TW202027618A - 含有微藻類之製品及其製造法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種微藻類製品及其製造法。於一實施形態中，本發明提供一種不增多去鎂葉綠素酸而處理微藻類之方法。藉由該方法，可提供一種減少了去鎂葉綠素酸之安全之微藻類製品。此種微藻類製品可提供各種健康、營養及/或美容效果。又，本發明提供一種細菌污染較少之能夠實現高濃度培養之培養裝置，藉此能夠實現方便性較高之微藻類之培養。
Description
本發明係關於一種包含微藻類之製品(例如食用製品、化妝品)以及用以製造其之方法及系統。本發明尤其是關於一種降低了去鎂葉綠素酸之包含微藻類之製品(例如食用製品、化妝品)以及能夠提供其之微藻類之回收、濃縮方法及用以高濃度地培養微藻類之裝置。
關於綠藻及裸藻等微藻類，所含有之維生素及礦物質類等營養成分受到注目，被作為健康食品或食品素材而利用。就目前作為食品廣泛流通之綠藻而言，確立了藉由光合成之獨立營養培養法、或利用有機碳源之從屬營養培養法等各種培養法。然而，由於增生速度、大小及細胞壁之有無等處理時應考慮之方面因微藻類之種類而不同，故而期望確立符合細胞之特性之製造法。
又，微藻類中可能含有包含有用成分及有害成分之各種成分。為了提供安全之食品，可能需要減少有害成分。藉由葉綠素含量較高之綠藻(專利文獻1＝日本專利特開2016-67313)等微藻類之品種改良亦可製備含有成分，但根據製造法之不同，製品中所包含之成分亦可能變動。期望確立有用成分較多、可減少有害成分之製造法及提供藉由該方法所製作之製品(例如食品)。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
專利文獻1：日本專利特開2016-67313
[解決問題之技術手段]
本發明者等人進行了銳意研究，結果發現了有效率地製造高品質之微藻類製品之方法。本發明能夠提供具有新的功能性且安全之微藻類製品(例如食用製品、化妝品)。本發明之製造方法藉由針對破裂等細胞膜及/或細胞壁之破壞有所減少、或者細胞器官之破壞、促進自我分解或細胞內成分分解等之酵素之分泌及/或活性有所減少(例如由於物理毒殺及/或化學毒殺之減少)的微藻類，進行使對微藻類本身或微藻類之成分造成不良影響之酵素等失活且/或分解的處理，能夠提供減少了去鎂葉綠素酸之微藻類製品。
本發明提供一種高效率地製造高品質之微藻類製品之方法及能夠有益地使用於該方法中之裝置。
因此，本發明代表性地提供以下項目。
(項目B1)
一種用以製造微藻類製品之方法，其包括如下步驟：
(A)培養後直至(B)步驟為止於將賦予微藻類之應力量控制在特定值以下之條件下進行維持之步驟，且將該微藻類之密度維持在特定值以下、且/或不將該微藻類濃縮至特定倍率以上；及
(B)將微藻類供於使葉綠素酶失活之處理。
(項目B2)
如上述項目之任一者之方法，其中上述密度之特定值及/或上述濃縮之特定倍率係基於將上述微藻類濃縮之情形時之去鎂葉綠素酸之增多而決定。
(項目B3)
如上述項目之任一者之方法，其中上述密度之特定值為約10 g/L(乾燥重量)以下。
(項目B4)
如上述項目之任一者之方法，其中上述密度之特定值為約5 g/L(乾燥重量)以下。
(項目B5)
如上述項目之任一者之方法，其中上述濃縮之特定倍率為約100倍以上。
(項目B6)
如上述項目之任一者之方法，其中上述濃縮之特定倍率為約10倍以上。
(項目B7)
如上述項目之任一者之方法，其中上述應力量之特定值為約5以下。
(項目B8)
如上述項目之任一者之方法，其中上述應力量之特定值為約3以下。
(項目B9)
如上述項目之任一者之方法，其中上述應力量之特定值為約2以下。
(項目B10)
如上述項目之任一者之方法，其中於(A)步驟中不進行將上述微藻類進行濃縮之處理。
(項目B11)
如上述項目之任一者之方法，其中培養上述微藻類之步驟包括使上述微藻類增生至1 g/L(乾燥重量)之密度以上。
(項目B12)
如上述項目之任一者之方法，其中於(B)步驟之後包括將上述微藻類進行濃縮之步驟。
(項目B13)
如上述項目之任一者之方法，其中(B)步驟包括將上述微藻類進行加熱。
(項目B14)
如上述項目之任一者之方法，其中上述加熱包括加熱至95℃以上。
(項目B15)
如上述項目之任一者之方法，其中(B)之步驟係於如下條件下進行：不使岩藻黃素分解、或於(B)步驟之前後進行比較之情形時之岩藻黃素之減少未達80%。
(項目B16)
如上述項目之任一者之方法，其中上述條件包含岩藻黃素之分解量未達10%。
(項目B17)
如上述項目之任一者之方法，其中於(B)步驟之後包括使上述微藻類乾燥之步驟。
(項目B18)
如上述項目之任一者之方法，其中上述微藻類每1 g乾燥重量生產葉綠素30 mg以上。
(項目B19)
如上述項目之任一者之方法，其中上述微藻類為生產岩藻黃素之藻類。
(項目B20)
如上述項目之任一者之方法，其中上述微藻類為每1 g乾燥重量生產岩藻黃素8 mg以上之藻類。
(項目B21)
如上述項目之任一者之方法，其中上述微藻類為定鞭藻綱。
(項目B22)
如上述項目之任一者之方法，其中上述微藻類為巴夫藻科。
(項目B23)
如上述項目之任一者之方法，其中上述微藻類為巴夫藻屬。
(項目B24)
如上述項目之任一者之方法，其中上述微藻類為P. calceolate、P. granifera、P. gyrans、P. lutheri、P. pinguis或P. salina。
(項目B25)
如上述項目之任一者之方法，其中上述微藻類為P. granifera或P. gyrans。
(項目B26)
一種微藻類製品，其係藉由包括進行如上述項目之任一方法之方法所製造且用以用於生物或用於生物攝取，該微藻類製品包含上述微藻類之藻體。
(項目B27)
如上述項目之任一者之微藻類製品，其中上述微藻類之去鎂葉綠素酸之含量為0.2重量%以下。
(項目B28)
如上述項目之任一者之微藻類製品，其中上述微藻類之去鎂葉綠素酸之含量為0.1重量%以下。
(項目B29)
一種用以用於生物或用於生物攝取之微藻類製品，其包含微藻類之藻體，上述微藻類之去鎂葉綠素酸之含量為0.2重量%以下(乾燥重量)。
(項目B30)
一種用以用於生物或用於生物攝取之微藻類製品，其包含微藻類之藻體，上述微藻類之去鎂葉綠素酸之含量為0.1重量%以下(乾燥重量)。
(項目B31)
如上述項目之任一者之微藻類製品，其中上述微藻類為定鞭藻綱。
(項目B32)
如上述項目之任一者之微藻類製品，其中上述微藻類為P.granifera或P. gyrans。
(項目B33)
如上述項目之任一者之微藻類製品，其為食用製品或化妝品。
(項目B34)
如上述項目之任一者之微藻類製品，其中上述生物為哺乳動物。
(項目B35)
如上述項目之任一者之微藻類製品，其中上述生物為人類。
(項目B36)
如上述項目之任一者之微藻類製品，其中岩藻黃素之含量為0.8重量%以上。
(項目B37)
如上述項目之任一者之微藻類製品，其中上述微藻類之岩藻黃素含量為0.8重量%以上(乾燥重量)。
(項目B38)
如上述項目之任一者之微藻類製品，其中上述微藻類之葉綠素含量為3重量%以上(乾燥重量)。
(項目B39)
如上述項目之任一者之微藻類製品，其為食用製品。
(項目B40)
如上述項目之任一者之微藻類製品，其為食品。
(項目B41)
如上述項目之任一者之微藻類製品，其為以每天提供100～150 mg之葉綠素之方式供攝取之食用製品。
(項目B42)
如上述項目之任一者之微藻類製品，其為化妝品。
(項目B43)
一種用以製造凍結品之方法，其包括如下步驟：
藉由如上述項目之任一者之方法製備微藻類濃縮液；及
將上述微藻類濃縮液進行凍結。
(項目B44)
如上述項目之任一者之方法，其中凍結之步驟包含冷卻至-40℃以下。
(項目B45)
如上述項目之任一者之微藻類製品，其為凍結品。
(項目B46)
如上述項目之任一者之微藻類製品，其為乳製品不添加、乳酸冰淇淋、冰牛奶或冰淇淋。
(項目B47)
如上述項目之任一者之凍結品，其包含賦形劑、抗氧化劑、乳化劑、及增黏劑中之1種或複數種。
(項目B48)
如上述項目之任一者之凍結品，其包含果實果汁及香料中之1種或複數種。
(項目B49)
如上述項目之任一者之凍結品，其為板狀之形態。
(項目B50)
一種用以製造油浸漬品之方法，其包括如下步驟：
藉由如上述項目之任一者之方法製備微藻類濃縮液；及
將上述微藻類與油進行混合。
(項目B51)
如上述項目之任一者之方法，其包括向上述微藻類濃縮液添加水來進行除鹽之步驟。
(項目B52)
如上述項目之任一者之方法，其包括將上述微藻類濃縮液進行凍結乾燥之步驟。
(項目B53)
如上述項目之任一者之微藻類製品，其為油浸漬品。
(項目B54)
如上述項目之任一者之油浸漬品，其包含抗氧化劑。
(項目B55)
如上述項目之任一者記載之油浸漬品，其中抗氧化劑包含α-生育酚。
(項目B56)
如上述項目之任一者之油浸漬品，其相對於乾燥藻體1 g包含約1～100重量%之油。
(項目B57)
如上述項目之任一者之油浸漬品，其包含乳化劑。
(項目B58)
一種食用膠囊，其包含如上述項目之任一者之油浸漬品。
(項目B59)
如上述項目之任一者之微藻類製品，其為包含乾燥劑及抗氧化劑中之1種或複數種之乾燥品。
(項目B60)
如上述項目之任一者之微藻類製品，其為封入遮光容器中之乾燥品。
(項目B61)
一種用以製造乾燥微藻類之方法，其包括如下步驟：
藉由上述項目之任一者之方法製備微藻類濃縮液；及
於賦形劑、乳化劑及抗氧化劑中之1種或複數種之存在下使上述微藻類濃縮液乾燥。
(項目A1)
一種用以製造巴夫藻目之微藻類製品之方法，其包括如下步驟：
(A)培養後直至(B)步驟為止於將賦予微藻類之應力量控制在特定值以下之條件下進行維持之步驟，且將該微藻類之密度維持在特定值以下、且/或不將該微藻類濃縮至特定倍率以上；及
(B)將微藻類供於使葉綠素酶失活之處理。
(項目A2)
如項目A1記載之方法，其中上述密度之特定值及/或上述濃縮之特定倍率基於將上述微藻類濃縮之情形時之去鎂葉綠素酸之增多而決定。
(項目A3)
如項目A1或2記載之方法，其中上述密度之特定值為約10 g/L(乾燥重量)以下。
(項目A4)
如項目A1或2記載之方法，其中上述密度之特定值為約5 g/L(乾燥重量)以下。
(項目A5)
如項目A1～4中任一項記載之方法，其中上述濃縮之特定倍率為約100倍以上。
(項目A6)
如項目A1～4中任一項記載之方法，其中上述濃縮之特定倍率為約10倍以上。
(項目A7)
如項目A1～6中任一項記載之方法，其中上述應力量之特定值為約5以下。
(項目A8)
如項目A1～6中任一項記載之方法，其中上述應力量之特定值為約3以下。
(項目A9)
如項目A1～6中任一項記載之方法，其中上述應力量之特定值為約2以下。
(項目A10)
如項目A1～9中任一項記載之方法，其中於(A)步驟中不進行將上述微藻類進行濃縮之處理。
(項目A11)
如項目A1～10中任一項記載之方法，其中培養上述微藻類之步驟包括使上述微藻類增生至1.5 g/L(乾燥重量)之密度以上。
(項目A12)
如項目A1～11中任一項記載之方法，其中於(B)步驟之後包括將上述微藻類進行濃縮之步驟。
(項目A13)
如項目A1～12中任一項記載之方法，其中(B)步驟包括將上述微藻類進行加熱。
(項目A14)
如項目A13記載之方法，其中上述加熱包含加熱至95℃以上。
(項目A15)
如項目A1～14中任一項記載之方法，其中(B)步驟係於如下條件下進行：不使岩藻黃素分解、或於(B)步驟之前後進行比較之情形時岩藻黃素之減少未達80%。
(項目A16)
如項目A15記載之方法，其中上述條件包含岩藻黃素之分解量未達10%。
(項目A17)
如項目A1～16中任一項記載之方法，其中於(B)步驟之後包括使上述微藻類乾燥之步驟。
(項目A18)
如項目A1～17中任一項記載之方法，其中上述微藻類每1 g乾燥重量生產葉綠素30 mg以上。
(項目A19)
如項目A1～18中任一項記載之方法，其中上述微藻類為生產岩藻黃素之藻類。
(項目A20)
如項目A1～19中任一項記載之方法，其中上述微藻類為每1 g乾燥重量生產岩藻黃素8 mg以上之藻類。
(項目A21)
如項目A1～20中任一項記載之方法，其中上述微藻類為巴夫藻科。
(項目A22)
如項目A1～21中任一項記載之方法，其中上述微藻類為巴夫藻屬。
(項目A23)
如項目A1～22中任一項記載之方法，其中上述微藻類為P. calceolate、P. granifera、P. gyrans、P. lutheri、P. pinguis或P. salina。
(項目A24)
如項目A23記載之方法，其中上述微藻類為P. granifera或P. gyrans。
(項目A25)
一種微藻類製品，其係藉由包括進行如項目A1～24中任一項記載之方法之方法所製造且用以用於生物或用於生物攝取，該微藻類製品包含上述微藻類之藻體。
(項目A26)
如項目A25記載之微藻類製品，其中上述微藻類之去鎂葉綠素酸之含量為0.2重量%以下。
(項目A27)
如項目A26記載之微藻類製品，其中上述微藻類之去鎂葉綠素酸之含量為0.1重量%以下。
(項目A28)
一種用以用於生物或用於生物攝取之微藻類製品，其包含巴夫藻目之微藻類之藻體，且上述微藻類之去鎂葉綠素酸之含量為0.2重量%以下(乾燥重量)。
(項目A29)
一種用以用於生物或用於生物攝取之微藻類製品，其包含巴夫藻目之微藻類之藻體，且上述微藻類之去鎂葉綠素酸之含量為0.1重量%以下(乾燥重量)。
(項目A30)
如項目A28或29記載之微藻類製品，其中上述微藻類為P. granifera或P. gyrans。
(項目A31)
如項目A25～30之任一項記載之微藻類製品，其為食用製品或化妝品。
(項目A32)
如項目A25～31之任一項記載之微藻類製品，其中上述生物為哺乳動物。
(項目A33)
如項目A25～31之任一項記載之微藻類製品，其中上述生物為人類。
(項目A34)
如項目A25～33之任一項記載之微藻類製品，其中岩藻黃素之含量為0.8重量%以上。
(項目A35)
如項目A25～34之任一項記載之微藻類製品，其中上述微藻類之岩藻黃素含量為0.8重量%以上(乾燥重量)。
(項目A36)
