TW202034948A

TW202034948A - 包含減劑量之滅活脊髓灰質炎病毒之聯合疫苗組合物及其製備方法

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Publication number: TW202034948A
Application number: TW108136931A
Authority: TW
Inventors: 英德吉夏瑪; 拉凱許庫瑪; 傑格納森吉凡尼; 曼諾哈多塔潘妮; 安里席多
Original assignee: 印度商印度血清研究公司
Priority date: 2018-10-12
Filing date: 2019-10-14
Publication date: 2020-10-01
Also published as: US20210346483A1; AU2019359564A1; MX2021004233A; WO2020075184A1; UY38412A; MD20210028A2; BR112021006707A2; SG11202103622SA; AR116631A1; PE20211648A1; EP3863665A1; CA3115803A1; CO2021004556A2; CN113164577A; PH12021550812A1; CN113164577B; MD4890B1; KR20210091158A; JOP20190242A1; JP7478144B2

Abstract

本發明係關於一種包含抗原/免疫原之聯合的全液體免疫原性組合物。該免疫原性組合物包含最適量之抗原/免疫原，以賦予對多種疾病之抵抗。該組合物表現出改良之免疫原性及穩定性。亦揭示一種用於製備疫苗組合物之方法。

Description

包含減劑量之滅活脊髓灰質炎病毒之聯合疫苗組合物及其製備方法

本發明涉及生物技術領域，且更特定言之，本發明涉及一種製備包含一組抗原/免疫原及防腐劑之多劑量聯合疫苗組合物之方法。本發明進一步涉及一種聯合疫苗製造領域中之改良方法。

可提供針對多種疾病之免疫原性之聯合疫苗始終比單價疫苗更具優勢，因為其減少了注射次數、減少了與多次肌內注射相關聯之併發症、減少了管理及生產成本、減少了庫存成本、減少了疫苗接種延遲或遺漏之風險，並且藉由減少單獨之疫苗接種次數得以改良患者順從性。而且，與需要復水之聯合疫苗相比，聯合疫苗之全液體製劑具有明顯之優勢。發現全液體疫苗之平均製備時間幾乎為非全液體疫苗之一半。幾乎所有醫護人員(97.6%)表示，在日常實踐中更喜歡使用全液體疫苗。(參考：Soubeyrand B,等人; Assessment of preparation time with fully-liquid versus non-fully liquid paediatric hexavalent vaccines. A time and motion study; Vaccine 2015; 33:3976-82)。

當前已知且可用之聯合疫苗可能不包含適當免疫原性形式之適當抗原的適當製劑，以在一次注射中針對多種疾病在易感人群中實現所需位準之安全性、功效及免疫原性。僅用幾種其他抗原就可以產生之不同疫苗組合之數量是可觀的。藉由向DTwP或DTaP中添加1至4種其他抗原組分(例如HIB(凍幹或液體)、HBV、IPV、HAV)，可以生成44種可能之不同疫苗組合。如果考慮到來自不同製造商之單個組分，則數量將增加到數千個。由於必須單獨開發每個單獨之新聯合疫苗(考慮到組分根據來源之差異)，以證明安全性、穩定性、相容性及功效，因此開發所有此等疫苗成為一項艱巨任務。聯合疫苗之抗原： 白喉及破傷風抗原

白喉及破傷風係分別由白喉棒狀桿菌及破傷風梭狀芽胞桿菌引起之急性感染。在此兩種情況下，此等細菌之有效外毒素均為導致臨床疾病之原因。提供對此等細菌之防護的疫苗包含被化學修飾以形成類毒素之毒素，一種不再具有毒性但仍具有抗原性之化學修飾之毒素。白喉及破傷風毒素藉由在含有牛提取物之培養基中生長白喉棒狀桿菌及破傷風梭狀芽胞桿菌而產生。使用以下處理滅活毒素，包括加熱、UV、福馬林/甲醛、戊二醛、乙醯基乙烯亞胺等，以製備類毒素[白喉類毒素(D)及破傷風類毒素(T)]。有關牛海綿狀腦病(BSE)、傳染性海綿狀腦病(TSE)、克亞二氏病(CJD及變異性CJD疾病)之擔憂可能源於生長培養基中使用之動物組分，該培養基含有透過疫苗傳播之牛提取物。(參考：WHO Guidelines on Transmissible Spongiform Encephalopathies in relation to Biological and Pharmaceutical Products; 2003 & EMEA/CPMP/BWP/819/01; 2001年4月24日)。百日咳抗原

在1940年代引入了包含化學滅活及熱滅活之百日咳博多特氏菌之全細胞疫苗，其可大幅降低百日咳博多特氏菌引起之百日咳的發生率。

全細胞DTP疫苗通常與幾種局部不良事件(例如注射部位之紅斑、腫脹及疼痛)、發燒及其他輕度全身性事件(例如嗜睡、煩躁及厭食)相關聯(參考：Cody CL, Baraff LJ, Cherry JD, Marcy SM, Manclarck CR; The nature and rate of adverse reactions associated with DTP and DT immunization in infants and children. Paediatrics 1981; 68:650-60)及(參考：Long SS, DeForest A, Pennridge Pediatric Associates, 等人 Longitudinal study of adverse reactions following Diphtheria-tetanus-pertussis vaccine in infancy. Paediatrics 1990; 85:294-302)。在接受全細胞DTP疫苗之兒童中，更嚴重之全身性事件(例如，抽搐{伴有或不伴有發燒}及低滲低反應性發作)之發生頻率較低(1,750次施藥中一例之比例)(參考：Cody CL, Baraff LJ, Cherry JD, Marcy SM, Manclarck CR; The nature and rate of adverse reactions associated with DTP and DT immunization in infants and children. Paediatrics 1981; 68:650-60)。急性腦病之發生率甚至更低(一百萬次施藥中0-10.5例之比例)。專家確信，全細胞百日咳疫苗在某些罕見病例下會造成持久之腦損傷。(參考：Institute of Medicine; DPT vaccine and chronic nervous system dysfunction, a new analysis; Washington D.C., National Academy Press, 1994)。

有幾篇報導引證了全細胞百日咳疫苗接種、反應原性及嚴重副作用之間之關係，導致疫苗接受率下降，並且因此導致流行病再次流行(Miller, D.L., Ross, E.M., Alderslade, R., Bellman, M.H.,及Brawson, N.S.B. (1981). Pertussis immunization and serious acute neurological illness in children: Brit Med. J. 282: 1595-1599)。

全細胞百日咳(wP)相關之不良反應阻礙了其在全球範圍內之繼續使用，因此在工業化世界中，基於wP之聯合疫苗逐漸被基於無細胞百日咳之聯合疫苗所取代。

最近，已經開發確定組分之百日咳疫苗。先前已報導所有液體基於六價無細胞百日咳之疫苗(DTaP IPV PRP-T-HBsAg)(EP1028750)。

Infanrix® Hexa(GSK)係目前全球唯一銷售之包含Salk IPV的六價小兒聯合疫苗。該產品(DTaP3 -IPV-HBV//Hib)作為五價產品之預裝注射器銷售，該五價產品與凍幹之Hib抗原PRP-T接合物一起包裝在一個單獨小瓶中，在使用前用其餘疫苗復水。

第二種六價疫苗Hexyon®(亦稱為Hexacima®及Hexaxim®)係一種來自Sanofi Pasteur之全液體六價疫苗；但是，其亦具有aP。該疫苗可能針對歐洲及全球私人市場。

七價聯合疫苗正由Bharat Biotech International開發，其包含DT、無細胞百日咳、Sabin IPV(I型：40 DU，2型：8 DU，3型：32DU)、單株滅活輪狀病毒(G9菌株，即116E菌株)、與TT之乙型流感嗜血桿菌PRP接合物及重組乙型肝炎疫苗。

但是，越來越擔心無細胞百日咳(aP)疫苗之長期有效性，特別是在發展中國家中。最近報告表明，青春期對百日咳之免疫力下降，這是導致不滿六個月之嬰兒在完全接種疫苗之前病例增加之原因。據估計，在嬰兒期用aP免疫之8至12歲之兒童中，疫苗之效力為24%。在澳大利亞進行之一項觀察性研究亦顯示，嬰兒期接種aP疫苗之青少年患病率高於接種wP疫苗之青少年(相對風險為3.3，95%可信區間為2.4-4.5)。

從成本之角度觀之，歸因於製造差異及特許費成本，aP抗原歷來比wP抗原之成本高出10至30倍，因此對發展中國家構成經濟負擔。因此，基於wP之六價疫苗的成本將更適合在資源貧乏國家之公共部門使用。

因此，由於成本以及對aP疫苗之長期有效性之擔憂，尤其在發展中國家，用於發展中國家之六價疫苗中全細胞百日咳(wP)之使用已變得重要。

與最佳之全細胞百日咳(wP)疫苗相比，aP疫苗在大規模免疫接種專案中效果不佳(Vickers等人 2006; Cherry 2012)。

最近對高度免疫化群體之暴發研究表明，aP疫苗之保護時間太短(Klein等人 2012; Misegades等人 2012)，導致年齡較大之兒童及青少年之免疫力下降，並且此年齡段之病例相應地增加(Skowronski等人 2002; Klein等人 2012)。此與wP疫苗相反，後者可以在青少年時期提供良好之保護(Klein等人 2012)。由於此等缺點，在1990年代轉向aP疫苗之國家中，現在有一代兒童不僅不大能很好抵抗百日咳，而且對加強免疫之應答亦較弱，此係因為兒童接種之疫苗可能決定其對以後加強疫苗接種之免疫應答(Podda等人 1995; Mascart等人 2007; Sheridan等人 2012; Liko, Robison及Cieslak 2013; Smits等人 2013)。

導致wP反應原性之最重要因素之一係脂寡糖(LOS)之存在，脂寡糖係來自細菌外膜之內毒素。

wP疫苗中毒素之滅活可以藉由多種方法完成，但在最終產品中不應檢測到活性不耐熱之毒素。許多製造商實施之用於滅活wP毒素的全細胞百日咳(wP)整體方法使用熱處理/福馬林。一些報導引證使用硫柳汞來滅活wP。但是，使用硫柳汞會導致IPV之抗原性喪失(Vaccine 1994 第12卷第9號 851 - 856. Deleterious effect of thimerosal on the potency of inactivated poliovirus vaccine)，因此，在含有IPV之聯合疫苗的情況下，可能需要將其放在與含硫柳汞之wP分開之小瓶中，以隨時間保持其效力或改變百日咳源整體滅活。一些抗原即活性PT亦可用作免疫應答調節劑，並且已經觀察到不同疫苗之間對各種抗原之免疫應答存在顯著差異(WHO, 1993)。

根據體外或體內試驗之使用，LOS之化學提取導致內毒素含量的顯著下降(20%)以及內毒素相關毒性的劇烈下降(高達97%)。LOS提取不影響產品之完整性，更重要的是，不影響DTP之效力及/或穩定性。而且，幾乎沒有觀察到抗體及T細胞應答之任何差異。(參考：Waldely Oliveira Dias等人; An improved whole cell pertussis vaccine with reduced content of endotoxin; Human Vaccines & Immunotherapeutics 9:2, 339–348; 2012年2月)。乙型肝炎抗原

有多種肝炎病毒株。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HepB)引起的疾病，該病毒會感染人類之肝臟，並且引起稱為肝炎之炎症。對抗該疾病之疫苗含有一種病毒包膜蛋白，即乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。現在可獲得已用於大規模免疫之疫苗，例如Merck之產品RecombivaxHB®及Comvax®，Glaxo SmithKline Biologicals之Engerix-B®及Pediarix®。與HepB單抗原疫苗相比，具有乙型肝炎組分之聯合疫苗具有更高的完成率及順從性結果。(參見：Kurosky等人；Effect of Combination Vaccines on Hepatitis B Vaccine Compliance in Children in the United States；The Pediatric Infectious Disease Journal. 36(7):e189–e196, 2017年7月)。一些參考文獻引證乙型肝炎表面抗原與其他抗原之組合在磷酸鋁上之吸附。Hexavac®聯合疫苗由於乙型肝炎組分之免疫原性低而退出市場。因此，需要包含具有足夠或增強之免疫原性之乙型肝炎抗原之聯合疫苗組合物。流感嗜血桿菌 (Hib) 抗原

流感嗜血桿菌係作為上呼吸道菌群之正常部分的革蘭氏陰性球桿菌。乙型流感嗜血桿菌(Hib b)係導致兒童腦膜炎侵入性血源性感染之主要原因，亦為嬰兒出生後頭2年腦膜炎之主要原因。1987年，加拿大開始使用多糖疫苗[磷酸多核糖基核糖醇(PRP)]對流感嗜血桿菌進行免疫。Hib之磷酸多核糖基核糖醇(PRP)膠囊係生物體之主要毒力因數。抗PRP抗體係血清殺菌活性之主要貢獻者，抗體位準之提高與侵襲性疾病風險之降低有關。PRP係一種T細胞非依賴性抗原，因此具有以下特徵：a)在不到18個月大之嬰兒及兒童中誘導不良之抗體應答，b)與T細胞依賴性抗原相比，抗體應答之變化及數量上較小；c)產生更高比例之免疫球蛋白M(IgM)，以及d)無法誘導加強應答。

最初僅基於PRP組分之疫苗被證明對嬰兒無效。進一步的努力針對PRP接合疫苗，其中PRP與稱為載體蛋白之蛋白(例如腦膜炎奈瑟氏球菌、白喉類毒素、破傷風類毒素及CRM 197之外膜蛋白)接合。在聯合疫苗中包含Hib接合物組分與降低之Hib免疫原性有關。此外，Hib-接合物在水性介質中不穩定，並且無法以此種形式長時間保存。因此，流感嗜血桿菌b(Hib)之PRP多糖通常被配製成乾燥之固體，其在遞送時用其他抗原之液體製劑進行復水。例如在Infanrix® hexa(WO99/48525)中。脊髓灰質炎抗原

