TW202014207A - 用於靶向及清除聚集體之結合物(conjugates) - Google Patents

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Abstract

本發明在一些實施例中提供一種結合物，其包含：a)與IgG之Fc片段競爭以結合至Fc受體之肽；及b)靶向分子聚集體之靶向部分。在一些實施例中，本發明提供使用該等結合物治療與聚集體形成有關之疾病或病症之方法。

Description

用於靶向及清除聚集體之結合物(CONJUGATES)
多種疾病及病症由蛋白質、多醣、脂質及/或核苷酸之聚集體所致或與其有關。在許多情況下，此等聚集體視為有毒。此等疾病影響在整個身體中之多個細胞、組織及器官。
澱粉樣變性係一類與組織中之異常蛋白質構象異構體(稱為澱粉樣原纖維)之積聚有關之疾病。臨床特徵視澱粉樣變性之類型而定，且可包括腹瀉、體重減輕、疲勞、舌腫大(glossomegaly)、出血、軀體感覺障礙、體位低血壓、周邊水腫及脾腫大。澱粉樣變性之治療通常僅處理症狀，且可能並不有效。澱粉樣變性之實例包括AL澱粉樣變性、AA澱粉樣變性、甲狀腺素運載蛋白澱粉樣變性、軟腦膜澱粉樣變性、第II型糖尿病及某些神經退化性疾病，諸如阿茲海默氏病(Alzheimer's Disease)及庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease)。
肝醣貯積症係一系列通常與導致異常肝醣合成或糖酵解之酶缺陷有關的疾病。此等疾病可為遺傳的或後天性的，且症狀視疾病類型而改變。肝醣貯積症之實例包括GSDI-XV。治療通常係有限的碳水化合物飲食，但可包括用別嘌呤醇及/或人類粒細胞群落刺激因子治療。
脂質聚集體疾病包括動脈粥樣硬化、心臟病及神經退化性疾病，諸如尼曼-匹克C型疾病(Niemann-Pick Type C disease)。涉及RNA分子異常聚集之疾病包括齒狀紅核蒼白球路易體萎縮(Dentatorubral pallidoluysian atrophy，DRPLA)、亨廷頓氏舞蹈病(Huntington chorea，HD)、眼咽型肌肉萎縮症(Oculopharyngeal muscular dystrophy，OPMD)、脊髓延髓肌肉萎縮症(Spinobulbar muscular atrophy，SBMA)及第1、2、3、6、7及17型脊髓小腦失調(SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA17)、XA脆折、XE脆折、弗里德利希共濟失調(Friedrich's ataxia)、第1型肌緊張性營養障礙(DM1)、第2型肌緊張性營養障礙(DM2)、第8、10及12型脊髓小腦失調(SCA8、SCA 10、SCA 12)、肌肉萎縮性側索硬化及額顳癡呆(fronotemporal dementia，FTD)。此等疾病缺乏能夠清除聚集體之有效治療。
神經系統之退化性疾病造成明顯的全世界醫藥及公共衛生負擔。此等疾病之流行率及發生率隨著年齡增長而顯著升高，且在許多國家，預計病例數目隨著預期壽命延長而增加(Checkoway H等人 IARC Sci Publ. 2011; (163):407-19)。在2015年，國際阿茲海默氏病協會(Alzheimer's Disease International，ADI)估算在全世界存在4680萬患有阿茲海默氏病之人，且截至2050年此數目將增長至1.315億人(Prince M.等人 ADI Report. 2016年9月20日; 1-131)。在2018年，估算570萬各年齡的美國人患有阿茲海默氏病，其中550萬人之年齡係65歲且更老(阿茲海默氏病協會(Alzheimer's Association). 2018 Alzheimer's Disease Facts and Figures. Alzheimers Dement 2018; 14(3):367-429)。截至2050年，在不存在預防或治癒該疾病之醫藥介入下，在美國65歲且更老之患有阿茲海默氏病之人的數目幾乎可達三倍，由510萬達至預計1400萬。同上。
神經退化性疾病通常與細胞內或細胞外蛋白聚集體之積聚有關，該等蛋白質聚集體係諸如帕金森氏病中之α-突觸核蛋白、阿茲海默氏病中之β-澱粉樣蛋白及滔蛋白、亨廷頓氏病中之亨廷頓蛋白及傳染性朊病毒腦病中之朊病毒蛋白(PrP)(Brundin P等人 Nat Rev Mol Cell Biol. 2010年4月; 11(4): 301-307)。其他全身退化性疾病亦歸因於α-突觸核蛋白、β-澱粉樣蛋白、亨廷頓蛋白、朊病毒蛋白及澱粉素，該等疾病中之一些存在於神經系統外部。此等疾病包括諸如以下之疾病：第II型糖尿病，其特徵為澱粉素沈積；及澱粉樣變性，一種澱粉樣蛋白積累於諸如心臟、腎臟、肝臟、脾臟、神經系統或消化道之多種器官及組織中之罕見疾病。
正形成關於蛋白質聚集體病症之新穎理解，該等蛋白質聚集體病症係諸如涉及蛋白質褶疊異常之阿茲海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、傳染性海綿狀腦病(TSE)、運動神經元病、滔蛋白病變、第II型糖尿病、澱粉樣變性等。證據表明此等惡意蛋白質之蛋白質褶疊異常及後續傳播係與由滔蛋白、α突觸核蛋白及β-澱粉樣蛋白所致之疾病共有之通用現象(Panegyres PK及Armari E. Am J Neurodegener Dis. 2013; 2(3): 176-186)。聚集蛋白質之沈積係此等原本不相關的病理性條件之主要特徵。
α-突觸核蛋白、β-澱粉樣蛋白、亨廷頓蛋白、朊病毒蛋白質之蛋白質聚集通常在若干相同單體蛋白質自結合以使構形由天然結構變為聚集結構時開始。咸信，在大多數聚集疾病中，由天然結構至富β片寡聚結構之構形轉變甚至在原纖維化過程中仍十分關鍵(Morales B等人. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2009年11月; 8(5): 363-371)。因此，多種療法均嘗試阻斷蛋白質褶疊異常在整個大腦及身體中之傳播(Frost B及Diamond MI. Nat Rev Neurosci. 2010年3月; 11(3): 155-159)。一些此等策略包括使用化合物、抗體、疫苗、小分子、抗氧化劑、不穩定肽或天然提取物(1)抑制澱粉樣多肽產生，(2)抑制澱粉樣原纖維形成及(3)使澱粉樣結構不穩定。
目前諸如阿茲海默氏病之聚集體疾病尚無治癒方法，且阿茲海默氏病中之預後不良。截至2018年，大多數治療僅限於主要由乙醯膽鹼酯酶抑制劑組成之症狀處理。在美國僅有五種批准的藥物用於治療阿茲海默氏病(Aricept®、Exelon®、Razadyne®、Namenda®及Donepezil®))。此等藥物暫時減慢症狀之惡化且改良患有阿茲海默氏病之彼等患者及其照顧者之生活品質。然而，其並不治癒阿茲海默氏病或阻止其進行。
鑒於缺乏用於聚集體相關之疾病或病症之有效治療選項，需要創新治療劑用於治療此等疾病或病症。
在一些實施例中，本發明提供一種結合物，其包含：a)與IgG之Fc片段競爭以結合至Fc受體之肽；及b)靶向分子聚集體之靶向部分。在一些實施例中，肽活化Fc效應子功能。在一些實施例中，Fc受體選自由以下組成之群：FcγRI、FcγRII及FcγRIII。在一些實施例中，Fc受體係人類受體。在一些實施例中，Fc受體係以下中之任一者：FcγRI、FcRn、TREM2、CD33、TMEM119、CD11b、CD45、Iba1、CX3CR1、CD68、P2X家族或 P2Y家族受體。在一些實施例中，Fc受體係TREM2。在一些實施例中，Fc受體係FcRn。在一些實施例中，Fc受體係人類FcγRI (hFcγRI)。在一些實施例中，Fc效應子功能係吞噬作用。在一些實施例中，肽與IgG3或IgG1抗體之Fc部分競爭。在一些實施例中，肽與IgG1之Fc部分競爭。在一些實施例中，肽包含LLG之三肽基元。在一些實施例中，肽包含基元ςP之二聚體且其中ς表示疏水性殘基。在一些實施例中，肽在肽之N端包含蘇胺酸。在一些實施例中，肽在肽之C端下包含麩胺酸。在一些實施例中，肽包含胺基酸序列TX2CXXςPXLLGCφXE (SEQ ID NO: 1)；其中X係任何胺基酸，ς係疏水性殘基且φ係酸性胺基酸。在一些實施例中，肽特異性結合至hFcγRI且不展現與hFcγRII或hFcγRIII之交叉反應性。在一些實施例中，肽包含胺基酸序列AQVNSCLLLPNLLGC (SEQ ID NO: 2)。在一些實施例中，肽包含胺基酸序列AQVNSCLLLPNLLGCGDDK (SEQ ID NO: 3)。在一些實施例中，將肽中之一或多個胺基酸殘基甲基化。在一些實施例中，將與SEQ ID NO: 2或3之位置11對應之胺基酸位置處之天冬醯胺殘基甲基化。在一些實施例中，將與SEQ ID NO: 2或3之位置13對應之胺基酸位置處之白胺酸殘基甲基化。
在一些實施例中，本發明提供一種結合物多聚體，其包含彼此鍵聯以產生二聚或寡聚肽之本文所揭示之結合物中之任兩者或更多者。在一些實施例中，肽結合至兩個hFcγRI且活化Fc效應子功能。在一些實施例中，結合物包含兩個藉由KKKKK連接子(SEQ ID NO: 22)連接之Fc模擬肽。在一些實施例中，結合物能夠將免疫細胞募集於分子聚集體中。在一些實施例中，免疫細胞係單核球衍生細胞。在一些實施例中，免疫細胞係巨噬細胞。在一些實施例中，免疫細胞係單核球。在一些實施例中，免疫細胞係微神經膠質細胞。在一些實施例中，結合物結合至免疫細胞且有助於活化免疫細胞。在一些實施例中，結合物有助於吞噬分子聚集體中之至少一部分。在一些實施例中，靶向部分靶向蛋白質聚集體。在一些實施例中，蛋白質聚集體包含以下蛋白質中之任一者之聚集體：α-突觸核蛋白、滔蛋白、澱粉樣蛋白β、TDP-43、SOD1、FUS、TDP-43、朊病毒蛋白質、免疫球蛋白輕鏈、甲狀腺素運載蛋白、血纖維蛋白原、膠原蛋白、胰島澱粉樣多肽、溶菌酶、降鈣素、血清澱粉樣A蛋白質、LECT2、澱粉素、膠溶素、血纖維蛋白原A、促乳素、角膜上皮蛋白及β2 -微珠蛋白。在一些實施例中，靶向部分靶向脂質聚集體。在一些實施例中，脂質聚集體係膽固醇聚集體。在一些實施例中，靶向部分靶向多醣聚集體。在一些實施例中，靶向部分靶向肝醣聚集體。在一些實施例中，靶向部分係小分子。在一些實施例中，靶向部分係肽。在一些實施例中，靶向部分係核酸。在一些實施例中，靶向部分係染料。在一些實施例中，染料結合至澱粉樣蛋白。在一些實施例中，染料係選自由以下組成之群：硫代黃素、五聚體甲醯基噻吩乙酸(pFTAA)、七聚體甲醯基噻吩乙酸(hFTAA)、剛果紅(Congo Red)、結晶紫、1-胺基-8-萘磺酸(ANS)、4-(二氰基乙烯基)-久洛利定(DCVJ)、胺基苯并蒽酮、甲氧基XO4、噻嗪紅、匹茲堡B (Pittsburgh B)及其澱粉樣蛋白結合衍生物。在一些實施例中，硫代黃素係硫代黃素T或其澱粉樣蛋白結合衍生物。在一些實施例中，澱粉樣蛋白包含以下蛋白質中之任何一或多者：α-突觸核蛋白、滔蛋白、澱粉樣蛋白β、TDP-43、SOD1、FUS、C79ORF、TDP-43、朊病毒蛋白質、免疫球蛋白輕鏈、甲狀腺素運載蛋白、血纖維蛋白原、膠原蛋白、胰島澱粉樣多肽、溶菌酶、降鈣素、血清澱粉樣A蛋白質、LECT2、澱粉素、膠溶素、血纖維蛋白原A、促乳素、角膜上皮蛋白及β2 -微珠蛋白。在一些實施例中，澱粉樣蛋白包含溶菌酶。在一些實施例中，染料結合至膽固醇。在一些實施例中，染料係非律平(filipin)或其膽固醇結合衍生物。在一些實施例中，染料結合至膠原蛋白。在一些實施例中，染料係天狼星紅(sirius red)、Col-F、俄勒岡綠488 (Oregon Green 488)或天狼猩紅(Picrosirius red)、亮綠SF淡黃、堅牢綠FCF (Fast Green FCF)、甲基藍、水藍、苯胺藍及其膠原蛋白結合衍生物。在一些實施例中，染料結合多醣聚集體。在一些實施例中，染料結合肝醣聚集體。在一些實施例中，染料係選自由以下組成之群：過碘酸、艾爾遜藍(alcian blue)及二甲基亞甲基藍。在一些實施例中，染料結合核苷酸聚集體。在一些實施例中，染料結合至RNA聚集體。在一些實施例中，染料結合DNA聚集體。在一些實施例中，靶向部分已經修飾以有助於與肽結合。在一些實施例中，靶向部分已經修飾以使其包括羧基。在一些實施例中，靶向部分之羧基結合至肽之胺基端。在一些實施例中，靶向部分已經修飾以使其包括胺基。在一些實施例中，靶向部分之胺基結合至肽之羧基端。
在一些實施例中，靶向部分藉助於連接子與肽結合。在一些實施例中，連接子係不可裂解連接子、腙連接子、硫醚連接子、二硫鍵連接子、肽連接子或β-葡萄糖苷酸連接子。在一些實施例中，連接子係剛性連接子。在一些實施例中，連接子包含化合物II之結構。
Figure 02_image001
，(化合物II)，其中n係1-30，且m係0、1、2、3、4或5。在一些實施例中，n係1-25、1-20、1-15、1-10、1-8、1-6、1-4、1-2或1。在一些實施例中，n係2。在一些實施例中，m係0。在一些實施例中，連接子係β-丙胺酸連接子、短聚乙二醇(PEG)連接子或長PEG連接子。在一些實施例中，連接子係β-丙胺酸連接子。
在一些實施例中，結合物進一步與額外異源部分結合。在一些實施例中，異源部分係生物素。在一些實施例中，結合物包含稠合至硫代黃素T之胺基酸序列AQVNSCLLLPNLLGCGDDK (SEQ ID NO: 3)，或其衍生物。在一些實施例中，結合物包含稠合至化合物I之胺基酸序列AQVNSCLLLPNLLGCGDDK (SEQ ID NO: 3)：
Figure 02_image003
。在一些實施例中，結合物包含化合物III之結構：
Figure 02_image005
，其中R1 係生物素或氫； 其中R2 包含： a)化合物IV (
Figure 02_image007
)； b)化合物V (
Figure 02_image009
)； c)化合物VI (
Figure 02_image011
)；或 d)化合物VII (
Figure 02_image013
)。在一些實施例中，R1 係生物素。在一些實施例中，R1 係氫。在一些實施例中，R2 包含化合物V(