如項目A25～35之任一項記載之微藻類製品，其中上述微藻類之葉綠素含量為3重量%以上(乾燥重量)。
(項目A37)
如項目A25～36之任一項記載之微藻類製品，其為食用製品。
(項目A38)
如項目A25～36之任一項記載之微藻類製品，其為食品。
(項目A39)
如項目A25～36之任一項記載之微藻類製品，其為以每1天提供100～150 mg之葉綠素之方式供攝取之食用製品。
(項目A40)
如項目A25～36之任一項記載之微藻類製品，其為化妝品。
(項目1)
一種微藻類製品，其用以用於生物或用於生物攝取。
(項目2)
如項目1記載之微藻類製品，其中上述微藻類為定鞭藻。
(項目3)
如項目1或2記載之微藻類製品，其中去鎂葉綠素酸之含量為0.1重量%以下。
(項目4)
如項目1～3之任一項記載之微藻類製品，其為食用製品或化妝品。
(項目5)
如項目1～4之任一項記載之微藻類製品，其中上述生物為哺乳動物。
(項目6)
如項目1～5之任一項記載之微藻類製品，其中上述微藻類之去鎂葉綠素酸含量為0.1重量%以下(乾燥重量)。
(項目7)
如項目1～6之任一項記載之微藻類製品，其中上述微藻類為巴夫藻目。
(項目8)
如項目1～7之任一項記載之微藻類製品，其中上述微藻類為巴夫藻科。
(項目9)
如項目1～8之任一項記載之微藻類製品，其中上述微藻類為巴夫藻屬。
(項目10)
如項目1～9之任一項記載之微藻類製品，其中上述生物為人類。
(項目11)
如項目1～10之任一項記載之微藻類製品，其中岩藻黃素之含量為0.8重量%以上。
(項目12)
如項目1～11之任一項記載之微藻類製品，其中上述微藻類之岩藻黃素含量為0.8重量%以上(乾燥重量)。
(項目13)
如項目1～12之任一項記載之微藻類製品，其中上述微藻類之葉綠素含量為3重量%以上(乾燥重量)。
(項目14)
如項目1～13之任一項記載之微藻類製品，其為化妝品。
(項目15)
如項目1～13之任一項記載之微藻類製品，其為食用製品。
(項目16)
如項目1～13之任一項記載之微藻類製品，其為食品。
(項目17)
如項目1～16之任一項記載之微藻類製品，其為以每天提供100～150 mg之葉綠素之方式供攝取之食用製品。
(項目18)
一種用以製造微藻類製品之方法，其包括如下步驟：
(A)將微藻類於控制應力量之條件下供於使葉綠素酶失活之處理。
(項目19)
如項目18記載之方法，其中上述應力量未達2。
(項目20)
如項目18記載之方法，其中上述應力量未達3。
(項目21)
如項目18～20中任一項記載之方法，其中上述供於使葉綠素酶失活之處理之步驟中之上述微藻類之密度為10 g/L(乾燥重量)以下。
(項目22)
如項目18～21中任一項記載之方法，其中於(A)步驟開始時，賦予至上述微藻類之應力量為低度之應力量。
(項目23)
如項目18～22中任一項記載之方法，其中於培養上述微藻類之步驟之後且(A)步驟之前不進行將上述微藻類進行濃縮之處理。
(項目24)
如項目18～23中任一項記載之方法，其包括於培養上述微藻類之步驟之後且(A)步驟之前將上述微藻類之細胞密度濃縮至3 g/L(乾燥重量)以下。
(項目25)
如項目18～24中任一項記載之方法，其中培養上述微藻類之步驟包括使上述微藻類增生至1.7 g/L(乾燥重量)之密度以上。
(項目26)
如項目18～25中任一項記載之方法，其中於(A)步驟之後包括將上述微藻類進行濃縮之步驟。
(項目27)
如項目18～26中任一項記載之方法，其中(A)步驟包括將上述微藻類進行加熱。
(項目28)
如項目27記載之方法，其中上述加熱包括加熱至95℃以上。
(項目29)
如項目18～28中任一項記載之方法，其中(A)步驟係於不使岩藻黃素分解或該分解有所減少之條件下進行。
(項目30)
如項目29記載之方法，其中上述條件包含岩藻黃素之分解量未達10%。
(項目31)
如項目18～30中任一項記載之方法，其中於(A)步驟後包括使上述微藻類乾燥之步驟。
(項目32)
如項目18～31中任一項記載之方法，其中上述微藻類每1 g乾燥重量生產葉綠素30 mg以上。
(項目33)
如18～32中任一項記載之方法，其中上述微藻類為生產岩藻黃素之藻類。
(項目34)
如項目18～33中任一項記載之方法，其中上述微藻類為每1 g乾燥重量生產岩藻黃素8 mg以上之藻類。
(項目35)
如項目18～34中任一項記載之方法，其中上述微藻類為巴夫藻目。
(項目36)
如項目18～35中任一項記載之方法，其中上述微藻類為巴夫藻科。
(項目37)
如項目18～36中任一項記載之方法，其中上述微藻類為巴夫藻屬。
(項目38)
如項目18～37中任一項記載之方法，其中上述微藻類為P. calceolate、P. granifera、P. gyrans、P. lutheri、P. pinguis或P. salina。
(項目39)
一種裝置，其特徵在於：其係用以培養微藻類者，且包含：
具有透光之材料之壁之至少2個培養部；
連接上述至少2個培養部之上部彼此之上部連接部；
連接上述至少2個培養部之下部彼此之下部連接部；及
設置於上述至少2個培養部中之至少1者而非所有培養部之至少1個氣泡產生器件；且
上述至少2個培養部、上部連接部及下部連接部以流體連通之方式而構成，以封入培養基；
上述裝置係以上部連接部較下部連接部更遠離安裝地板之方式設置。
(項目40)
如項目39記載之裝置，其中上述至少2個培養部具有約10 mm～約1000 mm之外徑。
(項目41)
如項目39或40記載之裝置，其中上述至少2個培養部具有約10 cm～約1000 cm之長度。
(項目42)
如項目39～41之任一項記載之裝置，其中上述氣泡產生器件設置於較上部連接部更接近下部連接部之位置。
(項目43)
如項目39～42之任一項記載之裝置，其係以上述培養基僅通過過濾器及上述氣泡產生器件與外部氣體接觸之方式而構成。
(項目44)
如項目39～43之任一項記載之裝置，其除上述氣泡產生器件以外不具有用於攪拌之動力源。
(項目45)
如項目39～44之任一項記載之裝置，其中上述至少2個培養部彼此為任一培養部彼此均不處於包含關係之分離之部分。
(項目46)
如項目39～45之任一項記載之裝置，其係以上述至少2個培養部不相互遮光之方式而構成。
(項目47)
一種系統，其係包含培養槽、及
進行使葉綠素酶失活之處理之處理部
之用以製造微藻類製品者，且
係以自上述培養部至上述處理部之間控制對微藻類之應力量之方式構成。
(項目48)
如項目47記載之系統，其係以藉由輥子泵、莫諾泵(Mono pump)或隔膜泵使自上述培養部至上述處理部之間之水流產生之形式而構成。
於本發明中，關於上述1或複數個特徵，意圖除已明示之組合以外，還可進一步進行組合而提供。關於本發明之又一實施形態及優勢，只要視需要閱讀以下之詳細說明進行理解，則可被業者認識。
[發明之效果]
本發明中，微藻類製品安全且具有新的功能性，可提供健康、營養及/或美容上之利益。又，本發明之微藻類製品由於對動物(尤其是人類)有害之成分減少或消失，有害作用減少或消失，故而能夠充分地發揮出微藻類製品所具有之功能。本發明之製造方法及系統能夠有效率地提供一種降低了去鎂葉綠素酸之微藻類製品。又，本發明之培養裝置使各種微藻類之細菌污染較少之高濃度培養成為可能。
以下，一面例示本發明最佳之形態一面進行說明。於整個本說明書中，單數形式之表現只要未特別提及，應理解為亦包含其複數形式之概念。因此，單數形式之冠詞(例如於英語之情形時，「a」、「an」、「the」等)只要未特別提及，則應理解為亦包含其複數形式之概念。又，於本說明書中所使用之用語只要未特別提及，則應理解為以該領域中通常所使用之含義而使用。因此，只要未另外定義，則本說明書中所使用之所有專業用語及科學技術用語具有與本發明所屬之領域之業者通常所理解者相同之含義。於矛盾之情形時，本說明書(包括含義)優先。
以下適當說明於本說明書中特別使用之用語之定義及/或基本技術內容。
(定義等)
於本說明書中，「微藻類」係指包含葉綠體之顯微鏡大小(例如0.1 μm～1 mm)之微生物，通常棲息於水中。微藻類中包含作為原核生物之藍菌門(cyanobacteria)、以及作為真核生物之灰胞藻門(Glaucophyta)、紅藻植物門(紅藻)(Rhodophyta)、綠藻植物門(Chlorophyta)、隱藻植物門(褐色鞭毛藻類)(Cryptophyta)、定鞭藻植物門(定鞭藻)(Haptophyta)、不等鞭毛植物門(Heterokontophyta)、甲藻植物門(甲藻)(Dinophyta)、裸藻類(Euglenida)及綠蜘藻植物門(Chlorarachniophyta)之生物。
綠藻植物門中包含共球藻綱(Trebouxiophyceae)，共球藻綱中包含綠藻目(Chlorellales)，綠藻目(Chlorellales)中包含綠藻科(Chlorellaceae)，綠藻科(Chlorellaceae)中包含綠藻屬(Chlorella)。
裸藻類(Euglenida)中包含裸藻綱(Euglenophyceae)，裸藻綱(Euglenophyceae)中包含裸藻目(Euglenales)，裸藻目(Euglenales)中包含裸藻科(Euglenaceae)，裸藻科(Euglenaceae)中包含眼蟲藻屬(Euglena)。
藍菌門(cyanobacteria)中包含顫藻目(Oscillatoriales)，顫藻目(Oscillatoriales)中包含節螺藻(Arthrospira)屬(Arthrospira)。
定鞭藻植物門(定鞭藻)(Haptophyta)中包含定鞭藻綱(Haptophyceae)，定鞭藻綱(Haptophyceae)中包含巴夫藻亞綱(Pavlovophycidae)及普林藻綱(rymnesiophycidae)。巴夫藻亞綱(Pavlovophycidae)中包含巴夫藻目(Pavlovales)，巴夫藻目(Pavlovales)中包含巴夫藻科(Pavlovaceae)，巴夫藻科(Pavlovaceae)中包含Diacronema、Exanthemachrysis、Pavlova、Rebecca。定鞭藻為細胞直徑5～50 μm左右之植物浮游生物，係進行光合成之獨立營養生物。大多棲息於海洋中，但一部分物種亦分佈於淡水或鹽湖中。定鞭藻於外洋區域中之生物量較大，作為海洋之一次生產者較重要。
於本說明書中，「微藻類製品」係指包含微藻類之藻體或微藻類之一部分成分之製品(例如食用製品、化妝品)。典型而言，微藻類製品為乾燥品、或用乾燥品進一步加工而成之製品(包含成分萃取製品)、或用未使其乾燥之微藻類所製造之成分萃取製品(例如岩藻黃素萃取製品)。
於本說明書中，「食用製品」係指以生物(例如動物、人類)攝取為目的之物品，食用製品中，除以通常之含義而使用之食品及飲料、非人類動物用之餌食以外，還包含食品添加物、功能性食品(例如特定保健用食品)、及補充品。
於本說明書中，「化妝品」係指目的在於為了清潔、並美化動物(例如人類)之身體、增添魅力、改變容貌、或使皮膚或者毛髮保持健康而以穿著、塗擦、噴灑於身體以及與該等類似而方法而使用的任意之製品。於本說明書中，「化妝品」並不限定於所謂之藥品醫療設備等法(舊藥事法)上之「化妝品」，例如亦可為準藥品、藥品、雜貨之任一者。於本說明書中，「準藥品」係於日本之「與藥品、醫療設備等之品質、有效性及安全性之確保等有關之法律」中所規定之藥品與化妝品之中間性分類，包含對人體之作用較緩和者，亦包含對人體之作用較緩和之機械器具。作為準藥品之例，可列舉藥用化妝品(包含藥用肥皂、藥用牙膏等)、沐浴劑、防治用準藥品(殺蟲劑等)及指定準藥品(飲劑、漱口劑、一部分腸胃藥等)，但並不限定於該等。於本說明書中，「藥品」係指為了進行人類或動物之疾病之診斷、治療、預防而給予之藥品，包含：日本藥典中所收錄者；為以用於人或動物之疾病之診斷、治療或預防為目的者而非機械器具、齒科材料、醫療用品及衛生用品者(除準藥品以外)；及為以對人或動物之身體之結構或功能產生影響為目的者而非機械器具、齒科材料、醫療用品及衛生用品者(除準藥品及化妝品以外)。
於本說明書中，「葉綠素(chlorophyll)」係以該技術領域中之普通之含義而使用，係經常用於在光合成之光反應中吸收光能之物質。具有葉綠體之微藻類可包含葉綠素。
於本說明書中，「去鎂葉綠素酸」係以該技術領域中之普通之含義而使用，係經常於微藻類中由葉綠素之分解而產生之物質。去鎂葉綠素酸可藉由葉綠素酶作用於葉綠素而產生。由於存在可能產生呈現出皮膚損傷之衛生上之危害之可能性，故而於綠藻加工品等中，含量受到規制(一九八一年五月八日)(環食第九九號)(日本厚生省環境衛生局長向日本各都道府縣知事、各政令市市長、各特別區區長通知))。
於本說明書中，「岩藻黃素」係以該技術領域中之普通之含義而使用，為具有以下結構
[化1]
之物質。已知，岩藻黃素容易因加熱、光照射及氧化等而分解。
於本說明書中，微藻類製品之「製造」係指自準備細胞之步驟至獲得微藻類製品之步驟之一連串之過程、其一部分步驟、或其步驟之任意之組合，可與「生產」交換使用。例如微藻類製品之製造中可包括培養微藻類之步驟、對微藻類進行處理之步驟(例如加熱處理)、將微藻類進行濃縮之步驟、及使微藻類乾燥之步驟等中至少1個步驟，但並不限定於該等。
於本說明書中，「培養」係以該技術領域中之普通之含義而使用，係指使細胞於培養基中或培養基上維持於生存狀態之操作，細胞之數量於培養中可增加，亦可減少，亦可維持。於本說明書中，「正式培養」係指於該培養結束之後將所獲得之微藻類作為用於製品製造之原料而使用之培養。於本說明書中，「種子培養」係指除正式培養以外之培養，例如可列舉：轉移至更大規模之培養之前之培養、為了以穩定狀態維持微藻類而於細胞密度不大幅變動之條件下實施之培養(維持培養)、用以改變細胞狀態(例如自休眠狀態向穩定狀態之改變(馴化培養)、自穩定狀態向快速增生狀態之改變)之培養等。
於本說明書中，「濃縮」係指藉由不利用細胞增生之方法(例如離心分離、過濾、介質之去除等)使細胞密度上升之操作。濃縮亦可藉由將上述微藻類之細胞密度維持於3 g/L(乾燥重量)而表現。
