CN118121536A - 一种下调pd-l1表达的ros响应短肽水凝胶的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种下调PD‑L1表达的ROS响应短肽水凝胶的制备和应用，涉及医药技术领域，其制备方法包括如下：Step 1：采用传统固相合成方法合成多肽KFMFMK；Step 2：所有氨基酸选择Fmoc保护的氨基酸，树脂则选择Rink树脂，首先Rink树脂使用二氯甲烷(DCM)溶胀，随后20％哌啶脱保护20min，清洗树脂；Step 3：使用茚三酮显色法验证Fmoc保护基团是否成功脱去；Step 4：反应结束后，使用DCM以及DMF交替清洗三遍，使用茚三酮显色法检测氨基酸是否耦合成功；Step 5：分别使用二甲亚砜(DMSO)以及纯水溶解MTX，MET配置相应的母液，称取KFMFMK六肽1mg，取192μL PB溶液(pH＝6.5，0.2M,),向上述PB溶液中分别加入4μL MTX以及4μL MET母液，混匀后加入到称取的KFMFMK多肽固体中。

Description

一种下调PD-L1表达的ROS响应短肽水凝胶的制备和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种下调PD-L1表达的ROS响应短肽水凝胶的制备和应用。

背景技术

近年来，癌症已经成为继心血管疾病的第二大杀手，因此癌症的早期诊断和高效治疗成为研究热点。

临床常见的癌症治疗手段包括手术，化疗，放疗以及免疫治疗。手术治疗和放疗属于局部治疗，化疗主要通过化学药物杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞生长繁殖，属于全身性癌症治疗手段，其在临床中最为常见。但化疗也存在不可忽视的缺陷：选择性较差，对正常组织毒副作用大，治疗窗口狭窄，多药耐药性等。这些缺陷限制了其在临床上的进一步使用。

免疫治疗作为癌症新兴治疗方法对实体瘤患者有良好的治疗作用，尤其是靶向免疫检查点(Immune checkpoint，IC)途径的程序性细胞死亡蛋白-1(PD1)/程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)或CTLA4的阻断治疗，已被证实具有持久的抗肿瘤活性和较低的免疫毒副作用，能显著延长肿瘤患者的生存期。肿瘤细胞特异性高表达的PD-L1与肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)表面的PD-1相互作用被认为是肿瘤发生免疫逃逸的主要机制，使用中和抗体(neutralizing antibody)anti-PD1/PD-L1靶向IC的策略在多种类型的肿瘤临床治疗(包括黑色素瘤、非小细胞肺癌和结直肠癌等)中获得了巨大的成功。但理论上中和抗体本身可能是具备抗原性的，在宿主体内会随着时间的推移产生抗抗体(anti-antibody)从而丢失其阻断作用。另一方面采用抗体靶向PD1/PD-L1的免疫治疗方法成本非常高昂，给国家和家庭带来了巨大的经济负担。因此探索基于非抗体靶向IC的替代治疗策略有着重要的临床意义和经济效益。

二甲双胍是一种双胍类的药物，在临床上作为糖尿病的一线治疗药物。目前越来越多的研究表明：二甲双胍在重塑肿瘤免疫微环境表现出积极作用，此种药物可以启动自然杀伤细胞的功能和浸润，促进先天免疫系统的激活，在增加CD8+T细胞浸润的同时抑制肿瘤免疫抑制细胞。但二甲双胍的水溶性较强，肾脏清除率高，大量给药容易引起乳酸中毒。因此二甲双胍的药物缓释问题成为亟待解决的关键。

米托蒽醌是一种拓扑异构酶Ⅱ的抑制剂，广泛应用于多种肿瘤治疗中。据报道，米托蒽醌可以引起免疫原性细胞死亡(ICD)效应，用以激活肿瘤免疫微环境。但其溶解性较差，半衰期短，缺乏特异性，容易出现多药耐药，副作用严重，易对正常组织造成损伤。

