BR112020023026A2 - anticorpos completamente humanos contra ox40, método para a sua preparação e sua utilização - Google Patents

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Abstract

“anticorpos completamente humanos contra ox40, método para a sua preparação e sua utilização”. o presente pedido provê anticorpos monoclonais completamente humanoscontra a superfamília de receptor do fator de necrose tumoral, membro 4 (tnfrsf4), também conhecido como ox40 e cd134. também provê os métodos de geração de hibridoma que usam um rato transgênico humanizado, as moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos anti-ox40, vetores de expressão e células hospedeiras usadas para a expressão de anticorpos anti-x40. a invenção fornece ainda os métodos para validar a função de anticorpos in vitro e a eficácia de anticorpos in vivo. os anticorpos da invenção proporcionam um agente muito potente para o tratamento de múltiplos cânceres para modular a função imune humana.

Description

“ANTICORPOS COMPLETAMENTE HUMANOS CONTRA OX40, MÉTODO PARA A SUA PREPARAÇÃO E SUA UTILIZAÇÃO” Reivindicação de Prioridade
[001] O presente pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente PCT Número PCT/CN2018/086574, depositado em 11 de maio de 2018, e Pedido de Patente Chinês Número 201810529840.5, depositado em 29 de maio de 2018.
Listagem de Sequências
[002] O presente pedido contém uma listagem de sequências e é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
Campo da Invenção
[003] A presente invenção refere-se geralmente a anticorpos. Mais especificamente, a aplicação refere-se a anticorpos monoclonais completamente humanos contra o OX40, um método para a sua preparação e sua utilização.
Fundamentos da Invenção
[004] As evidências crescentes de resultados pré-clínicos e clínicos demonstraram que os pontos de verificação de imunidade alvos estão se tornando a abordagem mais promissora para o tratamento de pacientes com cânceres. A superfamília de receptor de fator de necrose tumoral, membro 4 (TNFRSF4, também conhecido como OX40, CD134 e ACT35), uma das proteínas de ponto de controle imune, desempenha um papel principal em função de células T potenciando a sinalização do receptor de células T e levando à sua ativação.
[005] OX40 é expresso principalmente por células T CD4+ e CD8+ ativadas, células T de memória, células T reguladoras (Treg) e células matadoras naturais (NK – “Natural Killer”). A interação do OX40 expresso em células T ativadas, e seu ligante (OX40L) expresso em células apresentadoras de antígenos promove dramaticamente a ativação, proliferação e migração da célula T, aumenta a sobrevivência das células T efetoras, aumenta a formação do centro germinal e a maturação das células dendríticas. Além disso, a sinalização de OX40 pode inibir a diferenciação e a expansão de Tregs, antagonizar a geração de Tregs induzíveis e bloquear a função supressora de Treg.
Provou-se em uma variedade de modelos de tumor murino pré-clínicos e ensaios clínicos que um agonista de OX40 é bem uma estratégia promissora para o tratamento de câncer e doenças infecciosas. Múltiplos agentes agonistas com alvo em OX40 foram desenvolvidos por companhias farmacêuticas, tais como MedImmune, GlaxoSmithKline (GSK), Pfizer e Incyte. Um anticorpo murino agonista com alvo em OX40 (9B12, AgonOX), desenvolvido por MedImmune, foi usado em teste clínico de Fase I em pacientes com câncer avançado. Os pacientes tratados com um curso do anticorpo “9B12” mostraram um perfil de toxicidade aceitável e regressão de pelo menos uma lesão metastática em 12 de 30 pacientes. Mecanisticamente, este tratamento aumentou a resposta de células T e B para imunizações de antígeno repórter (por exemplo KLH), levou à regulação positiva preferencial do OX40 em células Treg CD4+ FoxP3+ em linfócitos de infiltração de tumor e aumentou a reatividade antitumoral de células T e B em pacientes com melanoma. A GSK está também desenvolvendo GSK-3174998, um anticorpo monoclonal IgG1 humanizado que ativa OX-40 sobre a superfície das células T, identificado através de uma colaboração com o Centro de Câncer MD Anderson, para o tratamento potencial de câncer incluindo tumores sólidos e malignidades hematológicas. Outros agentes no desenvolvimento clínico que tem OX40 como alvo incluem o anticorpo agonista IgG2 totalmente humano PF-04518600, que está atualmente em desenvolvimento clínico em um amplo espectro de malignidades; e INCAN-1949 de Incyte, que é um anticorpo IgG1 humano anti-OX40 com perfil de agonista ótimo e a capacidade de esgotar seletivamente células T reguladoras intratumorais, para o tratamento potencial de câncer.
[006] Há alguns espaços para melhoria para o anticorpo contra o OX40 como um agente terapêutico. Como um agonista contra os receptores co-estimuladores, a toxicidade pode ser as questões mais preocupantes, tais como a tempestade de citocina, que limita as aplicações clínicas. Além disso, os anticorpos anti-OX40 atualmente testados em testes clínicos são anticorpos quiméricos humano-camundongo ou humanizados, alta imunogenicidade diminui a eficácia devido às sequências de proteína derivadas de camundongo. O anticorpo completamente humano supera estas deficiências e mostrou eficiência mais elevada e toxicidade mais baixa in vivo.
[007] Nesta invenção, foram gerados anticorpos completamente humanos contra OX40 utilizando nossa tecnologia de hibridoma proprietária. Os anticorpos desta invenção possuem alta afinidade de ligação; se ligam especificamente a ambas, proteína OX40 humana e de macaco; e respostas imunes moduladoras potentes, incluindo aumentar a proliferação de células T e aumentar a produção de citocina IFN-γ e interleucina -2 e prejudicar a função supressiva de células de Treg.
Sumário da Invenção
[008] Estes e outros objetivos são fornecidos pela presente invenção que, em um sentido amplo, refere-se a compostos, métodos, composições e artigos de fabricação que proporcionam anticorpos com eficácia melhorada. Os benefícios fornecidos pela presente invenção são amplamente aplicáveis no campo de anticorpos terapêuticos e diagnósticos e podem ser usados em conjunto com anticorpos que reagem com uma variedade de alvos. A presente invenção fornece anticorpos, de preferência anticorpos monoclonais completamente humanos, que se ligam aOX40 humana. Também fornece métodos de geração de hibridoma que usam ratos humanizados, moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos anti-OX40, vetores e células hospedeiras usadas para a expressão de anticorpos anti-OX40. A invenção fornece ainda os métodos para validar a função de anticorpos in vitro e in vivo. Os anticorpos da invenção proporcionam um agente potente para o tratamento de doenças múltiplas compreendendo o câncer através da modulação da função imunológica humana.
[009] Em alguns aspectos, a invenção compreende um anticorpo isolado, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo.
[010] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno tem uma ou mais das seguintes propriedades:
[011] a) ligação deOX40 humana com um KD de 1 x 10-8 M ou menos;
[012] (b) induzir a produção de uma citocina (por exemplo, IL -2 ou IFN-γ) em células T CD4+;
[013] (c) aumentar a proliferação de células T CD4+ humanas primárias;
[014] (d) melhorar a proliferação de células T CD4+ efetoras humanas primárias na presença de células Treg;
[015] (e) ligar aOX40 humana ou de macaco rhesus respectivamente; ou
[016] (f) não tendo reatividade cruzada ao CD40 humano, CD137 e CD271.
[017] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção de ligação ao antígeno se liga ao domínio CRD2 e/ou CRD3 do OX40.
[018] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[019] A) uma ou mais CDRs de cadeia pesada (CDRHs) selecionadas a partir de pelo menos um do grupo consistindo em:
[020] (i) uma CDRH1 com pelo menos 90% de identidade de sequência a uma CDRH1 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 7, 13, 15, 21 e 27;
[021] (ii) uma CDRH2 com pelo menos 90% de identidade de sequência a uma CDRH2 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3, 9, 17, 23 e 29; e
[022] (iii) uma CDRH3 com pelo menos 90% de identidade de sequência a uma CDRH3 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 11, 19, 25 e 31;
[023] B) uma ou mais CDRs de cadeia leve (CDRLs) selecionadas a partir de pelo menos um dentre o grupo consistindo em:
[024] (i) uma CDRL1 com pelo menos 90% de identidade de sequência a uma CDRL1 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 8, 14, 16, 22 e 28;
[025] (ii) uma CDRL2 com pelo menos 90% de identidade de sequência a uma CDRL2 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 10, 18, 24 e 30; e
[026] (iii) uma CDRL3 com pelo menos 90% de identidade de sequência a uma CDRL3 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 12, 20, 26 e 32; ou
[027] C) um ou mais CDRHs de A) e um ou mais CDRLs de B).
[028] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[029] A) uma ou mais CDRs de cadeia pesada (CDRHs) selecionadas a partir de pelo menos um do grupo consistindo em:
[030] (i) uma CDRH1 selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 7, 13, 15, 21 e 27, ou uma CDRH1 que difere em sequência de aminoácidos da CDRH1 por adição, deleção ou substituição de aminoácidos de não mais do que 2 aminoácidos;
[031] (ii) uma CDRH2 selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3, 9, 17, 23 e 29, ou uma CDRH2 que difere em sequência de aminoácidos da CDRH2 por adição, deleção ou substituição de aminoácidos de não mais do que 2 aminoácidos; e
[032] (iii) uma CDRH3 selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 11, 19, 25 e 31, ou uma CDRH3 que difere em sequência de aminoácidos da CDRH3 por adição, deleção ou substituição de aminoácidos de não mais do que 2 aminoácidos;
[033] B) uma ou mais CDRs de cadeia leve (CDRLs) selecionadas a partir de pelo menos um dentre o grupo consistindo em:
[034] (i) uma CDRL1 selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 8, 14, 16, 22 e 28, ou uma CDRL1 que difere em sequência de aminoácidos da CDRL1 por adição, deleção ou substituição de aminoácidos de não mais do que 2 aminoácidos;
[035] (ii) uma CDRL2 selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 10, 18, 24 e 30, ou uma CDRL2 que difere em sequência de aminoácidos da CDRL2 por adição, deleção ou substituição de aminoácidos de não mais do que 2 aminoácidos; e
[036] (iii) uma CDRL3 selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 12, 20, 26 e 32, ou uma CDRL3 que difere em sequência de aminoácidos da CDRL3 por adição, deleção ou substituição de aminoácidos de não mais do que 2 aminoácidos; ou
[037] C) um ou mais CDRHs de A) e um ou mais CDRLs de B).
[038] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[039] A) uma CDRH3 compreendendo SEQ ID NO: 5, 11, 19, 25 ou 31; ou
[040] B) uma CDRH3 com pelo menos 90% de identidade de sequência a uma CDRH3 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 5, 11, 19, 25 e 31; ou
[041] C) uma CDRH3 que difere em sequência de aminoácidos da CDRH3 de (A) por adição, deleção ou substituição de aminoácidos de não mais do que 2 aminoácidos,
[042] e em que o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno se liga aOX40 humana com um KD de 1 x 10-8 M ou menos.
[043] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[044] (a) uma CDRH1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 1;
[045] (b) uma CDRH2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 3;
[046] (c) uma CDRH3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 5;
[047] (d) uma CDRL1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 2;
[048] (e) uma CDRL2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 4; e
[049] (f) uma CDRL3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 6.
[050] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[051] (a) uma CDRH1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 7;
[052] (b) uma CDRH2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 9;
[053] (c) uma CDRH3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 11;
[054] (d) uma CDRL1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 8;
[055] (e) uma CDRL2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 10; e
[056] (f) uma CDRL3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 12.
[057] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[058] (a) uma CDRH1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 13;
[059] (b) uma CDRH2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 9;
[060] (c) uma CDRH3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 11;
[061] (d) uma CDRL1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 14;
[062] (e) uma CDRL2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 10; e
[063] (f) uma CDRL3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 12.
[064] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[065] (a) uma CDRH1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 15;
[066] (b) uma CDRH2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 17;
[067] (c) uma CDRH3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 19;
[068] (d) uma CDRL1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 16;
[069] (e) uma CDRL2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 18; e
[070] (f) uma CDRL3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 20.
[071] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[072] (a) uma CDRH1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 21;
[073] (b) uma CDRH2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 23;
[074] (c) uma CDRH3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 25;
[075] (d) uma CDRL1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 22;
[076] (e) uma CDRL2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 24; e
[077] (f) uma CDRL3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 26.
[078] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[079] (a) uma CDRH1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 27;
[080] (b) uma CDRH2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 29;
[081] (c) uma CDRH3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 31;
[082] (d) uma CDRL1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 28;
[083] (e) uma CDRL2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 30; e
[084] (f) uma CDRL3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 32.
[085] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[086] (A) uma região variável de cadeia pesada (VH):
[087] (i) compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41 e 43;
[088] (ii) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90% ou 95% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41 e 43; ou
[089] (iii) compreendendo uma sequência de aminoácidos com adição, deleção e/ou substituição de um ou mais (tais como 1-10, 1-5, 1-3,1, 2, 3, 4 ou 5) aminoácidos comparados com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41 e 43; e/ou
[090] (B) uma região variável de cadeia leve (VL):
[091] (i) compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42 e 44;
[092] (ii) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42 e 44; ou
[093] (iii) compreendendo uma sequência de aminoácidos com adição, deleção e/ou substituição de um ou mais (tais como 1-10, 1-5, 1-3,1, 2, 3, 4 ou 5) aminoácidos comparados com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42 e 44.
[094] Em algumas modalidades, a invenção compreende um anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno que compete a ligação para o mesmo epítopo com o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno como definido acima.
[095] Em alguns aspectos, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolada, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável da cadeia pesada e/ou a região variável da cadeia leve do anticorpo isolado conforme aqui descrito.
[096] Em alguns aspectos, a invenção refere-se a um vetor que compreende a molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo ou sua porção ligadora de antígeno conforme aqui descrito.
[097] Em alguns aspectos, a invenção refere-se a uma célula hospedeira que compreende o vetor de expressão descrito aqui.
[098] Em alguns aspectos, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um anticorpo ou sua porção ligadora de antígeno como aqui descrito e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[099] Em alguns aspectos, a invenção refere-se a um método para a preparação de um anticorpo anti-OX40 ou sua porção ligadora de antígeno que compreende a expressão do anticorpo ou porção ligadora de antígeno do mesmo na célula hospedeira e isolar o anticorpo ou sua porção ligadora de antígeno a partir da célula hospedeira.
[0100] Em alguns aspectos, a invenção refere-se a um método de modular uma resposta imune em um indivíduo, compreendendo administrar o anticorpo ou porção ligadora de antígeno do mesmo, conforme aqui descrito, ao indivíduo, de modo que uma resposta imune no indivíduo seja modulada.
[0101] Em alguns aspectos, a invenção refere-se a um método para o tratamento de crescimento anormal de células em um indivíduo, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo ou sua porção ligadora de antígeno ou da composição farmacêutica conforme aqui apresentada ao indivíduo.
[0102] Em alguns aspectos, a invenção refere-se a um método para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo ou sua porção ligadora de antígeno ou da composição farmacêutica conforme aqui apresentada ao indivíduo.
[0103] Em alguns aspectos, a invenção refere-se a um método para reduzir a metástase de células tumorais em um indivíduo, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo ou sua porção ligadora de antígeno ou da composição farmacêutica conforme aqui apresentada ao indivíduo.
[0104] Em alguns aspectos, a invenção refere-se a um método para prejudicar a função supressora de células de Treg em um indivíduo, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo ou sua porção ligadora de antígeno ou da composição farmacêutica conforme aqui apresentada ao indivíduo.
[0105] Em alguns aspectos, a invenção refere-se a um método para o tratamento ou prevenção de doenças que compreendem distúrbios proliferativos (tais como cânceres), doenças autoimunes, doenças inflamatórias ou doenças infecciosas em um indivíduo que compreende a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo ou da sua porção de ligação ao antígeno ou da composição farmacêutica conforme aqui apresentada ao indivíduo.
[0106] Em alguns aspectos, a invenção refere-se ao uso do anticorpo ou porção ligadora de antígeno do mesmo conforme aqui descrito na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doenças que compreendem distúrbios proliferativos (tais como cânceres), doenças autoimunes, doenças inflamatórias ou doenças infecciosas.
[0107] Em alguns aspectos, a invenção refere-se ao uso do anticorpo ou sua porção ligadora de antígeno como aqui descrito na fabricação de um agente diagnóstico para diagnosticar doenças proliferativas compreendendo distúrbios proliferativos (tais como cânceres), doenças autoimunes, doença inflamatória ou doenças infecciosas.
[0108] Em alguns aspectos, a invenção refere-se ao anticorpo ou porção ligadora de antígeno do mesmo conforme aqui descrito para uso no tratamento ou prevenção de doenças que compreendem distúrbios proliferativos (tais como cânceres), doenças autoimunes, doenças inflamatórias ou doenças infecciosas.
[0109] Em alguns aspectos, a invenção refere-se a kits ou dispositivos e métodos associados que empregam o anticorpo ou sua porção ligadora de antígeno conforme aqui descrito, e composições farmacêuticas conforme aqui descritas, que são úteis para o tratamento de doenças que compreendem distúrbios proliferativos (tais como cânceres), doenças autoimunes, doenças inflamatórias ou doenças infecciosas. Para este fim, a presente invenção proporciona, de preferência, um artigo de fabricação útil para o tratamento de tais distúrbios, compreendendo um receptáculo contendo o anticorpo ou sua porção ligadora de antígeno, conforme aqui descrito, e materiais instrutivos para o uso do anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo, conforme aqui descrito, para tratar, melhorar ou prevenir um distúrbio proliferativo ou progressão ou sua recorrência.
[0110] O precedente é um resumo e assim contém, por necessidade, simplificações, generalizações, e omissões de detalhes; consequentemente, aqueles versados na técnica apreciarão que o sumário é apenas ilustrativo e não se destina a ser de nenhum modo limitativo. Outros aspectos, características e vantagens dos métodos,
composições e/ou dispositivos e/ou outros objetos aqui descritos tornar-se-ão evidentes nos ensinamentos aqui apresentados. O sumário é fornecido para introduzir uma seleção de conceitos em uma forma simplificada que são adicionalmente descritos abaixo na Descrição Detalhada. Este sumário não se destina a identificar características chaves ou características essenciais do assunto reivindicado, nem pretende ser usado como um auxílio na determinação do escopo do assunto reivindicado. Além disso, os conteúdos de todas as referências, patentes e pedidos de patente publicados citados por todo este pedido são incorporados aqui em sua totalidade por referência. Breve Descrição das Figuras
[0111] Figura 1 é um gráfico que mostra a comparação entre as variantes do anticorpo anti-OX40 1.62.3-u1-lgG1K após a mutação PTM.
[0112] Figura 2 é um gráfico que mostra anticorpos que se ligam a células CHO- K1 transfectadas comOX40 humana.
[0113] Figura 3 é um gráfico que mostra anticorpos que se ligam a células T CD4+ ativadas.
[0114] Figura 4 é um gráfico que mostra anticorpos competitivamente ligando a OX40 com OX40L.
[0115] Figura 5 é um gráfico que mostra anticorpos que se ligam às células 293F de macaco rhesus transfectadas com OX40.
[0116] Figura 6 é um gráfico que mostra os resultados do teste de ligação cruzada de família de anticorpos anti-OX40 a outros membros da família TNFR incluindo CD40 humano, CD137 e CD271 por ELISA.
[0117] Figuras 7A, 7B e 7C são gráficos que mostram a categorização (“binning”) do epítopo dos anticorpos contra os anticorpos de referência BMK1 (Figura 7A), BMK7 (Figura 7B) e BMK10 (Figura 7C), respectivamente.
[0118] Figuras 8A, 8B e 8C são gráficos que mostram o efeito de anticorpos sobre a atividade de luciferase de NFkB estimulada por OX40 em células Jurkat usando anticorpos livres ou ligação cruzada de FcyR por células CHO-K1 expressando CD32b ou reagente IgG Fc anti-humano. A atividade repórter de anticorpos livres (Figura 8A) ou ligação cruzada por (Figura 8B) F(ab')2 de IgG anti-humana de cabra ou células CHO-K1 que expressam CD32b é mostrada, respectivamente.
[0119] Figura 9 é um gráfico que mostra o efeito de anticorpos sobre a secreção de IL -2 induzida por anti-CD3 por células T CD4+ humanas primárias.
[0120] Figura 10 é um gráfico que mostra o efeito de anticorpos sobre a secreção de IFN-γ induzida por anti-CD3 por células T CD4+ humanas primárias.
[0121] Figura 11 é um gráfico que mostra o efeito de anticorpos sobre a proliferação induzida por anti-CD3 de células T CD4+ humanas primárias.
[0122] Figura 12 é um gráfico que mostra o efeito de anticorpos sobre proliferação induzida por CD3/CD28 Dynabeads de células efetoras T CD4+ humanas primárias na presença de células Treg.
[0123] Figura 13A é um gráfico que mostra a expressão de OX40 em células T CD4+ ativadas, e a Figura 13B é um gráfico que mostra a expressão de OX40 em células Jurkat superexpressando OX40.
[0124] Figura 14A é um gráfico que mostra o efeito ADCC de anticorpos OX40 em células Jurkat que expressam OX40, e a Figura 14B é um gráfico que mostra o efeito ADCC de anticorpos OX40 em células T CD4+ humanas ativadas.
[0125] Figura 15A é um gráfico que mostra o efeito CDC de anticorpos OX40 em células Jurkat que expressam OX40, e a figura 15B é um gráfico que mostra o efeito CDC De anticorpos OX40 em Células T CD4 + humanas ativadas.
[0126] Figuras 16A e 16B são gráficos que mostram o crescimento tumoral de camundongos contendo tumor MC38 após a administração do anticorpo 1.134.9-u1- IgG1L.
[0127] Figura 17 é um gráfico que mostra a mudança de peso corporal de camundongos contendo tumores MC38 após a administração do anticorpo 1.134.9-u1- IgG1L.
Descrição Detalhada da Invenção
[0128] Embora a presente invenção possa ser concretizada em muitas formas diferentes, aqui descritas são modalidades ilustrativas específicas da mesma que exemplificam os princípios da invenção. Deve ser enfatizado que a presente invenção não é limitada às modalidades específicas ilustradas. Além disso, quaisquer cabeçalhos de seção aqui usados são para propósitos organizacionais apenas e não devem ser interpretados como limitativos do assunto descrito.
[0129] A menos que de outro modo definido aqui, os termos científicos e técnicos usados em conexão com a presente invenção devem ter os significados que são comumente entendidos por aqueles versados na técnica. Além disso, a menos que de outra forma exigido pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e vários termos devem incluir o singular. Mais especificamente, conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem os referentes plurais, a menos que o contexto claramente dite de outra forma. Desse modo, por exemplo, a referência a “uma proteína” inclui uma pluralidade de proteínas; a referência a “uma célula” que inclui misturas de células, e semelhantes.
Neste pedido de patente, o uso de “ou” significa “e/ou” a menos que atestado de outra forma. Além disso, o uso do termo “compreendendo”, bem como outras formas, tal como “compreende” e “compreendido”, não é limitante. Além disso, as faixas fornecidas no relatório descritivo e nas reivindicações anexas incluem ambos os pontos terminais e todos os pontos entre os pontos finais.
[0130] Geralmente, a nomenclatura usada em conexão com, e técnicas de cultura de célula e tecido, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e proteína e química de ácido nucleico e hibridização aqui descritas são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Os métodos e técnicas da presente invenção são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e descritos em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas em todo o presente relatório, a menos que de outro modo indicado. Ver, por exemplo, Abbas e colaboradores., Cellular and Molecular Immunology, 6a ed., W.B. Saunders Company (2010); Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I. (2000); Ausubel e colaboradores., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow e Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I. (1998); e Coligan e colaboradores., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). A nomenclatura usada em conexão com, e os procedimentos de laboratório e técnicas de química analítica, química orgânica sintética, e química medicinal e farmacêutica aqui descrita são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Além disso, quaisquer cabeçalhos de seção aqui usados são para propósitos organizacionais apenas e não devem ser interpretados como limitativos do assunto descrito.
Definições
[0131] A fim de entender melhor a invenção, as definições e explicações dos termos relevantes são fornecidas como segue.
[0132] O termo "anticorpo" ou "Ab", conforme aqui usado, refere-se geralmente a uma proteína tetramérica em forma de Y compreendendo duas cadeias de polipeptídeo pesada (H) e duas leves (L) mantidas juntas por ligações de dissulfeto covalente e interações não-covalentes.
Cadeias leves de um anticorpo podem ser classificadas em cadeia leve κ e λ.
As cadeias pesadas podem ser classificadas em μ, δ, γ, α e ε, que definem isotipos de um anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente.
Em uma cadeia leve e uma cadeia pesada, uma região variável é ligada a uma região constante por meio de uma região “J” de cerca de 12 ou mais aminoácidos, e uma cadeia pesada compreende ainda uma região “D” de cerca de 3 ou mais aminoácidos.
Cada cadeia pesada consiste em uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada (CH). Região constante de cadeia pesada consiste em 3 domínios (C H1, CH2 e C H3). Cada cadeia leve consiste em uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve (CL). As regiões VH e V L podem ainda ser divididas em regiões hipervariáveis (denominadas regiões determinantes de complementariedade (CDR)), que são interespaçadas por regiões relativamente conservadoras (denominadas região estruturais (FR)). Cada V H e V L consiste em 3 CDRs e 4 FRs na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 de N-terminal para C-terminal.
A região variável (VH e VL) de cada par de cadeia pesada/leve forma sítios de ligação de antígenos, respectivamente.
A distribuição de aminoácidos em várias regiões ou domínios segue a definição em Sequências de Kabat de Proteínas de Interesse imunológico (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), ou
Chothia & Lesk (1987) J.
Mol.
Biol. 196:901-917; Chothia e colaboradores., (1989)
Nature 342:878-883. Anticorpos podem ser de diferentes isotipos de anticorpos, por exemplo, anticorpo IgG (por exemplo, subtipo IgG1, IgG2, IgG3 ou lgG4), IgA1, IgA2, IgD,
IgE ou IgM.
