TW202024120A - 靶向樹突狀細胞之胞外囊泡及其用途 - Google Patents

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Abstract

本揭露係關於包含靶向部分之經修飾胞外囊泡，例如胞外體，其中該靶向部分可特異性結合至在不同免疫細胞(例如，樹突狀細胞)上表現之標記物。本文亦提供用於使用胞外體治療及/或預防一系列醫學病症之方法。

Description

靶向樹突狀細胞之胞外囊泡及其用途
本揭露係關於包含靶向部分之經修飾胞外囊泡(EV)(例如 ，胞外體)，以及此等EV治療及/或預防一系列醫學病症(諸如癌症)之用途。
EV(例如 ，胞外體)係細胞間通信之重要介體。該等EV亦在診斷及預測許多疾病諸如癌症時為重要生物標記物。作為藥物遞送媒劑，EV(例如 ，胞外體)作為許多治療領域中之新治療模式提供優於傳統藥物遞送方法(例如 ，肽免疫化、DNA疫苗)之許多優勢。然而，儘管許多EV(例如 ，胞外體)具有一定優勢，但是其臨床功效有限。例如，在患有不能進行手術的非小細胞肺癌(NSCLC)之患者中，在II期臨床試驗中，將源自樹突狀細胞之胞外體(DEX)作為一線化學療法之後的維持免疫療法進行研究。然而，因為尚未達到主要端點(在化學療法停止後4個月，無進展存活(PFS)之患者為至少50%)，所以試驗終止。Besse, B.,等人 ,Oncoimmunology 5(4):e1071008 (2015)。
因此，需要新的及更有效的經工程化EV(例如 ，胞外體)，尤其是可特異性靶向特異性免疫細胞之彼等者，以便更好地實現基於EV之技術之治療性用途及其他應用。
本文提供了一種胞外囊泡(EV)，其包含特異性結合至樹突狀細胞之標記物的外源性靶向部分。在某些態樣中，該標記物僅存在於樹突狀細胞上。在一些態樣中，樹突狀細胞包含漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)、骨髓/習知樹突狀細胞1(cDC1)、骨髓/習知樹突狀細胞2(cDC2)、或其任何組合。在某些態樣中，樹突狀細胞為cDC1。
在一些態樣中，標記物包含C-型凝集素域家族9成員A(CLEC9A)蛋白、樹突狀細胞特異性細胞間黏附分子-3-結合非整聯蛋白(DC-SIGN)、CD207、CD40、Clec6、樹突狀細胞免疫受體(DCIR)、DEC-205、凝集素樣經氧化低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)、MARCO、Clec12a、DC-去唾液酸醣蛋白受體(DC-ASGPR)、DC免疫受體2(DCIR2)、Dectin-1、巨噬細胞甘露糖受體(MMR)、BDCA-1(CD303、Clec4c)、Dectin-2、Bst-2(CD317)、或其任何組合。在某些態樣中，標記物包含Clec9a蛋白中之抗原決定基。在某些態樣中，標記物包含C-型凝集素樣域。在一些態樣中，C-型凝集素樣域包含含有SEQ ID NO:1之胺基酸120至233的胺基酸序列。在一些態樣中，標記物包含Clec9a蛋白之胞外區。在某些態樣中，Clec9a蛋白之胞外區包含含有SEQ ID NO:1之胺基酸57至241的胺基酸序列。
在一些態樣中，外源性靶向部分包含微量蛋白、經設計錨蛋白重複蛋白(darpin)、抗運載蛋白(anticalin)、阿德奈汀(adnectin)、適體、肽模擬分子、受體之天然配位體、駱駝科奈米抗體、或其任何組合。在一些態樣中，外源性靶向部分包含全長抗體、單域抗體、僅重鏈抗體(VHH)、單鏈抗體、僅鯊魚重鏈抗體(VNAR)、scFv、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、或其任何組合。在某些態樣中，抗體為單鏈抗體。
在一些態樣中，EV包含將外源性靶向部分連接至EV之支架蛋白。
在一些態樣中，支架蛋白為支架X蛋白。在某些態樣中，支架X蛋白包含前列腺素F2受體負調節子(PTGFRN蛋白)；基礎免疫球蛋白(basigin)(BSG蛋白)；免疫球蛋白超家族成員2(IGSF2蛋白)；免疫球蛋白超家族成員3(IGSF3蛋白)；免疫球蛋白超家族成員8(IGSF8蛋白)；整聯蛋白β-1(ITGB1蛋白)；整聯蛋白α-4(ITGA4蛋白)；4F2細胞表面抗原重鏈(SLC3A2蛋白)；ATP運輸蛋白類別(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4蛋白)、CD13、胺肽酶N(ANPEP)、腦啡肽酶(膜金屬內肽酶；MME)、核苷酸外焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員1(ENPP1)、神經纖毛蛋白-1(NRP1)、CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI錨蛋白、乳凝集素、LAMP2、LAMP2B、其片段、或其任何組合。在一些態樣中，支架X蛋白包含闡明為SEQ ID NO:33之胺基酸序列。在一些態樣中，支架X蛋白包含與SEQ ID NO:1具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%序列同一性之胺基酸序列。
在一些態樣中，本文揭示之EV(例如 ，胞外體)進一步包含支架Y蛋白。在某些態樣中，支架Y蛋白包含肉豆蔻醯化的富丙胺酸之蛋白激酶C受質(MARCKS蛋白)、肉豆蔻醯化的富丙胺酸之蛋白激酶C受質樣1(MARCKSL1蛋白)、腦酸溶性蛋白1(BASP1蛋白)、其片段、及或其任何組合。在一些態樣中，支架Y蛋白為BASP1或其片段。
在一些態樣中，支架Y蛋白包含N端域(ND)及效應域(ED)，其中ND及/或ED與EV之內腔表面締合。在某些態樣中，ND經由肉豆蔻醯化來與胞外體之內腔表面締合。在一些態樣中，ED藉由離子相互作用來與胞外體之內腔表面締合。在其他態樣中，ED包含(i)鹼性胺基酸或(ii)呈一定序列之兩個或兩個以上鹼性胺基酸，其中鹼性胺基酸選自由Lys、Arg、His、及其任何組合組成之群。在一些態樣中，鹼性胺基酸為(Lys)n，其中n為1與10之間的整數。在一些態樣中，ED包含Lys(K)、KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO: 205)、KKKKK(SEQ ID NO: 206)、Arg(R)、RR、RRR、RRRR(SEQ ID NO: 207)；RRRRR(SEQ ID NO: 208)、KR、RK、KKR、KRK、RKK、KRR、RRK、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO: 209)、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO: 210)、或其任何組合。
在一些態樣中，ND包含如在G:X2:X3:X4: X5:X6中闡明之胺基酸序列，其中G表示Gly；其中「:」表示肽鍵，其中X2至X6中之各者獨立地為胺基酸，且其中X6包含鹼性胺基酸。在某些態樣中，(i)X6選自由Lys、Arg、及His組成之群；(ii)X5選自由Pro、Gly、Ala、及Ser組成之群；(iii)X2選自由Pro、Gly、Ala、及Ser組成之群；(iv)X4選自由Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln、及Met組成之群；或(v)(i)-(iv)之任何組合。
在一些態樣中，ND包含胺基酸序列G:X2: X3:X4:X5:X6，其中(i)G表示Gly；(ii)「:」表示肽鍵；(iii)X2為選自由Pro、Gly、Ala、及Ser組成之群的胺基酸；(iv)X3為胺基酸；(v)X4為選自由Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln、及Met組成之群的胺基酸；(vi)X5為選自由Pro、Gly、Ala、及Ser組成之群的胺基酸；且(vii)X6為選自由Lys、Arg、及His組成之群的胺基酸。在一些態樣中，X3選自由Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、及Arg組成之群。
在一些態樣中，ND及ED藉由連接子來連接。在某些態樣中，連接子包含肽鍵或一或多個胺基酸。
在一些態樣中，ND包含選自由以下項組成之群的胺基酸序列：(i)GGKLSKK(SEQ ID NO: 211)、(ii)GAKLSKK(SEQ ID NO: 212)、(iii)GGKQSKK(SEQ ID NO: 213)、(iv)GGKLAKK(SEQ ID NO: 214)、及(vi)其任何組合。在一些態樣中，ND包含選自由以下項組成之群的胺基酸序列：(i)GGKLSKKK(SEQ ID NO: 238)、(ii)GGKLSKKS(SEQ ID NO: 239)、(iii)GAKLSKKK(SEQ ID NO: 240)、(iv)GAKLSKKS(SEQ ID NO: 241)、(v)GGKQSKKK(SEQ ID NO: 242)、(vi)GGKQSKKS(SEQ ID NO: 243)、(vii)GGKLAKKK(SEQ ID NO: 244)、(viii) GGKLAKKS(SEQ ID NO: 245)、及(ix)其任何組合。在某些態樣中，ND包含胺基酸序列GGKLSKK(SEQ ID NO: 211)。
在一些態樣中，支架蛋白之長度為至少約8、至少約9、至少約10、至少約11、至少約12、至少約13、至少約14、至少約15、至少約16、至少約17、至少約18、至少約19、至少約20、至少約21、至少約22、至少約23、至少約24、至少約25、至少約30、至少約35、至少約40、至少約45、至少約50、至少約55、至少約60、至少約65、至少約70、至少約75、至少約80、至少約85、至少約90、至少約95、至少約100、至少約105、至少約110、至少約120、至少約130、至少約140、至少約150、至少約160、至少約170、至少約180、至少約190、或至少約200個胺基酸。
在某些態樣中，支架蛋白包含 (i)GGKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO: 246)、 (ii)GAKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO: 247)、 (iii)GGKQSKKKKGYNVN(SEQ ID NO: 248)、 (iv)GGKLAKKKKGYNVN(SEQ ID NO: 249)、 (v)GGKLSKKKKGYSGG(SEQ ID NO: 250)、 (vi)GGKLSKKKKGSGGS(SEQ ID NO: 251)、 (vii)GGKLSKKKKSGGSG(SEQ ID NO: 252)、 (viii)GGKLSKKKSGGSGG(SEQ ID NO: 253)、 (ix)GGKLSKKSGGSGGS(SEQ ID NO: 254)、 (x)GGKLSKSGGSGGSV(SEQ ID NO: 255)、或 (xi)GAKKSKKRFSFKKS(SEQ ID NO: 256)。
在一些態樣中，支架蛋白在N端處不包含Met。在某些態樣中，支架蛋白在支架蛋白之N端處包含肉豆蔻醯化的胺基酸殘基。在一些態樣中，支架蛋白之N端處之胺基酸殘基為Gly。在某些態樣中，支架蛋白之N端處之胺基酸殘基為合成的。在一些態樣中，支架蛋白之N端處之胺基酸殘基為甘胺酸類似物。
在一些態樣中，本文揭示之EV(例如 ，胞外體)進一步包含治療分子、免疫調節劑、佐劑、或其任何組合。在某些態樣中，治療分子包含抗原。在某些態樣中，治療分子包含免疫抑制劑。在一些態樣中，免疫抑制劑包含反義寡核苷酸。
在一些態樣中，佐劑為干擾素基因刺激物(STING)促效劑、toll樣受體(TLR)促效劑、炎症介體、或其任何組合。在某些態樣中，佐劑為STING促效劑。在一些態樣中，STING促效劑包含環狀二核苷酸STING促效劑或非環狀二核苷酸STING促效劑。
在一些態樣中，佐劑為TLR促效劑。在某些態樣中，TLR促效劑包含TLR2促效劑(例如 ，脂磷壁酸、非典型LPS、MALP-2及MALP-404、OspA、膜孔蛋白、LcrV、脂化甘露聚醣(lipomannan)、GPI錨定物、溶血磷脂醯絲胺酸、脂磷聚醣(LPG)、糖磷脂醯肌醇(GPI)、酵母聚醣、hsp60、gH/gL醣蛋白、紅血球凝聚素)、TLR3促效劑(例如 ，雙鏈RNA，例如 ，聚(I:C))、TLR4促效劑(例如 ，脂多醣(LPS)、脂磷壁酸、β-防禦素2、纖連蛋白EDA、HMGB1、SNAP相關蛋白(snapin)、腱生蛋白C)、TLR5促效劑(例如 ，鞭毛蛋白)、TLR6促效劑、TLR7/8促效劑(例如 ，單鏈RNA、CpG-A、聚G10、聚G3、瑞喹莫德(Resiquimod))、TLR9促效劑(例如 ，非甲基化CpG DNA)、或其任何組合。
在一些態樣中，免疫調節劑包含細胞介素。在某些態樣中，細胞介素包含干擾素。在一些態樣中，EV為胞外體。
在一些態樣中，治療分子、免疫調節劑、佐劑、或其任何組合與支架X或支架Y或其組合締合。在一些態樣中，治療分子與支架X蛋白締合。在某些態樣中，治療分子與支架Y蛋白締合。在一些態樣中，免疫調節劑與支架X蛋白締合。在一些態樣中，免疫調節劑與支架Y蛋白締合。在一些態樣中，其中佐劑與支架X蛋白締合。在某些態樣中，其中佐劑與支架Y蛋白締合。
本文亦揭示一種包含本揭露之EV及醫藥學上可接受之載體的醫藥組成物。本揭露亦提供一種產生本文揭示之EV的細胞。本文亦揭示一種包含一或多個載體之細胞，其中載體包含編碼本文揭示之靶向部分的核酸序列。本文提供包含本揭露之EV的套組。本揭露進一步提供一種製備EV(例如 ，胞外體)之方法，其包含在合適條件下培養本文揭示之細胞且獲得EV。
本揭露進一步提供一種預防或治療有需要之受試者之疾病的方法，其包含向受試者投與本文揭示之EV或本文揭示之醫藥組成物。在一些態樣中，疾病選自癌症、血友病、糖尿病、生長因子缺乏症、眼睛疾病、移植物抗宿主疾病(GvHD)、自體免疫疾病、胃腸道疾病、心血管疾病、呼吸疾病、過敏性疾病、退行性疾病、感染性疾病、纖維變性疾病、或其任何組合。
本文亦提供一種將EV遞送至受試者之方法，其包含向受試者投與本揭露之EV。
在一些態樣中，本文揭示之EV係非經腸、經口、靜脈內、肌肉內、腫瘤內、鼻內、皮下、或腹膜內投與。在一些態樣中，預防或治療疾病之方法或將EV遞送至受試者之方法包含投與額外治療劑。
相關申請案之交互參照
本PCT申請案主張2019年7月3日申請之美國臨時申請案第62/870,574號及2018年8月24日申請之國際申請案第PCT/US2018/048026號的優先權益，兩者以全文引用方式併入本文。 對經由EFS-WEB以電子方式 提交之序列表之參考
本申請案中提交的以電子方式提交之序列表(名稱：4000_066PC02_Seqlisting_ST25.txt，大小：286,490個位元組；及創建日期：2019年8月23日)之內容以全文引用方式併入本文。
本揭露係關於一種包含靶向部分之EV(例如 ，胞外體)，該靶向部分未在該EV中天然地表現且可特異性地將EV靶向至免疫細胞，諸如樹突狀細胞。在一些態樣中，靶向部分特異性地結合至在免疫細胞上表現之標記物。各個態樣之非限制性實例在本揭露中展示。I. 定義
為使本說明書可更容易理解，首先定義某些術語。額外定義在整個實施方式中闡明。
應注意，術語「一(個/種)(a/an)」實體係指一或多個(種)該實體；例如，「一個核苷酸序列(a nucleotide sequence)」應理解為表示一或多個核苷酸序列。因此，術語「一個(種)」、「一或多個(種)」及「至少一個(種)」在本文中可互換使用。
此外，「及/或」在本文中使用時應視為對兩個指定特徵或組分中之各者在存在或不存在另一者之情況下的具體揭示。因此，如在本文於短語諸如「A及/或B」中所用之術語「及/或」時旨在包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)以及「B」(單獨)。同樣地，如在諸如「A、B、及/或C」之短語中使用之術語「及/或」意欲包括以下態樣中之各者：A、B、及C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。
應理解，當在本文中用語言「包含」描述各態樣時，亦提供以「由...組成」及/或「實質上由...組成」之術語描述之其他相似態樣。
除非另外定義，否則本文所用之全部技術及科學術語皆具有本揭露相關領域之熟習此項技藝者通常理解的相同含義。舉例而言，以下出版物為熟習此項技術者提供本揭露中所用的許多術語之綜合詞典：the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 第2版, 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 第3版, 1999, Academic Press；及the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, 修訂版, 2000, Oxford University Press。
單位、前綴及符號皆以其國際單位制(Système International de Unites，(SI))公認形式表示。數值範圍包括定義該範圍之數值。除非另外指出，否則核苷酸序列自左至右以5’至3’方向書寫。胺基酸序列自左至右以胺基至羧基之方向書寫。本文中提供之標題不限制本發明之各種態樣，該等態樣可藉由參考整個說明書得出。因此，即將在下文定義之術語藉由參照說明書全文進行更完整地定義。
術語「約 」在本文中用於意謂近似、大致、大約或在...左右。當術語「約」與數值範圍結合使用時，其藉由將邊界擴展至所述數值以上及以下來修飾該範圍。一般而言，術語「約」可藉由例如向上或向下(增大或降低)10%之變化來修飾高於或低於所述值之數值。
如本文所用，術語「胞外囊泡 (extracellular vesicle) 」或「EV 」係指包含圍住內部空間之膜的細胞衍生之囊泡。胞外囊泡包含所有膜結合之囊泡(例如胞外體、奈米囊泡)，其具有比其所衍生自之細胞較小之直徑。在一些態樣中，胞外囊泡之直徑在20 nm至1000 nm範圍內，且可包含在內部空間(亦即 ，內腔)中、展示在胞外囊泡之外表面上、及/或跨越膜之各種巨分子有效負載。在一些態樣中，有效負載可包含核酸、蛋白、碳水化合物、脂質、小分子、及/或其組合。在一些態樣中，EV包含一或多種有效負載或其他外源性生物活性分子。在一些態樣中，EV包含靶向部分，其對於該EV而言為外源性的(亦即 ，未在該EV中天然地表現)並且允許EV靶向特定免疫細胞(例如 ，樹突狀細胞)群體。在某些態樣中，胞外媒劑可進一步包含一或多個支架部分。舉例而言但不限於，胞外囊泡包括凋亡體、細胞之片段、藉由直接或間接操作(例如，藉由連續擠壓或用鹼性溶液處理)衍生自細胞之囊泡、囊泡化細胞器、以及由活細胞(例如，藉由直接質膜出芽或晚期胞內體與質膜之融合)產生之囊泡。胞外囊泡可衍生自活的或死的生物、外植組織或器官、原核或真核細胞、及/或培養細胞。在一些態樣中，胞外囊泡由表現一或多種轉基因產物之細胞產生。本文揭示之EV經修飾且因此不包含天然存在之EV。
如本文使用，術語「胞外體 (exosome) 」係指直徑在20-300 nm之間(例如，40-200 nm之間)之胞外囊泡。胞外體包含住內部空間(亦即，內腔)之膜，且在一些態樣中，可藉由直接質膜出芽或藉由晚期胞內體與質膜之融合由細胞(例如，生產細胞)產生。在一些態樣中，胞外體包含一或多個外源生物活性分子(例如，如本文所述)。在一些態樣中，本文揭示之胞外體包含胞外體外源性(亦即，未在胞外體中天然地表現)且使該胞外體靶向特定免疫細胞(例如，樹突狀細胞)群體之靶向部分。在某些態樣中，胞外體進一步包含一或多個支架部分。如以上所述，胞外體可源自生產細胞且可基於其尺寸、密度、生物化學參數或其組合而自生產細胞分離。在一些態樣中，本揭露之胞外體由表現一或多種轉殖基因產物之細胞產生。本揭露之胞外體經修飾且因此不包含天然存在之胞外體。
如本文使用，術語「奈米囊泡 (nanovesicle) 」係指直徑在20-250 nm之間(例如 ，30-150 nm之間)之胞外囊泡且藉由直接或間接操作而自細胞(例如 ，生產細胞)中產生以致於在無操作之情況下，該細胞不產生奈米囊泡。用以產生奈米囊泡之細胞之適當操作包括但不限於連續擠壓、用鹼性溶液處理、音波處理、或其組合。在一些態樣中，產生奈米囊泡可導致生產細胞之破壞。在一些態樣中，本文所述奈米囊泡之群體實質上不含經由自質膜直接出芽或晚期胞內體與質膜融合而衍生自細胞之囊泡。在一些態樣中，奈米囊泡包含一或多種外源性生物活性分子(例如 ，本文揭示)。在一些態樣中，奈米囊泡可進一步包含靶向部分，其對於該奈米囊泡而言為外源性的(亦即 ，未在該奈米囊泡中天然地表現)且允許奈米囊泡靶向特定免疫細胞(例如 ，樹突狀細胞)群體。在某些態樣中，奈米囊泡進一步包含一或多個支架部分。奈米囊泡一旦衍生自生產細胞，便可基於其尺寸、密度、生物化學參數、或其組合而自生產細胞中分離。如本文使用，奈米囊泡經修飾並且因此不包含天然存在之奈米囊泡。
如本文使用，術語「表面工程化 EV (surface-engineered EV)(例如 ，胞外體)」(例如 ，支架X工程化EV，例如 ，胞外體)係指具有在組成上經修飾之膜或表面的EV(例如 ，胞外體)，以使得工程化EV(例如 ，胞外體)之膜或表面不同於修飾前之EV或天然存在之EV。工程化可係在EV(例如 ，胞外體)之表面上或在EV(例如 ，胞外體)之膜中以使得EV(例如 胞外體)之表面得以改變。例如，膜在其蛋白、脂質、小分子、碳水化合物等 之組成上經修飾。該組成物可藉由化學、物理、或生物方法來改變或自先前或同時藉由化學、物理、或生物方法修飾之細胞產生而改變。具體而言，該組成物可藉由遺傳工程化來改變或自先前藉由遺傳工程化修飾之細胞產生而改變。在一些態樣中，表面工程化EV(例如 胞外體)包含一或多種外源性生物活性分子。在某些態樣中，外源性生物活性分子可包含外源性蛋白(亦即 ，EV(例如 胞外體)未天然地表現之蛋白)或其片段或變異體，其可暴露於EV(例如 胞外體)之表面，或可為在EV(例如 胞外體)之表面上暴露之部分的錨定點(連接物)。在其他態樣中，表面工程化EV(例如 胞外體)包含更高表現(例如 ，更高數目)之天然胞外體蛋白(例如 ，支架X)或其片段或變異體，其可暴露於EV(例如 胞外體)之表面，或可為在EV(例如 胞外體)之表面上暴露之部分的錨定點(連接物)。
如本文使用，術語「內腔工程化胞外體 (lumen-engineered exosome) 」(例如 ，支架Y工程化胞外體)係指EV(例如 胞外體)，其中該EV(例如 胞外體)之膜或內腔在組成上經修飾，以使得工程化EV(例如 胞外體)之內腔不同於修飾前之EV(例如 胞外體)或天然存在之EV(例如 胞外體)。工程化可直接在EV(例如 胞外體)之內腔中或膜中以使得EV(例如 胞外體)之內腔得以改變。例如，膜在其蛋白、脂質、小分子、碳水化合物等 之組成上經修飾，以使得EV(例如 胞外體)之內腔得以修飾。該組成物可藉由化學、物理、或生物方法來改變或自先前藉由化學、物理、或生物方法修飾之細胞產生而導致改變。具體而言，該組成物可藉由遺傳工程化來改變或自先前藉由遺傳工程化修飾之細胞產生而改變。在一些態樣中，內腔工程化胞外體包含一或多種外源性生物活性分子。在某些態樣中，外源性生物活性分子可包含外源性蛋白(亦即 ，EV(例如 胞外體)未天然地表現之蛋白)或其片段或變異體，其可暴露於EV(例如 胞外體)之內腔中，或可為在EV(例如 胞外體)之內層上暴露之部分的錨定點(連接物)。在其他態樣中，內腔工程化EV(例如 胞外體)包含更高表現之天然胞外體蛋白(例如 ，支架X或支架Y)或其片段或變異體，其可暴露於胞外體之內腔或可為在胞外體之內腔中暴露之部分的錨定點(連接物)。
當在本文所述EV(例如 胞外體)之情形中使用時，術語「經修飾 (modified) 」係指EV(例如 胞外體)及/或其生產細胞之變更或工程化，以使得經修飾EV(例如 胞外體)不同於天然存在之EV(例如 胞外體)。在一些態樣中，經修飾之本文所述EV(例如 胞外體)包含在蛋白、脂質、小分子、碳水化合物等 之組成上與天然存在之EV(例如 胞外體)之膜相比有所不同的膜(例如 ，膜包含更高密度或數目之天然胞外體蛋白且/或膜包含未天然地存在於胞外體中之多種(例如 ，至少兩種)生物活性分子(例如 ，治療分子(例如 ，抗原)、靶向部分、佐劑、及/或免疫調節劑)。如本文使用，未天然地存在於胞外體中之生物活性分子亦描述為「外源性生物活性分子 」。在某些態樣中，對於膜之此類修飾改變EV(例如 胞外體)(例如 ，表面工程化EV，例如 ，本文所述胞外體)之外表面。在某些態樣中，對於膜之此類修飾改變EV(例如 胞外體)(例如 ，內腔工程化EV，例如 ，本文所述胞外體)之內腔。
如本文使用，術語「結合部分 (binding moiety) 」、「生物分佈改良劑 (bio-distribution modifying agent )」及「靶向部分 (targeting moiety) 」係可互換的且係指可改良胞外囊泡(例如 ，胞外體、奈米囊泡)在活體內 或在活體外 (例如 ，在不同品種之細胞的混合培養物中)之分佈的試劑。靶向部分可為生物分子，諸如蛋白、肽、脂質、或合成分子。例如，靶向部分可為抗體(例如 ，抗-CD22奈米抗體)、合成聚合物(例如 ，PEG)、天然配位體(例如 ，CD40L、白蛋白)、重組蛋白(例如 ，XTEN)，但不限於此。不受任何特定理論約束，本文揭示之靶向部分可藉由結合至在特定細胞類型(例如 ，癌細胞或某一組織所特有之細胞)上表現之標記物(在本文中亦稱為「靶分子 」)來改良EV(例如 ，胞外體)之分佈。在一些態樣中，本文揭示之靶向部分結合至特定免疫細胞(例如 ，樹突狀細胞)群體之標記物。在某些態樣中，標記物僅在所關注之免疫細胞群體上表現。在一些態樣中，標記物包含C-型凝集素域家族9成員A(CLEC9A)蛋白、樹突狀細胞特異性細胞間黏附分子-3-結合非整聯蛋白(DC-SIGN)、CD207、CD40、Clec6、樹突狀細胞免疫受體(DCIR)、DEC-205、凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)、MARCO、Clec12a、DC-去唾液酸醣蛋白受體(DC-ASGPR)、DC免疫受體2(DCIR2)、Dectin-1、巨噬細胞甘露糖受體(MMR)、BDCA-1(CD303、Clec4c)、Dectin-2、Bst-2(CD317)、或其任何組合。在某些態樣中，靶向部分在EV(例如 ，胞外體)之表面上展示。在一些態樣中，靶向部分可藉由融合至支架蛋白(例如 ，支架X)(例如 ，以經遺傳編碼之融合分子形式)在EV表面上展示。在其他態樣中，靶向部分可藉由將靶向部分連接至EV表面分子之化學反應而在EV表面上展示。非限制性實例為聚乙二醇化。在一些態樣中，本文揭示之靶向部分可與功能性部分，諸如小分子(例如 ，STING、ASO)、藥物、及/或治療蛋白(例如 ，抗間皮蛋白抗體/促細胞凋亡蛋白)組合。
如本文使用，術語「C- 型凝集素域家族 9 成員 A(C-type lectin domain family 9 member A) 」(Clec9a )蛋白係指V組C-型凝集素樣受體(CTLR)，其充當活化受體且在骨髓譜系細胞(例如 ，DC)中表現。Huysamen等人 , J Biol Chem 283(24):16693-701(2008)；美國專利第9,988,431 B2號，該等文獻各自以全文引用方式併入本文。Clec9a之同義詞為已知的且包括CD370、DNGR-1、5B5、HEEE9341、及含有C-型凝集素域之9A。在一些態樣中，Clec9a蛋白在人類cDC1細胞上表現。在一些態樣中，Clec9a蛋白在小鼠cDC1及pDC細胞上表現。除非另外指示，如本文使用之Clec9a可意指來自一或多個物種(例如 ，人類、非人類靈長類動物、犬、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、及熊)之Clec9a。
如本文使用，術語「C- 型凝集素樣域 (C-type lectin like domain) 」(CTLD)係指與C-型凝集素之碳水化合物識別域(CRD)同源，或具有與原型C-型凝集素CRD之結構類似之結構的蛋白域。Zelensky等人 ,FEBS J 272(24):6179-217(2005)。最初，CTLD域被鑒別為所謂C-型凝集素(鈣依賴性碳水化合物結合蛋白)共有之域且命名為「碳水化合物識別域」(「CRD」)。最近，已顯而易見的是，此域在許多真核蛋白之間共享，其中若干蛋白不結合糖部分，且因此，該標準域被命名為CTLD。已報道CTLD結合廣泛多種化合物，包括碳水化合物、脂質及蛋白。CTLD由大約120胺基酸殘基組成且特徵性地含有兩或三個鏈內二硫橋鍵。雖然來自不同蛋白之CTLD之間的在胺基酸序列水準下之相似性相對較低，但是發現許多CTLD之3D結構為高度保守的，且結構變異性實質上局限於通常藉由多達五個環定義之所謂環區。參見 美國公開案第2013/0273150號，其以全文引用方式併入本文。
如本文使用，術語「C- 型凝集素 (C-type lectins )」係指含有至少一個C-型凝集素域(CTLD)之蛋白超家族，該等蛋白根據其CTLD之排列而分類成組。Huysamen等人 , J Biol Chem 283(24):16693-701(2008)。目前，C-型凝集素歸類為17個不同C-型凝集素組(I-XVII組)。Zelensky等人 ,FEBS J 272(24):6179-217(2005)。
如本文使用，術語「支架部分 (scaffold moiety )」係指可用於將有效負載或所關注的任何其他外源性生物活性分子(例如 ，靶向部分、佐劑、及/或免疫調節劑)在EV(例如 胞外體)之內腔表面或外表面上錨定至EV(例如 胞外體)的分子。在某些態樣中，支架部分包含合成分子。在一些態樣中，支架部分包含非多肽部分。在其他態樣中，支架部分包含脂質、碳水化合物、或天然地存在於EV(例如 胞外體)中之蛋白。在一些態樣中，支架部分包含脂質、碳水化合物、或未天然地存在於EV(例如 胞外體)中之蛋白。在某些態樣中，支架部分為支架X。在一些態樣中，支架部分為支架Y。在其他態樣中，支架部分包含支架X及支架Y。可用於本揭露之其他支架部分之非限制性實例包括：胺肽酶N(CD13)；腦啡肽酶，亦稱為AKA膜金屬內肽酶(MME)；核苷酸外焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員1(ENPP1)；神經纖毛蛋白-1(NRP1)；CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI錨蛋白、乳凝集素、LAMP2、及LAMP2B。
如本文所用，術語「支架 X(Scaffold X )」係指近來已在胞外體之表面上經鑑別之胞外體蛋白。參見例如 美國專利第10,195,290號，其以全文引用方式併入本文。支架X蛋白之非限制性實例包括：前列腺素F2受體負調節子(「PTGFRN蛋白」)；基礎免疫球蛋白(「BSG蛋白」)；免疫球蛋白超家族成員2(「IGSF2蛋白」)；免疫球蛋白超家族成員3(「IGSF3蛋白」)；免疫球蛋白超家族成員8(「IGSF8蛋白」)；整聯蛋白β-1(「ITGB1蛋白」)；整聯蛋白α-4(「ITGA4蛋白」)；4F2細胞表面抗原重鏈(「SLC3A2蛋白」)；及ATP運輸蛋白類別(「ATP1A1蛋白」、「ATP1A2蛋白」、「ATP1A3蛋白」、「ATP1A4蛋白」、「ATP1B3蛋白」、「ATP2B1蛋白」、「ATP2B2蛋白」、「ATP2B3蛋白」、「ATP2B蛋白」)。在一些態樣中，支架X蛋白可為完整蛋白或其片段(例如 ，功能性片段，例如 ，能夠將另一部分錨定在EV(例如 胞外體)之外表面或內腔表面上的最小片段)。在一些態樣中，支架X可將外源性蛋白(例如 ，本文揭示之彼等者，例如 ，靶向部分、治療分子、佐劑、及/或免疫調節劑)錨定至胞外體之外表面或內腔表面。
如本文使用，術語「支架 Y (Scaffold Y )」係指最近在胞外體之內腔中鑑別之胞外體蛋白。參見例如 國際申請案第PCT/US2018/061679號，其以全文引用方式併入本文。支架Y蛋白之非限制性實例包括：肉豆蔻醯化的富丙胺酸之蛋白激酶C受質(「MARCKS蛋白」)；肉豆蔻醯化的富丙胺酸之蛋白激酶C受質樣1(「MARCKSL1蛋白」)；及腦酸溶性蛋白1(「BASP1蛋白」)。在一些態樣中，支架Y蛋白可為完整蛋白或其片段(例如 ，功能性片段，例如 ，能夠將某一部分錨定至胞外體之內腔表面的最小片段)。在一些態樣中，支架Y可將外源性蛋白(例如 ，本文揭示之彼等者，例如 ，靶向部分、治療分子、佐劑、及/或免疫調節劑)錨定至EV(例如 胞外體)之內腔表面。
