TW202038985A - 大豆萃取物用於預防及／或治療發炎性皮膚疾病及抑制ＭＡＰＫ途徑之磷酸化、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ途徑之磷酸化、或ＩＫＫ／ＮＦ－κＢ途徑之磷酸化，及ＣＣＬ２０基因、Ｓ１００－Ａ７基因、Ｓ１００－Ａ８基因、Ｓ１００－Ａ９基因、ＢＤ２基因、及ＬＬ－３７基因的表現量的用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種大豆萃取物用於預防及/或治療發炎性皮膚疾病及抑制MAPK途徑之磷酸化、JAK/STAT途徑之磷酸化、IKK/NF-κB途徑之磷酸化、CCL20基因、S100-A7基因、S100-A8基因、S100-A9基因、BD2基因、及LL-37基因的表現量的用途。

Description

大豆萃取物用於預防及/或治療發炎性皮膚疾病及抑制MAPK 途徑之磷酸化、JAK/STAT途徑之磷酸化、或IKK/NF-κB途徑之磷酸化，及CCL20基因、S100-A7基因、S100-A8基因、S100-A9基因、BD2基因、及LL-37基因的表現量的用途

本發明是有關於一種大豆萃取物用於預防及/或治療發炎性皮膚疾病及抑制MAPK途徑之磷酸化、JAK/STAT途徑之磷酸化、或IKK/NF-κB途徑之磷酸化，及CCL20基因、S100-A7基因、S100-A8基因、S100-A9基因、BD2基因、及LL-37基因的表現量的用途。

皮膚是人體最大的器官，與外界環境直接接觸，它的健康直接影響人之外觀、心情與社交活動，因此如何預防或治療這些皮膚相關疾病是非常重要課題，而當前最常見之皮膚疾病大多都與發炎反應息息相關，而造成皮膚外觀之改變，導致生理上的缺陷甚至有致命的危險，且造成公共衛生保險及醫療保健成本之負擔。目前最常見的發炎性皮膚疾病(inflammatory skin disease)包括異位性皮膚炎(atopic eczema)、接觸性皮膚炎(contact dermatitis)以及乾癬(psoriasis)，尤其乾癬疾病困擾著逾11萬的台灣人，或是因外界紫外線與汙染造成之皮膚發炎症狀，不僅在國內，環觀全世界，有數以萬計的患者被此類疾病嚴重困擾著，甚至會引起共病症的發生，對人體健康造成更重大的威脅。

世界衛生組織於2014年向全球傳達一個訊息：乾癬是一種嚴重的非傳染性疾病(non-communicable disease)，其發炎性疾病的本質、心理社會層面之衝擊，以及與其他更致命的非傳染性疾病具有共通的危險因子，也與心血管疾病有關，需要更多公眾的關注。乾癬同樣也是一種自體免疫疾病，影響台灣大約0.2%的人口，男女性罹患率相等，主因為免疫系統異常，而導致皮層不正常生長。乾癬病灶可能出現於身體各部位(包括臉上、頭皮、手腳和指甲)，不具傳染性。乾癬真正的病因尚不清楚，但可能與某些因子相關，包括遺傳、自體免疫功能異常，以及外在因子像是環境或心理壓力等因素。

此外，乾癬俗稱牛皮癬、銀屑病，是一種常見的慢性免疫介導(immune-mediated)的發炎性皮膚疾病，會經常性的復發(recurrent)但本身不具傳染性(contagious)，在全球盛行率(prevalence)為1~3%，且具有明顯的特徵，易於臨床診斷；雖大部分患者無生命危險，但對患者的外表與生活品質都造成一定程度的影響。疾病的歷史可追溯至遠古時代，當時乾癬、痲瘋(leprosy)與其他發炎性皮膚疾病被認為是相同的病症，一直到了19世紀皮膚學家才獨立出乾癬的疾病症狀，例如：以外力移除乾癬部位的皮屑後會在傷口處形成小血滴的Auspitz sign、於紅斑周圍會形成白色圈型的Woronoff’s ring以及皮膚受到創傷後易誘發乾癬的Koebner’s現象。目前乾癬已是常見且可被明確診斷的疾病，各個年齡層都有發病的可能，且男女比率無明顯差距。這種疾病的病理特徵包括角質細胞的異常增殖、真皮層的血管新生(angiogenesis)、樹突細胞(dendritic cells)的活化，促發炎細胞激素(pro-inflammatory cytokines)的釋放，以及T淋巴細胞、嗜中性白血球(neutrophils)、單核細胞(monocytes)和巨噬細胞(macrophages)等免疫的浸潤(infiltration)並向皮膚的募集(recruitment)，而其病灶部位則是會有發紅(red)、脫屑(scaly)以及浮起之斑塊(plaques)等特徵。乾癬的典型皮膚表現包括紅斑(erythema)與鱗片狀脫屑，分別代表血管(vascular)和表皮受到侵犯，甚至有一些乾癬患者會伴隨著乾癬性關節炎(psoriasis arthritis)的發生，導致關節(joint)腫脹與發炎，也可能因為指甲病變造成指甲變形。乾癬的發病機制尚未十分清楚，然而有越來越多的證據證實乾癬是由免疫介導的疾病，遺傳(genetic)和免疫學(immunological)的相關研究已經注意到細胞激素在乾癬的致病機轉(pathogenesis)中扮演著關鍵的角色。

然而，由於這些發炎性皮膚疾病之成因複雜，雖然已經發展出許多治療藥物，但仍有許多藥物療效較不佳、使用禁忌及副作用多、或是藥費過於昂貴以及有經常性復發之可能，更重要的是無法達到根治的目的，因此，開發新穎的藥物來治療這些發炎性皮膚疾病是刻不容緩之課題。為了解決上述問題，本領域的技術人員亟需研發出具有預防及/或治療發炎性皮膚疾病功效之新穎醫藥品、食品產品或保養品以造福有此需求的廣大族群。

有鑑於此，本發明之目的為提供一種大豆萃取物用於製備一預防及/或治療發炎性皮膚疾病之組成物的用途。

在本發明的一實施例中，該發炎性皮膚疾病是選自於由下列所組成的群組：異位性皮膚炎、接觸性皮膚炎以及乾癬。

本發明之另一目的為提供一種大豆萃取物用於製備一抑制有絲分裂劑活化蛋白質激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途徑之磷酸化的表現量，Janus激酶(Janus kinase,JAK)/轉錄訊息傳遞及活化子蛋白(signal transducer and activator of transcription,STAT)途徑之磷酸化的表現量，及IκB激酶(IκB kinase,IKK)/NF-κB途徑之磷酸化的表現量之組成物的用途。

在本發明的一實施例中，該MAPK途徑之磷酸化是由腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、介白素-17A(interleukin-17A,IL-17A)或介白素-22(interleukin-22,IL-22)所誘導。

在本發明的一實施例中，該MAPK途徑包括細胞外調節激酶(extracellular regulated kinase,ERK)、p38及c-Jun N-端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)。

在本發明的一實施例中，該JAK/STAT途徑之磷酸化是由IL-22所誘導。

在本發明的一實施例中，該JAK/STAT途徑包括轉錄訊息傳遞及活化子蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)及Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)。

在本發明的一實施例中，該IKK/NF-κB途徑之磷酸化是由TNF-α或IL-17A所誘導。

在本發明的一實施例中，該IKK/NF-κB途徑包括IκBα蛋白質。

本發明之另一目的為提供一種大豆萃取物用於製備一抑制第二十型C-C類趨化因子配體蛋白(C-C Motif Chemokine Ligand 20,CCL20)基因、蛋白質S100-A7(Protein S100-A7,S100-A7)基因、蛋白質S100-A8(Protein S100-A8,S100-A8)基因、蛋白質S100-A9(Protein S100-A9,S100-A9)基因、Beta-防禦素-2(Beta-defensin-2,BD2)基因、及LL-37基因的表現量之組成物的用途。

在本發明的一實施例中，該CCL20基因、該S100-A7基因、該S100-A8基因、該S100-A9基因、該BD2基因、及該LL-37基因是由TNF-α、IL-17A或IL-22所誘導。

在本發明的一實施例中，該大豆是一大豆渣。

在本發明的一實施例中，該大豆萃取物之濃度為至少1μg/mL。

在本發明的一實施例中，該大豆萃取物是以一溶劑萃取該大豆所獲得，該溶劑為水、醇或醇水混合物。

在本發明的一實施例中，該組成物是一醫藥品、一食品產品或一保養品。

綜上所述，本發明大豆萃取物之功效在於：可抑制MAPK途徑之磷酸化、JAK/STAT途徑之磷酸化、或IKK/NF-κB途徑之磷酸化，及CCL20基因、S100-A7基因、S100-A8基因、S100-A9基因、BD2基因、及LL-37基因的表現量。此外，本發明大豆萃取物亦藉由活體外細胞實驗及活體內動物實驗被證實可用來預防及/或治療發炎性皮膚疾病，例如乾癬。