可以使用不同種類之疫苗： • Albert Sabin博士于1961年開發之活減毒(弱)口服脊髓灰質炎疫苗(OPV)。口服投與包含Sabin菌株之OPV。 • Jonas Salk博士于1955年開發之滅活(死)脊髓灰質炎疫苗(IPV)。包含Salk菌株之IPV作為注射劑投與。 • 最近，已經開發了注射用Sabin滅活脊髓灰質炎病毒，其藉由用福馬林滅活Salk菌株脊髓灰質炎病毒而製備，並且亦可在商業產品中獲得。

活減毒(OPV)及滅活(IPV)脊髓灰質炎疫苗兩者已有效控制全世界之脊髓灰質炎疾病。脊髓灰質炎疫苗可包含Salk或Sabin菌株。

1955年，Jonas Salk博士成功滅活了野生型脊髓灰質炎病毒，從而使其成為注射型製劑，並且將其命名為Salk菌株，該Salk菌株包括Mahoney 1型、MEF 2型及Saukett 3型，其等已用於脊髓灰質炎疾病疫苗。Sabin菌株包括Sabin1及Sabin2菌株。

脊髓灰質炎疫苗之當前可接受之標準劑量包含40 D抗原單位之1型滅活脊髓灰質炎病毒(Mahoney)，8 D抗原單位之2型滅活脊髓灰質炎病毒(MEF-1)及32 D抗原單位之3型滅活脊髓灰質炎病毒(Saukett)，例如Infanrix-hexa®(WO99/48525)。

IPV目前可作為非佐劑之獨立製劑使用，或以多種組合使用，包括DT-IPV(與白喉及破傷風類毒素一起使用)及六價IPV疫苗(與百日咳、乙型肝炎、乙型流感嗜血桿菌及佐劑一起使用)，例如Infanrix® hexa(WO99/48525)。

但是，與OPV相比，IPV之總生產成本要高得多。此主要是由於對以下之需求：(i)每劑更多病毒；(ii)額外之下游處理(即濃縮、純化及滅活)；以及相關之QC測試(iii)下游之抗原損失或低回收率及iv)容量。迄今為止，在中低收入國家，財務挑戰一直是IPV創新及實施之主要弊端。

根除脊髓灰質炎病毒後，未來全球對IPV之需求可能會從每年目前之8000萬劑增加到4.5億劑。因此，可能需要「延長」IPV供應之方法。

本申請人意外地發現，與標準劑量之IPV抗原相比，降低劑量之IPV顯示出對脊髓灰質炎之非劣效/等效抵抗。在習知疫苗之供應不足以滿足全球需求的情況下，或在習知疫苗之生產成本使疫苗無法以發展中國家可承受之價格出售的情況下，需要使用較低劑量之IPV抗原提供抗感染保護作用之低劑量有效疫苗製劑。亦需暴露於較低劑量之IPV；相比于現有之市售製劑可能更安全。因此，需要評估以更實惠之價格提供IPV之各種策略。因此，包含降低劑量之IPV之聯合疫苗可使其更便宜並且易於投與。

在大流行性流感疫苗之情況下，使用佐劑可以降低劑量，增加可獲得性並且降低疫苗成本。因此，已經推測，IPV之佐劑疫苗製劑將降低成本並且亦將增加全世界可用之IPV劑量之數量。

此外，鋁鹽已被認為是安全的，已經被用於含有IPV之聯合疫苗中，具有最低之開發障礙並且製造便宜。然而，已知鋁佐劑可顯著降低劑量。

此外，六價疫苗中存在之全細胞百日咳抗原已被證明係強大之免疫刺激劑。由於磷酸鋁佐劑及全細胞百日咳疫苗之免疫刺激作用，我們推測，在降低IPV劑量之情況下可以獲得良好之免疫應答。其他抗原

可能包含在聯合疫苗中之其他抗原為流感嗜血桿菌(a、c、d、e、f血清型及未包封之菌株)、肝炎(A、C、D、E、F及G菌株)、腦膜炎奈瑟氏球菌A、B、C、W、X、Y、流感、肺炎球菌、鏈球菌、炭疽、登革熱、瘧疾、麻疹、腮腺炎、風疹、BCG、日本腦炎、輪狀病毒、天花、黃熱、傷寒、帶狀皰疹、水痘病毒等。

聯合疫苗中使用之抗原範圍及類型取決於要使用之目標群體年齡，例如嬰兒、學步兒童、兒童、青少年及成人。可預防百日咳博多特氏菌、破傷風梭菌、白喉棒狀桿菌及視情況之滅活脊髓灰質炎病毒(IPV)及/或乙型肝炎病毒及/或乙型流感嗜血桿菌感染之最早已知之聯合疫苗是已知的(參見例如WO 93/24148、WO97/00697、WO2000/030678、WO2008/028956、US 6013264及WO2005089794)。

然而，充分證明之抗原競爭現象已經複雜化並且阻礙多價疫苗之開發。此種現象是指所觀察到的是與單獨投與時對此此等抗原之免疫應答相比，一起投與多種抗原通常會導致對某些抗原之應答減弱。

同時，多劑量疫苗應包含防腐劑，以避免被有害微生物污染。對於出口到欠發達國家之疫苗產品，考慮到要使用疫苗之國家之環境，分配方法等，含防腐劑之多劑量疫苗較佳。已使用之防腐劑之實例包括此項技術已知之氯化本索寧(Phemerol)、硫柳汞、苯酚、甲醛及2-苯氧基乙醇(2-PE)。適用於疫苗之防腐劑應該係對環境安全的，對細菌及酵母及其他真菌是有效的，並且對疫苗之免疫原性沒有負面影響。

硫柳汞係乙基汞之衍生物，已在許多疫苗中廣泛用作防腐劑。已知硫柳汞可防止污染微生物之生長並且在疫苗產品之存儲或使用方法中保持無菌狀態，許多已獲得WHO資格預審(PQ)之聯合疫苗均含有硫柳汞作為防腐劑。但是，有報導涉及某些對硫柳汞之過敏反應(約占群體之16%)，主要以延遲型局部超敏反應之形式，包括注射部位發紅及腫脹。

進一步言之，滅活脊髓灰質炎疫苗習知地使用2-PE代替硫柳汞作為防腐劑，因為已知滅活脊髓灰質炎疫苗中使用硫柳汞作為防腐劑即使在冰箱中保存亦會在一周內將疫苗效力降低50%或更多。(Vaccine 1994 第12卷第9號 851 - 856. Deleterious effect of thimerosal on the potency of inactivated poliovirus vaccine)。

聯合疫苗(包括D、T、wP、Hib、HBsAg及IPV)亦使用濃度為5 mg/mL之2-PE(WO2010046934、WO2008020322及WO2012093406)。

但是，在2-8℃下，在基於DPT之聯合疫苗中，發現2-PE比硫柳汞具有對抗酵母及真菌之較弱之抗微生物活性。藉由增加2-PE之量以滿足所需標準來提高聯合疫苗之防腐功效係一種選擇。但是，增加2PE濃度可能會在接受聯合疫苗之受試者中之幼兒中引起安全問題，從而導致在批准此類疫苗態樣存在監管障礙。

因此，藉由將2-PE與滿足安全性及管理標準之至少一種其他防腐劑組合來提高聯合疫苗之防腐效力將是有利的。可以使用的除2-PE以外之防腐劑之實例包括此項技術已知之氯化本索寧(Phemerol)、對羥基苯甲酸酯、苯酚、甲醛。

根據USP、BP及EP，發現對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、苄醇通過了抗微生物測試。此外，此等防腐劑是無毒，但有效的。對羥基苯甲酸酯之毒性相對較低，此係由於人體擺脫此等藥物之便捷性及快速性。小鼠腹膜內對羥基苯甲酸甲酯之LD50為1g/kg。尚未發現對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯之混合物可用於商業疫苗。

本申請人發現2-苯氧基乙醇及對羥基苯甲酸酯(例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯)之混合物的防腐效果比單獨之2-苯氧基乙醇更有效。

進一步言之，本申請人發現聯合疫苗組合物中正確形式之抗原之免疫原性、反應原性、穩定性及維持取決於組合物之配製方式，其包括： a)製作單個抗原之方法 b)抗原添加順序 c)對於某些抗原，使用特定量之特定佐劑， d)抗原在佐劑上之單獨吸附或聯合吸附，其中聯合吸附以易於操作之形式具有其優點，並且缺點包括其中第一預吸附抗原在添加後續抗原期間可能部分或完全解吸附。由於先前之抗原可能會飽及吸附能力，因此最後一步添加之抗原可能不會被完全吸附。弱吸附之抗原在儲存時可能會解吸。 e)抗原在佐劑上之吸附程度 f)使用最低明礬濃度 g)使用最佳濃度及類型之防腐劑 h)使用各種參數，包括攪拌、溫度及pH。目的

文中至少一個實施例滿足之本發明之一些目的如下：

本發明之一個目的係改良現有技術之一或多個問題或至少提供有用之替代方案。

本發明之另一個目的係提供一種全液體聯合疫苗，其適合於防止及預防由白喉、破傷風、百日咳、脊髓灰質炎、流感嗜血桿菌及乙型肝炎引起之感染，或防止、改良或延遲其臨床表現之發作或進展。

本發明之又另一個目的係提供一種包含各種減劑量之滅活脊髓灰質炎病毒(IPV)抗原之全液體聯合疫苗，與標準劑量之IPV抗原相比，該疫苗顯示出對脊髓灰質炎之非劣效/等效抵抗。

本發明之又另一個目的係提供一種包含至少一種對羥基苯甲酸酯即對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯防腐劑及2-苯氧基乙醇(2-PE)之全液體聯合疫苗，以提高多劑量聯合疫苗之防腐效力。

本發明之又另一個目的係提供一種製造此種聯合疫苗之組合物/製劑之改良方法，其中該疫苗顯示出改良之免疫原性，降低之反應原性，改良之穩定性並且進一步滿足每種所述免疫原性組分之血清保護的標準。

藉由下面之描述，本發明之其他目的及優點將變得更加顯而易見，而無意於限制本發明之範圍。

一種聯合疫苗組合物，其包含減劑量之滅活脊髓灰質炎病毒(IPV)抗原與其他抗原/免疫原及作為防腐劑之至少一種對羥基苯甲酸酯(即對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯)及2-苯氧基乙醇(2-PE)組合，其中改良了多劑量聯合疫苗之防腐效力及其製備方法。

本發明涉及一種聯合疫苗組合物，其包含以下： a)使用半合成培養基生產之高純度白喉類毒素(D)及破傷風類毒素(T)，隨後進行解毒並且分別吸附在磷酸鋁佐劑上，從而提高免疫原性 b)使用熱及化學滅活之組合製備之滅活全細胞百日咳博多特氏菌(wP)組分，特定百日咳博多特氏菌菌株具有特定比例，從而導致降低之反應原性並且提高之效力。 c)與載體蛋白(CP)接合之乙型流感嗜血桿菌(Hib)莢膜多糖抗原(PRP) d)減劑量之Salk或Sabin(滅活脊髓灰質炎病毒)IPV，其表現出與藉由使用改良之甲醛滅活方法及視情況吸附到磷酸鋁佐劑上製備之標準劑量相比相當之功效。 e)單獨吸附到磷酸鋁佐劑上從而導致增強之免疫原性之乙型肝炎(HepB)表面抗原 f)最低明礬含量，從而確保降低之反應原性 g)除2-苯氧基乙醇(2-PE)以外之至少一種對羥基苯甲酸酯(即對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯)作為防腐劑。

儘管本發明可能易於受到不同實施例之影響，但是在以下詳細討論中展示某些實施例，應理解，本發明可以被認為是本發明原理之示例，並且不旨在將本發明之範圍限制為本說明書中說明及揭示之內容。提供實施例以便將本發明之範圍充分並且完全地傳達給熟悉此項技術者。闡述了與特定組分及方法有關之許多細節，以提供對本發明之實施例之完整理解。對於熟悉此項技術者將顯而易見的是，實施例中提供之細節不應被解釋為限制本發明之範圍。在一些實施例中，未詳細描述悉知組合物，悉知方法及悉知技術。

在本發明中，所使用之術語僅出於解釋特定實施例之目的，並且此種術語不應被認為限制本發明之範圍。如本發明中所使用，除非上下文另外明確指出，否則形式「一(a)/(an)」及「該”」亦可意圖包括複數形式。

術語第一、第二、第三等不應解釋為限制本發明之範圍，因為上述術語僅可用於區分一個元件、組分、區域、層或部分與另一組分、區域、層或部分。除非本發明明確提出，否則本文中使用之諸如第一、第二、第三等之術語並且不暗示特定之順序或次序。本發明提供了一種免疫原性組合物及其製備方法。

術語「疫苗」”視情況可用術語「免疫原性組合物」代替，反之亦然。

「D抗原單位」(亦稱為「國際單位」或IU)：脊髓灰質炎病毒之D抗原形式誘導保護性中和抗體。本文所指之D抗原單位(例如在本發明之疫苗中)係在配製最終疫苗之前添加到每個人劑量之配製疫苗中(通常為0.5mL最終體積)之每種未吸附之大量IPV抗原類型之測得的總D抗原單位。測量D-抗原單位之可靠方法在此項技術中是眾所周知的，並且例如由歐洲藥典揭示。例如，可使用以下實例1(「藉由ELISA進行D抗原定量」)中所述之ELISA試驗來測量D抗原單位。歐洲藥典提供了測試樣品(歐洲藥典生物學參考製劑，可從歐洲藥典秘書處獲得，例如代碼P 216 0000)，以在製造商之間標準化此類方法(Pharmeuropa Special Issue, Bio 96-2)。因此，D抗原單位值在此項技術中係眾所周知的。

