TW202031296A - Cd44靶向多臂偶聯物 - Google Patents

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Abstract

本發明公開了一類可以特異性靶向CD44的多支鏈藥物偶聯物。這類化合物與CD44發生了特異性結合，可以靶向高表達CD44的腫瘤細胞和組織，使得該偶聯物在目標組織的濃度更高，提高其臨床治療效果，降低毒性。本發明化合物適用於治療所有高表達CD44的腫瘤，包括但不限於胃癌、胰腺癌、小細胞肺癌、結腸癌、乳腺癌、肺腺癌、肝癌、鼻咽癌、惡性膠質瘤、淋巴瘤、腎癌、卵巢癌、頭頸癌、鱗狀細胞癌等。

Description

CD44靶向多臂偶聯物
本發明總體上涉及多臂靶向偶聯物。具體地，本發明涉及CD44靶向分子與抗癌劑協同作用的多臂偶聯物。
惡性腫瘤的發病率與死亡率近些年來呈明顯上升趨勢，已經對人類的身體健康構成了嚴重的威脅。
CD44是一組分佈較為廣泛、分子形式多樣的膜整合糖蛋白，包括胞外區、跨膜區和近膜區。CD44作為I型跨膜糖蛋白，首先結合透明質酸，引發細胞內訊息途徑，繼而導致了一系列細胞脫落、轉移、侵襲反應。CD44作為細胞黏附分子家族中的一員，在調節細胞與細胞間和細胞與細胞外基質之間的粘附和結合方面發揮重要作用，對維繫組織結構整體性非常重要。CD44還可傳導細胞內訊息，調節腫瘤細胞的發生、活動等，如乳腺癌、結直腸癌等。當前大量研究認為CD44與腫瘤的發生、發展、浸潤、轉移關係密切，CD44的表達常出現在腫瘤發生的早期階段，並且隨著腫瘤發展，差異更加顯著，像一些癌前病變，CD44就有所表達。
“CD44靶向多肽”是指能與CD44靶向結合的多肽。典型的“CD44靶向多肽”包括具有以下結構的多肽：Ac-KPSSPPEE-NH2 和Ac-NASAPPEE-NH2 。上述兩個多肽與CD44的部分連接域具有序列同源性，可以與CD44靶向性結合。
其中，結構為Ac-KPSSPPEE-NH2 的多肽也被稱之為A6多肽，A6的結構如下：
Figure 02_image003
Ac-NASAPPEE-NH2 的多肽結構如下：
Figure 02_image005
WO2005028539、WO2010019233、WO2011063156、WO2011063158公開了一種處於臨床三期的藥物nktr-102，該藥物主要用於轉移性乳腺癌，由Nektar Therapeutics研發。該藥物是一種水溶性的多支鏈聚合物前驅藥物，以提高藥物的負載，結構如下：
Figure 02_image007
該化合物是使用多臂PEG與伊立替康連接，以提高水溶性，增加載藥量，在抗癌作用不變的情況下，降低副作用。但該藥物仍具有缺點，比如，靶向性較差，不能作用於特定的癌細胞，在殺死癌細胞的同時，也會影響正常細胞的性能，而使不良反應發生率仍然比較高。
中國專利申請CN 108727583 A公開了一種多臂的聚合靶向抗癌偶聯物，該類化合物不僅呈現出高載荷能力，而且具有靶向性，使得該偶聯物在目標組織的濃度更高。但由於惡性腫瘤細胞的結構、功能和代謝出現異常，細胞的分裂和增殖無休止並且無秩序，非常難以清除，需要藥品研發人員不斷開發療效更好的抗癌藥物。
發明概要
本發明公開了一種具有靶向性的多支鏈藥物偶聯物，該偶聯物具有三個或更多的支鏈，該偶聯物可表示為下式：
Figure 02_image001
(Ⅰ)。
R為有機中心，POLY為聚合物，L為多價連接子，T為靶向分子，D為活性劑，q為3-8之間的任一整數。
有機中心，“R”
在結構式(Ⅰ)中，“R”是一個1-100個原子的有機核心基團。比較好地是，R含有3-50個原子，更好地是，R含有大約3-30個原子。R可以為全部為碳原子的核心，也可選擇性的含有1個或多個雜原子，例如，O、S、N、P等，取決於所使用的特殊中心分子。R可以是直鏈、支鏈或環狀的，發出至少3個獨立的聚合物支鏈。結構式(Ⅰ)中，“q”與從“R”發出的聚合物支鏈的數量相對應。
在一些具體的方案中，“R”具有三個聚合物支鏈，“R”優選為：
Figure 02_image010
、
Figure 02_image012
在一些具體的方案中，“R”具有四個聚合物支鏈，“R”優選為：
Figure 02_image014
、
Figure 02_image016
、
Figure 02_image018
在一些具體的方案中，“R”具有六個聚合物支鏈，“R”優選為：
Figure 02_image020
在一些具體的方案中，“R”具有八個聚合物支鏈，“R”優選為：
Figure 02_image022
、
Figure 02_image024
聚合物，“POLY”
在結構式(Ⅰ)中，“POLY”為聚合物，優選的聚合物為水溶性的，任意的水溶性聚合物可以用於形成本發明的偶聯物，本發明所指聚合物可以是任意幾何形態或形式的。代表性的聚合物包括但並不限於：聚乙二醇、聚丙二醇、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羥烷基甲基丙烯酸胺)、聚(羥烷基甲基丙烯酸鹽)、聚(醣類)、聚(α-羥基酸)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯乙酸)、聚膦嗪、聚唑啉、聚(N-丙烯醯嗎啉)等。
在典型的化合物中，“POLY”為聚乙二醇，可為任意幾何形態或形式，包括直鏈、支鏈、叉形鏈等，較好的，本發明優選的“POLY”為直線型的聚乙二醇，典型的結構為：
Figure 02_image026
，“
Figure 02_image028
”代表原子的連接處，標“&”號的氧原子為與有機中心“R”連接的原子。其中k 的取值範圍為大約5~500，最好為50~200，優選101~125，更優選k 為113。本領域技術人員應該知曉，在高分子領域，k 代表所述的聚合物的聚合度，即聚合物大分子鏈上所含重複單元數目的平均值，其取決於所述的聚合物的分子量，例如，當k 為113時，是指平均值為113。在聚合物大分子鏈上所含重複單元數目的平均值為113的情況下，實際上包含了重複單元數目不等的聚合物分子鏈，例如，不同聚合物分子鏈的實際的重複單元的個數可能為例如100-130。 r為1-10之間的任一整數，更優選的，本發明“POLY”為：
Figure 02_image030
或
Figure 02_image032
。
本發明POLY還可為：
Figure 02_image034
等。
在本發明的具體方案中，“R”是具有5個碳原子的有機核心基團，其可連接四個聚合物支鏈，每個聚合物支鏈包括線狀的聚乙二醇連接臂。
在具體的符合結構式(Ⅰ)的多支鏈藥物偶聯物的製備中，可預先製備或購買所需的多臂聚合物，即連接有q個聚合物臂的R，
Figure 02_image036
。
在具體方案中，多臂聚合物
Figure 02_image036
可以為3armPEG20K-SCM、4armPEG20K-SCM或8armPEG20K-SCM。其中，
Figure 02_image036
優選分子量約為20 kDa。所述的“約為20 kDa”是指分子量在20000±2000之間。
在本發明的實施例中所使用的4arm-PEG20K-SCM的結構如下：
Figure 02_image038
。
本發明優選的方案中，“POLY”為線狀的聚乙二醇連接臂，即本發明偶聯物優選下述類型的化合物：
