CN105566459A - 可抑制RAGE与Aβ的结合或能与Aβ/RAGE结合的富脯胺酸胜肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种含富脯胺酸胜肽产品,此产品系取自一乳源而非基因合成。此产品具有多个富脯胺酸胜肽,这些富脯胺酸胜肽可抑制RAGE与Aβ结合,或能与Aβ/RAGE结合。此产品可用于减少因RAGE或Aβ引起疾病的风险,如神经退化性疾病或糖尿病等。本发明亦提供此产品的制造方法。
Description
技术领域
本发明系关于一种富脯胺酸胜肽(PRP)产品,取自一乳源而非基因合成的,特别涉及可抑制RAGE与Aβ的结合或能与Aβ/RAGE结合的富脯胺酸胜肽产品。
背景技术
全球失智症人口已超过3,500万,阿兹海默症已为先进国家人口老化的共同问题。目前市场上有银杏萃取物EGb761作为防止老人失智症的保健食品,于中草药销售量占欧美第一名。惟银杏萃取物EGb761的预防效果经常受到质疑。此外,许多研究报导显示,常食乳品可降低老人失智症的风险。研究报导也显示乳品中所含有富脯胺酸胜肽(proline-richpeptide,PRP),为有助于改善阿兹海默症患者脑部功能的主因。因此,市面上出现从初乳中萃取初乳素(Colostrinin)的产品,用来防治阿兹海默症。初乳是由雌性哺乳动物乳房在分娩后最初数天内产出的黄色粘稠液体。分娩数天后它将被成熟母乳替代。与成熟母乳相比,初乳中含有丰富的生长因子和免疫球蛋白等机能性成分,特别是PRP的含量比成熟母乳多很多。美国专利US8,168,585有说明如何从初乳中萃取初乳素(Colostrinin)的方法。然而,此等初乳素产品虽含有浓度高于初乳的PRP,却有其它缺点。举例而言,此等初乳素产品须从初乳中萃取,而初乳却是分娩后的短暂期间才有,且为初生仔畜健康所必需。此等初乳素产品原料来源受限,产品价格因此居高不下。因此,市场上仍期待有更创新技术解决上述问题。
发明内容
本发明提供一种含有富脯胺酸胜肽(proline-richpeptide,PRP)的产品,此产品具有可抑制RAGE与Aβ的结合或能与Aβ/RAGE结合的功能。此产品可以一般的乳品产制,不受限于初乳。此产品可减少因RAGE或Aβ引起疾病的风险,如神经退化性疾病或糖尿病等。
本发明系将一般乳蛋白有限分解后,利用特定单源抗体分离出具有能与Aβ或RAGE结合,或能抑制RAGE与Aβ结合的富脯胺酸胜肽。详言之,本发明利用Aβ容易以疏水性聚集,而RAGE含高量脯胺酸区域等特性,设定特定的氨基酸序列条件。依据所设定的条件搜查乳蛋白的氨基酸序列,以选定欲合成的PRP的氨基酸序列。然后进一步合成各种含所选定PRP序列的胜肽。藉由所合成胜肽,一方面制造各合成胜肽的单源抗体;一方面检测各合成胜肽与Aβ或RAGE的结合力,以及抑制RAGE与Aβ结合的能力。接着,本发明将具有与Aβ或RAGE结合功能的合成胜肽的单源抗体,与亲和性色层分析的树脂结合并制成亲和性管柱。本发明于另一方面将一般乳品进行有限分解以产制含多种乳胜肽的水解物。然后,使含多种乳胜肽的水解物流经上述的亲和性管柱,藉此收集特定功能性的乳源富脯胺酸胜肽,以制成富脯胺酸胜肽的产品。
本发明尚包含其他各方面及各种实施例,以解决其他问题并合并上述的各方面详细揭露于以下实施方式中。
图式简单说明
图1为本发明的方法的流程图。
图2A及图2B为具有Pro-X-X-Pro基序的PRP结构示意图;图2C为具有Pro-X-X-X-Pro基序的PRP结构示意图,其中Pro代表脯胺酸,X代表任一氨基酸。
图3为在步骤M1,步骤M2及步骤M3取样的电泳分析结果。
图4显示各种合成PRP与RAGE结合的实验结果。
图5A与5B显示合成PRP与Aβ结合的实验结果。
图6A与6B显示合成PRP与RAGE结合的实验结果。
