CN112675298B

CN112675298B - 一种免疫佐剂、含有所述免疫佐剂的疫苗及制备方法和应用

Info

Publication number: CN112675298B
Application number: CN202011578279.3A
Authority: CN
Inventors: 刘野; 陈思思; 张玉芳
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2024-05-03
Anticipated expiration: 2040-12-28
Also published as: CN112675298A

Abstract

本发明提供了一种免疫佐剂、含有所述免疫佐剂的疫苗及制备方法和应用，属于免疫佐剂技术领域；所述免疫佐剂是由多肽进行叠氮化物和炔烃环加成反应制备得到的；所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为XKXXXG；所述K经叠氮修饰；所述G经炔基修饰；所述X选自R、D、V、Y、Q、T和S中的一种或几种。本发免疫佐剂与传统铝佐剂相比，有更好增强体液免疫应答效果，同时也能够增强T细胞的免疫应答。

Description

一种免疫佐剂、含有所述免疫佐剂的疫苗及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫技术领域，尤其涉及一种免疫佐剂、含有所述免疫佐剂的疫苗及制备方法和应用。

背景技术

免疫佐剂是指预先或与抗原同时注入体内、可增强机体对抗原的应答或改变应答类型的非特异性免疫增强物质。全球第1个批准用于人类的疫苗佐剂是氢氧化铝佐剂。然而但铝佐剂只能提高体液免疫应答和局部(注射部位)巨噬细胞的应答，免疫增强效果不均衡。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫佐剂、含有所述免疫佐剂的疫苗及制备方法和应用，本发明的免疫佐剂能够增强疫苗细胞免疫的强度。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种免疫佐剂，所述免疫佐剂是由多肽进行叠氮化物和炔烃环加成反应制备得到的；所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为XKXXXG；所述K经叠氮修饰；所述G经炔基修饰；所述X选自R、D、V、Y、Q、T和S中的一种或几种。

优选的，所述多肽选自第一多肽、第二多肽和第三多肽中的一种或几种；所述第一多肽、第二多肽和第三多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：4所示。

优选的，当所述多肽为第一多肽时，所述免疫佐剂的分子结构式如式IV所示，

当所述多肽为第二多肽时，所述免疫佐剂的分子结构式如式V所示，

当所述多肽为第三多肽时，所述免疫佐剂的分子结构式如式VI所示，

式IV、式V和式VI中的n独立为2～8。

本发明还提供了上述方案所述免疫佐剂或者所述制备方法得到的免疫佐剂在制备疫苗中的应用。

本发明还提供了上述方案所述免疫佐剂的制备方法，包括以下步骤：将所述多肽溶于缓冲液，得到混合液，在氩气保护下，依次加入CuSO₄、三羟丙基三唑基甲胺和抗坏血酸钠，进行环加成反应，得到免疫佐剂；

所述缓冲液包括叔丁醇和磷酸盐缓冲液；所述叔丁醇和磷酸盐缓冲液的体积比为10：1～1：10。

优选的，所述多肽和CuSO₄的质量比为(5～30)：(1.92～12)；所述多肽和三羟丙基三唑基甲胺的质量比为(5～30)：(2～30)；所述多肽和抗坏血酸钠的质量比为(5～30)：(5～25)；所述多肽和缓冲液的质量体积比为(5～30)mg：(2～10)mL。

优选的，所述环加成反应的温度为20～30℃，所述环加成反应的时间为9～16h。

本发明还提供了一种疫苗，包括免疫佐剂和免疫原，所述免疫佐剂为上述方案所述免疫佐剂或者所述制备方法得到的免疫佐剂。

优选的，所述疫苗包括新冠疫苗。

优选的，所述疫苗的剂型包括注射剂。

本发明提供了一种免疫佐剂，所述免疫佐剂是由多肽进行叠氮化物和炔烃环加成反应制备得到的；所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为XKXXXG；所述K经叠氮修饰；所述G经炔基修饰；所述X选自R、D、V、Y、Q、T和S中的一种或几种。本发明的多肽经过叠氮和炔基修饰，使其可以通过特定的反应发生响应完成组装，利用外源化学手段来实现生物大分子的功能调控，组装后的多肽能够增强与抗原提呈细胞接触的机会。本发免疫佐剂与传统铝佐剂相比，有更好增强体液免疫应答效果，同时也能够增强T细胞的免疫应答。在本发明中，本发明中的多肽均易溶于水，具有良好的生物相容性，分子量小，在修饰的叠氮和炔基基于环加成反应响应后完成组装，组装后的多肽仍具有良好的水溶性并且能够增加与抗原提呈细胞接触的机会，从而发挥增强免疫应答的作用。