Figure 02_image015
)。
在一些實施例中，本發明提供一種藉由投與本文所揭示之結合物中之任何一或多者治療澱粉樣變性之方法。在一些實施例中，澱粉樣變性係選自由以下組成之群：AL澱粉樣變性、AA澱粉樣變性、阿茲海默病、LECT2澱粉樣變性、軟腦膜澱粉樣變性、老年全身性澱粉樣變性、家族澱粉樣多發性神經病、血液透析相關之澱粉樣變性、第2型糖尿病、庫賈氏病、格斯曼-斯托斯勒-謝恩克爾症候群(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome)、芬蘭型澱粉樣變性、大腦澱粉樣血管病、家族內臟澱粉樣變性、原發性皮膚澱粉樣變性促乳素瘤、家族角膜澱粉樣變性、帕金森氏病、肌肉萎縮性側索硬化、大腦澱粉樣血管病、額顳葉癡呆、甲狀腺髓樣癌及B2M澱粉樣變性。在一些實施例中，澱粉樣變性係家族澱粉樣變性。在一些實施例中，澱粉樣變性係全身澱粉樣變性。
在一些實施例中，本發明提供一種藉由用本文所揭示之結合物中之任一者治療細胞或組織而降低細胞或組織中之聚集體含量之方法。在一些實施例中，本發明提供一種組合物，其包含本文所揭示之結合物中之任一者及醫藥學上可接受之賦形劑。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2018年4月30日申請之美國臨時申請案62/664,345之優先權。前述申請案以全文引用的方式併入本文中。
術語「連接子」及「鍵聯」可互換使用且意謂包含共價鍵或共價連接或連接至兩個不同實體(例如本文所揭示之靶向部分中之任一者及本文所揭示之肽中之任一者)之原子鏈之化學部分。
「鍵聯部分」意謂能夠與其他分子反應以藉由共價鍵形成鍵聯之化學反應性基團、取代基或部分，例如親核體或親電體。
在所有其語法形式下，術語「序列相似性」係指可共用或可不共用共同進化源之核酸或胺基酸序列之間的一致性或對應性程度。然而，在常見用法及本申請案中，在經諸如「高度」之副詞修飾時，術語「同源」可指序列相似性且可關於或可不關於共同進化源。
關於參考肽(或核苷酸)序列之「序列一致性百分比(%)」或「一致性百分比(%)」定義為在比對序列且必要時引入間隙以獲得最大序列一致性百分比且不考慮作為序列一致性之一部分的任何保守取代之後，候選序列中與參考肽(核苷酸)序列中之胺基酸殘基(或核酸)一致之胺基酸殘基(或核酸)之百分比。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術中之各種方式實現，例如使用公開可獲得之電腦軟體，如BLAST、BLAST -2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定比對序列之適當參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何算法。然而，出於本文之目的，胺基酸(核酸)序列一致性%值使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生。ALIGN-2序列比較電腦程式藉由Genentech, Inc.創作，且原始程式碼已在美國版權局(U.S. Copyright Office), Washington D.C., 20559申請用戶文檔，其在此註冊在美國版權註冊第TXU510087號下。ALIGN-2程式可公開購自Genentech, Inc., South San Francisco, Calif.或可自原始程式碼編譯。ALIGN-2程式經編譯可用於UNIX操作系統，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不變化。
本文所揭示之數值範圍包括界定範圍之數值以及存在於所揭示之數值範圍內之任何個別數值或範圍。舉例而言，「1-10」之揭示範圍將包括諸如「1-5」、「2-6」、「7-9」及「5-10」之範圍
除非上下文以其他方式對術語進行明確規定，否則單數術語「一(a/an)」包括複數個指示物。術語「一(a)」(或「一(an)」)以及術語「一或多」及「至少一」在本文中可互換使用。此外，本文所使用之「及/或」應視為兩種或更多種指定特徵或組分中之各者具有或不具有另一者之特定揭示內容。因此，諸如本文「A及/或B」之短語中所用之術語「及/或」意欲包括「A及B」；「A或B」；「A(單獨)」；及「B(單獨)」。同樣，諸如「A、B及/或C」之短語中所用之術語「及/或」意欲涵蓋以下態樣中之各者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。
在整個本說明書中，詞語「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或包含「(comprising)」之變化形式應理解為意指包括所述整體或整體群，而不排除任何其他整體或整體群。如本文所用，術語「包含」亦涵蓋使用較窄術語「由……組成」及「基本上由……組成」。
術語「基本上由……組成」限於所指定材料或步驟及不會顯著影響本文所揭示之本發明之基本及新穎特徵之彼等者。
「胺基酸」包括天然胺基酸與經取代之胺基酸。「天然胺基酸」係指如肽領域中一般可接受之常出現之胺基酸中之任一者，且除非另外指定，否則表示L-胺基酸(除諸如甘胺酸之非對掌性胺基酸之外)，包括藉由基因密碼直接編碼之典型的20個胺基酸，以及硒半胱胺酸、硒甲硫胺酸及鳥胺酸。「經取代之胺基酸」係指含有一或多個通常不係胺基酸之一部分的額外化學部分之胺基酸。此類取代可藉由能夠與所選側鏈或末端殘基反應之靶向衍生劑且經由其他本領域中可接受之方法引入。舉例而言，半胱胺醯基殘基最常與α-鹵代乙酸酯(及相對應的胺) (諸如氯乙酸或氯乙醯胺)反應以產生羧甲基或羧醯胺基甲基衍生物。半胱胺醯基殘基亦可藉由與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、磷酸氯乙醯酯、N-烷基順丁烯二醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞基苯甲酸鹽、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑反應而衍生。在一些實施例中，羧基側基(天冬胺醯基或麩胺醯基)可藉由與諸如1-環己基-3-(2-嗎啉基-(4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳化二亞胺之碳化二亞胺反應而選擇性改質。在一些實施例中，天冬胺醯基及麩胺醯基殘基可藉由與銨離子反應而轉化為天冬醯胺醯基及麩醯胺醯基殘基。麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基可脫除醯胺基以形成對應的麩胺醯基及天冬胺醯基殘基。或者，殘基可在適度酸性條件下脫除醯胺基。其他修飾包括脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基之磷酸化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基之甲基化(參見例如T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, 第79-86頁)、N端胺之乙醯化及C端羧基之醯胺化。亦可併入封端基團及/或活化基團。
在本文中術語「肽」、「多肽」、「寡肽」及「蛋白質」可互換使用，係指任何長度之胺基酸鏈。鏈可為直鏈、分支鏈或環狀的，其可包含經修飾之胺基酸，及/或可間雜有非胺基酸。術語亦涵蓋以天然方式或藉由介入修飾之胺基酸鏈；例如二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或修飾，諸如與標記組分結合。定義內亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及此項技術中已知之其他修飾的多肽。應理解，多肽可作為單一鏈或相關鏈出現。
1.肽 在一些實施例中，結合物包含能夠活化免疫細胞之肽。在一些實施例中，肽能夠募集免疫細胞。在一些實施例中，肽能夠與IgG之Fc片段競爭以結合至Fc受體。在一些實施例中，肽係WO 2009/090268中所述之肽中之任一者，該文獻以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，肽之長度小於50、45、40、35、30、25、20、15或10個胺基酸。在一些實施例中，肽之長度小於25個胺基酸。在一些實施例中，肽之長度小於20個胺基酸。在一些實施例中，肽之長度在5-50、10-50、5-40、10-40、5-30、10-30、5-25、10-25、5-20、10-20或15-25個胺基酸之間。
術語包括含有肽之轉譯後修飾的肽，例如糖基化、乙醯化、磷酸化及硫酸化。另外，蛋白質片段、其類似物(包括並非由基因密碼編碼之胺基酸，例如高半胱胺酸、鳥胺酸、D-胺基酸及肌酸)、天然或人造突變體或變異體或組合、融合蛋白、衍生之殘基(例如胺基之烷基化、羧基之乙醯化或酯化)及其類似物包括於肽之含義內。關於肽之「修飾」意謂一或多種官能基中之修飾，例如胺基酸之任何部分、糖或其他碳水化合物之結構及/或位置、或生物分子之其他取代基，且可包括(但不限於)化學修飾(例如丁二醯化、醯化、二硫鍵之結構及/或位置)以及非共價結合(例如小分子，包括藥物之非共價結合)。
根據本發明之一實施例之肽在本文中可用於指限制性(亦即在兩個主鏈末端、兩個側鏈或末端中之一者與側鏈之間具有一些允許環化之元素，例如醯胺或二硫鍵)或非限制性(例如直鏈)的具有少於約50個胺基酸殘基，諸如少於約40、30、20或10個胺基酸殘基之胺基酸序列。此清單亦可包括例如寡聚物，諸如連接於一起之3、4或5個肽，或包含藉助於肽連接子連接於一起之2個肽的二聚體。在特定實施例中，肽在約10與約30個胺基酸殘基之間，且在更特定實施例中，係16至18個胺基酸殘基。然而，在閱讀本發明時，熟習此項技術者顯而易見的是，其不係所需的特定肽之長度但其仍能結合於Fc受體(例如FcγRI)且與IgG之結合競爭。舉例而言，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及25個胺基酸殘基之胺基酸序列意欲為本發明之上下文內之肽化合物。二聚肽可具有包含兩個藉由一種連接之肽胺基酸序列之胺基酸序列。連接子可包含具有少於約10個胺基酸殘基，諸如9、8、7、6、5、4或3個胺基酸殘基之胺基酸序列。連接子胺基酸殘基可具有單一胺基酸或不同胺基酸之組合。舉例而言，可使用甘胺酸(G)及絲胺酸(S)之組合。或者，連接子可包含僅甘胺酸、絲胺酸或離胺酸(K)之殘基。
能夠模擬Fc片段之生物活性(諸如效應子功能)的本發明肽可稱為『Fc模擬肽』。如藉由(但不限於)本發明所涵蓋之Fc片段之效應子功能包含吞噬作用、CDC及/或ADCC。在一些實施例中，生物活性肽結合至Fc受體，例如Fcγ受體。在一些實施例中，此類肽與IgG之Fc片段競爭以結合至Fc受體(例如Fcγ受體)，且因此結合至Fc受體(例如Fcγ受體)上與Fc片段相同或重疊的結合位點。以可包括二聚體及寡聚物之複合物形式(多聚體)存在下，Fc模擬肽可觸發效應子功能。以可溶性形式(單體)存在下，Fc模擬肽可抑制效應子功能。在一些實施例中，若抑制效應子功能所需之可溶性形式之IC50 濃度低於10-20 μM，則呈可溶形式之此等肽能夠活化效應子功能。
不能模擬IgG之Fc片段與Fcγ受體之效應子功能，亦即呈多聚體形式下不能觸發效應子功能及呈可溶性形式下不能抑制效應子功能的肽可稱為『Fc非模擬肽』。使用此術語，可定義肽之四個群組：i)第一群組包含與Fc片段競爭以結合至Fc受體(例如受體)且因此結合至Fc受體(例如Fcγ受體)上與Fc片段相同的結合位點之肽。然而，此類肽呈複合形式下不可活化效應子功能，但在呈可溶性形式時可活化效應子功能。在一些實施例中，若需要抑制效應子功能之可溶性形式之IC50 濃度高於10-20 μM，則此等肽可失去其觸發效應子功能之能力，且因此複合肽之親合力足夠低。ii)，第二群組包含與IgG之Fc片段競爭以結合至Fc受體(例如Fcγ受體)且因此結合至Fc受體(例如Fcγ受體)上與Fc片段相同的結合位點之肽。在一些實施例中，此肽當呈二聚時以及當呈複合形式，亦即呈可溶性環肽二聚體形式時可活化效應子功能。此類肽亦可稱為承諾促效劑。iii)第三群組包含不與IgG之Fc片段競爭以結合至Fc受體(例如Fcγ受體)之肽。然而，此等肽在呈複合形式時可活化Fc受體(例如Fcγ受體)(Berntzen等人, 2006)。iv)第四群組包含不與IgG之Fc片段競爭以結合至Fc受體(例如Fcγ受體)但能夠在不同於Fc結合位點之位點結合至Fc受體(例如Fcγ受體)之肽。此等肽呈複合或可溶性形式下不可活化或抑制效應子功能。此等肽可具有過高而不能活化效應子功能之親和力及親合力。
在一些實施例中，本文所揭示之肽中之任一者可包含天然與非天然產生之胺基酸序列。非天然產生意謂胺基酸序列不見於自然界中。在一些實施例中，非天然產生之胺基酸序列具有約10與30個之間的胺基酸殘基，或者約20個胺基酸殘基。此等肽胺基酸包括含有天然地以及非天然產生之胺基酸的肽、肽類似物、類肽及肽模擬物。在一特定態樣中，本發明之肽包含僅由天然產生之胺基酸組成之胺基酸殘基。
在兩個恆定域CH1與CH2之間亦包含鉸鏈區之免疫球蛋白重鏈之C端區可稱為『Fc片段』。C端區之此片段可為天然序列Fc片段或變異型Fc片段。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc片段之邊界可不同，但人類IgG重鏈Fc片段通常定義為由位置231處之胺基酸殘基伸展至其羧基端。在上鉸鏈及核心鉸鏈之情況下，『Fc片段』自位置216開始(根據Rabat (1987, 1991)之EU命名法)。免疫球蛋白之Fc片段一般包含兩個恆定域：CH2及CH3。人類IgG Fc片段之CH2域通常由約胺基酸231延伸至約胺基酸340。人類IgG Fc片段之CH3域通常由人類IgG之約胺基酸341延伸至約胺基酸殘基447 (亦即包含CH2域C端之殘基)。在本發明之一些實施例中，變異型IgG Fc片段可選自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在特定實施例中，IgG Fc片段具有IgG1。在一些實施例中，在替代方案中，IgG1 Fc可書寫為Fcγ1。『鉸鏈片段』一般定義為自人類IgG1之Glu 216伸展至Pro 230，或IgG2、IgG3或IgG4中之等效位置(Burton, 1985)。功能Fc片段具有天然序列Fc片段之效應子功能，例如：C1q結合、CDC、Fc受體結合、吞噬作用、助噬粒子之胞吞作用、抗原呈遞、炎性介體(例如IL-6、TNFα、IL-1)之釋放、細胞協作、超氧叢發、ADCC、細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調等。如藉由(但不限於)本發明所涵蓋之Fc片段之效應子功能包含吞噬作用、CDC及/或ADCC。
