TW202003575A - 抗ox40的全人抗體及其製備方法和用途 - Google Patents

Abstract

本申請提供了針對腫瘤壞死因數受體超家族的成員4 (TNFRSF4)(也稱為OX40和CD134)的全人單株抗體。本申請還提供了使用人源化轉基因大鼠產生雜交瘤的方法、編碼抗OX40抗體的核酸分子、用於表達抗OX40抗體的表達載體和宿主細胞。本發明還提供了用於體外驗證抗體功能和體內抗體功效的方法。本發明的抗體提供了用於藉由調節人免疫功能治療多種癌症的非常有效的藥劑。

Description

抗OX40的全人抗體及其製備方法和用途

本申請一般而言涉及抗體。更具體地，本申請涉及抗OX40的全人單株抗體、其製備方法及其用途。

優先權資訊

本申請要求2018年5月11日提交的PCT申請號PCT/CN2018/086574和2018年5月29日提交的中國申請號201810529840.5的優先權。 序列表

本申請包含序列表，並且其全部內容藉由引用併入本文。 發明背景

來自臨床前和臨床結果的越來越多的證據表明，靶向免疫檢查點正在成為治療癌症患者的最有前途的方法。腫瘤壞死因數受體超家族成員4 （TNFRSF4，也稱為OX40、CD134和ACT35）是免疫檢查點蛋白之一，其藉由增強T細胞受體信號傳導並導致其活化而在T細胞功能中起著主要作用。

OX40主要由活化的CD4⁺ 和CD8⁺ T細胞、記憶T細胞、調節性T（Treg）細胞和天然殺傷（NK）細胞表達。活化的T細胞上表達的OX40與在抗原呈遞細胞上表達的其配體（OX40L）的相互作用顯著促進T細胞活化、增殖和遷移、增加效應T細胞的存活，增強生髮中心形成和樹突細胞成熟。另外，OX40信號傳導可抑制Treg的分化和擴增，拮抗誘導型Tregs的產生並阻斷Treg抑制功能。已經在多種臨床前小鼠腫瘤模型和臨床試驗中證明了OX40的激動劑是治療癌症和感染性疾病的頗有前景的策略。製藥公司諸如MedImmune, GlaxoSmithKline (GSK), Pfizer和Incyte已經開發了靶向OX40的多種激動性藥劑。在晚期癌症患者的I期臨床試驗中使用由MedImmune開發的靶向OX40的激動型鼠抗體（9B12，AgonOX）。用一個療程的抗體“9B12”治療的患者顯示出可接受的毒性特徵，並且在30位元患者中的12位中至少有一個轉移性病變發生消退。從機制上說，這種治療增加了對報導抗原免疫（例如KLH）的T和B細胞應答，導致腫瘤浸潤淋巴細胞中CD4+ FoxP3+ Treg細胞上OX40的優先上調，並增加了黑色素瘤患者中T和B細胞的抗腫瘤反應性。GSK也在開發用於潛在治療包括實體瘤和血液惡性腫瘤在內的癌症的GSK-3174998，其是藉由與MD Anderson癌症中心合作鑒定出的一種人源化IgG1單株抗體，其啟動T細胞表面上的OX-40。臨床開發中的靶向OX40的其他藥物包括Pfizer的全人IgG2激動劑抗體PF-04518600，其目前正在處於廣譜惡性腫瘤的臨床開發中；和Incyte的INCAGN-1949，其為抗OX40人IgG1抗體，具有最佳激動劑特性和選擇性消耗腫瘤內調節性T細胞的能力，用於潛在地治療癌症。

對於作為治療劑的針對OX40的抗體存在一些改進的空間。作為抗共刺激受體的激動劑，毒性可能是最受關注的問題，例如細胞因數風暴，這限制了臨床應用。此外，目前在臨床試驗中測試的抗OX40抗體是人-小鼠嵌合或人源化抗體，由於小鼠來源的蛋白質序列而產生的高免疫原性降低了功效。全人抗體克服了這些缺點，並且在體內顯示出更高的效率和更低的毒性。

在本發明中，藉由利用我們專有的雜交瘤技術，我們已經產生了針對OX40的全人抗體。本發明的抗體具有高結合親和力；特異性結合人和猴OX40蛋白；並有效地調節免疫應答，包括增強T細胞增殖和增加細胞因數IFN-γ和白細胞介素-2的產生以及削弱Treg細胞的抑制功能。

本發明提供了廣義而言，涉及提供具有改善功效的抗體的化合物、方法、組合物和製品的這些和其它目標。本發明提供的益處廣泛地適用於抗體治療和診斷領域，並且可以與能夠與各種靶標反應的抗體聯合使用。本發明提供了與人OX40結合的抗體，較佳全人單株抗體。還提供了使用人源化大鼠產生雜交瘤的方法，編碼抗OX40抗體的核酸分子，用於表達抗OX40抗體的載體和宿主細胞。本發明進一步提供了體外和體內驗證抗體功能的方法。本發明的抗體提供了藉由調節人免疫功能治療多種疾病(包括癌症)的有效藥劑。

在一些方面，本發明包括分離的抗體或其抗原結合部分。

在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分具有一種或多種以下性質： （a）以1×10^-8 M或更低的K_D 結合人OX40； （b）在CD4⁺ T細胞中誘導細胞因數(例如，IL-2或IFN-γ)產生； （c）增強原代人CD4⁺ T細胞的增殖； （d）在Treg細胞存在的情況下增強原代人CD4⁺ T效應細胞的增殖； （e）分別結合人或獼猴OX40；或 （f）對人CD40、CD137和CD271沒有交叉反應性。

在一些實施方案中，該分離的抗體或其抗原結合部分結合OX40的CRD2和/或CRD3結構域。

在一些實施方案中，該分離的抗體或其抗原結合部分包含： A)一個或多個重鏈CDR （CDRH），其選自以下的至少一個： （i）與如選自SEQ ID NO：1、7、13、15、21和27的序列之一所示的CDRH1具有至少90%序列同一性的CDRH1； （ii）與如選自SEQ ID NO：3、9、17、23和29的序列之一所示的CDRH2具有至少90%序列同一性的CDRH2；和 （iii）與如選自SEQ ID NO：5、11、19、25和31的序列之一所示的CDRH3具有至少90%序列同一性的CDRH3； B）一個或多個輕鏈CDR（CDRL），其選自以下的至少一個： （i）與如選自SEQ ID NO：2、8、14、16、22和28的序列之一所示的CDRL1具有至少90%序列同一性的CDRL1； （ii）與如選自SEQ ID NO：4、10、18、24和30的序列之一所示的CDRL2具有至少90%序列同一性的CDRL2；和 （iii）與如選自SEQ ID NO：6、12、20、26和32的序列之一所示的CDRL3具有至少90%序列同一性的CDRL3；或 C）A）的一個或多個CDRH和B）的一個或多個CDRL。

在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： A）一個或多個重鏈CDR（CDRH），其選自以下的至少一個： （i）選自SEQ ID NO：1、7、13、15、21和27的CDRH1，或與該CDRH1在氨基酸序列上相異在於不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH1； （ii）選自SEQ ID NO：3、9、17、23和29的CDRH2，或與該CDRH2在氨基酸序列上相異在於不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH2；和 （iii）選自SEQ ID NO：5、11、19、25和31的CDRH3，或與該CDRH3在氨基酸序列上相異在於不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH3； B）一個或多個輕鏈CDR（CDRL），其選自以下的至少一個： （i）選自SEQ ID NO：2、8、14、16、22和28的CDLH，或與該CDRL1在氨基酸序列上相異在於不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL1； （ii）選自SEQ ID NO：4、10、18、24和30的CDRL2，或與該CDRL2在氨基酸序列上相異在於不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL2；和 （iii）選自SEQ ID NO：6、12、20、26和32的CDRL3，或與該CDRL3在氨基酸序列上相異在於不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL3；或 C）A）的一個或多個CDRH和B）的一個或多個CDRL。

在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： A）包含SEQ ID NO: 5、11、19、25或31的CDRH3；或 B）與如選自SEQ ID NO: 5、11、19、25和31的序列之一所示的CDRH3具有至少90%序列同一性的CDRH3；或 C)與(A)的CDRH3在氨基酸序列上相異在於不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH3， 並且其中分離的抗體或其抗原結合部分以1×10^-8 M或更低的KD結合人OX40。

在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （a）包含SEQ ID NO：1或由其組成的CDRH1； （b）包含SEQ ID NO：3或由其組成的CDRH2； （c）包含SEQ ID NO：5或由其組成的CDRH3； （d）包含SEQ ID NO：2或由其組成的CDRL1； （e）包含SEQ ID NO：4或由其組成的CDRL2；和 （f）包含SEQ ID NO：6或由其組成的CDRL3。

在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （a）包含SEQ ID NO：7或由其組成的CDRH1； （b）包含SEQ ID NO：9或由其組成的CDRH2； （c）包含SEQ ID NO：11或由其組成的CDRH3； （d）包含SEQ ID NO：8或由其組成的CDRL1； （e）包含SEQ ID NO：10或由其組成的CDRL2；和 （f）包含SEQ ID NO：12或由其組成的CDRL3。

在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （a）包含SEQ ID NO：13或由其組成的CDRH1； （b）包含SEQ ID NO：9或由其組成的CDRH2； （c）包含SEQ ID NO：11或由其組成的CDRH3； （d）包含SEQ ID NO：14或由其組成的CDRL1； （e）包含SEQ ID NO：10或由其組成的CDRL2；和 （f）包含SEQ ID NO：12或由其組成的CDRL3。

在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （a）包含SEQ ID NO：15或由其組成的CDRH1； （b）包含SEQ ID NO：17或由其組成的CDRH2； （c）包含SEQ ID NO：19或由其組成的CDRH3； （d）包含SEQ ID NO：16或由其組成的CDRL1； （e）包含SEQ ID NO：18或由其組成的CDRL2；和 （f）包含SEQ ID NO：20或由其組成的CDRL3。

在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （a）包含SEQ ID NO：21或由其組成的CDRH1； （b）包含SEQ ID NO：23或由其組成的CDRH2； （c）包含SEQ ID NO：25或由其組成的CDRH3； （d）包含SEQ ID NO：22或由其組成的CDRL1； （e）包含SEQ ID NO：24或由其組成的CDRL2；和 （f）包含SEQ ID NO：26或由其組成的CDRL3。

在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （a）包含SEQ ID NO：27或由其組成的CDRH1； （b）包含SEQ ID NO：29或由其組成的CDRH2； （c）包含SEQ ID NO：31或由其組成的CDRH3； （d）包含SEQ ID NO：28或由其組成的CDRL1； （e）包含SEQ ID NO：30或由其組成的CDRL2；和 （f）包含SEQ ID NO：32或由其組成的CDRL3。

在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （A）重鏈可變區（VH），其中： （i）包含選自SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43的氨基酸序列； （ii）包含與選自SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43的氨基酸序列具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；或 （iii）包含與選自SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43的氨基酸序列相比具有一個或多個（如1－10個，1－5個，1－3個，1、2、3、4或5個）氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或 （B）輕鏈可變區（VL），其中： （i）包含選自SEQ ID NO：34、36、38、40、42和44的氨基酸序列； （ii）包含與選自SEQ ID NO：34、36、38、40、42和44的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；或 （iii）包含與選自SEQ ID NO：34、36、38、40、42和44的氨基酸序列相比具有一個或多個（如1－10個，1－5個，1－3個，1、2、3、4或5個）氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

在一些實施方案中，本發明包含與上文所定義的分離的抗體或其抗原結合部分競爭結合同一表位元的分離的抗體或其抗原結合部分。

在一些方面，本發明涉及分離的核酸分子，其包含編碼如本文所揭露的分離的抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區的核酸序列。

在一些方面，本發明涉及包含編碼如本文所揭露的抗體或其抗原結合部分的核酸分子的載體。

在一些方面，本發明涉及包含如本文所揭露的表達載體的宿主細胞。

在一些方面，本發明涉及藥物組合物，其包含至少一種如本文所揭露的抗體或其抗原結合部分和藥學上可接受的載體。

在一些方面，本發明涉及用於製備抗OX40抗體或其抗原結合部分的方法，其包括在宿主細胞中表達抗體或其抗原結合部分並從宿主細胞分離抗體或抗原結合部分。

在一些方面，本發明涉及調節受試者的免疫應答的方法，其包括向受試者施用如本文所揭露的抗體或其抗原結合部分，使得受試者中的免疫應答受到調節。

在一些方面，本發明涉及用於治療受試者中的異常細胞生長的方法，其中包括向受試者施用有效量的如本文所揭露的抗體或其抗原結合部分或藥物組合物。

在一些方面，本發明涉及用於抑制受試者中的腫瘤細胞生長的方法，其中包括向受試者施用有效量的如本文所揭露的抗體或其抗原結合部分或藥物組合物。

在一些方面中，本發明涉及用於減少受試者中的腫瘤細胞轉移的方法，其中包括向受試者施用有效量的如本文所揭露的抗體或其抗原結合部分或藥物組合物。

在一些方面，本發明涉及用於削弱受試者中的Treg細胞的抑制功能的方法，其中包括向受試者施用有效量的如本文所揭露的抗體或其抗原結合部分或藥物組合物。

在一些方面，本發明涉及用於治療或預防受試者中的疾病（包括增殖性病症(諸如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或傳染性疾病）的方法，其包括向受試者施用有效量的如本文所揭露的抗體或其抗原結合部分或藥物組合物。

在一些方面，本發明涉及如本文所揭露的抗體或其抗原結合部分在製備用於治療或預防疾病（包括增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或傳染性疾病）的藥物中的用途。

在一些方面，本發明涉及如本文所揭露的抗體或其抗原結合部分在製備用於診斷增殖性疾病（包括增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或傳染性疾病）的診斷劑中的用途。

在一些方面，本發明涉及如本文所揭露的抗體或其抗原結合部分用於治療或預防疾病（包括增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或傳染性疾病）的用途。

在一些方面，本發明涉及使用如本文所揭露的抗體或其抗原結合部分的試劑盒或裝置和相關方法，以及如本文所揭露的藥物組合物，其可用於治療疾病（包括增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或傳染性疾病）。為此，本發明較佳提供可用於治療此類病症的製品，其包含含有如本文所揭露的抗體或其抗原結合部分的容器以及用於使用如本文所揭露的抗體或其抗原結合部分來治療、改善或預防增殖性病症或其進展或復發的說明材料。

以上內容是一個概述，因此必要時包含細節的簡化、概括和省略；因此，本領域技術人員將認識到，該概述僅是舉例說明性的，並不意圖以任何方式進行限制。本文所述的方法、組合物和/或裝置和/或其他主題的其它方面、特徵和優勢將在本文所示的教導中變得明顯。提供概述以簡化地介紹一些概念的集合，這些概念將在下面的詳細描述中進一步描述。本概述不旨在確定所要求保護的主題的關鍵特徵或基本特徵，也不旨在用作確定所要求保護的主題的範圍的輔助手段。此外，貫穿本申請引用的所有參考文獻、專利和揭露的專利申請的內容藉由引用整體併入本文。

雖然本發明可以以許多不同的形式來實施，但在此揭露的是驗證本發明原理的其具體的舉例說明性實施方案。應該強調的是，本發明不限於所舉例說明的具體實施方案。此外，本文使用的任何章節標題僅用於組織目的，並不被解釋為限制所描述的主題。

除非在此另外定義，否則與本發明結合使用的科學和技術術語將具有本領域普通技術人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數形式的術語應包括複數形式，複數形式的術語應包括單數形式。更具體地，如在本說明書和所附申請專利範圍中所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數形式“一”，“一個”和“該”包括複數指示物。因此，例如，提及“一種蛋白質”包括多種蛋白質；提及“一個細胞”包括細胞的混合物等。在本申請中，除非另有說明，否則使用“或”意指“和/或”。此外，術語“包含”以及其他形式（諸如“包括”和“含有”）的使用不是限制性的。此外，說明書和所附申請專利範圍中提供的範圍包括端點和端點之間的所有值。

通常，與本文描述的細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學和蛋白質以及核酸化學和雜交有關的術語以及其技術是本領域眾所周知和常用的術語。除非另有說明，否則本發明的方法和技術通常根據本領域公知的常規方法進行，並如在本說明書全文中引用和討論的各種通用和更具體的參考文獻中所述進行。參見例如Abbas等人, Cellular and Molecular Immunology, 6^th ed., W.B. Saunders Company (2010); Sambrook J. & Russell D.Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology , Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and LaneUsing Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); 和Coligan等人,Short Protocols in Protein Science , Wiley, John & Sons, Inc. (2003)。與本文描述的分析化學，合成有機化學和藥物和藥物化學有關的術語以及實驗室程式和技術是本領域中眾所周知和常用的術語。此外，本文使用的任何章節標題僅用於組織目的，並且不被解釋為限制所描述的主題。 定義

為了更好地理解本發明，相關術語的定義和解釋提供如下。

如本文所用，術語“抗體”或“Ab”通常是指包含藉由共價二硫鍵和非共價相互作用保持在一起的兩條重鏈（H）和兩條輕鏈（L）多肽鏈的Y形四聚體蛋白。抗體的輕鏈可以分為κ和λ輕鏈。重鏈可分為μ、δ、γ、α和ε，它們分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈中，可變區藉由約12個或更多個氨基酸的“J”區與恆定區連接，並且重鏈還包含約3個或更多個氨基酸的“D”區。每條重鏈由重鏈可變區（V_H ）和重鏈恆定區（C_H ）組成。重鏈恆定區由3個結構域（C_H 1，C_H 2和C_H 3）組成。每條輕鏈由輕鏈可變區（V_L ）和輕鏈恆定區（C_L ）組成。V_H 和V_L 區可以進一步分為由相對保守的區域（稱為框架區（FR））間隔開的高變區（稱為互補決定區（CDR））。每個V_H 和V_L 由以下順序的3個CDR和4個FR組成：從N端到C端的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。每個重鏈/輕鏈對的可變區（V_H 和V_L ）分別形成抗原結合位點。氨基酸在各種區域或結構域中的分佈遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))或Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia等人, (1989) Nature 342:878-883中的定義。抗體可以具有不同的抗體同種型，例如IgG（例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亞型），IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗體。

術語抗體的“抗原結合部分”或“抗原結合片段”，其可以在本申請的上下文中互換使用，是指包含全長抗體的片段的多肽，其保留了與全長抗體特異性結合的抗原特異性結合的能力，和/或其與全長抗體競爭結合相同的抗原。一般而言，參見Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 第二版, Raven Press, N.Y. (1989)，其出於所有目的藉由引用併入本文。抗體的抗原結合片段可藉由重組DNA技術或藉由完整抗體的酶促或化學切割來產生。在一些條件下，抗原結合片段包括Fab, Fab', F(ab')₂ , Fd, Fv, dAb和互補決定區（CDR）片段，單鏈抗體（例如scFv），嵌合抗體，雙抗體和包含足以賦予多肽特異性抗原結合能力的至少一部分抗體的此類多肽。抗體的抗原結合片段可從給定抗體（例如，在本申請中提供的單株抗人OX40抗體）藉由本領域技術人員已知的常規技術（例如，重組DNA技術或酶促或化學切割方法）獲得，並且可以以與完整抗體相同的方式篩選特異性。