为了克服上述癌症治疗的局限性，药物的递送显得至关重要，在提高疗效的同时降低抗癌药物的副作用。近年来，具有良好生物相容性以及生物可降解性的可注射用水凝胶作为药物载体引发了广泛关注。其中多肽水凝胶由于其制备简单、凝胶能力优越、生物相容性高等优点，使其在局部给药和免疫治疗方面显示出巨大的潜力。

发明内容

本发明提供了一种下调PD-L1表达的ROS响应短肽水凝胶的制备和应用，制备了以KFMFMK六肽为基础的多肽水凝胶Gel KFM以及负载药物后的Gel@MET/MTX，验证Gel KFM以及Gel@MET/MTX水凝胶的形成；多肽水凝胶Gel KFM以及Gel@MET/MTX对ROS的响应性；多肽水凝胶Gel KFM自身对PD-L1的降解能力；负载药物后的Gel@MET/MTX对肿瘤细胞增殖的抑制作用；对4T1以及MC38小鼠模型的肿瘤抑制作用。提供了一种高效低毒，能够激活肿瘤免疫微环境的治疗新思路。

本发明解决上述技术问题的方案如下：一种下调PD-L1表达的ROS响应短肽水凝胶的制备和应用，其制备方法包括如下：

Step 1：采用传统固相合成方法合成多肽KFMFMK；

Step 2：所有氨基酸选择Fmoc保护的氨基酸，树脂则选择Rink树脂，首先Rink树脂使用二氯甲烷(DCM)溶胀，随后20％哌啶脱保护20min，清洗树脂；

Step 3：使用茚三酮显色法验证Fmoc保护基团是否成功脱去。若成功脱去，随后进行氨基酸的耦合，按照树脂：氨基酸为1：2的当量比进行投料，称定后使用N,N-二甲基酰胺(DMF)溶解，加入耦合剂苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)以及N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)混匀，随后加入到树脂中，将多肽合成管置于摇床中反应6h；

Step 4：反应结束后，使用DCM以及DMF交替清洗三遍，使用茚三酮显色法检测氨基酸是否耦合成功。随后重复上述步骤，最终合成KFMFMK六肽；

Step 5：称取KFMFMK六肽1mg，向其中加入200μL PB溶液(pH＝6.5，0.2M,)，使用移液枪吹打均匀，置于超声波清洗机中超声5min，随后于室温静置6h，即为Gel KFM；

Step 6：分别使用二甲亚砜(DMSO)以及纯水溶解MTX，MET配置相应的母液，称取KFMFMK六肽1mg，取192μL PB溶液(pH＝6.5，0.2M,),向上述PB溶液中分别加入4μL MTX以及4μL MET母液，混匀后加入到称取的KFMFMK多肽固体中，使用移液枪吹打均匀，置于超声波清洗机中超声5min,随后于室温静置6h，即为Gel@MET/MTX。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述Gel KFM以及Gel@MET/MTX是一种多肽水凝胶，可通过流变实验验证Gel KFM以及Gel@MET/MTX的形成，透射电镜(TEM)测定Gel KFM以及Gel@MET/MTX的形貌，圆二色谱(CD)测定Gel KFM以及Gel@MET/MTX的二级结构。

进一步，所述多肽水凝胶Gel KFM具有ROS响应性，通过流变实验以及高效液相验证Gel KFM的ROS响应性,通过电子吸收光谱验证Gel@MET/MTX与ROS共孵育后的药物释放

进一步，所述具有ROS响应性的多肽水凝胶Gel KFM可以显著降低PD-L1的表达。

进一步，所述具有ROS响应性的多肽水凝胶Gel KFM负载药物后的Gel@MET/MTX可以有效抑制肿瘤细胞的生长增殖，应用于诱导肿瘤细胞凋亡，遏制肿瘤的生长，激活肿瘤免疫微环境。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种下调PD-L1表达的ROS响应短肽水凝胶的制备和应用，具有以下优点：