Figure 02_image040
。
在本發明中，多價連接子L優選為：
Figure 02_image042
。
符號“*”在這裡代表多價連接子L與靶向分子T的連接點，“#”代表多價連接子L與活性劑D的連接點，“%”代表多價連接子L與POLY的連接點。其中，m為1-20之間的任一整數，l 、n分別為1-10之間的任一整數。最優選的，l 為5，m為3，n為4，即本發明優選的多價連接子L為
Figure 02_image044
。
D為如下式所示的喜樹鹼類藥物：
Figure 02_image046
R1 -R5 相互獨立地選自於以下基團：氫、鹵素、醯基、烷基、取代的烷基、烷氧基、取代烷氧基、烯基、炔基、環烷基、羥基、氰基、硝基、疊氮基、醯胺基、肼、胺基、取代胺基、羥基羰基、烷氧羰基、烷氧羰氧基、任選取代的胺基甲醯氧基、芳基磺醯氧基、烷基磺醯氧基、R9 C(O)O-，其中R9 是鹵素、胺基、取代的胺基、雜環、取代的雜環；R6 為H或OR8 ，R8 為烷基、烯基、環烷基、鹵代烷基或羥烷基；R7 為羥基、胺基、或硫醇。
所述雜環優選含氮雜環，更優選5-6員含氮雜環。對於上述具有取代基的基團，其取代基可選自羥基、氰基、C1-C5直鏈或支鏈烷基、C3-C7環烷基、C1-C5直鏈或支鏈烷氧基、5-6員雜環基、5-12員芳基或5-12員雜芳基，所述5-12員雜芳基和5-6員雜環基優選氮原子作為雜原子。所述雜環例如可以是吡咯，哌啶等，所述5-6員雜環基例如可以是吡咯基，哌啶基；所述芳基包括苯基，萘基，聯苯基及其類似物。
另外，對於取代的胺基甲醯氧基而言，其取代基連同其所連接的N原子還可以形成6員環，且該6員環還可以具有上述取代基。
優選的，D為伊立替康或SN38。
其中，伊立替康結構如下：
Figure 02_image048
。
SN38的結構如下：
Figure 02_image050
。
T為靶向分子，其為可與CD44結合的“CD44靶向多肽”。典型的“CD44靶向多肽”包括具有以下序列的多肽： Ac-KPSSPPEE-NH2 ；Ac-NASAPPEE-NH2 ；QETWFQNGWQGKNP； KEKWFENEWQGKNP；KEQWFGNRWHEGYR； QIRQQPRDPPTETLELEVSPDPAS。
還包括上述多肽的取代變異體(substitution variants)、加成變異體(addition variants)和化學修飾衍生物。
T還可為WO99/05263所公開的多肽，即具有以下序列的多肽或者其取代變異體(substitution variants)、加成變異體(addition variants)和化學修飾衍生物：Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu (KPSSPPEE)、Asn-Ala-Ser-Ala-Pro-Pro-Glu-Glu (NASAPPEE)。此外，T還可為WO2007141533所公開的FKBP-L多肽。
靶向分子T還可為能與CD44結合的單克隆抗體或其天然配體。能與CD44結合的天然配體包括且不限於透明質酸(hyaluronic acid, HA)、骨橋蛋白(osteopontin, OPN)、絲甘蛋白(Serglycin)、膠原蛋白(Collagen)、纖維連接蛋白(Fibronectin)、層黏連蛋白(Laminin)、硫酸軟骨素C (chondroitin sulfate C, CSC)、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate, HS)、錨蛋白(ankyrin)、半乳糖凝集素(Galectin-3)、L-選擇素、P-選擇素、C型凝集素和位址素(addressin)等。
本發明優選的靶向分子T為Ac-KPSSPPEE-NH2 和Ac-NASAPPEE-NH2 。這兩個多肽以封端的NH2 端和多價連接子L相連。
在本發明的具體實施方案中，結構式(Ⅰ)的多支鏈藥物偶聯物包括如下化合物A、化合物B、化合物C、化合物D。
Figure 02_image052
化合物A
Figure 02_image054
化合物B
Figure 02_image056
化合物C
Figure 02_image058
化合物D 其中，化合物A，化合物B，化合物C和化合物D分子結構中的k各自獨立地為101~125，優選k各自獨立地為113。
在本發明的具體實施方案中，結構式(Ⅰ)的多支鏈藥物偶聯物為：
Figure 02_image060
化合物a 在化合物a中，D為伊立替康，T為A6，即Ac-KPSSPPEE-NH2 。
Figure 02_image062
化合物b 在化合物b中，D為伊立替康，T為Ac-NASAPPEE-NH2 。
Figure 02_image064
化合物c 在化合物c中，D為SN38，T為A6，即Ac-KPSSPPEE-NH2 。
Figure 02_image066
化合物d 在化合物d中，D為SN38，T為Ac-NASAPPEE-NH2 。
在本發明的實施方案中，製備具有結構式(Ⅰ)的多支鏈藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽的方法包括： 將活性劑D與多價連接子L進行連接，得到D-L部分； 將D-L部分與多臂聚合物
Figure 02_image036
連接，得到
Figure 02_image068
； 將
Figure 02_image068
與靶向分子T連接。
本發明為一個多臂聚合物修飾的靶向抗癌偶聯物，其中，水溶性的聚合物修飾可增強該偶聯物的水溶性，從而提高載藥量；靶向分子增加靶向性，使得該偶聯物在目標組織的濃度更高；L為任意的連接子，其作用是首先將靶向分子與抗癌藥物連接起來，再將靶向分子、抗癌藥物與聚合物臂連接起來，使得整個偶聯物形成一個有機的整體。本發明偶聯物是典型的前驅藥物，透過水解作用或酶解作用，活性劑D被釋放出來，與母體分離，發揮生理活性。相比未偶聯的藥物，本發明偶聯物能夠表現出更強的作用，在人體或其他動物體內組織更加富集。
本發明偶聯物，藥學上可接受的鹽包括無機鹽和有機鹽，典型的鹽包括硝酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、甲酸鹽、乳酸鹽、苯甲酸鹽、醋酸鹽、三氟乙酸鹽、二氯乙酸鹽、三氯乙酸鹽、混合的氯氟乙酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽、磺酸鹽、甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、庚烷磺酸鹽等，其中優選鹽酸鹽和醋酸鹽，可用藥物化學領域的常規手段成鹽。
在本發明的具體方式中，化合物A，化合物B，化合物C和化合物D的典型的鹽包括鹽酸鹽、醋酸鹽，典型的鹽酸鹽為每個支鏈分別結合一分子或兩分子鹽酸的鹽酸鹽，典型的醋酸鹽為每個支鏈分別結合一分子或兩分子醋酸的醋酸鹽。
化合物a、化合物b、化合物c、化合物d典型的鹽酸鹽為每個支鏈分別結合一分子或兩分子鹽酸的鹽酸鹽，該優選的偶聯物為四或八分子鹽酸鹽。
化合物a、化合物b、化合物c、化合物d典型的醋酸鹽為每個支鏈分別結合一分子或兩分子醋酸的醋酸鹽，該優選的偶聯物為四或八分子醋酸鹽。
本發明化合物能夠與CD44發生特異性結合，可以靶向高表達CD44的腫瘤細胞和組織，使得該偶聯物在目標組織的濃度更高，提高其臨床治療效果，降低毒性。