图7A与7B显示合成PRP抑制RAGE与Aβ结合的实验结果。
图8A显示乳源功能性PRP能与Aβ及RAGE结合的实验结果;图8B显示乳源功能性PRP能抑制RAGE与Aβ结合的实验结果。
图9显示本发明的酪蛋白水解物过滤与萃取的示意图。
实施方式
以下将参考所附图式示范本发明的较佳实施例。所附图式中相似元件系采用相同的元件符号。应注意为清楚呈现本发明,所附图式中的各元件并非完全按照实物的比例绘制,而且为避免模糊本发明的内容,以下说明亦省略习知零组件、相关材料、及其相关处理技术。
本发明的研发动机出自于对阿兹海默症的主要病因的理解与研究。研究显示,存在人体中名为β-淀粉样蛋白(β-AmyloidProtein,Aβ)的蛋白质在阿兹海默症当中扮演着很重要的角色。Aβ在人类脑中是自然产生的。当人类老化时,Aβ可能过多而在脑中聚集,形成斑块(senileplaque)。目前了解阿兹海默症的病因主要有三:(1)细胞外Aβ聚集成球聚体或斑块;(2)神经细胞内Tau蛋白过度磷酸化,形成神经纤维缠结(neurofibrillarytangle);(3)发炎或氧化直接或间接伤害神经细胞。这三种原因中,Aβ的聚集被认为是阿兹海默症的关键病因。
详言之,Aβ系由位于细胞膜上的β-淀粉样蛋白前体(amyloidprecursorprotein,APP)经β-secretase与γ-secretase所分解产生。Aβ含有42或40个氨基酸的分子。以下显示含有42个氨基酸的Aβ分子
1Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-
21Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-
41Ile-Ala
人类脑脊液与血浆中Aβ1-40比Aβ1-42分别多10倍与1.5倍。但Aβ1-42末端多两个疏水性氨基酸,聚集较快,也是斑块的主要成分。Aβ含有Lys16~Glu22序列会自动聚集。Gly29~Val40序列则以反向排列β折板(antiparallelβ-sheet)紧密形成球聚体(globulomers)。Aβ含高量的疏水性氨基酸,疏水性结合在其分子间的聚集扮演重要的角色。
RAGE为进阶糖化产物的受体(receptorforadvancedglycationendproduct,RAGE)。糖尿病或高血糖产生的进阶糖化产物(advancedglycationendproduct,AGE)主要经由血脑屏障(blood-brainbarrier,BBB)内皮细胞上的RAGE进入脑部而伤害神经。RAGE也会和Aβ结合。人类脑脊液中含Aβ2.5ng/ml,血浆含0.9ng/ml。周边血液的Aβ可经BBB的RAGE运入脑内。Aβ与RAGE的结合也会伤害细胞,破坏BBB的紧密连结,失去血脑屏障的功能。因此,抑制RAGE与Aβ结合的药物即可望用于防治因血脑屏障失能所造成的疾病,如阿兹海默症等。
以下显示RAGE分子的氨基酸序列。从RAGE分子的氨基酸序列可知RAGE分子含高量脯胺酸。
1maagtavgawvlvlslwgavvgaqnitarigeplvlkckgapkkppqrlewklntgrtea
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181petglftlqselmvtparggdprptfscsfspglprhralrtapiqprvwepvpleevql
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301cvathsshgpqesravsisiiepgeegptagsvggsglgtlalalgilggIgtaalligv
361ilwqrrqrrgeerkapenqeeeeeraelnqseepeagesstggp