如本文所用，術語“單株抗體”或“mAb”是指單分子組成的抗體分子製劑。單株抗體顯示對特定表位元的單一結合特異性和親和力。

如本文所用，術語“人抗體”或“全人抗體”旨在包括具有可變區的抗體，其中框架區和CDR區均源自人種系免疫球蛋白序列。此外，如果抗體含有恆定區，恆定區也來源於人種系免疫球蛋白序列。本發明的人抗體可以包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基（例如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變引入的突變）。然而，如本文所用，術語“人抗體”不旨在包括其中來源於另一種哺乳動物物種如小鼠的種系的CDR序列已經嫁接到人框架序列上的抗體。

如本文所用，術語“人單株抗體”是指顯示單一結合特異性的抗體，其具有其中框架和CDR區均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區。

術語“人源化抗體”旨在指其中來源於另一種哺乳動物物種如小鼠的種系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗體。可以在人框架序列內進行額外的框架區修飾。

如本文所用的術語“嵌合抗體”是指這樣的抗體，其中可變區序列來自一個物種並且恆定區序列來自另一物種，例如其中可變區序列源自小鼠抗體和恆定區序列來源於人抗體的抗體。

如本文所用，術語“重組抗體”是指藉由重組手段製備、表達、產生或分離的抗體，例如從對於另一物種的免疫球蛋白基因而言是轉基因的動物分離的抗體，使用轉染至宿主細胞中的重組表達載體表達的抗體，從重組組合抗體文庫中分離的抗體或藉由涉及將免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他手段製備、表達、產生或分離的抗體。

如本文所用，術語“抗OX40抗體”或“OX40抗體”是指如本文所定義的能夠與例如人OX40受體的OX40受體結合的抗體。

在本文中可互換使用的術語“OX40”、“OX40受體”、“OX40蛋白”、“腫瘤壞死因數受體超家族成員4 （TNFRSF4）”或“CD134”是腫瘤壞死因數（TNF）受體超家族的成員。術語“OX40”可以包括人OX40受體，以及其變體、同工型和物種同源物。因此，如本文中所定義和揭露的抗體或其抗原結合部分也可以結合來自除人外的物種的OX40，例如獼猴OX40。

如本文所用，術語“人OX40”是指人序列OX40，例如具有Genbank登錄號CAE11757.1的人OX40的完整氨基酸序列。人OX40序列可以與Genbank登錄號CAE11757.1的人OX40不同，例如在非保守區中具有保守的突變，並且OX40具有與Genbank登錄號CAE11757.1的人OX40基本上相同的生物學功能。

如本文所用，術語“小鼠OX40”是指小鼠序列OX40，例如具有Genbank登錄號CAA59476.1的小鼠OX40的完整氨基酸序列。

如本文所用，術語“獼猴OX40”是指獼猴序列OX40，例如具有Genbank登錄號XP_001090870.1的獼猴OX40的完整氨基酸序列。

如本文所用，術語“Ka”旨在表示特定抗體-抗原相互作用的締合速率，而本文所用的術語“Kd”旨在表示特定抗體-抗原相互作用的解離速率。抗體的Kd值可以使用本領域良好建立的方法來確定。如本文所用，術語“K_D ”旨在表示特定抗體-抗原相互作用的解離常數，其從Kd與Ka的比率（即，Kd/Ka）獲得並且表示為摩爾濃度（M）。確定抗體Kd的較佳方法是藉由使用表面電漿共振，較佳使用生物感測器系統如Biacore®系統。

如本文所用的術語IgG抗體的“高親和力”是指標對靶抗原例如OX40受體具有1×10^-7 M或更低，更較佳5×10^-8 M或更低，甚至更較佳1×10^-8 M或更低，甚至更較佳5×10^-9 M或更低，甚至更較佳1×10^-9 M或更低的K_D 的抗體。

如本文所用的術語“EC₅₀ ”，也被稱為“半數有效濃度”，是指在特定的暴露時間後誘導在基線和最大值之間的50%的應答的藥物、抗體或毒劑的濃度。在本申請的上下文中，EC₅₀ 的單位為“nM”。

如本文所用，術語“競爭結合”是指兩種抗體在它們與結合靶標結合中的相互作用。如果在第二抗體存在的情況下第一抗體與其同源表位的結合相比於在第二抗體不存在的情況下第一抗體的結合而言可檢測地降低，則第一抗體與第二抗體競爭結合。相對的情況可以成立但不必如此，即在第一抗體存在的情況下第二抗體與其表位的結合也可檢測地降低，但不必如此。也就是說，第一抗體可抑制第二抗體與其表位的結合，而第二抗體不抑制第一抗體與其相應表位的結合。然而，在每種抗體可檢測地抑制另一種抗體與其同源表位元的結合的情況下，無論是相同、更大還是更小程度，抗體均被認為彼此“交叉競爭”對它們各自的表位的結合。

如本文所用，“抑制結合”的能力是指抗體或其抗原結合片段抑制兩個分子（例如人OX40和人抗OX40抗體）的結合至任何可檢測水準。在某些實施方案中，兩個分子的結合可以被抗體或其抗原結合片段抑制至少50％。在某些實施方案中，這種抑制作用可以大於60％、大於70％、大於80％或大於90％。

如本文所用，術語“表位”是指免疫球蛋白或抗體特異性結合的抗原部分。“表位”也被稱為“抗原決定簇”。表位或抗原決定簇通常由分子例如氨基酸、碳水化合物或糖側鏈的化學活性表面基團組成，並且通常具有特定的三維結構和特定的電荷特徵。例如，表位通常包含獨特立體構象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連續或不連續的氨基酸，其可以是“線性”或“構象”表位。參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)。在線性表位元中，蛋白質和相互作用分子（例如抗體）之間的所有相互作用位點沿蛋白質的一級氨基酸序列線性存在。在構象表位中，相互作用位點跨越蛋白質中彼此分離的氨基酸殘基。取決於藉由本領域技術人員已知的常規技術檢測的結合相同表位的競爭性，可以篩選抗體。例如，可以進行競爭或交叉競爭研究以獲得彼此競爭或交叉競爭結合抗原（例如RSV融合蛋白）的抗體。在國際專利申請WO 03/48731中描述了用於獲得結合相同表位的抗體的高通量方法，其基於它們的交叉競爭。

如本文所用，術語“分離的”是指藉由人工方式從天然狀態獲得的狀態。如果某種“分離的”物質或組分天然存在，則可能是因為其天然環境發生變化，或者物質與天然環境分離，或者兩者兼而有之。例如，某種未分離的多核苷酸或多肽天然存在於某個活動物體內，從該天然狀態分離的相同的高純度多核苷酸或多肽被稱為分離的多核苷酸或多肽。術語“分離的”既不排除混合的人造或合成物質，也不排除不影響分離的物質的活性的其他不純物質。

如本文所用，術語“分離的抗體”旨在指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體（例如，特異性結合OX40蛋白的分離的抗體基本上不含特異性結合除OX40蛋白以外的抗原的抗體）。然而，特異性結合人OX40蛋白的分離的抗體對其他抗原如來自其他物種的OX40蛋白可能具有交叉反應性。此外，分離的抗體可以基本上不含其他細胞材料和/或化學物質。

如本文所用，術語“載體”是指可以在其中插入多核苷酸的核酸媒介物。當載體允許插入其中的多核苷酸編碼的蛋白質的表達時，該載體稱為表達載體。該載體可以藉由轉化、轉導或轉染入宿主細胞而使攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞中表達。載體是本領域技術人員所熟知的，包括但不限於質粒，噬菌體，黏粒，人工染色體如酵母人工染色體（YAC），細菌人工染色體（BAC）或P1衍生人工染色體（PAC） ；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體和動物病毒。可用作載體的動物病毒包括但不限於逆轉錄病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒（如單純皰疹病毒）、痘病毒、杆狀病毒、乳頭瘤病毒、乳多空病毒（如SV40）。載體可以包含用於控制表達的多個元件，包括但不限於啟動子序列，轉錄起始序列，增強子序列，選擇元件和報導基因。另外，載體可以包含複製起點。

如本文所用，術語“宿主細胞”是指可被工程化以產生目標蛋白質、蛋白質片段或肽的細胞系統。宿主細胞包括但不限於培養細胞，例如來源於齧齒類動物（大鼠、小鼠、豚鼠或倉鼠）的哺乳動物培養細胞，如CHO、BHK、NSO、SP2/0、YB2/0；或人體組織或雜交瘤細胞、酵母細胞和昆蟲細胞，以及包含在轉基因動物或培養組織內的細胞。該術語不僅涵蓋特定的受試細胞，而且還涵蓋這種細胞的後代。 因為某些修飾可由於突變或環境影響而在後續世代中發生，這樣的後代可能與親本細胞不同，但仍包括在術語“宿主細胞”的範圍內。

如本文所用，術語“同一性”是指藉由比對和比較序列確定的兩個或更多個多肽分子或兩個或更多個核酸分子的序列之間的關係。“百分比同一性”是指比較分子中氨基酸或核苷酸之間相同殘基的百分比，並基於被比較的最小分子的大小計算。對於這些計算，比對中的間隙（如果有的話）較佳藉由特定的數學模型或電腦程式（即“演算法”）來定址。可以用於計算比對的核酸或多肽的同一性的方法包括在Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; 和Carillo et al, 1988, SIAMJ. Applied Math. 48:1073中描述的那些。

如本文所用，術語“免疫原性”是指刺激生物體中特異性抗體或致敏淋巴細胞形成的能力。它不僅指抗原刺激特定免疫細胞活化、增殖和分化以最終產生免疫效應物質如抗體和致敏淋巴細胞的性質，還指抗體或致敏T淋巴細胞的特異性免疫應答可以在用抗原刺激生物體後在生物體的免疫系統中形成。免疫原性是抗原最重要的特性。抗原是否能夠成功誘導宿主中免疫應答的產生取決於三個因素：抗原的性質，宿主的反應性和免疫手段。

如本文所用，術語“轉染”是指將核酸引入真核細胞特別是哺乳動物細胞的過程。用於轉染的方案和技術包括但不限於脂質轉染和化學和物理方法如電穿孔。許多轉染技術在本領域是公知的並且在本文中揭露。參見例如Graham等人, 1973, Virology 52:456; Sambrook等人, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 同上; Davis等人, 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al, 1981, Gene 13:197。在本發明的一個具體實施方案中，將人XO40基因轉染入293F細胞。

如本文所用，術語“雜交瘤”和術語“雜交瘤細胞系”可以互換使用。當提及術語“雜交瘤”和術語“雜交瘤細胞系”時，它們也包括雜交瘤的亞克隆和後代細胞。

如本文所用，術語“SPR”或“表面電漿共振”是指並且包括允許藉由檢測生物感測器基質內的蛋白質濃度的改變來分析即時生物特異性相互作用的光學現象，例如使用BIAcore系統（Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ）。關於詳細描述，參見實施例5和Jönsson, U.,等人 (1993)Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jönsson, U.,等人 (1991)Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B.,等人 (1995)J. Mol. Recognit. 8:125-131; 和Johnnson, B.,等人 (1991)Anal. Biochem. 198:268-277。

如本文所用，術語“螢光啟動細胞分選”或“FACS”是指專門類型的流式細胞術。它提供了根據每個細胞的特定光散射和螢光特徵，將生物細胞的異質混合物以每次一個細胞分揀到兩個或更多個容器中的方法（FlowMetric. “Sorting Out Fluorescence Activated Cell Sorting”. 2017-11-09）。用於進行FACS的儀器是本領域技術人員已知的並且可以對於公眾是可商購獲得的。這種儀器的實例包括Becton Dickinson（Foster City，Calif.）的FACS Star Plus、FACScan和FACSort儀器、來自Coulter Epics Division（Hialeah，FLa）的Epics C和來自Cytomation（Colorado Springs，Colo.）的MoFlo。

如本文所用，術語“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”或“ADCC”是指其中與某些細胞毒性細胞（例如天然殺傷（NK）細胞，嗜中性粒細胞和巨噬細胞）上存在的Fc受體（FcR）結合的分泌的Ig使這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原的靶細胞並隨後用細胞毒素殺死靶細胞的細胞毒性形式。抗體“武裝”細胞毒性細胞，並且對於這種殺傷是絕對需要的。介導ADCC的主要細胞NK細胞僅表達FcγRIII，而單核細胞表達FcγRI，FcγRII和FcγRIII。造血細胞上的FcR表達總結在Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)的464頁的表3中。為了評估感興趣分子的ADCC活性，可以進行體外ADCC測定，例如美國專利號5,500,362或5,821,337中所述的測定。可用於此類測定的效應細胞包括外周血單核細胞（PBMC）和天然殺傷（NK）細胞。可選或另外地，感興趣分子的ADCC活性可以在體內評估，例如在如Clynes等人 PNAS (USA) 95:652-656 (1998)揭露的動物模型中評估。

術語“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”是指在補體存在下靶細胞的裂解。經典補體途徑的啟動由補體系統的第一組分（C1q）與結合其同源抗原的抗體（適當的亞類）結合而啟動。為了評估補體活化，可以執行CDC測定，例如Gazzano-Santoro等人, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)中所述的。

術語“受試者”包括任何人或非人動物，較佳人。

如本文所用，術語“癌症”是指引發醫學病症的任何腫瘤或惡性細胞生長、增殖或轉移介導的實體瘤和非實體瘤如白血病。

本文在治療病情的情況中使用的術語“治療”和“醫治”一般涉及人或動物的治療和療法，其中實現了一些期望的治療效果，例如，抑制病情進展，包括進展速度下降、進展速度停滯、病情消退、病情改善和病情治癒。還包括了作為預防措施（即預防）的治療。對於癌症，“治療”可能是指抑制或減緩腫瘤或惡性細胞生長、增殖或轉移或其某種組合。對於腫瘤，“治療”包括去除全部或部分腫瘤、抑制或減緩腫瘤生長和轉移、預防或延遲腫瘤的發展或其某種組合。

如本文所用，術語“治療有效量”涉及活性化合物或包含活性化合物的材料、組合物或劑型的量，其在按照所需的治療方案施用時有效用於產生與合理的益處/風險比相稱的某些所需的治療效果。例如，當與治療OX40相關疾病或病症聯合使用時，“有效量”是指抗體或其抗原結合部分有效治療所述疾病或病症的量或濃度。

如本文所用，關於哺乳動物中的某種疾病狀況的術語“預防”，“防治”或“防止”是指預防或延遲該疾病的發作或預防其臨床或亞臨床症狀的表現。

如本文所用，術語“藥學上可接受的”是指載體、稀釋劑、賦形劑和/或其鹽在化學和/或物理上與製劑中的其他成分相容，並且與接受者在生理學上相容。

如本文所用，術語“藥學上可接受的載體和/或賦形劑”是指在藥理學和/或生理學上與受試者和活性劑相容的載體和/或賦形劑，其在本領域中是公知的（參見，例如， Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995），並且包括但不限於pH調節劑，表面活性劑，佐劑和離子強度增強劑。例如，pH調節劑包括但不限於磷酸鹽緩衝液；表面活性劑包括但不限於陽離子、陰離子或非離子表面活性劑，例如Tween-80；離子強度增強劑包括但不限於氯化鈉。

如本文所用，術語“佐劑”是指非特異性免疫增強劑，其在與抗原一起遞送至生物體或被提前遞送至有機體時可以增強生物體中的對抗原的免疫應答或改變免疫應答的類型。存在多種佐劑，包括但不限於鋁佐劑（例如氫氧化鋁），弗氏佐劑（例如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑），短小棒狀桿菌，脂多糖，細胞因數等。弗氏佐劑是目前動物實驗中最常用的佐劑。氫氧化鋁佐劑更常用於臨床試驗。 抗OX40抗體

在一些方面，本發明包括分離的抗體或其抗原結合部分。

在本申請的上下文中，“抗體”可以包括多克隆抗體，單株抗體，嵌合抗體，人源化和靈長類動物化抗體，CDR移植抗體，人抗體，重組產生的抗體，胞內抗體，多特異性抗體，雙特異性抗體，單價抗體，多價抗體，抗獨特型抗體，合成抗體，包括其突變蛋白及變體；及其衍生物（包括Fc融合蛋白和其他修飾），以及任何其他免疫反應性分子，只要其表現出與OX40蛋白的優先締合或結合。此外，除非上下文另外規定，否則該術語還包括所有類別的抗體（即IgA，IgD，IgE，IgG和IgM）和所有亞類（即IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2）。在一個較佳的實施方案中，抗體是單株抗體。在更較佳的實施方案中，抗體是人單株抗體。

人抗體可以使用本領域已知的各種技術來產生。一種技術是噬菌體展示，其中在噬菌體上合成（較佳人）抗體文庫，用感興趣的抗原或其抗體結合部分篩選文庫，並分離結合抗原的噬菌體，從其中可以獲得免疫反應性片段。用於製備和篩選這種文庫的方法是本領域眾所周知的，並且用於產生噬菌體展示文庫的試劑盒可商購獲得（例如，Pharmacia重組噬菌體抗體系統，目錄號27-9400-01；以及Stratagene SurfZAP^TM 噬菌體展示試劑盒，目錄號240612）。還有其他方法和試劑可用於產生和篩選抗體展示文庫（參見例如Barbas等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982（1991））。

人抗體還可以藉由將人免疫球蛋白基因座引入轉基因動物（例如其中內源免疫球蛋白基因已經部分或完全失活並且已引入人免疫球蛋白基因的小鼠）中來製備。在攻擊時，觀察到人抗體產生，其與在人中各方面觀察到的非常相似，包括基因重排、裝配和抗體庫。這種方法例如描述於美國專利5,545,807； 5,545,806； 5,569,825； 5,625,126； 5,633,425；5,661,016和關於XenoMouse^® 技術的美國專利6,075,181和6,150,584；和Lonberg and Huszar,Intern. Rev. Immunol . 13:65-93 (1995)中。或者，可以藉由產生針對靶抗原的抗體的人B淋巴細胞（這樣的B淋巴細胞可以從患有腫瘤性疾病或者可能已經在體外被免疫的個體中獲得）的永生化來製備人抗體。參見例如Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy , Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner等人,J. Immunol , 147 (l):86-95 (1991); 和U.S.P.N. 5,750,373。

單株抗體可以使用本領域已知的多種技術來製備，包括雜交瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術、轉基因動物（例如XenoMouse^® ）或其一些組合。例如，可以使用雜交瘤和本領域公認的生物化學和遺傳工程技術來生產單株抗體，如詳細描述於An, Zhigiang (ed.)Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic , John Wiley and Sons, 1^st ed. 2009; Shire et. al. (eds.)Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing , Springer Science + Business Media LLC, 1^st ed. 2010; Harlow等人,Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988; Hammerling,等人, in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)中，每篇文獻在此全部引入作為參考。應該理解，可以進一步改變選定的結合序列，例如以提高對靶的親和力、使靶結合序列人源化、改善其在細胞培養物中的產生、降低其體內免疫原性、產生多特異性抗體等，並且包含改變的靶結合序列的抗體也是本發明的抗體。在一個較佳的實施方案中，藉由使用雜交瘤來製備抗人OX40單株抗體。 產生本發明的人單株抗體的雜交瘤的產生