本發明化合物適用於治療所有高表達CD44的腫瘤，包括但不限於胃癌、胰腺癌、小細胞肺癌、結腸癌、乳腺癌、肺腺癌、肝癌、鼻咽癌、惡性膠質瘤、淋巴瘤、腎癌、卵巢癌、頭頸癌、鱗狀細胞癌等。
本發明還提供治療CD44高表達腫瘤的方法，包括將治療有效量的本發明提供的具有結構式(Ⅰ)的多支鏈藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，給藥於患有CD44高表達腫瘤的哺乳動物，所述哺乳動物包括人。
本發明還提供治療CD44腫瘤的方法，包括：將治療有效量的藥物組成物，給藥於患有CD44高度表現腫瘤的哺乳動物，所述哺乳動物包括人，所述藥物組成物包含具有結構式(Ⅰ)的多支鏈藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的賦形劑。
具體實施例
在下面將對本發明進行詳細描述。然而，本發明可能具體體現為許多不同的形式，而且它不應該被侷限於此處所描述的實施例中，提供這些實施例中的目的是使所披露內容更完整與全面。所用試劑和原料，除了提供製備方法的除外，其餘均為市售。4armPEG20K-SCM購自北京鍵凱科技有限公司，分子量約為20 kDa。除非另有定義，否則本文中所有科技術語具有的含義與申請專利範圍主題所屬技術領域人員通常理解的含義相同。
4arm-PEG20K-SCM結構如下：
Figure 02_image038
名詞解釋
縮寫 名詞解釋 縮寫 名詞解釋
DMF N,N-二甲基甲醯胺 TFA 三氟乙酸
DCM 二氯甲烷 TBME 甲基叔丁基醚
DMSO 二甲基亞碸 HOSU N-羥基琥珀醯亞胺
DMAP 4-二甲胺基吡啶 DME 乙二醇二甲醚
DCC 二環己基碳二亞胺 HOBT 1-羥基苯并三唑
IPA 異丙醇 THF 四氫呋喃
EA 乙酸乙酯 DIEA N,N-二異丙基乙胺
DEPC 氰基磷酸二乙酯 TEA 三乙胺
PBS 磷酸鹽緩衝液 EDC·HCl 1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽
DIC N,N-二異丙基碳二亞胺 TIS 三異丙基矽烷
實施例1
Figure 02_image070
1.BP103a的製備
向250 mL三口瓶中加入18.20 g化合物BP103a05，100 ml EA，攪拌溶解後降溫至0℃，加入150 ml HCl/EA (3.5 M)，保溫0℃，TLC監控反應完畢後將反應液濃縮至乾，加入甲基叔丁基醚製漿，過濾，濾餅用TBME洗滌、真空乾燥得白色固體BP103a 10.40 g。 2.BP103a07的製備
向100 mL燒瓶加入3.00 g BP103a (1.0 eq)，4.02 g (1.0 eq) BP102c07，40 ml DCM，4.0 ml DIEA (2.0 eq)，室溫攪拌，TLC監控反應完畢，蒸發去除有機溶劑，管柱層析得6.4 g油狀物BP103a07。 3.BP103a08的製備
向200 mL三口瓶中加入9.00 g BP103a07 (1.0 eq)，3.96 g HOSU (1.53 eq)，90 ml DCM，6.60g EDC·HCl (1.53 eq)，室溫反應2h，TLC監控反應完畢後，DCM稀釋後用50 mmol/L的磷酸二氫鉀水溶液洗滌2次，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，濃縮得無色油狀物5.93 g BP103a08。 4.BP103a30的製備
向200 mL燒瓶加入2.93 g化合物NH2 -Lys(Boc)-OH·HCl (1.0eq)，60 ml水，2.00 g NaHCO3 (2.0 eq)，攪拌滴加5.91 g BP103a08 (1.0 eq)溶於60 ml DME的溶液，補加60 ml THF，攪拌過夜，TLC監控反應完畢，蒸發去除有機溶劑，用稀鹽酸調節pH≈3，EA萃取，無水硫酸鈉乾燥，濃縮，得4.50 g無色油狀物BP103a30。 5.BP103a31的製備
向100 mL三口瓶中加入5.00 g BP103a30 (1.0 eq)，1.40g HOSU (1.53 eq)，50 ml DCM，2.33 g EDC·HCl (1.53 eq)，室溫反應2h，TLC監控反應完畢後，DCM稀釋後用50 mmol/L的磷酸二氫鉀水溶液洗滌2次，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，濃縮得無色油狀物4.89 g BP103a31。 實施例2     中間物Ac-KPSSPPEEC-NH2 的合成
Figure 02_image072
Ac-KPSSPPEEC-NH2 合成採用本專業人員熟知的Fmoc法固相合成，利用Rink-amide Resin、採用20%的哌啶/DMF脫除Fmoc，偶聯試劑採用HOBT/DIC，DMF為反應溶劑，反應監控採用茚三酮檢測法，依次將下列保護胺基酸連接到樹脂上：Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH，並用醋酸酐、吡啶乙醯化，然後DMF洗滌、甲醇洗滌、DCM洗滌後乾燥，加入裂解試劑(TFA：苯甲硫醚：苯酚：TIS=85：5：5：5)，反應2小時後用冰TBME沉澱、離心，得Ac-KPSSPPEEC-NH2 粗產物，經HPLC製備純化後凍乾得純物質。 實施例3     中間物Ac-NASAPPEEC-NH2 的合成
Figure 02_image074
Ac-NASAPPEEC-NH2 合成採用本專業人員熟知的Fmoc法固相合成，利用Rink-amide Resin、採用20%的哌啶/DMF脫除Fmoc，偶聯試劑採用HOBT/DIC，DMF為反應溶劑，反應監控採用茚三酮檢測法，依次將下列保護胺基酸連接到樹脂上：Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH，並用醋酸酐、吡啶乙醯化，然後DMF洗滌、甲醇洗滌、DCM洗滌後乾燥，加入裂解試劑(TFA：苯甲硫醚：苯酚：TIS=85：5：5：5)，反應2小時後用冰TBME沉澱、離心，得Ac-NASAPPEEC-NH2 粗產物，經HPLC製備純化後凍乾得純物質。 實施例4
Figure 02_image076
1.BP143b02的製備
向250 mL圓底燒瓶中加入3.50 g鹽酸伊立替康三水合物(1.0 eq)，52.5 ml DMF，加熱至60℃溶解，5-10 min後減壓蒸發去除DMF，加入300 ml正庚烷減壓蒸餾，重複三次，旋轉乾燥後加入105 ml DCM，1.08g Boc-Gly-OH (1.2 eq)，63 mg DMAP (0.1 q)，滴加1.59 g DCC (1.5 eq)溶於10 ml DCM的溶液，20℃反應4小時，TLC監控反應完畢後，過濾，濃縮至剩餘25%體積時加入120 ml IPA，蒸發去除75%的溶劑，加入150 ml正庚烷，室溫攪拌1小時，過濾，正庚烷洗滌2次，乾燥得淡黃色固體4.02 g BP143b02。 2.BP143b03的製備
