TW201945402A - 可誘導之嵌合細胞激素受體 - Google Patents
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Abstract
本發明提供對配位體(例如小分子或蛋白質)反應之可誘導之嵌合細胞激素受體,此類受體用於改良包含可誘導之嵌合細胞激素受體之經遺傳修飾之免疫細胞(諸如T細胞)之功能活性之用途,及包含此類細胞之組合物。
Description
本發明大體上係關於可誘導之嵌合細胞激素受體,其係併與免疫細胞(例如T細胞)使用以治療疾病。
嵌合抗原受體T (CAR-T)細胞已進入臨床且已證實極有前景的結果(Maus, M.等人,2014,Blood 123,2625-35)。儘管大多數個體已使用衍生自個體之自身T細胞的自體CAR-T細胞進行治療,但衍生自健康供體的同種異體CAR-T細胞提供更具商業可行性之現成選項,具有治療較寬廣範圍之個體之潛力。
藉由使來自健康供體的T細胞賦予由腫瘤相關抗原特異性活化的CAR來產生同種異體CAR-T細胞。不表現功能性TCR (例如,經剔除或敲低)的同種異體CAR-T細胞缺乏基礎TCR信號。基礎TCR信號增加持久性。TCR調動Ca2+
,最終導致NFAT及NFkB活化。儘管細胞激素可經STAT5增加持久性,但此不會再現天然TCR信號傳導。因此,需要改良同種異體CAR-T細胞持久性之組合物及方法。
本發明提供對配位體(例如,小分子或蛋白質)有反應的可誘導之嵌合細胞激素受體,此類受體用於改良經遺傳修飾之T細胞(例如,經基因修飾之抗原特異性T細胞,諸如嵌合抗原受體T (CAR-T)細胞)之功能性活性之用途,包含可誘導之嵌合細胞激素受體之細胞,及包含此類細胞之組合物。特定言之,本發明提供用於增強CAR-T細胞之治療功效之方法及組合物。
在一個態樣中,本發明提供可誘導之嵌合細胞激素受體,其包含:二聚化域;酪胺酸激酶活化域;及酪胺酸效應域。
在一些實施例中,酪胺酸激酶活化域包含蛋白質之(或衍生自其之)詹納斯激酶(JAK)結合域。在某些此等實施例中,酪胺酸激酶活化域還包含跨膜域。
在一些實施例中,酪胺酸激酶活化域包含受體酪胺酸激酶(RTK)之(或衍生自其之)酪胺酸激酶域。在某些此等實施例中,酪胺酸激酶活化域還包含跨膜域。
在一些實施例中,酪胺酸效應域包含至少一個受體之(或衍生自其之)STAT活化域。在一些實施例中,酪胺酸效應域包含兩種受體(或衍生自其之)至少兩個STAT活化域。在一些實施例中,酪胺酸效應域包含至少三個、四個或更多個受體之(或衍生自其之)STAT活化域。
在一些實施例中,酪胺酸效應域包含至少一種受體酪胺酸激酶(RTK)之(或衍生自其之)細胞質尾之一部分。
在一些實施例中,二聚化域結合至配位體,諸如AP1903、AP20187、二聚FK506、或二聚FK506樣類似物。
在一些實施例中,二聚化域包含FKBP多肽。在一些實施例中,FKBP多肽為FKBP12多肽。在一些實施例中,FKBP12多肽包含胺基酸取代F36V (SEQ ID NO.: 218)。
在一些實施例中,二聚化域包含選自由如下組成之群之胺基酸序列:(i)包含一或多個胺基酸取代之FKBP多肽,(ii)未經修飾之FKBP多肽之兩個或三個串聯重複序列,及(iii)包含一或多個胺基酸取代之FKBP多肽之兩個或三個串聯重複序列。
在一些實施例中,二聚化域包含選自SEQ ID NO.: 69-87之二聚化域序列。
在一些實施例中,二聚化域包含選自SEQ ID NO.: 69-73之FKBP二聚化域序列。
在一些實施例中,二聚化域包含多肽之(或衍生自其之)胺基酸序列,該多肽選自由如下組成之群:FKBP12、FKBP12 (F36V)、OX-40之胞外域及TNFR2超家族受體之胞外域。在示例性實施例中,TNFR2超家族受體為BCMA、TACI或BAFFR。
在一些實施例中,二聚化域係結合小分子。在示例性實施例中,小分子為AP1903、AP20187、二聚FK506、或二聚FK506樣類似物。在一些實施例中,二聚化域係結合蛋白質。
在一些實施例中,二聚化域包含蛋白質之(或衍生自其之)胺基酸序列,該蛋白質選自由如下組成之群:FKBP、親環素、類固醇結合蛋白、雌激素結合蛋白、糖皮質激素結合蛋白、維生素D結合蛋白、四環素結合蛋白、細胞激素受體之胞外域、受體酪胺酸激酶、TNFR家族受體及免疫輔受體。
在一些實施例中,衍化二聚化域的免疫輔受體係選自由如下組成之群:紅血球生成素受體、催乳素受體、生長激素受體、血小板生成素受體、粒細胞群落刺激因子受體、GP130、共同γ鏈受體、共同β鏈受體、IFNα受體、IFNγ受體、IFNλ受體、IL2/IL15受體、IL3受體、IL4受體、IL5受體、IL7受體、IL9受體、IL10受體、IL12受體、IL13受體、IL20受體、IL21受體、IL22受體、IL23受體、IL27受體、TSLP受體、G-CSF受體、GM-CSF受體、CNTF受體、OSM受體、LIF受體、CT-1受體、TGFBR1/ALKL5、TGFBR2、EGFR/HER1、ERBB2/HER2、ERBB3/HER3、ERRB4/HER4、INSR、IGF-1R、IRR、PDGFRA、PDGFRB、CSF-1R、KIT/SCFR、FLK2/FLT3、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4、CCK4、TRKA、TRKB、TRKC、MET、RON、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR1、DDR2、RET、ROS、LTK、ALK、ROR1、ROR2、MUSK、AATYK、AATYK2、AATYK3、RTK106、TNFR1、Fas、TRAILR1、TRAILR2、NGFR、DR3、DR6、EDAR、TNFR2、LTbR、OX40、CD40、CD27、CD30、4-1BB、RANK、Fn14、TACI、BAFFR、HVEM、BCMA、GITR、TROY、RELT、XEDAR、TRAILR3、TRAILR4、OPG、DcR3、PD-1、CD80、CD86、ICOS-L、ICOS、CTLA-4、BTLA、CD160、LAG3及TIM3。
在一些實施例中,酪胺酸激酶活化域包含受體之(或衍生自其之)JAK結合域。在一個示例性實施例中,受體為激素受體。
在一些實施例中,酪胺酸激酶活化域包含蛋白質或受體之(或衍生自其之)JAK結合域,該蛋白質或受體選自由EPOR、GP130、PRLR、GHR、GCSFR及TPOR/MPLR組成之群。
在一些實施例中,酪胺酸激酶活化域包含RTK之(或衍生自其之)酪胺酸激酶域,其中該RTK係選自由如下組成之群:EGFR/HER1、ERBB2/HER2、ERBB3/HER3、ERRB4/HER4、INSR、IGF-1R、IRR、PDGFRA、PDGFRB、CSF-1R、KIT/SCFR、FLK2/FLT3、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4、CCK4、TRKA、TRKB、TRKC、MET、RON、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR1、DDR2、RET、ROS、LTK、ALK、ROR1、ROR2、MUSK、AATYK、AATYK2、AATYK3及RTK106。在一個示例性實施例中,RTK為EGFR。
在一些實施例中,酪胺酸激酶活化域包含選自SEQ ID NO.: 88-133之酪胺酸激酶活化域序列。
在一些實施例中,存在於酪胺酸激酶活化域中的跨膜域包含蛋白質之(或衍生自其之)跨膜域,該蛋白質選自由如下組成之群:EPOR、GP130、PRLR、GHR、GCSFR、PD-1及TPOR/MPLR。
在一些實施例中,跨膜域包含衍生自TPOR/MPLR之跨膜域。在一些實施例中,跨膜域係衍生自SEQ ID NO.: 64之天然的TPOR/MPLR序列之胺基酸478-582。
在一些實施例中,跨膜域包含SEQ ID NO.: 64之天然的TPOR/MPLR序列之胺基酸區478-582的缺失變異體。在一些實施例中,缺失變異體包含SEQ ID NO.: 64之天然的TPOR/MPLR序列之胺基酸區478-582。在一些實施例中,缺失變異體包含從SEQ ID NO.: 64之天然的TPOR/MPLR序列之區域489-510缺失1至18個胺基酸。
在一些實施例中,跨膜域包含SEQ ID NO.: 64之天然的TPOR/MPLR之胺基酸區478-582之插入變異體。在一些實施例中,插入變異體包含在SEQ ID NO.: 64之天然的TPOR/MPLR之胺基酸478-582。在一些實施例中,插入變異體包含在SEQ ID NO.: 64之天然的TPOR/MPLR之胺基酸478-582。在示例性實施例中,插入於插入變異體中的胺基酸係選自由如下組成之群:白胺酸、纈胺酸及異白胺酸。
在一些實施例中,酪胺酸效應域包含受體之(或衍生自其之)至少一個STAT活化域。在一些實施例中,酪胺酸效應域包含兩種受體之(或衍生自其之)至少兩個STAT活化域。在一些實施例中,酪胺酸效應域包含至少三個、四個或更多個效應子之(或衍生自其之)STAT活化域。在一些實施例中,受體為激素受體及/或細胞激素受體。
在一些實施例中,酪胺酸效應域包含至少一個、兩個、三個、四個或更多個受體之(或衍生自其之)STAT活化域,其中該等受體係選自由如下組成之群:BLNK、IL2RG、EGFR、EpoR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNAR1/2、IFNLR1、IL10R1、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、IL2Rb、IL2small、IL7R、IL7Ra、IL9R、IL15R及IL21R。
在一些實施例中,酪胺酸效應域包含至少一個、兩個、三個、四個或更多個受體之(或衍生自其之)細胞尾(包含可經磷酸化的一或多個酪胺酸殘基之受體之細胞質尾之一部分),其中該受體為細胞激素受體、激素受體及/或RTK。
在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體包含二聚化域;酪胺酸激酶活化域,其包含跨膜域及JAK結合域;及酪胺酸效應域,其包含受體之(或衍生自其之)至少一個STAT活化域。在某些此等實施例中,酪胺酸效應域可包含至少兩個、三個、四個或更多個受體之(或衍生自其之)STAT活化域。
在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體包含二聚化域;酪胺酸激酶活化域,其包含跨膜域及JAK結合域;及酪胺酸效應域,其包含受體之(或衍生自其之)至少一個細胞尾。在某些此等實施例中,酪胺酸效應域可包含至少兩個、三個、四個或更多個受體之(或衍生自其之)細胞尾。
在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體包含含有FKBP多肽之二聚化域;含有跨膜域及JAK結合域之酪胺酸激酶活化域,其中該跨膜域包括選自由如下組成之群之蛋白質之(或衍生自其之)跨膜域:EPOR、GP130、PRLR、GHR、GCSFR、PD-1及TPOR,及該JAK結合域包括選自由如下組成之群之蛋白質之(或衍生自其之)JAK結合域:EPOR、GP130、PRLR、GHR、GCSFR及TPOR;及酪胺酸效應域,其包含受體之(或衍生自其之)至少一個STAT活化域,該受體選自由如下組成之群:BLNK、IL2RG、EGFR、EpoR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNAR1/2、IFNLR1、IL10R1、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、IL2Rb、IL2small、IL7R、IL7Ra、IL9R、IL15R及IL21R。在某些此等實施例中,酪胺酸效應域包含至少兩種、三種、四種或更多種受體之(或衍生自其之)STAT活化域。
在一些實施例中,酪胺酸效應域包含選自SEQ ID NO.: 134-176之酪胺酸效應域序列。
在一些實施例中,二聚化域位於可誘導之嵌合細胞激素受體的N端。
在一些實施例中,二聚化域位於可誘導之嵌合細胞激素受體的C端。
在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體包含膜靶向模體。在示例性實施例中,膜靶向模體包含肉豆蔻醯化模體。
在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體係經肉豆蔻醯基化。
在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體包含揭示於表2A或2B中之序列。在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體包含選自SEQ ID NO.: 1-58、187-215及225-311之序列。
在另一個態樣中,本發明提供多核苷酸,其包含編碼本文所述的可誘導之嵌合細胞激素受體的核酸序列。在另一個態樣中,本發明提供包含多核苷酸之表現載體。
在另一個態樣中,本發明提供工程化免疫細胞,其包含本文所揭示的至少一種可誘導之嵌合細胞激素受體。在一些實施例中,工程化免疫細胞包含至少兩種可誘導之嵌合細胞激素受體。在一些實施例中,工程化免疫細胞包含本文所揭示的至少三種或四種可誘導之嵌合細胞激素受體。當免疫細胞中存在超過一種可誘導之嵌合細胞激素受體時,每個受體之二聚化域、酪胺酸激酶活化域及酪胺酸效應域可相同或不同。
在另一個態樣中,本發明提供工程化免疫細胞,其包含編碼本文所揭示的可誘導之嵌合細胞激素受體之至少一個多核苷酸。
在一些實施例中,工程化免疫細胞還包含嵌合抗原受體(CAR)或編碼CAR之多核苷酸。
在一些實施例中,免疫細胞係選自由如下組成之群:T細胞、樹突細胞、殺手樹突細胞、肥大細胞、NK細胞、巨噬細胞、單核細胞及B細胞。