如本文所用，術語蛋白質(例如治療性蛋白、支架X或支架Y)之「片段 (fragment )」係指比天然存在之序列更短、與天然存在之蛋白質相比缺失N及/或C末端或缺失蛋白質之任何部分的蛋白質之胺基酸序列。如本文所用，術語「功能性片段 (functional fragment) 」係指保留蛋白質功能之蛋白質片段。因此，在一些態樣中，支架X蛋白之功能性片段保留將某一部分錨定在EV(例如 胞外體)之內腔表面或外表面上的能力。類似地，在某些態樣中，支架Y蛋白之功能性片段保留將某一部分錨定在EV(例如 胞外體)之內腔表面上的能力。片段是否為功能性片段可藉由在此項技術中已知用以確定EV(例如 胞外體)之蛋白質含量之任何方法來評估，包括西方墨點法、FACS分析及片段與自體螢光蛋白例如 GFP之融合。在某些態樣中，支架X蛋白之功能性片段保留至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%的天然存在之支架X蛋白之能力，例如 ，錨定某一部分之能力。在一些態樣中，支架Y蛋白之功能性片段保留至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%的天然存在之支架Y蛋白之能力，例如 ，錨定另一分子之能力。
如本文使用，術語分子(例如 ，功能性分子、治療分子、支架X及/或支架Y)之「變異體 (variant )」係指在藉由此項技術中已知之方法來比較時，與另一分子共享某些結構及功能同一性的分子。例如，蛋白質之變異體可包括在另一蛋白質中之取代、插入、缺失、框移或重排。
在一些態樣中，支架X之變異體包含與全長成熟PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、或ATP運輸蛋白或PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、或ATP運輸蛋白之片段(例如 ，功能性片段)具有至少約70%同一性的變異體。在一些態樣中，PTGFRN之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:1之PTGFRN或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，BSG之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:9之BSG或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，IGSF2之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:34之IGSF2或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，IGSF3之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:20之IGSF3或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，IGSF8之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:14之IGSF8或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，ITGB1之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:21之ITGB1或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，ITGA4之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:22之ITGA4或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，SLC3A2之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:23之SLC3A2或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，ATP1A1之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:24之ATP1A1或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，ATP1A2之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:25之ATP1A2或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，ATP1A3之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:26之ATP1A3或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，ATP1A4之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:27之ATP1A4或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，ATP1B3之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:28之ATP1B3或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，ATP2B1之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:29之ATP2B1或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，ATP2B2之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:30之ATP2B2或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，ATP2B3之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:31之ATP2B3或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，ATP2B4之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:32之ATP2B4或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，本文揭示之支架X蛋白之變異體或片段之變異體保留特異性靶向EV(例如 胞外體)之能力。在一些態樣中，支架X包括一或多個突變，例如，保守胺基酸取代。
在一些態樣中，支架Y之變異體包含與MARCKS、MARCKSL1、BASP1或MARCKS、MARCKSL1、或BASP1之片段具有至少70%同一性之變異體。在一些態樣中，MARCKS之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:47之MARCKS或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，MARCKSL1之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:48之MARCKSL1或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，BASP1之變異體或片段之變異體與根據SEQ ID NO:49之BASP1或與其功能片段共享至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些態樣中，支架Y蛋白之變異體或片段之變異體保留特異性靶向內腔表面EV(例如 胞外體)之能力。在一些態樣中，支架Y包括一或多個突變，例如 ，保守胺基酸取代。
「保守胺基酸取代」為用具有相似側鏈之胺基酸殘基置換胺基酸殘基的取代。具有相似側鏈之胺基酸殘基的家族已在此項技術中經定義，包括鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺、絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支鏈側鏈(例如，酥胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳香族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，若多肽中之胺基酸經來自同一側鏈家族之另一胺基酸置換，則該取代被視為保守的。在另一態樣中，一串胺基酸可用在側鏈家族成員之順序及/或組成上有所不同的在結構上類似之串來進行保守置換。
介於兩個多核苷酸或多肽序列之間的術語「序列同一性百分比」或「同一性百分比」係指在比較窗上由序列所共有的相同匹配位置之數目，慮及為了兩個序列之最佳比對而必須引入之添加或缺失(亦即缺口)。匹配位置為在靶序列與參照序列中皆存在之相同核苷酸或胺基酸的任何位置。存在於靶序列中之缺口不計數在內，因為缺口不為核苷酸或胺基酸。同樣，存在於參照序列中之缺口不計數在內，因為計數靶序列核苷酸或胺基酸，而非來自參照序列之核苷酸或胺基酸。
藉由確定兩個序列中存在的相同胺基酸殘基或核酸鹼基所處之位置數目以產生相匹配位置之數目，將相匹配位置之數目除以比較窗中的位置總數，結果乘100產生序列同一性百分比。比較序列及判定兩個序列之間的序列一致性百分比可使用供在線使用及供下載的易於獲得的軟體完成。合適的軟體程式可由各種來源獲得，並且係用於兩個蛋白質及核苷酸序列之比對。確定序列同一性百分比之一合適程式為bl2seq，作為可獲自美國政府之National Center for Biotechnology Information BLAST網址(blast.ncbi.nlm.nih.gov)的程式之BLAST套件之一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法進行兩個序列之間的比較。BLASTN係用於比較核酸序列，而BLASTP係用於比較胺基酸序列。其他合適的程式為例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，作為生物資訊學程式之EMBOSS套件之一部分且亦可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa下獲自European Bioinformatics Institute(EBI)。
在同多核苷酸或多肽參照序列比對的單一多核苷酸或多肽靶序列內之不同區域可各自具有其自身序列同一性百分比。應注意，序列同一性百分比值可四捨五入為最近的十分位。舉例而言，80.11、80.12、80.13及80.14可四捨五入為80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18及80.19可四捨五入為80.2。亦應注意，長度值將總是整數。
熟習此項技術者應理解，用於計算序列同一性百分比的序列比對之產生不限於由一級序列資料排外地驅動之二級序列-序列比較。序列比對可由多重序列比對獲得。產生多重序列比對之一合適程式為ClustalW2，可獲自www.clustal.org。另一合適的程式為MUSCLE，可獲自www.drive5.com/muscle/。ClustalW2及MUSCLE可替代地獲自例如EBI。
亦應理解，序列比對可藉由將序列資料與來自異質來源之資料諸如結構資料(例如蛋白質結晶結構)、功能資料(例如突變之位置)或種系發生資料整合在一起而產生。整合異質資料以產生多重序列比對之合適的程式為T-Coffee，可獲自www.tcoffee.org，且替代地可獲自例如EBI。亦應理解，用於計算序列一致性百分比之最終比對可自動地或人工地加以驗證。
多核苷酸變異體可含有在編碼區、非編碼區或這兩者中之變更。在一態樣中，多核苷酸變異體含有產生沉默取代、添加、或缺失，但不改變所編碼多肽之性質或活性的變更。在另一態樣中，核苷酸變異體藉由因遺傳密碼之簡並性所導致的沉默取代而產生。在其他態樣中，5-10個、1-5個、或1-2個胺基酸以任何組合來進行取代、缺失、或添加之變異體。多核苷酸變異體可出於多種原因，例如為了使特定宿主之密碼子表現最佳化(使人類mRNA中之密碼子變成其他密碼子，例如細菌宿主諸如大腸桿菌(E. coli ))而產生。
天然存在之變異體係稱為「對偶基因變異體」，且係指佔據生物之染色體上的給定基因座的基因之若干替代形式(Genes II, Lewin, B. 編著, John Wiley & Sons, New York(1985))。此等對偶基因變異體可在多核苷酸及/或多肽水準上變化且包括在本揭露中。或者，非天然存在之變異體可藉由突變誘發技術或藉由直接合成來產生。
使用蛋白質工程化及重組DNA技術之已知方法，可產生變異體以改良或更改多肽之特徵。例如，可自分泌蛋白質之N端或C端缺失一或多個胺基酸而不實質性損失生物功能。Ron等人 ,J. Biol.Chem. 268: 2984-2988(1993)(其以全文引用方式併入本文)報道即使在缺失3、8、或27個胺基端胺基酸殘基後仍具有肝素結合活性的變異體KGF蛋白。類似地，干擾素γ在缺失來自此蛋白質之羧基端的8-10個胺基酸殘基之後呈現高達十倍更高之活性。(Dobeli等人,J. Biotechnology 7 :199-216(1988)，其以全文引用方式併入本文。)
此外，有充分的證據表明變異體常常保留類似於天然存在之蛋白質的生物活性。例如，Gayle及合作者(J. Biol.Chem 268 :22105-22111(1993)，其以全文引用方式併入本文)進行人類細胞介素IL-1a之廣泛突變分析。他們使用隨機誘變以產生超過3,500個單獨的IL-1a突變體，每個變異體在分子之全長上有平均2.5個胺基酸變化。在每個可能的胺基酸位置處檢查多個突變。研究者發現「大部分分子可在對結合或生物活性幾乎沒有影響之情況下變更([m]ost of the molecule could be altered with little effect on either [binding or biological activity])。」(參見摘要。)實際上，在超過3,500個所檢查的核苷酸序列中僅有23個獨特的胺基酸序列產生在活性上顯著不同於野生型之蛋白質。
如上所述，多肽變異體包括例如經修飾之多肽。修飾包括例如乙醯化、醯化、ADP核醣化、醯胺化、黃素之共價連接、血紅素部分之共價連接、核苷酸或核苷酸衍生物之共價連接、脂質或脂質衍生物之共價連接、磷脂醯肌醇之共價連接、交聯、環化、二硫鍵形成、去甲基、共價交聯之形成、半胱胺酸之形成、焦麩胺酸之形成、甲醯化、γ-羧化、醣化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻醯化(myristoylation)、氧化、聚乙二醇化(Mei等人,Blood 116:270-79(2010)，其以全文引用之方式併入本文中)、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、轉送RNA介導的向蛋白質中添加胺基酸諸如精胺醯化、以及泛蛋白化。在一些態樣中，支架X及/或支架Y在任何便利的位置處經修飾。
如本文使用術語「連接至 (linked to )」、「偶聯至 (conjugated to )」及「錨定至 (anchored to )」可互換使用且係指在第一部分與第二部分之間，例如 支架X與本文揭示之靶向部分之間所形成的共價或非共價鍵。
術語「經囊封 (encapsulated) 」或該術語之語法上不同形式(例如 ，囊封作用(encapsulation)、或囊封(encapsulating))，係指在無需化學或物理連接兩個部分的情況下，使第一部分(例如 ，外源性生物活性分子，例如 ，治療分子、佐劑、或免疫調節劑)處於第二部分(例如 ，EV，例如 ，胞外體)內部的狀態或過程。在一些態樣中，術語「經囊封 」可與「處於 … 內腔中 (in the lumen of )」互換使用。將第一部分(例如 ，外源性生物活性分子，例如 ，治療分子、佐劑、或免疫調節劑)囊封至第二部分(例如 ，EV，例如 ，胞外體)中之非限制性實例在本文中別處得以揭示。
如本文使用，術語「生產細胞 (producer cell) 」係指用於產生EV(例如 胞外體)之細胞。生產細胞可為活體外 培養之細胞或活體內 之細胞。生產細胞包括但不限於已知有效產生EV(例如 胞外體)之細胞，例如 HEK293細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、間質幹細胞(MSC)、BJ人類包皮纖維母細胞、fHDF纖維母細胞、AGE.HN® 神經元前驅細胞、CAP® 羊水細胞、脂肪間質幹細胞、RPTEC/TERT1細胞。在某些態樣中，生產細胞不為抗原呈遞細胞。在一些態樣中，生產細胞不為樹突狀細胞、B細胞、肥大細胞、巨噬細胞、嗜中性球、Kupffer-Browicz細胞、衍生自此等細胞中之任一者之細胞、或其任何組合。在一些態樣中，在本揭露中有用之EV(例如 胞外體)未在暴露於EV(例如 胞外體)表面上之MHC I類或II類分子上攜帶抗原，反而可能在EV(例如 胞外體)之內腔中或在EV(例如 胞外體)之表面上藉由連接至支架X及/或支架Y而攜帶抗原。
如本文使用，「MHC I 類分子 (MHC class I molecule) 」係指編碼MHC I類分子之野生型或變異體HLA I類基因之蛋白產物。因此，「HLA I 類分子 (HLA class I molecule) 」及「MHC I 類分子 」在本文中可互換使用。
MHC I類分子為兩個主要類別的主要組織相容性複合物(MHC)分子之一(另一類別為MHC II類)且存在於有顎脊椎動物身體中之所有有核細胞之細胞表面上。它們亦出現在血小板上，但不出現在紅血球上。其功能係將來自細胞內部之蛋白之肽片段呈現給細胞毒性T細胞；此舉觸發自免疫系統針對藉助於MHC I類蛋白呈現之特定非自體抗原之立即反應。因為MHC I類分子呈遞衍生自細胞質蛋白之肽，所以MHC I類呈遞途徑通常被稱為細胞質或內源性途徑。
在人類中，對應於MHC I類之HLA為HLA-A、HLA-B、及HLA-C。MHC I類分子包含兩條蛋白鏈：α鏈及β2-微球蛋白(β2m)鏈。人類β2m藉由B2M基因編碼。I類MHC分子結合主要由藉由蛋白酶體降解細胞質蛋白所產生的肽。然後，MHC I:肽複合物經由內質網插入細胞外部質膜中。抗原決定基肽結合在I類MHC分子之胞外部分上。因此，I類MHC之功能係將細胞內蛋白呈現給細胞毒性T細胞(CTL)。然而，I類MHC亦可在稱為交叉呈遞之過程中呈遞自外源性蛋白產生之肽。
正常細胞將來自正常細胞蛋白轉換之肽呈現在其I類MHC上，且因中樞及周邊耐受機制而導致CTL不響應於該等肽而被活化。當細胞表現外來蛋白時，諸如在病毒感染後，一部分I類MHC將此等肽呈現在細胞表面上。因此，對於MHC:肽複合物具有特異性之CTL將識別且殺死呈遞細胞。或者，I類MHC本身可充當自然殺手細胞(NK)之抑制性配位體。作為由一些病毒及某些腫瘤用於逃避CTL反應之機制，表面I類MHC之正常水準降低會啟動NK細胞殺傷。
如本文使用，「MHC II 類分子 (MHC class II molecule) 」係指編碼MHC II類分子之野生型或變異體HLA II類基因的蛋白產物。因此，「HLA II 類分子 (HLA class II molecule) 」及「MHC II 類分子 」在本文中可互換使用。
MHC II類分子為通常僅存在於專門抗原呈遞細胞諸如樹突狀細胞、單核吞噬細胞、一些內皮細胞、胸腺上皮細胞、及B細胞上之一種類別的主要組織相容性複合物(MHC)分子。此等細胞在引發免疫反應中為至關重要的。藉由II類肽呈遞之抗原衍生自胞外蛋白(而非如在MHC I類中一般衍生自細胞質)。
如同MHC I類分子，II類分子亦為異二聚體，但在此情況下由均在MHC中編碼之兩個同源肽，亦即α鏈及β鏈組成。子名稱α1、α2等係指HLA基因中之單獨域；各域通常由基因中之不同外顯子編碼，且一些基因具有編碼前導序列、跨膜序列等之其他域。此等分子具有胞外區以及跨膜序列及胞質尾區。該等鏈之α1及β1區域融合在一起以產生膜遠側肽結合域，而該等鏈之其餘胞外部分α2及β2區域形成膜近側免疫球蛋白樣域。抗原或肽結合於其中之抗原結合凹槽由兩個α-螺旋壁及β-褶板組成。因為MHC II類分子之抗原結合凹槽在兩端敞開，而I類分子上之對應凹槽在各末端處閉合，所以由MHC II類分子呈遞之抗原更長，通常為15與24個胺基酸殘基之間的長度。MHC II類分子之負載藉由吞噬作用來發生；將胞外蛋白內吞、在溶酶體中消化，且將所得抗原決定性肽片段負載至MHC II類分子上，然後使其遷移至細胞表面。在人類中，MHC II類蛋白複合物由人類白血球抗原基因複合物(HLA)編碼。對應於MHC II類之HLA為HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、及HLA-DR。HLA基因複合物中之突變可導致裸淋巴球症候群(BLS)，其為一種類型的MHC II類缺乏症。
如本文使用，術語「分離 (isolate) 」、「經分離 (isolated) 」及「分離 (isolating) 」或「純化 (purify) 」、「經純化 (purified) 」及「純化 (purifying) 」以及「經提取 (extracted) 」及「提取 」可互換使用且係指所需EV之製備狀態(例如複數個已知或未知量及/或濃度)，該等EV已經歷純化之一或多個過程，例如，所需EV製劑之選擇或富集。在一些態樣中，如本文使用之分離或純化為自含有生產細胞之樣品中移除、部分移除(例如， 一部分)EV之過程。在一些態樣中，經分離之EV組成物不具有可偵測之非所需活性，或替代地，非所需活性之水準或量等於或低於可接受之水準或量。在其他態樣中，經分離之EV組成物具有等於或高於可接受量及/或濃度的所需EV之量及/或濃度。在其他態樣中，經分離之EV組成物與獲得該組成物之起始材料(例如， 生產細胞製劑)相比得以富集。此富集與起始材料相比可提高了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%、99.999%、99.9999%、或大於99.9999%。在一些態樣中，經分離之EV製劑實質上不含殘餘生物製品。在一些態樣中，經分離之EV製劑100%不含、99%不含、98%不含、97%不含、96%不含、95%不含、94%不含、93%不含、92%不含、91%不含、或90%不含任何污染性生物物質。殘餘生物製品可包括非生物材料(包括化學品)或不需要的核酸、蛋白質、脂質或代謝物。實質上不含殘餘生物製品亦可意指EV組成物不包含可偵測之生產細胞且僅EV為可偵測的。
如本文使用，術語「免疫調節劑 (immune modulator )」係指作用於與胞外囊泡接觸之靶標(例如 ，靶細胞)上且調控免疫系統之藥劑。可引入EV(例如 ，胞外體)及/或生產細胞中之免疫調節劑之非限制性實例包括諸如檢查點抑制劑之調節劑、檢查點抑制劑之配位體、細胞介素、其衍生物、或其任何組合之藥劑。免疫調節劑亦可包括促效劑、拮抗劑、抗體、抗原結合片段、多核苷酸，諸如siRNA、miRNA、lncRNA、mRNA、DNA、或小分子。
如本文使用，術語「有效負載 (payload) 」係指作用於與EV接觸之靶標(例如 ，靶細胞)之藥劑。可包括在EV(例如 胞外體)上之有效負載之非限制性實例為治療分子(例如 ，抗原或免疫抑制劑)、佐劑、及/或免疫調節劑。可引入EV(例如 胞外體)、及/或生產細胞中之有效負載包括諸如核苷酸(例如 ，包含可偵測部分或毒素或破壞轉錄之核苷酸)、核酸(例如 ，編碼多肽諸如酶之DNA或mRNA分子，或具有調控功能之RNA分子諸如miRNA、dsDNA、lncRNA、及siRNA)、胺基酸(例如 ，包含可偵測部分或毒素或破壞轉譯之胺基酸)、多肽(例如 ，酶)、脂質、碳水化合物、及小分子(例如 ，小分子藥物及毒素)之藥劑。在某些態樣中，有效負載包含外源性生物活性分子(例如 ，本文揭示之彼等者)。
如本文使用，術語「生物活性分子 (biologically active molecule) 」係指在生物系統(例如 ，細胞或人類受試者)中具有活性之藥劑，包括但不限於蛋白、多肽或肽，包括但不限於結構蛋白、酶、細胞介素(諸如干擾素及/或白介素)；抗生素；多株或單株抗體、或其有效部分，諸如Fv片段，該抗體或其部分可為天然、合成或人源化的；肽激素、受體、信號轉導分子或其他蛋白；如以下定義之核酸，包括但不限於寡核苷酸或經修飾寡核苷酸、反義寡核苷酸或經修飾反義寡核苷酸、cDNA、基因組DNA、人工或天然染色體(例如，酵母人工染色體)或其一部分；RNA，包括mRNA、tRNA、rRNA或核酶、或肽核酸(PNA)；病毒或病毒樣粒子；核苷酸或核糖核苷酸或其合成類似物，其可經修飾或未經修飾；胺基酸或其類似物，其可經修飾或未經修飾；非肽(例如，類固醇)激素；蛋白聚醣；脂質；或碳水化合物。在某些態樣中，生物活性分子包含治療分子(例如 ，抗原)、靶向部分(例如 ，抗體或其抗原結合片段)、佐劑、免疫調節劑、或其任何組合。在一些態樣中，生物活性分子包含巨分子(例如，蛋白、抗體、酶、肽、DNA、RNA、或其任何組合)。在一些態樣中，生物活性分子包含小分子(例如 ，反義寡聚物(ASO)、siRNA、STING、藥物、或其任何組合)。在一些態樣中，生物活性分子為胞外體外源的，亦即 ，未天然地存在於胞外體中。
如本文使用，術語「治療分子 (therapeutic molecule) 」係指可治療及/或預防受試者(例如 ，人類受試者)之疾病或病症的任何分子。
在一些態樣中，治療分子包含抗原。如本文使用，術語「抗原 (antigen )」係指在引入受試者中時引起針對其自身之免疫反應(細胞性或體液性)的任何藥劑。在一些態樣中，抗原未在主要組織相容性複合物I及/或II分子上表現。在其他態樣中，雖然EV(例如 胞外體)中之抗原不表現為MHC I或II類複合物，但EV(例如 胞外體)仍可在EV(例如 胞外體)之表面上含有MHC I/II類分子。因此，在某些態樣中，本文揭示之EV(例如 胞外體)不直接與T細胞之T-細胞受體(TCR)相互作用來誘導針對抗原之免疫反應。類似地，在某些態樣中，本揭露之EV(例如 胞外體)不經由反串來直接將抗原轉移至靶細胞(例如 ，樹突狀細胞)之表面。反串係通常由衍生自樹突狀細胞(DEX)之EV(例如 胞外體)用於誘導T細胞活化之機制。參見 Pitt, J.M.等人 ,J Clin Invest 126(4): 1224-32(2016)。在其他態樣中，本揭露之EV(例如 胞外體)被抗原呈遞細胞吞沒且可在抗原呈遞細胞之表面上表現為MHC I類及/或MHC II類複合物。
在一些態樣中，治療分子包含免疫抑制劑。如本文使用，術語「免疫抑制劑 」係指減緩或終止受試者之免疫反應的任何試劑(例如 ，治療分子)。免疫抑制劑可給予受試者以預防受試者之免疫系統在器官移植後發動免疫反應或用於治療由過度活躍的免疫系統造成之疾病。免疫抑制劑之實例包括但不限於鈣調磷酸酶抑制劑，諸如但不限於環孢素、ISA(TX)247、他克莫司或鈣調磷酸酶，雷帕黴素靶標，諸如但不限於西羅莫司、依維莫司、FK778或TAFA-93，白介素-2 α-鏈阻斷劑，諸如但不限於巴利昔單抗及達利珠單抗，肌苷單磷酸脫氫酶之抑制劑，諸如黴酚酸酯，二氫葉酸還原酶之抑制劑，諸如但不限於胺甲蝶呤，皮質類固醇，諸如但不限於潑尼龍及甲基潑尼松龍，或免疫抑制抗代謝物，諸如但不限於硫唑嘌呤。在某些態樣中，免疫抑制劑包含反義寡核苷酸。在一些態樣中，本文揭示之EV(例如 ，胞外體)可包含抗原及免疫抑制劑。不欲被任一種理論約束，包含抗原及免疫抑制劑之EV(例如 ，胞外體)可用於誘導對於抗原之耐受性。
如本文使用，術語「抗體 (antibody )」包含天然或部分或全部合成產生之免疫球蛋白及其片段。該術語亦包括具有與免疫球蛋白結合域同源之結合域的任何蛋白。「抗體」進一步包括包含特異性結合並識別抗原之來自免疫球蛋白基因或其片段之構架區的多肽。術語抗體之使用旨在包括完整抗體、多株、單株及重組抗體、其片段，且進一步包括單鏈抗體、人源化抗體、鼠類抗體、嵌合、小鼠-人類、小鼠-靈長類動物、靈長類動物-人類單株抗體、抗獨特型抗體、抗體片段諸如scFv、(scFv)2 、Fab、Fab’、及F(ab’)2 、F(ab1)2 、Fv、dAb及Fd片段、雙抗體以及抗體相關多肽。抗體包括雙特異性抗體及多特異性抗體，只要其呈現所需生物活性或功能即可。在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段包含scFv、scFab、scFab-Fc、奈米抗體、或其任何組合。在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段包含促效抗體、阻斷抗體、靶向抗體、其片段、或其組合。在一些態樣中，促效抗體為CD40L促效劑。在一些態樣中，阻斷抗體結合選自程式化死亡1(PD-1)、程式化死亡配位體1(PD-L1)、細胞毒性T-淋巴球相關蛋白4、及其任何組合之靶蛋白。
術語「個體 (individual) 」、「受試者 (subject) 」、「宿主 (host) 」及「患者 (patient) 」在本文中可互換使用且係指需要診斷、處理、或治療之任何哺乳動物受試者，尤其是人類。本文描述之組成物及方法適用於人類治療及獸醫應用。在一些態樣中，受試者為哺乳動物，且在其他態樣中，受試者為人類。如本文使用，「哺乳動物受試者(mammalian subject)」包括所有哺乳動物，包括但不限於人類、家畜(例如 ，犬、貓及其類似動物)、農畜(例如 ，牛、羊、豬、馬及其類似動物)及實驗室動物(例如 ，猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠及其類似動物)。
如本文使用，術語「實質上不含 (substantially free) 」意指包含EV(例如胞外體)之樣品包含按質量/體積(m/v)百分濃度計小於10%之巨分子。一些部分可含有小於0.001%、小於0.01%、小於0.05%、小於0.1%、小於0.2%、小於0.3%、小於0.4%、小於0.5%、小於0.6%、小於0.7%、小於0.8%、小於0.9%、小於1%、小於2%、小於3%、小於4%、小於5%、小於6%、小於7%、小於8%、小於9%、或小於10%(m/v)之巨分子。
如本文使用，術語「巨分子 (macromolecule) 」意指核酸、污染性蛋白、脂質、碳水化合物、代謝物、或其組合。
如本文使用，術語「習知胞外體蛋白 (conventional exosome protein) 」意指先前已知在胞外體中富集之蛋白，包括但不限於CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI錨蛋白、乳凝集素LAMP2、及LAMP2B、其片段、或與其結合之肽。
如本文使用之「投與 (Administering) 」意指將包含本文揭示之EV(例如 胞外體)之組成物經由醫藥學上可接受之途徑來給予受試者。投與途徑可為靜脈內，例如靜脈內注射及靜脈內輸注。其他投與途徑包括例如皮下、肌肉內、經口、經鼻及肺部投與。EV(例如 胞外體)可作為包含至少一種賦形劑之醫藥組成物之一部分來投與。
如本文使用之「免疫反應 (immune response) 」係指脊椎動物體內針對外來物或異常(例如 癌性細胞)之生物反應，該反應保護生物體以使其免於此等外來物及由其造成之疾病。免疫反應藉由免疫系統之一或多種細胞(例如，T淋巴球、B淋巴球、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜伊紅球、肥大細胞、樹突狀細胞或嗜中性球)及由任何此等細胞或肝臟產生之可溶性巨分子(包括抗體、細胞介素、及補體)的作用來介導，從而導致選擇性靶向、結合、損傷、破壞、及/或自脊椎動物體內清除：入侵病原體、感染該等病原體之細胞或組織、癌性或其他異常細胞，或在自體免疫性或病理炎症情況下，正常人類細胞或組織。免疫反應包括例如 T細胞(例如 效應T細胞、Th細胞、CD4+細胞、CD8+T細胞、或Treg細胞)之活化或抑制，或免疫系統之任何其他細胞(例如 NK細胞)之活化或抑制。因此免疫反應可包含體液性免疫反應(例如 ，由B-細胞介導)、細胞性免疫反應(例如 ，由T細胞介導)、或體液性及細胞性免疫反應兩者。在一些態樣中，免疫反應為「抑制性」免疫反應。抑制性免疫反應為阻斷或減少刺激物(例如 ，抗原)之影響的免疫反應。在某些態樣中，抑制性免疫反應包含產生針對刺激物之抑制性抗體。在一些態樣中，免疫反應為「刺激性」免疫反應。刺激性免疫反應為導致產生可破壞且清除靶抗原(例如 ，腫瘤抗原或病毒)之效應細胞(例如 ，細胞毒性T淋巴球)的免疫反應。
如本文使用，術語「免疫細胞 (immune cell) 」係指涉及介導免疫反應之免疫系統的任何細胞。免疫細胞之非限制性實例包括T淋巴球、B淋巴球、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜伊紅球、肥大細胞、樹突狀細胞、嗜中性球、或其組合。在一些態樣中，免疫細胞為樹突狀細胞。在某些態樣中，樹突狀細胞包含漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)、習知樹突狀細胞1(cDC1)、習知樹突狀細胞2(cDC2)、或其任何組合。因此，在某些態樣中，本文揭示之EV(例如 ，胞外體)可特異性靶向之免疫細胞包括習知樹突狀細胞1(cDC1)及/或漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)。