於本說明書中，「應力量」係由使微藻類中所產生之去鎂葉綠素酸量增大之任意之操作所累積之去鎂葉綠素酸生產性之指標。某操作給予微藻類之應力量係定義為：除該操作之有無以外，於相同之條件下對常溫下所培養之NBRC 102809株(可自NITE取得)進行既有去鎂葉綠素酸量之測定之情形時之以(於進行該操作時所測得之既有去鎂葉綠素酸量)/(於未進行該操作時所測得之既有去鎂葉綠素酸量)而表示之比率。尤其是未給予較大之刺激之NBRC 102809株中，可觀察到約30～90 mg/100 g(乾燥重量)之既有去鎂葉綠素酸量。應力量可根據於類似之條件下所測得之既有去鎂葉綠素酸量進行預測。
於本說明書中，「高度之應力量」係指由各操作所給予之應力量之合計為5以上之應力量。
於本說明書中，「低度之應力量」係指由各操作所給予之應力量之合計為2以下之應力量。
於在本說明書中使用時，試樣中之分析物之「量」通常係指反映試樣之體積中可檢測出之分析物之質量之絕對值。然而，量亦企圖指與其他分析物量進行比較之相對量。例如試樣中之分析物之量亦可為大於試樣中通常存在之分析物之對照水準或正常水準之量。
於本說明書中，用語「約」只要未明示為其他，則指所示之值正或負10%。
於本說明書中，「系統」係指執行本發明之方法或程序之構成，本來意指用以實現目的之體系或組織，係複數個要素成體系地構成並相互影響者，於電腦之領域中係指硬體、軟體、OS(Operating System，操作系統)、網路等整體之構成，但於本發明中，並不一定必須利用電腦，只要為包含各種構成之構成物，則理解為屬於系統之範疇。
(較佳之實施形態)
以下對本發明之較佳之實施形態進行說明。理解到，以下所提供之實施形態係為了更好地理解本發明而提供者，本發明之範圍不應限定於以下記載。因此，明確業者可參酌本說明書中之記載，於本發明之範圍內進行適當改變。又，理解到，本發明之以下實施形態可單獨使用，或可將該等組合使用。
(微藻類製品)
於一態樣中，本發明提供一種微藻類製品。於一實施形態中，微藻類製品為食品或化妝品。發明者發現了一種於微藻類中之去鎂葉綠素酸生成得到抑制之狀態下製備微藻類製品之方法，藉此能夠提供安全之微藻類製品(例如食品、化妝品)。於一實施形態中，本發明之微藻類製品(於本說明書中，各成分之重量%係以去除了水分後之每單位重量來定義)中所包含之去鎂葉綠素酸量可為約1重量%以下、約0.7重量%以下、約0.5重量%以下、約0.2重量%以下、約0.1重量%以下、約0.07重量%以下、約0.05重量%以下、約0.02重量%以下、約0.01重量%以下、約0.007重量%以下、約0.005重量%以下、約0.002重量%以下、約0.001重量%以下、約0.0007重量%以下、約0.0005重量%以下、約0.0002重量%以下、或約0.0001重量%以下等。
本發明之微藻類製品中可使用任意之微藻類。本發明之微藻類製品可包含微藻類之藻體及微藻類成分之萃取物之任一者，此處，藻體不僅指無損傷之細胞，亦指破裂而細胞成分分離之狀態之細胞，例如可指藻類細胞之主要構成成分(例如細胞壁、細胞膜、蛋白質、脂質、碳水化合物)之任一者於微藻類製品中包含10重量%以上、5重量%以上、1重量%以上、0.5重量%以上、0.1重量%以上、0.05重量%以上、0.01重量%以上、0.005重量%以上、0.001重量%以上、0.0005重量%以上、或0.0001重量%以上之狀態。作為可使用之微藻類之例，可列舉：藍細菌門(cyanobacteria)、以及作為真核生物之灰胞藻門(Glaucophyta)、紅藻植物門(紅藻)(Rhodophyta)、綠藻植物門(Chlorophyta)、隱藻植物門(隱藻)(Cryptophyta)、定鞭藻植物門(定鞭藻)(Haptophyta)、不等鞭毛植物門(Heterokontophyta)、甲藻植物門(甲藻)(Dinophyta)、裸藻類(Euglenida)及綠蜘藻植物門(Chlorarachniophyta)之生物。例如可使用之綠藻植物門之微藻類中包含共球藻綱(Trebouxiophyceae)，共球藻綱中包含綠藻目(Chlorellales)，綠藻目(Chlorellales)中包含綠藻科(Chlorellaceae)，綠藻科(Chlorellaceae)中包含綠藻屬(Chlorella)。例如可使用之裸藻類(Euglenida)之微藻類中包含裸藻綱(Euglenophyceae)，裸藻綱(Euglenophyceae)中包含裸藻目(Euglenales)，裸藻目(Euglenales)中包含裸藻科(Euglenaceae)，裸藻科(Euglenaceae)中包含眼蟲藻屬(Euglena)。例如可使用之藍菌門(cyanobacteria)之微藻類中包含顫藻目(Oscillatoriales)，顫藻目(Oscillatoriales)中包含節螺藻(Arthrospira)屬(Arthrospira)。例如可使用之定鞭藻植物門(定鞭藻)(Haptophyta)之微藻類中包含定鞭藻綱(Haptophyceae)，定鞭藻綱(Haptophyceae)中包含巴夫藻亞綱(Pavlovophycidae)及普林藻綱(rymnesiophycidae)。巴夫藻亞綱(Pavlovophycidae)中包含巴夫藻目(Pavlovales)，巴夫藻目(Pavlovales)中包含巴夫藻科(Pavlovaceae)，巴夫藻科(Pavlovaceae)中包含Diacronema、Exanthemachrysis、Pavlova及Rebecca。普林藻綱中包含金藻目(Isochrysidales)，金藻目中包含Isochrysis、Imantonia、Emiliania、Gephyrocapsa及Reticulofenestra之屬，Isochrysis中包含I. galbana、I. litoralis、I. maritima、Tisochrysis lutea，Emiliania中包含E. huxleyi，Gephyrocapsa中包含G. oceanica、G. ericsonii、G. muellerae、G. protohuxleyi。由於金藻目之微藻類與巴夫藻目之微藻類可能具有生產岩藻黃素、高產量生產EPA(eicosapantaenoic acid，二十碳五稀酸)之相同之性質，故而於本發明中，關於岩藻黃素生產中可能成為問題之去鎂葉綠素酸之產生之問題之方面，至少屬於巴夫藻目之微藻類與屬於金藻目之微藻類會具有共用之課題，故而關於本發明，業者可理解：於該上下文中，藉由本發明之內容可同樣地解決該問題。本發明之較佳之實施形態中，可包含去鎂葉綠素酸量之產生量可能成為問題之微藻類作為對象之微藻類。作為此種微藻類，可列舉眼蟲藻目(例如上述眼蟲藻科、眼蟲藻屬之微藻類)、巴夫藻目(例如上述巴夫藻科、巴夫藻屬之微藻類)、金藻目(例如上述金藻科、金藻屬之微藻類)，但不限定於該等。於一實施形態中，所使用之微藻類為巴夫藻科。於一實施形態中，所使用之微藻類為巴夫藻屬。於一實施形態中，所使用之微藻類為P. calceolate、P. granifera、P. gyrans、P. lutheri、P. pinguis或P. salina。
於一實施形態中，本發明之微藻類製品所包含之微藻類其去鎂葉綠素酸有所減少。於一實施形態中，本發明之微藻類製品所包含之微藻類之去鎂葉綠素酸含量可為約1重量%以下、約0.7重量%以下、約0.5重量%以下、約0.2重量%以下、約0.1重量%以下、約0.07重量%以下、約0.05重量%以下、約0.02重量%以下、約0.01重量%以下、約0.007重量%以下、約0.005重量%以下、約0.002重量%以下、或約0.001重量%以下等。微藻類製品所包含之微藻類之去鎂葉綠素酸含量可藉由(微藻類製品所包含之去鎂葉綠素酸量)/(微藻類製品所包含之微藻類量)進行計算。
於一實施形態中，本發明之微藻類製品中可使用高產量生產岩藻黃素之微藻類(例如定鞭藻綱)。於一實施形態中，本發明之微藻類製品(於本說明書中，各成分之重量%係作為除去水分之每單位重量進行定義)所包含之岩藻黃素量可為約0.001重量%以上、約0.002重量%以上、約0.005重量%以上、約0.007重量%以上、約0.01重量%以上、約0.02重量%以上、約0.05重量%以上、約0.07重量%以上、約0.1重量%以上、約0.2重量%以上、約0.5重量%以上、約0.7重量%以上、約1重量%以上、約2重量%以上、或約5重量%以上等。於一實施形態中，本發明之微藻類製品所包含之微藻類之岩藻黃素含量可為約0.01重量%以上、約0.02重量%以上、約0.05重量%以上、約0.07重量%以上、約0.1重量%以上、約0.2重量%以上、約0.5重量%以上、約0.7重量%以上、約1重量%以上、約2重量%以上、或約5重量%以上等。微藻類製品所包含之微藻類之岩藻黃素含量可藉由(微藻類製品所包含之岩藻黃素量)/(微藻類製品所包含之微藻類量)進行計算。已知岩藻黃素具有抗肥胖、抗糖尿病、抗氧化、抗癌、抑制血管新生等效果，故而期待含有大量岩藻黃素之本發明之微藻類製品發揮出該等效果。
於一實施形態中，本發明之微藻類製品中可使用高產量生產葉綠素之微藻類(例如定鞭藻綱)。葉綠素可能產生去鎂葉綠素酸，但發明者發現了即便為高產量生產葉綠素之微藻類亦不會使去鎂葉綠素酸量上升地進行加工從而製造微藻類製品的方法，即便為高產量生產葉綠素之微藻類亦可良好地使用。於一實施形態中，本發明之微藻類製品(於本說明書中，各成分之重量%係作為除去水分之每單位重量進行定義)所包含之葉綠素量可為約0.001重量%以上、約0.002重量%以上、約0.005重量%以上、約0.007重量%以上、約0.01重量%以上、約0.02重量%以上、約0.05重量%以上、約0.07重量%以上、約0.1重量%以上、約0.2重量%以上、約0.5重量%以上、約0.7重量%以上、約1重量%以上、約2重量%以上、約5重量%以上、約7重量%以上、約10重量%以上、約20重量%以上、約30重量%以上、或約40重量%以上等。於一實施形態中，本發明之微藻類製品所包含之微藻類之葉綠素含量可為約0.01重量%以上、約0.02重量%以上、約0.05重量%以上、約0.07重量%以上、約0.1重量%以上、約0.2重量%以上、約0.5重量%以上、約0.7重量%以上、約1重量%以上、約2重量%以上、約5重量%以上、約7重量%以上、約10重量%以上、約20重量%以上、約30重量%以上、或約40重量%以上等。微藻類製品所包含之微藻類之葉綠素含量可以(微藻類製品所包含之葉綠素量)/(微藻類製品所包含之微藻類量)進行計算。
於一實施形態中，本發明之微藻類製品可為食品、餌食、補充品、食品添加物、飲料等食用製品，可為任意之食用製品。作為食品之微藻類製品(於本說明書中，各成分之重量%係作為除去水分之每單位重量進行定義)可包含約0.001～100重量%、例如約0.001重量%、約0.002重量%、約0.005重量%、約0.007重量%、約0.01重量%、約0.02重量%、約0.05重量%、約0.07重量%、約0.1重量%、約0.2重量%、約0.5重量%、約0.7重量%、約1重量%、約2重量%、約5重量%、約7重量%、約10重量%、約20重量%、約50重量%、約70重量%、或約100重量%之微藻類或其成分。例如巴夫藻目之微藻類由於不具有細胞壁，可具有柔軟之特性，故而於攝取時不會給人不愉快之食感。於在意微藻類之味道或風味之情形時，可與任意之適宜之矯味劑、除臭劑、遮蔽劑組合使用，亦可使用包衣(coating)或膠囊化等方法遮蔽微藻類之味道或風味。於本發明中，由於微藻類之去鎂葉綠素酸可減少，故而微藻類製品(例如補充品、食品添加物)例如能夠以約10重量%以上等之高濃度包含微藻類。又，富含岩藻黃素等有用成分之微藻類由於以少量之攝取便能夠發揮出效果，故而能夠用作補充品及/或食品添加物。
於一實施形態中，本發明之微藻類製品可為任意之化妝品。作為化妝品之微藻類製品(於本說明書中，各成分之重量%係作為除去水分之每單位重量進行定義)可包含約0.001～100重量%、例如約0.001重量%、約0.002重量%、約0.005重量%、約0.007重量%、約0.01重量%、約0.02重量%、約0.05重量%、約0.07重量%、約0.1重量%、約0.2重量%、約0.5重量%、約0.7重量%、約1重量%、約2重量%、約5重量%、約7重量%、約10重量%、約20重量%、約50重量%、約70重量%、或約100重量%之微藻類或其成分。例如巴夫藻目之微藻類由於不具有細胞壁從而可具有柔軟之特性，故而於應用於皮膚時之刺激較小。於在意微藻類之氣味等之情形時，可與任意之適宜之除臭劑、遮蔽劑組合使用，亦可使用包衣或膠囊化等方法遮蔽微藻類之成分。於本發明中，由於微藻類之去鎂葉綠素酸可減少，故而微藻類化妝品例如即便以約10重量%以上等之高濃度包含微藻類，亦可安全地使用。
於一實施形態中，本發明之微藻類製品為哺乳動物用。於一實施形態中，本發明之微藻類製品為人類用(例如人類之食用)。
於一實施形態中，本發明之微藻類製品可為乾燥狀態，亦可包含水分。於一實施形態中，本發明之微藻類製品中之水分量可為約0.1重量%～約50重量%、例如約0.5重量%、約1重量%、約1.5重量%、約2重量%、約2.5重量%、約3重量%、約4重量%、約5重量%、約7重量%、約10重量%、約20重量%、約30重量%、約40重量%、約50重量%、尤其是約2.5重量%、約3重量%、約4重量%等。藉由使其乾燥，可提昇微藻類之保存性、易加工性等。於一實施形態中，作為乾燥狀態之本發明之微藻類製品可包含賦形劑(糊精等)、乾燥劑、抗氧化劑及除氧劑中之1種或複數種，可減少微藻類之成分(例如岩藻黃素)之分解。乾燥劑、抗氧化劑及除氧劑可使用能夠添加於食品中、或一併封入至食品之包裝中使用之任意者。於一實施形態中，乾燥劑、抗氧化劑及/或除氧劑可放入透氣性之袋子等容器中而添加於本發明之微藻類製品中。於一實施形態中，本發明之微藻類製品(例如乾燥品)中亦可包含乳化劑，例如可促進抗氧化劑進入微藻類細胞內。於一實施形態中，本發明之微藻類製品(例如乾燥品)可封入至遮光容器中，可減少微藻類之成分(例如岩藻黃素)之分解。本發明之微藻類製品(例如乾燥品)可於低溫下保存，可減少微藻類之成分(例如岩藻黃素)之分解。
本發明之微藻類製品可為任意之適宜之形態。於一實施形態中，本發明之微藻類製品例如可為錠劑(乾燥)、粉末、膠囊、霜劑、冷凍品、液狀等形態，但並不限定於該等。