向100 mL三口瓶中加入4.02 g BP143b02，50 ml DCM，攪拌溶解後滴加11.6 ml TFA，室溫反應2h，TLC監控反應完畢後加入150 ml乙腈，減壓蒸餾120 ml溶劑後倒入320 ml TBME溶液中，攪拌30 min，過濾，濾餅用TBME洗滌得淡黃色固體BP143b03 4.00 g。 3.BP143b04的製備
向200 mL三口瓶中加入3.69 g BP143b03，100 ml DCM，3.21 g (1.05 eq) BP103a30，2.7 ml DIEA (3.0 eq)，1.2 ml DEPC (1.5 eq)，室溫反應1h，TLC監控反應完畢後，DCM稀釋後，水洗兩次，飽和食鹽水洗滌一次，乾燥，濃縮，HPLC純化後凍乾得到淡黃色固體BP143b04 1.85 g。 4.BP143b05的製備
向50 mL圓底燒瓶中加入1.20 g BP143b04，10 ml的10% TFA/DCM，室溫反應，TLC監控反應完畢後，倒入TBME中，離心，乾燥得淡黃色固體化合物BP143b05 210 mg。 5. BP143b06的製備
向10 mL圓底燒瓶中加入51 mg BP143b05 (4.0 eq)，2 ml DCM，11 μl TEA (8.0 eq)，201 mg 4armPEG20K-SCM (1.0 eq)，室溫反應過夜後，濃縮，加入TBME中，離心，經HPLC製備純化、凍乾得黃綠色固體化合物BP143b06 85 mg。 實施例5
Figure 02_image078
Figure 02_image080
1.  BP149a01的製備
向100 mL三口燒瓶中加入10.00 g化合物SN38 (1.0 eq)，110 ml DMSO，溶解澄清後加入5.56 g (Boc)2 O (1.0 eq)、9.82 g DIEA (3.0 eq)，反應2小時後TLC監控反應完畢，將反應液倒入純化水中，乙酸乙酯萃取3次，合併有機相，用純化水洗滌，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，得類白色固體，甲基叔丁基醚製漿後過濾，乾燥後得類白色固體7.95 g化合物BP149a01。 2.  BP149a02的製備
向250 mL圓底燒瓶中加入7.95 g化合物BP149a01 (1.0 eq)，2.83 g Boc-Gly-OH (1.0 eq)，80 ml二氯甲烷，390 mg DMAP (0.2 eq)，滴加5.00 g DCC (1.5 eq)溶於20 ml DCM的溶液，室溫反應1小時，TLC監控反應完畢後，過濾，濃縮至無液體蒸出，加入30 ml IPA，溶解澄清後加入200 ml正庚烷，攪拌製漿30分鐘，過濾，正庚烷洗滌2次，乾燥得淡黃色固體8.73 g化合物BP149a02。 3.  BP149a03的製備
向100 mL三口瓶中加入8.73 g化合物BP149a02，40 ml DCM，攪拌溶解後降溫至0℃，滴加40 ml TFA，室溫反應2h，TLC監控反應完畢後將反應液倒入800 ml TBME溶液中，攪拌30 min，過濾，濾餅用TBME洗滌，真空乾燥後得淡黃色固體BP149a03 4.95 g。 4.  BP149b01的製備
向200 mL三口瓶中加入2.3 g化合物BP149a03，45 ml DCM，3.196g (1.05 eq)化合物BP103a31，1.75 ml TEA (3.0 eq)，室溫反應4h，TLC監控反應完畢後，DCM稀釋，稀鹽酸洗滌1次，水洗兩次，飽和食鹽水洗滌一次，無水硫酸鈉乾燥，濃縮得粗產物，粗產物經HPLC製備純化後DCM萃取，無水硫酸鈉乾燥、濃縮乾燥得淡黃色固體BP149b01 2.20 g。 5.  BP149b02的製備
向200 mL三口燒瓶中加入2.0 g化合物BP149b01，40 ml的10% TFA/DCM，室溫反應，TLC監控反應完畢後，倒入TBME中，離心，乾燥得淡黃色固體BP149b02 1.75 g。 6.  BP149b03的製備
向200 mL三口燒瓶中加入4.08 g化合物BP149b02 (5.0 eq)，100 ml DMF，1.96 g DIEA (20 eq)，16.05 g 4armPEG20K-SCM (1.0 eq)，室溫反應2小時後，倒入1 L甲基叔丁基醚中，攪拌30分鐘後過濾，乾燥得類白色固體20.50 g粗產物，粗產物經HPLC製備純化、凍乾得BP149b03 12.36 g純物質。 實施例6
Figure 02_image082
室溫條件下向100 ml三口反應瓶中加入2.00 g (1.0 eq) BP143b06，35 ml pH=7.0的PBS溶液攪拌溶解澄清，取0.45 g (5.0 eq)標靶多肽1 (Ac-KPSSPPEEC-NH2 )溶於30 ml純化水中，用碳酸氫鈉溶液調節pH≈6.5後加入到反應瓶中，0.5小時後HPLC檢測反應完畢，經HPLC製備純化、凍乾，得化合物a 1.65 g純物質。MALDI-TOF檢測分子量為28810.73。 實施例7
Figure 02_image084
室溫條件下向100 ml三口反應瓶中加入2.00 g (1.0 eq) BP143b06，35 ml pH=7.0的PBS溶液攪拌溶解澄清，取0.38 g (5.0 eq)標靶多肽2 (Ac-NASAPPEEC-NH2 )溶於30 ml純化水中，用碳酸氫鈉溶液調節pH≈6.5後加入到反應瓶中，0.5小時後HPLC檢測反應完畢，經HPLC製備純化、凍乾，得化合物b 1.42 g純物質。MALDI-TOF檢測分子量為28931.52。 實施例8
Figure 02_image086
室溫條件下向100 ml三口反應瓶中加入2.00 g (1.0 eq) BP149b03，35 ml pH=7.0的PBS溶液攪拌溶解澄清，取0.46 g (5.0 eq)標靶多肽1 (Ac-KPSSPPEEC-NH2 )溶於30 ml純化水中，用碳酸氫鈉溶液調節pH≈6.5後加入到反應瓶中，0.5小時後HPLC檢測反應完畢，經HPLC製備純化、凍乾，得化合物c 1.45 g純物質。MALDI-TOF檢測分子量為28191.63。 實施例9
Figure 02_image088
室溫條件下向100 ml三口反應瓶中加入2.00 g (1.0 eq) BP149b03，35 ml pH=7.0的PBS溶液攪拌溶解澄清，取0.39 g (5.0 eq)靶向多肽2 (Ac-NASAPPEEC-NH2 )溶於30 ml純化水中，用碳酸氫鈉溶液調節pH≈6.5後加入到反應瓶中，0.5小時後HPLC檢測反應完畢，經HPLC製備純化、凍乾，得化合物d 1.53 g純物質。MALDI-TOF檢測分子量為27982.32。 實施例10   合成生物素標記的靶向多肽3
Figure 02_image090
生物素標記的靶向多肽3的合成採用本專業人員熟知的Fmoc法固相合成，利用Rink-amide Resin、採用20%的哌啶/DMF脫除Fmoc，偶聯試劑採用HOBT/DIC，DMF為反應溶劑，反應監控採用茚三酮檢測法，依次將下列保護胺基酸連接到樹脂上：Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH，脫除Fmoc保護後用醋酸酐、吡啶乙醯化，加入水合肼的DMF溶液，脫除Dde保護基，依次連接Fmoc-PEG3-OH、生物素，然後DMF洗滌、甲醇洗滌、DCM洗滌後乾燥，加入裂解試劑(TFA：苯甲硫醚：苯酚：EDT：水=82.5：5：5：2.5：5)，反應2小時後用冰TBME沉澱、離心，得粗產物，經HPLC製備純化後凍乾得純物質。 實施例11   合成生物素標記的靶向多肽4