如本文使用，術語「樹突狀細胞 (dendritic cell) 」或「DC 」係指能夠處理細胞外及細胞內蛋白且在MHC分子的情形下呈遞抗原以便使雛期T細胞預敏化的一種類別的骨髓衍生免疫細胞。在一些態樣中，樹突狀細胞可劃分至三個子集：(i)習知樹突狀細胞1(cDC1)、(ii)習知樹突狀細胞2(cDC2)、及(iii)漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)。在某些態樣中，不同DC子集可基於其表型表現來區分。例如，在一些態樣中，人類cDC1細胞為CD1c- 及CD141+ 。在一些態樣中，人類cDC2細胞為CD1c+ 及CD141- 。在一些態樣中，人類pDC細胞為CD123+ 。在一些態樣中，小鼠cDC1細胞為XCR1+ 、Clec9a+ 、及Sirpa- 。在一些態樣中，小鼠cDC2細胞為CD8+ 、CD11b+ 、Sirpa+ 、XCR1- 、及CD1c,b+ 。在一些態樣中，小鼠pDC細胞為CD137+ 、XCR1- 、及Sirpa- 。用於區分不同DC子集之其他表型標記物在此項技術中為已知的。參見例如 Collin等人 ,Immunology 154(1): 3-20(2018)。在一些態樣中，不同DC子集可基於其功能性質來區分。例如，在某些態樣中，pDC產生大量IFN-α，而cDC1及cDC2產生炎症性細胞介素，諸如IL-12、IL-6、及TNF-α。區分不同DC子集之其他方法在此項技術中為已知的。參見例如 美國專利第8,426,565 B2號及第9,988,431號，該等專利中之各者以全文引用方式併入本文。
如本文使用之「治療 (treat/treatment/ treating) 」係指例如 降低疾病或病狀之嚴重性；縮短病程之持續時間；改善或消除與疾病或病狀相關聯之一或多種症狀；向患有疾病或病狀之受試者提供有益效果，而未必治癒該疾病或病狀。該術語亦包括疾病或病狀或其症狀之預防或防止。在一態樣中，術語「治療(treating)」或「治療(treatment)」意指在受試者中誘導針對抗原之免疫反應。
如本文所用之「預防(Prevent /preventing )」係指減少或減輕特定結果之發生或嚴重性。在一些態樣中，預防某一結果經由預防性治療來達成。II. 胞外囊泡，例如 胞外體
本文揭示能夠調控受試者之免疫系統的經修飾EV(例如 胞外體)。在本揭露中有用之EV(例如 胞外體)經工程化以表現靶向部分(亦即 ，外源性靶向部分)，從而允許EV(例如 ，胞外體)靶向特定免疫細胞(例如 ，樹突狀細胞)群體。在某些態樣中，靶向部分結合至在免疫細胞上表現之標記物(例如 ，本文揭示之彼等者)。在其他態樣中，標記物僅在免疫細胞上表現。仍在其他態樣中，本揭露之EV(例如 ，胞外體)可包含多個(例如 ，兩個或兩個以上)靶向部分。在一些態樣中，多個靶向部分結合至相同標記物。在其他態樣中，多個靶向部分結合至不同標記物。
在一些態樣中，EV(例如 ，胞外體)可進一步包含一或多種額外外源性生物活性分子，例如抗原、佐劑、及/或免疫調節劑。因此，在某些態樣中，本文揭示之EV(例如 ，胞外體)包含(i)靶向部分(例如 ，本文揭示)及(ii)抗原。在一些態樣中，EV(例如 ，胞外體)包含(i)靶向部分及(ii)佐劑。在一些態樣中，EV(例如 ，胞外體)包含(i)靶向部分及(ii)免疫調節劑。在其他態樣中，本文揭示之EV(例如 ，胞外體)包含(i)靶向部分、(ii)抗原、(iii)佐劑、及(iv)免疫調節劑。
如以上 描述，本文所述EV(例如 胞外體)係具有約20-300 nm之間之直徑的胞外囊泡。在某些態樣中，本揭露之EV(例如 胞外體)具有約20-290 nm、20-280 nm、20-270 nm、20-260 nm、20-250 nm、20-240 nm、20-230 nm、20-220 nm、20-210 nm、20-200 nm、20-190 nm、20-180 nm、20-170 nm、20-160 nm、20-150 nm、20-140 nm、20-130 nm、20-120 nm、20-110 nm、20-100 nm、20-90 nm、20-80 nm、20-70 nm、20-60 nm、20-50 nm、20-40 nm、20-30 nm、30-300 nm、30-290 nm、30-280 nm、30-270 nm、30-260 nm、30-250 nm、30-240 nm、30-230 nm、30-220 nm、30-210 nm、30-200 nm、30-190 nm、30-180 nm、30-170 nm、30-160 nm、30-150 nm、30-140 nm、30-130 nm、30-120 nm、30-110 nm、30-100 nm、30-90 nm、30-80 nm、30-70 nm、30-60 nm、30-50 nm、30-40 nm、40-300 nm、40-290 nm、40-280 nm、40-270 nm、40-260 nm、40-250 nm、40-240 nm、40-230 nm、40-220 nm、40-210 nm、40-200 nm、40-190 nm、40-180 nm、40-170 nm、40-160 nm、40-150 nm、40-140 nm、40-130 nm、40-120 nm、40-110 nm、40-100 nm、40-90 nm、40-80 nm、40-70 nm、40-60 nm、40-50 nm、50-300 nm、50-290 nm、50-280 nm、50-270 nm、50-260 nm、50-250 nm、50-240 nm、50-230 nm、50-220 nm、50-210 nm、50-200 nm、50-190 nm、50-180 nm、50-170 nm、50-160 nm、50-150 nm、50-140 nm、50-130 nm、50-120 nm、50-110 nm、50-100 nm、50-90 nm、50-80 nm、50-70 nm、50-60 nm、60-300 nm、60-290 nm、60-280 nm、60-270 nm、60-260 nm、60-250 nm、60-240 nm、60-230 nm、60-220 nm、60-210 nm、60-200 nm、60-190 nm、60-180 nm、60-170 nm、60-160 nm、60-150 nm、60-140 nm、60-130 nm、60-120 nm、60-110 nm、60-100 nm、60-90 nm、60-80 nm、60-70 nm、70-300 nm、70-290 nm、70-280 nm、70-270 nm、70-260 nm、70-250 nm、70-240 nm、70-230 nm、70-220 nm、70-210 nm、70-200 nm、70-190 nm、70-180 nm、70-170 nm、70-160 nm、70-150 nm、70-140 nm、70-130 nm、70-120 nm、70-110 nm、70-100 nm、70-90 nm、70-80 nm、80-300 nm、80-290 nm、80-280 nm、80-270 nm、80-260 nm、80-250 nm、80-240 nm、80-230 nm、80-220 nm、80-210 nm、80-200 nm、80-190 nm、80-180 nm、80-170 nm、80-160 nm、80-150 nm、80-140 nm、80-130 nm、80-120 nm、80-110 nm、80-100 nm、80-90 nm、90-300 nm、90-290 nm、90-280 nm、90-270 nm、90-260 nm、90-250 nm、90-240 nm、90-230 nm、90-220 nm、90-210 nm、90-200 nm、90-190 nm、90-180 nm、90-170 nm、90-160 nm、90-150 nm、90-140 nm、90-130 nm、90-120 nm、90-110 nm、90-100 nm、100-300 nm、110-290 nm、120-280 nm、130-270 nm、140-260 nm、150-250 nm、160-240 nm、170-230 nm、180-220 nm、或190-210 nm之間之直徑。本文所述EV(例如 胞外體)之尺寸可根據以下 描述之方法來量測。
在一些態樣中，本揭露之EV(例如 胞外體)包含雙脂質膜(「EV(例如 胞外體)之膜」)，其包含內表面及外表面。在某些態樣中，內表面朝向EV(例如 胞外體)之內核(亦即 ，內腔)。在某些態樣中，外表面可與生產細胞或靶細胞之胞內體、多囊體或膜/細胞質接觸。
在一些態樣中，EV(例如 胞外體)之膜包含脂質及脂肪酸。在一些態樣中，EV(例如 胞外體)之膜包含磷脂、醣脂、脂肪酸、神經鞘脂質、磷酸甘油酯、固醇、膽固醇、及磷脂醯絲胺酸。
在一些態樣中，EV(例如 胞外體)之膜包含內部小葉及外部小葉。內部小葉及外部小葉之組成可藉由在此項技術中已知之跨雙層分佈檢定來確定，參見例如 Kuypers等人， Biohim Biophys Acta 1985 819:170。在一些態樣中，外部小葉之組成為大約70-90%之間之膽鹼磷脂、大約0-15%之間之酸性磷脂、及大約5-30%之間之磷脂醯乙醇胺。在一些態樣中，內部小葉之組成為大約15-40%之間之膽鹼磷脂、大約10-50%之間之酸性磷脂、及大約30-60%之間之磷脂醯乙醇胺。
在一些態樣中，EV(例如 胞外體)之膜包含一或多種多醣，諸如聚醣。
在一些態樣中，EV(例如 胞外體)之膜進一步包含一或多個支架部分，其能夠將本文揭示之靶向部分錨定(例如 ，在EV之外表面上)。因此，在某些態樣中，本文揭示之EV(例如 ，胞外體)包含靶向部分及支架部分，其中支架部分將靶向部分錨定或連接至EV(例如 ，在EV之外表面上)。在一些態樣中，可在本文揭示之EV(例如 ，胞外體)中表現之額外外源性生物活性分子(例如 ，抗原、佐劑、或免疫調節劑)中之至少一者或本文揭示之任何其他外源性生物活性分子亦經由支架部分來錨定或連接至EV(例如 ，在外表面或內腔表面上)。在一些態樣中，在EV(例如 ，抗原、佐劑、或免疫調節劑)中表現之額外外源性生物活性分子中之各者經由支架部分來錨定或連接至EV。在某些態樣中，支架部分為多肽(「胞外體蛋白」)。在其他態樣中，支架部分為非多肽部分。在一些態樣中，胞外體蛋白包括在胞外體膜上富集之各種膜蛋白，諸如跨膜蛋白、整合蛋白及周邊蛋白。它們可包括各種CD蛋白、轉運蛋白、整聯蛋白、凝集素、及鈣黏蛋白。在某些態樣中，支架部分(例如 ，胞外體蛋白)包含支架X。在其他態樣中，支架部分(例如 ，胞外體蛋白)包含支架Y。在其他態樣中，支架部分(例如 ，胞外體蛋白)包含支架X及支架Y兩者。關於可用於本揭露之支架部分的額外揭露貫穿本揭露提供。靶向部分
本文揭示之EV(例如 ，胞外體)經工程化或經修飾以靶向所關注之特定細胞(例如 ，樹突狀細胞)。在一些態樣中，EV(例如 ，胞外體)包含特異性結合至在細胞或細胞群體上表現之標記物(或靶分子)的靶向部分。在某些態樣中，標記物在多種細胞類型，例如 所有抗原呈遞細胞(例如 ，樹突狀細胞、巨噬細胞、及B淋巴球)上表現。在其他態樣中，標記物僅在特定細胞(例如 ，樹突狀細胞)群體上表現。
在一些態樣中，本揭露之靶向部分特異性結合至樹突狀細胞之標記物。在某些態樣中，標記物僅在樹突狀細胞上表現。在一些態樣中，樹突狀細胞包含漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)、骨髓/習知樹突狀細胞1(cDC1)、骨髓/習知樹突狀細胞2(cDC2)、或其任何組合。在一些態樣中，標記物包含C-型凝集素域家族9成員A(Clec9a)蛋白、樹突狀細胞特異性細胞間黏附分子-3-結合非整聯蛋白(DC-SIGN)、CD207、CD40、Clec6、樹突狀細胞免疫受體(DCIR)、DEC-205、凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)、MARCO、Clec12a、DC-去唾液酸醣蛋白受體(DC-ASGPR)、DC免疫受體2(DCIR2)、Dectin-1、巨噬細胞甘露糖受體(MMR)、BDCA-1(CD303、Clec4c)、Dectin-2、Bst-2(CD317)、或其任何組合。在一些態樣中，適用於本揭露之標記物包含C-型凝集素樣域。在某些態樣中，標記物為Clec9a且樹突狀細胞為cDC1。
在一些態樣中，本文揭示之靶向部分結合至人類Clec9a蛋白或其片段。人類Clec9a蛋白之序列在此項技術中為已知的。例如，人類Clec9a之胺基酸序列由241個胺基酸組成且可在可公開獲得之UniProt登錄號Q6UXN8(標準序列；SEQ ID NO: 370)及B0ZBM2下發現，其各自以全文引用方式併入本文。人類Clec9a蛋白存在天然變異體且該變異體含有以下胺基酸取代：A107G。
在一些態樣中，本文揭示之靶向部分結合至小鼠Clec9a蛋白或其片段。小鼠Clec9a蛋白之序列亦在此項技術中為已知的。小鼠Clec9A之胺基酸序列可在可公開獲得之UniProt登錄號Q8BRU4(標準序列，SEQ ID NO: 371)、B0ZBM3、B0ZBM5、B0ZBM6、B0ZBM7、Q5M8M6、及Q8CBB4下發現，其各自以全文引用方式併入本文。由替代性剪接產生之小鼠Clec9a蛋白之變異體在此項技術中為已知的。Clec9a同功型2(Uniprot識別符：Q8BRU4-2)之序列與標準序列(SEQ ID NO: 372)的差異如下：31-58：GAWCVVTMISCVVCMGLLATSIFLGIKF→V；105-105：G→GTDASTGPVLLTSPQMVPQTLDSKETG。Clec9a同功型3(Uniprot識別符：Q8BRU4-3)之序列與標準序列(SEQ ID NO: 373)的差異如下：156-173：EFISSIGKLKGGNKYWVG→SRWNQWILVLGRWLFSSL；及174-238：缺失。Clec9a同功型4(Uniprot識別符：Q8BRU4-4)之序列與標準序列(SEQ ID NO: 374)的差異如下：105-105：G→GTDASTGPVLLTSPQMVPQTLDSKETG。Clec9a同功型5(Uniprot識別符：Q8BRU4-5)之序列與標準序列(SEQ ID NO: 375)的差異如下：106-147：SDCSPCPHNW...SCLKEGASLF→CQQKDSDQPA...VRRRHLDPAS；及148-238：缺失。因此，本文揭示之靶向部分可結合至小鼠Clec9a之任何此等變異體。
在一些態樣中，本文揭示之靶向部分可結合至人類及小鼠Clec9a，包括其任何變異體。在一些態樣中，本揭露之靶向部分可結合至來自其他物種之Clec9a，包括但不限於黑猩猩、恆河猴、犬、奶牛、馬、或大鼠。此等Clec9a蛋白之序列在此項技術中為已知的。參見例如 美國專利第8,426,565 B2號，其以全文引用方式併入本文。
在一些態樣中，本文揭示之靶向部分可允許藉由表現對於靶向部分具有特異性之標記物的細胞(例如 ，cDC1)來更大程度地吸收EV(例如 ，胞外體)。在某些態樣中，與參考相比，EV之吸收增加至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約100%或更大。在一些態樣中，參考包含不表現本文揭示之靶向部分之EV(例如 ，胞外體)。
在一些態樣中，本文揭示之EV(例如 ，胞外體)經增加之吸收可允許更大免疫反應。因此，在某些態樣中，與參考相比，表現本文揭示之靶向部分之EV(例如 ，胞外體)可增加免疫反應(例如 ，針對負載至胞外體上之腫瘤抗原)至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約100%或更大。在一些態樣中，參考包含不表現本文揭示之靶向部分之EV(例如 ，胞外體)。在某些態樣中，免疫反應由T細胞(例如 ，CD8+ T細胞或CD4+ T細胞)及/或B細胞介導。
如以上 描述，本文揭示之靶向部分可包含肽、抗體或其抗原結合片段、化合物、或其任何組合。在一些態樣中，靶向部分係可特異性結合至Clec9a之肽。參見例如 Yan等人 , Oncotarget 7(26): 40437-40450(2016)。例如，在某些態樣中，肽包含Clec9a之可溶性片段。此類肽之非限制性實例描述於美國專利第9,988,431 B2號中，其以全文引用方式併入本文。在某些態樣中，肽包含Clec9a之配位體(天然或合成)，諸如在Ahrens等人 ，Immunity 36(4): 635-45(2012)；及Zhang等人 , Immunity 36(4): 646-57(2012)中描述之彼等者。包含Clec9a配位體之肽之非限制性實例描述於國際公開案第WO2013/053008 A2號，其以全文引用方式併入本文。
在一些態樣中，靶向部分為抗體或其抗原結合片段。在某些態樣中，靶向部分為單鏈Fv抗體片段。在某些態樣中，靶向部分為單鏈F(ab)抗體片段。在某些態樣中，靶向部分為奈米抗體。在某些態樣中，靶向部分為單一抗體(monobody)。可用作本文所述靶向部分之Clec9a結合劑之非限制性實例提供於美國公開案第2013/0273150 A1號；美國專利第8,426,565 B2號；第8,580,266 B2號；國際公開案第WO 2017/134301 A1號；第WO 2013/053008 A2號；第WO 2019/032662 A1號；第WO 2011/044452 A2號中，該等文獻各自以全文引用方式併入本文。
在一些態樣中，本文揭示之EV(例如 ，胞外體)包含一或多個(例如 ，2個、3個、4個、5個、或更多個)靶向部分。在某些態樣中，一或多個靶向部分與本文揭示之其他外源性生物活性分子(例如 ，治療分子、佐劑、或免疫調節劑)組合來表現。在一些態樣中，一或多個靶向部分可在EV(例如 胞外體)之外表面上表現。因此，在某些態樣中，一或多個靶向部分連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架部分(例如 ，支架X)。當一或多個靶向部分與其他外源性生物活性分子(例如 ，治療分子、佐劑、或免疫調節劑)組合來表現時，其他外源性生物活性分子可在EV(例如 胞外體)之表面(例如 ，外表面或內腔表面)上或在內腔中表現。治療分子
在一些態樣中，本文揭示之EV(例如 ，胞外體)經工程化或經修飾以將一或多種(例如 ，兩種、三種、四種、五種或更多種)治療分子遞送至靶標。在某些態樣中，治療分子包含抗原。因此，在某些態樣中，本文揭示之EV(例如 ，胞外體)包含靶向部分及抗原。
在一些態樣中，可使用本文揭示之EV(例如 ，胞外體)遞送之抗原包含腫瘤抗原。腫瘤抗原之非限制性實例包括：α-胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、上皮腫瘤抗原(ETA)、黏蛋白1(MUC1)、Tn-MUC1、黏蛋白16(MUC16)、酪胺酸酶、黑素瘤相關抗原(MAGE)、腫瘤蛋白p53(p53)、CD4、CD8、CD45、CD80、CD86、程式化死亡配位體1(PD-L1)、程式化死亡配位體2(PD-L2)、NY-ESO-1、PSMA、TAG-72、HER2、GD2、cMET、EGFR、間皮素、VEGFR、α-葉酸受體、CE7R、IL-3、癌-睾丸抗原(CTA)、MART-1gp100、TNF-相關細胞凋亡誘導配位體、Brachyury(黑素瘤優先表現抗原(PRAME))、或其組合。在其他態樣中，抗原可包含新抗原。如本文使用，術語「新抗原 (neoantigen) 」係指由腫瘤特異性突變基因來編碼之抗原。在一些態樣中，抗原源自細菌、病毒、真菌、原生動物、或其任何組合。在一些態樣中，抗原源自致癌病毒。在其他態樣中，抗原源自包含以下項之群：人類γ皰疹病毒4(愛潑斯坦巴爾病毒)、A型流感病毒、B型流感病毒、巨細胞病毒、金黃色葡萄球菌、結核分枝桿菌、沙眼衣原體、HIV-1、HIV-2、冠狀病毒(例如 ，MERS-CoV及SARS CoV)、絲狀病毒(例如 ，馬堡病毒及埃博拉病毒)、化膿性鏈球菌、肺炎鏈球菌、瘧原蟲物種(例如 ，間日瘧原蟲及惡性瘧原蟲)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、人類乳頭瘤病毒(HPV)、B型肝炎、C型肝炎、人類皰疹病毒8、單純性皰疹病毒2(HSV2)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)、銅綠假單胞菌、腸球菌屬、變形菌屬、腸桿菌屬、放線桿菌屬、凝固酶陰性葡萄球菌(CoNS)、支原體屬、或其組合。
在一些態樣中，治療分子包含免疫抑制劑。因此，在某些態樣中，本文揭示之EV(例如 ，胞外體)包含靶向部分及免疫抑制劑。
其他合適治療分子之非限制性實例包括藥理活性藥物及遺傳活性分子，包括抗腫瘤劑、消炎劑、激素或激素拮抗劑、離子通道改性劑、及神經刺激劑。治療劑之合適有效負載之實例包括在「The Pharmacological Basis of Therapeutics」Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y.,(1996)，第九版中之以下章節描述之彼等者：Drugs Acting at Synaptic and Neuroeffector Junctional Sites; Drugs Acting on the Central Nervous System; Autacoids: Drug Therapy of Inflammation; Water, Salts and Ions; Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism; Cardiovascular Drugs; Drugs Affecting Gastrointestinal Function; Drugs Affecting Uterine Motility; Chemotherapy of Parasitic Infections; Chemotherapy of Microbial Diseases; Chemotherapy of Neoplastic Diseases; Drugs Used for Immunosuppression; Drugs Acting on Blood-Forming organs; Hormones and Hormone Antagonists; Vitamins, Dermatology; and Toxicology，其全部以引用方式併入本文。合適有效負載進一步包括毒素、及生物及化學戰劑，例如參見Somani, S. M.(編), Chemical Warfare Agents, Academic Press, New York(1992))。
在某些態樣中，本文揭示之EV(例如 ，胞外體)經工程化或經修飾以包含兩種或兩種以上治療分子(例如 ，抗原或免疫抑制劑)，亦即第一治療分子及第二治療分子(例如 ，除了本文揭示之靶向部分以外)。在一些態樣中，第一治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第一支架Y，且第二治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第二支架Y。在一些態樣中，第一治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y，且第二治療分子在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分。在一些態樣中，第一治療分子在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分，且第二治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y。在一些態樣中，第一治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y，且第二治療分子連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X。在一些態樣中，第一治療分子在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分，且第二治療分子連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X。在一些態樣中，第一治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y，且第二治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X。在一些態樣中，第一治療分子在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分，且第二治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X。在一些態樣中，第一治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X，且第二治療分子連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X。在一些態樣中，第一治療分子連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之第一支架X，且第二治療分子連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之第二支架X。在一些態樣中，第一治療分子連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X，且第二治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y。在一些態樣中，第一治療分子連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X，且第二治療分子在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分。在一些態樣中，第一治療分子連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X，且第二治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X。在一些態樣中，第一治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第一支架X，且第二治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第二支架X。在一些態樣中，第一治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X，且第二治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y。在一些態樣中，第一治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X，且第二治療分子在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分。在一些態樣中，第一治療分子連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之第一支架X，且第二治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第二支架X。在一些態樣中，第一治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第一支架X，且第二治療分子連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之第二支架X。在一些態樣中，第一治療分子在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分，且第二治療分子在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分。
在一些態樣中，治療分子包含自體抗原。如本文使用，術語「自體抗原 (self-antigen) 」係指由宿主細胞或組織來表現之抗原。在正常健康狀態下，此等抗原被身體識別為自體抗原且不引起免疫反應。然而，在某些患病條件下，身體自己的免疫系統可將自體抗原識別為外來抗原且發動針對該等外來抗原之免疫反應，由此產生自體免疫性。在某些態樣中，本揭露之EV(例如 胞外體)可包含自體抗原(亦即 ，已經誘導針對其之T細胞反應且導致自體免疫性的自體(生殖系)蛋白)。此類EV(例如 胞外體)可用於靶向自體反應性T細胞且抑制其活性。自體抗原(包括相關疾病或病症)之非限制性實例包括：β-細胞蛋白(I型糖尿病)、髓磷脂寡樹突狀細胞醣蛋白(MOG，多發性硬化)、滑液蛋白(類風濕性關節炎)、或其組合。
在一些態樣中，治療分子包含抗體或其抗原結合片段。在一些態樣中，治療分子包含至少2種、至少3種、至少4種、或至少5種抗體或其抗原結合片段。在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段包含scFv、scFab、scFab-Fc、奈米抗體、或其任何組合。在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段包含促效抗體、阻斷抗體、靶向抗體、其片段、或其組合。在一些態樣中，促效抗體為CD40L促效劑。在一些態樣中，阻斷抗體結合選自程式化死亡1(PD-1)、程式化死亡配位體1(PD-L1)、細胞毒性T-淋巴球-相關蛋白4、及其任何組合之靶蛋白。在一些態樣中，EV(例如 胞外體)包含抗-IL12抗體或其抗原結合片段及抗-CD40L抗體或其抗原結合片段。佐劑
如以上 描述，本揭露之EV(例如 胞外體)可包含一或多種外源性生物活性分子。在一些態樣中，可在EV(例如 ，胞外體)中表現之外源性生物活性分子係佐劑。因此，在某些態樣中，本文揭示之EV(例如 ，胞外體)包含靶向部分及佐劑。在一些態樣中，本文揭示之EV(例如 ，胞外體)包含兩種、三種、四種、五種或更多種不同佐劑。如本文使用，術語「佐劑 」係指增強有效負載之治療效果(例如 ，增加對抗原之免疫反應)的任何物質。因此，與參考(例如 ，無佐劑之對應EV或包含抗原及佐劑之非EV遞送媒劑)相比，本文所述EV(例如 胞外體)能夠將對抗原之免疫反應增加至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約100%或更大。佐劑之非限制性實例包括：干擾素基因刺激物(STING)促效劑、toll樣受體(TLR)促效劑、炎症介體、及其任何組合。