1、KFMFMK六肽经固相合成法制备，经超声制备Gel KFM以及负载药物后的Gel@MET/MTX的水凝胶Gel@MET/MTX。该Gel@MET/MTX以多肽水凝胶Gel KFM为载体，生物相容性高，生物降解性好，降解产物无毒，且Gel KFM水凝胶自身可以显著降低肿瘤细胞以及肿瘤组织PD-L1的表达。负载MET以及MTX后，解决了上述两种药物的缺陷，使得二甲双胍的缓释成为可能，同时局部给药的方式，解决了米托蒽醌对正常组织毒副作用大的问题。该发明通过制备Gel@MET/MTX，显著抑制肿瘤细胞的生成和增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，降解PD-L1的表达，促进CD8+T细胞的浸润；

2、多肽水凝胶Gel KFM自身即可显著降低PD-L1的表达，与临床上PD-L1的抑制剂相比，KFMFMK六肽水凝胶的合成制备简单易行，成本低廉，作为一种非抗体靶向IC的替代治疗策略有着重要的临床意义和经济效益，此外，本发明创新性地将MET/MTX负载在水凝胶中，MET作为免疫激活剂，激活肿瘤免疫微环境；MTX作为化疗药物，诱导肿瘤细胞凋亡引发ICD效应，在一定程度上同样对肿瘤免疫微环境起到刺激作用，本发明中Gel@MET/MTX具有良好的抗肿瘤性能，为非抗体靶向IC的替代治疗策略提供了新思路。

附图说明

图1为本发明的步骤流程图；

图2为本发明的Gel KFM以及Gel@MET/MTX的表征；

图3为本发明的Gel KFM以及Gel@MET/MTX对ROS的响应性和药物释放；

图4为本发明的Gel KFM对PD-L1的表达抑制；

图5为本发明的Gel@MET/MTX对4T1以及MC38肿瘤细胞的毒性；

图6为本发明的Gel@MET/MTX对小鼠4T1皮下瘤模型的抑制作用；

图7为本发明的Gel@MET/MTX对小鼠MC38皮下瘤模型的抑制作用。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。在下列段落中以举例方式更具体地描述本发明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。

需要说明的是，当组件被称为“固定于”另一个组件，它可以直接在另一个组件上或者也可以存在居中的组件。当一个组件被认为是“连接”另一个组件，它可以是直接连接到另一个组件或者可能同时存在居中组件。当一个组件被认为是“设置于”另一个组件，它可以是直接设置在另一个组件上或者可能同时存在居中组件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1：Gel以及Gel@MET/MTX的表征

实验方法：

Gel KFM水凝胶的制备：通过固相合成方法制备KFMFMK六肽，使用电子天平称取1mg多肽固体。移液枪吸取200μL PB溶液(pH＝6.5，0.2M)加入上述多肽固体中，混匀后置于超声波清洗机中超声5min，随后将样品取出于室温中静置6h，即为Gel KFM水凝胶，拍照。

Gel@MET/MTX水凝胶的制备：通过固相合成方法制备KFMFMK六肽，使用电子天平称取1mg多肽固体。分别称取二甲双胍20mg，米托蒽醌2mg，分别向称定的二甲双胍以及米托蒽醌固体中加入38.8μL纯水以及180μL的DMSO溶液，配置成相应的二甲双胍以及米托蒽醌母液。移液枪吸取192μL的PB溶液(pH＝6.5，0.2M)，向其中分别加入4μL二甲双胍母液以及米托恩醌母液，混匀后置于超声波清洗机中超声5min，随后将样品取出于室温中静置6h，即为Gel@MET/MTX水凝胶，拍照。

