TW202024339A - 腦梗塞發病風險預測方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種預測腦梗塞的發病風險或發病時期的方法。一種預測腦梗塞未發病的受檢查者的腦梗塞發病時期的方法，包括：檢測步驟，對源自腦梗塞未發病的受檢查者的樣品中有無RNF213 p.R4810K基因多態性進行檢測；以及判定步驟，根據所述檢測步驟中的RNF213 p.R4810K基因多態性的有無，來判定該受檢查者的腦梗塞發病時期是否比通常早。一種用於預測腦梗塞發病風險的基因標記，包含RNF213 p.R4810K基因多態性。一種用於預測腦梗塞發病風險的生物標記，包含RNF213 p.R4810K基因所編碼的多肽。

Description

腦梗塞發病風險預測方法

本發明是有關於一種腦梗塞的發病風險或發病時期的預測、及屬於該些研究領域的、尤其是針對正常人而言的腦梗塞發病風險預測方法。

非專利文獻1中揭示有：作為煙霧病（moyamoya disease）的易感基因（susceptibility gene）的RNF213基因多態性（c.14576 G＞A, p.R4859K, rs112735431）不僅與煙霧病非偶然地相關聯，而且亦與單側煙霧病或動脈粥樣硬化（atherosclerosis）的顱內主幹動脈狹窄（顱內狹窄）非偶然地相關聯，另一方面，揭示有：並未確認到所述RNF213基因多態性與頸部頸動脈狹窄、腦動脈瘤、腦內出血的非偶然的關聯。

再者，與非專利文獻1中的RNF213基因多態性相關的（c.14576 G＞A, p.R4859K, rs112735431）這一表述是基於東北大學團體的命名。於本說明書中，基於京都大學團體的命名而將同一RNF213基因多態性表述為p.R4810K多態性（c.14429 G＞A, rs112735431）或僅表述為p.R4810K多態性。兩者是基於胺基酸的計算方法的差異者，且為同一多態性 [現有技術文獻] [非專利文獻]

[非專利文獻1]「RNF213與煙霧症候群（RNF213 and Moyamoya syndrome）」，宮脇哲，2016年區位神經-血管學會議（Niche Neuro-Angiology Conference 2016），http://nnac.umin.jp/nnac/NNAC#2016#files/%E5%AE%AE%E8%84%87%E5%85%88%E7%94%9F.pdf

[發明所欲解決之課題] 本發明的目的在於提供一種預測腦梗塞的發病風險或發病時期的方法。 [解決課題之手段]

腦梗塞被分類為粥樣血栓性腦梗塞（atherothrombotic brain infarction（腦動脈血管栓塞））、腔隙性腦梗塞（lacunar infarction）、及腦栓塞（embolism）三種。

根據本發明者的研究，得知RNF213 p.R4810K基因多態性與粥樣血栓性腦梗塞之間非偶然地具有相關性。根據該情況，而提供如下方法：藉由對源自腦梗塞未發病的受檢查者的樣品中有無RNF213基因多態性進行檢測，來預測該受檢查者的腦梗塞的發病風險或發病時期的方法（或輔助性地進行預測的方法）。

本發明包括以下的發明。 （1）一種預測腦梗塞未發病的受檢查者的腦梗塞發病時期的方法，包括： 檢測步驟，對源自腦梗塞未發病的受檢查者的樣品中有無RNF213 p.R4810K基因多態性進行檢測；以及 判定步驟，根據所述檢測步驟中的所述RNF213 p.R4810K基因多態性的有無，來判定該受檢查者的腦梗塞發病時期是否比通常早。

（2）如所述（1）中記載的方法，其中於所述檢測步驟中檢測到所述RNF213 p.R4810K基因多態性的情況下，在所述判定步驟中，判斷為該受檢查者與並不具有所述RNF213 p.R4810K基因多態性的人員相比，腦梗塞發病時期早。

（3）如所述（1）或（2）中記載的方法，其中於所述判定步驟中，基於所述RNF213 p.R4810K基因多態性的有無、及該受檢查者的識別資訊，來判定該受檢查者的腦梗塞發病時期是否比通常早。

（4）一種用於預測腦梗塞發病風險的基因標記，包含RNF213 p.R4810K基因多態性。

（5）一種用於預測腦梗塞發病風險的生物標記，包含RNF213 p.R4810K基因所編碼的多肽。 [發明的效果]

根據本發明的見解，對於腦梗塞未發病的受檢查者，可自早期階段起便對腦梗塞進行預防或採取對策。

RNF213（環指蛋白（Ring finger protein）213）（基因庫登記編號（GenBank accession number）NM_001256071.1）近年來被鑑定為煙霧病的疾病易感基因，且存在於人類染色體區域17q25.3中。

RNF213 p.R4810K基因多態性為序列編號2所表示的核苷酸（nucleotide）序列中的73097 G＞A的單鹼基多態性（SNP；Single Nucleotide Polymorphism（單核苷酸多態性））。RNF213 p.R4810K如所述現有文獻般已知為煙霧病易感多態性。