以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

圖1是大豆萃取物於咪喹莫特(Imiquimod,IMQ)誘導小鼠模型對小鼠皮膚外觀之影響的示意圖。

圖2是大豆萃取物於IMQ誘導小鼠模型對小鼠耳朵外觀之影響的示意圖。

圖3A是大豆萃取物於IMQ誘導小鼠模型對小鼠皮膚經皮水分散失(trans-epidermal water loss,TEWL)生理參數之影響的數據圖。

圖3B是大豆萃取物於IMQ誘導小鼠模型對小鼠皮膚紅色素生理參數之影響的數據圖。

圖3C是大豆萃取物於IMQ誘導小鼠模型對小鼠皮膚血流速度之影響的數據圖。

圖3D是大豆萃取物於IMQ誘導小鼠模型對小鼠皮膚耳朵厚度之影響的數據圖。

圖3E是大豆萃取物於IMQ誘導小鼠模型對小鼠皮膚含水量生理參數之影響的數據圖。

圖4是大豆萃取物於IMQ誘導小鼠模型對小鼠皮膚組織之影響的染色圖。

圖5A是以MTT還原分析法檢測大豆萃取物於人類角質細胞之細胞存活率的數據圖。

圖5B是以結晶紫染色試驗檢測大豆萃取物於人類角質細胞之細胞存活率的數據圖。

圖5C是以錐藍排除法檢測大豆萃取物於人類角質細胞之細胞存活率的數據圖。

圖6A是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內ERK磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。

圖6B是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內ERK磷酸化之表現的數據圖，其中*表示與對照組比較，p<0.05。

圖7A是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內p38磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。

圖7B是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內p38磷酸化之表現的數據圖，其中*表示與對照組比較，p<0.05。

圖8A是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內JNK磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。

圖8B是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內JNK磷酸化之表現的數據圖，其中*表示與對照組比較，p<0.05。

圖9A是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內ERK磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。

圖9B是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內ERK磷酸化之表現的數據圖，其中*表示與對照組比較，p<0.05。

圖10A是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內p38磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。

圖10B是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內p38磷酸化之表現的數據圖，其中*表示與對照組比較，p<0.05。

圖11A是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內JNK磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。

圖11B是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內JNK磷酸化之表現的數據圖，其中*表示與對照組比較，p<0.05。

圖12A是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內ERK磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。

圖12B是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內ERK磷酸化之表現的數據圖，其中*表示與對照組比較，p<0.05。

圖13A是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內p38磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。

圖13B是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內p38磷酸化之表現的數據圖，其中*表示與對照組比較，p<0.05。

圖14A是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內JNK磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。

圖14B是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內JNK磷酸化之表現的數據圖，其中*表示與對照組比較，p<0.05。

圖15A是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內STAT3磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。

圖15B是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內STAT3磷酸化之表現的數據圖，其中*表示與對照組比較，p<0.05。

圖16A是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內JAK2磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。

圖16B是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內JAK2磷酸化之表現的數據圖，其中*表示與對照組比較，p<0.05。

圖17A是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內IκBα磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。

圖17B是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內IκBα磷酸化之表現的數據圖，其中*表示與對照組比較，p<0.05。

圖18A是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內IκBα磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。

圖18B是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內IκBα磷酸化之表現的數據圖，其中*表示與對照組比較，p<0.05。

圖19A是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內CCL20 mRNA之表現的數據圖，其中*表示p<0.05。

圖19B是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內S100-A7 mRNA之表現的數據圖，其中*表示p<0.05。

圖19C是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內S100-A8 mRNA之表現的數據圖，其中*表示p<0.05。

圖19D是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內S100-A9 mRNA之表現的數據圖，其中*表示p<0.05。

圖19E是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內BD2 mRNA之表現的數據圖，其中*表示p<0.05。

圖19F是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內LL-37 mRNA之表現的數據圖，其中*表示p<0.05。

圖19G是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內CCL20 mRNA之表現的數據圖，其中*表示p<0.05。

圖19H是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內S100-A7 mRNA之表現的數據圖，其中*表示p<0.05。

圖19I是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內S100-A8 mRNA之表現的數據圖，其中*表示p<0.05。

圖19J是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內S100-A9 mRNA之表現的數據圖，其中*表示p<0.05。

圖19K是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內BD2 mRNA之表現的數據圖，其中*表示p<0.05。

圖19L是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內LL-37 mRNA之表現的數據圖，其中*表示p<0.05。

圖19M是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內CCL20 mRNA之表現的數據圖，其中*表示p<0.05。

圖19N是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內S100-A7 mRNA之表現的數據圖，其中*表示p<0.05。

圖19O是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內S100-A8 mRNA之表現的數據圖，其中*表示p<0.05。

圖19P是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內S100-A9 mRNA之表現的數據圖，其中*表示p<0.05。

圖19Q是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內BD2 mRNA之表現的數據圖，其中*表示p<0.05。

圖19R是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內LL-37 mRNA之表現的數據圖，其中*表示p<0.05。

定義

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。

依據本發明，利用Sigma-plot(Version 8.0,2002)軟體，以平均值正負標準差(mean±standard error of the mean,SEM)作為代表值，利用未配對之雙尾檢定(unpaired,t-test two tailed)的學生t-檢定(student t-test)進行統計，以未經 任何處理作為對照組，並與進行實驗處理之實驗組比較是否具有差異，若p值小於0.05為具有顯著差異，p值小於0.05以星號(*)做為註記。

依據本發明，大豆(soybean)(Glycine max(L.)Merr.)是豆科(Fabaceae)大豆屬(Glycine)一年生草本植物，亦是亞洲膳食中常見的農作物。在古代的社會裡，大豆為五榖之一，稱作「菽」，原產於中國東北或華北，適合栽種於溫帶的氣候。大豆已知具有降血脂及預防骨質疏鬆症之功效。

依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)、口服地(orally)或局部地(topically)投藥的劑型，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)、外部製劑(external preparation)以及類似之物。

依據本發明，醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該醫藥上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它們的組合。

依據本發明，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。

依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。

依據本發明，該外部製劑是藉由將本發明的醫藥品與一為熟習此項技藝者所詳知的基底(base)相混合而被製備。

依據本發明，該基底可包含有一或多種選自於下列的添加劑(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強劑(absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、膠凝劑(gelling agents)[諸如卡波普^®974P(carbopol^®974P)、微結晶纖維素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纖維素(carboxymethylcellulose)]、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、螯合劑(chelating agents)、乳化劑(emulsifiers)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)以及推進劑(propellants)等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，保養品可進一步包含有一被廣泛地使用於保養品製造技術之可接受的佐劑(acceptable adjuvant)。例如，該可接受的佐劑可包含有 一或多種選自於下列的試劑：溶劑、膠凝劑、活性劑、防腐劑、抗氧化劑、遮蔽劑(screening agent)、螯合劑、界面活性劑、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料以及氣味吸收劑。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，保養品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚(skincare)或化妝(makeup)的形式，這包括，但不限於：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或複合型之乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、面膜(mask)、貼片、貼布(pack)、擦劑、粉末、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫、分散液、滴劑、慕斯(mousse)、防曬油(sunblock)、化妝水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妝產品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身體清潔產品(body cleansing products)等。

依據本發明，保養品亦可與一或多種選自於下列之已知活性的外用劑(external use agents)一起合併使用：美白劑(whitening agents)[諸如維生素A酸(tretinoin)、兒茶素(catechin)、麴酸、熊果苷以及維生素C]、保濕劑、抗發炎劑(anti-inflammatory agents)、殺菌劑(bactericides)、紫外線吸收劑(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[諸如蘆薈萃取物(aloe extract)]、皮膚營養劑(skin nutrients)、麻醉劑(anesthetics)、抗痘劑(anti-acne agents)、止癢劑(antipruritics)、止痛劑(analgesics)、抗皮膚炎劑(antidermatitis agents)、抗過角化劑(antihyperkeratolytic agents)、抗乾皮膚劑(anti-dry skin agents)、抗汗劑(antipsoriatic agents)、抗老化劑(antiaging agents)、抗皺劑(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出劑(antiseborrheic agents)、傷口治療劑(wound-healing agents)、皮質類固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有關這些外用劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，食品產品可被當作食品添加物(food additive)，藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。