如此項技術中所一般已知，Fcγ受體(FcγR)係結合IgG抗體且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體(包括此等受體之對偶基因變異體及交替剪接形式)的受體。FcγRII受體包括FcγRIIa (活化受體)及FcγRIIb (抑制受體)，兩者具有主要在其細胞質結構域方面不同的類似胺基酸序列。Fc受體在Ravetch及Kinet (1991, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92)；Capel等人, (1994, Immunomethods 4: 25-34)；及de Haas等人, (1995, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41)中進行綜述。
根據本發明之一實施例之肽可獲自能夠結合至諸如FcγRI之Fcγ受體之肽文庫。文庫可呈現於粒子或分子複合物上，例如可複製基因封裝，諸如酵母、細菌性或噬菌體(例如T7)粒子、病毒、細胞或共價、核糖體、微珠粒或其他活體外呈現系統，各粒子或分子複合物含有編碼肽之核酸。噬菌體呈現描述於WO92/01047及例如美國專利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160及US6521404中，其各自以全文引用的方式併入本文中。
在選擇能夠結合FcγRI受體且呈現於噬菌體或其他文庫粒子或分子複合物上之本發明之肽之後，核酸可獲自噬菌體或呈現該所選肽之其他粒子或分子複合物。此類核酸可藉由自核酸序列獲自噬菌體或呈現該肽之其他粒子或分子複合物之核酸表現而用於後續肽產生中。
在一些實施例中，呈可溶性形式之本發明之肽可結合至FcγRI，而不引發效應子響應。在一些實施例中，為活化受體，必須發生受體成簇。
在一些實施例中，可進一步測試結合FcγRI之能力，亦與例如IgG之Fc片段競爭以結合至FcγRI能力。在一些實施例中，根據本發明之肽可以功能Fc片段之親和力或以如藉由例如BIACORE所量測更佳或更低之親和力結合FcγRI。
可在適當條件下比較不同肽之結合親和力。
在本發明肽之胺基酸序列內進行取代所需之技術可用於此項技術中。變異型序列可由可預計或可能無法預計對效應子功能具有極小或有益作用之取代製得，且測試結合Fc受體之能力及/或任何其他所需特性。
在一些實施例中，肽包含與SEQ ID NO: 1-21中之任一者之序列具有至少60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列同源性之序列，或其功能片段。在一些實施例中，肽包含與SEQ ID NO: 1-21中之任一者之序列具有至少60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之序列，或其功能片段。在本文所揭示之肽中之任一者之情況下，「其功能片段」定義為能夠結合至及/或活化Fc受體(例如hFcγRI)。
在一些實施例中，肽包含胺基酸序列TX2CXXςPXLLGCφXE (SEQ ID NO: 1)；其中X係任何胺基酸，ς係疏水性殘基且φ係酸性胺基酸。在一些實施例中，肽特異性結合至hFcγRI且不展現與hFcγRII或hFcγRIII之交叉反應性。在一些實施例中，肽包含胺基酸序列AQVNSCLLLPNLLGC (SEQ ID NO: 2)。在一些實施例中，肽包含胺基酸序列AQVNSCLLLPNLLGCGDDK (SEQ ID NO: 3)。在一些實施例中，肽包含以下任一胺基酸序列： TDTCLMLPLLLGCDEE  (SEQ ID NO: 4) DPICWYFPRLLGCTTL  (SEQ ID NO: 5) WYPCYIYPRLLGCDGD  (SEQ ID NO: 6) GNICMLIPGLLGCSYE  (SEQ ID NO: 7) VNSCLLLPNLLGCGDD  (SEQ ID NO: 8) TPVCILLPSLLGCDTQ  (SEQ ID NO: 9) TVLCSLWPELLGCPPE  (SEQ ID NO: 10) TFSCLMWPWLLGCESL  (SEQ ID NO: 11) FGTCYTWPWLLGCEGF  (SEQ ID NO: 12) SLFCRLLLTPVGCVSQ  (SEQ ID NO: 13) HLLVLPRGLLGCTTLA  (SEQ ID NO: 14) TSLCSMFPDLLGCFNL  (SEQ ID NO: 15) SHPCGRLPMLLGCAES  (SEQ ID NO: 16) TSTCSMVPGPLGAVSTW  (SEQ ID NO: 17) KDPCTRWAMLLGCDGE  (SEQ ID NO: 18) IMTCSVYPFLLGCVDK  (SEQ ID NO: 19) IHSCAHVMRLLGCWSR  (SEQ ID NO: 20) AQVNSCLLLPNLLGCSYEKKKKKEYSCGLLNPLLLCNVQA  (SEQ ID NO: 21)
在一些實施例中，肽中之胺基酸中之一或多者經修飾以降低蛋白水解。在一些實施例中，將肽中之胺基酸殘基中之一或多者甲基化。在一些實施例中，將肽中之天冬醯胺胺基酸殘基中之一或多者(若肽包含一或多個天冬醯胺胺基酸殘基)甲基化。在一些實施例中，將肽中之白胺酸胺基酸殘基中之一或多者(若肽包含一或多個白胺酸胺基酸殘基)甲基化。在一些實施例中，將與SEQ ID NO: 2或3之位置11對應之胺基酸位置處之天冬醯胺殘基甲基化。在一些實施例中，將與SEQ ID NO: 2或3之位置13對應之胺基酸位置處之白胺酸殘基甲基化。
蛋白質之直系同源物之特徵通常為具有使用設定為預設參數之ALIGN經與特定蛋白質之胺基酸序列之全長比對計數為大於75%之序列一致性。當藉由此方法評定時，與參考序列甚至更相似之蛋白質將展示逐漸增加之一致性百分比，諸如至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%或至少98%之序列一致性。另外，可在所揭示之肽之特定域之全長上比較序列一致性。當明顯小於完整序列的序列進行序列一致性比較時，同源序列通常將在10-20個胺基酸之短窗口上具有至少80%之序列一致性，且視其與參考序列之相似性而定可具有至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%之序列一致性。此短窗口上之序列一致性可使用LFASTA測定；方法描述於NCSA網站。
與SEQ ID NO: 1-21中之任一者相比，特定變異體可包括一或多個胺基酸序列變化(胺基酸殘基之添加、缺失、取代及/或插入)。在一些實施例中，與SEQ ID NO: 1-21中之任一者相比，肽具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸變化。在一些實施例中，與SEQ ID NO: 1-21中之任一者相比具有1或多個胺基酸變化之肽仍能夠結合至Fc受體(例如Fc受體，諸如FcγRI)。
在一些實施例中，與SEQ ID NO: 1-21中之任一者相比，肽具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個保守胺基酸取代。「保守性胺基酸取代」係胺基酸殘基經側鏈(R基)之化學性質(例如電荷或疏水性)類似之另一胺基酸殘基取代的胺基酸取代。一般而言，保守胺基酸取代實質上不改變肽之功能特性(例如肽結合至諸如FcγRI之Fc受體之能力)。在其中兩個或更多個胺基酸序列彼此間差異為保守性取代之情況下，可上調序列一致性或相似度百分比以根據保守取代性質加以校正。進行此調節之手段為熟習此項技術者所熟知。參見例如Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331。含有具有類似化學特性之側鏈的胺基酸之群的實例包含(1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；(2)脂族-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；(3)含有醯胺之側鏈：天冬醯胺及麩醯胺酸；(4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；(5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；(6)酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸，及(7)含硫側鏈係半胱胺酸及甲硫胺酸。在特定實施例中，保守胺基酸取代基團係：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸酯及天冬醯胺-麩醯胺酸。或者，保守置換係在公開於Gonnet等人 (1992) Science 256: 1443-1445中之PAM250對數似然性矩陣中具有正值的任何變化。「適度保守」置換係在PAM250對數似然矩陣中具有非負值之任何變化。
在一些實施例中，本文所揭示之肽序列中之任一者中之一或多個胺基酸殘基經非天然產生或非標準胺基酸置換，將一或多個胺基酸殘基修飾成非天然產生或非標準形式，或將一或多個非天然產生或非標準胺基酸插入至序列中。本發明之序列中之變化數及位置之實例描述於本文其他地方中。天然產生之胺基酸包括20種藉由其標準單字母代碼標識為G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E之「標準」L-胺基酸。在一些實施例中，本文所揭示之肽中之任一者包含一或多個非天然產生之胺基酸。非標準胺基酸包括可併入至肽主鏈中之任何其他殘基或由現有胺基酸殘基之修飾產生。非標準胺基酸可為天然產生或非天然產生的。若干天然產生非標準胺基酸在此項技術中已知，諸如4-羥脯胺酸、5-羥基離胺酸、3-甲基組胺酸、N-乙醯基絲胺酸等(Voet及Voet, Biochemistry, 第2版, (Wiley) 1995)。在其N-α位置衍生之彼等胺基酸殘基僅位於胺基酸序列之N端。通常在本發明中，胺基酸係L-胺基酸，但其可為D-胺基酸。改變因此可包含將L-胺基酸修飾成D-胺基酸或經D-胺基酸置換。胺基酸之甲基化、乙醯化及/或磷酸化形式亦已知，且本發明中之胺基酸可經受此類修飾。
本發明之抗體域及肽中之胺基酸序列可包含上文所述之非天然或非標準胺基酸。非標準胺基酸(例如D-胺基酸)可在合成期間併入至胺基酸序列中，或在胺基酸序列合成之後藉由「原始」標準胺基酸之修飾或置換。
在一些實施例中，非標準及/或非天然產生之胺基酸之使用增加結構及功能多樣性，且因此可增加在本發明之肽中獲得所需特性之可能性。另外，與標準L-胺基酸相比，D-胺基酸及類似物已展示具有較佳藥物動力學概況，此係由於具有L-胺基酸之肽在向例如人類之動物投與後的活體內降解。
在一些實施例中，肽中之至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%之胺基酸係D-胺基酸。在特定實施例中，肽中之所有胺基酸係D-胺基酸。在一些實施例中，本發明提供一種肽，其包含呈本文所揭示之胺基酸序列中之任一者之反向次序或呈能夠結合至Fc受體(例如FcγRI)之抗體之胺基酸序列部分之反向次序的胺基酸序列。在一些實施例中，本發明提供一種「逆反相」肽，其中肽中之所有胺基酸係D-胺基酸且包含呈本文所揭示之胺基酸序列中之任一者之反向次序或呈能夠結合至Fc受體(例如FcγRI)之抗體之胺基酸序列部分之反向次序的胺基酸序列。「逆反相」肽可為需要的，因為其將不大可能藉由已投與肽或包含肽之結合物之個體中存在之蛋白酶分解。本發明之肽可經進一步修飾或衍生以含有此項技術中已知且可易於獲得之額外非蛋白部分。此類衍生物可改良化合物之溶解性、吸收及/或生物半衰期。或者部分可消除或減少化合物之任何不合需要的副作用。
例示性衍生物包括如下化合物，其中：化合物係交聯的或使得能夠在分子間交聯。舉例而言，肽部分可經修飾以含有一個Cys殘基且由此能夠與類似分子形成分子間二硫鍵。相同的化合物亦可經由其C端交聯。
在一些實施例中，N端可經醯化或修飾成為經取代之胺。例示性N端衍生基團包括-NRR1 (而非-NH2)、-NRC(O)R1、-NRC(O)OR1、-NRS(O)2R1、-NHC(O)NHR1、丁二醯亞胺或苯甲氧基羰基-NH-(CBZ-NH-)，其中R及Rl各自獨立地係氫或低碳數烷基,且其中苯環可經1至3個選自由以下組成之群的取代基取代:C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氯及溴。
在一些實施例中，可將C端酯化或醯胺化。舉例而言，此項技術中所描述之方法可用以將(NH-CH2 -CH2 -NH2 )2 添加至於本發明之肽中。同樣地，此項技術中所描述之方法可用以將-NH2 添加至本發明之肽中。例示性C端衍生基團包括例如-C(O)R2，其中R2係低碳烷氧基或-NR3R4，其中R3及R4獨立地係氫或C1-C8烷基(例如C1-C4烷基)。
在一些實施例中，二硫鍵可經另一更穩定交聯部分(例如伸烷基)置換。參見例如：Bhatnagar等人 (1996), J. Med. Chem. 39: 3814 9；Alberts等人 (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp., 357-9。
