ない重篤な有害事象が発生する症例があることが報告されている。しかし、このような重篤な有害事象を治療開始前に知る方法はこれまでに報告されていない。
　本発明は、免疫チェックポイント阻害剤を用いた腫瘍免疫療法における重篤な有害事象の発生の予測を補助する方法を提供することを一課題とする。
　本発明は、以下の態様を含む。
項１．免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象の発生の予測を補助する方法であって、免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者から採取された末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞の数を反映する値を取得する工程を含み、前記値が所定の基準範囲外である場合に、前記患者が免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象を引き起こす可能性があることを示唆する、前記方法。
項２．前記値が、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞数の割合である、項１に記載の方法。
項３．前記末梢血は、前記投与候補患者は、免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性評価試験を受け、前記治療が有効であることが示唆された前記投与候補患者の末梢血である、項１又は２に記載の方法。
項４．前記有効性評価試験が、末梢血単核細胞の腫瘍細胞傷害活性である時、末梢血単核細胞の腫瘍細胞傷害活性値が所定の基準値以上である場合に前記治療が有効であることが示唆され、及び／又は前記有効性評価試験が、腫瘍組織におけるＰＤ－Ｌ１陽性細胞の割合である時、腫瘍組織におけるＰＤ－Ｌ１陽性細胞の割合が基準値以上である場合に前記治療が有効であることが示唆される、項３に記載の方法。
項５．前記投与候補患者は、免疫チェックポイント阻害剤を投与する前の患者、又は免疫チェックポイント阻害剤を投与中の患者である、項１から４のいずれか一項に記載の方法。
項６．免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象の発生の予測を補助するための予測補助装置であって、前記予測補助装置は、制御部を備え、前記制御部は、免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者から採取した末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞数を反映する値を取得し、前記値が所定の基準範囲外である場合に、前記患者が免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象を引き起こす可能性があることを示唆する、前記装置。
項７．免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者における全生存期間の良否の予測を補助する方法であって、免疫チェックポイント阻害剤を投与することが予定されている患者から採取した末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞数を反映する値を取得する工程を含み、前記値が所定の基準範囲外である場合に、前記患者の全生存期間が不良となる可能性を示唆する、前記方法。
項８．免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者から採取した末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞の数を反映する値が所定の基準範囲内である前記投与候補患者に投与するための、免疫チェックポイント阻害剤。
項９．前記投与対照患者が、間質性肺疾患を有する患者、間質性肺疾患の既往歴がある患者、自己免疫疾患を合併している患者、慢性自己免疫疾患を有する患者、自己免疫疾患の既往がある患者、臓器移植を受けた患者、結核感染患者、結核感染の既往歴がある患者、及び間質性肺疾患のリスク因子の保因者から選択される、項８に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
項１０．免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者から採取した末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞の数を反映する値が所定の基準範囲外である前記投与候補患者に投与するための、副腎皮質ホルモン剤および／又は免疫抑制剤からなる、免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象の予防剤。
　本発明によれば、免疫チェックポイント阻害剤を用いた腫瘍免疫療法における重篤な有害事象の発生の予測を補助することができる。また、投与候補患者の全生存期間の良否を予測することができる。さらに、重篤な有害事象が発生する可能性のある患者に対しては、免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象の発生を防ぐための対策を講じることができる。
予測補助システム１０００の構成の概要を示す。 予測補助プログラム１０４２による処理の流れを示す。 予測補助プログラム１０４２による処理の流れを示す。 ペムブロリズマブまたはニボルマブ投与非小細胞肺癌患者52名の内訳を示す。 末梢血T細胞と抗PD-1療法による腫瘍縮小効果の関係を示す。 抗PD-1療法の効果に対するPeriCyto法の予測能の検証したROC曲線を示す。 抗PD-1療法を受けた全患者（一次治療、及び二次治療以降を含む）における無増悪生存期間を示す。 は抗PD-1療法が２回目以降である患者の無増悪生存期間を示す。 抗PD-1療法を受けた全患者（一次治療、及び二次治療以降を含む）における全生存期間を示す。 抗PD-1療法が二次治療以降である患者の全生存期間を示す。 無増悪生存期間に関する解析結果を示す。 全生存期間に関する解析結果を示す。 、抗PD-L1抗体染色陽性細胞の割合が50％以上の患者群と、50％未満の患者群における、抗PD-1療法の一次治療適用と、二次治療以降の治療適用を受けた患者数を示す。 PeriCytoと関連するT細胞プロファイルを示す。 今回の検討において確認された有害事象の例を示す。 52名の患者を重篤な有害事象が発生しなかった患者群（Non-severe AE群）と、発生した患者群（Severe AE群）に分けた際の、各群のPeriCyto（％）の値の分布を示す。 Non-severe AE群とSevere AE群の無増悪生存期間（PFS）の比較を示す。 Non-severe AE群とSevere AE群の全生存期間（OS）の比較を示す。 CITRUS解析の結果を示す。 クラスター16920に属するT細胞の数をNon-severe AE群とSevere AE群との間で比較した結果を示す。 重篤な有害事象が発生した患者と発生しなかった患者のT細胞プロファイルを示す。 CD3+及びCD4+でゲーティングした細胞のCD45RAとCD25の発現強度を比較した結果を示す。 Non-severe AE群とSevere AE群の間の末梢血のCD4+T細胞におけるCD4+CD25+CD45RA+T細胞の比率の比較結果を示す。 Non-severe AE群とSevere AE群の間のエフェクターTreg細胞の比率の比較結果を示す。 (CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+のカットオフ値を求めるためのROC曲線解析の結果を示す。 (CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+が高い（≧6％）患者と低い（<6.1％）患者の間でPeriCyto（％）の比較結果を示す。 PeriCyto（％）が17％以上の患者群を、(CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+が6％以上の群と(CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+が6％未満の群に分け無増悪生存期間の比較を行った結果を示す。 