将制备的Gel KFM以及Gel@MET/MTX于Discovery HR-20TA仪器上进行流变学测试。在动态频率扫描模式下，200μL的Gel KFM以及Gel@MET/MTX置于测试样品平台，固定应变为0.1％，按照预先设定的程序测试在10-0.05Hz频率范围内扫描水凝胶的储能模量(G′)以及损耗模量(G″)的变化。在0.01-10％的范围内，以1rad/s的固定频率对水凝胶进行动态应变扫描表征，测定了水凝胶G′以及G″的变化，验证水凝胶的形成。

取静置的水凝胶Gel KFM以及Gel@MET/MTX，使用PB溶液稀释至1mM。将稀释后的Gel KFM以及Gel@MET/MTX于Tecnai G2 F20的透射电镜中获取透射电子图，验证Gel以及Gel@MET/MTX的组装形貌；此外于J-715流变仪中记录190-280nm范围的圆二色谱图，验证Gel KFM以及Gel@MET/MTX的组装二级结构；

实验结果及结论：

如附图2所示，倒瓶法说明了KFMFMK六肽水凝胶Gel KFM的形成，负载MET以及MTX之后仍能形成水凝胶；此外，流变仪测定Gel KFM以及Gel@MET/MTX样品，二者的储能模量均大于损耗模量，进一步验证水凝胶的形成。电子透射图表明Gel以及Gel@MET/MTX均为纤维；CD色谱表明二者的组装二级结构均为β-折叠。

实施例2：Gel KFM以及Gel@MET/MTX对ROS的响应性和药物释放

实验方法：

吸取制备好的Gel KFM以及Gel@MET/MTX水凝胶300μL，随后向以上两个水凝胶中加入50μL浓度为1mM的H₂O₂于37℃环境中孵育过夜。将孵育液使用Discovery HR-20TA仪器进行流变学测试。在动态频率扫描模式下，200μL的Gel以及Gel@MET/MTX置于测试样品平台，固定应变为0.1％，按照预先设定的程序测试在10-0.05Hz频率范围内扫描水凝胶的G′以及G″的变化。在0.01-10％的范围内，以1rad/s的固定频率对水凝胶进行动态应变扫描表征，测定了水凝胶G′以及G″的变化，验证水凝胶对ROS的响应性。同时通过TEM以及CD色谱观察Gel KFM以及Gel@MET/MTX与H₂O₂共孵育之后形貌以及二级组装结构的变化。

吸取300μL Gel KFM于离心管中，向其中加入300μL H₂O₂(100μM)，将离心管置于37℃的环境中孵育过夜，待水凝胶完全水解，使用高效液相色谱(HPLC)测定加入H₂O₂前后的保留时间变化。

吸取300μL Gel@MET/MTX于离心管中，向其中加入300μLH₂O₂(100μM)，将离心管置于37℃的环境中，在预设的时间点吸取300μL上清液，保存于-20℃中。待所有样品收集完毕后，置于冷冻干燥机中冻存，向冻干粉中加入150μL的DMSO溶液，超声10min，离心取上清。使用酶标仪读取各个样品的吸光度值，测定药物释放。

实验结果及结论：

如附图3所示，流变仪测定Gel KFM以及Gel@MET/MTX与H₂O₂共孵育后的溶液，二者的损耗模量均大于储能模量，表明Gel KFM以及Gel@MET/MTX在H₂O₂的孵育下，水凝胶的结构被破坏；此外，TEM图像表明构成水凝胶的纳米纤维结构消失；CD色谱表明Gel KFM以及Gel@MET/MTX的二级结构由β-折叠变化成为无规则结构。以上结果均说明Gel KFM以及Gel@MET/MTX对ROS具有良好的响应能力。

