TW202019387A - 一種金滑菇萃取物及其製備方法和應用 - Google Patents

Abstract

本發明涉及化妝品領域，提供一種保濕抗皺的金滑菇萃取物及其製備方法。金滑菇萃取物的主要成分為金滑菇多醣，分子量為4～20 kDa。通過脫脂、熱水超聲萃取以及分級醇沉純化，可以提高多醣的提取率，並且得到分子量較小的金滑菇多醣，使之易於被人體吸收，並且具有保濕抗皺的功效，將其應用於化妝品原物料中，可使產品達到較佳保濕及抗皺功能。

Description

一種金滑菇萃取物及其製備方法和應用

本發明涉及化妝品領域，具體涉及具有一種金滑菇萃取物及其製備方法和應用。

皮膚組織的衰老及厚度會隨著年齡增加而有明顯改變。當皮下脂肪減少，彈力纖維與膠原蛋白纖維會發生變化而使皮膚漸漸失去彈性和張力，更進一步導致皮膚鬆弛與皺紋產生。因此現在很多化妝品都會添加具有保濕及抗皺成分。

近年來研究發現，天然菇蕈類所萃取之多醣體影響之生理活性有調節免疫機能、抗老化、抗炎症、抗氧化、抗腫瘤活性、抗病毒、清除自由基等功效。其中以多體醣中所分離出來的β-葡聚醣已被證實可以促進皮膚中膠原蛋白和彈性蛋白增加，具有良好保濕及抗皺功效(Du, B et al., 2014)。進而增強皮膚彈性並減少皮膚細紋的產生，讓肌膚恢復細緻、彈性及柔嫩。可應用於化妝品原物料配方中，以增加化妝品之產品功能性及價值性，例如保濕和抗皺等功能。

金滑菇(Flammulina velutipes)又名絨柄金錢菇，子實體為金黃色菌柄，且絨毛較多，富含有多種活性物質，如膳食纖維、多醣、胺基酸等，具有很高的營養價值。由於金滑菇子實體菇體黏滑，可萃取出大量透明黃色、無味具黏滑性的金滑菇多醣體萃取物。活性物質也較金針菇多，包含多醣體和胺基酸成分約為金針菇的1.5~2倍，其中金滑菇含有獨特的β- 1,3-D-葡聚醣。臨床實驗證明，將β- 1,3-D-葡聚醣使用在皮膚上，能增加皮膚的彈性並形成較厚實的真皮層，對於老化或已經形成皺紋的皮膚，供應越多的表皮成長因子，就愈能增加膠原蛋白和彈性蛋白的產生，進而改善皮膚的外觀，並讓小細紋和皺紋消失。然而，目前未有金滑菇對於保濕和抗皺相關的研究及應用。

多醣的萃取方法，大多將菇蕈類之菌絲體進行液態發酵培養或直接採用子實體，以熱水萃取法、酶萃取或酸堿萃取法等進行萃取，進一步再藉由有機溶劑，如酒精等，進行沉澱以得到多醣。此傳統方式所萃取出來之多醣分子質量較大，約為100k道耳頓(Dalton, Da)至1000k道耳頓之間，人體皮膚較無法輕易吸收，如應用於添加在化妝品配方中，可能無法使其化妝品達到較佳保濕和抗皺之功效。因此，本發明人有鑑於此，根據先前技術所具有之不足處，乃亟思加以改良，提供具有一種保濕抗皺的金滑菇萃取物及其製備方法，可將該萃取物應用於護膚保養品如面膜、化妝水、精華液等，開發更多的功效護膚品，以提供消費者更多元的選擇。