PeriCyto（％）が17％以上の患者群を、(CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+が6％以上の群と(CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+が6％未満の群に分け全生存期間の比較を行った結果を示す。 抗PD-L1抗体染色陽性細胞の割合が50％以上の患者群を、(CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+が6％以上の群と(CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+が6％未満の群に分け無増悪生存期間の比較を行った結果を示す。 抗PD-L1抗体染色陽性細胞の割合が50％以上の患者群を、(CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+が6％以上の群と(CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+が6％未満の群に分け全生存期間の比較を行った結果を示す。 non-severe AE群に属する患者１名と、severe AE群に属する患者１名から採取した末梢血由来細胞サンプルについてCD4+CD3+PBMCでゲーティングした後にFoxp3とCD25の発現強度を測定した結果を示す。 CD4+CD45RA+CD25+T細胞群における Foxp3+陽性細胞の比率を、non-severe AE群に属する患者群(n=5)とsevere AE群に属する患者群(n=4)の間で比較した結果を示す。
１．予測補助方法
　本発明のある実施形態は、免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象の発生の予測を補助する方法に関する。前記方法は、免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者から採取した末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞（本明細書において「ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞」と呼ぶこともある）の数を反映する値を取得する工程を含む。前記方法において、前記値が所定の基準範囲外である場合に、前記投与候補患者が免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象を引き起こす可能性があることを示唆する。また、前記値が所定の基準範囲内である場合に、前記投与候補患者が免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象を引き起こす可能性が低いことを示唆する。
　免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗Ｔｉｍ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＣＲ８抗体、又はこれらの混合物等を有効成分として含み得る。医薬品名としては、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ等である。
　免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者は、腫瘍を有する患者、又は腫瘍を有する可能性のある患者である。腫瘍を有する可能性のある患者は、例えば、腫瘍の原発巣を外科的切除、放射線療法等で処置した患者であって、原発巣以外に腫瘍細胞が、転移、又は播種している可能性がある患者、再発の可能性のある患者等である。
　腫瘍には悪性腫瘍及び良性腫瘍が含まれるが、好ましくは悪性腫瘍である。また、腫瘍には、上皮性腫瘍及び非上皮性腫瘍が含まれるが、好ましくは上皮性腫瘍である。本発明において、腫瘍として最も好ましくは、上皮性悪性腫瘍である。
　悪性腫瘍としては、例えば、気管、気管支又は肺等から発生する呼吸器系悪性腫瘍；上咽頭、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、虫垂、上行結腸、横行結腸、Ｓ状結腸、直腸又は肛門部等から発生する消化管系悪性腫瘍；肝臓癌；膵臓癌；膀胱、尿管又は腎臓から発生する泌尿器系悪性腫瘍；卵巣、卵管及び子宮等のから発生する女性生殖器系悪性腫瘍；乳癌：前立腺癌；皮膚癌；視床下部、下垂体、甲状腺、副甲状腺、副腎等の内分泌系悪性腫瘍；中枢神経系悪性腫瘍；骨軟部組織から発生する悪性腫瘍等の固形腫瘍、及び骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、慢性単球性白血病、急性全骨髄性白血病、急性巨核球性白血病、赤白血病、好酸球性白血病、慢性好酸球性白血病、慢性好中球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、ヘアリー細胞白血病、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫等の造血系悪性腫瘍；リンパ系悪性腫瘍等の造血器腫瘍が挙げられる。より好ましくは、肺癌（扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞癌、腺癌）等の呼吸器系上皮性悪性腫瘍；胃癌、十二指腸癌、大腸癌（Ｓ上結腸癌、直腸癌等）等の消化管系上皮性悪性腫瘍；肝臓癌；膵臓癌；膀胱癌；甲状腺癌；卵巣癌；乳癌：前立腺癌；を挙げることができる。最も好ましくは、肺癌である。また、肺がんの中でも非小細胞癌が好ましい。
　免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象とは、免疫チェックポイント阻害剤の投与に依存して発生した有害事象であって、免疫チェックポイント阻害剤による治療を中止せざるを得ない有害事象を意図する。治療を中止せざるを得ない有害事象として、例えば、薬剤性肺障害、間質性肺炎、重症筋無力症、心筋炎、筋炎、横紋筋融解症、大腸炎、小腸炎、重度の下痢、１型糖尿病、重篤な血液疾患、劇症肝炎、肝不全、肝機能障害、肝炎、硬化性胆管炎、甲状腺機能障害、下垂体機能障害、副腎障害、神経障害、腎障害、脳炎、重度の皮膚障害、静脈血栓塞栓症、血球貪食症候群、膵炎、白質脳症、イレウス、帯状疱疹等を挙げることができる。重篤な有害事象の症状は、各免疫チェックポイント阻害剤の添付文書にしたがう。
　免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者は、未治療の患者であってもよいが、免疫チェックポイント阻害剤による化学療法を受けている患者、免疫チェックポイント阻害剤による化学療法を過去に受けた患者、免疫チェックポイント阻害剤以外の抗がん剤を用いた化学療法を受けている患者、免疫チェックポイント阻害剤以外の抗がん剤を用いた化学療法を過去に受けた患者、外科的腫瘍切除を受けた患者、放射線療法を受けている患者、放射線療法を過去に受けた患者等であってもよい。
　投与候補患者は、免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性評価試験を受けた患者であることが好ましい。また、前記有効性評価試験において、その結果に基づいて、前記治療の有効性が示唆された患者であることが好ましい。
　有効性評価試験として、例えば、特許文献１に記載の末梢血単核細胞を用いた腫瘍細胞傷害活性の値を利用した、腫瘍免疫療法の効果を予測する方法を挙げることができる。具体的には、前記方法は、悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、腫瘍細胞とを、エンゲージャーの存在下で、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで接触させる工程と、前記末梢血単核細胞と接触した腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する工程と、前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定することを含む。言い換えると、投与候補患者から採取された末梢血単核細胞の腫瘍細胞傷害活性が結果であり、この結果に基づいて、前記結果は前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であることが示唆される。腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定するための基準値は、例えばＲＯＣ曲線Ｒｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｏｒａｔｉｎｇ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　ｃｕｒｖｅ、受信者動作特性曲線）を使用し決定することができる。エンゲージャーは、例えば、二重特異性分子である。二重特異性分子は、Ｔ細胞の表面抗原と腫瘍細胞の表面抗原に結合する。二重特異性分子には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、二重特異性抗体等が含まれる。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーとしては、ＥｐｈＡ２とＣＤ３を標的とするエンゲージャー、ＣＤ１９とＣＤ３を標的とするエンゲージャー等を挙げることができる。また二重特異性抗体としては、ＥｐＣＡＭとＣＤ３を標的とする抗体を挙げることができる。