在一些實施例中，可修飾一或多個個別胺基酸殘基。已知多種衍生劑與所選側鏈或末端殘基特定反應，如下文所詳述：
在一些實施例中，離胺醯基殘基及胺基端殘基可與丁二酸或其他羧酸酐反應，由此逆轉離胺醯基殘基之電荷。其他適用於衍生含有α-胺基之殘基的試劑包括醯亞胺酯，諸如吡啶甲醯亞胺酸甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氫化物；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2,4-戊二酮；及轉胺酶催化之與乙醛酸酯之反應。
在一些實施例中，精胺醯基殘基可藉由與若干習知試劑中之任一者或組合(包括苯基乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮及茚滿三酮(ninhydrin))反應而進行修飾。由於胍官能基具有高pKa，因此精胺醯基殘基之衍生化需要反應在鹼性條件下進行。此外，此等試劑可與離胺酸之基團以及精胺酸ε-胺基反應。
已充分研究對酪胺醯基殘基之特定修飾，其中尤其關注藉由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應而將光譜標記引入酪胺醯基殘基中。N-乙醯基咪唑；及四硝基甲烷可分別用於形成O-乙醯基酪胺醯基物種及3-硝基衍生物。
在一些實施例中，羧基側鏈基團(天冬胺醯基或麩胺醯基)可藉由與諸如1-環己基-3-(2-嗎啉基-(4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳化二亞胺之碳化二亞胺反應而選擇性修飾。此外，天冬胺醯基及麩胺醯基殘基可藉由與銨離子反應而轉化為天冬醯胺醯基及麩醯胺醯基殘基。
在一些實施例中，麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基可脫除醯胺基以形成對應的麩胺醯基及天冬胺醯基殘基。或者，此等殘基在適度酸性條件下脫除醯胺基。此等殘基之任一形式均屬於本發明範疇內。半胱胺醯基殘基可經胺基酸殘基或其他部分置換以消除二硫鍵鍵結或相反使交聯穩定。參見例如Bhatnagar等人 (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9。
用雙官能劑衍生化適用於使本發明之肽或其功能衍生物交聯至水不溶性支撐基質或其他大分子媒劑。常用交聯劑包括例如1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基丁二醯亞胺酯(例如與4-疊氮柳酸之酯)、同型雙官能醯亞胺酯(包括二丁二醯亞胺基酯，諸如3,3'-二硫代雙(丁二醯亞胺基丙酸酯)及雙官能順丁烯二醯亞胺(諸如雙-N-順丁烯二醯亞胺基-1,8-辛烷)。諸如3-[(對疊氮苯基)二硫基]丙醯亞胺甲酯之衍生劑產生能夠在光存在下形成交聯之可光活化中間物。或者，美國專利：US3,969,287；US3,691,016；US4,195,128；US4,247,642；US4,229,537；及US4,330,440中所述之反應性水不溶性基質(諸如溴化氰活化之碳水化合物)及反應性基質用於蛋白質固定。
在一些實施例中，碳水化合物(寡醣)基團宜可連接至已知係蛋白質中之糖基化位點之位點。在一些實施例中，當O-連接之寡醣及N-連接之寡醣係序列Asn-X-Ser/Thr之一部分時，使O-連接之寡醣連接至絲胺酸(Ser)或蘇胺酸(Thr)殘基，而使N-連接之寡醣連接至天冬醯胺(Asn)殘基，其中X可為除脯胺酸外之任何胺基酸。在一些實施例中，X係19種天然產生之胺基酸中之一者，並非脯胺酸。N-連接及O-連接之寡醣及各類型中發現之糖殘基之結構可不同。兩者上常見之一種類型之糖係N-乙醯基神經胺糖酸(稱為唾液酸)。唾液酸通常係N-連接與O-連接之寡醣之末端殘基，且藉助於其負電荷，可賦予經糖基化化合物酸性特性。
此類位點可併入預期用於本發明之肽的連接子中，且在一些實施例中，在肽化合物重組產生期間藉由細胞糖基化(例如在諸如CHO、BHK、COS之哺乳動物細胞中)。然而，此類位點可進一步藉由此項技術中已知之合成或半合成程序糖基化。
其他可能的修飾包括脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲胺醯基之羥基或羥丁胺醯基殘基之磷酸化、Cys中之硫原子之氧化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基之甲基化。Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San I Francisco), 第79-86頁 (1983)。
在特定實施例中，適用於肽衍生化之部分係水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如丙三醇)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而可在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分支鏈或非分支鏈的。聚合物可以美國專利：US4640835、US4496689、US4301144、US4670417、US4791192或US4179337中所闡述之方式連接至肽。WO 93/00109亦描述使肽中之胺基酸殘基連接至PEG分子之方法。連接至肽之聚合物數目可不同，且若連接超過一個聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物之數目及/或類型可基於例如包括(但不限於)待改良肽之特定特性或功能或其是否將用於指定條件下之療法之考慮因素來確定。
在一替代實施例中，本發明之肽可經進一步修飾以含有血清載體蛋白以延長活體內半衰期。血清載體蛋白可為天然產生之血清載體蛋白或其片段。特定實例包括甲狀腺素-結合蛋白、甲狀腺素運載蛋白、α1-酸糖蛋白、轉鐵蛋白、血纖維蛋白原，且尤其白蛋白，以及其片段。在一些實施例中，載體蛋白具有人類來源。必要時，各者可具有一或多個相對於天然產生之序列額外或不同的胺基酸，其限制條件為所得序列之半衰期功能等效。片段包括保持成熟序列之載劑功能的母體蛋白質之任何較小部分。肽及載體蛋白組分可直接或間接共價連接。間接共價鍵聯欲意謂肽中之胺基酸經由插入化學序列(例如橋聯基團)連接至載體蛋白中之胺基酸。特定橋聯基團包括例如脂族基團，包括肽。直接共價鍵聯欲意謂肽中之胺基酸在無插入橋聯基團下直接連接至載體蛋白中之胺基酸。例如當在各者中一種組分中之半胱胺酸殘基經由硫醇基連接至另一組分中之半胱胺酸殘基時，且當一種組分之C端酸官能基連接至另一者之N端胺時，特定實例包括二硫化物[--S--S--]及醯胺[--CONH--]鍵聯。
除本文所述之靶向部分中之任一者以外，本文所揭示之肽中之任一者亦可用可偵測或功能標記物標記。因此，肽可以肽結合物之形式存在以便獲得可偵測及/或可定量信號。肽結合物可包含與可偵測或功能標記物結合之本發明之肽。標記物可為產生或可誘發以產生信號之任何分子，包括(但不限於)螢光劑、放射性標記、酶類、化學發光劑或光敏劑。因此，結合可藉由偵測螢光或發光、放射性、酶活性或光吸收來偵測及/或量測。
適合的標記以說明而非限制之方式包括， -   酶類，諸如鹼性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸去氫酶(「G6PDH」)、α-D半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖澱粉酶、碳酸酐酶、乙醯膽鹼酯酶、溶菌酶、蘋果酸去氫酶及過氧化酶，例如辣根過氧化酶； -   螢光標記物/顏料/染色劑； o 螢光標記或螢光劑，諸如螢光素及其衍生物、螢光染料、若丹明化合物及衍生物、GFP (用於「綠色螢光蛋白」之GFP)、丹醯基、傘酮、藻紅素、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二甲醛及胺螢；螢光團，諸如鑭系穴狀化合物及螯合物，例如銪等(Perkin Elmer及Cis Biointernational)、-靜默變化標記物或化學發光劑，諸如異魯米諾(isoluminol)、魯米諾(luminol)及二氧雜環丁烷； -   生物發光標記，諸如螢光素酶及螢光素； -   敏化劑；-輔酶； -   酶基質； -   放射性標記物，包括(但不限於)溴W、碳14、鈷57、氟δ、鎵67、鎵68、氫3 (氚)、銦111、銦113m、碘123m、碘125、碘126、碘131、碘133、汞107、汞203、磷32、錸99m、錸101、錸105、釕95、釕97、釕103、釕105、鈧47、硒75、硫35、鎝99、鎝99m、碲121m、碲122m、碲125m、銩165、銩167、銩168、釔199及本文中所提及之其他放射性標記物； -   粒子，諸如乳膠或碳粒子；金屬溶膠；微晶；脂質體；細胞等，其可用染料、催化劑或其他可偵測基團進一步標記；-分子，諸如生物素、洋地黃毒苷或5-溴去氧尿苷； -   毒素部分，諸如選自以下之群的毒素部分：綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin，PE或其細胞毒性片段或突變體)、白喉毒素(Diptheria toxin)或其細胞毒性片段或突變體、肉毒桿菌毒素(botulinum toxin) A、B、C、D、E或F、蓖麻毒素(ricin)或其細胞毒性片段(例如蓖麻毒素A)、相思子毒素(abrin)或其細胞毒性片段、沙泊寧(saporin)或其細胞毒性片段、美洲商陸抗病毒毒素(pokeweed antiviral toxin)或其細胞毒性片段及欖香膠素1或其細胞毒性片段。
適合的酶類及輔酶揭示於Litman等人, US4275149及Boguslaski等人, US4318980中，其各自以全文引用的方式併入本文中。適合的螢光劑及化學發光劑揭示於Litman等人, US 4,275,149中，其各自以全文引用的方式併入本文中。標記物進一步包括化學部分，諸如生物素，其可經由結合至特異性同源可偵測部分(例如經標記之抗生素蛋白或抗生蛋白鏈菌素)來偵測。可偵測標記可使用此項技術中已知之習知化學方式或藉由基因融合連接至本發明之肽。
在一些實施例中，本發明提供一種作為能夠結合至Fc受體(例如FcγRI)之抗體片段的肽。已展示完全抗體之片段可執行結合抗原之功能。結合片段之實例係(i)Fab片段，其由VL、VH、CL及CH1域組成；(ii)Fd片段，其由VH及CH1域組成；(iii)Fv片段，其由單一抗體之VL及VH域組成；(iv)dAb片段(Ward等人 1989，McCafferty等人 1990，Holt等人 2003)，其由VH或VL域組成；(v)分離之CDR區；(vi)F(ab')2片段，一種包含兩個連接之Fab片段的二價片段，(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH域及VL域藉由肽連接子連接，該肽連接子使兩個域結合以形成抗原結合位點(Bird等人 1988，Huston等人 1988)；(viii)雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09965)及(ix)「雙功能抗體」，藉由基因融合構築之多價或多特異性片段(WO94/13804；Hollinger等人 1993)。可藉由併入連接VH及VL域之二硫橋鍵來使Fv、scFv或雙功能抗體分子穩定(Reiter等人, 1996)。亦可製得包含接合於CH3域之scFv之微型抗體(Hu等人 1996)。結合片段之其他實例係：Fab'，其藉由在重鏈CH1域之羧基端處添加若干殘基而不同於Fab片段，包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸；及Fab'-SH，其係其中恆定域之半胱胺酸殘基攜帶游離巰基的Fab'片段。包含抗體抗原結合位點之抗體片段包括(但不限於)諸如Fab、Fab'、Fab'-SH、scFv、Fv、dAb及Fd之分子。包括一或多個抗體抗原結合位點之多種其他抗體分子已進行工程改造，包括例如Fab2、Fab3、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及微型抗體。抗體分子及其構築之方法及用途描述於Hollinger及Hudson (2005)中。
2.靶向部分 在一些實施例中，使本文揭示之肽中之任一者與一或多個靶向部分結合。
在一些實施例中，靶向部分靶向蛋白質聚集體。在一些實施例中，蛋白質聚集體包含以下蛋白質中之任一者之聚集體：α-突觸核蛋白、滔蛋白、澱粉樣蛋白β、TDP-43、SOD1、FUS、TDP-43、朊病毒蛋白質、免疫球蛋白輕鏈、甲狀腺素運載蛋白、血纖維蛋白原、膠原蛋白、胰島澱粉樣多肽、溶菌酶、降鈣素、血清澱粉樣A蛋白質、LECT2、澱粉素、膠溶素、血纖維蛋白原A、促乳素、角膜上皮蛋白及β2 -微珠蛋白。
在一些實施例中，靶向部分靶向脂質聚集體。在一些實施例中，脂質聚集體係膽固醇聚集體。
在一些實施例中，靶向部分靶向多醣聚集體。在一些實施例中，靶向部分靶向肝醣聚集體。
在一些實施例中，靶向部分係肽。在一些實施例中，靶向部分係核酸。在一些實施例中，靶向部分係脂質。在一些實施例中，靶向部分係多醣。在特定實施例中，靶向部分係染料或其衍生物。
在一些實施例中，靶向部分係小分子。在一些實施例中，靶向部分之大小小於1000 g/mol、小於900 g/mol、小於800 g/mol、小於700 g/mol、小於800 g/mol、小於700 g/mol、小於600 g/mol、小於500 g/mol、小於400 g/mol、小於300 g/mol、小於200 g/mol或小於100 g/mol。在特定實施例中，靶向部分之大小小於500 g/mol。在特定實施例中，靶向部分之大小小於400 g/mol。