本發明涉及化妝品領域，具體涉及具有一種保濕抗皺的金滑菇萃取物及其製備方法，其製備過程簡單方便且多醣損失率少，可快速純化分離具有專一功效性之小分子量多醣萃取物。此方法將金滑菇子實體利用熱水萃取經超音波輔助，再藉由酒精分級沉澱原理可做為高與低分子量之區分，以不同酒精濃度製備分級流程可製備成具有良好保濕抗皺效用的化妝品，具體可製成面膜、化妝水、精華液、修復霜等產品；本發明的有益效果：有效地提高皮膚彈性、推遲皮膚衰老，使皮膚不易乾燥產生皺紋，改善皮膚，提高皮膚的光亮度。

一種金滑菇萃取物，其主要成分為金滑菇多醣，所述的金滑菇多醣分子量為4～20 kDa。並且，其中β- 1,3-D-葡聚醣含量為12%～15%。

上述金滑菇萃取物的製備方法包括以下步驟：

（1） 脫脂：金滑菇子實體粉末經過醇溶液脫脂處理，脫去脂類和有色物質和小分子物質；

（2）提取：經過脫脂處理的金滑菇子實體粉末用熱水超聲萃取，離心後取上清液；

（3） 第一次醇沉：步驟（2）獲取的上清液減壓濃縮加入醇，至混合液中醇的體積濃度為35%～45%，醇沉並離心分離；

（4）第二次醇沉：取步驟（3）上清液，減壓濃縮後加入醇，至混合液中醇的體積濃度為55%～65%，醇沉並離心分離；

（5）第三次醇沉：取步驟（4）上清液，減壓濃縮後加入醇，至混合液中醇的體積濃度為75%～85%，醇沉並離心分離，取沉澱與步驟（3）和（4）離心分離所獲得的沉澱合併。

優選的，步驟（1）中，用75%～85%醇溶液，在65～75℃下反應6～8小時脫脂。

優選的，所述的醇溶液為甲醇、乙醇、乙二醇、丙二醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇或叔丁醇中的任一種。

步驟（3）～（5）中醇沉的條件為：加入醇溶液攪拌，並0～10℃下攪拌沉澱12～72小時。優選的，加入4～15倍醇溶液進行醇沉。

更優選的，步驟（3）的混合液中，醇濃度為40%，步驟（4）的醇溶液濃度為60%，步驟（5）醇溶液濃度為80%。

步驟（2）中，熱水超聲萃取的方法為：經過脫脂處理的金滑菇子實體粉末在70～90℃下用熱水超聲萃取提取1～5次，合併提取液；超聲萃取的條件為：頻率40～80KHz，每次10～60分鐘。

上述金滑菇萃取物具有良好的吸濕、保水能力，並且具有清除自由基和抗氧化能力，對膠原蛋白酶和彈性蛋白酶有良好的抑制作用，同時不影響細胞的生長，有良好的保濕抗皺效果，可用於製備護膚品或化妝品。

護膚品或化妝品包括單不限於面膜、化妝水、精華液、修復霜、乳液等。

所述金滑菇萃取物作為護膚品或化妝品中保濕和/或抗皺的活性成分。

所述金滑菇萃取物作為清除自由基、抗氧化、吸濕、保水、抑制彈性蛋白酶或者抑制膠原蛋白酶的活性成分。

一種保濕抗皺的護膚品或化妝品，含有上述的金滑菇萃取物，其中金滑菇多醣的分子量為4-20KD。

本發明的有益效果在於：通過改進提取方法，將金滑菇子實體去脂後，用熱水進行超聲提取，可得到含較多的多醣萃取液，再以不同酒精濃度進行分級沉降進行純化將金滑菇多醣進行分離可得不同分子量、β- 1,3-D-葡聚醣含量及官能基之鍵結，得到的萃取物多醣分子量在4-20 kDa，其中β- 1,3-D-葡聚醣含量超過12%。製備過程簡單方便且多醣損失率少，可快速純化分離具有專一功效性之小分子量多醣萃取物。