為了獲得產生本發明抗體例如本發明的人單株抗體的雜交瘤，可以分離來自免疫小鼠的脾細胞和/或淋巴結細胞並將其融合至合適的永生化細胞系，例如小鼠骨髓瘤細胞系。就抗原特異性抗體的產生篩選產生的雜交瘤。雜交瘤的產生在本領域中是眾所周知的。參見例如Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York。 產生本發明的單株抗體的轉染瘤的產生

本發明的抗體還可以在宿主細胞轉染瘤中使用例如本領域眾所周知的重組DNA技術和基因轉染方法的組合(例如Morrison, S. (1985) Science 229:1202)來產生。在一個實施方案中，將藉由標準分子生物學技術獲得的編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA插入一個或多個表達載體中，使得該基因可操作地連接于轉錄和翻譯調節序列。在此上下文下，術語“可操作地連接”意在表示將抗體基因連接到載體中，使得載體內的轉錄和翻譯控制序列發揮它們調節抗體基因轉錄和翻譯的預期功能。

術語“調控序列”旨在包括控制抗體鏈基因的轉錄或翻譯的啟動子、增強子和其他表達控制元件（例如聚腺苷酸化信號）。這些調節序列描述於例如Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))中。用於哺乳動物宿主細胞表達的示例性調控序列包括指導哺乳動物細胞中高水準蛋白質表達的病毒元件，例如來自巨細胞病毒（CMV）、猿猴病毒40（SV40）、腺病毒（例如腺病毒主要晚期啟動子（AdMLP）和多瘤病毒的啟動子和/或增強子。或者，可以使用非病毒調控序列，例如泛素啟動子或β-珠蛋白啟動子；還有，由不同來源的序列組成的調控元件，如SRa啟動子系統，其包含來自SV40早期啟動子和人T細胞白血病病毒1型的長末端重複序列的序列(Takebe等人 (1988) MoI. Cell. Biol. 8:466-472)。表達載體和表達控制序列被選擇為與使用的表達宿主細胞相容。

可以將抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因插入相同或不同的表達載體中。在一些實施方案中，可變區用於藉由將其插入到已經編碼所需同種型的重鏈恆定區和輕鏈恆定區的表達載體中來產生任何抗體同種型的全長抗體基因，使得VH區段可操作地連接至載體內的CH區段和VL區段可操作地連接至載體內的CL區段。另外或可選地，重組表達載體可以編碼促進抗體鏈從宿主細胞分泌的信號肽。可以將抗體鏈基因克隆到載體中，使得信號肽符合讀框地連接到抗體鏈基因的氨基末端。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽（即來自非免疫球蛋白蛋白質的信號肽）。

除了抗體鏈基因和調控序列之外，本發明的重組表達載體還可以攜帶額外的序列，例如調節載體在宿主細胞中複製的序列（例如複製起點）和選擇標記基因。選擇標記基因有助於選擇導入了載體的宿主細胞（參見例如美國專利號4,399,216； 4,634,665和5,179,017）。例如，通常選擇標記基因賦予載體已經導入其中的宿主細胞對藥物（例如G418，潮黴素或甲氨蝶呤）的抗性。選擇標記基因可以包括二氫葉酸還原酶（DHFR）基因（用於具有甲氨蝶呤選擇/擴增的dhfr-宿主細胞）和neo基因（用於G418選擇）。

為了表達輕鏈和重鏈，藉由標準技術將編碼重鏈和輕鏈的表達載體轉染到宿主細胞中。術語“轉染”的各種形式旨在涵蓋通常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中的各種技術，例如電穿孔，磷酸鈣沉澱，DEAE-葡聚糖轉染等。可以在原核或真核宿主細胞例如哺乳動物宿主細胞（其可以裝配和分泌適當折疊和免疫活性的抗體）中表達本發明的抗體。

用於表達本發明重組抗體的哺乳動物宿主細胞包括與DHFR選擇標記（例如，如R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. MoI. Biol. 159:601-621中所述的）一起使用的中國倉鼠卵巢（CHO細胞）（包括在Urlaub和Chasin，（1980）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中描述的dhfr CHO細胞），NSO骨髓瘤細胞，COS細胞和SP2細胞。特別地，為了與NSO骨髓瘤一起使用，另一種表達系統是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中揭露的GS基因表達系統。當將編碼抗體基因的重組表達載體導入哺乳動物宿主細胞時，藉由培養宿主細胞足以允許抗體在宿主細胞中表達的時間段或將抗體分泌到宿主細胞生長的培養基中來產生抗體。使用標準蛋白質純化方法可從培養基中回收抗體。 具有某些性質的抗OX40抗體

本發明的抗體的特徵在於抗體的特定功能特徵或性質。在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分具有一種或多種以下性質： （a）以1×10^-8 M或更低的K_D 結合人OX40； （b）誘導CD4⁺ T細胞中細胞因數（例如，IL-2或IFN-γ）的產生； （c）增強原代人CD4⁺ T細胞的增殖； （d）在Treg細胞存在的情況下增強原代人CD4⁺ T效應細胞的增殖； （e）分別結合人或獼猴OX40；或 （f）對人CD40、CD137和CD271沒有交叉反應性。

本發明的抗體以高親和力結合人OX40。本發明的抗體與OX40的結合可以使用本領域中充分建立的一種或多種技術，例如ELISA來評估。本發明抗體的結合特異性也可以藉由例如流式細胞術監測抗體與表達OX40蛋白的細胞的結合來確定。例如，抗體可以藉由流式細胞術測定來測試，其中抗體與表達人OX40的細胞系例如已經轉染以在其細胞表面上表達OX40的CHO細胞反應。用於流式細胞術測定的其他合適的細胞包括表達天然OX40的抗CD3-刺激的CD4⁺ 活化T細胞。另外或可選地，可以在BIAcore結合測定中測試抗體的結合，包括結合動力學（例如K_d 值）。其他合適的結合分析包括ELISA分析，例如使用重組OX40蛋白。例如，本發明的抗體以1×10^-8 M或更低的K_D 結合人OX40蛋白，以1×10^-9 M或更低的K_D 結合人OX40蛋白，以5×10^-10 M或更低的K_D 結合人OX40蛋白，以2×10^-10 M或更低的K_D 結合人OX40蛋白，以1×10^-10 M或更低的K_D 結合人OX40蛋白，以5×10^-11 M或更低的K_D 結合人OX40蛋白，以3×10^-11 M或更低的K_D 結合人OX40蛋白，或以2×10^-11 M或更低的K_D 結合人OX40蛋白。 包含與特定序列具有序列同一性的CDR的抗OX40抗體

在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： A)一個或多個重鏈CDR （CDRH），其選自以下的至少一個： （i）與如選自SEQ ID NO：1、7、13、15、21和27的序列之一所示的CDRH1具有至少90%序列同一性的CDRH1； （ii）與如選自SEQ ID NO：3、9、17、23和29的序列之一所示的CDRH2具有至少90%序列同一性的CDRH2；和 （iii）與如選自SEQ ID NO：5、11、19、25和31的序列之一所示的CDRH3具有至少90%序列同一性的CDRH3； B）一個或多個輕鏈CDR（CDRL），其選自以下的至少一個： （i）與如選自SEQ ID NO：2、8、14、16、22和28的序列之一所示的CDRL1具有至少90%序列同一性的CDRL1； （ii）與如選自SEQ ID NO：4、10、18、24和30的序列之一所示的CDRL2具有至少90%序列同一性的CDRL2；和 （iii）與如選自SEQ ID NO：6、12、20、26和32的序列之一所示的CDRL3具有至少90%序列同一性的CDRL3；或 C）A）的一個或多個CDRH和B）的一個或多個CDRL。

除非另有說明，否則將氨基酸分配給每個CDR可以根據以下提供的編號方案之一：Kabat等人 (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest (5^th Ed.), US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242; Chothia等人, 1987, PMID: 3681981; Chothia等人, 1989, PMID: 2687698; MacCallum等人,1996, PMID: 8876650; 或Dubel, Ed. (2007)Handbook of Therapeutic Antibodies, 3^rd Ed., Wily-VCH Verlag GmbH and Co.。

抗體序列中的可變區和CDR可以根據本領域已經開發的一般規則（如上所述，例如Kabat編號系統）或藉由將序列與已知可變區的資料庫比對來鑒定。在Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001和Dinarello等人, Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000中描述了鑒定這些區域的方法。抗體序列的示例性資料庫描述於並可獲自www.bioinf.org.uk/abs上的“Abysis”網站（由Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London, London, England的A.C. Martin維護）和VBASE2網站www.vbase2.org，如Retter等人, Nucl. Acids Res., 33 (Database issue): D671 -D674 (2005)中所述。較佳使用Abysis資料庫分析序列，其整合了來自Kabat、IMGT和蛋白質資料庫（PDB）的序列資料與來自PDB的結構資料，參見Dr. Andrew C. R. Martin所著的書中的Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains . In:Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547,也可在網站bioinforg.uk/abs上獲得）。Abysis資料庫網站還包括已經開發用於識別可以根據本文的教導使用的CDR的一般規則。除非另有說明，否則本文所述的所有CDR均根據Kabat的Abysis資料庫網站獲得。

兩個氨基酸序列之間的百分比同一性可以使用E.Meyers和W.Miller的演算法(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))確定，該演算法已被併入ALIGN程式（版本2.0），使用PAM120權重殘基表，空位長度罰分為12，空位罰分為4。另外，兩個氨基酸序列之間的百分比同一性可以藉由Needleman和Wunsch的演算法(J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))確定，其已併入GCG套裝軟體（可從http://www.gcg.com獲得）中的GAP程式中，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，空隙權重為16、14、12、10、8、6或4，長度權重為1、2、3、4、5或6。

另外地或可選地，本發明的蛋白質序列可以進一步用作“查詢序列”來執行針對公共資料庫的搜索以例如識別相關序列。這種搜索可以使用Altschul,等人 (1990) J. MoI. Biol. 215:403-10的XBLAST程式（版本2.0）來執行。可用XBLAST程式進行BLAST蛋白質搜索，得分=50，字長=3，以獲得與本發明的抗體分子同源的氨基酸序列。為了獲得用於比較目的的空位比對，可使用空位BLAST，如Altschul等人, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402中所述的。當使用BLAST和空位BLAST程式時，可以使用各個程式（例如，XBLAST和NBLAST）的默認參數。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。

在其他實施方案中，CDR氨基酸序列可與上述相應序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。作為說明性實例，抗體可包含與如選自SEQ ID NO：1、7、13、15、21和27的序列之一所示的CDRH1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的CDRH1。

包含具有氨基酸添加、缺失和/或取代的CDR的抗OX40抗體 在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： A）一個或多個重鏈CDR（CDRH），其選自以下的至少一個： （i）選自SEQ ID NO：1、7、13、15、21和27的CDRH1，或與該CDRH1在氨基酸序列上相異在於不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH1； （ii）選自SEQ ID NO：3、9、17、23和29的CDRH2，或與該CDRH2在氨基酸序列上相異在於不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH2；和 （iii）選自SEQ ID NO：5、11、19、25和31的CDRH3，或與該CDRH3在氨基酸序列上相異在於不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH3； B）一個或多個輕鏈CDR（CDRL），其選自以下的至少一個： （i）選自SEQ ID NO：2、8、14、16、22和28的CDLH，或與該CDRL1在氨基酸序列上相異在於不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL1； （ii）選自SEQ ID NO：4、10、18、24和30的CDRL2，或與該CDRL2在氨基酸序列上相異在於不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL2；和 （iii）選自SEQ ID NO：6、12、20、26和32的CDRL3，或與該CDRL3在氨基酸序列上相異在於不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL3；或 C）A）的一個或多個CDRH和B）的一個或多個CDRL。

在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分的CDR包含不超過1個氨基酸的保守取代。本文使用的術語“保守取代”是指氨基酸取代，其不會不利地影響或改變包含氨基酸序列的蛋白質/多肽的基本性質。例如，保守取代可以藉由本領域已知的標準技術（例如定點誘變和PCR介導的誘變）引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸殘基被具有相似側鏈的另一氨基酸殘基取代的取代，例如物理或功能相似的殘基（例如具有相似的大小、形狀、電荷、化學性質包括形成共價鍵或氫鍵的能力等）至相應的氨基酸殘基的取代。本領域已經定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有鹼性側鏈的氨基酸（例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸），具有酸性側鏈的氨基酸（例如天冬氨酸和谷氨酸），具有不帶電荷的極性側鏈的氨基酸（例如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸），具有非極性側鏈的氨基酸（例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸），具有β-分支側鏈的氨基酸（例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）和具有芳香族側鏈的氨基酸（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）。因此，相應的氨基酸殘基較佳被來自相同側鏈家族的另一個氨基酸殘基取代。用於鑒定氨基酸保守取代的方法在本領域中是公知的（參見例如Brummell等人， Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi等人, Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); 和Burks等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)，其藉由引用併入本文）。 包含CDR的抗OX40抗體

在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （a）包含SEQ ID NO：1的CDRH1； （b）包含SEQ ID NO：3的CDRH2； （c）包含SEQ ID NO：5的CDRH3； （d）包含SEQ ID NO：2的CDRL1； （e）包含SEQ ID NO：4的CDRL2；和 （f）包含SEQ ID NO：6的CDRL3。

在一個具體的實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （a）由SEQ ID NO：1組成的CDRH1； （b）由SEQ ID NO：3組成的CDRH2； （c）由SEQ ID NO：5組成的CDRH3； （d）由SEQ ID NO：2組成的CDRL1； （e）由SEQ ID NO：4組成的CDRL2；和 （f）由SEQ ID NO：6組成的CDRL3。

在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （a）包含SEQ ID NO：7的CDRH1； （b）包含SEQ ID NO：9的CDRH2； （c）包含SEQ ID NO：11的CDRH3； （d）包含SEQ ID NO：8的CDRL1； （e）包含SEQ ID NO：10的CDRL2；和 （f）包含SEQ ID NO：12的CDRL3。

在一個具體的實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （a）由SEQ ID NO：7組成的CDRH1； （b）由SEQ ID NO：9組成的CDRH2； （c）由SEQ ID NO：11組成的CDRH3； （d）由SEQ ID NO：8組成的CDRL1； （e）由SEQ ID NO：10組成的CDRL2；和 （f）由SEQ ID NO：12組成的CDRL3。

在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （a）包含SEQ ID NO：13的CDRH1； （b）包含SEQ ID NO：9的CDRH2； （c）包含SEQ ID NO：11的CDRH3； （d）包含SEQ ID NO：14的CDRL1； （e）包含SEQ ID NO：10的CDRL2；和 （f）包含SEQ ID NO：12的CDRL3。

在一個具體的實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （a）由SEQ ID NO：13組成的CDRH1； （b）由SEQ ID NO：9組成的CDRH2； （c）由SEQ ID NO：11組成的CDRH3； （d）由SEQ ID NO：14組成的CDRL1； （e）由SEQ ID NO：10組成的CDRL2；和 （f）由SEQ ID NO：12組成的CDRL3。

在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （a）包含SEQ ID NO：15的CDRH1； （b）包含SEQ ID NO：17的CDRH2； （c）包含SEQ ID NO：19的CDRH3； （d）包含SEQ ID NO：16的CDRL1； （e）包含SEQ ID NO：18的CDRL2；和 （f）包含SEQ ID NO：20的CDRL3。

在一個具體的實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （a）由SEQ ID NO：15組成的CDRH1； （b）由SEQ ID NO：17組成的CDRH2； （c）由SEQ ID NO：19組成的CDRH3； （d）由SEQ ID NO：16組成的CDRL1； （e）由SEQ ID NO：18組成的CDRL2；和 （f）由SEQ ID NO：20組成的CDRL3。

在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （a）包含SEQ ID NO：21的CDRH1； （b）包含SEQ ID NO：23的CDRH2； （c）包含SEQ ID NO：25的CDRH3； （d）包含SEQ ID NO：22的CDRL1； （e）包含SEQ ID NO：24的CDRL2；和 （f）包含SEQ ID NO：26的CDRL3。

在一個具體的實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （a）由SEQ ID NO：21組成的CDRH1； （b）由SEQ ID NO：23組成的CDRH2； （c）由SEQ ID NO：25組成的CDRH3； （d）由SEQ ID NO：22組成的CDRL1； （e）由SEQ ID NO：24組成的CDRL2；和 （f）由SEQ ID NO：26組成的CDRL3。

在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （a）包含SEQ ID NO：27的CDRH1； （b）包含SEQ ID NO：29的CDRH2； （c）包含SEQ ID NO：31的CDRH3； （d）包含SEQ ID NO：28的CDRL1； （e）包含SEQ ID NO：30的CDRL2；和 （f）包含SEQ ID NO：32的CDRL3。

在一個具體的實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （a）由SEQ ID NO：27組成的CDRH1； （b）由SEQ ID NO：29組成的CDRH2； （c）由SEQ ID NO：31組成的CDRH3； （d）由SEQ ID NO：28組成的CDRL1； （e）由SEQ ID NO：30組成的CDRL2；和 （f）由SEQ ID NO：32組成的CDRL3。 包含重鏈可變區和輕鏈可變區的抗OX40抗體

在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含： （A）重鏈可變區（VH），其中： （i）包含選自SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43的氨基酸序列； （ii）包含與選自SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43的氨基酸序列具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；或 （iii）包含與選自SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43的氨基酸序列相比具有一個或多個氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或 （B）輕鏈可變區，其中： （i）包含選自SEQ ID NO：34、36、38、40、42和44的氨基酸序列； （ii）包含與選自SEQ ID NO：34、36、38、40、42和44的氨基酸序列具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；或 (iii）包含與選自SEQ ID NO：34、36、38、40、42和44的氨基酸序列相比具有一個或多個氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

在一個具體的實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含由SEQ ID NO：33的氨基酸序列組成的重鏈可變區和由SEQ ID NO：34的氨基酸序列組成的輕鏈可變區。

在一個具體的實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含由SEQ ID NO：35的氨基酸序列組成的重鏈可變區和由SEQ ID NO：36的氨基酸序列組成的輕鏈可變區。

在一個具體的實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含由SEQ ID NO：37的氨基酸序列組成的重鏈可變區和由SEQ ID NO：38的氨基酸序列組成的輕鏈可變區。

在一個具體的實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含由SEQ ID NO：39的氨基酸序列組成的重鏈可變區和由SEQ ID NO：40的氨基酸序列組成的輕鏈可變區。

在一個具體的實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含由SEQ ID NO：41的氨基酸序列組成的重鏈可變區和由SEQ ID NO：42的氨基酸序列組成的輕鏈可變區。

在一個具體的實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分包含由SEQ ID NO：43的氨基酸序列組成的重鏈可變區和由SEQ ID NO：44的氨基酸序列組成的輕鏈可變區。