[0133] O termo "porção ligadora de antígeno" ou “fragmento ligador de antígeno” de um anticorpo, que pode ser utilizado de forma intercambiável no contexto do pedido, refere-se a polipeptídeos compreendendo fragmentos de um anticorpo de comprimento total, que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno que o anticorpo de comprimento total se liga a, e/ou competir com o anticorpo de comprimento total para ligação ao mesmo antígeno. Geralmente, ver Fundamental Immunology, Cap. 7 (Paul, W, ed , a segunda edição, Raven Press, NI (1989), que é incorporado aqui por referência para todos os propósitos. Fragmentos de ligação de antígenos de um anticorpo podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante ou por clivagem enzimática ou química de um anticorpo intacto. Sob algumas condições, fragmentos de ligação de antígenos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb e região determinante de complementariedade (CDR), anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv), anticorpo quimérico, dianticorpo e tais polipeptídeos que compreendem pelo menos parte do anticorpo suficiente para conferir a capacidade de ligação específica do antígeno nos polipeptídeos. Fragmentos de ligação de antígeno de um anticorpo podem ser obtidos a partir de um dado anticorpo (por exemplo, o anticorpo monoclonal anti-humano OX40 fornecido no presente pedido) por técnicas convencionais conhecidas por um versado na técnica (por exemplo, técnica de DNA recombinante ou métodos de clivagem enzimática ou química), e podem ser triados para especificidade da mesma maneira pela qual anticorpos intactos são selecionados.
[0134] O termo "anticorpo monoclonal" ou "mAb", conforme aqui usado, refere- se a uma preparação de moléculas de anticorpos de uma única composição molecular.
Um anticorpo monoclonal exibe uma única especificidade de ligação e afinidade para um epítopo particular.
[0135] O termo "anticorpo humano" ou "anticorpo completamente humano", conforme aqui usado, destina-se a incluir anticorpos tendo regiões variáveis nas quais ambas as regiões de estrutura e CDR são derivadas de sequências de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana. Além disso, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante também é derivada de sequências de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo). Entretanto, o termo "anticorpo humano", conforme aqui usado, não se destina a incluir anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas em sequências de estruturas humanas.
[0136] O termo "anticorpo monoclonal humano", conforme aqui usado, refere-se a anticorpos que apresentam uma especificidade de ligação simples, que têm regiões variáveis nas quais ambas as regiões de estrutura e CDR são derivadas de sequências de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana.
[0137] O termo "anticorpo humanizado" destina-se a se referir a anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie mamífera, tal como um camundongo, foram enxertadas em sequências de estruturas humanas. Modificações adicionais da região de estrutura podem ser feitas dentro das sequências da estrutura humana.
[0138] O termo "anticorpo quimérico", conforme aqui usado, refere-se a um anticorpo no qual as sequências de região variável são derivadas de uma espécie e as sequências de região constante são derivadas de uma outra espécie, tal como um anticorpo no qual as sequências de região variável são derivadas de um anticorpo de camundongo e as sequências de região constante são derivadas de um anticorpo humano.
[0139] O termo "anticorpo recombinante", conforme aqui usado, refere-se a um anticorpo que é preparado, expresso, criado ou isolado por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados de um animal que é transgênico para outros genes de imunoglobulina da espécie, anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira, anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpos recombinantes, combinatórios, ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolve a união de sequências de genes de imunoglobulina a outras sequências de DNA.
[0140] O termo “anticorpo anti-OX40” ou “anticorpo OX40”, como aqui usado, refere-se a um anticorpo, conforme aqui definido, capaz de se ligar a um receptor OX40, por exemplo, um receptorOX40 humana.
[0141] Os termos "OX40”, “receptor OX40", “proteína OX40”, “superfamília do receptor do fator de necrose tumoral, membro 4 (TNFSF4)”, ou a “CD134”, que são usados aqui de forma intercambiável, é um membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (TNF). O termo "OX40" pode incluir receptorOX40 humana, bem como variantes, isoformas, e seus homólogos de espécies. Consequentemente, um anticorpo ou porção ligadora de antígeno do mesmo, conforme definido e descrito aqui, pode também se ligar a OX40 de espécies outras que humanas, por exemplo, cynomolgus X40.
[0142] O termo "OX40 humana", conforme aqui usado, refere-se à sequência humana OX40, tal como a sequência de aminoácidos completa deOX40 humana tendo Acesso ao Genbank No CAE11757.1. A sequência OX40 humana pode diferir deOX40 humana de Acesso ao Genbank No CAE11757.1 tendo, por exemplo, mutações conservadas ou mutações em regiões não conservadas e o OX40 tem substancialmente a mesma função biológica que aOX40 humana de Acesso ao Genbank No CAE117571.1.
[0143] O termo "OX40 de camundongo", conforme aqui usado, refere-se à sequência de camundongo OX40, tal como a sequência completa de aminoácidos do OX40 do camundongo, tendo o Acesso ao Genbank No CAA59476.1.
[0144] O termo "cynomolgus OX40", conforme aqui usado, refere-se à sequência cynomolgus OX40, tal como a sequência de aminoácidos completa de macaco Rhesus OX40, tendo Acesso ao Genbank No. XP_001090870.1.
[0145] O termo "Ka", conforme aqui usado, se destina a referir-se à taxa de associação de uma interação anticorpo-antígeno particular, enquanto o termo "Kd", conforme aqui usado, se destina a referir-se à taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular. Valores Kd para anticorpos podem ser determinados usando métodos bem estabelecidos na técnica. O termo "KD", conforme aqui usado, se destina a se referir à constante de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular, que é obtida a partir da relação de Kd para Ka (isto é, Kd/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M). Um método preferido para a determinação do Kd de um anticorpo é através da utilização de ressonância de plasmon de superfície, de preferência utilizando-se um sistema biossensor tal como um sistema Biacore®.
[0146] O termo "alta afinidade" para um anticorpo IgG, como aqui usado, refere- se a um anticorpo tendo um KD de 1 x 10-7 M ou menos, mais preferivelmente 5 x 10-8 M ou menos, ainda mais preferivelmente 1x10-8 M ou menos, ainda mais preferivelmente 5 x 10-9 M ou menos e ainda mais preferivelmente 1 x 10-9 M ou menos para um antígeno alvo, por exemplo, um receptor OX40.
[0147] O termo "EC50", como aqui usado, que é também denominado como “meia concentração máxima efetiva”, refere-se à concentração de um fármaco, anticorpo ou tóxico que induz uma resposta a meio caminho entre a linha de base e o máximo após um tempo de exposição especificado. No contexto da aplicação, o EC50 é expresso na unidade de “nM”.
[0148] O termo "competir por ligação”, conforme aqui usado, refere-se à interação de dois anticorpos em sua ligação a um alvo de ligação. Um primeiro anticorpo compete para ligação com um segundo anticorpo se a ligação do primeiro anticorpo com seu epítopo cognato for detectavelmente diminuída na presença do segundo anticorpo em comparação com a ligação do primeiro anticorpo na ausência do segundo anticorpo. A alternativa, onde a ligação do segundo anticorpo a seu epítopo também é detectavelmente diminuída na presença do primeiro anticorpo, pode, mas não precisa, ser o caso. Isto é, um primeiro anticorpo pode inibir a ligação de um segundo anticorpo a seu epítopo sem que o segundo anticorpo iniba a ligação do primeiro anticorpo a seu respectivo epítopo. No entanto, quando cada anticorpo detectavelmente inibe a ligação do outro anticorpo com seu epítopo cognato, seja na mesma extensão, maior ou menor, os anticorpos são referidos para “competir de forma cruzada” uma com a outra para ligação de seu(s) epítopo(s) respectivo(s).
[0149] A capacidade de “inibir a ligação”, como aqui usado, refere-se à capacidade de um anticorpo ou fragmento ligador de antígeno do mesmo para inibir a ligação de duas moléculas (por exemplo,OX40 humana e anticorpo anti-OX40 humana) a qualquer nível detectável. Em certas modalidades, a ligação das duas moléculas pode ser inibida pelo menos 50% pelo anticorpo ou fragmento ligador de antígeno do mesmo. Em certas modalidades, tal efeito inibidor pode ser maior do que 60%, maior do que 70%, maior do que 80%, ou maior do que 90%.
[0150] O termo "epítopo", conforme aqui usado, refere-se a uma porção do antígeno que uma imunoglobulina ou anticorpo se liga especificamente. “Epítopo” é também conhecido como “determinantes antigênicos”. Epítopo ou determinante antigênico geralmente consiste em grupos de superfície quimicamente ativos de uma molécula tal como aminoácidos, carboidratos ou cadeias laterais de açúcar, e geralmente tem uma estrutura tridimensional específica e uma característica de carga específica. Por exemplo, um epítopo compreende, de modo geral, pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos consecutivos ou não consecutivos em uma conformação estérica única, a qual pode ser “linear” ou “conformacional”. Veja, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed (1996). Em um epítopo linear, todos os sítios de interação entre uma proteína e uma molécula de interação (por exemplo, um anticorpo) está presente linearmente ao longo da sequência primária de aminoácidos da proteína. Em um epítopo conformacional, os sítios de interação abrangem sobre resíduos de aminoácidos que são separados um do outro em uma proteína. Os anticorpos podem ser selecionados dependendo da competitividade de ligação ao mesmo epítopo por técnicas convencionais conhecidas por um versado na técnica. Por exemplo, o estudo em competição ou competição cruzada pode ser conduzido para obter anticorpos que competem ou competem cruzadamente entre si para ligação a antígenos (por exemplo, proteína de fusão RSV). Métodos de alta produtividade para obtenção de anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo, que são baseados em sua competição cruzada, são descritos em um Pedido de Patente Internacional WO 03/48731.
[0151] O termo "isolado", conforme aqui usado, refere-se a um estado obtido a partir do estado natural por meios artificiais. Se uma certa substância ou componente “isolado” está presente na natureza, é possível porque seu ambiente natural muda, ou a substância é isolada do ambiente natural, ou ambos. Por exemplo, um certo polinucleotídeo ou polipeptídeo não isolado existe naturalmente em um determinado corpo animal vivo, e o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo com elevada pureza isolada de tal estado natural é chamado polinucleotídeo ou polipeptídeo isolado. O termo "isolado" não exclui a substância artificial ou sintetizada misturada nem outras substâncias impuras que não afetam a atividade da substância isolada.
[0152] O termo "anticorpo isolado", conforme usado aqui, destina-se a se referir a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos tendo especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a uma proteína OX40 é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos outros que proteínas OX40). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a uma proteína OX40 humana pode, no entanto, ter reatividade cruzada a outros antígenos, tais como proteínas OX40 de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outro material celular e/ou produtos químicos.
[0153] O termo "vetor", conforme aqui usado, refere-se a um veículo de ácido nucleico que pode ter um polinucleotídeo inserido no mesmo. Quando o vetor permite a expressão da proteína codificada pelo polinucleotídeo inserido no mesmo, o vetor é chamado de vetor de expressão. O vetor pode ter os elementos de material genético transportados expressos em uma célula hospedeira por transformação, transdução ou transfecção na célula hospedeira. Os vetores são bem conhecidos por uma pessoa versada na técnica, incluindo, mas não se limitando a, plasmídeos, fagos, cosmídeos, cromossoma artificial tal como cromossomo artificial de levedura (YAC), cromossomo artificial bacteriano (BAC) ou cromossomo artificial derivado de P1 (PAC); fago tal como fago λ ou fago M13 e vírus animal. Os vírus animais que podem ser usados como vetores incluem, mas não estão limitados a, retrovírus (incluindo lentivírus), adenovírus, vírus adenoassociado, vírus do herpes (tal como vírus do herpes simplex), vírus pox, baculovírus, papilomavírus, vírus de papova (tal como SV40). Um vetor pode compreender múltiplos elementos para controlar a expressão, incluindo, mas não se limitando a, uma sequência promotora, uma sequência de iniciação de transcrição, uma sequência intensificadora, um elemento de seleção e um gene repórter. Além disso, um vetor pode compreender origem de replicação.
[0154] O termo "célula hospedeira", conforme aqui usado, refere-se a um sistema celular que pode ser construído para gerar proteínas, fragmentos de proteína ou peptídeos de interesse. As células hospedeiras incluem, sem limitação, células cultivadas, por exemplo, células cultivadas em mamíferos derivadas de roedores (ratos, camundongos, porquinhos da índia, ou hamsters) tais como CHO, BHK, NSO, SP2/0, YB2/0; ou tecidos humanos ou células de hibridoma, células de levedura e células de insetos, e células compreendidas dentro de um animal transgênico ou tecido cultivado. O termo abrange não apenas a célula em questão particular, mas também a progênie de tal célula. Porque certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido à mutação ou influências ambientais, tal progênie não pode ser idêntica à célula parental, mas ainda está incluída dentro do escopo do termo "célula hospedeira".
[0155] O termo "identidade", conforme aqui usado, refere-se a uma relação entre as sequências de duas ou mais moléculas de polipeptídeo ou duas ou mais moléculas de ácido nucléico, conforme determinado pelo alinhamento e comparação das sequências. “Percentual de identidade” significa a porcentagem de resíduos idênticos entre os aminoácidos ou nucleotídeos nas moléculas comparadas e é calculada com base no tamanho da menor das moléculas que estão sendo comparadas. Para estes cálculos, os espaços em alinhamentos (se houver) são, de preferência, endereçados por um modelo matemático particular ou programa de computador (isto é, um “algoritmo”).
Métodos que podem ser usados para calcular a identidade dos ácidos nucleicos e polipeptídeos alinhados incluem aqueles descritos em Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, Nova Iorque: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, Nova Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, Nova Iorque: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, Nova Iorque: M.
Stockton Press; e Carillo e colaboradores, 1988, SIAMJ. Applied Math. 48:1073.
[0156] O termo "imunogenicidade", conforme aqui usado, refere-se à capacidade de estimular a formação de anticorpos específicos ou linfócitos sensibilizados em organismos. Não apenas se refere à propriedade de um antígeno para estimular um imunócito específico para ativar, proliferar e diferenciar de modo a finalmente gerar uma substância efetora imunológica tal como anticorpo e linfócito sensibilizado mas também se refere à resposta imune específica que anticorpo ou linfócito T sensibilizado pode ser formado no sistema imunológico de um organismo após estimulação do organismo com um antígeno. A imunogenicidade é a propriedade mais importante de um antígeno. Se um antígeno pode induzir com sucesso a geração de uma resposta imune em um hospedeiro depende de três fatores, propriedades de um antígeno, reatividade de um hospedeiro e meios de imunização.
[0157] O termo "transfecção", conforme aqui usado, refere-se ao processo pelo qual os ácidos nucleicos são introduzidos em células eucarióticas, particularmente células de mamíferos. Protocolos e técnicas para transfecção incluem, mas não se limitam a transfecção de lipídeo e métodos químicos e físicos tais como eletroporação.
Um número de técnicas de transfecção é bem conhecido na técnica e é aqui descrito.
Veja, por exemplo, Graham e colaboradores., 1973, Virology 52:456; Sambrook e colaboradores., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, acima; Davis e colaboradores., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu e colaboradores, 1981, Gene 13:197. Em uma modalidade específica da invenção, o gene OX40 humano foi transfectado em células 293F.
[0158] O termo "hibridoma" e o termo "linhagem celular de hibridoma", conforme aqui usado, podem ser usados de forma intercambiável. Quando o termo "hibridoma" e o termo "linhagem celular de hibridoma" são mencionados, eles também incluem subclones e célula de progênie de hibridoma.
[0159] O termo “RPS” ou "ressonância de plasmon de superfície", como aqui usado, refere-se a e inclui um fenômeno óptico que permite a análise de interações bioespecíficas em tempo real pela detecção de alterações nas concentrações de proteína dentro de uma matriz de biossensor, por exemplo, usando o sistema BIAcore (Pharmacia Biossensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, NJ). Para descrições adicionais, ver Exemplo 5 e Jönsson, U., e colaboradores. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jönsson, U., e colaboradores. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., e colaboradores. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; e Johnnson, B., e colaboradores. (1991) Anal.
Biochem. 198:268-277.
[0160] O termo "separação de células ativada por fluorescência" ou "FACS", conforme aqui usado, refere-se a um tipo especializado de citometria de fluxo. Fornece um método para a separação de uma mistura heterogênea de células biológicas em dois ou mais recipientes, uma célula de cada vez, com base nas características específicas de dispersão de luz e fluorescência de cada célula (FlowMetric. “Sorting Out Fluorescence Activated Cell Sorting”. Recuperado 09.11.2017.). Os instrumentos para a realização de FACS são conhecidos por aqueles versados na técnica e são comercialmente disponíveis para o público. Exemplos de tais instrumentos incluem instrumentos FACS Star Plus, FACScan e FACSort da Becton Dickinson (Foster City, Calif.) Epics C da Coulter Epics Division (Hialeah, Fla) e MoFlo de Cytomation (Colorado Springs, Colo.).
[0161] O termo "citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo" ou “ADCC”, como aqui usado, refere-se a uma forma de citotoxicidade em que a Ig secretada ligada sobre receptores Fc (FcRs) presente em certas células citotóxicas (por exemplo, Células Natural Killer (NK), neutrófilos e macrófagos) permite que estas células efetoras citotóxicas se liguem especificamente a uma célula alvo carregando antígeno e matam subsequentemente a célula alvo com citotoxinas. Os anticorpos “armam” as células citotóxicas e são absolutamente requeridos para tal morte. As células primárias para a mediação de ADCC, células NK, expressam somente FcyrIII, enquanto monócitos expressam FcγRI, FcγRII e FcγRIII. A expressão de FcR sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457- 92 (1991). Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio de ADCC in vitro, tal como aquele descrito na Patente Norte-Americana No. 5.500.362 ou 5.821.337, pode ser realizado. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK).
Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como aquele descrito em Clynes e colaboradores PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).
[0162] O termo "citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-se à lise de uma célula alvo na presença de complemento. A ativação da via clássica do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema complemento
(C1q) a anticorpos (da subclasse apropriada) que são ligados ao seu antígeno cognato.
Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro e outros, J Immunol. Methods 202: 163 (1996), podem ser realizados.
[0163] O termo "indivíduo" inclui qualquer animal humano ou não humano, de preferência seres humanos.
[0164] O termo "câncer", conforme aqui usado, refere-se a qualquer ou um tumor ou um crescimento celular maligno, proliferação ou mediada por metástase, tumores sólidos e tumores não-sólidos, tais como leucemia e iniciação de uma condição médica.
[0165] O termo "tratamento", “tratando” ou “tratado”, como aqui usado no contexto de tratamento de uma condição, refere-se geralmente ao tratamento e terapia, seja de um ser humano ou animal, em que algum efeito terapêutico desejado é obtido, por exemplo, a inibição do progresso da condição, e inclui uma redução na taxa de progresso, uma parada na taxa de progresso, regressão da condição, melhora da condição e cura da condição. O tratamento como uma medida profilática (isto é, profilaxia, prevenção) é também incluído. Para o câncer, os métodos de “tratamento” de câncer podem se referir a amortecer ou retardar o crescimento, proliferação, ou metástase de células tumorais ou malignas, ou alguma combinação dos mesmos. Para tumores, o “tratamento” inclui a remoção de todo ou parte do tumor, inibição ou redução do crescimento de tumor e metástase, prevenção ou retardo do desenvolvimento de tumor, ou alguma combinação dos mesmos.
[0166] O termo "quantidade eficaz", como aqui usado, refere-se àquela quantidade de um composto ativo, ou um material, composição ou dosagem que compreende um composto ativo, que é eficaz para produzir algum efeito terapêutico desejado, comensurável com uma proporção razoável de benefício/risco, quando administrado de acordo com um regime de tratamento desejado. Por exemplo, o termo "quantidade eficaz", quando usado em conexão com o tratamento de doenças ou condições relacionadas com OX40, refere-se a um anticorpo ou porção de ligação antigênica do mesmo em uma quantidade ou concentração eficaz para tratar as ditas doenças ou condições.
[0167] O termo "prevenir", "prevenção" ou "prevenindo", como aqui usado, com referência a uma determinada condição de doença em um mamífero, refere-se à prevenção ou retardamento do início da doença, ou prevenção da manifestação de sintomas clínicos ou subclínicos da mesma.
[0168] O termo "farmaceuticamente aceitável", para uso na presente invenção, significa que o veículo, diluente, excipiente e/ou seus sais, são quimicamente e/ou fisicamente compatíveis com outros ingredientes na formulação, sendo fisiologicamente compatíveis com o recipiente.
[0169] Como aqui usado, o termo "veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável" refere-se a um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente e/ou fisiologicamente compatível com um indivíduo e um agente ativo, que é bem conhecido na técnica (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences. Editado por Gennaro AR, 19a ed Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995), e inclui, mas não é limitado a, regulador de pH, tensoativo, adjuvante e intensificador de resistência iônica.
Por exemplo, o regulador de pH inclui, mas não está limitado a, tampão de fosfato; o tensoativo inclui, mas não está limitado a, tensoativo catiônico, aniônico ou não-iônico, por exemplo, Tween -80; o intensificador de resistência iônica inclui, mas não é limitado a, cloreto de sódio.
[0170] Como aqui usado, o termo "adjuvante" refere-se a um imunopotenciador não-específico, que pode aumentar a resposta imune a um antígeno ou mudar o tipo de resposta imune em um organismo quando ele é liberado junto com o antígeno ao organismo ou é liberado ao organismo de antemão. Há uma variedade de adjuvantes, incluindo, mas não limitados a, adjuvantes de alumínio (por exemplo, hidróxido de alumínio), adjuvantes de Freund (por exemplo, adjuvante completo de Freund e adjuvante incompleto de Freund), Corynebacteirum parvum, lipopolissacarídeo, citocinas, e semelhantes. O adjuvante de Freund é o adjuvante mais comumente usado em experimentos de animais agora. Adjuvante de hidróxido de alumínio é mais comumente usado em ensaios clínicos. Anticorpos Anti-OX40
[0171] Em alguns aspectos, a invenção compreende um anticorpo isolado ou uma porção de ligação antigênica do mesmo.
[0172] No contexto da aplicação, os “anticorpos” podem incluir anticorpos policlonais, anticorpos multiclonais, anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e primatizados, anticorpos enxertados com CDR, anticorpos humanos, anticorpos recombinantemente produzidos, intracorpos, anticorpos multiespecíficos, anticorpos biespecíficos, anticorpos monovalentes, anticorpos multivalentes, anticorpos anti-idiotípicos, anticorpos sintéticos, incluindo muteinas e suas variantes; e seus derivados incluindo fusões Fc e outras modificações, e qualquer outra molécula imunorreativa contanto que exiba associação preferencial ou ligação com uma proteína OX40. Além disso, a menos que ditado de outra forma pelas restrições contextuais, o termo ainda compreende todas as classes de anticorpos (isto é IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) e todas as subclasses (isto é, IgG1, IgG2, IgG3, lgG4, IgA1 e IgA2). Em uma modalidade preferida, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em uma modalidade mais preferida, o anticorpo é um anticorpo monoclonal humano.
[0173] Anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na técnica. Uma técnica é a exibição de fagos em que uma biblioteca de anticorpos (preferivelmente humanos) é sintetizada em fagos, a biblioteca é selecionada com o antígeno de interesse ou uma porção de ligação de anticorpos do mesmo, e o fago que liga o antígeno é isolado, do qual pode-se obter os fragmentos imune-reativos. Métodos para a preparação e seleção de tais bibliotecas são bem conhecidos na técnica e kits para a geração de bibliotecas de exibição de fagos são comercialmente disponíveis (por exemplo, o Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catálogo No 27-9400- 01; e o kit de exibição de fago Stratagene SurZAPTM, catálogo no 240612). Existem também outros métodos e reagentes que podem ser usados na geração e seleção de bibliotecas de exibição de anticorpos (veja, por exemplo, Barbas e colaboradores, Proc Natl Acad Sei USA 88: 7978-7982 (1991)).
[0174] Anticorpos humanos também podem ser feitos introduzindo-se loci de imunoglobulina humana em animais transgênicos, por exemplo, camundongos em que os genes endógenos de imunoglobulinas foram parciais ou completamente inativado e genes de imunoglobulinas humanas foram introduzidos. No desafio, observa-se a produção de anticorpos humanos, que se assemelha estritamente à vista em humanos em todos os aspectos, incluindo o rearranjo gênico, a montagem e o repertório de anticorpos. Esta abordagem é descrita, por exemplo, em U.S.P.Ns. 5.545.807; 5.545.806;
5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016 e U.S.P.Ns. 6.075.181 e 6.150.584 a respeito da tecnologia XenoMouse; e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65- 93 (1995). Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado através da imortalização de linfócitos B humanos que produzem um anticorpo dirigido contra um antígeno alvo (tais linfócitos B podem ser recuperados de um indivíduo que sofre de um distúrbio neoplásico ou podem ter sido imunizados in vitro). Veja, por exemplo, Cole e colaboradores, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner e colaboradores, J Immunol, 147 (l): 86-95 (1991); e U.S.P.N. 5.750.373.
[0175] Anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo técnicas de hibridoma, técnicas recombinantes, tecnologias de exibição de fagos, animais transgênicos (por exemplo, um XenoMouse®) ou alguma combinação dos mesmos. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando-se hibridoma e técnicas de engenharia bioquímica e genética reconhecidas na técnica tais como descritas em maiores detalhes em An, Zhigiang (ed.) Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley and Sons, 1a ed. 2009; Shire et. al. (eds.) Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Springer Science + Business Media LLC, 1a ed. 2010; Harlow e colaboradores., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988; Hammerling, e colaboradores., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) cada um dos quais é incorporado aqui em sua totalidade por referência. Deve ser entendido que uma sequência de ligação selecionada pode ser adicionalmente alterada, por exemplo, para melhorar a afinidade para o alvo, para humanizar a sequência de ligação alvo, para melhorar sua produção em cultura celular, para reduzir sua imunogenicidade in vivo, para criar um anticorpo multiespecífico etc, e que um anticorpo compreendendo a sequência de ligação alvo alterada é também um anticorpo desta invenção. Em uma modalidade preferida, o anticorpo monoclonal OX40 anti-humano é preparado pelo uso de hibridoma.
Geração de Hibridomas que Produzem Anticorpos Monoclonais Humanos da Invenção
[0176] Para gerar hibridomas que produzem os anticorpos da invenção, por exemplo, anticorpos monoclonais humanos da invenção, esplenócitos e/ou células de linfonodos de camundongos imunizados podem ser isolados e fundidos a uma linhagem celular imortalizada apropriada, tal como uma linhagem celular de mieloma de camundongo. Os hibridomas resultantes podem ser selecionados para a produção de anticorpos específicos de antígeno. A geração de hibridomas é bem conhecida na técnica. Veja, por exemplo , Harlow e Lane (1988), A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nova Iorque.