一般而言,PRP的二级结构主要为多脯胺酸II螺旋(polyprolineIIhelix)。不同于α螺旋,为伸展型的左手螺旋(lefthandhelix),其能与其他分子的接触面积较多。另外,脯胺酸的α-NH2与自身的δ-C形成共价键,无法如α螺旋形成分子内氢键,而且其所游离出来的-C=O能够与其它分子形成分子间的氢键。因此,PRP较容易与其他蛋白质进行非特异性的结合。再者,脯胺酸本身为疏水性氨基酸,故PRP如再多含几个疏水性氨基酸,则容易与其他分子的疏水性区域以疏水性交互作用结合。
依据前述可知,Aβ分子主要靠疏水性聚集,而RAGE分子含有PRP区域。因此,本发明的特点之一在于寻找一种特定PRP,此特定PRP能与Aβ结合,以降低周边血液游离Aβ藉由RAGE进入脑部。此外,此PRP亦能与RAGE结合,以阻挠RAGE与Aβ结合。能与Aβ或RAGE其中之一结合的PRP都在本发明范围中。此特定的PRP具有至少以下的优点之一:减少周边血液的Aβ运入脑中;及减少Aβ与RAGE结合导致血脑屏障失能。
以下依据一较佳实施例并参考图1,说明本发明的富脯胺酸胜肽产品的制造步骤。
步骤A:选定欲合成PRP的氨基酸序列
查询常食乳品所含的各种乳蛋白的各种氨基酸序列,从其中选定一条或多条序列作为欲合成PRP的氨基酸序列。从各种乳蛋白的氨基酸序列可发现,β-酪蛋白、α-酪蛋白、κ-酪蛋白等都含有若干片段具有较多脯胺酸(proline)与疏水性氨基酸,其中尤以β酪蛋白含量最多。因此,本发明的此较佳实施例是从β酪蛋白中选定欲合成PRP氨基酸序列。以下显示山羊乳β酪蛋白氨基酸序列。举例而言,欲合成PRP的氨基酸序列可为YPFTGPIPNSLPQN(系选自羊乳β酪蛋白75~88序列)及PFPKYPVEPFT(系选自羊乳β酪蛋白125~135序列)等。本发明不以此为限。
61GlnAspLysIleHisProPheAlaGlnAlaGlnSerLeuValTyrProPheThrGlyPro
81IleProAsnSerLeuProGlnAsnIleLeuProLeuThrGlnThrProValValValPro
101ProPheLeuGlnProGluIleMetGlyValProLysValLysGluThrMetValProLys
121HisLysGluMetProPheProLysTyrProValGluProPheThrGluSerGlnSerLeu
141ThrLeuThrAspValGluLysLeuHisLeuProLeuProLeuValGlnSerTrpMetHis
161GlnProProGlnProLeuSerProThrValMetPheProProGlnSerValLeuSerLeu
181SerGlnProLysValLeuProValProGlnLysAlaValProGlnArgAspMetProIle
201GlnAlaPheLeuLeuTyrGlnGluProValLeuGlyProValArgGlyProPheProIle
可基于要与Aβ或RAGE其中之一结合为考量,设定各种合适条件来选定欲合成PRP的氨基酸序列。以β酪蛋白(但不限于此)为例,欲合成PRP的氨基酸序列的选定条件较佳为以下项目的至少其中之一:
(1)欲合成PRP的氨基酸总个数为20个或20个以下。
(2)以氨基酸总个数为准,欲合成PRP中脯胺酸的个数至少占有15%。
(3)以氨基酸总个数为准,欲合成PRP中疏水性氨基酸的个数至少占有45%。
(4)欲合成PRP具有Pro-X-X-Pro基序(motif)或Pro-X-X-X-Pro基序,其中Pro代表脯胺酸,X代表任意氨基酸。