在特定實施例中，靶向部分係染料或其衍生物。如本文所用，「染料」定義為係或衍生自用以向蛋白質、多醣、脂質、金屬及/或核苷酸中添加顏色或改變其顏色之天然或合成物質的化合物。在一些實施例中，染料可用以染色細胞或其組分。熟習此項技術者將理解何物分類為染料/染色劑。在一些實施例中，染料係能夠結合至蛋白質、多醣、脂質、金屬及/或核苷酸以有助於觀測蛋白質、多醣、脂質、金屬及/或核苷酸之化合物。在較佳實施例中，染料結合至聚集體或聚集體中所存在之組分。在一些實施例中，染料結合至聚集體中之蛋白質、多醣、脂質、金屬及/或核苷酸。在一些實施例中，靶向部分係染料之衍生物，該衍生物與導出衍生物之染料相比仍保持結合至特異性標靶(例如蛋白質、肽、多醣、核苷酸、脂質或其聚集體)之能力但缺乏或具有改變之染色能力。
在一些實施例中，染料結合至澱粉樣蛋白。在一些實施例中，染料係選自由以下組成之群：硫代黃素、五聚體甲醯基噻吩乙酸(pFTAA)、七聚體甲醯基噻吩乙酸(hFTAA)、剛果紅、結晶紫、1-胺基-8-萘磺酸(ANS)、4-(二氰基乙烯基)-久洛利定(DCVJ)、胺基苯并蒽酮、甲氧基XO4、噻嗪紅、匹茲堡B、ProteoStat® 及其澱粉樣蛋白結合衍生物。在一些實施例中，硫代黃素係硫代黃素T或其澱粉樣蛋白結合衍生物。在一些實施例中，硫代黃素T之澱粉樣蛋白結合衍生物包含下式化合物I：
Figure 02_image017
。在一些實施例中，澱粉樣蛋白包含以下蛋白質中之任何一或多者：α-突觸核蛋白、滔蛋白、澱粉樣蛋白β、TDP-43、SOD1、FUS、C79ORF、TDP-43、朊病毒蛋白質、免疫球蛋白輕鏈、甲狀腺素運載蛋白、血纖維蛋白原、膠原蛋白、胰島澱粉樣多肽、溶菌酶、降鈣素、血清澱粉樣A蛋白質、LECT2、澱粉素、膠溶素、血纖維蛋白原A、促乳素、角膜上皮蛋白及β2 -微珠蛋白、或其片段或衍生物。在一些實施例中，澱粉樣蛋白包含溶菌酶。
在一些實施例中，染料結合至膽固醇。在一些實施例中，染料係非律平或其膽固醇結合衍生物。
在一些實施例中，染料結合至膠原蛋白。在一些實施例中，染料係天狼星紅(sirius red)、Col-F、俄勒岡綠488、天狼猩紅(Picrosirius red)、亮綠SF淡黃、堅牢綠FCF、甲基藍、水藍、苯胺藍及其膠原蛋白結合衍生物。
在一些實施例中，染料結合多醣聚集體。在一些實施例中，染料結合肝醣聚集體。在一些實施例中，染料係選自由以下組成之群：胭脂紅、過碘酸、艾爾遜藍及二甲基亞甲基藍。
在一些實施例中，染料結合核苷酸聚集體。在一些實施例中，染料結合至RNA聚集體。在一些實施例中，染料結合DNA聚集體。在一些實施例中，染料結合至具有擴增之CUG、CAG、CCUG、CCG或CGG重複序列之聚核苷酸。
在一些實施例中，靶向部分已經修飾以有助於與肽結合。在一些實施例中，靶向部分已經修飾以使其包括羧基。在一些實施例中，靶向部分之羧基結合至肽之胺基端。在一些實施例中，靶向部分已經修飾以使其包括胺基。在一些實施例中，靶向部分之胺基結合至肽之羧基端。在一些實施例中，靶向部分藉助於連接子與肽結合。在一些實施例中，連接子係選自由以下組成之群：不可裂解連接子、腙連接子、硫醚連接子、二硫鍵連接子、肽連接子及β-葡萄糖苷酸連接子。在某些此類實施例中，連接子係剛性的。
3.結合物 在一些實施例中，使本文揭示之肽中之任一者融合至本文所揭示之靶向部分中之任一者以產生本文所揭示之結合物中之任一者。
在一些實施例中，本文所揭示之靶向部分中之任一者(例如本文所揭示之染料中之任一者)與本文所揭示之肽中之任一者直接結合(例如在連接子不存在下)。在一些實施例中，本文所揭示之靶向部分中之任一者(例如本文所揭示之染料中之任一者)藉助於連接子或鍵聯部分與本文所揭示之肽中之任一者結合。在一些實施例中，本文所揭示之靶向部分中之任一者(例如本文所揭示之染料中之任一者)藉由鍵聯共價連接至肽。在一些實施例中，連接子係剛性的。在替代實施例中，連接子係可撓性的。在較佳實施例中，連接子不應(i)抑制及/或不利地影響靶向部分(例如染料)之聚集體靶向特性，或(ii)抑制及/或不利地影響肽與IgG之Fc片段競爭以結合至Fc受體之能力。
在一些實施例中，靶向部分在用於靶向部分(例如染料)與肽之共價連接之取代基位置中之一者包括反應性連接基團，「連接部分」。能夠形成共價鍵之連接部分通常係能夠與諸如醇、醇鹽、胺、羥胺及硫醇之親核性分子反應之親電子官能基。親電子連接部分之實例包括丁二醯亞胺基酯、異硫氰酸酯、磺醯氯、磺酸酯、矽烷基鹵、2,6-二氯三嗪基、五氟苯基酯、胺基磷酸酯、順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺、鹵乙醯基、環氧化物、烷基鹵、烯丙基鹵、醛、酮、醯基疊氮及酸酐。在一些實施例中，連接部分係靶向部分(例如染料)上之羧基取代基之N-羥基丁二醯亞胺基酯(NHS)。
在一些實施例中，連接部分係胺基磷酸酯試劑，本文所揭示之染料中之任一者。其他活化及偶合劑包括包括TBTU (2-(1H-苯并疊氮基-1-基)-1-1,3,3-四甲基
Figure 108114951-A0101-12-0011
六氟磷酸鹽)、TFFH(N,N′,N″,N′″-四甲基
Figure 108114951-A0101-12-0011
2-氟-六氟磷酸鹽)、PyBOP (苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯啶基-鏻六氟磷酸鹽，EEDQ (2-乙氧基-1-乙氧羰基-1,2-二氫-喹啉)、DCC (二環己基碳化二亞胺)；DIPCDI (二異丙基碳化二亞胺)、MSNT (1-(均三甲苯-2-磺醯基)-3-硝基-1H-1,2,4-三唑及芳基磺醯基鹵，例如三異丙基苯磺醯基氯。
在一些實施例中，連接子包含原子，諸如氧或硫；單元，諸如-NH-、-CH2 -、-C(O)-、-C(O)NH-或烴基。術語「烴基」係指可完全飽和或具有一或多個不飽和單元之視情況經取代之直鏈或環狀、直鏈或分支鏈碳鏈。在某些實施例中，烴基包含一或多個不飽和單元。在一些實施例中，連接子包含視情況經取代之飽和或不飽和C1-30 烴基。在一些實施例中，連接子包含視情況經取代之飽和或不飽和C1-25 烴基。在一些實施例中，連接子包含視情況經取代之飽和或不飽和C1-20 烴基。在一些實施例中，連接子包含視情況經取代之飽和或不飽和C1-15 烴基。在一些實施例中，連接子包含視情況經取代之飽和或不飽和C1-10 烴基。在一些實施例中，連接子包含視情況經取代之飽和或不飽和C1-8 烴基。在一些實施例中，連接子包含視情況經取代之飽和或不飽和C1-6 烴基。在一些實施例中，連接子包含視情況經取代之飽和或不飽和C1-4 烴基。在一些實施例中，連接子包含視情況經取代之飽和或不飽和C1-2 烴基。在任一前述之一些實施例中，鏈之一或多個飽和碳視情況經以下置換：-C(O)-、-C(O)C(O)-、-CONH-、-CONHNH-、-CO2 -、-OC(O)-、-NHCO2 -、-O-、-NHCONH-、-OC(O)NH-、-NHNH-、-NHCO-、-S-、-SO-、-SO2 -、-NH-、-SO2 NH-或-NHSO2 -。在前述之某些實施例中，連接子係剛性的。
在一些實施例中，本文所揭示之靶向部分中之任一者(例如本文所揭示之染料中之任一者)藉助於包含化合物II結構之連接子共價連接至本文所揭示之肽中之任一者。
Figure 02_image019
， (化合物II) 其中n係1-30，且其中m係0、1、2、3、4或5。在一些實施例中，n係1-25、1-20、1-15、1-10、1-8、1-6、1-4、1-2或1。在一些實施例中，n係2。在一些實施例中，m係0。
在一些實施例中，連接子係β-Ala連接子、短聚乙二醇(PEG)連接子或長PEG連接子。在特定實施例中，連接子係β-丙胺酸連接子。在一些實施例中，PEG連接子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個PEG單元。在特定實施例中，連接子係β-丙胺酸；9-胺基-4,7-二氧雜壬酸或6-胺基-4-氧雜己酸。在一些實施例中，連接子係FMOC衍生之連接子。
在一些實施例中，結合物包含化合物III之結構：
Figure 02_image021
， 其中R1 係生物素或氫； 其中R2 包含： a)化合物IV (
Figure 02_image023
)； b)化合物V (
Figure 02_image025
)； c)化合物VI (
Figure 02_image027
)；或 d)化合物VII (
Figure 02_image029
)。在一些實施例中，R1 係生物素。在一些實施例中，R1 係氫。在特定實施例中，R2 包含化合物V (
Figure 02_image031
)。
肽可在包括胺基酸側鏈、胺基端及羧基端之位點與靶向部分(例如染料)結合。肽可經官能化以在此等位點中之任一者攜帶反應性胺基、巰基、硫醚基、二硫鍵、羥基及羧基。
本文所揭示之結合物中之任一者可藉由熟習此項技術者已知之方法製備。包含胺基酸及胺基酸類似物之肽可藉由與本文所揭示之染料中之任一者結合而與靶向部分共價融合。在一些實施例中，該染料攜帶與肽上之親核基團(例如胺基端)或胺基酸之側鏈親核體反應之親電子連接部分。或者，染料可呈親核性形式，例如胺基-或巰基-連接部分，其與肽上之親電子基團(例如胺基酸之羧基末端或羧基側鏈之NHS)反應。在一些實施例中，在結合反應期間，染料可位於固體支撐物，亦即合成樹脂上。或者，肽可在與染料結合之前已發生分解。在某些實施例中，某些胺基酸側鏈可與本文所揭示之染料中之任一者之活化形式結合。天冬胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、半胱胺酸、組胺酸及酪胺酸具有用於結合之反應性官能基。藉由適當選擇保護基，肽上之某些反應性官能基可選擇性解掩蔽以與靶向部分(例如染料)反應。
在一些實施例中，肽可直接或藉由間隔基團或鍵聯基團之中間物(諸如聚醛、類似戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)、二伸乙基-三胺五乙酸(DPTA))或在偶合劑存在下與酶類或螢光標記偶合。含有螢光素型之標記物之結合物可藉由與異硫氰酸酯反應來製備。
在一些實施例中，熟習現有用於使放射性同位素與肽直接或經由諸如上文所提及之EDTA、DTPA之螯合劑偶合的技術者已知之方法可用於診斷中可用之放射性元素。同樣可用鈉125 藉由氯胺T方法[i]或另外用鎝99m 藉由Crockford等人之技術或如Hnatowich所描述經由DTPA連接執行標記。
在一些實施例中，本發明結合物中之任一者結合至例如Fc受體(例如FcγRI)。此類結合可例如在投與結合物之後在活體內進行，或其可例如在ELISA、西方墨點法、免疫細胞化學、免疫沈澱、親和力層析法及生物化學或基於細胞之分析中在活體外進行。根據本文所揭示之方法，熟習此項技術者能夠根據其偏好及一般知識選擇適合的確定肽與Fc受體(例如FcγRI)之結合模式。此類方法可尤其包括競爭性ELISA及α篩選。
在一些實施例中，本發明提供一種本文所揭示之結合物中之任一者之二聚體或寡聚物。在一些實施例中，二聚體或寡聚物中之結合物藉助於連接子彼此鍵聯。在一些實施例中，結合物中之肽結合至兩個hFcγRI。在一些實施例中，結合物中之肽活化Fc效應子功能。在一些實施例中，結合物包含兩個藉由KKKKK連接子(SEQ ID NO: 22)連接之Fc模擬肽。
在一些實施例中，本文揭示之結合物中之任一者能夠將免疫細胞募集於分子聚集體中。在一些實施例中，免疫細胞係單核球衍生細胞。在一些實施例中，免疫細胞係巨噬細胞。在一些實施例中，免疫細胞係單核球。在一些實施例中，免疫細胞係神經膠質細胞(例如微神經膠質細胞)。在一些實施例中，結合物結合至免疫細胞且有助於活化免疫細胞。在一些實施例中，結合物有助於吞噬分子聚集體中之至少一部分。 4.治療方法 對於本文所描述之方法中之任一者，本發明涵蓋整個申請案中所描述之結合物及/或組合物中之任一者之用途。另外，對於本文所描述之方法中之任一者，本發明涵蓋一種方法之任何一或多個步驟與另一方法之任何一或多個步驟之組合。
術語「治療(treatment/treating)」及其類似術語在本文中用以意謂獲得所需藥理學及/或生理效果。「治療」病狀或疾病係指治癒以及改善病狀或疾病之至少一種症狀，且包括投與相對於不接受組合物之個體會降低有需要個體中之醫學病狀之症狀之頻率或延遲其發作之組合物。如本文所用，「治療」涵蓋治療哺乳動物，尤其人類之疾病或病狀，且包括：(a)預防易患該疾病或病狀但尚未開始經歷症狀之個體出現該疾病或病狀之症狀；(b)抑制該疾病或病狀(例如遏制其顯現)；或(c)緩解該疾病或病狀(例如使得疾病或病狀消退，從而改良一或多種症狀)。舉例而言，治療諸如阿茲海默氏病之澱粉樣變性疾病涵蓋預防明顯的記憶喪失或認知減退、減輕澱粉樣蛋白斑、改良記憶及/或改良或減輕認知減退。其他澱粉樣變性病狀之治療可涵蓋預防/緩解/逆轉腹瀉、體重減輕、疲勞、舌腫大、出血、軀體感覺障礙、體位低血壓、周邊水腫及脾腫大。動脈粥樣硬化或心臟病之治療可涵蓋消除膽固醇/脂質聚集體及/或預防/緩解/逆轉動脈粥樣硬化及/或心臟病。肝醣貯積症之治療可涵蓋消除肝醣沈積物及/或任何與彼疾病有關之相關之症狀(行動缺陷、認知缺陷、肝臟缺陷等)。
在一些實施例中，本發明提供一種藉由使聚集體與本文所揭示之結合物中之任一者接觸將免疫細胞募集於聚集體中之方法。在一些實施例中，免疫細胞係本文所揭示之免疫細胞中之任一者。在一些實施例中，將免疫細胞活化以使得能夠清除聚集體(例如藉由吞噬作用或藉由募集/活化額外免疫細胞)。在一些實施例中，聚集體係本文所揭示之聚集體中之任一者。在一些實施例中，聚集體及免疫細胞係在活體外。在一些實施例中，聚集體及免疫細胞在活體內。在一些實施例中，聚集體及免疫細胞係在動物中。在一些實施例中，動物係哺乳動物。在一些實施例中，哺乳動物係人類。在一些實施例中，免疫細胞係單核球衍生細胞。在一些實施例中，免疫細胞係巨噬細胞。在一些實施例中，免疫細胞係單核球。在一些實施例中，免疫細胞係微神經膠質細胞。
在一些實施例中，本發明提供一種用本文所揭示之結合物中之任何一或多者治療有需要之個體之方法，其中該個體具有與蛋白質聚集體有關之疾病或病症。在一些實施例中，蛋白質聚集體包含以下中之任何一或多者：α-突觸核蛋白、滔蛋白、澱粉樣蛋白β、TDP-43、SOD1、FUS、TDP-43、朊病毒蛋白質、免疫球蛋白輕鏈、甲狀腺素運載蛋白、血纖維蛋白原、膠原蛋白、胰島澱粉樣多肽、溶菌酶、降鈣素、血清澱粉樣A蛋白質、LECT2、澱粉素、膠溶素、血纖維蛋白原A、促乳素、角膜上皮蛋白及β2 -微珠蛋白、或其聚集體形成片段或衍生物。在一些實施例中，澱粉樣蛋白由重複肽序列構成，該等重複肽序列由如C9ORF72、亨廷頓氏疾病、XA脆折、XE脆折、弗里德利希共濟失調、第1型肌緊張性營養障礙(DM1)、庫賈氏病、第2型肌緊張性營養障礙(DM2)及第8、10及12型脊髓小腦失調(SCA8、SCA 10、SCA 12)中所見之核苷酸重複序列擴增之RAN轉譯產生。