附图说明

图1为第一多肽的LC-MS结果图；

图2为第一多肽RK(azide)DVYG(alkyne)作为反应底物(S1)利用环加成反应来完成自组装的化学反应式；

图3为产物(peptide)n的LC-MS结果图；

图4为S蛋白包被ELISA实验结果，其中，s+n即新冠S+N蛋白组；s+n+al即新冠S+N蛋白+铝佐剂组；(peptide)n即新冠S+N蛋白+多肽组；

图5为中和抗体检测结果，其中，s+n即新冠S+N蛋白组；s+n+al即新冠S+N蛋白+铝佐剂组；(peptide)n即新冠S+N蛋白+多肽组；

图6为IFN-γELISPOT实验结果，其中，A组：2μg/kg多肽佐剂+各50μg/kg的S与N蛋白；B组：10μg/kg多肽佐剂+各50μg/kg的S与N蛋白；C组：50μg/kg多肽佐剂+各50μg/kg的S与N蛋白；D组：铝佐剂+各50μg/kg的S与N蛋白；E组：各50μg/kg的S与N蛋白。

具体实施方式

在本发明中，同一条多肽上修饰了炔基与叠氮，该肽链本身由于空间位阻效应，同一条肽链难以反应，会优先与其他肽链反应。

在本发明中，所述多肽优选的选自第一多肽、第二多肽和第三多肽中的一种或几种；所述第一多肽、第二多肽和第三多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：4所示。在本发明中，所述第一多肽、第二多肽和第三多肽由吉尔公司合成。

在本发明中，所述第一多肽的氨基酸序列具体为：RKDVYG，所述K经叠氮修饰；所述G经炔基修饰；所述第一多肽的分子结构式如式I所示；所述第一多肽为线性肽链，化学式为C₃₅H₅₂N₁₂O₁₀，相对分子质量为800.39；

在本发明中，所述第二多肽的氨基酸序列具体为：KKQTYG，所述K经叠氮修饰；所述G经炔基修饰；所述第二多肽的分子结构式如式II所示；所述第二多肽为线性肽链，化学式为C₃₅H₅₃N₁₁O₁₀，相对分子质量为787.88；

在本发明中，所述第三多肽的氨基酸序列具体为：RKDVSG，所述K经叠氮修饰；所述G经炔基修饰；所述第三多肽的分子结构式如式III所示；所述第三多肽为线性肽链，化学式为C₂₉H₄₈N₁₂O₁₀，相对分子质量为724.36；

在本发明中，当所述多肽为第一多肽时，所述免疫佐剂的分子结构式如式IV所示，

式IV、式V和式VI中的n独立优选为2～8，进一步优选为3～5。

本发明的免疫佐剂是一种组装多肽，可以通过特定的环加成反应(click)完成组装，反应条件温和，在一价铜离子的催化作用下，叠氮只会与炔基发生反应形成三氮唑五元环的结构，特异性强，过程简单，操作方便；本发明的免疫佐剂易合成，制备成本低，生物相容性，生物毒性低，可以作为新佐剂使用。

本发明还提供了上述方案所述免疫佐剂的制备方法，包括以下步骤：将所述多肽溶于缓冲液，得到混合液，在氩气保护下，依次加入CuSO₄、三羟丙基三唑基甲胺和抗坏血酸钠，进行环加成反应(CuAAC反应，Copper-CatalyzedAzide-Alkyne CycloadditionReaction)，得到免疫佐剂；

所述缓冲液包括叔丁醇和磷酸盐缓冲液缓冲液；所述叔丁醇和磷酸盐缓冲液缓冲液的体积比为(10：1)～(1：10)。

在本发明中，所述多肽和CuSO₄的质量比优选为(5～30)：(1.92～12)，进一步优选为(15～20)：(5～10)；所述多肽和三羟丙基三唑基甲胺的质量比优选为(5～30)：(2～30)，进一步优选为(15～20)：(10～20)；所述多肽和所述抗坏血酸钠的质量比优选为(5～30)：(5～25)，进一步优选为(15～20)：(10～20)；所述多肽和缓冲液的质量体积比为(5～30)mg：(2～10)mL，进一步优选为(15～20)mg：(5～8)mL。在本发明中，所述环加成反应的温度优选为20～30℃，进一步优选为25℃，所述环加成反应的时间优选为9～16h，进一步优选为12h。