在其它實施方案中，重鏈可變區和/或輕鏈可變區的氨基酸序列可以與上述各個序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93 ％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。作為說明性實例，抗體可以包含與SEQ ID NO：33的氨基酸序列組成的重鏈可變區具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重鏈可變區。

在一些進一步的實施方案中，分離的抗體或其抗原結合部分可以包含重鏈和/或輕鏈的可變區中的氨基酸的保守取代或修飾。本領域理解的是，可以進行某些不消除抗原結合的保守序列修飾。參見例如Brummell等人 (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt等人 (1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov等人 (1997) J. Biol. Chem. 272:26864- 26870; Hall等人 (1992) J. Immunol. 149:1605-12; Kelley and O’ Connell (1993) Biochem. 32:6862-35; Adib-Conquy等人 (1998) Int. Immunol. 10:341-6 and Beers等人 (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43。

如上所述，本文使用的術語“保守取代”是指氨基酸取代，其不會不利地影響或改變包含氨基酸序列的蛋白質/多肽的基本性質。例如，保守取代可以藉由本領域已知的標準技術（例如定點誘變和PCR介導的誘變）引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸殘基被具有相似側鏈的另一氨基酸殘基取代的取代，例如物理或功能相似的殘基（例如具有相似的大小、形狀、電荷、化學性質包括形成共價鍵或氫鍵的能力等）至相應的氨基酸殘基的取代。本領域已經定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有鹼性側鏈的氨基酸（例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸），具有酸性側鏈的氨基酸（例如天冬氨酸和谷氨酸），具有不帶電荷的極性側鏈的氨基酸（例如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸），具有非極性側鏈的氨基酸（例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸），具有β-分支側鏈的氨基酸（例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）和具有芳香族側鏈的氨基酸（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）。因此，相應的氨基酸殘基較佳被來自相同側鏈家族的另一個氨基酸殘基取代。用於鑒定氨基酸保守取代的方法在本領域中是公知的（參見例如Brummell等人， Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi等人， Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); 和Burks等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)，其藉由引用併入本文）。 表位競爭結合和表位作圖

將進一步理解的是，所揭露的抗體將與由所選擇的靶或其片段呈遞的離散表位或免疫原性決定簇締合或結合。在一些實施方案中，表位或免疫原性決定簇包括分子的化學活性表面分組，例如氨基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基。在一些實施方案中，表位可以具有特定的三維結構特徵和/或特異性電荷特性。因此，如本文所用，術語“表位”包括能夠與免疫球蛋白或T細胞受體特異性結合或以其他方式與分子相互作用的任何蛋白質決定簇。在一些實施方案中，當抗體優先識別蛋白質和/或大分子的複雜混合物中的其靶抗原時，抗體被認為特異性結合（或免疫特異性結合或反應）抗原。在一些實施方案中，當平衡解離常數（K_D ）小於或等於10^-6 M或者小於或等於10^-7 M時，更較佳當K_D 小於或等於10^-8 M時，甚至更較佳當K_D 小於或等於10^-9 M時，抗體被認為特異性結合抗原。

由連續氨基酸形成的表位元（有時稱為“線性”或“連續”表位）通常在蛋白質變性時保留，而藉由三級折疊形成的表位通常在蛋白質變性後丟失。在任何情況下，抗體表位元通常在獨特的空間構象中包含至少3個，更通常地至少5或8-10個氨基酸。

在這方面，應該理解的是，在一些實施方案中，表位可以與例如PD-1蛋白的一個或多個區域、結構域或基序結合或位於其中。類似地，本領域公認的術語“基序”將根據其通用含義使用，並且通常應該是指通常十至二十個連續氨基酸殘基的蛋白質的短保守區域。

無論如何，一旦確定了抗原上的所需表位，就有可能產生針對該表位的抗體，例如藉由使用本發明中描述的技術用包含表位的肽免疫。或者，在發現過程中，抗體的產生和表徵可以闡明關於位於特定結構域或基序中的期望表位元的資訊。從這些資訊中，有可能競爭性篩選與相同表位的結合的抗體。實現這一點的方法是進行競爭研究以發現彼此競爭性結合的抗體，即抗體競爭結合抗原。在WO 03/48731中描述了基於其交叉競爭對抗體進行競爭結合的高通量方法。競爭結合或結構域水準或表位元作圖包括抗體競爭或在酵母上的抗原片段表達的其他方法在本領域中是公知的。

如本文所用，術語“競爭結合”是指用於基於抗原結合特徵和競爭對抗體進行分組或分類的方法。儘管這些技術對於定義和分類本發明的抗體是有用的，但是這些倉（bin）並不總是直接與表位結合，並且表位結合的這種初始測定可以藉由本領域中和如本文所述的其他公認的方法進一步改進和確認。然而，可以理解的是，將抗體憑經驗性地分配至各個倉提供了可以指示所揭露的抗體的治療潛力的資訊。

更具體地，可以藉由使用本領域已知和本文實施例中所示的方法確定選定的參考抗體（或其片段）是否結合相同的表位或與第二測試抗體交叉競爭結合（即，在相同的倉內）。

其他相容的表位作圖技術包括丙氨酸掃描突變體，肽印跡（Reineke（2004）Methods Mol Biol 248：443-63）（特別地藉由引用整體併入本文）或肽切割分析。另外，可以使用諸如抗原的表位切除，表位元提取和化學修飾等方法（Tomer（2000）Protein Science 9：487-496）（特別地藉由引用整體併入本文）。 編碼本發明抗體的核酸分子

在一些方面，本發明涉及分離的核酸分子，其包含編碼如本文所揭露的分離的抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區的核酸序列。

本發明的核酸可以使用標準分子生物學技術獲得。對於雜交瘤表達的抗體（例如，如下文進一步描述的由攜帶人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠製備的雜交瘤），可以藉由標準PCR擴增或cDNA克隆技術獲得編碼藉由雜交瘤製備的抗體的輕鏈和重鏈的cDNA。對於從免疫球蛋白基因文庫獲得的抗體（例如，使用噬菌體展示技術），編碼這種抗體的核酸可以從基因文庫中回收。

藉由將編碼VH的核酸可操作地連接至編碼重鏈恆定區（CH1，CH2和CH3）的另一DNA分子，可將編碼VH區的分離的核酸轉化為全長重鏈基因。人重鏈恆定區基因的序列在本領域中是已知的（參見例如Kabat等（1991），同上），並且藉由標準PCR擴增可以獲得包含這些區域的DNA片段。重鏈恆定區可以是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgE，IgM或IgD恆定區，但更較佳是IgG1或IgG4恆定區。

藉由將編碼VL的DNA可操作地連接至編碼輕鏈恆定區CL的另一DNA分子，可將編碼VL區的分離的核酸轉化為全長輕鏈基因（以及Fab輕鏈基因）。人輕鏈恆定區基因的序列是本領域已知的（參見例如Kabat等，同上），並且可以藉由標準PCR擴增獲得包含這些區域的DNA片段。在較佳的實施方案中，輕鏈恆定區可以是κ或λ恆定區。

一旦獲得編碼VH和VL區段的DNA片段，可以藉由標準重組DNA技術進一步操作這些DNA片段，例如將可變區基因轉化為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中，編碼VL或VH的DNA片段與編碼另一種蛋白質的另一DNA片段例如抗體恆定區或柔性接頭可操作地連接。在本文中使用的術語“可操作地連接”旨在表示兩個DNA片段連接成使得兩個DNA片段編碼的氨基酸序列保持在框內。

在一些實施方案中，本發明涉及分離的核酸分子，其包含編碼如本文所揭露的分離的抗體的重鏈可變區的核酸序列。

在一些具體的實施方案中，分離的核酸分子編碼分離的抗體的重鏈可變區並且包含選自以下的核酸序列： （A）編碼如SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43所示的重鏈可變區的核酸序列； （B）如SEQ ID NO：45、47、49、51、53或55所示的核酸序列；或 （C）在高度嚴格條件下與（A）或（B）的核酸序列的互補鏈雜交的核酸序列。

例如，核酸分子由SEQ ID NO：45、47、49、51、53或55組成。或者，核酸分子與SEQ ID NO：45、47、49、51、53或55共有至少80％ （例如至少85％、86％、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些具體實施方案中，同一性百分比源自遺傳密碼的簡並性，並且編碼的蛋白質序列保持不變。

在一些實施方案中，本發明涉及分離的核酸分子，其包含編碼如本文所揭露的分離的抗體的輕鏈可變區的核酸序列。

在一些具體的實施方案中，分離的核酸分子編碼分離的抗體的輕鏈可變區，其包含選自以下的核酸序列： （A）編碼如SEQ ID NO：34、36、38、40、42或44所示的輕鏈可變區的核酸序列; （B）如SEQ ID NO：46、48、50、52、54或56所示的核酸序列；或者 （C）在高度嚴格條件下與（A）或（B）的核酸序列的互補鏈雜交的核酸序列。

例如，核酸分子由SEQ ID NO：46、48、50、52、54或56組成。或者，核酸分子與SEQ ID NO：46、48、50、52、54或56共有至少80％（例如至少85％、86％、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些具體實施方案中，同一性百分比源自遺傳密碼的簡並性，並且編碼的蛋白質序列保持不變。

示例性的高嚴格條件包括在45℃下在5X SSPE和45％甲醯胺中雜交，並在65℃在0.1X SSC中進行最終洗滌。本領域中應理解，可藉由改變溫度和緩衝液或鹽濃度來實現等同嚴格度的條件，如Ausubel等人(編輯), Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons (1994), 第6.0.3至6.4.10頁中所述。可以基於探針的鳥苷/胞嘧啶（GC）鹼基配對的長度和百分比，憑經驗確定或精確計算雜交條件中的改變。可如Sambrook等人（編輯），Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989)，第9.47至9.51頁中所述計算雜交條件。 藥物組合物

在一些方面，本發明涉及藥物組合物，其包含至少一種如本文所揭露的抗體或其抗原結合部分和藥學上可接受的載體。 組合物的組分

藥物組合物可以任選地含有一種或多種另外的藥物活性成分，例如另一種抗體或藥物。本發明的藥物組合物還可以與例如另一種免疫刺激劑、抗癌劑、抗病毒劑或疫苗組合施用，使得抗OX40抗體增強對疫苗的免疫反應。藥學上可接受的載體可以包括例如藥學上可接受的液體、凝膠或固體載體、水性介質、非水性介質、抗微生物劑、等滲劑、緩衝劑、抗氧化劑、麻醉劑、懸浮/分散劑、螯合劑、稀釋劑、佐劑、賦形劑或無毒的輔助物質，本領域已知的各種組分的組合或更多。

合適的組分可以包括例如抗氧化劑、填充劑、黏合劑、崩解劑、緩衝劑、防腐劑、潤滑劑、調味劑、增稠劑、著色劑、乳化劑或穩定劑如糖和環糊精。合適的抗氧化劑可包括例如甲硫氨酸、抗壞血酸、EDTA、硫代硫酸鈉、鉑、過氧化氫酶、檸檬酸、半胱氨酸、巰基甘油、巰基乙酸、巰基山梨糖醇、丁基甲基苯甲醚、丁基化羥基甲苯和/或丙基砷酸鹽。如本發明所揭露的，在包含還原抗體或其抗原結合片段的一種或多種抗氧化劑如甲硫氨酸的含有本發明揭露的組合物的抗體或抗原結合片段的溶劑中，其可被氧化。氧化還原可防止或減少結合親和力的降低，從而增強抗體穩定性並延長保質期。因此，在一些實施方案中，本發明提供了包含一種或多種抗體或其抗原結合片段和一種或多種抗氧化劑如甲硫氨酸的組合物。本發明進一步提供了多種方法，其中將抗體或其抗原結合片段與一種或多種抗氧化劑如甲硫氨酸混合。從而，抗體或其抗原結合片段可以被防止氧化，以延長其保質期和/或增加活性。

為了進一步說明，藥學上可接受的載體可以包括例如含水媒介物，例如氯化鈉注射液、林格氏注射液、等滲右旋糖注射液、無菌水注射液，或右旋糖和乳酸林格注射液、非含水媒介物例如植物來源的不揮發性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油、抑菌或抑真菌濃度的抗微生物劑、等滲劑例如氯化鈉或葡萄糖、緩衝劑例如磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑、抗氧化劑例如硫酸氫鈉、局部麻醉劑例如鹽酸普魯卡因、懸浮劑和分散劑例如羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮、乳化劑例如聚山梨酯80 （TWEEN-80）、隔離試劑或螯合劑如EDTA （乙二胺四乙酸）或EGTA （乙二醇四乙酸）、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。可將用作載體的抗微生物劑添加到包含酚類或甲酚類、汞製劑、苯甲醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯紮氯銨和苄索氯銨的多劑量容器中的藥物組合物中。合適的賦形劑可以包括例如水、鹽水、右旋糖、甘油或乙醇。合適的無毒輔助物質可以包括例如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、溶解度增強劑或諸如乙酸鈉、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或環糊精的試劑。 施用、製劑和劑量

本發明的藥物組合物可以藉由各種途徑體內施用至有需要的受試者，該途徑包括但不限於口服、靜脈內、動脈內、皮下、腸胃外、鼻內、肌內、顱內、心內、心室內、氣管內、口腔、直腸、腹膜內、皮內、局部、經皮和鞘內，或者藉由植入或吸入。本發明組合物可以配製成固體、半固體、液體或氣體形式的製劑；包括但不限於片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、軟膏劑、溶液劑、栓劑、灌腸劑、注射劑，吸入劑和氣霧劑。根據預期的應用和治療方案可以選擇合適的製劑和施用途徑。

用於腸內施用的合適製劑包括硬或軟的明膠膠囊，丸劑，片劑，包括包衣片劑，酏劑，混懸劑，糖漿劑或吸入劑及其控釋劑型。

適用於腸胃外施用（例如藉由注射）的製劑包括活性成分溶解、懸浮於其中或以其他方式提供的（例如，在脂質體或其他微粒中）的水性或非水性、等滲、無熱原、無菌液體（例如溶液，混懸液）。這些液體可以另外含有其它藥學上可接受的成分，例如抗氧化劑，緩衝劑，防腐劑，穩定劑，抑菌劑，懸浮劑，增稠劑和使製劑與預期接受者的血液（或其他相關體液）等滲的溶質。賦形劑的實例包括例如水，醇、多元醇、甘油、植物油等。適用於此類製劑的等滲載體的實例包括氯化鈉注射液、林格溶液或乳酸林格氏注射液。類似地，特定劑量方案（包括劑量，時間和重複）將取決於具體個體和個體的病史以及諸如藥代動力學（例如半衰期，清除率等）的經驗考慮。

施用頻率可以在治療過程中確定和調整，並且基於減少增殖或致瘤細胞的數量，維持這種腫瘤細胞的減少，減少腫瘤細胞的增殖或延遲轉移的發展。在一些實施方案中，施用的劑量可以被調節或減少以控制潛在的副作用和/或毒性。或者，本發明治療組合物的持續連續釋放製劑可能是合適的。 本

領域技術人員將會理解，合適的劑量可因患者而異。確定最佳劑量通常涉及治療益處水準與任何風險或有害副作用的平衡。所選擇的劑量水準將取決於多種因素，包括但不限於特定化合物的活性，施用，施用時間，化合物清除速率，治療持續時間，其他聯合使用的藥物、化合物和/或材料，病症的嚴重程度，以及物種，患者的性別、年齡、體重、病情、一般健康狀況和以前的病史。化合物的量和施用途徑最終由醫生、獸醫或臨床醫師決定，但通常選擇劑量以達到實現所需效果的作用部位處的局部濃度，而不會導致實質性的有害或不利副作用。

通常，本發明的抗體或其抗原結合部分可以以各種範圍施用。這些包括每劑量約5μg/kg體重至約100mg/kg體重；每劑量約50μg/kg體重至約5mg/kg體重；每劑量約100μg/kg體重至約10mg/kg體重。其他範圍包括每劑量約100μg/kg體重至約20mg/kg體重和每劑量約0.5mg/kg體重至約20mg/kg體重。在某些實施方案中，劑量為至少約100μg/kg體重，至少約250μg/kg體重，至少約750μg/kg體重，至少約3mg/kg體重，至少約5mg/kg體重，至少約10mg/kg體重。

無論如何，本發明的抗體或其抗原結合部分較佳根據需要施用於有需要的受試者。本領域技術人員可以確定施用頻率，例如主治醫生基於所治療病症、所治療受試者的年齡、所治療病症的嚴重程度、所治療受試者的一般健康狀況等的考慮。

在某些較佳的實施方案中，涉及本發明的抗體或其抗原結合部分的治療過程將包含在數週或數月的時間內施用的多劑量的所選藥物產品。更具體地說，本發明的抗體或其抗原結合部分可以每天、每兩天、每四天、每週、每十天、每兩週、每三週、每月、每六週、每兩個月、每十週或每三個月施用。就此而言，可以理解的是，可以基於患者響應和臨床實踐來改變劑量或者調整間隔。

在給予一次或多次施用的個體中也可憑經驗確定所揭露的治療組合物的劑量和方案。例如，可給予個體增量劑量的如本文所述產生的治療組合物。在選定的實施方案中，劑量可分別根據經驗確定或觀察到的副作用或毒性逐漸增加或減少或減輕。為了評估所選擇的組合物的功效，可以如前所述跟蹤特定疾病、病症或病情的標誌物。對於癌症，這些包括藉由觸診或視覺觀察直接測量腫瘤大小，藉由X射線或其他成像技術間接測量腫瘤大小；藉由直接腫瘤活組織檢查和腫瘤樣本的顯微鏡檢查評估的改善；測量根據本文所述方法鑒定的間接腫瘤標誌物（例如用於前列腺癌的PSA）或致瘤性抗原，疼痛或麻痹的減輕；與腫瘤相關的言語、視力、呼吸或其他失能的改善；食欲增加；或藉由接受的測試測量的生活品質的提高或生存期的延長。本領域技術人員將明白，劑量將根據個體、腫瘤病情的類型、腫瘤病情的階段、腫瘤病情是否已開始轉移至個體中的其他位置以及過去使用的治療和並行使用的治療而變化。

用於腸胃外施用（例如靜脈內注射）的相容製劑將包含濃度為約10μg/ml至約100mg/ml的如本文所揭露的抗體或其抗原結合部分。在某些選定的實施方案中，抗體或其抗原結合部分的濃度將包括20μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml或1mg/ml。在其他較佳的實施方案中，ADC濃度將包括2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml，5mg/ml，6mg/ml，8mg/ml，10mg/ml，12mg/ml，14mg ml，16mg/ml，18mg/ml，20mg/ml，25mg/ml，30mg/ml，35mg/ml，40mg/ml，45mg/ml，50mg/ml，60mg/ml，70mg/ml，80mg/ml，90mg/ml或100mg/ml。 本發明的應用

本發明的抗體、抗體組合物和方法具有許多體外和體內用途，包括例如OX40的檢測或免疫應答的增強。例如，可以將這些分子體外或離體施用于培養細胞，或例如體內施用於人受試者，以增強各種情況下的免疫力​​。免疫應答可以被調節，例如被增強、刺激或上調。