於一實施形態中，本發明之微藻類製品可為油浸漬品。油可為任意之食用油，例如可為橄欖油、菜籽油、紫蘇油、亞麻籽油、玉米油、大豆油、葵花籽油、紅花油、棉籽油、稻米油、堅果油、萼梨油、杏仁油、花生油、黃油、牛脂、豬油、酥油、人造奶油、椰子油、棕櫚油、椰子油等。特定之實施形態中，於油浸漬品中，可使用經乾燥之本發明之微藻類。油浸漬品中之本發明之微藻類：油之混合比例如以重量計可為約1：100～100：1、約1：50～50：1、約1：20～20：1、約1：10～10：1、約1：5～5：1、約1：75、約1：50、約1：25、約1：20、約1：15、約1：10、約1：7、約1：5、約1：2、約1：1、約2：1、約5：1、約7：1、約10：1、約15：1、約20：1、約25：1、約50：1、約75：1或約100：1。於一實施形態中，本發明之油浸漬品亦可包含抗氧化劑，作為抗氧化劑，例如可列舉維生素E(生育酚、生育三烯酚，例如維生素E)、抗壞血酸、β胡蘿蔔素、維生素A、蕃茄紅素、綠原酸、土耳其鞣酸、木聚糖、芝麻素、薑黃素、香豆素、橄欖油刺激醛(oleocanthal)、橄欖苦苷、白藜蘆醇、兒茶素、花青苷、單、芸香苷、異黃酮、陳黃皮酮、葉黃素、玉米黃素、斑螫黃素、蝦紅素、β-隱黃素、玉紅黃素、還原型輔酶，但並不限定於該等。於一實施形態中，本發明之油浸漬品亦可以經乳化劑乳化之形態而提供。於一實施形態中，本發明之油浸漬品亦可包含賦形劑(糊精等)。於一實施形態中，本發明之油浸漬品可封入至食用膠囊中而提供。
於一實施形態中，本發明之微藻類製品可為凍結品。低溫下，可減少微藻類之成分(例如岩藻黃素)之分解。於一實施形態中，凍結品可為乳製品不添加、雪酪、乳酸冰淇淋(乳固形物成分3%以上)、冰牛奶(乳固形物成分10%以上：乳脂肪成分3%以上)、冰淇淋(乳固形物成分15%以上：乳脂肪成分8%以上)、冰棒、冰淇淋等，但並不限定於該等。凍結品中亦可添加賦形劑(環糊精、糖類等)、果汁(例如柑橘類、葡萄、蘋果、桃等)、果實萃取物、蔬菜汁、甜味劑、香料、著色料、抗氧化劑、增黏劑等。於一實施形態中，凍結品可為板狀之形態、或杯裝之形態。由於本發明之微藻類可具有海藻之風味，故而於凍結品中亦可添加用以遮蔽該風味之添加劑(例如果汁、果實萃取物、香料)。
於一實施形態中，本發明之微藻類製品(於本說明書中，各成分之重量%係作為除去水分之每單位重量進行定義)可包含：
約1～5重量%之本發明之微藻類及約0.1重量%以下、約0.07重量%以下、約0.05重量%以下、約0.02重量%以下、約0.01重量%以下、約0.007重量%以下、約0.005重量%以下、約0.002重量%以下、或約0.001重量%以下之去鎂葉綠素酸、
約5～10重量%之本發明之微藻類及約0.2重量%以下、約0.15重量%以下、約0.1重量%以下、約0.05重量%以下、約0.02重量%以下、約0.015重量%以下、約0.01重量%以下、約0.005重量%以下、或約0.002重量%以下之去鎂葉綠素酸、
約10～20重量%之本發明之微藻類及約0.5重量%以下、約0.2重量%以下、約0.1重量%以下、約0.05重量%以下、約0.02重量%以下、約0.015重量%以下、約0.01重量%以下、約0.007重量%以下、或約0.005重量%以下之去鎂葉綠素酸、
約20～50重量%之本發明之微藻類及約1重量%以下、約0.7重量%以下、約0.5重量%以下、約0.2重量%以下、約0.1重量%以下、約0.07重量%以下、約0.05重量%以下、約0.02重量%以下、約0.01重量%以下或約0.005重量%以下之去鎂葉綠素酸、或
約50～100重量%之本發明之微藻類及約2重量%以下、約1.5重量%以下、約1重量%以下、約0.5重量%以下、約0.2重量%以下、約0.15重量%以下、約0.1重量%以下、約0.07重量%以下、約0.05重量%以下、約0.02重量%以下、或約0.01重量%以下之去鎂葉綠素酸。
(微藻類製品之製造方法)
於一態樣中，本發明提供一種微藻類製品之製造方法。該製造方法中包括培養微藻類之步驟、處理微藻類之步驟、將微藻類進行濃縮之步驟、使微藻類乾燥之步驟、及將微藻類之成分分離之步驟中之至少1個步驟。可將可於上述本發明之微藻類製品中使用之任意之微藻類用於該製造方法中。又，該製造方法能夠以達成上述本發明之微藻類製品所包含之微藻類之任意之狀態(例如去鎂葉綠素酸、岩藻黃素及/或葉綠素含量)之方式而實施。
本發明之一特徵係於微藻類製品之製造方法之任意之步驟中包含將微藻類於控制應力量之條件下供於使葉綠素酶失活之處理(例如加熱)。本發明之各種實施形態中，控制微藻類之應力量之條件可為任意之條件，例如可列舉：不進行將微藻類進行濃縮之處理之條件、使微藻類維持於固定之細胞密度以下之條件、將於濃縮時對細胞施加之壓力(例如，離心濃縮時之G之強度)及/或時間(例如離心操作之時間)限制於不出現弊害之範圍之條件、降低因添加物(例如沈澱劑、凝結劑)投予而引起之伴隨濃縮之對細胞之物理損傷及化學損傷的條件等。於一實施形態中，步驟(A)中亦可包括測定應力量之步驟。用以抑制去鎂葉綠素酸之應力量之控制例如可藉由使微藻類之密度維持於低度、及/或不將微藻類大幅濃縮而達成。於一實施形態中，自培養後至使葉綠素酶失活之處理中給予至微藻類之應力量可藉由將微藻類之密度維持於特定值以下、及/或不將微藻類濃縮至特定倍率以上而維持於特定值以下。此時之密度之特定值及濃縮之特定倍率可基於濃縮目標之微藻類之情形時之去鎂葉綠素酸之增多而決定。
再者，應力量之控制可藉由「極力抑制加熱前之刺激水準」而實現。例如可規定對巴夫藻等微藻類施加之刺激之量、或規定施加過刺激之巴夫藻之狀態。例如視認性較高的可列舉如下外觀：巴夫藻由於無細胞壁而柔軟，故而因離心力而形狀變得扁平、或細胞受傷。
尤其是本發明之特徵在於提供一種方法，其係用以製造微藻類製品者，其包括如下步驟：
(A)其係自培養後至(B)之步驟中於控制於特定值以下之條件下維持給予至微藻類之應力量之步驟，且將該微藻類之密度維持於特定值以下、且/或不將該微藻類濃縮至特定倍率以上；及
(B)將微藻類供於使葉綠素酶失活之處理之步驟。發明者出乎預料地發現，於將微藻類置於應力負荷之情形時，會生成有害之去鎂葉綠素酸。對用以避免生成該去鎂葉綠素酸之方法進行了摸索，結果發現藉由將微藻類供於使葉綠素酶失活之處理能夠抑制其後之去鎂葉綠素酸增多。然而，於在葉綠素酶失活處理之前已大量地生成去鎂葉綠素酸之情形時，藉由葉綠素酶失活處理而得之去鎂葉綠素酸抑制效果有限。為了於可大量生產成為去鎂葉綠素酸之來源之葉綠素之微藻類中達成更有效之去鎂葉綠素酸抑制進行了反覆研究，發現重要的是於培養後葉綠素酶失活處理之前之期間中避免應力負荷，尤其是避免由高密度及濃縮操作而引起之應力負荷。關於綠藻等具有細胞壁之「較硬之」微藻類，認為高密度或濃縮操作並非對細胞給予應力之因素，可預測該見解為「柔軟之」巴夫藻目之微藻類特有者。因此，必須注意培養後至葉綠素酶失活處理之前之期間之細胞密度及濃縮操作本身為先前未認識到之課題。此種課題較新穎，但關於使用之微藻類，業者能夠容易地決定為了達成所需去鎂葉綠素酸抑制效果所需要之密度及濃縮倍率之極限。例如可藉由實驗性地確認濃縮微藻類之情形時以何種程度增大去鎂葉綠素酸量而決定所容許之密度及濃縮倍率。
於一實施形態中，本發明之微藻類製品之製造方法包括培養微藻類之步驟。於一實施形態中，培養之步驟可細分為種子培養之步驟及正式培養之步驟等。於一實施形態中，種子培養可包含複數個培養階段(例如試驗管之培養階段(約100 mL)、PET(Polyethylene terephthalate，聚對苯二甲酸乙二酯)瓶、燒瓶或者培養基瓶(medium bottle)之培養階段(約1 L以下)、本發明之光生物反應器之培養階段(約5 L)、10～20根約5 L容量之本發明之光生物反應器或2～4根約25 L容量之本發明之光生物反應器之培養階段(約50～100 L)、及更大規模之光生物反應器之培養階段(約1000 L以上)中之任意之組合)。只要未特別說明，以下所說明之培養條件於任一種類之培養中均可應用。培養微藻類之步驟之條件(例如溫度、pH值、攪拌條件、光照射條件、及培養基組成)分別可較佳地設定。於一實施形態中，微藻類之培養亦可包含複數個階段(例如種子培養及正式培養、於室內之無污染培養及於室外之高速增生培養、馴化培養及正式培養等)。培養微藻類之步驟亦可包含使上述微藻類增生至1.5 g/L(乾燥重量)或1.7 g/L(乾燥重量)之密度以上。
於一實施形態中，微藻類可於約0℃～80℃下、更具體而言可於約20℃～30℃之溫度下進行培養。作為合適之溫度之上限，可列舉80℃、70℃、60℃、50℃、40℃、30℃、20℃等，作為下限，可列舉0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃等，只要無矛盾，可採用該等之任意之組合作為合適之溫度範圍。只要微藻類不死滅，則可利用任意之培養溫度。培養溫度無需固定，尤其是於培養槽設置於室外之情形時，可不進行嚴密之溫度管理。較佳為於培養期間之至少一部分中將微藻類供於能夠較佳地生存、增生之溫度。於因直射日光等使溫度過度上升之情形時，可藉由任意之冷卻方法(例如水冷)降低溫度。例如於微藻類為定鞭藻之情形時，於約25～30℃之溫度下可較佳地增生。
於一實施形態中，微藻類可以約2～13之pH值進行培養。作為合適之pH值之上限，可列舉pH值13、pH值12、pH值11、pH值10、pH值9、pH值8.5、pH值8、pH值7.5、pH值7、pH值6等，作為下限，可列舉pH值2、pH值3、pH值4、pH值5、pH值6、pH值6.5、pH值7、pH值7.5、pH值8等，只要無矛盾，則可採用該等之任意之組合作為合適之pH值範圍。只要微藻類不死滅，則可利用任意之pH值。適合於每個微藻類之種類之pH值可不同，但只要為業者，則可容易地設定適合於所使用之微藻類之pH值。較佳為於培養中不引起急遽之pH值變化，可使用任意之適宜之緩衝劑(例如二氧化碳、胺化合物等)控制pH值變化。例如於微藻類為定鞭藻之情形時，於約8之pH值之弱鹼性之環境下可較佳地增生。
於一實施形態中，微藻類可於培養中供於攪拌條件，亦可不攪拌。作為用於攪拌之方法，可列舉曝氣攪拌、機械攪拌(漿葉攪拌等)、流水攪拌(例如使用泵)、藉由培養槽之振盪等之攪拌等，但並不限定於該等。根據攪拌方法不同，存在微藻類受損傷之情況，尤其是不具有細胞壁之裸藻或定鞭藻等由於相對較軟，故而可能較佳為於培養中避免破壞細胞之類之遽烈之攪拌。
於一實施形態中，微藻類可於培養期間中之至少一部分中於光照射下進行培養。於微藻類不受損傷之範圍內照射之光量越多，微藻類之增生速度越可提昇，但因微藻類之種類而不同。根據微藻類不同，亦存在較佳為非固定之光照射之情況。亦可選擇性地照射特定之波長區域。於室外培養微藻類之情形時，可能有利的是利用自然光。即便於室外培養微藻類且僅利用自然光作為光源之情形時，亦可藉由培養槽之深度之調整或光生物反應器之直徑之調整等而控制微藻類每1個細胞之光量。尤其是於使光合成色素較多之定鞭藻等增生時，可能有利的是照射自然光等較高之光量。能夠使用之光能量例如可為約30 μmol m-2
s-1
～約3000 μmol m-2
s-1
、或約30 μmol m-2
s-1
～約1500 μmol m-2
s-1
，可能較佳為約50 μmol m-2
s-1
～約300 μmol m-2
s-1
。例如於微藻類為定鞭藻之情形時，以約100 μmol m-2
s-1
～約150 μmol m-2
s-1
之光能量可較佳地增生。
微藻類之培養時所使用之培養基之組成可根據微藻類之種類設為任意之適宜者。作為培養基中可包含之代表性之成分，可列舉無機鹽(例如鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽、鎂鹽)、糖(例如葡萄糖)、有機鹽、氮源(硝酸鹽、銨鹽等)、磷源(無機磷、磷酸鹽等)等，亦可包含其他成分。氮源或磷源等由於可隨著微藻類之增生而被消耗，故而可適當地添加。又，若添加碳源(例如二氧化碳)，則可利用於微藻類。例如於培養定鞭藻之情形時，由於定鞭藻大多棲息於海水～汽水域，故而可較佳地使用與海水～汽水之組成相近之培養基(例如包含海水之約50～75%之鹽類之培養基)或與海水～汽水之滲透壓相近之培養基。
於本發明之製造方法中之培養之步驟中，為了培養之效率化，較佳為使微藻類密度增大，例如以微藻類之乾燥重量換算計可培養至至少0.01 g/L、至少0.02 g/L、至少0.05 g/L、至少0.07 g/L、至少0.1 g/L、至少0.2 g/L、至少0.5 g/L、至少0.7 g/L、至少1 g/L、至少1.5 g/L、至少2 g/L、至少2.5 g/L、至少3 g/L、至少3.5 g/L、至少4 g/L、至少4.5 g/L、至少5 g/L、至少5.5 g/L、至少6 g/L、至少7 g/L、至少8 g/L、至少9 g/L、至少10 g/L、至少20 g/L、至少50 g/L或至少100 g/L之密度。尤其是若使用下文詳細記載之本發明之裝置，則可能能夠將微藻類(例如定鞭藻)培養至2 g/L以上之高密度。關於培養期間，可持續至達成目的之微藻類密度為止，亦可規定特定之培養期間，亦可維持培養等無期限地持續。
於一實施形態中，本發明之微藻類製品之製造方法包括處理微藻類之步驟。於一實施形態中，該處理係使葉綠素酶失活之處理。藉由使葉綠素酶失活，能夠抑制去鎂葉綠素酸之生成。作為使葉綠素酶失活之處理，例如可列舉加熱處理、任意之公知之蛋白質改性處理(溫度負荷(低溫、高溫)、藥劑處理(醇、強酸、強鹼、其他改性劑)、放射線照射(紫外線、γ線等))等，但並不限定於該等。使葉綠素酶失活之處理(例如加熱處理)可於使葉綠素酶失活之任意適宜之條件(方法、時間等)下實施，可較佳地應用不破壞微藻類、及/或不破壞微藻類之有用成分之條件。例如由於定鞭藻可產生岩藻黃素，故而可能較佳為於岩藻黃素之分解較少、例如於處理前後進行比較之情形時之岩藻黃素之減少未達0.01%、未達0.02%、未達0.05%、未達0.07%、未達0.1%、未達0.2%、未達0.5%、未達0.7%、未達1%、未達2%、未達3%、未達4%、未達5%、未達6%、未達7%、未達8%、未達9%、未達10%、未達15%、未達20%、未達25%、未達30%、未達35%、未達40%、未達45%、未達50%、未達60%、未達70%、或未達80%之條件下進行處理。使葉綠素酶失活之處理較佳為於控制應力量之條件下進行，較佳為對在該處理之前所給予之應力量不大之微藻類實施。於對給予了較大之應力量之微藻類實施使葉綠素酶失活之處理之情形時，存在已經產生了大量之去鎂葉綠素酸之可能性，存在無法充分地獲得藉由葉綠素酶失活而得之去鎂葉綠素酸抑制效果之情況。於一實施形態中，於培養後、使葉綠素酶失活之處理之前給予至微藻類之應力量為1000以下、700以下、500以下、200以下、100以下、90以下、80以下、70以下、60以下、50以下、45以下、40以下、35以下、30以下、25以下、20以下、15以下、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4.5以下、4以下、3.5以下、3以下、2.5以下、2以下、1.5以下、或1.2以下。於一實施形態中，處理微藻類之步驟包含使微藻類及/或其他微生物死滅。於以食品或食品添加物之形式提供微藻類製品之情形時，不存在生存生物可能較容易進行製品之處理。例如作為此種使其死滅之處理，可列舉加熱處理、放射線照射等，但並不限定於該等。