根據本發明者等人的研究，已判明：RNF213 p.R4810K多態性使大動脈動脈粥樣硬化症所致的缺血性腦中風（即，腦梗塞）的風險增加。於本說明書中，缺血性腦中風與腦梗塞為相同含義。

缺血性腦中風為近年來的早逝的一個原因，且尤其為亞洲的身體障礙及早逝的主要原因，但缺血性腦中風與特有的遺傳決定相關性仍未知。主要於東亞確認到的、作為腦血管疾病的煙霧病與環指蛋白213（RNF213）這一易感基因相關聯，其調節不全有損小鼠（mouse）腦中的腦灌注。因此，本發明者等人設立RNF213於缺血性腦中風中發揮更通常的作用這一假說，並調查作為煙霧病的最通常的風險的RNF213基因的p.R4810K多態性、與缺血性腦中風及其亞型的關聯。

根據缺血性腦中風的三個獨立的日本研究，本發明者等人對東亞祖先的46,958人（17,752例病例及29,206例正常人例（對照（control）））的病例對照資料（case-control data）進行分析。本發明者等人於固定效應模型（fixed effects model）下進行了東亞人的整合分析（meta-analysis）。

結果，根據東亞人的組合整合分析，顯示出：於基因組（genome）整個區域中，p.R4810K多態性與所有缺血性腦中風（OR（優勢比）1.91，95%CI（95%可靠區間）1.55-2.36，p=1.5×10^-9 ）及大動脈動脈粥樣硬化症（OR 3.58，95%CI 2.55-5.03，p=2.0×10^-13 ）非偶然地存在關聯。於藉由性別而層別化的情況下，該關聯於女性中更明顯（男性中OR 1.50，95%CI 1.14-1.98，p=0.004：女性中OR 2.69，95%CI 1.95-3.69，p=1.2×10^-9 ）。關於腦中風發病的平均年齡，與RNF213 p.R4810K多態性非保持者相比，RNF213 p.R4810K多態性保持者中低4.1歲（p=1.1×10^-8 ）。此處，本說明書中的、「腦梗塞發病時期比通常早」這一用語是指比RNF213 p.R4810K多態性非保持者中的平均腦梗塞發病時期早，或者是指比包含RNF213 p.R4810K多態性保持者及RNF213 p.R4810K多態性非保持者在內的平均腦梗塞發病時期早。

根據該些，可得出如下結論：RNF213 p.R4810K多態性為缺血性腦中風、尤其是大動脈動脈粥樣硬化症的缺血性腦中風的遺傳危險因子。

RNF213 p.R4810K基因多態性為序列編號2所表示的核苷酸序列中的73097 G＞A的單鹼基多態性（SNP；Single Nucleotide Polymorphism（單核苷酸多態性）），可為用於預測腦梗塞發病風險、或者用於輔助預測的基因標記。

序列編號2為包含mysterin基因及其周邊區域的基因[FLJ3520、NPTX1、CARD14、及Raptor（KIAA1303）]的人類第17號染色體去氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的部分核苷酸序列，相當於美國國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中所記錄的Contig #NT010783.15的第43560001～43795000號的核苷酸。

序列編號2所表示的核苷酸序列除了為G或A的第73097位的SNP（於本說明書中，簡稱為73097 G＞A）以外，亦可存在為T或C的第4766位的SNP（4766 T＞C）、為G或A的第120764位的SNP（120764 G＞A）、為G或A的第152917位的SNP（152917 G＞A）、及為G或A的第232102位的SNP（232102 G＞A）。

再者，於本說明書中，SNP的位置是以序列編號2所表示的核苷酸序列中的核苷酸的位置為基準來記載。例如，「第73097位的SNP」是指序列編號2所表示的核苷酸序列中的第73097位的核苷酸中的SNP。於記載為「73097 G＞A」等的情況下，在「＞」記號前記載主要對偶基因（major allele）的鹼基（該情況下為G），在「＞」記號後記載次要對偶基因（minor allele）的鹼基（該情況下為A）。

另外，於本說明書中，只要並無特別說明，則核苷酸序列是作為DNA的序列而記載，但於多核苷酸（polynucleotide）為核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）的情況下，將胸腺嘧啶（thymine）（T）適宜換用為尿嘧啶（uracil）（U）。

於本發明中，多核苷酸除了包含序列編號2所表示的核苷酸序列的連續部分序列或其互補序列以外，亦可包含任意的附加序列。

於本發明中，多核苷酸較佳為經分離或精製。

於本發明的所述方法的檢測步驟中，在源自從受檢查者採取的生物體的試樣中，對73097 G＞A的SNP進行檢測。

人類的人種並無特別限定，較佳為東亞人（東亞人種（East Asian）/蒙古人種（Mongoloid））。

此處，人種（race）為智人（Homo sapiens）種類中的可作為特定的子群（subgroup）來區別的群體。人種具有特有且可區別的基因組合，且藉由利用該基因組合而形成的特徵（精神特徵、以及肉體特徵）來鑑定。相同人種的成員共有共通的遺傳祖先，結果，共有類似的基因組合，因此共有可明確區別的遺傳特徵。