HPLC色谱说明，KFMFMK六肽水凝胶Gel KFM与H₂O₂共孵育后，KFMFMK转化为其氧化形式KFM^oFM^oK。

以上结果均说明Gel KFM以及Gel@MET/MTX对ROS具有良好的响应能力，随后测定的药物释放曲线表明，负载MET以及MTX的水凝胶达到了缓释的效果。

实施例3：Gel KFM对PD-L1的表达抑制

实验方法：

采用蛋白免疫印迹法(Westen Blot,WB)评估水凝胶Gel KFM对PD-L1在细胞水平的表达抑制。将4T1以及MC38肿瘤细胞种植到6孔板中，密度为100000个细胞/毫升。经24h培养后，向六孔板中依次加入PBS,MET,Gel KFM,Gel@MET，其中MET的浓度为4mM。待细胞与各组药物共孵育24h后，使用预冷的PBS洗涤细胞2遍，向六孔板中加入1mL PBS，随后使用细胞刮刀刮取肿瘤细胞，收集细胞至离心管中，离心取细胞沉淀。蛋白免疫印迹法测定4T1以及MC38细胞中的PD-L1蛋白含量。

实验结果及结论：

如附图4所示，在4T1以及MC38肿瘤细胞中，与PBS组相比，MET单独处理肿瘤细胞时，对PD-L1具有轻微的抑制作用。经水凝胶Gel组孵育后，PD-L1的表达量降低最为显著，表明水凝胶Gel KFM能够有效降低PD-L1的表达，可作为潜在非抗体靶向IC的替代治疗策略。Gel@MET组，与PBS组相较，对PD-L1也具有降解作用，但是相比于Gel KFM组，PD-L1的表达量明显高于Gel组，提示Gel与MET在降解PD-L1方面具有拮抗作用。

实施例4：Gel@MET/MTX对4T1以及MC38肿瘤细胞的毒性实验方法：

配置不同母液的MET与MTX，按照浓度比MET比MTX为40比1的比例进行包裹，其中包裹MET的浓度为0.8，1.6，8，16，40，80mM；MTX的浓度为5，10，50，100，250，500μM。

首先，将负载有不同浓度MET以及MTX的Gel@MET/MTX使用移液枪吸取10μL于96孔微孔板中，固化过夜。

其次，将肿瘤细胞4T1以及MC38分别种植在固化有Gel@MET/MTX的96孔微孔板中，密度为50000个细胞/毫升。肿瘤细胞与Gel@MET/MTX共孵育24h，同时设置对照，在加入细胞悬液的同时，向每个孔中加入5μM过氧化氢溶液共孵育24h。孵育结束后弃掉旧的培养基，使用PBS清洗两遍。然后在每个孔中加入10μL的MTT(5mg/mL)，并在37℃的5％二氧化碳加湿培养箱中再培养4小时。最后除去培养基，用100μL DMSO裂解紫色晶体。溶液的光密度在酶标仪上测定，波长为570nm。细胞存活率以对照培养值的百分比表示，用以下公式计算。细胞存活率(％)＝(OD药物-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100％。

实验结果及结论：

如附图5所示，Gel@MET/MTX对4T1以及MC38肿瘤细胞具有明显的杀伤作用，且呈现出浓度依赖型效应。Gel@MET/MTX+H₂O₂组中各个浓度下的细胞存活率均低于Gel@MET/MTX组，加入H₂O₂后，加速了水凝胶中的药物释放，细胞毒性随之加强，这说明水凝胶对H₂O₂具有良好的响应性。

实施例5：Gel@MET/MTX对小鼠4T1皮下瘤模型的抑制作用实验方法：

建立4T1小鼠皮下瘤模型，以评估Gel@MET/MTX对小鼠4T1模型的抑制抑制作用。将4T1乳腺癌细胞(2x10⁷个)接种到雌性BABL/c小鼠(重约20g)的右前肢腋窝处。当肿瘤体积达到50-100mm³时，将小鼠随机分为6组(n＝5)，分别为PBS，Gel@MET，MTX，MET/MTX，Gel@MTX，Gel@MET/MTX。给药剂量及给药时间点如附图6所示，并每隔一天记录肿瘤大小和小鼠体重。在种瘤后16天处死小鼠，立即解剖取出肿瘤和肺并进行称重，之后，将肿瘤和器官用福尔马林固定，包埋在石蜡中，切成5毫米的切片，并以进行进一步的组织学分析，包括H&E染色，TUNEL，CD8，PD-L1免疫荧光染色。动物的方案和处理是按照护理指南进行的天津医科大学实验动物使用经天津医科大学动物伦理委员会批准。