在某些態樣中，本揭露係關於包含兩種或兩種以上外源性生物活性分子之經修飾或經工程化EV，其中兩種或兩種以上外源性生物活性分子係佐劑，亦即第一佐劑及第二佐劑(例如 ，除了本文揭示之靶向部分以外)。在一些態樣中，第一佐劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第一支架Y，且第二佐劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第二支架Y。在一些態樣中，第一佐劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y，且第二佐劑在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分。在一些態樣中，第一佐劑在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分，且第二佐劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y。在一些態樣中，第一佐劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y，且第二佐劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X。在一些態樣中，第一佐劑在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分，且第二佐劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X。在一些態樣中，第一佐劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y，且第二佐劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X。在一些態樣中，第一佐劑在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分，且第二佐劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X。在一些態樣中，第一佐劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X，且第二佐劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X。在一些態樣中，第一佐劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之第一支架X，且第二佐劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之第二支架X。在一些態樣中，第一佐劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X，且第二佐劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y。在一些態樣中，第一佐劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X，且第二佐劑在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分。在一些態樣中，第一佐劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X，且第二佐劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X。在一些態樣中，第一佐劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第一支架X，且第二佐劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第二支架X。在一些態樣中，第一佐劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X，且第二佐劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y。在一些態樣中，第一佐劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X，且第二佐劑在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分。在一些態樣中，第一佐劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之第一支架X，且第二佐劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第二支架X。在一些態樣中，第一佐劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第一支架X，且第二佐劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之第二支架X。在一些態樣中，第一佐劑在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分，且第二佐劑在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分。
在一些態樣中，適用於本揭露之佐劑誘導細胞質模式識別受體之活化。細胞質模式識別受體之非限制性實例包括：干擾素基因刺激物(STING)、視網酸可誘導基因(RIG-1)、黑素瘤分化相關蛋白5(MDA5)、含有核苷酸結合低聚合域、富含白胺酸重複序列及熱蛋白域(NLRP)、炎性體、或其組合。在某些態樣中，佐劑係STING促效劑。干擾素基因刺激物(STING)係通常由細菌產生之環狀二核苷酸的胞質傳感物。一旦激活，其便造成I型干擾素之產生並引發免疫反應。在某些態樣中，STING促效劑包含環狀二核苷酸STING促效劑或非環狀二核苷酸STING促效劑。
已知環狀嘌呤二核苷酸諸如但不限於cGMP、環狀二-GMP(c-二-GMP)、cAMP、環狀二-AMP(c-二-AMP)、環狀-GMP-AMP(cGAMP)、環狀二-IMP(c-二-IMP)、環狀AMP-IMP(cAIMP)及其任何類似物刺激或增強患者中之免疫或發炎反應。CDN可具有連接環狀二核苷酸之2’2’、2’3’、2’5’、3’3’、或3’5’鍵、或其任何組合。
環狀嘌呤二核苷酸可經由標準有機化學技術來修飾以產生嘌呤二核苷酸之類似物。合適的嘌呤二核苷酸包括但不限於腺嘌呤、鳥嘌呤、肌苷、次黃嘌呤、黃嘌呤、異鳥嘌呤、或此項技術中已知之任何其他適當的嘌呤二核苷酸。環狀二核苷酸可為經修飾之類似物。可使用在此項技術中已知之任何合適修飾，包括但不限於硫代磷酸酯、二硫代硫酸酯、氟酸酯、及二氟酸酯修飾。
亦可使用非環狀二核苷酸促效劑，諸如5,6-二甲基呫噸酮-4-乙酸(DMXAA)或在此項技術中已知之任何其他非環狀二核苷酸促效劑。
可用於本揭露之STING促效劑之非限制性實例包括：DMXAA、STING促效劑-1、ML RR-S2 CDA、ML RR-S2c-二-GMP、ML-RR-S2 cGAMP、2’3’-c-二-AM(PS)2、2’3’-cGAMP、2’3’-cGAMPdFHS、3’3’-cGAMP、3’3’-cGAMPdFSH、cAIMP、cAIM(PS)2、3’3’-cAIMP、3’3’-cAIMPdFSH、2’2’-cGAMP、2’3’-cGAM(PS)2、3’3’-cGAMP、及其組合。STING促效劑之非限制性實例可發現於美國專利第9,695,212號、第WO 2014/189805 A1號、第WO 2014/179335 A1號、第WO 2018/100558 A1號、美國專利第10,011,630 B2號、第WO 2017/027646 A1號、第 WO 2017/161349 A1號、及第WO 2016/096174 A1號，該等專利中之各者以全文引用方式併入。
在一些態樣中，適用於本揭露中之STING促效劑包含WO 2016/096174、WO 2016/096174 A1、 WO 2014/093936、WO 2014/189805、WO 2015/077354中揭示之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，該等文獻之內容以全文引用方式併入本文。亦參見Cell reports 11, 1018-1030(2015)。
在一些態樣中，適用於本揭露之STING促效劑包含c-二-AMP、c-二-GMP、c-二-IMP、c-AMP-GMP、c-AMP-IMP、及c-GMP-IMP，其在WO 2013/185052及Sci. Transl. Med. 283,283ra52(2015)中描述，該等文獻以全文引用方式併入本文。
在一些態樣中，適用於本揭露之STING促效劑包含WO 2014/189806、WO 2015/185565、 WO 2014/179760、WO 2014/179335、WO 2015/017652、WO 2016/096577、WO 2016/120305、WO 2016/145102、WO 2017/027646、WO 2017/075477、WO 2017/027645、WO 2018/100558、WO 2017/175147、或WO 2017/175156中揭示之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，該等文獻之內容各自以全文引用方式併入本文。
在一些態樣中，適用於本揭露中之STING促效劑為CL606、CL611、CL602、CL655、CL604、CL609、CL614、CL656、CL647、CL626、CL629、CL603、CL632、CL633、CL659或其醫藥學上可接受之鹽。在一些態樣中，適用於本揭露中之STING促效劑為CL606或其醫藥學上可接受之鹽。在一些態樣中，適用於本揭露中之STING促效劑為CL611或其醫藥學上可接受之鹽。在一些態樣中，適用於本揭露中之STING促效劑為CL602或其醫藥學上可接受之鹽。在一些態樣中，適用於本揭露中之STING促效劑為CL655或其醫藥學上可接受之鹽。在一些態樣中，適用於本揭露中之STING促效劑為CL604或其醫藥學上可接受之鹽。在一些態樣中，適用於本揭露中之STING促效劑為CL609或其醫藥學上可接受之鹽。在一些態樣中，適用於本揭露中之STING促效劑為CL614或其醫藥學上可接受之鹽。在一些態樣中，適用於本揭露中之STING促效劑為CL656或其醫藥學上可接受之鹽。在一些態樣中，適用於本揭露中之STING促效劑為CL647或其醫藥學上可接受之鹽。在一些態樣中，適用於本揭露中之STING促效劑為CL626或其醫藥學上可接受之鹽。在一些態樣中，適用於本揭露中之STING促效劑為CL629或其醫藥學上可接受之鹽。在一些態樣中，適用於本揭露中之STING促效劑為CL603或其醫藥學上可接受之鹽。在一些態樣中，適用於本揭露中之STING促效劑為CL632或其醫藥學上可接受之鹽。在一些態樣中，適用於本揭露中之STING促效劑為CL633或其醫藥學上可接受之鹽。在一些態樣中，適用於本揭露中之STING促效劑為CL659或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些態樣中，EV(例如 胞外體)包含環狀二核苷酸STING促效劑及/或非環狀二核苷酸STING促效劑。在一些態樣中，當若干環狀二核苷酸STING促效劑存在於本文揭示之EV(例如 胞外體)上時，此類STING促效劑可相同或可不同。在一些態樣中，當若干非環狀二核苷酸STING促效劑存在時，此類STING促效劑可為相同或不同的。在一些態樣中，本揭示之EV(例如胞外體)組成物可包含兩個或兩個以上EV(例如胞外體)群，其中EV(例如胞外體)之各群包含不同的STING促效劑或其組合。
在一些態樣中，一或多種外源性生物活性分子例如佐劑係TLR促效劑。TLR促效劑之非限制性實例包括：TLR2促效劑(例如 ，脂磷壁酸、非典型LPS、MALP-2及MALP-404、OspA、膜孔蛋白、LcrV、脂化甘露聚醣、GPI錨定物、溶血磷脂醯絲胺酸、脂磷聚醣(LPG)、糖磷脂醯肌醇(GPI)、酵母聚醣、hsp60、gH/gL醣蛋白、紅血球凝聚素)、TLR3促效劑(例如 ，雙鏈RNA，例如 ，聚(I:C))、TLR4促效劑(例如 ，脂多醣(LPS)、脂磷壁酸、β-防禦素2、纖連蛋白EDA、HMGB1、SNAP相關蛋白、腱生蛋白C)、TLR5促效劑(例如 ，鞭毛蛋白)、TLR6促效劑、TLR7/8促效劑(例如 ，單鏈RNA、CpG-A、聚G10、聚G3、瑞喹莫德)、TLR9促效劑(例如 ，非甲基化CpGDNA)、及其組合。TLR促效劑之非限制性實例可發現於WO2008115319A2、US20130202707A1、 US20120219615A1、US20100029585A1、 WO2009030996A1、WO2009088401A2、及 WO2011044246A1中，該等文獻中之各者以全文引用方式併入。
在一些態樣中，包含靶向部分(例如 ，本文揭示之彼等者)及佐劑之EV(例如 ，胞外體)可包含額外外源性生物活性分子(例如 ，免疫調節劑)。免疫調節劑
在一些態樣中，本揭露之EV(例如 胞外體)經修飾或經工程化以包含一或多種(例如 ，兩種、三種、四種、五種或更多種)免疫調節劑。在某些態樣中，一或多種免疫調節劑與本文揭示之其他外源性生物活性分子(例如 ，靶向部分、治療分子、及/或佐劑)組合來表現。
在一些態樣中，本揭露係關於包含兩種或兩種以上外源性生物活性分子之經修飾或經工程化EV，其中兩種或兩種以上外源性生物活性分子係免疫調節劑，亦即第一免疫調節劑及第二免疫調節劑(例如 ，除了本文揭示之靶向部分以外)。在一些態樣中，第一免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第一支架Y，且第二免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第二支架Y。在一些態樣中，第一免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y，且第二免疫調節劑在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分。在一些態樣中，第一免疫調節劑在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分，且第二免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y。在一些態樣中，第一免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y，且第二免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X。在一些態樣中，第一免疫調節劑在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分，且第二免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X。在一些態樣中，第一免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y，且第二免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X。在一些態樣中，第一免疫調節劑在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分，且第二免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X。在一些態樣中，第一免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X，且第二免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X。在一些態樣中，第一免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之第一支架X，且第二免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之第二支架X。在一些態樣中，第一免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X，且第二免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y。在一些態樣中，第一免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X，且第二免疫調節劑在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分。在一些態樣中，第一免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X，且第二免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X。在一些態樣中，第一免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第一支架X，且第二免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第二支架X。在一些態樣中，第一免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X，且第二免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y。在一些態樣中，第一免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X，且第二免疫調節劑在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分。在一些態樣中，第一免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之第一支架X，且第二免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第二支架X。在一些態樣中，第一免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第一支架X，且第二免疫調節劑連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之第二支架X。在一些態樣中，第一免疫調節劑在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分，且第二免疫調節劑在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分。
在一些態樣中，可與本文所述EV(例如 胞外體)一起使用之免疫調節劑具有抗腫瘤活性。在其他態樣中，適用於本揭露之免疫調節劑具有致耐受性活性。在一些態樣中，免疫調節劑可調控先天免疫反應。在某些態樣中，免疫調節劑藉由靶向自然殺手細胞來調控先天免疫反應。在一些態樣中，免疫調節劑可調控適應性免疫反應。在一些態樣中，免疫調節劑藉由靶向細胞毒性T細胞來調控適應性免疫反應。在其他態樣中，免疫調節劑藉由靶向B細胞來調控適應性免疫反應。在某些態樣中，本文揭示之免疫調節劑可調節胞外體對於細胞毒性T細胞或B細胞之分佈(亦即 ，生物分佈改良劑)。
在一些態樣中，免疫調節劑包含負性檢查點調節子之抑制劑或負性檢查點調節子之結合配偶體之抑制劑。在某些態樣中，負性檢查點調節子包含細胞毒性T-淋巴球相關蛋白4(CTLA-4)、程式化細胞死亡蛋白1(PD-1)、淋巴球活化基因3(LAG-3)、含有T-細胞免疫球蛋白黏蛋白之蛋白3(TIM-3)、B及T淋巴球衰減因子(BTLA)、具有Ig及ITIM域之T細胞免疫受體(TIGIT)、T細胞活化之V-域Ig抑制因子(VISTA)、腺苷A2a受體(A2aR)、殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)、CD20、CD39、CD73、或其任何組合。
在一些態樣中，免疫調節劑為細胞毒性T-淋巴球相關蛋白4(CTLA-4)之抑制劑。在某些態樣中，CTLA-4抑制劑為CTLA-4之單株抗體(「抗-CTLA-4抗體」)。在某些態樣中，抑制劑為CTLA-4之單株抗體之片段。在某些態樣中，抗體片段為CTLA-4之單株抗體之scFv、(scFv)2 、Fab、Fab’、及F(ab’)2 、F(ab1)2 、Fv、dAb、或Fd。在某些態樣中，抑制劑為針對CTLA-4之奈米抗體、雙特異性抗體、或多特異性抗體。在一些態樣中，抗-CTLA-4抗體為伊匹珠單抗(ipilimumab)。在其他態樣中，抗-CTLA-4抗體為曲利木單抗(tremelimumab)。
在一些態樣中，免疫調節劑為程式化細胞死亡蛋白1(PD-1)之抑制劑。在一些態樣中，免疫調節劑為程式化死亡-配位體1(PD-L1)之抑制劑。在一些態樣中，免疫調節劑為程式化死亡-配位體2(PD-L2)之抑制劑。在某些態樣中，PD-1、PD-L1、或PD-L2之抑制劑為PD-1(「抗-PD-1抗體」)、PD-L1(「抗-PD-L1抗體」)、或PD-L2(「抗-PD-L2抗體」)之單株抗體。在一些態樣中，抑制劑為抗-PD-1抗體、抗-PD-L1抗體、或抗-PD-L2抗體之片段。在某些態樣中，抗體片段為PD-1、PD-L1、或PD-L2之單株抗體之scFv、(scFv)2 、Fab、Fab’、及F(ab’)2 、F(ab1)2 、Fv、dAb、或Fd。在某些態樣中，抑制劑為針對PD-1、PD-L1、或PD-L2之奈米抗體、雙特異性抗體、或多特異性抗體。在一些態樣中，抗-PD-1抗體為妮威祿單抗(nivolumab)。在一些態樣中，抗-PD-1抗體為派姆單抗(pembrolizumab)。在一些態樣中，抗-PD-1抗體為皮地利珠單抗(pidilizumab)。在一些態樣中，抗-PD-L1抗體為阿替珠單抗(atezolizumab)。在其他態樣中，抗-PD-L1抗體為阿維單抗(avelumab)。
在一些態樣中，免疫調節劑為淋巴球活化基因3(LAG3)之抑制劑。在某些態樣中，LAG3之抑制劑為LAG3之單株抗體(「抗-LAG3抗體」)。在一些態樣中，抑制劑為抗-LAG3抗體之片段，例如 、scFv、(scFv)2 、Fab、Fab’、及F(ab’)2 、F(ab1)2 、Fv、dAb、或Fd。在某些態樣中，抑制劑為針對LAG3之奈米抗體、雙特異性抗體、或多特異性抗體。
在一些態樣中，免疫調節劑為含有T-細胞免疫球蛋白黏蛋白之蛋白3(TIM-3)之抑制劑。在一些態樣中，免疫調節劑為B及T淋巴球衰減因子(BTLA)之抑制劑。在一些態樣中，免疫調節劑為具有Ig及ITIM域之T細胞免疫受體(TIGIT)之抑制劑。在一些態樣中，免疫調節劑為T細胞活化之V-域Ig抑制因子(VISTA)之抑制劑。在一些態樣中，免疫調節劑為腺苷A2a受體(A2aR)之抑制劑。在一些態樣中，免疫調節劑為殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)之抑制劑。在一些態樣中，免疫調節劑為吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)之抑制劑。在一些態樣中，免疫調節劑為CD20、CD39、或CD73之抑制劑。
在一些態樣中，免疫調節劑包含正性共刺激分子之活化劑或正性共刺激分子之結合配偶體之活化劑。在某些態樣中，正性共刺激分子包含TNF受體超家族成員(例如 ，CD120a、CD120b、CD18、OX40、CD40、Fas受體、M68、CD27、CD30、4-1BB、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、TRAILR4、RANK、OCIF、TWEAK受體、TACI、BAFF受體、ATAR、CD271、CD269、AITR、TROY、CD358、TRAMP、及XEDAR)。在一些態樣中，正性共刺激分子之活化劑為TNF超家族成員(例如， TNFα、TNF-C、OX40L、CD40L、FasL、LIGHT、TL1A、CD27L、Siva、CD153、4-1BB配位體、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、CAMLG、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITR配位體、及EDA-2)。
在一些態樣中，免疫調節劑為TNF受體超家族成員4(OX40)之活化劑。在某些態樣中，OX40之活化劑為促效性抗-OX40抗體。在其他態樣中，OX40之活化劑為OX40配位體(OX40L)。
在一些態樣中，免疫調節劑為CD27之活化劑。在某些態樣中，CD27之活化劑為促效性抗-CD27抗體。在其他態樣中，CD27之活化劑為CD27配位體(CD27L)。
在一些態樣中，免疫調節劑為CD40之活化劑。在某些態樣中，CD40之活化劑為促效性抗-CD40抗體。在一些態樣中，CD40之活化劑為CD40配位體(CD40L)。在某些態樣中，CD40L為單體CD40L。在其他態樣中，CD40L為三聚體CD40L。
在一些態樣中，免疫調節劑為糖皮質素誘導之TNFR相關蛋白(GITR)之活化劑。在某些態樣中，GITR之活化劑為促效性抗-GITR抗體。在其他態樣中，GITR之活化劑為GITR之天然配位體。
在一些態樣中，免疫調節劑為4-1BB之活化劑。在特定態樣中，4-1BB之活化劑為促效性抗-4-1BB抗體。在某些態樣中，4-1BB之活化劑為4-1BB之天然配位體。
在一些態樣中，免疫調節劑為Fas受體(Fas)。在此類態樣中，Fas受體在EV(例如 胞外體)之表面上呈現。在一些態樣中，免疫調節劑為Fas配位體(FasL)。在某些態樣中，Fas配位體在EV(例如 胞外體)之表面上呈現。在一些態樣中，免疫調節劑為抗-Fas抗體或抗-FasL抗體。
在一些態樣中，免疫調節劑為CD28-超家族共刺激分子之活化劑。在某些態樣中，CD28-超家族共刺激分子為ICOS或CD28。在某些態樣中，免疫調節劑為ICOSL、CD80、或CD86。
在一些態樣中，免疫調節劑為可誘導T細胞共刺激因子(ICOS)之活化劑。在某些態樣中，ICOS之活化劑為促效性抗-ICOS抗體。在其他態樣中，ICOS之活化劑為ICOS配位體(ICOSL)。
在一些態樣中，免疫調節劑為CD28之活化劑。在一些態樣中，CD28之活化劑為促效性抗-CD28抗體。在其他態樣中，CD28之活化劑為CD28之天然配位體。在某些態樣中，CD28之配位體為CD80。
在一些態樣中，免疫調節劑包含細胞介素或細胞介素之結合配偶體。在某些態樣中，細胞介素包含IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、或IFN-γ。在一些態樣中，免疫調節劑包含FLT-3(CD135)。
在一些態樣中，本文所述EV(例如 胞外體)包含第一支架部分。在某些態樣中，第一外源性生物活性分子(例如 ，靶向部分、治療分子、佐劑、或免疫調節劑)連接至第一支架部分。在其他態樣中，第二外源性生物活性分子(例如 ，靶向部分、治療分子、佐劑、或免疫調節劑)連接至第一支架部分。在其他態樣中，第一外源性生物活性分子及第二外源性生物活性分子連接至第一支架部分。在一些態樣中，EV(例如 胞外體)進一步包含第二支架部分。在某些態樣中，第一外源性生物活性分子連接至第一支架部分，且第二外源性生物活性分子連接至第二支架部分。在一些態樣中，第一支架部分及第二支架部分為相同的(例如 ，均為支架X或均為支架Y)。在其他態樣中，第一支架部分及第二支架部分為不同的(例如 ，第一支架部分為支架X且第二支架部分為支架Y；或第一支架部分為支架Y且第二支架部分為支架X)。
支架X之非限制性實例包括：前列腺素F2受體負性調節子(PTGFRN)；基礎免疫球蛋白(BSG)；免疫球蛋白超家族成員2(IGSF2)；免疫球蛋白超家族成員3(IGSF3)；免疫球蛋白超家族成員8(IGSF8)；整聯蛋白β-1(ITGB1)；整聯蛋白α-4(ITGA4)；4F2細胞表面抗原重鏈(SLC3A2)；及ATP運輸蛋白類別(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B)。在某些態樣中，支架X為完整蛋白。在其他態樣中，支架X為蛋白片段(例如 ，功能性片段)。
在其他態樣中，適用於本揭露之支架部分，亦即第一支架部分、第二支架部分、及/或第三支架部分，包括習知胞外體蛋白，包括但不限於四旋蛋白分子(例如 ，CD63、CD81、CD9及其他分子)、溶酶體相關膜蛋白2(LAMP2及LAMP2B)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、GPI錨蛋白、乳凝集素及其片段、具有針對此等蛋白或其片段中之任一者之親和力的肽、或其任何組合。
支架Y之非限制性實例包括：肉豆蔻醯化的富丙胺酸之蛋白激酶C受質(MARCKS)；肉豆蔻醯化的富丙胺酸之蛋白激酶C受質樣1(MARCKSL1)；及腦酸溶性蛋白1(BASP1)蛋白。在一些態樣中，支架Y為完整蛋白。在某些態樣中，支架Y為蛋白片段(例如 ，功能性片段)。
在一些態樣中，本揭露之EV(例如 胞外體)包含兩種或兩種以上外源性生物活性分子，例如(i)一或多個治療分子(例如 ，抗原)及(ii)一或多個靶向部分，其中一或多個治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y，且一或多個靶向部分連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X。在一些態樣中，本揭露之EV(例如 胞外體)包含兩種或兩種以上外源性生物活性分子，例如(i)一或多個治療分子(例如 ，抗原)及(ii)一或多個靶向部分，其中一或多個治療分子在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分，且一或多個靶向部分連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X。在一些態樣中，本揭露之EV(例如 胞外體)包含兩種或兩種以上外源性生物活性分子，例如(i)一或多個治療分子(例如 ，抗原)及(ii)一或多個靶向部分，其中一或多個治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X，且一或多個靶向部分連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X。在一些態樣中，本揭露之EV(例如 胞外體)包含兩種或兩種以上外源性生物活性分子，例如(i)一或多個治療分子(例如 ，抗原)及(ii)一或多個靶向部分，其中一或多個治療分子連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之第一支架X，且一或多個靶向部分連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之第二支架X。在一些態樣中，本揭露之EV(例如 胞外體)包含兩種或兩種以上外源性生物活性分子，例如，(i)一或多個治療分子(例如 ，抗原)及(ii)一或多個靶向部分，其中一或多個治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第一支架X，且一或多個靶向部分連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之第二支架X。
在一些態樣中，本文揭示之一或多種外源性生物活性分子(例如 ，靶向部分、治療分子、免疫調節劑、或佐劑)可經修飾以增加在EV(例如 胞外體)中之囊封。此修飾可包括藉由用化學品或酶處理促效劑或藉由物理或化學改變外源性生物活性分子(例如 ，佐劑及/或抗原)之極性或電荷而添加脂質結合標籤。外源性生物活性分子可藉由單一處理，或藉由組合處理來修飾，例如 僅添加脂質結合標籤，或添加脂質結合標籤及改變極性。先前實例意謂非限制性說明性情況。預期可實施修飾之任何組合。與未修飾外源性生物活性分子之囊封相比，該修飾可使外源性生物活性分子在EV(例如 胞外體)中之囊封增加2倍與10,000倍之間、10倍與1,000倍之間、或100倍與500倍之間。與未修飾外源性生物活性分子之囊封相比，該修飾可使外源性生物活性分子在EV(例如 胞外體)中之囊封增加至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、或10,000倍。
具體態樣之額外非限制性實例包括EV(例如 胞外體)，其包含(i)一或多個靶向部分、(ii)一或多個治療分子(例如 ，腫瘤抗原)、及(iii)一或多個佐劑(例如 ，STING促效劑或TLR促效劑)及/或免疫調節劑，其中： (a)一或多個靶向部分連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之第一支架X，一或多個治療分子連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之第二支架X，且一或多個佐劑及/或免疫調節劑(a1)在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分，或(a2)連接至第三支架部分，例如 胞外體之外表面上或胞外體之內腔表面上之支架X或EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y； (b)一或多個靶向部分連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X，一或多個治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y，且一或多個佐劑及/或免疫調節劑(b1)在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分，或(b2)連接至第三支架部分，例如 胞外體之外表面上或胞外體之內腔表面上之支架X或EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y； (c)一或多個靶向部分連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X，一或多個治療分子在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分，且一或多個佐劑及/或免疫調節劑(c1)在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分，或(c2)連接至支架部分，例如 胞外體之外表面上或胞外體之內腔表面上之支架X或EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y； (d)一或多個靶向部分連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之支架X，一或多個治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架X，且一或多個佐劑及/或免疫調節劑(d1)在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分，或(d2)連接至支架部分，例如 胞外體之外表面上或胞外體之內腔表面上之支架X或EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y；或 (e)一或多個靶向部分連接至EV(例如 胞外體)之外表面上之第一支架X，一或多個治療分子連接至EV(例如 胞外體)之內腔表面上之第二支架X，並且一或多個佐劑及/或免疫調節劑(e1)在EV(例如 胞外體)之內腔中，不連接至任何支架部分，或(e2)連接至第三支架部分，例如 胞外體之表面上或胞外體之內腔中之支架X或EV(例如 胞外體)之內腔表面上之支架Y。