例如，關於世界的主要人類群體，基於23種基因資訊來調查遺傳親緣關係，而分類為非洲人（African）（黑種人（Negroid））、高加索人種（Caucasoid）（白種人）、大洋洲人（Oceanian）（澳大利亞人種（Australoid））、東亞人種（蒙古人種）及美洲原住民（native American）五種。

所謂東亞人，是指以日本人、朝鮮人、中國人、臺灣人及蒙古人的任一者為起源的人。東亞人較佳為日本人、朝鮮人、或中國人。

若為本領域技術人員，則可基於個體的身體特徵、祖籍國、先祖起源的相關資訊等而容易地確定該個體的人種。

作為所述方法中所使用的源自生物體的試樣，可使用可採取基因組DNA的任意的組織、細胞、體液等，就獲得的容易性及低侵入性等觀點而言，較佳為使用毛髮、指甲、皮膚、黏膜、血液、血漿、血清、唾液等。

SNP的檢測方法於該技術領域中是眾所周知的。例如，可使用：限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）（限制酶切斷片段長度多態性）法、聚合酶鏈式反應-單鏈構型多態性（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）（單鏈DNA高次結構多態性分析）法、對偶基因特異性寡核苷酸（Allele Specific Oligonucleotide，ASO）雜交法、序列法、放大折射突變系統（Amplification Refracting Mutation System，ARMS）法、變性濃度梯度凝膠電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）法、RNAseA切斷法、染料標記寡核苷酸連接（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation，DOL）法、泰曼（TaqMan）PCR法、引物延伸（primer extension）法、侵入物法（invader method）等。

另外，RNF213 p.R4810K基因所編碼的多肽為包含序列編號1所表示的胺基酸序列的多肽（此處，序列編號1所表示的胺基酸序列中第4810號的精胺酸經取代為離胺酸），可為用於預測腦梗塞發病風險的生物標記。

即，如上所述，RNF213 p.R4810K的SNP的變異伴有人類mysterin的第4810號的胺基酸取代（精胺酸→離胺酸），因此，自受試驗者分離mysterin多肽，並對其第4810號的胺基酸進行鑑定，藉此可預測腦梗塞發病風險、或者可實現用以進行預測的輔助。 [實施例]

以下示出實施例，並對本發明進行具體說明，但本發明不受實施例的限制。

腦中風死亡率雖於過去數十年間減少^{1 ）} ，但就世界而言，腦中風仍為早逝的第二主要原因，亦為身體障礙的主要原因^{2 ）} 。在佔世界人口的31%的東南亞及東亞，腦中風為早逝的主要原因，腦中風的發生率及罹患率穩步增加^{1,2 ）} 。流行病學研究暗示有腦中風亞型的實質性地理差異及人種差異^{3,4 ）} 。心因性栓塞症為西歐各國的缺血性腦中風的通常的病因學亞型^{5 ）} 。另一方面，顱內動脈狹窄引起的大動脈動脈粥樣硬化症在大部分亞洲各國中為主要病因^{6 ）} 。認為環境風險主要因素與遺傳背景的不同為亞洲的大動脈動脈粥樣硬化症的高罹患率的主要原因。最近，藉由大規模的多祖先全基因組（genome wide）關聯整合分析，來鑑定與腦中風及腦中風亞型相關聯的32個基因座^{7 ）} 。該研究中，檢查了約800萬單鹼基多態性（SNPs）。然而，該分析中，將小於1%（＜0.01）的次要對偶基因頻率（minor-allele frequency；MAF）的SNPs除外，進而，缺血性腦中風的亞洲特異性遺傳決定因子仍未知。

17q25.3上的環指蛋白213基因（RNF213）被鑑定為煙霧病的易感基因^{8,9 ）} 。於80%以上的煙霧病患者中檢測到RNF213 p.R4810K多態性（c.14429 G＞A，rs112735431），但東亞的健康受試驗者的對偶基因（allele）攜帶頻率為約2%^{8,9 ）} 。RNF213對作為AAA+ ATPase與E3連接酶兩者發揮功能的591kDa蛋白^{12 ）} 進行編碼，且與顱內的主幹部閉塞病變的發病及經降低的腦血流中的代償反應相關聯^{13,14 ）} 。最近，兩個個別研究報告有：具有顱內內頸動脈狹窄或近端大腦中動脈狹窄的東亞非煙霧病患者中的RNF213 p.R4810K多態性的高頻率（20%～25%）^{10,15 ）} 。因此，本發明者等人設立該遺傳變異有可能與亞洲的整體性缺血性腦中風相關聯這一假說。此處，對參加了三個獨立的日本研究的急性缺血性腦中風患者進行分析，調查RNF213 p.R4810K多態性與缺血性腦中風及其亞型的關聯性。