依據本發明，食品產品的種類包括但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。

實施例1. 大豆萃取物之製備

大豆萃取物是參考Chiu,T.M.,et al.,In vitro and in vivo anti-photoaging effects of an isoflavone extract from soybean cake.J Ethnopharmacol,2009.126(1)：p.108-13文獻所述流程來製備。簡言之，取適量之大豆渣，加入ddH₂O與95%精製乙醇(ddH₂O與95%精製乙醇的比例為30~100%)混合後震盪，接著以離心之方式分離大豆殘渣，並過濾上清液後再以減壓濃縮方式，進行體積之濃縮，最後以冷凍乾燥機進行濃縮液之乾燥，最終獲得大豆萃取物之粉末。

實施例2. 大豆萃取物在減緩小鼠咪喹莫特(Imiquimod,IMQ)誘導模型中之皮膚發炎與增生反應上之效用評估

在本實施例中，所有動物試驗均由輔仁大學(Fu Jen Catholic University)之實驗動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)同意執行(同意書編號：A10367)，並已考量「替代(Replace)」、「減量(Reduce)」及「精緻化(Refine)」之3R精神，將實驗設計最佳化。

目前最為廣泛使用的活體試驗主要是以小鼠(mice)為主，小鼠實驗具有多項優點：操作取得方便、生殖能力優良、基因特性明確、品系種類繁多，因此實驗小鼠的使用與特點可應用於支持藥物於活體之作用的相關研究。本實施例使用之實驗動物為小鼠，購自國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center,NLAC)，品系為BALB/cByJNarl近親品系小鼠。實驗動物之飼養與處理遵照輔仁大學實驗動物中心之守則；新購入之小鼠以每籠2~5隻飼養於受控環境中為期一週之適應期，飼養環境之溫度設定在21~25℃，濕度為60±5%，光照以每日12小時光照/12小時黑暗之循環，並提供無苜蓿飼料(Alfalfa-free food)與飲用水自由進食。

本實施例中，欲評估在小鼠咪喹莫特(Imiquimod,IMQ)誘導模型中，大豆萃取物對乾癬皮膚嚴重程度之影響，IMQ是一種TLR7/8的促進劑(agonist)，並具有強效免疫活化之作用，可用來誘發且加重小鼠皮膚的乾癬症 狀。本實施例利用溶於外用溶劑(ddH₂O)之大豆萃取物預先塗抹於小鼠背部皮膚與右側耳朵，再以IMQ處理誘發乾癬樣發炎反應，此步驟持續施行6天並成功誘導乾癬病灶的產生後，再比較控制組與經大豆萃取物預處理過後的小鼠，其皮膚各項指標之差異。

在本實施例中，選用8~11週齡之BALB/c品系雄性小鼠，首先將小鼠分成4組，包括(1)對照組、(2)大豆萃取物(10mg/mL)對照組、(3)IMQ實驗組、及(4)大豆萃取物與IMQ實驗組，其中對照組以凡士林(Vaselina Pura)為載體賦形劑(vehicle cream)處理；大豆萃取物對照組以10mg/mL大豆萃取物及凡士林為載體賦形劑處理；IMQ實驗組以62.5mg劑量之市售咪喹莫特(Imiquimod,IMQ)乳膏(Aldara 5%)處理；大豆萃取物與IMQ實驗組以10mg/mL大豆萃取物及62.5mg劑量之市售咪喹莫特乳膏處理。本實驗所使用之大豆萃取物溶於ddH₂O，用於塗抹小鼠背部皮膚及右側耳朵。於實驗前三天先以除毛刀及除毛乳膏移除小鼠背部之毛髮，小鼠經過三天的休息時間，接著確認小鼠的健康狀況和背部除毛區域之皮膚無異樣後，始進行實驗。

每日進行大豆萃取物於皮膚表面塗抹試驗前，先利用多功能皮膚檢測系統(Cutometer^® MPA 580)及非接觸型雷射血流計(laser-Doppler)(Omegawave FLO-N1)測量小鼠皮膚生理相關數值，包括經皮水分散失(trans-epidermal water loss,TEWL)、皮膚酸鹼數值(pH value)、黑色素(melanin)、紅色素(erythema)、表皮含水量(skin hydration)與血流(blood flow)等參數，另外也會量測小鼠左右兩側耳朵之厚度(ear thickness)，並進行拍照記錄皮膚及耳朵外觀之變化，由於環境中之溫度與濕度對於皮膚表面所偵測之參數有很大的影響，因此在本實施例中進行皮膚表面生理參數的評估時，使用恆溫恆濕箱來維持檢測環境的溫濕度。接著再以局部塗抹投藥的方式將大豆萃取物(10mg/mL)塗抹於大豆萃取物對照組與大豆萃取物與IMQ實驗組之小鼠背部與耳朵，其餘則是以ddH₂O塗抹於毋須藥物處理之組別，一小時過後，IMQ實驗組及大豆萃取物與IMQ實驗組小鼠開始以62.5mg劑量之市售咪喹莫特(Imiquimod,IMQ)乳膏(Aldara 5%)以局部塗抹的方式均勻塗抹於已除毛之背部皮膚與右側耳朵，俾以誘發類乾癬之發炎反應的發生，毋須IMQ處理之組別(即對照組及大豆萃取物對照組)則是以凡士林(Vaselina Pura)為載體賦形劑(vehicle cream)塗抹。上 述實驗步驟連續進行六天，每日記錄小鼠皮膚生理參數與拍照。結果顯示於圖1及圖2。

圖1是大豆萃取物於IMQ誘導小鼠模型對小鼠皮膚外觀之影響的示意圖。圖2是大豆萃取物於IMQ誘導小鼠模型對小鼠耳朵外觀之影響的示意圖。實驗結果顯示，IMQ實驗組在第三天(Day 2)時，小鼠皮膚外觀開始有發紅(redness)腫脹的現象並持續至實驗第七天(Day 6)；在實驗第四天(Day 3)開始，小鼠皮膚發紅程度更嚴重且開始有增厚(thickening)與脫屑(scaling)之現象，實驗第五天(Day 4)至第七天(Day 6)，小鼠背部皮膚皮屑更加密集厚度且皮層也持續變厚，這些都是由於角質細胞過度增生(hyperproliferation)以及白血球(leukocyte)浸潤(infiltration)到表皮層中所致；而在大豆萃取物與IMQ實驗組中，發現經過大豆萃取物預處理的小鼠皮膚在IMQ的刺激後，可以有效減緩表皮增生及其發炎之症狀，根據照片記錄可以觀察到以大豆萃取物預處理之小鼠皮膚與未經處理之IMQ小鼠相較之下，大豆萃取物確實減少小鼠背部皮屑的產生，且發紅以及皮膚增生的程度也有降低的趨勢；此外，在對照組與大豆萃取物(10mg/mL)對照組這兩個組別可以觀察到，單獨以大豆萃取物處理，不會對小鼠背部皮膚造成不良反應，小鼠背部外觀皆與控制組無差異(圖1)。除了小鼠背部皮膚之紀錄，同時也拍照紀錄了小鼠耳朵外觀之變化，大豆萃取物與IMQ之處理皆塗抹於小鼠右側耳朵，左側耳朵則不進行任何處理，作為對照組。實驗結果顯示，IMQ實驗組小鼠耳朵在實驗第二天(Day 1)開始，耳朵之血管開始有擴張之情形，實驗第三天(Day 2)開始，耳朵開始發紅腫脹至實驗第七天(Day 6)；而在大豆萃取物與IMQ實驗組則可以觀察到，經過大豆萃取物前處理的小鼠耳朵，耳朵發紅腫脹與血管擴張之情況與IMQ實驗組相較皆有緩解與改善的趨勢；而在對照組與大豆萃取物對照組也同樣可以觀察到，單獨以大豆萃取物處理，不會對小鼠耳朵產生不良影響，小鼠耳朵外觀皆與對照組無差異(圖2)。這些實驗結果皆顯示大豆萃取物確實具有抑制IMQ誘發之乾癬樣發炎反應之潛力。