在一些實施例中,免疫細胞係衍生自幹細胞。在示例性實施例中,免疫細胞係衍生自成體幹細胞、非人類幹細胞、臍帶血幹細胞、祖細胞、骨髓幹細胞、誘導型多能幹細胞、全能幹細胞或造血幹細胞。
在一些實施例中,免疫細胞為T細胞。在一些實施例中,免疫細胞為自體T細胞。在一些實施例中,免疫細胞為同種異體T細胞。
在另一個態樣中,本發明提供一種調節個體中工程化免疫細胞之方法,該方法包括對個體投與配位體,該個體先前已投與本文所述的工程化免疫細胞,其中該二聚配位體結合至可誘導之嵌合細胞激素受體之二聚化域。在一個示例性實施例中,配位體為AP1903。
在另一個態樣中,本文提供一種製備工程化免疫細胞之方法,該方法包括將包含編碼可誘導之嵌合細胞激素受體的多核苷酸之多核苷酸或表現載體引入至免疫細胞中。在一個示例性實施例中,免疫細胞係選自由如下組成之群:T細胞、樹突細胞、殺手樹突細胞、肥大細胞、NK細胞、巨噬細胞、單核細胞、B細胞及衍生自乾細胞之免疫細胞。在一個示例性實施例中,免疫細胞為T細胞。
在另一個態樣中,本發明提供一種分離的免疫細胞,其包含:(i)至少一種可誘導之嵌合細胞激素受體,其包含如本文所揭示的二聚化域、酪胺酸激酶活化域及酪胺酸效應域;及(ii)嵌合抗原受體(CAR),其包含胞外配位體結合域、跨膜域及細胞內訊號域。
在一些實施例中,分離的免疫細胞包含至少兩種可誘導之嵌合細胞激素受體。在一些其他實施例中,分離的免疫細胞包含三種或四種可誘導之嵌合細胞激素受體。
在一些實施例中,本發明之分離的免疫細胞展示在與結合至二聚化域的配位體接觸後相對於不表現可誘導之嵌合細胞激素受體之分離的免疫細胞之持久性改良之持久性。
在一些實施例中,本發明之分離的免疫細胞展示在與結合至二聚化域之配位體接觸後相對於由不表現可誘導之嵌合細胞激素受體之分離的免疫細胞顯示之STAT之活化,增加之STAT之活化。在細胞中活化的STAT可為STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6或其組合。
在一些實施例中,與不表現可誘導之嵌合細胞激素受體的分離的免疫細胞所顯示的STAT之活化相比,在與結合至二聚化域的配位體接觸後,藉由本發明之分離的免疫細胞的STAT之活化隨著配位體之劑量而增加。
在一些實施例中,本發明之分離的免疫細胞展示與藉由不表現可誘導之嵌合細胞激素受體的分離的免疫細胞展示的細胞毒性相比,在與結合至二聚化域的配位體接觸後細胞毒性增加。
在一些實施例中,與不表現可誘導之嵌合細胞激素受體的分離的免疫細胞相比,本發明之分離的免疫細胞在與結合至二聚化域的配位體接觸後擴增。
在一些實施例中,本發明之分離的免疫細胞上幹細胞記憶(Tscm)及/或中樞記憶(Tcm)之細胞標記之水平在與結合至二聚化域的配位體接觸後與不表現可誘導之嵌合細胞激素受體的分離的免疫細胞上此等標記之水平相比增加或不變。
在一個態樣中,本文提供一種產生分離的免疫細胞之方法,該分離的免疫細胞包含本文所揭示的可誘導之嵌合細胞激素受體,該方法包括如下步驟:(a)提供免疫細胞;(b)將編碼包含胞外配位體結合域、跨膜域及細胞內訊號域之嵌合抗原受體(CAR)之多核苷酸引入至免疫細胞中;(c)將編碼可誘導之嵌合細胞激素受體之多核苷酸引入至免疫細胞中。
在一些實施例中,以上方法的步驟c)包括穩定地表現可誘導之嵌合細胞激素受體至細胞中。
在一些實施例中,在以上方法的步驟c)中,藉由轉位子/轉位酶系統、基於病毒之基因轉移系統或電穿孔將編碼可誘導之嵌合細胞激素受體之多核苷酸引入至細胞中。
在一些實施例中,在以上方法的步驟b)中,藉由轉位子/轉位酶系統或基於病毒之基因轉移系統將編碼嵌合抗原受體之多核苷酸引入至細胞中
在一些實施例中,基於病毒之基因轉移系統包含重組逆轉錄病毒或慢病毒。
在以上方法的一些實施例中,步驟(b)發生在步驟(c)之前或步驟(c)發生在步驟(b)之前。
在一個態樣中,本發明提供包含本文所述的分離的免疫細胞之醫藥組合物。
在一個態樣中,本發明提供一種用於治療個體之病症之方法,其中該方法包括投與包含本文所揭示的可誘導之細胞激素受體之分離的免疫細胞或投與包含此類免疫細胞之醫藥組合物。
在另一個態樣中,本發明提供本文所揭示的分離的免疫細胞或包含分離的免疫細胞之醫藥組合物用於治療病症之用途。
在一些實施例中,將細胞或醫藥組合物提供給個體不止一次。
在一些實施例中,將細胞或醫藥組合物以間隔至少約1、2、3、4、5、6、7或更多天提供給個體。
在一些實施例中,在投與分離的免疫細胞或醫藥組合物之前,個體先前已用治療劑進行治療。在一個示例性實施例中,治療劑為抗體或化療劑。
在一些實施例中,使用本發明方法治療的病症為病毒性疾病、細菌性疾病、癌症、發炎性疾病、免疫性疾病或老化相關疾病。癌症可為惡性血液病或實體癌症。
在一些實施例中,使用本發明方法治療的惡性血液病係選自急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性嗜伊紅血球性白血病(CEL)、骨髓發育不良症候群(MDS)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或多發性骨髓瘤(MM)。
在一些實施例中,使用本發明方法治療的實體癌症係選自膽管癌、膀胱癌、骨及軟組織癌、腦腫瘤、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸腺癌、結腸直腸癌、硬纖維瘤、胚胎癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、胃腺癌、多形性膠質母細胞瘤、婦科腫瘤、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、肺癌、惡性黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、胰臟管腺癌、原發性星形細胞瘤、原發性甲狀腺癌、前列腺癌、腎癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、睾丸生殖細胞腫瘤、尿路上皮細胞癌、子宮肉瘤或子宮癌。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2018年3月2日申請的美國臨時申請案第62/637,600號及2019年3月1日申請的國際申請案第PCT/US2019/020340號之優先權,其中各案之內容係以全文引用的方式併入本文中。
參考序列表
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本申請案通過EFS-Web以電子方式申請且包括呈.txt格式以電子方式提交之序列表。.txt檔案包含在2019年2月27日創建的名為「ALGN_016_01TW_SeqList_ST25」且大小為~814 KB之序列表。包含在該.txt檔案中的序列表係本說明書之部分且以全文引用的方式併入本文中。
本發明提供嵌合受體及其用於改良免疫細胞之活體內持久性及治療功效之用途。本文提供對配位體,諸如小分子(例如,AP1903)或蛋白質(例如,Epo、Tpo或PD-L1)敏感之受體。亦提供包含此類可誘導之嵌合細胞激素受體之細胞,包含此類細胞之組合物,及用於改良分離的T細胞(例如CAR-T細胞)之功能活性之方法。本文亦提供具有改良的持久性之CAR-T細胞、及使用此類CAR-T細胞治療病症之方法。
一般技術
一般技術
除非另有指示,否則本發明之實務將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術,此等技術係在此項技術範圍內。此類技術充分闡釋於文獻中,諸如,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等人,1989) Cold Spring Harbor Press;Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait編,1984);Methods in Molecular Biology,Humana Press;Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis編,1998) Academic Press;Animal Cell Culture (R.I. Freshney編,1987);Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather及P.E. Roberts,1998) Plenum Press;Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle、J.B. Griffiths及D.G. Newell編,1993-1998) J. Wiley及Sons;Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.);Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir及C.C. Blackwell編);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller及M.P. Calos編,1987);Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel等人編,1987);PCR: The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人編,1994);Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan等人編,1991);Short Protocols in Molecular Biology (Wiley及Sons,1999);Immunobiology (C.A. Janeway及P. Travers,1997);Antibodies (P. Finch,1997);Antibodies: a practical approach (D. Catty.編,IRL Press,1988-1989);Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd及C. Dean編,Oxford University Press,2000);Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow及D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999);The Antibodies (M. Zanetti及J.D. Capra編,Harwood Academic Publishers,1995)。
定義
定義
如本文所用,「自體」意指用於治療個體之源自該個體或源自人類白細胞抗原(HLA)相容供體之細胞、細胞系或細胞群。
如本文所用,「同種異體」意指用於治療個體的細胞或細胞群不係源自該個體而係源自供體。
如本文所用,術語「內源性」係指來自生物體、細胞、組織或系統或產生於其內部之任何材料。
如本文所用,術語「外源性」係指自生物體、細胞、組織或系統引入或產生於其外部之任何材料。
如本文所用,「免疫細胞」係指功能上參與先天性及/或適應性免疫反應之起始及/或執行之造血源細胞。免疫細胞之實例包括T細胞,例如,α/β T細胞及γ/δ T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T(NKT)細胞、不變NKT細胞、肥大細胞、骨髓衍生之吞噬細胞、樹突細胞、殺手樹突細胞、巨噬細胞及單核細胞。如本文所用,術語「免疫細胞」亦指衍生自(例如,但不限於)幹細胞之細胞。幹細胞可為成體幹細胞、非人類胚胎幹細胞,更特定言之非人類幹細胞、臍帶血幹細胞、祖細胞、骨髓幹細胞、誘導型多能幹細胞、全能幹細胞或造血幹細胞。
術語「多肽」、「寡肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用,係指任何長度之胺基酸鏈,較佳係相對短的鏈(例如10-100個胺基酸)以及包含約10-250、10-500、10-1000、50-200、50-500或50-1000個胺基酸之較長鏈。鏈可係直鏈或分支鏈,其可包含經修飾之胺基酸,且/或可間隔非胺基酸。該術語亦包括已天然修飾或藉由干預修飾之胺基酸鏈;例如,二硫鍵之形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或修飾,諸如與標記組分結合。該定義中亦包括(例如)包含胺基酸(包括(例如)非天然胺基酸等)之一或多種類似物之多肽以及本技術中已知的其他修飾。應明瞭,多肽可呈單鏈或相關鏈存在。
如本文所用,術語「表現」係指藉由啟動子驅動的特定核苷酸序列之轉錄及/或轉譯。
如本文所用,「表現載體」係指包含重組多核苷酸之載體,該重組多核苷酸包含可以操作方式連結至意欲表現之核苷酸序列的表現控制序列。表現載體包括本技術中已知的所有彼等,包括黏質體、質體(例如,裸露的或包含在脂質體中)及併入重組多核苷酸的病毒(例如,慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
如本文所用,「可以操作方式連接」係指單個核酸片段上核酸序列之締合,使得一個核酸序列之功能受另一個核酸序列影響。例如,當啟動子能夠影響編碼序列之表現時(即,編碼序列係在啟動子之轉錄控制下),該啟動子係可以操作方式連結至該編碼序列。
如本文所用,「表現控制序列」意指導引核酸之轉錄的核酸序列。表現控制序列可為啟動子(諸如組成型或可誘導之啟動子)或增強子。表現控制序列係可以操作方式連結至意欲轉錄之核酸序列。
「啟動子」及「啟動子序列」可互換使用且係指能夠控制編碼序列或功能性RNA之表現的DNA序列。通常,編碼序列係位於啟動子序列的3′。熟習此項技術者應明瞭,不同啟動子可導引基因在不同組織或細胞類型中、或在發育之不同階段、或回應於不同環境或生理條件之表現。
在本發明之任何載體中,載體視需要包含本文所揭示的啟動子。