　また、有効性評価試験として、例えば、腫瘍組織におけるＰＤ－Ｌ１陽性細胞の割合を上げることができる。腫瘍組織におけるＰＤ－Ｌ１陽性細胞の検出は、公知の方法に従った免疫染色により行うことができる。免疫染色には、例えば、ＰＤ－Ｌ１　ＩＨＣ　２２Ｃ３　ｐｈａｒｍＤｘ「ダコ」（アジレント・テクノロジー株式会社）等を使用することができる。腫瘍組織におけるＰＤ－Ｌ１陽性細胞の割合の基準値は、各免疫チェックポイント阻害剤について設定されている公知の基準値を使用することができる。腫瘍組織におけるＰＤ－Ｌ１陽性細胞の割合（すなわち、結果）が基準値以上の場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であることが示唆される。例えば、ペムブロリズマブの初回治療の適応基準は腫瘍組織におけるＰＤ－Ｌ１陽性細胞が１％以上となっている。
　末梢血は、Ｔ細胞を含む単核細胞を取得できる限り制限されない。末梢血は、動脈血であっても静脈血であってもよいが、好ましくは静脈血である。末梢血の採血は、例えば四肢の血管から行うことができる。また、手術や生検の際に、四肢以外の血管から採血しても良い。
　末梢血の採血方法は、単核細胞を取得できる限り制限されないが、抗凝固剤を使用して採血することが好ましい。抗凝固剤としては、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、ヘパリン塩等を挙げることができる。好ましくはヘパリンである。
　末梢血中のＴ細胞の表面抗原を解析するため、患者から採血した血液から、単核球分画を回収することが好ましい。単核球分画を回収する方法は公知である。例えば、ヒトリンパ球分離用の比重液（１．０７７±０．００１ｇ／ｍｌ程度の密度を有する）を使って遠心分離により取得することができる。また、溶血剤を使って末梢血中の赤血球を溶血させ、得られる有核細胞を使用してもよい。
　末梢血中のＴ細胞の表面抗原の解析方法、また所定の表面抗原を有する細胞の数の計数方法は公知であり、例えばフローサイトメトリー法により解析できる。解析対象となる表面抗原は、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、及びＣＤ４５ＲＡを含む。表面抗原には、さらに、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７を含んでいてもよい。解析対象の表面抗原の発現が陽性である場合「＋」と表現することがある。また、解析対象の表面抗原の発現が強陽性である場合「＋＋」と表現することがある。解析対象の表面抗原の発現が検出限界以下である場合「－」と表現することがある。
　表面抗原を染色するための抗体は、市販の抗体を使用することができる。
　本実施形態では、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞の数を反映する値を使用して、重篤な有害事象の発生を予測、または前記予測を補助する。
　末梢血のＴ細胞を他の細胞と区別するための表面抗原として、ＣＤ３を挙げることができる。すなわち、本明細書においてＴ細胞とはＣＤ３陽性細胞を意図する。ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞には、ナイーブ制御性Ｔ細胞が含まれうる。ナイーブ制御性Ｔ細胞は、転写因子であるＦＯＸＰ３を発現することが知られている。また、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞は、前記表面抗原プロファイルに加え、さらにＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）陽性、及び／又はＣＤ２７陽性であってもよい。
　ＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞の数を反映する値として、例えば以下の計算式に基づいて算出される値を上げることができる：
　　（１）（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞の数）／（ＣＤ４陽性Ｔ細胞数）　　（２）（ＣＤ４陽性Ｔ細胞数）／（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞の数）　　（３）（ＣＤ４陽性Ｔ細胞数）－（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞の数）　　（４）（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞の数）－（ＣＤ４陽性Ｔ細胞数）。
　式（１）に基づいて算出される値については、所定の基準値未満の場合を基準範囲内とし、所定の基準値以上の場合を基準範囲外とする。
　式（２）に基づいて算出される値については、所定の基準値未満の場合を基準範囲外とし、所定の基準値以上の場合を基準範囲内とする。
　式（３）に基づいて算出される値については、所定の基準値未満の場合を基準範囲外とし、所定の基準値以上の場合を基準範囲内とする。
　式（４）に基づいて算出される値については、所定の基準値未満の場合を基準範囲内とし、所定の基準値以上の場合を基準範囲外とする。
　ただし、式（４）に基づいて算出される値は、絶対値を使用してもよい。この場合の基準範囲の判定は、式（３）に基づいて算出される値と同様である。また、式（３）に基づいて算出される値と式（４）に基づいて算出される値は、患者ごとにＣＤ４陽性Ｔ細胞数が異なるため、例えば、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数が単位個数（例えば、１０００個）となるように、数値を補正することが好ましい。
　より好ましくは、式（１）に基づいて算出される値、すなわち、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞数の割合を示す値である。割合を示す値は、式（１）によって算出される除算値であってもよく、前記除算値を百分率で表してもよい。
　基準値は、患者が免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象を引き起こすか否かを判定できる値である限り制限されない。例えば、基準値は、患者が免疫チェックポイント阻害剤による治療を受けても重篤な有害事象を引き起こさなかった陰性対照患者の末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞の数を反映する値や、患者が免疫チェックポイント阻害剤による治療を受けても重篤な有害事象を引き起こした陽性対照患者の末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞の数を反映する値から求めることができる。陰性対照患者の前記値、及び陽性対照患者の前記値を測定する方法は、投与候補患者の前記値を測定する方法と同じであることが好ましい。基準値は、陰性対照患者の前記値と陽性対照患者の前記値の中央値、平均値、最頻値等とすることができる。あるいは、基準値は、ＲＯＣ曲線、判別分析法、モード法、Ｋｉｔｔｌｅｒ法、３σ法、ｐ‐ｔｉｌｅ法等により算出してもよい。
２．予測補助システム
　本発明のある実施形態は、免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象の発生の予測を補助するための予測補助システム１０００（以下、単に「予測補助システム１０００」と呼ぶ）に関する。