這種金滑菇萃取物可以有效地提高皮膚彈性、推遲皮膚衰老，使皮膚不易乾燥產生皺紋，改善皮膚，提高皮膚的光亮度。

本發明解決了金滑菇所萃取出之多醣分子質量較大不易被人體吸收的問題，並獲得更多β- 1,3-D-葡聚醣含量，使之可以應用於化妝品，解決現有的金滑菇粗多醣無法使產品達到較佳保濕及抗皺功能之問題。

實施例1

（1） 脫脂：取金滑菇子實體冷凍乾燥至含水量低於5%，粉碎後取100g 與1000mL 80%（體積濃度）乙醇溶液混合，65～75℃回流6小時脫脂，去除脂類、低聚糖色素和小分子物質，過濾取固體；

（2） 提取：脫脂後的金滑菇子實體粉末乾燥後，加入2000mL 80℃ 熱水，60KHz超聲萃取150分鐘，取上清液，殘渣繼續用熱水超聲萃取；共提取三次，合併上清液。

（3）第一次醇沉：上清液減壓濃縮至1L，緩慢加入醇類溶液至40%（體積濃度），攪拌使之沉澱產生絮狀物，在4℃下攪拌48小時使多醣完全析出，4000rpm條件下離心30min，取固體冷凍乾燥，得到40%濃度乙醇下的金滑菇多醣；

（4） 第二次醇沉：上清液繼續減壓濃縮至1L，緩慢加入醇類溶液至60%（體積濃度），攪拌使之沉澱產生絮狀物，在4℃下攪拌48小時使多醣完全析出，4000rpm條件下離心30min，取固體冷凍乾燥，得到60%濃度乙醇下的金滑菇多醣；

（5）第三次醇沉：上清液繼續減壓濃縮至1L，緩慢加入醇類溶液至80%（體積濃度），攪拌使之沉澱產生絮狀物，在4℃下攪拌48小時使多醣完全析出，4000rpm條件下離心30min，取固體冷凍乾燥，得到80%濃度乙醇下的金滑菇多醣。

合併步驟（3）～（5）的沉澱，收率約4～6克。經過分析，其主要成分為多糖，分子量4～20 kDa，β- 1,3-D-葡聚醣含量13%～14%。

實施例2

另外取金滑菇子實體，用傳統的熱水萃取法，70～80℃下按1g：10mL的比例用熱水提取12小時，濃縮後再用4倍體積95%乙醇進行醇沉，獲得金滑菇粗多醣，其分子量在200～1000 kDa，作為對照組。

取上述金滑菇粗多醣和實施例1的金滑菇多醣0.1~0.5克粉末，以30%甘油水溶液為陽性對照，檢測其吸濕能力。

實驗方法：分別取0.1 ～ 0.5克的樣品粉末放置在錫箔紙上，置於康威氏皿內室之小圓碟中並秤重，在外室加上加入3 ml 標準飽和溶液，于康威氏皿蓋子邊緣塗抹凡士林使之成為密閉空間，放入 30 ℃烘箱中 4、24、48、72、96小時，取出小圓碟秤重，依下列公式計算在不同濕度下之吸濕率。

吸濕能力 (%) = [ (Wt – Wo ) / Ws ] × 100%

Wo：樣品皿和樣品總重 (g)。

Wt：24 小時後取出之樣品皿和樣品總重 (g)。

Ws：樣品原始重量 (g)。

結果如圖1。在相對濕度環境下放置24小時後，40~80%金滑菇多醣具有介於30%~40%之吸濕能力，顯著高於陽性對照組和金滑菇粗多醣對照組；金滑菇粗多醣的吸濕能力低於陽性對照組。

實施例3

實施例1的金滑菇多醣和對照組金滑菇粗多醣分別配製成1wt%溶液，以1%甘油溶液為陽性對照，在相對濕度環境下，測試其不同時間的保水能力。

試驗方法：樣品溶液放入直徑3 cm的秤量瓶中，將樣品溶液置於30℃含有矽膠 (silica gel) 乾燥箱，在不同時間點測量樣品 (0、 4、24、48、72、96小時)。