於一實施形態中，使葉綠素酶失活之處理為加熱處理，可為約50℃～200℃、例如約50℃、約60℃、約70℃、約80℃、約85℃、約90℃、約95℃、約97℃、約100℃、約102℃、約105℃、約107℃、約110℃、約120℃、約130℃、約140℃、約150℃、約160℃、約170℃、約180℃、約190℃、約200℃等之加熱處理。加熱處理之時間可為約10秒～20小時，例如約10秒、約30秒、約1分鐘、約2分鐘、約5分鐘、約7分鐘、約10分鐘、約15分鐘、約20分鐘、約25分鐘、約30分鐘、約40分鐘、約50分鐘、約1小時、約1.5小時、約2小時、約2.5小時、約3小時、約4小時、約5小時、約7小時、約10小時、約20小時等。
於一實施形態中，使葉綠素酶失活之處理時之微藻類之密度以乾燥重量計可為約0.01～100 g/L，例如約100 g/L以下、約70 g/L以下、約50 g/L以下、約40 g/L以下、約30 g/L以下、約20 g/L以下、約15 g/L以下、約10 g/L以下、約7 g/L以下、約5 g/L以下、約4 g/L以下、約3 g/L以下、約2 g/L以下、約1 g/L以下、約0.5 g/L以下、或約0.1 g/L以下且約0.01 g/L以上、約0.05 g/L以上、約0.1 g/L以上、約0.2 g/L以上、約0.5 g/L以上、約0.7 g/L以上、約1 g/L以上、約2 g/L以上、約3 g/L以上、約4 g/L以上、約5 g/L以上、約7 g/L以上、或約10 g/L以上。若微藻類之密度例如超過10 g/L，則可能存在整體中之葉綠素酶之失活變得不充分之情況。於一實施形態中，可於培養後至使葉綠素酶失活之處理之間將微藻類供於不使應力量大幅增大之處理，例如作為此種處理，例如可列舉輕度之膜濃縮(1.5倍濃縮、2倍濃縮、3倍濃縮等)等。於一實施形態中，於培養後至使葉綠素酶失活之處理之間，微藻類不濃縮至上述濃度。於一實施形態中，於培養後至使葉綠素酶失活之處理之間，微藻類不進行稀釋。
於一實施形態中，於使葉綠素酶失活之處理之前及/或處理中，微藻類不實施高度之離心分離處理，例如不置於50 G以上、100 G以上、200 G以上、500 G以上、700 G以上、1000 G以上、1500 G以上、2000 G以上、2500 G以上、3000 G以上、3500 G以上、4000 G以上、4500 G以上、5000 G以上、6000 G以上、7000 G以上、8000 G以上、9000 G以上、或10000 G以上之重力加速度中，例如不實施約10秒以上、約30秒以上、約1分鐘以上、約2分鐘以上、約5分鐘以上、約7分鐘以上、約10分鐘以上、約15分鐘以上、約20分鐘以上、約25分鐘以上、約30分鐘以上、約40分鐘以上、約50分鐘以上、約1小時以上、約1.5小時以上、約2小時以上、約2.5小時以上、約3小時以上、約4小時以上、約5小時以上、約7小時以上、約10小時以上、或約20小時以上之時間之離心處理。
於一實施形態中，本發明之微藻類製品之製造方法包括將微藻類進行濃縮之步驟。微藻類之濃縮時可使用該技術領域中公知之任意適宜之方法，例如可列舉離心分離、過濾、介質去除(蒸發等)、凝結劑或沈澱劑之使用等，但並不限定於該等。濃縮操作能夠使微藻類之應力量增大。尤其是不具有細胞壁之裸藻或巴夫藻目等由於較對較軟，故而藉由濃縮操作可使去鎂葉綠素酸產生增多。再者，藉由濃縮操作會使去鎂葉綠素酸產生增多，關於不具有細胞壁之裸藻或巴夫藻目之微藻類等，去鎂葉綠素酸會因細胞之濃縮處理而增多，該等課題係於本發明中最早發現者。例如綠藻、衣藻之葉綠素a＋b量亦取決於培養條件、時間，但每1 g乾燥藻體成為25 mg左右之情況較多，實施例中所利用之巴夫藻每1 g乾燥藻體為35.3 mg，判明預想之外地多。因此，本發明係引入先前之伴隨微藻類之濃縮之方法中未預想之問題者，進而，亦提供其解決方法。
於一實施形態中，於使葉綠素酶失活之處理之前不實施將微藻類進行濃縮之步驟。於將包含未濃縮之微藻類之培養基供於使葉綠素酶失活之處理之情形時，與經濃縮之情形時相比，可能需要更多試劑或能量，可能帶來更高度之環境負荷。然而，由於發明者發現了能夠使微藻類(例如定鞭藻)增生至2 g/L以上之高密度之培養法(例如使用下文詳細記載之本發明之培養裝置之方法)，故而即便於將微藻類於不濃縮之情況下供於使葉綠素酶失活之處理之情形時，亦能夠將環境負荷抑制為最低限度。
於一實施形態中，於培養後至使葉綠素酶失活之處理之前之間，本發明之微藻類不濃縮至1000倍以上、900倍以上、800倍以上、700倍以上、600倍以上、500倍以上、400倍以上、300倍以上、200倍以上、150倍以上、100倍以上、90倍以上、80倍以上、70倍以上、60倍以上、50倍以上、40倍以上、30倍以上、20倍以上、15倍以上、10倍以上、9倍以上、8倍以上、7倍以上、6倍以上、5倍以上、4倍以上、3倍以上、2倍以上或1.5倍以上，或不供於此種濃縮操作。
由於認為於使葉綠素酶失活之處理之後，即便使微藻類負荷應力，去鎂葉綠素酸亦不會增多，故而可不進行濃縮操作。於一實施形態中，於使葉綠素酶失活之處理之後，本發明之微藻類濃縮至1000倍以上、900倍以上、800倍以上、700倍以上、600倍以上、500倍以上、400倍以上、300倍以上、200倍以上、150倍以上、100倍以上、90倍以上、80倍以上、70倍以上、60倍以上、50倍以上、40倍以上、30倍以上、20倍以上、15倍以上、10倍以上、9倍以上、8倍以上、7倍以上、6倍以上、5倍以上、4倍以上、3倍以上、2倍以上或1.5倍以上，或供於此種濃縮操作。於一實施形態中，於使葉綠素酶失活之處理後，微藻類以乾燥重量計濃縮至約10 g/L以上、約20 g/L以上、約50 g/L以上、約70 g/L以上、約100 g/L以上、約150 g/L以上、約200 g/L以上、約300 g/L以上、約400 g/L以上、或約500 g/L以上，或供於此種濃縮操作。
於一實施形態中，本發明之微藻類製品之製造方法包括使微藻類乾燥之步驟。可以成為上述本發明之微藻類製品之水分含量之方式進行乾燥。
於一實施形態中，本發明之微藻類製品之製造方法包括將微藻類之成分分離之步驟。微藻類其藻體本身可能有用，特定之成分亦可能有用。因此，可將微藻類所包含之特定之成分自其他微藻類成分分離，使特定之成分之濃度增大。又，於又一實施形態中，可自微藻類分離並去除特定之成分(有害成分等)。例如，本發明者發現作為定鞭藻之巴夫藻中大量包含岩藻黃素，因而可將岩藻黃素分離、並進行精製，製成本發明之微藻類製品。
於一實施形態中，於本發明之製造方法中所使用之微藻類可為高產量生產葉綠素之微藻類，例如可為於培養步驟結束時以藻體乾燥重量基準計生產葉綠素0.1 mg/g以上、0.2 mg/g以上、0.5 mg/g以上、0.7 mg/g以上、1 mg/g以上、2 mg/g以上、5 mg/g以上、7 mg/g以上、10 mg/g以上、15 mg/g以上、20 mg/g以上、25 mg/g以上、30 mg/g以上、40 mg/g以上、50 mg/g以上、70 mg/g以上、或100 mg/g以上之微藻類。尤其是於培養步驟之結束時以藻體乾燥重量基準計生產葉綠素30 mg/g以上之微藻類可高產量生產葉綠素。由於葉綠素可產生去鎂葉綠素酸，故而高產量生產葉綠素之微藻類可藉由本發明之製造方法更顯著地減少去鎂葉綠素酸量，因此於本發明之對象之微藻類中可包含該高產量生產葉綠素之微藻類。
於一實施形態中，本發明之製造方法(例如油浸漬品之製造方法)可包括將微藻類濃縮液進行除鹽之步驟。於一實施形態中，除鹽之步驟可藉由如下方式而實施：於藉由本發明之方法所製備之微藻類濃縮液中例如添加約1～100倍、約2～50倍、約5～20倍或約10倍量之水，例如攪拌約10分鐘～5小時，其後進行離心濃縮處理。
於一實施形態中，本發明之製造方法可包括使微藻類濃縮液乾燥之步驟，亦可不包括該步驟。尤其是於製備調味醬或蔬菜汁等含有大量水分之製品之情形時，可不包括乾燥之步驟。於一實施形態中，乾燥之步驟可包括將藉由本發明之方法所製備之微藻類濃縮液進行噴霧乾燥。於一實施形態中，乾燥之步驟可於賦形劑、乳化劑及抗氧化劑中之1種或複數種之存在下實施。賦形劑可防止微藻類之成分(例如岩藻黃素)與空氣接觸以減少該成分之分解。抗氧化劑能夠減少微藻類之成分(例如岩藻黃素)之分解，且藉由與乳化劑組合，可進一步促進微藻類細胞內之成分之分解減少。
於一實施形態中，本發明之製造方法可包括使微藻類濃縮液凍結之步驟。於一實施形態中，凍結之步驟可包括：將藉由本發明之方法所製備之微藻類濃縮液進行冷凍(例如-40℃以下)；或封入(較佳為密封、真空包裝)至耐煮沸殺菌(80～100℃)或者蒸煮殺菌之袋(例如尼龍袋、鋁袋)中於低溫(例如-40℃以下)下進行冷凍。於一實施形態中，亦可將微藻類濃縮液進行成形冷凍之後封入至袋中。於一實施形態中，凍結之步驟可包括快速冷凍(例如將微藻類濃縮液直接暴露於低溫環境下)。封入至1個袋中之微藻類濃縮液之量可列舉1 ml、3 mL、5 mL、10 mL、50 mL、100 mL、200 mL、1 L、2 L、3 L、5 L、8 L、10 L、15 L、20 L等，但並不限定於該等。於一實施形態中，於封入時可脫氣注入，亦可真空包裝凍結物。
(用以培養微藻類之裝置)
於一態樣中，本發明提供一種用以培養微藻類之裝置。於一實施形態中，該裝置之特徵在於：包含具有透明材料之壁之至少2個培養部、連接上述至少2個培養部之上部彼此之上部連接部、連接上述至少2個培養部之下部彼此之下部連接部、及設置於上述至少2個培養部中之至少1者而非所有培養部之至少1個氣泡產生器件，且上述至少2個培養部、上部連接部及下部連接部以流體連通且封入有培養基之方式構成，上述裝置係以上部連接部較下部連接部更遠離安裝地板之方式設置。由於至少2個培養部、上部連接部及下部連接部藉由培養基而流體連通，故而藉由氣泡之產生可產生如培養基於整個裝置內循環之流動，可有效率地達成溫和之攪拌狀態。於較佳之實施形態中，本發明之裝置除氣泡產生器件以外不具有用於攪拌之動力源。例如定鞭藻由於在流水條件下可適宜地增生，故而此種裝置之利用可能適宜。又，可利用一個控制系統來抑制水量而進行活用。於一實施形態中，本發明之裝置可包含相互連接之複數個重複單元(例如1個培養部＋1個上部連接部＋1個下部連接部、2個培養部＋1個上部連接部＋1個下部連接部等)，於此種實施形態中，藉由調整重複單元之數量可容易地改變形成連續之一個系統之培養基之體積。培養基體積越大，培養基環境之變動可越小。本發明之裝置係水流主要於上下方向產生之縱置式裝置，就有效率之光利用、適宜之攪拌條件等因素而言，相較於橫置式裝置，縱置式裝置更能使微藻類增生至高密度。
於一實施形態中，培養部可具有細長之管狀之形狀。於一實施形態中，培養部之外徑可為約10 mm～約1000 mm，例如可為約10 mm、約30 mm、約50 mm、約70 mm、約100 mm、約150 mm、約200 mm、約250 mm、約300 mm、約400 mm、約500 mm、約700 mm或約1000 mm、或該等值之間之任意值。由於培養部之直徑越細，則培養部之每單位體積之受光量越會增大，故而可更適合於微藻類之增生。於一實施形態中，培養部之內徑可為約5 mm～約1000 mm，例如可為約5 mm、約7 mm、約10 mm、約30 mm、約50 mm、約70 mm、約100 mm、約150 mm、約200 mm、約250 mm、約300 mm、約400 mm、約500 mm、約700 mm或約1000 mm。於一實施形態中，培養部之長度可為10 cm～1000 cm，例如可為約10 cm、約20 cm、約50 cm、約70 cm、約100 cm、約150 cm、約200 cm、約250 cm、約300 cm、約400 cm、約500 cm或約1000 cm、或該等值之間之任意值。作為培養部之壁之透明材料，例如可列舉丙烯酸樹脂材料、玻璃材料、聚乙烯材料，但並不限定於該等。只要為透過特定之波長之材料，則可任意地使用。例如就OPMS30543株而言，由於430 nm及680 nm附近之波長可對光合成有用，故而較佳為此種波長之光之透過率較高之素材。
於一實施形態中，裝置為如每1 L之受光面積成為至少10 cm2
/L、至少20 cm2
/L、至少50 cm2
/L、至少70 cm2
/L、至少100 cm2
/L、至少150 cm2
/L、至少200 cm2
/L、至少250 cm2
/L、至少300 cm2
/L、至少350 cm2
/L、至少400 cm2
/L、至少450 cm2
/L、至少500 cm2
/L、至少550 cm2
/L、至少600 cm2
/L、至少650 cm2
/L、至少700 cm2
/L、至少750 cm2
/L、至少800 cm2
/L、至少900 cm2
/L、或至少1000 cm2
/L之構成。於一實施形態中，裝置可具有如所有培養部接受大致均等之光量之構成。例如於一實施形態中，培養部為任一培養部彼此均不處於包含關係之分離之部分。又，本發明之裝置若以分離之培養部不相互遮光(例如不接觸)之方式而構成，則受光量增大，故而可有利。