在一些實施例中，疾病或病症係澱粉樣變性。在一些實施例中，澱粉樣變性係選自由以下組成之群：AL澱粉樣變性、AA澱粉樣變性、阿茲海默病、LECT2澱粉樣變性、軟腦膜澱粉樣變性、老年全身性澱粉樣變性、家族澱粉樣多發性神經病、血液透析相關之澱粉樣變性、第2型糖尿病、庫賈氏病、格斯曼-斯托斯勒-謝恩克爾症候群、芬蘭型澱粉樣變性、大腦澱粉樣血管病、家族內臟澱粉樣變性、原發性皮膚澱粉樣變性促乳素瘤、家族角膜澱粉樣變性、帕金森氏病、肌肉萎縮性側索硬化、大腦澱粉樣血管病、額顳葉癡呆、甲狀腺髓樣癌及B2M澱粉樣變性。在一些實施例中，澱粉樣變性係家族澱粉樣變性。在一些實施例中，澱粉樣變性係全身澱粉樣變性。
在一些實施例中，本發明提供一種用本文所揭示之結合物中之任何一或多者治療有需要之個體之方法，其中該個體具有與多醣聚集體有關之疾病或病症。在一些實施例中，多醣係肝醣。在一些實施例中，疾病或病症係肝醣貯積病或病症。在一些實施例中，疾病或病症係選自由以下組成之群：龐培疾(Pompe Disease)、馮基爾克氏病(von Gierke Disease)、福布斯克瑞病(Forbes-Cori Disease)、安德森病(Andersen Disease)、麥卡德爾病(McArdle Disease)、赫爾斯病(Hers Disease)、塔里氏病(Tarui's Disease)、範康尼氏比克爾症候群(Fanconi-Bickel Syndrome)、GSD IX、GSD X、GSD XI、GSD XII、GSD XIII、GSD XV及拉福拉病(Lafora Disease)。
在一些實施例中，本發明提供一種用本文所揭示之結合物中之任何一或多者治療有需要之個體之方法，其中該個體具有與脂質聚集體有關之疾病或病症。在一些實施例中，脂質係膽固醇。在一些實施例中，脂質係鞘磷脂。在一些實施例中，脂質係醯基鞘鞍醇三己糖(Gb3)或葡萄糖腦苷脂。在一些實施例中，疾病或病症係心臟病或動脈粥樣硬化。在一些實施例中，疾病或病症係高膽固醇血症。在一些實施例中，疾病或病症係阿茲海默氏病或帕金森氏病。在一些實施例中，疾病或病症係法布立病(Fabry disease)或A型、B型或C型尼曼-匹克病(Niemann-Pick Type A, Type B or Type C disease)。
在一些實施例中，本發明提供一種用本文所揭示之結合物中之任何一或多者治療有需要之個體之方法，其中該個體具有與核苷酸聚集體有關之疾病或病症。在一些實施例中，疾病或病症與RNA聚集體相關。在一些實施例中，疾病或病症與DNA聚集體相關。在一些實施例中，疾病或病症與異常微隨體擴增相關。與異常微隨體擴增有關之病狀(在本文中亦稱為微隨體擴增疾病)包括多種神經及肌神經疾病(O'Donnell等人, 2002, Annu. Rev. Neurosci. 25: 315)。此等疾病或病狀由編碼及非編碼區中之微隨體重複序列擴增所致。此等微隨體重複序列擴增可包括例如CAG或CUG重複序列或其變化形式(例如CCUG)。舉例而言，特徵化編碼區擴增疾病包括齒狀紅核蒼白球路易體萎縮(DRPLA)、亨廷頓氏舞蹈病(HD)、眼咽型肌肉萎縮症(OPMD)、脊髓延髓肌肉萎縮症(SBMA)、特定形式之庫賈氏病及第1、2、3、6、7及17型脊髓小腦失調(SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA17)。特徵化非編碼區擴增疾病包括XA脆折、XE脆折、弗里德利希共濟失調、第1型肌緊張性營養障礙(DM1)、第2型肌緊張性營養障礙(DM2)及第8、10及12型脊髓小腦失調(SCA8、SCA 10、SCA 12)。亨廷頓氏病及第2型亨廷頓氏病樣病(HDL2)亦由微隨體擴增所致。肌肉萎縮性側索硬化或額顳癡呆(FTD)與9號染色體開放閱讀框架72(C9ORF72)基因中之重複序列擴增有關。
在一些實施例中，本文所述之結合物中之任一者可與替代療法組合。應瞭解，根據本發明之蛋白質聚集相關疾病之治療可與此項技術中已知之其他治療方法組合(亦即組合療法)。因此，在澱粉樣變性之情況下，本發明化合物可與諸如抗澱粉樣蛋白藥物之額外藥物共同投與(同時或個別)。此類抗澱粉樣蛋白藥之實例包括(但不限於)澱粉樣蛋白不穩定抗體、澱粉樣蛋白不穩定肽及抗澱粉樣蛋白小分子。其他組合療法可包括治療有效量之至少一種選自由以下組成之群的藥物：BACE抑制劑；蕈毒鹼拮抗劑；膽鹼酯酶抑制劑；γ分泌酵素抑制劑；γ分泌酵素調節劑；HMG-CoA還原酶抑制劑；非類固醇消炎劑；N-甲基-D-天門冬胺酸受體拮抗劑；抗澱粉樣蛋白抗體；維生素E；菸鹼乙醯膽鹼受體促效劑；CB1受體反相促效劑或CB1受體拮抗劑；抗生素；生長激素促分泌物；組織胺H3拮抗劑；AMPA促效劑；PDE4抑制劑；GABAA反相促效劑；澱粉樣蛋白聚集之抑制劑；肝醣合成酶激酶β抑制劑；α分泌酵素活性之啟動子；PDE-10抑制劑；憶思能(Exelon)(雷斯替明(rivastigmine))；康耐視(Cognex)(他可林(tacrine))；滔蛋白激酶；抗Aβ疫苗；APP配體；上調胰島素膽固醇降低劑之藥劑；膽固醇吸收抑制劑；纖維酸酯；LXR促效劑；LRP模擬物；菸鹼受體促效劑；H3受體拮抗劑；組蛋白脫乙醯基酶抑制劑；Hsp90抑制劑；m1蕈毒鹼受體促效劑；5-HT6受體拮抗劑；mGluR1；mGluR5；正向異位調節劑或促效劑；mGluR2/3拮抗劑；可減輕神經炎症之消炎劑；前列腺素EP2受體拮抗劑；PAI-1抑制劑；及可誘發Aβ流出之藥劑。
其他組合療法可包括治療有效量之至少一種選自由以下組成之群的療法：物理療法、按摩、大麻素(參見例如Ramirez等人, The Journal of Neuroscience, 2005年2月23日, 25(8):1904-1913)；迪美本(dimebon)(參見例如R S Doody等人, The Lancet 372:207-215 (2008)；選擇性雌激素受體分子(SERM)，例如雷洛昔芬(raloxifene) (EVISTA®)；抗高血壓劑，包括α-阻斷劑、β-阻斷劑、α-β阻斷劑、血管收縮素轉化酶抑制劑、血管緊張素受體阻斷劑(ARB，諸如纈沙坦(valsartan)(例如DIOVAN®))、鈣離子通道阻斷劑及利尿劑(參見例如I Hajjar等人, The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences 60:67-73 (2005))；及抗氧化劑，諸如大蒜提取物(garlic extract)、薑黃素(curcumin)、褪黑激素(melatonin)、白藜蘆醇(resveratrol)、銀杏提取物(Ginkgo biloba extract)、綠茶、維生素C及維生素E(參見例如B Frank等人, Ann Clin Psychiatry 17(4):269-86 (2005))。
在膽固醇相關疾病或病症之情況下，本文所述之結合物中之任一者可與膽固醇降低及/或心臟保護藥物組合，該等藥物係諸如他汀(statin)，例如阿托伐他汀(atorvastatin)(LIPITOR®)、西立伐他汀(cerivastatin)(BAYCOL®)、氟伐他汀(fluvastatin)(例如LESCOL®)、美伐他汀(mevastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)(例如LIVALO®)、普伐他汀(pravastatin)(例如PRAVACHOL®)、羅素他汀(rosuvastatin)(例如CRESTOR®)及辛伐他汀(simvastatin)(例如ZOCOR®)。
5.醫藥組合物 在一些實施例中，可將本文所述之結合物中之任一者至調配醫藥組合物中。用於根據本發明之用途之醫藥組合物可以習知方式使用一或多種生理學上可接受之載劑或賦形劑調配。此類調配物一般將實質上不含熱原質，符合大多數法規要求。
在某些實施例中，本發明之治療方法包括以植入物或裝置方式全身性或局部投與組合物。當投與時，用於本發明中之用途之治療組合物呈不含熱原質之生理學上可接受之形式。在本文所揭示之方法中，除如上文所述之組合物中亦可視情況包括之結合物外，治療上適用的藥劑可與主題化合物同時或依序投與。
在一些實施例中，本文所揭示之結合物將非經腸，且尤其靜脈內或皮下投與。在一些實施例中，鞘內投與結合物。在一些實施例中，肌肉內投與結合物。在一些實施例中，腦室內投與結合物。在一些實施例中，鼻內投與結合物。適用於非經腸投與之醫藥組合物包含一或多種結合物以及一或多種醫藥學上可接受之無菌等張水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或乳液、或可以就在使用之前復原成無菌可注射溶液或分散液的無菌散劑，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑、使調配物與指定接受者之血液等張之溶質或懸浮劑或增稠劑。可用於本發明之醫藥組合物中之適合的水性及非水性載劑之實例包括水、乙醇、多元醇(諸如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)及其適合的混合物、植物油(諸如橄欖油)及可注射之有機酯(諸如油酸乙酯)。可例如藉由使用塗層材料(諸如卵磷脂)、藉由在分散液之情況下維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。
必要時，組合物及調配物可呈現於可含有一或多種含有活性成分之單位劑型的包裝或施配器裝置中。包裝可例如包含金屬或塑膠箔，諸如泡殼包裝。包裝或施配器裝置可附有投與說明書。
此外，組合物可以用於遞送至目標組織部位之形式囊封或注射。在某些實施例中，本發明之組合物可包括能夠將一或多種結合物遞送至目標組織部位之基質，從而提供用於顯現組織且最佳能夠吸收入體內之結構。舉例而言，基質可提供結合物之緩慢釋放。此類基質可由目前用於其他植入醫學應用中之材料形成。
基質材料之選擇係基於生物相容性、可生物降解性、機械特性、裝飾性外觀及界面特性。主題組合物之特定應用將限定合適調配物。用於組合物之潛在基質可為可生物降解及化學限定之硫酸鈣、磷酸三鈣、羥磷灰石、聚乳酸及聚酸酐。其他潛在材料係可生物降解的且以生物學方式明確限定，諸如骨骼或皮膚膠原蛋白。其他基質包含純蛋白質或細胞外基質組分。其他潛在基質係不可生物降解的且以化學方式限定，諸如燒結羥基磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽或其他陶瓷。基質可包含上述類型之材料(諸如聚乳酸及羥磷灰石或膠原蛋白及磷酸三鈣)中之任一者之組合。生物陶瓷可在組成中，諸如在鈣-鋁酸鹽-磷酸鹽及處理中加以改變以改變孔徑、粒度、粒子形狀及可生物降解性。
在某些實施例中，本發明之方法可例如呈以下形式經口投與：膠囊、扁囊劑、丸劑、錠劑、口含錠(使用調味基底，通常蔗糖及阿拉伯膠或黃蓍膠)、散劑、顆粒劑或呈於水性或非水性液體中之溶液或懸浮液形式、或呈水包油或油包水液體乳液形式、或呈酏劑或糖漿形式、或呈片劑形式(使用惰性基底，諸如明膠及丙三醇或蔗糖及阿拉伯膠)及呈口腔洗液形式及其類似物，各者含有預定量之藥劑作為活性成分。藥劑亦可以大丸劑、舐劑或糊劑之形式投與。
在用於經口投與之固體劑型(膠囊、錠劑、丸劑、糖衣藥丸、散劑、顆粒劑及其類似物)中，可將一或多種本發明之治療化合物與一或多種醫藥學上可接受之載劑混合，諸如檸檬酸鈉或磷酸二鈣及/或以下中之任一者：(1)填充劑或增量劑，諸如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇及/或矽酸；(2)黏合劑，諸如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯啶酮、蔗糖及/或阿拉伯膠；(3)保濕劑，諸如丙三醇；(4)崩解劑，諸如瓊脂-瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯澱粉、海藻酸、某些矽酸鹽及碳酸鈉；(5)溶液阻滯劑，諸如石蠟；(6)吸收促進劑，諸如四級銨化合物；(7)潤濕劑，諸如鯨蠟醇及丙三醇單硬脂酸酯；(8)吸收劑，諸如高嶺土及膨潤土；(9)潤滑劑，諸如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉及其混合物；及(10)著色劑。在膠囊、錠劑及丸劑之情況下，醫藥組合物亦可包含緩衝劑。亦可使用諸如乳糖(lactose/milk sugar)以及高分子量聚乙二醇及其類似物之賦形劑將類似類型之固體組合物用作軟填充及硬填充明膠膠囊中之填充劑。
用於經口投與之液體劑型包括醫藥學上可接受之乳液、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿及酏劑。除活性成分之外，液體劑型可含有常用於此項技術中之惰性稀釋劑(諸如水或其他溶劑)、助溶劑及乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻油)、丙三醇、四氫呋喃醇、聚乙二醇及脫水山梨糖醇之脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀釋劑外，口服組合物亦可包括佐劑，諸如潤濕劑、乳化劑及懸浮劑、甜味劑、調味劑、著色劑、芳香劑及防腐劑。
懸浮液除活性化合物之外可含有懸浮劑，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇及脫水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂、黃蓍及其混合物。