較佳的受試者包括需要增強免疫應答的人患者。該方法特別適用於治療具有可藉由增強免疫應答（例如T細胞介導的免疫應答）治療的病症的人患者。在一個具體的實施方案中，該方法特別適合於體內治療癌症。為了實現免疫的抗原特異性增強，可以將抗OX40抗體與感興趣的抗原一起施用，或者抗原可能已經存在於待治療的受試者中（例如攜帶腫瘤或病毒的受試者）。當抗OX40的抗體與另一種藥劑一起施用時，兩者可以以任何順序施用或同時施用。

本發明進一步提供了用於檢測樣品中人OX40抗原的存在或測量人OX40抗原的量的方法，包括在允許抗體或其部分與人OX40之間形成複合物的條件下使樣品和對照樣品與特異性結合人OX40的人單株抗體或其抗原結合部分接觸。然後檢測複合物的形成，其中與對照樣品相比，樣品之間的差異複合物形成表明樣品中存在人OX40抗原。此外，本發明的抗OX40抗體可用於藉由免疫親和純化來純化人OX40。 治療包括癌症在內的病症

在一些方面，本發明提供了治療哺乳動物中的病症的方法，其包括向需要治療的受試者（例如人）施用治療有效量的本文所揭露的抗體或其抗原結合部分。例如，該病症是癌症。

可以使用本揭露提供的方法治療或預防各種涉及OX40的癌症，無論是惡性的還是良性的，以及無論是原發性的還是繼發性的。該癌症可以是實體癌症或血液惡性腫瘤。此類癌症的實例包括肺癌例如支氣管癌（例如鱗狀細胞癌、小細胞癌、大細胞癌和腺癌）、肺泡細胞癌、支氣管腺瘤、軟骨性錯構瘤（非癌性）和肉瘤（癌性）；心臟癌例如黏液瘤、纖維瘤和橫紋肌瘤；骨癌例如骨軟骨瘤、軟骨瘤(condromas)、軟骨母細胞瘤、軟骨黏液樣纖維瘤、骨樣骨瘤、巨細胞瘤、軟骨肉瘤、多發性骨髓瘤、骨肉瘤、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、尤因氏瘤(尤因氏肉瘤)和網織細胞肉瘤；腦癌例如神經膠質瘤（例如多形性成膠質細胞瘤）、間變性星形細胞瘤、星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤、髓母細胞瘤、脊索瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤、松果體瘤、骨瘤、血管母細胞瘤、顱咽管瘤、脊索瘤、生殖細胞瘤、畸胎瘤、皮樣囊腫和血管瘤；消化系統中的癌症如結腸癌、平滑肌瘤、表皮樣癌、腺癌、平滑肌肉瘤、胃腺癌、腸脂肪瘤、腸神經纖維瘤、腸纖維瘤、大腸息肉和結直腸癌；肝癌如肝細胞腺瘤、血管瘤、肝細胞癌、纖維層癌、膽管癌、肝母細胞瘤和血管肉瘤；腎癌如腎腺癌、腎細胞癌、腎上腺樣瘤和腎盂的移行細胞癌；膀胱癌；血液癌如急性淋巴細胞性（淋巴母細胞性）白血病、急性髓性（髓細胞性、髓系、成髓細胞性、骨髓單核細胞性）白血病、慢性淋巴細胞性白血病（例如Sezary綜合征和毛細胞白血病）、慢性髓細胞性（髓性、髓系、粒細胞性）淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、蕈樣真菌病和骨髓增殖性疾病（包括骨髓增生性疾病如真性紅細胞增多症、骨髓纖維化、血小板增多症和慢性髓細胞性白血病）；皮膚癌如基底細胞癌、鱗狀細胞癌、黑色素瘤、卡波西氏肉瘤和佩吉特氏病；頭頸癌；與眼相關的癌症如視網膜母細胞瘤和眼內黑色素瘤;男性生殖系統癌症如良性前列腺增生、前列腺癌和睾丸癌（例如精原細胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌和絨毛膜癌）；乳腺癌；女性生殖系統癌症如子宮癌（子宮內膜癌）、宮頸的癌症（宮頸癌）、卵巢的癌症（卵巢癌）、外陰癌、陰道癌、輸卵管癌和葡萄胎；甲狀腺癌（包括乳頭狀、濾泡狀、間變性或髓質癌）；嗜鉻細胞瘤（腎上腺）；甲狀旁腺的非癌性生長；胰腺癌；和血液學癌症例如白血病、骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤和霍奇金氏淋巴瘤。在一個具體的實施方案中，癌症是結腸癌。

在一些實施方案中，癌症的實例包括但不限於B細胞淋巴瘤（包括低等級/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤（NHL）；小淋巴細胞（SL）NHL；中等等級/濾泡NHL；中等等級彌散性NHL；高等級免疫母細胞NHL；高級淋巴母細胞性NHL；高級小非裂解細胞NHL；龐大疾病NHL；套細胞淋巴瘤；AIDS相關淋巴瘤；以及瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症；慢性淋巴細胞性白血病（CLL）；急性淋巴母細胞性白血病（ALL）白血病；毛細胞白血病；慢性骨髓母細胞性白血病；和移植後淋巴增生性疾病（PTLD），以及與斑痣性錯構瘤病相關的異常血管增生、水腫（如與腦腫瘤相關的）、B細胞增殖性疾病和麥格氏綜合征。更多具體的實例包括但不限於復發性或難治性NHL、前線低級NHL、III/IV期NHL，化療耐受性NHL、前體B淋巴母細胞性白血病和/或淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、B細胞慢性淋巴細胞性白血病和/或幼淋巴細胞性白血病和/小淋巴細胞性淋巴瘤、B細胞幼淋巴細胞性淋巴瘤、免疫細胞瘤和/或淋巴漿細胞性淋巴瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、結節邊緣區-MALT淋巴瘤、結節邊緣區淋巴瘤、毛細胞白血病、漿細胞瘤和/或漿細胞骨髓瘤、低度/濾泡性淋巴瘤、中度/濾泡性NHL、套細胞淋巴瘤、濾泡中心淋巴瘤（濾泡）、中度彌漫性NHL、彌漫性大B細胞淋巴瘤、侵襲性NHL（包括侵襲性前線NHL和侵襲性復發性NHL）、自體幹細胞移植後復發性或難治性NHL (NHL relapsing after or refractory to autologous stem cell transplantation)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、高度免疫母細胞性NHL、高度淋巴母細胞NHL、高度小非裂解細胞性NHL、龐大疾病NHL、伯基特淋巴瘤、前體(外周)大顆粒淋巴細胞性白血病、蕈樣肉芽腫病和/或塞紮裡綜合征、皮膚（皮膚的）淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤。

在一些實施方案中、癌症的實例還包括但不限於B細胞增殖性病症，其還包括但不限於淋巴瘤（例如B細胞非霍奇金淋巴瘤（NHL））和淋巴細胞白血病。這種淋巴瘤和淋巴細胞性白血病包括例如a）濾泡性淋巴瘤，b）小的非裂解細胞性淋巴瘤/伯基特淋巴瘤（包括地方性伯基特淋巴瘤、散發性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特淋巴瘤），c）邊緣區淋巴瘤（包括結外邊緣區B細胞淋巴瘤（黏膜相關淋巴組織淋巴瘤，MALT）、結節邊緣區B細胞淋巴瘤和脾邊緣區淋巴瘤），d）套細胞淋巴瘤（MCL），e）大細胞淋巴瘤（包括B細胞彌漫性大細胞淋巴瘤（DLCL）、彌漫性混合細胞淋巴瘤、免疫母細胞性淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤-肺B細胞淋巴瘤），f）毛細胞白血病，g）淋巴細胞性淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症，h）急性淋巴細胞性白血病（ALL）、慢性淋巴細胞性白血病CLL）/小淋巴細胞性淋巴瘤（SLL）、B細胞幼淋巴細胞性白血病，i）漿細胞瘤、漿細胞性骨髓瘤、多發性骨髓瘤、漿細胞瘤和/或j）霍奇金氏病。

在一些其他實施方案中，該病症是自身免疫性疾病。可用抗體或其抗原結合部分治療的自身免疫性疾病的實例包括自身免疫性腦脊髓炎、紅斑狼瘡和類風濕性關節炎。抗體或其抗原結合部分還可用於治療或預防感染性疾病、炎症性疾病（例如過敏性哮喘）和慢性移植物抗宿主病。 免疫應答的刺激

在一些方面，本發明還提供增強（例如刺激）受試者的免疫應答的方法，其包括向受試者施用本發明的抗體或其抗原結合部分，以使受試者中的免疫應答增強。例如，受試者是哺乳動物。在一個具體的實施方案中，該受試者是人。

術語“增強免疫應答”或其語法變化意味著刺激、誘發、增加、改善或增強哺乳動物免疫系統的任何反應。免疫應答可以是細胞應答（即細胞介導的，例如細胞毒性T淋巴細胞介導的）或體液應答（即抗體介導的應答），並且可以是一級或二級免疫應答。增強免疫應答的實例包括增加的CD4⁺ 輔助T細胞活性和細胞溶解性T細胞的產生。可以使用本領域技術人員已知的許多體外或體內測量來評估免疫應答的增強，該測量包括但不限於細胞毒性T淋巴細胞測定、細胞因數釋放（例如IL-2產生或IFN-γ產生）、腫瘤消退、攜帶腫瘤的動物的存活、抗體產生、免疫細胞增殖、細胞表面標誌物的表達和細胞毒性。通常地，本揭露的方法當與未治療的哺乳動物或沒有使用本文揭露的方法治療的哺乳動物的免疫應答相比，增強了哺乳動物的免疫應答。在一個實施方案中，抗體或其抗原結合部分用於增強人對微生物病原體（例如病毒）的免疫應答。在另一個實施方案中，抗體或其抗原結合部分用於增強人對疫苗的免疫應答。在一個實施方案中，該方法增強細胞免疫應答，特別是細胞毒性T細胞應答。在另一個實施方案中，細胞免疫應答是T輔助細胞應答。在又一個實施方案中，免疫應答是細胞因數產生，特別是IFN-γ產生或IL-2產生。抗體或其抗原結合部分可用于增強人對微生物病原體（例如病毒）或疫苗的免疫應答。

抗體或其抗原結合部分可以作為單一療法單獨使用，或者可以與化學療法或放射療法組合使用。 與化療組合使用

抗體或其抗原結合部分可以與抗癌劑、細胞毒性劑或化學治療劑組合使用。

術語“抗癌劑”或“抗增殖劑”意指可用於治療細胞增殖性病症例如癌症的任何藥劑，並且包括但不限於細胞毒性劑、細胞抑制劑、抗血管生成劑、放射療法和放射治療劑、靶向抗癌劑、BRM、治療性抗體、癌症疫苗、細胞因數、激素療法、放射療法和抗轉移劑和免疫治療劑。應該理解的是，在如上該的選定實施方案中，此類抗癌劑可以包含綴合物並且可以在施用之前與揭露的位點特異性抗體結合。更具體而言，在某些實施方案中，將選擇的抗癌劑連接至工程化抗體的不配對半胱氨酸以提供如本文所述的工程化偶聯物。因此，這樣的工程化綴合物被明確地考慮在本發明的範圍內。在其他實施方案中，所揭露的抗癌劑將與包含如上所述的不同治療劑的位點特異性綴合物組合施用。

如本文所用，術語“細胞毒性劑”是指對細胞有毒並降低或抑制細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。在某些實施方案中，該物質是源自活生物體的天然存在的分子。細胞毒性劑的實例包括但不限於細菌（例如，白喉毒素、假單胞菌內毒素和外毒素、葡萄球菌腸毒素A），真菌（例如α-八疊球菌素、侷限麯黴素），植物（相思豆毒蛋白、蓖麻毒素、蒴蓮根毒素、槲寄生素、美洲商陸抗病毒蛋白、皂草素、白樹毒素、momoridin、天花粉蛋白、大麥毒素、油桐（Aleurites fordii）蛋白、石竹素蛋白、Phytolacca mericana蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜抑制劑、麻風樹毒蛋白、巴豆毒素、石鹼草抑制劑、白樹毒素、mitegellin、侷限麯黴素、酚黴素、新黴素和單端孢黴烯族化合物）或動物（例如細胞毒性RNA酶，如胞外胰腺RNA酶；DNA酶I，包括其片段和/或變體）的小分子毒素或酶促活性毒素。

為了本發明的目的，“化學治療劑”包括非特異性降低或抑制癌細胞的生長、增殖和/或存活的化學化合物（例如細胞毒性劑或細胞抑制劑）。這些化學試劑通常針對細胞生長或分裂所需的細胞內過程，因此對於通常快速生長和分裂的癌細胞特別有效。例如，長春新鹼使微管解聚，從而抑制細胞進入有絲分裂。通常，化學治療劑可以包括抑制或被設計用於抑制癌細胞或可能變成性或產生致瘤後代（例如TIC）的細胞的任何化學藥劑。這些藥劑通常是組合使用的，並且通常是最有效的，例如，在諸如CHOP或FOLFIRI的方案中。

可以與本發明的位點特異性構建體組合使用的抗癌劑（作為位點特異性綴合物的組分或未綴合狀態）的實例包括但不限於烷化劑、烷基磺酸鹽、氮丙啶、乙烯亞胺和甲基三聚氰胺、多聚乙醯(acetogenins)、喜樹鹼、苔蘚抑素、卡利士他汀(callystatin)、CC-1065、克瑞托欣(cryptophycins)、朵拉司他汀、多卡米星、艾榴素（eleutherobin）、水鬼蕉鹼、沙克迪因（sarcodictyin）、海綿素（spongistatin）、氮芥、抗生素、烯二炔類抗生素、dynemicin、雙膦酸鹽、埃斯波黴素、色素蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素類（aclacinomysins）、放線菌素、安麯黴素、偶氮絲氨酸、博萊黴素、放線菌素C、卡拉賓辛（carabicin）、洋紅黴素、嗜癌黴素、色黴素類（chromomycinis）、更生黴素、柔紅黴素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN^® 多柔比星、表柔比星、依索比星、伊達比星、麻西羅黴素、絲裂黴素、黴酚酸、諾加黴素、橄欖黴素、培洛黴素、博地黴素（potfiromycin）、嘌呤黴素、三鐵阿黴素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈脲菌素、殺結核菌素、烏苯美司、淨司他丁、佐柔比星；抗-代謝物、埃羅替尼、威羅菲尼、克唑替尼、索拉非尼、依魯替尼、恩雜魯胺、葉酸類似物、嘌呤類似物、雄激素、抗-腎上腺素、葉酸補充劑如弗林酸（frolinic acid）、醋葡醛內酯、醛磷醯胺糖苷、氨基乙醯丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、貝斯布希（bestrabucil）、比生群、依達曲沙、迪夫法明（defofamine）、秋水仙胺、地吖醌、艾夫尼辛（elfornithine）、依利醋銨、愛波喜龍、依託格魯、硝酸鎵、羥基脲、香菇多糖、氯尼達明、美坦生類化合物（maytansinoids）、米托胍腙、米托蒽醌、莫丹摩爾（mopidanmol）、尼特林（nitraerine）、噴司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基肼、丙卡巴肼、PSK®多糖複合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)、雷佐生；根黴素；西佐喃；鍺螺胺；替奴佐酸；三亞胺醌；2,2',2''-三氯三乙胺；單端孢黴烯類(尤其是T-2毒素、維拉庫林A（verracurin A）、杆孢菌素A和蛇形菌素)；烏拉坦；長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；呱泊溴烷；凱西托欣（gacytosine）；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環磷醯胺；噻替派；紫杉烷類；苯丁酸氮芥（chloranbucil）；GEMZAR®吉西他濱；6-硫代鳥嘌呤；巰嘌呤；氨甲喋呤；鉑類似物；長春鹼；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼，NAVELBINE®長春瑞濱；諾消靈；替尼泊苷；依達曲沙；柔紅黴素；氨基蝶呤；希羅達；伊班膦酸鹽；伊立替康(Camptosar，CPT-11)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸；類視色素；卡培他濱；考布他汀；甲醯四氫葉酸；奧沙利鉑；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR和VEGF-A的抑制劑（其減少細胞增殖），以及上述任一項的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。這一定義中還包括的是用於調節或抑制對腫瘤的激素作用的抗激素劑，諸如抗雌激素和選擇性雌激素受體調節劑，抑制調節腎上腺中的雌激素產生的芳香酶的芳香酶抑制劑，和抗-雄激素；以及曲沙他濱(1，3-二氧雜環戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸、核酶諸如VEGF表達抑制劑和HER2表達抑制劑；疫苗，PROLEUKIN^® rIL-2；LURTOTECAN^® 拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX^® rmRH；長春瑞濱和埃斯波黴素，以及上述任一項的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。 與放射療法組合使用

本發明還提供了抗體或其抗原結合部分與放射療法（即，用於在腫瘤細胞內局部誘導DNA損傷的任何機制，例如γ-照射、X-射線、UV-照射、微波、電子發射等）的組合。還考慮了使用放射性同位素至腫瘤細胞的定向遞送的聯合療法，並且所揭露的綴合物可以與靶向的抗癌劑或其他靶向手段結合使用。通常，放射療法在約1週至約2週的時間段內以脈衝方式施用。放射療法可以對患有頭頸癌的受試者施用約6至7週。任選地，放射療法可以作為單劑量或作為多個順序劑量施用。 診斷

本發明提供了用於檢測、診斷或監測增殖性病症的體外和體內方法以及篩選來自患者的細胞以鑒定腫瘤細胞包括致瘤細胞的方法。這樣的方法包括鑒定用於治療的患有癌症的個體或監測癌症的進展，包括將患者或從患者獲得的樣品（體內或體外）與本文所述的抗體接觸，並檢測樣品中與結合的或游離的靶分子的結合的抗體的存在或不存在或結合水準。在一些實施方案中，抗體將包含如本文所述的可檢測標記或報導分子。

在一些實施方案中，抗體與樣品中特定細胞的結合可表示樣品可能含有致瘤細胞，從而表明具有癌症的個體可用本文所述的抗體有效治療。

可以藉由多種測定法分析樣品，例如放射免疫測定法，酶免疫測定法（例如ELISA），競爭結合測定法，螢光免疫測定法，免疫印跡測定法，Western印跡分析和流式細胞術測定法。相容的體內診斷或診斷測定可以包括本領域公知的成像或監測技術，例如本領域技術人員已知的磁共振成像，電腦化斷層攝影（例如CAT掃描），正電子斷層掃描（例如PET掃描），放射線照相術，超音波等。 藥物包裝和試劑盒