　図１を参照しながら、予測補助システム１０００は、免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象の発生の予測を補助するための予測補助装置１０（以下、単に「予測補助装置１０」と呼ぶ）と、予測補助装置１０と通信可能に接続された細胞解析装置３００を備える。細胞解析装置３００は、例えばフローサイトメータである。図１では、予測補助装置１０と細胞解析装置３００が直接接続された形態を示しているが、予測補助装置１０と細胞解析装置３００とは、ネットワーク９９を介して、有線、又は無線で接続されていてもよい。
　また、予測補助装置１０は、ネットワーク９９を介して電子カルテシステム５００と通信可能に接続されていてもよい。ネットワーク９９は、有線、又は無線であり得る。
２－１．予測補助装置１０
　予測補助装置１０は、制御部１００と、入力装置１１１と、出力装置１１２を備える。　制御部１００は、演算処理を行うＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｓｓｅｃｉｎｇ　Ｕｎｉｔ１０１）と、メモリ１０２と、ＲＯＭ１０３と、記憶装置１０４と、インタフェース１０５を備える。制御部１００内の各構成は、バス１０９によって通信可能に接続されている。記憶装置１０４は、オペレーティングシステム（ＯＳ）１０４１と、免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象の発生の予測を補助するための予測補助プログラム１０４２（以下、単に「予測補助プログラム１０４２」と呼ぶ）と、基準値のデータベースＤＢ１（以下、単に「基準値ＤＢ１」と呼ぶ）を格納する。予測補助装置１０はコンピュータであり、ＯＳ１０４１と予測補助プログラム１０４２が協働してコンピュータを予測補助装置１０として機能させる。基準値ＤＢ１は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞数を反映する値の基準値を記録している。
　入力装置１１１は、マウス、キーボード等である。
　出力装置１１２は、ディスプレイ等である。また、出力装置１１２の１つとしてプリンタを備えていてもよい。
　入力装置１１１と出力装置１１２は、タッチパネルのように一体となっていてもよい。　インタフェース１０５は、制御部１００と入力装置１１１、出力装置１１２、及び細胞解析装置３００と通信可能に接続されている。
２－２．予測補助プログラム１０４２
　図２及び図３を用いて、予測補助プログラム１０４２の処理について説明する。本項において使用する用語について上記１．と重複する用語は、上記１．における説明をここに援用する。
　図２に示すステップＳ１１において、制御部１００は、オペレータが入力装置１１１から入力した処理開始要求を受け付け、予測補助処理を開始し、免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者から採取した末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞数を反映する値を取得する。
　ステップＳ１３において、制御部１００は、基準値ＤＢ１に記録されている基準値を読み出し、ステップＳ１１において取得した値を基準値と比較する。ステップＳ１３において、前記値が基準範囲外であると判定した場合（「ＹＥＳ」の場合）、制御部１００はステップＳ１５に進む。ステップＳ１３において、前記値が基準範囲内であると判定した場合（「ＮＯ」の場合）、制御部１００はステップＳ１５に進む。
　ステップＳ１５において、制御部１００は、免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象を引き起こす可能性があることを示すラベルを出力装置１１２に出力し、処理を終了する。ラベルは、注意を促すテキストや、記号等であり得る。
　ステップＳ１７において、制御部１００は、免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象を引き起こす可能性がないことを示すラベルを出力装置１１２に出力し、処理を終了する。ラベルは、注意を促すテキストや、記号等であり得る。若しくは、免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象を引き起こす可能性に関連するラベルは何も出力せずに処理を終了する。
　予測補助プログラム１０４２は、図３に示す、免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者が、免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性評価試験を受けた場合の処理を行ってもよい。
　図３に示すステップＳ２１において、制御部１００は、オペレータが入力装置１１１から入力した処理開始要求を受け付け、前記投与候補患者の免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性評価試験の結果を取得する。有効性評価試験の結果は、ネットワーク９９を介して電子カルテシステム５００から取得することができる。電子カルテシステム５００に格納された投与候補患者の情報は、患者識別番号等を照合して取得することができる。若しくは、オペレータが、入力装置１１１から前記投与候補患者の免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性評価試験の結果を入力し、制御部１００がこれを受け付けることで取得してもよい。
　ステップＳ２３において、制御部１００は、治療の有効性評価試験の結果の対応する基準値を基準値ＤＢ１から取得し、ステップＳ２１で得られた結果と、基準値の比較を行う。前記結果が基準値以上である場合（「ＹＥＳ」の場合）、制御部１００は上述のステップＳ１１に進む。ステップＳ２３において、前記結果が基準値未満であると判定した場合（「ＮＯ」の場合）、制御部１００は、免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者に対して免疫チェックポイント阻害剤が無効である可能性を示すラベルを出力する。ラベルは、無効であることを示唆する内容のテキストや、記号等であり得る。
　予測補助プログラム１０４２は、記憶媒体等に読み取り可能に記録され、提供されてもよい。すなわち、前記予測補助プログラム１０４２は、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等の記憶媒体に記憶される。前記記憶媒体へのプログラムの記憶形式は、前記提示装置が前記プログラムを読み取り可能である限り制限されない。前記記憶媒体への記憶は、不揮発性であることが好ましい。
３．全生存期間の良否の予測補助方法
　本発明のある実施形態は、免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者における全生存期間の良否の予測を補助する方法に関する。前記方法は、免疫チェックポイント阻害剤を投与することが予定されている患者（投与候補患者）から採取した末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞数を反映する値を取得する工程を含む。前記方法において、前記値が所定の基準範囲外である場合に、前記患者の全生存期間が不良となる可能性を示唆する。前記値が所定の基準範囲内である場合に、前記患者の全生存期間が良好であることを示唆する。
　免疫チェックポイント阻害剤を投与することが予定されている患者から採取した末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞数を反映する値を取得する工程に関しては、上記１．に記載の予測補助方法と同様であるので、上記１．の説明をここに援用する。
４．免疫チェックポイント阻害剤
　本発明のある実施形態は、上記１．に記載の予測補助方法において、免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者から採取した末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞の数を反映する値が所定の基準範囲内である前記投与候補患者に対して投与される、免疫チェックポイント阻害剤に関する。免疫チェックポイント阻害剤に関する説明は、上記１における説明を援用する。