实验结果及结论：

与生理盐水组相比，MTX，Gel@MTX，MET/MTX，Gel@MET/MTX组均明显抑制了肿瘤的生长，其中Gel@MET/MTX组的肿瘤生长曲线与MTT/MTX具有显著性差异，表明水凝胶作为药物载体的必要性；Gel@MET与生理盐水组表现出相差无几的肿瘤生长曲线，表明MET仅作为免疫刺激剂出现，在此剂量下不具备抗肿瘤性能。H&E染色结果同样表明Gel@MET/MTX具有最优良的抗肿瘤效果，其肿瘤组织破坏最为明显。此外，Gel@MET，Gel@MTX以及Gel@MET/MTX组明显降低了PD-L1的表达，说明水凝胶Gel在作为药物载体的同时可以显著降低PD-L1的表达；而Gel@MET/MTX与Gel@MTX相比，其瘤内CD8+T细胞浸润增加，表明MET可作为免疫刺激剂，激活肿瘤免疫微环境。且Gel@MET/MTX组的小鼠在整个治疗过程中体重无明显变化，器官的H&E染色与PBS组相比也无明显损坏，以上结果均说明Gel@MET/MTX可以遏制肿瘤的生长趋势，显著降低PD-L1的表达，促进肿瘤细胞凋亡，增加瘤内CD8+T细胞的浸润，激活肿瘤免疫微环境，在此基础上，也无明显的毒副作用。

实施例6：Gel@MET/MTX对小鼠MC38皮下瘤模型的抑制作用实验方法：

建立MC38小鼠皮下瘤模型，以评估Gel@MET/MTX对小鼠MC38模型的抑制抑制作用。将MC38乳腺癌细胞(1x10⁷个)接种到雌性C57BL/6J小鼠(重约20g)的右前肢腋窝处。当肿瘤体积达到50-100mm³时，将小鼠随机分为6组(n＝5)，分别为PBS，Gel@MET，MTX，MET/MTX，Gel@MTX，Gel@MET/MTX。给药剂量及给药时间点如附图7所示，并每隔一天记录肿瘤大小和小鼠体重。在分组后16天处死小鼠，立即解剖取出肿瘤和肺并进行称重，之后，将肿瘤和器官用福尔马林固定，包埋在石蜡中，切成5毫米的切片，并以进行进一步的组织学分析，包括H&E染色，TUNEL，CD8，PD-L1免疫荧光染色。动物的方案和处理是按照护理指南进行的天津医科大学实验动物使用经天津医科大学动物伦理委员会批准。

实验结果及结论：

与生理盐水组相比，MTX，Gel@MTX，MET/MTX，Gel@MET/MTX组均明显抑制了肿瘤的生长，其中Gel@MET/MTX组的肿瘤生长曲线与MET/MTX具有显著性差异，表明水凝胶作为药物载体的必要性；Gel@MET组与生理盐水组表现出相差无几的肿瘤生长曲线，表明MET仅作为免疫刺激剂出现，在此剂量下不具备抗肿瘤性能。H&E染色结果同样表明Gel@MET/MTX具有最优良的抗肿瘤效果，其肿瘤组织破坏最为明显。此外，Gel@MET，Gel@MTX以及Gel@MET/MTX组明显降低了PD-L1的表达，说明水凝胶Gel KFM在作为药物载体的同时可以显著降低PD-L1的表达；而Gel@MET/MTX与Gel@MTX相比，其瘤内CD8+T细胞浸润增加，表明MET可作为免疫刺激剂，激活肿瘤免疫微环境。且Gel@MET/MTX组的小鼠在整个治疗过程中体重无明显变化，器官的H&E染色与PBS组相比也无明显损坏，以上结果均说明Gel@MET/MTX可以遏制肿瘤的生长趋势，显著降低PD-L1的表达，促进肿瘤细胞凋亡，增加瘤内CD8+T细胞的浸润，激活肿瘤免疫微环境，在此基础上，也无明显的毒副作用。