實施例3. 大豆萃取物在改善小鼠IMQ誘導引起之皮膚損傷上的效用評估

在本實施例中，選用之小鼠模型及處理方式是同上面實施例2。對於乾癬患者而言，皮膚組織之屏障功能皆有異常與受損之情形，因此也被列為皮膚屏障相關疾病，因此在本發明中除了以拍照方式來觀察大豆萃取物對於 IMQ誘發發炎反應之效果外，也利用了多功能皮膚檢測系統評估小鼠皮膚表面各項生理參數之變化情形，並且以非接觸型雷射血流計來分析小鼠血流之變化。此外，每隻小鼠由於個體差異，初始生理參數並不相同，若單純根據測得之數值大小來判斷，會有誤判之情形發生，因此在本實施例中，於實驗開始前，會對每隻小鼠進行生理參數之檢測包括經皮水分散失(TEWL)、紅色素、表皮含水量(以皮膚保溼測試儀(corneometer)測量)、血流以及左右兩側耳朵之厚度等數值後始進行實驗，其後天數也同樣在每日實驗進行前先量測小鼠生理參數，並將實驗第一天(Day 0)記錄之各項生理參數值以100%為比較基準進行校正，以減少個體差異之誤差。

圖3A是大豆萃取物於IMQ誘導小鼠模型對小鼠皮膚經皮水分散失(TEWL)生理參數之影響的數據圖。由圖3A可見，IMQ實驗組在實驗第二天(Day 1)開始，量測之TEWL數值有上升之趨勢，顯示小鼠皮膚組織之屏障功能受到損傷，導致角質層水分散失，TEWL數值越高則代表角質層持水能力越差；而在大豆萃取物與IMQ實驗組則可以觀察到，小鼠的背部皮膚與耳朵經過大豆萃取物之前處理，小鼠皮膚之TEWL數值與IMQ實驗組相較有大幅度下降之趨勢，顯示大豆萃取物的處理改善了角質層水分散失的情形。圖3B是大豆萃取物於IMQ誘導小鼠模型對小鼠皮膚紅色素生理參數之影響的數據圖。圖3C是大豆萃取物於IMQ誘導小鼠模型對小鼠皮膚血流速度之影響的數據圖。由圖3B及圖3C可見，IMQ實驗組的紅色素和血流速度之數值同樣也有上升的現象，顯示小鼠的皮膚有發炎之情形，導致發炎反應相關症狀包括發紅與血管擴張促進血流速度等的發生；而由大豆萃取物與IMQ實驗組的數據可見，大豆萃取物的前處理減緩了紅色素和血流速度數值的升高，顯示發炎反應相關症狀都有緩解的作用。圖3D是大豆萃取物於IMQ誘導小鼠模型對小鼠皮膚耳朵厚度之影響的數據圖。由圖3D可見，IMQ實驗組之小鼠的右側耳朵厚度也隨著實驗天數的增加而增厚，顯示IMQ的刺激導致小鼠耳朵組織發炎腫脹且表皮層增厚；而由大豆萃取物與IMQ實驗組的數據可見，大豆萃取物的前處理改善了小鼠耳朵的發紅腫脹程度與發炎反應。圖3E是大豆萃取物於IMQ誘導小鼠模型對小鼠皮膚含水量生理參數之影響的數據圖。由圖3E可見，IMQ實驗組的小鼠皮膚含水量隨著實驗天數的增加，有逐日驟降之趨勢，表示皮膚保濕性能較差；而由大豆萃取物 與IMQ實驗組的數據可見，大豆萃取物的前處理有助於提高小鼠皮膚的保濕性能。同樣地，與前述實驗結果一致，對照組與大豆萃取物對照組之小鼠無論在TEWL、紅色素、皮膚含水量、血流速度還是耳朵之厚度皆可以觀察到，單獨以大豆萃取物處理，不會對小鼠背部皮膚或耳朵產生不良反應，小鼠背部皮膚生理參數與耳朵厚度皆趨近於對照組。本實施例的結果證實，大豆萃取物確實可改善小鼠IMQ誘導引起之皮膚損傷。

實施例4. 大豆萃取物在改善小鼠IMQ誘導引起之皮膚病理反應上的效用評估

在組織學上，乾癬具有一個決定性的外觀，就是表皮會明顯的增厚，而且由於表皮角質細胞的不正常增生，表皮的支撐架(rete)會變得細長並向下方的真皮層形成長而薄的突出，並且會有大量免疫相關細胞募集至皮膚。在本實施例中，利用蘇木素-伊紅染色(hematoxylin and eosin stain,H&E stain)法分析小鼠背部皮膚組織之變化。選用之小鼠模型及處理方式是同上面實施例2，並於實驗第七日將小鼠以過量二氧化碳(CO₂)犧牲後取下皮膚與耳朵組織，以進行後續分析。

將小鼠皮膚與耳朵組織完全浸泡在以緩衝溶液稀釋至濃度4%之多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)溶液中，置於4℃進行8~12小時的組織固定步驟，接著將組織取出並直接包埋至石蠟(paraffin)中。使用常規方法製備皮膚與耳朵之石蠟塊並進行切片厚度為5μm的連續切片，接著以蘇木素-伊紅染色法進行組織切片染色，最後使用全自動螢光細胞影像觀察系統取得組織切片H&E染色之影像。

圖4是大豆萃取物(10mg/mL)於IMQ誘導小鼠模型對小鼠皮膚組織之影響的染色圖。由圖4可見，與對照組相較，IMQ實驗組小鼠的表皮層有非常明顯增厚的現象，且有長而薄突出之支撐架，也有許多免疫細胞的聚集；而在大豆萃取物與IMQ實驗組中則是可以觀察到，雖然皮膚厚度仍然有增厚之現象，但卻未出現長而薄突出之支撐架，而免疫細胞聚集之密集度也有減少的趨勢，顯示大豆萃取物的前處理確實可以有效減少IMQ誘導小鼠背部皮膚之發炎反應，並減少免疫細胞之浸潤作用。本實施例的結果顯示，大豆萃取物有很大的潛力作為抗發炎製劑用於乾癬皮膚疾病的治療。

實施例5. 大豆萃取物對於人類表皮角質細胞無細胞毒性之效用評估

在本實施例中，利用MTT還原分析法(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay)、錐藍排除法(Trypan-blue exclusion method)以及結晶紫染色試驗(Crystal violet assay)三種技術檢測正常人類表皮角質細胞(normal human epidermal keratinocytes,NHEK)在不同濃度之大豆萃取物的處理下對其存活率之影響，以篩選最適合之作用濃度，上述三種分析方法各自透過不同原理之作用來偵測藥物對細胞存活率之影響，是最常見檢驗細胞存活率之方法。

首先，由皮膚組織分離初代表皮角質細胞(Primary human epidermal keratinocytes)，本實施例使用之人類初代表皮角質細胞(human primary epidermal keratinocytes)均從人類包皮(foreskins)檢體分離之細胞，使用之包皮檢體由馬偕紀念醫院(Mackay Memorial Hospital)提供給輔仁大學，並附有人體試驗倫理委員會(institutional review board,IRB)提供之使用同意書(同意書編號：13MMHIS022)，研究人員與檢體捐贈者無交流，且檢體不具可辨識捐贈者身分之相關訊息。取得之包皮保存於DMEM培養基中，存放於4℃環境。將皮膚組織樣品以最低必需培養基(minimum essential medium,S-MEM)清洗三次，接著以解剖器具去除皮下脂肪，並將皮膚組織剪成適當大小置於含蛋白酶(protease)之培養基中，於4~8℃下作用48小時。接著以鑷子將組織的表皮層與真皮層分開。

將分離之表皮層浸泡於DMEM中，再以震盪(vortex)方式將表皮層的角質細胞與角質層分離，最後以室溫(room temperature,RT)及轉速1100rpm條件進行離心5分鐘，接著去除上清液並加入適量含有5%胎牛腦下垂體萃取物(bovine pituitary extract,BPE)、0.0005%表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)及0.1%的抗生素-抗黴劑溶液(antibiotic-antimycotic solution,AA)之角質細胞無血清培養基(keratinocyte serum-free medium,KSFM)，均勻種於75cm²細胞培養角瓶(75T flask)中，置於條件為37℃、5% CO₂之細胞培養箱(incubator)中進行細胞培養，每48小時更換培養基，待細胞生長至80~90%飽和度時，進行細胞繼代培養。

本實施例以人類包皮組織分離之初代角質細胞進行研究，實驗中使用之細胞代數為第2~4代(second-to fourth-passage)。首先將生長80~90%飽和度之角質細胞以pH 7.4之磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffered saline,PBS)清洗兩次，加入胰蛋白酶(TrypLE Express)於細胞培養箱中作用使細胞懸浮(suspension)，接著將混合之細胞液移至離心管中，以室溫及轉速1100rpm條件進行離心5分鐘，最後再去除上清液並加入適量含有5% BPE、0.0005% EGF及0.1% AA之無血清培養基，繼代於細胞培養角瓶(75T flask)中，置於條件為37℃、5%之細胞培養箱中進行細胞培養，並每48小時更換培養基。