20种氨基酸中,疏水性氨基酸有8个,如下:Ala,Val,Leu,Ile,Pro,Phe,Trp,Met。一般而言,PRP每个螺旋含三个氨基酸,侧基向外而形成三角柱状。位于平面与其他分子接触的脯胺酸排列可能为Pro-X-X-Pro(如图2A或2B所示),或Pro-X-X-X-Pro(如图2C所示)。细胞内协助讯号分子传递的SH3-结构域(SH3domain),其结合的序列即Pro-X-X-Pro。脯胺酸位于三角柱分子螺旋结构的同一平面,脯胺酸本身为疏水性,且其独特游离的胜肽键的C=O能形成分子间的氢键,增加与其他分子的结合力。以Pro-X-X-Pro基序或Pro-X-X-X-Pro基序搜寻乳中主要蛋白质的氨基酸序列,可发现β酪白含11个为最多,αs1酪蛋白有2个,κ酪蛋白有1个,IgA抗体的轻链(lightchain)含2个,乳铁蛋白(lactoferrin)有1个。β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)和α-乳白蛋白(α-lactalbumin)则没有Pro-X-X-Pro或Pro-X-X-X-Pro基序。
步骤B:制造具有A步骤所选定的氨基酸序列的合成PRP
以习知的胜肽合成技术合成经A步骤所选定的氨基酸序列的PRP。举例而言,可选定合成羊乳β酪蛋白75~88序列的YPFTGPIPNSLPQN胜肽、125~135序列的PFPKYPVEPFT胜肽等。可自行执行此步骤或委托合格的生技公司完成。
步骤C:制造合成PRP的单源抗体
本发明的此步骤主要在于制造步骤B所取得的合成PRP(经胜肽合成)的单源抗体。可用习知的单源抗体制造技术来完成此步骤。此步骤的简要说明为:首先将胜肽合成的各种PRP分别与KLH或BSA连结,免疫小鼠并制作融合瘤。经酵素免疫分析法(ELISA)挑出对此PRP具专一性的阳性细胞株,并以培养液繁殖或制造腹水,生产单源抗体。以50%饱和硫酸铵沉淀,再经proteinG管柱纯化抗体。
步骤D:筛选功能性合成PRP
本发明的此步骤主要是将步骤B所取得的各种合成PRP进行功能性检测,以筛选出具有与能Aβ或RAGE结合的功能,或能抑制RAGE与Aβ结合的功能的PRP。于此实施例,筛选方法是使用酵素免疫检测法,但本发明不以此为限。使用酵素免疫检测法的举例说明如下。首先,可将步骤B所取得的各种合成PRP分别墨点在硝化纤维素膜(nitrocellulosemembrane,NC膜)上,以牛血清白蛋白(BSA)进行阻断后再与RAGE或Aβ培养,PBST清洗后再加anti-RAGE或anti-Aβ的抗体培养,清洗后再加抗小鼠IgG-HRP酶标记抗体(antimouseIgG-HRP),以ECL呈色。能与NC膜上的PRP结合则会呈色,否则不呈色。
图4显示各种合成PRP(a~g)与RAGE结合的实验结果。a~g为各合成的PRP墨点于NC膜上,与1ml700ng/mlRAGE培养,以RAGE抗体侦测。如图所示,有的呈色较强显示亲和力较强,有的几乎不呈色显示不结合。可选择呈色较强的PRP和其单源抗体进一步研究。
图5A以不同剂量的PRP墨点于NC膜,加Aβ培养,以Aβ抗体侦测,呈色随PRP浓度增加而增加(dose-dependent)。图5B改以不同剂量的Aβ墨点于NC膜,加PRP培养,以自制的PRP单源抗体(参考步骤C)侦测,呈色亦随墨点量增加而增加,证实此PRP能与Aβ结合。
图6A以不同剂量的PRP墨点于NC膜,加RAGE培养,以RAGE抗体侦测,呈色随PRP浓度增加而增加。图6B改以不同剂量的RAGE墨点于NC膜,加PRP培养,以自制的PRP单源抗体(参考步骤C)侦测,呈色亦随墨点量增加而增加,证实此PRP能与RAGE结合。
图7A以RAGE墨点于NC膜,加Aβ或Aβ事先混合PRP,以Aβ抗体侦测。Aβ混合PRP者呈色较弱。图7B改以Aβ墨点于NC膜,加RAGE或RAGE事先混合PRP,以RAGE抗体侦测,亦是RAGE混合PRP者呈色较弱,证实此PRP能抑制RAGE与Aβ结合。