於一實施形態中，連接部可為透明材料，亦可不為透明材料。於連接部不為透明材料之情形時，可藉由減小連接部內之體積而提昇整個裝置之受光效率。於一實施形態中，連接部可具有不抑制培養基之流動之形狀(例如與培養部相比不過細之形狀)，但可具備如適當抑制培養基之流動之結構(閥等)。
於一實施形態中，於上部連接部可設置孔，例如通過該孔插入空氣導入用管、CO2
導入用管、pH值計及排空氣用管等管體(tube)、計器(meter)、繩索(cord)等。
於一實施形態中，氣泡產生器件可為氣泡石或設置於培養部之下部之氣體導入用之孔。於一實施形態中，氣泡產生器件設置於較上部連接部靠下部連接部更近之位置。藉由於培養基之深部產生氣泡，產生伴隨氣泡之上升之培養基之流動，攪拌能夠更有效率。例只要為限於2 m之水深，則水壓較低，藉由氣泡石能夠容易地導入氣體。於一實施形態中，氣泡產生器件亦可為用以將複數種氣體(例如空氣及二氧化碳)各者分別導入之複數個氣泡產生器件。氣泡產生器件較佳為如不阻礙裝置中之水流之大小，例如可具有培養部之內徑之80%以下、70%以下、60%以下、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下或10%以下之直徑。圖4所示之培養器中，作為氣泡產生器件之氣泡石具有培養部之內徑之約28%之直徑。由於可能較佳為產生固定之方向之流動，故而例如於本發明之裝置具備4個培養部之情形時，可於僅兩端之2個培養部、或僅中央之2個培養部等規律性之位置設置氣泡產生器件。
於一實施形態中，用以培養微藻類之裝置係以培養基僅通過過濾器及氣泡產生器件與外部氣體接觸之方式而構成。於一實施形態中，藉由以裝置內部與裝置外部之環境獨立之方式構成裝置，能夠穩定地培養經不住污染(例如細菌污染)之微藻類(例如定鞭藻)，又，可能能夠污染較少地培養。於一實施形態中，裝置中亦可安裝採水用之旋塞。
於一實施形態中，裝置亦可包含感測器，例如pH值測定器、溫度測定器、壓力測定器、氧量測定器、水之硬度測定器及氨測定器等，亦可以基於來自感測器之輸入信號控制該培養裝置或用以製造微藻類製品之其他裝置之方式而構成。
於一實施形態中，為了簡單及成本之減少，可參考本說明書之記載，主要利用自來水管道材料之標準品進行製作，或於pH值計之插入、或氣泡石之選定、排氣位置及其形狀等方面下工夫。
上述所說明之用以培養微藻類之裝置由於可能能夠污染較少地培養微藻類，故而該裝置可尤佳地用於正式培養之前之種子培養。
再者，關於本發明中所使用之管體之粗細度，只要自來水管道材料之規格及丙烯酸樹脂管或者玻璃管之外徑適合，便可進行調整，例如可利用以50A及100A之規格所製作而成者。
(用於微藻類製品之製造之系統)
於一態樣中，本發明提供一種用於微藻類製品(例如，食品)之製造之系統。系統可具備用以實施上述微藻類製品之製造方法之任意合適之方法。於一實施形態中，本發明提供一種系統，其係包含培養槽、及進行使葉綠素酶失活之處理之處理部者，且係以自上述培養部至上述處理部之間可對微藻類控制應力量之方式而構成。
於本發明之系統中可於任意之部位安裝泵(流速可變部)。泵例如可為注射泵、柱塞泵、活塞泵、或滾子泵。藉由泵能夠調整流速及壓力等。
本發明之微藻類製品製造系統可具有如圖15所示之控制單元30。控制單元30具有控制部31、及檢測部32。控制部31與檢測部32係可相互通信地連接。可僅藉由硬體(例如專用電路)執行上述控制，亦可藉由使CPU(Central Processing Unit，中央處理單元)執行程序而執行上述控制。
由感測器(例如培養槽中之pH值測定器、溫度測定器、壓力測定器、氧量測定器、硬度測定器及氨測定器等)所取得之資料被發送至檢測部32，向控制部31發送信號。
控制部31係由CPU(Central Processing Unit，中央處理單元)、ROM(Read Only Memory，唯讀記憶體)、RAM(Random Access Memory，隨機存取記憶體)、及微藻類製品製造系統所包含之各種致動器之驅動電路所構成。ROM52中儲存有BIOS(Basic Input/Output System，基本輸入/輸出系統)、OS(Operating System，操作系統)、各種驅動器、及各種應用軟體等各種程序。檢測部32由微藻類製品製造系統所包含之各種感測器(例如pH值測定器、溫度測定器)之檢測電路所構成。
控制單元30與輸入部41、顯示部42、記憶部43、及介面44分別可通信地連接。介面44使控制單元30與外部之裝置之間能夠收發資料。控制單元30經由介面44例如與通用電腦(所謂之個人電腦)連接。
輸入部41接收來自使用者之輸入。輸入部41例如由鍵盤、滑鼠、或觸控面板所構成。顯示部42例如由LCD(Liquid Crystal Display，液晶顯示裝置)或ELD(Electro Luminescence Display，電場發光顯示器)之類之顯示器所構成。再者，於輸入部41及顯示部42由觸控面板構成之情形時，輸入部41與顯示部42一體化。
記憶部43例如由硬碟之類之非揮發性記憶體所構成。記憶部43中供各種控制之程序及資料(例如自輸入部41輸入至控制單元30之資料)等儲存。
控制部31基於自輸入部41輸入至控制單元30之資料、及輸入至檢測部32之感測器之各輸出信號之至少1者而控制培養槽、溫度調節器、攪拌器件、添加成分(例如氮源、磷源、培養基等)罐、加熱器、濃縮器等微藻類製品製造系統所包含之構成要素中之至少1者。送液管例如可切換流路等控制其長度。
(普通技術)
於本說明書所使用之分子生物學手法、生化學手法、微生物學手法為該領域中周知且慣用者。
(註記)
於本說明書中，「或」係於可採用文章中所列舉之事項之「至少1個以上」時所使用。「或者」亦相同。於在本說明書中寫明「2個值」之「範圍內」之情形時，該範圍亦包含2個值本身。
關於本說明書中所引用之科學文獻、專利、專利申請等參考文獻，其整體與各具體地記載者相同之程度地於本說明書中作為參考被援用。
以上，為了容易理解，列示了較佳之實施形態對本發明進行了說明。以下，基於實施例對本發明進行說明，但上述說明及以下實施例係僅為了例示而提供，並非為了限定本發明而提供。因此，本發明之範圍不受本說明書中具體所記載之實施形態所限定，亦不受實施例所限定，僅受申請專利範圍所限定。
[實施例]
以下記載實施例。關於試劑類，具體而言，使用實施例中所記載之製品，利用其他製造商(Sigma-Aldrich、和光純藥、Nacalai、R&D Systems、USCN Life Science INC等)之同等品亦能夠代用。
(實施例1：微藻類之培養)
將開放培養及光生物反應器培養中之定鞭藻之培養進行比較。
本實施例之實驗中使用市售之巴夫藻屬之NBRC 102809株(Pavlova gyrans)、或於沖繩之海中所採取之巴夫藻屬之OPMS30543株(Pavlova granifera)(寄存編號NBRC114066)。關於OPMS30543株與NBRC 102809株，針對培養、去鎂葉綠素酸生成及岩藻黃素生產，可表現出相同之性質。於將人工海水之素MARINE ART SF-1(富田製藥，德島)以成為50%海水濃度之方式溶解於水而成之水溶液中，以成為使用用法規定之2倍濃度之方式添加Daigo IMK培養基(日本製藥，大阪)成分，製備培養液(pH值＝約7.5)。隨著藻細胞之增生，pH值會上升，調整pH值，以使其維持於8±0.5。培養開始時之微藻類密度為約0.1 g/L。培養槽全部設置於室外，僅照射自然光。
培養槽係使用以下者。
・光生物反應器(丙烯酸樹脂製，直徑100 mm)(圖1)
・光生物反應器(丙烯酸樹脂製，直徑200 mm)(圖1)
・光生物反應器(丙烯酸樹脂製，直徑250 mm)(圖1)
・光生物反應器(聚乙烯袋，直徑450 mm)(圖1)
・500 L罐×2(圖2)
・750 L輸水道(圖2)
僅輸水道培養槽利用漿葉進行攪拌，其他培養槽進行曝氣攪拌。
500 L罐分別利用200 L之培養基進行培養。試驗期間之間之氣溫為約21℃～約28℃。
其結果獲得如圖3所示之結果。可知：定鞭藻難以進行開放培養，雖會某種程度地增生，但由於細菌污染，難以維持穩定之增生。另一方面，於使用光生物反應器之情形時，以2週達成約12倍之增生，細胞密度達到約1.2 g/L。
又，以與上述相同之條件使用1.5 t之座式水槽(曝氣攪拌)嘗試培養，以約0.04 g/L之微藻類密度開始培養之後，以2週達到約0.14 g/L之微藻類密度，但由於其後產生了細菌污染，故而增生失敗。另一方面，發明者所製作之光生物反應器中，即便幾次嘗試培養，亦幾乎無此種失敗。
(實施例2：光生物反應器之設計)
由於知曉定鞭藻之培養中，光生物反應器較適宜，故而將光生物反應器之設計進行了最佳化(圖4、圖5)。圖4之光生物反應器由於較細之透明管成為培養槽，故而受光面積較大。又，若進行曝氣攪拌，則水流於2根管體之間循環，較1根管體之光生物反應器能夠更有效率地攪拌。此種類型之光生物反應器可如圖6般設為進一步連接之構成。該光生物反應器(PBR)具有較大之受光面積。
將各培養槽之受光面積進行比較。
[表1]
| 每1 L之受光面積(cm2/L) | |
| 30 L Panlite(15 L水量) | 125.6 cm2 /L |
| 200 L Panlite(150 L水量) | 63.64 cm2 /L |
| 500 L Panlite(200 L水量) | 44.7 cm2 /L |
| 輸水道管路(Raceway tank)(750 L水) | 32.4 cm2 /L |
| 乙烯基池(65 L，水深10 cm) | 152 cm2 /L |
| 乙烯基池(130 L，水深20 cm) | 102 cm2 /L |
| 座式水槽1.5 ton(3.6 m×l.8 m×0.25 m) | 43.2 cm2 /L |
| PBR 50A(2根型) | 738.5 cm2 /L |
| PBR 100A(2根型) | 233.9 cm2 /L |
| PBR 100A(1根型) | 380.4 cm2 /L |
| PBR 200A(1根型) | 194.05 cm2 /L |
| PBR 250A(1根型) | 155.5 cm2 /L |
| 開放池(ϕ3 m*15 cm深度) | 70.65 cm2 /L |
與實施例1相同地以成為50%之方式添加人工海水，於所得之IMK×2培養基中添加CO2
，藉此調整至pH值＝8，於該培養基中添加約0.1 g/L之上述巴夫藻株，於室外自然光下，於圖4之光生物反應器中一面曝氣攪拌一面進行培養。試驗期間之間之氣溫為約21℃～約28℃。
將結果示於圖5。以約1週達成約10倍之增生，細胞密度達到約1.1 g/L。
進而，使用相同之培養槽實施長期培養(圖6)。其結果為，於約40天內達成了穩定之連續培養，儘管回收了數次藻體，但仍能夠維持約3.5 g/L之較高之細胞密度。
於如上述之光生物反應器中所培養之微藻類由於細菌污染得以減少，故而可期待：於此種光生物反應器中進行種子培養，其後進行開放培養，藉此於開放培養中亦可於產生細菌污染之前且充分之增生之後達成微藻類之回收。
(實施例3：微藻類之回收)
定鞭藻由於不具有細胞壁，故而具有相對較軟之特徵。又，定鞭藻為約1～10 μm之相對較小之微藻類。因此，研究了能夠高效率地回收軟而小之定鞭藻之方法。
對上述巴夫藻株(0.516 g/L)進行離心分離或過濾(MF膜)，將藻體進行100倍濃縮。濃縮後，用顯微鏡觀察細胞之狀態。
於離心分離時，使用HITACHI himac CR22GII(日立製作所，東京)以5,000 rpm進行約10分鐘離心操作。由於藉由一次離心操作能夠濃縮大約3 L分，故而於10 L之離心操作中將其重複了約3次。將該濃縮物進一步進行約1～2次離心濃縮(約30～60分鐘)，歸攏在一起。
過濾時，使用Microza AHP1010D(旭化成製造，東京)(超濾器，作為區分分子量50 KDa，掃流方式)之膜及磁體泵MD-15RV-N(IWAKI，東京)(流出量；16/19 L/min)，以50～100 mL/min之速度進行操作以使濾液流出，濃縮時間為約6 L/hr。
確認：利用離心分離及過濾兩個方法，能夠於不破壞細胞之情況下回收定鞭藻。
(實施例4：微藻類中之去鎂葉綠素酸之生成)
發明者針對上述巴夫藻株進行了成分分析。可知：於藉由吸光光度法(可見)進行測定之情形時，包含約2250 mg/100 g(乾燥重量)之葉綠素。
其結果為發現：作為定鞭藻之巴夫藻中，與通常之綠藻等微藻類相比較，包含更多之葉綠素。
眾所周知，葉綠素於微藻類中會被代謝，藉此被轉換為去鎂葉綠素酸，已知去鎂葉綠素酸會引起光過敏症等，較理想為限制動物之攝取。研究了於巴夫藻之培養及回收之間是否會生成去鎂葉綠素酸。
將上述巴夫藻株之培養物10 L(0.516 g/L)進行離心分離，濃縮至100倍。其後，藉由高壓釜將濃縮物進一步進行加熱(100℃，1分鐘)。既有去鎂葉綠素酸及葉綠素酶活性度分別以如下方式進行測定。總去鎂葉綠素酸量＝既有去鎂葉綠素酸量＋葉綠素酶活性度。
・既有去鎂葉綠素酸之定量法
將自色素之醚萃取溶液轉移至17%鹽酸之葉綠素分解物量換算為去鎂葉綠素酸a(mg%)。
稱取乾燥之微藻類100 mg至乳缽中，加入約0.5 g之海砂及85%(V/V)丙酮20 ml，迅速地磨碎之後將上清液轉移至離心管中。進而向殘査中添加丙酮10 ml並同樣地進行操作，將上清液轉移至離心管，再一次重複該操作。繼而，進行離心分離(3000 rpm，5分鐘)，並將該上清液轉移至加入有乙醚30 ml之分液漏斗中。繼而，於該醚-丙酮混合物中加入5%硫酸鈉溶液50 ml，並緩慢地振動，拋棄硫酸鈉層。進而，重複3次該洗淨操作之後，加入無水硫酸鈉進行脫水，取出醚層，用乙醚將總量設為50 ml製作色素原液。將該色素原液20 ml用17%鹽酸20 ml、繼而用17%鹽酸10 ml依序進行振動萃取，其後，將鹽酸層轉移至加入有飽和硫酸鈉溶液150 ml及乙醚20 ml之分液漏斗中。將其進行振動萃取，分取醚層，並向其中加入乙醚，將總量設為20 ml，將所得者作為分解物萃取液。將該分解物萃取液用乙醚準確地稀釋至成為需要之濃度，並測定667 nm之吸光度。根據標準品之去鎂葉綠素酸a之吸光度算出葉綠素分解物量，作為既有去鎂葉綠素酸量(mg%)。標準品之去鎂葉綠素酸a之吸光度係使用S.R. Brown(J. Fish Res. Bd. Canada 25，523-540. 1968)之去鎂葉綠素酸a於667 nm之比吸光係數70.2(0.1%溶液、1 cm所示之吸光度)。
