TW202007695A

TW202007695A - 短胜肽、及其組合物用於治療/預防糖尿病及與之相關疾病之用途

Info

Publication number: TW202007695A
Application number: TW107125276A
Authority: TW
Inventors: 林万登
Original assignee: 東海大學
Priority date: 2018-07-21
Filing date: 2018-07-21
Publication date: 2020-02-16
Also published as: CN110746487A; CN110746487B; TWI680139B

Abstract

本發明所揭胜肽係具有改善高血糖所造成之細胞壞死、細胞凋亡或/及細胞肥大之能力，並且，能夠恢復因糖尿病所引發之胰島細胞的增生能力，因此，藉由投予一有效量之本發明所揭胜肽至一罹患糖尿病或高血糖症之患者，係能夠有效地達到治療糖尿病或其併發症之功效，其中，糖尿病併發症係包含有糖尿病心臟病、糖尿病血管病變、糖尿病肝臟病變、糖尿病腎病、胰島壞死等。

Description

短胜肽、及其組合物用於治療/預防糖尿病及與之相關疾病之用途

本發明係有關於胜肽之用途，特別係指一種短胜肽、及其組合物用於治療/預防糖尿病及與之相關疾病之用途。

按，糖尿病係為一種代謝性疾病，會使患者之血糖長期處於高於標準值之狀態。而糖尿病除了會使患者持續處於高血糖之狀態外，更會使身體各部位或各器官受到高血糖之影響而病變，例如視網膜病變、腎臟病、傷口難以癒合、心血管疾病等。

糖尿病性心肌病係為一種發生於糖尿病患者之心臟疾病，會造成糖尿病病患之死亡率增加。糖尿病性心肌病之成因及心臟病變狀況係不同於其他心臟病，如高血壓心臟病或冠狀動脈硬化心臟病。一般來說，糖尿病性心肌病係包含一系列相互影響之病徵，如氧化壓力、心肌細胞肥大、凋亡和纖維化，而該些病徵係會造成嚴重之後果，例如心力衰竭、心律失常。

目前對於糖尿病之治療與預防，除了改善生活及飲食習慣外，僅能透過藥物調控血糖，而對於已經發生併發症之糖尿病病患來說，亦為針對症狀提供適當療法。惟，長期服用該些治療糖尿病或其併發症之藥物係會對於患者健康產生副作用外，亦無法有效地達到治療或改善糖尿病及其併發症之效果。

本發明之主要目的係在於提供一種短胜肽、及其組合物用於治療/預防糖尿病及與之相關疾病之用途，其係達到有效地治療糖尿病及其併發症之功效，並且不會產生傳統藥物所造成之副作用。

本發明之另一目的係在於提供一種短胜肽、及其組合物用於治療/預防糖尿病及與之相關疾病之用途，其係能夠治療受損之胰島細胞，使其恢復分泌胰島素及胰高血糖素之能力，達到治療糖尿病之功效。

緣是，為能達成上述目的，於本發明之一實施例中係揭露一種胜肽，其胺基酸序列係包含有SEQ ID No.2所示序列或是與其至少90％相同之同源序列。

其中，該胜肽之胺基酸序列係為SEQ ID No.2。

而上述胜肽係能夠作為一組合物之活性成份而被製備為一胜肽組合物，舉例來說，該胜肽組合物係為一食品、一營養補充品或一藥品。

於本發明之另一實施例中，該胜肽組合物中更包含有另一胜肽，其胺基酸序列係為SEQ ID No.1。

由於本發明所揭胜肽於高血糖環境下，係具有調控脂質代謝，以及調控細胞凋亡、細胞肥大、細胞存活路徑中相關蛋白質表現之能力，並且，能夠使受損之胰島細胞恢復增生，因此，本發明所揭胜肽係能夠用於作為一醫藥組合物之活性成份，而該醫藥組合物之用途係為治療或/及預防糖尿病、高血糖病症及糖尿病併發症，其中，該糖尿病併發症係包含有糖尿病心臟病、糖尿病血管病變、糖尿病肝臟病變、糖尿病腎病、胰島壞死等。