关于步骤C与步骤D的实施顺序,较佳的先C后D,但也可先D后C或同时进行,可视实际状况的需要而定。
步骤E:取得功能性合成PRP的单源抗体
依据步骤D的筛选结果,自步骤C所获得的各种单源抗体中取得具有与能Aβ或RAGE结合的功能、或能抑制RAGE与Aβ结合的功能的合成PRP的单源抗体。
步骤F:制造具功能性合成PRP单源抗体的亲和性管柱
本发明此步骤主要在于:制造具上述功能的合成PRP单源抗体的色层分析管柱。此步骤系继步骤C、D及E之后进行。可用习知的制造技术来完成此步骤,简要说明如下。首先,取上述的功能性合成PRP单源抗体,将其与合适的色层分析树酯结合后,装入管柱内即形成功能性合成PRP单源抗体的亲和性管柱。步骤F所完成的亲和性管柱将供步骤M所取得的小胜肽所用。
步骤M:从乳品中提取小胜肽
步骤M主要是为获得乳品中的各种小胜肽分子。详言之,本发明的步骤M用来分解一般乳品中乳蛋白的成分,以收集经分解后所产生的各种小胜肽,其中可能包含各种PRP。步骤M与之前所述的本发明的步骤A,B,C,D,E及F等各步骤是分开进行的。可在进行步骤M时同时进行步骤A,B,C,D,E及F的任一步骤,或视需要在之前之后进行。进行步骤M取得的各种小胜肽将于后续步骤G中透过亲和性管柱于其中萃取出具功能性的乳源富脯胺酸胜肽,即为本发明的产品。以下详细说明本发明步骤M。
步骤M所指的乳品可为一般的乳品,如前述不受限于初乳。乳品中PRP的数量以在β酪蛋白所含最多。以酪蛋白为例,乳中的酪蛋白系由上万个分子聚集呈直径约140nm的酪蛋白胶粒,外层包覆κ-酪蛋白,内层主要由αs1-酪蛋白、β酪蛋白、钙磷奈米小粒组成。习知技术分解酪蛋白是直接添加酵素或微生物发酵水解蛋白质。惟此种作法可能使外层胶粒的蛋白过度分解,而内层胶粒蛋白尚未分解。况且所分离酪蛋白胶粒也难控制均一的分解至需求的小胜肽。本发明采用与习知不同的作法,本发明的作法包含酪蛋白胶粒分离、酵解,连续通过滤膜将小胜肽滤出,而大分子胜肽包括酵素则继续流回培养槽分解。本发明设计大分子胜肽流回培养槽分解的步骤可将乳品中所含的小胜肽充分取出,并避免过度分解,有效增加产能。
以下详细说明本发明步骤M的方法与结果:
步骤M1:乳品提取酪蛋白
此步骤主要是将乳品经酸化或凝乳酶处理以取出沉淀的酪蛋白。举例而言,使用一般正常生乳、未均质的杀菌乳或脱脂还原乳为原料乳,以羊乳含β酪蛋白较多为佳。将原料乳离心脱脂。加凝乳酶使凝乳,排除乳清。或加酸调羊乳pH4.2(牛乳则调pH4.6),沉淀分离酪蛋白。可选择性地将上述取得的酪蛋白进一步解离。举例而言,酪蛋白重新悬浮于溶液如10mMNa-phosphate,pH7.5中。添加柠檬酸钠或EDTA(乙二胺四乙酸),或以高功率超音波如20kHz50W震碎胶粒,使白色样品变淡。上述解离酪蛋白胶粒的步骤可提高酵素分解效率,可视需要选择使用。
步骤M2:有限酵解酪蛋白以生成小胜肽
添加蛋白分解酵素或以微生物发酵分解步骤M1所产生的酪蛋白。以添加胰蛋白酶(trypsin),于pH7.5,50℃反应为佳。酵素分解中的酪蛋白水解物,可于定温震荡或搅拌培养以生成小胜肽。
步骤M3:藉由过滤以收集小胜肽
小胜肽是指将酪蛋白水解物经过一特定过滤膜过滤而收集到的产物。过滤膜的孔径取决于所需小胜肽的功能或其他需求而定。在此实施例中,过滤膜的孔径设定为可过滤出分子量在5kDa以下的分子。可使用合适过滤器将酪蛋白水解物中的小胜肽滤过收集之。过滤器可为扫流式(tangentflow)过滤膜或其它合适装置。图9显示步骤M2所酵解的酪蛋白水解物91,经由管子92以泵浦93打到过滤器95,以过滤分离出小胜肽。