（方法） （研究設計與參加者） 於該兩階段的病例對照研究中，本發明者等人對來自日本的三例病例對照研究中來自東亞參加者的缺血性腦中風資料進行了研究。本發明者等人將並非東亞子孫的患者及對照除外。主研究（primary study）中，使用包含所有的患者的廣泛的臨床資料及放射線資料的日本國立循環器官疾病研究中心（National Cerebral and Cardiovascular Center；NCVC）的基於醫院的單一群體（NCVC生物庫）。再現研究（replication studies）中，p.R4810K基因型是源自日本生物庫（Biobank Japan）（16,256例缺血性腦中風病例及27,294例對照）、及久山（Hisayama）及Fukuoka Stroke Registry（FSR）試驗（1,113例病例及對照901例）的全基因組的基因型分析資料。該研究自所有的試驗參加者取得了書面同意，且由負有責任的倫理委員會及日本國立循環器官疾病研究中心（NCVC）的倫理委員會認可。

（主研究Primary study） 主研究的參加者是由大阪、關西地區的腦中風及心血管疾病專業的600個床位的第三次中心即日本國立循環器官疾病研究中心（NCVC）募集。將自2012年6月起至2017年5月入院且於NCVC在全面同意書中署名的非心因性腦栓塞症（大動脈動脈粥樣硬化症（large-artery atherosclerosis）、小血管閉塞症（small-vessel occlusion）等）的日本患者383例包含於本研究中。基於日本厚生勞動省的煙霧病研究委員會的基準，將被診斷為心因性腦栓塞症cardioembolic stroke（心因性栓塞型中風）、確定/疑似煙霧病的患者除外^{17 ）} 。患者選擇順序的流程圖是於圖1中詳細敘述。

人口統計學資料、粥樣硬化性危險因子、放射線學觀察結果、及病歷是自藉由腦中風患者的前瞻性研究所收集的資料庫（前瞻性收集資料庫（prospectively-collected database））獲得。腦中風亞型是依照與急性腦中風治療相關的Org 10172基準[the Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment (TOAST) criteria（Org 10172於急性中風治療中的試驗（TOAST）標準）]而分類^{18 ）} 。腦血管病變是藉由磁共振成像法（magnetic resonance imaging；MRI）及MR血管造影（MR angiography）、或電腦斷層掃描（computed tomography，CT）及CT血管造影（CT angiography）進行鑑定。前部循環狹窄（anterior circulation stenosis）是依照殺鼠靈-阿斯匹靈症狀性顱內疾病（Warfarin-Aspirin Symptomatic Intracranial Disease，WASID）的研究基準^{19 ）} ，而定義為顱內內頸動脈（intracranial internal carotid artery）、大腦中動脈（middle cerebral artery）或大腦前動脈（anterior cerebral artery）中有超過50%（＞50%）的直徑減少。同樣地，後部循環狹窄（posterior circulation stenosis）是依照顱內、脊柱後、或大腦後動脈中的所述基準來定義。

對照受試驗者是於2007至2015年間在日本關西地區募集。將潛在對照1,027名中、具有腦梗塞或煙霧病的病歷的16名受試驗者除外。最終選擇1,011名對照受試驗者。收集靜脈血液樣品，分析前於-80℃下保存。如上文所記載般^{8 ）} ，使用泰曼SNP試驗（TaqMan SNP Assays）（應用生物系統（Applied Biosystems），福斯特城（Foster City），加州（California，CA））及7300/7500實時PCR系統（7300/7500 Real-Time PCR System）（應用生物系統（Applied Biosystems），福斯特城（Foster City），加州（California，CA））進行p.R4810K基因型決定。

（再現研究Replication studies） 藉由自以前的報告^{7 ）} 檢索資料，而進行缺血性腦中風（大動脈動脈粥樣硬化症（large-artery atherosclerosis）、小血管閉塞症（small-vessel occlusion）、及心因性腦栓塞症（cardioembolism））與RNF213 p.R4810K多態性之間的關聯性的確認。具體而言，自日本生物庫（Biobank Japan）項目（project）記錄16,256件缺血性腦中風患者。對照是自岩手醫學大庫（Iwate Medical Megabank（IMM））、基於日本保健中心的多目的分群研究（基於日本公共健康中心的前瞻性研究（Japan Public Health Center-based Prospective study（JPHC）））、日本多機構協同分群研究（Japan Multi-institutional Collaborative Cohort Study（JMICC））、東北醫學大庫（Tohoku Medical Megabank（ToMMo））四個基於人群的研究而獲得。進而，1,113例缺血性腦中風與901例的對照例是自研究日本心血管疾病的久山研究、與日本的急性腦中風患者的基於多機構醫院的記錄即FSR試驗而獲得。