在一些態樣中，免疫調節劑包含支持生髮中心反應所需之細胞內相互作用的蛋白。在某些態樣中，此蛋白包含信號轉導淋巴球活化分子(SLAM)家族成員或SLAM-相關蛋白(SAP)。在一些態樣中，SLAM家族成員包含SLAM、CD48、CD229(Ly9)、Ly108、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME、CD2F-10、或其組合。
在一些態樣中，免疫調節劑包含T-細胞受體(TCR)或其衍生物。在某些態樣中，免疫調節劑為TCR α-鏈或其衍生物。在其他態樣中，免疫調節劑為TCR β-鏈或其衍生物。在其他態樣中，免疫調節劑為T-細胞之輔受體或其衍生物。
在一些態樣中，免疫調節劑包含嵌合抗原受體(CAR)或其衍生物。在某些態樣中，CAR結合至本文揭示之治療分子中之一或多者(例如 ，腫瘤抗原，例如 ，α-胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、上皮腫瘤抗原(ETA)、黏蛋白1(MUC1)、Tn-MUC1、黏蛋白16(MUC16)、酪胺酸酶、黑素瘤-相關抗原(MAGE)、腫瘤蛋白p53(p53)、CD4、CD8、CD45、CD80、CD86、程式化死亡配位體1(PD-L1)、程式化死亡配位體2(PD-L2)、NY-ESO-1、PSMA、TAG-72、HER2、GD2、cMET、EGFR、間皮素、VEGFR、α-葉酸受體、CE7R、IL-3、癌-睾丸抗原、MART-1gp100、及TNF-相關細胞凋亡-誘導配位體)。
在某些態樣中，免疫調節劑為CD28之活化劑。在某些態樣中，活化劑為CD28之單株抗體之片段。在某些態樣中，抗體片段為CD28之單株抗體之scFv、(scFv)2 、Fab、Fab’、及F(ab’)2 、F(ab1)2 、Fv、dAb、或Fd。在某些態樣中，活化劑為針對CD28之奈米抗體、雙特異性抗體、或多特異性抗體。
在一些態樣中，免疫調節劑包含NF-κB抑制劑。可用於本揭露之NF-κB抑制劑之非限制性實例包括：IKK複合物抑制劑(例如 ，TPCA-1、NF-κB活化抑制劑VI(BOT-64)、BMS 345541、氨來呫諾(Amlexanox)、SC-514(GK 01140)、IMD 0354、IKK-16)、IκB降解抑制劑(例如 ，BAY 11-7082、MG-115、MG-132、乳胞素、環氧酶素、小白菊內酯、卡非佐米(Carfilzomib)、MLN-4924(Pevonedistat))、NF-κB核轉位抑制劑(例如 ，JSH-23、咯利普蘭(Rolipram))、p65乙醯化抑制劑(例如 ，沒食子酸、漆樹酸)、NF-κB-DNA結合抑制劑(例如 ，GYY 4137、p-XSC、CV 3988、前列腺素E2(PGE2))、NF-κB轉錄活化抑制劑(例如 ，LY 294002、渥曼青黴素(Wortmannin)、美沙拉嗪(Mesalamine))、或其組合。亦參見 Gupta, S.C.等人 ,Biochim Biophys Acta 1799:775-787(2010)，其以全文引用方式併入本文。在其他態樣中，免疫調節劑包含COX-2抑制劑、mTOR抑制劑(例如 ，雷帕黴素及衍生物)、前列腺素、非類固醇抗炎症劑(NSAID)、抗白三烯、或其組合。
在一些態樣中，免疫調節劑為促效劑。在某些態樣中，促效劑為內源性促效劑(諸如激素)或神經遞質。在其他態樣中，促效劑為外源性促效劑，諸如藥物。在一些態樣中，促效劑為物理促效劑，其可在不結合至受體的情況下產生促效反應。在一些態樣中，促效劑為超促效劑，其可產生比內源性促效劑更大的最大反應。在某些態樣中，促效劑為在受體處具有完全功效之完全促效劑。在其他態樣中，促效劑為相對於完全促效劑在受體處僅具有部分功效之部分促效劑。在一些態樣中，促效劑為可抑制受體之組成性活性的反向促效劑。在一些態樣中，促效劑為與其他共促效劑一起起作用以便對受體產生效應之共促效劑。在某些態樣中，促效劑為經由形成共價鍵來永久性地結合至受體之不可逆促效劑。在某些態樣中，促效劑為針對特定類型受體之選擇性促效劑
在一些態樣中，免疫調節劑為拮抗劑。在特定態樣中，拮抗劑為競爭性拮抗劑，其可逆地結合至受體的與內源性配位體或促效劑相同之結合位點處，而不使該受體活化。競爭性拮抗劑可影響達成最大反應所需要的促效劑之量。在其他態樣中，拮抗劑為非競爭性拮抗劑，其結合至受體之活性位點或受體之別構位點。非競爭性拮抗劑可降低可藉由任何數量之促效劑獲得之最大反應程度。在其他態樣中，拮抗劑為非競爭性拮抗劑，其在結合至單獨別構結合位點前，需要藉由促效劑進行受體活化。
在一些態樣中，免疫調節劑包含抗體或抗原結合片段。免疫調節劑可為全長蛋白或其片段。抗體或抗原結合片段可源自天然來源、或部分或全部合成產生。在一些態樣中，抗體為單株抗體。在此等態樣之一些態樣中，單株抗體為IgG抗體。在某些態樣中，單株抗體為IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4。在一些其他態樣中，抗體為多株抗體。在某些態樣中，抗原結合片段選自Fab、Fab’、及F(ab’)2 、F(ab1)2 、Fv、dAb、及Fd片段。在某些態樣中，抗原結合片段為scFv或(scFv)2 片段。在某些其他態樣中，抗體或抗原結合片段為NANOBODY® (單域抗體)。在一些態樣中，抗體或抗原結合片段為雙特異性或多特異性抗體。
在各種態樣中，抗體或抗原結合片段為完全人類的。在一些態樣中，抗體或抗原結合片段為人源化的。在一些態樣中，抗體或抗原結合片段為嵌合的。在此等態樣之一些態樣中，嵌合抗體具有非人類V區域及人類C區域。在一些態樣中，抗體或抗原結合片段為非人類的，諸如鼠科或獸醫的。
在某些態樣中，免疫調節劑為多核苷酸。在此等態樣之一些態樣中，多核苷酸包括但不限於mRNA、miRNA、siRNA、反義RNA、shRNA、lncRNA、及dsDNA。在一些態樣中，多核苷酸為RNA(例如 ，mRNA、miRNA、siRNA、反義RNA、shRNA、或lncRNA)。在此等態樣之一些態樣中，當多核苷酸為mRNA時，其可轉譯成所需多肽。在一些態樣中，多核苷酸為微小RNA(miRNA)或前體miRNA分子。在此等態樣之一些態樣中，將miRNA遞送至靶細胞之細胞質，以使得miRNA分子可使靶細胞中之自然mRNA沉默。在一些態樣中，多核苷酸為小干擾RNA(siRNA)或短髮夾RNA(shRNA)，其能夠干擾致癌基因或其他異常調控多肽之表現。在此等態樣之一些態樣中，將siRNA遞送至靶細胞之細胞質，以使得siRNA分子可使靶細胞中之自然mRNA沉默。在一些態樣中，多核苷酸為與mRNA互補之反義RNA。在一些態樣中，多核苷酸為長非編碼RNA(lncRNA)，其能夠調控基因表現且調節疾病。在一些態樣中，多核苷酸為可轉錄成RNA之DNA。在此等態樣之一些態樣中，轉錄RNA可轉譯成所需多肽。
在一些態樣中，免疫調節劑為蛋白、肽、醣脂、或醣蛋白。
在各種態樣中，組成物包含兩種或兩種以上上述免疫調節劑，包括原子、分子等 之混合物、融合物、組合及偶聯物。在一些態樣中，組成物包含與膜締合或封裝在該胞外囊泡之封閉容積內之一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、或十二種不同免疫調節劑。在某些態樣中，組成物包含與多肽組合之核酸。在某些態樣中，組成物包含彼此偶聯之兩種或兩種以上多肽。在某些態樣中，組成物包含偶聯至外源性生物活性分子之蛋白。在此等態樣之一些態樣中，外源性生物活性分子為前藥。
在一些態樣中，本文揭示之EV(例如 ，胞外體)包含靶向部分及STING促效劑。在一些態樣中，本文揭示之EV(例如 ，胞外體)包含靶向部分及TLR促效劑(例如 ，TLR3促效劑)。在一些態樣中，本文揭示之EV(例如 ，胞外體)包含靶向部分及IFN-α或IFN-γ。在一些態樣中，靶向部分特異性結合至aClec9a蛋白(或其變異體)。在此等態樣中之各者中，靶向部分可包含抗原、免疫抑制劑、或兩者。支架 X 工程化 EV ，例如，胞外體，
在一些態樣中，本揭露之EV(例如 胞外體)包含在其組成上經修飾之膜。例如，其膜組成可藉由改變膜之蛋白質、脂質或聚醣含量而經修飾。
在一些態樣中，表面工程化EV(例如 胞外體)藉由化學及/或物理方法，諸如PEG誘導融合及/或超音波融合而產生。在其他態樣中，表面工程化EV(例如 胞外體)藉由遺傳工程化產生。自經遺傳修飾生產細胞或經遺傳修飾細胞之子代產生之EV(例如 胞外體)可含有經修飾之膜組成。在一些態樣中，表面工程化EV(例如 胞外體)具有更高或更低密度(例如 ，更高數目)之支架部分(例如 ，胞外體蛋白，例如 ，支架X)或包括支架部分之變異體或片段。在某些態樣中，表面工程化EV(例如 胞外體)可在其外表面上包含多個(例如 ，兩個或兩個以上)支架部分。在一些態樣中，多個支架部分中之各者為相同的。在其他態樣中，多個支架部分中之一或多者為不同的。
例如，表面(例如 ，支架X)工程化EV可自用編碼支架部分(例如 ，胞外體蛋白，例如 ，支架X)或其變異體或片段之外源序列轉型之細胞(例如 ，HEK293細胞)產生。包括由外源序列表現之支架部分的EV可包括經修飾之膜組成物。
支架部分之各種修飾或片段可用於本揭露之態樣。例如，經修飾以具有增強之對結合劑之親和力的一或多個支架部分可用於產生可用結合劑純化之表面工程化EV。可使用經修飾以便更有效地靶向EV及/或膜的支架部分。亦可使用經修飾以便包含特異性及有效靶向胞外體膜所需要之最小片段的支架部分。
支架部分可經工程化以表現為融合分子，例如 ，支架X與一或多種外源性生物活性分子(例如 ，本文揭示之彼等者，例如 ，治療分子(例如 ，抗原)、佐劑、及/或免疫調節劑)之融合分子。例如，融合分子可包含連接至治療分子(例如 ，抗原)、佐劑、及/或免疫調節劑的本文揭示之支架部分(例如 ，支架X，例如， PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP轉運蛋白、或其片段或變異體)。在融合分子的情況下，治療分子、佐劑、及/或免疫調節劑可為天然肽、重組肽、合成肽、或其任何組合。
在一些態樣中，與在此項技術中已知之EV相比，本文所述表面(例如 ，支架X)工程化EV展現極好特徵。例如，經表面(例如支架X)工程化在其表面上含有比天然存在之EV或使用習知胞外體蛋白產生之EV更高度富含之經修飾蛋白。在一些態樣中，本文所述表面(例如 ，支架X)工程化EV可表現更大數目(例如 ，2個、3個、4個、5個或更多個)外源性生物活性分子，以使得不需要多個EV。另外，與天然存在之EV或使用習知胞外體蛋白所產生之EV相比，本發明之表面(例如 ，支架X)工程化EV可具有更大、更具特異性、或更受控之生物活性。
在一些態樣中，支架X包含前列腺素F2受體負性調節子(PTGFRN多肽)。PTGFRN蛋白亦可稱為CD9配偶體1(CD9P-1)、含Glu-Trp-Ile EWI模體之蛋白F(EWI-F)、前列腺素F2-α受體調節蛋白、前列腺素F2-α受體相關蛋白或CD315。人類PTGFRN蛋白(Uniprot登錄號9P2B2)之全長胺基酸序列在表1中展示為SEQ ID NO: 1。PTGFRN多肽含有信號肽(SEQ ID NO: 1之胺基酸1至25)、胞外域(SEQ ID NO: 1之胺基酸26至832)、跨膜域(SEQ ID NO: 1之胺基酸833至853)、及細胞質域(SEQ ID NO: 1之胺基酸854至879)。成熟PTGFRN多肽由無信號肽之SEQ ID NO: 1，亦即SEQ ID NO: 1之胺基酸26至879組成。在一些態樣中，適用於本揭露之PTGFRN多肽片段包含PTGFRN多肽之跨膜域。在其他態樣中，適用於本揭露之PTGFRN多肽片段包含PTGFRN多肽之跨膜域及(i)跨膜域之N端之至少五個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少40個、至少50個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少110個、至少120個、至少130個、至少140個、至少150個胺基酸、(ii)跨膜域之C端之至少五個、至少10個、至少15個、至少20個、或至少25個胺基酸、或(i)及(ii)兩者。
在一些態樣中，PTGFRN多肽之片段缺少一或多個功能域或結構域，諸如IgV。
在其他態樣中，支架X包含與SEQ ID NO:1之胺基酸26至879具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%相同之胺基酸序列。在其他態樣中，支架X包含與SEQ ID NO:33具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%相同之胺基酸序列。在其他態樣中，支架X包含胺基酸序列SEQ ID NO: 33，除了一個胺基酸突變、兩個胺基酸突變、三個胺基酸突變、四個胺基酸突變、五個胺基酸突變、六個胺基酸突變、或七個胺基酸突變以外。該等突變可為取代、插入、缺失或其任何組合。在一些態樣中，支架X包含胺基酸序列SEQ ID NO: 33及SEQ ID NO:33之N端及/或C端之1個胺基酸、兩個胺基酸、三個胺基酸、四個胺基酸、五個胺基酸、六個胺基酸、七個胺基酸、八個胺基酸、九個胺基酸、十個胺基酸、11個胺基酸、12個胺基酸、13個胺基酸、14個胺基酸、15個胺基酸、16個胺基酸、17個胺基酸、18個胺基酸、19個胺基酸、或20個胺基酸或更長。
在其他態樣中，支架X包含與SEQ ID NO:2、3、4、5、6、或7具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%相同之胺基酸序列。在其他態樣中，支架X包含胺基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7，除了一個胺基酸突變、兩個胺基酸突變、三個胺基酸突變、四個胺基酸突變、五個胺基酸突變、六個胺基酸突變、或七個胺基酸突變以外。該等突變可為取代、插入、缺失或其任何組合。在一些態樣中，支架X包含胺基酸序列SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、或7及SEQ ID NO:2、3、4、5、6、或7之N端及/或C端之1個胺基酸、兩個胺基酸、三個胺基酸、四個胺基酸、五個胺基酸、六個胺基酸、七個胺基酸、八個胺基酸、九個胺基酸、十個胺基酸、11個胺基酸、12個胺基酸、13個胺基酸、14個胺基酸、15個胺基酸、16個胺基酸、17個胺基酸、18個胺基酸、19個胺基酸、或20個胺基酸或更長。
Figure 02_image001
Figure 02_image003
Figure 02_image005
在一些態樣中，支架X包含基礎免疫球蛋白(BSG蛋白)，其由SEQ ID NO: 9表示。BSG蛋白亦稱為5F7、膠原酶刺激因子、細胞外基質金屬蛋白酶誘導物(EMMPRIN)、白血球活化抗原M6、OK血型抗原、腫瘤細胞衍生之膠原酶刺激因子(TCSF)或CD147。人類BSG蛋白之Uniprot編號為P35613。BSG蛋白之信號肽為SEQ ID NO:9之胺基酸1至21。SEQ ID NO: 9之胺基酸138-323為胞外域，胺基酸324至344為跨膜域，且SEQ ID NO: 9之胺基酸345至385為細胞質域。
在其他態樣中，支架X包含與SEQ ID NO:9之胺基酸22至385具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%相同之胺基酸序列。在一些態樣中，BSG多肽之片段缺少一或多個功能域或結構域，諸如IgV，例如 ，SEQ ID NO:9之胺基酸221至315。在其他態樣中，支架X包含與SEQ ID NO:10、11、或12具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%相同之胺基酸序列。在其他態樣中，支架X包含胺基酸序列SEQ ID NO: 10、11、或12，除了一個胺基酸突變、兩個胺基酸突變、三個胺基酸突變、四個胺基酸突變、五個胺基酸突變、六個胺基酸突變、或七個胺基酸突變以外。該等突變可為取代、插入、缺失或其任何組合。在一些態樣中，支架X包含胺基酸序列SEQ ID NO: 10、11、或12及SEQ ID NO:10、11、或12之N端及/或C端之1個胺基酸、兩個胺基酸、三個胺基酸、四個胺基酸、五個胺基酸、六個胺基酸、七個胺基酸、八個胺基酸、九個胺基酸、十個胺基酸、11個胺基酸、12個胺基酸、13個胺基酸、14個胺基酸、15個胺基酸、16個胺基酸、17個胺基酸、18個胺基酸、19個胺基酸、或20個胺基酸或更長。
在一些態樣中，支架X包含免疫球蛋白超家族成員8(IgSF8或IGSF8蛋白)，其亦稱為CD81配偶體3、含有Glu-Trp-Ile EWI模體之蛋白2(EWI-2)、角質細胞相關跨膜蛋白4(KCT-4)、LIR-D1、前列腺素調控樣蛋白(PGRL)或CD316。全長人類IGSF8蛋白在Uniprot中為登錄號Q969P0且在本文中展示為SEQ ID NO: 14。人類IGSF8蛋白具有信號肽(SEQ ID NO: 14之胺基酸1至27)、胞外域(SEQ ID NO: 14之胺基酸28至579)、跨膜域(SEQ ID NO: 14之胺基酸580至600)、及細胞質域(SEQ ID NO: 14之胺基酸601至613)。
在其他態樣中，支架X包含與SEQ ID NO:14之胺基酸28至613具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%相同之胺基酸序列。在一些態樣中，IGSF8蛋白缺少一或多個功能域或結構域，諸如IgV。在其他態樣中，支架X包含與SEQ ID NO:15、16、17、或18具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%相同之胺基酸序列。在其他態樣中，支架X包含胺基酸序列SEQ ID NO: 15、16、17、或18，除了一個胺基酸突變、兩個胺基酸突變、三個胺基酸突變、四個胺基酸突變、五個胺基酸突變、六個胺基酸突變、或七個胺基酸突變以外。該等突變可為取代、插入、缺失或其任何組合。在一些態樣中，支架X包含胺基酸序列SEQ ID 15、16、17、或18及SEQ ID NO:15、16、17、或18之N端及/或C端之1個胺基酸、兩個胺基酸、三個胺基酸、四個胺基酸、五個胺基酸、六個胺基酸、七個胺基酸、八個胺基酸、九個胺基酸、十個胺基酸、11胺基酸、12個胺基酸、13個胺基酸、14個胺基酸、15個胺基酸、16個胺基酸、17個胺基酸、18個胺基酸、19個胺基酸、或20個胺基酸或更長。
在一些態樣中，本揭露之支架X包含免疫球蛋白超家族成員3(IgSF3或IGSF3蛋白)，其亦稱為含有Glu-Trp-Ile EWI模體之蛋白3(EWI-3)，且展示為胺基酸序列SEQ ID NO:20。人類IGSF3蛋白具有信號肽(SEQ ID NO: 20之胺基酸1至19)、胞外域(SEQ ID NO: 20之胺基酸20至1124)、跨膜域(SEQ ID NO: 20之胺基酸1125至1145)、及細胞質域(SEQ ID NO: 20之胺基酸1146至1194)。
在其他態樣中，支架X包含與SEQ ID NO:20之胺基酸28至613具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%相同之胺基酸序列。在一些態樣中，IGSF3蛋白缺少一或多個功能域或結構域，諸如IgV。
在一些態樣中，本揭露之支架X包含整聯蛋白β-1(ITGB1蛋白)，其亦稱為纖維連接蛋白受體亞單位β、醣蛋白IIa(GPIIA)、VLA-4亞單位β、或CD29，且展示為胺基酸序列SEQ ID NO:21。人類ITGB1蛋白具有信號肽(SEQ ID NO: 21之胺基酸1至20)、胞外域(SEQ ID NO: 21之胺基酸21至728)、跨膜域(SEQ ID NO: 21之胺基酸729至751)、及細胞質域(SEQ ID NO: 21之胺基酸752至798)。
在其他態樣中，支架X包含與SEQ ID NO:21之胺基酸21至798具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%相同之胺基酸序列。在一些態樣中，ITGB1蛋白缺少一或多個功能域或結構域，諸如IgV。
在其他態樣中，支架X包含ITGA4蛋白，其包含與無信號肽(SEQ ID NO:22之胺基酸1至33)之SEQ ID NO:22具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列。在一些態樣中，ITGA4蛋白缺少一或多個功能域或結構域，諸如IgV。
在其他態樣中，支架X包含SLC3A2蛋白，其包含與無信號肽之SEQ ID NO:23具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列。在一些態樣中，SLC3A2蛋白缺少一或多個功能域或結構域，諸如IgV。
在其他態樣中，支架X包含ATP1A1蛋白，其包含與無信號肽之SEQ ID NO:24具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列。在一些態樣中，ATP1A1蛋白缺少一或多個功能域或結構域，諸如IgV。
在其他態樣中，支架X包含ATP1A2蛋白，其包含與無信號肽之SEQ ID NO:25具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列。在一些態樣中，ATP1A2蛋白缺少一或多個功能域或結構域，諸如IgV。
在其他態樣中，支架X包含ATP1A3蛋白，其包含與無信號肽之SEQ ID NO:26具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列。在一些態樣中，ATP1A3蛋白缺少一或多個功能域或結構域，諸如IgV。
在其他態樣中，支架X包含ATP1A4蛋白，其包含與無信號肽之SEQ ID NO:27具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列。在一些態樣中，ATP1A4蛋白缺少一或多個功能域或結構域，諸如IgV。
在其他態樣中，支架X包含ATP1A5蛋白，其包含與無信號肽之SEQ ID NO:28具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列。在一些態樣中，ATP1A5蛋白缺少一或多個功能域或結構域，諸如IgV。
在其他態樣中，支架X包含ATP2B1蛋白，其包含與無信號肽之SEQ ID NO:29具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列。在一些態樣中，ATP2B1蛋白缺少一或多個功能域或結構域，諸如IgV。
在其他態樣中，支架X包含ATP2B2蛋白，其包含與無信號肽之SEQ ID NO:30具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列。在一些態樣中，ATP2B2蛋白缺少一或多個功能域或結構域，諸如IgV。
在其他態樣中，支架X包含ATP2B3蛋白，其包含與無信號肽之SEQ ID NO:31具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列。在一些態樣中，ATP2B3蛋白缺少一或多個功能域或結構域，諸如IgV。
在其他態樣中，支架X包含ATP2B4蛋白，其包含與無信號肽之SEQ ID NO:32具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列。在一些態樣中，ATP2B4蛋白缺少一或多個功能域或結構域，諸如IgV。
在其他態樣中，支架X包含IGSF2蛋白，其包含與無信號肽之SEQ ID NO:34具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列。在一些態樣中，IGSF2蛋白缺少一或多個功能域或結構域，諸如IgV。
其他支架X蛋白之非限制性實例可發現於2019年2月5日授予之美國專利第US10195290B1號，其以全文引用方式併入。
在一些態樣中，該序列編碼支架部分之缺少自然蛋白之N端之至少5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、或800個胺基酸的片段。在一些態樣中，該序列編碼支架部分之缺少自然蛋白之C端之至少5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、或800個胺基酸的片段。在一些態樣中，該序列編碼支架部分之缺少自然蛋白之N端及C端之至少5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、或800個胺基酸的片段。在一些態樣中，該序列編碼支架部分之缺少自然蛋白之一或多個功能域或結構域的片段。
在一些態樣中，支架部分(例如 ，支架X，例如 ，PTGFRN蛋白)連接至一或多種異源蛋白。一或多種異源蛋白可連接至支架部分之N端。一或多種異源蛋白可連接至支架部分之C端。在一些態樣中，一或多種異源蛋白連接至支架部分之N端及C端。在一些態樣中，異源蛋白為哺乳動物蛋白。在一些態樣中，異源蛋白為人類蛋白。
在一些態樣中，支架X可用於將任何部分同時連接至EV(例如胞外體)之內腔表面及外表面上。例如，除了EV(例如 胞外體)之外表面以外，PTGFRN多肽可用於將治療分子(例如 ，抗原)、佐劑、及/或免疫調節劑連接至內腔內側(例如 ，內腔表面上)。因此，在某些態樣中，支架X可用於雙重目的，例如 ，治療分子(例如 ，抗原)在內腔表面上且佐劑或免疫調節劑在EV(例如 胞外體)之外表面上，治療分子(例如 ，抗原)在EV(例如胞外體)之外表面上且佐劑或免疫調節劑在內腔表面上，佐劑在內腔表面上且免疫調節劑在EV(例如 胞外體)之外表面上，或免疫調節劑在內腔表面上且佐劑在EV(例如 胞外體)之外表面上。支架 Y 工程化 EV ，例如胞外體
在一些態樣中，本揭露之EV(例如 胞外體)包含不同於天然存在之EV的內部空間(亦即 ，內腔)。例如，可改變EV以使得EV(例如 胞外體)之內腔表面之組成物具有不同於天然存在之胞外體之蛋白、脂質、或聚醣含量(例如 ，包含本文揭示之多種外源性生物活性分子)。
在一些態樣中，工程化EV(例如胞外體)可自用編碼支架部分(例如 ，胞外體蛋白，例如 ，支架Y)或支架部分之修飾或片段的外源序列轉型之細胞產生，該支架部分或其修飾或片段改變EV(例如 胞外體)之內腔表面之組成或含量。可在EV(例如胞外體)之內腔表面上表現之胞外體蛋白之各種修飾或片段可用於本發明之態樣。
在一些態樣中，可改變EV(例如 胞外體)之內腔表面之胞外體蛋白包括但不限於肉豆蔻醯化的富丙胺酸之蛋白激酶C受質(MARCKS)蛋白、肉豆蔻醯化的富丙胺酸之蛋白激酶C受質樣1(MARCKSL1)蛋白、腦酸溶性蛋白1(BASP1)蛋白、或其任何組合。在某些態樣中，本揭露之EV(例如 胞外體)包含兩種或兩種以上(例如 ，2種、3種、4種、5種、或更多種)此類胞外體蛋白。
在一些態樣中，支架Y包含MARCKS蛋白(Uniprot登錄號P29966)。MARCKS蛋白亦稱為蛋白激酶C受質80 kDa蛋白輕鏈。全長人類MARCKS蛋白之長度為332個胺基酸且在胺基酸殘基152-176處包含鈣調蛋白結合域。在一些態樣中，支架Y包含MARCKSL1蛋白(Uniprot登錄號P49006)。MARCKSL1蛋白亦稱為MARCKS-樣蛋白1、及巨噬細胞肉豆蔻醯化的富含丙胺酸之C激酶受質。全長人類MARCKSL1蛋白之長度為195個胺基酸。MARCKSL1蛋白在胺基酸殘基87-110處具有參與脂質結合及鈣調蛋白結合之效應域。在一些態樣中，支架Y包含BASP1蛋白(Uniprot登錄號P80723)。BASP1蛋白亦稱為22 kDa神經元組織富集之酸性蛋白或神經元軸突膜蛋白NAP-22。全長人類BASP1蛋白序列(異構體1)之長度為227個胺基酸。藉由替代性剪接所產生之異構體缺失SEQ ID NO: 49(異構體1)之胺基酸88至141。表2提供本文揭示之示範性支架Y(亦即 ，MARCKS、MARCKSL1、及BASP1蛋白)之全長序列。
Figure 02_image007
成熟BASP1蛋白序列缺失SEQ ID NO: 49之第一Met且因此含有SEQ ID NO: 49之胺基酸2至227。類似地，成熟MARCKS及MARCKSL1蛋白亦分別缺少SEQ ID NO: 47及48之第一Met。因此，成熟MARCKS蛋白含有SEQ ID NO: 47之胺基酸2至332。成熟MARCKSL1蛋白含有SEQ ID NO: 48之胺基酸2至227。
在其他態樣中，適用於本揭露之支架Y包含與SEQ ID NO:49之胺基酸2至227具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列。在其他態樣中，支架Y包含與SEQ ID NO:50-155中之任一者具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列。在其他態樣中，適用於本揭露之支架Y包含胺基酸序列SEQ ID NO: 49，除了一個胺基酸突變、兩個胺基酸突變、三個胺基酸突變、四個胺基酸突變、五個胺基酸突變、六個胺基酸突變、或七個胺基酸突變以外。該等突變可為取代、插入、缺失或其任何組合。在一些態樣中，適用於本揭露之支架Y包含SEQ ID NO: 50-155中之任一者之胺基酸序列及SEQ ID NO:50-155之N端及/或C端處之1個胺基酸、兩個胺基酸、三個胺基酸、四個胺基酸、五個胺基酸、六個胺基酸、七個胺基酸、八個胺基酸、九個胺基酸、十個胺基酸、11個胺基酸、12個胺基酸、13個胺基酸、14個胺基酸、15個胺基酸、16個胺基酸、17個胺基酸、18個胺基酸、19個胺基酸、或20個胺基酸或更長。
在一些態樣中，SEQ ID NO: 47-155中之任一者之蛋白序列對於本揭露之支架Y(例如 ，連接至靶向部分及/或治療分子及/或佐劑及/或免疫調節劑之支架部分)而言係足夠的。
在一些態樣中，適用於本揭露之支架Y包含具有GXKLSKKK之肽，其中X為丙胺酸或任何其他胺基酸(SEQ ID NO: 376)。在一些態樣中，EV(例如胞外體)包含具有序列(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)之肽，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由(Pro、Gly、Ala、Ser)組成之群之任何胺基酸，ξ為選自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)組成之群之任何胺基酸，Φ為選自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)組成之群之任何胺基酸，且(+)為選自由(Lys、Arg、His)組成之群之任何胺基酸；且其中位置五不為(+)且位置六不為(+)亦不為(Asp或Glu)。在其他態樣中，本文所述胞外體(例如 ，工程化胞外體)包含具有序列(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+) (+)之肽，其中各括號位置表示胺基酸，且其中π為選自由(Pro、Gly、Ala、Ser)組成之群之任何胺基酸，X為任何胺基酸，Φ為選自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)組成之群之任何胺基酸，且(+)為選自由(Lys、Arg、His)組成之群之任何胺基酸；且其中位置五不為(+)且位置六不為(+)亦不為(Asp或Glu)。參見 Aasland等人 ,FEBS Letters 513(2002)141-144中之胺基酸命名法。
在其他態樣中，支架Y包含與SEQ ID NO:47-155中之任一者具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一性之胺基酸序列。
本文所述支架Y工程化EV(例如胞外體)可自用在SEQ ID NO:47-155中闡明之序列轉型之細胞產生。