本發明之組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。微生物作用之預防可藉由包括各種抗細菌及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸及其類似物來確保。組合物亦可需要包括等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外，可注射醫藥學形式之延長吸收可藉由包括延遲吸收之藥劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)來達成。
應理解，給藥方案將由主治醫師考慮改變本發明之主題結合物作用之多種因素來決定。多種因素包括(但不限於)患者之年齡、性別及飲食、嚴重疾病、投與時間及其他臨床因素。視情況，劑量隨用於復原之基質類型及組合物中之化合物類型變化。其他已知生長因子至最終組合物中之添加亦可影響劑量。可藉由骨骼生長及/或修復之週期評估，例如X射線(包括DEXA)、組織形態學測定及四環素標記監測進程。
結合物之另一靶向遞送系統係膠態分散系統。膠態分散系統包括大分子複合物、奈米囊劑、微球、珠粒及包括水包油乳化液、微胞、混合微胞及脂質體之基於脂質之系統。在一些實施例中，本發明之膠態系統係脂質體。脂質體係適用作活體外及活體內遞送媒劑之人造膜囊泡。脂質體之組成通常係磷脂之組合，通常與類固醇，尤其膽固醇組合。亦可使用其他磷脂或其他脂質。脂質體之物理特徵視pH值、離子強度及二價陽離子之存在而定。
適用於脂質體產生之脂質之實例包括磷脂醯基化合物，諸如磷脂醯甘油、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯乙醇胺、鞘脂、腦苷脂及神經節苷脂。說明性磷脂包括卵磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼及二硬脂醯基磷脂醯膽鹼。基於例如器官特異性、細胞特異性及細胞器特異性，脂質體之靶向亦為可能的且在此項技術中已知。
本發明提供調配物，該等調配物可經改變以包括酸及鹼以調節pH值；及緩衝劑以使pH值保持在狹窄範圍內。
實例 現已大體描述本發明，本發明將參考以下實例而更容易理解，該等實例僅出於說明本發明之某些實施例的目的，且不意欲限制本發明。
實例 1 ： 產生 BDB 化合物1係硫代黃素T之羧酸衍生物。添加此化合物作為圖1中所示之經生物素標記之合成環肽(其係cp33肽之衍生物)之末端殘基 (Bonetto S等人 FASEB J. 2009; 23(2):575-85)。在下文所提供之實例中，所得結合物稱為「BDB」。
實例 2 ：確定 BDB 與 澱粉樣蛋白之結合 使用螢光分析在活體外評估BDB與多種澱粉樣蛋白之結合。結果概述於圖2中。
個別製備澱粉樣蛋白(雞溶菌酶(hLys)、全長人類α突觸核蛋白及人類滔蛋白P301S)以用於螢光分析中。將hLys (Sigma)溶解於136.8 mM NaCl、2.68 mM KCl、0.01% w/v NaN3 (pH 2，濃度為1.45 mg/ml)中且在55℃下在定軌振盪器中在150 rpm下培育24小時。將全長人類α突觸核蛋白(Alexotech)溶解於PBS中之150 mM NaCl、1% v/v曲拉通-x100 (濃度為2.2 mg/ml)中，且在37℃下在定軌振盪器中在250 rpm下培育72小時。人類滔蛋白P301S在37℃下在8 mg/ml之於PBS中之4 mg/ml肝素(Sigma)、30 mM 3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)(pH 7.2)中培育72小時。將溶液與九個體積之具有1% v/v十二烷基肌胺酸鈉(Sigma)之PBS混合且在室溫下搖盪1小時。不可溶滔蛋白藉由在4℃下超速離心粒化1小時且使丸粒再懸浮於PBS中且在100 W下超聲處理3×20秒(Hielscher UP200St超音波處理器)。
使用螢光分偵測BDB與澱粉樣蛋白之結合。使用三種螢光報導體溶液中之一者偵測澱粉樣蛋白結合(30 µM BDB、cp33肽(Bonetto S等人 FASEB J. 2009; 23(2):575-85)或硫代黃素T (ThT) (Sigma)溶液，於PBS中)。將一微升之澱粉樣蛋白懸浮液(30 µM滔蛋白或溶菌酶或150 µM α-突觸核蛋白)與19 µl三種報導體溶液中之一者於黑色384孔聚苯乙烯盤(Greiner Bio-one)中混合。將Envision盤讀取器設定為在450 nm下激發且量測460-680 nm範圍內之發射。自實驗數據減去報導體溶液之對應螢光信號。如圖2中所展示，在澱粉樣蛋白存在下，BDB及Tht之螢光增加。在澱粉樣蛋白存在下，不與化合物1結合之cp33肽並不展示螢光信號。
實例 3 ： 確定 BDB 與 活化之吞噬細胞之結合 為確定BDB與活化之吞噬細胞之結合親和力，在BDB、經生物素標記之人類IgG1或PBS存在下使活化及非活化U937細胞或鼠類初級巨噬細胞再懸浮。細胞接著使用AF488-抗生蛋白鏈菌素結合物、APC-Cy7死/活染色劑或僅死/活染色劑染色且使用螢光活化細胞分選(FACS)量測。
特定言之，將U937細胞在RPMI 1640 + 2 mM麩醯胺酸 + 10% v/v胎牛血清(FCS)中在100 µg/ml人類IFNγ(Thermo Fisher Scientific)不存在或存在下培養48小時。將鼠類初級巨噬細胞在100 µg/ml LPS (Sigma)不存在或存在下培養48小時。5×105 個細胞之等分試樣在300 g下離心3分鐘且再懸浮於50 µl之10 µM BDB、1 µM經生物素標記之人類IgG1或PBS中。將樣品在4℃下培育1小時，且接著在100 g下離心3分鐘。使細胞再懸浮於50 µl之具有APC-Cy7死/活染色劑(Thermo Fisher Scientific，於PBS中1:2000)之AF488-抗生蛋白鏈菌素結合物(Thermo Fisher Scientific，於PBS中1:500)或僅死/活染色劑中。將樣品在4℃下培育30分鐘，且接著在100 g下離心3分鐘。樣品用200 µl冷PBS洗滌且再懸浮於250 µl PBS中以用於使用FACS Canto II分析，每種條件記錄104 個事件。使用FlowJo軟體，細胞使用前向及側向散射曲線(FSC相對於SSC)進行觀測，且活細胞根據其活/死染色閘控。標識各條件下對於AF488信號陽性之活細胞之百分比且進行繪製。重複實驗三次且結果以平均值(+/-SD)存在。使用單因子ANOVA估算條件之間的差異顯著性(** P＜0.01，**** P＜0.0001)。如圖3中所顯示，用IFNγ (IFNg)處理之U937細胞或用LPS處理之鼠類初級巨噬細胞展示BDB結合增強。此等結果與BDB結合至表面表現增加之Fc受體一致。IgG1以高親和力結合多種受體，且標記細胞而不考慮活化狀態。
實例 4 ： 滴定 BDB 及 IgG1 與 IFNg 刺激之 U937 細胞之結合 使用以下方法確定BDB及IgG1與IFNγ刺激之U937細胞之結合。將U937細胞於RPMI 1640 + 2 mM麩醯胺酸 + 10% v/v FCS中在100 μg/ml人類IFNγ存在下培養48小時。5×105 個U937細胞之等分試樣在300 g下離心3分鐘且再懸浮於50 µl濃度分別在0.01-5 μM或0.01-1 μM範圍內之BDB或經生物素標記之IgG1中。如上文所述執行染色及FACS分析。
圖4表明當BDB之濃度增加時，多達80%之IFNg活化之U937細胞得以結合。在大致200 nM BDB下發現半最大結合。IgG1在相同條件下結合至所有細胞。
實例 5 ： 使用未經標記之人類 IgG1 進行 BDB 及 cp33 肽與 Fc 受體之競爭結合 進行人類IgG1與BDB或cp33肽之間的競爭性分析以確定BDB及cp33肽與Fc受體之特異性結合。特定言之，將U937細胞於RPMI 1640 + 2 mM麩醯胺酸 + 10% v/v FCS中在100 μg/ml人類IFNγ存在下培養48小時。5×105 個細胞之等分試樣在300 g下離心3分鐘且再懸浮於50 µl濃度在0.001-5 μM範圍內之存在或不存在對照單株人類IgG1 (Nip228，MedImmune Ltd)之1 μM BDB或cp33中。如上文所述執行染色及FACS分析。
圖5表明，當人類IgG1之濃度增加高於大致10 nM時，BDB與cp33肽換為不結合至IFNγ活化之U937細胞。此競爭與BDB及cp33肽結合至Fc受體一致。
實例 6 ： 表明 BDB 及澱粉樣蛋白在 U937 細胞表面之共定位 將IFNγ活化U937細胞，一種人類巨噬細胞株，與BDB、cp33肽或媒劑在Alexa Fluor™ 647標記之hLys澱粉樣蛋白存在或不存在下一起培育以判定與媒劑相比，在BDB或cp33肽存在下IFNγ活化之U937細胞是否具有澱粉樣蛋白結合增加。
特定言之，使用AlexaFluor™ 647微米級蛋白質標記套組(Thermo Fisher Scientific)根據製造商之說明書用螢光染料alexa 647標記hLys，但具有以下修改：在蛋白質標記之後，用PBS製造多達500 μl之溶液，且在20800下離心樣品40分鐘。丟棄上清液，且將丸粒用PBS洗滌，再懸浮於500 μl PBS中且重複離心。使最終丸粒再懸浮於100 μl PBS中。
將U937細胞於RPMI 1640 + 2 mM麩醯胺酸 + 10% v/v FCS中在100 μg/ml人類IFNγ存在下培養48小時。5×105 個細胞之等分試樣在300 g下離心3分鐘且再懸浮於50 µl之1 µM BDB或cp33中，且接著與1或0.1 μM AF647-hLyz一起培育。如前所述執行染色及FACS分析，此時報導對於AF488-抗生蛋白鏈菌素與AF647 h-Lyz陽性之活細胞之百分比。
圖6比用BDB、cp33肽或媒劑對照處理之IFNγ活化之U937細胞表面上較澱粉樣蛋白之位置。BDB與cp33肽展示細胞結合而不考慮是否存在澱粉樣蛋白(上面四個圖中y軸上之位移)。與在cp33肽存在下之1.0%或用媒劑處理時之0.4%相比，在BDB存在下觀察到多達14.4%之IFNγ活化之U937細胞結合澱粉樣蛋白。此等結果表明BDB增強澱粉樣蛋白與IFGγ活化之U937細胞之結合。
實例 7 ： 量測標記之澱粉樣蛋白之吞噬作用 與pHrodo紅標記之澱粉樣蛋白、BDB、cp33肽或對照共同培育巨噬細胞分化之U937細胞以確定在各種條件下吞噬之澱粉樣蛋白之量。hLys澱粉樣蛋白原纖維如上文所述產生且用pHrodo紅微米級標記套組(ThermoFisher)根據製造商之說明書標記，但其中改為藉由在微量離心管中在20,000x g下離心三輪而自標記之澱粉樣蛋白移除未併入之標記物，丟棄上清液且使澱粉樣蛋白丸粒再懸浮於PBS中。U937細胞在100 μg/ml M-CSF (Peprotech)、1 μg/ml PMA (Sigma)及100 μg/ml IFNγ (Thermo Fisher Scientific)存在下分化成巨噬細胞持續4天。每種條件下8×105 個細胞在300 g下離心3分鐘且再懸浮於50 μl之1 μM BDB、1 µM cp33、1 µM具有0.1 µM標記之澱粉樣蛋白之BDB、具有0.1 µM標記之澱粉樣蛋白之1 µM cp33、0.1 µM標記之澱粉樣蛋白或pHrodo紅標記之大腸桿菌懸浮液(Thermo Fisher Scientific)之1:100 PBS稀釋液中。將細胞在4℃下培育1小時，在100 g下離心3分鐘且再懸浮於300 µl含有100 μg/ml M-CSF、1 μg/ml PMA及100 μg/ml IFNg之RPMI培養基中。對於各條件，將100 μl之細胞懸浮液接種於具有透明底部之黑色96孔盤(Greiner Bio-one)之各孔中。
將盤置放於IncuCyte儀器中且程式化設置以每小時掃描相差與紅色螢光通道持續48小時。接著使用IncuCyte Zoom軟體用紅色通道處理演算法處理各時間點之原始數據。使用總紅色目的區域(µm²/孔)之量度定量細胞內pHrodo紅螢光之形態。
圖7表明，藉由巨噬細胞分化之U937細胞，BDB增強澱粉樣蛋白之吞噬作用。紅色(y軸)報導吞噬之澱粉樣蛋白；此信號更快速增加且在與cp33-澱粉樣蛋白(3)或單獨澱粉樣蛋白(2)相比，在用BDB-澱粉樣蛋白(1)處理之細胞中實現較大幅度。添加pHrodo紅大腸桿菌作為陽性對照(4)。在澱粉樣蛋白不存在下，BDB (5)及cp33肽(6)並不產生信號。
在個別實驗中，在如上文所述之相同吞噬作用分析中各測試若干不同BDB構築體。在此實驗中，BDB構築體包含化合物III之結構：
Figure 02_image033
， 其中R1 係生物素(其可視情況經氫置換)；R2 係： a)單獨染料(
Figure 02_image035
；化合物IV)； b)具有β-丙胺酸連接子之染料(
Figure 02_image037
；化合物V)； c)具有6-胺基-4-氧雜己酸酯連接子之染料(
Figure 02_image039
；化合物VI)；或 d)具有9-胺基-4,7-二氧雜壬酸酯連接子之染料(
Figure 02_image041
；化合物VII)。在此實驗中，出人意料地發現，與不具有連接子之BDB或具有較長6-胺基-4-氧雜己酸酯或9-胺基-4,7-二氧雜壬酸酯連接子之BDB相比，具有更具剛性之β-丙胺酸連接子之BDB誘發大於兩倍速率之澱粉樣蛋白吞噬作用(圖8)。
實例 8 ： 在澱粉樣蛋白結合與 FcR 結合部分之間添加連接子之結構性作用 研發空間填充模型以確定在澱粉樣蛋白結合與FcR結合部分之間添加連接子之結構性作用。特定言之，圖9表明不使用連接子、使用β-Ala連接子、短PEG連接子及長PEG連接子(FMOC衍生之β-丙胺酸；9-胺基-4,7-二氧雜壬酸；及6-胺基-4-氧雜己酸)之模型之間的比較。