SNP基因型分型（genotyping）是使用因美納（Illumina）的人類全表現微珠晶片（HumanOmniExpress BeadChip）與人類外顯子組微珠晶片（HumanExome BeadChip）的組合分析、或因美納（Illumina）的人類全表現外顯子組微珠晶片（Human OmniExpressExome BeadChip）分析並由理化學研究所生命醫學科學研究中心（理化學研究所綜合醫學科學中心（RIKEN Center for Integrative Medical Sciences））實施。為了將東亞以外的受試驗者除外，應用用以確定試樣無關的血緣同一性分析（Identity-by-Descent analysis）、及包含主成分分析的標準的品質管理順序。單倍型定相（Haplotype phasing）及基因型插補（genotype imputation）是使用具有符合包含成功率及哈溫（Hardy-Weinberg）平衡試驗的品質管理基準的基因型資料的過濾樣品來實施。使用所插補的對偶基因的投予量來實施全基因組關聯分析[genome-wide association study（GWAS）]，並使其適合於具有加法遺傳模型的邏輯式迴歸模型。本發明者等人取入10個主成分、年齡、性別作為共變量。詳細情況記載於上文^{7 ）} 。

於如下情況下，將樣品除外。 1）缺失變異的比例高（缺失＞0.05）的情況 2）所報告的性別或民族性、與遺傳決定的性別或民族性之間存在不一致的情況 3）顯示出潛在關聯性的情況

（統計分析Statistical analysis） 連續變數是以平均±SD來表示，並使用學生t檢定（Student's t-test）進行比較。類別變數是以數值與百分比來表現，並適宜使用卡方檢定（chi-square test）與兩側檢定的費雪精準檢定（two-tailed Fisher's exact test）進行比較。本發明者等人因同型接合體的數量不充分而於主研究中將RNF213多態性與缺血性腦中風的風險之間的關聯性假設為顯性模型來進行試驗。另外，本發明者等人為了與使用插補法（imputation methods）的驗證研究（再現研究（replication studies））進行比較，而對用於整合分析的邏輯加法模型（log-additive model）下的關聯性進行調查。使用多個邏輯迴歸模型（logistic regression model）同時控制潛在混擾因子（confounding factor），之後針對各腦中風亞型計算優勢比（OR Ratio）及95%可靠區間CI。模型中所考慮到的變數為年齡（連續）、性別、高血壓、血脂異常症、糖尿病及吸煙。所有的分析是使用JMP Pro 12.2軟體（SAS研究公司（SAS Institute Inc.），凱里（Cary），北卡羅來納州（North Carolina，NC））來進行。

認為概率值為兩側，且p＜0.05並非偶然。整合分析是使用認為p＜5×10^-8 於基因組整體中並非偶然的逆方差固定效應模型（inverse variance fixed effects model）並藉由審查管理（Review Manager）（RevMan）5.3軟體（北歐科克倫中心（The Nordic Cochrane Center），丹麥（Denmark），哥本哈根（Copenhagen））進行。

（結果） （主研究Primary study） 於主研究中，尤其記錄有非心因性腦栓塞症腦中風患者。滿足所述全面性基準的1,775名非心因性腦栓塞症腦中風患者中的383名（21.6%）同意參加NCVC生物庫，並於本主研究中進行了分析。將NCVC生物庫的參加者與非參加者的兩種患者的特徵示於表1中。與NCVC生物庫的非參加者相比較，參加者更年輕，且女性更少。關於血脂異常症及吸煙習慣，較非參加者而言，參加者更高，但其他危險因子及腦中風亞型的分佈為同等程度。將本主研究參加者的基線（base line）特性示於表2中。腦中風患者與對照對象相比，年齡更高，女性更少，且具有更大量的動脈粥樣硬化症風險因子。

[表1]

	參加者 （Participants） N=383	非參加者 （Non-participants） N=1392	P 值（P value）
年齡，歲（Age, yr）	68.5±13.5	72.2±12.1	＜0.0001
女性（Female）	110（28.7%）	476（34.2%）	0.05
高血壓（Hypertension）	314（82.0%）	1151（82.7%）	0.76
糖尿病（Diabetes mellitus）	116（30.3%）	388（27.9%）	0.37
血脂異常（Dyslipidemia）	261（68.2%）	837（60.1%）	0.004
吸煙習慣（Smoking habit）	231（60.5%）	758（54.5%）	0.04
中風亞型（Stroke subtypes）			0.51
大動脈動脈粥樣硬化症 （Large-artery atherosclerosis）	131（34.2%）	433（31.1%）
小血管閉塞症 （Small-vessel occlusion）	132（34.5%）	499（35.8%）
其他（Others）	120（31.3%）	460（33.1%）
NCVC生物庫參加者與非參加者的患者特性。（Patient characteristics of participants and non-participants in NCVC biobank.）

[表2]