還提供了包含包含一個或多個劑量的抗體或其抗原結合部分的一個或多個容器的藥物包裝和試劑盒。在某些實施方案中，提供單位劑量，其中單位劑量含有預定量的組合物，該組合物包含例如抗體或其抗原結合部分，具有或不具有一種或多種其他試劑。對於其他實施方案，這種單位劑量以一次性使用的預充式注射用注射器供應。在其他實施方案中，單位劑量中包含的組合物可以包含鹽水、蔗糖或類似物；緩衝液，如磷酸鹽等；和/或配製在穩定和有效的pH範圍內。或者，在某些實施方案中，綴合物組合物可以作為凍幹粉末提供，其可以在加入合適的液體（例如無菌水或鹽溶液）後重建。在某些較佳的實施方案中，組合物包含一種或多種抑制蛋白質聚集的物質，包括但不限於蔗糖和精氨酸。容器上或與容器相關聯的任何標籤指示封裝的綴合物組合物用於治療選擇的腫瘤疾病狀況。

本發明還提供了用於產生位點特異性綴合物以及任選地一種或多種抗癌劑的單劑量或多劑量施用單元的試劑盒。該試劑盒包括容器以及在容器上或與容器相關聯的標籤或包裝插頁。合適的容器包括例如瓶，小瓶，注射器等。容器可以由多種材料形成，例如玻璃或塑膠，並且包含藥學有效量的所揭露的綴合或非綴合形式的綴合物。在其他較佳實施例中，容器包括無菌存取口（例如容器可以是靜脈內溶液袋或具有可被皮下注射針頭刺穿的塞子的小瓶）。這樣的試劑盒通常在合適的容器中包含工程化偶聯物的藥學上可接受的製劑，並且任選地在相同或不同的容器中包含一種或多種抗癌劑。試劑盒還可以含有其他藥學上可接受的製劑，用於診斷或組合治療。例如，除了本發明的抗體或其抗原結合部分之外，這樣的試劑盒可以含有任何一種或多種抗癌劑，例如化學治療劑或放射治療劑；抗血管生成劑；抗轉移劑；靶向抗癌劑；細胞毒性劑；和/或其他抗癌劑。

更具體地說，試劑盒可以具有含有所揭露的抗體或其抗原結合部分的單個容器，其含有或不含另外的組分，或者它們可以具有用於每種所需試劑的不同容器。在提供用於綴合的組合治療劑的情況下，可以按摩爾當量組合或一種組分多於另一種的方式預混合單一溶液。或者，試劑盒的綴合物和任何任選的抗癌劑可以在施用于患者之前分開保存在不同的容器中。試劑盒還可以包含用於容納無菌藥學上可接受的緩衝液或其他稀釋劑例如抑菌注射用水（BWFI）、磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）、林格氏溶液和葡萄糖溶液的第二/第三容器裝置。

當試劑盒的組分以一種或多種液體溶液提供時，液體溶液較佳為水溶液，特別較佳無菌水溶液或鹽水溶液。然而，試劑盒的組分可以作為乾粉提供。當試劑或組分以乾粉形式提供時，可以藉由添加合適的溶劑來重構粉末。可以設想溶劑也可以提供於另一個容器中。

如上簡要所述，該試劑盒還可含有向患者施用抗體或其抗原結合部分和任何任選組分的工具，例如一種或多種針，I.V.袋或注射器，或者甚至滴眼器、移液管或其他類似裝置，藉由其可以將製劑注射或引入動物體內或將其施用於身體的患病區域。本發明的試劑盒通常還包括用於容納小瓶或類似物的裝置以及用於商業銷售的其他緊密封閉的部件，例如注射或吹塑塑膠容器，其中放置並且保持所需的小瓶和其他裝置。 序列表概述

本申請附帶有包含許多核酸和氨基酸序列的序列表。下表A、B和C提供了所包含的序列的概述。

如本文所揭露的六種說明性抗體是全人抗OX40單株抗體，分別稱為“1.62.3-u1-IgG1K”、“1.62.3-u1-3-IgG1K”、“1.7.10-u1-IgG1K”、“1.134.9-u1-IgG1L”、“1.186.19-u1-IgG1K”和“1.214.23-u1-IgG1K”。 表A CDR氨基酸序列

表B 可變區氨基酸序列

表C 可變區核苷酸序列

實施例

藉由參考以下實施例將更容易地理解本文一般地描述的本發明，這些實施例是以舉例說明的方式提供的，並且不旨在限制本發明。這些實施例並不旨在表示下面的實驗是全部或僅進行的實驗。 實施例1 材料的製備 1.1免疫原的產生

由Sangon Biotech合成編碼OX40蛋白的胞外結構域(ECD)的cDNA (GenBank ref CAB96543.1)，並將其插入經修飾的表達載體pcDNA3.3(ThermoFisher)中。大規模製備質粒DNA，並藉由測序驗證插入的DNA序列。藉由將人OX40 ECD基因轉染入Freestyle 293F(ThermoFisher)或Expi-293F細胞(ThermoFisher)來獲得與人Fc或His標籤偶聯的融合蛋白OX40 ECD。5天后，從暫態轉染的細胞培養物中收穫上清液。對融合蛋白進行純化和定量以用於免疫和篩選。 1.2 基準抗體的生產

在實施例中使用四種基準抗體即BMK1、BMK5、BMK7和BMK10作為陽性對照。根據美國專利第US8236930B2號(Pfizer)的11D4的克隆合成BMK1。根據美國專利申請第US20140308276號(University of Texas System)的106-222的克隆合成BMK5。根據PCT揭露第WO2016057667號(MedImmune)的OX40mAb24的克隆合成BMK7。根據PCT揭露第WO2015153513號(Genentech)的1A7.gr1的克隆合成BMK10。

1.3 建立穩定的細胞系 為了獲得用於抗體篩選和驗證的工具，我們產生了OX40轉染細胞系。簡而言之，根據製造商的方案，使用Lipofectamine 2000或PlasFect轉染試劑盒用含有全長OX40基因的經修飾的表達載體pcDNA3.3轉染CHO-K1或293F細胞。在轉染48-72小時後，將轉染的細胞在含有殺稻瘟菌素的培養基中培養以供篩選。隨著時間推移，這將篩選具有穩定地整合至其基因組DNA中的表達質粒的細胞。同時檢查細胞的OX40表達。一旦表達被證實，則單個目標克隆藉由有限稀釋挑選並擴大到大量。然後將所建立的單株細胞系維持在含有殺稻瘟菌素的培養基中培養。 實施例2 抗體雜交瘤的產生 2.1 免疫和細胞融合

使用OMT大鼠製備針對OX40的全人單株抗體，其包含可用於具有人獨特型的功能性免疫球蛋白的最佳產生的嵌合多核苷酸。如PCT揭露WO2014/093908中所述，該大鼠品系攜帶人重鏈和輕鏈轉基因。為了產生針對OX40的全人單株抗體，用磷酸鋁(Alum-Phos)作為佐劑混合20 μg人OX40 ECD蛋白在足墊部位免疫6-8週齡的OMT大鼠，並將TiterMax混合20 μg人OX40 ECD蛋白皮下注射用於第一次加強，並用Alum-Phos和TiterMax混合人OX40 ECD蛋白每兩週重複免疫。每1或2週藉由酶聯免疫吸附測定(ELISA)測量血清抗體滴度。當血清抗體效價足夠高時，用無佐劑的DPBS混合40 μg人OX40 ECD蛋白質對大鼠進行最終加強免疫。細胞融合如下進行：準備骨髓瘤細胞SP2/0，在融合前一週將骨髓瘤細胞解凍復蘇，並且每天以1：2傳代直到融合前一天，以保持細胞處於對數生長期。將從經免疫的OMT大鼠的淋巴結分離的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞(以1:1.1的比例)混合。將細胞混合物洗滌並以2 x 10⁶ 個細胞/mL重懸浮於ECF溶液中，準備好進行ECF。在細胞電融合後，將來自融合室的細胞懸液立即轉移至含有更多培養基的無菌管中，並在37℃培養箱中孵育至少24小時。將細胞懸液混合並轉移到96孔板(1 x 10⁴ 個細胞/孔)中。將96孔板在37℃，5％ CO₂ 下培養，並定期監測。當克隆足夠大時，將100 uL上清液從組織培養板轉移到96孔測定板中用於抗體篩選。 2.2 雜交瘤上清液的高通量篩選

使用ELISA作為第一篩選方法來測試雜交瘤上清液與人和猴OX40蛋白的結合。簡而言之，將平板(Nunc)用1 ug/mL的人或獼猴OX40 ECD的可溶性蛋白質在4℃包被過夜。在封閉和洗滌後，將雜交瘤上清液轉移至包被的平板並在室溫下孵育2小時。然後洗滌平板，隨後用二抗(山羊抗-大鼠IgG HRP(Bethyl))孵育1小時。洗滌後，加入TMB底物，並用2M HCl終止相互作用。使用微孔板讀數儀(Molecular Device)讀取450 nm處的吸光度。

為了證實抗OX40抗體與細胞膜上表達的構象性OX40分子的天然結合，對OX40轉染的細胞系進行流式細胞術(FACS)分析。將表達人OX40的293F細胞以1 x 10⁵ 個細胞/孔的密度轉移到96孔U形底板(Corning)中。然後將雜交瘤上清液與細胞混合並在4℃下孵育1小時。在用1 x PBS/1％BSA洗滌後，施用二抗山羊-抗大鼠Alexa647 (Jackson ImmunoResearch Lab)與細胞在4℃避光孵育半小時。然後洗滌細胞並重懸浮於1 x PBS/1％BSA中或用4％多聚甲醛固定，並藉由流式細胞術(BD)進行分析。將與未轉染OX40的293F細胞系結合的抗體用作陰性對照。將使用Jurkat NFkB-螢光素酶報告T細胞測試抗體的生物活性用作第二篩選方法。簡而言之，如上所述構建過表達人OX40/CD40融合蛋白的Jurkat NFkB-螢光素酶報告細胞。將細胞在含有10％ FBS和0.5 mg/mL潮黴素B(作為篩選)的完全RPMI1640培養基中培養。收集OX40 Jurkat報導細胞並以4 x 10⁴ 個細胞/孔添加到96孔板中。向細胞中加入交聯抗體F(ab')₂ 山羊抗-大鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Lab)和RPMI 1640完全培養基稀釋的雜交瘤上清液，然後將細胞在37℃，5％ CO₂ 中孵育過夜。第二天，將重構的螢光素酶底物(Promega)加入到每個孔(50 μL/孔)並充分混合。使用微孔板讀數儀(Molecular Device)讀取螢光素酶強度。 2.3 雜交瘤亞克隆：

一旦藉由第一和確認篩選驗證了特異性結合和生物活性，則將陽性雜交瘤細胞系用於亞克隆。簡言之，對於每個雜交瘤細胞系，對細胞進行計數並稀釋至每200 μL克隆培養基中1個細胞的密度。將細胞懸液以200 μL/孔接種到兩個96孔板中。將平板在37℃，5％ CO₂ 下培養，直至它們準備好藉由ELISA測定來檢查。收集所選單株的耗盡上清液(ESN)，並純化抗體以用於進一步表徵。 實施例3 全人抗體分子的構建和純化 3.1 雜交瘤測序

使用RNeasy Plus Mini試劑盒(Qiagen)和Trizol試劑從單株雜交瘤細胞中抽提RNA。按如下方法擴增OX40嵌合抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。簡言之，首先使用逆轉錄酶將RNA反轉錄成cDNA，如下所述。 表1. cDNA擴增反應(20 μL)

表2 cDNA擴增反應條件

將所得cDNA用作後續PCR擴增的範本，使用對目標基因特異的引物。 PCR反應如下進行。 表3. PCR反應系統(50 μL)

表4. PCR反應條件

將PCR產物(10 μL)插入到pMD18-T載體中；並將10 μL連接產物轉化入Top 10感受態細胞。將轉化的細胞鋪在2-YT + Cab平板上並培養過夜。使用M13-48和M13-47引物藉由PCR檢查陽性克隆，然後測序。

選擇雜交瘤克隆1.7.10、1.62.3、1.134.9、1.186.19和1.214.23用於序列最佳化和進一步評估。 3.2 抗體序列最佳化

藉由將特定位元點處的適當修飾引入編碼抗體的核苷酸序列來進行抗體序列最佳化。根據製造商的方案，使用QuickChange誘變試劑盒藉由定點誘變引入去除PTM(翻譯後修飾)位點的突變。

雜交瘤克隆1.62.3重鏈的CDR1中的氨基酸NGG被鑒定為脫醯胺位點，因此設計反義誘變核苷酸以將以下突變引入“1.62.3-u1-IgG1K”重鏈：N至Q(NGG-QGG)、N至S(NGG-SGG)或G至A(NGG-NAG)。克隆1.62.3輕鏈的CDR1中的氨基酸C被鑒定為半胱氨酸殘基，因此將半胱氨酸(C至S)突變為絲氨酸。藉由測序驗證所有的突變。

第1圖顯示PTM突變後變體之間的比較。變體分別命名為抗體“1.62.3-u1-1-IgG1K”、“1.62.3-u1-2-IgG1K”和“1.62.3-u1-2-IgG1K”。抗體“1.62.3-u1-1-IgG1K”含有N至Q的突變，“1.62.3-u1-2-IgG1K”含有N至S的突變，“1.62.3-u1-3-IgG1K”含有G至A突變。 3.3 全人抗體分子的構建和純化

如上所述擴增OX40雜交瘤抗體的VH和VL。將合成基因重新克隆到經修飾的人IgG1表達載體pcDNA3.4(ThermoFisher)中以表達全人抗體。用載體暫態轉染Expi-293F細胞以用於抗體表達。收集含有抗體的培​​養上清液並使用蛋白A層析進行純化。 全人單株抗體1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-IgG1K(序列最佳化的克隆命名為“1.62.3-u1-3-IgG1K”)、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K分別從雜交瘤克隆1.7.10、1.62.3、1.134.9、1.118.19和1.214.23雜交瘤獲得。其序列概括於表A、B和C中。 實施例4 抗體表徵 4.1 藉由表面電漿共振(SPR)測試完整結合動力學親和力

藉由使用Biacore T200 (GE)進行SPR測定來表徵抗體針對OX40的親和力和結合動力學。將抗人IgG抗體預固定到感測器晶片(CM5)上，並且當注射至晶片時捕獲稀釋於緩衝液(1×HBS-EP +，GE)中的抗OX40抗體。然後將不同濃度的人或猴OX40蛋白和緩衝液以30 μL/min的流速流過感測器晶片，進行180s的締合相，然後進行解離。使用BIAevaluation T200軟體藉由1：1 Langmuir結合模型擬合結合和解離曲線。

實驗結果顯示於下表5中。 表5. 藉由SPR測定的針對人OX40的完全動力學結合親和力

如表5所示，本發明的說明性抗體(包括1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-IgG1K、1.62.3-u1-3-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19 -u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K)以高特異性與人OX40結合，K_D 為1.79×10^-10 M至2.08×10^-9 M。 4.2 藉由流式細胞術測定的結合親和力分析

將表達人OX40的CHO-K1細胞以5×10⁴ 個細胞/mL的密度轉移到96孔U形底板(Corning)中。將測試抗體在洗滌緩衝液(1 x PBS/1％BSA)中以1:2梯度稀釋，並與細胞在4℃下一起孵育1小時。加入二抗山羊抗-人IgG Fc FITC (3.2摩爾FITC/摩爾IgG，Jackson Immunoresearch Lab)並與細胞一起在4℃避光孵育半小時。然後洗滌細胞一次，重懸浮於1 x PBS/1％BSA中並藉由流式細胞術(BD)分析。基於定量小球Quantum^TM MESF試劑盒(Bangs Laboratories, Inc.)將螢光強度轉化為每個細胞結合的分子數。使用Graphpad Prism5計算每種抗體的K_D 值。

將由流式細胞術測定的抗人OX40抗體針對表達人OX40的CHO-K1細胞的結合的資料顯示於表6和第2圖中。資料證明說明性抗體1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-3-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K對表達人OX40的CHO-K1細胞具有良好的結合效率。 表6. 藉由流式細胞術測試的抗-OX40抗體針對細胞表面人OX40的結合親和力

如表6和第2圖中所示，抗體1.134.9-u1-IgG1L和1.214.23-u1-IgG1K以可與BMK7和BMK10相當或甚至高於其的高親和力與細胞表面人OX40結合。 4.3 抗OX40抗體與OX40的結合

基於細胞的FACS用於測試抗OX40抗體對OX40的結合活性。簡而言之，將表達人OX40的CHO-K1細胞或活化的人CD4⁺ T細胞以1 x 10⁵ 個細胞/孔的密度轉移到96孔U底板(Corning)中。將測試抗體在洗滌緩衝液(1 x PBS/1％BSA)中連續稀釋並與細胞一起在4℃下孵育1小時。在用1 x PBS/1％BSA洗滌後，施用二抗山羊抗-人IgG Fc-PE (Jackson ImmunoResearch Lab)並與細胞一起在4℃避光孵育1小時。然後洗滌細胞並重懸浮於1 x PBS/1％BSA中或用4％多聚甲醛固定，然後藉由流式細胞術(BD)分析。

第3圖顯示了藉由流式細胞術測定的抗OX40抗體對活化的人CD4⁺ T細胞的結合的資料。資料顯示說明性抗體1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K以劑量依賴性方式與細胞表面人OX40結合。 4.4 對配體與OX40的結合的競爭

使用基於ELISA的競爭測定來測試抗OX40抗體是否可競爭性阻斷OX40與OX40配體(OX40L)的結合。簡而言之，將酶標板(Nunc)在4℃用包被1 μg/mL的人OX40 ECD過夜。將抗體在封閉緩衝液中梯度稀釋並與恆定濃度的OX40L混合。封閉和洗滌後，將抗體/OX40L混合物加入酶標板中，然後在室溫下孵育1小時。然後洗滌平板，隨後用HRP偶聯的二抗孵育1小時以檢測OX40L與OX40 ECD的結合。洗滌後，加入TMB底物，並用2M HCl終止相互作用。使用微孔板讀數儀(Molecular Device)讀取450 nm和540 nm處的吸光度。

如第4圖所示，說明性抗體1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K與OX40L競爭地結合人OX40。 4.5 直系同源物(物種交叉)結合測試

藉由基於細胞的FACS測量抗OX40抗體與獼猴OX40的交叉反應性。簡而言之，將表達獼猴OX40的293F細胞以2 x 10⁵ 個細胞/孔的密度轉移到96孔U形底板(Corning)中。將測試抗體在洗滌緩衝液(1 x PBS/1％BSA)中梯度稀釋並與細胞在4℃下孵育1小時。用1 x PBS/1％BSA洗滌後，施用二抗山羊抗-人IgG Fc-PE (Jackson ImmunoResearch Lab)並與細胞一起在4℃避光孵育1小時。然後洗滌細胞並重懸浮於1 x PBS/1％BSA中或用4％多聚甲醛固定，然後藉由流式細胞術(BD)分析。

如第5圖所示，說明性抗體1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-3-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K與轉染了獼猴OX40的293F細胞發生交叉反應性結合。 4.6 同系物(家族交叉)結合

在4℃下將人OX40、CD40、4-1BB(CD137)和CD271 ECD包被在酶標板(Nunc)上過夜。封閉和洗滌後，將測試抗體在封閉緩衝液中稀釋並加入酶標板並在室溫下孵育1小時。然後洗滌酶標板，隨後用二抗山羊抗-人IgG Fc-HRP(Bethyl)孵育1小時。洗滌後，加入TMB底物，並用2M HCl終止相互作用。使用微孔板讀數儀(Molecular Device)讀取450 nm和540 nm處的吸光度。