本發明係揭露一胜肽，其胺基酸序列係包含有SEQ ID No.:1所示序列，具體來說，該胜肽之胺基酸序列係為SEQ ID No.:1、SEQ ID No.:2，或是包含SEQ ID No.:2之序列。

由於本發明所揭胜肽係具有改善高血糖所造成之細胞壞死、細胞凋亡或/及細胞肥大之能力，並且，能夠恢復因糖尿病所引發之胰島細胞的增生能力，因此，藉由投予一有效量之本發明所揭胜肽至一罹患糖尿病或高血糖症之患者，係能夠有效地達到治療糖尿病或其併發症之功效，其中，糖尿病併發症係包含有糖尿病心臟病、糖尿病血管病變、糖尿病肝臟病變、糖尿病腎病、胰島壞死等。

本發明所揭胜肽係得作為一醫藥組合物搭配一藥學上或一食品上能夠接受之載體，被製備成為一組合物。換言之，該胜肽係為該組合物中之活性成份，而該胜肽之胺基酸序列係包含有SEQ ID No.2所示序列，具體來說，該胜肽之胺基酸序列係為SEQ ID No.2。

更進一步來說，該組合物係更包含有另一胜肽，其胺基酸序列係為SEQ ID No.1。

而本發明所揭胜肽係能夠以本發明所屬技術領域之通常方法製備而得，例如生物體中萃取或水解而分離，亦得以胜肽化學合成方式、或是以重組微生物、基因轉殖動物作為產製平台而製備，並且，於發明所屬技術領域且具通常知識者可理解，於不影響本發明所揭胜肽之正常生理作用之情況下，得於胺基酸序列之5’端或3’端額外增加用以修飾之其他胜肽片段，達到提昇本發明所揭胜肽之穩定性或特性，亦能達成本發明之功效。

本發明所揭IF胜肽，係指胺基酸序列為SEQ ID No.:1之胜肽，其說明如下表一所示。

表一：IF胜肽之說明

本發明所揭DF胜肽，該指胺基酸序列為SEQ ID No.:2之胜肽，其說明如下表二所示。

表二：DF胜肽之說明

以下，為能證實本發明所揭技術特徵之功效，將茲舉若干實例並搭配圖式作更進一步說明如后。

實例中之動物試驗係按照IACUC-10518方案進行，並經台灣國立台灣體育大學機構動物照護及使用委員會（IACUC）批准。

實例一：製備短胜肽

以化學合成方式製備本發明所揭IF胜肽及DF胜肽，並且，以HPLC法確認IF胜肽及DF胜肽之純度，結果如第一圖及第二圖所示，顯示藉由化學合成方法製得之胜肽具有高純度。

實例二：細胞培養

自美國典型培養物保藏中心購入H9c2細胞（ATCC，CRL-1446）（Rockville，MD）。H9c2細胞係培養於添加有2mM谷氨酰胺、10％牛血清（Cosmic Calf Serum）、100U/mL盤尼西林及鏈黴素、1mM丙酮酸鈉之DMEM培養基（DMEM），培養條件為：37℃下、潮濕空氣（5％二氧化碳）。

實例三：細胞實驗

將H9c2細胞分為若干組，包含有：

控制組，以正常葡萄糖（22mM）之培養基進行培養；

高糖組：以含高糖（33mM）之培養基進行培養；

低劑量IF胜肽組：以含高糖（33mM）及5μg之IF胜肽之培養基進行培養；

高劑量IF胜肽組：以含高糖（33mM）及10μg之IF胜肽之培養基進行培養；

低劑量DF胜肽組：以含高糖（33mM）及5μg之IF胜肽之培養基進行培養；

高劑量DF胜肽組：以含高糖（33mM）及10μg之IF胜肽之培養基進行培養。

各組細胞分別以其條件培養24小時後，進行後續分析。

實例四：細胞型態分析

將實例三中之各組細胞固定，並以DAPI染劑染色後，再以螢光顯微鏡與UV光顯微鏡分別於波長495nm及520nm觀察，結果如第三圖所示。

由第三圖A及第三圖B之結果顯示，相較於控制組，高糖組之H9c2細胞表面積增加及肌動蛋白絲增長，顯示高糖培養係會誘導細胞肥大；而藉由投予IF胜肽或DF胜肽，能夠使細胞於高糖培養之環境下仍不會過度肥大，亦即能夠抑制細胞肥大，並且，隨著投予劑量之增加，抑制細胞肥大之效果越佳。