Geração de Transfectomas Produzindo Anticorpos Monoclonais da Invenção
[0177] Os anticorpos da invenção também podem ser produzidos em uma transfecção de células hospedeiras usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção genética como é bem conhecido na técnica (por exemplo, Morrison, S. (1985) Science 229: 1202). Em uma modalidade, DNA que codifica cadeias leves e pesadas parciais ou de comprimento completo obtidas por técnicas de biologia molecular padrão é inserido em um ou mais vetores de expressão, de modo que os genes sejam operacionalmente ligados a sequências reguladoras de transcrição e tradução. Neste contexto, o termo "operacionalmente ligado" significa que um gene anticorpo é ligado a um vetor tal que as sequências de controle de transcrição e tradução dentro do vetor servem a sua função pretendida de regular a transcrição e tradução do gene anticorpo.
[0178] O termo "sequência reguladora" destina-se a incluir promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes da cadeia de anticorpos. Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). As sequências reguladoras exemplares para a expressão de células hospedeiras de mamíferos incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteína em células de mamíferos, tais como promotores e/ou intensificadores derivados de citomegalovírus (CMV), Vírus Símio 40 (SV40), Adenovírus, (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)) e polioma. Alternativamente, podem ser usadas sequências reguladoras não virais, tais como o promotor ubiquitina ou promotor de β- globina. Ainda adicionalmente, os elementos reguladores compostos de sequências de diferentes fontes, tais como o sistema promotor SRa, que contém sequências do promotor precoce SV40 e da repetição terminal longa do vírus da leucemia da célula T humana tipo 1 (Takebe e colaboradores (1988) MoI. Cell. Biol. 8: 466-472). O vetor de expressão e as sequências de controle de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada.
[0179] O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada de anticorpo podem ser inseridos nos mesmos vetores de expressão ou separados. Em algumas modalidades, as regiões variáveis são usadas para criar genes de anticorpo de comprimento total de qualquer isotipo de anticorpos inserindo-os em vetores de expressão já codificando regiões constantes de cadeia pesada e constantes de cadeia leve do isotipo desejado tal que o segmento VH é operacionalmente ligado ao(s) segmento(s) CH dentro do vetor e o segmento VL é operacionalmente ligado ao segmento de CL dentro do vetor. Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo de sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpos a partir de uma célula hospedeira. O gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor tal que o peptídeo de sinal é ligado em estrutura ao término amino do gene de cadeia de anticorpos. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptídeo de sinal heterólogo (isto é, um peptídeo de sinal a partir de uma proteína não-imunoglobulina).
[0180] Em adição aos genes de cadeia de anticorpos e sequências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem transportar sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (veja, por exemplo, Patentes Norte-Americanas Nos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Genes marcadores selecionáveis podem incluir o gene de reductase de diidrofolato (DHFR) (para uso em células dhfr-hospedeiras com seleção/amplificação de metotrexato) e o gene neo (para seleção G418).
[0181] Para a expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(s) de expressão (s) codificando as cadeias pesada e leve é(são) transfectado(s) em uma célula hospedeira por técnicas padrão. As várias formas do termo "transfecção" destinam-se a abranger uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação de cálcio-fosfato, transfecção de DEAE-dextrano e similares. É possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, por exemplo, células hospedeiras de mamíferos, que podem montar e secretar um anticorpo adequadamente dobrado e imunologicamente ativo.
[0182] Células hospedeiras de mamíferos para expressar os anticorpos recombinantes da invenção incluem Células de Ovário de Hamster Chinês (células CHO) (incluindo células dhfr CHO, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. ScL USA 77: 4216-4220, usada com um marcador selecionável DHFR, por exemplo, como descrito em R. J. Kaufman e P. A. Sharp (1982) J. MoI. Biol. 159: 601-621), células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Em particular, para uso com células de mieloma NSO, outro Sistema de expressão no sistema de expressão do gene GS revelado em WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338, 841. Quando vetores de expressão recombinante codificando gentes de anticorpos são introduzidos em células mamíferas, os anticoros são produzidos pelo cultivo das células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são crescidas.
Anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura usando métodos de purificação de proteína padrões.
Anticorpos Anti-OX40 com Certas Propriedades
[0183] Os anticorpos da Invenção são caracterizados por características funcionais particulares ou propriedades dos anticorpos. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a porção ligadora de antígeno do mesmo tem uma ou mais das seguintes propriedades:
[0184] (a) ligação aOX40 humana com um KD of 1 x 10-8 M ou menos;
[0185] (b) indução da produção de uma citocina (por exemplo, IL-2 ou IFN-γ) em células T CD4+;
[0186] (c) aumento da proliferação das células T CD4+ primárias humanas;
[0187] (d) aumento da proliferação das células efetoras T CD4+ humanas primárias em presença de células Treg;
[0188] (e) ligação a OX40 humana ou de macaco rhesus; ou
[0189] (f) não ter reatividade cruzada ao CD40 humano, CD137 e CD271
[0190] O anticorpo da Invenção se liga a OX40 humana com alta afinidade. A ligação do anticorpo da Invenção ao OX40 pode ser avaliada usando uma ou mais técnicas bem estabelecida na técnica, por exemplo, ELISA. A especificidade de ligação de u m anticorpo da Invenção pode ser determinada pelo monitoramento da ligação do anticorpo às células expressando uma proteína OX40, por exemplo, citometria de fluxo. Por exemplo, um anticorpo pode ser testado por um ensaio de citometria de fluxo em que o anticorpo é reagido com uma linhagem celular que expressa OX40 humana, tal como células CHO que têm sido transfectadas para expressar OX40 em sua superfície celular. Outras células adequadas para uso nos ensaios de citometria de fluxo incluem células T CD4+ ativadas estimuladas por anti-CD3, que expressam OX40 nativas. Adicionalmente ou alternativamente, a ligação do anticorpo, incluindo a cinética de ligação (por exemplo, valor Kd) pode ser testada nos ensaios de ligação BIAcore. Ainda outros ensaios de ligação adequadis incluem ensaios de ELISA, por exemplo, usando uma proteína OX40 recombinante. Por exemplo, um anticorpo da invenção se liga a uma OX40 humana com um KD de 1 x 10-8 M ou menos, se liga a uma OX40 humana com um KD de 1 x 10-9 M ou menos, se liga a uma OX40 humana com um KD de 5 x 10-10 M ou menos, se liga a uma OX40 humana com um KD de 2 x 10-10 M ou menos, se liga a uma proteína OX40 humana com um KD de 1 x 10-10 M ou menos, se liga a uma proteína OX40 humana com um KD de 5 x 10-11 M ou menos, se liga a uma proteína OX40 humana com um KD de 3 x 10-11 M ou menos, ou se liga a uma proteína OX40 humana com um KD de 2 x 10-11 M ou menos.
Anticorpos Anti-OX40 Compreendendo CDRs com Identidade de Sequência à Sequências Específicas
[0191] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou sua porção ligadora de antígeno compreende:
[0192] A) uma ou mais CDRs de cadeia pesada (CDRHs) selecionadas a partir de pelo menos um do grupo consistindo em:
[0193] (i) uma CDRH1 com pelo menos 90% de identidade de sequência a uma CDRH1 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 1, 7, 13, 15, 21 e 27;
[0194] (ii) uma CDRH2 com pelo menos 90% de identidade de sequência a uma CDRH2 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3, 9, 17, 23 e 29; e
[0195] (iii) uma CDRH3 com pelo menos 90% de identidade de sequência a uma CDRH3 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 5, 11, 19, 25 e 31;
[0196] B) uma ou mais CDRs de cadeia leve (CDRLs) selecionadas a partir de pelo menos um dentre o grupo consistindo em:
[0197] (i) uma CDRL1 com pelo menos 90% de identidade de sequência a uma CDRL1 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 8, 14, 16, 22 e 28;
[0198] (ii) uma CDRL2 com pelo menos 90% de identidade de sequência a uma CDRL2 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 10, 18, 24 e 30; e
[0199] (iii) uma CDRL3 com pelo menos 90% de identidade de sequência a uma CDRL3 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 12, 20, 26 e 32; ou
[0200] C) um ou mais CDRHs de A) e um ou mais CDRLs de B).
[0201] A atribuição de aminoácidos a cada CDR pode ser de acordo com um dos esquemas de numeração fornecidos por Kabat e colaboradores. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5a Ed.), US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publicação no. 91-3242; Chothia e colaboradores., 1987, PMID: 3681981;
Chothia e colaboradores., 1989, PMID: 2687698; MacCallum e colaboradores.,1996, PMID: 8876650; ou Dubel, Ed. (2007) Handbook of Therapeutic Antibodies, 3a Ed., Wily- VCH Verlag GmbH e Co. a menos que de outro modo observado.
[0202] As regiões variáveis e CDRs em uma sequência de anticorpos podem ser identificadas de acordo com as regras gerais que foram desenvolvidas na técnica (conforme descrito acima, tal como, por exemplo, o sistema de numeração Kabat) ou pelo alinhamento das sequências contra uma base de dados de regiões variáveis conhecidas.
Métodos para a identificação destas regiões são descritos em Kontermann e Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, Nova Iorque, NI, 2001 e Dinarello e colaboradores., Current Protocols in Immunology, John Wiley e Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000. Bases de dados exemplares de sequências de anticorpos são descritas em, e podem ser acessadas através do website “Abysis” em www.bioinf.org.uk/abs (mantido por A.C.
Martin no Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London, Londres, Inglaterra) e o website VBASE2 em www.vbase.org, como descrito em Retter e colaboradores, Nucl. Acids Res., 33 (análise de Banco de Dados): D671-D674 (2005).
De preferência, as sequências são analisadas utilizando-se o banco de dados Abysis, que integra os dados de sequência de Kabat, IMGT e o Banco de Dados de Proteína (PDB) com dados estruturais a partir do PDB. Ver capítulo do livro do Dr. Andrew C. R.
Martin Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. Em: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. e Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547, também disponível no website bioinforg.uk/abs).
O website de banco de dados Abysis ainda inclui regras gerais que foram desenvolvidas para identificar CDRs que podem ser usadas de acordo com os ensinamentos da presente invenção. A menos que de outra forma indicado, todas as CDRs apresentadas aqui são derivadas de acordo com o website de base de dados Abysis como por Kabat.
[0203] A identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci. 4: 11- 17 (1988)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. Além disso, a porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada pelo algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48 : 444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando ou um matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
[0204] Adicionalmente ou alternativamente, as sequências de proteínas da presente invenção podem ainda ser usadas como uma “sequência de consulta” para realizar uma pesquisa contra bases de dados públicas para, por exemplo, identificar sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas utilizando o programa XBLAST (versão 2.0) de Altschul e colaboradores (1990) J. MoI. Biol. 215: 403-10.
Pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de anticorpos da invenção. Para obter os alinhamentos de espaços para fins de comparação, o Gapped BLAST pode ser utilizado conforme descrito em Altschul e colaboradores (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402. Quando utilizando programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrões dos programas respectivos (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Veja www.ncbi.nlm.nih.gov.
[0205] Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos CDR podem ser pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às respectivas sequências apresentadas acima. Como um exemplo ilustrativo, o anticorpo pode compreender uma CDRH1 com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência a um CDRH1 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 7, 13, 15, 21 e
27. Anticorpos Anti-OX40 Compreendendo CDRs com Adição, Deleção e/ou Substituição de Aminoácidos
[0206] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[0207] A) uma ou mais CDRs de cadeia pesada (CDRHs) selecionadas a partir de pelo menos um do grupo consistindo em:
[0208] (i) uma CDRH1 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 7, 13, 15, 21 e 27, ou uma CDRH1 que difere em sequência de aminoácidos da CDRH1 por adição, deleção ou substituição de aminoácidos de não mais do que 2 aminoácidos;
[0209] (ii) uma CDRH2 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3, 9, 17, 23 e 29, ou uma CDRH2 que difere em sequência de aminoácidos aa CDRH2 por adição, deleção ou substituição de aminoácidos de não mais do que 2 aminoácidos; e
[0210] (iii) uma CDRH3 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 11, 19, 25 e 31, ou uma CDRH3 que difere em sequência de aminoácidos da CDRH3 por adição, deleção ou substituição de aminoácidos de não mais do que 2 aminoácidos;
[0211] B) uma ou mais CDRs de cadeia leve (CDRLs) selecionadas a partir de pelo menos um do grupo consistindo em:
[0212] (i) uma CDRL1 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 8, 14, 16, 22 e 28, ou uma CDRL1 que difere em sequência de aminoácidos da CDRL1 por adição, deleção ou substituição de aminoácidos de não mais do que 2 aminoácidos;
[0213] (ii) uma CDRL2 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 10, 18, 24 e 30, ou uma CDRL2 que difere em sequência de aminoácidos da CDRL2 por adição, deleção ou substituição de aminoácidos de não mais do que 2 aminoácidos; e
[0214] (iii) uma CDRL3 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 12, 20, 26 e 32, ou uma CDRL3 que difere em sequência de aminoácidos da CDRL3 por adição, deleção ou substituição de aminoácidos de não mais do que 2 aminoácidos; ou
[0215] C) uma ou mais CDRHs de A) e um ou mais CDRLs de B).
[0216] Em algumas modalidades, as CDRs do anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno contêm uma substituição conservativa de não mais do que 1 aminoácido. O termo "substituição conservativa", conforme aqui usado, refere-se a substituições de aminoácidos que não afetam adversamente ou alteram as propriedades essenciais de uma proteína/polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos.
Por exemplo, uma substituição conservativa pode ser introduzida através de técnicas padrão conhecidas na técnica, tais como mutagênese direcionada ao sítio e mutagênese mediada por PCR. Substituições conservativas de aminoácidos incluem substituições em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar, por exemplo, um resíduo fisicamente ou funcionalmente similar (tal como, tendo tamanho, forma, carga similares, propriedade química incluindo a capacidade de formar ligação covalente ou ligação de hidrogênio etc) ao resíduo de aminoácido correspondente. As famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos tendo cadeias laterais alcalinas (por exemplo, lisina, arginina e histidina), aminoácidos tendo cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico), aminoácidos tendo cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina , asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), aminoácidos tendo cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), aminoácidos tendo cadeias laterais β-ramificadas (tais como treonina, valina, isoleucina) e aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Portanto, um resíduo de aminoácido correspondente é preferivelmente substituído por outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Métodos para identificar substituições conservativas de aminoácidos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Brummell e colaboradores., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi e colaboradores. Protein Eng. 12 (10): 879-884 (1999); e Burks e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997), que são incorporados aqui por referência).
Anticorpos Anti-OX40 Compreendendo CDRs
[0217] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[0218] (a) uma CDRH1 compreendendo SEQ ID NO: 1;
[0219] (b) uma CDRH2 compreendendo SEQ ID NO: 3;
[0220] (c) uma CDRH3 compreendendo SEQ ID NO: 5;
[0221] (d) uma CDRL1 compreendendo SEQ ID NO: 2;
[0222] (e) uma CDRL2 compreendendo SEQ ID NO: 4; e
[0223] (f) uma CDRL3 compreendendo SEQ ID NO: 6.
[0224] Em uma modalidade específica, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[0225] (a) uma CDRH1 consistindo em SEQ ID NO: 1;
[0226] (b) uma CDRH2 consistindo em SEQ ID NO: 3;
[0227] (c) uma CDRH3 consistindo em SEQ ID NO: 5;
[0228] (d) uma CDRL1 consistindo em SEQ ID NO: 2;
[0229] (e) uma CDRL2 consistindo em SEQ ID NO: 4; e
[0230] (f) uma CDRL3 consistindo em SEQ ID NO: 6.
[0231] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[0232] (a) uma CDRH1 compreendendo SEQ ID NO: 7;
[0233] (b) uma CDRH2 compreendendo SEQ ID NO: 9;
[0234] (c) uma CDRH3 compreendendo SEQ ID NO: 11;
[0235] (d) uma CDRL1 compreendendo SEQ ID NO: 8;
[0236] (e) uma CDRL2 compreendendo SEQ ID NO: 10; e
[0237] (f) uma CDRL3 compreendendo SEQ ID NO: 12.
[0238] Em uma modalidade específica, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[0239] (a) uma CDRH1 consistindo em SEQ ID NO: 7;
[0240] (b) uma CDRH2 consistindo em SEQ ID NO: 9;
[0241] (c) uma CDRH3 consistindo em SEQ ID NO: 11;
[0242] (d) uma CDRL1 consistindo em SEQ ID NO: 8;
[0243] (e) uma CDRL2 consistindo em SEQ ID NO: 10; e
[0244] (f) uma CDRL3 consistindo em SEQ ID NO: 12.
[0245] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[0246] (a) uma CDRH1 compreendendo SEQ ID NO: 13;
[0247] (b) uma CDRH2 compreendendo SEQ ID NO: 9;
[0248] (c) uma CDRH3 compreendendo SEQ ID NO: 11;
[0249] (d) uma CDRL1 compreendendo SEQ ID NO: 14;
[0250] (e) uma CDRL2 compreendendo SEQ ID NO: 10; e
[0251] (f) uma CDRL3 compreendendo SEQ ID NO: 12.
[0252] Em uma modalidade específica, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[0253] (a) uma CDRH1 consistindo em SEQ ID NO: 13;
[0254] (b) uma CDRH2 consistindo em SEQ ID NO: 9;
[0255] (c) uma CDRH3 consistindo em SEQ ID NO: 11;
[0256] (d) uma CDRL1 consistindo em SEQ ID NO: 14;
[0257] (e) uma CDRL2 consistindo em SEQ ID NO: 10; e
[0258] (f) uma CDRL3 consistindo em SEQ ID NO: 12.
[0259] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[0260] (a) uma CDRH1 compreendendo SEQ ID NO: 15;
[0261] (b) uma CDRH2 compreendendo SEQ ID NO: 17;
[0262] (c) uma CDRH3 compreendendo SEQ ID NO: 19;
[0263] (d) uma CDRL1 compreendendo SEQ ID NO: 16;
[0264] (e) uma CDRL2 compreendendo SEQ ID NO: 18; e
[0265] (f) uma CDRL3 compreendendo SEQ ID NO: 20.
[0266] Em uma modalidade específica, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[0267] (a) uma CDRH1 consistindo em SEQ ID NO: 15;
[0268] (b) uma CDRH2 consistindo em SEQ ID NO: 17;
[0269] (c) uma CDRH3 consistindo em SEQ ID NO: 19;
[0270] (d) uma CDRL1 consistindo em SEQ ID NO: 16;
[0271] (e) uma CDRL2 consistindo em SEQ ID NO: 18; e
[0272] (f) uma CDRL3 consistindo em SEQ ID NO: 20.
[0273] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[0274] (a) uma CDRH1 compreendendo SEQ ID NO: 21;
[0275] (b) uma CDRH2 compreendendo SEQ ID NO: 23;
[0276] (c) uma CDRH3 compreendendo SEQ ID NO: 25;
[0277] (d) uma CDRL1 compreendendo SEQ ID NO: 22;
[0278] (e) uma CDRL2 compreendendo SEQ ID NO: 24; e
[0279] (f) uma CDRL3 compreendendo SEQ ID NO: 26.
[0280] Em uma modalidade específica, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[0281] (a) uma CDRH1 consistindo em SEQ ID NO: 21;
[0282] (b) uma CDRH2 consistindo em SEQ ID NO: 23;
[0283] (c) uma CDRH3 consistindo em SEQ ID NO: 25;
[0284] (d) uma CDRL1 consistindo em SEQ ID NO: 22;
[0285] (e) uma CDRL2 consistindo em SEQ ID NO: 24; e
[0286] (f) uma CDRL3 consistindo em SEQ ID NO: 26.
[0287] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[0288] (a) uma CDRH1 compreendendo SEQ ID NO: 27;
[0289] (b) uma CDRH2 compreendendo SEQ ID NO: 29;
[0290] (c) uma CDRH3 compreendendo SEQ ID NO: 31;
[0291] (d) uma CDRL1 compreendendo SEQ ID NO: 28;
[0292] (e) uma CDRL2 compreendendo SEQ ID NO: 30; e
[0293] (f) uma CDRL3 compreendendo SEQ ID NO: 32.
[0294] Em uma modalidade específica, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[0295] (a) uma CDRH1 consistindo em SEQ ID NO: 27;
[0296] (b) uma CDRH2 consistindo em SEQ ID NO: 29;
[0297] (c) uma CDRH3 consistindo em SEQ ID NO: 31;
[0298] (d) uma CDRL1 consistindo em SEQ ID NO: 28;
[0299] (e) uma CDRL2 consistindo em SEQ ID NO: 30; e
[0300] (f) uma CDRL3 consistindo em SEQ ID NO: 32. Anticorpos Anti-OX40 Compreendendo uma Região Variável de Cadeia Pesada e uma Região Variável de Cadeia Leve
[0301] Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende:
[0302] (A) uma região variável de cadeia pesada:
[0303] (i) compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41 e 43;
[0304] (ii) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90% ou 95% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41 e 43; ou
[0305] (iii) compreendendo uma sequência de aminoácidos com adição, deleção e/ou substituição de um ou mais aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41 e 43; e/ou
[0306] (B) uma região variável de cadeia leve:
[0307] (i) compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42 e 44;
[0308] (ii) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42 e 44; ou
[0309] (iii) compreendendo uma sequência de aminoácidos com adição, deleção e/ou substituição de um ou mais aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42 e 44.
[0310] Em uma modalidade específica, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada consistindo em sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34.
[0311] Em uma modalidade específica, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35 e uma região variável de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36.
[0312] Em uma modalidade específica, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37 e uma região variável de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38.
[0313] Em uma modalidade específica, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40.
[0314] Em uma modalidade específica, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e uma região variável de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42.
[0315] Em uma modalidade específica, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43 e uma região variável de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44.
[0316] Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos da região variável de cadeia pesada e/ou região variável de cadeia leve podem ser pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às respectivas sequências apresentadas acima. Como um exemplo ilustrativo, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência a uma região variável de cadeia pesada consistindo da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33.
[0317] Em algumas modalidades adicionais, o anticorpo isolado ou a sua porção ligadora de antígeno pode conter substituição conservativa ou modificação de aminoácidos nas regiões variáveis da cadeia pesada e/ou cadeia leve. Entende-se na técnica que certas modificações de sequência conservativas podem ser feitas que não removem a ligação de antígenos. Ver, por exemplo, Brummell e colaboradores (1993) Biochem 32: 1180-8; de Wildt e colaboradores (1997) Prot. Eng. 10: 835-41; Komissarov e colaboradores (1997) J. Biol. Chem. 272 : 26864-26870; Hall e colaboradores (1992) J.
Immunol. 149: 1605-12; Kelley e O'Connell (1993) Biochem. 32: 6862-35; Adib-Conquy e colaboradores (1998) Int. Immunol. 10: 341-6 e Beers e colaboradores (2000) Clin. Can. Res. 6: 2835-43.
[0318] Conforme descrito acima, o termo "substituição conservativa", conforme aqui usado, refere-se a substituições de aminoácidos que não afetam adversamente ou alteram as propriedades essenciais de uma proteína/polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos. Por exemplo, uma substituição conservativa pode ser introduzida através de técnicas padrão conhecidas na técnica, tais como mutagênese direcionada ao sítio e mutagênese mediada por PCR. Substituições conservativas de aminoácidos incluem substituições em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar, por exemplo, um resíduo fisicamente ou funcionalmente similar (tal como, tendo tamanho, forma, carga, propriedade química similar, incluindo a capacidade de formar ligação covalente ou ligação de hidrogênio etc) ao resíduo de aminoácido correspondente. As famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica.
Estas famílias incluem aminoácidos tendo cadeias laterais alcalinas (por exemplo, lisina, arginina e histidina), aminoácidos tendo cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico), aminoácidos tendo cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), aminoácidos tendo cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina) , aminoácidos tendo cadeias laterais β-ramificadas (tais como treonina, valina, isoleucina) e aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Portanto, um resíduo de aminoácido correspondente é preferivelmente substituído por outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Métodos para identificação de substituições conservativas de aminoácidos são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Brummell e colaboradores., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi e colaboradores., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); e Burks e colaboradores., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997), que são incorporados aqui por referência). Categorização e Mapeamento de Epítopo
[0319] Será ainda apreciado que os anticorpos descritos se associarão com, ou se ligam a epítopos discretos ou determinantes imunogênicos apresentados pelo alvo selecionado ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, os epítopos ou determinantes imunogênicos incluem grupos de moléculas de superfície ativas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforila, ou grupos sulfonila. Em algumas modalidades, epítopos podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específicas. Desse modo, como aqui usado, o termo "epítopo" inclui qualquer determinante de proteína capaz de ligação específica a um receptor de imunoglobulina ou célula T ou de outra forma interagindo com uma molécula. Em algumas modalidades, diz-se que um anticorpo se liga especificamente (ou se liga a forma imunológica ou reage) a um antígeno quando ele preferivelmente reconhece seu antígeno alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas. Em algumas modalidades, diz-se que um anticorpo liga especificamente um antígeno quando a constante de dissociação de equilíbrio (KD) é menor que ou igual a 10-6 M ou menor que ou igual a 10-7 M , mais preferivelmente quando o e KD é menor que ou igual a 10-8 M, e ainda mais preferivelmente quando o KD é menor que ou igual a 10-9 M.
[0320] Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos (algumas vezes referidos como epítopos “lineares” ou “contínuos”) são tipicamente retidos sob a desnaturação da proteína, enquanto os epítopos formados por dobragem terciária são tipicamente perdidos mediante a desnaturação da proteína. Em qualquer caso, um epítopo de anticorpo tipicamente inclui pelo menos 3, e mais usualmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em uma conformação espacial única.
[0321] A este respeito, será apreciado que, em algumas modalidades, um epítopo pode estar associado com, ou residir em, uma ou mais regiões, domínios ou motivos de, por exemplo, a proteína PD -1. Similarmente, o termo "motivo" reconhecido na técnica será usado de acordo com seu significado comum e geralmente se refere a uma região curta, conservada de uma proteína que é tipicamente de dez a vinte resíduos contíguos de aminoácidos.
[0322] Em qualquer caso, uma vez que um epítopo desejado sobre um antígeno é determinado, é possível gerar anticorpos para esse epítopo, por exemplo, imunizando com um peptídeo que compreende o epítopo utilizando as técnicas descritas na presente invenção. Alternativamente, durante o processo de descoberta, a geração e caracterização de anticorpos pode elucidar informação sobre epítopos desejáveis localizados em domínios ou motivos específicos. A partir desta informação, é então possível competitivamente selecionar anticorpos para ligação ao mesmo epítopo. Uma abordagem para se conseguir isto é conduzir estudos de competição para encontrar anticorpos que se ligam competitivamente uns com os outros, isto é, os anticorpos competem por ligação ao antígeno. Um processo de alta produtividade para anticorpos caracterizados com base em sua competição cruzada é descrito em WO 03/48731.