　免疫チェックポイント阻害剤には、投与制限対象者が存在する。一般的に、前記投与制限対象患者には、免疫チェックポイント阻害剤の投与は行われない。しかし、上記１．に記載の方法により、末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞の数を反映する値が所定の基準範囲内であることが示唆された投与候補患者については、仮に前記投与候補患者が、前記投与制限対象者に該当する場合であっても、免疫チェックポイント阻害剤の投与の余地があり得る。投与制限対象者は、例えば、間質性肺疾患を有する患者、間質性肺疾患の既往歴がある患者、自己免疫疾患を合併している患者、慢性自己免疫疾患を有する患者、自己免疫疾患の既往がある患者、臓器移植（造血幹細胞移植を含む）を受けた患者、結核感染患者、結核感染の既往歴がある患者、間質性肺疾患のリスク因子（肺手術の既往、呼吸機能低下、酸素投与、肺への放射線照射等）の保因者等を挙げることができる。
５．副腎皮質ホルモン剤および／又は免疫抑制剤からなる、免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象の予防剤
　本発明のある実施形態は、副腎皮質ホルモン剤および／又は免疫抑制剤からなる、免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象の予防剤（以下、単に「予防剤」とも呼ぶ）に関する。前記予防剤は、免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者から採取された末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞の数を反映する値が所定の基準範囲外である前記投与候補患者に投与される。
　前記投与候補患者から採取した末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞の数を反映する値が所定の基準範囲外であるかいなかは、上記１．において説明した方法により判定できる。
　副腎皮質ホルモン剤には、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン等を含む。
　免疫抑制剤には、シクロスポリン、タクロリムス、シクロホスファミド等を含む。
　予防剤の投与量は、副腎皮質ホルモン剤、又は免疫抑制剤の投与量に基づいて規定できる。例えば、厚生労働省が各薬剤について承認している一般的な１日の投与量と同じであるか、一般的な１日の投与量の５０％～９０％程度の投与量を例示できる。この範囲は、使用する薬剤に応じて設定できる。例えば、プレドニゾロンの場合、５ｍｇ～１０ｍｇ／日程度を投与することができる。予防剤は、免疫チェックポイント阻害剤の投与に先立って、又は同時に投与を開始することができる。ここで、「同時」とは、例えば、免疫チェックポイント阻害剤の投与開始から０時間～３時間以内に予防剤の投与を開始することを意図する。
　一般的な投与量よりも少ない量で薬剤を投与することにより、重篤な有害事象を抑制し、かつ免疫チェックポイント阻害剤による治療効果を可能な限り阻害せずに治療を継続することができる。
　以下に実施例を示して本発明についてより詳細に説明する。しかし、本発明は、実施例に限定して解釈されるものではない。なお、以下の検討は、ヘルシンキ宣言の原則に従って行った。検討プロトコルは大阪大学医学部付属病院倫理審査委員会による承認を受け、検討に参加する前に参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。
Ｉ．材料及び方法
１．対象患者
　今回の検討は、大阪大学附属病院又は大阪刀根山医療センターにおけるペムブロリズマブまたはニボルマブ投与非小細胞肺癌症例を対象とした。症例登録期間は、2017年11月-2019年8月とした。EGFR変異またはALK転座のある患者は、将来最前線のがん免疫療法臨床試験に登録されない可能性があるため、分析から除外した。データ解析日は、2021年6月30日とした。症例からは、全ての症例において、ペムブロリズマブまたはニボルマブ投与前の末梢血について後述する方法により末梢血単核球の腫瘍細胞傷害活性の測定を行った。末梢血を用いた腫瘍細胞傷害活性の測定は、以下、PeriCyto法と呼ぶ。また、腫瘍組織におけるPD-L1の発現は、各施設でPD-L1 IHC 22C3 pharmDx「ダコ」（アジレント・テクノロジー株式会社；製造販売承認番号：22800EZX00078000）を使用した免疫組織化学によって評価した。
　応答は、固形腫瘍の応答評価基準（the Response Evaluation Criteria in Solid Tumours：RECIST） version 1.1に従って評価した。無増悪生存期間（PFS）は、抗PD-1療法の開始日からRECIST version 1.1に従って評価した疾患の増悪日までを測定した。疾患の増悪のないPFSは、最後の既知の接触の日に打ち切った。全生存期間（OS）は、抗PD-1療法の開始から死亡までとした。生存患者のOSは、最後の既知の接触の日に打ち切った。重篤な有害事象（AE）は、抗PD-1療法の中止につながるAEとして定義した。
２．PeriCyto法
（１）EphA2-specific T-cell engagerの構築
　EphA2-specific scFv 4H5、ショートリンカー、及びOKT3由来CD3-specific scFvを含むEphA2-specific T-cell engagerを構築した。具体的には、EphA2-specific engagerは、4H5 heavy-chain、a glycine (G) serine (S) linker [(G4S)3]、4H5 light-chain、G4S linker、OKT3 heavy-chain、(G4S)3 linker、及びOKT3 light-chainからなり、C末端側のストップコドンの前に6×His-Myc tagを挿入した。リコンビナントEngagerタンパク質の調製はThermo Fisher Scientific社に委託した。EphA2-specific engager DNAフラグメントを調製し、pcDNA3.3 vectorにサブクローニングした。EphA2-specific engager DNAフラグメントを含むpcDNA3.3 vectorをExpi293 （登録商標） cellsに遺伝子導入した。遺伝子導入した細胞を培養した後、培養上清からHis-tagアフィニティクロマトグラフィーによりリコンビナントEngagerタンパク質を精製した。精製されたタンパク質を、以下EphA2/CD3BiTEと呼ぶ。
（２）PeriCyto法
　U251細胞株は、森靖子博士（神戸大学、日本）より提供を受けた。ショートタンデムリピート（STR）プロファイリングとマイコプラズマテストによる細胞株認証は、JCRBセルバンクに委託した。U251細胞を96ウェル平底細胞培養プレート（Corning）に、10％ウシ胎児血清（FBS; HyClone、Thermo Scientific）を含むPRMI培地1640（Nacalai Tesque）を使用して１ウェルあたり1×104細胞の密度で播種した。U251細胞を播種した24時間後に、5×104個の患者から単離したばかりの末梢血単核細胞（PBMC）と、100 ng/mlのEphA2/CD3BiTEを含むプレートに添加した。PBMCは、Lymphoprep（Axis Shield）を使用した密度勾配遠心分離によって末梢血から分離した。培養は、37℃、５％CO2存在下の湿式インキュベータ内で行った。
　48時間共培養した後、10％FBSを含むRPMI 1640培地で4回穏やかに洗浄し非接着細胞を除去し、残りの接着生細胞を3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-5-（3-カルボキシメトキシフェニル）-2-（4-スルホフェニル）-2H-テトラゾリウム（MTS）アッセイ（CellTiter96 aqueous one solution cell proliferation assay; Promega）で検出した。検出は、メーカー提供のプロトコルにしたがった。
　EphA2/CD3 BiTEを介した細胞傷害率は、次の式で生存可能であった標的細胞の減少の程度に基づいて算出した。
EphA2/CD3BiTEを介した細胞傷害率（％）= [1-（処理したウェルの吸光度）/（未処理ウェルの吸光度）]×100
　処理した各ウェルは、1×104個のU251細胞と、5×104個のPBMCと、100 ng / mlのEphA2 / CD3BiTEを含む。未処理の各ウェルは、1×104個のU251細胞と5×104個のPBMCを含み、EphA2/CD3BiTEは含まれていない。