「宿主細胞」包括單個細胞或細胞培養物,其可係或已係用於併入多核苷酸插入物之載體的接受者。宿主細胞包括單個宿主細胞之繼代,且由於天然、偶然或故意突變,該繼代可能不一定與原始親本細胞完全相同(在形態學或在基因組DNA補體方面)。宿主細胞包括用本發明之多核苷酸活體內轉染之細胞。
如本文所用,術語「胞外配位體結合域」係指能夠結合配位體的寡肽或多肽。較佳地,該域能夠將與細胞表面分子相互作用。例如,可選擇胞外配位體結合域以識別充作與特定疾病狀態相關之靶細胞上之細胞表面標記的配位體。
術語「莖域」或「鉸鏈域」在本文中可互換使用,係指用於將跨膜域連接至胞外配位體結合域的任何寡肽或多肽。特定言之,莖域係用於為胞外配位體結合域提供更大的靈活性及可接近性。
術語「細胞內訊號域」係指蛋白質之部分,其轉導效應子信號功能信號並導引細胞執行特定功能。
如本文所用,「共刺激分子」係指T細胞上之同源結合搭配物,其與共刺激配位體特異性結合,藉此介導細胞之共刺激反應,諸如(但不限於)增殖。共刺激分子包括(但不限於)MHC I類分子、BTLA及Toll配位體受體。共刺激分子之實例包括CD27、CD28、CD8、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、與淋巴細胞功能相關之抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及與CD83及類似特異性結合之配位體。
「共刺激配位體」係指抗原呈現細胞上之分子,其特異性結合T細胞上之同源共刺激信號分子,藉此提供除了藉由(例如)TCR/CD3複合體與加載有肽的MHC分子結合而提供的主要信號之外的信號,介導T細胞反應,包括(但不限於)增殖活化、分化及類似。共刺激配位體可包括(但不限於)CD7、B7-1(CD80)、B7-2 (CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可誘導之共刺激配位體(ICOS-L)、細胞內黏附分子(ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴細胞毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、結合Toll配位體受體之促效劑或抗體及與B7-H3特異性結合之配位體。共刺激配位體亦尤其包括與存在於T細胞上之共刺激分子特異性結合之抗體,諸如(但不限於)CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性結合之配位體。
「抗體」為能夠藉由位於免疫球蛋白分子之可變區中的至少一個抗原識別位點特異性結合至標靶(諸如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等)之免疫球蛋白分子。如本文所用,該術語不僅包括完整多株或單株抗體,而且包括其抗原結合片段(諸如Fab、Fab’、F(ab’)2
及Fv)、及包含抗原識別位點之免疫球蛋白分子之任何其他修飾組態,包括(例如,但不限於)單鏈(scFv)及域抗體(包括(例如)鯊魚及駱駝科抗體)、及包含抗體、抗體模擬物或提供特定蛋白質-蛋白質相互作用之任何蛋白質之融合蛋白。
如本文所用,術語抗體之「抗原結合片段」或「抗原結合部分」係指完整抗體之一或多個片段,其保留特異性結合至所給定抗原之能力。抗體之抗原結合功能可藉由完整抗體之片段執行。包含在術語抗體之「抗原結合片段」內的結合片段之實例包括Fab;Fab’;F(ab’)2
;由VH及CH1域組成之Fd片段;由抗體之單臂之VL及VH域組成之Fv片段;單域抗體(dAb)片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989)及分離的互補決定區(CDR)。
「優先地結合」或「特異性結合」(在本文中可互換使用)至標靶(例如,BCMA蛋白質)之抗體、抗體結合物或多肽為本技術中熟知的術語,及確定此種特異性或優先結合之方法亦係本技術中熟知的。若分子以比其與替代細胞或物質的反應或締合更頻繁地、更快速地、以持續時間更長地且/或以與特定細胞或物質的更強親和力地反應或締合,則稱該分子展現「特異性結合」或「優先結合」。若抗體以比其結合至其他物質的更大親和力、結合性、更容易地且/或以持續時間更長地結合,則該抗體「特異性結合」或「優先結合」至靶標。亦應明瞭,藉由閱讀該定義,例如,特異性或優先地結合至第一靶標之抗體(或部分或抗原決定基)可或可不特異性或優先地結合至第二靶標。因此,「特異性結合」或「優先結合」不一定需要(儘管其可包括)排他性結合。通常但不是必須地,提及結合意指優先結合。
如本技術中已知,如在本文中可互換使用的「多核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸之鏈,且包括DNA及RNA。核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基、及/或其類似物、或可藉由DNA或RNA聚合酶併入鏈中之任何受質。多核苷酸可包含經修飾之核苷酸,諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在,可在鏈之組裝之前或之後賦予對核苷酸結構之修飾。核苷酸之序列可間雜非核苷酸組分。可在聚合後(諸如)藉由與標記組分結合進一步修飾多核苷酸。其他類型之修飾包括(例如)「封端」、以類似物取代天然的核苷酸中之一或多者、核苷酸間修飾,諸如(例如)彼等具有不帶電荷之鍵結(例如,甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷醯胺酯、胺甲酸酯等)者及彼等具有帶電荷之鍵結(例如,硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)者、彼等包含側基部分(諸如(例如)蛋白質(例如,核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等))者、彼等具有嵌入劑(例如,吖啶、補骨脂素等)者、彼等包含螯合劑(例如,金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)者、彼等包含烷基化劑者、彼等具有經修飾之鏈結(例如,α變旋異構核酸等)者、以及多核苷酸之未修飾形式。此外,通常存在於糖中的任何羥基可(例如)經膦酸酯基、磷酸酯基置換,藉由標准保護基保護,或被活化以製備對額外核苷酸之額外鏈結,或可結合至固體擔體。5’及3’端OH可經磷酸化或經胺或1至20個碳原子之有機封端基部分取代。其他羥基亦可衍生為標准保護基。多核苷酸亦可包含本技術中通常已知的核糖或去氧核糖之類似形式,包括(例如)2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基、2’-氟-或2’-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-或β-變旋異構糖、差向異構糖,諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptulose)、非環狀類似物及無鹼基核苷類似物(諸如甲基核苷)。一或多個磷酸二酯鏈結可經替代性連接基置換。此等替代性連接基包括(但不限於)其中的磷酸酯經P(O)S(「硫代酸酯」)、P(S)S(「二硫代酸酯」)、(O)NR2
(「醯胺化物」)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2
(「甲縮醛」)置換之實施例,其中每個R或R’獨立地為H或視需要包含醚(-O-)鍵之經取代或未經取代之烷基(1-20個C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。並非多核苷酸中的所有鏈結均必須相同。前面描述適用於本文提及的所有多核苷酸,包括RNA及DNA。
如本文所用,「轉染」係指細胞攝取外源或異源RNA或DNA。當已將此種RNA或DNA引入細胞內時,該細胞已被外源或異源RNA或DNA「轉染」。當經轉染之RNA或DNA影響表型變化時,細胞已被外源或異源RNA或DNA「轉形」。可將轉形RNA或DNA整合(共價連接)至構成細胞基因組之染色體DNA中。
如本文所用,「轉形」係指將核酸片段轉移至宿主生物體之基因組中,導致遺傳上穩定之遺傳。包含經轉形之核酸片段之宿主生物體被稱為「轉殖基因」或「重組」或「經轉形」之生物體。
如本文所用,「實質上純」係指材料至少50%純度(即,不含污染物),更佳地,至少90%純度,更佳地,至少95%純度,又更佳地,至少98%純度,且最佳地,至少99%純度。
如本文所用,「治療」為用於獲得有益或所需的臨床結果之方法。出於本發明之目的,有益或所需的臨床結果包括(但不限於)如下中之一者或多者:減少腫瘤或癌細胞之增殖(或破壞腫瘤或癌細胞),抑制腫瘤細胞之轉移,縮小或減小腫瘤尺寸,消退疾病(例如,癌症),減少由疾病(例如,癌症)引起之症狀,提高彼等罹患疾病(例如,癌症)者之生活品質,減少治療疾病(例如,癌症)所需的其他藥物之劑量,延遲疾病(例如,癌症)之進展,治癒疾病(例如,癌症),及/或延長患有疾病(例如,癌症)的個體之生存期。
「改善」意指與不投與治療相比減輕或改良一或多種症狀。「改善」亦包括縮短或減少症狀之持續時間。
如本文所用,藥物、化合物或醫藥組合物之「有效劑量」或「有效量」為足以實現任何一種或多種有益或所需的結果之量。對於預防性使用,有益或所需的結果包括消除或降低風險,減輕嚴重度,或延遲疾病(包括疾病之生化、組織學及/或行為症狀、其併發症及出現於疾病發展中之中間病理表型)之開始。對於治療性用途,有益或所需的結果包括臨床結果,諸如降低各種疾病或病症(諸如(例如)癌症)之一或多種症狀之發生率或改善該一或多種症狀,減少治療疾病所需的其他藥物之劑量,增強另一種藥物之效果,及/或延遲疾病之進展。有效劑量可以一或多次投藥投與。出於本發明之目的,藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量為足以直接或間接完成預防性或治療性治療之量。如在臨床情況中所瞭解,藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量可或可不與另一種藥物、化合物或醫藥組合物結合來實現。因此,在投與一或多種治療劑之情況下可考慮「有效劑量」,且若與一或多種其他藥劑結合,單一藥劑可視作係以有效量給與,可出現所需的結果或實現所需的結果。
如本文所用,術語「個體」係指任何脊椎動物,包括(但不限於)人類及其他靈長類動物(例如,黑猩猩、食蟹獼猴及其他猿猴類)、農場動物(例如,牛、羊、豬、山羊及馬)、運動動物、寵物(包括家養哺乳動物,例如,狗及貓)、實驗室動物(例如,兔、囓齒動物(諸如小鼠、大鼠及天竺鼠))及鳥類(例如,家禽、野禽及獵禽,諸如雞、火雞及其他鶉雞、鴨、鵝及類似)。在一些實施例中,個體為哺乳動物。在示例性實施例中,個體為人類。
如本文所用,「載體」意指構築體,其能夠在宿主細胞中遞送,且較佳地表現所關注的一或多個基因或序列。載體之實例包括(但不限於)病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑相關的DNA或RNA表現載體、包封在脂質體中之DNA或RNA表現載體、及某些真核細胞(諸如生產細胞)。
如本文所用,「醫藥上可接受之載劑」或「醫藥上可接受之賦形劑」包括當與活性成分組合時允許該成分保留生物活性且不與個體免疫系統反應之任何材料。實例包括(但不限於)任何標準醫藥載劑,諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水乳液)及各種類型之潤濕劑。用於氣霧劑或非經腸投與之較佳稀釋劑為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或生理(0.9%)鹽水。包含此類載劑之組合物藉由熟知的習知方法來調配(參見,例如,Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,A. Gennaro編,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990;及Remington,The Science and Practice of Pharmacy第21版 Mack Publishing,2005)。
本文中提及「約」某一值或參數時包括(並描述)針對該值或參數本身之實施例。例如,提及「約X」之描述包括「X」之描述。數字範圍包括定義該範圍之數字。
應瞭解,在本文中用語句「包含」描述實施例的任何處,亦提供以「由...組成」及/或「基本上由...組成」描述之其他類似實施例。
在本發明之態樣或實施例係根據馬庫西群組(Markush groups)或其他替代物群組描述之處,本發明不僅包括作為整體列出的整個群組,但不包括各個組別之每個成員及主要群組之所有可能的子集,而且包括缺少群組成員中之一或多者之主要群組。本發明亦設想明確排除所主張發明中之任何群組成員中之一或多者。
除非另外定義,否則本文所用的所有技術及科學術語具有如熟習本發明所屬領域技術者通常所瞭解的相同含義。如果發生衝突,將由本說明書(包括定義)控制。在本說明書及申請專利範圍中,詞語「包括(comprise)」或變化形式(諸如「包括(comprises/comprising)」)將被理解為意指包括所關注的所述整數或整數組但不排除任何其他整數或整數組。除非上下文另有要求,否則單數術語應包括複數及複數術語應包括單數。
本文描述示例性方法及材料,然而,類似或等效於彼等本文所述者之方法及材料亦可用於本發明之實務或測試中。材料、方法及實例僅係說明性而非係限制性。
可誘導之嵌合細胞激素受體及改良之分離的免疫細胞
可誘導之嵌合細胞激素受體及改良之分離的免疫細胞