Outros métodos de mapeamento de caracterização ou de nível de domínio ou de epítopo compreendendo a competição de anticorpos ou a expressão de fragmentos de antígenos em levedura são bem conhecidos na técnica.
[0323] Como aqui usado, o termo "caracterização" refere-se a métodos usados para agrupar ou classificar anticorpos com base em suas características de ligação ao antígeno e competição. Embora as técnicas sejam úteis para definir e categorizar os anticorpos da presente invenção, as características não se correlacionam diretamente sempre com epítopos e tais determinações iniciais de ligação de epítopo podem ser adicionalmente refinadas e confirmadas por uma outra metodologia reconhecida na técnica e conforme aqui descrito. Entretanto, será apreciado que a atribuição empírica dos anticorpos para caracterizações individuais fornece informações que podem ser indicativas do potencial terapêutico dos anticorpos apresentados.
[0324] Mais especificamente, pode-se determinar se um anticorpo de referência selecionado (ou fragmento do mesmo) se liga ao mesmo epítopo ou compete para ligação cruzada com um segundo anticorpo de teste (isto é, está na mesma caracterização) usando métodos conhecidos na técnica e expostos nos Exemplos aqui.
[0325] Outras técnicas de mapeamento de epítopo compatíveis incluem mutantes de varredura de alanina, blots de peptídeo (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248: 443-63) (aqui especificamente incorporados por referência em sua totalidade), ou análise de clivagem de peptídeo. Além disso, métodos tais como excisão de epítopo, extração de epítopo e modificação química de antígenos podem ser empregados (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496) (aqui especificamente incorporado por referência em sua totalidade). Moléculas de Ácido Nucleico que Codificam Anticorpos da Invenção
[0326] Em alguns aspectos, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolada, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável da cadeia pesada e/ou a região variável da cadeia leve do anticorpo isolado conforme aqui descrito.
[0327] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser obtidos utilizando técnicas de biologia molecular padrão. Para anticorpos expressos por hibridomas (por exemplo, hibridomas preparados a partir de camundongos transgênicos que carregam genes de imunoglobulinas humanas como descrito mais abaixo), cDNAs que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo feito pelo hibridoma podem ser obtidos através de amplificação por PCR padrão ou técnicas de clonagem de cDNA. Anticorpos obtidos a partir de uma biblioteca de genes de imunoglobulina (por exemplo , usando técnicas de exibição de fagos), um ácido nucleico que codifica tais anticorpos pode ser recuperado a partir da biblioteca de genes.
[0328] O ácido nucleico isolado que codifica a região VH pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento total ligando operativamente o ácido nucleico que codifica VH a outra molécula de DNA que codifica regiões constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As sequências de genes de região constante de cadeia pesada humana são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Kabat E colaboradores (1991), acima) e fragmentos de DNA que compreendem estas regiões podem ser obtidos através de amplificação por PCR padrão. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante IgG1, IgG2, IgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, mas mais preferivelmente é uma região constante de IgG1 ou lgG4.
[0329] O ácido nucleico isolado que codifica a região VL pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento total (bem como um gene de cadeia leve Fab) ligando operativamente o DNA que codifica VL a outra molécula de DNA que codifica a região constante da cadeia leve, CL. As sequências de genes da região constante da cadeia leve humana são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Kabat E colaboradores, acima) e fragmentos de DNA que compreendem estas regiões podem ser obtidos através de amplificação por PCR padrão. Em modalidades preferenciais, a região constante da cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda.
[0330] Uma vez que os fragmentos de DNA que codificam os segmentos VH e VL são obtidos, estes fragmentos de DNA podem ser adicionalmente manipulados por técnicas de DNA recombinante padrão, por exemplo, para converter os genes de região variável em genes de cadeia de anticorpo de comprimento total, a genes de fragmento Fab ou a um gene scFv. Nestas manipulações, um fragmento de DNA que codifica VL ou VH é operativamente ligado a outro fragmento de DNA que codifica outra proteína, tal como uma região constante de anticorpos ou um ligante flexível. O termo "operacionalmente ligado", conforme usado neste contexto, destina-se a significar que os dois fragmentos de DNA são unidos de modo que as sequências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentos de DNA permanecem “in-frame”.
[0331] Em algumas modalidades, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolada, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo isolado como descrito aqui.
[0332] Em algumas modalidades específicas, a molécula de ácido nucleico isolada codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo isolado e compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em:
[0333] (A) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada como apresentado em SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41 e 43;
[0334] (B) uma sequência de ácido nucleico apresentada em SEQ ID NO: 45, 47, 49, 51, 53 ou 55; ou
[0335] (C) uma sequência de ácido nucleico que hibridizada sob condições de alta estringência para a fita complementar da sequência de ácido nucleico de (A) ou (B).
[0336] Por exemplo, a molécula de ácido nucléico é constituída de SEQ ID NO: 45, 47, 49, 51, 53 ou 55. Alternativamente, a molécula de ácido nucléico compartilha pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) identidade de sequência para SEQ ID NO: 45, 47, 49, 51, 53 ou 55. Em algumas modalidades específicas, a porcentagem de identidade é derivada da degeneração do código genético, e as sequências de proteína codificada permanecem inalteradas.
[0337] Em algumas modalidades, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolada, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo isolado como descrito aqui.
[0338] Em algumas modalidades específicas, a molécula de ácido nucleico isolada codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo isolado compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em:
[0339] (A) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada como apresentado em SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42 ou 44;
[0340] (B) uma sequência de ácido nucleico apresentada em SEQ ID NO: 46, 48, 50, 52, 54 ou 56; ou
[0341] (C) uma sequência de ácido nucleico que hibridizada sob condições de alta estringência para a fita complementar da sequência de ácido nucleico de (A) ou (B).
[0342] Por exemplo, a molécula de ácido nucléico é constituída de SEQ ID NO: 46, 48, 50, 52, 54 ou 56. Alternativamente, a molécula de ácido nucléico compartilha pelo menos 80% (por exemplo, pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) identidade de sequência para SEQ ID NO: 46, 48, 50, 52, 54 ou 56. Em algumas modalidades específicas, a porcentagem de identidade é derivada da degeneração do código genético, e as sequências de proteína codificadas permanecem inalteradas.
[0343] Condições de alto rigor exemplares incluem a hibridização a 45o C em 5X SSPE e 45% de formamida, e uma lavagem final a 65o C em 0,1 X SSC. Entende-se na técnica que condições de estringência equivalente podem ser obtidas através da variação de temperatura e tampão, ou concentração de sal, conforme descrito em Ausubel, e colaboradores (Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), pp. 6.3.0 a 6.4.10. Modificações em condições de hibridização podem ser empiricamente determinadas ou calculadas precisamente com base no comprimento e na porcentagem de emparelhamento de base de guanosina/citosina (GC) da sonda. As condições de hibridização podem ser calculadas conforme descrito em Sambrook e colaboradores, (Eds.), Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989), pp. 9.47 a 9.51.
Composições Farmacêuticas
[0344] Em alguns aspectos, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um anticorpo ou sua porção de ligação a antígeno como aqui descrito e um veículo farmaceuticamente aceitável. Componentes das Composições
[0345] A composição farmacêutica pode opcionalmente conter um ou mais ingredientes farmaceuticamente ativos adicionais, tal como um outro anticorpo ou um fármaco. As composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas em terapia combinada com, por exemplo, um outro agente imunossupressor, agente anticâncer, agente antiviral, ou uma vacina, tal que o anticorpo anti-OX40 aumenta a resposta imunológica contra a vacina. Um veículo farmaceuticamente aceitável pode incluir, por exemplo, um veículos líquido, gel ou sólido farmaceuticamente aceitáveis, um meio aquoso, um meio não aquoso, um agente antimicrobiano, agentes isotônicos, tampões, antioxidantes, anestésicos, agente de suspensão/dispersão, um agente quelante, um diluente, adjuvante, excipiente ou uma substância auxiliar não tóxica, outros conhecidos na técnica, várias combinações de componentes ou mais.
[0346] Os componentes adequados podem incluir, por exemplo, antioxidantes, enchedores, aglutinantes, agentes desintegrantes, tampões, conservantes, lubrificantes,
flavorizantes, agentes espessantes, agentes corantes, emulsificantes ou estabilizantes tais como açúcares e ciclodextrina. Antioxidantes adequados podem incluir, por exemplo, metionina, ácido ascórbico, EDTA, tiossulfato de sódio, platina, catalase, ácido cítrico, cisteína, mercapto glicerol, ácido tioglicólico, mercapto sorbitol, butil metil anisol , hidróxi tolueno butilado e/ou propilgalacto. Como descrito na presente invenção, em um solvente que contém um anticorpo ou um fragmento ligador de antígeno da presente invenção, descreve-se composições que incluem um ou mais antioxidantes tais como metionina, anticorpo redutor ou fragmento ligador de antígeno da mesma que podem ser oxidados. A redução de oxidação pode impedir ou reduzir uma diminuição na afinidade de ligação, intensificando assim a estabilidade do anticorpo e vida de prateleira prolongada. Assim, em algumas modalidades, a presente invenção fornece uma composição que compreende um ou mais anticorpos ou fragmento de ligação antigênica do mesmo e um ou mais antioxidantes tais como metionina. A presente invenção fornece ainda uma variedade de métodos, em que um anticorpo ou fragmento ligador de antígeno do mesmo é misturado com um ou mais antioxidantes, tal como metionina, de modo que o anticorpo ou fragmento ligador de antígeno do mesmo possa ser impedido de oxidação , para prolongar sua vida de prateleira e/ou atividade aumentada.
[0347] Para ainda ilustrar, veículos farmacêuticos aceitáveis podem incluir, por exemplo, veículos aquosos tais como injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer, injeção de dextrose isotônica, injeção de água estéril, ou dextrose e injeção de Ringer lactada, veículos não aquosos tais como óleos fixos de origem vegetal, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de gergelim, ou óleo de amendoim, agentes antimicrobianos em concentrações bacteriostáticas ou fungiestáticas, agentes isotônicos tais como cloreto de sódio ou dextrose, tampões tais como tampões fosfato ou citrato, antioxidantes tais como bissulfato de sódio, anestésicos locais tais como cloridrato de procaína, agentes de suspensão e dispersantes tais como carboximetilcelulose de sódio, hidroxipropil metilcelulose, ou polivinilpirrolidona, agentes emulsificantes tais como Polissorbato 80 (TWEEN-80), agentes sequestrantes ou quelantes tais como EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético) ou EGTA (ácido etileno glicol tetraacético), álcool etílico, polietileno glicol, propileno glicol , hidróxido de sódio, ácido clorídrico, ácido cítrico, ou ácido láctico. Os agentes antimicrobianos utilizados como veículos podem ser adicionados às composições farmacêuticas em recipientes de múltiplas doses que incluem fenóis ou cresóis, mercuriais, álcool benzílico, clorobutanol, ésteres de ácido metil e propil p-hidroxibenzoico, timerosal, cloreto de benzalcônio e cloreto de benzetônio.
Os excipientes adequados podem incluir, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, ou etanol. As substâncias auxiliares não tóxicas adequadas podem incluir, por exemplo, agentes umectantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento de pH, estabilizantes, melhoradores de solubilidade, ou agentes tais como acetato de sódio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, ou ciclodextrina. Administração, Formulação e Dosagem
[0348] A composição farmacêutica da invenção pode ser administrada in vivo, a um indivíduo em necessidade do mesmo, por várias vias, incluindo, mas não limitadas a, oral, intravenosa, intra-arterial, subcutânea, parenteral, intranasal, intramuscular, intracraniana, intracardíaca, intraventricular, intratraqueal, bucal, retal, intraperitoneal, intradérmica, tópica, transdérmica e intratecal, ou de outra forma por implantação ou inalação. As composições em questão podem ser formuladas em preparações em formas sólidas, semissólidas, líquidas ou gasosas; incluindo, mas não se limitando a, comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, pomadas, soluções, supositórios, enemas, injeções, inalantes e aerossóis. A formulação apropriada e a via de administração podem ser selecionadas de acordo com a aplicação pretendida e regime terapêutico.
[0349] Formulações adequadas para administração enteral incluem cápsulas de gelatina dura ou moles, pílulas, comprimidos, incluindo comprimidos revestidos, elixires, suspensões, xaropes ou inalações e formas de liberação controlada dos mesmos.
[0350] Formulações adequadas para administração parenteral (por exemplo, por injeção), incluem líquidos aquosos ou não-aquosos, isotônicos, livres de pirogênio, estéreis (por exemplo, soluções, suspensões), em que o ingrediente ativo é dissolvido, suspenso ou de outro modo fornecido (por exemplo, em um lipossoma ou outro microparticulado). Tais líquidos podem conter ainda outros ingredientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como antioxidantes, tampões, conservantes, estabilizadores, bacteriostáticos, agentes de suspensão, agentes espessantes e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue (ou outro fluido corporal relevante) do recipiente pretendido. Exemplos de excipientes incluem, por exemplo, água, álcoois, polióis, glicerol, óleos vegetais e semelhantes. Exemplos de veículos isotônicos adequados para uso em tais formulações incluem injeção cloreto de sódio, solução de Ringer, ou injeção de Ringer lactada. Similarmente, o regime de dosagem particular, incluindo a dose, tempo e repetição, dependerá do indivíduo particular e da história médica do indivíduo, bem como considerações empíricas, tais como a farmacocinética (por exemplo, meia-vida, taxa de eliminação etc).
[0351] A frequência de administração pode ser determinada e ajustada durante o curso da terapia, e é baseada na redução do número de células proliferativas ou tumorigênicas, mantendo a redução de tais células neoplásicas, reduzindo a proliferação de células neoplásicas, ou retardando o desenvolvimento de metástase. Em algumas modalidades, a dosagem administrada pode ser ajustada ou atenuada para gerenciar efeitos colaterais potenciais e/ou toxicidade. Alternativamente, formulações de liberação contínua prolongada de uma composição terapêutica em questão podem ser apropriadas.
[0352] Será apreciado por aqueles versados na técnica que dosagens apropriadas podem variar de paciente para paciente. A determinação da dosagem ótima geralmente envolverá o equilíbrio do nível de benefício terapêutico contra qualquer risco ou efeitos colaterais deletérios. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores incluindo, mas sem limitações, a atividade do composto particular, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação, a severidade da condição, e as espécies, sexo, idade, peso, condição, saúde geral e história médica anterior do paciente. A quantidade de composto e via de administração estará, por fim, na discrição do médico, veterinário, ou clínico, embora geralmente a dosagem seja selecionada para atingir concentrações locais no local de ação que atingem o efeito desejado sem causar efeitos colaterais danosos ou deletérios substanciais.
[0353] Em geral, o anticorpo ou a sua porção ligadora de antígeno da invenção pode ser administrado em várias faixas. Estas incluem cerca de 5 μg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal por dose; cerca de 50 μg/kg de peso corporal a cerca de 5 mg/kg de peso corporal por dose; cerca de 100 μg/kg de peso corporal a cerca de 10 mg/kg de peso corporal por dose. Outras faixas incluem cerca de 100 μg/kg de peso corporal a cerca de 20 mg/kg de peso corporal por dose e cerca de 0,5 mg/kg de peso corporal a cerca de 20 mg/kg de peso corporal por dose. Em certas modalidades, a dosagem é de pelo menos cerca de 100 μg/kg de peso corporal, pelo menos cerca de 250 μg/kg de peso corporal, pelo menos cerca de 750 μg/kg de peso corporal, pelo menos cerca de 3 mg/kg de peso corporal, pelo menos cerca de 5 mg/kg de peso corporal, pelo menos cerca de 10 mg/kg de peso corporal.
[0354] Em qualquer evento, o anticorpo ou a sua porção ligadora de antígeno da invenção é administrado, de preferência, conforme necessário a indivíduos em necessidade dos mesmos. A determinação da frequência de administração pode ser feita por pessoas versadas na técnica, tal como um médico atendente com base em considerações da condição que está sendo tratada, a idade do indivíduo sendo tratado, a gravidade da condição sendo tratada, o estado geral da saúde do indivíduo que está sendo tratado e semelhantes.
[0355] Em certas modalidades preferidas, o curso de tratamento envolvendo o anticorpo ou a porção ligadora de antígeno da presente invenção irá compreender múltiplas doses do produto de fármaco selecionado durante um período de semanas ou meses. Mais especificamente, o anticorpo ou a porção ligadora de antígeno da presente invenção pode ser administrado uma vez a cada dia, a cada dois dias, a cada quatro dias, a cada semana, a cada dez dias, a cada duas semanas, a cada três semanas, a cada mês , a cada seis semanas, a cada dois meses, a cada dez semanas ou a cada três meses. A este respeito, será apreciado que as dosagens podem ser alteradas ou o intervalo pode ser ajustado com base na resposta do paciente e práticas clínicas.
[0356] Dosagens e regimes também podem ser determinados empiricamente para as composições terapêuticas apresentadas em indivíduos que receberam uma ou mais administração (s). Por exemplo, os indivíduos podem receber dosagens incrementais de uma composição terapêutica produzida conforme descrito aqui. Em modalidades selecionadas, a dosagem pode ser aumentada gradualmente ou reduzida ou atenuada com base, respectivamente, em efeitos colaterais ou toxicidade empiricamente determinados ou observados. Para avaliar a eficácia da composição selecionada, um marcador da doença, distúrbio ou condição específica pode ser seguido conforme descrito anteriormente. Para o câncer, estas incluem medições diretas de tamanho de tumor através de palpação ou observação visual, medição indireta de tamanho de tumor por raios-x ou outras técnicas de formação de imagem; um aperfeiçoamento conforme avaliado por biópsia de tumor direto e exame microscópico da amostra de tumor; a medição de um marcador de tumor indireto (por exemplo , PSA para câncer de próstata) ou um antígeno tumorigênico identificado de acordo com os métodos aqui descritos, uma diminuição na dor ou paralisia; fala melhorada, visão, respiração ou outra incapacidade associada com o tumor; aumento do apetite; ou aumento na qualidade de vida conforme medido por testes aceitos ou prolongamento da sobrevivência. Será evidente para aqueles versados na técnica que a dosagem variará dependendo do indivíduo, do tipo de condição neoplásica, do estágio da condição neoplásica, se a condição neoplásica começou a metastatizar para outros locais no indivíduo, e os tratamentos passados e simultâneos sendo usados.
[0357] Formulações compatíveis para administração parenteral (por exemplo, injeção intravenosa) compreenderão o anticorpo ou sua porção ligadora de antígeno como aqui descrito em concentrações de cerca de 10 μg/mL a cerca de 100 mg/mL. Em certas modalidades selecionadas, as concentrações do anticorpo ou a sua porção ligadora de antígeno compreenderão 20 μg/mL, 40 μg/mL, 60 μg/mL, 80 μg/mL, 100 μg/ mL, 200 μg/mL, 300, μg/mL, 400 μg/mL, 500 μg/mL, 600 μg/mL, 700 μg/mL, 800 μg/mL, 900 μg/mL ou 1 mg/mL. Em outras modalidades preferidas, as concentrações ADC compreenderão 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 8 mg/mL, 10 mg/mL, 12 mg/mL, 14 mg/mL, 16 mg/mL, 18 mg/mL, 20 mg/mL, 25 mg/mL, 30 mg/mL, 35 mg/mL, 40 mg/mL, 45 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL ou 100 mg/mL.
Aplicações da Invenção
[0358] Os anticorpos, composições de anticorpos e métodos da presente invenção têm numerosas utilidades in vitro e in vivo envolvendo, por exemplo, detecção de OX40 ou aumento da resposta imunológica. Por exemplo, estas moléculas podem ser administradas a células em cultura, in vitro ou ex vivo, ou a indivíduos humanos, por exemplo, in vivo, para aumentar a imunidade em uma variedade de situações. A resposta imune pode ser modulada, por exemplo, aumentada, estimulada ou regulada positivamente.
[0359] Os indivíduos preferidos incluem pacientes humanos em necessidade de melhoria de uma resposta imunológica. Os métodos são particularmente adequados para o tratamento de pacientes humanos tendo um distúrbio que pode ser tratado pelo aumento de uma resposta imunológica (por exemplo, a resposta imunológica mediada por células T). Em uma modalidade particular, os métodos são particularmente adequados para o tratamento de câncer in vivo. Para se obter uma melhoria específica para o antígeno de imunidade, os anticorpos anti-OX40 podem ser administrados junto com um antígeno de interesse ou o antígeno já pode estar presente no indivíduo a ser tratado (por exemplo, um paciente carregando tumor ou portador de vírus). Quando os anticorpos para OX40 são administrados junto com um outro agente, os dois podem ser administrados em ordem ou simultaneamente.
[0360] A invenção fornece ainda métodos para detectar a presença de antígeno OX40 humana em uma amostra, ou medir a quantidade de antígeno OX40 humana, compreendendo contatar a amostra, e uma amostra de controle, com um anticorpo monoclonal humano, ou uma sua porção ligadora de antígeno, que se liga especificamente a OX40 humana, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou porção do mesmo e OX40 humana. A formação de um complexo é então detectada, em que uma diferença de formação de complexo entre a amostra comparada com a amostra de controle é indicativa da presença de antígeno OX40 humana na amostra. Além disso, os anticorpos anti-OX40 da invenção podem ser usados para purificar a OX40 humana por meio de purificação por imunoafinidade.
Tratamento de Distúrbios Incluindo Cânceres
[0361] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um método de tratamento de um distúrbio em um mamífero, que compreende administrar ao indivíduo (por exemplo, um ser humano) em necessidade de tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou sua porção ligadora de antígeno como aqui descrito. Por exemplo, o distúrbio é um câncer.
[0362] Uma variedade de cânceres onde OX40 está implicado, seja maligno ou benigno e se primário ou secundário, pode ser tratada ou prevenida com um método fornecido pela descrição. Os cânceres podem ser cânceres sólidos ou malignidades hematológicas. Exemplos de tais cânceres incluem cânceres pulmonares tais como carcinoma broncogênico (por exemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma de célula pequena, carcinoma de células grandes, e adenocarcinoma), carcinoma de células alveolares, adenoma brônquica, hamartoma condromatoso (não canceroso), e sarcoma (canceroso); câncer do coração tal como mixoma, fibromas, e rabdomiomas; cânceres ósseos tais como osteocondromas, condromas, condroblastomas, fibromas condromixoide, osteomas osteoides, tumores de células gigantes, condrosarcoma, mieloma múltiplo, osteosarcoma, fibrosarcomas, histiocitoma fibroso maligno , tumor de Ewing (Sarcoma de Ewing), e sarcoma de células de retículo; câncer do cérebro, tais como gliomas (por exemplo, glioblastoma multiforme), astrocitomas anaplástico, astrocitomas, oligodendrogliomas, meduloblastomas, cordoma, Schwanomas, ependimomas, meningiomas, adenoma de pituitária, pinealoma, osteomas,
hemangioblastomas, craniofaringiomas, cordomas, germinomas, teratomas, cistos dermoide, e angiomas; cânceres no sistema digestivo tal como câncer de cólon, leiomioma, carcinoma epidermoide, adenocarcinoma , leiomiossarcoma,
adenocarcinomas do estômago, lipomas intestinais, neurofibromas intestinais, fibromas intestinais, pólipos em intestino grosso, e cânceres colorretais; cânceres de fígado tais como adenomas hepatocelular, hemangioma, carcinoma hepatocelular, carcinoma fibrolamelar, colangiocarcinoma, hepatoblastoma e angiossarcoma; cânceres de rim tais como adenocarcinoma de rim, carcinoma de células renais, hipernefroma, e carcinoma de células transicionais da pelve renal; cânceres de bexiga; cânceres hematológicos tais como leucemia linfocítica aguda (linfoblástica), leucemia mieloide aguda (mielocítica,
mielógena, mieloblasto, mielomonocítica), leucemia linfocítica crônica (por exemplo, síndrome de Sézary e leucemia de célula pilosa), leucemia mielocítica crônica (mieloide,
mielógena, granulocítica), linfoma de Hodgkin, linfoma de não-Hodgkin, linfoma de células B, micose fungoide e distúrbios mieloproliferativos (incluindo distúrbios mieloproliferativos tais como policitemia vera, mielofibrose , trombocitemia e leucemia mielocítica crônica); cânceres de pele tais como carcinoma de células basais, carcinoma de células escamosas, melanoma, sarcoma de Kaposi, e doença de Paget; cânceres de cabeça e pescoço; cânceres relacionados ao olho tais como retinoblastoma e melanocarcinoma intraocular; cânceres de sistema reprodutivo masculino tais como hiperplasia prostática benigna, câncer da próstata, e cânceres testiculares (por exemplo, seminoma, teratoma, carcinoma embrionário, e coriocarcinoma); câncer de mama;
cânceres do sistema reprodutivo feminino tais como câncer uterino (carcinoma endometrial), câncer cervical (carcinoma cervical), câncer dos ovários (carcinoma ovariano), carcinoma vulvar, carcinoma vaginal, câncer do da trompa de falópio, e mole hidatiforme; câncer da tiroide (incluindo câncer papilar, folicular, anaplástico ou medular);
feocromocitomas (glândula adrenal); crescimentos não cancerosos das glândulas paratireoide ; cânceres pancreáticos; e cânceres hematológicos tais como leucemias, mielomas, linfomas não-Hodgkin e linfomas de Hodgkin. Em uma modalidade específica, o câncer é o câncer de cólon.