	對照 （Control） （N=1011）	非心因性栓塞型中風患者 （Non-cardioembolic stroke patients） N=383	P 值（P value）
年齡，歲（Age, yr）	63.1±15.2	68.5±13.5	＜0.0001
女性（Female）	433（42.8%）	110（28.7%）	＜0.0001
高血壓（Hypertension）	266（26.3%）	314（82.0%）	＜0.0001
糖尿病（Diabetes mellitus）	81（8.0%）	116（30.3%）	＜0.0001
血脂異常（Dyslipidemia）	112（11.1%）	261（68.2%）	＜0.0001
吸煙發生率（Smoking incidence）	307（30.4%）	231（60.5%）	＜0.0001
顱外內頸動脈狹窄 （Extracranial ICA stenosis）	-	46（12.0%）
顱內動脈狹窄 （Intracranial artery stenosis）
前部循環狹窄 （Anterior circulation stenosis）	-	111（29.0%）
後部循環狹窄 （Posterior circulation stenosis）	-	58（15.1%）
中風亞型（Stroke subtypes）
大動脈動脈粥樣硬化症 （Large-artery atherosclerosis）	-	131（34.2%）
小血管閉塞症 （Small-vessel occlusion）	-	132（34.5%）
其他（Others）	-	120（31.3%）
RNF213 p.R4810K基因型			0.0044
GG	990（97.2%）	363（94.8%）
GA	20（2.0%）	20（5.2%）
AA	1（0.1%）	0（0%）
主要研究中參加者的RNF213 p.R4810K變異體的基線特性與患病率。ICA表示內頸動脈。（Baseline characteristics and prevalence ofRNF213 p.R4810K variant of participants in the primary study. ICA indicates internal carotid artery.）

發現RNF213 p.R4810K多態性於非心因性腦栓塞症腦中風患者中為5.2%及於正常對照者中為2.1%（粗OR 2.60，95%CI 1.39-4.85，p=0.0019）。對年齡、性別、及動脈粥樣硬化症的危險因子進行調整後，RNF213 p.R4810K多態性與非心因性腦栓塞症腦中風的關聯仍保持非偶然的狀態（經調整的OR 3.90，95%CI 1.62-9.24，p=0.0026）。與對照受試驗者相比較，僅大動脈動脈粥樣硬化症與多態性非偶然地相關聯（粗OR 5.19，95%CI 2.53-10.64，p=2.6×10^-6 ；經調整的OR 11.45，95%CI 3.46-36.17，p=0.0001）（表3）。

[表3]

	對照（Control）	非心因性栓塞型中風（Non-cardioembolic stroke）
全部（Overall）	大動脈動脈粥樣硬化症 （Large-artery atherosclerosis）	小血管閉塞症 （Small-vessel occlusion）	其他（Others）
p.R4810K變異體的攜帶頻率 （Carrier frequency of the p.R4810K variant）	21/1011 （2.1%）	20/383 （5.2%）	13/131 （9.9%）	4/132 （3.0%）	3/120 （2.5%）
粗（Crude）OR（95%CI）	1.0	2.60（1.39-4.85）	5.19（2.53-10.64）	1.47（0.50-4.36）	1.21（0.36-4.11）
經調整的（Adjusted）OR*（95%CI）	1.0	3.90（1.62-9.24）	11.45（3.46-36.17）	1.31（0.28-5.02）	2.10（0.43-7.38）
P 值（P value）		0.0026	0.0001	0.71	0.29
主研究中，各中風亞型中的RNF213 p.R4810K變異體的攜帶頻率。非心因性栓塞型中風包括：大動脈動脈粥樣硬化症、小血管閉塞症、以及其他。OR表示相對於對照受試驗者而言的各中風亞型中的RNF213 p.R4810K變異體的存在優勢比；CI表示可靠區間。*按照年齡、性別、高血壓、糖尿病、血脂異常、與吸煙發生率調整。（Carrier frequency of the RNF213 p.R4810K variant in each stroke subtype in the primary study. Noncardioembolic stroke includes large-artery atherosclerosis, small-vessel occlusion, and others. OR indicates odds ratio for the presence of the RNF213 p.R4810K variant in each stroke subtype compared with control subjects; CI, confidence interval.*Adjusted for age, sex, hypertension, diabetes mellitus, dyslipidemia, and smoking incidence.）

基於RNF213 p.R4810K多態性的有無的腦中風患者間的比較中，關於腦中風發病的平均年齡，較非攜帶者而言於RNF213多態性中低（58.1±15.5歲：69.1±13.2歲，p=0.0003）（表4）。

[表4]

	p.R4810K 變異體（+） （N=20）	p.R4810K 變異體（-） （N=363）	優勢比 （Odds ratio） （95%CI）	P值（P value）
年齡（歲）（Age(yr.)）	58.1±15.5	69.1±13.2		0.0003
女性（Female）	11（55.0%）	99（27.3%）	3.3（1.2-8.1）	0.011
高血壓（Hypertension）	14（70.0%）	300（82.6%）	0.5（0.2-1.3）	0.23
糖尿病（Diabetes mellitus）	5（25.0%）	111（30.3%）	0.8（0.3-2.1）	0.80
血脂異常（Dyslipidemia）	12（60.0%）	249（68.6%）	0.7（0.3-1.7）	0.46
吸煙發生率（Smoking incidence）	11（55.0%）	220（60.8%）	0.8（0.3-2.0）	0.64
顱外內頸動脈狹窄 （Extracranial ICA stenosis）	3（15.0%）	43（11.9%）	1.3（0.4-4.7）	0.72
顱內動脈狹窄 （Intracranial artery stenosis）
前部循環狹窄 （Anterior circulation stenosis）	12（60.0%）	99（27.3%）	4.0（1.6-10.1）	0.0038
後部循環狹窄 （Posterior circulation stenosis）	3（15.0%）	55（15.2%）	1.0（0.3-3.5）	1.00
中風亞型（Stroke subtypes）				0.012
大動脈動脈粥樣硬化症 （Large-artery atherosclerosis）	13（65.0%）	118（32.5%）
腔隙性（Lacunar）	4（20.0%）	128（35.3%）
其他（Others）	3（15.0%）	117（32.2%）
主研究中，有RNF213 p.R4810K變異體與無RNF213 p.R4810K變異體的中風患者的比較。（Comparisons between stroke patients with and without RNF213 p.R4810K variant in the primary study.） ICA表示內頸動脈；CI表示可靠區間。（ICA indicates internal carotid artery; CI, confidence interval.）