由上述結果可知，本發明所揭IF胜肽或DF胜肽係能抑制心肌細胞於高糖環境下發生肥大之型態變化，而能夠達到預防或治療與高血糖相關心臟病之功效。

實例五：分析與心肌細胞肥大相關蛋白質表現

以西方墨點法分析實例三中各組細胞內與心肌細胞肥大相關之蛋白質之表現，包含有NFATC3、ANP、BNP、JNK、P38，結果如第四圖及第五圖所示。

由第四圖及第五圖之結果可知，於高糖環境下，細胞內之NFATC3、JNK、P38之表現量係明顯增加，由於NFATC3係會增加進核作用，會誘使心肌細胞肥大，並且，JNK及P38係會參與誘導心肌細胞肥大路徑之重要因子，因此可知高糖環境下確實會誘導與心肌細胞肥大相關之蛋白質表現，使心肌細胞肥大。

而當於高糖環境下同時投予本發明所揭IF胜肽或DF胜肽時，不僅會抑制細胞內之NFATC3表現量，同時亦會抑制ANP、BNP及磷酸化P38之表現，並且，抑制上述蛋白質表現之效果係會隨著投予胜肽之劑量增加而提昇。由此顯示，藉由投予本發明所揭IF胜肽或DF胜肽係能夠降低心肌細胞被高糖誘導肥大之情形發生，而能夠有效達到預防或治療高血糖相關心臟病之功效。

實例五：分析與心肌細胞凋亡相關蛋白質表現

以TUNEL法及DAPI染色法觀察實例三中各組細胞，並且量化TUNEL陽性表現之細胞數量，結果如第六圖及第七圖所示。更進一步地，以西方墨點法分析各組細胞中與心肌細胞凋亡相關之蛋白質之表現，包含Bid、活化之細胞凋亡酶9（cleaved Caspase 9）及活化之細胞凋亡酶3（cleaved caspase 3），結果如第八圖所示。

由第六圖及第七圖之結果可知，於高糖環境下會使H9c2細胞發生細胞凋亡之現象，而於高糖環境下投予本發明所揭IF胜肽或DF胜肽係能抑制細胞凋亡之現象，顯示本發明所揭IF胜肽或DF胜肽係能夠避免心肌細胞死亡。

再者，由第八圖之結果可知，促進細胞凋亡相關蛋白質：Bid、活化之細胞凋亡酶9及活化之細胞凋亡酶3之表現量係會被高糖環境誘導增加，顯示高糖環境係會使細胞發生細胞凋亡，而相較於此，於高糖環境下投予本發明所揭IF胜肽或DF胜肽係能夠降低促進細胞凋亡相關蛋白質表現，並且，能夠隨著投予劑量之增加而使降低幅度加大。

由上述結果可知，於高糖環境下，本發明所揭胜肽係能夠抑制與心肌細胞凋亡相關蛋白質表現，進而能夠達到治療或預防與高血糖相關心臟病之功效。

實例六：分析與心肌細胞存活相關蛋白質表現

以西方墨點法分析實例三中各組細胞中與心肌細胞存活相關之蛋白質之表現，包含有PI3k、Akt、Bclxl、Bcl2，結果如第九圖及第十圖所示。

由第九圖及第十圖之結果可知，高糖培養係會抑制細胞內如PI3k、Akt等之促細胞存活之蛋白質活化，並且，同時會抑制與抗細胞凋亡相關蛋白質之表現，如Bclxl、Bcl2；而同時投予高糖及本發明所揭IF胜肽或DF胜肽係能夠活化細胞內PI3k、Akt之表現，並且，提高Bclxl、Bcl2之表現。