[0363] Em algumas modalidades, os exemplos de câncer incluem, mas não se limitam a, linfoma de célula B (incluindo linfoma de não-Hodgkin de grau baixo/folicular (NHL); leucemia linfocítica pequena (SL) NHL; NHL grau intermediário/folicular; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástica de alto grau; NHL linfoblástico de alto grau; NHL célula não clivada pequena de grau elevado; NHL doença volumosa; linfoma de célula de Manto; linfoma relacionado a AIDS; e macroglobinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de célula pilosa; leucemia mieloblástica crônica; e distúrbio linfoprolierativo pós-transplante (PTLD), bem como proliferação vascular anormal associada com facomatoses, edema (tal como aquele associado com tumores cerebrais), distúrbios proliferativos de células B e síndrome de Meigs. Exemplos mais específicos incluem, mas não estão limitados a, NHL reincidente ou refratário, NHL de baixo grau de linha frontal, NHL estágio III/IV, NHL resistente à quimioterapia, leucemia linfoblástica de precursor B e/ou linfoma, linfoma linfocítico pequeno, leucemia linfocítica crônica de célula B e/ou leucemia prolinfocítica e/ou linfoma linfocítico pequeno, linfoma prolinfocítico de célula B, imunocitoma e/ou linfoma linfoplasmacítico, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de célula B marginal da zona marginal, linfoma de zona marginal esplênica, linfoma de zona marginal extranodal- MALT, linfoma de zona marginal nodal, leucemia de célula pilosa, plasmocitoma e/ou mieloma de células plasmáticas, linfoma de grau baixo/folicular, NHL de grau intermediário/follicular, linfoma de célula de manto, linfoma de centro de folículo (folicular), NHL difusa de grau intermediário, linfoma de célula B grande difusa, NHL agressivo (incluindo NHL de linhagem frontal agressiva e NHL de recidiva agressiva), NHL após recidiva ou refratário ao transplante de células tronco autólogas, linfoma de célula B mediastinal primário, linfoma de efusão primário, NHL imunoblástica de alto grau, NHL linfoblástico de alto grau, NHL de célula não clivada pequena de grau elevado, NHL de doença volumosa, linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica granular grande (periférica) precursora, micose fungoide e/ou síndrome Sézary, linfoma de pele (cutâneo), linfoma de célula grande anaplástica, linfoma angiocêntrico.
[0364] Em algumas modalidades, os exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a, distúrbios proliferativos de células B, que incluem, mas não estão limitados a, linfomas (por exemplo, linfomas não-Hodgkin (NHL) de célula B) e leucemias linfocíticas. Tais linfomas e leucemias linfocíticas incluem, por exemplo a) linfomas foliculares, b) linfomas de células não-clivadas pequenas/linfoma de Burkitt (incluindo linfoma de Burkitt endêmico, linfoma de Burkitt esporádico e linfoma de não Burkitt), c) linfoma de zona marginal (incluindo linfoma de célula B de zona marginal extranodal (linfomas de tecido linfático associado à mucosa, MALT), linfoma de célula B de zona marginal nodal e linfoma de zona marginal esplênica), d) linfoma de célula de Manto (MCL), e) linfoma de célula grande (incluindo linfoma de célula grande difusa de célula B (DLCL) , linfoma de célula mista difusa, linfoma imunoblástico, linfoma de célula B mediastinal primário, linfoma angiocêntrico - linfoma de célula B Pulmonar), f) leucemia de células cabeludas, g) linfoma linfocítico, macroglobulinemia de Waldenstrom, h) leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL)/linfoma linfocítico pequeno (SLL), leucemia prolinfocítica de célula B, i) neoplasmas de célula plasmática, mieloma de célula plasmática, mieloma múltiplo, e/ou doença de Hodgkin.
[0365] Em algumas outras modalidades, o distúrbio é uma doença autoimune.
Exemplos de doenças autoimunes que podem ser tratadas com o anticorpo ou sua porção ligadora de antígeno incluem encefalomielite autoimune, lúpus eritematoso e artrite reumatoide. O anticorpo ou a sua porção ligadora de antígeno também pode ser usado para tratar ou prevenir doença infecciosa, doença inflamatória (tal como asma alérgica) e doença de enxerto-versus-hospedeiro crônica.
Estimulação de uma Resposta Imune
[0366] Em alguns aspectos, a invenção também fornece um método para melhorar (por exemplo, estimular) uma resposta imunológica em um indivíduo compreendendo administrar um anticorpo ou uma sua porção ligadora de antígeno da invenção ao indivíduo, de modo que uma resposta imunológica no indivíduo é melhorada.
Por exemplo, o indivíduo é um mamífero. Em uma modalidade específica, o indivíduo é um ser humano.
[0367] O termo "potencializar uma resposta imunológica" ou suas variações gramaticais, significa estimular, provocar, ampliar, melhorar ou aumentar qualquer resposta de um sistema imunológico de um mamífero. A resposta imune pode ser uma resposta celular (isto é, mediada por célula, tal como mediada por linfócitos T citotóxico) ou uma resposta humoral (isto é, resposta mediada por anticorpos), e pode ser uma resposta imunológica primária ou secundária. Exemplos de aumento da resposta imune incluem a atividade aumentada de células T CD4+ e a geração de células T citolíticas. O aumento da resposta imune pode ser avaliado utilizando-se um número de medições in vitro ou in vivo conhecidas por aqueles versados na técnica, incluindo, mas não se limitando a, ensaios de linfócitos T citotóxicos, liberação de citocinas (por exemplo, produção de IL -2 ou produção de IFN-γ), regressão de tumores, sobrevivência de animais carregando tumor, produção de anticorpos, proliferação de células imunes, expressão de marcadores de superfície celular e citotoxicidade. Tipicamente, os métodos da invenção aumentam a resposta imune por um mamífero quando comparados com a resposta imune por um mamífero não tratado ou um mamífero não tratado usando os métodos descritos aqui. Em uma modalidade, o anticorpo ou uma porção de ligação antigênica do mesmo é usado para aumentar a resposta imunológica de um ser humano a um patógeno microbiano (tal como um vírus). Em outra modalidade, o anticorpo ou uma porção de ligação antigênica do mesmo é usado para melhorar a resposta imunológica de um ser humano a uma vacina. Em uma modalidade, o método aumenta uma resposta imunológica celular, particularmente uma resposta de células T citotóxicas. Em outra modalidade, a resposta imunológica celular é uma resposta de células T auxiliares. Em ainda outra modalidade, a resposta imune é uma produção de citocinas, particularmente a produção de IFN-γ ou a produção de IL-2. O anticorpo ou sua porção ligadora de antígeno pode ser usado para aumentar a resposta imune de um ser humano a um patógeno microbiano (tal como um vírus) ou a uma vacina.
[0368] O anticorpo ou a sua porção ligadora de antígeno pode ser usado sozinho como uma monoterapia, ou pode ser usado em combinação com terapias químicas ou radioterapias.
Utilização Combinada com Quimioterapias
[0369] O anticorpo ou a sua porção ligadora de antígeno pode ser usado em combinação com um agente anticancerígeno, um agente citotóxico ou agente quimioterapêutico.
[0370] O termo "agente anticancerígeno" ou “agente antiproliferativo" significa qualquer agente que possa ser usado para tratar um distúrbio proliferativo celular tal como câncer, e inclui, mas não está limitado a, agentes citotóxicos, agentes citostáticos, agentes antiangiogênicos, agentes de redução de volume, agentes quimioterapêuticos, radioterapia e agentes radioterapêuticos, agentes anticâncer alvos, BRMs, anticorpos terapêuticos, vacinas de câncer, citocinas, terapias hormonais, terapia de radiação e agentes anti-metastáticos e agentes imunoterapêuticos. Será apreciado que, em modalidades selecionadas como discutido acima, tais agentes anticancerígenos podem compreender conjugados e podem ser associados com os anticorpos sítio-específicos descritos antes da administração. Mais especificamente, em certas modalidades os agentes anticancerígenos selecionados serão ligados às cisteínas não pareadas dos anticorpos construídos para fornecer conjugados construídos como apresentado aqui.
Consequentemente, tais conjugados construídos são expressamente contemplados como estando dentro do escopo da presente invenção. Em outras modalidades, os agentes anticancerígenos descritos serão administrados em combinação com conjugados sítio-específicos compreendendo um agente terapêutico diferente como apresentado acima.
[0371] Como aqui usado, o termo "agente citotóxico" significa uma substância que é tóxica para as células e diminui ou inibe a função das células e/ou causa destruição das células. Em certas modalidades, a substância é uma molécula que ocorre naturalmente derivada de um organismo vivo. Exemplos de agentes citotóxicos incluem, mas não estão limitados a, toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de bactérias (por exemplo toxina diftérica, endotoxina e exotoxina de Pseudomonas, enterotoxina estafilocócica A), fúngica (por exemplo, α-sarcina, restrictocina), plantas (por exemplo, abrina, ricina, modecina, viscumina, proteína antiviral de pokeweed, saporina, gelonina, momoridina, tricosantina, toxina de cevada, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantinas, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitegelina, restrictocina, fenomicina, neomicina , e os tricotecenos) ou animais (por exemplo, RNases citotóxicas, tais como RNases pancreáticas extracelulares; DNase I, incluindo fragmentos e/ou suas variantes).
[0372] Para os propósitos da presente invenção, um “agente quimioterapêutico” compreende um composto químico que diminui ou inibe não especificamente o crescimento, proliferação e/ou sobrevivência de células cancerosas (por exemplo, agentes citotóxicos ou citostáticos). Tais agentes químicos são frequentemente dirigidos a processos intracelulares necessários para o crescimento ou divisão celular, e são assim particularmente eficazes contra células cancerosas, que geralmente crescem e dividem- se rapidamente Por exemplo, a vincristina despolimeriza microtúbulos, e assim inibe as células de entrarem em mitose. Em geral, agentes quimioterapêuticos podem incluir qualquer agente químico que inibe, ou seja projetado para inibir, uma célula cancerosa ou uma célula que provavelmente se torne cancerosa ou gerar progênie tumorigênica (por exemplo, TIC). Tais agentes são frequentemente administrados, e são muitas vezes mais eficazes, em combinação, por exemplo, em regimes tais como CHOP ou FOLFIRI.
[0373] Exemplos de agentes anticâncer que podem ser usados em combinação com as construções sítio-específicas da presente invenção (ou como um componente de um conjugado sítio-específico ou em um estado não conjugado) incluem, mas não estão limitados a, agentes alquilantes, alquil sulfonatos, aziridinas, etileniminas e metilamelaminas, acetogeninas, uma camptotecina, briostatina, calistatina, CC-1065, criptoficinas, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, uma sarcodictina, espongistatina, mostardas de nitrogênio, antibióticos, antibióticos de enediina, dinemicina, bisfosfonatos, esperamicina, cromóforos antibiótico de enediina cromoproteína, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN® doxorrubicina, epirubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina,
quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex,
zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos, erlotinib, vemurafenib, crizotinib, sorafenib, ibrutinib, enzalutamida, análogos de ácido fólico, análogos de purina, andrógenos, anti-
adrenais, reabastecedores de ácido fólico, tais como ácido frolínico, aceglatona,
glicosídeo aldofosfamida, ácido aminolevulínico, eniluracila, amsacrina, bestrabucil, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptínio, uma epotilona, etoglucid, nitrato de gálio, hidroxiureia, lentinan, lonidainina,
maytansinoides, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etilidrazida, procarbazina,
complexo de polissacarídeo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR), razoxano;
rizoxina; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"- triclorotrietilamina; trichotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretan; vindesina; dacarbazina; manomustina; miobronitol; mitolactol;
pipobroman; gacitosina; arabinosídeo (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, cloranbucil; GEMZAR® gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato;
análogos da platina, vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona;
vincristina; NAVELBINE® vinorrelbina; novantrona; teniposida; edatrexato; daunomicina; desaminomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecan (Camptoar, CPT-11),
inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluormetilornitina; retinoides; capecitabina;
combretastatina; leucovorina; oxaliplatina; inibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR e VEGF-A que reduzem a proliferação celular e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima.
Também incluídos nesta definição são agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação hormonal em tumores tais como anti-estrogênios e moduladores seletivos de receptor de estrogênio, inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogênio nas glândulas adrenais, e antiandrogênios; assim como troxaciclina (análogo a1,3-dioxolano nucleosídeo citosina); oligonucleotídeos antessentido, ribozimas tais como um inibidor de expressão de VEGF e um inibidor de expressão HER2 ; vacinas, rIL -2; PROLEUKIN® rIL-2; inibidor de topoisomerase 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; Vinorrelbina e Esperamicinas e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima.
Utilização Combinada com Radioterapias
[0374] A presente invenção também proporciona a combinação do anticorpo ou da sua porção de ligação ao antígeno com radioterapia (isto é, qualquer mecanismo para induzir danos ao DNA localmente dentro de células tumorais tais como irradiação gama, raios X, irradiação UV, microondas, emissões eletrônicas e semelhantes). A terapia combinada utilizando a administração direcionada de radioisótopos para células tumorais é também contemplada, e os conjugados descritos podem ser usados em conexão com um agente anticancerígeno alvo ou outros meios de direcionamento. Tipicamente, a terapia por radiação é administrada em pulsos durante um período de tempo de cerca de 1 a cerca de 2 semanas. A terapia de radiação pode ser administrada a indivíduos com câncer de cabeça e pescoço durante cerca de 6 a 7 semanas. Opcionalmente, a terapia de radiação pode ser administrada como uma única dose ou como múltiplas doses sequenciais.
Diagnóstico
[0375] A invenção proporciona métodos in vitro e in vivo para detectar, diagnosticar ou monitorar distúrbios proliferativos e métodos de triagem de células de um paciente para identificar células tumorais incluindo células tumorigênicas. Tais métodos incluem a identificação de um indivíduo com câncer para o tratamento ou a monitorização da progressão de um câncer , compreendendo contatar o paciente ou uma amostra obtida de um paciente (in vivo ou in vitro) com um anticorpo como descrito aqui e detectando a presença ou ausência, ou nível de associação, do anticorpo para ligar ou liberar moléculas alvo na amostra. Em algumas modalidades, o anticorpo compreenderá um rótulo detectável ou molécula repórter como descrito aqui.
[0376] Em algumas modalidades, a associação do anticorpo com células particulares na amostra pode denotar que a amostra pode conter células tumorigênicas, indicando assim que o indivíduo tendo câncer pode ser eficazmente tratado com um anticorpo como descrito aqui.
[0377] Amostras podem ser analisadas por numerosos ensaios, por exemplo, radioimunoensaios, imunoensaios de enzima (por exemplo, ELISA), ensaios de ligação competitiva, imunoensaios fluorescentes, ensaios de imunoblot, análise de Western Blot e ensaios de citometria de fluxo. Os ensaios de diagnóstico ou teragnóstico in vivo compatíveis podem compreender técnicas de imageamento ou monitoramento reconhecidas na arte, por exemplo, formação de imagem por ressonância magnética, tomografia computadorizada (por exemplo, varredura CAT), tomografia de positron (por exemplo , varredura de PET), radiografia, ultrassom etc, como seria conhecido por aqueles versados na técnica. Embalagens e Kits Farmacêuticos
[0378] Embalagens e kits farmacêuticos compreendendo um ou mais recipientes, compreendendo uma ou mais doses do anticorpo ou sua porção ligadora de antígeno também são fornecidos. Em certas modalidades, é fornecida uma dosagem unitária em que a dosagem unitária contém uma quantidade pré-determinada de uma composição que compreende, por exemplo, o anticorpo ou a sua porção de ligação ao antígeno, com ou sem um ou mais agentes adicionais. Para outras modalidades, tal dosagem unitária é fornecida em seringa preenchida de utilização única para injeção. Em ainda outras modalidades, a composição contida na dosagem unitária pode compreender solução salina, sacarose ou semelhantes; um tampão, tal como fosfato, ou semelhante; e/ou ser formulada dentro de uma faixa de pH estável e eficaz. Alternativamente, em certas modalidades, a composição conjugada pode ser fornecida como um pó liofilizado que pode ser reconstituído mediante a adição de um líquido apropriado, por exemplo, água estéril ou solução salina. Em certas modalidades preferidas, a composição compreende uma ou mais substâncias que inibem a agregação de proteínas, incluindo, mas não se limitando a, sacarose e arginina. Qualquer etiqueta sobre, ou associada a, ao(s) recipiente(s) indica que a composição de conjugado encerrada é usada para o tratamento da condição de doença neoplásica de escolha.
[0379] A presente invenção também proporciona kits para a produção de unidades de administração de dose única ou multidose de conjugados sítio-específicos e, opcionalmente, um ou mais agentes anticancerígenos. O kit compreende um recipiente e um rótulo ou inserção de embalagem em ou associado com o recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas etc Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico e contêm uma quantidade farmaceuticamente eficaz dos conjugados descritos em forma conjugada ou não-conjugada. Em outras modalidades preferidas, o(s) recipiente(s) compreende(m) um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa ou um frasco de solução intravenosa dotado de uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Tais kits geralmente conterão em um recipiente adequado uma formulação farmaceuticamente aceitável do conjugado construído e, opcionalmente, um ou mais agentes anticancerígenos nos mesmos ou diferentes recipientes. Os kits também podem conter outras formulações farmaceuticamente aceitáveis, seja para diagnóstico ou terapia combinada. Por exemplo, além do anticorpo ou da sua porção ligadora de antígeno da invenção, tais kits podem conter qualquer uma ou mais dentre uma faixa de agentes anticâncer tais como fármacos quimioterapêuticos ou radioterapêuticos; agentes antiangiogênicos; agentes anti-metastáticos; agentes anticâncer alvos; agentes citotóxicos; e/ou outros agentes anticancerígenos.
[0380] Mais especificamente, os kits podem ter um único recipiente que contém o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno, com ou sem componentes adicionais, ou eles podem ter recipientes distintos para cada agente desejado. Onde são providos terapêuticos combinados para conjugação, uma única solução pode ser pré-misturada, ou em combinação molar equivalente, ou com um componente em excesso do outro.
Alternativamente, os conjugados e qualquer agente anticancerígeno opcional do kit podem ser mantidos separadamente dentro de recipientes distintos antes da administração a um paciente. Os kits também podem compreender um segundo/terceiro meios de recipiente para conter um tampão estéril, farmaceuticamente aceitável ou outro diluente tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato (PBS), solução de Ringer e solução de dextrose.
[0381] Quando os componentes do kit são providos em uma ou mais soluções líquidas, a solução líquida é, de preferência, uma solução aquosa, sendo particularmente preferida uma solução aquosa ou salina estéril. Entretanto, os componentes do kit podem ser fornecidos como pó(s) seco(s). Quando reagentes ou componentes são fornecidos como um pó seco, o pó pode ser reconstituído pela adição de um solvente adequado. Prevê-se que o solvente pode também ser provido em um outro recipiente.
[0382] Como indicado brevemente acima, os kits também podem conter um meio pelo qual administrar o anticorpo ou a sua porção ligadora de antígeno e quaisquer componentes opcionais a um paciente, por exemplo, uma ou mais agulhas, bolsas I.V.
ou seringas, ou mesmo um conta-gotas, pipeta, ou outro aparelho similar, do qual a formulação pode ser injetada ou introduzida no animal ou aplicada a uma área doente do corpo. Os kits da presente invenção também incluem, tipicamente, um meio para conter os frascos, ou semelhantes, e outros componentes em confinamento estreito para venda comercial, tais como, por exemplo, injeção ou recipientes de plástico moldados por sopro, nos quais os frascos desejados e outros aparelhos são colocados e retidos. Resumo de Listagem de Sequências
[0383] Anexado ao presente pedido está uma listagem de sequências que compreende um número de sequências de ácido nucleico e de aminoácidos. As seguintes Tabelas A, B e C proporcionam um resumo das sequências incluídas.
[0384] Seis anticorpos ilustrativos, conforme aqui descrito, que são anticorpos monoclonais anti-X40 totalmente humanos, são designados como: “1.62.3-u1-IgG1K”, “1.62.3-u1-3-IgG1K”, “1.7.10-u1-IgG1K”, “1.134.9-u1-IgG1L”, “1.186.19-u1-IgG1K” e “1.214.23-u1-IgG1K”, respectivamente.
Tabela A Sequências de Aminoácidos CDR Anticorpo CDR1 CDR2 CDR3 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 5
CDRH YISGSGNTIYYAD ERGAAGTGWF
1.7.10-u1- GFTFSDYYMS
SVKG DP IgG1K SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 6
CDRL
RASQGISSWLA AASSLQG QQVNSFPWT SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 11
CDRH YIYYSGSTYYNPS GGSISNGGYYWS DEWELRGFDY
1.62.3-u1- LKS IgG1K SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 12
CDRL KSSQSVVFSSNN WSSTRES QQYYSSPWT
KICLA CDRH SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 11
YIYYSGSTYYNPS GGSISNAGYYWS DEWELRGFDY LKS
1.62.3-u1-3- SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 12 IgG1K
CDRL KSSQSVVFSSNN WSSTRES QQYYSSPWT
KISLA SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 19
CDRH EIYHGGNTNYNPS APGDWGGSPY GGSISSYNWWS
1.134.9-u1- LKS FDF IgG1L SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 20
CDRL NSRDSSGNPV QGDNLRTYYAS GRNKRPS
V SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 25
CDRH YISGSGNTIYYAD ERGAAGAGWF
1.186.19-u1- GFTFSDYYMG
SVKG DP IgG1K SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 26
CDRL
RASQGISSWLA AASSLQG QQVNSFPWT SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 31
CDRH EIFHSGNTNYNPS
1.214.23-u1- GGSISNRNWWS SFAVALDS
LKS IgG1K SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 32
CDRL
RASQDINSYLA AASSLQS QQLFSYPIT Tabela B Sequências de Aminoácidos da Região Variável Anticorpo VH VL SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 34
QVHLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCR
1.7.10-u1- GFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVS ASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLI IgG1K YISGSGNTIYYADSVKGRFTISRDNA YAASSLQGGVPSRFSGSGSGTDF
KNSLYLQMNSLRADDTAVYFCARER TLTISSLQPEDFATYYCQQVNSFP
GAAGTGWFDPWGQGTLVTVSS WTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36
1.62.3-u1- QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVS DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKS IgG1K GGSISNGGYYWSWIRQHPGKGLEW SQSVVFSSNNKICLAWYQQKPGQ
IGYIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTS PPKLLIYWSSTRESGVPDRFSGSG KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDE SGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ
WELRGFDYWGQGTLVTVSS YYSSPWTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 38
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVS DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKS
1.62.3-u1- GGSISNAGYYWSWIRQHPGKGLEWI SQSVVFSSNNKISLAWYQQKPGQP 3-IgG1K GYIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTS PKLLIYWSSTRESGVPDRFSGSGS
KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDE GTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQY
WELRGFDYWGQGTLVTVSS YSSPWTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 40
QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVS SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQG
1.134.9- GGSISSYNWWSWVRQPPGKGLEWI DNLRTYYASWYQQKPGQAPILLIY u1-IgG1L GEIYHGGNTNYNPSLKSRVTMSVDN GRNKRPSGIPDRFSGSSSGNTASL
SKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARA TITGAQAEDEAAYYCNSRDSSGNP
PGDWGGSPYFDFWGQGTLVTVSS VVFGGGTKLTVL SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 42
QVHLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCR
1.186.19- GFTFSDYYMGWIRQAPGQGLEWVS ASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLI u1-IgG1K YISGSGNTIYYADSVKGRFTISRDNA YAASSLQGGVPSRFSGSGSGTDF
KNSLYLQMNSLRADDTAVYFCAKER TLTISSLQPEDFATYHCQQVNSFP
GAAGAGWFDPWGQGTLVTVSS WTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44
QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCVVS DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRA
1.214.23- GGSISNRNWWSWVRQPPGKGLEWI SQDINSYLAWCQQKPGKAPKLLIY u1-IgG1K GEIFHSGNTNYNPSLKSRVTISVDKS AASSLQSGVPSRFSGTGSGTEFTL
KNQFSLKVNSVTAADTAVYYCAKSF TISSLQPEDFATYYCQQLFSYPITF
AVALDSWGQGTLVTVSS GQGTRLEIK Tabela C Sequências Nucleotídicas da Região Variável VHnu (sequências de nucleotídeos VLnu (sequências de Anticorpo da região variável de cadeia nucleotídeos da região variável de pesada) cadeia leve) SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 46
CAG GTG CAC CTG GTG GAG TCT GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC AAG CCT CCA TCT TCC GTG TCT GCA TCT
1.7.10-u1-
GGA GGG TCC CTG AGA CTC TCC GTA GGA GAC AGA GTC ACC IgG1K
TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC ATC ACT TGT CGG GCG AGT TTC AGT GAC TAC TAC ATG AGC CAG GGT ATT AGC AGC TGG TTA TGG ATC CGC CAG GCT CCA GGG GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA AAG GGG CTG GAG TGG GTT TCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC TAC ATT AGT GGT AGT GGT AAC CTG ATC TAT GCT GCA TCC AGT ACC ATT TAC TAC GCA GAC TCT TTG CAA GGT GGG GTC CCA GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCA AGG TTC AGC GGC AGT TCC AGG GAC AAC GCC AAG AAC GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT TCA CTG TAT CTG CAA ATG AAC CTC ACC ATC AGC AGC CTG AGC CTG AGA GCC GAC GAC ACG CAG CCT GAA GAT TTT GCA ACT GCC GTA TAT TTC TGT GCG AGA TAC TAT TGT CAA CAG GTT AAC GAG AGA GGA GCA GCT GGT ACA AGT TTC CCG TGG ACG TTC GGG TGG TTC GAC CCC TGG GGC GGC CAA GGG ACC AAG GTG CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC GAA ATC AAA
TCC TCA SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 48
CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GAC ATC GTG ATG ACC CAG TCT GGC CCA GGA CTG GTG AAG CCT CCA GAC TCC CTG GCT GTG TCT TCA CAG ACC CTG TCC CTC ACC CTG GGC GAG AGG GCC ACC TGC ACT GTC TCT GGT GGC TCC ATC AAC TGC AAG TCC AGC CAG ATC AGT AAT GGT GGT TAC TAC AGT GTT GTA TTC AGC TCC AAC TGG AGC TGG ATC CGC CAG CAC AAT AAG ATC TGC TTA GCT TGG CCA GGG AAG GGC CTG GAG TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGA
1.62.3-u1- ATT GGG TAC ATC TAT TAC AGT CAG CCT CCT AAG CTG CTC ATT IgG1K GGG AGC ACC TAC TAC AAC CCG TAC TGG TCA TCT ACC CGG GAA
TCC CTC AAG AGT CGA GTT ACC TCC GGG GTC CCT GAC CGA ATA TCA GTA GAC ACG TCT AAG TTC AGT GGC AGC GGG TCT AAC CAG TTC TCC CTG AAA CTG GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC AGC TCT GTG ACT GCC GCG GAC ATC AGC AGC CTG CAG GCT ACG GCC GTG TAT TAC TGT GCG GAA GAT GTG GCA GTT TAT TAC AGA GAT GAG TGG GAG CTA CGG TGT CAG CAA TAT TAT AGT TCT GGG TTT GAC TAC TGG GGC CAG CCG TGG ACG TTC GGC CAA GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC GGG ACC AAG GTG GAA ATC
TCA AAA SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 50
CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GAC ATC GTG ATG ACC CAG TCT GGC CCA GGA CTG GTG AAG CCT CCA GAC TCC CTG GCT GTG TCT TCA CAG ACC CTG TCC CTC ACC CTG GGC GAG AGG GCC ACC TGC ACT GTC TCT GGT GGC TCC ATC AAC TGC AAG TCC AGC CAG ATC AGT AAT GCC GGT TAC TAC AGT GTT GTA TTC AGC TCC AAC TGG AGC TGG ATC CGC CAG CAC AAT AAG ATC AGC TTA GCT TGG CCA GGG AAG GGC CTG GAG TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGA ATT GGG TAC ATC TAT TAC AGT CAG CCT CCT AAG CTG CTC ATT
1.62.3-u1-
GGG AGC ACC TAC TAC AAC CCG TAC TGG TCA TCT ACC CGG GAA 3-IgG1K
TCC CTC AAG AGT CGA GTT ACC TCC GGG GTC CCT GAC CGA ATA TCA GTA GAC ACG TCT AAG TTC AGT GGC AGC GGG TCT AAC CAG TTC TCC CTG AAA CTG GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC AGC TCT GTG ACT GCC GCG GAC ATC AGC AGC CTG CAG GCT ACG GCC GTG TAT TAC TGT GCG GAA GAT GTG GCA GTT TAT TAC AGA GAT GAG TGG GAG CTA CGG TGT CAG CAA TAT TAT AGT TCT GGG TTT GAC TAC TGG GGC CAG CCG TGG ACG TTC GGC CAA GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC GGG ACC AAG GTG GAA ATC
TCA AAA SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 52
CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GGT TCT GTG GTT TCT TCT GAA GGC CCA GGA CTG GTG AAG CCT CTG ACT CAG GAC CCT GCT TCG GGG ACC CTG TCC CTC ACC GTG TCT GTG GCC TTG GGA TGC GCT GTC TCT GGT GGC TCC CAG ACA GTC AGG ATC ACA TGC ATC AGT AGT TAT AAC TGG TGG CAG GGA GAC AAC CTC AGA AGT TGG GTC CGC CAG CCC CCA ACC TAT TAT GCA AGC TGG TAC GGG AAG GGA CTG GAG TGG ATT CAG CAG AAG CCA GGA CAG
1.134.9- GGG GAA ATC TAT CAT GGT GGG GCC CCT ATA CTT CTC ATC TAT u1-IgG1L AAC ACC AAC TAC AAC CCG TCC GGT AGA AAC AAG CGG CCC
CTC AAG AGT CGA GTC ACC ATG TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCA GTA GAC AAC TCC AAG AAC TCT GGC TCC AGC TCG GGA CAG TTC TCC CTG AAG CTG AGC AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC TCT GTG ACC GCC GCG GAC ACG ACT GGG GCT CAG GCG GAA GCC GTA TAT TAC TGT GCG AGA GAT GAG GCT GCG TAC TAC TGT GCC CCC GGG GAC TGG GGA GGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT TCC CCC TAT TTT GAC TTC TGG GGT AAT CCT GTG GTA TTC GGC GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GGA GGG ACC AAG CTG ACC
GTC TCC TCA GTC CTA SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 54
CAG GTG CAC CTG GTG GAG TCT GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC AAG CCT CCA TCT TCC GTG TCT GCA TCT GGA GGG TCC CTG AGA CTC TCC GTA GGA GAC AGA GTC ACC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC ATC ACT TGT CGG GCG AGT TTC AGT GAC TAC TAC ATG GGC CAG GGT ATT AGC AGC TGG TTA TGG ATC CGC CAG GCT CCA GGG GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA CAG GGG CTG GAG TGG GTT TCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC
1.186.19- TAC ATT AGT GGT AGT GGT AAC
CTG ATC TAT GCT GCA TCC AGT u1-IgG1K ACC ATT TAC TAC GCA GAC TCT
TTG CAA GGT GGG GTC CCA GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCA AGG TTC AGC GGC AGT TCC AGG GAC AAC GCC AAG AAC GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT TCA CTG TAT CTG CAA ATG AAC CTC ACC ATC AGC AGC CTG AGC CTG AGA GCC GAC GAC ACG CAG CCT GAA GAT TTT GCA ACT GCC GTT TAT TTC TGT GCG AAA TAC CAT TGT CAA CAG GTT AAC GAG AGA GGA GCA GCT GGT GCA AGT TTC CCG TGG ACG TTC GGG TGG TTC GAC CCC TGG GGC GGC CAA GGG ACC AAG GTG CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC GAA ATC AAA
TCC TCA SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 56
CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GAC ATC CAG TTG ACC CAG TCT GGC CCA GGA CTG GTG AAG CCT CCA TCC TTC CTG TCT GCA TCT TCG GGG ACC CTG TCC CTC ACC GTA GGA GAC AGA GTC ACC TGT GTT GTC TCC GGT GGC TCC ATC ACT TGC CGG GCC AGT ATC AGC AAT AGA AAC TGG TGG CAG GAC ATT AAC AGT TAT TTA AGT TGG GTC CGC CAG CCC CCA GCC TGG TGT CAG CAA AAA CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG ATT GGG AAA GCC CCT AAG CTC
1.214.23- GGG GAA ATC TTT CAT AGT GGG CTG ATC TAT GCT GCA TCC TCT u1-IgG1K AAC ACC AAC TAC AAC CCG TCC TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA
CTC AAG AGT CGC GTC ACC ATA AGG TTC AGC GGC ACT GGA TCA GTA GAC AAG TCC AAG AAC TCT GGG ACA GAG TTC ACT CTC CAG TTC TCC CTG AAG GTG AAC ACA ATC AGC AGC CTG CAG CCT TCT GTG ACC GCC GCG GAC ACG GAA GAT TTT GCA ACT TAT TAC GCC GTG TAT TAC TGT GCG AAA TGT CAA CAG CTT TTT AGT TAC TCC TTT GCA GTG GCC CTT GAC CCG ATC ACC TTC GGC CAA TCC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GGG ACA CGA CTG GAG ATT
GTC ACC GTC TCC TCA AAA Exemplos
[0385] A presente invenção, assim geralmente descrita, será entendida mais prontamente com referência aos seguintes Exemplos, que são fornecidos a título de ilustração e não se destinam a limitar a presente invenção. Os Exemplos não se destinam a representar que as experiências abaixo são todas ou as únicas experiências realizadas.