本文中之術語「劑量」通常係本發明疫苗之一次投與，通常係一次注射。典型人劑量為0.5mL。當然，可在疫苗投與時間表中投與各種劑量。

術語「IPV」或本文中包含此等組分之免疫原性組合物旨在表示滅活脊髓灰質炎病毒1型(例如Mahoney，較佳使用)、2型(例如MEF-1)或3型(例如Saukett)、或者此等類型中任兩種或所有三種之Sabin血清型1、2、3組合。出於本發明目的之全劑量(或標準劑量)(分別為基於Salk之1、2及3型IPV之40-8-32 D個抗原單位)IPV免疫原性組合物之實例可為Poliovac®(Serum Institute of India Pvt. Ltd.)。因此，在本文中指出，與標準劑量之基於Salk之IPV相比，本發明之免疫原性組合物中減少(降低)一、二、三倍劑量，此係指在該疫苗之每個劑量中配製之D-抗原單位分別等於1、2及/或3型IPV之40、8及/或32個D抗原單元之劑量之X%減少(如在每種大量IPV抗原類型中所測量的)。

在整個說明書中，術語「糖」可表示多糖或寡糖，並且包括兩者。莢膜糖抗原可為全長多糖，或可擴展到細菌「大小糖」及「寡糖」(其天然具有少量之重複單元，或者其係為了便於處理而尺寸減小之多糖，但仍然能夠在宿主中誘導保護性免疫應答。

根據本發明之第一實施例，聯合疫苗組合物包含選自但不限於以下之抗原/免疫原組：白喉類毒素(D)、破傷風類毒素(T)、全細胞百日咳博多特氏菌(wP)、乙型流感嗜血桿菌(Hib)PRP-CP接合物、乙型肝炎(HepB)、減劑量之滅活脊髓灰質炎病毒(IPV)，並且進一步包含2-苯氧基乙醇及至少一種對羥基苯甲酸酯防腐劑之組合。

根據本發明之第二實施例，聯合疫苗組合物可進一步包含一或多種分別選自由以下組成但不限於以下之群組之抗原：流感嗜血桿菌(a、c、d、e、f血清型及未包封之菌株)、肝炎(A、C、D、E、F及G菌株)、腦膜炎奈瑟氏球菌A、B、C、Y、W-135或X、流感、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門桿菌抗原、無細胞百日咳抗原、修飾之腺苷酸環化酶、瘧疾抗原(RTS、S)、肺炎球菌、鏈球菌、炭疽、登革熱、瘧疾、麻疹、腮腺炎、風疹、BCG、人類乳突病毒、日本腦炎、登革熱、寨卡、埃博拉、屈公、輪狀病毒、天花、黃熱病、黃病毒、帶狀皰疹、水痘病毒抗原。

根據本發明之第三實施例，在聯合疫苗組合物中使用之IPV菌株包括選自1型、2型及3型群組之滅活Sabin菌株或選自1型Mahoney、2型MEF及3型Saukett群組之滅活Salk菌株。

在第三實施例之一個態樣中，脊髓灰質炎病毒可藉由以下方法生長： • CCL81-VERO(猴腎)細胞用作脊髓灰質炎病毒(即Sabin及Salk菌株)生長之宿主細胞。 • 用所需之脊髓灰質炎病菌株感染宿主細胞並且孵育72小時後，將含有病毒及細胞碎片之培養基彙集並且收集在單個容器中。 • 用100 KDa濾筒對濾液進行切向流過濾；用磷酸鹽緩衝液滲濾，並且用陰離子交換色譜純化。 • 在投與給患者之前，必須使用適當之滅活方法將病毒滅活。

然而，本發明人意外地發現，甲醛滅活後D-抗原之高百分比損失可能是由於磷酸鹽緩衝液之存在，其意外地導致脊髓灰質炎病毒顆粒之不期望聚集。

因此，本發明之一個重要態樣包括一種福馬林滅活之改良方法，其包括以下步驟： a) 純化之病毒池在pH為7至7.5之(30至50 mM)範圍內從磷酸鹽緩衝液緩衝交換為Tris緩衝液， b) 向上述混合物中加入含甘氨酸(5 gm/l)之M-199培養基 c) 加入0.025%甲醛，然後混合， d) 隨後將混合物在37℃下孵育5至13天，同時在磁力攪拌器上連續攪拌病毒塊， e) 在第7天將孵育後之混合物置於中間TFF系統(100 KDa，0.1 m² )中，滅活後進行最終過濾 f) 隨後將過濾後之物料儲存在2-8℃下， g) 進行D-Ag ELISA用以D-Ag單位測定

根據本發明之第四實施例，在聯合疫苗組合物中使用之IPV菌株包括劑量減少之選自1型、2型及3型群組之滅活Sabin菌株或選自1型Mahoney、2型MEF及3型Saukett群組之滅活Salk菌株。

根據本發明之第五實施例，IPV(Sabin或Salk菌株)可不單獨吸附到任何佐劑上，然後添加到最終之聯合疫苗組合物中。

根據第五實施例之一較佳態樣，IPV(Sabin或Salk菌株)可吸附在佐劑上，更佳地存在于聯合疫苗中之磷酸鋁鹽或氫氧化鋁鹽，其中IPV抗原對1型IPV之吸附百分比可在10%-30%之範圍內，2型IPV可在60%-100%之範圍內，而3型IPV可在0%-25%之範圍內。

根據本發明之第六實施例，一或多種IPV(Sabin或Salk菌株)組分可單獨地吸附在選自以下群組之佐劑上：鋁鹽(Al³ +)，例如氫氧化鋁(Al(OH)₃ )或磷酸鋁(AlPO₄ )、明礬、磷酸鈣、MPLA、3D-MPL、QS21、含CpG之寡去氧核苷酸佐劑、脂質體或水包油乳劑或其組合。(例如在與其他組分(如果存在)混合之前或之後)。如果被吸附，則一或多種IPV組分可單獨或作為混合物一起吸附在氫氧化鋁(Al(OH)₃ )或磷酸鋁上。

IPV(Sabin或Salk菌株)組分可藉由以下步驟吸附在鋁鹽上： • 取所需體積之高壓滅菌之Al(PO)₄ 或Al(OH)₃ ，以在50 ml容器中獲得之最終明礬(Al³ +)濃度在0.1至0.8 mg/劑量之間 • 添加具有調整後之D-Ag單位之IPV塊，並且用稀釋劑(10x M-199 + 0.5%甘氨酸)補足體積， • 調整最終製劑之pH，並且獲得pH在6-7.5之間之最終製劑。

在第六實施例之一態樣中，福馬林滅活之IPV之吸附可在濃度選自每種血清型0.1 mg/劑量、0.2 mg/劑量、0.3 mg/劑量、0.4 mg/劑量、0.5 mg/劑量、0.6 mg/劑量、0.7 mg/劑量及0.8 mg/劑量，較佳地0.1 mg/劑量至1.25 mg/劑量之明礬(Al³ +)上，且在選自6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7及6.8，較佳地6.5之pH下進行。

在第六實施例之又另一態樣中，在Tris存在下福馬林滅活後D-抗原之回收百分比可為50%、60%、70%或80%，並且磷酸鋁吸附後之吸附百分比可在70%至80%、80%至90%或90%至99%或95%至99%之間。

根據本發明之第七實施例，分別從白喉棒狀桿菌及破傷風梭狀芽胞桿菌獲得白喉毒素(外毒素)及破傷風毒素(外毒素)，然後使用合適之滅活方法將其解毒。如此獲得之白喉類毒素(D)及破傷風類毒素(T)可使用凝膠過濾色譜法純化。由此獲得之純化之DT進一步用於配製聯合疫苗。

在第七實施例之一個態樣中，白喉毒素藉由在半合成培養基中生長白喉棒狀桿菌而產生，該半合成培養基由以下成分在最優濃度下以以下任意聯合組成：聯合1：

酪蛋白水解物、一水合麥芽糖、冰醋酸、乳酸鈉、硫酸鎂、β-丙氨酸、庚二酸、煙酸、硫酸銅、硫酸鋅、氯化錳、L-胱氨酸、氯化鈣二水合物、正磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵及WFI。聯合2：

酪蛋白水解物、一水合麥芽糖、冰醋酸、乳酸鈉、硫酸鎂、ß-丙氨酸、庚二酸、煙酸、氯化錳、L-胱氨酸、氯化鈣二水合物、正磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵及WFI。聯合3：

酪蛋白水解物、一水合麥芽糖、冰醋酸、乳酸鈉、ß-丙氨酸、庚二酸、煙酸、硫酸銅、硫酸鋅、氯化錳、L-胱氨酸、氯化鈣二水合物、正磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀及WFI。聯合4：

酵母提取物、一水合麥芽糖、冰醋酸、乳酸鈉、硫酸鎂、ß-丙氨酸、庚二酸、煙酸、硫酸銅、硫酸鋅、氯化錳、L-胱氨酸、氯化鈣二水合物、正磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵及WFI。

根據第七實施例之第二態樣，破傷風毒素藉由在半合成培養基中生長破傷風梭狀芽胞桿菌而產生，該半合成培養基由以下成分在最優濃度下以以下任意聯合組成：聯合1：

酪蛋白消化液、氯化鈣、磷酸氫二鉀、無水葡萄糖、氯化鈉、硫酸鎂、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆辛、泛酸鈣、煙酸、L-胱氨酸、氯化鐵、維生素B12溶液、生物素、濃HCl、NaOH、無水乙醇及WFI 聯合2：

酪蛋白消化液、氯化鈣、β-丙氨酸、磷酸氫二鉀、無水葡萄糖、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸亞鐵、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆辛、泛酸鈣、煙酸、L-胱氨酸、氯化鐵、維生素B12溶液、生物素、濃HCl、NaOH、無水乙醇及WFI 聯合3：

酪蛋白消化液、氯化鈣、磷酸氫二鉀、無水葡萄糖、氯化鈉、硫酸鋅、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆辛、泛酸鈣、煙酸、L-胱氨酸、氯化鐵、維生素B12溶液、生物素、濃HCl、NaOH、無水乙醇及WFI 聯合4：

酪蛋白水解物、氯化鈣、磷酸氫二鉀、無水葡萄糖、氯化鈉、硫酸鎂、氯化錳、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆辛、泛酸鈣、煙酸、L-胱氨酸、氯化鐵、維生素B12溶液、生物素、濃HCl、NaOH、無水乙醇及WFI

在第七實施例之又另一個態樣中，使用以下滅活方法中之一種或組合對白喉及破傷風毒素進行解毒，該滅活方法包括加熱、UV、福馬林/甲醛、乙醯基乙烯亞胺等。

根據本發明之第八實施例，在聯合疫苗組合物中使用之肝炎(Hep)抗原包含源自乙型肝炎菌株表面之肝炎抗原(HBsAg)。

在第九實施例之一態樣中，可藉由以下方法中之一種製備HBsAg： • 藉由從慢性乙型肝炎攜帶者血漿中純化顆粒形式之抗原，因為大量HBsAg在肝臟中合成並且在HBV感染期間釋放到血流中 • 藉由重組DNA方法表達蛋白質

根據本發明之第九實施例，白喉類毒素(D)、破傷風類毒素(T)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)單獨吸附在選自以下之群組之佐劑上：鋁鹽(Al³⁺ )，例如氫氧化鋁(Al(OH)₃ )或磷酸鋁(AlPO₄ )、明礬、磷酸鈣、MPLA、3D-MPL、QS21、含CpG之寡去氧核苷酸佐劑、脂質體或水包油乳劑或其組合。

仍較佳地，白喉類毒素(D)、破傷風類毒素(T)及乙型肝炎表面抗原(HBsAg)單獨吸附在磷酸鋁上。

在第九實施例之一態樣中，吸附在磷酸鋁上之白喉類毒素(D)抗原具有至少50%之吸附百分比。

在第九實施例之另一態樣中，吸附在磷酸鋁上之破傷風類毒素(T)抗原具有至少40%之吸附百分比。

在第九實施例之又另一態樣中，吸附在磷酸鋁上之乙型肝炎表面抗原(HBsAg)具有至少70%之吸附百分比。

根據本發明之第十實施例，在本發明之聯合疫苗中使用之Hib抗原衍生自乙型流感嗜血桿菌(Hib)菌株760705之莢膜多糖。

根據第十實施例之一個態樣，Hib PRP抗原與選自由以下組成但不限於以下之載體蛋白群組之載體蛋白接合：CRM197、白喉類毒素、腦膜炎奈瑟氏球菌外膜複合物、破傷風類毒素之片段C、百日咳類毒素、流感嗜血桿菌之蛋白D、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST及銅綠假單胞菌之外毒素A、外膜複合物c(OMPC)、孔蛋白、轉鐵蛋白結合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌表面黏附素A(PsaA)、肺炎球菌PhtD、肺炎球菌表面蛋白BVH-3及BVH-11、炭疽芽胞桿菌之保護性抗原(PA)及炭疽芽胞桿菌之解毒浮腫因數(EF)及致死因數(LF)、卵清蛋白、鑰孔戚血藍蛋白(KLH)、人血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)及結核菌素之純化蛋白衍生物(PPD)、合成肽、熱休克蛋白、百日咳蛋白、細胞因數、淋巴因數、激素、生長因數、包含來自多種病原體衍生抗原例如N19之多種人CD4+T細胞表位之人造蛋白、鐵攝取蛋白、來自艱難梭菌及無乳鏈球菌蛋白之毒素A或B。

亦較佳地，Hib PRP與破傷風類毒素(TT)藉由以下接合：CNBr化學、還原胺化化學、氰基化化學或已經在New York: Marcel Dekker, 1994: 37-69，Kniskern等人之「Conjugation: design, chemistry, and analysis」，以及Ellis等人之「Development and clinical uses of Haemophilus influenzae type B conjugate vaccines」中之揭示之任何其他化學。