本文提供可誘導之嵌合細胞激素受體、包含此類受體之細胞、及包括此類細胞之方法。亦提供此類可誘導之嵌合細胞激素受體用於改良分離的免疫細胞(例如,分離的T細胞,諸如包含嵌合抗原受體(CAR)之分離的T細胞)之功能活性之用途。本文所提供的方法及組合物係可用於改良包含CAR之免疫細胞(諸如CAR-T細胞)之活體內及活體外持久性、細胞毒性、記憶表型及/或治療功效。
在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體以任何順序包含:二聚化域、酪胺酸激酶活化域及酪胺酸效應域。視需要地,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體可包括膜靶向模體。在包含可誘導之嵌合細胞激素受體之宿主細胞中本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之由配位體介導之二聚化誘導由受體介導之信號傳導事件。在一些實施例中,該信號傳導可導致改良之持久性。例如,在一個示例性實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體藉由配位體二聚化將活化JAK-STAT途徑且模擬由天然細胞激素受體誘導之信號傳導。「模擬」意指藉由本發明之可誘導之嵌合細胞激素受體活化的信號傳導級聯類似於藉由天然細胞激素受體活化的信號傳導級聯,而藉由本發明之嵌合細胞激素受體誘導的活化程度可不同於藉由天然細胞激素受體誘導的活化程度。例如,若本發明之可誘導之嵌合細胞激素受體及天然細胞激素受體均活化STAT轉錄因子;則可能的是,此兩種受體活化STAT之水平可係相似或不同。
可誘導之嵌合細胞激素受體之「二聚化域」可係可藉由可結合至二聚化域之配位體誘導二聚化或甚至三聚化或多聚化之任何胺基酸序列。因此,二聚化域為配位體結合域。在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之二聚化域可存在於細胞膜外部。在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體之二聚化域可存在於細胞膜內部。
在一些實施例中,結合至二聚化域之配位體為二聚配位體。例如,二聚化域可包含FK506結合蛋白(「FKBP」)之胺基酸序列。FKBP蛋白特異性結合至藥物FK506。為FK506之多聚類似物之配位體(即,包含FK506之至少兩個複本或其衍生物之配位體)可藉由配位體結合至第一蛋白及第二蛋白且藉此使得其等在一起誘導各包含FKBP之胺基酸序列之第一蛋白及第二蛋白之二聚化。第一蛋白及第二蛋白可係相同或不同。因此,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體可藉由將可誘導之嵌合細胞激素受體暴露至結合至可誘導之嵌合細胞激素受體之二聚化域之適宜二聚配位體而誘導二聚化。
在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之二聚化域可包含(例如)FKBP、親環素、類固醇結合蛋白、雌激素結合蛋白、糖皮質激素結合蛋白、維生素D結合蛋白或四環素結合蛋白之(或衍生自其之)胺基酸序列。如本文所用,「FKBP多肽」、「親環素多肽」或類似係指具有各別蛋白質之胺基酸序列或其部分或變異體之多肽,其中其部分或變異體保留以高親和力結合至對應之配位體(例如,就FKBP多肽而言,配位體FK506及相關分子)的能力。
在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之二聚化域可包含細胞激素受體之胞外域之(或衍生自其之)胺基酸序列,該等細胞激素受體諸如(例如,但不限於):紅血球生成素受體、催乳素受體、生長激素受體、血小板生成素受體、粒細胞群落刺激因子受體、GP130、共同γ鏈受體、共同β鏈受體、IFNα受體、IFNγ受體、IFNλ受體、IL2/IL15受體、IL3受體、IL4受體、IL5受體、IL7受體、IL9受體、IL10受體、IL12受體、IL13受體、IL20受體、IL21受體、IL22受體、IL23受體、IL27受體、TSLP受體、G-CSF受體、GM-CSF受體、CNTF受體、OSM受體、LIF受體、CT-1受體、TGFBR1/ALKL5及TGFBR2。在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之二聚化域可包含受體酪胺酸激酶(RTK)之胞外域之(或衍生自其之)胺基酸序列,該受體酪胺酸激酶(RTK)諸如:EGFR/HER1、ERBB2/HER2、ERBB3/HER3、ERRB4/HER4、INSR、IGF-1R、IRR、PDGFRA、PDGFRB、CSF-1R、KIT/SCFR、FLK2/FLT3、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4、CCK4、TRKA、TRKB、TRKC、MET、RON、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR1、DDR2、RET、ROS、LTK、ALK、ROR1、ROR2、MUSK、AATYK、AATYK2、AATYK3及RTK106。細胞激素受體及RTK之胞外域可藉由對應之配位體或促效劑(例如,就血小板生成素受體多肽而言,對應之配位體包括(例如)TPO、艾曲波帕(eltrombopag)及相關分子)二聚化。
在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之二聚化域可包含(例如) TNFR家族受體之胞外域之(或衍生自其之)胺基酸序列,該等TNFR家族受體諸如:TNFR1、Fas、TRAILR1、TRAILR2、NGFR、DR3、DR6、EDAR、TNFR2、LTbR、OX40、CD40、CD27、CD30、4-1BB、RANK、Fn14、TACI、BAFFR、HVEM、BCMA、GITR、TROY、RELT、XEDAR、TRAILR3、TRAILR4、OPG、DcR3。TNFR家族受體之胞外域在結合至三聚TNFR配位體結合後多聚化。衍生自TNFR家族受體(包含BCMA胞外域)之示例性二聚化域胺基酸序列為:MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNA (SEQ ID NO: 216)。在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之二聚化域可包含或衍生自(例如)諸如以下之免疫輔受體或配位體之胞外域之(或衍生自其之)胺基酸序列:PD-1、CD80、CD86、ICOS-L、ICOS、CTLA-4、BTLA、CD160、LAG3或TIM3。免疫輔受體之胞外域在結合呈現對應之配位體之細胞後聚集。衍生自免疫輔受體(包含胞外PD-1)之示例性二聚化域胺基酸序列為:MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV (SEQ ID NO: 217)。
在一些實施例中,二聚化域可包含FKBP多肽胺基酸序列。FKBP為具有脯胺醯基異構酶活性且結合至藥物FK506及其他相關藥物之一組蛋白質。
視需要地,FKBP可為人類FKBP12 (亦稱為FKBP1A;GenBank: CAG46965.1)。視需要地,FKBP12多肽可包含F36V突變。包含F36V突變之FKBP12以高親和力結合至二聚配位體AP1903(Jemal, A.等人,CA Cancer J. Clinic. 58,71-96(2008);Scher, H. I.及Kelly, W. K.,Journal of Clinical Oncology 11,1566-72 (1993))。此外,包含F36V突變之FKBP12以比野生型FKBP12結合AP1903高得多的親和力結合至AP1903。
示例性二聚化域胺基酸序列(包含具有F36V突變之FKBP12多肽)為:GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLES (SEQ ID NO: 218)。
在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體之二聚化域可包含FKBP之胺基酸序列,該FKBP包含選自由如下組成之群之修飾:(i)包含一或多個胺基酸取代之FKBP多肽,(ii)未經修飾之(天然的)FKBP胺基酸序列之兩個或三個串聯重複序列,及(iii)包含一或多個胺基酸取代之FKBP多肽之兩個或三個串聯重複序列。在一些實施例中,FKBP蛋白為人類FKBP蛋白(GenBank: CAG46965.1)及對本文所述的FKBP之修飾係對人類FKBP蛋白進行。在一些實施例中,FKBP中之一或多個胺基酸取代包括如下中之一或多者:F36V、L106P、E31G、R71G及K105E、參考人類FKBP蛋白之殘基(GenBank: CAG46965.1)。在該等實施例中,在二聚化域包含本文所揭示的二聚化域序列之兩個或三個串聯重複序列之情況下,每個重複序列可包含該序列之不同突變。例如,在一個示例性實施例中,二聚化域包含FKBP序列之三個串聯重複序列,其中該等重複序列中之一者包含天然FKBP序列,第二重複序列包含包含F36V取代之FKBP,及第三重複序列包含以任何順序包含F36V及L106P取代之FKBP。
在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體之二聚化域可包含FKBP之胺基酸序列,該FKBP包含選自由如下組成之群之修飾:(i) 包含F36V取代之FKBP多肽,(ii) 包含F36V及L106P取代之FKBP多肽,(iii) 包含E31G、F36V、R71G及K105E取代之FKBP多肽,及(iv) 任何此等FKBP多肽之兩個或三個串聯重複序列。
在一些實施例中,二聚化域可為親環素多肽胺基酸序列。親環素為結合至環孢素(環孢菌素A)之蛋白質。親環素包括(例如)親環素A及親環素D。
在一些實施例中,二聚化域可具有揭示於美國專利第9434935號中之配位體結合區之任何特徵,該案係針對所有目的以引用的方式併入本文中。
在一些實施例中,本發明之可誘導之嵌合細胞激素受體之二聚化域可包含選自由如下組成之群之多肽之(或衍生自其之)胺基酸序列:FKBP12 (F36V)、OX-40之胞外域、及TNFR2超家族受體之胞外域(例如,BCMA、TACI、BAFFR)。
在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之二聚化域包含揭示於表1B中之二聚化域胺基酸序列。
如本文所用,「二聚」配位體可視需要包含適宜結合分子之超過兩個複本(即配位體可係多聚);然而,基於此類配位體二聚化對應之結合分子之能力,如本文所用,此類配位體仍可被認為係「二聚」。類似地,在一些實施例中,如本文所提供的二聚化域可能能夠支持多聚化(例如,在相同分子中提供二聚化域之多個複本之情況下);然而,基於此種域二聚化之能力,如本文所用,此種域亦仍可被認為係「二聚化域」。通常,凋亡蛋白酶-9信號傳導可在凋亡蛋白酶-9分子之二聚化後有效地誘導(即不需要三聚化或其他多聚化)。此外,除非上下文另有明確說明,否則本文提及「配位體」係指二聚配位體(例如,當提及誘導本文所提供的嵌合凋亡蛋白酶-9蛋白之二聚化之「配位體」時)。
如本文所用,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸激酶活化域可包含RTK之跨膜域,接著係詹納斯激酶(JAK)結合域或酪胺酸激酶。JAK及RTK激酶藉由多聚化活化。JAK包括JAK1、JAK2、JAK3及TYK2,且結合至由Box 1及Box 2模體組成之近膜模體。活化JAK2激酶(包含紅血球生成素受體跨膜、Box 1及Box 2模體)之示例性酪胺酸激酶活化域胺基酸序列為:SEPVSGPTPSDLDPLILTLSLILVVILVLLTVLALLSHRRALKQKIWPGIPSPESEFEGLFTTHKGNFQLWLYQNDGCLWWSPCTPFTEDPPASLEVLSERC (SEQ ID NO: 219)。在一些實施例中,跨膜域可含有減少配位體非依賴性二聚化的突變。
在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸激酶活化域包含蛋白質之(或衍生自其之)JAK結合域。在一些實施例中,蛋白質為受體。在一些實施例中,蛋白質為激素受體或細胞激素受體。
在一些實施例中,酪胺酸激酶活化域包含蛋白質之(或衍生自其之)JAK結合域,該蛋白質選自由如下組成之群:催乳素受體(PRLR)、生長激素受體(GHR)、血小板生成素受體/骨髓增生性白血病蛋白受體(TPOR/MPLR)、紅血球生成素受體(EPOR)、粒細胞群落刺激因子受體(GCSFR)或GP130。術語「衍生自」意指對天然序列進行一或多個修飾。例如,可僅使用天然序列之一部分,或可修飾天然序列以包含取代、插入及/或缺失突變、或此等修飾之組合。在一些實施例中,JAK結合域包含TPOR或EPOR之(或衍生自其之)JAK結合域。
在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸激酶活化域包含蛋白質之(或衍生自其之)跨膜域,該蛋白質選自由如下組成之群:PRLR、GHR、TPOR/MPLR、EPOR、GCSFR及GP130。
在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸激酶活化域包含PD-1之(或衍生自其之)跨膜域。在此等實施例中,酪胺酸激酶活化域還包含如本文所述之受體之(或衍生自其之)JAK結合域或酪胺酸激酶域。
在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸激酶活化域包含跨膜域及JAK結合域或跨膜域及酪胺酸激酶域,其中該跨膜域係衍生自細胞激素/激素受體(例如,TpoR)、單體化細胞激素/激素受體(例如,EpoR L241G L242P)、或單體受體(例如,PD1)。如本文所用,「單體化細胞激素/激素受體」係指細胞激素受體或激素受體,其為呈天然形式之同源二聚物或異二聚物,但係經突變以呈單體受體存在。