由上述結果可知，本發明所揭IF胜肽或DF胜肽係能夠於高糖環境下，避免細胞走向凋亡，而能維持存活之狀態，是以，藉由投予本發明所揭IF胜肽或DF胜肽係能夠有效地治療或預防高血糖相關心臟疾病。

實例七：動物試驗

取若干6週齡雄性ICR小鼠，飼養於24±2℃、55±10％濕度、光週期為12小時之環境下。經適應飼養一週後，將小鼠隨機分為6組，各組8隻，其中：

對照組：正常小鼠，未投予任何藥物；

疾病組：以STZ誘導，得到糖尿病模式小鼠，未投予任何藥物；

藥物治療組：以STZ誘導形成糖尿病模式小鼠，並投予阿卡波糖，劑量為20mg / kg /天；

DF胜肽低劑量組：以STZ誘導形成糖尿病模式小鼠，並投予DF胜肽，劑量為25mg/kg/天；

DF胜肽高劑量組：以STZ誘導形成糖尿病模式小鼠，並投予DF胜肽，劑量為50mg/kg/天。

而實驗時間共6週，前2週係先以STZ誘導2週，後4週依照各組飼養及治療條件進行飼養。

分別測量各組小鼠於前2週及後4週之攝食量，結果如第十一圖所示。由此結果顯示各組小鼠之飲食係不受到不同治療條件而有所影響。

實例八：葡萄糖耐受性試驗

取實例七中試驗結束之各組小鼠，進行葡萄糖耐受性試驗，並於試驗後15、30、60、120分鐘時檢測各組小鼠之血糖，結果如第十二圖所示。

由第十二圖之結果可知，STZ誘導之小鼠係無法調控血糖，而經STZ誘導之小鼠於投予DF胜肽後，係能夠調控血糖；並且，比較藥物治療組、DF胜肽低劑量組及DF胜肽高劑量組之結果，顯示本發明所揭DF胜肽於個體內調控血糖之效果係與藥物相近。

實例九：脂質代謝檢測之結果

檢測實例七中試驗結束之各組小鼠血液中總膽固醇、總甘油、胰島素及醣化血色素之含量，結果如第十三圖所示。

由第十三圖之結果可知，糖尿病小鼠血液中總膽固醇、總甘油及醣化血色素係高於正常小鼠，並且，其胰島素含量係明顯低於正常小鼠，顯示糖尿病小鼠之代謝處於不正常之狀態；而當糖尿病小鼠被投予DF胜肽後，其血液中總膽固醇、總甘油及醣化血色素係明顯降低，並且胰島素之含量係被明顯提昇。更進一步地，將DF胜肽低劑量組及DF胜肽高劑量組分別與對照組及藥物治療組相比，可知投予DF胜肽係能夠調控糖尿病小鼠之脂質及糖份代謝，使之血液中代謝相關數值恢復至與正常小鼠相近，並且，DF胜肽之調控脂質與糖份代謝之能力係較市售糖尿病藥物佳。

實例十：組織切片染色結果

犧牲實例七中試驗結束之各組小鼠，並取其肝臟、腎臟、心臟、肺臟、脂肪組織、胰臟，再進行組織切片及H&E染色，結果如第十四圖所示。

由第十四圖之結果可知，糖尿病小鼠之心臟、腎臟、胰臟係被破壞，具體來說，由各組小鼠肺組織切片顯示，對照組小鼠係具有正常的肺泡和細支氣管，但疾病組小鼠之肺部組織切片係有淋巴細胞浸潤之現象。

由各組小鼠之肺臟切片可知，疾病組小鼠之腎臟係具有腎小球繫膜擴張、腎小球基質空泡化之現象。而相較於疾病組小鼠，DF胜肽低劑量組及DF胜肽高劑量組小鼠心臟、腎臟、胰臟等組織型態戲箱用DF和APPH治療4週後，病理形態學改變得到有效改善。