・葉綠素酶活性度之定量法
於含水丙酮中進行保溫，將葉綠素分解物之生成增加量換算成去鎂葉綠素酸a量(mg%)。
準確稱量乾燥之微藻類100 mg，向其中加入冷M/15磷酸緩衝液(pH8.0)及丙酮之混合液(7：3)10 ml，於37℃下保溫3小時。其後用10%鹽酸設為弱酸性，藉由與既有去鎂葉綠素酸之定量法相同之方法測定去鎂葉綠素酸量，自該測定值減去既有去鎂葉綠素酸量，求出增加量，將該增加量作為葉綠素酶活性度。
[表2]
未濃縮之培養液中，既有去鎂葉綠素酸及總去鎂葉綠素酸兩者均為低度，便於進行過離心分離處理之情形時，既有去鎂葉綠素酸量有所上升。由於藉由加熱會使葉綠素酶活性受到抑制，故而總去鎂葉綠素酸量與既有去鎂葉綠素酸量相同。
| 原液 | 100倍濃縮液 | |
| 既有去鎂葉綠素酸量(mg%) | 17.91 | 150.72 |
| 總去鎂葉綠素酸量(mg%) | 20.39 | 135.51 |
| 葉綠素酶活性度(mg%) | 2.48 | -15.21 |
由於與原液相比，100倍濃縮液中既有去鎂葉綠素酸量為約9倍，故而可預測上述濃縮操作之應力量為約9。
將上述巴夫藻株之培養物10 L(0.516 g/L)與實施例3之過濾濃縮同樣地藉由MF膜濃縮至100倍(約12小時以上)。其後，將濃縮物藉由盤管式加熱(圖12)進行加熱(於110℃下2分鐘或4分鐘)。針對各試樣與上述同樣地測定既有去鎂葉綠素酸量，結果觀察到上升。藉由MF膜之濃縮處理中，用顯微鏡觀察到與離心分離處理相比，細胞之損傷為輕度，但由於既有去鎂葉綠素酸量有所上升，故而可知實際上應力量較大。又，於實施過上述加熱處理之樣品中，既有去鎂葉綠素酸量亦為較高之值，因而若以細胞密度較高之狀態進行加熱處理，則存在無法充分地抑制既有去鎂葉綠素酸量之可能性。
進而，對由模型刺激而引起之去鎂葉綠素酸生產之上升進行試驗。使上述巴夫藻株之培養物L(1.482 g/L)通過級聯泵(圖10)，回收一部分此時之培養物作為試樣進行評價。對未通過泵、通過泵1次、通過泵2次(90秒)、通過泵3次(135秒)、通過泵5次(225秒)、泵10分鐘循環或泵20分鐘循環之試樣進行評價。用顯微鏡觀察各試樣之後，將試樣供於盤管式加熱處理(110℃，4分鐘)、離心分離濃縮處理及凍結乾燥，針對該乾燥物(10 mg)，與上述同樣地對既有去鎂葉綠素酸、總去鎂葉綠素酸及葉綠素酶活性度進行測定。
[表3]
物理衝擊越增大，既有去鎂葉綠素酸量越增大。又，除物理衝擊以外，通過後之培養液之溫度亦上升，可推測其亦有助於既有去鎂葉綠素酸量之增大。
| 通過0次 | 通過1次 | 通過2次 | 通過3次 | 超過2次 | |
| 0 sec | 45 sec | 90 sec | 135 sec | 20 min | |
| 既有去鎂葉綠素酸量(mg%) | 36.91 | 53.59 | 47.48 | 70.54 | 83.67 |
| 總去鎂葉綠素酸量(mg%) | 64.31 | 55.16 | 64.69 | 69.38 | 58.09 |
| 葉綠素酶活性度(mg%) | 27.40 | 1.58 | 17.21 | -1.16 | -25.59 |
由於與未通過泵相比，通過1次泵、通過2次泵、通過3次泵及泵20分鐘循環中，各自之既有去鎂葉綠素酸量為約1.4倍、約1.3倍、約1.9倍及約2.3倍，故而可預測上述各剪斷力負荷下之應力量為約1.3～2.3。
根據該等結果，發現藉由對微藻類之操作可增大去鎂葉綠素酸量。因此，研究了用以減少去鎂葉綠素酸之方法。
(實施例5：藉由加熱處理之去鎂葉綠素酸之抑制)
對上述巴夫藻株進行加熱處理，結果接近於褐色之藻體之顏色變化成鮮豔之綠色，未觀察到藻體之破裂(圖11)。由於認為催化去鎂葉綠素酸之產生之葉綠素酶會因加熱而失活，故而對藉由加熱是否會抑制去鎂葉綠素酸產生進行了試驗。
藉由與實施例4同樣之過濾操作，將60 L培養物(0.145 g/L)於28℃下歷時約10小時濃縮至0.6 L(100倍濃縮：13.440 g/L)。用顯微鏡觀察濃縮後之細胞，未看到異常。將濃縮物之一部分利用圖12所示之裝置以95℃以上加熱4分鐘。
對去鎂葉綠素酸進行試驗，結果與非加熱濃縮物相比，加熱濃縮物之既有去鎂葉綠素酸量增大。認為其原因在於葉綠素酶之失活不充分。作為葉綠素酶之失活不充分之原因，認為有如下情況：由於溶液中之固體密度較高(1%～1.5%)，故而溶液之導熱率下降而於規定之溫度下未能充分地加熱到內部之細胞；以及由細胞外物質(蛋白質、多糖等)之密度上升引起之隔熱性之增大等。
如圖12所示構成加熱裝置。使上述巴夫藻株之培養物(0.592 g/L)通過管體，以固定之速度(10、20、40或80 mL/分)輸送至油加熱器(105℃)並調整加熱時間。將自油加熱器送出之加熱液回收至冰上之瓶中。各條件下之熱處理時間為約8分鐘、約4分鐘、約2分鐘及約1分鐘。將所回收之各試樣進行離心分離處理(圖13)，與上述同樣地對既有去鎂葉綠素酸、總去鎂葉綠素酸及葉綠素酶活性度進行測定。
[表4]
| ①盤管式 (加熱，8分鐘) | ②盤管式 (加熱，4分鐘) | ③盤管式 (加熱，2分鐘) | ④盤管式 (加熱，1分鐘) | ⑤不加熱 | |
| 既有去鎂葉綠素酸量(mg%) | 37.18 | 35.89 | 70.10 | 155.36 | 41.40 |
| 總去鎂葉綠素酸量(mg%) | 38.30 | 39.00 | 40.60 | 1135.13 | 801.53 |
| 葉綠素酶活性度(mg%) | 1.12 | 3.11 | -29.49 | 979.77 | 760.14 |
可知藉由充分地加熱，即便其後進行離心分離處理，總去鎂葉綠素酸量亦不會上升。再者，1分鐘之加熱試樣較未加熱之試樣，既有去鎂葉綠素酸量有所上升，認為其原因在於：葉綠素酶之失活不充分，且因加熱所導致之細胞破壞而釋出之葉綠素酶作用於大範圍之葉綠素。
進而，亦對利用如圖14所示之板式加熱所得之去鎂葉綠素酸抑制效果進行了試驗。
[表5]
可知藉由板式之加熱亦可抑制去鎂葉綠素酸之產生。
| 110℃，4分鐘 (盤管式) | 不加熱 (基準) | 110℃，4分鐘 (板式) | 100℃，4分鐘 (板式) | |
| 既有去鎂葉綠素酸量(mg%) | 63.97 | 35.93 | 57.10 | 61.15 |
| 總去鎂葉綠素酸量(mg%) | 84.35 | 1079.13 | 76.21 | 86.29 |
| 葉綠素酶活性度(mg%) | 20.37 | 1043.19 | 19.11 | 25.15 |
根據以上結果，藉由於控制應力量之同時抑制葉綠素酶活性，成功抑制了去鎂葉綠素酸之量。
(實施例6：微藻類之處理期間之岩藻黃素之穩定性)
發明者發現於上述巴夫藻株等定鞭藻中岩藻黃素較豐富。已知岩藻黃素為有用之成分，但為化學不穩定之物質，會因熱等容易地分解。對於加熱處理期間定鞭藻中之岩藻黃素是否分解進行了研究。
岩藻黃素之定量可藉由於HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相層析法)分析中與自和光純藥(東京)所購入之標準品之岩藻黃素(99%)進行比較而進行。
HPLC分析之條件如下。
管柱：COSMOSIL 5C18AR-II，內徑4.6×100 mm
管柱溫度：40℃
溶劑：72.5%乙腈水溶液(0.1%甲酸)、20分鐘溶出
流量：1 mL/min
檢測：450 nm波長
導入量：20 μL
對剛培養後之濕樣品之由加熱引起之岩藻黃素分解進行了研究。
將上述巴夫藻株之培養物藉由過濾器進行過濾，取得過濾藻體。使該過濾藻體於凍結乾燥、60℃1小時或75℃30分鐘之條件下進行乾燥。於該乾燥樣品中添加水及乙腈，對岩藻黃素進行萃取，將萃取液轉移至管體中進行離心分離(12000 rpm，3 min)，藉由HPLC對上清液進行分析。其結果為，測定出以下表中所示之岩藻黃素量。
[表6]
於60℃1小時及75℃30分鐘之加熱條件下，觀察到岩藻黃素之分解。
| 條件 | n＝3之平均岩藻黃素量(mg/g) |
| 凍結乾燥(不加熱) | 6.13 |
| 60℃，1小時 | 4.87 |
| 75℃，30分鐘 | 4.82 |
對由凍結乾燥樣品之加熱而引起之岩藻黃素分解進行研究。
準備凍結乾燥樣品。對該凍結乾燥樣品於不加熱之情況下以120℃1小時或170℃30分鐘之條件進行處理。
於加熱處理後之樣品中添加水及乙腈，對岩藻黃素進行萃取，將萃取液轉移至管體中進行離心分離(12000 rpm，3 min)，將上清液利用HPLC進行分析。其結果為，測定出以下表中所示之岩藻黃素量。
[表7]
於60℃1小時及75℃30分鐘之加熱條件下，可觀察到岩藻黃素之分解。
| 條件 | n=3之平均岩藻黃素量 (mg/g) |
| 凍結乾燥(不加熱) | 9.67 |
| 120℃，1小時 | 6.5 |
| 170oC，30分鐘 | 0.09 |
對實施例5之盤管式加熱(圖12)中之岩藻黃素之分解進行研究，結果如以下表所示。
[表8]
*於加熱試樣中岩藻黃素量增大，預測原因在於：由於加熱，細胞收縮，藻體單位重量減少。
即便供於實施例5中所研究之用以抑制去鎂葉綠素酸產生之盤管式之加熱條件，亦未觀察到岩藻黃素量之降低。
| 岩藻黃素量(mg/g) | |
| ①加熱，8分鐘 | 11.00 |
| ②加熱，4分鐘 | 11.91 |
| ③加熱，2分鐘 | 12.46 |
| ④加熱，1分鐘 | 11.71 |
| ⑤不加熱 | 10.19 |
又，對實施例5之板式加熱中之岩藻黃素之分解進行研究，結果如以下表所示。
[表9]
即便供於實施例5中所研究之用以抑制去鎂葉綠素酸產生之板式之加熱條件，亦未觀察到岩藻黃素量之降低。
| 110℃，4分鐘 (盤管式) | 不加熱 (基準) | 110℃，4分鐘 (板式) | 100℃，4分鐘 (板式) | |
| 既有去鎂葉綠素酸量(mg%) | 63.97 | 35.93 | 57.10 | 61.15 |
| 總去鎂葉綠素酸量(mg%) | 84.35 | 1079.13 | 76.21 | 86.29 |
| 葉綠素酶活性度(mg%) | 20.37 | 1043.19 | 19.11 | 25.15 |
| Fx量(mg/g) | 15.93 | 14.31 | 12.33 | 13.84 |
| Fx比率(%) | 111.3 | 100 | 86.2 | 96.7 |
(實施例6X：其他微藻類種類之處理)
於金藻屬之微藻類(I. galbana、I. litoralis、I. maritima、Tisochrysis lutea等)中，亦與上述同樣地對去鎂葉綠素酸生成抑制條件、及岩藻黃素分解減少條件進行研究。對使金藻屬微藻類負荷應力(濃縮處理及剪斷處理等)時之去鎂葉綠素酸生成量進行確認。於使金藻屬微藻類不負荷應力或輕度地負荷(1.5倍、2倍之濃縮等)之條件下，進行葉綠素酶失活處理(例如加熱)，確認去鎂葉綠素酸生成量之抑制。又，對上述條件中之岩藻黃素分解之水準進行確認。根據該等結果而決定不過度地生成去鎂葉綠素酸、岩藻黃素分解較少之處理條件之範圍。
(實施例7：微藻類製品)
使上述株乾燥並進行粉末化而製作食品(圖16)。外觀呈現出自然之綠色，為如岩生紫菜之風味。關於巴夫藻，確認可適宜地用作食品。
(實施例8：油浸漬品)
對上述所製造之藻體之保存性進行試驗。將上述株之培養物與上述實施例同樣地以100℃以上加熱處理4分鐘，其後進行離心濃縮處理，而製備巴夫藻濃縮液。對該濃縮液添加約10倍量之自來水，並攪拌約3小時～4小時，其後再次進行離心濃縮處理，藉此進行除鹽。將除鹽藻體凍結。其後，按照以下順序製備乾燥藻體。
・將凍結藻體於室溫、流水、溫浴條件下進行解凍。主要為最大約60℃之加溫條件。
・以約80～85℃殺菌約1分鐘～1小時。
・藉由濾器(strainer)及10000 G之磁通密度之磁體去除異物。
・以-18℃～-60℃進行預凍結。
・凍結乾燥48小時以上。於市售之凍結乾燥機內以成為-20℃～-80℃之方式進行預冷卻，將經預凍結之凍結藻體視用量、用途設置於分支管或者腔室。藉由真空泵將凍結乾燥機內之壓力減壓至20 Pa以下，視用量凍結乾燥24小時～48小時以上。根據情況使腔室內之溫度加溫至10℃～20℃。
・使用藥匙或乳缽將凍結乾燥物粉碎至細胞不垮塌之程度。尤其是於量較多之情形時，使用粉碎設備。
・藉由80 mesh之篩網及12000 G之磁通密度之磁體去除異物。
◎試驗條件
(乾燥品)
・於每個各測定時點之塑膠袋中放入250 mg以上之乾燥藻體。(試驗試樣為n＝3)
・於塑膠袋中視需要放入乾燥劑及除氧劑，並將塑膠袋放入鋁袋中。乾燥劑，二氧化矽凝膠(FUJIGEL SANGYO，大阪)；除氧劑，VITALON(常盤產業，神奈川)。
・於各設定溫度條件下(冷藏；5℃，常溫；20℃～28℃，高溫；40℃)遮光放置。
・開始時之測定中，對試樣製備時之殘留物進行分析。
・於其後之各時點(2週後、1月後、2～12月後之各月、15月後、18月後、21月後、24月後)中，自各試樣回收少量進行分析。
・分析中，對岩藻黃素之量及去鎂葉綠素酸(使用n＝3試樣混合物)進行測定。
(油浸漬品)
・將乾燥藻體12 g與12 mL之油或12 mL之維生素E添加油混合進行混練。油，橄欖油(FUJIFILM Wako Pure Chemical，大阪)；α-生育酚，FUJIFILM Wako Pure Chemical，大阪)。
・確認油分與藻體已充分融合，其後，計量油藻體混合物約100 mg並加入至Eppen管(聚丙烯製，2 mL容量)中。(試驗試樣為n＝3)
・於各設定溫度條件下(冷蔵；5℃，常溫；20℃～28℃，高溫；40℃)下遮光放置。
・開始時之測定中，對試樣製備時之殘留物之油藻體混合物進行分析。
・於其後之各時點(2週後、1月後、其後每1月)中，自各試樣回收少量進行分析。
・分析中，對岩藻黃素之量進行測定。
岩藻黃素之萃取如以下般而實施，岩藻黃素之測定與實施例7相同。
・於各時點之試樣中添加100%乙醇，於超音波下萃取10分鐘。
・進行離心分離(12000 rpm，2分鐘)，分離成萃取液及藻體。