在一些態樣中，適用於本揭露之支架Y蛋白包含「N端域」(ND)及「效應域」(ED)，其中ND及/或ED與EV(例如胞外體)之內腔表面締合。在一些態樣中，適用於本揭露之支架Y蛋白包含胞內域、跨膜域、及胞外域；其中胞內域包含「N端域」(ND)及「效應域」(ED)，其中ND及/或ED與EV(例如胞外體)之內腔表面締合。如本文使用，術語「與…締合」係指支架蛋白與EV(例如胞外體)之內腔表面之間的相互作用，其不涉及與膜組分之共價連接。例如，適用於本揭露之支架可例如經由脂質錨定物(例如，肉豆蔻酸)與EV之內腔表面締合及/或與和膜磷脂之帶負電荷頭部靜電相互作用之多鹼域締合。在其他態樣中，支架Y蛋白包含N端域(ND)及效應域(ED)，其中ND與EV之內腔表面締合且ED藉由離子相互作用與EV之內腔表面締合，其中ED包含呈一定序列之至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、或至少七個連續鹼性胺基酸，例如，離胺酸(Lys)。
在其他態樣中，支架Y蛋白包含N端域(ND)及效應域(ED)，其中ND與EV(例如胞外體)之內腔表面締合，且ED藉由離子相互作用與EV之內腔表面締合，其中ED包含呈一定序列之至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、或至少七個連續鹼性胺基酸，例如，離胺酸(Lys)。
在一些態樣中，ND經由脂化，例如經由肉豆蔻醯化與EV(例如胞外體)之內腔表面締合。在一些態樣中，ND在N端具有Gly。在一些態樣中，N端Gly經肉豆蔻醯化。
在一些態樣中，ED藉由離子相互作用與EV(例如胞外體)之內腔表面締合。在一些態樣中，ED藉由靜電相互作用，尤其是吸引性靜電相互作用與EV(例如胞外體)之內腔表面締合。
在一些態樣中，ED包含(i)鹼性胺基酸(例如，離胺酸)，或(ii)在多肽序列中彼此鄰近之兩個或兩個以上鹼性胺基酸(例如，離胺酸)。在一些態樣中，鹼性胺基酸為離胺酸(Lys；K)、精胺酸(Arg，R)、或組胺酸(His，H)。在一些態樣中，鹼性胺基酸為(Lys)n，其中n為1與10之間的整數。
在其他態樣中，若ED之N端直接連接至ND之C端之離胺酸，亦即，離胺酸為在ED之N端且融合至ND之C端之離胺酸，則ED包含至少一個離胺酸且ND在C端包含離胺酸。在其他態樣中，當ED之N端藉由連接子，例如一或多個胺基酸連接至ND之C端時，ED包含至少兩個離胺酸、至少三個離胺酸、至少四個離胺酸、至少五個離胺酸、至少六個離胺酸、或至少七個離胺酸。
在一些態樣中，ED包含K、KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO: 205)、KKKKK(SEQ ID NO: 206)、R、RR、RRR、RRRR(SEQ ID NO: 207)；RRRRR(SEQ ID NO: 208)、KR、RK、KKR、KRK、RKK、KRR、RRK、(K/R) (K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO: 209)、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R) (K/R)(SEQ ID NO: 210)、或其任何組合。在一些態樣中，ED包含KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO: 205)、KKKKK (SEQ ID NO: 206)、其任何組合。在一些態樣中，ND包含如在G:X2:X3:X4:X5:X6中闡明之胺基酸序列，其中G表示Gly；其中「:」表示肽鍵；其中X2至X6中之各者獨立地表示胺基酸；且其中X6表示鹼性胺基酸。在一些態樣中，X6胺基酸選自由Lys、Arg、及His組成之群。在一些態樣中，X5胺基酸選自由Pro、Gly、Ala、及Ser組成之群。在一些態樣中，X2胺基酸選自由Pro、Gly、Ala、及Ser組成之群。在一些態樣中，X4選自由Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln、及Met組成之群。
在一些態樣中，支架Y蛋白包含N端域(ND)及效應域(ED)，其中ND包含如在G:X2:X3:X4:X5:X6中闡明之胺基酸序列，其中G表示Gly；其中「:」表示肽鍵；其中X2至X6中之各者獨立地為胺基酸；其中X6包含鹼性胺基酸，且其中ED藉由肽鍵連接至X6且在ED之N端包含至少一個離胺酸。
在一些態樣中，支架Y蛋白之ND包含胺基酸序列G:X2:X3:X4:X5:X6，其中G表示Gly；「:」表示肽鍵；X2表示選自由Pro、Gly、Ala、及Ser組成之群的胺基酸；X3表示任何胺基酸；X4表示選自由Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln、及Met組成之群的胺基酸；X5表示選自由Pro、Gly、Ala、及Ser組成之群的胺基酸；且X6表示選自由Lys、Arg、及His組成之群的胺基酸。
在一些態樣中，X3胺基酸選自由Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、及Arg組成之群。
在一些態樣中，ND及ED藉由連接子連接。在一些態樣中，連接子包含一或多個胺基酸。在一些態樣中，術語「連接子」係指肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)或非多肽，例如烷基鏈。在一些態樣中，兩個或兩個以上連接子可串聯連接。一般而言，連接子提供柔性或防止/改善位阻。連接子通常不裂解；然而，在某些態樣中，此類裂解可合乎需要。因此，在一些態樣中，連接子可包含一或多個蛋白酶可裂解位點，該一或多個位點可位於連接子序列內或在連接子序列之任一端處側接連接子。當ND及ED藉由連接子連接時，ED包含至少兩個離胺酸、至少三個離胺酸、至少四個離胺酸、至少五個離胺酸、至少六個離胺酸、或至少七個離胺酸。
在一些態樣中，連接子為肽連接子。在一些態樣中，肽連接子可包含至少約兩個、至少約三個、至少約四個、至少約五個、至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個、至少約30個、至少約35個、至少約40個、至少約45個、至少約50個、至少約55個、至少約60個、至少約65個、至少約70個、至少約75個、至少約80個、至少約85個、至少約90個、至少約95、或至少約100個胺基酸。
在一些態樣中，連接子為甘胺酸/絲胺酸連接子。在一些態樣中，肽連接子為根據式[(Gly)n-Ser]m之甘胺酸/絲胺酸連接子，其中n為1至100之任何整數且m為1至100之任何整數。在其他態樣中，甘胺酸/絲胺酸連接子係根據式[(Gly)x-Sery]z，其中x為1至4之整數，y為0或1，且z為1至50之整數。在一些態樣中，肽連接子包含序列Gn，其中n可為1至100之整數。在一些態樣中，肽連接子可包含序列(GlyAla)n，其中n為1與100之間的整數。在其他態樣中，肽連接子可包含序列(GlyGlySer)n，其中n為1與100之間的整數。
在一些態樣中，肽連接子為合成的，亦即非天然存在的。在一態樣中，肽連接子包括肽(或多肽)(例如，天然或非天然存在之肽)，其包含將胺基酸之第一線性序列連接或基因融合至胺基酸之第二線性序列(其並未天然地連接至或天然地基因融合至第一線性序列)的胺基酸序列。例如，在一態樣中，肽連接子可包含非天然存在之多肽，其為天然存在之多肽的修飾形式(例如，包含突變，諸如添加、取代或缺失)。
在其他態樣中，肽連接子可包含非天然存在之胺基酸。在其他態樣中，肽連接子可包含以並非天然發生之線性序列來出現的天然存在之胺基酸。仍在其他態樣中，肽連接子可包含天然存在之多肽序列。
本揭露亦提供經分離之胞外囊泡(EV)，例如胞外體，其包含連接至支架Y蛋白之靶向部分及額外外源生物活性分子(例如 ，治療分子、佐劑、及/或免疫調節劑)，其中支架Y蛋白包含ND—ED，其中：ND包含G:X2:X3:X4:X5:X6；其中：G表示Gly；「:」表示肽鍵；X2表示選自由Pro、Gly、Ala、及Ser組成之群的胺基酸；X3表示任何胺基酸；X4表示選自由Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Glu、及Met組成之群的胺基酸；X5表示選自由Pro、Gly、Ala、及Ser組成之群的胺基酸；X6表示選自由Lys、Arg、及His組成之群的胺基酸；「—」表示視情況選用之連接子；且ED為包含以下項之效應域：(i)至少兩個連續離胺酸(Lys)，其藉由肽鍵或一或多個胺基酸連接至X6，或(ii)至少一個離胺酸，其藉由肽鍵直接連接至X6。
在一些態樣中，X2胺基酸選自由Gly及Ala組成之群。在一些態樣中，X3胺基酸為Lys。在一些態樣中，X4胺基酸為Leu或Glu。在一些態樣中，X5胺基酸選自由Ser及Ala組成之群。在一些態樣中，X6胺基酸為Lys。在一些態樣中，X2胺基酸為Gly、Ala、或Ser；X3胺基酸為Lys或Glu；X4胺基酸為Leu、Phe、Ser、或Glu；X5胺基酸為Ser或Ala；且X6胺基酸為Lys。在一些態樣中，「—」連接子包含肽鍵或一或多個胺基酸。
在一些態樣中，支架蛋白中之ED包含Lys(K)、KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO: 205)、KKKKK (SEQ ID NO: 206)、Arg(R)、RR、RRR、RRRR(SEQ ID NO: 207)；RRRRR(SEQ ID NO: 208)、KR、RK、KKR、KRK、RKK、KRR、RRK、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO: 209)、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO: 210)、或其任何組合。
在一些態樣中，支架Y蛋白包含選自由以下項組成之群的胺基酸序列：(i)GGKLSKK(SEQ ID NO: 211)、(ii)GAKLSKK(SEQ ID NO: 212)、(iii)GGKQSKK (SEQ ID NO: 213)、(iv)GGKLAKK(SEQ ID NO: 214)、或(v)其任何組合。
在一些態樣中，支架Y蛋白中之ND包含選自由以下項組成之群的胺基酸序列：(i)GGKLSK(SEQ ID NO: 215)、(ii)GAKLSK(SEQ ID NO: 216)、(iii)GGKQSK (SEQ ID NO: 217)、(iv)GGKLAK(SEQ ID NO: 218)、或(v)其任何組合且支架蛋白中之ED包含K、KK、KKK、KKKG (SEQ ID NO: 219)、KKKGY(SEQ ID NO: 220)、KKKGYN (SEQ ID NO: 221)、KKKGYNV(SEQ ID NO: 222)、KKKGYNVN(SEQ ID NO: 223)、KKKGYS(SEQ ID NO: 224)、KKKGYG(SEQ ID NO: 225)、KKKGYGG(SEQ ID NO: 226)、KKKGS(SEQ ID NO: 227)、KKKGSG(SEQ ID NO: 228)、KKKGSGS(SEQ ID NO: 229)、KKKS(SEQ ID NO: 230)、KKKSG(SEQ ID NO: 231)、KKKSGG(SEQ ID NO: 232)、KKKSGGS(SEQ ID NO: 233)、KKKSGGSG(SEQ ID NO: 234)、KKSGGSGG(SEQ ID NO: 235)、KKKSGGSGGS(SEQ ID NO: 236)、KRFSFKKS(SEQ ID NO: 237)。
在一些態樣中，適用於本揭露之支架Y蛋白之多肽序列由選自由以下項組成之群的胺基酸序列組成：(i)GGKLSKK(SEQ ID NO: 211)、(ii)GAKLSKK(SEQ ID NO: 212)、(iii)GGKQSKK(SEQ ID NO: 213)、(iv) GGKLAKK(SEQ ID NO: 214)、或(v)其任何組合。
在一些態樣中，支架Y蛋白包含選自由以下項組成之群的胺基酸序列：(i)GGKLSKKK(SEQ ID NO: 238)、(ii)GGKLSKKS(SEQ ID NO: 239)、(iii) GAKLSKKK(SEQ ID NO: 240)、(iv)GAKLSKKS(SEQ ID NO: 241)、(v)GGKQSKKK(SEQ ID NO: 242)、(vi) GGKQSKKS(SEQ ID NO: 243)、(vii)GGKLAKKK(SEQ ID NO: 244)、(viii)GGKLAKKS(SEQ ID NO: 245)、及(ix)其任何組合。
在一些態樣中，適用於本揭露之支架Y蛋白之多肽序列由選自由以下項組成之群的胺基酸序列組成：(i)GGKLSKKK(SEQ ID NO: 238)、(ii)GGKLSKKS(SEQ ID NO: 239)、(iii)GAKLSKKK(SEQ ID NO: 240)、(iv) GAKLSKKS(SEQ ID NO: 241)、(v)GGKQSKKK(SEQ ID NO: 242)、(vi)GGKQSKKS(SEQ ID NO: 243)、(vii) GGKLAKKK(SEQ ID NO: 244)、(viii)GGKLAKKS(SEQ ID NO: 245)、及(ix)其任何組合。
在一些態樣中，支架Y蛋白之長度為至少約8、至少約9、至少約10、至少約11、至少約12、至少約13、至少約14、至少約15、至少約16、至少約17、至少約18、至少約19、至少約20、至少約21、至少約22、至少約23、至少約24、至少約25、至少約26、至少約27、至少約28、至少約29、至少約30、至少31、至少約32、至少約33、至少約34、至少約35、至少約36、至少約37、至少約38、至少約39、至少約39、至少約40、至少約41、至少約42、至少約43、至少約44、至少約50、至少約46、至少約47、至少約48、至少約49、至少約50、至少約55、至少約60、至少約65、至少約70、至少約75、至少約80、至少85、至少約90、至少約95、至少約100、至少約105、至少約110、至少約115、至少約120、至少約125、至少約130、至少約135、至少約140、至少約145、至少約150、至少約155、至少約160、至少約165、至少約170、至少約175、至少約180、至少約185、至少約190、至少約195、至少約200、至少約205、至少約210、至少約215、至少約220、至少約225、至少約230、至少約235、至少約240、至少約245、至少約250、至少約255、至少約260、至少約265、至少約270、至少約275、至少約280、至少約285、至少約290、至少約295、至少約300、至少約305、至少約310、至少約315、至少約320、至少約325、至少約330、至少約335、至少約340、至少約345、或至少約350個胺基酸。
在一些態樣中，支架Y蛋白之長度為約5個與約10個之間、約10個與約20個之間、約20個與約30個之間、約30個與約40個之間、約40個與約50個之間、約50個與約60個之間、約60個與約70個之間、約70個與約80個之間、約80個與約90個之間、約90個與約100個之間、約100個與約110個之間、約110個與約120個之間、約120個與約130個之間、約130個與約140個之間、約140個與約150個之間、約150個與約160個之間、約160個與約170個之間、約170個與約180個之間、約180個與約190個之間、約190個與約200個之間、約200個與約210個之間、約210個與約220個之間、約220個與約230個之間、約230個與約240個之間、約240個與約250個之間、約250個與約260個之間、約260個與約270個之間、約270個與約280個之間、約280個與約290個之間、約290個與約300個之間、約300個與約310個之間、約310個與約320個之間、約320個與約330個之間、約330個與約340、或約340個與約250個之間的胺基酸。
在一些態樣中，支架Y蛋白包含(i)GGKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO: 246)、 (ii)GAKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO: 247)、 (iii)GGKQSKKKKGYNVN(SEQ ID NO: 248)、 (iv)GGKLAKKKKGYNVN(SEQ ID NO: 249)、 (v)GGKLSKKKKGYSGG(SEQ ID NO: 250)、 (vi)GGKLSKKKKGSGGS(SEQ ID NO: 251)、 (vii)GGKLSKKKKSGGSG(SEQ ID NO: 252)、 (viii)GGKLSKKKSGGSGG(SEQ ID NO: 253)、 (ix)GGKLSKKSGGSGGS(SEQ ID NO: 254)、 (x)GGKLSKSGGSGGSV(SEQ ID NO: 255)、或 (xi)GAKKSKKRFSFKKS(SEQ ID NO: 256)。
在一些態樣中，適用於本揭露之支架Y蛋白之多肽序列由以下項組成：(i)GGKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO: 246)、(ii)GAKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO: 247)、(iii)GGKQSKKKKGYNVN(SEQ ID NO: 248)、 (iv)GGKLAKKKKGYNVN(SEQ ID NO: 249)、 (v)GGKLSKKKKGYSGG(SEQ ID NO: 250)、 (vi)GGKLSKKKKGSGGS(SEQ ID NO: 251)、 (vii)GGKLSKKKKSGGSG(SEQ ID NO: 252)、 (viii)GGKLSKKKSGGSGG(SEQ ID NO: 253)、 (ix)GGKLSKKSGGSGGS(SEQ ID NO: 254)、 (x)GGKLSKSGGSGGSV(SEQ ID NO: 255)、或 (xi)GAKKSKKRFSFKKS(SEQ ID NO: 256^#)。
適用於本揭露之支架Y蛋白的非限制性實例在以下列出。在一些態樣中，支架Y蛋白包含在表3中闡明之胺基酸序列。在一些態樣中，支架Y蛋白由在表3中闡明之胺基酸序列組成。
Figure 02_image009
Figure 02_image011
Figure 02_image013
在一些態樣中，適用於本揭露之支架Y蛋白不包含N端Met。在一些態樣中，支架Y蛋白在支架蛋白之N端包含脂化胺基酸，例如 肉豆蔻醯化胺基酸，其充當脂質錨定物。在一些態樣中，支架蛋白之N端的胺基酸殘基為Gly。N端Gly之存在為N-肉豆蔻醯化之必要要求。在一些態樣中，支架蛋白之N端的胺基酸殘基為合成的。在一些態樣中，支架蛋白之N端的胺基酸殘基為甘胺酸類似物，例如 烯丙基甘胺酸、丁基甘胺酸、或炔丙基甘胺酸。
在其他態樣中，脂質錨定物可為在此項技術中已知之任何脂質錨定物，例如 棕櫚酸或糖基磷脂醯肌醇。在特殊情況下，例如 藉由使用肉豆蔻酸有限之培養基，一些其他脂肪酸(包括較短鏈及不飽和脂肪酸)可連接至N端甘胺酸。例如，據報道在BK通道中，肉豆蔻酸酯在轉錄後經由羥基酯鍵連接至內部絲胺酸/蘇胺酸或酪胺酸殘基。在此項技術中已知之膜錨定物在下表中給出：
Figure 02_image015
連接子
如以上 描述，本揭露之胞外囊泡(EV)(例如 ，胞外體及奈米囊泡)可包含一或多個連接子，其將本文揭示之一或多種外源生物活性分子(例如 ，靶向部分、治療分子(例如 ，抗原)、佐劑、或免疫調節劑)連接至EV(例如 ，至外表面或內腔表面上)。在一些態樣中，一或多種外源生物活性分子(例如 ，靶向部分、治療分子、佐劑、或免疫調節劑)直接或經由一或多個支架部分(例如 ，支架X或支架Y)連接至EV。例如，在某些態樣中，一或多種外源生物活性分子經由支架X連接至胞外體之外表面。在其他態樣中，一或多種外源生物活性分子經由支架X或支架Y連接至胞外體之內腔表面。連接子可為在此項技術中已知之任何化學部分。
如本文使用，術語「連接子 (linker) 」係指肽或多肽序列(例如 ，合成肽或多肽序列)或非多肽，例如 烷基鏈。在一些態樣中，兩個或兩個以上連接子可串聯連接。當存在多個連接子時，連接子中之各者可相同或不同。一般而言，連接子提供柔性或防止/改善位阻。連接子通常不裂解；然而，在某些態樣中，此類裂解可合乎需要。因此，在一些態樣中，連接子可包含一或多個蛋白酶可裂解位點，該一或多個位點可位於連接子序列內或在連接子序列之任一端處側接連接子。
在一些態樣中，連接子為肽連接子。在一些態樣中，肽連接子可包含至少約兩個、至少約三個、至少約四個、至少約五個、至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個、至少約30個、至少約35個、至少約40個、至少約45個、至少約50個、至少約55個、至少約60個、至少約65個、至少約70個、至少約75個、至少約80個、至少約85個、至少約90個、至少約95、或至少約100個胺基酸。
在一些態樣中，肽連接子為合成的，亦即非天然存在的。在一態樣中，肽連接子包括肽(或多肽)(例如，天然或非天然存在之肽)，其包含將胺基酸之第一線性序列連接或基因融合至胺基酸之第二線性序列(其並未天然地連接至或天然地基因融合至第一線性序列)的胺基酸序列。例如，在一態樣中，肽連接子可包含非天然存在之多肽，其為天然存在之多肽的修飾形式(例如，包含突變，諸如添加、取代或缺失)。
連接子可易於裂解(「可裂解連接子」)，由此便於釋放外源生物活性分子(例如 ，靶向部分、治療分子、佐劑、或免疫調節劑)。
在一些態樣中，連接子為「敏感性降低之連接子」。在一些態樣中，敏感性降低之連接子含有二硫鍵。在一些態樣中，連接子為「酸不穩定性連接子」。在一些態樣中，酸不穩定性連接子含有腙。合適的酸不穩定性連接子亦包括例如順式烏頭酸連接子、醯肼連接子、胺硫甲醯基連接子、或其任何組合。
在一些態樣中，連接子包含不可裂解連接子。III 用於產生工程化胞外體之生產細胞
本揭露之EV(例如 胞外體)可由在活體外或受檢者之體液中生長之細胞產生。當胞外體自活體外 細胞培養物產生時，可使用各種生產細胞，例如 HEK293細胞、CHO細胞、及MSC。在某些態樣中，生產細胞不為樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞、肥大細胞、嗜中性球、Kupffer-Browicz細胞、衍生自此等細胞中之任一者之細胞、或其任何組合。
生產細胞可經遺傳修飾以包含一或多個外源序列(例如 ，編碼本文揭示之一或多種外源生物活性分子，例如 ，靶向部分、治療分子(例如 ，抗原)、佐劑、或免疫調節劑)，從而產生本文所述胞外體。經遺傳修飾之生產細胞可藉由瞬時或穩定轉型而含有外源序列。外源序列可作為質體而轉型。外源序列可在靶位點處或隨機位點處穩定地整合至生產細胞之基因組序列中。在一些態樣中，產生用於生產本文揭示之EV(例如 胞外體)的穩定細胞株。
外源序列可插入生產細胞之基因組序列中，定位在編碼胞外體蛋白之內源序列以內、上游(5’-末端)或下游(3’-末端)。此項技術中已知之各種方法可用於引入外源序列至生產細胞中。例如，使用各種基因編輯方法(例如， 使用同源重組、轉位子介導系統、loxP-Cre系統、CRISPR/Cas9或TALEN之方法)修飾之細胞為在本揭露之範圍內。
外源序列可包含編碼本文揭示之支架部分或其片段或變異體的序列。可引入編碼支架部分之序列之額外複本以便產生本文所述胞外體(例如 ，在EV(例如 胞外體)之表面上或內腔表面上具有更高密度的支架部分或表現多個不同支架部分)。可引入編碼支架部分之修飾或片段的外源序列以便產生含有支架部分之修飾或片段之內腔工程化及/或表面工程化胞外體。
在一些態樣中，生產細胞可用一或多個載體修飾(例如 ，轉染)，該一或多個載體編碼連接至本文所述外源生物活性分子(例如 ，靶向部分、治療分子(例如 ，抗原)、佐劑、及/或免疫調節劑)的一或多個支架部分。
在一些態樣中，進一步修飾本文揭示之生產細胞以便包含額外外源序列。例如，可引入額外外源序列以便調節內源性基因表現，或產生包括某種多肽(例如 ，抗原)作為有效負載之胞外體。在一些態樣中，對生產細胞進行修飾以便包含兩個外源序列，一者編碼支架部分(例如 ，支架X及/或支架Y)、或變異體或其片段，且另一者編碼有效負載。在某些態樣中，可進一步修飾生產細胞以包含對胞外體賦予額外功能(例如 ，佐劑、免疫調節劑、或靶向部分)之額外外源序列。在一些態樣中，對生產細胞進行修飾以便包含兩個外源序列，一者編碼本文揭示之支架部分、或變異體或其片段，且另一者編碼對胞外體賦予額外功能(例如 ，佐劑、免疫調節劑、或靶向部分)之蛋白。在一些態樣中，進一步修飾生產細胞以便包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、或十個或更多個額外外源序列。
在一些態樣中，本揭露之EV(例如 胞外體)(例如 ，表面工程化及/或內腔工程化胞外體)可自以一序列轉型之細胞產生，該序列編碼本文揭示之全長成熟支架部分或連接至靶向部分、治療分子(例如 ，抗原)、佐劑、及/或免疫調節劑之支架部分。本文所述支架部分中之任一者可自質體、插入基因組中之外源序列或其他外源核酸諸如合成信使RNA(mRNA)表現。IV 醫藥組成物
本文提供呈適合於投與受試者之形式的醫藥組成物，其包含具有所需純度之本揭露之EV(例如 胞外體)及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。醫藥學上可接受之賦形劑或載劑可部分地藉由所投與之特定組成物以及藉由用於投與組成物之特定方法來確定。因此，存在包含複數個胞外囊泡之醫藥組成物之多種合適調配物。(參見例如 Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa.第21版(2005))。醫藥組成物一般經調配成無菌的並且完全符合美國食品藥物管理局之所有良好操作規範(GMP)規定。
在一些態樣中，醫藥組成物包含一或多種治療劑及本文所述之胞外體。在某些態樣中，EV(例如 胞外體)與一或多個額外治療劑在醫藥學上可接受之載劑中共同投與。在一些態樣中，包含EV(例如 胞外體)之醫藥組成物在投與額外治療劑前投與。在其他態樣中，包含EV(例如 胞外體)之醫藥組成物在投與額外治療劑後投與。在其他態樣中，包含EV(例如 胞外體)之醫藥組成物與額外治療劑同時投與。
可接受之載劑、賦形劑、或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對接受者(例如，動物或人類)為無毒的，且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六烴季銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸、或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如 Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。
載劑或稀釋劑之實例包括但不限於水、鹽水、林格氏溶液、右旋糖溶液、及5%人血清白蛋白。此類介質及化合物在醫藥活性物質中之使用係此項技術中熟知的。除非任何習知媒介物或化合物與本文所述胞外囊泡不相容，否則涵蓋其在組成物中之使用。補充治療劑亦可併入組成物中。通常，醫藥組成物經調配以便與其預定投藥途徑相容。EV(例如 胞外體)可藉由非經腸、局部、靜脈內、經口、皮下、動脈內、皮內、經皮、直腸、顱內、腹膜內、鼻內、腫瘤內、肌肉內途徑或作為吸入劑來投與。在某些態樣中，包含胞外體之醫藥組成物經靜脈內投與，例如 藉由注射。EV(例如胞外體)可視情況與其他治療劑組合投與，該等治療劑至少部分有效治療EV(例如胞外體)所預期針對之疾病、病症或病狀。
溶液或懸浮液可包括以下組分：無菌稀釋劑諸如水、鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌化合物諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲基酯；抗氧化劑諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合化合物諸如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，及用於調節滲透壓之化合物諸如氯化鈉或葡萄糖。pH值可用酸或鹼諸如鹽酸或氫氧化鈉調節。製劑可封裝於安瓿、拋棄式注射器或由玻璃或塑膠製成之多劑量小瓶中。
適於注射應用之醫藥組成物包括無菌水溶液(若為水溶性的)或分散液及無菌散劑。對於靜脈內投與，合適的載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。組成物一般為無菌的，並且應該足夠液體化以便容易注射。載劑可為溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、及液體聚乙二醇、及其類似物)及其合適的混合物。適當的流動性可例如藉由使用塗層諸如卵磷脂、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由利用界面活性劑來保持。對微生物作用之防止可藉由各種抗細菌及抗真菌化合物例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、乙汞硫柳酸鈉及其類似物來實現。若需要，可將等滲透壓化合物例如 糖、多元醇諸如甘露糖醇、山梨糖醇、及氯化鈉添加至組成物。可注射組成物之延長吸收可藉由在組成物中納入延遲吸收之化合物(例如單硬脂酸鋁及明膠)來實現。
無菌可注射溶液可藉由將有效量之EV(例如胞外體)併入根據需要含有本文所列之一種成分或成分之組合的適當溶劑中來製備。一般而言，分散液係藉由將EV(例如胞外體)併入含有基礎分散介質及任何所需其他成分之無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑的情況下，製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，藉此自其先前無菌過濾之溶液產生活性成分加上任何額外所需成分之散劑。EV(例如 胞外體)可以貯庫型注射劑或植入製劑形式投與，其可以允許持續或脈衝釋放EV(例如 胞外體)之方式來配製。
全身性投與包含胞外體之組成物亦可藉由經黏膜方式進行。對於經黏膜投與，在調配物中使用適用於欲滲透之障壁的滲透劑。此類滲透劑一般為此項技術中已知的，並且對於經黏膜投與，包括例如清潔劑、膽汁鹽、及梭鏈孢酸衍生物。經黏膜投與可經由使用例如 鼻腔噴霧劑來實現。
在某些態樣中，將包含胞外體之醫藥組成物靜脈內投與至受益於該醫藥組成物之受試者。在某些其他態樣中，將組成物投與至淋巴系統，例如 藉由淋巴管內注射或藉由結節內注射(參見例如 Senti等人 ，PNAS 105(46): 17908(2008))、或藉由肌肉內注射、藉由皮下投與、藉由腫瘤內注射、藉由直接注射至胸腺中或肝臟中。
在某些態樣中，包含胞外體之醫藥組成物作為液體懸浮液投與。在某些態樣中，醫藥組成物以能夠在投與後形成貯庫物之調配物形式投與。在某些較佳態樣中，貯庫物將EV(例如 胞外體)緩慢釋放至循環中，或以貯庫物形式保持不變。
通常，醫藥學上可接受之組成物經高度純化以便不含污染物，為生物相容且無毒性的，並且適合於投與受試者。若水為載劑之成分，則水經高度純化且處理以便不含污染物，例如 內毒素。
醫藥學上可接受之載劑可為乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、褐藻酸鹽、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、甲基羥基苯甲酸鹽、丙基羥基苯甲酸鹽、滑石、硬脂酸鎂、及/或礦物油，但不限於此。醫藥組成物可進一步包括潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、增味劑、乳化劑、懸浮劑、及/或防腐劑。
本文所述之醫藥組合物包含本文所述EV(例如 胞外體)及視情況醫藥學活性劑或治療劑。治療劑可為生物劑、小分子劑、或核酸劑。
提供包含含有本文所述EV(例如 胞外體)之醫藥組成物的劑型。在一些態樣中，將劑型調配成靜脈內注射用液體懸浮液。在一些態樣中，將劑型調配成腫瘤內注射用液體懸浮液。
在某些態樣中，胞外體之製劑經受輻射，例如 X射線、γ射線、β粒子、α粒子、中子、質子、元素核、UV射線，以便破壞殘餘有複製能力之核酸。
在某些態樣中，胞外體之製劑經受使用多於1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、或多於100 kGy之照射劑量的γ照射。
在某些態樣中，胞外體之製劑經受使用多於0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、或大於10000 mSv之照射劑量的X射線照射。V 套組