Figure 02_image092
生物素標記的靶向多肽4採用本專業人員熟知的Fmoc法固相合成，利用Rink-amide Resin、採用20%的哌啶/DMF脫除Fmoc，偶聯試劑採用HOBT/DIC，DMF為反應溶劑，反應監控採用茚三酮檢測法，依次將下列保護胺基酸連接到樹脂上：Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH 、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH，脫除Fmoc後用醋酸酐、吡啶乙醯化，加入水合肼的DMF溶液，脫除Dde保護基，依次連接Fmoc-PEG3-OH、Biotin，然後DMF洗滌、甲醇洗滌、DCM洗滌後乾燥，加入裂解試劑(TFA：苯甲硫醚：苯酚：EDT：水=82.5：5：5：2.5：5)，反應2小時後用冰TBME沉澱、離心，得粗產物，經HPLC製備純化後凍乾得純物質。 實施例12   化合物a-生物素偶合物的製備
Figure 02_image094
室溫條件下向100 ml三口反應瓶中加入2.00 g (1.0 eq) BP143b06，35 ml pH=7.0的PBS溶液攪拌溶解澄清，取0.57 g (5.0 eq)生物素標記的靶向多肽3溶於30 ml純化水中，用碳酸氫鈉溶液調節pH≈6.5後加入到反應瓶中，0.5小時後HPLC檢測反應完畢，經HPLC製備純化、凍乾，得1.24 g純物質。MALDI-TOF檢測分子量為30325.51。 實施例13   化合物b-生物素偶合物的製備
Figure 02_image096
室溫條件下向100 ml三口反應瓶中加入2.00 g (1.0 eq) BP143b06，35 ml pH=7.0的PBS溶液溶解澄清，取0.60 g (5.0 eq)生物素標記的靶向多肽4溶於30 ml純化水中，用碳酸氫鈉溶液調節pH≈6.5後加入到反應瓶中，0.5小時後HPLC檢測反應完畢，經HPLC製備純化、凍乾，得1.33 g純物質。MALDI-TOF檢測分子量為30596.56。 實施例14   化合物c-生物素偶合物的製備
Figure 02_image098
室溫條件下向100 ml三口反應瓶中加入2.00 g (1.0 eq) BP149b03，35 ml pH=7.0的PBS溶液攪拌溶解澄清，取0.55 g (5.0 eq)生物素標記的靶向多肽3溶於30 ml純化水中，用碳酸氫鈉溶液調節pH≈6.5後加入到反應瓶中，0.5小時後HPLC檢測反應完畢，經HPLC製備純化、凍乾，得1.26g純物質。MALDI-TOF檢測分子量為30223.25。 實施例15   化合物d-生物素偶合物的製備
Figure 02_image100
室溫條件下向100 ml三口反應瓶中加入2.00 g (1.0 eq) BP149b03，35 ml pH=7.0的PBS溶液攪拌溶解澄清，取0.58 g (5.0 eq)生物素標記的靶向多肽4溶於30 ml純化水中，用碳酸氫鈉溶液調節pH≈6.5後加入到反應瓶中，0.5小時後HPLC檢測反應完畢，經HPLC製備純化、凍乾，得1.33 g純物質。MALDI-TOF檢測分子量為30491.18。 實施例16   本發明化合物與CD44特異性結合 1. 材料和方法 1.1 本發明化合物用生物素標記的偶合物
化合物a-生物素偶合物、化合物b-生物素偶合物、化合物c-生物素偶合物、化合物d-生物素偶合物的結構及其製備方法見實施例10-15，在試驗中分別被稱之為偶合物a、偶合物b、偶合物c、偶合物d。 1.2細胞培養
SKOV3細胞在McCoy’s 5A培養液中培養。細胞培養液中添加了10% FBS，1000 U/mL青黴素，100 μg/mL鏈黴素和4 mmol/L l-麩醯胺酸。 1.3 偶合物與SKOV3細胞的結合
向偶合物a、偶合物b、偶合物c、偶合物d (分別溶於冰的PBS中，使其濃度為100 μmol/L)中加入5 mmol/L雙(磺基丁二醯亞胺)辛二酸鹽，使其與SKOV3細胞結合。加入Triton X-100細胞裂解液，細胞裂解後離心，轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜後進行免疫墨點分析。用與辣根過氧化物酶結合的鏈黴親和素(HRP-SA)培育PVDF膜，檢測與偶合物交聯的蛋白。透過抗CD44的單克隆抗體DF1485和過氧化物酶標記的驢抗小鼠免疫球蛋白墨點染色來檢測CD44。用新鮮配製的化學發光試劑和Hypermax ECL膠片曝光進行檢測。 1.4 偶合物標記蛋白的免疫沉澱
與偶合物交聯的SKOV3細胞透過Triton X-100裂解，與蛋白A瓊脂糖在室溫下培育2小時進行預清洗，將100 μg清洗過的裂解液與加了2 μg DF1485 (抗Cd44的抗體)或者鼠源IgG1的20 μL蛋白A瓊脂糖在室溫下培育過夜。用裂解緩衝液洗滌5次後，在SDS-PAGE樣品緩衝液中煮沸後從蛋白A-瓊脂糖中洗提免疫沉澱蛋白。洗提的材料和5 μg原始材料被加入SDS-PAGE，轉移到PVDF膜，再透過HRP-SA染色。 2. 結果
SKOV3細胞與偶合物結合。用DF1485對以此細胞製備的裂解物進行免疫沉澱。對被洗提的蛋白和起始的裂解物進行PAGE/blotting，分別以HRP-SA染色來檢測生物素標籤，以DF1485染色來檢測CD44。
當反應體系中包括起始裂解物、偶合物和HRP-SA，在0-250 kDa範圍內出現很多非特異性條帶；當反應體系中包括起始裂解物和HRP-SA，在0-250 kDa範圍內無條帶，說明以HRP-SA染色被偶合物標記的蛋白具有特異性。當反應體系中包括免疫沉澱蛋白、偶合物和HRP-SA，在85 kDa處出現特異性條帶；當反應體系中包括免疫沉澱蛋白和HRP-SA，在0-250 kDa範圍內無條帶，說明DF1485特異性地沉澱了被偶合物標記的約85 kDa的蛋白質。與初始裂解物相比，該條帶在免疫沉澱蛋白中的染色程度更明顯，表明該蛋白通過抗CD44免疫沉澱得到了極大的富集。
當反應體系中包括起始裂解物、偶合物和DF1485，在85 kDa處出現特異性條帶；當反應體系中包括起始裂解物和DF1485，在85 kDa處出現特異性條帶。當反應體系中包括免疫沉澱蛋白、偶合物和DF1485，在85 kDa處出現特異性條帶；當反應體系中包括免疫沉澱蛋白和DF1485，在85 kDa處出現特異性條帶。說明該85 kDa的條帶就是CD44，且CD44存在於所有樣品中。
以上結果表明，本發明化合物與CD44發生了特異性結合，可以靶向高表達CD44的腫瘤細胞和組織，使得該偶聯物在目標組織的濃度更高，提高其臨床治療效果，降低毒性。
在實施例17-21中，所有動物實驗操作嚴格遵守動物使用和管理規範。腫瘤相關參數的計算參考中國CFDA《細胞毒類抗腫瘤藥物非臨床研究技術指導原則》(2006年11月)，%T/C ≦ 40%並經統計學分析P >0.05為有效。相對腫瘤增殖率越低，說明抑制腫瘤效果越良好。
腫瘤體積(TV)計算公式如下：TV (mm3 ) =l × w2 /2 其中，l 表示腫瘤長徑(mm)；w表示腫瘤短徑(mm)。