Exemplo 1 Preparação de Materiais
1.1 Geração de Imunógeno
[0386] cDNA que codifica o domínio extracelular (ECD) da proteína OX40 (GenBank ref CAB96543.1) foi sintetizado por Sangon Biotech e inserido em um vetor de expressão modificado pcDNA3.3 (ThermoFisher). Max-prep o plasmídeo de DNAs e as sequências de DNA inseridas foram verificadas por sequenciamento. Proteínas de fusão OX40 ECD conjugadas com Fc humano ou His foram obtidas por transfecção de gene OX40 ECD humano em células Freestyle 293F (ThermoFisher) ou Expi-293F (ThermoFisher). Após 5 dias, os sobrenadantes foram coletados das culturas de células transfectadas transientes. As proteínas de fusão foram purificadas e quantificadas para o uso de imunização e triagem.
1.2 Produção de Anticorpos de Referência
[0387] Quatro anticorpos de referência, a saber, BMK1, BMK5, BMK7 e BMK10, são aplicados como controles positivos nos exemplos. BMK1 foi sintetizado de acordo com o clone de 11D4 da Patente Norte-Americana No. US8236930B2 (Pfizer). BMK5 foi sintetizado de acordo com o clone de 106-22 do Pedido de Patente Norte-Americano N° US20140308276 (University of Texas System). BMK7 foi sintetizado de acordo com o clone de OX40mAb24 da Publicação PCT N° WO2016057667 (MedImmune). BMK10 foi sintetizado de acordo com o clone de 1A7.gr1 da Publicação PCT N° WO2015153513 (Genentech).
1.3 Estabelecimento de Linhagens de Células Estáveis
[0388] A fim de obter ferramentas para triagem e validação de anticorpos, gerou- se linhagens de células transfectantes OX40. Resumidamente, células CHO-K1 ou 293F foram transfectadas com o vetor de expressão modificado pcDNA3.3 contendo OX40 de comprimento completo usando Lipofectamina 2000 ou Kit de Transfecção PlasFect de acordo com o protocolo do fabricante. Em 48-72 horas após a transfecção, as células transfectadas foram cultivadas em meio contendo Blasticidina para seleção. Ao longo do tempo, isto selecionará as células que têm o plasmídeo de expressão estavelmente incorporado em seus DNAs genômicos. Enquanto isso, as células foram verificadas quanto à expressão de OX40. Uma vez a expressão verificada, clones únicos de interesse foram coletados por diluição limitante e escalonados até grandes volumes. As linhagens de células monoclonais estabelecidas foram então mantidas em meio contendo Blasticidina.
Exemplo 2
Geração de Hibridoma de Anticorpos
2.1 Imunização e Fusão Celular
[0389] Anticorpos monoclonais completamente humanos contra OX40 foram preparados utilizando ratos OMT, que compreendem polinucleotídeos quiméricos úteis para a produção ótima de imunoglobulinas funcionais com idiotipos humanos. A cepa de rato transporta o transgene de cadeia pesada e leve humano conforme descrito na Publicação PCT WO 2014/093908. Para gerar anticorpos monoclonais completamente humanos contra OX40, ratos OMT, 6-8 semanas de idade, foram imunizados com 20 μg de proteína OX40 ECD humana em fosfato de alumínio (Alume-Phos) na pata e 20 μg de proteína OX40 ECD humana em TiterMax subcutaneamente para primeiro reforço, e a imunização foi repetida a cada duas semanas com proteína OX40 ECD humana em Alum-Phos e TiterMax. Os títulos de anticorpos séricos foram medidos por ensaio imunoadsorvente ligado a enzima (ELISA) a cada uma ou duas semanas. Quando o título de anticorpo sérico foi suficientemente alto, os ratos receberam um reforço final com 40 μg de proteína OX40 ECD humana em DPBS sem adjuvante. A fusão das células foi realizada como se segue: preparação das células de mieloma SP2/0, as células de mieloma foram descongeladas na semana anterior à fusão, e foram divididas 1: 2 cada dia até o dia antes da fusão para manter as células em fase de crescimento logarítmico.
Linfócitos B isolados do linfonodo de ratos OMT imunizados foram combinados com células de mieloma (razão de 1: 1.1). A mistura celular foi lavada e ressuspensa em solução de ECF a 2 x 106 células/mL. As células estão prontas para ECF. Após a fusão de células eletrônicas, a suspensão celular da câmara de fusão foi imediatamente transferida para um tubo estéril contendo mais meio, e incubada por pelo menos 24 horas em uma incubadora a 37o C. A suspensão de células foi misturada e transferida para placas de 96 poços (1 x 104 células/poço). As placas de 96 poços foram cultivadas a 37o
C, 5% de CO2, e foram monitoradas periodicamente. Quando os clones foram grandes o bastante, 100 uL de sobrenadante foram transferidos das placas de cultura de tecido para placas de ensaio de 96 poços para triagem de anticorpos.
2.2 Triagem de Alto Rendimento de Sobrenadantes de Hibridoma
[0390] ELISA foi usado como primeiro método de triagem para testar a ligação de sobrenadantes de hibridoma à proteína OX40 humana e macaco. Em resumo, as placas (Nunc) foram revestidas com proteína solúvel de OX40 ECD humana ou de macaco rhesus em 1 ug/mL por uma noite a 4o C. Após o bloqueio e a lavagem, os sobrenadantes de hibridoma foram transferidos para as placas revestidas e incubados à temperatura ambiente por 2 horas. As placas foram então lavadas e subsequentemente incubadas com anticorpo secundário, IgG anti-rato de cabra HRP (Bethyl) por 1 hora. Após a lavagem, o substrato TMB foi adicionado e a interação foi interrompida por HCl 2M. A absorbância a 450 nm foi lida usando um leitor de microplaca (Molecular Device).
[0391] A fim de confirmar a ligação nativa de anticorpos anti-OX40 em moléculas de OX40 conformacionais expressas em membrana celular, análise de citometria de fluxo (FACS) foi realizada em linhagens de células transfectadas com OX40. Células 293F que expressam OX40 humanas foram transferidas em placas de fundo em U de 96 poços (Corning) a uma densidade de 1x105 células/poço. Os sobrenadantes de hibridoma foram então carregados nas células e incubados durante 1 h a 4o C. Após a lavagem com 1 x PBS/BSA 1%, o anticorpo secundário de cabra anti-rato Alexa647 (Jackson ImmunoResearch Lab) foi aplicado e incubado com células a 4o C no escuro por meia hora. As células foram então lavadas e ressuspensas em 1 x PBS/BSA 1% ou fixadas com paraformaldeído a 4%, e analisadas por citometria de fluxo (BD). Ligação de anticorpo à linhagem celular 293F parental foi usada como controle negativo. Teste da bioatividade de anticorpos usando células T repórter Jurkat NFkB -luciferase foi usada como segundo método de triagem. Resumidamente, foi construída uma célula repórter Jurkat NFkB-luciferase superexpressando proteína de fusão OX40/CD40 humana como descrito acima. As células foram cultivadas em meio de RPMI1640 completo contendo FBS 10% e 0,5 mg/mL de Higromicina B como seleção. Células repórter OX40 Jurkat foram coletadas e adicionadas a uma placa de 96 poços a 4x104 células/poço. Anticorpos de ligação cruzada F(ab')2 IgG anti-rato de cabra (JacksonImmunoResearch Lab) e RPMI 1640 com meio completo de sobrenadantes de hibridoma diluídos foram adicionados às células, e em seguida as células foram incubadas a 37° C, CO2 5% durante a noite. O segundo dia, o substrato de luciferase reconstituída (Promega) foi adicionado a cada poço (50 μL/poço) e bem misturado. A intensidade de luciferase foi lida utilizando-se um leitor de microplaca (Molecular Device).
2.3 Subclonagem de Hibridoma:
[0392] Uma vez que a ligação específica e a bioatividade foram verificadas através da primeira e da triagem de confirmação, as linhagens de células de hibridoma positivas foram usadas para a subclonagem. Resumidamente, para cada linhagem de células de hibridoma, as células foram contadas e diluídas para dar 1 célula por 200 μL de meio de clonagem. A suspensão de células foi plaqueada 200 μL/poço em duas placas de 96 poços. As placas foram cultivadas a 37o C, CO2 5%, até que elas estejam prontas para serem verificadas por ensaio ELISA. O sobrenadante exausto (ESN) de clones únicos selecionados foi coletado, e os anticorpos foram purificados para caracterização adicional.
Exemplo 3 Construção e purificação de moléculas de anticorpos completamente humanos
3.1 sequenciamento de Hibridoma
[0393] Os RNAs foram isolados de células de hibridoma monoclonal utilizando Mini Kit RNeasy Plus (Qiagen) com reagente Trizol. A região variável de cadeia pesada (VH) e a região variável de cadeia pesada (VL) dos anticorpos quiméricos OX40 foram amplificadas como segue. Em resumo, o RNA é primeiramente transcrito reversamente em cDNA utilizando-se uma transcriptase reversa conforme aqui descrito. Tabela 1. Reação de Amplificação de cDNA (20 μL) Componente Quantidade Até 5 μg RNA total 5 μL Iniciador (50 μM oligo(dT)20/50 ng/μL 1 μL/1μL hexâmetros aleatórios) Tampão de Anelamento 1 μL Água livre de RNase/DNase to 8 μL 65°C por 5min, então colocado imediatamente no gelo por pelo menos 1 minuto 2× Mistura de Reação da Primeira-Fita 10 μL Mistura Enzimática SuperScript™ 2 μL III/RNaseOUT™ Tabela 2. Condição de Reação de Amplificação de cDNA Passo Passo Passo Passo 2 1 3 4 Temperatura 25 50 85 4 Tempo 10 min 50 min 5 min ∞
[0394] O cDNA resultante foi usado como padrão para amplificação PCR subsequente usando iniciadores específicos para genes de interesse. A reação PCR foi feita como segue.
Tabela 3. Sistema de Reação PCR (50 μL) Componente Quantidade cDNA 2,0 μL Premix Ex Taq 25 μL conjuntos 5’- iniciadores degenerados (10 2,5 μL pM) 3’- região constante iniciador degenerado 1,0 μL (10 pM) ddH2O 19,5 μL Tabela 4. Condição de Reação PCR Passo 1 Passo 2 Passo 3 Passo 4 Passo 5 Temperatura 95 94 58 72 72 (oC) Tempo 4 min 45 seg 45 seg 1 min 10 min Ciclos NA 30 NA NA
[0395] O produto de PCR (10 μL) foi inserido no vetor pMD18-T; e 10 μL do produto de ligação foram transformados nas células Top 10 competentes. As células transformadas foram plaqueadas em placas de 2-YT+Cab e incubadas durante a noite.
Clones positivos foram verificados por PCR usando iniciadores M13-48 e M13-47 seguido por sequenciamento.
[0396] Os clones de hibridoma 1.7.10, 1.62.3, 1.134.9, 1.186.19 e 1.214.23 foram selecionados para otimização de sequência e avaliação adicional.
3.2 Otimização da Sequência de Anticorpos
[0397] A otimização da sequência de anticorpos foi realizada introduzindo-se modificação apropriada no sítio específico na sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo. As mutações de remoção de sítio de PTM (modificação pós-traducional) foram introduzidas por mutagênese direcionada ao sítio utilizando o kit de Mutagênese QuickChange de acordo com o protocolo do fabricante.
[0398] O aminoácido NGG em CDR1 da cadeia pesada 1.62.3 do clone de hibridoma foi identificado como um sítio de desamidação, de modo que nucleotídeos mutagênicos antessentido foram projetados para introduzir mutações seguintes na cadeia pesada “1.62.3-u1-IgG1K”: N a Q (NGG-QGG), N a S (NGG-SGG) ou G a A (NGG- NAG). O aminoácido C em CDR1 da cadeia leve de clone 1.62.3 foi identificado como resíduo de cisteína, de modo que serina foi substituída por cisteína (C a S). Todas as mutações foram verificadas por sequenciamento.
[0399] A comparação entre as variantes após a mutação PTM é mostrada na Figura 1. As variantes são nomeadas como anticorpos “1.62.3-u1-1-IgG1K”, “1.62.3-u1- 2-IgG1K”, e “1.62.3-u1-2-IgG1K”, respectivamente. Anticorpo “1.62.3-u1-1-IgG1K”, contém a mutação N a Q, “1.62.3-u1-2-IgG1K” contém a mutação N a S, e “1.62.3-u1-3- IgG1K” contém a mutação G a A.
3.3 Construção e purificação de molécula de anticorpo completamente humano
[0400] Os anticorpos de hibridoma VH e VL de OX40 foram amplificados como descrito acima. Genes sintéticos foram clonados novamente no vetor de expressão de IgG1 humano modificado pcDNA3.4 (ThermoFisher) para expressar anticorpos completamente humanos. Células Expi-293 F foram transfectadas transitoriamente com o vetor para expressão de anticorpos. O sobrenadante da cultura contendo anticorpos foi coletado e purificado utilizando cromatografia de Proteína A.
[0401] Os anticorpos monoclonais completamente humanos 1.7.10-u1-IgG1K,
1.62.3-u1-IgG1K (Sequência clone otimizada nomeada como “1.62.3-u1-3-IgG1K”),
1.134.9-u1-IgG1L, 1.186.19-u1-IgG1K e 1.214.23-u1-IgG1K foram obtidos a partir dos clones de hibridoma 1.7.10, 1.62.3, 1.134.9, 1.186.19 e 1.214.23 hibridomas, respectivamente. As suas sequências estão resumidas na Tabela A, B e C.
Exemplo 4
Caracterização de Anticorpos
4.1 Teste de afinidade de ligação cinética total por ressonância de plasmon de superfície (SPR)
[0402] Anticorpos foram caracterizados por afinidade e cinética de ligação a OX40 por ensaio SPR usando Biacore T200 (GE). Anticorpo IgG anti-humano foi pré- imobilizado em um chip sensor (CM5), e anticorpos anti-OX40 em tampão de corrida (1xHBS-EP+, GE) foram capturados quando injetados no chip. Então, várias concentrações de OX40 humana ou de macaco e tampão de corrida foram escoadas através do chip sensor a uma taxa de fluxo de 30 μL/min para uma fase de associação de 180 s, seguida por dissociação. A curva de associação e dissociação foi ajustada por um modelo de ligação de Langmuir 1:1 utilizando o software BIAevaluation T200.
[0403] Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 5 abaixo.
Tabela 5. Afinidade de ligação cinética total para OX40 humana por SPR Abs ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
1.7.10-u1-IgG1K 8,60×105 1,28×10-3 1,49×10-9
1.62.3-u1-IgG1K 5,26×105 2,43×10-4 4,61×10-10
1.62.3-u1-3-IgG1K 6,97×105 1,45×10-3 2,08×10-9
1.134.9-u1-IgG1L 2,07×105 3,70×10-5 1,79×10-10
1.186.19-u1-IgG1K 3,90×105 4,51×10-4 1,16×10-9
1.214.23-u1-IgG1K 4,26×105 2,14×10-4 5,02×10-10 BMK7 2,44×105 1,54×10-3 6,30×10-9 BMK10 4,42×105 2,25×10-5 5,10×10-10
[0404] Como mostrado na Tabela 5, os anticorpos ilustrativos da invenção, incluindo 1.7.10-u1-IgG1K, 1.62.3-u1-IgG1K, 1.62.3-u1-3-IgG1K, 1.134.9-u1-IgG1L,
1.186.19-u1-IgG1K e 1.214.23-u1-IgG1K se ligam a OX40 humana com alta especificidade, com um KD de 1,79×10-10 M a 2,08×10-9 M.
4.2 Análise de afinidade de ligação por citometria de fluxo
[0405] Células CHO-K1 que expressam OX40 humanas foram transferidas em placas de fundo em U de 96 poços (Corning) a uma densidade de 5×104 células/mL. Os anticorpos de teste foram diluídos 1: 2 em série em tampão de lavagem (1 x PBS/1% BSA) e incubados com células a 4o C durante 1 h. O anticorpo secundário IgG Fc FITC de cabra anti-humano (3,2 moles de FITC por mol de IgG, Jackson Immunoresearch Lab) foi adicionado e incubado com células a 4o C no escuro por meia hora. As células foram então lavadas uma vez, ressuspensas em 1 x PBS/BSA 1% e analisadas por citometria de fluxo (BD). A intensidade de fluorescência foi convertida em moléculas/células ligadas com base nas contas quantitativas Kits QuantumTM MESF (Bangs Laboratories, Inc.). O valor KD de cada anticorpo foi calculado usando Graphpad Prism5.
[0406] Os dados para ligação de anticorpos OX40 anti-humanos a células CHO- K1 que expressam OX40 humana por citometria de fluxo são mostrados na Tabela 6 e Figura 2. Os dados demonstram que os anticorpos ilustrativos 1.7.10-u1-IgG1K, 1.62.3- u1-3-IgG1K, 1.134.9-u1-IgG1L, 1.186.19-u1-IgG1K e 1.214.23-u1-IgG1K mostram eficiência de ligação às células CHO-K1 que expressam OX40 humana.
[0407] Tabela 6. Afinidade de ligação de anticorpos anti-OX40 à OX40 humana de superfície celular testada por citometria de fluxo Abs Bmax (M) KD (M)
1.134.9-u1-IgG1L 2,1×10-10 5,3×10-10
1.214.23-u1-IgG1K 1,7×10-10 6,7×10-11 BMK7 2,0×10-10 1,5×10-9 BMK10 1,8×10-10 2,3×10-10
[0408] Como demonstrado na Tabela 6 e Figura 2, os anticorpos 1.134.9-u1- IgG1L e 1.214.23-u1-IgG1K se ligam a uma OX40 humana de superfície celular com alta afinidade que é comparável ou mesmo maior do que BMK7 e BMK10.
4.3 Ligação de anticorpos anti-OX40 a OX40
[0409] FACS à base de células foi usado para testar a atividade de ligação de anticorpos anti-OX40 a OX40. Resumidamente, células CHO-K1 expressando OX40 humana ou células T CD4+ humanas ativadas foram transferidas para placas de fundo em U de 96 poços (Corning) a uma densidade de 1x105 células/poço. Os anticorpos de teste foram serialmente diluídos em tampão de lavagem (1 x PBS/ BSA 1%) e incubados com células a 4o C por 1 h. Após a lavagem com 1x PBS/BSA 1%, o anticorpo secundário de IgG-PE de cabra anti-humana (Jackson ImmunoResearch Lab) foi aplicado e incubado com células a 4o C no escuro por 1 h. As células foram então lavadas e ressuspensas em 1 x PBS/ BSA 1% ou fixadas com paraformaldeído a 4%, e então analisadas por citometria de fluxo (BD).
[0410] Os dados para ligação de anticorpos anti-OX40 para células T CD4+ ativadas por citometria de fluxo são mostrados na Figura 3. Os dados mostram que os anticorpos ilustrativos 1.7.10-u1-IgG1K, 1.62.3-u1-IgG1K, 1.134.9-u1-IgG1L, 1.186.19- u1-IgG1K e 1.214.23-u1-IgG1K se ligam à OX40 humana de superfície celular de uma maneira dose-dependente.
4.4 Competição de ligação de ligante à OX40
[0411] Ensaio de competição baseado em ELISA foi usado para testar se anticorpos anti-OX40 poderiam bloquear competitivamente a ligação OX40 à OX40 ligante (OX40L). Em resumo, as placas (Nunc) foram revestidas com OX40 ECD humano a 1 μg/mL de um dia para o outro a 4o C. Os anticorpos foram diluídos serialmente em tampão de bloqueio e misturados com concentração constante de OX40L. Após o bloqueio e a lavagem, a mistura de anticorpos/OX40L foi adicionada às placas, e em seguida incubada em temperatura ambiente por 1 h. As placas foram então lavadas e subsequentemente incubadas com anticorpo secundário conjugado a HRP por 1 h para detectar a ligação de OX40L à OX40 ECD. Após a lavagem, o substrato TMB foi adicionado e a interação foi interrompida por HCl 2M. A absorbância a 450 nm e 540 nm foi lida usando-se um leitor de microplaca (Molecular Device).
[0412] Como mostrado na Figura 4, os anticorpos ilustrativos 1.7.10-u1-IgG1K,
1.62.3-u1-IgG1K, 1.134.9-u1-IgG1L, 1.186.19-u1-IgG1K e 1.214.23-u1-IgG1K competitivamente se ligam a OX40 humana com OX40L.