本文亦提供包含一或多種本文所述胞外體的套組。在一些態樣中，本文提供包含一或多個容器、視情況選用之說明書之醫藥包裝或套組，該一或多個容器填充有本文所述之醫藥組合物之成分中之一或多者，諸如本文提供之一或多種胞外體。在一些態樣中，套組含有本文所述之醫藥組成物及任何預防劑或治療劑，諸如本文所述之彼等者。VI 產生胞外體之方法
在一些態樣中，本揭露亦係關於產生本文所述之胞外體之方法。在一些態樣中，該方法包含：自生產細胞獲得EV(例如 胞外體)，其中生產細胞含有EV(例如 胞外體)之兩種或兩種以上組分(例如 ，(i)治療分子及佐劑，(ii)治療分子及免疫調節劑，或(iii)治療分子、佐劑、及免疫調節劑)；及視情況分離所獲得之EV(例如 胞外體)。在一些態樣中，該方法包含：藉由引入本文揭示之胞外體之兩種或兩種以上組分(例如 ，(i)治療分子及佐劑，(ii)治療分子及免疫調節劑，或(iii)治療分子，佐劑，及免疫調節劑)來修飾生產細胞；自經修飾生產細胞獲得EV(例如 胞外體)；及視情況分離所獲得之EV(例如 胞外體)。在其他態樣中，該方法包含：自生產細胞獲得胞外體；分離所獲得之胞外體；及修飾經分離之胞外體(例如 ，藉由插入多種外源生物活性分子，例如 治療分子、佐劑、免疫調節劑、及/或靶向部分)。在某些態樣中，該方法進一步包含將經分離之胞外體調配成醫藥組成物。修飾生產細胞之方法
如以上 描述，在一些態樣中，產生胞外體之方法包含用多種(例如 ，兩種或兩種以上)本文所述之外源生物活性分子(例如 ，治療分子、佐劑、免疫調節劑、及/或靶向部分)修飾生產細胞。在一些態樣中，本文揭示之生產細胞可進一步用本文揭示之支架部分(例如 ，支架X或支架Y)修飾。
在一些態樣中，生產細胞可為哺乳動物細胞株、植物細胞株、昆蟲細胞株、真菌細胞株、或原核細胞株。在某些態樣中，生產細胞為哺乳動物細胞株。哺乳動物細胞株之非限制性實例包括：人類胚胎腎(HEK)細胞株、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株、HT-1080細胞株、海拉細胞株、PERC-6細胞株、CEVEC細胞株、纖維母細胞細胞株、羊水細胞細胞株、上皮細胞株、間質幹細胞(MSC)細胞株、及其組合。在某些態樣中，哺乳動物細胞株包含HEK-293細胞、BJ人類包皮纖維母細胞、fHDF纖維母細胞、AGE.HN® 神經元前驅細胞、CAP® 羊水細胞、脂肪間質幹細胞、RPTEC/TERT1細胞、或其組合。在一些態樣中，生產細胞為原代細胞。在某些態樣中，原代細胞可為原代哺乳動物細胞、原代植物細胞、原代昆蟲細胞、原代真菌細胞、或原代原核細胞。
在一些態樣中，生產細胞不為免疫細胞，諸如抗原呈遞細胞、T細胞、B細胞、自然殺手細胞(NK細胞)、巨噬細胞、T輔助細胞、或調控T細胞(Treg細胞)。在其他態樣中，生產細胞不為抗原呈遞細胞(例如 ，樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞、肥大細胞、嗜中性球、Kupffer-Browicz細胞、或衍生自此等細胞中之任一者之細胞)。
在一些態樣中，用於修飾生產細胞之多種外源生物活性分子可為轉基因或mRNA，且藉由轉染、病毒轉導、電穿孔、擠壓、音波處理、細胞融合、或熟習此項技術者已知之其他方法來引入生產細胞中。
在一些態樣中，多種外源生物活性分子藉由轉染來引入生產細胞中。在一些態樣中，多種外源生物活性分子可使用合成巨分子諸如陽離子脂質及聚合物來引入合適生產細胞中(Papapetrou等人 ，Gene Therapy 12: S118-S130(2005))。在一些態樣中，陽離子脂質經由電荷相互作用來與多種外源生物活性分子形成複合物。在此等態樣之一些態樣中，帶正電荷之複合物結合至帶負電荷之細胞表面且被細胞藉由胞吞作用吸收。在一些其他態樣中，陽離子聚合物可用於轉染生產細胞。在此等態樣之一些態樣中，陽離子聚合物為聚乙烯亞胺(PEI)。在某些態樣中，化學品諸如磷酸鈣、環糊精、或凝聚胺可用於將多種外源生物活性分子引入生產細胞。多種外源生物活性分子亦可使用物理方法諸如粒子介導轉染、「基因槍」、生物彈道技術、或粒子轟擊技術來引入生產細胞中(Papapetrou等人 ，Gene Therapy 12: S118-S130(2005))。報導基因諸如β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、螢光素酶或綠色螢光蛋白可用於評價生產細胞之轉染效率。
在某些態樣中，多種外源生物活性分子藉由病毒轉導來引入生產細胞中。許多病毒可用作基因轉移媒劑，包括莫洛尼(moloney)鼠類白血病病毒(MMLV)、腺病毒、腺相關病毒(AAV)、單純皰疹病毒(HSV)、慢病毒及泡沫病毒。病毒介導之基因轉移媒劑包含基於DNA病毒之載體，諸如腺病毒、腺相關病毒及皰疹病毒，以及基於逆轉錄病毒之載體。
在某些態樣中，多種外源生物活性分子藉由電穿孔引入生產細胞中。電穿孔在細胞膜中產生瞬時的孔，從而允許各種分子引入細胞中。在一些態樣中，DNA及RNA以及多肽及非多肽治療劑可藉由電穿孔來引入生產細胞中。
在某些態樣中，多種外源生物活性分子藉由顯微注射來引入生產細胞中。在一些態樣中，玻璃微量吸移管可用於在微觀水準下將多種外源生物活性分子注射至生產細胞中。
在某些態樣中，多種外源生物活性分子藉由擠壓來引入生產細胞中。
在某些態樣中，多種外源生物活性分子藉由音波處理來引入生產細胞中。在一些態樣中，生產細胞暴露於高強度音波，導致細胞膜之瞬時破壞，從而允許負載多種外源生物活性分子。
在某些態樣中，多種外源生物活性分子藉由細胞融合來引入生產細胞中。在一些態樣中，多種外源生物活性分子藉由電細胞融合來引入。在其他態樣中，聚乙二醇(PEG)用於融合生產細胞。在其他態樣中，仙台病毒用於融合生產細胞。
在一些態樣中，多種外源生物活性分子藉由低滲透壓溶胞來引入生產細胞中。在此類態樣中，生產細胞可暴露於低離子強度緩衝液，導致其破裂，從而允許負載一或多個部分。在其他態樣中，針對低滲溶液之可控透析可用於使生產細胞溶脹且在生產細胞膜中產生孔。生產細胞隨後暴露於容許膜之再封的條件下。
在一些態樣中，多種外源生物活性分子藉由清潔劑處理來引入生產細胞中。在某些態樣中，生產細胞用溫和清潔劑處理，該清潔劑藉由形成孔而瞬時損害生產細胞膜，從而允許負載多種外源生物活性分子。在負載生產細胞之後，沖掉清潔劑，從而再封該膜。
在一些態樣中，多種外源生物活性分子藉由受體介導之胞吞作用來引入生產細胞中。在某些態樣中，生產細胞具有表面受體，其在結合多種外源生物活性分子時，誘導受體及所締合分子之內化。
在一些態樣中，多種外源生物活性分子藉由過濾來引入生產細胞中。在某些態樣中，可迫使生產細胞及多種外源生物活性分子穿過孔徑小於生產細胞之過濾器，導致生產細胞膜之瞬時破壞且允許多種外源生物活性分子進入生產細胞。
在一些態樣中，生產細胞經受若干次冷凍解凍循環，導致細胞膜破壞，從而允許負載多種外源生物活性分子。修飾胞外體之方法
在一些態樣中，產生胞外體之方法包含藉由直接將多種外源生物活性分子引入EV中來修飾經分離之胞外體。在某些態樣中，多種外源生物活性分子包含治療分子(例如 ，抗原)、佐劑、免疫調節劑、靶向部分、或其組合。在一些態樣中，經分離之胞外體可藉由使用本文揭示之用於將多種外源生物活性分子引入EV(例如 胞外體)中之方法中之任一者來直接引入本文揭示之支架部分(例如 ，支架X或支架Y)而進行進一步修飾。
在某些態樣中，多種外源生物活性分子藉由轉染來引入胞外體。在一些態樣中，多種外源生物活性分子可使用合成巨分子諸如陽離子脂質及聚合物來引入EV中(Papapetrou等人 ，Gene Therapy 12: S118-S130(2005))。在某些態樣中，化學品諸如磷酸鈣、環糊精、或凝聚胺可用於將多種外源生物活性分子引入EV。
在某些態樣中，多種外源生物活性分子藉由電穿孔來引入EV中。在一些態樣中，胞外體暴露於電場，該電場在EV膜中產生瞬時孔，從而允許負載多種外源生物活性分子。
在某些態樣中，多種外源生物活性分子藉由顯微注射來引入EV中。在一些態樣中，玻璃微量吸移管可用於在微觀水準下將多種外源生物活性分子直接注射至EV中。
在某些態樣中，多種外源生物活性分子藉由擠壓來引入EV中。
在某些態樣中，多種外源生物活性分子藉由音波處理來引入EV中。在一些態樣中，EV暴露於高強度音波，導致EV膜之瞬時破壞，從而允許負載多種外源生物活性分子。
在一些態樣中，多種外源生物活性分子可偶聯至EV之表面。偶聯可藉由在此項技術中已知之方法來化學或酶促達成。
在一些態樣中，EV包含多種(例如， 兩種或兩種以上)經化學偶聯之外源生物活性分子。化學偶聯可藉由在使用或不使用連接子的情況下將多種外源生物活性分子與另一分子共價鍵結來實現。形成此類偶聯物為熟習此項技術者之技能範圍內且用於實現偶聯之各種技術為已知的，且特定技術之選擇藉由待偶聯之材料來指導。在某些態樣中，多肽偶聯至EV。在一些態樣中，非多肽諸如脂質、碳水化合物、核酸、及小分子偶聯至EV。
在一些態樣中，多種外源生物活性分子藉由低滲透壓溶胞來引入EV中。在此類態樣中，EV可暴露於低離子強度緩衝液，導致其破裂，從而允許負載多種外源生物活性分子。在其他態樣中，針對低滲溶液之可控透析可用於使EV溶脹且在EV膜中產生孔。EV隨後暴露於允許將膜再封之條件。
在一些態樣中，多種外源生物活性分子藉由清潔劑處理來引入EV中。在某些態樣中，胞外囊泡用溫和清潔劑處理，該清潔劑藉由形成孔而瞬時損害EV膜，從而允許負載多種外源生物活性分子。在負載EV後，沖掉清潔劑，從而再封該膜。
在一些態樣中，多種外源生物活性分子藉由受體介導之胞吞作用來引入EV中。在某些態樣中，EV具有表面受體，其在結合多種外源生物活性分子時，誘導受體及所締合分子之內化。
在一些態樣中，多種外源生物活性分子藉由機械點火來引入EV中。在某些態樣中，胞外囊泡可用連接至重粒子或帶電粒子諸如金微載體之多種外源生物活性分子來轟擊。在此等態樣之一些態樣中，粒子可經機械或電加速以使得其橫穿EV膜。
在一些態樣中，胞外囊泡經受若干次冷凍解凍循環，導致EV膜破壞，從而允許負載多種外源生物活性分子。分離 EV( 例如胞外體 ) 之方法
在一些態樣中，產生本文揭示之EV之方法包含將EV自生產細胞中分離。在某些態樣中，EV由生產細胞釋放至細胞培養基中。預期分離EV之所有已知方法皆被視為適合於本文中之用途。例如，EV之物理性質可用來將其從培養基或其他源材料中分離，包括基於電荷(例如 ，電泳分離)、尺寸(例如 ，過濾、分子篩分等 )、密度(例如 ，普通或梯度離心)、Svedberg常數(例如 ，在使用或不使用外力的情況下之沉澱等 )之分離。或者或另外，分離可基於一或多種生物性質，且包括可使用表面標記物之方法(例如 ，用於沉澱、與固相之可逆性結合、FACS分離、特異性配位體結合、非特異性配位體結合、親和力純化等 )。
分離及富集可以一般及非選擇性方式(通常包括連續離心)來進行。或者，分離及富集可以更具特異性及選擇性之方式(諸如使用EV或生產細胞特異性表面標記物)進行。例如，特異性表面標記物可用於免疫沉澱、FACS分選、親和力純化、及使用珠粒結合配位體之磁力分離。
在一些態樣中，尺寸排阻層析可用於分離EV。尺寸排阻層析技術為此項技術中已知的。本文提供示範性非限制性技術。在一些態樣中，一部分空隙容積得以分離且包含所關注之EV。此外，在一些態樣中，EV可在層析分離後藉由離心技術進一步分離(一或多個層析溶離份)，如通常在此項技術中已知的。在一些態樣中，例如，密度梯度離心可用於進一步分離胞外囊泡。在某些態樣中，可能希望進一步將生產細胞來源之EV與其他來源之EV分離。例如，生產細胞來源之EV可藉由使用對生產細胞具特異性之抗原抗體的免疫吸附捕獲來與非生產細胞來源之EV分離。
在一些態樣中，EV之分離可涉及各方法之組合，該等方法包括但不限於差速離心、基於尺寸之膜過濾、免疫沉澱、FACS分選、及磁力分離。治療方法
本揭露亦提供預防及/或治療有需要之受試者之疾病或病症的方法，其包含向受試者投與本文揭示之EV(例如 ，胞外體)。在一些態樣中，可用本發明方法治療之疾病或病症包含癌症、血友病、糖尿病、生長因子缺乏症、眼睛疾病、移植物抗宿主疾病(GvHD)、自體免疫疾病、胃腸道疾病、心血管疾病、呼吸疾病、過敏性疾病、退行性疾病、感染性疾病、纖維變性疾病、或其任何組合。在某些態樣中，可治療之疾病或病症與慢性炎症相關。在一些態樣中，治療為預防性的。在其他態樣中，本揭露之EV(例如 ，胞外體)用於誘導免疫反應。在其他態樣中，本揭露之EV用於對受試者進行疫苗接種。
在一些態樣中，疾病或病症為癌症。在某些態樣中，當向患有癌症之受試者投與時，本揭露之EV可上調免疫反應且增強受試者之免疫系統之腫瘤靶向。在一些態樣中，所治療之癌症之特徵在於白血球(T-細胞、B-細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、單核球)浸潤至腫瘤微環境或所謂「熱腫瘤」或「炎症性腫瘤」中。在一些態樣中，所治療之癌症之特徵在於低水準或不可偵測水準之白血球浸潤至腫瘤微環境或所謂「冷腫瘤」或「非炎症性腫瘤」中。在一些態樣中，投與EV之量及持續時間足以將「冷腫瘤」轉化成「熱腫瘤」，亦即 ，該投與導致白血球(諸如T-細胞)浸潤至腫瘤微環境中。在某些態樣中，癌症包含膀胱癌、宮頸癌、腎細胞癌、睾丸癌、結腸直腸癌、肺癌、頭頸癌、及卵巢癌、淋巴瘤、肝癌、膠質母細胞瘤、黑素瘤、骨髓瘤、白血病、胰腺癌、或其組合。在其他術語中，「遠端腫瘤 (distal tumor )」或「遠側腫瘤 (distant tumor) 」係指從初始(或原發性)腫瘤擴散至遠側器官或遠側組織(例如 淋巴結)之腫瘤。在一些態樣中，本揭露之EV治療轉移性擴散後之腫瘤。
在一些態樣中，疾病或病症為移植物抗宿主疾病(GvHD)。在一些態樣中，可用本揭露治療之疾病或病症為自體免疫疾病。自體免疫疾病之非限制性實例包括：多發性硬化、周圍神經炎、休格倫氏症候群(Sjogren’s syndrome)、類風濕性關節炎、脫髮、自體免疫性胰腺炎、Behcet氏病、大皰性類天皰瘡、乳糜瀉、Devic氏病(視神經脊髓炎)、腎絲球腎炎、IgA腎病、組合型血管炎、硬皮病、糖尿病、動脈炎、白斑病、潰瘍性結腸炎、腸躁症候群、牛皮癬、葡萄膜炎、全身性紅斑狼瘡及其組合。
在一些態樣中，疾病或病症為感染性疾病。在某些態樣中，疾病或病症為致癌病毒。在一些態樣中，可用本揭露治療之感染性疾病包括但不限於人類γ皰疹病毒4(愛潑斯坦巴爾病毒)、A型流感病毒、B型流感病毒、巨細胞病毒、金黃色葡萄球菌、結核分枝桿菌、沙眼衣原體、HIV-1、HIV-2、冠狀病毒(例如 ，MERS-CoV及SARS CoV)、絲狀病毒(例如 ，馬堡病毒及埃博拉病毒)、化膿性鏈球菌、肺炎鏈球菌、瘧原蟲物種(例如 ，間日瘧原蟲及惡性瘧原蟲)、Chikungunya病毒、人類乳頭瘤病毒(HPV)、B型肝炎、C型肝炎、人類皰疹病毒8、單純性皰疹病毒2(HSV2)、克雷伯氏菌屬、銅綠假單胞菌、腸球菌屬、變形菌屬、腸桿菌屬、放線桿菌屬、凝固酶陰性葡萄球菌(CoNS)、支原體屬、或其組合。
在一些態樣中，將EV(例如 ，胞外體)靜脈內投與至受試者之循環系統。在一些態樣中，EV以合適液體輸注且投與至受試者之血管。
在一些態樣中，將EV(例如 ，胞外體)動脈內投與至受試者之循環系統。在一些態樣中，EV以合適液體輸注且投與至受試者之動脈。
在一些態樣中，將EV(例如 ，胞外體)藉由鞘內投與來投與至受試者。在一些態樣中，將EV經由 注射來投與至脊髓管或蛛網膜下腔中以使得其到達腦脊髓液(CSF)。
在一些態樣中，將EV(例如 ，胞外體)腫瘤內投與至受試者之一或多個腫瘤。
在一些態樣中，將EV(例如 ，胞外體)藉由鼻內投與來投與至受試者。在一些態樣中，EV可以局部投與或全身投與之形式來經由鼻部吸入。在某些態樣中，EV作為鼻用噴霧劑來投與。
在一些態樣中，將EV(例如 ，胞外體)藉由腹膜內投與來投與至受試者。在一些態樣中，EV以合適液體輸注且注射至受試者之腹膜中。在一些態樣中，腹膜內投與使得EV分佈至淋巴管。在一些態樣中，腹膜內投與使得EV分佈至胸腺、脾臟、及/或骨髓。在一些態樣中，腹膜內投與使得EV分佈至一或多個淋巴結。在一些態樣中，腹膜內投與使得EV分佈至頸部淋巴結、腹股溝淋巴結、縱膈淋巴結、或胸骨淋巴結中之一或多者。在一些態樣中，腹膜內投與使得EV分佈至胰腺。
在一些態樣中，將EV(例如 胞外體)藉由眼周投與來投與至受試者。在一些態樣中，將其注射至眼周組織中。眼周藥物投與包括結膜下、眼球筋膜前、眼球筋膜後、及眼球後投與途徑。
除非另外指示，否則本揭露之實踐將使用細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉基因生物學、微生物學、重組DNA、及免疫學之習知技術，此等技術為在此項技術之技能範圍內。此等技術在文獻中有充分說明。參見 例如Sambrook等人 編(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人 編(1992)Molecular Cloning: A Laboratory Manual,(Cold Springs Harbor Laboratory, NY)；D. N. Glover編,(1985)DNA Cloning, 第I卷及第II卷；Gait編(1984)Oligonucleotide Synthesis；Mullis. 等人 美國專利第4,683,195號；Hames及Higgins編(1984)Nucleic Acid Hybridization；Hames及Higgins編(1984)Transcription And Translation; Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(Alan R. Liss, Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology(Academic Press, Inc., N.Y.)；Miller及Calos編(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,(Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu等人 編, Methods In Enzymology, 第154卷及第155卷；Mayer及Walker編(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press, London)；Weir及Blackwell編,(1986)Handbook Of Experimental Immunology, 第I-IV卷; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,(1986); )；Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 第2版CRC Press(2007)及Ausubel等人 (1989)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)。
以上引用之所有參考文獻以及本文引用之所有參考文獻全部均以引用方式併入本文。
以下實例藉助於說明且非藉助於限制來提供。 實例 實例1：抗-Clec9A EV(例如 ，胞外體)構築體之表徵
為了評估使用靶向部分增加所關注之特定細胞對EV(例如 ，胞外體)之吸收的功效，產生四種不同抗-Clec9a胞外體構築體。圖1提供在胞外體構築體上表現之不同靶向部分之示意圖：(i)連接至全長支架X蛋白之抗-Clec9a單鏈Fv片段(「scFab-FLPrX」)；(ii)連接至截短支架X蛋白之抗-Clec9a單鏈Fv片段(「ScFv-SLPrX」)；(iii)連接至全長支架X蛋白之抗-Clec9a單鏈F(ab)片段(「scFab-FLPrX」)；及(iv)連接至截短支架X蛋白之抗-Clec9a單鏈F(ab)片段(「scFab-SLPrX」)。簡言之，抗小鼠Clec9A純系10B4抗體之序列(參見 Caminschi等人， Blood 112:3264(2008)；美國公開案第2013/0273150號)用於設計單鏈F(ab)或Fv抗體片段。使用截短或全長支架X蛋白，在胞外體之外表面上表現抗體片段。胞外體中之各者亦包含綠色螢光蛋白(GFP)標籤以便有助於表現分析。
為了開始對構築體進行表徵，使用表現不同抗-Clec9a靶向部分之胞外體來轉染HEK293細胞。然後，藉由流動式細胞測量術來確定GFP+ 之經轉染細胞之百分比。亦評估經轉染之HEK293細胞所產生之胞外體中之GFP表現以確定胞外體所表現之靶向部分之相對量。另外，使用OCTET分析來評估不同胞外體與小鼠及人類Clec9a蛋白之結合。
如圖2A中展示，在用不同抗-Clec9a靶向部分構築體轉染之HEK293細胞之間，GFP表現為可比較的，這表明不同構築體具有可比較的轉染效率。然而，關於在胞外體上表現之靶向部分之量及胞外體結合至小鼠及人類Clec9a蛋白之能力，觀察到明顯差異。如圖2B中展示，在所測試之不同構築體之間，胞外體主要表現連接至全長或截短支架X蛋白之抗-Clec9a單鏈F(ab)抗體片段。關於其結合能力，如圖3A-3C展示，表現連接至全長支架X蛋白之抗-Clec9a單鏈F(ab)(亦即 ，抗-Clec9a scFab-FLPrX)之胞外體構築體呈現出與小鼠及人類Clec9A蛋白之最大結合。因此，選擇此胞外體構築體以便進一步分析。 實例2：分析在經分離人類樹突狀細胞中之吸收
為了評估在實例1中描述之抗-Clec9a scFab-FLPrX胞外體構築體是否可特異性靶向表現人類Clec9a蛋白之細胞，使用基於pan-樹突狀細胞陰性珠粒之RoboSep套組以便純化來自四種不同人類供體PBMC之樹突狀細胞(DC)。將經純化DC與不同濃度之胞外體構築體培育隔夜。作為對照，將一些DC與表現單獨支架X蛋白之胞外體一起培育。然後，使用流動式細胞測量術來量測不同DC群體(亦即 ，漿細胞樣DC(pDC)、習知DC1(cDC1)、及習知DC2(cDC2))對胞外體之吸收。不同DC子集之閘控策略在圖4中提供。
如圖5A-5D(底部圖形)展示，在所有四個供體之間，存在cDC1細胞對抗-Clec9a scFab-FLPrX EV構築體之優先吸收。相比之下，在不同供體之間，表現單獨支架X之EV之吸收係不同的。圖5A-5D(頂部圖形)。例如，在供體1中，在cDC2群體中觀察到對照EV(亦即 ，表現單獨支架X)之最大吸收。然而，在供體2中，在cDC1細胞中觀察到最大吸收。
以上結果證明抗-Clec9a scFab-FLPrX胞外體構築體可特異性靶向人類cDC1細胞，使得cDC1細胞對胞外體之吸收更大。 實例3：分析在經分離小鼠樹突狀細胞中之吸收
為了評估優先靶向表現小鼠Clec9A蛋白之細胞之能力，自小鼠脾細胞純化總樹突狀細胞。然後，將細胞與不同濃度之抗-Clec9a scFab-FLPrX胞外體或對照胞外體構築體(亦即 ，表現單獨支架X蛋白)一起培養隔夜。再次使用流動式細胞測量術來評估不同DC群體對胞外體構築體之吸收。使用以下表型標記物來鑑別不同DC群體：(i)pDC：CD317+ 、XCR1- 、Sirpα- ；(ii)cDC1：、XCR1+ 、Clec9a+ 、Sirpα- ；及(iii)cDC2：、CD8+ 、CD11b+ 、Sirpα+ 、XCR1- 、CD1c,b+ 。圖6。
如先前對於人類DC所觀察到的，與其他DC群體相比，存在cDC1群體對抗-Clec9a scFab-FLPrX胞外體構築體之優先吸收。圖7A。相比之下，在不同DC群體之間，對照胞外體(亦即 ，表現單獨支架X蛋白)之吸收係可比較的。圖7B。
為了確定經增加之吸收是否歸因於Clec9a結合，在細胞與胞外體構築體一起培養之後，在不同DC群體中評估Clec9a蛋白之表現。如圖8A及8B所示，當用對照EV治療時，在cDC1及pDC細胞中無Clec9a表現之顯著下調。然而，使用抗-Clec9a scFab-FLPrX胞外體構築體，在cDC1細胞及pDC中觀察到Clec9a表現之顯著下調。下調對Clec9a蛋白具有特異性，因為對於兩種胞外體構築體而言，在cDC1細胞中未觀察到其他非Clec9a蛋白(例如 ，XCR1)之表現的顯著差異。圖8C。
以上結果證明抗-Clec9a scFab-FLPrX胞外體構築體亦可特異性靶向小鼠cDC1細胞。 實例4：分析在Clec9a-表現HEK細胞中之吸收
為了進一步確認抗-Clec9a scFab-FLPrX胞外體特異性靶向Clec9a-表現細胞之能力，將人類胚胎腎(HEK)細胞用人類或小鼠Clec9a蛋白轉染。然後，使用以下三種不同抗-Clec9a抗體來確認經轉染細胞之Clec9a表現：(i)抗小鼠10b4抗體；(ii)抗小鼠7h11抗體；及(iii)抗人類E8F抗體。如圖9A及9B展示，小鼠及人類Clec9a在HEK細胞中穩定表現且可藉由不同抗-Clec9a抗體來偵測到。
隨後，將Clec9a-表現HEK細胞與抗-Clec9a scFab-FLPrX胞外體構築體或對照胞外體(亦即 ，表現單獨支架X蛋白)一起培養。胞外體進一步包含GFP蛋白標籤，其用於量測HEK細胞中之胞外體吸收。如圖10A及10B所示，在人類Clec9a-表現HEK細胞中觀察到抗-Clec9a scFab-FLPrX EV之顯著吸收。吸收對Clec9a表現具有特異性，因為在未轉染HEK細胞(亦即 ，不表現Clec9a)中觀察到最小吸收。類似地，在轉染及未轉染HEK細胞中，無對照EV之顯著吸收。人類Clec9a-表現HEK細胞所進行之吸收增加早在培育後4小時即顯現。圖10A。對於小鼠Clec9a-表現HEK細胞觀察到類似結果。圖11。
總之，以上結果確認本文揭示之抗-Clec9a靶向部分之特異性，且表明表現此類靶向部分之EV可特異性靶向Clec9a表現細胞，諸如cDC1細胞。 實例5：評估抗-Clec9a-表現EV(例如 ，胞外體)在活體內 之免疫細胞生物分佈
為了評估表現抗-Clec9a靶向部分之EV(例如 ，胞外體)是否可在活體內 特異性靶向Clec9a-表現細胞，使用B16F10腫瘤(黑素瘤)小鼠模型。如圖12A中展示，用B16腫瘤細胞接種小鼠。當腫瘤之平均尺寸達到100 mm3 (大約腫瘤誘導後第8天)時，動物接受以下項中之一者之單一靜脈內投與：(i)單獨PBS；(ii)抗-Clec9a-表現胞外體；或(iii)對照胞外體(亦即 ，表現單獨支架X蛋白)。圖12B提供不同治療組。向動物投與2 x 1011 個粒子之劑量之胞外體。胞外體投與後1小時處死動物且評估血液、脾臟、及腫瘤中之胞外體吸收。將所有胞外體用Cy5-ASO標記且因此藉由使用流動式細胞測量術量測Cy5-ASO表現而評估吸收。
如圖12C中展示，在血液中，對於以下細胞類型而言，在用兩種EV中之任一者治療之動物(亦即 ，圖12B中之第II組及第III組)之間，無胞外體吸收之明顯差異：(i)cDC2、(ii)pDC、(iii)CD11b+ Ly6C+(單核球)；(iv)CD11b+ Ly6G+(嗜中性球)；及(v)T、NK、B細胞。然而，在cDC1群體中，存在吸收之顯著差異。如圖12C中展示，與對照動物(亦即 ，圖12B中之第III組)相比，用抗-Clec9a-表現胞外體治療之動物的血液中之更大百分比的cDC1細胞對於Cy5-ASO表現呈陽性。與對照動物相比，在用抗-Clec9a-表現胞外體治療之動物中，由cDC1吸收之胞外體量(如藉由Cy5-ASO表現之MFI來量測)亦更大。圖12D。對於亦被認為表現Clec9a蛋白之pDC細胞而言，觀察到類似結果。
有趣的是，在用抗-Clec9a-表現胞外體治療之動物中，在脾臟中，在其他細胞群體(除了cDC1以外)中，似乎存在胞外體吸收之適度至顯著增加。圖12E。然而，當評估細胞所吸收之胞外體的量時，僅在cDC1細胞中存在顯著差異。圖12F。此結果表明雖然脾臟內之一些細胞可優先吸收表現抗-Clec9a靶向部分之胞外體，但此類胞外體呈現出對於已知表現Clec9a蛋白之cDC1的趨向性。
在腫瘤內，吸收之差異不如在血液及脾臟中所觀察到的差異明顯。然而，與對照動物相比，在用抗-Clec9a-表現胞外體治療之動物中，觀察到cDC1群體之胞外體吸收的適度增加。圖12G及12H。
以上結果確認先前活體外資料且證明表現抗-Clec9a靶向部分之EV(例如 ，胞外體)可優先靶向Clec9a-表現細胞，諸如cDC1及pDC細胞。 實例6：分析投與途徑對抗-Clec9aEV(例如 ，胞外體)之免疫細胞生物分佈的影響
為了確認來自B16F10腫瘤模型之結果且亦為了確定投與途徑是否可影響抗-Clec9a胞外體之免疫細胞生物分佈，使用CT26腫瘤小鼠模型。如圖13A中展示，用CT26腫瘤細胞接種小鼠。當腫瘤尺寸達到100 mm3 (大約腫瘤誘導後第8天)，動物接受以下項中之一者之單一投與(靜脈內或腫瘤內)：(i)單獨PBS；(ii)抗-Clec9a-表現胞外體(「aClec9aEV」)；(iii)表現單獨支架X蛋白之胞外體(「PrXEV」)；或(iv)表現不相關抗體之胞外體(「同型EV」)。對於靜脈內投與，將胞外體以1 x 1011 個粒子之劑量投與。對於腫瘤內投與，將胞外體以1 x 1010 個粒子之劑量投與。然後，將動物在大約1小時後處死，且評估血液、脾臟、及/或腫瘤中之胞外體吸收。圖13B提供不同治療組。
如在B16F10腫瘤小鼠模型中所觀察到的(參見 實例6)，與其他胞外體相比，來自血液(圖13C及13D)及脾臟(圖13E及13F)之cDC1細胞呈現出抗-Clec9a胞外體之更大吸收。對於所分析的其他細胞類型(亦即 ，cDC2、CD11b+ Ly6C+(單核球)、CD11b+ Ly6G+(嗜中性球)、T、NK、及B細胞)，不存在抗-Clec9a胞外體之優先吸收。事實上，與抗-Clec9a胞外體相比，此等其他細胞類型似乎呈現出對照胞外體(亦即 ，表現單獨支架X蛋白或表現不相關抗體)之更大吸收。由cDC1吸收之胞外體的量(如藉由Cy5-ASO表現之MFI來量測)亦與先前在B16F10腫瘤小鼠模型中所觀察到者一致。與對照動物相比，在用抗-Clec9a胞外體治療之動物中，cDC1細胞吸收了更大量的胞外體。
如圖13I-13J所示，在腫瘤中觀察到類似結果。不論投與途徑為何(亦即 ，靜脈內(圖13G及13H)；腫瘤內(圖13I及13J))，在接受抗-Clec9a胞外體之動物中，腫瘤內之DC1細胞優先吸收胞外體。
此等結果確認表現抗-Clec9a靶向部分之EV(例如 ，胞外體)可在活體內 優先靶向Clec9a-表現細胞。此等結果進一步表明抗-Clec9a胞外體對於Clec9a-表現細胞之趨向性增加與投與途徑無關。 實例7：分析表現抗-Clec9a靶向部分及STING促效劑之EV(例如 ，胞外體)之吸收
將STING促效劑引導至特異性免疫細胞之能力可有助於減少EV(例如 ，胞外體)之毒性及/或增加其效力。因此，在先前實例中描述之抗-Clec9a胞外體進一步負載有STING促效劑。簡言之，將包括ML RR-S2 CDA銨鹽(MedChem Express，目錄號HY-12885B)及(3-3 cAIMPdFSH；InvivoGen，目錄號tlrl-nacairs)之1mM STING促效劑與經純化胞外體(1E12個總粒子)在300 ul PBS中、在37℃下培育隔夜。然後將混合物在PBS中沖洗兩次且藉由超速離心在100,000 x g下純化。然後，在用人類或小鼠Clec9a蛋白轉染之STING-報道基因HEK細胞中，評估胞外體靶向STING途徑之能力。
如圖14A中展示，在未轉染之報道基因HEK細胞(亦即 ，不表現Clec9a蛋白)中，不存在STING活性之顯著差異。然而，對於用小鼠或人類Clec9蛋白轉染之報道基因HEK細胞而言，與游離STING促效劑(亦即 ，不負載在胞外體中)相比，當細胞用抗-Clec9a胞外體治療時，觀察到STING途徑之更大活化。圖14B及14C。此結果與先前實例一致且證明表現STING促效劑之抗-Clec9aEV(例如 ，胞外體)可用於將STING促效劑優先遞送至Clec9a蛋白表現細胞，例如 cDC1。
為了確認以上結果，亦在經修飾以表現小鼠Clec9a蛋白之STING-報道基因Raw-螢光素酶細胞中評估負載有STING促效劑之抗-Clec9a胞外體之吸收。如圖15A及15B所示，觀察到類似結果。在自然STING-報道基因Raw-螢光素酶細胞(亦即 ，不表現Clec9a蛋白)中，在不同組之間未觀察到STING活性之顯著差異。然而，在表現Clec9a之STING-報道基因Raw-螢光素酶細胞中，當細胞用負載有STING促效劑之抗-Clec9a胞外體治療時，觀察到顯著更大的STING活性。
以上結果確認抗-Clec9a之表現可選擇性地將EV(例如 ，胞外體)靶向輸送至Clec9a表現細胞，諸如樹突狀細胞。 實例8：分析用抗-Clec9aEV(例如 ，胞外體)治療後之細胞介素產生
為了進一步評估抗-Clec9a EV(例如 ，胞外體)特異性靶向Clec9a表現細胞之能力，在用負載有STING促效劑之抗-Clec9a胞外體刺激後評估在總小鼠脾細胞及經分離小鼠脾臟樹突狀細胞(DC)中之STING活性。使用由十三種不同細胞介素組成之多元組，以細胞介素產生來量測STING活性，該等細胞介素亦即 IFNβ、CXCL10、CCL5、IL-6、IL-12、IFNα、TNFα、GMC-SF、IFNγ、IL-10、CCL2、IL-1β、及CXCL1。
如圖16B、17D-17F、18D-18F、19E-19G、20C、及20D所示，用負載有STING促效劑之抗-Clec9a胞外體治療之經分離脾臟DC產生更大量的大部分所測試細胞介素(例如 ，CXCL10、CCL5、IL-6、IL-12、IFNα、TNFα)。然而，當使用總脾細胞時，未觀察到顯著差異(參見 圖16A、17A-17C、18A-18C、19A-19D、20A、及20B)。此缺少差異進一步支持抗-Clec9a靶向部分之特異性，因為Clec9a表現細胞構成極少比例之總脾細胞。