根據第十實施例之第二態樣，載體蛋白以游離形式及接合形式存在於本發明之組合物中，未接合形式較佳地不超過組合物中載體蛋白作為整體之總量之20%，更佳地小於5重量%。

根據第十實施例之第三態樣，Hib抗原基本上不吸附在任何佐劑上。

根據第十實施例之第四態樣，Hib抗原可不故意或有意地吸附在任何佐劑上。

根據第十實施例之第五態樣，Hib抗原在任何佐劑上之吸附百分比小於20%。

根據本發明之第十一實施例，用於本發明之聯合疫苗組合物中之全細胞百日咳(wP)抗原製劑較佳地由百日咳博多特氏菌菌株134、509、25525及6229按特定比例混合並且隨後藉由利用沒有硫柳汞之改良之滅活方法進行滅活，因此導致反應原性降低及效力增加而製成，並且wP抗原可或可不吸附在鋁基佐劑上。

根據第十一實施例之一態樣中，用於本發明之聯合疫苗組合物中之全細胞百日咳(wP)抗原製劑較佳地由百日咳博多特氏菌菌株134、509、25525及6229按1:1:0.25:0.25之比例混合而製成。

根據第十一實施例之第二態樣，使用以下滅活處理中之一或多種對聯合疫苗組合物中使用之全細胞百日咳(wP)抗原製劑進行滅活，該滅活處理包括加熱、UV、福馬林/甲醛、乙醯基乙烯亞胺等。

仍較佳地，使用熱處理及化學處理之組合對聯合疫苗組合物中使用之全細胞百日咳(wP)抗原製劑進行滅活。仍較佳地，在甲醛存在下在56±2℃下加熱滅活10至15分鐘，其中wP塊保持不結塊且易於均質化，從而導致反應原性降低並且在更長之時間內提供更好之wP效力。

根據第十一實施例之第三態樣，聯合疫苗組合物中使用之全細胞百日咳(wP)抗原製劑可或可不吸附在鋁基佐劑上，如氫氧化鋁、磷酸鋁或其組合(例如在與其他組分(如果存在)混合之前或之後)。如果被吸附，則一或多種wP菌株(即134、509、25525及6229)可單獨或作為混合物一起被吸附。

根據本發明之第十二實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第十三實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第十四實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第十五實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第十六實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第十七實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第十八實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第十九實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第二十實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第二十一實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第二十二實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第二十三實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第二十四實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第二十五實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第二十六實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第二十七實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第二十八實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第二十九實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第三十實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第三十一實施例，多劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第三十二實施例，最終單劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第三十三實施例，最終單劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第三十四實施例，最終單劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

根據本發明之第三十五實施例，最終單劑量聯合疫苗組合物/製劑包括：

NMT-不多於

根據本發明之第三十六實施例，最終聯合疫苗組合物之一或多種抗原可基本上不吸附在任何佐劑上。

根據本發明之第三十七實施例，免疫原性組合物之pH可在pH 6.0至pH 8.0之範圍內；更佳地在pH 6.0至pH 7.5之範圍內；仍更佳地在pH 6.2至pH 7.2之範圍內；最佳地在pH 6.3至pH 6.8之範圍內。

根據本發明之第三十八實施例，免疫原性組合物可另外包含選自由碳酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、葡萄糖酸鹽及酒石酸鹽組成之群組的緩衝劑，以及包括磷酸鹽緩衝劑之更複雜的有機緩衝劑，該磷酸鹽緩衝劑包含磷酸鈉及/或磷酸鉀，其比例經選擇以達到所需pH。在另一個實例中，緩衝劑含有經配製以達到所需pH之Tris(羥甲基)氨基甲烷或「Tris」。亦在另一個實例中，緩衝劑可為含漢克斯鹽之最低必需培養基。本發明亦設想了其他緩衝劑，例如HEPES、呱嗪-N, N'-雙(PIPES)及2-乙磺酸(MES)。緩衝劑有助於穩定本發明之免疫原性組合物。緩衝劑之量可在0.1 mM至100 mM之範圍內，較佳地選自5 mM、6 mM、7 mM、22 mM、23 mM、24 mM、25 mM、26 mM、27 mM、28 mM、29 mM及30 mM。

實施例之又另一態樣，免疫原性組合物可另外包含選自由表面活性劑、聚合物及鹽組成之群組之藥學上可接受之賦形劑。表面活性劑之實例可包括非離子表面活性劑，例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80等。聚合物之實例可包括聚葡萄糖、羧甲基纖維素、透明質酸、環糊精等。鹽之實例可包括NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4.2H2O、CaCl2、MgCl2等。較佳地，鹽可為NaCl。通常，鹽之量可在100 mM至200 mM之範圍內。

可添加氨基酸例如組氨酸、甘氨酸、精氨酸及賴氨酸以使免疫原性組合物穩定。

根據本發明之第三十九實施例，免疫原性組合物可另外包含一或多種選自鋁鹽(Al³⁺ )，例如氫氧化鋁(Al(OH)₃ )或磷酸鋁(AlPO₄ )、明礬、磷酸鈣、MPLA、3D-MPL、QS21、含CpG之寡去氧核苷酸佐劑、脂質體或水包油乳液之群組之佐劑。

仍較佳地，組合物包含磷酸鋁(AlPO₄ )作為佐劑。

仍較佳地，組合物包含氫氧化鋁(AlOH₃ )作為佐劑。

在第三十九實施例之一態樣中，最終製劑之抗原可被吸附在原位磷酸鋁凝膠或現成磷酸鋁凝膠或其組合上。

在第三十九實施例之一個較佳態樣中，本發明之組合物可包含2.5 mg/0.5 ml或更少之量，特別為1.5 mg/0.5 ml至0.1mg/0.5 ml之量之佐劑。

根據本發明之第四十實施例，免疫原性組合物可另外包含選自由以下組成之群組之免疫刺激組分：油及水乳液、MF-59、脂質體、脂多糖、皂素、脂質A、脂質A衍生物、單磷醯脂質A、3-脫醯基單磷醯脂質A、AS01、AS03、寡核苷酸、包含至少一種未甲基化CpG及/或脂質體之寡核苷酸、弗氏佐劑、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、聚合物、共聚物例如聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，包括嵌段共聚物、聚合物p 1005、CRL-8300佐劑、胞壁醯二肽、TLR-4激動劑、鞭毛蛋白、衍生自革蘭氏陰性細菌之鞭毛蛋白、TLR-5激動劑、能夠結合TLR-5受體之鞭毛蛋白之片段、α-C-半乳糖苷基神經醯胺、殼聚糖、介白素-2、QS-21、ISCOMS、鯊烯混合物(SAF-1)、Quil A、霍亂毒素B亞基、聚磷腈及衍生物、分枝桿菌細胞壁製劑、黴菌酸衍生物、非離子嵌段共聚物表面活性劑、OMV、fHbp、皂素與固醇及脂質之組合。

根據本發明之第四十一實施例，免疫原性組合物可另外包含選自由氯化本索寧(Phemerol)、苯酚、間甲酚、硫柳汞、甲醛、氯化苯銨、苄醇、氯丁醇、對氯間甲酚、或苯甲醇或其組合組成之群組之防腐劑。疫苗組合物可包含用於單次免疫之防腐劑，或可包含用於多次免疫之防腐劑(即「多劑量」試劑盒)。防腐劑以多劑量佈置之包含較佳。作為在多劑量組合物中包含防腐劑之替代方案(或除此之外)，可將組合物容納在具有用於去除材料之無菌適配器之容器中。通常，防腐劑之量可在0.1 mg至50 mg之範圍內。

根據本發明之第四十二實施例，根據投與途徑及所需製劑，免疫原性組合物可另外包含輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、膠凝劑或增黏劑、調味劑、色素等。

根據本發明之第四十三實施例，免疫原性組合物可為全液體的，但不限於此。液體製劑之適宜形式可包括緩衝至所需pH之溶液、懸浮液、乳劑、糖漿、等滲水溶液、黏性組合物及酏劑。

本發明之免疫原性組合物可為透皮製劑之形式，包括洗劑、凝膠、噴霧劑、軟膏或其他適宜技術。如果需要鼻腔或呼吸道(黏膜)投與(例如，氣溶膠吸入或吹入)，則組合物可為一定形式，並且藉由擠壓噴霧分配器、泵分配器或氣溶膠分配器進行分配。氣溶膠通常在壓力下借助於烴。泵分配器可較佳地分配計量劑量或具有特定粒徑之劑量。當以溶液、懸浮液及凝膠形式時，在一些實施例中，免疫原性組合物除了活性成分亦包含大量水(較佳為純淨水)。

根據本發明之第四十四實施例，該聯合疫苗可在2-8℃下穩定12至36個月；在25℃下穩定2至6個月；在37℃下穩定1周至4周。

根據本發明之第四十五實施例，免疫原性組合物可配製成用於減少包括以下之健康狀況之發作或進行預防之方法：白喉、破傷風、百日咳、乙型肝炎病毒、乙型流感嗜血桿菌、脊髓灰質炎病毒感染，該方法涉及經由腸胃外或皮下或皮內、肌肉內或腹膜內或靜脈內投與或注射投與或從植入物中持續釋放或藉由滴眼液投與或鼻腔或直腸或頰或陰道、經口或胃內或黏膜或經舌、肺泡或牙齦或嗅覺或呼吸道黏膜投與或任何其他免疫途徑，向人受試者投與免疫有效量之免疫原性組合物。

根據本發明之第四十六實施例，免疫原性組合物可配製成單劑量小瓶或多劑量小瓶(2劑量或5劑量或10劑量小瓶)或多劑量試劑盒或預填充之注射器，其中該免疫原性組合物可在單劑量方案中給予，或較佳地多劑量方案，其中在主要疫苗接種方法之後，如果需要，在1-3年後以後續時間間隔給予1-3個獨立劑量。劑量方案亦將至少部分地根據對賦予保護性免疫所需之加強劑量之需要來確定。

仍較佳地，根據包括第一劑量及在1-3年後以後續時間間隔給予第二劑量之兩劑量方案，免疫原性組合物可配製成投與給2歲或以下之人受試者或兒童。

仍較佳地，免疫原性組合物可與其他藥物或任何其他疫苗同時投與。

根據本發明之第四十七實施例，申請人發現，考慮到：i)製備單個抗原之方法，ii)添加抗原之順序，iii)對某些抗原使用特定量之特定佐劑，iv)抗原在佐劑上之單獨吸附或組合吸附，v)抗原在佐劑上之吸附程度，vi)使用最低明礬濃度，vii)使用最佳濃度及類型之防腐劑，以及viii)使用各種參數，包括攪拌、溫度及pH，當藉由以下揭示之方法製造疫苗時，可得到具有改良之免疫原性及降低之反應原性之多劑量全液體聯合疫苗。SIIPL 聯合疫苗中使用之菌株之生物來源： 白喉類毒素：

白喉棒狀桿菌PW8 CN2000菌株由印度Himachal Pradesh，Kasauli國家控制局中央研究所(C.R.I.)從英國倫敦惠康研究實驗室於1973年以凍幹形式獲得。將該菌株在C.R.I. Kasauli處在主種子批-白喉棒狀桿菌CN2000 A1下復活並且進一步凍幹。破傷風類毒素：

破傷風梭狀芽胞桿菌哈佛菌株49205菌株係由國家控制局C.R.I Kasauli從裡克斯沃爾克斯格宗海德研究所(荷蘭)以凍幹形式獲得的。百日咳：

在SIIPL製造百日咳疫苗需要使用四種百日咳博多特氏菌菌株134、509、6229及25525。菌株134及509之主種子來自荷蘭之裡克斯研究所，由印度Himachal Pradesh，Kasauli國家控制局中央研究所獲得。菌株6229及25525之主種子來自英格蘭之李斯特研究所。乙型肝炎：

萊茵生物技術公司(德國)構建了含有HBsAg表面抗原基因之重組漢遜酵母菌株。萊茵生物技術公司亦製作了主細胞庫(MCB漢遜酵母K3/8-1菌株ADW，12/94)，並且對該庫進行了所有表徵測試。乙型流感嗜血桿菌：

產生細胞底物之源生物係乙型流感嗜血桿菌，菌株760705。該菌株最初於1976年11月從一個2歲零2個月大之男嬰(出生于14-8-74)中分離出來。在阿姆斯特丹大學學術醫學中心(AMC)進行菌株之三次傳代，然後儲存在-70℃下。作為SIIPL與荷蘭疫苗研究所(荷蘭NVI)合作之一部分，該菌株已轉移至SIIPL。IPV ：

Salk脊髓灰質炎病毒之菌株及來源如下。脊髓灰質炎病毒 1 型：菌株：Mahoney 來源：荷蘭比爾索芬生物公司脊髓灰質炎病毒 2 型：菌株：MEF1 來源：荷蘭比爾索芬生物公司脊髓灰質炎病毒 3 型：菌株：Saukett 來源：荷蘭比爾索芬生物公司

在整個說明書中，詞字「包括(comprise)」或諸如「包括(comprises)」或「包括(comprising)」之變體將被理解為暗示包括陳述之元素、整數或步驟，或元素、整數或步驟群組，但不排除任何其他元素、整數或步驟或元素、整數或步驟群組。

表述「至少」或「至少一種」之使用表明使用一或多種元素或成分或數量，因為在本發明之實施例中可用於實現一或多種期望之目的或結果。儘管已經描述了本發明之某些實施例，但是此等實施例藉由實例之方式給出，並且不旨在限制本發明之範圍。在閱讀本文之揭示內容之後，熟悉此項技術者可在本發明之範圍內對本發明之製劑進行變化或修改。此樣之變化或修改完全在本發明之精神範圍內。

對於各種物理參數、尺寸及數量給出之數值僅為近似值，並且可設想，除非在說明書中有相反之說明，否則高於分配給物理參數、尺寸及數量之數值之值落入本發明之範圍內。

儘管文中已經將重點放在較佳實施例之特定特徵上，但是應當理解，在不脫離本發明之原理之情況下，可添加許多附加特徵並且可在較佳實施例中進行許多改變。從本文之揭示內容中，本發明之較佳實施例中之此等及其他改變對於熟悉此項技術者而言將係顯而易見的，由此將清楚地理解，前述描述性內容僅應被解釋為係對本發明之說明而不是限制。優點