・僅回收需要量之萃取液，並利用HPLC進行測定。
將岩藻黃素測定之結果示於以下。
[表10]
[表11]
| 乾燥品中之岩藻黃素(相對於開始時之量之比率(%)) | |||||||||||||
| 溫度 | 乾燥劑 | 除氧劑 | 2W | 1M | 2M | 3M | 4M | 5M | 6M | 7M | 8M | 9M | |
| A | 冷藏 | - | - | 100 | 99 | 88 | 92 | 80 | 72 | 64 | 57 | 42 | 32 |
| B | 常溫 | - | - | 51 | 59 | 39 | 33 | 29 | 21 | 17 | 11 | 8 | 4 |
| C | 常溫 | 〇 | - | 91 | 76 | 52 | 48 | 38 | 37 | 6 | 30 | 27 | 27 |
| D | 常溫 | 〇 | 〇 | 102 | 99 | 89 | 88 | 86 | 77 | 76 | 71 | 68 | 66 |
| E | 高溫 | - | - | 34 | 15 | 4 | 3 | 2 | 1 | 2 | - | - | - |
| F | 高溫 | 〇 | - | 32 | 13 | 4 | 6 | 4 | 3 | 3 | - | - | - |
| G | 高溫 | 〇 | 〇 | 51 | 35 | 21 | 10 | 4 | 1 | 0 | - | - | - |
| 浸漬品中之岩藻黃素(相對於開始時之量之比率(%)) | ||||||||||||
| 溫度 | 維生素E | 2W | 1M | 2M | 3M | 4M | 5M | 6M | 7M | 8M | 9M | |
| A | 冷藏 | - | 100 | 101 | 91 | 95 | 98 | 92 | 89 | 91 | 85 | 86 |
| B | 冷藏 | 〇 | 100 | 94 | 90 | 94 | 93 | 94 | 94 | 88 | 85 | 84 |
| C | 常溫 | - | 96 | 94 | 97 | 82 | 78 | 72 | 65 | 57 | 44 | 44 |
| D | 常溫 | 〇 | 84 | 79 | 73 | 72 | 72 | 76 | 67 | 63 | 59 | 50 |
| E | 高溫 | - | 55 | 28 | 8 | 5 | 4 | 3 | 2 | - | - | - |
| F | 高溫 | 〇 | 51 | 31 | 16 | 10 | 7 | 4 | 5 | - | - | - |
發現：乾燥品藉由乾燥劑＋除氧劑之添加，即便於常溫下亦可良好地維持岩藻黃素。發現：油浸漬品即便於常溫下亦可良好地維持岩藻黃素，藉由維生素E之添加可進一步提昇穩定性。推測：尤其是於冷凍-20℃以下之保存、添加有乾燥劑＋除氧劑之乾燥品於5℃以下之保存、油浸漬並於5℃以下之保存之條件下可充分地抑制岩藻黃素之減少。
將乾燥品之去鎂葉綠素酸測定之結果示於以下。
[表12]
不論溫度如何，於任一條件下，均未觀察到既有去鎂葉綠素酸量之增加。預計於乾燥狀態下之保存不會導致大量生成引起去鎂葉綠素酸。
| 乾燥品中之既有去鎂葉綠素酸量(mg%) | |||||||||||||
| 溫度 | 乾燥劑 | 除氧劑 | 2W | 1M | 2M | 3M | 4M | 5M | 6M | 7M | 8M | 9M | |
| A | 冷藏 | - | - | 42 | 57 | 51 | 60 | 51 | 51 | 53 | 47 | 33 | 53 |
| B | 常溫 | - | - | 49 | 61 | 53 | 47 | 46 | 36 | 38 | 23 | 19 | 27 |
| C | 常溫 | 〇 | - | 41 | 71 | 64 | 60 | 61 | 56 | 37 | 50 | 36 | 64 |
| D | 常溫 | 〇 | 〇 | 59 | 71 | 60 | 63 | 86 | 59 | 73 | 70 | 45 | 81 |
| E | 高溫 | - | - | 58 | 46 | 27 | 18 | 19 | 14 | 12 | - | - | - |
| F | 高溫 | 〇 | - | 43 | 53 | 33 | 94 | 43 | 38 | 42 | - | - | - |
| G | 高溫 | 〇 | 〇 | 54 | 112 | 65 | 89 | 89 | 83 | 76 | - | - | - |
(實施例9：凍結品)
按照以下順序使上述微藻類凍結。
・將與上述實施例相同地製備之微藻類濃縮液進行冷凍(-40℃以下)、或封入耐煮沸殺菌(80～100℃)或者蒸煮殺菌之尼龍袋或者鋁袋(較佳為密封、真空包裝)於-40℃以下進行快速冷凍。封入時，視需要進行脫氣注入及/或真空包裝凍結物。
・視需要添加賦形劑(環糊精等)、抗氧化劑、乳化劑及/或增黏劑
・視需要添加果實果汁、果實萃取物及/或香料等。可遮蔽微藻類之風味。
・視需要添加乳製品，製備乳酸冰淇淋、冰牛奶、或冰淇淋。
・將凍結物成形為板狀、或以板狀之形態使其凍結。
(註記)
如以上所述，使用本發明之較佳之實施形態例示了本發明，但應當理解，本發明應僅由申請專利範圍解釋其範圍。關於本說明書中所引用之專利、專利申請及其他文獻，應當理解為：其內容本身與具體地於本說明書中所記載者相同，其內容應當作為對本說明書之參考進行援用。
[產業上之可利用性]
本發明提供一種降低了去鎂葉綠素酸之安全之微藻類製品、以及使其能夠有效率地提供之製造方法及系統，此種微藻類製品可提供各種健康、營養及/或美容效果，又，藉由使用此種製造方法及系統，能夠以較小之環境負荷提供高品質之微藻類製品。又，本發明提供一種細菌污染較小之能夠高濃度培養之培養裝置，藉此使方便性較高之微藻類之培養成為可能。
圖1係表示實施例1中所使用之各種光生物反應器。分別為直徑100 mm之丙烯酸樹脂製、直徑200 mm之丙烯酸樹脂製、直徑250 mm之丙烯酸樹脂製、及直徑450 mm之聚乙烯袋。
圖2係表示實施例1中所使用之開放培養之培養槽。分別為500 L罐(使用培養基200 L)、及750 L之輸水道。
圖3係表示於各培養槽中培養微藻類時之增生。縱軸係表示每1 L培養基中所包含之微藻類之乾燥重量，橫軸係表示培養天數。
圖4係表示最佳地設計之能夠高濃度培養微藻類之光生物反應器。
圖5係表示圖4之光生物反應器之裝置構成。
圖6係表示能夠高濃度培養微藻類之光生物反應器之又一實施形態。可如圖所示般將複數個光生物反應器連接。
圖7係表示用水進行冷卻以使圖4之光生物反應器不成為高溫之情況。
圖8係表示於最佳地設計之光生物反應器中培養微藻類時之增生。縱軸係表示每1 L培養基中所包含之微藻類之乾燥重量，橫軸係表示培養天數。
圖9係表示持續約40天於光生物反應器中培養微藻類時之增生。縱軸係表示每1 L培養基中所包含之微藻類之乾燥重量，橫軸係表示培養天數。表示實施例1中所使用之開放培養之培養槽。
圖10係表示用以給予模型刺激所使用之級聯泵。
圖11係表示加熱處理之前後之定鞭藻之顯微鏡觀察圖像。比例尺表示50 μm。
圖12係表示實施例4中所使用之加熱裝置之構成。
圖13係表示各實施過加熱處理之試樣之離心分離處理前後之試樣之外觀。
圖14係表示實施例4中所使用之板式加熱裝置。
圖15係將用以製造微藻類製品之系統之控制單元之構成按功能分開表示之例示性之方塊圖。
圖16係表示微藻類製品之例。
Claims (61)
- 一種用以製造微藻類製品之方法，其包括如下步驟： (A)培養後直至(B)步驟為止於將賦予微藻類之應力量控制在特定值以下之條件下進行維持之步驟，且將該微藻類之密度維持在特定值以下、且/或不將該微藻類濃縮至特定倍率以上；及 (B)將微藻類供於使葉綠素酶失活之處理。
- 如請求項1之方法，其中上述密度之特定值及/或上述濃縮之特定倍率係基於將上述微藻類濃縮之情形時之去鎂葉綠素酸之增多而決定。
- 如請求項1或2之方法，其中上述密度之特定值為約10 g/L(乾燥重量)以下。
- 如請求項1或2之方法，其中上述密度之特定值為約5 g/L(乾燥重量)以下。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中上述濃縮之特定倍率為約100倍以上。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中上述濃縮之特定倍率為約10倍以上。
- 如請求項1至6中任一項之方法，其中上述應力量之特定值為約5以下。
- 如請求項1至6中任一項之方法，其中上述應力量之特定值為約3以下。
- 如請求項1至6中任一項之方法，其中上述應力量之特定值為約2以下。
- 如請求項1至9中任一項之方法，其中於(A)步驟中不進行將上述微藻類進行濃縮之處理。
- 如請求項1至10中任一項之方法，其中培養上述微藻類之步驟包括使上述微藻類增生至1 g/L(乾燥重量)之密度以上。
- 如請求項1至11中任一項之方法，其中於(B)步驟之後包括將上述微藻類進行濃縮之步驟。
- 如請求項1至12中任一項之方法，其中(B)步驟包括將上述微藻類進行加熱。
- 如請求項13之方法，其中上述加熱包括加熱至95℃以上。
- 如請求項1至14中任一項之方法，其中(B)步驟係於如下條件下進行：不使岩藻黃素分解、或於(B)步驟之前後進行比較之情形時岩藻黃素之減少未達80%。
- 如請求項15之方法，其中上述條件包含岩藻黃素之分解量未達10%。
- 如請求項1至16中任一項之方法，其中於(B)步驟之後包括使上述微藻類乾燥之步驟。
- 如請求項1至17中任一項之方法，其中上述微藻類每1 g乾燥重量生產葉綠素30 mg以上。
- 如請求項1至18中任一項之方法，其中上述微藻類為生產岩藻黃素之藻類。
- 如請求項1至19中任一項之方法，其中上述微藻類為每1 g乾燥重量生產岩藻黃素8 mg以上之藻類。
- 如請求項1至20中任一項之方法，其中上述微藻類為定鞭藻綱。
- 如請求項1至20中任一項之方法，其中上述微藻類為巴夫藻科。
- 如請求項1至20中任一項之方法，其中上述微藻類為巴夫藻屬。
- 如請求項1至20中任一項之方法，其中上述微藻類為P. calceolate、P. granifera、P. gyrans、P. lutheri、P. pinguis或P. salina。
- 如請求項20之方法，其中上述微藻類為P. granifera或P. gyrans。
- 一種微藻類製品，其係藉由包括進行如請求項1至25中任一項之方法之方法所製造並用以用於生物或用於生物攝取，且該微藻類製品包含上述微藻類之藻體。
- 如請求項26之微藻類製品，其中上述微藻類之去鎂葉綠素酸之含量為0.2重量%以下。
- 如請求項27之微藻類製品，其中上述微藻類之去鎂葉綠素酸之含量為0.1重量%以下。
- 一種用以用於生物或用於生物攝取之微藻類製品，其包含微藻類之藻體，且上述微藻類之去鎂葉綠素酸之含量為0.2重量%以下(乾燥重量)。
- 一種用以用於生物或用於生物攝取之微藻類製品，其包含微藻類之藻體，且上述微藻類之去鎂葉綠素酸之含量為0.1重量%以下(乾燥重量)。
- 如請求項29或30之微藻類製品，其中上述微藻類為定鞭藻綱。
- 如請求項29或30之微藻類製品，其中上述微藻類為P. granifera或P. gyrans。
- 如請求項26至32中任一項之微藻類製品，其為食用製品或化妝品。
- 如請求項26至32中任一項之微藻類製品，其中上述生物為哺乳動物。
- 如請求項26至32中任一項之微藻類製品，其中上述生物為人類。
- 如請求項26至35中任一項之微藻類製品，其中岩藻黃素之含量為0.8重量%以上。
- 如請求項26至36中任一項之微藻類製品，其中上述微藻類之岩藻黃素含量為0.8重量%以上(乾燥重量)。
- 如請求項26至37中任一項之微藻類製品，其中上述微藻類之葉綠素含量為3重量%以上(乾燥重量)。
- 如請求項26至38中任一項之微藻類製品，其為食用製品。
- 如請求項26至38中任一項之微藻類製品，其為食品。
- 如請求項26至38中任一項之微藻類製品，其為以每天提供100～150 mg之葉綠素之方式供攝取之食用製品。
- 如請求項26至38中任一項之微藻類製品，其為化妝品。
- 一種用以製造凍結品之方法，其包括如下步驟： 藉由如請求項1至25中任一項之方法製備微藻類濃縮液；及 將上述微藻類濃縮液進行凍結。
- 如請求項43之方法，其中進行凍結之步驟包括冷卻至-40℃以下。
- 如請求項39至41中任一項之微藻類製品，其為凍結品。
- 如請求項45之微藻類製品，其為乳製品不添加、乳酸冰淇淋、冰牛奶或冰淇淋。
- 如請求項45或46之凍結品，其包含賦形劑、抗氧化劑、乳化劑、及增黏劑中之1種或複數種。
- 如請求項45至47中任一項之凍結品，其包含果實果汁及香料中之1種或複數種。
- 如請求項45至48中任一項之凍結品，其為板狀之形態。
- 一種用以製造油浸漬品之方法，其包括如下步驟： 藉由如請求項1至25中任一項之方法製備微藻類濃縮液；及 將上述微藻類與油進行混合。
- 如請求項50之方法，其包括向上述微藻類濃縮液添加水來進行除鹽之步驟。
- 如請求項50或51之方法，其包括將上述微藻類濃縮液進行凍結乾燥之步驟。
- 如請求項39至41中任一項之微藻類製品，其為油浸漬品。
- 如請求項53之油浸漬品，其包含抗氧化劑。
- 如請求項54之油浸漬品，其中抗氧化劑包含α-生育酚。
- 如請求項53至55中任一項之油浸漬品，其相對於乾燥藻體1 g包含約1～100重量%之油。
- 如請求項53至56中任一項之油浸漬品，其包含乳化劑。
- 一種食用膠囊，其包含如請求項53至57中任一項之油浸漬品。
- 如請求項39至41中任一項之微藻類製品，其為包含乾燥劑及抗氧化劑中之1種或複數種之乾燥品。
- 如請求項39至41及59中任一項之微藻類製品，其為封入至遮光容器中之乾燥品。
- 一種用以製造乾燥微藻類之方法，其包括如下步驟： 藉由如請求項1至25中任一項之方法製備微藻類濃縮液；及 於賦形劑、乳化劑及抗氧化劑中之1種或複數種之存在下使上述微藻類濃縮液乾燥。
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