本實施例使用之大豆萃取物溶於無菌之ddH₂O。當細胞生長至八分滿時，始以大豆萃取物處理，配製原始濃度為1mg/mL、3mg/mL、10mg/mL及30mg/mL，接著以KSFM為溶劑作1000倍稀釋，最後將含有大豆萃取物之培養基混合液分別加入不同培養盤，對照組則加入含同體積溶劑(ddH₂O)之培養基混合液，實驗組作用濃度為1μg/mL、3μg/mL、10μg/mL及30μg/mL，於細胞培養箱中作用24小時。

本實施例使用MTT還原分析法是根據Huang,C.C.,et al.,Protective effects of (-)-epicatechin-3-gallate on UVA-induced damage in HaCaT keratinocytes.Arch Dermatol Res,2005.296(10)：p.473-81文獻敘述之步驟進行。此法用於分析細胞之存活率或增殖作用(proliferation)。MTT的全稱為3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，是一種黃色的化合物。其原理存活之細胞會透過粒線體(mitochondria)中的琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)與細胞色素C(cytochrome C)的作用，將MTT之四氮唑(tetrazolium)代謝還原，使四氮唑的環基裂開，生成不溶於水的藍紫色結晶產物甲瓚(formazan)，並沉積在細胞中，而死細胞則無此功能，再以DMSO將甲瓚溶解，此產物在吸光值為550~570nm時有最大吸收，用於測定細胞的存活率。MTT僅可作用於活細胞中，死細胞因粒線體中琥珀酸脫氫酶不具活性，無法將MTT還原成甲瓚；而藍紫色的甲瓚生成量與活細胞數目成正比關係，因此常被用於細胞存活率之測定。

將培養好之細胞懸浮於含有5% BPE、0.0005% EGF及0.1% AA之無血清培養基中均勻分散，並以每孔3 x 10⁴個細胞的數量均勻種入24孔(24 well)培養盤中培養24小時使細胞充分貼附於培養盤底，接著分別加入不同濃度大豆萃取物(1μg/mL、3μg/mL、10μg/mL及30μg/mL)混合培養基，於條件為37℃、5%之細胞培養箱中培養24小時，而後以PBS清洗一次，加入含0.5mg/mL MTT之混合培養基並於細胞培養箱中作用2~4小時，而後移除MTT試劑並加入適量DMSO溶解孔盤底部之藍紫色結晶物，接著利用酵素連結免疫吸附分析儀(enzyme linked immunosorbent assay reader,ELISA reader)以550nm之波長測定其吸光值，作為細胞存活率之檢測，檢視人類表皮角質細胞在大豆萃取物的處理下是否具細胞毒性(cytotoxicity)。

錐藍排除法的實驗流程如下：將培養好之細胞懸浮於含有5% BPE、0.0005% EGF及0.1% AA之無血清培養基中均勻分散，並以每孔3 x 10⁵個細胞的數量均勻種入6孔(6well)培養盤中培養24小時使細胞充分貼附於培養盤底，接著分別加入不同濃度大豆萃取物混合培養基，於條件為37℃、5%之細胞培養箱中培養24小時，而後以PBS清洗一次，加入TrypLE Express於細胞培養箱中作用使細胞懸浮，接著將混合之細胞液移至離心管中，以室溫及轉速1100rpm條件進行離心5分鐘，最後再去除上清液並加入無血清培養基並使細胞均勻分散，將細胞液與0.4%錐藍溶液(trypan blue solution)以1：1稀釋並混合均勻，再利用血球計數器(hemacytometer)於顯微鏡下計數存活細胞數目。

計算公式：每mL的細胞數=(4格細胞數總和/4) x 10⁴(計數盤體積) x 稀釋倍數。

結晶紫染色試驗主要用於測定細胞存活率。結晶紫是一種紫色的三苯甲烷染劑(triarylmethane dye)，主要是染細胞中的單股DNA與蛋白質，並透過分光光度儀(spectrophotometry)測量結晶紫染色之細胞的吸光值來評估藥物對細胞之毒性。

將培養好之細胞懸浮於含有5% BPE、0.0005% EGF及0.1% AA之KSFM中均勻分散，並以每孔3 x 10⁴個細胞的數量均勻種入24孔(24well)培養盤中培養24小時使細胞充分貼附於培養盤底，接著分別加入不同濃度大豆萃取物(1μg/mL、3μg/mL、10μg/mL及30μg/mL)混合培養基，於細胞培養箱中培養24小時，而後以PBS清洗一次，每個孔盤中加入500μL甲醇(methanol)於室溫進 行30分鐘之活細胞固定步驟，接著移除甲醇並風乾，並加入0.1%結晶紫染劑溶液(crystal violet staining solution)染色1小時，其後移除結晶紫溶液，再以ddH₂O清洗三次，最後於每孔加入33%醋酸(acetic acid)溶液將紫色結晶產物溶解，並利用ELISA讀取儀以550nm之波長測定其吸光值，作為細胞存活率之檢測。

圖5A是以MTT還原分析法檢測大豆萃取物於人類角質細胞之細胞存活率的數據圖。圖5B是以結晶紫染色試驗檢測大豆萃取物於人類角質細胞之細胞存活率的數據圖。圖5C是以錐藍排除法檢測大豆萃取物於人類角質細胞之細胞存活率的數據圖。由圖5A至圖5C可見，透過MTT還原分析法、結晶紫染色試驗以及錐藍排除法這三種試驗方法的檢測結果皆一致，經過不同濃度大豆萃取物處理之組別，在濃度範圍1~10μg/mL之間均不會影響NHEK的存活率，而在濃度30μg/mL下對NHEK的存活率有些微影響，顯示大豆萃取物在濃度10μg/mL以下對於NHEK不具細胞毒性，因此在後續的體外實驗中，選擇1μg/mL、3μg/mL及10μg/mL濃度之大豆萃取物作為NHEK藥物處理之作用濃度。

實施例6. 大豆萃取物抑制NHEK中TNF-α、IL-17A及IL-22誘導有絲分裂劑活化蛋白質激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途徑之磷酸化作用的效用評估

依據過去眾多的研究及臨床經驗顯示在乾癬的致病機轉中，免疫及發炎細胞所釋放出的各種細胞激素中，尤其以TNF-α、IL-17A及IL-22是當前研究認為直接作用於NHEK，同樣的，這些也是引起種種病理現象的重要細胞激素。因此本實施例探討大豆萃取物是否能夠及如何阻斷這些細胞激素在NHEK所造成下游反應及這些病生理現象。其中，MAPK訊息傳導路徑與TNF-α活化之路徑有著密切之關係，並且調節皮膚細胞中訊息路徑下游的各種反應。因此在本實施例中，調查了大豆萃取物可能參與調節的訊息傳導路徑。在NHEK加入不同濃度之大豆萃取物(1μg/mL、3μg/mL及10μg/mL)預處理24小時後，再以TNF-α(50ng．mL^-1)刺激發炎反應之誘發，並透過西方墨點轉漬法(Western blot)分析MAPK途徑中ERK、p38以及JNK等蛋白質之磷酸化反應。

本實施例利用蛋白質電泳及西方墨點轉漬法分析細胞內蛋白質表現量或蛋白質活化情形，其原理是使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)之方式，不同濃度比例之膠體，其內部細孔隨著膠體比例越高孔徑越小，藉此將不同大小分子量蛋白質分離。透過特異性抗體(antibody)與抗原(antigen)的專一性(specificity)結合，來偵測細胞、組織或體液中特定蛋白質的表現情形，這項技術結合了膠體電泳(gel electrophoresis)、抗體抗原專一性結合與酵素受質(enzyme substrate)的偵測。在本實施例中利用此技術觀察經過大豆萃取物前處理以及TNF-α、IL-17A與IL-22誘導發炎反應後，相關蛋白質之表現情形。