本文上面描述之本發明具有若干技術進步及優點，包括但不限於實現包含D、T、wP、HBsAg、Hib PRP-TT接合物及IPV之聯合疫苗組合物及其製造方法。當與其他聯合疫苗組合物相比時，本發明提供了以下優點： 1. 全液體聯合疫苗 2. 與標準劑量相比，IPV抗原之劑量降低，其表現出與標準劑量(40-8-32 DU)相當之功效 3. 改良之D、T、wP、HepB、Hib、IPV抗原之免疫原性 4. 在12個月內，在2-8℃及室溫下測試之提高之穩定性 5. 使用不含傳染性海綿狀腦病(TSE)或牛海綿狀腦病(BSE)之半合成培養基生產的高純度白喉類毒素(D)及破傷風類毒素(T)。 6. 全細胞百日咳博多特氏菌(wP)抗原包含1:1:0.25:0.25比例之百日咳博多特氏菌菌株134、509、25525及6229，從而提高了針對百日咳博多特氏菌之效力及免疫原性。 7. 使用熱及甲醛滅活之組合滅活全細胞百日咳博多特氏菌(wP)組分之改良方法。該方法不含硫柳汞且滅活之全細胞百日咳抗原保持不結塊且均質，從而導致降低之反應原性，並且在更長時間內提供了更好之效力。 8. 在乙型流感嗜血桿菌PRP-TT接合物總量中游離PRP較低(低於7%) 9. Hib抗原在任何佐劑上之吸附百分比小於20%。 10. 單獨吸附在磷酸鋁佐劑上之白喉類毒素抗原(D)、破傷風類毒素(T)抗原及乙型肝炎(HepB)表面抗原之吸附特性得到改良，從而提高了功效及免疫原性。 11. 最低總明礬含量(Al³⁺ )，從而確保降低之反應原性。 12. 優化濃度之2-苯氧基乙醇(2-PE)及至少一種對羥基苯甲酸酯(對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯)作為防腐劑，因此有效地保持了多劑量全液體聯合疫苗之抗菌能力。實例

包括以下實例以說明本發明之較佳實施例。熟悉此項技術者應理解，以下實例中揭示之組合物及技術代表發明人發現之在本發明之實施中發揮良好作用之技術，因此可認為構成其實施之較佳方式。然而，根據本發明，熟悉此項技術者應當理解，可在所揭示之特定實施例中進行許多改變，並且在不脫離本發明之精神及範圍之情況下仍可獲得相似或類似之結果。實例 1 ：根據本發明之疫苗組合物之各種組合

另外用氫氧化鈉/碳酸鈉將如上所述之組合物之pH調節至約6.0至7.0，並且藉由添加生理鹽水(0.9%)來補足體積。疫苗可能含有在製造方法中使用之痕量戊二醛、甲醛、新黴素、鏈黴素及多黏菌素B。

另外用氫氧化鈉/碳酸鈉將如上所述之組合物之pH調節至約6.0至7.0，並且藉由添加生理鹽水(0.9%)來補足體積。疫苗可能含有在製造方法中使用之痕量戊二醛、甲醛、新黴素、鏈黴素及多黏菌素B。實例 2 ：乙型流感嗜血桿菌接合物之製造方法

圖1流程圖顯示了製造步驟之總體視圖。該方法之53個步驟中之每個步驟如下簡要介紹：步驟 1 ：接種階段 I 搖瓶 (S1) ：

使用工作種子批小瓶來接種裝有0.22 µm過濾之種子培養基之接種階段搖瓶。使用具有25 mL工作體積之一次性PETG 125 mL燒瓶。該階段係在恒溫振盪器中在受控攪拌(200±50 rpm)及溫度(36±2℃)下進行的。在達到適當之細菌生長(OD590≥1.0)後，將培養物轉移至下一接種階段(S2階段)，該階段如步驟2所述。革蘭氏染色作為方法中之對照進行，以確保培養物純度(革蘭氏陰性球桿菌)。步驟 2 ：接種階段 II 搖瓶 (S2) ：

S2接種階段包括具有800 mL工作容積之2 L fernbach燒瓶(S2A及S2B)。將S2A燒瓶用於OD590測量，直到OD590在可接受之標準之內，並且將S2B燒瓶用於S3階段之接種。兩個燒瓶中均裝有過濾滅菌之培養基，其與S1接種階段相同。將S1階段燒瓶用於接種階段II搖瓶。該階段係在恒溫振盪器中在受控攪拌(200±50rpm)及溫度(36±2℃)下進行的。在達到適當之細菌生長(OD₅₉₀ ≥1.0)後，將培養物轉移至下一接種階段(S3階段)，該階段如步驟3所述。革蘭氏染色作為方法中之對照進行，以確保培養物純度(革蘭氏陰性球桿菌)。步驟 3 ：接種階段 III 發酵罐：

S3接種階段包括具有35 L工作容積之120 L發酵罐。發酵罐中裝有與先前接種階段相同之培養基。將S2階段燒瓶用於接種接種發酵罐。在接種發酵罐中，在溫度(36±2℃)、DO(10%設定值)、攪拌(300-600 rpm)、曝氣(1-5 LPM)及背壓(0.2 bar)下進行生長。在達到適當之細菌生長(OD590≥1.0)後，將培養物轉移至下一生產階段(S4階段)，該階段如步驟4所述。革蘭氏染色作為方法中之對照進行，以確保培養物純度(革蘭氏陰性球桿菌)。步驟 4 ： 1200 L 規模生產發酵：

1200 L生產發酵罐之工作容積為800 L。其裝有基礎培養基組分，並且原地進行蒸汽滅菌。隨後，在通過0.22μm過濾器後添加各種培養基補充劑。用從步驟3獲得之S3階段培養物接種發酵罐。發酵在受控之溶解氧(20%-設定點)、溫度(36±2℃)、pH(7.1-7.4)、攪拌(40-400 rpm)、曝氣(50-300 LPM)及背壓(0.2 bar)下進行。在發酵方法中添加了兩個離散之營養物。藉由測量OD590(OD590≥3.5)監測生長，並且在達到穩定階段後認為發酵已完成。在生長及靜止期，多糖產物被分泌出並且積聚在培養液中。革蘭氏染色作為方法中之對照進行，以確保培養物純度(革蘭氏陰性球桿菌)。步驟 5 ：福馬林處理：

藉由使用化學試劑(福馬林)，可在此步驟中減少生物負荷。加入0.1%福馬林，並且將發酵液在37℃下孵育不小於2小時。福馬林處理後，將容器迅速冷卻至＜15℃。已驗證添加福馬林可減少生物負荷。孵育期後藉由培養板進行驗證。生物負荷減少之肉湯可按步驟6所述準備進行收穫。步驟 6 ：連續離心收穫：

連續離心被用作主要收穫步驟。執行該步驟以從滅活生物質中分離出含多糖之粗肉湯。使用連續離心機之目的係去除＞90%之生物質，如OD590減少所測量之。離心機以約15000 g以及200-500 L/h之液體流量運轉。離心之上清液按步驟7所述進行進一步處理。步驟 7 ： 50LP 深度過濾：

離心之上清液通過50LP深度過濾器，以除去粗物質，例如細胞碎片。該步驟允許產物經由濾液通過，並且與其他深度過濾器串聯，如步驟8所述。步驟 8 ： 90LP 深度過濾：

來自50LP深度過濾器之濾液進一步通過90LP深度過濾器(標稱0.22 µm等級)，以進一步去除先前之深度過濾器可能沒有保留之任何不溶物。此步驟可確保濾液基本不含細胞碎片，並且可順暢地通過0.22 µm過濾器。在步驟9中描述了後續之過濾步驟。步驟 9 及 10 ： 0.22 µm 過濾：

來自90 LP深度過濾器之濾液進一步通過0.22 µm過濾器，並且將濾液收集在儲罐中。步驟 11 及 12 ： 100 kD 濃縮及滲濾：

進行該步驟以除去培養基組分及小分子量雜質。另外，進行濃縮以減小工作量。因為Hib多糖(PRP)之分子量≥500 kD，所以選擇了100 kD截留分子量。將肉湯濃縮至約10倍，隨後使用0.01 M PBS緩衝液(pH 7.2)滲濾不小於5體積。保留物中得到之產物稱為「粗製PRP」，並且按步驟13所述進行進一步處理。濃縮之肉湯經由0.22 µm過濾器藉由轉移端口轉移到DSP區域，以確保沒有細菌轉移到DSP區域。步驟 13 ： CTAB 沉澱：

CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)係一種陽離子去污劑，其用於沉澱多糖。CTAB由親水區域及疏水部分組成，並且沉澱蛋白質、核酸及多糖。從步驟12獲得之粗製PRP在1%CTAB濃度下沉澱並且孵育＞2小時。在步驟14中描述CTAB沉澱收穫。步驟 14 、 15 及 16 ： CTAB 沉澱離心、收集及儲存：

在SEZ-3，FF中，使用連續離心機以15000 rpm離心CTAB沉澱。收穫CTAB沉澱、稱重、等分並且儲存在≤-20℃下，以便進一步處理。此係第一個方法中之保持步驟。步驟 17 及 18 ： CTAB 糊狀物解凍並且溶解：

將冷凍之CTAB糊狀物解凍至室溫。將解凍之沉澱溶解在5.85%NaCl溶液中。在攪拌罐中進行溶解，並且將多糖產物溶解在水相中。罐中裝有一些不溶物質，此等物質來自沉澱之蛋白質及核酸。如步驟19中所述，對該懸浮液進行進一步處理。步驟 19 ：離心：

將步驟18中獲得之物質在2-8℃，5000-6500 rpm下離心20-30分鐘，以除去未溶解之物質。收集離心之上清液，並且按照步驟20所述進行進一步處理。步驟 20 ： 72% 乙醇沉澱：

將72%乙醇用於沉澱PRP。使用96%乙醇產生相對於在步驟19中獲得之上清液之72%乙醇之最終濃度。該沉澱在2-8℃下過夜進行。按照步驟21中所述收穫所得沉澱物。步驟 21 及 22 ：離心及沉澱溶解：

藉由在2-8℃，5000-6500 rpm下離心20-30分鐘收集72%乙醇沉澱物。將得到之沉澱溶解在W.F.I.中直到獲得清晰之視覺效果。在步驟23中描述了對溶解沉澱之後續處理。步驟 23 ： DOC 及 32% 乙醇沉澱：

向從步驟22獲得之材料中，添加6%乙酸鈉及1%去氧膽酸鈉(DOC)。使用96%乙醇以產生32%乙醇之最終濃度。DOC及32%乙醇均會促進蛋白質雜質之沉澱，同時使多糖在液相中。該沉澱在2-8℃下過夜進行(不少於8小時)。步驟 24 ：離心：

將步驟23中獲得之物質在2-8℃，5000-6500 rpm下離心20-30分鐘以去除沉澱物。收集離心之上清液並且按照步驟25中所述進行進一步處理。步驟 25 ：深度及碳過濾：

在步驟24中獲得之上清液包含可溶性PRP，並且進行深度過濾，然後進行碳過濾，以去除核酸及色素。藉由在260 nm下間斷測量吸光度(A₂₆₀ )來監測核酸之去除。達到目標A₂₆₀ 後，將溶液通過0.22 µm過濾器過濾，然後按照步驟26中所述，對該過濾溶液進行進一步處理。步驟 26 ： 64% 乙醇沉澱：

在步驟25中獲得之過濾物質進一步用96%乙醇沉澱，最終濃度為64%乙醇。該沉澱在2-8℃下過夜進行。藉由離心收集得到之沉澱物，並且按照步驟27所述進行進一步處理。步驟 27 ：沉澱收集及溶解：

倒出上清液並且丟棄以收集沉澱。在室溫下將沉澱溶於W.F.I.中。步驟 28 ： 300 kD 濃縮及滲濾：

使用300 kD NMWCO膜濃縮溶解之沉澱溶液。使用W.F.I將其進一步滲濾不小於(NLT)8倍。按照步驟29中所述，進一步處理所得之滲餘物。步驟 29 及 30 ： 0.22 µm 過濾及純化之 PRP 儲存：

將300 kD UF滲餘物通過0.22μm過濾器作為澄清步驟，以最大程度地減少生物負荷。將所得純化之PRP等分，並且儲存在≤-20℃下，直至按照步驟31中所述進行進一步使用。將純化之PRP樣品送去Q.C.分析。步驟 31 ：解凍及合併：

基於接合物批次大小，將從步驟30獲得之適量之天然多糖解凍。對合併物質之PRP含量進行檢測，此係按照步驟32中所述進行進一步處理所必需的。步驟 32 ： 100 kD 濃縮：

合併之純化多糖必須具有最低濃度(8-12 mg/mL)才能進行進一步處理。如果合併之多糖濃度低於目標濃度，則使用100 kD UF NMWCO膜濃縮合併之多糖溶液。

濃縮後抽取樣品以確保對於後續步驟達到最低濃度(步驟33)。步驟 33 ：鹼解聚：

在使用碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液之溫和鹼性條件下，將從步驟32獲得之濃縮多糖(相當於74g/110g)解聚。在達到目標多糖大小後，按照步驟34中所述活化解聚多糖。

步驟34：多糖啟動：

使用溴化氰活化在步驟33中獲得之解聚多糖。該活化在氮氣環境下進行。溴化氰係劇毒化學品，在處理該化學品時要格外小心。步驟 35 ：接頭連接：

在6-10分鐘內，將新鮮製備之己二酸二醯肼(ADH)溶液添加到從步驟34獲得之反應混合物中。該反應在2-10℃下進行不少於16小時。ADH接頭之作用係在多糖中提供接合反應所需之胺基。步驟 36 ：濃縮及滲濾：

濃縮從步驟35獲得之反應混合物，並且使用10 kD NMWCO UF膜用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)逐體積滲濾，以除去游離ADH。在HPLC上監測ADH之去除，並且繼續進行滲濾直至游離ADH位準達到5%以下。所得滲餘物進一步用不少於5X MES-NaCl緩衝液滲濾。將其進一步濃縮以達到不少於20 mg/mL之濃度。將該濃縮之經處理之PRP保持在2-8℃下，直至按照步驟37中所述進行進一步使用。步驟 37 及 38 ： 0.22 µm 過濾及經處理之 PRP 儲存：