在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸激酶活化域包含TPOR/MPLR之(或衍生自其之)跨膜域。天然的TPOR/MPLR之示例性全長序列顯示於表1A中(SEQ ID NO.: 64)。在一些實施例中,酪胺酸激酶活化域包含顯示於表1A中之TPOR/MPLR序列之(或衍生自其之)跨膜域。例如,在一些實施例中,酪胺酸激酶活化域包含顯示於表1A中之TPOR/MPLR之胺基酸478-582 (該序列亦以「TPOR/MPLR (478-582) (野生型序列)」顯示於表1C中)。
在一些其他實施例中,酪胺酸激酶活化域包含顯示於表1A中的衍生自TPOR/MPLR之胺基酸478-582之序列。在此等實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸激酶活化域包含衍生自顯示於表1A中之TPOR/MPLR之胺基酸478-582之序列,其中該序列包含選自由如下組成之群之一或多個突變:取代、缺失、插入及其組合。在一個示例性實施例中,酪胺酸激酶活化域包含顯示於表1A中之TPOR/MPLR之胺基酸序列478-582之缺失變異體。在一些實施例中,缺失變異體包括自顯示於表1A中之TPOR/MPLR之區域478-582缺失1個、1至20個、1至19個、1至18個、1至17個、1至16個、1至15個、1至14個、1至13個、1至12、1至11個、1至10個、1至9個、1至8個、1至7個、1至6個、1至5個、1至4個、1至3個、1至2個胺基酸。在一些實施例中,缺失變異體包括自顯示於表1A中之TPOR/MPLR之區域489-510缺失1個、1至20個、1至19個、1至18個、1至17個、1至16個、1至15個、1至14個、1至13個、1至12、1至11個、1至10個、1至9個、1至8個、1至7個、1至6個、1至5個、1至4個、1至3個、1至2個胺基酸。在一個示例性實施例中,酪胺酸激酶活化域包含顯示於表1C中之TPOR/MPLR之胺基酸序列478-582之缺失變異體。
在一些實施例中,酪胺酸激酶活化域包含顯示於表1A中之TPOR/MPLR之胺基酸序列478-582之插入變異體。在一些實施例中,插入變異體包含在顯示於表1A中之TPOR/MPLR之區域478-582中插入1個、1至10個、1至9個、1至8個、1至7個、1至6個、1至5個、1至4個、1至3個、1至2個胺基酸。在一個示例性實施例中,酪胺酸激酶活化域包含顯示於表1C中之TPOR/MPLR之胺基酸序列478-582之插入變異體。在一些實施例中,插入至插入變異體中之胺基酸係選自由如下組成之群:白胺酸、纈胺酸及異白胺酸。
在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸激酶活化域包含衍生自顯示於表1A中之TPOR/MPLR之胺基酸478-582之序列,其中該序列包含該區域中胺基酸之缺失及插入之組合。在一個示例性實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸激酶活化域包含衍生自顯示於表1A中之TPOR/MPLR之胺基酸478-582之序列,其中該序列包含自區域478-582缺失1至18個胺基酸及在區域478-582中插入1至8個胺基酸。在另一個示例性實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸激酶活化域包含衍生自顯示於表1A中之TPOR/MPLR之胺基酸489-510之序列,其中該序列包含自區域489-510缺失1至18個胺基酸及在區域489-510中插入1至8個胺基酸。在一些實施例中,插入至插入變異體中之胺基酸係選自由如下組成之群:白胺酸、纈胺酸及異白胺酸。
在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸激酶活化域包含揭示於表1C中之序列。
在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸激酶活化域包含缺失及/或插入PRLR、GHR、EPOR、GCSFR或GP130之跨膜域之變異體。表1A中揭示天然的PRLR、GHR、EPOR、GCSFR及GP130之示例性全長序列及其登錄號。根據本發明,可定位PRLR、GHR、EPOR、GCSFR及GP130之跨膜域及可製備此等跨膜域之插入及/或缺失變異體。
在一些實施例中,酪胺酸激酶活化域之跨膜及/或JAK結合域可衍生自(例如)共同γ鏈受體、共同β鏈受體、IFNα受體(IFNAR)、IFNγ受體(IFNGR)、IFNλ受體(IFNLR)、IL2/IL15受體(IL2R/IL15R)、IL3受體(IL3R)、IL4受體(IL4R)、IL5受體(IL5R)、IL7受體(IL7R)、IL9受體( IL9R),IL10受體(IL10R)、IL12受體(IL12R)、IL13受體(IL13R)、IL20受體(IL20R)、IL21受體(IL21R)、IL22受體(IL22R)、IL23受體(IL23R)、IL27受體(IL27R)、TSLP受體(TSLPR)、G-CSF受體(GCSFR)、GM-CSF受體(GMCSFR)、CNTF受體(CNTFR)、OSM受體(OSMR)、LIF受體(LIFR)或CT-1受體(CT1R)。
在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸激酶活化域包含受體酪胺酸激酶(RTK)之(或衍生自其之)酪胺酸激酶域。來自活化RTK激酶之RTK的示例性酪胺酸激酶活化域(包含表皮生長因子受體跨膜及激酶域)為:GLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYL (SEQ ID NO: 220)。在一些實施例中,酪胺酸激酶活化域包含衍生自其他RTK之跨膜域及酪胺酸激酶域,該其他RTK諸如(例如)如下:EGFR/HER1、ERBB2/HER2、ERBB3/HER3、ERRB4/HER4、INSR、IGF-1R、IRR、PDGFRA、PDGFRB、CSF-1R、KIT/SCFR、FLK2/FLT3、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4、CCK4、TRKA、TRKB、TRKC、MET、RON、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR1、DDR2、RET、ROS、LTK、ALK、ROR1、ROR2、MUSK、AATYK、AATYK2、AATYK3或RTK106。
在一些實施例中,酪胺酸激酶活化域包含EGFR之(或衍生自其之)酪胺酸激酶域。
在一些實施例中,酪胺酸激酶活化域包含揭示於表1B中之酪胺酸激酶活化域序列。
在一些實施例中,酪胺酸效應域可含有至少一種受體之細胞質尾(細胞尾)之一部分,該至少一種受體諸如:細胞激素受體、激素受體、或RTK、或酪胺酸激酶轉接蛋白。如本文所使用的「細胞尾」為包含一或多個酪胺酸殘基之部分,該一或多個酪胺酸殘基能夠在活化後被激酶磷酸化。於細胞尾或轉接蛋白內的酪胺酸被經活化之酪胺酸激酶磷酸化。經磷酸化之酪胺酸模體募集信號轉導因子。來自細胞激素受體(包含IL2Rb遠端細胞尾) 之示例性酪胺酸效應域胺基酸序列為:VTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV (SEQ ID NO: 221)。
某些受體(諸如細胞激素受體及激素受體)之細胞質包含STAT活化域(在本文中亦可稱為STAT結合域)。在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸效應域包含受體之(或衍生自其之)至少一個STAT活化域。在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸效應域包含兩種、三種、四種或更多種受體之(或衍生自其之)至少兩個、三個、四個或更多個STAT活化域。受體可為細胞激素受體及/或激素受體。
在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸效應域包含至少一種、兩種、三種、四種或更多種受體(例如,細胞激素受體、激素受體或RTK)或酪胺酸激酶轉接蛋白之(或衍生自其之)細胞尾(包含能夠被激酶磷酸化之一或多個酪胺酸殘基之細胞質尾之一部分)。在一個示例性實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸效應域包含細胞激素受體之(或衍生自其之)細胞尾及激素受體之(或衍生自其之)細胞尾。在另一個示例性實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸效應域包含細胞激素受體之(或衍生自其之)細胞尾及RTK之(或衍生自其之)尾。在又另一個示例性實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸效應域包含激素受體之(或衍生自其之)細胞尾及RTK之(或衍生自其之)細胞尾。在又另一個示例性實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸效應域包含激素受體之(或衍生自其之)細胞尾;RTK之(或衍生自其之)細胞尾;及細胞激素受體之(或衍生自其之)細胞尾。涵蓋其中細胞尾中之至少一者包含酪胺酸激酶轉接蛋白之含可磷酸化之酪胺酸之部分的細胞尾之類似組合。當可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸效應域包含超過一個細胞尾時,該等細胞尾可以任何順序存在。
在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸效應域包含兩個細胞激素受體之(或衍生自其之)STAT活化域。在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸效應域包含選自由如下組成之群之至少一個受體之(或衍生自其之)STAT活化域:BLNK (B-細胞連接蛋白)、IL2RG、EGFR、EpoR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNAR1/2、IFNLR1、IL10R1、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、IL2Rb、IL2small、IL7R、IL7Ra、IL9R、IL15R及IL21R。當酪胺酸效應域包含超過一個STAT活化域時,該等STAT活化域係串聯的,其中一個域係膜近端的及其他域係膜遠端的。
在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸效應域包含第一受體之(或衍生自其之)細胞尾,該第一受體選自由如下組成之群:BLNK、IL2RG、EGFR、EpoR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNAR1/2、IFNLR1、IL10R1、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、IL2Rb、IL2small、IL7R、IL7Ra、IL9R、IL15R及IL21R,及第二受體之(或衍生自其之)細胞尾,該第二受體選自由如下組成之群:BLNK、IL2RG、EGFR、EpoR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNAR1/2、IFNLR1、IL10R1、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、IL2Rb、IL2small、IL7R、IL7Ra、IL9R、IL15R及IL21R。在此等實施例中,來自第一受體之細胞尾可係膜近端的及來自第二受體之細胞尾可係膜遠端的,或反之亦然。本發明涵蓋其中可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸效應域包含超過兩個(諸如三個、四個或更多個)來自該段落中所述的受體之細胞質之類似實施例。
在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸效應域包含揭示於表1B中之至少一個酪胺酸效應域序列。在一些實施例中,酪胺酸效應域包含揭示於表1B中之至少兩個酪胺酸效應域序列。當存在揭示於表1B中之超過一個酪胺酸效應域序列時,任何序列可係膜近端的及其他序列可係膜遠端的。