首先，依照實驗需求，將不同條件處理之細胞以PBS清洗後，於直徑35mm之培養皿中加入新鮮配置之放射免疫沉澱測定溶解緩衝液(radioimmunoprecipitation assay lysis buffer,RIPA lysis buffer)使細胞破解，其中含有蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)防止蛋白質被分解、磷酸酶抑制劑(phosphatase inhibitor)防止已磷酸化之蛋白質被分解及可破壞細胞膜之還原劑(detergent)，配方如下：17mM Tris-HCl,pH 7.4,50mM NaCl,5mM EDTA,1mM氟化鈉(sodium fluoride),1%曲拉通X-100(Triton X-100),1%去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate),0.1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulphate,SDS),1mM正釩酸鈉(sodium orthovanadate),1mM苯甲基磺酰氟(phenylmethane sulfonyl fluoride,PMSF),1μg/mL抑肽酶(aprotinin)及1μg/mL亮抑酶肽(leupeptin)，並置於冰上使用刮勺將細胞刮下再以超音波(sonication)進行均質化(homogenization)，接著將抽取物在4℃下以13200rpm之轉速離心10分鐘，將細胞胞器碎片及蛋白質分離後取上清液，不同樣本各取適量體積以二金雞鈉酸分析蛋白質分析套組(Bicinchoninic acid assay(BCA)protein assay kit)進行蛋白質濃度之測定與定量。不同條件處理之蛋白質樣品以最低蛋白質濃度作為基準，稀釋至相同濃度，取10~60μg胞內蛋白質加入含1.5%二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)之還原樣品緩衝液(reduce sample buffer)，置於95℃水浴加熱5分鐘，目的是透過加熱使蛋白質變性，打斷蛋白質中雙硫鍵及次級結構，使蛋白質呈現線性，蛋白質在後續電泳過程中才可依照分子量大小排列在SDS-PAGE。接著利用8~12%之SDS-聚丙烯醯胺凝膠於80伏特(volt)恆定電壓下進行電泳，將不同分子量的蛋白質分離，接著以100毫安培之電流於轉漬緩衝液(transfer buffer)(50mM Tris-HCl、40mM甘胺酸(glycine)、0.04% SDS及20%甲醇)中在4℃下將膠體上分離之蛋白質電轉漬(electroblot)至聚二氟 乙烯膜(polyvinylidene fluoride membranes,PVDF membranes)。轉漬完成後，將PVDF膜與封阻緩衝液(blocking buffer)(0.5%脫脂奶粉(skim milk powder)及Tris-緩衝鹽溶液(Tris-buffered saline)/0.05%吐溫20(tween 20)(TBS-T))於搖擺機(shaker)上室溫搖盪1小時，填塞膜上無蛋白質轉漬之孔洞，阻斷非專一性(non-specific)結合。再以TBS-T緩衝液清洗3次，每次10分鐘，接著加入1：1000比例稀釋之一級抗體(primary antibody)於室溫搖晃2小時或4℃搖盪隔夜，再以TBS-T緩衝液清洗3次，每次10分鐘，加入含有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記之二級抗體(secondary antibody)置於室溫搖盪1小時進行探針(probe)標記，最後再以TBS-T緩衝液清洗3次，每次10分鐘後於暗房(dark room)中加入增強型化學冷光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑進行呈色，試劑中含有HRP之受質會生成不穩定之過氧化中間產物，隨即分解以冷光之形式釋放能量，再使用底片感光將此連續訊號堆疊成像，以偵測特定蛋白質之表現強度。隨後將PVDF膜以再生緩衝液(stripping buffer)(62.5mM Tris-HCl,pH 6.7,2% SDS及100mM β-巰乙醇(β-mercaptoethanol))在60℃水浴槽中隔水加熱10分鐘去除膜上原鍵結之一級與二級抗體，以TBS-T緩衝液清洗後再次加入特定蛋白質之一級與二級抗體後進行特定蛋白質總量之偵測。將所偵測之蛋白質表現強度加以量化分析，藉此評估胞內訊息之傳遞路徑，探討作用之機轉。

圖6A是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內ERK磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。圖6B是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內ERK磷酸化之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有TNF-α處理之組別，黑色長條表示有處理TNF-α之組別。由圖6A及圖6B可見，單獨以不同濃度之大豆萃取物處理NHEK，不影響ERK蛋白之活化，而單獨以TNF-α處理之組別，發現ERK蛋白受到活化而有顯著的磷酸化作用產生，而這樣的磷酸化作用程度則是隨著大豆萃取物預處理之濃度越高而降低，呈現劑量依賴(dose-dependent)之關係。

圖7A是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內p38磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。圖7B是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內p38磷酸化之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有TNF-α處理之組別，黑色長條表示有處理TNF-α之組別。圖8A是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮 角質細胞內JNK磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。圖8B是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內JNK磷酸化之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有TNF-α處理之組別，黑色長條表示有處理TNF-α之組別。由圖7A至圖8B可見，單獨以大豆萃取物預處理NHEK不會造成p38和JNK蛋白的活化，而經過TNF-α的單獨處理則是會促進p38和JNK蛋白的磷酸化程度大幅度上升，並且隨著大豆萃取物預處理之濃度的增加，p38和JNK蛋白之磷酸化反應有逐漸下降之趨勢，且實驗結果也同樣呈現劑量依賴之關係，這些實驗結果說明大豆萃取物可以有效抑制TNF-α所誘導之MAPK途徑的磷酸化作用。

在IL-17A的訊息傳導路徑中，已知IL-17A的刺激會導致肌動蛋白1(Actin-1,Act1)、腫瘤壞死因子受體結合因子6(Tumor-necrosis factor receptor associated factor 6,TRAF6)募集至IL-17受體(IL-17R)，並產生TRAF6的多聚泛素化(polyubiquitination)，緊接著TAK1的多聚泛素化，因此有了以下訊息傳遞路徑的活化，包括IκB激酶(IκB kinase,IKK)/NF-κB途徑及MAPK途徑。因此在本實施例中，利用西方墨點轉漬法去評估在大豆萃取物的作用下，IL-17A所誘導MAPK包括ERK、p38及JNK的磷酸化是否受到影響，以釐清大豆萃取物在IL-17A訊息傳遞所扮演之角色。在NHEK加入不同濃度大豆萃取物(1μg/mL、3μg/mL及10μg/mL)預處理24小時後，再以IL-17A(50ng．mL^-1)刺激發炎反應之誘發，並分析相關蛋白之反應。

圖9A是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內ERK磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。圖9B是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內ERK磷酸化之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有IL-17A處理之組別，黑色長條表示有處理IL-17A之組別。由圖9A及圖9B可見，單獨以大豆萃取物處理NHEK，ERK蛋白之表現不會受到影響，而單獨以IL-17A處理NHEK，發現ERK蛋白之磷酸化作用有顯著上調，而經過大豆萃取物的預處理可以有效下調ERK之活化，且隨著大豆萃取物處理濃度越高而降低，呈現劑量依賴之關係。

圖10A是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內p38磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。圖10B是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內p38磷酸化之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有IL-17A處理之組別，黑色長條表示有處理IL-17A之組別。圖11A是大豆萃取物及IL-17A於人類初 代表皮角質細胞內JNK磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。圖11B是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內JNK磷酸化之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有IL-17A處理之組別，黑色長條表示有處理IL-17A之組別。由圖10A至圖11B可見，單獨以大豆萃取物預處理NHEK不影響p38和JNK蛋白之活化，而IL-17A的單獨處理則是會促進p38和JNK蛋白之磷酸化作用表現上升，透過大豆萃取物預處理，p38和JNK蛋白磷酸化之表現受到抑制，且隨著大豆萃取物處理濃度增加抑制效果越明顯，實驗結果也同樣呈現劑量依賴之關係。這些實驗結果顯示大豆萃取物具有能力抑制IL-17A誘導之MAPK途徑的活化。

在許多自體免疫性疾病中都可以發現IL-22的表現有異常的現象，特別是乾癬這種發炎性的皮膚疾病，乾癬患者血清中的IL-22含量會顯著高於正常對照組。此外，皮膚細胞在IL-22的刺激下會活化下游訊息傳遞分子的磷酸化，包括JAK/STAT途徑和MAPK途徑，因此本實施例評估在大豆萃取物的作用下，如何影響IL-22的分子作用機制。在NHEK加入大豆萃取物(1μg/mL、3μg/mL及10μg/mL)預處理24小時，再以IL-22(50ng．mL^-1)誘導發炎反應，並利用西方墨點轉漬法分析相關蛋白之表現。

圖12A是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內ERK磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。圖12B是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內ERK磷酸化之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有IL-22處理之組別，黑色長條表示有處理IL-22之組別。由圖12A及圖12B可見，NHEK單獨以大豆萃取物處理後，對ERK蛋白之表現無影響，而單獨以IL-22處理的組別，則是可以發現ERK蛋白有明顯的活化，在大豆萃取物的預處理的組別則可以觀察到ERK之活化作用有明顯的受到抑制，且抑制程度隨著大豆萃取物濃度越高而提升，呈現劑量依賴之關係。