4.5 Teste de Ortólogos (Espécies Cruzadas)
[0413] A reatividade cruzada dos anticorpos anti-OX40 para o OX40 de macacos rhesus foi medida por FACS baseado em células. Resumidamente, células 293F de macaco rhesus expressando OX40 foram transferidas em placas de fundo em U de 96 poços (Corning) a uma densidade de 2x105 células/poço. Os anticorpos de teste foram serialmente diluídos em tampão de lavagem (1 x PBS/ BSA 1%) e incubados com células a 4o C por 1 h. Após a lavagem com 1 x PBS/ BSA 1%, o anticorpo secundário de IgG Fc-PE de cabra anti-humano (Jackson ImmunoResearch Lab) foi aplicado e incubado com células a 4o C no escuro por 1 h. As células foram então lavadas e ressuspensas em 1 x PBS/ BSA 1% ou fixadas com paraformaldeído a 4%, e então analisadas por citometria de fluxo (BD).
[0414] Como demonstrado na Figura 5, os anticorpos ilustrativos 1.7.10-u1- IgG1K, 1.62.3-u1-3-IgG1K, 1.134.9-u1-IgG1L, 1.186.19-u1-IgG1K e 1.214.23-u1-IgG1K têm ligação cruzada às células 293F transfectadas com OX40 de macaco rhesus.
4.6 Ligação Homóloga (Família Cruzada)
[0415] OX40 Humana, CD40, 4-1BB (CD137) e CD271 ECD foram revestidos em placas (Nunc) durante a noite a 4o C. Após bloqueio e lavagem, os anticorpos de teste foram diluídos em tampão de bloqueio e adicionados às placas e incubados à temperatura ambiente durante 1 h. As placas foram então lavadas e subsequentemente incubadas com anticorpo secundário IgG Fc-HRP anti-humano de cabra (Betila) por 1 h. Após lavagem, foi adicionado substrato TMB e a interação foi interrompida por HCl 2M.
A absorbância a 450 nm e 540 nm foi lida usando-se um leitor de microplaca (Molecular Device).
[0416] Os resultados no teste de ligação da família cruzada dos anticorpos anti- OX40 para CD40 humano, 4-1BB (CD137) e CD271 ECD por ELISA são mostrados na Figura 6. O resultado demonstra que anticorpos 1.7.10-u1-IgG1K, 1.62.3-u1-IgG1K,
1.134.9-u1-IgG1L, 1.186.19-u1-IgG1K e 1.214.23-u1-IgG1K se ligam especificamente ao OX40 (isto é, CD134) e não se ligam a CD40 humano, CD137 e CD271.
4.7 Teste de Categorização (“Binning”) de Epítopos Contra Anticorpos BMK
[0417] O epítopo de ligação de anticorpos anti-X40 foi categorizado contra anticorpos de referência por ELISA. Os anticorpos de teste foram revestidos em placas (Nunc) durante a noite a 4o C. Após o bloqueio e a lavagem, a concentração constante de proteína OX40 humana diluída em tampão de bloqueio foi adicionada às placas e incubada à temperatura ambiente por 1 h. Então, as referências biotiniladas foram diluídas serialmente e adicionadas a cada poço e incubadas por mais 1 hora. As placas foram então lavadas e subsequentemente incubadas com estreptavidina-HRP de anticorpo secundário (Life Technology) durante 1 hora. Após a lavagem, o substrato TMB foi adicionado e a interação foi interrompida por HCl 2M. A absorbância a 450 nm e 540 nm foi lida usando-se um leitor de microplaca (Molecular Device).
[0418] Figuras 7A, 7B e 7C mostram a caracterização do epítopo dos anticorpos
1.7.10-u1-IgG1K, 1.62.3-u1-IgG1K, 1.134.9-u1-IgG1L, 1.186.19-u1-IgG1K e 1.214.23- u1-IgG1K contra anticorpos de referência BMK1 (Figura 7A), BMK7 (Figura 7B) e BMK10 (Figura 7C), respectivamente. Como mostrado na Figura 7A, os anticorpos 1.7.10-u1- IgG1K, 1.62.3-u1-IgG1K, 1.134.9-u1-IgG1L, 1.186.19-u1-IgG1K e 1.214.23-u1-IgG1K compartilham diferentes características de BMK1. Como mostrado nas Figuras 7B e 7C, os anticorpos 1.62.3-u1-IgG1K e 1.134.9-u1-IgG1L compartilham diferentes características de BMK7 e BMK10, mas os anticorpos 1.7.10-u1-IgG1K, 1.186.19-u1- IgG1K e 1.214.23-u1-IgG1K compartilham características similares ou próximas com BMK7 e BMK10.
4.8 Ensaio de Bioatividade Usando Células T Repórter Jurkat NFkB-Luciferase
[0419] A capacidade de anticorpos anti-OX40 para sinalizar através da OX40 humana foi avaliada utilizando-se uma linhagem de células Jurkat construída que expressando proteína de fusão OX40/CD40 e gene repórter NFkB-luciferase. Bioatividade de anticorpos anti-OX40 ligador de forma cruzada por uso de um reagente Fc IgG anti-humano ou células expressando complementos do receptor Fcy humano foram medidos. As células repórter Jurkat NFkB-luciferase foram cultivadas em meio RPMI 1640 completo contendo 10% de FBS e 0,5 mg/mL de Higromicina B como seleção.
[0420] Para determinar a bioatividade de anticorpos anti-OX40 em condição complexada, células CHO-K1 expressando CD32b ou F(ab’)2 IgG anti-humano de cabra (Jackson ImmunoResearch Lab) foram usadas para mediar a ligação cruzada de anticorpos, que agrupa e ativa o OX40 nas células repórter Jurkat. Células repórter Jurkat OX40 foram coletadas e adicionadas a uma placa de 96 poços. Anticorpos OX40 serialmente diluídos em meio completo foram adicionados às células na presença de células CHO-K1 expressando CD32b, células CHO-K1 parentais ou anticorpos de ligação cruzada, e incubadas com as placas a 37o C, 5% de CO2 por 6 horas ou durante a noite. Substrato de luciferase reconstituído (Promega) foi adicionado a cada poço e bem misturado. A intensidade de luciferase foi lida utilizando-se um leitor de microplaca (Molecular Device). Anticorpos anti-OX40 também foram testados quanto à bioatividade em condição solúvel.
[0421] Figuras 8A, 8B e 8C mostram o efeito de testes de anticorpos sobre a atividade de luciferase de NFkB estimulada por OX40 em células Jurkat usando anticorpos livres ou ligação cruzada FcyR por células CHO-K1 expressando CD32b ou reagente Fc IgG anti-humano. A atividade repórter de anticorpos livres (Figura 8A) ou ligação cruzada por (Figura 8B) F(ab')2 IgG anti-humana de cabra ou (Figura 8C) células CHO-K1 que expressam CD32a é mostrada, respectivamente.
[0422] Conforme mostrado nas Figuras 8A, 8B e 8C, os anticorpos de ligação cruzada podem ativar eficazmente a sinalização de OX40.
4.9 Função in vitro de anticorpos anti-OX40 testados por ensaios com base em células
[0423] Células T CD4+ humanas usadas neste exemplo foram isoladas de PBMCs humanas utilizando Kit de Enriquecimento de Células T CD4+ Humano (StemCell) de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram ressuspensas em meio RPMI 1640 completo.
4.9.1 Efeitos de anticorpos anti-OX40 sobre a produção de Interleucina 2 (IL -2) in vitro
[0424] Neste ensaio, placas de 96 poços de fundo chato tratadas com cultura não-tecido (Corning) foram pré-revestidas com anti-CD3 durante a noite a 4o C. No dia do ensaio, as placas foram lavadas com meio RPMI 1640 completo para remover anticorpos não ligados. Células T CD4+ humanas recentemente isoladas foram adicionadas a cada poço a uma densidade de 1x105 células/poço em um volume de 100 μL. Então, concentração constante de anticorpo de ligação cruzada F(ab')2 IgG anti- humana de cabra e anticorpos OX40 serialmente diluídos foram misturados em 100 μL e foram também adicionados a cada poço das placas. As placas foram incubadas a 37° C, 5% de CO2 durante 3 dias e então os sobrenadantes foram coletados para a medição de IL-2 por ELISA.
[0425] Figura 9 mostra o efeito de anticorpos sobre a secreção de IL-2 anti-CD3 induzida por células T CD4+ humanas primárias. Foi demonstrado que os anticorpos ilustrativos (incluindo 1.7.10-u1-IgG1K, 1.62.3-u1-IgG1K, 1.134.9-u1-IgG1L, 1.186.19-u1- IgG1K e 1.214.23-u1-IgG1K) intensificaram a secreção de IL-2 por células T CD4+ humanas primárias.
4.9.2 Efeitos de anticorpos anti-OX40 sobre a secreção de citocina IFNγ e proliferação de células T CD4+ in vitro
[0426] Para avaliar diretamente o efeito de anticorpos anti-OX40 na intensificação da produção de IFNγ e proliferação de células T CD4+, executamos um ensaio para coestimular células T CD4+ humanas através do sinal OX40 em combinação com complexo de receptor de células CD3/T (TCR). Em resumo, placas de 96 poços de fundo chato tratadas com não-cultura (Corning) foram pré-revestidas com 100 μL de mistura de concentração constante de anti-CD3 e concentração diferente de anticorpos anti-OX40. As placas foram incubadas durante a noite a 4o C, e em seguida lavadas com meio RPMI 1640 completo para remover anticorpos não ligados. Células T CD4+ humanas recentemente isoladas foram adicionadas a cada poço a uma densidade de 1x105 células/poço em um volume de 200 μL. As placas foram incubadas a 37° C, 5% de CO2 durante 3 dias e então os sobrenadantes foram coletados para medição de IFNγ por
ELISA. Os concentrados de células foram coletados para medir a proliferação de células T CD4+ por 3H-timidina como segue: 3H-timidina (PerkinElmer) foi adicionada às placas de cultura de células a 0,5 μCi/poço. As placas foram cultivadas em 5% de CO2 a 37o C por 16 a 18 horas, antes a incorporação de 3H-timidina nas células proliferantes foi determinada usando Contador de Cintilação Topcount NXT (Perkin Elmer).
[0427] Figura 10 mostra o efeito de anticorpos sobre a secreção de IFNγ induzida por anti-CD3 por células T CD4+ humanas primárias. Observa-se que os anticorpos ilustrativos 1.7.10-u1-IgG1K, 1.62.3-u1-3-IgG1K, 1.134.9-u1-IgG1L, 1.186.19-u1-IgG1K e 1.214.23-u1-IgG1K aumentaram a secreção de IFNγ pelas células T CD4+ humanas primárias.
[0428] Figura 11 mostra o efeito de anticorpos sobre a proliferação induzida por anti-CD3 de células T CD4+ humanas primárias. Foi demonstrado que os anticorpos ilustrativos 1.7.10-u1-IgG1K, 1.62.3-u1-3-IgG1K, 1.134.9-u1-IgG1L, 1.186.19-u1-IgG1K e 1.214.23-u1-IgG1K aumentaram a proliferação de células T CD4+ humanas primárias.
4.9.3 Efeito de anticorpos anti-OX40 humanas em função supressora de Tregs
[0429] Tregs, uma subpopulação de células T, são um modulador imune chave e desempenham papéis essenciais na manutenção da autotolerância. As células T reguladoras CD4+CD25+ são sugeridas estarem associadas ao crescimento tumoral, visto que números aumentados de Tregs foram encontrados em pacientes com múltiplos cânceres e foram associados com prognóstico deficiente. Para avaliar diretamente o efeito de anticorpos anti-OX40 humanas sobre a resposta supressora imune, comparamos a função de Tregs na presença e ausência de anticorpos anti-OX40. Células Treg CD4+CD25+ e T efetora CD4+CD25- (Teff) foram separadas usando-se microesferas anti-CD25 específicas (StemCell). As células Teff foram plaqueadas a 1x105 células/50 μL/poço e co-cultivadas com 1x105 Tregs/50 μL/poço em placas de fundo redondo de 96 poços (BD). As células foram então estimuladas com células dendríticas alogênicas humanas (DCs) induzidas a partir de monócitos em 1 DC/10 Teff na presença de anticorpo de ligação cruzada, bem como anticorpos anti-X40. Nenhum anticorpo ou isotipo de anticorpo foi usado como controle negativo. As co-culturas foram incubadas a 37o C, 5% de CO2 durante 5 dias. Os concentrados de células foram coletados no dia 5 para determinar a proliferação de Teff medida pela incorporação de 3H-timidina.
[0430] Figura 12 mostra o efeito de anticorpos sobre proliferação induzida por células dendríticas de células T CD4+ efetoras humanas primárias na presença de células Treg. Os anticorpos 1, 1.134.9-u1-IgG1L e 1.214.23-u1-IgG1K podem restaurar a proliferação de células CD4+CD25- por reversão da função supressora de células T reguladoras.
4.10 Teste de ADCC e CDC:
[0431] OX40 é expresso em uma variedade de tipos celulares. A fim de avaliar a sua capacidade de desencadear a função efetora Fc, os anticorpos anti-OX40 foram avaliados se eles poderiam induzir o efeito de ADCC e CDC sobre as células expressando OX40.
[0432] Figura 13A mostra a expressão de OX40 em células T CD4+ ativadas humanas e a Figura 13B mostra a expressão de OX40 em células Jurkat superexpressando OX40.
4.10.1 Teste ADCC:
[0433] Células Jurkat que expressam OX40 ou células T CD4+ ativadas, como alvo, e várias concentrações de anticorpos anti-OX40 foram pré-incubadas em placa de fundo redondo de 96 poços (BD) durante 30 minutos; e então PBMCs alogênicas, como efetor, foram adicionadas em razão efetor/alvo de 50: 1. A placa foi mantida a 37o C, 5% de CO2 durante 4 horas. A lise celular alvo foi determinada por Kit de Detecção de
Citotoxicidade baseado em LDH (Roche). A absorbância a 492 nm foi lida usando-se um leitor de microplaca (Molecular Device).
[0434] Figuras 14A e 14B mostram o efeito de ADCC de anticorpos OX40 em células Jurkat que expressam OX40 (Figura 14A) ou células T CD4+ ativadas (Figura 14B), respectivamente. Como mostrado nas Figuras 14A e 14B, os anticorpos ilustrativos da presente descrição, isto é, 1.134.9-u1-IgG1L e 1.214.23-u1-IgG1K, têm baixo efeito ADCC sobre as células Jurkat que superexpressam OX40 e células T CD4+ humanas ativadas.
4.10.2 Teste CDC:
[0435] Células Jurkat que expressam OX40 ou células T CD4+ humanas ativadas, como alvo, e várias concentrações de anticorpos anti-OX40 foram misturadas em placa de fundo redondo de 96 poços (BD). O complemento humano foi adicionado em uma diluição final de 1: 50. A placa foi mantida a 37° C, 5% de CO2 durante 2 horas.
A lise celular alvo foi determinada por CellTiter-Glo (Promega). A luminescência foi lida utilizando-se um leitor de microplaca (Molecular Device).
[0436] Figuras 15A e 15B mostram o efeito CDC de anticorpos OX40 em células Jurkat que superexpressam OX40 (Figura 15A) ou células T CD4+ humanas ativadas (Figura 15B), respectivamente. Como mostrado nas Figuras 15A e 15B, os anticorpos ilustrativos da presente descrição, isto é, 1.134.9-u1-IgG1L e 1.214.23-u1-IgG1K, têm baixo efeito CDC sobre células Jurkat que superexpressam OX40 e células T CD4+ humanas ativadas.
4.11 Mapeamento de Domínio
[0437] A fim de examinar o domínio de ligação dos anticorpos OX40, foi usada uma série de variantes quiméricas de OX40 humanas/camundongo. Os anticorpos OX40 ligam-se especificamente a OX40 humana, sem reatividade cruzada a OX40 de camundongo e CD40 humano, apesar de compartilhar 60% e 23% de identidade em sua sequência de aminoácidos (alternativamente, referida como “aa”), respectivamente. Resumidamente, foram construídas vinte e duas variantes (denominadas como variantes “x1”, “x2” …“x22”) com a substituição dos seguintes resíduos do domínio extracelular de OX40 humana XO40 (hPro1) com os aminoácidos correspondentes de camundongo OX40 (mPro1) ou aminoácidos CD40 humanos (hPro40).
[0438]  Variante x1: xPro1.FL-x1: CRDmox40_1 (OX40 humana aa 29 a 65 substituída com as contrapartes de camundongo)
[0439]  Variante x2: xPro1.FL.x2: CRDmox40_2 (OX40 humana aa 66 a 107 substituída com as contrapartes de camundongo)
[0440]  Variante x3: xPro1.FL-x3: CRDmox40_3 (OX40 humana aa 108 a 146 substituída com as contrapartes de camundongo)
[0441]  Variante x4: xPro1. FL-x4: CRDmox40_4 (OX40 humana aa 147 a 214 substituída com as contrapartes de camundongo)
[0442]  Variante x5: xPro1.FL-x5: CRDmox40_1-2 (OX40 humana aa 29 a 107 substituída com as contrapartes de camundongo)
[0443]  Variante x6: xPro1.FL-x6: CRDmox40_2-3 (OX40 humana aa 66 a 146 substituída com as contrapartes de camundongo)
[0444]  Variante x7:xPro1. FL-x7: CRDmox40_3-4 (OX40 humana aa 108 a 214 substituída com as contrapartes de camundongo)
[0445]  Variante x8: xPro1.FL-x8: CRDmox40_1-3 (OX40 humana aa 29 a 146 substituída com as contrapartes de camundongo)
[0446]  Variante x9: xPro1.FL-x9: CRDmox40_2-4 (OX40 humana aa 66 a 214 substituída com as contrapartes de camundongo)
[0447]  Variante x10: xPro1.FL-x10: CRDmox40_1, 2, 4 (OX40 humana aa 29 a 107 e 147 a 214 substituídas com as contrapartes de camundongo)
[0448]  Variante x11: xPro1.FL-11: CRDmox40_1,3,4 (OX40 humana aa 29 a 65 e 108 a 214 substituídas com as contrapartes de camundongo)
[0449]  Variante x12: xPro1.FL-x12: CRDhcd40_1 (OX40 humana aa 29 a 65 substituídas com as contrapartes de aa CD40 humano)
[0450]  Variante x13: xPro1.FL-x13: CRDhcd40_2 (OX40 humana aa 66 a 107 substituída com as contrapartes de aa CD40 humano)
[0451]  Variante x14: xPro1.FL-x14:CRDhcd40_3 (OX40 humana aa 108 a 146 substituídas com as contrapartes de aa CD40 humano)
[0452]  Variante x15: xPro1.FL-x15: CRD hcd40_4 (OX40 humana aa 147 a 214 substituída com as contrapartes de aa CD40 humano)
[0453]  Variante x16: xPro1.FL-x16: CRDhcd40_1-2 (OX40 humana aa 29 a 107 substituída com as contrapartes de aa CD40 humano)
[0454]  Variante x17: xPro1.FL-x17: CRDhcd40_2-3 (OX40 humana aa 66 a 146 substituída com as contrapartes de aa CD40 humano)
[0455]  Variante x18: xPro1.FL-x18: CRDhcd40_3-4 (OX40 humana aa 108 a 214 substituída com as contrapartes de aa CD40 humano)
[0456]  Variante x19: xPro1.FL-x19: CRDhcd40_1-3 (OX40 humana aa 29 a 146 substituída com as contrapartes de aa CD40 humano)
[0457]  Variante x20: xPro1. FL-x20: CRDhcd40_2-4 (OX40 humana aa 66 a 214 substituída com as contrapartes de aa CD40 humano)
[0458]  Variante x21: xPro1. FL-x21: CRDhcd40_1,2,4 (OX40 humana aa 29 a 107 e 147 a 214 substituída com as contrapartes de aa CD40 humano)
[0459]  Variante x22: xPro1. FL-x22: CRDhcd40_1,3,4 (OX40 humana aa 29 a 65 e 108 a 214 substituídas com as contrapartes de aa CD40 humano)
[0460] As vinte e duas variantes a partir de “x1” a “x22” foram clonadas em vetor pcDNA3.0, e usadas para a transfecção de células 293F. Resumidamente, células 293F foram diluídas para uma densidade de 1x106 células/mL com meio de FreeStyle 293F e alíquotas de 3 mL por poço foram adicionadas a placa de 24 poços. As transfecções foram realizadas utilizando reagente 293fectina (Life Technologies). Para cada transfecção, 3 μg de DNA foram diluídos em 150 μL de meio de soro reduzido Opti-MEMI (Life Technologies), e em seguida combinados com 6 μL de reagente 293fectina pré- diluído em 150 μL de meio de soro reduzido Opti-MEMI. A mistura de DNA/Lipofectamina foi deixada em repouso a 25o C por 20 minutos antes de ser adicionada à cultura. As células transfectadas foram analisadas por citometria de fluxo 48h pós-transfecção.
[0461] Ligação de anticorpos a variantes de OX40 quiméricas foram analisadas por citometria de fluxo. Resumidamente, anticorpos de 1 μg/mL, exceto BMK10 que é 2 μg/mL, foram incubados com OX40 quimérico expressos em células 293F transfectadas por 1 hora a 4o C, e em seguida incubados com 3 μg/mL de IgG Fc R-PE anti-humano de cabra (Jackson ImmunoResearch Lab) por 40 minutos a 4o C. As células foram analisadas utilizando o citômetro de fluxo.
[0462] Resultados são mostrados nas Tabelas 7-9 abaixo.
Tabela 7. Ligação das variantes aos anticorpos OX40
1.134.9-u1-IgG1L 1.214.23-u1-IgG1K MFI PE+ % MFI PE+ % 293F 29,2 0 293F 28,6 0 293F+1.134.9- 293F+1.214.23- u1-IgG1L+ IgG u1-IgG1K + IgG 28,8 0,106 26,7 0,158 Fc R-PE cabra Fc R-PE cabra anti-humano anti-humano hPro1 9162 85,2 hPro1 8324 89,3 mPro1 44,4 0,937 mPro1 49,9 0,315 x1 6442 75,3 x1 5421 82,9 x2 49,5 0,904 x2 23300 92,8 x3 3805 66,1 x3 2251 70 x4 24100 96,6 x4 23200 97,7 x5 61 1,73 x5 21700 96,5 x6 211 6,75 x6 113 2,31 x7 9157 80,3 x7 6542 81,5 x8 43,2 0,678 x8 42,6 0,743 x9 44,1 0,668 x9 80,1 0,244 x10 42,7 0,624 x10 19600 94,4 x11 9403 74 x11 6260 70,8
Tabela 8. Ligação das variantes ao anticorpo referência BMK1 ou BMK5 BMK1 BMK5 MFI PE+ % MFI PE+ % 293F 28,3 0,024 293F 28,4 0,023 293F+BMK1+ 293F+BMK5+ IgG IgG Fc R-PE 25,1 0,063 Fc R-PE cabra 24,4 0,081 cabra anti- anti-humano humano hPro1 8101 89,1 hPro1 9641 89,2 mPro1 33,7 0,189 mPro1 31,6 0,04 x1 43,7 1,22 x1 6029 80,4 x2 14800 94,3 x2 53,9 1,89 x3 3334 72,7 x3 4412 73,7 x4 22300 97,9 x4 25900 98,3 x5 103 2,02 x5 66,1 2,65 x6 12600 90,4 x6 134 8,43 x7 8118 85,8 x7 9740 88,8 x8 39,4 0,31 x8 63,8 0,652 x9 12800 93,2 x9 38,6 0,198 x10 58,2 0,43 x10 33,5 0,12 x11 105 4,44 x11 33,5 0,12
Tabela 9. Ligação às variantes do anticorpo de referência BMK7 ou BMK10 BMK7 BMK10 MFI PE+ % MFI PE+ % 293F 22,5 0 293F 22,7 0,045 293F+BMK7+ 293F+BMK10+ IgG Fc R-PE IgG Fc R-PE 21,8 0,147 21,9 0,084 cabra anti- cabra anti- humano humano hPro1 18900 97,2 hPro1 27600 98,3 mPro1 157 21,2 mPro1 4997 91,6 x1 14900 91,6 x1 18100 92,6 x2 23900 92,8 x2 33700 95,1 x3 772 56,7 x3 4931 87 x4 18200 99,6 x4 29500 99,7 x5 26300 98,9 x5 39700 99,5 x6 7066 88,9 x6 14000 94,1 x7 775 49,6 x7 6816 96,6 x8 2629 95,7 x8 16700 98,4 x9 2975 82,5 x9 19700 97,1 x10 16400 97,9 x10 24400 98,6 x11 1144 37,8 x11 8204 91,5 x12 7969 96,8 x12 10300 97,8 x13 10300 95,3 x13 15000 96,5 x14 25,7 0,068 x14 26,9 0,113 x15 22300 99 x15 31300 99,5 x16 20000 89,6 x16 28100 91,8 x17 24,2 0,086 x17 27,4 0,16 x18 27,5 0,042 x18 28 0,176 x19 26,9 0,043 x19 27,2 0,22 x20 25,4 0,066 x20 24,2 0,064 x21 171 20,8 x21 2111 94,5 x22 23,8 0 x22 32,8 0,806 hPro40 60,3 0,291 hPro40 28,8 0,068
[0463] Tabela 10 mostra o domínio de OX40 (colorido em cinza) envolvido na ligação de antígeno.
Tabela 10. Domínio de OX40 (colorido em cinza) envolvido na ligação de antígeno
Abs CRD1 CRD2 CRD3 CRD4
1.214.23-u1-IgG1K
1.134.9-u1-IgG1L BMK1 BMK5 BMK7 BMK10
[0464] Note-se: que o CRD refere-se a um domínio rico em cisteína, em que a Expressão CRCD1 refere-se aos aminoácidos 29-65 do OX4 humano, a expressão CRD2 refere-se aos aminoácidos 66-107 da OX4 humana, A expressão CRD3 se refere aos aminoácidos 108-146 de OX4 humano, e a expressão CRD4 se refere Aos Aminoácidos 147-214 da OX40 humana.
4.12 Anticorpo OX40 inibe o crescimento de carcinoma de cólon MC38 em modelo transgênico OX40 humana
[0465] Este estudo avaliou a eficácia antitumoral in vivo do anticorpo 1.134.9-u1- IgG1L em modelo de câncer de cólon MC38 em camundongos OX40 B-hTNFRSF4 humanizados.
[0466] Camundongos OX40 B-hTNFRSF4 humanizados foram adquiridos de Biocytogen Co, Ltd. Os camundongos foram mantidos em gaiolas de ventilação individual em temperatura e umidade constantes com 5 animais em cada gaiola.