综上所述，本发明报道的ROS响应型Gel KFM水凝胶可显著降低PD-L1的表达，可作为潜在非抗体靶向IC的替代治疗策略；同时负载二甲双胍与米托恩醌药物的Gel@MET/MTX水凝胶具有良好抗肿瘤性能，能够有效遏制肿瘤的生长。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可按说明书附图所示和以上所述而顺畅地实施本发明；但是,凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时,凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种下调PD-L1表达的ROS响应短肽水凝胶的制备和应用，其制备方法包括如下：

Step 1：采用传统固相合成方法合成多肽KFMFMK；

Step 2：所有氨基酸选择Fmoc保护的氨基酸，树脂则选择Rink树脂，首先Rink树脂使用二氯甲烷(DCM)溶胀，随后20％哌啶脱保护20min，清洗树脂；

Step 3：使用茚三酮显色法验证Fmoc保护基团是否成功脱去。若成功脱去，随后进行氨基酸的耦合，按照树脂：氨基酸为1：2的当量比进行投料，称定后使用N,N-二甲基酰胺(DMF)溶解，加入耦合剂苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)以及N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)混匀，随后加入到树脂中，将多肽合成管置于摇床中反应6h；

Step 4：反应结束后，使用DCM以及DMF交替清洗三遍，使用茚三酮显色法检测氨基酸是否耦合成功。随后重复上述步骤，最终合成KFMFMK六肽；

Step 5：称取KFMFMK六肽1mg，向其中加入200μL PB溶液(pH＝6.5，0.2M,)，使用移液枪吹打均匀，置于超声波清洗机中超声5min，随后于室温静置6h，即为Gel KFM；

Step 6：分别使用二甲亚砜(DMSO)以及纯水溶解MTX，MET配置相应的母液，称取KFMFMK六肽1mg，取192μL PB溶液(pH＝6.5，0.2M,),向上述PB溶液中分别加入4μL MTX以及4μLMET母液，混匀后加入到称取的KFMFMK多肽固体中，使用移液枪吹打均匀，置于超声波清洗机中超声5min,随后于室温静置6h，即为Gel@MET/MTX。

2.根据权利要求1所述一种下调PD-L1表达的ROS响应短肽水凝胶的制备和应用，其特征在于，所述六肽水凝胶Gel KFM以及负载药物后的Gel@MET/MTX均为凝胶状态，可通过流变实验验证水凝胶的形成，透射电镜(TEM)测定Gel KFM以及Gel@MET/MTX的形貌，圆二色谱(CD)测定GelKFM以及Gel@MET/MTX的二级结构。

3.根据权利要求1所述一种下调PD-L1表达的ROS响应短肽水凝胶的制备和应用，其特征在于，所述多肽水凝胶GelKFM具有ROS响应性，通过流变实验以及高效液相验证Gel KFM的ROS响应性；负载药物的Gel@MET/MTX可对ROS响应，造成MET以及MTX的释放。

4.根据权利要求1所述一种下调PD-L1表达的ROS响应短肽水凝胶的制备和应用，其特征在于，所述具有ROS响应性的多肽水凝胶Gel KFM自身可以显著降低PD-L1的表达。

5.根据权利要求4所述一种下调PD-L1表达的ROS响应短肽水凝胶的制备和应用，其特征在于，所述具有ROS响应性的多肽水凝胶负载药物后的Gel@MET/MTX可以有效抑制肿瘤细胞的生长增殖，应用于诱导肿瘤细胞凋亡，遏制肿瘤的生长，激活肿瘤免疫微环境。