在本发明中，所述环加成反应的体系中，抗坏血酸钠(Na-Ascorbate)可以用作Cu(I)催化的炔烃叠氮点击化学反应(CuAAC)的还原剂；它催化还原Cu(II)源(CuSO₄)，从而释放出催化活性的Cu(I)离子；Cu(I)是催化炔烃叠氮点击化学反应(CuAAC)的铜源，作为催化剂；三羟丙基三唑基甲胺(THPTA，tris-hydroxypropyltriazolylmethylamine C₁₈H₃₂N₁₀O₃)是一种水溶性的，非常有效的促进配体，能够稳定一价铜离子，用于Cu(I)催化的炔烃叠氮化物点击化学反应(CuAAC)；叔丁醇/磷酸盐缓冲液(^tBuOH/PBS，^tBuOH和PBS体积比为7：3)，模拟生理条件，有较高的Cu(I)催化的炔烃叠氮化物点击化学反应(CuAAC)效率与产率。

在本发明中，^tBuOH购自广州市金华大化学试剂有限公司、CuSO₄、THPTA以及NaAsc购自上海泰坦科技有限公司，PBS购自美国Gibco公司。

在本发明中，叠氮和端炔在绝大多数化学条件下保持稳定，却可以在一价铜催化条件下，高效专一地转换为1,3-取代的三氮唑；本发明的制备方法反应条件温和，能够在生理学条件下进行，产率高，具有很高的化学选择性，不受水氧干扰，容易引入目标物质。

在本发明中，所述疫苗优选的包括新冠疫苗；所述免疫原优选的包括S蛋白和/或N蛋白。

在本发明中，所述疫苗的剂型优选的包括注射剂。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

第一多肽RK(azide)DVYG(alkyne)由吉尔公司合成。第一多肽的LC-MS结果图如图1所示。

以第一多肽RK(azide)DVYG(alkyne)作为反应底物(S1)利用环加成反应来完成自组装，化学反应式如图2所示，产物(peptide)n的结构式如式IV所示，

环加成反应的具体用量参见表1。

表1环加成反应的具体用量

	Mw	mmol	Wt(mg)	eq.
					S1	800.39	9.2	7.4	1.0
CuSO₄	159.60	16.0	4.6	2.5
					THPTA	434.50	46.0	20.0	5.0
Na-Ascorbate	198.11	92.0	18.2	10.0

将第一多肽作为底物S1(7.4mg)溶于^tBuOH/PBS(v/v＝7:3，终体积4ml)，在氩气保护下，首先加入CuSO₄(4.6mg)，再加入THPTA(20.0mg)，最后加入NaAsc(18.2mg)，25℃反应过夜；次日，产物用ms小瓶分装，-80℃冷藏过夜；第三天利用冻干机冻干后备用。

产物(peptide)n的LC-MS结果图参见图3。

以第二多肽KK(azide)QTYG(alkyne)作为反应底物(S2)利用环加成反应来完成自组装，反应条件参见上述第一多肽的环加成反应，产物(peptide)n的结构式如式V所示，

以第三多肽RK(azide)DVSG(alkyne)作为反应底物(S3)利用环加成反应来完成自组装，反应条件参见上述环加成反应，产物(peptide)n的结构式如式VI所示，

实施例2

作为佐剂使用时，将冻干粉末用水或生理盐水溶解，在新冠疫苗的Balb/C小鼠实验中免疫剂量为2μg/只鼠、10μg/只鼠或者50μg/只鼠，注射方式使用腹腔注射。

动物免疫的具体方法：新冠S+N蛋白作为新冠疫苗，上述实施例1中所制备得到的组装多肽作为疫苗佐剂，动物选用SPF级的BALB/c小鼠，6～8周龄，在无菌环境下饲养，每组4只。

具体的动物实验分组：

第一组：新冠S+N蛋白组---(s+n)组：其中S与N蛋白分别，混合后肌肉注射；

第二组：新冠S+N蛋白+铝佐剂组---(-s+n+al)组：其中S与N蛋白分别为10μg/只鼠，蛋白与铝佐剂的比例为1：3.5，铝佐剂35μg/只鼠，蛋白与铝佐剂三者混合后采用肌肉注射；

第三组：新冠S+N蛋白+多肽组---((peptide)n)组：其中S与N蛋白分别为10μg/只鼠，蛋白混合后采用肌肉注射，多肽为10μg/只鼠采用腹腔注射，混合蛋白与多肽同时免疫；