使來自步驟36之滲餘物通過0.22 µm過濾器，該過濾器用作澄清步驟。此亦確保了在該方法中控制生物負荷位準，該方法在C級區域進行。收集過濾之活化多糖，取樣、等分並且在2-8℃下儲存，直至進行進一步處理。從經處理之多糖池中提取樣品進行分析，其包括PRP分子大小(kD)、PRP含量及PRP活化度。在步驟40中描述經處理之PRP之進一步處理。步驟 39 ： TT 10 kD 濃縮及滲濾：

接合反應需要兩種組分，即經處理之多糖及載體蛋白(TT)。濃縮載體蛋白，並且使用10 kD UF NMWCO膜用MES-NaCl緩衝液滲濾。然後使用同一膜將該滲濾之載體蛋白進一步濃縮至不小於20 mg/mL。步驟 40 ：接合：

接合反應需要兩種組分，即經處理之多糖及載體蛋白(TT)。從步驟38獲得活化之多糖組分。從步驟39獲得載體蛋白。在EDC存在下，在攪拌下以PRP:TT=1:1(w/w)之比例將兩種組分以適當之量混合。在HPLC上監測接合反應，並且持續直至達到≥85%蛋白質轉化率(基於游離蛋白向接合物之轉化率)。步驟 41 ：淬火：

在接合反應進行到其轉化之可接受標準(步驟40)之後，藉由淬火終止反應。使用磷酸鹽EDTA緩衝液淬火接合反應。隨後按照步驟42中所述處理此接合反應。步驟 42 ： 30 SP 及 0.22 微米過濾：

將從步驟41獲得之接合物通過30 SP過濾器過濾，然後進行0.22 μm過濾。此可確保去除任何大之聚集體。按照步驟43中所述處理經過濾之接合物。步驟 43 ： 300 kD 超濾及滲濾：

使用300 kD UF NMWCO膜，用0.05%鹽水滲濾從步驟42中獲得之接合反應混合物。進行滲濾以除去接合試劑及未反應之TT。按照步驟44中所述進一步處理所得之滲餘物。步驟 44 及 45 ： 0.22 µm 過濾及粗製接合物儲存：

使來自步驟43之滲餘物通過0.22 µm過濾器，該過濾器用作澄清步驟。此亦確保在該方法中控制生物負荷位準，該方法在C級區域進行。收集過濾之粗製接合物，取樣並且在2-8℃下儲存直至進一步處理。在步驟46中描述粗製接合物之進一步處理。步驟 46 ：粗製接合物稀釋：

如果需要，將來自步驟45之粗製接合物用W.F.I.稀釋，達到目標濃度4±1 mg/mL，並且藉由步驟47中所述之沉澱步驟進一步處理。步驟 47 ：硫酸銨沉澱：

使用硫酸銨(50%w/v儲備溶液)將稀釋之接合反應混合物進一步處理以除去游離PRP。在攪拌下，在小於15℃下進行沉澱步驟。沉澱步驟將接合物帶入沉澱物中，並且將游離PRP留在上清液中。加入硫酸銨後，將所得懸浮液在不攪拌之情況下在低於15℃下儲存不小於12小時。步驟 48 ：沉澱收集及溶解：

將得自步驟47之懸浮液在2-8℃下以約7000 g離心40±10分鐘。藉由傾析丟棄上清液，並且將獲得之沉澱溶解在Tris-鹽水中。步驟 49 ： 300 kD 滲濾：

將來自步驟48之所得溶液通過30 SP深度過濾器過濾，並且使用300 kD NMWCO膜用20 mM Tris-鹽水滲濾。步驟 50 ： GPC 色譜純化：

將來自步驟49之所得溶液載入到約70 L GPC柱上用於尺寸排阻色譜，該柱包含Toyopearl HW-65F羥基化甲基丙烯酸聚合物珠粒凝膠。對經處理之接合物使用GPC色譜(硫酸銨後)可降低所得材料中之游離PRP含量。用20 mM Tris 0.9%NaCl洗脫柱子，並且基於A280收集餾分。基於關於游離PRP、比例及分子大小之接受標準將適當餾分合併，並且按照步驟51中所述，對合併物進行進一步處理。步驟 51 ： 300 kD 滲濾：

使用300 kD UF NMWCO膜，用20 mM Tris滲濾來自步驟50所得合併之接合洗脫液。該滲餘物體積之目標係使其中之PRP含量為約1 mg/mL。步驟 52 及 53 ： 0.22 µm 過濾：

在A級環境下，將藉由步驟51得到之整體接合物通過0.22 μm過濾器過濾，以確保無菌。使0.22 µm過濾器經過完整性測試。來自過濾之整體接合物之樣品被送至Q.C.進行完整之分析。過濾後之接合物被標記為「無菌Hib整體接合物」，並且儲存在2-8℃下。整體接合物將在2-8℃下最多儲存3個月，此後如果不使用，可在-70℃下儲存長達1年之久。獲得之 Hib PRP-TT 接合物抗原之品質特徵 如下： PRP含量(µg/0.5ml) : 8.1 比例(PRP:TT) : 0.5 游離PRP(%) : 4.8% PMW(kD) : 983 平均MW(kD) : 752實例 3 ：製造滅活 wP 抗原之方法 全細胞百日咳 (wP) 抗原之滅活方法：

進行各種實驗後，進行滅活方法之優化，此等實驗包括在甲醛存在下於56℃滅活10 min，在甲醛存在下於56℃滅活15 min，在hymine存在下於56℃滅活10 min，在hymine存在下於56℃滅活15 min並且在56℃下僅加熱30 min。用此等方法未觀察到效力之顯著差異。在此等方法中，選擇在甲醛存在下於56℃持續10分鐘係因為與上述其他方法相比，使用此方法產生之百日咳細胞團更均質。滅活 wP 抗原之製造方法包括以下步驟： a). 百日咳博多特氏菌菌株134在甲醛存在下於56℃滅活10-15分鐘 b). 百日咳博多特氏菌菌株509在甲醛存在下於56℃滅活10-15分鐘 c). 百日咳博多特氏菌菌株25525及6229在甲醛存在下於56℃滅活10-15分鐘 c). 百日咳博多特氏菌菌株6229在甲醛存在下於56℃滅活10-15分鐘 d). 隨後以1:1:0.25:0.25之比例混合滅活百日咳博多特氏菌菌株134、509、25525及6229。 e). 視情況吸附在鋁基佐劑上。

該方法不含硫柳汞且滅活全細胞百日咳抗原保持不結塊且均質，從而導致降低之反應原性，並且在更長之時間內提供更好之效力。實例 4 ：滅活脊髓灰質炎病毒 (IPV) 之生產方法 1. 脊髓灰質炎病毒可藉由以下方法生長： a)將CCL81-VERO(猴腎)細胞用作用於脊髓灰質炎病毒即Sabin及Salk菌株生長之宿主細胞。 b)用所需之脊髓灰質炎病毒株感染宿主細胞並且孵育72小時後，將含有病毒及細胞碎片之培養基合併並且收集在單個容器中。 c)用100 KDa濾筒對濾液進行切向流過濾；用磷酸鹽緩衝液滲濾，並且用陰離子交換色譜純化。 d)在投與給患者之前，必須使用適當之滅活方法將病毒滅活。2. 福馬林滅活包括以下步驟： a)純化之病毒池在pH為7至7.5之(30至50 mM)範圍內從磷酸鹽緩衝液緩衝交換為Tris緩衝液， b)向上述混合物中加入含甘氨酸(5 gm/l)之M-199培養基 c)加入0.025%甲醛，然後混合， d)隨後將混合物在37℃下孵育5至13天，同時在磁力攪拌器上連續攪拌病毒塊， e)在第7天將孵育後之混合物置於中間TFF系統(100 KDa，0.1 m2)中，滅活後進行最終過濾 f)隨後將過濾後之物料儲存在2-8℃下， g)進行D-Ag ELISA用以D-Ag單位測定 h)IPV 1型、2型及3型之單價池物料隨後混合形成三價或二價IPV(Salk或Sabin血清型) i)調節最終製劑之pH，並且獲得pH在6與6.8之間之最終製劑。 j)IPV抗原(Sabin或Salk菌株)隨後添加到最終之聯合疫苗組合物中，吸附在聯合疫苗中存在之佐劑(磷酸鋁鹽)上，其中發現IPV抗原對IPV 1型之吸附百分比在10%-30%之範圍內，IPV 2型在60%-100%之範圍內，而IPV 3型在0%-25%之範圍內。3. IPV(Sabin 及 Salk 菌株 ) 分別吸附在鋁鹽上時之配製程序： a)取所需體積之高壓滅菌之AlPO4以在50 ml容器中使最終明礬(Al³⁺ )濃度在0.1與0.8 mg/劑量之間 b)添加具有調整之D-Ag單位之IPV物料，並且用稀釋劑(10x M-199 + 0.5%甘氨酸)補足體積， c)調節最終製劑之pH，並且獲得pH在6與6.8之間之最終製劑。4) 經鋁吸附之單價池相應地配製成三價或二價 IPV(Salk 或 Sabin 血清型 ) 結果： 發現IPV 1、2及3型(Sabin＆Salk)在磷酸鋁(AlPO4)鹽上之吸附百分比為至少90% 申請人已經能夠將脊髓灰質炎病毒抗原之劑量減少2倍(而脊髓灰質炎病毒抗原之標準劑量為1型-40 DU，2型-8DU，3型- 32DU)。

實例 5 ：製造聯合疫苗之方法 該實例簡要介紹包含 D 、 T 、 wP 、 HBsAg 、 Hib PRP-TT 接合物、 IPV 及防腐劑之聯合疫苗組合物之製造方法： 組分 I- 經明礬吸附之白喉類毒素 組分 II- 經明礬吸附之破傷風類毒素 組分 III–wP 抗原 ( 如實例 3 中所揭示 ) 組分 IV- 經明礬吸附之乙型肝炎表面抗原 組分 V-Hib PRP 接合物 ( 如實例 2 中所揭示 ) 組分 VI-IPV 抗原 ( 如實例 4 中所揭示 ) 1. 製備包含經明礬吸附之白喉類毒素之組分 I ： a). 將磷酸鋁轉移到容器/器皿中 b). 添加白喉類毒素 c). 用醋酸/氫氧化鈉將pH調節至4.5至5.5 d). 等待穩定 e). 用氫氧化鈉/碳酸鈉將pH調節至5.5至6.5 f). 等待穩定2. 製備包含經明礬吸附之破傷風類毒素之組分 II ： a). 將磷酸鋁轉移到容器/器皿中 b). 添加破傷風類毒素 c). 用醋酸/氫氧化鈉將pH調節至4.5至5.5 d). 等待穩定 e). 用氫氧化鈉/碳酸鈉將pH調節至5.5至6.5 f). 等待穩定3. 製備包含經明礬吸附之乙型肝炎表面抗原之組分 IV ： a). 將磷酸鋁轉移到容器/器皿中 b). 添加乙型肝炎表面抗原 c). 用醋酸/氫氧化鈉將pH調節至4.5至5.5 d). 等待穩定 e). 用氫氧化鈉/碳酸鈉將pH調節至5.5至6.5 f). 等待穩定4. 製造包含 D 、 T 、 wP 、 HBsAg 、 Hib PRP-TT 接合物、 IPV 及防腐劑之聯合疫苗組合物的方法 1.將生理鹽水添加到攪拌器皿/容器中； 2.添加組分I 3.將組分II在組分I中混合並且在RT下攪拌30-45分鐘。 4.在上述混合物中添加組分III，然後在RT下攪拌30-60分鐘。 5.將組分IV加入步驟4中獲得之混合物中，然後在RT下攪拌30-60分鐘。 6.將組分V加入步驟5中獲得之混合物中，然後在6–16℃下攪拌30-60分鐘。 7.將組分VI加入步驟6中獲得之混合物中，然後在6-16℃下攪拌。 8.在6-16℃下，將以下揭示之防腐劑組合中之一種加入步驟7中獲得之混合物中。 a)2-苯氧基乙醇，其量為約1 mg/0.5 ml至6 mg/0.5 ml(v/v)；或 b)2-苯氧基乙醇，其量為約1 mg/0.5 ml至6 mg/0.5 ml(v/v)及對羥基苯甲酸甲酯，其使用濃度為0.1-1.5 mg/0.5 ml(w/v)；或 c)2-苯氧基乙醇，其量為約1 mg/0.5 ml至6 mg/0.5 ml(v/v)及對羥基苯甲酸丙酯，其使用濃度為0.05-0.2 mg/0.5 ml(w/v)；或 d)2-苯氧基乙醇，其量為約1 mg/0.5 ml至6 mg/0.5 ml(v/v)，對羥基苯甲酸甲酯，其使用濃度為0.1-1.5 mg/0.5 ml(w/v)及對羥基苯甲酸丙酯，其使用濃度為0.05-0.2 mg/0.5 ml(w/v)。 9.檢查pH，如果需要，用氫氧化鈉/碳酸鈉將pH調節至6.0至7.5 10.用鹽水(0.9%)補足在步驟9中得到之體積，隨後攪拌3小時。實例 6 ：抗原之吸附、效力及穩定性

觀察結果： •用半劑量濃度之IPV製造之六價疫苗批次已顯示出令人鼓舞之測試結果。 •發現在半濃度IPV下製造之六價疫苗之IPV體內功效與具有全劑量IPV之現有疫苗(SIIPL製造之Poliovac)相當。實例 7 ：抗菌能力測試