图3呈现分别在步骤M1,步骤M2及步骤M3取样并进行电泳分析的结果。详言之,取经过步骤M1分离的酪蛋白、再经过步骤M2的酵解且过滤前、及再经过步骤M3的5kDa过滤后的三种样品,使其分别通过10-16.5%gel的凝胶电泳Tricine-SDS(十二烷基硫酸钠,sodiumdodecylsulfate)-PAGE(聚丙烯酰胺胶体电泳PolyAcrylamideGelElectrophoresis)加以分离,并以CBG-250染色所得结果如图3所示。如图所示,酪蛋白样品的上层呈色带为αs1-酪蛋白与β酪蛋白,其实际分子量为23与24.5kDa,比标准分子量移动得慢,主因含有较多疏水性氨基酸侧基。第二样品加酵素处理酪蛋白明显被分解。第三样品经5kDa滤膜过滤后的样品在大于5kDa仍有呈色带,可能也是含较多疏水性氨基酸之故,整体仍可看出比过滤前的样品少了较大的分子。
步骤M4:引导无法过滤的成分回到步骤M2或M1
步骤M4为继步骤M3后将无法过滤的成分,譬如未适度分解的酪蛋白以及胰蛋白酶等引导流回步骤M2的培养槽继续酵解。如有需要也可引导流回步骤M1进行处理。图9显示无法通过过滤器95的成分,经由管子96留回酪蛋白水解物91中继续酵解。
步骤G:萃取功能性乳源PRP(即为富脯胺酸胜肽产品)
步骤G主要在于:从乳品中萃取出具有能与Aβ或RAGE结合功能,或能抑制RAGE与Aβ结合功能的PRP。更详言之,此步骤系从乳品分解所得的小胜肽中萃取出具有上述功能的PRP。步骤G是利用步骤F所制造的单源抗体亲和性管柱进行萃取。所以,相较于习知的方法,本发明G步骤的萃取方法,具有针对特定功能的PRP结构的专一性。换言之,经G步骤萃取所得的PRP为能与Aβ或RAGE结合,或能抑制RAGE与Aβ结合的功能性PRP。
可用各种合适技术来完成步骤G。以下是本实施例执行此步骤的简要说明。首先将步骤M所产制含小胜肽溶液通入步骤F所制造的管柱内。此管柱将抓住具有与此管柱的单源抗体所对应PRP相同抗原表位(epitope)的胜肽。流经管柱的溶液中含有没有被管柱抓住的胜肽,其大部分胜肽都是没有相同抗原表位的胜肽或其他杂质。可将此流经管柱的溶液排出不用,并以磷酸盐缓冲液PBS清洗管柱内残留未结合的胜肽。之后再以20%乙醇或pH2.7溶液,或其他合适溶液(视各支单源抗体结合的特性而定),洗出结合于管柱的功能性PRP。可称此功能性PRP为乳源功能性PRP,以有别于之前于步骤B中所得到以仪器等合成的合成PRP。图9显示步骤M所产制含小胜肽溶液经由管子97流入单源抗体亲和性管柱98,而获得乳源功能性PRP90。
步骤H:检测功能性乳源PRP的功能
可将步骤G获得的乳源功能性PRP墨点于NC膜,与Aβ或RAGE培养,再分别以Aβ单源抗体或RAGE单源抗体检测,藉此证实乳源功能性PRP能与Aβ及RAGE结合,如图8A所示。另外,将Aβ墨点于NC膜,与RAGE或RAGE与乳源PRP预混合的溶液培养,再以RAGE单源抗体检测,结果显示RAGE与乳源PRP预混合者呈色较淡,证实乳源功能性PRP亦可抑制RAGE与Aβ结合,如图8B所示。
本发明的乳源功能性PRP90是从乳品中以步骤F所制造的单源抗体亲和性管柱进行萃取所得,因此乳源功能性PRP90所含的胜肽理论上皆应具有可抑制RAGE与Aβ的结合或能与Aβ/RAGE结合的专一性功能。实质而言,乳源功能性PRP90取自结合于管柱的功能性PRP,故其所含的具功能性胜肽数量相当高,特别比没有经过单源抗体亲和性管柱萃取的产品数量高。如前述,在乳源功能性PRP90制程中,有以PBS溶液清洗掉没有相同抗原表位的胜肽,故乳源功能性PRP90所含不具功能性胜肽数量则是相当低,特别比没有经过单源抗体亲和性管柱萃取的产品数量低。目前市面上的初乳素(Colostrinin)等PRP产品都是没有经过单源抗体亲和性管柱来移除不具功能性的胜肽。本发明乳源功能性PRP90含有相对高的功能性胜肽数量,相对低的不具功能性胜肽数量,所以本发明乳源功能性PRP90的产品只要取配制成很低的浓度就可以测得与Aβ或RAGE结合的功能,或抑制RAGE与Aβ结合的功能。举例而言,采用BCA蛋白质浓度测定法,本发明乳源功能性PRP90其浓度只要达到100μg/ml就可测得与Aβ或RAGE结合的功能,或抑制RAGE与Aβ结合的功能。