比對對照組之肝臟組織切片，於疾病組小鼠之肝臟組織切片中可發現正常結構肝細胞減少，並且有肝壞死、細胞核凋亡、細胞浸潤、水腫及中央靜脈充血等現象；而DF胜肽低劑量組及DF胜肽高劑量組小鼠之肝臟型態相較於糖尿病小鼠係具有明顯改善。

再者，由各組小鼠心臟組織切片圖可知，糖尿病小鼠之心肌細胞明顯肥大，並且心臟組織中具有較多之間質空間，而DF胜肽低劑量組及DF胜肽高劑量組中，其心臟細胞之結構型態係明顯優於糖尿病小鼠，並且比藥物治療組佳。

由各組小鼠胰腺組織切片顯示，對照組小鼠之胰腺表現為圓形區域，並且，其細胞排列為由毛細血管分開之不規則、具有分支及吻合線之型態，此為胰腺組織正常之型態。而於疾病組小鼠之胰腺組織切片中可發現，胰島正逐漸退行，並且，特別是胰島中心，其大小和數量係為明顯減少。就藥物治療組小鼠之胰腺切片圖來看，顯示投予藥物係無法改善STZ誘導之糖尿病模式對於胰島或胰腺細胞之破壞。相較於疾病組小鼠，DF胜肽低劑量組及DF胜肽高劑量組小鼠之胰腺係恢復具有略成圓形區域之型態。

由上述結果可知，糖尿病係會造成個體許多器官或組織受損，而投予本發明所揭胜肽至罹患糖尿病或與其相關疾病之個體，係能夠避免細胞凋亡或壞死，維持細胞維持正常結構，並且，能夠使細胞結構恢復至類似於正常細胞結構。換言之，本發明所揭胜肽係能夠達到治療或預防糖尿病及與其相關病症，如腎臟病、心臟病、肝臟壞死等之功效，並且具有恢復胰島細胞之功效。

實例十一：免疫組織染色之結果

藉由免疫組織染色法觀察實例七中各組小鼠分泌胰島素之β細胞及表現胰高血糖素之細胞群，結果如第十五圖所示。

由第十五圖之結果顯示，對照組小鼠於β細胞之細胞質中係有顯示為深棕色之胰島素分泌；而於疾病組小鼠之免疫組織切片中，其能夠分泌胰島素之β細胞的數量係顯著減少；於藥物治療組小鼠中，其分泌胰島素之β細胞的數量係未明顯增加；而相較於疾病組或藥物治療組，DF胜肽低劑量組及DF胜肽高劑量組小鼠無論是分泌胰島素之β細胞，或是分泌胰高血糖素之細胞群，其數量皆明顯增加。

由上述結果可知，本發明所揭胜肽係不僅能夠避免胰島β細胞及分泌胰高血糖素之細胞群受損，並且對於已經受損之胰島β細胞及分泌胰高血糖素之細胞群，係具有治療之功效。

實例十二：免疫螢光染色之結果

以免疫螢光染色法觀察實例七中各組小鼠胰島細胞中與細胞增生相關之生物標幟物：PCNA之表現，結果如第十六圖所示。

由第十六圖之結果可知，疾病組小鼠之胰島細胞係未表現PCNA，藥物治療組小鼠之胰島細胞中表現PCNA者係十分少。相較於疾病組或藥物治療組，DF胜肽低劑量組及DF胜肽高劑量組小鼠之胰島細胞中係明顯有PCNA之表現（箭頭處），並且，隨著劑量增加，PCNA之表現數量越多。

由此結果顯示，糖尿病確實會造成胰島細胞死亡、無法增生，而藉由投予本發明所揭胜肽係能夠有效保護胰島細胞持續被破壞，並且能夠恢復胰島細胞之增生能力，達到治療糖尿病及其相關疾病之功效。