圖 1 展示合成BDB之示意圖，一種包含硫代黃素T之特定羧酸衍生物(化合物1)及特定靶向部分(cp33肽衍生物)之結合物。如所示，經由連接子添加化合物1作為經生物素標記之合成環肽(其係cp33肽之衍生物)之末端殘基 (Bonetto S等人 FASEB J. 2009; 23(2):575-85)。在一些實施例中，連接子可包含β-丙胺酸、9-胺基-4,7-二氧雜壬酸及/或6-胺基-4-氧雜己酸。圖 2 展示表明結合至多種澱粉樣蛋白之BDB的資料。如所示，與無澱粉樣蛋白之對照反應相比，在澱粉樣蛋白存在下，BDB及Tht之螢光增加。與無澱粉樣蛋白之對照反應相比，在澱粉樣蛋白存在下，不與化合物1結合之cp33肽並不展示螢光信號。圖 3 展示結合至來自人類及小鼠之活化吞噬細胞之BDB的資料。如所示，用IFNγ (IFNg)處理之U937細胞或用LPS處理之鼠類初級巨噬細胞在流動式細胞測量術實驗中展示BDB結合增強。此等結果與BDB結合至表面表現增加之Fc受體一致。IgG1以高親和力結合多種受體，且標記細胞而不考慮活化狀態。圖 4 展示BDB與IFNγ活化之U937細胞之結合曲線。如所示，在流動式細胞測量術實驗中，濃度逐漸增加之BDB使得多達80%之IFNγ活化之U937細胞結合。在大致200 nM BDB下發現半最大結合。IgG1在相同條件下結合至所有細胞。圖 5 展示在流動式細胞測量術實驗中來自人類IgG1、BDB及cp33肽之間關於結合至IFNγ活化之U937細胞之競爭分析的資料。如所示，當人類IgG1之濃度增加高於大致10 nM時，BDB與cp33肽換為不結合至IFNγ活化之U937細胞。此競爭與BDB及cp33肽結合至Fc受體一致。圖 6 展示在流動式細胞測量術實驗中比較澱粉樣蛋白之位置與用BDB、cp33肽或媒劑對照處理之IFNγ活化之U937細胞之表面的資料。如所示，BDB增強澱粉樣蛋白與IFNγ活化之U937細胞之結合。BDB與cp33肽展示細胞結合而不考慮是否存在澱粉樣蛋白(上面四個圖中y軸上之細胞群體向上位移)。與在cp33肽存在下之1.0%或用媒劑處理時之0.4%相比，在BDB存在下觀察到多達14.4%之IFNγ活化之U937細胞結合澱粉樣蛋白。圖 7 展示用pHrodo紅標記之澱粉樣蛋白、BDB、cp33肽或對照共同培育之巨噬細胞分化之U937細胞的標記之澱粉樣蛋白吞噬作用資料。如所示，藉由巨噬細胞分化之U937細胞發現，BDB增強澱粉樣蛋白之吞噬作用。紅色(y軸)報導吞噬之澱粉樣蛋白；此信號更快速增加且在與cp33-澱粉樣蛋白(3)或單獨澱粉樣蛋白(2)相比，在用BDB-澱粉樣蛋白(1)處理之細胞中實現較大幅度。添加pHrodo紅大腸桿菌作為陽性對照(4)。在澱粉樣蛋白不存在下，BDB (5)及cp33肽(6)並不產生信號。圖 8 展示與pHrodo紅標記之溶菌酶澱粉樣蛋白、cp33或多種BDB構築體共同培育之巨噬細胞分化之U937細胞的標記之澱粉樣蛋白吞噬作用資料。Cp33 = 單獨肽(無染料)；scBDB1 = 具有亂序肽部分之BDB1；BDB1 = 無連接子BDB構築體；BDB2 = 包含β-丙胺酸連接子之BDB構築體；BDB3 = 包含6-胺基-4-氧雜己酸酯連接子之BDB構築體；且BDB4 = 包含9-胺基-4,7-二氧雜壬酸酯連接子之BDB構築體。使用Incucyte顯微鏡對pHrodo-紅像素進行自動分析，在2小時時間點以任意螢光單位繪圖吞噬作用。圖 9 展示澱粉樣蛋白結合域(粉色)可藉由不同長度之連接子(綠色)與FcR結合域(灰色)分隔之空間填充模型。表明在澱粉樣蛋白結合與FcR結合部分之間添加連接子之結構性作用。在一些實施例中，連接子可包含β-丙胺酸；9-胺基-4,7-二氧雜壬酸(短PEG連接子)及6-胺基-4-氧雜己酸(長PEG連接子)。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006

Claims (81)

  1. 一種結合物，其包含：a)與IgG之Fc片段競爭以結合至Fc受體之肽；及b)靶向分子聚集體之靶向部分。
  2. 如請求項1之結合物，其中該肽活化Fc效應子功能。
  3. 如請求項1或2之結合物，其中該Fc受體係選自由以下組成之群：FcγRI、FcγRII及FcγRIII。
  4. 如請求項1至3中任一項之結合物，其中該Fc受體係人類受體。
  5. 如請求項1至4中任一項之結合物，其中該Fc受體係人類FcγRI (hFcγRI)。
  6. 如請求項2之結合物，其中該Fc效應子功能係吞噬作用。
  7. 如請求項1至6中任一項之結合物，其中該肽與IgG3或IgG1抗體之Fc部分競爭。
  8. 如請求項1至7中任一項之結合物，其中該肽與IgG1之Fc部分競爭。
  9. 如請求項1至8中任一項之結合物，其中該肽包含LLG之三肽基元。
  10. 如請求項1至9中任一項之結合物，其中該肽包含基元ςP之二聚體且其中ς表示疏水性殘基。
  11. 如請求項1至10中任一項之結合物，其中該肽在該肽之N端包含蘇胺酸。
  12. 如請求項1至11中任一項之結合物，其中該肽在該肽之C端包含麩胺酸。
  13. 如請求項1至12中任一項之結合物，其中該肽包含胺基酸序列TX2CXXςPXLLGCφXE (SEQ ID NO: 1)；其中X係任何胺基酸，ς係疏水性殘基且φ係酸性胺基酸。
  14. 如請求項1至13中任一項之結合物，其中該肽特異性結合至hFcγRI且不展現與hFcγRII或hFcγRIII之交叉反應性。
  15. 如請求項1至14中任一項之結合物，其中該肽包含胺基酸序列AQVNSCLLLPNLLGC (SEQ ID NO: 2)。
  16. 如請求項1至14中任一項之結合物，其中該肽包含胺基酸序列AQVNSCLLLPNLLGCGDDK (SEQ ID NO: 3)。
  17. 如請求項1至16中任一項之結合物，其中該肽中之一或多個胺基酸殘基係經甲基化。
  18. 如請求項15至17中任一項之結合物，其中與SEQ ID NO: 2或3之位置11對應之胺基酸位置處之天冬醯胺殘基係經甲基化。
  19. 如請求項15至18中任一項之結合物，其中與SEQ ID NO: 2或3之位置13對應之胺基酸位置處之白胺酸殘基係經甲基化。
  20. 一種結合物，其包含如請求項1至19中任一項之結合物中之兩者或更多者，其彼此鍵聯以產生二聚或寡聚肽。
  21. 如請求項20之結合物，其中該肽結合至兩個hFcγRI且活化Fc效應子功能。
  22. 如請求項20或21之結合物，其包含兩個藉由KKKKK連接子(SEQ ID NO: 22)連接之Fc模擬肽。
  23. 如請求項1至22中任一項之結合物，其中該結合物能夠將免疫細胞募集至該等分子聚集體。
  24. 如請求項1至23中任一項之結合物，其中該免疫細胞係單核球衍生細胞。
  25. 如請求項24之結合物，其中該免疫細胞係巨噬細胞。
  26. 如請求項24之結合物，其中該免疫細胞係單核球。
  27. 如請求項24之結合物，其中該免疫細胞係微神經膠質細胞。
  28. 如請求項24至27中任一項之結合物，其中該結合物結合至該免疫細胞且有助於活化該免疫細胞。
  29. 如請求項1至28中任一項之結合物，其中該結合物有助於該等分子聚集體中之至少一部分之吞噬作用。
  30. 如請求項1至29中任一項之結合物，其中該靶向部分靶向蛋白質聚集體。
  31. 如請求項30之結合物，其中該等蛋白質聚集體包含以下蛋白質中之任一者之聚集體：α-突觸核蛋白、滔蛋白、澱粉樣蛋白β、TDP-43、SOD1、FUS、TDP-43、朊病毒蛋白質、免疫球蛋白輕鏈、甲狀腺素運載蛋白、血纖維蛋白原、膠原蛋白、胰島澱粉樣多肽、溶菌酶、降鈣素、血清澱粉樣A蛋白質、LECT2、澱粉素、膠溶素、血纖維蛋白原A、促乳素、角膜上皮蛋白及β2 -微珠蛋白、或其聚集體形成片段或衍生物。
  32. 如請求項1至29中任一項之結合物，其中該靶向部分靶向脂質聚集體。
  33. 如請求項32之結合物，其中該等脂質聚集體係膽固醇聚集體。
  34. 如請求項1至29中任一項之結合物，其中該靶向部分靶向多醣聚集體。
  35. 如請求項34之結合物，其中該靶向部分靶向肝醣聚集體。
  36. 如請求項1至35中任一項之結合物，其中該靶向部分係小分子。
  37. 如請求項1至35中任一項之結合物，其中該靶向部分係肽。
  38. 如請求項1至35中任一項之結合物，其中該靶向部分係核酸。
  39. 如請求項1至35中任一項之結合物，其中該靶向部分係染料。
  40. 如請求項39之結合物，其中該染料結合至澱粉樣蛋白。
  41. 如請求項39之結合物，其中該染料係選自由以下組成之群：硫代黃素、五聚體甲醯基噻吩乙酸(pFTAA)、七聚體甲醯基噻吩乙酸(hFTAA)、剛果紅、結晶紫、1-胺基-8-萘磺酸(ANS)、4-(二氰基乙烯基)-久洛利定(DCVJ)、胺基苯并蒽酮、甲氧基XO4、噻嗪紅、匹茲堡B及其澱粉樣蛋白結合衍生物。
  42. 如請求項40之結合物，其中該硫代黃素係硫代黃素T或其澱粉樣蛋白結合衍生物。
  43. 如請求項39至42中任一項之結合物，其中該澱粉樣蛋白包含以下蛋白質中之任何一或多者：α-突觸核蛋白、滔蛋白、澱粉樣蛋白β、TDP-43、SOD1、FUS、TDP-43、朊病毒蛋白質、免疫球蛋白輕鏈、甲狀腺素運載蛋白、血纖維蛋白原、膠原蛋白、胰島澱粉樣多肽、溶菌酶、降鈣素、血清澱粉樣A蛋白質、LECT2、澱粉素、膠溶素、血纖維蛋白原A、促乳素、角膜上皮蛋白及β2 -微珠蛋白。
  44. 如請求項43之結合物，其中該澱粉樣蛋白包含溶菌酶。
  45. 如請求項39之結合物，其中該染料結合至膽固醇。
  46. 如請求項45之結合物，其中該染料係非律平(filipin)或其膽固醇結合衍生物。
  47. 如請求項39之結合物，其中該染料結合至膠原蛋白。
  48. 如請求項47之結合物，其中該染料係天狼星紅、Col-F、俄勒岡綠488、天狼猩紅、亮綠SF淡黃、堅牢綠FCF、甲基藍、水藍、苯胺藍及其膠原蛋白結合衍生物。
  49. 如請求項39之結合物，其中該染料結合多醣聚集體。
  50. 如請求項49之結合物，其中該染料結合肝醣聚集體。
  51. 如請求項49或50之結合物，其中該染料係選自由以下組成之群：胭脂紅、過碘酸、艾爾遜藍及二甲基亞甲基藍。
  52. 如請求項39之結合物，其中該染料結合核苷酸聚集體。
  53. 如請求項52之結合物，其中該染料結合至RNA聚集體。
  54. 如請求項52之結合物，其中該染料結合DNA聚集體。
  55. 如請求項1至54中任一項之結合物，其中該靶向部分已經修飾以有助於與該肽結合。
  56. 如請求項55之結合物，其中該靶向部分已經修飾以使其包括羧基。
  57. 如請求項56之結合物，其中該靶向部分之該羧基結合至該肽之胺基端。
  58. 如請求項55之結合物，其中該靶向部分已經修飾以使其包括胺基。
  59. 如請求項58之結合物，其中該靶向部分之該胺基結合至該肽之羧基端。
  60. 如請求項1至59中任一項之結合物，其中該靶向部分藉助於連接子與該肽結合。
  61. 如請求項60之結合物，其中該連接子係選自由以下組成之群：不可裂解連接子、腙連接子、硫醚連接子、二硫鍵連接子、肽連接子及β-葡萄糖苷酸連接子。
  62. 如請求項60之結合物，其中該連接子包含化合物II之結構，
    Figure 03_image043
    , (化合物II) 其中n係1至30，且m係0、1、2、3、4或5。
  63. 如請求項62之結合物，其中n係1至25、1至20、1至15、1至10、1至8、1至6、1至4、1至2或1。
  64. 如請求項62之結合物，其中n係2。
  65. 如請求項62至64中任一項之結合物，其中m係0。
  66. 如請求項60之結合物，其中該連接子係β-丙胺酸連接子、短聚乙二醇(PEG)連接子或長PEG連接子。
  67. 如請求項60之結合物，其中該連接子係β-丙胺酸連接子。
  68. 如請求項1至67中任一項之結合物，其中該結合物進一步與額外異源部分結合。
  69. 如請求項68之結合物，其中該異源部分係生物素。
  70. 如請求項1至31中任一項之結合物，其中該結合物包含稠合至硫代黃素T之胺基酸序列AQVNSCLLLPNLLGCGDDK (SEQ ID NO: 3)，或其衍生物。
  71. 如請求項70之結合物，其中該結合物包含稠合至化合物I之胺基酸序列AQVNSCLLLPNLLGCGDDK (SEQ ID NO: 3)：
    Figure 03_image045
    。
  72. 如請求項1至71中任一項之結合物，其中該結合物包含化合物III之結構：
    Figure 03_image047
    ， 其中R1 係生物素或氫； 其中R2 包含： a) 化合物IV (
    Figure 03_image049
    )； b) 化合物V (
    Figure 03_image051
    )； c) 化合物VI (
    Figure 03_image053
    )；或 d) 化合物VII (
    Figure 03_image055
    )。
  73. 如請求項72之結合物，其中R1 係生物素。
  74. 如請求項72之結合物，其中R1 係氫。
  75. 如請求項72至74中任一項之結合物，其中R2 包含化合物V(
    Figure 03_image057
    )。
  76. 一種治療澱粉樣變性之方法，藉由投與如請求項1至75之結合物中之任何一或多者實現。
  77. 如請求項76之方法，其中該澱粉樣變性係選自由以下組成之群：AL澱粉樣變性、AA澱粉樣變性、阿茲海默病、LECT2澱粉樣變性、軟腦膜澱粉樣變性、老年全身性澱粉樣變性、家族澱粉樣多發性神經病、血液透析相關之澱粉樣變性、第2型糖尿病、庫賈氏病、格斯曼-斯托斯勒-謝恩克爾症候群、芬蘭型澱粉樣變性、大腦澱粉樣血管病、家族內臟澱粉樣變性、原發性皮膚澱粉樣變性促乳素瘤、家族角膜澱粉樣變性、帕金森氏病、肌肉萎縮性側索硬化、大腦澱粉樣血管病、額顳葉癡呆、甲狀腺髓樣癌及B2M澱粉樣變性。
  78. 如請求項76或77之方法，其中該澱粉樣變性係家族澱粉樣變性。
  79. 如請求項78之方法，其中該澱粉樣變性係全身澱粉樣變性。
  80. 一種降低細胞或組織中聚集體的含量之方法，其藉由用如請求項1至75之結合物中之任一者治療該細胞或組織實現。
  81. 一種組合物，其包含如請求項1至75中任一項之結合物及醫藥學上可接受之賦形劑。
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