在一些實施例中,酪胺酸效應域包含來自諸如以下之細胞激素受體之細胞尾之序列:共同γ鏈受體、共同β鏈受體、IFNα受體、IFNγ受體、IFNλ受體、IL2/IL15受體、IL3受體、IL4受體、IL5受體、IL7受體、IL9受體、IL10受體、IL12受體、IL13受體、IL20受體、IL21受體、IL22受體、IL23受體、IL27受體、TSLP受體、G-CSF受體、GM-CSF受體、CNTF受體、OSM受體、LIF受體、CT-1受體、紅血球生成素受體、生長激素受體、催乳素受體、血小板生成素受體或GP130。來自RTK (包含EGFR遠端細胞尾)之示例性酪胺酸效應域胺基酸序列為:VIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA (SEQ ID NO: 222)。在一些實施例中,酪胺酸效應域包含來自諸如以下之RTK之細胞尾之序列:GFR/HER1、ERBB2/HER2、ERBB3/HER3、ERRB4/HER4、INSR、IGF-1R、IRR、PDGFRA、PDGFRB、CSF-1R、KIT/SCFR、FLK2/FLT3、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4、CCK4、TRKA、TRKB、TRKC、MET、RON、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR1、DDR2、RET、ROS、LTK、ALK、ROR1、ROR2、MUSK、AATYK、AATYK2、AATYK3或RTK106。來自酪胺酸激酶轉接蛋白(包含BLNK酪胺酸域)之示例性酪胺酸效應域胺基酸序列為:ASESPADEEEQWSDDFDSDYENPDEHSDSEMYVMPAEENADDSYEPPPVEQETRPVHPALPFARGEYIDNRSSQRHSPPFSKTLPSKPSWPSEKARLTSTLPALTALQKPQVPPKPKGLLEDEADYVVPVEDNDENYIHPTESSSPPPEKAPMVNR (SEQ ID NO: 223)。在一些實施例中,酪胺酸效應域包含來自或結合至諸如以下之轉接蛋白之序列:ALX、BLNK、Grb7、Nsp、SLP-76、SOCS、TSAd、APS、Bam32、Crk、Gads、Grb2、Nck、SLAP、Shc、FRS2、Dab、Dok、IRS、eps8、AFAP110、Gab、ADAP、Carma1、Cas、CIN85、Cortactin、E3B1、Vinexin、SKAP-55、BANK、BCAP、Dof、Paxillin、LAT、LAX、LIME、NTAL、PAG、SIT或者TRIM。
在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之酪胺酸效應域可包含來自一或多個細胞激素受體、RTK及/或轉接蛋白之序列。在一些實施例中,該等序列可係串聯的。在一些實施例中,酪胺酸效應域可包含(例如)來自細胞激素受體、RTK或酪胺酸激酶轉接蛋白之較短的含酪胺酸肽。在一些實施例中,酪胺酸效應域可係能夠結合包括(例如)以下之一或多種蛋白質之合成序列:磷光體-酪胺酸結合蛋白(PTB)域、Src同源性2 (SH2)域、C2域及/或Src同源性3(SH3)域。
在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體包含二聚化域;包含跨膜域及JAK結合域之酪胺酸激酶活化域;及包含至少一個受體之(或衍生自其之)STAT活化域之酪胺酸效應域。在一些此等實施例中,二聚化域包含FKBP多肽;跨膜域包括蛋白質之(或衍生自其之)跨膜域,該蛋白質選自由如下組成之群:EPOR、GP130、PRLR、GHR、GCSFR、PD-1及TPOR;JAK結合域包含蛋白質之(或衍生自其之)JAK結合域,該蛋白質選自由如下組成之群:EPOR、GP130、PRLR、GHR、GCSFR及TPOR;及STAT活化域包括至少一種受體之(或衍生自其之)STAT活化域,該至少一種受體選自由如下組成之群:BLNK、IL2RG、EGFR、EpoR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNAR1/2、IFNLR1、IL10R1、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、IL2Rb、IL2small、IL7R、IL7Ra、IL9R、IL15R及IL21R。
在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體包含選自表1B之二聚化域、選自表1B或表1C之酪胺酸激酶活化域及選自表1B之酪胺酸效應域。
在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體包含選自表2A或表2B之序列。在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體包含選自SEQ ID NO.: 1-58、187-215及225-311之序列。
表1A提供本發明中提供的天然的受體之示例性全長序列,自該等天然的受體衍生得跨膜蛋白。表1A中提供的序列為參考序列,與該等參考序列有關的後來突變表示於(例如)表1B及1C中。
表1A :示例性的天然的受體
表1A :示例性的天然的受體
可用於本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體中之示例性胺基酸序列示於表1B中。
表1B
表1B
可用於本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體中之TPOR/MPLR(或衍生自其之)示例性跨膜及JAK結合序列示於表1C中。
表1C
表1C
在另一個態樣中,本文提供分離的免疫細胞,其包含本文所揭示的一或多種可誘導之嵌合細胞激素受體。在其他實施例中,本文所提供的分離的免疫細胞包含(i)本文所揭示的一或多種可誘導之嵌合細胞激素受體及(ii)嵌合抗原受體(CAR)。有利地,相對於不表現可誘導之嵌合細胞激素受體之細胞,本文所提供的分離的免疫細胞展示在與結合至二聚化域之配位體接觸後改良之持久性。在一些實施例中,相對於不表現可誘導之嵌合細胞激素受體之細胞,本文所提供的分離的免疫細胞展示在與結合至二聚化域之配位體接觸後改良之細胞毒性、增加之擴增及/或增加之記憶表型標記水平。藉由包含本文所述的可誘導之嵌合細胞激素受體之分離的免疫細胞展示的持久性、細胞毒性、擴增及/或記憶表型標記之改良可係在活體外或活體內。在一些實施例中,分離的免疫細胞係選自由如下組成之群:T細胞、樹突細胞、殺手樹突細胞、肥大細胞、NK細胞、巨噬細胞、單核細胞及B細胞。
在一些實施例中,分離的免疫細胞為分離的T細胞。在一些實施例中,本文所提供的分離的T細胞包含本文所揭示的一或多種可誘導之嵌合細胞激素受體。在其他實施例中,本文所提供的分離的T細胞包含(i)本文所揭示的一或多種可誘導之嵌合細胞激素受體及(ii)嵌合抗原受體(CAR)。有利地,相對於不表現可誘導之嵌合細胞激素受體之細胞,本文所提供的分離的T細胞展示在與結合至二聚化域之配位體接觸後改良之活體內持久性。在一些實施例中,相對於不表現可誘導之嵌合細胞激素受體之細胞,本文所提供的分離的T細胞展示在與結合至二聚化域之配位體接觸後改良之細胞毒性、增加之擴增及/或增加之記憶表型標記水平。此等特徵中之一或多者之改良可係活體外或活體內。
在一些實施例中,相對於不表現可誘導之嵌合細胞激素受體之分離的免疫細胞,包含本文所揭示的一或多種可誘導之嵌合細胞激素受體之分離的免疫細胞展示在與結合至二聚化域之配位體接觸後,(i)增加的活體內持久性、(ii)增加的STAT活化、(iii)增加的細胞毒性、(iv)增加的記憶表型標記水平、(v)增加的擴增(增殖)、或此等功能特徵之組合。在一些實施例中,本文所述的一或多種功能特徵之改良係隨劑量改變,即,包含可誘導之嵌合細胞激素受體之免疫細胞之功能活性在與劑量遞增之結合至二聚化域之配位體接觸後增加。在一些實施例中,藉由可誘導之嵌合細胞激素受體活化之STAT包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6或其組合。STAT之活化包括STAT之募集、STAT之磷酸化及/或STAT之二聚化或STAT之易位。在一些實施例中,藉由包含可誘導之嵌合細胞激素受體之免疫細胞增加或維持之記憶表型標記包括幹細胞記憶(Tscm)標記及中樞記憶(Tcm)標記。
在一些實施例中,與不表現可誘導之嵌合細胞激素受體之免疫細胞相比,藉由包含本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之免疫細胞所展示的一或多種功能特徵改良至少約2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、125倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、或甚至約500倍,包括其間的值及範圍。
在一些實施例中,與不表現可誘導之嵌合細胞激素受體之免疫細胞相比,藉由包含本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之免疫細胞所展示的一或多種功能特徵改良至少約10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、75%、80%、90%、100%、125%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、或甚至約500%,包括其間的值及範圍。
在一些實施例中,本發明之分離的免疫細胞(諸如分離的T細胞)包含顯示於表2A中之可誘導之嵌合細胞激素受體。
表 2A :示例性的可誘導之嵌合細胞激素受體序列
表 2A :示例性的可誘導之嵌合細胞激素受體序列
在一些實施例中,本發明之分離的免疫細胞(諸如分離的T細胞)包含表2B中所示之可誘導之嵌合細胞激素受體。
表 2B :示例性的可誘導之嵌合細胞激素受體序列
表 2B :示例性的可誘導之嵌合細胞激素受體序列
本發明涵蓋對顯示於表2A及2B中之本發明實施例之可誘導之嵌合細胞激素受體之修飾,包括具有不顯著影響其性質之修飾之功能等效蛋白質及具有增強或降低之活性及/或親和力之變異體。多肽之修飾係本技術中之常規實務及不需要在此詳細描述。經修飾之多肽之實例包括具有胺基酸殘基之保守取代、胺基酸之一或多個缺失或新增(其等不顯著有害地改變功能活性,或其等成熟(增強)多肽對其配位體之親和力、或化學類似物之用途)之多肽。
胺基酸序列插入包括胺基-及/或羧基端融合,長度範圍為一個殘基至包含一百個或更多個殘基之多肽,及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體或融合至抗原決定基標籤之抗體。
取代變異體在可誘導之嵌合細胞激素受體中缺失至少一個胺基酸殘基且在其位置插入不同殘基。表3中在標題「保守取代」下顯示保守取代。若此類取代導致生物活性改變,則可引入表3中稱為「示例性取代」或如下文參考胺基酸類別進一步描述之更實質性的改變,及篩選產物。
表 3 :胺基酸取代
表 3 :胺基酸取代
在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體可在將編碼可誘導之嵌合細胞激素受體之多核苷酸引入至細胞中後在分離的免疫細胞(諸如CAR-T細胞)中原位合成。或者,可誘導之嵌合細胞激素受體可在細胞外部產生,且然後引入至細胞中。本技術中已知用於將多核苷酸構築體引入至細胞中之方法。在一些實施例中,穩定之轉形方法可用於將多核苷酸構築體整合至細胞之基因組中。在其他實施例中,短暫轉形方法可用於短暫表現多核苷酸構築體,且該多核苷酸構築體不整合至細胞之基因組中。在其他實施例中,可使用由病毒介導之方法。可藉由任何適宜方法(諸如(例如)重組病毒載體(例如逆轉錄病毒、腺病毒)、脂質體及類似)將多核苷酸引入至細胞中。短暫轉形方法包括(例如,但不限於)顯微注射、電穿孔或粒子轟擊。多核苷酸可包括在載體(諸如(例如)質體載體或病毒載體)中。
在一些實施例中,本發明之分離的免疫細胞(諸如分離的T細胞)可包含至少一種可誘導之嵌合細胞激素受體及至少一種CAR。在一些實施例中,分離的免疫細胞(諸如分離的T細胞)可包含至少一個不同可誘導之嵌合細胞激素受體群體及至少一種CAR。例如,存在於分離的免疫細胞中之不同可誘導之嵌合細胞激素受體群體可包括具有相同二聚化域但具有不同酪胺酸激酶活化域及不同酪胺酸效應域之受體、或具有相同二聚化域、相同酪胺酸激酶活化域但具有不同酪胺酸效應域之受體、或具有彼此不同的所有三個域之受體、及類似。在一些實施例中,分離的免疫細胞(諸如分離的T細胞)可包含至少一種可誘導之嵌合細胞激素受體及CAR群體,每種CAR包含不同胞外配位體結合域。
將不同可誘導之嵌合細胞激素受體群體引入至免疫細胞中可允許操縱細胞功能結果及/或表型。例如,存在於分離的免疫細胞中之不同可誘導之嵌合細胞激素受體可活化不同細胞內信號傳導事件,每個事件均導致特定功能結果且/或將細胞導引至特定表型。藉由操縱引入至細胞中之可誘導之嵌合細胞激素受體群體,可操縱細胞的功能結果及/或表型。例如,可操縱引入至免疫細胞中之可誘導之嵌合細胞激素受體群體以包含更多數量的受體,該等受體係活化一個STAT轉錄因子而不係其他STAT,藉此使細胞的功能結果及/或表型偏向於藉由該STAT控制之受體。
在分離的免疫細胞(例如本文所提供的分離的T細胞)之一些實施例中,CAR可包含胞外配位體結合域(例如,單鏈可變片段(scFv))、跨膜域及細胞內訊號域。在一些實施例中,胞外配位體結合域、跨膜域及細胞內訊號域係在一個多肽中,即,在單鏈中。本文亦提供多鏈CAR及多肽。在一些實施例中,多鏈CAR包含:包含跨膜域及至少一個胞外配位體結合域之第一多肽、及包含跨膜域及至少一個細胞內訊號域之第二多肽,其中該等多肽組裝在一起形成多鏈CAR。
CAR之胞外配位體結合域特異性結合至所關注的靶標。所關注的靶標可係所關注的任何分子,包括(例如,但不限於)BCMA、EGFRvIII、Flt-3、WT-1、CD20、CD23、CD30、CD38、CD70、CD33、CD133、LeY、NKG2D、CS1、CD44v6、ROR1、CD19、緊密連接蛋白-18.2 (緊密連接蛋白-18A2或緊密連接蛋白18同功異形物2)、DLL3 (δ樣蛋白3、果蠅δ同源物3、δ3)、Muc17(Mucin17、Muc3、Muc3)、FAPα (纖維母細胞活化蛋白α)、Ly6G6D (淋巴細胞抗原6複合基因座蛋白G6d、c6orf23、G6D、MEGT1、NG25)、RNF43(E3泛素-蛋白連接酶RNF43、RING指蛋白43)。