[0467] As células MC38 foram mantidas in vitro como uma cultura de monocamada em meio DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mM de L- glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina a 37o C em uma atmosfera de 5% de CO2 em ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por meio por tratamento com tripsina-EDTA. As células que cresceram em uma fase de crescimento exponencial foram coletadas e contadas para a inoculação tumoral.
[0468] Cada camundongo foi inoculado subcutaneamente na direita axilar (lateral) com células tumorais MC38 (3x105) em 0,1 mL de PBS para o desenvolvimento tumoral. Os animais foram aleatoriamente agrupados quando o volume médio de tumor alcançou 65 mm3, então o tratamento começou para o estudo de eficácia. Todos os anticorpos teste e anticorpos controle foram administrados por injeção intraperitoneal (IP) duas vezes por semana (BIW) por três semanas (“BIWx 3”). Informações detalhadas são fornecidas na Tabela 11.
Tabela 11. Número Dose (mg/kg Via da Grupo do Sexo Tratamento peso Esquema Dose Animal corporal) 1 8 fêmea Isotipo hIgG1 5 IP BIW × 3
1.134.9-u1- 2 8 fêmea 5 IP BIW × 3 IgG1L
1.134.9-u1- 3 8 fêmea 1 IP BIW × 3 IgG1L
1.134.9-u1- 4 8 fêmea 0,2 IP BIW × 3 IgG1L
[0469] Todos os procedimentos relacionados com o manuseio de animais, cuidados e o tratamento no estudo foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas Comitê de Cuidado e Uso Animal Institucional (IACUC) de WuXi Apptec seguindo a orientação da Associação para Avaliação e Acreditação de Cuidados com Animais de Laboratório (AAALAC). No momento da monitoração de rotina, os animais foram checados diariamente para quaisquer efeitos do crescimento e tratamentos de tumor em comportamento normal tal como mobilidade, consumo de alimento e água (olhando apenas), ganho/perda de peso corporal (peso corporal foi medido uma vez a cada dia), carência de olho/cabelo e qualquer outro efeito anormal como declarado no protocolo. A morte e os sinais clínicos observados foram registrados com base nos números de animais dentro de cada subconjunto.
[0470] Os tamanhos de tumor foram medidos três vezes por semana em duas dimensões usando um calibrador, e o volume foi medido em mm3 utilizando a fórmula: V = 0.5axb2 onde a e b são os diâmetros longos e curtos do tumor, respectivamente. Os tamanhos de tumor são então usados para os cálculos de valores de T/C (%). T/C (%) da taxa de proliferação de tumor relativa foi calculada usando a fórmula: T/C % = TRTV/CRTV X 100% (TRTV significa grupo de tratamento em relação ao volume de tumor; CRTV significa controle negativo relativo ao volume do tumor). O volume de tumor relativo foi calculado com base nas medições de tumor, a fórmula de cálculo foi: RTV = Vt/V0, V0 é o volume médio de tumor no dia de início de tratamento, Vt é o volume médio de tumor de uma medida de tempo , TRTV usou dados do dia da mesma forma com CRTV.
[0471] TGI é calculado para cada grupo utilizando a fórmula: TGI (%) = [1-(Ti- T0)/(Vi-V0)]×100; Ti é o volume médio de tumor de um grupo de tratamento em um dado dia, T0 é o volume médio de tumor do grupo de tratamento no primeiro dia de tratamento, Vi é o volume médio de tumor do grupo de controle do veículo no mesmo dia com Ti, e V0 é o volume médio de tumor do grupo do veículo no primeiro dia de tratamento.
[0472] O resumo das estatísticas, incluindo a média e o erro padrão da média (SEM), é provido para o volume de tumor de cada grupo em cada ponto de tempo. A análise estatística da diferença no volume do tumor entre os grupos e a análise da interação do fármaco foi conduzida nos dados obtidos no melhor ponto de tempo terapêutico. ANOVA de uma via foi realizada para comparar o volume de tumor entre três ou mais grupos. Quando uma estatística de F significativa (a proporção de variação de tratamento para a variância de erro) foi obtida, as comparações entre os grupos foram realizadas com teste de Games-Howell; se não, Dunnett-t (2-lados) pode ser usado.
Todos os dados foram analisados usando SPSS 17.0. Um valor de P menor que 0,05 (p < 0,05) foi considerado como sendo estatisticamente significativo.
[0473] Os dados experimentais são mostrados nas Tabelas 12 e 13 bem como nas Figuras 16 e 17.
Tabela 12. Os volumes médios de tumor com o tempo em camundongos contendo tumor MC38 após a administração de 1.134.9-u1-IgG1L Volume do Tumor (mm3) Dias após 1.134.9-u1- 1.134.9-u1- 1.134.9-u1- Isotipo hIgG1 tratamento IgG1L IgG1L IgG1L (5 mg/kg) (5 mg/kg) (1 mg/kg) (0.2 mg/kg) 0 66±4 65±4 65±3 65±4 3 103±6 103±7 104±4 104±9 5 164±10 131±17 133±8 137±12 7 260±19 178±31 191±14 228±29 10 750±97 376±95 194±32 539±73 12 1246±146 511±139 181±42 841±118 14 1709±195 611±165 227±57 1157±151 17 3955±1246 1168±295 417±101 2387±354 19 - 1574±415 625±150 2274±424 Tabela 13. A taxa de inibição do crescimento do tumor no dia 12 após a administração de 1.134.9-u1-IgG1L Número Volume do Valor de Grupo T/C (%) TGI (%) Animal Tumor (mm3) P Isotipo hIgG1 8 1246±146 - - - (5 mg/kg)
1.134.9-u1- IgG1L 8 511±139 41,29 62,26 0,019 (5 mg/kg)
1.134.9-u1- 8 181±42 14,61 90,17 0,001 IgG1L
(1 mg/kg)
1.134.9-u1- IgG1L 8 841±118 67,98 34,24 0,255 (0,2 mg/kg)
[0474] Pode ser visto que o anticorpo OX40 1.134.9-u1-IgG1L produziu uma atividade antitumor significativa contra o camundongo B-hTNFRSF4 tendo carcinoma de colon MC38, e o anticorpo foi bem tolerado pelos animais tendo o tumor.
Mapeamento de Epítopo
[0475] A fim de examinar o epítopo de ligação dos anticorpos OX40, os experimentos de varredura de alanina em OX40 humana foram conduzidos e seu efeito para a ligação de anticorpos foi avaliado. Os resíduos de alanina na OX40 humana foram mutados para códons de glicina, e todos os outros resíduos (exceto resíduos de cisteína e as áreas de superfície acessíveis ao solvente <10 do aminoácida OX40 baseado no complexo OX40-OX40R (PDB:2HEV) (SASA > 10 conjuntos de aminoácidos de superfície)) foram mutados em códons de alanina. Para cada resíduo do domínio extracelular de OX40 humana, substituições pontuais de aminoácidos foram feitas utilizando dois PCR sequenciais. Um plasmídeo pcDNA3.3-OX40-ECD.His que codifica ECD de OX40 humana e um His-tag C-terminal foi usado como padrão, e um conjunto de iniciador mutagênico foi usado para a primeira etapa PCR utilizando o kit de mutagênese direcionada a múltiplos sítios rápido QuikChange (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Endonuclease Dpn I foi usada para digerir o modelo parental após a reação de síntese da fita mutante. Na segunda etapa do PCR, o cassete de expressão de DNA linear que é composto de promotor CMV, um domínio extracelular de OX40, uma His-tag e uma poliadenilação de timidina quinase do vírus do herpes simplex (TK) foi amplificado e transitoriamente expresso em células 293F a 37o C (Life Technologies, Gaithersburg, MD), quantificado por ELISA de quantificação His-tag.
[0476] Anticorpo Monoclonal 1.134.9-ul-IgG1 (2 μg/mL) foi revestido em placas para ensaio de ligação ELISA. Após a interação com o sobrenadante que contém mutantes OX40 quantificados ou proteína OX40-ECD.His humana, anticorpo anti-His conjugado a HRP (1: 5000, GenScript-A00612, CHN) foi adicionado como anticorpo de detecção. A absorbância foi normalizada de acordo com a média de mutantes controle. Após a colocação de um corte adicional à mudança de dobra de ligação (< 0,75), os resíduos de epítopo determinados finais foram identificados pela consideração do mapeamento de domínio, mapeamento de epítopos e estrutura de cristal, que não incluiu os aminoácidos contribuindo para a estabilidade da estrutura, tal como um a.a.
pertencente a CRD3 & CRD4.
[0477] A mudança de dobra normalizada de mutações pontuais OX40 sobre a ligação de anticorpos foi mostrada na Tabela 14. Pontos quentes (“hotspots”) foram identificados pela consideração do mapeamento de domínio, varredura de alanina (corte: alteração de dobra de ligação <0,75, SASA>10) e estrutura de cristal (PDB: 2 HEV), que não incluiu os aminoácidos contribuindo para a estabilidade da estrutura, tal como a.a.
pertence a CRD3 & CRD4. Conforme mostrado na Tabela 15, existem oito posições hotspots para 1.134.9-u1-IgG1L. Tabela 14. Mudança de dobra normalizada de mutações do ponto OX40 sobre a ligação do anticorpo
1.134.9-u1-IgG1L Resíduo Mudança
DP OX40 de Dobra G 92 0,233 0,002 D 163 0,318 0,001 Y 72 0,384 0,003 N 88 0,429 0,004 S 159 0,458 0,002 A 164 0,470 0,005 G 70 0,511 0,012 T 100 0,557 0,032
F 133 0,627 0,005 P 115 0,632 0,006 V 106 0,662 0,001 T 145 0,675 0,001 D 104 0,692 0,001 E 94 0,716 0,002 N 138 0,730 0,004 N 146 0,730 0,001 G 151 0,742 0,003 T 113 0,784 0,003 T 105 0,787 0,004 Q 114 0,790 0,014 D 74 0,796 0,009 T 85 0,808 0,001 K 152 0,810 0,003 H 132 0,826 0,009 W 86 0,842 0,008 T 154 0,843 0,004 D 137 0,851 0,002 A 111 0,853 0,000 F 71 0,866 0,004 I 165 0,871 0,001 S 77 0,879 0,008 W 144 0,881 0,005 A 101 0,881 0,017 S 91 0,886 0,004 V 63 0,886 0,005 K 82 0,894 0,005 V 53 0,896 0,003 K 120 0,896 0,000 P 135 0,899 0,007 P 129 0,907 0,000 P 66 0,913 0,010 P 83 0,918 0,000 P 143 0,920 0,010 K 142 0,921 0,003 T 62 0,923 0,004 T 102 0,940 0,003 P 80 0,944 0,018 S 161 0,945 0,003 K 96 0,949 0,001 D 117 0,951 0,003 P 127 0,953 0,008 A 126 0,954 0,007 R 110 0,955 0,001
R 41 0,958 0,002 G 131 0,958 0,012 L 155 0,959 0,004 A 150 0,960 0,003 N 50 0,961 0,003 S 57 0,963 0,000 S 118 0,969 0,005 A 140 0,969 0,001 Q 156 0,970 0,001 Q 60 0,971 0,000 P 121 0,974 0,002 Q 103 0,974 0,001 R 55 0,976 0,001 M 52 0,977 0,005 Q 97 0,981 0,007 R 108 0,981 0,000 P 48 0,981 0,001 L 116 0,982 0,000 D 168 0,983 0,001 P 69 0,987 0,005 N 39 0,988 0,004 D 124 0,989 0,005 N 61 0,990 0,002 D 34 0,991 0,004 N 160 0,992 0,000 P 157 0,992 0,002 K 79 0,992 0,000 L 89 0,992 0,001 S 54 0,993 0,003 A 173 0,993 0,007 D 40 0,994 0,005 V 75 0,994 0,002 Y 119 0,995 0,002 R 95 0,996 0,003 R 65 0,996 0,001 S 38 0,997 0,002 H 153 0,997 0,001 S 162 0,998 0,004 E 167 0,998 0,007 G 68 0,998 0,002 Q 139 0,999 0,002 R 58 1,000 0,002 Y 36 1,000 0,003 G 33 1,000 0,007 T 148 1,000 0,006
R 169 1,001 0,001 V 123 1,001 0,006 L 149 1,002 0,006 H 44 1,002 0,001 S 59 1,002 0,002 S 78 1,002 0,004 R 47 1,002 0,001 L 29 1,003 0,006 P 37 1,006 0,002 H 30 1,007 0,005 D 170 1,012 0,002 R 90 1,012 0,002 P 130 1,013 0,003 V 32 1,014 0,006 A 158 1,014 0,002 L 98 1,015 0,002 P 172 1,016 0,004 P 171 1,016 0,003 V 76 1,019 0,002 T 35 1,021 0,001 E 45 1,024 0,001 a Mudança da dobra na ligação é relativa à ligação de várias substituições de alanina silenciosas Tabela 15. Oito posições hotspot para 1.134.9-u1-IgG1L
1.134.9-u1-IgG1L Resíduo Localização G 70 CRD2 Y 72 CRD2 N 88 CRD2 G 92 CRD2 E 94 CRD2 T 100 CRD2 D 104 CRD2
V 106 CRD2 Mudança de dobra de corte <0,75, SASA > 10.
[0478] Aqueles versados na técnica irão apreciar ainda que a presente invenção pode ser concretizada em outras formas específicas sem se afastar do espírito ou de seus atributos centrais. Pelo fato de que a descrição precedente da presente invenção descreve apenas modalidades exemplares da mesma, deve ser entendido que outras variações são contempladas como estando dentro do escopo da presente invenção. Consequentemente, a presente invenção não é limitada às modalidades particulares que foram descritas em detalhes aqui. Em vez disso, deve-se fazer referência às reivindicações anexas como indicativas do escopo e do conteúdo da invenção.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo isolado ou sua porção de ligação de antígeno, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno compreende: A) uma ou mais CDRs de cadeia pesada (CDRHs) selecionadas de pelo menos um do grupo consistindo em: (i) um CDRH1 com pelo menos 90% de identidade de sequência a um CDRH1 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 7, 13, 15, 21 e 27 ; (ii) um CDRH2 com pelo menos 90% de identidade de sequência a um CDRH2 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3, 9, 17, 23 e 29; e (iii) um CDRH3 com pelo menos 90% de identidade de sequência a um CDRH3 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 11, 19, 25 e 31; B) uma ou mais CDRs de cadeia Leve (CDRLs) selecionadas a partir de pelo menos um do grupo consistindo em: (i) um CDRL1 com pelo menos 90% de identidade de sequência a um CDRL1 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 8, 14, 16, 22 e 28; (ii) um CDRL2 com pelo menos 90% de identidade de sequência a um CDRL2 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 10, 18, 24 e 30; e (iii) um CDRL3 com pelo menos 90% de identidade de sequência a um CDRL3 como apresentado em uma das sequências selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 12 , 20, 26 e 32; ou C) um ou mais CDRHs de A) e um ou mais CDRLs de B).
    2. Anticorpo isolado ou sua porção de ligação de antígeno, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno compreende: A) uma ou mais CDRs de cadeia pesada (CDRHs) selecionadas de pelo menos um do grupo consistindo em: (i) um CDRH1 selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 7, 13, 15, 21 e 27, ou um CDRH1 que difere em sequência de aminoácidos do CDRH1 por adição de aminoácido, deleção ou substituição de não mais do que 2 aminoácidos; (ii) um CDRH2 selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3, 9, 17, 23 e 29, ou um CDRH2 que difere em sequência de aminoácidos da CDRH2 por adição de aminoácido, deleção ou substituição de não mais do que 2 aminoácidos; e (iii) um CDRH3 selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 11, 19, 25 e 31, ou um CDRH3 que difere em sequência de aminoácidos do CDRH3 por adição de aminoácido, deleção ou substituição de não mais do que 2 aminoácidos; B) uma ou mais CDRs de cadeia leve (CDRLs) selecionadas de pelo menos um do grupo consistindo em: (i) um CDRL1 selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 8, 14, 16, 22 e 28, ou um CDRL1 que difere em sequência de aminoácidos da CDRL1 por uma adição de aminoácido, deleção ou substituição de não mais do que 2 aminoácidos; (ii) um CDRL2 selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 10, 18, 24 e 30 ou um CDRL2 que difere em sequência de aminoácidos da CDRL2 por adição de aminoácido, deleção ou substituição de não mais do que 2 aminoácidos; e (iii) um CDRL3 selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 12, 20, 26 e 32, ou um CDRL3 que difere em sequência de aminoácidos da CDRL3 por adição de aminoácido, deleção ou substituição de não mais de não mais que 2 aminoácidos; ou C) um ou mais CDRHs de A) e um ou mais CDRLs de B).
    3. Anticorpo isolado ou sua porção de ligação de antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno compreende: (a) um CDRH1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 1; (b) um CDRH2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 3; (c) um CDRH3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 5; (d) um CDRL1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 2; (e) um CDRL2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 4; e (f) um CDRL3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 6.
    4. Anticorpo isolado ou sua porção de ligação de antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno compreende: (a) um CDRH1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 7; (b) um CDRH2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 9; (c) um CDRH3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 11; (d) um CDRL1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 8; (e) um CDRL2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 10; e (f) um CDRL3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 12.
    5. Anticorpo isolado ou sua porção de ligação de antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno compreende: (a) um CDRH1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 13; (b) um CDRH2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 9; (c) um CDRH3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 11; (d) um CDRL1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 14; (e) um CDRL2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 10; e (f) um CDRL3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 12.
    6. Anticorpo isolado ou sua porção de ligação de antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno compreende: (a) um CDRH1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 15; (b) um CDRH2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 17; (c) um CDRH3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 19; (d) um CDRL1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 16; (e) um CDRL2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 18; e (f) um CDRL3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 20.
    7. Anticorpo isolado ou sua porção de ligação de antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno compreende: (a) um CDRH1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 21; (b) um CDRH2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 23; (c) um CDRH3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 25; (d) um CDRL1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 22; (e) um CDRL2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 24; e (f) um CDRL3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 26.
    8. Anticorpo isolado ou sua porção de ligação de antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno compreende: (a) um CDRH1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 27; (b) Um CDRH2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 29; (c) um CDRH3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 31; (d) um CDRL1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 28; (e) um CDRL2 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 30; e (f) um CDRL3 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 32.
    9. Anticorpo isolado ou sua porção de ligação de antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno compreende: (A) uma região variável de cadeia pesada: (i) compreendendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41 e 43; (ii) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39 , 41 e 43; ou (iii) compreendendo uma sequência de aminoácidos com adição, deleção e/ou substituição de um ou mais aminoácidos comparados com a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41 e 43; e/ou (B) uma região variável de cadeia leve: (i) compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42 e 44; (ii) compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42 e 44; ou (iii) compreendendo uma sequência de aminoácidos com adição, deleção e/ou substituição de um ou mais aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42 e
    44.
    10. Anticorpo isolado ou sua porção de ligação de antígeno, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34; ou (b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:35 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36; ou (c) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:38; ou (d) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40; ou (e) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42; ou (f) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44.
    11. Anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno, de acordo com quaisquer das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que tem uma ou mais das seguintes propriedades: (a) ligação de OX40 humano com um KD de 1 x 10-8 M ou menos; (b) induzir produção de uma citocina (por exemplo, IL-2 ou IFN-γ) em células T CD4+; (c) intensificar a proliferação de células T CD4+ humanas primárias; (d) intensificar a proliferação de células efetoras T CD4+ humanas primárias na presença de células Treg; (e) ligação de OX40 humana ou de macacos rhesus respectivamente; ou (f) não ter reatividade cruzada a CD40, CD137 e CD271 humana.
    12. Anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno, de acordo com quaisquer das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, ou um anticorpo humanizado.
    13. Anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno, de acordo com quaisquer das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal completamente humano.
    14. Anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno, de acordo com quaisquer das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal completamente humano produzido por um animal mamífero transgênico.
    15. Anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno, de acordo com quaisquer das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal completamente humano produzido por um rato transgênico.
    16. Anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno, de acordo com quaisquer das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal completamente humano produzido por um rato transgênico com loci de imunoglobulina recombinante.
    17. Anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno, de acordo com quaisquer das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é fundido a uma região constante de uma IgG.
    18. Anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno, de acordo com quaisquer das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é fundido a uma região constante de uma IgG humana.
    19. Anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno, de acordo com quaisquer das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é fundido a uma região constante de uma IgG1 humana ou lgG4 humana.
    20. Anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno, de acordo com quaisquer das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se liga ao domínio CRD2 e/ou CRD3 de OX40.
    21. Anticorpo isolado ou sua porção de ligação de antígeno CARACTERIZADO pelo fato de que compete pela ligação do mesmo epítopo com o anticorpo isolado ou a sua porção de ligação de antígeno como definido em quaisquer das reivindicações precedentes.
    22. Molécula de ácido nucleico isolada CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada e/ou a região variável de cadeia leve do anticorpo isolado como definido em quaisquer das reivindicações 1-21.
    23. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADA pelo fato de que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo isolado como definido em quaisquer das reivindicações 1-21 e compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em: (A) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada como apresentado em SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41 ou 43; (B) uma sequência de ácido nucleico como apresentada em SEQ ID NO: 45, 47,49, 51, 53 ou 55 ; ou (C) uma sequência de ácido nucleico que hibridiza sob condições de alto rigor à fita complementar da sequência de ácido nucleico de (A) ou (B).
    24. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADA pelo fato de que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo isolado como definido em quaisquer das reivindicações 1-21 e compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em: (A) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada como apresentado em SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42 ou 44; (B) uma sequência de ácido nucleico como apresentada em SEQ ID NO: 46, 48, 50, 52, 54 ou 56 ; ou (C) uma sequência de ácido nucleico que hibridiza sob condições de alto rigor à fita complementar da sequência de ácido nucleico de (A) ou (B).
    25. Vetor CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definido em quaisquer das reivindicações 22-24.
    26. Célula hospedeira CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o vetor como definido na reivindicação 25.
    27. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende pelo menos um anticorpo ou porção de ligação antigênica do mesmo como definido em quaisquer das reivindicações 1-21 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
    28. Método para preparação de anticorpo ou sua porção de ligação de antígeno, de acordo com quaisquer das reivindicações 1-21, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: - expressar o anticorpo ou sua porção de ligação de antígeno como definido em quaisquer das reivindicações 1-21 na célula hospedeira da reivindicação 26; e - isolar o anticorpo ou sua porção de ligação de antígeno a partir da célula hospedeira.
    29. Método de modular uma resposta imune em um indivíduo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo o anticorpo ou sua porção de ligação de antígeno como definido em quaisquer das reivindicações 1-21 de modo que uma resposta imune é modulada no indivíduo.
    30. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que a proliferação de células T é melhorada no indivíduo.
    31. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que a proliferação induzida por anti-CD3 de células T CD4+ humanas primárias é melhorada no indivíduo.
    32. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que a proliferação de células efetoras T CD4+ humanas primárias na presença de células Treg é melhorada no indivíduo.
    33. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que a produção de citocina IFN-γ é aumentada.
    34. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que a produção de citocina IL-2 é aumentada.
    35. Método para o tratamento de crescimento anormal de células em um indivíduo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo ou porção de ligação antigênica do mesmo como definido em quaisquer das reivindicações 1-21 ou a composição farmacêutica da reivindicação 27 ao indivíduo.
    36. Método para prejudicar a função supressiva de células de Treg em um indivíduo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo ou sua porção de ligação de antígeno como definido em quaisquer das reivindicações 1-21 ou a composição farmacêutica da reivindicação 27 ao indivíduo.
    37. Método para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo ou sua porção de ligação de antígeno como definido em quaisquer das reivindicações 1-21 ou a composição farmacêutica da reivindicação 27 ao indivíduo.
    38. Método para redução de metástase de células tumorais em um indivíduo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo ou sua porção de ligação de antígeno como definido em quaisquer das reivindicações 1-21 ou a composição farmacêutica da reivindicação 27 ao indivíduo.
    39. Método para tratamento ou prevenção de doenças CARACTERIZADO pelo fato de que compreende distúrbios proliferativos (tais como cânceres), doenças autoimunes, doença inflamatória ou doenças infecciosas em um indivíduo, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo ou sua porção de ligação de antígeno como definido em quaisquer das reivindicações 1-21 ou a composição farmacêutica da reivindicação 27 ao indivíduo.
    40. Método, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é câncer sólido.
    41. Método, de acordo com a reivindicação 39 ou 40, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é câncer de cólon.
    42. Utilização do anticorpo ou sua porção de ligação de antígeno, de acordo com quaisquer das reivindicações 1-21, CARACTERIZADA pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para modular uma resposta imune em um indivíduo.
    43. Uso do anticorpo ou sua porção de ligação de antígeno, de acordo com quaisquer das reivindicações 1-21, CARACTERIZADO pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para o tratamento de crescimento anormal de células em um indivíduo.
    44. Uso do anticorpo ou sua porção de ligação de antígeno, de acordo com quaisquer das reivindicações 1-21, CARACTERIZADO pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo.
    45. Uso do anticorpo ou sua porção de ligação de antígeno, de acordo com quaisquer das reivindicações 1-21, CARACTERIZADO pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para reduzir a metástase de células tumorais em um indivíduo.
    46. Uso do anticorpo ou sua porção de ligação de antígeno, de acordo com quaisquer das reivindicações 1-21, CARACTERIZADO pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para tratamento ou prevenção de distúrbios proliferativos (tais como cânceres), doenças autoimunes, doença inflamatória ou doenças infecciosas.
    47. Uso do anticorpo ou sua porção de ligação de antígeno, de acordo com quaisquer das reivindicações 1-21, CARACTERIZADO pelo fato de que é para fabricação de um agente diagnóstico para diagnosticar distúrbios proliferativos (tais como cânceres), doenças autoimunes, doença inflamatória ou doenças infecciosas.
    48. Anticorpo ou sua porção de ligação de antígeno, de acordo com quaisquer das reivindicações 1-21, CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de distúrbios proliferativos (tais como cânceres), doenças autoimunes, doença inflamatória ou doenças infecciosas.
    49. Anticorpo ou sua porção de ligação de antígeno, de acordo com quaisquer das reivindicações 1-21, CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso no diagnóstico de distúrbios proliferativos (tais como cânceres), doenças autoimunes, doença inflamatória ou doenças infecciosas.
    50. Kit para tratamento ou diagnóstico de distúrbios proliferativos (tais como cânceres), doenças autoimunes, doença inflamatória ou doenças infecciosas CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um recipiente compreendendo pelo menos um anticorpo ou sua porção de ligação de antígeno como definido em quaisquer das reivindicações 1-21.
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