保水能力(%)= Ht / H0 × 100,

H0： 樣品放置乾燥箱前之水重

Ht：樣品放置乾燥箱後之水重

結果如圖2所示，在相對濕度環境下放置24小時後，金滑菇多醣（4-20 kDa)具有介於70%~80%之保水能力，顯著高於陽性對照組和金滑菇粗多醣對照組。

實施例4

實施例1的金滑菇多醣和對照組金滑菇粗多醣分別配製成不同濃度的溶液，以BHA為陽性對照，測試其清除過氧化氫的能力。

實驗方法: 取1 mL不同濃度（0～2 mg/mL）的樣品溶液於試管中，分別加入4 mM 過氧化氫溶液，混合物在30 ℃條件下反應10 min，以吸收波長 230 nm做檢測，皆以3次重複的平均值來計算。

過氧化氫清除率 (%) =1- [ (As – A1 ) / A0 ] × 100%

A0:為空白對照組的吸亮度

AS:為樣品的吸亮度

A1:為樣品幹擾實驗組(以水代替過氧化氫)的吸亮度

結果如圖3所示相同濃度下，金滑菇多醣（4-20 kDa）清除過氧化氫的能力顯著高於陽性對照組和金滑菇粗多醣對照組，說明其具有良好的清除自由基、抗氧化效果；金滑菇粗多醣清除過氧化氫能力最低。

隨著金滑菇多醣樣品（4-20 kDa）濃度增加，過氧化清除除能力更佳。

實施例5

實施例1的金滑菇多醣和對照組金滑菇粗多醣分別配製成不同濃度的溶液，測試其對細胞的毒性（對L929細胞的抑制）。

實驗方法:分別添加不同濃度（0~500 µg/mL）的樣品溶液的細胞培養液培養L929細胞48小時後，觀察細胞存活率之結果，以未添加任何金滑菇多醣萃取液(0µg /mL)之組別作為對照組。如圖4所示，不同濃度之金滑菇多醣萃取液皆不會影響細胞生長，此本發明4-20 kDa的金滑菇多醣並不會對細胞造成毒害，顯示其對於化妝品保養品之應用開發應無安全上之疑慮。

實施例6

實施例1的金滑菇多醣和對照組金滑菇粗多醣分別配製成不同濃度的溶液，用於測定其抑制膠原蛋白酶活性的能力。

實驗方法:分別添加不同濃度（0~1.0 mg/mL）的樣品溶液之40~80%金滑菇多醣與金滑菇粗多醣，在96孔盤中與膠原蛋白受質溶液混合。將稀釋的膠原蛋白酶加入各孔中於37℃下反應30分鐘。測量熒光最大值為495nm，發射最大值為515 nm，每個測定采三重複進行。

膠原蛋白酶抑制率(%)=（1 - Cabs - Dabs / Aabs - Babs）×100

A:有膠原蛋白酶，無樣品

B:無膠原蛋白酶，有樣品

C: 有膠原蛋白酶，無樣品

D: 無膠原蛋白酶，有樣品

結果如圖5所示，金滑菇多醣（4-20 kDa）對膠原蛋白酶的抑制能力顯著高於金滑菇粗多醣；隨著金滑菇多醣樣品濃度增加，膠原蛋白酶抑制活性能力更佳。

實施例7

實施例1的金滑菇多醣和對照組金滑菇粗多醣分別配製成不同濃度的溶液，用於測定其抑制彈性蛋白酶活性的能力。

實驗方法:分別添加不同濃度（0~1.0 mg/mL）的樣品溶液之40~80%金滑菇多醣與金滑菇粗多醣于96孔盤中，在依序加入彈力受質溶液及彈力蛋白酶。混合均勻後，靜至於室溫20分鐘，通過405nm處的吸亮度測量，每個測定采三重複進行。