在一些實施例中,CAR之胞外配位體結合域包含scFv,其包含靶抗原特異性單株抗體之藉由撓性連接子連接之輕鏈可變(VL)區及重鏈可變(VH)區。藉由使用短連接肽連接輕鏈及/或重鏈可變區來製備單鏈可變區片段(Bird等人,Science 242:423-426,1988)。連接肽之一個實例為具有胺基酸序列(GGGGS)3 (SEQ ID NO: 224)之GS連接子,其在一個可變域的羧基端與另一可變域的胺基端之間橋接約3.5 nm。已設計並使用其他序列之連接子(Bird等人,1988,同前述)。通常,連接子可係短、撓性多肽,且較佳包含約20個或更少個胺基酸殘基。連接子可進一步經修飾以獲得額外功能,諸如附著藥物或附著至固體擔體。單鏈變異體可重組或合成產生。就scFv之合成生產而言,可使用自動合成儀。就scFv之重組產生而言,可將包含編碼scFv之多核苷酸之適宜質體引入至適宜宿主細胞(真核細胞(諸如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細胞)或原核細胞(諸如大腸桿菌))中。編碼所關注的scFv之多核苷酸可藉由例行操縱(諸如多核苷酸之連接)來製備。可使用本技術中已知的標準蛋白質純化技術分離所得的scFv。
根據本發明之CAR之細胞內訊號域負責在使胞外配位體結合域結合至靶標後的細胞內信號傳導,導致免疫細胞之活化及免疫反應。細胞內訊號域具有活化其中表現CAR之免疫細胞之至少一種正常效應子功能之能力。例如,T細胞之效應子功能可係細胞溶解活性或輔助活性,包括細胞激素之分泌。
在一些實施例中,用於CAR中之細胞內訊號域可係例如(但不限於)協同作用以在抗原受體參與後引發信號轉導之T細胞受體及輔受體之細胞質序列、以及此等序列之任何衍生物或變異體及具有相同功能能力之任何合成序列。細胞內訊號域包含兩個不同類別之細胞質信號傳導序列:彼等引發抗原依賴性初級活化之序列、及彼等以抗原非依賴性方式起作用以提供次級或共刺激信號之序列。初級細胞質信號傳導序列可包含信號傳導模體,其已知為ITAM之基於免疫受體酪胺酸之活化模體。ITAM為明確定義的信號傳導模體,其係在多種受體之胞質內尾中發現,該等多種受體充當syk/zap70類酪胺酸激酶之結合位點。用於本發明中之ITAM之實例可包括作為非限制性實例的彼等衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d之ITAM。在一些實施例中,CAR之細胞內訊號域可包含CD3ζ訊號域。在一些實施例中,本發明之CAR之細胞內訊號域包含共刺激分子之域。
在一些實施例中,本發明之CAR之細胞內訊號域包含選自由41BB (GenBank: AAA53133.)及CD28 (NP_006130.1)之片段組成之群之共刺激分子之一部分。
CAR係在細胞之表面膜上表現。因此,CAR可包含跨膜域。用於本文所揭示的CAR之適宜跨膜域具有如下能力:(a)在細胞(較佳免疫細胞,諸如(例如,但不限於)淋巴細胞或自然殺手(NK)細胞)之表面處表現,及(b)與配位體結合域及細胞內訊號域相互作用,以導引免疫細胞對預定靶細胞之細胞反應。跨膜域可衍生自天然來源或衍生自合成來源。跨膜域可衍生自任何膜結合或跨膜蛋白。作為非限制性實例,跨膜多肽可係T細胞受體之次單元,諸如α、β、γ或δ、構成CD3複合體之多肽、IL-2受體p55(a鏈)、p75(β鏈)或γ鏈、Fc受體之次單元鏈,特定言之Fcγ受體III或CD蛋白。或者,跨膜域可係合成的且可主要包含疏水性殘基(諸如白胺酸及纈胺酸)。在一些實施例中,該跨膜域係衍生自人類CD8α鏈(例如,NP_001139345.1)。跨膜域可還包含介於胞外配位體結合域與該跨膜域之間的莖域。莖域可包含至多300個胺基酸,較佳10至100個胺基酸且最佳25至50個胺基酸。莖區可衍生自天然的分子之全部或部分,諸如衍生自CD8、CD4或CD28之胞外區之全部或部分、或衍生自抗體恆定區之全部或部分。或者,莖域可係對應於天然的莖序列之合成序列,或可係完全合成莖序列。在一些實施例中,該莖域為人類CD8α鏈(例如,NP_001139345.1)之一部分。在另一個特定實施例中,該跨膜及鉸鏈域包含人類CD8α鏈之一部分。在一些實施例中,本文所揭示的CAR可包含特異性結合BCMA、CD8α人鉸鏈及跨膜域之胞外配位體結合域、CD3ζ訊號域及4-1BB訊號域。在一些實施例中,CAR可藉由質體載體作為轉殖基因引入至免疫細胞中。在一些實施例中,質體載體亦可包含(例如)選擇標記,其提供針對接收載體之細胞之識別及/或選擇。
表4提供可用於本文所揭示的CAR中之CAR組分之示例性序列。
表 4 : CAR 組分之示例性序列
表 4 : CAR 組分之示例性序列
在將編碼CAR多肽之多核苷酸引入至細胞中後,可在細胞中原位合成CAR多肽。或者,CAR多肽可在細胞外部產生,且然後引入至細胞中。本技術中已知用於將多核苷酸構築體引入至細胞中之方法。在一些實施例中,穩定之轉形方法可用於將多核苷酸構築體整合至細胞之基因組中。在其他實施例中,短暫轉形方法可用於短暫表現多核苷酸構築體,且該多核苷酸構築體不整合至細胞之基因組中。在其他實施例中,可使用由病毒介導之方法。可藉由任何適宜方法(諸如(例如)重組病毒載體(例如逆轉錄病毒、腺病毒)、脂質體及類似者)將多核苷酸引入至細胞中。短暫轉形方法包括(例如,但不限於)顯微注射、電穿孔或粒子轟擊。多核苷酸可包括在載體(諸如(例如)質體載體或病毒載體)中。
本文亦提供分離的免疫細胞,其包含本文所述的至少一種可誘導之嵌合細胞激素受體。分離的免疫細胞可還包含嵌合抗原受體(CAR)。如本說明書中提及的經修飾以表現可誘導之嵌合細胞激素受體及/或CAR之分離的免疫細胞亦可互換地稱為工程化免疫細胞。可根據本文所述方法中之任何一種方法來製備此等分離的免疫細胞。能夠表現異源DNA之任何免疫細胞可用於表現可誘導之嵌合細胞激素受體及所關注的CAR之目的。在一些實施例中,分離的免疫細胞為T細胞。在一些實施例中,免疫細胞可衍生自(例如,但不限於)幹細胞。該等幹細胞可為成體幹細胞、非人類胚胎幹細胞(更特定言之非人類幹細胞)、臍帶血幹細胞、祖細胞、骨髓幹細胞、誘導型多能幹細胞、全能幹細胞或造血幹細胞。代表性人類細胞為CD34+細胞。在一些實施例中,分離的免疫細胞可為樹突細胞、殺手樹突細胞、肥大細胞、NK細胞、巨噬細胞、單核細胞、B細胞或T細胞。在一些實施例中,分離的免疫細胞可為選自由發炎性T淋巴細胞、細胞毒性T淋巴細胞、調節T淋巴細胞或輔助T淋巴細胞組成之群之T細胞。在一些實施例中,該細胞可衍生自由CD4+ T-淋巴細胞及CD8+ T-淋巴細胞組成之群。在一些實施例中,分離的免疫細胞為自體T細胞。在一些實施例中,分離的免疫細胞為同種異體T細胞。
在一些實施例中,本發明之CAR免疫細胞(例如,CAR-T細胞)包含編碼自殺多肽(諸如(例如)RQR8)之多核苷酸。參見,例如,WO2013153391A,其係以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中,自殺多肽係在細胞之表面上表現。在一些實施例中,自殺多肽係包含在CAR構築體中。在一些實施例中,自殺多肽不係CAR構築體之部分。
在一些實施例中,本文所揭示的CAR中之任何一者之胞外域可包含對單株抗體具有特異性(藉由單株抗體特異性識別)之一或多個抗原決定基。此等抗原決定基在本文中亦稱為mAb特異性抗原決定基。示例性mAb特異性抗原決定基揭示於國際專利公開案第WO 2016/120216號中,該案係以全文引用的方式併入本文中。在此等實施例中,CAR之胞外域包含特異性結合至所關注的標靶之抗原結合域及結合至一或多個單株抗體(mAb)之一或多個抗原決定基。包含mAb特異性抗原決定基之CAR可係單鏈或多鏈的。
在本文所述的CAR之胞外域中包含對單株抗體具有特異性之抗原決定基允許分选及消除表現CAR之工程化免疫細胞。在一些實施例中,允許消除在有害效應之情況下(例如)在投與至個體後提供安全轉化。
在增殖及遺傳修飾之前,可藉由各種非限制性方法從個體獲得細胞之來源。細胞可自許多非限制性來源獲得,包括外周血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸腔積液、脾組織及腫瘤。在一些實施例中,可使用熟習此項技術者可獲得並已知之任何數量的免疫細胞系,諸如T細胞系。在一些實施例中,細胞可係衍生自健康供體,衍生自診斷患有癌症之個體或衍生自診斷患有感染之個體。在一些實施例中,細胞可係呈現不同表型特徵之混合細胞群之部分。
本文亦提供根據本文所述任何方法從經轉形之免疫細胞(諸如經轉形之T細胞)獲得之細胞系。在一些實施例中,分離的免疫細胞(諸如根據本發明之分離的T細胞)包含編碼可誘導之嵌合細胞激素受體之多核苷酸。在一些實施例中,根據本發明之分離的免疫細胞包含編碼可誘導之嵌合細胞激素受體之多核苷酸及編碼CAR之多核苷酸。在一些實施例中,根據本發明之分離的免疫細胞包含編碼可誘導之嵌合細胞激素受體之多核苷酸、編碼CAR之多核苷酸及編碼NK細胞拮抗劑之多核苷酸。
本發明之分離的免疫細胞(諸如分離的T細胞)可在T細胞之遺傳修飾之前或之後,使用如一般描述的方法,例如(但不限於)美國專利6,352,694;6,534,055;6,905,680;6,692,964;5,858,358;6,887,466;6,905,681;7,144,575;7,067,318;7,172,869;7,232,566;7,175,843;5,883,223;6,905,874;6,797,514;6,867,041;及美國專利申請公開案第20060121005號,來進行活化及增殖。免疫細胞可在活體外或活體內增殖。通常,本發明之T細胞可增殖,例如,藉由與刺激T細胞之表面上的CD3 TCR複合體及共刺激分子之試劑接觸,以產生T細胞之活化信號。例如,化學品(諸如鈣離子載體A23187、佛波醇(phorbol)12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)或有絲分裂凝集素(例如植物血球凝集素(PHA)))可用於產生T細胞之活化信號。
在一些實施例中,可藉由與適宜抗體或其抗原結合片段接觸來活體外刺激免疫細胞群。例如,T細胞群可藉由與(例如)抗-CD3抗體或其抗原結合片段、或固定於表面上之抗-CD28抗體、或藉由與與鈣離子載體結合的蛋白激酶C活化劑(例如,苔蘚抑素)接觸而活體外刺激。為共刺激T細胞之表面上的輔助分子,使用結合輔助分子之配位體。例如,在適於刺激T細胞之增殖之條件下,可使T細胞群與抗-CD3抗體及抗-CD28抗體接觸。適於T細胞培養之條件包括適宜培養基(例如,最低要求培養基或RPMI培養基1640、或X-vivo 5(Lonza)),其可包含增殖及活性所必需的因子,包括血清(例如,胎牛或人類血清)、介白素-2 (IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、TGFβ及TNF、或熟習此項技術者已知的用於細胞生長之任何其他添加劑。用於細胞之生長之其他添加劑包括(但不限於)表面活性劑、血漿製劑(plasmanate)及還原劑(諸如N-乙醯基-半胱胺酸及2-巰基乙醇)。培養基可包括RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1、及X-Vivo 20(Optimizer),其係經添加胺基酸、丙酮酸鈉及維生素,無血清或補充適量的血清(或血漿)或一組確定的激素、及/或足以使T細胞生長及增殖的量之細胞激素。抗生素(例如青黴素及鏈黴素)僅包含在實驗培養物中,而不包含在意欲輸註至個體中之細胞培養物中。將靶細胞維持在支持生長所需的條件下,例如,適宜之溫度(例如,37℃)及大氣(例如,空氣加上5% CO2
)。已被暴露至不同刺激時間之T細胞可展示不同特徵。
在一些實施例中,可藉由與組織或細胞共培養來擴增本發明之細胞。該等細胞亦可(例如)在投與細胞至個體中後在個體的血液中活體內擴增。
在另一個態樣中,本發明提供包含任何本發明細胞之組合物(諸如醫藥組合物)。在一些實施例中,該組合物包含分離的T細胞,其包含編碼本文所述之任何可誘導之嵌合細胞激素受體之多核苷酸及編碼CAR之多核苷酸。
本文進一步描述表現載體、及多核苷酸組合物之投與。
在另一個態樣中,本發明提供製備本文所述之任何多核苷酸之方法。
與任何此類序列互補之多核苷酸亦包括在本發明中。多核苷酸可係單鏈(編碼或反義)或雙鏈的,且可係(基因組、cDNA或合成性)DNA、或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子(其包含內含子且以一對一方式對應於DNA分子)及mRNA分子(其不包含內含子)。額外的編碼或非編碼序列可(但不必)存在於本發明之多核苷酸內,及多核苷酸可(但不必)連接至其他分子及/或擔體材料。
多核苷酸可包含天然序列(即,編碼抗體或其部分之內源序列)或可包含此一序列之變異體。多核苷酸變異體包含一或多個取代、新增、缺失及/或插入,使得經編碼之多肽之免疫反應性相對於天然免疫反應性分子不會減少。通常可如本文所述評估對經編碼之多肽之免疫反應性的影響。變異體較佳展示與編碼天然抗體或其一部分之多核苷酸序列至少約70%相同,更佳地,至少約80%相同,又更佳地,至少約90%相同,且最佳地,至少約95%相同。
若此兩個序列中之核苷酸或胺基酸之序列在如下文所述進行最大對應性比對時係相同的,則認為兩個多核苷酸或多肽序列「相同」。兩個序列間的比較通常藉由在比較窗口上比較該等序列以鑑定及比較具序列相似性之局部區域來進行。如本文所用的「比較窗口」係指至少約20個連續位置、通常30至約75個、或40至約50個之片段,其中可將某一序列與相同數量的連續位置之參考序列在最佳比對此兩個序列後進行比較。
可使用Lasergene生物信息學軟體套組(DNASTAR, Inc.,Madison,WI)中的Megalign程式,使用預設參數,進行用於比較的序列之最佳比對。該程式體現描述於以下參考文獻中之幾種比對方案:Dayhoff, M.O.,1978,A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. Dayhoff, M.O.(編) Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC 第5卷,增刊3,第345-358頁;Hein J.,1990,Unified Approach to Alignment and Phylogenes 第626-645頁Methods in Enzymology 第183卷,Academic Press, Inc.,San Diego,CA;Higgins, D.G.及Sharp, P.M.,1989,CABIOS 5:151-153;Myers, E.W.及Muller W.,1988,CABIOS 4:11-17;Robinson, E.D.,1971,Comb.Theor. 11:105;Santou, N.、Nes, M.,1987,Mol. Biol. Evol. 4:406-425;Sneath, P.H.A.及Sokal, R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA;Wilbur, W.J.及Lipman, D.J.,1983,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730。