因此，以上結果進一步確認抗-Clec9a靶向部分可用於將EV(例如 ，胞外體)(包括負載有有效負載諸如STING促效劑之彼等者)特異性靶向輸送至Clec9a-表現細胞。 實例9：腫瘤模型中之抗-Clec9a EV(例如， 胞外體)之活體內 分析
為了確定負載有STING促效劑之所揭示抗-Clec9aEV(例如 ，胞外體)是否可用於在活體內 治療腫瘤，使用腫瘤動物模型。如圖21中展示，將動物用腫瘤接種(皮下)，且然後一旦建立腫瘤，將動物用以下方案中之一者治療：(i)單獨PBS；(ii)負載有STING促效劑之抗-Clec9a EV(例如 ，胞外體)；(iii)表現單獨支架X之STING-負載EV(例如 ，胞外體)；及(iv)可溶性STING促效劑。亦測試不同投與途徑(例如 ，鞘內、靜脈內、腹膜內)。定期監測動物且評估動物之腫瘤尺寸及存活率。亦處死一些動物，且評估不同組織中之抗腫瘤反應。 以引用之方式併入
在本申請案中引用之所有出版物、專利、專利申請案及其他文獻出於所有目的以全文引用之方式特此併入，其程度就如同每個單獨出版物、專利、專利申請案或其他文獻經單獨地指展示於所有目的以引用之方式併入一般。 等效物
雖然已展示且描述各種具體態樣，但是以上說明不具有限制性。應認識到可產生各種變化而不脫離本揭露之精神及範圍。熟習此項技術者在查閱本說明書後將對許多變型顯而易知。
圖1提供本文揭示之四種不同示範性抗-Clec9a靶向部分之示意圖。靶向部分包括以下(自左至右)：(i)連接至全長支架X蛋白之Clec9a-特異性單鏈Fv抗體片段(「scFv_FLPrX」)；(ii)連接至截短支架X蛋白之Clec9a-特異性單鏈FV抗體片段(「scFv_短PrX」)；(iii)連接至全長支架X蛋白之Clec9a-特異性單鏈F(ab)抗體片段(「scFab_FLPrX」)；及(iv)連接至截短支架X蛋白之Clec9a-特異性單鏈F(ab)抗體片段(「scFab_短PrX」)。在該等構築體中之各者中，截短或全長支架X蛋白偶聯至標籤(例如 ，FLAG、GFP、或mCherry)，其可用於偵測靶向部分之表現。
圖2A展示對在HEK293細胞中轉染之後的四種不同抗-Clec9a(「aClec9a」)構築體之表現模式進行比較的流動式細胞測量術直方圖。所示構築體包括圖1中描述之四種抗-Clec9a靶向部分中之一者。不同抗-CLEC9a構築體之表現水準藉由GFP表現來量測。未轉染HEK293細胞用作陰性對照。
圖2B展示圖2A中描述之經轉染HEK293細胞產生之胞外體中之GFP表現強度的比較。具體而言，胞外體表現以下靶向部分中之一者：(i)(i)連接至全長支架X蛋白之Clec9a-特異性單鏈Fv抗體片段(「scFv_FLPrX」)；(ii)連接至截短支架X蛋白之Clec9a-特異性單鏈FV抗體片段(「scFv_SLPrX」)；(iii)連接至全長支架X蛋白之Clec9a-特異性單鏈F(ab)抗體片段(「scFab_FLPrX」)；及(iv)連接至截短支架X蛋白之Clec9a-特異性單鏈F(ab)抗體片段(「scFab_SLPrX」)。螢光強度對應於胞外體中表現之靶向部分之相對量。作為對照，使用表現單獨支架X蛋白之胞外體(亦即 ，無抗-Clec9a靶向部分)。
圖3A、3B、及3C展示不同抗-CLEC9a胞外體構築體與人類及小鼠Clec9A蛋白之結合親和力，如藉由OCTET分析來量測。圖3A及3B提供各別與人類及小鼠Clec9A之結合結果。圖3C展示所使用之陽性(亦即 ，10b4抗體(底部線)及陰性對照(亦即 ，表現單獨支架X蛋白之胞外體(頂部線)之結合結果。
圖4提供用於區分不同人類DC子集之流動式細胞測量術閘控策略。具體而言，習知DC群體藉由對於CD11c+ 及HLA-DR高 群體進行閘控而得以鑑別。此群體然後進一步劃分成(i)CD1c- 及CD141+ (對於cDC1而言)及(ii)CD1c+ 及CD141- (對於cDC2而言)。為了鑑別pDC子集，對於CD11c+ 、HLA-DR中間 、及CD123+ 群體進行細胞閘控。
圖5A、5B、5C、及5D各別展示來自四個不同人類供體之不同樹突狀細胞群體中的抗-Clec9A-表現胞外體之吸收。在圖5A-5D中之各者中，上部圖對應於陰性對照(亦即 ，表現單獨支架X蛋白之胞外體)，並且下部圖對應於表現抗-Clec9A之胞外體。對於供體中之各者(亦即 ，供體1、2、3、及4)，展示以下三個不同樹突狀細胞(DC)群體之胞外體之吸收：漿細胞樣DC(「pDC」)、習知DC 1(「cDC1」)、及習知DC 2(「cDC2」)。胞外體之吸收展示為GFP表現之平均螢光指數(MFI)。結果展示為平均值±S.E.M。
圖6提供用於區分不同小鼠DC子集之流動式細胞測量術閘控策略。具體而言，pDC藉由對於CD137+ 、XCR1- 、及Sirpa- 群體進行閘控而得以鑑別。cDC1細胞藉由對於XCR1+ 、Clec9a+ 、及Sirpa- 群體進行閘控而得以鑑別。cDC2細胞藉由對於CD8+ 、CD11b+ 、Sirpa+ 、XCR1- 、及CD1c,b+ 進行閘控而得以鑑別。
圖7A及7B展示以下三個不同小鼠樹突狀細胞群體所進行之胞外體吸收之比較：漿細胞樣DC(「pDC+」)、習知DC1(「cDC1+」)、及習知(「DC2(「cDC2+」)。圖7A展示抗-Clec9A-表現胞外體之吸收。圖7B展示對照胞外體(亦即 ，表現單獨支架X蛋白)之吸收。胞外體之吸收展示為GFP表現之平均螢光指數(MFI)。結果展示為平均值±S.E.M。
圖8A及8B展示在用抗-Clec9A-表現胞外體處理之後，cDC1(圖8A)及pDC(圖8B)中之抗-Clec9A之下調的比較。圖8C展示抗-Clec9A-表現胞外體對於cDC1中之XCR1蛋白表現模式之影響。所展示之DC為未經刺激(三角形)或用以下胞外體中之一者處理：(i)對照胞外體(亦即 ，表現PrX單獨)(「PrX」)或(ii)抗-Clec9A-表現胞外體(「aClec9a」)。胞外體之吸收展示為GFP表現之平均螢光指數(MFI)。結果展示為平均值±S.E.M。
圖9A及9B各別展示用小鼠Clec9a及人類Clec9a轉染之HEK細胞中之Clec9a蛋白表現。Clec9a蛋白表現使用以下三種不同抗體來量測：(i)抗小鼠Clec9a(純系10b4)(「(2)」)、(ii)抗小鼠Clec9a(純系7h11)(「(3)」)、及(iii)抗人類Clec9a(純系E8F)(「(4)」)。未經染色細胞用作陰性對照(「(1)」)。
圖10A及10B展示在胞外體處理後4小時及24小時，用人類Clec9a轉染之HEK細胞之胞外體吸收。所展示之不同群組包括：(i)用對照胞外體(亦即 ，僅表現支架X蛋白)處理之未經轉染HEK細胞(「自然細胞–PrX EV」；圓形)；(ii)用抗-Clec9a-表現胞外體處理之未經轉染HEK細胞(「自然細胞–aClec9a EV」；正方形)；(iii)用對照胞外體處理之經轉染HEK細胞(「Clec9a細胞–Prx」；三角形)；及(iv)用抗-Clec9a-表現胞外體處理之經轉染HEK細胞(「Clec9a細胞–aClec9a EV」；倒三角形)。胞外體之吸收展示為mCherry表現之平均螢光指數(MFI)。結果展示為平均值±S.E.M。
圖11展示在胞外體處理後6小時，用小鼠Clec9a轉染之HEK細胞之胞外體吸收。所展示之不同群組包括：(i)用對照胞外體(亦即 ，僅表現支架X蛋白)處理之未經轉染HEK細胞(「自然細胞–PrX EV」；圓形)；(ii)用抗-Clec9a-表現胞外體處理之未經轉染HEK細胞(「自然細胞–aClec9a EV」；正方形)；(iii)用對照胞外體處理之經轉染HEK細胞(「Clec9a細胞–Prx」；三角形)；及(iv)用抗-Clec9a-表現胞外體處理之經轉染HEK細胞(「Clec9a細胞–aClec9a EV」；倒三角形)。胞外體之吸收展示為GFP表現之平均螢光指數(MFI)。結果展示為平均值±S.E.M。
圖12A、12B、12C、12D、12E、12F、12G、及12H展示靜脈內投與至帶有B16F10腫瘤之小鼠中之後，表現抗-Clec9a之胞外體之免疫細胞分佈。圖12A提供投與時程。圖12B展示不同治療組，包括組#(「Grp.」)、經投與組成物(「藥物」)、投與劑量(「劑量」)、投與途徑(「途徑」)、及各組中之動物數目(「N」)。圖12C及12D展示血液內之不同細胞群體對抗  -Clec9a胞外體之吸收。血液中所分析之細胞群體包括以下：(i)習知DC 1(cDC1)、(ii)習知DC 2(cDC2)、(iii)漿細胞樣DC(pDC)、(iv)CD11b+ Ly6C+(單核球)；(v)CD11b+ Ly6G+(嗜中性球)、及(vi)T、NK、及B細胞。圖12E及12F展示脾臟內之不同細胞群體對抗-Clec9a胞外體之吸收。脾臟中所分析之細胞群體包括以下：(i)習知DC 1(cDC1)、(ii)習知DC 2(cDC2)、(iii)漿細胞樣DC(pDC)、(iv)CD11b+ Ly6C+(單核球)；(v)CD11b+ Ly6G+(嗜中性球)；(vi)巨噬細胞；(vii)紅髓巨噬細胞；及(vi)T、NK、及B細胞。圖12G及12H展示腫瘤內之不同細胞群體對抗-Clec9a胞外體之吸收。所分析之細胞群體包括以下：(i)習知DC1(CD24+CD11b-)；(ii)習知DC2(CD24-CD11b+)、(iii)漿細胞樣DC(pDC)；及(iv)巨噬細胞。圖12C、12E、及12G將胞外體吸收展示為各群體內之Cy5陽性細胞百分比。圖12D、12F、及12H藉由量測Cy5表現之平均螢光強度(MFI)來展示不同細胞吸收之胞外體之量。
圖13A、13B、13C、13D、13E、13F、13G、13H、13I、及13J展示在靜脈內或腫瘤內投與之後，帶有CT26腫瘤之小鼠中之抗-Clec9a胞外體之免疫細胞分佈。圖13A提供投與時程。圖13B展示不同治療組，包括組#(「Grp.」)、經投與組成物(「藥物」)、投與劑量(「劑量」)、投與途徑(「途徑」)、各組中之動物數目(「N」)、及投與體積(「體積」)。圖13C及13D展示在靜脈內投與之後，血液內之不同細胞所進行之胞外體吸收。血液中所分析之細胞群體包括以下：(i)習知DC 1(cDC1)、(ii)習知DC 2(cDC2)、(iii)漿細胞樣DC(pDC)、(iv)CD11b+ Ly6C+(單核球)；(v)CD11b+ Ly6G+(嗜中性球)、及(vi)T、NK、及B細胞。圖13E及13F展示在靜脈內投與之後，脾臟內之不同細胞所進行之胞外體吸收。脾臟中所分析之細胞群體包括以下：(i)習知DC 1(cDC1)、(ii)習知DC 2 (cDC2)、(iii)CD11b+ Ly6C+(單核球)；(iv)CD11b+ Ly6G+(嗜中性球)；(v)F4/80+(巨噬細胞)；(vi)紅髓巨噬細胞；及(vii)T、NK、及B細胞。圖13G及13H展示在靜脈內投與之後，腫瘤內之不同細胞所進行之胞外體吸收。所分析之細胞群體包括以下：(i)習知DC1(CD24+CD11b-)；(ii)習知DC2(CD24+CD11b+)、(iii)漿細胞樣DC(pDC)；及(iv)巨噬細胞。圖13I及13J展示在腫瘤內投與之後，腫瘤內之不同細胞所進行之胞外體吸收。所分析之細胞群體包括以下：(i)習知DC1(CD24+CD11b-)；(ii)習知DC2(CD24+ CD11b+)、(iii)漿細胞樣DC(pDC)；及(iv)巨噬細胞。圖13C、13E、13G、及13I將胞外體吸收展示為各群體內之Cy5陽性細胞百分比。圖13D、13F、13H、及13J藉由量測Cy5表現之平均螢光強度(MFI)來展示不同細胞吸收之胞外體之量。
圖14A、14B、及14C展示負載有STING促效劑之抗-Clec9a胞外體在不同HEK-Blue STING報道基因細胞株中之吸收。圖14A展示在自然(亦即 ，未經修飾以表現Clec9a)HEK-Blue細胞株中之吸收。圖14B展示在經修飾以表現小鼠Clec9a之HEK-Blue細胞株中之吸收。圖14C展示在經修飾以表現人類Clec9a之HEK-Blue細胞株中之吸收。在圖14A-14C中之各者中，以下用作對照：(i)可溶性STING促效劑(「游離STING」)；(ii)表現單獨支架X之EV(「Prx」)；及(iii)同型對照(亦即 ，表現不相關抗體之胞外體)。
圖15A及15B展示負載有STING促效劑之抗-Clec9a胞外體在兩種不同STING RAW-報道細胞株中之吸收之比較。在圖15A中，展示在不表現Clec9a之自然STING Raw-報道細胞株中之吸收。在圖15B中，展示在經修飾以表現Clec9a之STING Raw-報道細胞株中之吸收。在圖15A及15B中，胞外體之吸收是基於STING螢光素酶報道基因活性來量測。在各圖式中展示以下背景：(i)可溶性STING促效劑(「游離STING」)(圓形)，(ii)表現單獨支架X之STING-負載胞外體(「Prx-STING」)(三角形)；(iii)表現連接至支架X之抗-Clec9a之STING-負載胞外體(「aClec9a-STING:)(實心倒三角形)；(iv)表現同型對照抗體之STING-負載胞外體(「同型-STING」)(空心倒三角形)；及(v)僅負載有STING促效劑之胞外體(「自然-STING」)(正方形)。
圖16A及16B展示在用負載有STING促效劑之抗-Clec9a胞外體(「aClec9a-STING」)(倒三角形)刺激總小鼠脾細胞(圖16A)或經分離小鼠脾臟樹突狀細胞(圖16B)後所產生之IFN-β之水準。在圖16A及16B中，以下用作對照：(i)無刺激(「-」)(圓形)；(ii)可溶性STING促效劑(「游離STING」)(正方形)；(iii)表現單獨支架X之STING-負載胞外體(「PrX-STING」)(三角形)；及(iv)表現同型對照抗體之STING-負載胞外體(「同型-STING」)(菱形)。
圖17A、17B、17C、17D、17E、及17F展示在用負載有STING促效劑之抗-Clec9a胞外體(「aClec9a-STING」)(倒三角形)刺激總小鼠脾細胞或經分離小鼠脾臟樹突狀細胞之後所產生之CXCL10、CCL5、及IL-6之水準。圖17A、17B、及17C各別展示使用總小鼠脾細胞量測之CXCL10、CCL5、及IL-6之水準。圖17D、17E、及17F各別展示使用經分離小鼠脾臟樹突狀細胞量測之CXCL10、CCL5、及IL-6之水準。對照與圖16A及16B中所使用之彼等者相同。
圖18A、18B、18C、18D、18E、及18F展示在用負載有STING促效劑之抗-Clec9a胞外體(「aClec9a-STING」)(倒三角形)刺激總小鼠脾細胞或經分離小鼠脾臟樹突狀細胞之後所產生之IL-12、IFN-α、及TNF-α之水準。圖18A、18B、及18C各別展示使用總脾細胞量測之IL-12、IFN-α、及TNF-α之水準。圖18D、18E、及18F各別展示使用經分離樹突狀細胞量測之IL-12、IFN-α、及TNF-α之水準。對照與圖16A及16B中所使用之彼等者相同。
圖19A、19B、19C、19D、19E、19F、19G、及19G展示在用負載有STING促效劑之抗-Clec9a胞外體(「aClec9a-STING」)(倒三角形)刺激總小鼠脾細胞或經分離小鼠脾臟樹突狀細胞之後所產生之GMC-SF、IFN-γ、IL-10、及CCL-2之水準。圖19A、19B、19C、及19D各別展示使用總脾細胞量測之GMC-SF、IFN-γ、IL-10、及CCL-2之水準。圖19E、19F、19G、及19G各別展示使用經分離樹突狀細胞量測之GMC-SF、IFN-γ、IL-10、及CCL-2之水準。對照與圖16A及16B中所使用之彼等者相同。
圖20A、20B、20C、及20D展示在用負載有STING促效劑之抗-Clec9a胞外體(「aClec9a-STING」)(倒三角形)刺激總小鼠脾細胞或經分離小鼠脾臟樹突狀細胞之後所產生之IL-1β及CXCL1之水準。圖20A及20B各別展示使用總脾細胞量測之IL-1β及CXCL1之水準。圖20C及20D各別展示使用經分離樹突狀細胞量測之IL-1β及CXCL1之水準。對照與圖16A及16B中所使用之彼等者相同。
圖21提供用於評估抗-Clec9a胞外體在腫瘤模型中之功效之實驗設計的示意圖。
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Claims (74)

  1. 一種胞外囊泡(EV)，其包含特異性結合至樹突狀細胞之標記物的外源靶向部分。
  2. 如申請專利範圍第1項之EV，其中該標記物僅存在於該樹突狀細胞上。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之EV，其中該樹突狀細胞包含漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)、骨髓/習知樹突狀細胞1(cDC1)、骨髓/習知樹突狀細胞2(cDC2)、或其任何組合。
  4. 如申請專利範圍第3項之EV，其中該樹突狀細胞為cDC1。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之EV，其中該標記物包含C-型凝集素域家族9成員A(Clec9a)蛋白、樹突狀細胞特異性細胞間黏附分子-3-結合非整聯蛋白(DC-SIGN)、CD207、CD40、Clec6、樹突狀細胞免疫受體(DCIR)、DEC-205、凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)、MARCO、Clec12a、DC-去唾液酸醣蛋白受體(DC-ASGPR)、DC免疫受體2(DCIR2)、Dectin-1、巨噬細胞甘露糖受體(MMR)、BDCA-1(CD303、Clec4c)、Dectin-2、Bst-2(CD317)、或其任何組合。
  6. 如申請專利範圍第5項之EV，其中該標記物包含該Clec9a蛋白中之抗原決定基。
  7. 如申請專利範圍第6項之EV，其中該標記物包含C-型凝集素樣域。
  8. 如申請專利範圍第7項之EV，其中該C-型凝集素樣域包含含有SEQ ID NO:1之胺基酸120至233的胺基酸序列。
  9. 如申請專利範圍第6項之EV，其中該標記物包含該Clec9a蛋白之胞外區。
  10. 如申請專利範圍第9項之EV，其中該Clec9a蛋白之胞外區包含含有SEQ ID NO:1之胺基酸57至241的胺基酸序列。
  11. 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之EV，其中該外源靶向部分包含肽、抗體或其抗原結合片段、化學化合物、或其任何組合。
  12. 如申請專利範圍第11項之EV，其中該外源靶向部分包含肽。
  13. 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之EV，其中該外源靶向部分包含微量蛋白、經設計之錨蛋白重複蛋白(darpin)、抗運載蛋白、阿德奈汀、適體、肽模擬分子、受體之天然配位體、駱駝科奈米抗體、或其任何組合。
  14. 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之EV，其中該外源靶向部分包含全長抗體、單域抗體、僅重鏈抗體(VHH)、單鏈抗體、僅鯊魚重鏈抗體(VNAR)、scFv、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、或其任何組合。
  15. 如申請專利範圍第11項之EV，其中該抗體為單鏈抗體。
  16. 如申請專利範圍第1項至第15項中任一項之EV，其中該EV包含將該外源靶向部分連接至該EV之支架蛋白。
  17. 如申請專利範圍第16項之EV，其中該支架蛋白為支架X蛋白。
  18. 如申請專利範圍第17項之EV，其中該支架X蛋白包含前列腺素F2受體負調節子(PTGFRN蛋白)；基礎免疫球蛋白(BSG蛋白)；免疫球蛋白超家族成員2(IGSF2蛋白)；免疫球蛋白超家族成員3(IGSF3蛋白)；免疫球蛋白超家族成員8(IGSF8蛋白)；整聯蛋白β-1(ITGB1蛋白)；整聯蛋白α-4(ITGA4蛋白)；4F2細胞表面抗原重鏈(SLC3A2蛋白)；ATP運輸蛋白類別(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4蛋白)、CD13、胺肽酶N(ANPEP)、腦啡肽酶(膜金屬內肽酶；MME)、核苷酸外焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員1(ENPP1)、神經纖毛蛋白-1(NRP1)、CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI錨蛋白、乳凝集素、LAMP2、LAMP2B、其片段、或其任何組合。
  19. 如申請專利範圍第17項或第18項之EV，其中該支架X蛋白包含闡明為SEQ ID NO:33之胺基酸序列。
  20. 如申請專利範圍第17項或第18項之EV，其中該支架X蛋白包含與SEQ ID NO:1具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%序列同一性之胺基酸序列。
  21. 如申請專利範圍第1項至第20項中任一項之EV，其進一步包含支架Y蛋白。
  22. 如申請專利範圍第21項之EV，其中該支架Y蛋白包含肉豆蔻醯化的富丙胺酸之蛋白激酶C受質(MARCKS蛋白)、肉豆蔻醯化的富丙胺酸之蛋白激酶C受質樣1(MARCKSL1蛋白)、腦酸溶性蛋白1(BASP1蛋白)、其片段、及或其任何組合。
  23. 如申請專利範圍第22項之EV，其中該支架Y蛋白為BASP1蛋白或其片段。
  24. 如申請專利範圍第21項至第23項中任一項之EV，其中該支架Y蛋白包含N端域(ND)及效應域(ED)，其中該ND及/或該ED與該EV之內腔表面締合。
  25. 如申請專利範圍第24項之EV，其中該ND經由肉豆蔻醯化來與該胞外體之內腔表面締合。
  26. 如申請專利範圍第24項或第25項之EV，其中該ED藉由離子相互作用來與該胞外體之內腔表面締合。
  27. 如申請專利範圍第24項至第26項中任一項之EV，其中該ED包含(i)鹼性胺基酸或(ii)呈一定序列之兩個或兩個以上鹼性胺基酸，其中該鹼性胺基酸選自由Lys、Arg、His、及其任何組合組成之群。
  28. 如申請專利範圍第27項之EV，其中該鹼性胺基酸為(Lys)n，其中n為1與10之間之整數。
  29. 如申請專利範圍第24項至第28項中任一項之EV，其中該ED包含Lys(K)、KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO: 205)、KKKKK(SEQ ID NO: 206)、Arg(R)、RR、RRR、RRRR(SEQ ID NO: 207)；RRRRR(SEQ ID NO: 208)、KR、RK、KKR、KRK、RKK、KRR、RRK、(K/R)(K/R)(K/R) (K/R)(SEQ ID NO: 209)、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO: 210)、或其任何組合。
  30. 如申請專利範圍第24項至第29項中任一項之EV，其中該ND包含如在G:X2:X3:X4:X5:X6中闡明之胺基酸序列，其中G表示Gly；其中「:」表示肽鍵，其中該X2至該X6中之各者獨立地為胺基酸，且其中該X6包含鹼性胺基酸。
  31. 如申請專利範圍第30項之EV，其中： (i) 該X6選自由Lys、Arg、及His組成之群； (ii) 該X5選自由Pro、Gly、Ala、及Ser組成之群； (iii) 該X2選自由Pro、Gly、Ala、及Ser組成之群； (iv) 該X4選自由Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln、及Met組成之群；或 (v) (i)-(iv)之任何組合。
  32. 如申請專利範圍第24項至第29項中任一項之EV，其中該ND包含胺基酸序列G:X2:X3:X4:X5:X6，其中 i. G表示Gly； ii. 「:」表示肽鍵； iii. 該X2為選自由Pro、Gly、Ala、及Ser組成之群的胺基酸； iv. 該X3為胺基酸； v. 該X4為選自由Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln、及Met組成之群的胺基酸； vi. 該X5為選自由Pro、Gly、Ala、及Ser組成之群的胺基酸；且 vii. 該X6為選自由Lys、Arg、及His組成之群的胺基酸。
  33. 如申請專利範圍第30項至第32項中任一項之EV，其中該X3選自由Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、及Arg組成之群。
  34. 如申請專利範圍第24項至第33項中任一項之EV，其中該ND及該ED藉由連接子來連接。
  35. 如申請專利範圍第34項之EV，其中該連接子包含肽鍵或一或多個胺基酸。
  36. 如申請專利範圍第24項至第35項中任一項之EV，其中該ND包含選自由以下項組成之群的胺基酸序列：(i)GGKLSKK(SEQ ID NO: 211)、(ii)GAKLSKK(SEQ ID NO: 212)、(iii)GGKQSKK(SEQ ID NO: 213)、(iv) GGKLAKK(SEQ ID NO: 214)、及(vi)其任何組合。
  37. 如申請專利範圍第36項之EV，其中該ND包含選自由以下項組成之群的胺基酸序列：(i)GGKLSKKK(SEQ ID NO: 238)、(ii)GGKLSKKS(SEQ ID NO: 239)、(iii) GAKLSKKK(SEQ ID NO: 240)、(iv)GAKLSKKS(SEQ ID NO: 241)、(v)GGKQSKKK(SEQ ID NO: 242)、(vi) GGKQSKKS(SEQ ID NO: 243)、(vii)GGKLAKKK(SEQ ID NO: 244)、(viii)GGKLAKKS(SEQ ID NO: 245)、及(ix)其任何組合。
  38. 如申請專利範圍第24項至第37項中任一項之EV，其中該ND包含胺基酸序列GGKLSKK(SEQ ID NO: 211)。
  39. 如申請專利範圍第16項至第38項中任一項之EV，其中該支架蛋白之長度為至少約8、至少約9、至少約10、至少約11、至少約12、至少約13、至少約14、至少約15、至少約16、至少約17、至少約18、至少約19、至少約20、至少約21、至少約22、至少約23、至少約24、至少約25、至少約30、至少約35、至少約40、至少約45、至少約50、至少約55、至少約60、至少約65、至少約70、至少約75、至少約80、至少約85、至少約90、至少約95、至少約100、至少約105、至少約110、至少約120、至少約130、至少約140、至少約150、至少約160、至少約170、至少約180、至少約190、或至少約200個胺基酸。
  40. 如申請專利範圍第16項至第39項中任一項之EV，其中該支架蛋白包含(i)GGKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO: 246)、(ii)GAKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO: 247)、(iii)GGKQSKKKKGYNVN(SEQ ID NO: 248)、 (iv)GGKLAKKKKGYNVN(SEQ ID NO: 249)、 (v)GGKLSKKKKGYSGG(SEQ ID NO: 250)、 (vi)GGKLSKKKKGSGGS(SEQ ID NO: 251)、 (vii)GGKLSKKKKSGGSG(SEQ ID NO: 252)、 (viii)GGKLSKKKSGGSGG(SEQ ID NO: 253)、 (ix)GGKLSKKSGGSGGS(SEQ ID NO: 254)、 (x)GGKLSKSGGSGGSV(SEQ ID NO: 255)、或 (xi)GAKKSKKRFSFKKS(SEQ ID NO: 256)。
  41. 如申請專利範圍第16項至第40項中任一項之EV，其中該支架蛋白在N端處不包含Met。
  42. 如申請專利範圍第16項至第41項中任一項之EV，其中該支架蛋白在該支架蛋白之N端處包含肉豆蔻醯化的胺基酸殘基。
  43. 如申請專利範圍第42項之EV，其中該支架蛋白之N端處之胺基酸殘基為Gly。
  44. 如申請專利範圍第41項或第42項之EV，其中該支架蛋白之N端處之胺基酸殘基為合成的。
  45. 如申請專利範圍第41項或第42項之EV，其中該支架蛋白之N端處之胺基酸殘基為甘胺酸類似物。
  46. 如申請專利範圍第1項至第45項中任一項之EV，其進一步包含治療分子、免疫調節劑、佐劑、或其任何組合。
  47. 如申請專利範圍第46項之EV，其中該治療分子包含抗原。
  48. 如申請專利範圍第46項之EV，其中該治療分子包含免疫抑制劑。
  49. 如申請專利範圍第48項之EV，其中該免疫抑制劑包含反義寡核苷酸。
  50. 如申請專利範圍第46項至第49項中任一項之EV，其中該佐劑為干擾素基因刺激物(STING)促效劑、toll樣受體(TLR)促效劑、炎症介體、或其任何組合。
  51. 如申請專利範圍第50項之EV，其中該佐劑為STING促效劑。
  52. 如申請專利範圍第51項之EV，其中該STING促效劑包含環狀二核苷酸STING促效劑或非環狀二核苷酸STING促效劑。
  53. 如申請專利範圍第50項之EV，其中該佐劑為TLR促效劑。
  54. 如申請專利範圍第53項之EV，其中該TLR促效劑包含TLR2促效劑(例如 ，脂磷壁酸、非典型LPS、MALP-2及MALP-404、OspA、膜孔蛋白、LcrV、脂化甘露聚醣、GPI錨定物、溶血磷脂醯絲胺酸、脂磷聚醣(LPG)、糖磷脂醯肌醇(GPI)、酵母聚醣、hsp60、gH/gL醣蛋白、紅血球凝聚素)、TLR3促效劑(例如 ，雙鏈RNA，例如 ，聚(I:C))、TLR4促效劑(例如 ，脂多醣(LPS)、脂磷壁酸、β-防禦素2、纖連蛋白EDA、HMGB1、SNAP相關蛋白、腱生蛋白C)、TLR5促效劑(例如 ，鞭毛蛋白)、TLR6促效劑、TLR7/8促效劑(例如 ，單鏈RNA、CpG-A、聚G10、聚G3、瑞喹莫德)、TLR9促效劑(例如 ，非甲基化CpG DNA)、或其任何組合。
  55. 如申請專利範圍第1項至第55項中任一項之EV，其中該治療分子、免疫調節劑、佐劑、或其任何組合與支架X或支架Y或其組合締合。
  56. 如申請專利範圍第46項至第54項中任一項之EV，其中該免疫調節劑包含細胞介素。
  57. 如申請專利範圍第56項之EV，其中該細胞介素包含干擾素。
  58. 如申請專利範圍第1項至第57項中任一項之EV，其中該EV為胞外體。
  59. 如申請專利範圍第46項至第58項中任一項之EV，其中該治療分子與支架X蛋白締合。
  60. 如申請專利範圍第46項至第59項中任一項之EV，其中該治療分子與支架Y蛋白締合。
  61. 如申請專利範圍第46項至第60項中任一項之EV，其中該免疫調節劑與支架X蛋白締合。
  62. 如申請專利範圍第46項至第61項中任一項之EV，其中該免疫調節劑與支架Y蛋白締合。
  63. 如申請專利範圍第46項至第62項中任一項之EV，其中該佐劑與支架X蛋白締合。
  64. 如申請專利範圍第46項至第63項中任一項之EV，其中該佐劑與支架Y蛋白締合。
  65. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項至第64項中任一項之EV及醫藥學上可接受之載劑。
  66. 一種細胞，其產生如申請專利範圍第1項至第64項中任一項之EV。
  67. 一種包含一或多個載體之細胞，其中該等載體包含編碼如申請專利範圍第1項至第64項中任一項之靶向部分的核酸序列。
  68. 一種套組，其包含如申請專利範圍第1項至第64項中任一項之EV及使用說明書。
  69. 一種製備EV之方法，其包含在合適條件下培養如申請專利範圍第66項或第67項之細胞及獲得該等EV。
  70. 一種預防或治療有需要之受試者之疾病的方法，其包含向該受試者投與如申請專利範圍第1項至第64項中任一項之EV或如申請專利範圍第65項之醫藥組成物。
  71. 如申請專利範圍第70項之方法，其中該疾病選自癌症、血友病、糖尿病、生長因子缺乏症、眼睛疾病、移植物抗宿主疾病(GvHD)、自體免疫疾病、胃腸道疾病、心血管疾病、呼吸疾病、過敏性疾病、退行性疾病、感染性疾病、纖維變性疾病、或其任何組合。
  72. 一種將EV遞送至受試者之方法，其包含向該受試者投與如申請專利範圍第1項至第64項中任一項之EV。
  73. 如申請專利範圍第70項至第72項中任一項之方法，其中該EV係非經腸、經口、靜脈內、肌肉內、腫瘤內、鼻內、皮下、或腹膜內投與。
  74. 如申請專利範圍第70項至第73項中任一項之方法，其包含投與額外治療劑。
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