本發明人在開發含有D、T、wP、Hib、HBsAg及IPV疫苗之多劑量聯合疫苗之同時，已經藉由首先以2.5 mg/0.5 ml劑量之濃度添加2-苯氧基乙醇(2-PE)對其抗菌能力進行了測試，2-苯氧基乙醇通常在此項技術中用作防腐劑。然而，在基於DPT之聯合疫苗中，發現2-PE對抗酵母及真菌之抗菌活性低於硫柳汞。

為滿足所需標準而增加2-PE(防腐劑)之量可能會增加幼童之安全性，該幼童係接種疫苗之受試者，亦可能影響最終產品之穩定性。進一步言之，疫苗中所含防腐劑之量應符合美國藥典、歐洲藥典、WHO藥典或其組合中關於疫苗安全性所定義之要求。

在此方面，本發明人進行了實驗以開發一種新型組合物，該組合物藉由在滿足安全性及抗菌能力標準之多劑量聯合疫苗中將2-PE與其他防腐劑如對羥基苯甲酸酯組合來滿足關於抗菌能力之要求。在本發明中，根據WHO對疫苗產品要求之歐洲藥典B類(EP-B)標準進行抗菌能力測試。

抗菌能力之篩選：

在第0小時，使實例1中揭示之六價聯合疫苗製劑分別接種總共六種微生物，其中包括四種不同之細菌-金黃色葡萄球菌(ATCC NO.-6538)、銅綠假單胞菌(ATCC NO.- 9027)、大腸桿菌(ATCC NO .- 8739)及金黃色葡萄球菌(環境分離物EMI)；一種酵母-白色念珠菌(ATCC NO.-10231)及一種真菌-巴西麯黴(ATCC NO.-16404)，以105至106 CFU/mL之量加入疫苗製劑中。然後，在第0小時、第24小時、第7天、第14天及第28天收集細菌、真菌、酵母樣品，並且在固體培養基中培養，在第3至5天之間計數菌落數，並且計算菌落之對數減少。結果顯示在下表38中。

NA- 不可用； 0.5% 2PE – 2.5 mg/0.5 ml 劑量； 0.4% 2PE – 2 mg/0.5 ml 劑量； 0.18%MP – 0.9 mg/0.5 ml 劑量； 0.02%PP – 0.1mg/0.5 ml 劑量； CFU- 菌落形成單位 觀察結果： •已觀察到，按照歐洲藥典B類，發現以不同組合製造之所有六價疫苗均符合防腐功效。但是，發現使用不同組合時，其功效有所不同。 •與其他防腐劑組合(即僅2PE、2PE與PP、2PE與MP及PP與MP)相比，含有2PE、MP及PP之六價疫苗之防腐功效係非常有效的。 •亦應注意，與含有0.4%2PE之相同組合相比，發現含有0.5%2PE及PP與MP之六價疫苗之防腐功效係更有效的。實例 8 ： SIIPL 之減劑量聯合疫苗與 Easy Six(Panacea)