３．フローサイトメトリー解析
　BD Pharm lyse（BD Biosciences）赤血球溶解バッファーを用いて赤血球を溶血させ、末梢血から白血球を抽出し、FACS解析に用いた。
　表面抗原染色は、Human TruStain FcX Fc Receptorブロッキング溶液（BioLegend）を使用してFcRブロックした後に行った。表面抗原を染色した細胞は、FACSDivaソフトウェア（BDBiosciences）を使用してBDLSRFortessaで解析した。次の抗体を表面抗原染色に使用した。抗CD45RA-FITC（クローンHI100）抗体、抗CD25-PE（BC96）抗体、抗4-1BB-BV421（4B4-1）抗体、抗CD8-BV510（RPA-T8）抗体、抗CD103-BV605（Ber-ACT8）抗体、抗CD4-BV711（OKT4）抗体、抗Tim-3-APC（F38-2E2）抗体、抗CD3-Alexa Fluor 700（UCHT1）抗体、およびIgG1アイソタイプコントロール （MOPC-21）である。抗体は、いずれもBiolegend社のものを購入した。 抗ICOS-PerCPeFluor 710（ISA-3）およびIgG1アイソタイプコントロール（P3.6.2.8.1）はeBioscienceから購入した。抗OX-40-PE-CF594（ACT35）抗PD-1-PE Cy7（EH12.1）は、BDBioscienceから購入した。
　実施例において、表面抗原名の後に記載される「＋」はその表面抗原が陽性であることを意味し、「－」はその表面抗原が検出限界以下であったことを意味する。また、「＋＋」は高発現（super high）を意味する。
４．統計解析
　An unpaired two-tailed Student’s t-testを使用して、サンプル間の差の有意性を検討した。ペアのデータ間の関係は、ピアソンの相関係数を使用して解析した。PFSとOSは、カプランマイヤー法を使用して推定した。ログランク検定を使用して、患者のサブグループ間のPFSとOSの違いを分析した。単変量解析、および多変量Cox比例ハザードモデルを使用して、95％信頼区間（CI）でハザード比（HR）を推定した。
　すべてのテストにおいて、p値<0.05の場合に、有意差有りと評価した。すべての解析は、JMP Pro 15ソフトウェア（SAS Institute、Inc.）を使用した。
ＩＩ．結果
１．末梢血単核球（T細胞）の細胞傷害活性と抗PD-1療法の相関
　ペムブロリズマブまたはニボルマブ投与非小細胞肺癌患者52名の内訳は図４に示す。52名の患者については、ペムブロリズマブまたはニボルマブによる治療を開始する前に、PeriCyto法による末梢血T細胞の細胞傷害活性（PeriCyto(％)）と、溶血させた末梢血を用いたフローサイトメトリーによる細胞ごとの表面抗原の解析を行った。
　図５Aに、末梢血T細胞と抗PD-1療法による腫瘍縮小効果の関係を示す。図中、PRは腫瘍の部分的縮小を示し、SDは腫瘍サイズの現状維持を示し、PDは増悪を示し、NEは評価不能となった群を示す。PR群及びSD群は、PD群及びNE群と比較してPeriCyto(％)が高い傾向を示した（p<0.0188）。
　抗PD-1療法の効果に対するPeriCyto法の予測能を評価するため、receiver operating characteristic（ROC）曲線のArea Under the Curve（AUC）領域の解析を行い、PR群及びSD群（合計n数=33）とPD（n=14）を抗PD-1療法の効果において区別するためのカットオフ値を求めた。AUC値は0.69であり、カットオフ値は、17.05％であった。この時の感度は75.76％、１－特異度は64.29％であり、p=0.0662であった（図５B）。
　PeriCyto(％)の暫定的なカットオフ値を17.05％とし、この値に基づいて、PeriCyto(％)が高い（PeriCyto(％)≧17.05％）患者群およびPeriCyto(％)が低い（PeriCyto(％)<17.05％）患者群の無増悪生存期間（PFS）と全生存期間（OS）を比較した。
　無増悪生存期間の比較結果を図６に示す。図６Aは抗PD-1療法を受けた全患者（一次治療、及び二次治療以降を含む）における無増悪生存期間を示す。Totalは、初回治療で抗PD-1療法を受けた患者と、二次治療において抗PD-1療法を受けた患者の合計である。二次治療以降の患者は、初回治療以降で抗PD-1療法以外の化学療法を受けている。図６Bは抗PD-1療法が２回目以降である患者の無増悪生存期間を示す。図６Aに示すように、全患者群において、PeriCyto(％)が高い患者群は、PeriCyto(％)が低い患者群と比較して、無増悪生存期間が有意に長かった（p=0.0068）。また、図６Bに示すように、抗PD-1療法が二次治療以降である患者群において、PeriCyto(％)が高い患者群は、PeriCyto(％)が低い患者群と比較して、無増悪生存期間が顕著に長かった（p=0.0025）。
　全生存期間の比較結果を図７に示す。図７Aは抗PD-1療法を受けた全患者（一次治療、及び二次治療以降を含む）における全生存期間を示す。図７Bは抗PD-1療法が二次治療以降である患者の全生存期間を示す。図７Aに示すように、全患者群において、PeriCyto(％)が高い患者群は、PeriCyto(％)が低い患者群と比較して、無増悪生存期間が長い傾向を示した（p=0.0787）。また、図７Bに示すように、抗PD-1療法が二次治療以降である患者群において、PeriCyto(％)が高い患者群は、PeriCyto(％)が低い患者群と比較して、全生存期間が長い傾向を示した。
　次に、どのような因子が、無増悪生存期間、及び全生存期間に影響を及ぼすか検討するため、因子ごとに単変量解析、多変量解析により、ハザード比（HR）、95％信頼区間（95％ CI）、及びｐ値を算出した。図８に無増悪生存期間に関する解析結果を示す。図９に全生存期間に関する解析結果を示す。図８によれば、PeriCyto(％)は、17.0％以上の患者群と17％未満の患者群を比較すると、無増悪生存期間において有意差を示した（単変量解析におけるハザード比は0.42、95％ CIは0.22-0.80、p値は0.0086；多変量解析におけるハザード比は0.33、95％ CIは0.15-0.72、p値は0.0058）。しかし、図９に示すように全生存期間では、PeriCyto(％)は、17.0％以上の患者群と17％未満の患者群を比較した場合、単変量解析及び多変量解析共に有意差は認められなかった（単変量解析におけるハザード比は0.55、95％ CIは0.28-1.08、p値は0.084；多変量解析におけるハザード比は0.56、95％ CIは0.26-1.22、p値は0.15）。
　一方、図８に示すように、患者の腫瘍における抗PD-L1抗体染色陽性細胞の割合を示す抗PD-L1抗体染色陽性細胞の割合が50％以上の患者群と50％未満の患者群では、無増悪生存期間については、単変量解析におけるハザード比は0.42、95％ CIは0.21-0.84、p値は0.014となり有意差は認められたものの、多変量解析におけるハザード比は0.93、95％ CIは0.35-2.47、p値は0.35となり有意差は認められなかった。図９に示すように、PD-L1の発現細胞が50％以上の患者群と50％未満の患者群における全生存期間の延長については、単変量解析におけるハザード比は0.24、95％ CIは0.12-0.48、p値は0.0001よりも低くなり有意差が認められた。また、多変量解析におけるハザード比は0.26、95％ CIは0.09-0.73、p値は0.011となり有意差が認められた。
　さらに一次治療と二次治療以降の治療ラインの比較では、無増悪生存期間、及び全生存期間の比較において、単変量解析、及び多変量解析とも有意差を示した。
　PeriCyto(%)は、無増悪生存期間との関連性が強いことから、抗PD-1療法の治療効果を反映することが裏付けられた。
　図１０に、抗PD-L1抗体染色陽性細胞の割合が50％以上の患者群と、50％未満の患者群における、抗PD-1療法の一次治療適用と、二次治療以降の治療適用を受けた患者数を示す。抗PD-L1抗体染色陽性細胞の割合が50％以上の患者は29名であり、このうち一次治療ラインの適用を受けた患者は27名（93％）であった。一方、抗PD-L1抗体染色陽性細胞の割合が50％未満の患者は22名であり、このうち一次治療ラインの適用を受けた患者は7名（32％）であった。一次治療ラインの適用を受けた患者数は、抗PD-L1抗体染色陽性細胞の割合が50％以上の患者群で有意に高かった（χ2検定によるp<0.0001）。