上述三组动物免疫时间间隔为0、2、4周，最后一次免疫后10天采血做ELISA检测与假病毒中和实验。

所有动物实验经中国医学科学院医学生物学研究所动物实验伦理委员会批准，严格按照云南省实验室动物福利与伦理委员会规定操作。

由抗原刺激机体产生的特异性抗体的免疫反应称为体液免疫，主要通过检测抗体的滴度的水平(主要是IgG)来体现体液免疫应答的强度与中和抗体实验来验证抗体的有效性。

三组所有BALB/c小鼠在最后一次免疫后10天采血做ELISA检测

具体步骤：用抗体稀释液(0.012mol/LNa₂CO₃，0.038mol/LNaHCO₃，pH 9.6)稀释新冠S蛋白，终浓度为5μg/ml，包被于96孔板，4℃，孵育过夜。利用PBST洗板3次，用含2％BSA的PBS封闭，37℃，孵育2h。用封闭液稀释小鼠血清，100μl/孔，小鼠的血清稀释度分别为:1:100、1:1000、1:10000、1:50000。37℃孵育1h后PBST洗板3次，按1:8000比例加入HRP标记的羊抗鼠IgG的二抗，37℃孵育1h后PBST洗板3次，加入TMB显色液，100μl/孔，显色5min。用2MH₂SO₄终止反应，50μl/孔。在波长450nm、630nm下，用酶联免疫检测仪检测OD值。

ELISA实验结果参见图4。图4结果显示：多肽佐剂组比不加佐剂的蛋白疫苗组与有铝佐剂的蛋白疫苗组更有效增强新冠疫苗引起的抗体反应；随着血清稀释度的增高的对比显示多肽佐剂组引起的IgG免疫反应更加强烈。

多肽佐剂提高新型冠状蛋白疫苗的体液免疫应答---中和抗体检测。

三组所有BALB/c小鼠在最后一次免疫后10天采血做中和抗体检测。

具体步骤：在96孔圆底板中，加入293TACE2转基因细胞，使每孔细胞数为2×10⁴个/孔，100μl/孔，37℃孵育，待细胞长成单层后；将待测血清按20、100、500倍的稀释度稀释好100μl/孔加入一块新的96孔U底板(最终体系：50μl血清稀释液+25μl培养基(含32μg/ml，最终浓度为8μg/ml的polybrene)+25μl假病毒)，培养箱孵育1h。孵育结束后，将最终感染液加入细胞培养板中，24h后换新鲜培养基，48h后进行检测。检测前将10ml LuciferaseAssayBuffer(-20℃保存，需提前放置在4℃冰箱溶化)加入1瓶Luciferase Assay Substrate(lyophilized)，平衡至25℃；将Luciferase Cell Cμlture Lysis 5X Reagent(CCLR)用ddH₂O稀释到1×，平衡至25℃。弃掉培养基，加入1×CCLR 20μl/孔，摇晃培养板，确保CCLR完全覆盖细胞。将培养板带到仪器前，调好仪器参数，加入100μl/孔的Luciferase AssaySystem试剂，检测，保存数据。检测结果参见图5。图5结果显示：多肽佐剂组比不加佐剂的蛋白疫苗组与有铝佐剂的蛋白疫苗组产生更强的中和抗体。

实施例3

利用高剂量新冠免疫蛋白疫苗与不同剂量的多肽佐剂免疫动物。

动物免疫的具体方法：新冠S+N蛋白作为新冠疫苗，上述实施例一中所制备得到的多肽作为疫苗佐剂，动物选用SPF级的BALB/c小鼠，6～8周龄，在无菌环境下饲养，A、B、C、D、E组每组5只。具体的动物实验分组：A组：新冠S与N蛋白分别为50μg/只鼠，肌肉注射，多肽为2μg/只鼠采用腹腔注射；B组：新冠S与N蛋白分别为50μg/只鼠，肌肉注射，多肽为10μg/只鼠采用腹腔注射；C组：新冠S与N蛋白分别为50μg/只鼠，肌肉注射，多肽为50μg/只鼠采用腹腔注射；D组：新冠S与N蛋白分别为50μg/只鼠，蛋白与铝佐剂的比例为1：3.5，铝佐剂175μg/只鼠肌肉注射；E组：新冠S与N蛋白分别为50μg/只鼠，肌肉注射；上述五组动物免疫时间间隔为0、3周，最后一次免疫后10天采血做IFN-γELISPOT检测。

多肽佐剂提高新型冠状肺炎疫苗的细胞免疫应答---IFN-γELISPOT检测

由抗原刺激机体T细胞分化、增殖、转化为致敏T细胞，当相同抗原再次进入机体，致敏T细胞所释放的细胞因子如γ-干扰素(IFN-γ)对抗原具有杀伤作用，检测IFN-γELISPOT能够体现细胞免疫的水平与强度。