相對腫瘤體積(RTV)的計算公式為：RTV =TVt /TVinitial 其中，TVinitial 為分組給藥時測量到的腫瘤體積；TVt 為給藥期間每一次測量時的腫瘤體積。
相對腫瘤增殖率(%T/C)的計算公式為：%T/C = 100% × (RTVT /RTVC ) 其中，RTVT 表示治療組RTV；RTVC 表示溶劑對照組RTV。
腫瘤生長抑制率TGI(%)的計算公式為：TGI = 100% × [1－(TVt(T) －TVinitial(T) )/(TVt(C) －TVinitial(C) )] 其中，TVt(T) 表示治療組每次測量的腫瘤體積；TVinitial(T) 表示分組給藥時治療組的腫瘤體積；TVt(C) 表示溶劑對照組每次測量的腫瘤體積；TVinitial(C) 表示分組給藥時溶劑對照組的腫瘤體積。
動物體重下降率的計算公式為：動物體重下降率 = 100% × (BWinitial －BWt )/BWinitial 其中，BWt 表示給藥期間每次測量的動物體重；BWinitial 表示分組給藥時的動物體重。
瘤重抑瘤率IR(%)的計算公式為：IR(%) = 100% × (WC －WT )/WC 其中，WC 表示對照組瘤重；WT 表示治療組瘤重。
試驗數據用Microsoft Office Excel 2007軟體進行計算和相關統計學處理。數據除特別說明外，用平均值±標準誤差(Mean±SE)表示，組間比較採用t-檢驗，P >0.05為顯著性差異。
實驗動物：雌性BALB/c裸小鼠(週齡：6~8週)，正常餵養約1週後，經獸醫檢驗，生命徵象狀況良好小鼠可入選本實驗。分組前使用記號筆於動物尾根部進行標識，分組後每只動物均用耳部剪缺方式標識。
化合物M、化合物a、化合物b給藥製劑配製：每次給藥前，分別準確稱量，加入2.5 mL的生理鹽水，渦旋震盪使藥物完全溶解，溶液中伊立替康有效濃度為4.0 mg·mL-1 。
化合物c、化合物d給藥製劑配製：每次給藥前，分別準確稱量，加入2. 5mL的生理鹽水，渦旋震盪使藥物完全溶解，溶液中SN38有效濃度為4.0 mg·mL-1 。
隨機分組：對動物接種腫瘤細胞後，當腫瘤體積達到100-300 mm3 時，將動物按隨機區組法分為6組，每組6隻小鼠，確保各組間腫瘤體積和小鼠體重均一。各組腫瘤體積的平均值與所有實驗動物腫瘤體積的平均值差異不超過±10％。
實驗開始後每週測量2次瘤徑，計算腫瘤體積，同時稱量動物體重並記錄。
實施例17-20的動物給藥為：於分組當天開始第一次給藥。第一組為溶劑對照組，尾靜脈注射給予生理鹽水。第2-6組分別尾靜脈注射給予受試樣品化合物M、化合物a、化合物b、化合物c、化合物d。
實驗結束後，稱量體重、測量瘤徑後動物安樂死(CO2 )。剝取腫瘤組織並稱重，計算RTV和%T/C。
實施例中所涉及到的對照測試樣品化合物M公開於中國專利申請CN 108727583 A，其結構如下：
Figure 02_image102
實施例17   本發明化合物對人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠異種移植瘤的抗腫瘤藥效實驗
測試樣品：化合物M、化合物a、化合物b、化合物c、化合物d。
試劑：DMEM培養液，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶，青黴素-鏈黴素，生理鹽水。
移植性腫瘤瘤株：人乳腺癌MDA-MB-231，來源於中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫(CAS，本實驗室液氮凍存)。
細胞培養：MDA-MB-231培養於DMEM培養基(DMEM，美國)，含10%胎牛血清FBS (GIBCO，美國)，培養於含5% CO2 的37℃培養箱。
動物模型製備：細胞接種法建立腫瘤裸鼠皮下移植模型，收集對數生長期的腫瘤細胞，計數後重新懸浮於1×PBS，調整細胞懸浮液濃度至1×107 細胞/ml。用1 ml注射器(4號針頭)在裸鼠右側背部皮下接種腫瘤細胞，1×106 細胞/小鼠。
給藥頻次及劑量：各組均為每週給藥一次，共給藥三次，QW×3，給藥劑量均為6mg·kg-1 (以伊立替康或SN38計)。
結果見表1： 表1    對腫瘤增殖率T/C(%)
組別 樣品 動物數 相對腫瘤體積 (RTV) 相對腫瘤增值率(%T/C)
1 空白溶劑 6 13.52 -
2 化合物M 6 2.34 17.3%
3 化合物a 6 0.109* 0.81%#
4 化合物b 6 0.254* 1.89%#
5 化合物c 6 0.417* 3.10%#
6 化合物d 6 0.262* 1.95%#
*與空白溶劑、化合物M組的RTV相比，P ＜0.05 #與空白溶劑、化合物M組的%T/C相比，P ＜0.05
實驗結果顯示，本發明化合物對人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤有良好抑制作用，且優於化合物M。 實施例18   本發明化合物對人胃癌NCI-N87細胞株裸鼠移植瘤模型腫瘤體內生長的抑制作用。
測試樣品：化合物M、化合物a、化合物b、化合物c、化合物d。
試劑：RPMI-1640培養液，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶，青黴素-鏈黴素，生理鹽水。
移植性腫瘤瘤株：人胃癌細胞NCI-N87，來源於中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫(CAS，本實驗室液氮凍存)。
細胞培養：在5% CO2 、37℃培養條件下，NCI-N87細胞在含10%胎牛血清RPMI-1640培養液中進行常規細胞培養；以0.25%胰蛋白酶分解繼代培養；根據細胞生長情況，每週繼代培養1到2次，繼代培養比例為1:2到1:6。
動物模型製備：收取對數生長期NCI-N87細胞，細胞計數後重新懸浮於無血清的RPMI-1640培養基中，調整細胞濃度至5×107 個細胞/mL；用移液器吸沖細胞使其分散均勻後裝入50 mL離心管中，將離心管置於冰盒中；用1 mL注射器吸取細胞懸浮液，注射到裸鼠前右肢腋窩皮下，每隻動物接種100 μL (5×106 個細胞/隻)，建立NCI-N87裸鼠移植瘤模型。
給藥頻次及劑量：各組均為每週給藥一次，共給藥四次，QW×4，給藥劑量均為20 mg·kg-1 。
結果見表2： 表2    對腫瘤增殖率T/C(%)
組別 樣品 動物數 相對腫瘤體積 (RTV，mm3 ) 平均相對腫瘤增值率(%T/C)
1 空白溶劑 6 7.31 -
2 化合物M 6 1.22 17.00%
3 化合物a 6 0.601* 8.20%#
4 化合物b 6 0.687* 9.37%#
5 化合物c 6 0.705* 9.62%#
6 化合物d 6 0.653* 8.91%#
*與空白溶劑、化合物M組的RTV相比，P ＜0.05 #與空白溶劑、化合物M組的%T/C相比，P ＜0.05
實驗結果顯示，本發明化合物對人胃癌NCI-N87細胞株裸鼠移植瘤模型腫瘤生長有良好抑制作用，且優於化合物M。 實施例19   HT-29裸鼠移植瘤模型體內藥效評估
測試樣品：化合物M、化合物a、化合物b、化合物c、化合物d。