Claims

一種全液體之多劑量免疫原性組合物，其包含： (i)白喉類毒素，(D)； (ii)破傷風類毒素，(T)； (iii)滅活全細胞百日咳，(wP)或無細胞百日咳，(aP)； (iv)乙型肝炎病毒表面抗原，(HBsAg)； (v)乙型流感嗜血桿菌抗原，(Hib)； (vi)滅活脊髓灰質炎病毒抗原，(IPV)，其中IPV 1型之量為1-50 DU/0.5 ml，IPV 3型之量為1-50 DU/0.5 ml；以及 (vii)2-苯氧基乙醇及至少一種其他防腐劑之聯合。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該組合物中之該滅活全細胞百日咳係比例為1:1:0.25:0.25之百日咳博多特氏菌菌株134、509、25525及6229。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該無細胞百日咳抗原包括選自修飾之腺苷酸環化酶、百日咳類毒素(PT)、絲狀血凝素(FHA)、百日咳桿菌黏附素(P69或PRN)或菌毛蛋白(FIM 1、2及3)的一或多種抗原。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該Hib抗原係使用氰基化接合化學或還原胺化接合化學接合至載體蛋白之Hib聚核糖基核糖醇磷酸(PRP)多糖，其中該氰基化試劑係選自溴化氰、1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)、1-氰基-4-吡咯烷基吡啶四氟硼酸鹽(CPPT)、1-氰基咪唑(1-CI)、1-氰基苯並且三唑(1-CBT)或2-氰基嗒口井-3(2H)酮(2-CPO)；並且載體蛋白選自包括以下之群組：破傷風類毒素、CRM197、白喉類毒素、腦膜炎奈瑟氏球菌外膜複合物、破傷風類毒素之片段C、百日咳類毒素、流感嗜血桿菌之蛋白D、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST及銅綠假單胞菌之外毒素A、外膜複合物c(OMPC)、孔蛋白、轉鐵蛋白結合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌表面黏附素A(PsaA)、肺炎球菌PhtD、肺炎球菌表面蛋白BVH-3及BVH-11、炭疽芽胞桿菌之保護性抗原(PA)及炭疽芽胞桿菌之解毒浮腫因數(EF)及致死因數(LF)、卵清蛋白、鑰孔戚血藍蛋白(KLH)、人血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、結核菌素之純化蛋白衍生物(PPD)、合成肽、熱休克蛋白、百日咳蛋白、細胞因數、淋巴因數、激素、生長因數、包含來自多種病原體衍生抗原諸如N19之多種人CD4+T細胞表位之人造蛋白、鐵攝取蛋白、來自艱難梭菌及無乳鏈球菌蛋白之具有或不具有接頭的毒素A或B。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該組合物亦包含1-20 DU/0.5ml之量的IPV 2型。
如申請專利範圍第1及5項之免疫原性組合物，其中該IPV 1型為Mahoney菌株或Sabin菌株；及/或其中該IPV 2型為MEF-1菌株或Sabin菌株；及/或其中該IPV 3型為Saukett菌株或Sabin菌株。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該另一種防腐劑選自氯化本索寧(Phemerol)、苯酚、間甲酚、甲醛、氯化苯銨、苄醇、氯丁醇、對氯間甲酚、苯甲醇及選自對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯及對羥基苯甲酸丁酯之群組之對羥基苯甲酸酯的群組。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該組合物包含1-6 mg/0.5ml(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1-1.5 mg/0.5ml(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯及0.05-0.2 mg/0.5ml(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該D、T、wP、HBsAg、Hib及IPV未吸附在佐劑上。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該D、T及HBsAg單獨吸附在選自鋁鹽(Al³⁺ )諸如氫氧化鋁(Al(OH)₃ )或磷酸鋁(AlPO₄ )、明礬、磷酸鈣、MPLA、3D-MPL、QS21、含CpG之寡去氧核苷酸佐劑、脂質體或水包油乳液之群組的佐劑上。
如申請專利範圍第10項之免疫原性組合物，其中該D、T、HBsAg係單獨吸附在磷酸鋁(AlPO₄ )佐劑上。
如申請專利範圍第10項之免疫原性組合物，其中該D抗原以至少50%之吸附百分比吸附在鋁鹽上。
如申請專利範圍第10項之免疫原性組合物，其中該T抗原以至少40%之吸附百分比吸附在鋁鹽上。
如申請專利範圍第10項之免疫原性組合物，其中該HBsAg抗原以至少50%之吸附百分比吸附在鋁鹽上。
如申請專利範圍第1、5及6項之免疫原性組合物，其中該IPV抗原吸附在氫氧化物(Al(OH)₃ )或磷酸鹽(AlPO₄ )之鋁鹽上，IPV 1型之吸附百分比係在10-100%範圍內，IPV 2型係在10-100%範圍內以及IPV 3型係在10-100%範圍內。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中Hib抗原在任何佐劑上之吸附百分比小於20%。
如申請專利範圍第1至16項中任一項之免疫原性組合物，其中該組合物中之總鋁含量(Al³⁺ )之量係0.1至0.6mg/0.5ml。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該組合物進一步包含選自氯化鈉或磷酸鹽緩衝鹽水之緩衝液。
如申請專利範圍第18項之免疫原性組合物，其中該組合物包含濃度為0.5%至1.5%之氯化鈉作為緩衝劑。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該組合物進一步包含藥學上可接受之運輸體、賦形劑、黏合劑、載體、等滲劑、乳化劑或潤濕劑。
如申請專利範圍第20項之免疫原性組合物，其中該組合物包含選自糖、多元醇、表面活性劑、聚合物、鹽、氨基酸或pH調節劑之群組的藥學上可接受之賦形劑。
如申請專利範圍第1至21項中任一項之免疫原性組合物，其中該單劑量免疫原性組合物不含防腐劑。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該組合物進一步包含選自以下之群組之一或多種抗原：流感嗜血桿菌(a、c、d、e、f血清型及未包囊菌株)、肝炎(A、C、D、E、F及G菌株)、輪狀病毒、腦膜炎奈瑟氏球菌A抗原、腦膜炎奈瑟氏球菌C抗原、腦膜炎奈瑟氏球菌W-135抗原、腦膜炎奈瑟氏球菌Y抗原、腦膜炎奈瑟氏球菌X抗原、肺炎鏈球菌抗原、腦膜炎奈瑟氏球菌B抗原、金黃色葡萄球菌抗原、炭疽、BCG、人類乳突病毒、傷寒沙氏桿菌抗原、非傷寒沙氏菌抗原、修飾之腺苷酸環化酶、瘧疾抗原(RTS，S)、麻疹、腮腺炎、風疹、黃病毒抗原、登革熱、寨卡、埃博拉、屈公、日本腦炎及腹瀉抗原。
如申請專利範圍第1至23項中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含：10至25 Lf之量之D抗原；2 Lf至10 Lf之量之T抗原；約12至16 IOU之量之wP抗原；7至15 µg之量之HBsAg；7至13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為1-50 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及1-50 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；0.1至0.6 mg之量之總鋁含量(Al³⁺ )；1至6 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1-1.5 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯。
如申請專利範圍第1至23項中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含：10至25 Lf之量之D抗原；2至10 Lf之量之T抗原；12至16 IOU之量之wP抗原；7至15 µg之量之HBsAg；7至13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為1-50 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、1-20 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及1-50 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；0.1至0.6 mg之量之總鋁含量(Al³⁺ )；約1至6 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1-1.5 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯。
如申請專利範圍第1至23項中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含：10至25 Lf之量之D抗原；2至10 Lf之量之T抗原；12至16 IOU之量之wP抗原；7至15 µg之量之HBsAg；7至13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為1-50 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及1-50 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；0.1至0.6 mg之量之總鋁含量(Al³⁺ )；1至6 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.05-0.2 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如申請專利範圍第1至23項中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含：10至25 Lf之量之D抗原；2至10 Lf之量之T抗原；12至16 IOU之量之wP抗原；7至15 µg之量之HBsAg；7至13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為1-50 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、1-20 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及1-50 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；0.1至0.6 mg之量之總鋁含量(Al³⁺ )；1至6 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.05-0.2 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如申請專利範圍第1至23項中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含：10至25 Lf之量之D抗原；2至10 Lf之量之T抗原；12至16 IOU之量之wP抗原；7至15 µg之量之HBsAg；7至13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為1-50 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、及1-50 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；0.1至0.6 mg之量之總鋁含量(Al³⁺ )；1至6 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1-1.5 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.05-0.2 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如申請專利範圍第1至23項中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含：10至25 Lf之量之D抗原；2至10 Lf之量之T抗原；12至16 IOU之量之wP抗原；7至15 µg之量之HBsAg；7至13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為1-50 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、1-20 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及1-50 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；0.1至0.6 mg之量之總鋁含量(Al³⁺ )；1至6 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1-1.5 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.05-0.2 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如申請專利範圍第1至23項中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含：10至25 Lf之量之D抗原；2 Lf至10 Lf之量之T抗原；12至16 IOU之量之wP抗原；7至15 µg之量之HBsAg；7至13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為1-25 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、及1-20 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；0.1至0.6 mg之量之總鋁含量(Al³⁺ )；1至6 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1-1.5 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯。
如申請專利範圍第1至23項中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含：10至25 Lf之量之D抗原；2 至10 Lf之量之T抗原；12至16 IOU之量之wP抗原；7至15 µg之量之HBsAg；7至13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為1-25 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、1-10 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及1-20 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；0.1至0.6 mg之量之總鋁含量(Al³⁺ )；約1至6 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1-1.5 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯。
如申請專利範圍第1至23項中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含：10至25 Lf之量之D抗原；2 至10 Lf之量之T抗原；12至16 IOU之量之wP抗原；7至15 µg之量之HBsAg；7至13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為1-25 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、及1-20 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；0.1至0.6 mg之量之總鋁含量(Al³⁺ )；1至6 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.05-0.2 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如申請專利範圍第1至23項中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含：10至25 Lf之量之D抗原；2 至10 Lf之量之T抗原；12至16 IOU之量之wP抗原；7至15 µg之量之HBsAg；7至13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為1-25 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、1-10 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及1-20 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；0.1至0.6 mg之量之總鋁含量(Al³⁺ )；1至6 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.05-0.2 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如申請專利範圍第1至23項中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含：10至25 Lf之量之D抗原；2 至10 Lf之量之T抗原；12至16 IOU之量之wP抗原；7至15 µg之量之HBsAg；7至13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為1-25 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、及1-20 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；0.1至0.6 mg之量之總鋁含量(Al³⁺ )；1至6 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1-1.5 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.05-0.2 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如申請專利範圍第1至23項中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含10至25 Lf之量之D抗原；2 至10 Lf之量之T抗原；12至16 IOU之量之wP抗原；7至15 µg之量之HBsAg；7至13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別地，1-25 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、1-10 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及1-20 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；0.1至0.6 mg之量之總鋁含量(Al³⁺ )；1至6 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1-1.5 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.05-0.2 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如前述申請專利範圍中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含以下中任一種： 10 Lf之量之D抗原；2 Lf之量之T抗原；12 IOU之量之wP抗原；8 µg之量之HBsAg；8 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為40 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及32 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；或 20 Lf之量之D抗原；4 Lf之量之T抗原；14 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；10 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為40 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、及32 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；或 25 Lf之量之D抗原；10 Lf之量之T抗原；16 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為40 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及32 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯。
如前述申請專利範圍中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含以下中任一種： 10 Lf之量之D抗原；2 Lf之量之T抗原；12 IOU之量之wP抗原；8 µg之量之HBsAg；8 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為40 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、8 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及32 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；或 20 Lf之量之D抗原；4 Lf之量之T抗原；14 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；10 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為40 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、8 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及32 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；或 25 Lf之量之D抗原；10 Lf之量之T抗原；16 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為40 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、8 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及32 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯。
如前述申請專利範圍中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含以下中任一種： 10 Lf之量之D抗原；2 Lf之量之T抗原；12 IOU之量之wP抗原；8 µg之量之HBsAg；8 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為40 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及32 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al3+)；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 20 Lf之量之D抗原；4 Lf之量之T抗原；14 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；10 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為40 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及32 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。 25 Lf之量之D抗原；10 Lf之量之T抗原；16 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為40 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及32 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如前述申請專利範圍中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含以下中任一種： 10 Lf之量之D抗原；2 Lf之量之T抗原；12 IOU之量之wP抗原；8 µg之量之HBsAg；8 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為40 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、8 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及32 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 20 Lf之量之D抗原；4 Lf之量之T抗原；14 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；10 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為40 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、8 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及32 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 25 Lf之量之D抗原；10 Lf之量之T抗原；16 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為40 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、8 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及32 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如前述申請專利範圍中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含以下中任一種： 10 Lf之量之D抗原；2 Lf之量之T抗原；12 IOU之量之wP抗原；8 µg之量之HBsAg；8 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為40 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及32 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 20 Lf之量之D抗原；4 Lf之量之T抗原；14 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；10 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為40 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及32 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 25 Lf之量之D抗原；10 Lf之量之T抗原；16 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為40 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及32 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如前述申請專利範圍中任一項之免疫原性組合物，其中0.5ml之該組合物包含以下中任一種： 10 Lf之量之D抗原；2 Lf之量之T抗原；12 IOU之量之wP抗原；8 µg之量之HBsAg；8 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為40 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、8 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及32 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 20 Lf之量之D抗原；4 Lf之量之T抗原；14 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；10 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為40 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、8 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及32 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al3+)；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 25 Lf之量之D抗原；10 Lf之量之T抗原；16 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為40 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、8 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及32 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如前述申請專利範圍中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含以下中任一種： 10 Lf之量之D抗原；2 Lf之量之T抗原；12 IOU之量之wP抗原；8 µg之量之HBsAg；8 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為20 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及16 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；或 20 Lf之量之D抗原；4 Lf之量之T抗原；14 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；10 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為20 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、及16 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；或 25 Lf之量之D抗原；10 Lf之量之T抗原；16 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為20 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及16 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯。
如前述申請專利範圍中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含以下中任一種： 10 Lf之量之D抗原；2 Lf之量之T抗原；12 IOU之量之wP抗原；8 µg之量之HBsAg；8 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為20 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、4 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及16 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；或 20 Lf之量之D抗原；4 Lf之量之T抗原；14 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；10 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為20 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、4 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及16 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；或 25 Lf之量之D抗原；10 Lf之量之T抗原；16 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為20 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、4 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及16 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯。
如前述申請專利範圍中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含以下中任一種： 10 Lf之量之D抗原；2 Lf之量之T抗原；12 IOU之量之wP抗原；8 µg之量之HBsAg；8 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為20 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及16 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 20 Lf之量之D抗原；4 Lf之量之T抗原；14 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；10 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為20 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、及16 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。 25 Lf之量之D抗原；10 Lf之量之T抗原；16 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為20 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及16 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如前述申請專利範圍中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含以下中任一種： 10 Lf之量之D抗原；2 Lf之量之T抗原；12 IOU之量之wP抗原；8 µg之量之HBsAg；8 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為20 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、4 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及16 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 20 Lf之量之D抗原；4 Lf之量之T抗原；14 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；10 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為20 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、4 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及16 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 25 Lf之量之D抗原；10 Lf之量之T抗原；16 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為20 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、4 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及16 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如前述申請專利範圍中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含以下中任一種： 10 Lf之量之D抗原；2 Lf之量之T抗原；12 IOU之量之wP抗原；8 µg之量之HBsAg；8 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為20 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、及16 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 20 Lf之量之D抗原；4 Lf之量之T抗原；14 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；10 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為20 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、及16 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 25 Lf之量之D抗原；10 Lf之量之T抗原；16 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為20 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及16 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如前述申請專利範圍中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含以下中任一種： 10 Lf之量之D抗原；2 Lf之量之T抗原；12 IOU之量之wP抗原；8 µg之量之HBsAg；8 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為20 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、4 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及16 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 20 Lf之量之D抗原；4 Lf之量之T抗原；14 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；10 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為20 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、4 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及16 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 25 Lf之量之D抗原；10 Lf之量之T抗原；16 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為20 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、4 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及16 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如前述申請專利範圍中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含以下中任一種： 10 Lf之量之D抗原；2 Lf之量之T抗原；12 IOU之量之wP抗原；8 µg之量之HBsAg；8 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為7.5 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、及6 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；或 20 Lf之量之D抗原；4 Lf之量之T抗原；14 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；10 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為7.5 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及6 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；或 25 Lf之量之D抗原；10 Lf之量之T抗原；16 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為7.5 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及6 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯。
如前述申請專利範圍中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含以下中任一種： 10 Lf之量之D抗原；2 Lf之量之T抗原；12 IOU之量之wP抗原；8 µg之量之HBsAg；8 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為7.5 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、1.5 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及6 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al3+)；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；或 20 Lf之量之D抗原；4 Lf之量之T抗原；14 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；10 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為7.5 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、1.5 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及6 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；或 25 Lf之量之D抗原；10 Lf之量之T抗原；16 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為7.5 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、1.5 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及6 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯。
如前述申請專利範圍中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含以下中任一種： 10 Lf之量之D抗原；2 Lf之量之T抗原；12 IOU之量之wP抗原；8 µg之量之HBsAg；8 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為7.5 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及6 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 20 Lf之量之D抗原；4 Lf之量之T抗原；14 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；10 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為7.5 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及6 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。 25 Lf之量之D抗原；10 Lf之量之T抗原；16 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為7.5 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及6 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如前述申請專利範圍中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含以下中任一種： 10 Lf之量之D抗原；2 Lf之量之T抗原；12 IOU之量之wP抗原；8 µg之量之HBsAg；8 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為7.5 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、1.5 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及6 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 20 Lf之量之D抗原；4 Lf之量之T抗原；14 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；10 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為7.5 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、1.5 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及6 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 25 Lf之量之D抗原；10 Lf之量之T抗原；16 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為40 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、8 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及32 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如前述申請專利範圍中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含以下中任一種： 10 Lf之量之D抗原；2 Lf之量之T抗原；12 IOU之量之wP抗原；8 µg之量之HBsAg；8 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為7.5 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、及6 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 20 Lf之量之D抗原；4 Lf之量之T抗原；14 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；10 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為7.5 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、及6 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 25 Lf之量之D抗原；10 Lf之量之T抗原；16 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為7.5 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)及6 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
如前述申請專利範圍中任一項之免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含以下中任一種： 10 Lf之量之D抗原；2 Lf之量之T抗原；12 IOU之量之wP抗原；8 µg之量之HBsAg；8 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為7.5 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、1.5 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及6 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 20 Lf之量之D抗原；4 Lf之量之T抗原；14 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；10 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為7.5 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、1.5 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及6 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 25 Lf之量之D抗原；10 Lf之量之T抗原；16 IOU之量之wP抗原；15 µg之量之HBsAg；13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為7.5 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、1.5 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及6 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；不多於0.55 mg之總鋁含量(Al³⁺ )；2.5 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；0.9 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；0.1 mg(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯。
一種製造全液體之多劑量免疫原性組合物之方法，該組合物包含： (i)白喉類毒素，(D)； (ii)破傷風類毒素，(T)； (iii)滅活全細胞百日咳，(wP)或無細胞百日咳，(aP)； (iv)乙型肝炎病毒表面抗原，(HBsAg)； (v)乙型流感嗜血桿菌抗原，(Hib)； (vi)滅活脊髓灰質炎病毒抗原，(IPV)以及 (vii)2-苯氧基乙醇及至少一種對羥基苯甲酸酯之組合；該方法包括以下步驟： a). 將生理鹽水添加到一攪拌器皿/容器中； b). 添加包含白喉類毒素之組分-I； c). 添加包含破傷風類毒素之組分-II； d). 添加包含滅活全細胞百日咳抗原或無細胞百日咳(aP)之組分-Ⅲ； e). 添加包含乙型肝炎表面抗原之組分-IV； f). 添加包含Hib抗原之組分-V； g). 添加包含IPV抗原之組分-VI，其中IPV 1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)之量為1-50 DU/0.5 ml；及IPV 3型(Saukett菌株或Sabin菌株)之量為1-50 DU/0.5 ml； h). 添加選自以下之防腐劑聯合： 1至6 mg/0.5 ml(v/v)之量之2-苯氧基乙醇及0.1至1.5 mg/0.5 ml(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯；或 1至6 mg/0.5 ml(v/v)之量之2-苯氧基乙醇及0.05至0.2 mg/0.5 ml(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯；或 1至6 mg/0.5 ml(v/v)之量之2-苯氧基乙醇，0.1至1.5 mg/0.5 ml(w/v)之量之對羥基苯甲酸甲酯及0.05至0.2 mg/0.5 ml(w/v)之量之對羥基苯甲酸丙酯； i). 用氫氧化鈉/碳酸鈉將pH調節至6.0至7.0；以及 j). 添加生理鹽水以補足體積。
如申請專利範圍第54項之方法，其中該組分-VI進一步包含1-20 DU/0.5 ml之量之IPV抗原2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)。
如申請專利範圍第54項之方法，其中該組分I之製備包括以下步驟： a). 將磷酸鋁轉移到該容器/器皿中； b). 添加白喉類毒素； c). 用醋酸/氫氧化鈉將pH調節至4.5至5.5； d). 穩定； e). 用氫氧化鈉/碳酸鈉將pH調節至5.5至6.5；以及 f). 用組氨酸緩衝液穩定。
如申請專利範圍第54項之方法，其中該組分II之製備包括以下步驟： a). 將磷酸鋁轉移到該容器/器皿中； b). 添加破傷風類毒素； c). 用醋酸/氫氧化鈉將pH調節至4.5至5.5； d). 穩定； e). 用氫氧化鈉/碳酸鈉將pH調節至5.5至6.5；以及 f). 用組氨酸緩衝液穩定。
如申請專利範圍第54項之方法，其中該組分II之製備包括以下步驟： a). 百日咳博多特氏菌菌株134在甲醛存在下於56℃滅活10-15分鐘； b). 百日咳博多特氏菌菌株509在甲醛存在下於56℃滅活10-15分鐘； c). 百日咳博多特氏菌菌株25525及6229在甲醛存在下於56℃滅活10-15分鐘； c) 百日咳博多特氏菌菌株6229在甲醛存在下於56℃滅活10-15分鐘； d). 隨後以1:1:0.25:0.25之比例混合滅活百日咳博多特氏菌菌株134、509、25525及6229； e). 視情況吸附在鋁基佐劑上；其中該方法不含硫柳汞且滅活全細胞百日咳抗原保持不結塊且均質，從而導致降低之反應原性，並且在更長之時間內提供更佳之效力。
如申請專利範圍第54項之方法，其中該組分IV之製備包括以下步驟： a). 將磷酸鋁轉移到該容器/器皿中； b). 添加乙型肝炎表面抗原； c). 用醋酸/氫氧化鈉將pH調節至4.5至5.5； d). 穩定； e). 用氫氧化鈉/碳酸鈉將pH調節至5.8至6.8；以及 f). 穩定。
如申請專利範圍第54項之方法，其中該組分-V之製備包括以下步驟： a). 使乙型流感嗜血桿菌發酵； b). 在0.1%甲醛存在下於37℃滅活2小時； c). 使Hib磷酸多核糖基核糖醇(PRP)多糖純化； d). 在己二酸二醯肼(ADH)接頭存在下，使用溴化氰氰基化接合化學將步驟c之純化產物與破傷風類毒素(TT)接合； e). 使步驟d之接合物純化；及 f). 純化之接合物較佳透過0.22 µm过滤器過濾；其中游離PRP在整個純化之Hib整體接合物中之百分比不超過5%。
一種全液體之多劑量免疫原性組合物，其中0.5 ml之該組合物包含10至25 Lf之量之D抗原；2 至10 Lf之量之T抗原；12至16 IOU之量之wP抗原；7至15 µg之量之HBsAg；7至13 µg之量之Hib抗原；IPV抗原，分別為1-25 DU之量之1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)、1-10 DU之量之2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)及1-20 DU之量之3型(Saukett菌株或Sabin菌株)；0.1至0.6 mg之量之總鋁含量(Al³⁺ )；約1至6 mg(v/v)之量之2-苯氧基乙醇；其中該組合物藉由以下方法製備： a). 將生理鹽水添加到一攪拌器皿/容器中； b). 添加包含白喉類毒素之組分-I； c). 添加包含破傷風類毒素之組分-II； d). 添加包含滅活全細胞百日咳抗原或無細胞百日咳(aP)之組分-Ⅲ； e). 添加包含乙型肝炎表面抗原之組分-IV； f). 添加包含Hib抗原之組分-V； g). 添加包含IPV抗原之組分-VI，其中IPV 1型(Mahoney菌株或Sabin菌株)之量為1-25 DU；2型(MEF-1菌株或Sabin菌株)之量為1-10 DU及3型(Saukett菌株或Sabin菌株)之量為1-20 DU； h). 添加1至6 mg/0.5 ml(v/v)之量之2-苯氧基乙醇 i). 用氫氧化鈉/碳酸鈉將pH調節至6.0至7.0；及 j). 添加生理鹽水以補足體積。