　一次治療で抗PD-1療法を受けた患者群の方が、二次治療以降に抗PD-1療法を受けた患者群に比べて無増悪生存期間および全生存期間が良好であることが既知の事実であることから、一次治療で抗PD-1療法を受けた患者の割合が多い抗PD-L1抗体染色陽性細胞の割合が 50%以上の患者群は50％未満の患者群に比べて治療ラインの差から無増悪生存期間および全生存期間が良好となった可能性が考えられた。
２．PeriCyto(%)とT細胞プロファイルの関係
　上記II．１．で述べたように、患者にはPeriCyto（％）が所定の基準値（今回は17％）よりも高い者と低い者が存在する。この差に寄与する因子を特定するため、PeriCyto（％）と患者末梢血中のT細胞プロファイルとの相関を検討した。T細胞のプロファイルは、エフェクターメモリーT細胞に関連する（CD45RA-CD27-CD4+）、（CD45RA-CD27-CD8+）、（CD45RA+CD27+CD4+）及び（CD45RA+CD27+CD8+）についてフローサイトメトリーにより解析した。
　その結果を図１１に示す。（CD45RA-CD27-CD4+）T細胞、及び（CD45RA-CD27-CD8+）T細胞の割合は、PeriCyto（％）と正の相関を示した（それぞれR2=0.1346, p=0.0155; R2=0.0984, p=0.0405）。（CD45RA+CD27+CD4+）T細胞及び（CD45RA+CD27+CD8+）T細胞の割合は、PeriCyto（％）と負の相関を示した（それぞれR2=0.1215, p=0.0220; R2=0.1324, p=0.0164）。
　以上の結果からPeriCytoが抗原特異的に活性化したT細胞と関連することが示唆された。
３．抗PD-1療法による重篤な有害事象の発生とPeriCyto（％）との関係
　重篤な有害事象（severe AEともいう）は、抗PD-1療法に起因して発生する有害事象であって、その有害事象のために治療継続が不可能となる事象と定義した。今回の検討において確認された有害事象の例を図１２Aに示す。また、図１２Bには、上記52名の患者を重篤な有害事象が発生しなかった患者群（Non-severe AE群）と、発生した患者群（Severe AE群）に分け、各群のPeriCyto（％）の値の分布を示す。
　Severe AE群ではPeriCyto（％）が17％以上を示す患者が多いものの、Non-severe AE群と比較してPeriCyto（％）が低い傾向を示した。なお、今回Severe AE群のn数が少ないため、有意な差は認められていない。PeriCyto（％）は治療開始前の末梢血単核球を使用していることから、抗PD-1療法により重篤な有害事象が発生する患者は、PeriCyto（％）は所定の基準値を超えているものの、治療に関係なく、もともと腫瘍細胞に対する免疫応答能が低いと考えられた。
４．重篤な有害事象の発生の有無と重篤な有害事象の発生要因の検討
　図１３にNon-severe AE群とSevere AE群の無増悪生存期間（PFS）Aと全生存期間（OS）Bの比較を示す。Severe AE群は、無増悪生存期間においては、Non-severe AE群よりも長い傾向を示した。一方、全生存期間においては、Severe AE群は、Non-severe AE群よりも短い傾向を示した。これは、ある程度の有害事象が起こる方が腫瘍の縮小効果が得られ増悪しにくいことを示すと考えられる。しかし、一方で、重篤な有害事象が発生した場合、治療が中止となるほか、有害事象の発生により患者の全身状態が悪くなり予後が不良となることが、全生存期間を短縮する原因の１つとして考えられた。
　次に、重篤な有害事象の発生要因の検討を行った。
　Cytobankソフトウェア（https://premium.cytobank.org/cytobank/）を使用したCITRUS解析（https://support.cytobank.org/hc/en-us/articles/226940667-Overview-of-CITRUS；クラスターの識別、特性評価、および回帰を行う。）により、重篤な有害事象が発生した患者と発生しなかった患者のT細胞プロファイルを比較した。CITRUS解析の結果、重篤な有害事象が発生した患者において、重篤な有害事象が発生しなかった患者の末梢血においてクラスター16920に属するT細胞が多く存在していることが明らかとなった（図１４）。クラスター16920に属するT細胞の数をNon-severe AE群とSevere AE群との間で比較した結果を図１５に示す。Severe AE群では、クラスター16920に属するT細胞の数が、Non-severe AE群と比較して有意に多かった（p=0.0198）。クラスター16920に属するT細胞の表面抗原解析の結果を図１６に示す。図１６において符号ａは、Severe AE群に属する患者１名の結果を示し、符号ｂは、Non-severe AE群に属する患者１名の結果を示す。Severe AE群に属する患者において、クラスター16920に属するT細胞は、CD45RA+、CD25 +、CD4 +、ICOS+、及びCD27+の細胞が多いことが示された。
　Non-severe AE群に属する患者１名と、Severe AE群に属する患者１名の末梢血におけるCD4+CD25+CD45RA+T細胞の割合をフローサイトメトリーにより解析した。
　図１７に、CD3+及びCD4+でゲーティングした細胞のCD45RAとCD25の発現強度を比較した結果を示す。Non-severe AE群に属する患者では、CD45RA+かつCD25+の細胞は0.5％であった。Severe AE群に属する患者では、CD45RA+かつCD25+の細胞は30.0％であり、Non-severe AE群に属する患者と比較して、顕著に高い値を示した。対照として、エフェクターTreg細胞のマーカーであるCD45RA-かつCD25++の細胞の割合を比較したが、Non-severe AE群に属する患者は3.9％であり、Severe AE群に属する患者は4.8％であり、両者の間に大きな差は認められなかった。
　末梢血のCD4+T細胞に対するCD4+CD25+CD45RA+T細胞の比率（以下、「(CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+」とも呼ぶ）と、エフェクターTreg細胞の比率について、Non-severe AE群とSevere AE群の間で比較を行った。結果を図１８に示す。（CD4+CD25+CD45RA+）/CD4+は、Non-severe AE群と比較してSevere AE群において高値を示した（図１８A、p = 0.0265）。対照的に、CD4 + T細胞におけるエフェクターTreg細胞（CD4+CD45RA-CD25 ++）の比率については、Non-severe AE群とSevere AE群との間に差は認められなかった（図１８B、p=0.8646）。
　次にROC曲線から求めたAUC値に基づいて、Non-severe AE群とSevere AE群を区別するための（CD4+CD25+CD45RA+）/CD4+のカットオフ値を暫定的に決定した。結果を図１９に示す。Severe AE群（n = 8）とNon-severe AE群（n = 35）を区別するためのAUCは0.81で、カットオフ値は6.1％、感度= 100.00％、１－特異性= 65.71％、p = 0.0413となった。そこで、検討に用いる暫定的な基準値を6％とした。
　(CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+のカットオフ値に基づいて、(CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+が高い（≧6％）患者と低い（<6.1％）患者の間でPeriCyto（％）を比較した。結果を図２０に示す。(CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+が高い患者のPeriCyto（％）は、(CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+が低い患者よりも有意に低かった（p=0.0061）。これらの結果を総合すると、抗PD-1療法中の重度の有害事象の発生は、抗PD-1療法開始前におけるPeriCyto（％）の低値群（ただし、PeriCyto（％）の値は所定の基準値以上）であって、かつ(CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+が高値である患者と相関することが明らかとなった。