試劑：McCoy’s 5A培養液，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶，青黴素-鏈黴素，注射用水，生理鹽水，乳酸，山梨糖醇。
移植性腫瘤瘤株：人結腸癌細胞HT-29，來源於中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫(CAS，本實驗室液氮凍存)。
細胞培養：在5% CO2 、37℃培養條件下，HT-29細胞在含10%胎牛血清McCoy’s 5A培養液中進行常規細胞培養；以0.25%胰蛋白酶分解繼代培養；根據細胞生長情況，每週繼代培養2到3次，繼代培養比例為1:4到1:6。
動物模型製備：收取對數生長期HT-29細胞，細胞計數後重新懸浮於無血清McCoy’s 5A培養基中，調整細胞濃度至4×107 個細胞/mL；用移液器吸沖細胞使其分散均勻後裝入50 mL離心管中，將離心管置於冰盒中；用1 mL注射器吸取細胞懸浮液，注射到裸鼠前右肢腋窩皮下，每只動物接種100 μL (4×106 個細胞/隻)，建立HT-29裸鼠移植瘤模型。
給藥頻次及劑量：各組均為每週給藥一次，共給藥四次，QW×4，給藥劑量均為20 mg·kg-1 。
結果見表3： 表3    對腫瘤增殖率T/C(%)
組別 樣品 動物數 相對腫瘤體積 (RTV) 相對腫瘤增值率(%T/C)
1 空白溶劑 6 9.76 -
2 化合物M 6 2.63 27%
3 化合物a 6 0.479* 4.9%#
4 化合物b 6 1.045* 10.23%#
5 化合物c 6 0.837* 8.56%#
6 化合物d 6 0.812* 8.31%#
*與空白溶劑、化合物M組的RTV相比，P ＜0.05 #與空白溶劑、化合物M組的%T/C相比，P ＜0.05
實驗結果顯示，本發明化合物對人結腸癌HT-29裸鼠移植瘤模型腫瘤體內生長有良好抑制作用，且優於化合物M。 實施例20   對人胰腺癌MIA Paca-2裸鼠異種移植模型的抑制作用
測試樣品：化合物M、化合物a、化合物b、化合物c、化合物d。
移植性腫瘤瘤株：人胰腺癌MIA Paca-2購於上海中科院細胞生物研究所。
細胞培養：MIA Paca-2細胞培養於DMEM，含10%胎牛血清FBS (GIBCO，美國)和2.5% HS。細胞放置於5% CO2 培養箱37℃培養。
動物模型製備：細胞接種法建立人胰腺癌MIA Paca-2裸鼠皮下移植瘤模型：收集對數生長期的腫瘤細胞，計數後重新懸浮於1×PBS，調整細胞懸浮液濃度至3×107 個細胞/ml。用1 ml注射器(4號針頭)在裸鼠右側背部皮下接種腫瘤細胞，3×106 個細胞/0.1 ml/鼠。
給藥頻次及劑量：各組均為每週給藥一次，共給藥三次，QW×3，給藥劑量均為6 mg·kg-1 。
結果見表4： 表4    對腫瘤增殖率T/C(%)
組別 樣品 動物數 相對腫瘤體積 (RTV) 相對腫瘤增值率(%T/C)
1 空白溶劑 6 13.1 -
2 化合物M 6 2.85 22
3 化合物a 6 0.361* 2.7#
4 化合物b 6 0.678* 5.07#
5 化合物c 6 0.537* 4.02#
6 化合物d 6 0.732* 5.47#
*與空白溶劑、化合物M組的RTV相比，P ＜0.05 #與空白溶劑、化合物M組的%T/C相比，P ＜0.05
實驗結果顯示，本發明化合物對人胰腺癌MIA Paca-2裸鼠移植瘤有良好抑制作用，且優於化合物M。 實施例21   對人小細胞肺癌細胞NCI-H446裸鼠異種移植模型的抑制作用
測試樣品：伊立替康、nktr-102、化合物a、化合物b、化合物c、化合物d。
伊立替康(原料藥)係購買所得。nktr-102的製備方法如下：
將實施例4中的BP143b03 (829 mg, 4.5 eq)添加到250 mL的反應瓶中，加入DCM (50 mL)，三乙胺(221 mg, 9.0 eq)，溶解後加入4ARM-PEG20K-SCM (5.00 g, 1.0 eq)添加到該反應瓶中。HPLC監控反應沒有明顯進展後，減壓蒸餾出去約20 mL DCM，將溶液倒入300 mL TBME中攪拌沉澱，過濾，得到5.4 g粗產物，粗產物經HPLC製備純化，脫鹽，用稀鹽酸調節pH至5-6，凍乾得到2.71 g淡綠色粉末nktr-102。
伊立替康給藥製劑配製：稱取12.0 mg的伊立替康，加入0.15 mL的1%乳酸，渦旋震盪使藥物完全溶解，再分別加入2.85 mL的1%山梨糖醇水溶液，渦旋震盪混合均勻，溶液中1%乳酸、1%山梨糖醇水溶液的比例約為5:95 (v/v)。溶液中伊立替康有效濃度為4.0 mg·mL-1 。
nktr-102給藥製劑配製：每次給藥前，準確稱量101.5 mg的nktr-102，加入2.5 mL的生理鹽水，渦旋震盪使藥物完全溶解，溶液中伊立替康有效濃度為4.0 mg·mL-1 。
移植性腫瘤瘤株：人小細胞肺癌細胞NCI-H446來源於中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。
細胞培養：在5% CO2、37℃、飽和濕度條件下，NCI-H446細胞在含10%胎牛血清RPMI-1640培養液中進行常規細胞培養；根據細胞生長情況，以0.25%胰蛋白酶分解繼代培養，每週繼代培養2到4次，繼代培養比例為1:3到1:4。
動物模型製備：細胞接種法建立腫瘤裸鼠皮下移植模型：收取對數生長期NCI-H446細胞，細胞計數後重新懸浮於含50%的RPMI-1640基礎培養基和50%的Matrigel中，調整細胞濃度至4×107 個細胞/mL；用移液器吸沖細胞使其分散均勻後裝入50 mL離心管中，將離心管置於冰盒中；用合適的注射器吸取細胞懸浮液，注射到裸鼠前右肢腋窩皮下，每隻動物接種200 μL(8×106 個細胞/隻)，建立NCI-H446裸鼠移植瘤模型。
動物給藥：於分組當天開始第一次給藥。第一組為溶劑對照組，尾靜脈注射給予生理鹽水。第2-7組分別尾靜脈注射給予受試樣品伊立替康、nktr102、化合物a、化合物b、化合物c、化合物d，以上各組均為每週給藥一次，共給藥三次，QW×3，給藥劑量均為6mg·kg-1 。
結果見表5： 表5    對腫瘤增殖率T/C(%)
組別 樣品 動物數 相對腫瘤體積 (RTV) 相對腫瘤增值率(%T/C)
1 空白溶劑 6 8.10 -
2 伊立替康 6 5.34 66.0
3 nktr-102 6 3.78 46.73
4 化合物a 6 0.364* 4.5#
5 化合物b 6 1.09* 13.48#
6 化合物c 6 0572.* 7.07#
7 化合物d 6 0.893* 11.04#
*與空白溶劑、伊立替康、nktr102組的RTV相比，P ＜0.05 #與空白溶劑、伊立替康、nktr102組的%T/C相比，P ＜0.05
實驗結果顯示，本發明化合物對人小細胞肺癌細胞 NCI-H446裸鼠移植瘤有良好抑制作用，且優於伊立替康和nktr102。
Figure 109105629-A0101-11-0001-1

Claims (17)

  1. 具有如下結構式(Ⅰ)的多支鏈藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽：
    Figure 03_image001
    (Ⅰ) R為有機中心，POLY為聚合物，L為多價連接子，T為靶向分子，D為活性劑，q為3-8之間的任一整數，其中，D為如下式所示的喜樹鹼類藥物：