应注意以上只例示本发明一较佳实施例。上述的实施例系为说明本发明并非用以限定本发明。凡其它未脱离本发明所揭示的精神下所完成的等效改变或修饰,均应包含在申请专利范围内。
符号说明:
步骤A:选定欲合成PRP的氨基酸序列
步骤B:制造具有A步骤所选定的氨基酸序列的合成PRP
步骤C:制造合成PRP的单源抗体
步骤D:筛选功能性合成PRP
步骤E:取得功能性合成PRP的单源抗体
步骤F:制造具功能性合成PRP单源抗体的亲和性管柱
步骤M:从乳品中提取小胜肽
步骤M1:乳品提取酪蛋白
步骤M2:有限酵解酪蛋白以生成小胜肽
步骤M3:藉由过滤以收集小胜肽
步骤M4:引导无法过滤的成分回到步骤M2或M1
步骤G:萃取功能性乳源PRP
步骤H:检测功能性乳源PRP的功能
90乳源功能性PRP
91酪蛋白水解物
92管子
93泵浦
95过滤器
96管子
97管子
98单源抗体的亲和性管柱
Claims (10)
1.一种制造富脯胺酸胜肽(PRP)产品的方法,该PRP产品具有可抑制进阶糖化产物受体(RAGE)与β-淀粉样蛋白(Aβ)的结合、或能与Aβ或RAGE结合的功能,该方法包含以下步骤:
步骤A:从乳蛋白氨基酸序列中选定欲合成PRP的氨基酸序列;
步骤B:制造具有所选定的氨基酸序列的合成PRP;
步骤C:制造该合成PRP的单源抗体;
步骤D:从该合成PRP筛选具该功能的功能性合成PRP
步骤E:取得该功能性合成PRP的单源抗体;
步骤F:制造该单源抗体的亲和性管柱;
步骤M:从乳品中提取小胜肽;以及
步骤G:将该小胜肽通过该亲和性管柱以萃取该PRP产品。
2.如权利要求1所述的方法,其中该步骤A更包含将以下条件的至少其中之一作为选定标准:
该欲合成PRP的氨基酸总个数为20个或20个以下;
以氨基酸总个数为准,该欲合成PRP中脯胺酸的个数至少占有15%;
以氨基酸总个数为准,该欲合成PRP中疏水性氨基酸的个数至少占有45%;及
该欲合成PRP具有Pro-X-X-Pro基序或Pro-X-X-X-Pro基序,其中Pro代表脯胺酸,X代表任一氨基酸。
3.如权利要求1所述的方法,其中该步骤M更包含以下步骤:
对该乳品进行酵素分解以获得酪蛋白水解物;及
将该酪蛋白水解物过滤以取得分子量在特定范围的该小胜肽。
4.如权利要求3所述的方法,其中该步骤M更包含以下步骤:
将未通过过滤的该酪蛋白水解物引导回该酵素分解步骤。
5.如权利要求3所述的方法,其中该步骤M更包含以下步骤:
以酸沉淀或凝乳酶凝乳先分离该乳品。
6.如权利要求5所述的方法,其中该步骤M更包含以下步骤:
以钙螯合剂或超音波处理该乳品。
7.如权利要求3所述的方法,其中该步骤M更包含以下步骤:使用可过滤出特定分子量以下的分子的过滤膜进行过滤。
8.一种富脯胺酸胜肽(PRP)产品,该PRP产品包含以下特征:
该PRP产品取自非基因合成的胜肽或乳源;
该PRP产品具有能与Aβ或RAGE结合、或能抑制RAGE与Aβ的结合的功能;及
相较于没有经过单源抗体亲和性管柱萃取的产品,该PRP产品具有该功能的富脯胺酸胜肽数量较高,具有不具该功能的富脯胺酸胜肽数量较低。
9.如权利要求8所述的产物,其中以BCA蛋白质浓度分析,该PRP产品的浓度只要达到100μg/ml即可测得与Aβ或RAGE结合,或抑制RAGE与Aβ结合的功能。
10.一种富脯胺酸胜肽(PRP)产品,其系以如权利要求1至7中任一项所述的方法制成。
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