藉由ELISA測定的抗OX40抗體對人CD40、4-1BB (CD137)和CD271 ECD的家族交叉結合測試的結果顯示於第6圖中。結果證明，OX40抗體1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K特異性結合OX40（即，CD134），並且不結合人CD40、CD137和CD271。 4.7 針對BMK抗體的抗原表位競爭結合測試(epitope binning)

藉由ELISA將抗OX40抗體的結合表位與基準抗體進行競爭結合。在4℃下將測試抗體包被在酶標板(Nunc)上過夜。封閉和洗滌後，將在封閉緩衝液中稀釋的恆定濃度的人OX40蛋白加入酶標板並在室溫下孵育1小時。然後將生物素化的基準抗體梯度稀釋並加入到每個孔中並再孵育1小時。然後洗滌酶標板，隨後加入二抗HRP偶聯的鏈黴親和素(Life Technology)孵育1小時。洗滌後，加入TMB底物，並用2M HCl終止相互作用。使用微孔板讀數儀(Molecular Device)讀取450 nm和540 nm處的吸光度。

第7A圖、第7B圖和第7 C圖分別顯示了抗體1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K針對基準抗體BMK1 (第7A圖)、BMK7 (第7B圖)和BMK10 (第7C圖)的表位元結合競爭情況。如第7A圖所示，抗體1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K的表位與BMK1不同。如第7B圖和第7C圖所示，抗體1.62.3-u1-IgG1K和1.134.9-u1-IgG1L的表位與BMK7和BMK10不同，而抗體1.7.10-u1-IgG1K、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K的表位與BMK7和BMK10類似或接近。 4.8使用Jurkat NFkB-螢光素酶報告T細胞的生物活性測定

使用表達OX40/CD40融合蛋白和NFkB-螢光素酶報告基因的工程化Jurkat細胞系評估抗OX40抗體啟動人OX40信號通路的能力。該實驗檢測了使用抗人IgG Fc試劑或表達人Fcγ受體的細胞交聯的抗OX40抗體的生物活性。將Jurkat NFkB-螢光素酶報告細胞培養在含有10％ FBS和0.5 mg/mL潮黴素B(作為篩選)的RPMI 1640完全培養基中。

為了測定交聯條件下抗OX40抗體的生物活性，使用表達CD32b的CHO-K1細胞或F(ab')₂ 山羊抗-人IgG (Jackson ImmunoResearch Lab)介導抗體交聯，其聚集並活化在Jurkat報告細胞上的OX40受體。收集OX40 Jurkat報告細胞並加入到96孔板中。將在完全培養基中梯度稀釋的OX40抗體在表達CD32b的CHO-K1細胞、親本CHO-K1細胞或交聯劑抗體存在的情況下加入到細胞中，並在37℃，5％ CO₂ 下孵育平板6小時或過夜。將重構的螢光素酶底物(Promega)加入到每個孔中並充分混合。使用微孔板讀數儀(Molecular Device)讀取螢光素酶強度。還測試了抗OX40抗體在游離條件下的生物活性。

第8A圖、第8B圖和第8C圖顯示了使用游離抗體或藉由表達CD32b的CHO-K1細胞或抗-人IgG Fc試劑的FcγR交聯測試抗體對Jurkat細胞中OX40刺激的NFkB螢光素酶活性的影響。分別顯示了(第8A圖)游離抗體或(第8B圖)被F(ab')₂ 山羊抗-人IgG交聯的抗體或(第8C圖)被表達CD32b的CHO-K1細胞交聯的抗體的報告基因的活性。

如第8A圖、第8B圖和第8C圖所示，交聯抗體可以有效啟動OX40信號傳導。 4.9 藉由基於細胞的測定法測試抗OX40抗體的體外功能

根據製造商的方案，使用人CD4⁺ T Cell Enrichment試劑盒(StemCell)從人PBMC分離本實施例中使用的人CD4⁺ T細胞。將細胞重懸浮于RPMI 1640完全培養基中。 4.9.1抗OX40抗體對白細胞介素2 (IL-2)產生的影響

在該測定中，未經組織培養處理的平底96孔板(Corning)在4℃下用抗-CD3抗體預包被過夜。在實驗當天，將平板用RPMI 1640完全培養基洗滌以去除未結合的抗體。將新鮮分離的人CD4⁺ T細胞以1 x 10⁵ 個細胞/孔的密度加入到每孔中，體積為100 μL。然後將恆定濃度的交聯抗體F(ab')₂ 山羊抗-人IgG和梯度稀釋的OX40抗體在100 μL中混合，並加入到平板的每個孔中。將平板在37℃，5％ CO₂ 下培養3天，然後收穫上清液藉由ELISA測量IL-2的含量。

第9圖顯示抗體對抗CD3誘導的原代人CD4⁺ T細胞的IL-2分泌的影響。證明了說明性抗體（包括1.7.10-u1-IgG1K, 1.62.3-u1-IgG1K, 1.134.9-u1-IgG1L, 1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K）增強了原代人CD4⁺ T細胞的IL-2分泌能力。 4.9.2抗OX40抗體對細胞因數IFNγ分泌和CD4⁺ T細胞增殖的影響

為了直接評估抗OX40抗體對增強IFNγ產生和CD4⁺ T細胞增殖的作用，我們進行了藉由OX40信號與CD3/T細胞受體(TCR)複合物的組合共同刺激人CD4⁺ T細胞的測定。簡言之，用100 μL恆定濃度的抗CD3和不同濃度的抗OX40抗體的混合物預包被未經組織培養處理的平底96孔板(Corning)。將平板在4℃孵育過夜，然後用RPMI 1640完全培養基洗滌以去除未結合的抗體。將新鮮分離的人CD4⁺ T細胞以1 x 10⁵ 個細胞/孔的密度加入到每個孔中，體積為200 μL。將平板在37℃，5％ CO₂ 下孵育3天，然後藉由ELISA收穫上清液用於IFNγ測量。收穫細胞沉澱物按如下方法藉由³ H-胸苷測量CD4⁺ T細胞增殖：以0.5 μCi/孔將³ H-胸苷(PerkinElmer)加入到細胞培養板中。將平板在37℃在5％ CO₂ 中培養16至18小時，然後使用Topcount NXT閃爍計數器(Perkin Elmer)測定增殖細胞中³ H-胸苷的摻入情況。

第10圖顯示了抗體對抗CD3誘導的原代人CD4⁺ T細胞的IFN-γ分泌的影響。證實了示例性抗體1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-3-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1增強了原代人CD4⁺ T細胞的IFN-γ分泌能力。

第11圖顯示了抗體對抗CD3誘導的原代人CD4⁺ T細胞增殖的影響。證明了說明性抗體1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-3-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1增強了原代人CD4⁺ T細胞的增殖能力。 4.9.3 人抗OX40抗體對Tregs抑制性功能的影響

Tregs是T細胞的一個亞群，其是一種關鍵的免疫調節劑，在維持自我耐受中起著重要作用。有人提出CD4⁺ CD25⁺ 調節性T細胞與腫瘤生長相關，因為在患有多種癌症的患者中發現Treg數量增加並且Treg數量增加與不良預後相關。為了直接評估抗OX40抗體對免疫抑制應答的作用，我們比較了在抗OX40抗體存在和不存在的情況下Treg的功能。使用特異性抗CD25微珠(StemCell)分離CD4⁺ CD25⁺ Treg和CD4⁺ CD25^- 效應T (Teff)細胞。將Teff細胞以1 x 10⁵ 個細胞/50 μL/孔接種，並以1 x 10⁵ 個Treg/50 μL/孔在96孔圓底平板(BD)中共培養。然後用在交聯抗體以及抗OX40抗體存在的情況下以1個DC/10個Teff細胞用從單核細胞誘導的人同種異體樹突細胞(DC)刺激細胞。無抗體或者同種型抗體被用作陰性對照。將共培養物在37℃，5％ CO₂ 下孵育5天。在第5天收集細胞沉澱以確定藉由³ H-胸苷摻入測量的Teff增殖。

第12圖顯示在Treg細胞存在的情況下抗體對樹突細胞誘導的原代人CD4⁺ T效應細胞增殖的影響。藉由逆轉調節性T細胞的抑制功能，抗體1.134.9-u1-IgG1L和1.214.23-u1-IgG1K可以恢復CD4⁺ CD25^- T細胞增殖。 4.10 ADCC和CDC測試：

OX40在多種細胞類型上表達。為了評估它們觸發Fc效應功能的能力，評估了抗OX40抗體是否可以對表達OX40的細胞誘導ADCC和CDC效應。

第13A圖顯示活化的人CD4⁺ T細胞上OX40的表達，第13B圖顯示過表達OX40的Jurkat細胞上OX40的表達。 4.10.1 ADCC測試：

將表達OX40的Jurkat細胞或活化的人CD4⁺ T細胞作為靶標，並將各種濃度的抗OX40抗體在96孔圓底平板(BD)中預孵育30分鐘；然後以50:1的效應物/靶標比例加入同種異體PBMC作為效應物。將板在37℃，5% CO₂ 下保持4小時。藉由基於LDH的細胞毒性檢測試劑盒(Roche)測定靶細胞裂解。使用微孔板讀數儀(Molecular Device)讀取492 nm處的吸光度。

第14A圖和第14B圖 分別顯示OX40抗體對過表達OX40的Jurkat細胞(第14A圖)或活化的人CD4⁺ T細胞(第14B圖)的ADCC作用。如第14A圖和第14B圖所示，本發明的說明性抗體1.134.9-u1-IgG1L和1.214.23-u1-IgG1K對過表達OX40的Jurkat細胞和活化的人CD4⁺ T細胞的ADCC作用較低。 4.10.2 CDC測試：

將表達OX40的Jurkat細胞或活化的人CD4⁺ T細胞作為靶標，並將各種濃度的抗OX40抗體在96孔圓底平板(BD)中混合。以1:50的終稀釋度添加人補體。將96孔板在37℃，5% CO₂ 條件下孵育2小時。藉由CellTiter-Glo (Promega)測定靶細胞裂解。使用微孔板讀數儀(Molecular Device)讀取發光。

第15A圖和第15B圖分別顯示OX40抗體對過表達OX40的Jurkat細胞(第15A圖)或活化的人CD4⁺ T細胞(第15B圖)的CDC作用。如第15A圖和第15B圖所示，本發明的說明性抗體1.134.9-u1-IgG1L和1.214.23-u1-IgG1K對過表達OX40的Jurkat細胞和活化的人CD4⁺ T細胞的CDC作用較低。 4.11 結構域作圖

為了檢查OX40抗體的結合結構域，使用一系列人/小鼠OX40嵌合變體。OX40抗體與人OX40特異性結合，而與小鼠OX40和人CD40沒有交叉反應性，儘管它們的氨基酸(或者，在本文中稱為“aa”)序列中分別共有60％和23％的同一性。簡而言之，藉由用相應的小鼠OX40 (mPro1)氨基酸或人CD40氨基酸(hPro40)替換人OX40 (hPro1)的胞外結構域的下列殘基，構建了二十二個變體(命名為變體“x1”、“x2”...“x22”)。 ●　變體x1：xPro1.FL-x1：CRDmox40_1 (將人OX40 aa 29至65用小鼠對應物替換) ●　變體x2：xPro1.FL.x2：CRDmox40_2 (將人OX40 aa 66至107用小鼠對應物替換) ●　變體x3：xPro1.FL-x3：CRDmox40_3(將人OX40 aa 108至146用小鼠對應物替換) ●　變體x4：xPro1.FL-x4：CRDmox40_4(將人OX40 aa 147至214用小鼠對應物替換) ●　變體x5：xPro1.FL-x5：CRDmox40_1-2(將人OX40 aa 29至107用小鼠對應物替換) ●　變體x6：xPro1.FL-x6：CRDmox40_2-3(將人OX40 aa 66至146用小鼠對應物替換) ●　變體x7：xPro1.FL-x7：CRDmox40_3-4(將人OX40 aa 108至214用小鼠對應物替換) ●　變體x8：xPro1.FL-x8：CRDmox40_1-3(將人OX40 aa 29至146用小鼠對應物替換) ●　變體x9：xPro1.FL-x9：CRDmox40_2-4(將人OX40 aa 66至214用小鼠對應物替換) ●　變體x10：xPro1.FL-x10：CRDmox40_1,2,4(將人OX40氨基酸29-107和147-214用小鼠對應物替換) ●　變體x11：xPro1.FL-x11：CRDmox40_1,3,4(將人OX40氨基酸29至65和108至214用小鼠對應物替換) ●　變體x12：xPro1.FL-x12：CRDhcd40_1(將人OX40 aa 29至65用人CD40 aa對應物替換) ●　變體x13：xPro1.FL-x13：CRDhcd40_2(將人OX40 aa 66至107用人CD40 aa對應物替換) ●　變體x14：xPro1.FL-x14：CRDhcd40_3(將人OX40 aa 108至146用人CD40 aa對應物替換) ●　變體x15：xPro1.FL-x15：CRD hcd40_4(將人OX40 aa 147至214用人CD40 aa對應物替換) ●　變體x16：xPro1.FL-x16：CRDhcd40_1-2(將人OX40 aa 29至107用人CD40 aa對應物替換) ●　變體x17：xPro1.FL-x17：CRDhcd40_2-3(將人OX40 aa 66至146用人CD40 aa對應物替換) ●　變體x18：xPro1.FL-x18：CRDhcd40_3-4(將人OX40 aa 108至214用人CD40 aa對應物替換) ●　變體x19：xPro1.FL-x19：CRDhcd40_1-3(將人OX40 aa 29至146用人CD40 aa對應物替換) ●　變體x20：xPro1.FL-x20：CRDhcd40_2-4(將人OX40 aa 66至214用人CD40 aa對應物替換) ●　變體x21：xPro1.FL-x21：CRDhcd40_1,2,4(將人OX40 aa 29至107和147至214用人CD40 aa對應物替換) ●　變體x22：xPro1.FL-x22：CRDhcd40_1,3,4(將人OX40 aa 29-65和108-214用人CD40 aa對應物替換)

將從“x1”到“x22”的二十二個變體克隆到pcDNA3.0載體中，並用於293F細胞轉染。簡而言之，用FreeStyle 293F培養基將293F細胞稀釋至1 x 10⁶ 個細胞/mL的密度，並將每孔3 mL的等份加入到24孔板中。使用293fectin試劑(Life Technologies)進行轉染。對於每次轉染，將3 μg DNA在150 μL Opti-MEMI減少血清培養基(Life Technologies)中稀釋，然後與在150 μL Opti-MEMI減少血清培養基中預先稀釋的6 μL 293fectin試劑組合。將DNA/Lipofectamine混合物在25℃放置20分鐘，然後加入到培養物中。轉染48小時後藉由流式細胞術分析轉​​染的細胞。

藉由流式細胞術分析抗體與嵌合OX40變體的結合。簡言之，將1 μg/mL抗體(但BMK10為2 μg/mL)與表達嵌合OX40的轉染293F細胞在4℃下孵育1小時，然後與3 μg/mL山羊抗-人IgG Fc R-PE (Jackson ImmunoResearch Lab)在4℃下孵育40分鐘。使用流式細胞儀分析細胞。

結果顯示在下面的表7-9中。 表7. 變體與OX40抗體的結合

表8. 變體與基準抗體BMK1或BMK5的結合

表9. 變體與基準抗體BMK7或BMK10的結合

表10顯示了參與抗原結合的OX40的結構域(呈灰色著色的)。 表10.參與抗原結合的OX40的結構域(呈灰色著色的)

注：CRD表示富含半胱氨酸的結構域，其中“CRD1”是指人OX40的氨基酸29-65，“CRD2”是指人OX40的氨基酸66-107，“CRD3”是指人OX40的氨基酸108-146，“CRD4”是指人OX40的氨基酸147-214。 4.12 OX40抗體抑制人OX40轉基因模型中MC38結腸癌的生長

該研究評估了抗體1.134.9-u1-IgG1L在OX40人源化B-hTNFRSF4小鼠中MC38結腸癌模型中的體內抗腫瘤功效。

OX40人源化B-hTNFRSF4小鼠購自Biocytogen Co., Ltd。將小鼠飼養在恆定溫度和濕度下的單獨通氣籠中，每籠5隻動物。

將MC38細胞培養在37℃、5％ CO₂ 的條件下，培養基為含10％胎牛血清，2 mM L-穀氨醯胺，100 U/mL青黴素和100 μg/mL鏈黴素的DMEM培養基。藉由胰蛋白酶-EDTA處理將腫瘤細胞每週常規傳代培養兩次。收穫處於指數生長期的細胞並計數以用於腫瘤接種。

每隻小鼠在右側腋下(側面)用在0.1 mL PBS中的MC38腫瘤細胞(3 x 10⁵ )皮下接種以形成腫瘤。當平均腫瘤體積達到65 mm³ 時，將動物隨機分組，然後開始治療以進行效力研究。所有測試抗體和對照抗體藉由腹腔內(IP)注射(每週兩次(BIW)，持續三週(“BIW×3”))。表11中提供了詳細資訊。 表11

與研究中的動物處理、護理和治療相關的所有程式均按照WuXi Apptec實驗動物管理委員會(IACUC)批准的指導方針，遵循國際實驗動物飼養評估及認證協會(AAALAC)來進行。在常規監測時，每天檢查動物以評估腫瘤生長和治療對正常行為諸如活動性、食物和水消耗(僅藉由觀看)、體重增加/減少(體重每天測量一次)、眼睛/毛髮光澤消退的任何影響以及任何其它異常影響，如方案中所述的。根據每個亞組內的動物數量記錄死亡和觀察到的臨床體征。

使用測徑器以二維方式每週三次測量腫瘤尺寸，並且使用以下公式以mm³ 測量體積：V = 0.5a×b² ，其中a和b分別是腫瘤的長徑和短徑。然後將腫瘤尺寸用於計算T/C (％)值。使用下式計算相對腫瘤增殖率的T/C (％)：T/C％ = T_RTV /C_RTV x 100％(T_RTV 表示治療組相對腫瘤體積；C_RTV 表示陰性對照相對腫瘤體積)。根據腫瘤測量值計算相對腫瘤體積，計算公式為：RTV = V_t /V₀ ，V₀ 是治療開始當天的平均腫瘤體積，V_t 是一次測量的平均腫瘤體積，T_RTV 使用與C_RTV 同一天的資料。

使用公式：TGI (%) = [1-(T_i -T₀ )/(V_i -V₀ )]×100計算每個組的TGI；T_i 是給定日的治療組的平均腫瘤體積，T₀ 是治療第一天時治療組的平均腫瘤體積，V_i 是與T_i 同一天時媒介物對照組的平均腫瘤體積，V₀ 是治療第一天時媒介物組的平均腫瘤體積。