如自表2及表4得知般，對有無RNF213多態性的受試驗者中的腦梗塞的發病年齡的平均（68.5歲）、與有RNF213多態性的受試驗者的腦梗塞發病年齡（表4中，平均為58.1歲）進行比較，有RNF213多態性的患者的腦梗塞的發病年齡年輕約11歲。

腦中風患者中，較非攜帶者而言，RNF213多態性攜帶者包含更多的女性（55.0%：27.3%，p=0.011），且顯示出顱內前部循環狹窄（60.0%：27.3%，p=0.004）及大動脈動脈粥樣硬化症（65.0%：32.5%，p=0.012）的更高的頻率（frequency）。顱外內頸動脈（extracranial internal carotid artery）或後部循環狹窄（posterior circulation stenosis）的產生、及高血壓、糖尿病、血脂異常症及吸煙發生率等現有的動脈粥樣硬化性危險因子於多態性攜帶者與非攜帶者之間並無不同。

（再現研究Replication studies） 關於RNF213 p.R4810K多態性，本發明者等人使用自日本生物庫項目^{7 ）} 記錄的16,256例的缺血性腦中風病例（包含心因性腦栓塞症腦中風）及27,294例的東亞系子孫來進行檢索。確認到RNF213 p.R4810K多態性於所有的缺血性腦中風患者中為2.3%及於通常群體中為1.3%。於RNF213 p.R4810K多態性與和基因型頻率相關的所有的缺血性腦中風（ncase（病例數）=16,256）之間發現非偶然的關聯（OR 1.77，95%CI 1.40-2.24，p=1.6×10^-6 ）。關於腦中風發病的平均年齡，較非攜帶者而言於RNF213 p.R4810K多態性中低（62.1±10.0歲：66.0±10.0歲，p=8.7×10^-7 ）。

僅對大動脈動脈粥樣硬化症（ncase=1,256）的患者進行分析，結果，4.0%的患者具有RNF213 p.R4810K多態性，與RNF213 p.R4810K多態性的關聯更顯著（OR 3.10，95%CI 1.98-4.84，p=6.9×10^-7 ；腦中風發病年齡56.9±10.2歲：65.0±9.7歲，p=6.3×10^-5 ）。另外，並未確認到RNF213 p.R4810K多態性、與小血管閉塞症（small-vessel occlusion）（ncase=4,613，OR 1.18，95%CI 0.80-1.72，p=0.403）或心因性腦栓塞症（ncase=710，OR 1.34，95%CI 0.62-2.90，p=0.455；圖2）的非偶然的關聯。於藉由性別而層別化的情況下，該些關聯性於女性中更明顯（男性OR 1.40，95%CI 1.03-1.91，p=0.030，女性OR 2.42，95%CI 1.69-3.45，p=1.3×10^-6 ；圖3）。

圖2是基於腦中風亞型的RNF213 p.R4810K多態性攜帶者與非攜帶者之間的缺血性腦中風的優勢比的森林圖。圖3是基於性別的RNF213 p.R4810K多態性攜帶者與非攜帶者之間的缺血性腦中風的優勢比的森林圖。SE表示標準誤差（standard error）；IV表示逆方差法（inverse variance method）；95%CI表示95%可靠區間；FSR表示福岡腦中風記錄（Fukuoka Stroke registry）；NCVC表示日本國立循環器官疾病中心（National Cerebral and Cardiovascular Center）。

與缺血性腦中風相關的RNF213基因座（染色體17的座標77358945-79358945）的區域圖中，作為該區域的讀序多態性（p=2.6×10^-7 ）是鑑定為rs112735431（RNF213 p.R4810K多態性）（圖4）。

於久山-FSR研究參加者中亦發現同樣的關聯。與對照進行比較，RNF213多態性的攜帶頻率尤其於具有大動脈動脈粥樣硬化症的患者（OR 4.20，95%CI 1.90-9.28，p=3.8×10^-4 ；圖2）中、及女性（OR 3.73，95%CI 1.10-12.73，p=0.035；圖3）中、所有的缺血性腦中風病例（OR 2.90，95%CI 1.39-6.04，p=0.0045）中非偶然地高。關於腦中風發病的平均年齡，較非攜帶者而言於RNF213多態性中存在更低的傾向（66.6±12.4歲：69.8±10.7歲，p=0.058）。