此外，也同時對p38和JNK蛋白之表現進行評估。圖13A是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內p38磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。圖13B是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內p38磷酸化之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有IL-22處理之組別，黑色長條表示有處理IL-22之組別。圖14A是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內JNK磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。圖14B是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內JNK 磷酸化之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有IL-22處理之組別，黑色長條表示有處理IL-22之組別。由圖13A至圖14B可見，NHEK單獨以大豆萃取物預處理不影響p38和JNK蛋白之活化，而經過IL-22單獨處理則是會誘發p38和JNK蛋白磷酸化作用大幅度的上升，而在大豆萃取物處理，則是可以有效降低p38和JNK蛋白磷酸化之表現，且隨著大豆萃取物處理濃度增加抑制效果越明顯，實驗結果呈現劑量依賴之關係。這些實驗結果說明大豆萃取物可有效抑制IL-22誘導之MAPK途徑之上調作用。

實施例7. 大豆萃取物抑制NHEK中IL-22誘導JAK-STAT途徑之磷酸化作用的效用評估

JAK-STAT途徑是許多細胞激素和生長因子共同的經典訊息傳遞路徑，在皮膚細胞中，IL-22會啟動JAK/STAT途徑之活化，還會誘發NHEK中STAT3的活化。因此在本實施例中，評估NHEK在大豆萃取物的作用下，對於IL-22啟動之JAK/STAT途徑之機轉探討。在NHEK中加入大豆萃取物(1μg/mL、3μg/mL及10μg/mL)預處理24小時，再以IL-22誘導發炎反應，並利用西方墨點轉漬法分析STAT3與JAK2等相關蛋白之表現。

圖15A是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內STAT3磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。圖15B是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內STAT3磷酸化之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有IL-22處理之組別，黑色長條表示有處理IL-22之組別。圖16A是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內JAK2磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。圖16B是大豆萃取物及IL-22於人類初代表皮角質細胞內JAK2磷酸化之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有IL-22處理之組別，黑色長條表示有處理IL-22之組別。由圖15A至圖16B可見，單獨以大豆萃取物處理NHEK，不會活化STAT3與JAK2蛋白之表現，單獨以IL-22處理之組別則是可以發現STAT3與JAK2蛋白之磷酸化作用有顯著上調，而在大豆萃取物處理之組別則是可以有效下調STAT3與JAK2蛋白之磷酸化作用，且隨著大豆萃取物作用濃度越高而降低，呈現劑量依賴之關係。這些實驗結果說明大豆萃取物可抑制NHEK中IL-22誘導JAK-STAT途徑之磷酸化作用。

實施例8. 大豆萃取物抑制NHEK中TNF-α和IL-17A誘導IKK/NF-κB途徑之磷酸化作用的效用評估

TNF-α及IL-17A所誘發的訊息傳遞中最重要的途徑還有IKK/NF-κB途徑，此途徑會影響許多TNF-α及IL-17A所誘發之發炎細胞激素的產生。此外，由於IκB蛋白的磷酸化和降解作用(degradation)，特別是α型的異構物(IκBα)是IKK/NF-κB途徑活化作用中的關鍵蛋白，因此在本實施例中，評估在大豆萃取物前處理(1μg/mL、3μg/mL及10μg/mL)，TNF-α及IL-17A所誘導的IκBα蛋白磷酸化反應是否受到影響。

圖17A是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內IκBα磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。圖17B是大豆萃取物及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內IκBα磷酸化之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有TNF-α處理之組別，黑色長條表示有處理TNF-α之組別。圖18A是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內IκBα磷酸化之表現的西方墨點轉漬圖。圖18B是大豆萃取物及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內IκBα磷酸化之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有IL-17A處理之組別，黑色長條表示有處理IL-17A之組別。由圖17A至圖18B可見，NHEK單獨以大豆萃取物預處理不影響IκBα蛋白之磷酸化，而經過TNF-α及IL-17A各自單獨處理，發現這兩個不同細胞激素處理之組別的IκBα蛋白磷酸化表現有顯著的上升，而在經過大豆萃取物前處理的組別，則是可以觀察到高度表現之磷酸化IκBα蛋白有下調的趨勢，並且隨著大豆萃取物處理濃度增加，抑制效果越明顯，實驗結果呈現劑量依賴之關係。這些實驗結果證明大豆萃取物可以透過調節IκBα蛋白的磷酸化與降解作用來影響TNF-α與IL-17A誘導之IKK/NF-κB途徑之活化。

實施例9. 大豆萃取物抑制NHEK中TNF-α、IL-17A和IL-22誘導相關基因之mRNA表現量的效用評估

在乾癬患者的病灶中，可以發現三種抗菌胜肽蛋白(antimicrobial peptides and proteins,AMPs)有高度的表現，包括抗菌胜肽(cathelicidin)、S100蛋白(S100 proteins)和防禦素(defensins)，並且被認為在乾癬的致病機轉中扮演著重要的角色。當NHEK受到TNF-α、IL-17A和IL-22刺激會產生許多種AMPs如β-防 禦素-2(β-defensin-2)、β-防禦素-3(β-defensin-3)、乾癬素(psoriasin)和LL-37等來加重發炎反應。除此之外，當NHEK受到TNF-α、IL-17A及IL-22的刺激，會釋出趨化激素第二十型C-C類趨化因子配體蛋白(C-C Motif Chemokine Ligand 20,CCL20)去吸引更多會分泌IL-17A之各式發炎細胞進入皮膚，產生惡性循環。因此在本實施例中利用大豆萃取物預處理NHEK後，然後分別給予TNF-α、IL-17A及IL-22的刺激後，利用即時定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)分別偵測大豆萃取物是否能夠改變這些AMPs與CCL20的mRNA生成量。

RT-qPCR用來觀察細胞中mRNA的表現，此法以細胞中萃取出之RNA作為起始材料，再使用RT-qPCR法，將組織核糖核酸(total RNA)或傳訊核糖核酸(messenger RNA,mRNA)利用反轉錄酶(reverse transcriptase)轉錄成互補去氧核醣核酸(complementary DNA,cDNA)。接著以cDNA作為qPCR反應的模板(template)運用擴增原理將cDNA放大的同時並達到即時定量之結果。將細胞經過大豆萃取物前處理以及TNF-α、IL-17A和IL-22誘導發炎反應後，以PBS清洗後，使用胰蛋白酶將細胞懸浮並離心以去除上清液，接著依據總RNA分離套組(total RNA isolation kit)操作步驟萃取RNA，將收集之細胞加入Buffer RL混合均勻，再加入Buffer RA與β-巰乙醇(β-mercaptoethanol)混合液，用力搖晃後於室溫靜置5分鐘，再以16000rcf轉速度離心10分鐘，將上清液抽起並加入75%酒精再用力搖晃，將DR管柱(DR column)放到收集管(collection tube)中，取樣品混合液至DR管柱中，再以14000rcf轉速離心1分鐘，移除離心後之廢液，再將DR管柱放到新的收集管中，接著加入Buffer W1再以14000rcf轉速度離心30秒後移除廢液，再加入Buffer W2(酒精稀釋)以14000rcf轉速離心30秒，再以14000rcf轉速離心2分鐘以去除殘留之Buffer W2，最後於DR管柱中加入適量Buffer RE靜置2分鐘，再以14000rcf轉速離心2分鐘獲得胞內總RNA。核酸的吸光值波長主要在230nm、260nm和280nm，230nm為殘留之有機鹽類、260nm為核酸濃度，而280nm則是蛋白質，接著使用分光光譜儀測定吸光值，並以A_260/280之比值預估樣本中之核酸純度及濃度試算。隨後依據第一股cDNA合成套組(first-strand cDNA synthesis kit)操作步驟合成cDNA，將RNA與焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)處理水、50μM Oligo(dT)及10mM dNTP混合，於65℃中作用5分鐘，接著加入轉錄 酶反應緩衝液(transcriptase reaction buffer)、25mM MgCl₂、0.1M二硫蘇糖醇(Dithiothreitol,DTT)、40U/μL RNase抑制劑(RNase Inhibitor)及200U/μL反轉錄酶(Reverse transcriptase)進行反轉錄反應，條件為50℃作用50分鐘，85℃作用5分鐘，再將樣品至於冰上至少1分鐘，加入RNase移除殘餘RNA並於37℃作用20分鐘，即合成cDNA。接著將cDNA加入正向引子(forward primer)、反向引子(reverse primer)、螢光定量試劑(SYBR green)與DEPC處理水，正反向引子序列如表1所示；將準備好之樣品放入儀器(CFX96^TM Real-Time PCR Detection System)進行cDNA基因放大，為了讓cDNA模板打開後使DNA聚合酶(DNA polymerase)黏附並複製，作用條件如下：DNA變性(denaturation)於95℃作用3秒；引子緩冷(annealing)配對於60℃作用20秒；引子延長(extension)於95℃作用10秒，一共進行54個循環(cycles)，結束後取得樣品之循環閥值(cycles threshold,Ct)，並以管家基因(house-keeping gene)作為參考(reference)基因，最終以qPCR相對定量(Relative Quantification,RQ)法，即2^-△△CT表示細胞內基因表現量之差異。