五组所有BALB/c小鼠在最后一次免疫后10天采血做IFN-γELISPOT检测

具体步骤：IFN-γELISPOT检测圆底板加入100μl样品/孔，25℃10min，在吸水纸上轻轻拍干。样品由：50μl刺激物稀释液(S蛋白)+50μl细胞稀释液(5×10⁵个细胞，具体体积按细胞计数浓度算，补加1640完全培养基到50μl)，加入刺激物后再加细胞。用封口膜密封检测板，37℃，CO₂培养箱静置，10～15h。控干，加入PBST，300μl/孔，洗板子3次，吸水纸上轻轻拍干。加入DetectionAB，100μl/孔，用封口膜密封检测板，25℃孵育1.5h，控干，加入PBST，300μl/孔，洗板子3次，吸水纸上轻轻拍干。加入Diluted Streptavidin-APConjuate，100μl/孔，用封口膜密封检测板，25℃孵育1h，控干，加入PBST，300μl/孔，洗板子3次，吸水纸上轻轻拍干。加入ready-to-use BCIP/NBT buffer，100μl/孔25℃孵育5～20min，显色，控干，用装蒸馏水的洗瓶冲洗板子3次，吸水纸上轻轻拍干，轻轻剥掉板底，擦干多余水分，自然风干后可长期保存，并用德国AID ELISPOT READER(德国AID酶联斑点分析仪)检测读点。检测结果参见图6。图6结果显示：A、B、C组与D、E组对比显示多肽作为佐剂能够增强细胞免疫的强度,该多肽作为佐剂的浓度范围较宽泛，其中等剂量10μg/kg的多肽佐剂组(B组)增强效果最好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国医学科学院医学生物学研究所

<120> 一种免疫佐剂、含有所述免疫佐剂的疫苗及制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)

<223> Xaa(1)=R、D、V、Y、Q、T or/and S

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)

<223> K=经叠氮修饰K

<220>

<221> UNSURE

<222> (3)

<223> Xaa(3)=R、D、V、Y、Q、T or/and S

<220>

<221> UNSURE

<222> (4)

<223> Xaa(4)=R、D、V、Y、Q、T or/and S

<220>

<221> UNSURE

<222> (5)

<223> Xaa(5)=R、D、V、Y、Q、T or/and S

<220>

<221> UNSURE

<222> (6)

<223> G=经炔基修饰G

<400> 1

Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Gly

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)

<223> K=经叠氮修饰K

<220>

<221> UNSURE

<222> (6)

<223> G=经炔基修饰G

<400> 2

Arg Lys Asp Val Tyr Gly

1 5

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)

<223> K=经叠氮修饰K

<220>

<221> UNSURE

<222> (6)

<223> G=经炔基修饰G

<400> 3

Lys Lys Gln Thr Tyr Gly

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)

<223> K=经叠氮修饰K

<220>

<221> UNSURE

<222> (6)

<223> G=经炔基修饰G

<400> 4

Arg Lys Asp Val Ser Gly

1 5

Claims

1.一种免疫佐剂，所述免疫佐剂是由多肽进行叠氮化和炔烃环加成反应制备得到的；所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为XKXXXG；所述K经叠氮修饰；所述G经炔基修饰；

所述多肽选自第一多肽、第二多肽和第三多肽中的一种或几种；所述第一多肽、第二多肽和第三多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：4所示；

当所述多肽为第一多肽时，所述免疫佐剂的分子结构式如式IV所示，

式IV、式V和式VI中的n独立为2～8。

2.权利要求1所述免疫佐剂的制备方法，包括以下步骤：

将所述多肽溶于缓冲液，得到混合液，所述缓冲液包括叔丁醇和磷酸盐缓冲液；所述叔丁醇和磷酸盐缓冲液的体积比为10:1～1:10；

在氩气保护下，向所述混合液中依次加入CuSO₄、三羟丙基三唑基甲胺和抗坏血酸钠，进行环加成反应，得到免疫佐剂。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述多肽和CuSO₄的质量比为(5～30):(1.92～12)；所述多肽和三羟丙基三唑基甲胺的质量比为(5～30):(2～30)；所述多肽和抗坏血酸钠的质量比为(5～30):(5～25)；所述多肽和缓冲液的质量体积比为(5～30)mg:(2～10)mL。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述环加成反应的温度为20～30℃，所述环加成反应的时间为9～16h。

5.权利要求1所述免疫佐剂或者权利要求2～3任意一项所述制备方法得到的免疫佐剂在制备疫苗中的应用。

6.一种疫苗，包括免疫佐剂和免疫原，其特征在于，所述免疫佐剂为权利要求1所述免疫佐剂或者权利要求2～3任意一项所述制备方法得到的免疫佐剂。

7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述免疫原包括新冠病毒免疫原。

8.根据权利要求6或7所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的剂型包括注射剂。