（組合整合分析Combined meta-analysis） 日本的三個研究中的東亞人的綜合整合分析中，於該RNF213 p.R4810K多態性與缺血性腦中風（OR 1.91，95%CI 1.55-2.36，p=1.5×10^-9 ）及大動脈動脈粥樣硬化症（OR 3.88，95%CI 2.55-5.03，p=2.0×10^-13 ；圖2）之間的基因組整體中顯示出非偶然的關聯。於藉由性別而層別化的情況下，在基因組整體中發現非偶然的關聯（男性中OR 1.50，95%CI 1.14-1.98，p=0.004：女性中OR 2.69，95%CI 1.95-3.69，p=1.2×10^-9 ；圖3）。關於腦中風發病的平均年齡，較非攜帶者而言於RNF213多態性中低4.1歲（95%CI 2.7-5.5歲）（p=1.1×10^-8 ；圖5）。

圖5是RNF213 p.R4810K多態性攜帶者與非攜帶者之間的腦中風發病年齡的比較。

關於該研究的主要觀察結果，RNF213 p.R4810K多態性的攜帶頻率於東亞子孫的缺血性腦中風患者、尤其是具有大動脈動脈粥樣硬化症的患者中，較正常對照受試驗體而言非偶然地高。於藉由性別而層別化的情況下，該關聯於女性中更明顯。兩個獨立的樣品中的驗證研究完全支持該些見解。

驗證研究保證基因型與表現型的關聯（genotype-phenotype association）顯示出可信賴的關聯性。該些資料顯示出煙霧病與大動脈動脈粥樣硬化症、即RNF213相關血管症之間的相當大的連續性。

本發明者等人的結果示出缺血性腦中風患者的RNF213 p.R4810K多態性的患病率（prevalence）中的明顯的性別特異差異。已經熟知煙霧病於女性患者中更頻繁地發生，煙霧病的女性相對於男性的比率為約1.8^{24 ）} 。另外，具有顱內動脈狹窄的女性的缺血性腦中風發病的風險高^{26 ）} 。因此，女性的性別及遺傳多態性會相加或相乘地有助於伴有大動脈動脈粥樣硬化症的缺血性腦中風發病。

本發明對於具有RNF213 p.R4810K多態性的受試驗者而言有效，作為受試驗者，並不限定於實施例中所記載的東亞人。

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無

圖1是表示患者選擇順序的流程圖。 圖2是基於腦中風亞型的RNF213 p.R4810K多態性攜帶者與非攜帶者之間的缺血性腦中風的優勢比的森林圖（forest plot）。SE表示標準誤差（standard error）；IV表示逆方差法（inverse variance method）；95%CI表示95%可靠區間；FSR表示福岡腦中風記錄（Fukuoka Stroke registry）；NCVC表示日本國立循環器官疾病中心（National Cerebral and Cardiovascular Center（日本國家顱內與心血管中心））。 圖3是基於性別的RNF213 p.R4810K多態性攜帶者與非攜帶者之間的缺血性腦中風的優勢比的森林圖。SE表示標準誤差（standard error）；IV表示逆方差法（inverse variance method）；95%CI表示95%可靠區間；FSR表示福岡腦中風記錄（Fukuoka Stroke registry）；NCVC表示日本國立循環器官疾病中心（National Cerebral and Cardiovascular Center）。 圖4是與缺血性腦中風相關的RNF213基因座（染色體17的座標77358945-79358945）的區域圖。 圖5是RNF213 p.R4810K多態性攜帶者與非攜帶者之間的腦中風發病年齡的比較。SD表示標准偏差（standard deviation）；IV表示逆方差法（inverse variance method）；95%CI表示95%可靠區間；FSR表示福岡腦中風記錄（Fukuoka Stroke registry）；NCVC表示日本國立循環器官疾病中心（National Cerebral and Cardiovascular Center）。

Claims (4)

1. 一種預測腦梗塞未發病的受檢查者的腦梗塞發病時期的方法，包括： 檢測步驟，對源自腦梗塞未發病的受檢查者的樣品中有無RNF213 p.R4810K基因多態性進行檢測；以及 判定步驟，根據所述檢測步驟中的RNF213 p.R4810K基因多態性的有無，來判定所述受檢查者的腦梗塞發病時期是否比通常早。
2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中於所述檢測步驟中檢測到所述RNF213 p.R4810K基因多態性的情況下，在所述判定步驟中，判斷為所述受檢查者與並不具有所述RNF213 p.R4810K基因多態性的人員相比，腦梗塞發病的風險高。
3. 一種用於預測腦梗塞發病風險的基因標記，包含RNF213 p.R4810K基因多態性。
4. 一種用於預測腦梗塞發病風險的生物標記，包含RNF213 p.R4810K基因所編碼的多肽。

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