　PeriCyto（％）が17％以上の患者群を、(CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+が6％以上の群と(CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+が6％未満の群に分け、無増悪生存期間（図２１A）と全生存期間（図２１B）の比較を行った。無増悪生存期間については、2群間に差は見られなかった。しかし、全生存期間では、(CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+が6％以上の群において不良である傾向が見られた。
　次に抗PD-L1抗体染色陽性細胞の割合が50％以上である患者群を、(CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+が6％以上の群と(CD4+CD25+CD45RA+)/CD4+が6％未満の群に分け、無増悪生存期間（図２２A）と全生存期間（図２２B）の比較を行った。無増悪生存期間については、2群間に差は見られなかった。しかし、全生存期間では、（CD4+CD25+CD45RA+）/CD4+が6％以上の群において不良である傾向が見られた。
　以上の結果から、末梢血から分離したCD4+T細胞におけるCD4+CD25+CD45RA+T細胞の存在割合は、重篤な有害事象の発生と関連することが示された。また、免疫チェックポイント阻害剤を用いた治療を開始する前に、末梢血から分離したCD4+T細胞におけるCD4+CD25+CD45RA+T細胞の存在割合を知ることにより、重篤な有害事象が発生するか否かを予測できることが示された。
　さらに、PeriCyto（%）又は抗PD-L1抗体染色陽性細胞の割合（％）と、CD4+T細胞におけるCD4+CD25+CD45RA+T細胞の存在割合を示す値を組み合わせることにより全生存期間の延長、すなわち予後を予測できることが示された。
５．CD4+CD45RA+CD25+T細胞におけるFoxp3発現
　フローサイトメトリーによりCD4+CD45RA+CD25+T細胞の細胞内におけるFoxp3の発現を測定した。細胞内Foxp3の染色は、Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Kit（Thermo Fisher Scientific）と抗Foxp3-APC抗体（クローンPCH101、Thermo Fisher Scientific）によって行った。
　図２３Aにnon-severe AE群に属する患者１名と、severe AE群に属する患者１名から採取した末梢血由来細胞サンプルについてCD4+CD3+PBMCでゲーティングした後にFoxp3とCD25の発現強度を測定した結果を示す。赤い点は、CD4+CD45RA+CD25+T細胞を示す。青い点は CD4+CD45RA-CD25++T細胞を示す。
　CD4+CD45RA+CD25+T細胞群における Foxp3+陽性細胞の比率を、non-severe AE群に属する患者群(n=5)とsevere AE群に属する患者群(n=4)の間で比較した。有意差は、Mann-Whitney U検定により評価した。結果を図２３Bに示す。
　non-severe AE群に属する患者に由来するCD4+CD45RA+CD25+T細胞におけるFoxp3陽性細胞の数と、severe AE群に属する患者に由来するCD4+CD45RA+CD25+T細胞におけるFoxp3陽性細胞の数の間に有意差は認められなかった（p=0.713）。
１０　予測補助装置
１００　制御部

Claims (10)

  1. 　免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象の発生の予測を補助する方法であって、
    　免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者から採取された末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞の数を反映する値を取得する工程を含み、
    　前記値が所定の基準範囲外である場合に、前記患者が免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象を引き起こす可能性があることを示唆する、
    前記方法。
  2. 　前記値が、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞数の割合である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記末梢血は、前記投与候補患者は、免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性評価試験を受け、前記治療が有効であることが示唆された前記投与候補患者の末梢血である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記有効性評価試験が、末梢血単核細胞の腫瘍細胞傷害活性である時、末梢血単核細胞の腫瘍細胞傷害活性値が所定の基準値以上である場合に前記治療が有効であることが示唆され、及び／又は
    　前記有効性評価試験が、腫瘍組織におけるＰＤ－Ｌ１陽性細胞の割合である時、腫瘍組織におけるＰＤ－Ｌ１陽性細胞の割合が基準値以上である場合に前記治療が有効であることが示唆される、
    請求項３に記載の方法。
  5. 　前記投与候補患者は、免疫チェックポイント阻害剤を投与する前の患者、又は免疫チェックポイント阻害剤を投与中の患者である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象の発生の予測を補助するための予測補助装置であって、
    　前記予測補助装置は、制御部を備え、
    　　前記制御部は、
    　　　免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者から採取した末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞数を反映する値を取得し、
    　　　前記値が所定の基準範囲外である場合に、前記患者が免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象を引き起こす可能性があることを示唆する、
    前記装置。
  7. 　免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者における全生存期間の良否の予測を補助する方法であって、
    　免疫チェックポイント阻害剤を投与することが予定されている患者から採取した末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞数を反映する値を取得する工程を含み、
    　前記値が所定の基準範囲外である場合に、前記患者の全生存期間が不良となる可能性を示唆する、
    前記方法。
  8. 　免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者から採取した末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞の数を反映する値が所定の基準範囲内である前記投与候補患者に投与するための、免疫チェックポイント阻害剤。
  9. 　前記投与対照患者が、間質性肺疾患を有する患者、間質性肺疾患の既往歴がある患者、自己免疫疾患を合併している患者、慢性自己免疫疾患を有する患者、自己免疫疾患の既往がある患者、臓器移植を受けた患者、結核感染患者、結核感染の既往歴がある患者、及び間質性肺疾患のリスク因子の保因者から選択される、請求項８に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
  10. 　免疫チェックポイント阻害剤の投与候補患者から採取した末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性、ＣＤ２５陽性、及びＣＤ４５ＲＡ陽性のＴ細胞の数を反映する値が所定の基準範囲外である前記投与候補患者に投与するための、副腎皮質ホルモン剤および／又は免疫抑制剤からなる、免疫チェックポイント阻害剤による重篤な有害事象の予防剤。
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