相對定量法分析方式如下：

△Ct(目標基因)=Ct(目標基因)-Ct(參考基因)

△△Ct=△Ct(目標基因)-△Ct(對照組的目標基因)

相對定量=2^-△△CT

圖19A是大豆萃取物(10μg/mL)及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內CCL20 mRNA之表現的數據圖。圖19B是大豆萃取物(10μg/mL)及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內S100-A7 mRNA之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有TNF-α處理之組別，黑色長條表示有處理TNF-α之組別。圖19C是大豆萃取物(10μg/mL)及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內S100-A8 mRNA之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有TNF-α處理之組別，黑色長條表示有處理TNF-α之組別。圖19D是大豆萃取物(10μg/mL)及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內S100-A9 mRNA之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有TNF-α處理之組別，黑色長條表示有處理TNF-α之組別。圖19E是大豆萃取物(10μg/mL)及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內BD2 mRNA之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有TNF-α處理之組別，黑色長條表示有處理TNF-α之組別。圖19F是大豆萃取物(10μg/mL)及TNF-α於人類初代表皮角質細胞內LL-37 mRNA之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有TNF-α處理之組別，黑色長條表示有處理TNF-α之組別。圖19G是大豆萃取物(10μg/mL)及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內CCL20 mRNA之表現的數據圖，其中黑色長條表示有處理IL-17A之組別。圖19H是大豆萃取物(10μg/mL)及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內S100-A7 mRNA之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有IL-17A處理之組別，黑色長條表示有處理IL-17A之組別。圖19I是大豆萃取物(10μg/mL)及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內S100-A8 mRNA之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有IL-17A處理之組別，黑色長條表示有處理IL-17A之組別。圖19J是大豆萃取物(10μg/mL)及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內S100-A9 mRNA之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有IL-17A處理之組別，黑色長條表示有處理IL-17A之組別。圖19K是大豆萃取物(10μg/mL)及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內BD2 mRNA之表現的數據圖，其中白色長條表示沒 有IL-17A處理之組別，黑色長條表示有處理IL-17A之組別。圖19L是大豆萃取物(10μg/mL)及IL-17A於人類初代表皮角質細胞內LL-37 mRNA之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有IL-17A處理之組別，黑色長條表示有處理IL-17A之組別。圖19M是大豆萃取物(10μg/mL)及IL-22於人類初代表皮角質細胞內CCL20 mRNA之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有IL-22處理之組別，黑色長條表示有處理IL-22之組別。圖19N是大豆萃取物(10μg/mL)及IL-22於人類初代表皮角質細胞內S100-A7 mRNA之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有IL-22處理之組別，黑色長條表示有處理IL-22之組別。圖19O是大豆萃取物(10μg/mL)及IL-22於人類初代表皮角質細胞內S100-A8 mRNA之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有IL-22處理之組別，黑色長條表示有處理IL-22之組別。圖19P是大豆萃取物(10μg/mL)及IL-22於人類初代表皮角質細胞內S100-A9 mRNA之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有IL-22處理之組別，黑色長條表示有處理IL-22之組別。圖19Q是大豆萃取物(10μg/mL)及IL-22於人類初代表皮角質細胞內BD2 mRNA之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有IL-22處理之組別，黑色長條表示有處理IL-22之組別。圖19R是大豆萃取物(10μg/mL)及IL-22於人類初代表皮角質細胞內LL-37 mRNA之表現的數據圖，其中白色長條表示沒有IL-22處理之組別，黑色長條表示有處理IL-22之組別。

實驗結果顯示，NHEK分別以TNF-α(圖19A~圖19F)、IL-17A(圖19G~圖19L)及IL-22(圖19M~圖19R)誘發乾癬之發炎反應，其中相關分子包括CCL20、S100-A7、S100-A8、S100-A9、BD2和LL-37之mRNA表現量急遽上升，而在經過大豆萃取物預處理之組別則是可以觀察到mRNA表現量明顯地被抑制下來，此外在單獨以大豆萃取物處理之組別，可以觀察到這些趨化激素與抗菌胜肽蛋白之mRNA表現量不受其影響。這些實驗結果證明大豆萃取物可有效減少TNF-α、IL-17A及IL-22誘導相關基因之mRNA表現量。

綜上所述，本發明大豆萃取物可抑制MAPK途徑之磷酸化、JAK/STAT途徑之磷酸化、或IKK/NF-κB途徑之磷酸化，及CCL20基因、S100-A7基因、S100-A8基因、S100-A9基因、BD2基因、及LL-37基因的表現量。此外，本發明大豆萃取物亦藉由活體外細胞實驗及活體內動物實驗而證實確實可用來預防及/或治療發炎性皮膚疾病，例如乾癬。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

<110> 輔仁大學學校財團法人輔仁大學

<120> 大豆萃取物用於預防及/或治療發炎性皮膚疾病及抑制MAPK途徑之磷酸化、JAK/STAT途徑之磷酸化、或IKK/NF-κ B途徑之磷酸化，及CCL20基因、S100-A7基因、S100-A8基因、S100-A9基因、BD2基因、及LL-37基因的表現量的用途

<130> 107B0648-I1

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 1

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 2

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 3

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 4

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 5

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 6

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 7

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 8

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成引子

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<210> 10

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<212> DNA

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<400> 10

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

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<400> 11

<210> 12

<211> 17

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<223> 合成引子

<400> 13

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 14

Claims (15)

1. 一種大豆萃取物用於製備一預防及/或治療發炎性皮膚疾病之組成物的用途。
2. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該發炎性皮膚疾病是選自於由下列所組成的群組：異位性皮膚炎、接觸性皮膚炎以及乾癬。
3. 一種大豆萃取物用於製備一抑制有絲分裂劑活化蛋白質激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途徑之磷酸化的表現量、Janus激酶(Janus kinase,JAK)/轉錄訊息傳遞及活化子蛋白(signal transducer and activator of transcription,STAT)途徑之磷酸化的表現量、或IκB激酶(IκB kinase,IKK)/NF-κB途徑之磷酸化的表現量之組成物的用途。
4. 如申請專利範圍第3項所述的用途，其中該MAPK途徑之磷酸化是由腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、介白素-17A(interleukin-17A,IL-17A)或介白素-22(interleukin-22,IL-22)所誘導。
5. 如申請專利範圍第4項所述的用途，其中該MAPK途徑包括細胞外調節激酶(extracellular regulated kinase,ERK)、p38及c-Jun N-端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)。
6. 如申請專利範圍第3項所述的用途，其中該JAK/STAT途徑之磷酸化是由IL-22所誘導。
7. 如申請專利範圍第6項所述的用途，其中該JAK/STAT途徑包括轉錄訊息傳遞及活化子蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)及Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)。
8. 如申請專利範圍第3項所述的用途，其中該IKK/NF-κB途徑之磷酸化是由TNF-α或IL-17A所誘導。
9. 如申請專利範圍第8項所述的用途，其中該IKK/NF-κB途徑包括IκBα蛋白質。
10. 一種大豆萃取物用於製備一抑制第二十型C-C類趨化因子配體蛋白(C-C Motif Chemokine Ligand 20,CCL20)基因、蛋白質S100-A7(Protein S100-A7,S100-A7)基因、蛋白質S100-A8(Protein S100-A8,S100-A8)基因、蛋白質S100-A9(Protein S100-A9,S100-A9)基因、Beta-防禦素-2(Beta-defensin-2,BD2)基因、及LL-37基因的表現量之組成物的用途。
11. 如申請專利範圍第10項所述的用途，其中該CCL20基因、該S100-A7基因、該S100-A8基因、該S100-A9基因、該BD2基因、及該LL-37基因是由TNF-α、IL-17A或IL-22所誘導。
12. 如申請專利範圍第1項、第3項或第10項所述的用途，其中該大豆是一大豆渣。
13. 如申請專利範圍第1項、第3項或第10項所述的用途，其中該大豆萃取物之濃度為至少1μg/mL。
14. 如申請專利範圍第1項、第3項或第10項所述的用途，其中該大豆萃取物是以一溶劑萃取該大豆所獲得，該溶劑為水、醇或醇水混合物。
15. 如申請專利範圍第1項、第3項或第10項所述的用途，其中該組成物是一醫藥品、一食品產品或一保養品。

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