無

第一圖係為以HPLC分析IF胜肽之結果。第二圖係為以HPLC分析DF胜肽之結果第三圖A係經IF胜肽處理之各組細胞以DAPI染色後之結果。第三圖B係經DF胜肽處理之各組細胞以DAPI染色後之結果。第四圖A係以西方墨點法觀察經IF胜肽處理之各組細胞中與心肌細胞肥大相關之蛋白質之表現（一）。第四圖B係以西方墨點法觀察經DF胜肽處理之各組細胞中與心肌細胞肥大相關之蛋白質之表現（一）。第五圖A係以西方墨點法觀察經IF胜肽處理之各組細胞中與心肌細胞肥大相關之蛋白質之表現（二）。第五圖B係以西方墨點法觀察經DF胜肽處理之各組細胞中與心肌細胞肥大相關之蛋白質之表現（二）。第六圖A係經IF胜肽處理之各組細胞以TUNEL法觀察之結果。第六圖B係為量化第六圖A中各組中TUNEL陽性表現之細胞數量的結果。第七圖A係經DF胜肽處理之各組細胞以TUNEL法觀察之結果。第七圖B係為量化第七圖A中各組中TUNEL陽性表現之細胞數量的結果。第八圖A係以西方墨點法觀察經IF胜肽處理之各組細胞中與促進細胞凋亡相關蛋白質之表現。第八圖B係以西方墨點法觀察經DF胜肽處理之各組細胞中與促進細胞凋亡相關蛋白質之表現。第九圖A係以西方墨點法觀察經IF胜肽處理之各組細胞中與心肌細胞存活相關蛋白質之表現（一）。第九圖B係以西方墨點法觀察經DF胜肽處理之各組細胞中與與心肌細胞存活相關蛋白質之表現（一）。第十圖A係以西方墨點法觀察經IF胜肽處理之各組細胞中與心肌細胞存活相關蛋白質之表現（二）。第十圖B係以西方墨點法觀察經DF胜肽處理之各組細胞中與與心肌細胞存活相關蛋白質之表現（二）。第十一圖A係為各組小鼠經不同處理前兩週之攝食量的測量結果。第十一圖B係為各組小鼠經不同處理後四週之攝食量的測量結果。第十二圖係為各組小鼠進行葡萄糖耐受性試驗之結果。第十三圖A係為各組小鼠血液中總三酸甘油脂之測量結果。第十三圖B係為各組小鼠血液中總膽固醇之測量結果。第十三圖C係為各組小鼠血液中胰島素之測量結果。第十三圖D係為各組小鼠血液中醣化血色素之測量結果。第十四圖係為各組小鼠各部位組織切片染色之結果。第十五圖A係為各組小鼠胰島β細胞經免疫組織染色之結果。第十五圖B係為各組小鼠表現胰高血糖素之細胞經免疫組織染色之結果。第十六圖係為各組小鼠胰島細胞經免疫螢光染色之結果。

Claims

一種胜肽，其胺基酸序列係包含有SEQ ID No.2所示序列。
依據申請專利範圍第1項所述胜肽，其中，該胜肽之胺基酸序列係為SEQ ID No.2。
一種胜肽組合物，其包含有至少一有效量之胜肽，其中，該胜肽之胺基酸序列係包含有SEQ ID No.2所示序列。
依據申請專利範圍第3項所述胜肽組合物，其中，該胜肽之胺基酸序列係為SEQ ID No.2。
依據申請專利範圍第3或4項所述胜肽組合物，其更包含有另一胜肽，其胺基酸序列係為SEQ ID No.1。
一種將申請專利範圍第1或2項所述胜肽用於製備治療或/及預防糖尿病之醫藥組合物之用途。
依據申請專利範圍第6項所述用途，其中，該醫藥組合物係更包含有另一胜肽，其胺基酸序列係為SEQ ID No.1。
一種將申請專利範圍第1或2項所述胜肽用於製備治療或/及預防糖尿病併發症之醫藥組合物之用途。
依據申請專利範圍第8項所述用途，其中，醫藥組合物係更包含有另一胜肽，其胺基酸序列係為SEQ ID No.1。
依據申請專利範圍第8項所述用途，其中，該糖尿病併發症係選自由糖尿病心臟病、糖尿病血管病變、糖尿病肝臟病變、糖尿病腎病及胰島壞死所組成之群。