彈性蛋白酶抑制率(%)=（1 - Cabs - Dabs / Aabs - Babs）×100

A:有彈性蛋白酶，無樣品

B:無彈性蛋白酶，有樣品

C: 有彈性蛋白酶，無樣品

D: 無彈性蛋白酶，有樣品

結果如圖6所示，金滑菇多醣（4-20 kDa）對彈性蛋白酶的抑制能力顯著高於金滑菇粗多醣；並且隨著金滑菇多醣樣品濃度增加，彈性蛋白酶抑制活性能力更佳。

無

圖1為實施例2金滑菇多醣、金滑菇粗多醣吸濕能力測定結果

圖2為實施例3金滑菇多醣、金滑菇粗多醣保水能力測定結果

圖3為實施例4金滑菇多醣、金滑菇粗多醣清除過氧化氫能力的測定結果。

圖4為實施例5金滑菇多醣、金滑菇粗多醣抑制L929細胞的測定結果。

圖5為實施例6金滑菇多醣、金滑菇粗多醣抑制膠原蛋白酶能力的測定結果。

圖6為實施例7金滑菇多醣、金滑菇粗多醣抑制彈性蛋白酶能力的測定結果。

Claims (10)

1. 一種金滑菇萃取物，其主要成分為金滑菇多醣，該金滑菇多醣分子量為4～20 kDa。
2. 如申請專利範圍第1項所述金滑菇萃取物的製備方法，包括以下步驟： （1） 脫脂：金滑菇子實體粉末經過醇溶液脫脂處理，脫去脂類和有色物質和小分子物質； （2） 提取：經過脫脂處理的金滑菇子實體粉末用熱水超聲萃取，離心後取上清液； （3） 第一次醇沉：步驟（2）獲取的上清液減壓濃縮加入醇至混合液中醇的體積濃度為35%～45%，醇沉並離心分離； （4）第二次醇沉：取步驟（3）上清液，減壓濃縮後加入醇，至混合液中醇的體積濃度為55%～65%，醇沉並離心分離； （5）第三次醇沉：取步驟（4）上清液，減壓濃縮後加入醇，至混合液中醇的體積濃度為75%～85%，醇沉並離心分離，取沉澱與步驟（3）和（4）離心分離所獲得的沉澱合併。
3. 如申請專利範圍第2項所述金滑菇萃取物的製備方法，其中該步驟（1）中，用75%～85%醇溶液，在65～75℃下反應6～8小時脫脂。
4. 如申請專利範圍第2項所述金滑菇萃取物的製備方法，其中該步驟（3）的醇溶液濃度為40%，步驟（4）的醇溶液濃度為60%，步驟（5）醇溶液濃度為80%。
5. 如申請專利範圍第2項所述金滑菇萃取物的製備方法，其中該醇溶液為甲醇、乙醇、乙二醇、丙二醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇或叔丁醇中的任一種；步驟（3）～（5）中醇沉的條件為：加入醇溶液攪拌，並0～10℃下攪拌沉澱12～72小時。
6. 如申請專利範圍第2項所述金滑菇萃取物的製備方法，其中該步驟（2）中，熱水超聲萃取的方法為：經過脫脂處理的金滑菇子實體粉末在70～90℃下用熱水超聲萃取提取1～5次，合併提取液；超聲萃取的條件為：頻率40～80KHz，每次10～60分鐘。
7. 如申請專利範圍第1項所述的金滑菇萃取物在製備護膚品或化妝品方面的應用。
8. 如申請專利範圍第7項所述的應用，其中該金滑菇萃取物作為護膚品或化妝品中保濕和/或抗皺的活性成分。
9. 如申請專利範圍第7項或第8項所述的應用，其中該金滑菇萃取物作為清除自由基、抗氧化、吸濕、保水、抑制彈性蛋白酶或者抑制膠原蛋白酶的活性成分。
10. 一種保濕抗皺的護膚品或化妝品，其中含有申請專利範圍第1項所述的金滑菇萃取物。

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