提供了每個組在每個時間點的腫瘤體積的概括統計，包括平均值和平均值的標準誤差(SEM)。對在最佳治療時間點獲得的資料進行組間腫瘤體積差異的統計分析和藥物相互作用分析。進行單因素ANOVA以比較三個或更多組之間的腫瘤體積。當獲得顯著的F統計量(治療方差與誤差方差的比率)時，使用Games-Howell檢驗進行組間比較；如果沒有，則使用Dunnett-t(雙側)。所有資料均使用SPSS 17.0進行分析。p值小於0.05(p ＜0.05)被認為是統計學顯著的。

實驗資料示於表12和13以及第16圖和第17圖中。 表12. 在施用1.134.9-u1-IgG1L後具有MC38腫瘤的小鼠的平均腫瘤體積隨時間的變化

表13. 1.134.9-u1-IgG1L施用後第12天的腫瘤生長抑制率

可以看出，OX40抗體1.134.9-u1-IgG1L對攜帶MC38結腸癌的B-hTNFRSF4小鼠產生了顯著的抗腫瘤活性，並且該荷瘤動物對本抗體有良好的耐受性。 4.13 表位作圖

為了檢驗OX40抗體的結合表位，對人OX40進行丙氨酸掃描實驗，並且評價它們對抗體結合的影響。將人OX40上的丙氨酸殘基突變為甘氨酸密碼子，並將所有其他殘基（除半胱氨酸殘基外，並且基於OX40-OX40R複合物(PDB: 2HEV)，溶劑可及表面積（solvent accessible surface area，SASA）＜10 (OX40氨基酸)（SASA ＞ 10設置為表面氨基酸））突變成丙氨酸密碼子。對於人OX40細胞外結構域（ECD）的每個殘基，使用兩個連續的PCR步驟進行點氨基酸替換。使用編碼人OX40的ECD和C端His標籤的pcDNA3.3-OX40-ECD.His質粒作為範本，並使用一組誘變引物用於使用QuikChange閃電多位點定向誘變試劑盒（Agilent technologies, Palo Alto, CA）的第一步PCR。在突變鏈合成反應後，使用Dpn I內切酶消化親本範本。在第二步PCR中，擴增由CMV啟動子、OX40的胞外結構域（ECD）、His-標籤和單純皰疹病毒胸苷激酶（TK）聚腺苷酸化組成的線性DNA表達盒，並將其在293F細胞（Life Technologies，Gaithersburg，MD）中在37℃暫態表達，藉由His標籤定量ELISA進行量化。

將單株抗體1.134.9-u1-IgG1L (2 μg/mL)包被在平板中用於ELISA結合測定。在與含有定量OX40突變體或人OX40-ECD.His蛋白質的上清液相互作用後，加入HRP綴合的抗His抗體(1:5000, GenScript-A00612, CHN)作為檢測抗體。根據對照突變體的平均值將吸光度標準化。在設定了額外的結合倍數變化的臨界值（＜0.75）後，藉由考慮結構域作圖、表位元作圖和晶體結構（它們不包括起結構穩定性作用的氨基酸，如屬於CRD3和CRD4的氨基酸）， 鑒定了最終確定的表位殘基。

OX40點突變對抗體結合的標準化變化倍數顯示在表14中。藉由考慮結構域作圖、丙氨酸掃描（臨界值：結合變化倍數＜0.75，SASA＞10）和晶體結構(PDB: 2HEV)（它們不包括起結構穩定性作用的氨基酸，如屬於CRD3和CRD4的氨基酸），鑒定了熱點殘基。如表15所示， 1.134.9-u1-IgG1L有8個熱點位置。 表14. OX40點突變對抗體結合的標準化變化倍數

^a 結合的變化倍數是相對於一些沉默丙氨酸取代的結合。 表15. 1.134.9-u1-IgG1L的8個熱點位置

變化倍數臨界值＜ 0.75, SASA ＞ 10 。

本領域技術人員將進一步認識到，在不脫離其精神或中心特徵的情況下，本發明可以以其他具體形式來實施。由於本發明的前述描述僅揭露了其示例性實施方案，應該理解的是，其他變化被認為是在本發明的範圍內。因此，本發明不限於在此詳細描述的特定實施方案。相反，應當參考所附申請專利範圍來指示本發明的範圍和內容。

1.134.9-u1-IgG1L、BMK‧‧‧抗體 MFI：平均螢光強度

第1圖顯示PTM突變後抗OX40抗體1.62.3-u1-IgG1K的變體之間的比較的圖。 第2圖顯示結合人OX40轉染的CHO-K1細胞的抗體的圖。 第3圖顯示結合活化的人CD4⁺ T細胞的抗體的圖。 第4圖顯示與OX40L競爭性結合OX40的抗體的圖。 第5圖顯示結合獼猴OX40轉染的293F細胞的抗體的圖。 第6圖顯示藉由ELISA進行的抗OX40抗體對其它TNFR家族成員（包括人CD40、CD137和CD271）的家族交叉結合測試的結果的圖。 第7A圖、第7B圖和第7C圖是顯示針對基準抗體BMK1 （第7A圖）、BMK7 （第7B圖）和BMK10 （第7C圖）的抗體的抗原表位競爭結合測試（epitope binning）的圖。 第8A圖、第8B圖和第8C圖是顯示使用游離抗體或藉由表達CD32b的CHO-K1細胞或抗人IgG Fc試劑的FcγR交聯，抗體對Jurkat細胞中OX40刺激的NFkB螢光素酶活性的影響的圖。分別顯示了（第8A圖）游離抗體或（第8B圖）F（ab'）₂ 山羊抗-人IgG或（第8C圖）表達CD32b的CHO-K1細胞交聯的報導分子活性。 第9圖是顯示抗體對抗CD3誘導的原代人CD4⁺ T細胞的IL-2分泌的作用的圖。 第10圖是顯示抗體對抗CD3誘導的原代人CD4⁺ T細胞的IFN-γ分泌的作用的圖。 第11圖是顯示抗體對抗CD3誘導的原代人CD4⁺ T細胞的增殖的作用的圖。 第12圖是顯示在Treg細胞存在的情況下抗體對CD3/CD28 Dynabeads誘導的原代人CD4⁺ T效應細胞的增殖的作用的圖。 第13A圖是顯示活化的人CD4⁺ T細胞上的OX40表達的圖，第13B圖是顯示過表達OX40的Jurkat細胞上的OX40表達的圖。 第14A圖是顯示OX40抗體對過表達OX40的Jurkat細胞的ADCC作用的圖，第14B圖是顯示OX40抗體對活化的人CD4⁺ T細胞的ADCC作用的圖。 第15A圖是顯示OX40抗體對過表達OX40的Jurkat細胞的CDC作用的圖，第15B圖是顯示OX40抗體對活化的人CD4⁺ T細胞的CDC作用的圖。 第16圖是顯示施用抗體1.134.9-u1-IgG1L後攜帶MC38腫瘤的小鼠的腫瘤生長的圖。 第17圖是顯示施用抗體1.134.9-u1-IgG1L後攜帶MC38腫瘤的小鼠的體重變化的圖。

MFI‧‧‧平均螢光強度

1.134.9-u1-IgG1L、BMK‧‧‧抗體

Claims (45)

1. 一種分離的抗體或其抗原結合部分，其中該分離的抗體或其抗原結合部分包含： A)一個或多個重鏈CDR (CDRH)，其選自以下的至少一個： (i)與如選自SEQ ID NO：1、7、13、15、21和27的序列之一所示的CDRH1具有至少90%序列同一性的CDRH1； (ii)與如選自SEQ ID NO：3、9、17、23和29的序列之一所示的CDRH2具有至少90%序列同一性的CDRH2；和 (iii)與如選自SEQ ID NO：5、11、19、25和31的序列之一所示的CDRH3具有至少90%序列同一性的CDRH3； B)一個或多個輕鏈CDR(CDRL)，其選自以下的至少一個： (i)與如選自SEQ ID NO：2、8、14、16、22和28的序列之一所示的CDRL1具有至少90%序列同一性的CDRL1； (ii)與如選自SEQ ID NO：4、10、18、24和30的序列之一所示的CDRL2具有至少90%序列同一性的CDRL2；和 (iii)與如選自SEQ ID NO：6、12、20、26和32的序列之一所示的CDRL3具有至少90%序列同一性的CDRL3；或 C) A)的一個或多個CDRH和B)的一個或多個CDRL。
2. 如申請專利範圍第1項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該分離的抗體或其抗原結合部分包含： A)一個或多個重鏈CDR (CDRH)，其選自以下的至少一個： (i)選自SEQ ID NO：1、7、13、15、21和27的CDRH1，或與該CDRH1在氨基酸序列上相異在於不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH1； (ii)選自SEQ ID NO：3、9、17、23和29的CDRH2，或與該CDRH2在氨基酸序列上相異在於不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH2；和 (iii)選自SEQ ID NO：5、11、19、25和31的CDRH3，或與該CDRH3在氨基酸序列上相異在於不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH3； B)一個或多個輕鏈CDR (CDRL)，其選自以下的至少一個： (i)選自SEQ ID NO：2、8、14、16、22和28的CDRL1，或與該CDRL1在氨基酸序列上相異在於不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL1； (ii)選自SEQ ID NO：4、10、18、24和30的CDRL2，或與該CDRL2在氨基酸序列上相異在於不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL2；和 (iii)選自SEQ ID NO：6、12、20、26和32的CDRL3，或與該CDRL3在氨基酸序列上相異在於不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL3；或 C)A)的一個或多個CDRH和B)的一個或多個CDRL。
3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該分離的抗體或其抗原結合部分包含： (a)包含SEQ ID NO：1或由其組成的CDRH1； (b)包含SEQ ID NO：3或由其組成的CDRH2； (c)包含SEQ ID NO：5或由其組成的CDRH3； (d)包含SEQ ID NO：2或由其組成的CDRL1； (e)包含SEQ ID NO：4或由其組成的CDRL2；和 (f)包含SEQ ID NO：6或由其組成的CDRL3。
4. 如申請專利範圍第1項或第2項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該分離的抗體或其抗原結合部分包含： (a)包含SEQ ID NO：7或由其組成的CDRH1； (b)包含SEQ ID NO：9或由其組成的CDRH2； (c)包含SEQ ID NO：11或由其組成的CDRH3； (d)包含SEQ ID NO：8或由其組成的CDRL1； (e)包含SEQ ID NO：10或由其組成的CDRL2；和 (f)包含SEQ ID NO：12或由其組成的CDRL3。
5. 如申請專利範圍第1項或第2項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該分離的抗體或其抗原結合部分包含： (a)包含SEQ ID NO：13或由其組成的CDRH1； (b)包含SEQ ID NO：9或由其組成的CDRH2； (c)包含SEQ ID NO：11或由其組成的CDRH3； (d)包含SEQ ID NO：14或由其組成的CDRL1； (e)包含SEQ ID NO：10或由其組成的CDRL2；和 (f)包含SEQ ID NO：12或由其組成的CDRL3。
6. 如申請專利範圍第1項或第2項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該分離的抗體或其抗原結合部分包含： (a)包含SEQ ID NO：15或由其組成的CDRH1； (b)包含SEQ ID NO：17或由其組成的CDRH2； (c)包含SEQ ID NO：19或由其組成的CDRH3； (d)包含SEQ ID NO：16或由其組成的CDRL1； (e)包含SEQ ID NO：18或由其組成的CDRL2；和 (f)包含SEQ ID NO：20或由其組成的CDRL3。
7. 如申請專利範圍第1項或第2項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該分離的抗體或其抗原結合部分包含： (a)包含SEQ ID NO：21或由其組成的CDRH1； (b)包含SEQ ID NO：23或由其組成的CDRH2； (c)包含SEQ ID NO：25或由其組成的CDRH3； (d)包含SEQ ID NO：22或由其組成的CDRL1； (e)包含SEQ ID NO：24或由其組成的CDRL2；和 (f)包含SEQ ID NO：26或由其組成的CDRL3。
8. 如申請專利範圍第1項或第2項的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該分離的抗體或其抗原結合部分包含： (a)包含SEQ ID NO：27或由其組成的CDRH1； (b)包含SEQ ID NO：29或由其組成的CDRH2； (c)包含SEQ ID NO：31或由其組成的CDRH3； (d)包含SEQ ID NO：28或由其組成的CDRL1； (e)包含SEQ ID NO：30或由其組成的CDRL2；和 (f)包含SEQ ID NO：32或由其組成的CDRL3。
9. 如申請專利範圍第1項或第2項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該分離的抗體或其抗原結合部分包含： (A)重鏈可變區，其： (i)包含選自SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43的氨基酸序列； (ii)包含與選自SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；或 (iii)包含與選自SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43的氨基酸序列相比具有一個或多個氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或 (B)輕鏈可變區，其： (i)包含選自SEQ ID NO：34、36、38、40、42和44的氨基酸序列； (ii)包含與選自SEQ ID NO：34、36、38、40、42和44的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；或 (iii)包含與選自SEQ ID NO：34、36、38、40、42和44的氨基酸序列相比具有一個或多個氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。
10. 如申請專利範圍第9項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該分離的抗體或其抗原結合部分包含： (a)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的輕鏈可變區；或 (b)包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的輕鏈可變區；或 (c)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的輕鏈可變區；或 (d)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的輕鏈可變區；或 (e)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的輕鏈可變區；或 (f)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的輕鏈可變區。
11. 如前述申請專利範圍中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其具有一個或多個以下性質： (a)以1×10^-8 M或更低的K_D 結合人OX40； (b)在CD4⁺ T細胞中誘導細胞因數(例如，IL-2或IFN-γ)產生； (c)增強原代人CD4⁺ T細胞的增殖； (d)在Treg細胞存在的情況下增強原代人CD4⁺ T效應細胞的增殖； (e)分別結合人或獼猴OX40；或 (f)對人CD40、CD137和CD271沒有交叉反應性。
12. 如前述申請專利範圍中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該抗體是單株抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
13. 如前述申請專利範圍中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該抗體是全人單株抗體。
14. 如前述申請專利範圍中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該抗體是由轉基因哺乳動物產生的全人單株抗體。
15. 如前述申請專利範圍中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該抗體是由轉基因大鼠產生的全人單株抗體。
16. 如前述申請專利範圍中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該抗體是由具有重組免疫球蛋白基因座的轉基因大鼠產生的全人單株抗體。
17. 如前述申請專利範圍中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該抗體融合至IgG的恆定區。
18. 如前述申請專利範圍中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該抗體融合至人IgG的恆定區。
19. 如前述申請專利範圍中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該抗體融合至人IgG1或人IgG4的恆定區。
20. 如前述申請專利範圍中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合部分，其中該抗體結合OX40的CRD2和/或CRD3結構域。
21. 一種分離的抗體或其抗原結合部分，其與前述申請專利範圍中任一項的分離的抗體或其抗原結合部分競爭結合相同的表位。
22. 一種分離的核酸分子，其包含編碼如申請專利範圍第1項至第21項的任一項中所定義的分離的抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區的核酸序列。
23. 如申請專利範圍第22項所述的分離的核酸分子，其編碼如申請專利範圍第1項至第21項的任一項中所定義的分離的抗體的重鏈可變區，並且包含選自以下的核酸序列： (A)編碼如SEQ ID NO：33、35、37、39、41或43所示的重鏈可變區的核酸序列; (B)如SEQ ID NO：45、47、49、51、53或55所示的核酸序列；或 (C)在高度嚴格條件下與(A)或(B)的核酸序列的互補鏈雜交的核酸序列。
24. 如申請專利範圍第22項所述的分離的核酸分子，其編碼如申請專利範圍第1項至第21項的任一項中所定義的分離的抗體的輕鏈可變區，並且包含選自以下的核酸序列： (A)編碼如SEQ ID NO：34、36、38、40、42或44所示的輕鏈可變區的核酸序列; (B)如SEQ ID NO：46、48、50、52、54或56所示的核酸序列；或 (C)在高度嚴格條件下與(A)或(B)的核酸序列的互補鏈雜交的核酸序列。
25. 一種載體，其包含申請專利範圍第22項至第24項的任一項的核酸分子。
26. 一種宿主細胞，其包含申請專利範圍第25項的載體。
27. 一種藥物組合物，其包含至少一種如申請專利範圍第1項至第21項的任一項中所定義的抗體或其抗原結合部分和藥學上可接受的載體。
28. 一種製備如申請專利範圍第1項至第21項的任一項中所定義的抗體或其抗原結合部分的方法，其包括以下步驟： - 在申請專利範圍第26項的宿主細胞中表達如申請專利範圍第1項至第21項的任一項中所定義的抗體或其抗原結合部分；和 - 從該宿主細胞分離抗體或其抗原結合部分。
29. 如申請專利範圍第1項至第21項中任一項所定義的抗體或其抗原結合部分在製備用於調節受試者內免疫應答的藥物中的用途。
30. 如申請專利範圍第29項所述的用途，其中T細胞增殖在施用該藥物的受試者中得以增強。
31. 如申請專利範圍第29項所述的用途，其中抗CD3誘導的原代人CD4⁺ T細胞增殖在施用該藥物的受試者中得以增強。
32. 如申請專利範圍第29項所述的用途，其中在Treg細胞存在的情況下原代人CD4⁺ T效應細胞的增殖在施用該藥物的受試者中得以增強。
33. 如申請專利範圍第29項所述的用途，其中在施用該藥物的受試者中細胞因數IFN-γ產量增加。
34. 如申請專利範圍第29項所述的用途，其中在施用該藥物的受試者中細胞因數IL-2產量增加。
35. 如申請專利範圍第1項至第21項中任一項所定義的抗體或其抗原結合部分在製備用於治療受試者內異常細胞生長的藥物中的用途。
36. 如申請專利範圍第1項至第21項中任一項所定義的抗體或其抗原結合部分在製備用於削弱受試者中Treg細胞的抑制性功能的的藥物中的用途。
37. 如申請專利範圍第1項至第21項中任一項所定義的抗體或其抗原結合部分在製備用於抑制受試者內腫瘤細胞生長的藥物中的用途。
38. 如申請專利範圍第1項至第21項中任一項所定義的抗體或其抗原結合部分在製備用於減少受試者的腫瘤細胞轉移的藥物中的用途。
39. 如申請專利範圍第1項至第21項的任一項中所定義的抗體或其抗原結合部分在製備用於治療或預防增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或感染性疾病的藥物中的用途。
40. 如申請專利範圍第39項所述的用途，其中該癌症是實體癌。
41. 如申請專利範圍第39項或第40項所述的用途，其中該癌症是結腸癌。
42. 如申請專利範圍第1項至第21項中任一項所定義的抗體或其抗原結合部分在製備用於診斷增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或感染性疾病的診斷劑中的用途。
43. 如申請專利範圍第1項至第21項中任一項所定義的抗體或其抗原結合部分，其用於治療或預防增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或感染性疾病。
44. 如申請專利範圍第1項至第21項中任一項所定義的抗體或其抗原結合部分，其用於診斷增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或感染性疾病。
45. 一種用於治療或診斷增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或感染性疾病的試劑盒，其包含容器，該容器包含申請專利範圍第1項至第21項的任一項中所定義的至少一種抗體或其抗原結合部分。

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