    Figure 03_image046
    其中，R1 -R5 相互獨立地選自於以下基團：氫、鹵素、醯基、烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯基、炔基、環烷基、羥基、氰基、硝基、疊氮基、醯胺基、肼、胺基、取代的胺基、羥基羰基、烷氧羰基、烷氧羰氧基、任選取代的胺基甲醯氧基、芳基磺醯氧基、烷基磺醯氧基、R9 C(O)O-，其中R9 是鹵素、胺基、取代的胺基、雜環、取代的雜環；R6 為H或OR8 ，R8 為烷基、烯基、環烷基、鹵代烷基或羥烷基；R7 為羥基、胺基或硫醇； T為CD44靶向多肽。
  2. 如請求項1所述的多支鏈藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，
    Figure 03_image001
    (Ⅰ) R為有機中心，POLY為聚合物，L為多價連接子，T為靶向分子，D為活性劑，q為3-8之間的任一整數，其中，D為如下式所示的喜樹鹼類藥物：
    Figure 03_image046
    其中，R1 -R5 相互獨立地選自於以下基團：氫、鹵素、醯基、烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯基、炔基、環烷基、羥基、氰基、硝基、疊氮基、醯胺基、肼、胺基、取代的胺基、羥基羰基、烷氧羰基、烷氧羰氧基、胺基甲醯氧基、芳基磺醯氧基、烷基磺醯氧基；R6 為H或OR8 ，R8 為烷基、烯基、環烷基、鹵代烷基或羥烷基；R7 為羥基； T為CD44靶向多肽。
  3. 如請求項1或2所述的多支鏈藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，POLY為聚乙二醇、聚丙二醇、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羥烷基甲基丙烯酸胺)、聚(羥烷基甲基丙烯酸鹽)、聚(醣類)、聚(α-羥基酸)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯乙酸)、聚膦嗪、聚唑啉或聚(N-丙烯醯嗎啉)。
  4. 如請求項3所述的多支鏈藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，POLY為：
    Figure 03_image106
    ，k 為5~500，優選50~200，最優選k 為113，r為1-10之間的任一整數，標“&”的氧原子為與有機中心R連接的原子，所述k 表示重複單元數目的平均值。
  5. 如請求項4所述的多支鏈藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其為：
    Figure 03_image040
    。
  6. 如請求項5所述的多支鏈藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，多價連接子L為：
    Figure 03_image109
    符號“*”代表多價連接子L與靶向分子T的連接點，“#”代表多價連接子L與活性劑D的連接點，“%”代表多價連接子L與POLY的連接點，其中，m為1-20之間的任一整數，l 、n分別為1-10之間的任一整數， 優選的，l 為5，m為3，n為4。
  7. 如請求項6所述的多支鏈藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，D為伊立替康或SN38。
  8. 如請求項1-7中任一項所述的多支鏈藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，T為Ac-KPSSPPEE-NH2 ，Ac-NASAPPEE-NH2 ，透明質酸(hyaluronic acid，HA)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、絲甘蛋白(Serglycin)、膠原蛋白(Collagen)、纖維連接蛋白(Fibronectin)、層黏連蛋白(Laminin)、硫酸軟骨素C (chondroitin sulfate C，CSC)、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate, HS)、錨蛋白(ankyrin)、半乳糖凝集素(Galectin-3)、L-選擇素、P-選擇素、C型凝集素或位址素(addressin)。
  9. 如請求項1-7中任一項所述的多支鏈藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，T為Ac-KPSSPPEE-NH2 或Ac-NASAPPEE-NH2 ，及其取代變異體、加成變異體和化學修飾衍生物。
  10. 如請求項8所述的多支鏈藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其為：
    Figure 03_image052
    化合物A
    Figure 03_image054
    化合物B
    Figure 03_image056
    化合物C
    Figure 03_image058
    化合物D 其中，化合物A，化合物B，化合物C和化合物D分子結構中的k 各自獨立地為101~125，優選k 各自獨立地為113。
  11. 如請求項9所述的多支鏈藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其為：
    Figure 03_image060
    化合物a
    Figure 03_image062
    化合物b
    Figure 03_image064
    化合物c
    Figure 03_image066
    化合物d。
  12. 如請求項11所述的多支鏈藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其為： 化合物a、化合物b、化合物c、化合物d的每個支鏈分別結合一分子或兩分子鹽酸的鹽酸鹽或者每個支鏈分別結合一分子或兩分子醋酸的醋酸鹽。
  13. 如請求項1-12中任一項所述的多支鏈藥物偶聯物在製備用於治療CD44高表達腫瘤的藥物中的應用。
  14. 如請求項13所述的應用，其中CD44高表達腫瘤選自胃癌、胰腺癌、小細胞肺癌、結腸癌、乳腺癌、肺腺癌、肝癌、鼻咽癌、惡性膠質瘤、淋巴瘤、腎癌、卵巢癌、頭頸癌、鱗狀細胞癌。
  15. 一種藥物組成物，其包含請求項1-12所述的多支鏈藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的賦形劑。
  16. 如請求項15所述的組成物在製備用於治療CD44高表達腫瘤的藥物中的應用。
  17. 如請求項16所述的應用，其中CD44高表達腫瘤選自胃癌、胰腺癌、小細胞肺癌、結腸癌、乳腺癌、肺腺癌、肝癌、鼻咽癌、惡性膠質瘤、淋巴瘤、腎癌、卵巢癌、頭頸癌、鱗狀細胞癌。
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