較佳地,藉由在至少20個位置之比較窗口上比較兩個最佳比對的序列來確定「序列同一性百分比」,其中多核苷酸或多肽序列之在比較窗口中之部分可包含與參考序列(不包含新增或缺失)相比20%或更少,通常5%至15%、或10%至12%之新增或缺失(即,缺口)以進行此兩個序列之最佳比對。藉由確定相同核酸鹼基或胺基酸殘基在兩個序列中出現的位置數以產生匹配位置的數量,將該匹配位置的數量除以參考序列中的位置總數(即窗口大小)及將該等結果乘以100以產生序列同一性百分比,來計算得百分比。
變異體亦可或替代性地與天然基因或其一部分或補體實質上同源。此類多核苷酸變異體能夠在中等嚴格條件下與編碼天然抗體(或互補序列)之天然的DNA序列雜交。
適宜之「中等嚴格條件」包括在5 X SSC、0.5% SDS、1.0 mM EDTA (pH 8.0)之溶液中預洗滌;在50℃-65℃ 5 X SSC下雜交過夜;接著在65℃下歷時20分鐘用含有0.1% SDS之2X、0.5X及0.2X SSC各洗滌兩次。
如本文所用,「高嚴格條件」為如下之其等條件:(1)洗滌採用低離子強度及高溫,例如0.015 M氯化鈉/0.0015 M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉,在50℃下;(2)在雜交中使用變性劑,諸如甲醯胺,例如,50% (v/v)甲醯胺與0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/50 mM磷酸鈉緩衝液(pH6.5)與750 mM氯化鈉、75 mM檸檬酸鈉,在42℃下;或(3)使用50%甲醯胺、5 x SSC (0.75 M NaCl、0.075 M檸檬酸鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5 x丹哈德溶液(Denhardt’s solution)、經音波處理之鮭魚精子DNA(50 µg/ml)、0.1% SDS及10%聚葡萄糖硫酸鹽,在42℃下,且在42℃下於0.2 x SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)及在55℃下於50%甲醯胺中洗滌,接著在55℃下進行由含有EDTA之0.1 x SSC組成之高嚴格洗滌。熟習此項技術者將認識到如何根據需要調整溫度、離子強度等以適應諸如探針長度及類似之因素。
熟習此項技術者將瞭解,由於遺傳密碼之簡併性,存在編碼如本文所述之多肽之許多核苷酸序列。此等多核苷酸中之一些與任何天然基因之核苷酸序列具有最小的同源性。儘管如此,本發明尤其涵蓋由於密碼子使用之差異而變化之多核苷酸。此外,包含本文所提供的多核苷酸序列之基因之等位基因係在本發明範圍內。等位基因為內源性基因,其由於一或多個突變(諸如核苷酸之缺失、新增及/或取代)而改變。所得的mRNA及蛋白質可(但不必)具有改變的結構或功能。可使用標準技術(諸如雜交、擴增及/或資料庫序列比較)鑑定等位基因。
可使用化學合成、重組方法或PCR獲得本發明之多核苷酸。本技術中熟知化學多核苷酸合成之方法但不需要在此詳細描述。熟習此項技術者可使用本文所提供的序列及商業DNA合成儀以產生所需的DNA序列。
就使用重組方法來製備多核苷酸而言,可將包含所需序列之多核苷酸插入至適宜載體中,及進而可將載體引入至適宜宿主細胞中以用於複製及增殖,如本文中進一步論述。可藉由本技術中已知的任何方法將多核苷酸插入至宿主細胞中。藉由直接攝取、內吞作用、轉染、F-交配或電穿孔引入外源多核苷酸來轉形細胞。一旦引入,外源多核苷酸可作為非整合載體(例如質體)保持在細胞內或整合至宿主細胞基因組中。經如此擴增之多核苷酸可藉由本技術中熟知的方法從宿主細胞中分離。參見,例如,Sambrook等人,1989。
或者,PCR允許DNA序列之再現。PCR技術係本技術中熟知的且描述於美國專利第4,683,195號、第4,800,159號、第4,754,065號及第4,683,202號中,以及PCR: The Polymerase Chain Reaction,Mullis等人編,Birkauswer Press,Boston,1994。
藉由在適宜載體中使用分離的DNA且將其插入至適宜宿主細胞中,可獲得RNA。當細胞複製且DNA被轉錄成RNA時,則可使用熟習此項技術者熟知的方法(如(例如)Sambrook等人,1989,同上述所述)來分離RNA。
適宜之選殖載體可根據標準技術構建,或可選自本技術中可獲得的大量選殖載體。雖然所選的選殖載體可根據意欲使用的宿主細胞而變化,但有用的選殖載體通常具有自我複製之能力,可具有特定限制性內切核酸酶之單個靶標,且/或可攜帶可用於選擇包含載體之選繁體之標記之基因。適宜之實例包括質體及細菌病毒,例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如,pBS SK +)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體(諸如pSA3及pAT28)。此等及許多其他選殖載體可從商業供應商(諸如BioRad、Strategene及Invitrogen)獲得。
表現載體通常為可複制之多核苷酸構築體,其含有根據本發明之多核苷酸。此意指表現載體必須可作為附加體或作為染色體DNA之組成部分在宿主細胞中複製。適宜之表現載體包括(但不限於)質體、病毒載體,包括腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒、黏質體及揭示於PCT公開案第WO 87/04462號中之表現載體。載體組分通常可包括(但不限於)如下中之一或多者:信號序列;複製起點;一或多個標記基因;適宜之轉錄控制元件(諸如啟動子、增強子及終止子)。為達表現(即轉譯),通常,亦需要一或多個轉譯控制元件,諸如核糖體結合位點、轉譯起始位點及終止密碼子。
包含所關注的多核苷酸之載體可藉由許多適宜方法中的任何一種方法引入至宿主細胞中,包括電穿孔、使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-聚葡萄糖或其他物質進行轉染;微彈轟擊;脂質體轉染;及感染(例如,在載體為感染劑,諸如疫苗病毒之情況下)。引入載體或多核苷酸之選擇通常取決於宿主細胞之特徵。
編碼本文所揭示的可誘導之嵌合細胞激素受體或CAR之多核苷酸可呈表現盒或表現載體(例如,用於引入至細菌宿主細胞中之質體、或病毒載體(諸如用於轉染昆蟲宿主細胞之桿狀病毒載體)、或質體或病毒載體(諸如用於轉染哺乳動物宿主細胞之慢病毒))存在。在一些實施例中,使用非病毒載體將編碼可誘導之嵌合細胞激素受體及/或CAR之多核苷酸引入至分離的免疫細胞中。可用於本發明之方法中之示例性非病毒載體包括(但不限於)基於轉位子之載體,諸如pigpiggyBac™,Frog Prince、Sleeping Beauty(例如,SB100X載體)及類似。在一些實施例中,將編碼可誘導之嵌合細胞激素受體及/或CAR之多核苷酸整合至細胞基因組中。在一些實施例中,該整合係定點的。提供定點整合之示例性方法包括使用基因組編輯核酸酶(諸如大範圍核酸酶、鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化子樣效應子核酸酶(TALEN)、及成簇、規則間隔之短回文重複相關核酸酶(CRISPR) (諸如Cas9內切核酸酶))之方法。
在一些實施例中,多核苷酸或載體可包括編碼核糖體跳躍序列之核酸序列,例如(但不限於),編碼2A肽之序列。在小核糖核酸病毒之口蹄疫病毒(Aphthovirus)子集中鑑定出的2A肽導致核糖體從一個密碼子「跳躍」至下一個密碼子而不在藉由密碼子編碼之兩個胺基酸之間形成肽鍵(參見(Donnelly及Elliott 2001;Atkins、Wills等人 2007;Doronina、Wu等人 2008))。「密碼子」意指mRNA上(或DNA分子之義鏈上)的三個核苷酸,其被核糖體轉譯成一個胺基酸殘基。因此,當多肽被框內的2A寡肽序列分開時,可從imRNA內的單個連續開放閱讀框合成兩個、三個、四個或更多個多肽。此種核糖體跳躍機制係本技術中熟知的並已知藉由幾種載體用於表現藉由單個信使RNA編碼之幾種蛋白質。
為將跨膜多肽導引至宿主細胞之分泌途徑中,在一些實施例中,在多核苷酸序列或載體序列中提供分泌信號序列(亦稱為前導序列、前原序列或前序列)。分泌信號序列可以操作方式連結至跨膜核酸序列,即此兩個序列在正確的閱讀框架中連接且定位以將新合成的多肽導引至宿主細胞之分泌途徑中。分泌信號序列通常定位於編碼所關注的多肽之核酸序列的5',雖然某些分泌信號序列可定位於所關注的核酸序列的其他位置(參見,例如,Welch等人,美國專利第5,037,743號;Holland等人,美國專利第5,143,830號)。在一些實施例中,信號肽包含以SEQ ID NO: 318或329顯示之胺基酸序列。熟習此項技術者將認識到,鑑於遺傳密碼之簡併性,此等多核苷酸分子之間可能存在相當大的序列變異。在一些實施例中,本發明之核酸序列經密碼子最佳化以在哺乳動物細胞中表現,較佳在人類細胞中表現。密碼子最佳化係指在所給定物種之高表現基因中通常很少見的密碼子之所關注的序列藉由通常在此等物種之高表現基因中很常見的密碼子(此等密碼子編碼胺基酸作為交換的密碼子)交換。
本文提供製備用於免疫療法中之免疫細胞之方法。在一些實施例中,該等方法包括將可誘導之嵌合細胞激素受體及CAR引入至免疫細胞中,且使該等細胞擴增。在一些實施例中,本發明係關於工程化免疫細胞之方法,該方法包括:提供細胞並表現可誘導之嵌合細胞激素受體,且在細胞之表面處表現至少一種CAR。在一些實施例中,該方法包括:轉染具有編碼可誘導之嵌合細胞激素受體之至少一個多核苷酸及編碼CAR之至少一個多核苷酸之細胞,且表現該細胞中之該等多核苷酸。在一些實施例中,該方法包括:轉染具有編碼可誘導之嵌合細胞激素受體之至少一個多核苷酸、編碼CAR之至少一個多核苷酸之細胞,且表現該細胞中之該等多核苷酸。
在一些實施例中,編碼可誘導之嵌合細胞激素受體及CAR之多核苷酸係存在於一或多個表現載體中以達成細胞中之穩定表現。在一些實施例中,該等多核苷酸係存在於病毒載體中以達成細胞中之穩定表現。在一些實施例中,該等病毒載體可為(例如)慢病毒載體或腺病毒載體。
在一些實施例中,編碼根據本發明之多肽之多核苷酸可為mRNA,其係(例如)藉由電穿孔直接引入至細胞中。在一些實施例中,cytoPulse技術(諸如PulseAgile)可用於短暫透化活細胞以將材料遞送至細胞中(例如http://cytopulse.com;US 6,078,490;PCT/US2011/000827;及PCT/US2004/005237)。可修改參數以確定針對於高轉染效率但死亡率最小之條件。
本文亦提供轉染免疫細胞(諸如T細胞)之方法。在一些實施例中,該方法包括:使免疫細胞與RNA接觸且對免疫細胞應用由如下組成之敏捷脈衝序列:(a)一個電脈衝,其電壓範圍為每厘米約2250至3000 V;(b)脈衝寬度為0.1 ms;(c)步驟(a)及(b)之電脈沖之間的脈衝時間間隔為約0.2至10 ms;(d)一個電脈衝,其電壓範圍為約2250至3000 V,脈衝寬度為約100 ms及步驟(b)之電脈衝與步驟(c)之第一電脈沖之間的脈衝時間間隔為約100 ms;及(e)四個電脈衝,電壓為約325 V且脈衝寬度為約0.2 ms及4個電脈沖各者之間的脈衝間隔為2 ms。在一些實施例中,轉染免疫細胞之方法包括使該免疫細胞與RNA接觸且對免疫細胞應用敏捷脈衝序列,該敏捷脈衝序列包括:(a)一個電脈衝,電壓為每厘米約2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000 V;(b)脈衝寬度為0.1 ms;(c)步驟(a)及(b)之電脈沖之間的脈衝時間間隔為約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 ms;(d)一個電脈衝,電壓範圍為約2250、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000 V,脈衝寬度為100 ms及步驟(b)之電脈衝與步驟(c)之第一電脈沖之間的脈衝時間間隔為100 ms;及(e)4個電脈衝,電壓為約325 V且脈衝寬度為約0.2 ms及4個電脈沖各者之間的脈衝時間間隔為約2 ms。包含在上述值範圍中之任何值均揭示於本申請案中。電穿孔介質可為本技術中已知的任何適宜介質。在一些實施例中,電穿孔介質之電導率在跨約0.01至約1.0毫西門子(milliSiemens)的範圍內。
在一些實施例中,該方法可進一步包括藉由滅活至少一種基因表現(例如(但不限於)TCR之組分、免疫抑制劑之靶標、HLA基因及/或免疫檢查點蛋白質(諸如(例如)PDCD1或CTLA-4))來遺傳修飾細胞之步驟。藉由滅活基因,其意圖使所關注的基因不以功能性蛋白質形式表現。在一些實施例中,意欲滅活之基因係選自由例如(但不限於)TCRα、TCRβ、CD52、GR、去氧胞苷激酶(DCK)、PD-1及CTLA-4組成之群。在一些實施例中,該方法包括藉由將可藉由選擇性DNA裂解選擇性滅活基因之稀切核酸內切酶引入至細胞中來滅活一或多個基因。在一些實施例中,該稀切內切核酸酶可為(例如)轉錄活化子樣效應子核酸酶(TALE-核酸酶)或Cas9內切核酸酶。
在另一個態樣中,遺傳修飾細胞之步驟可包括:藉由滅活表現免疫抑制劑之靶標之至少一個基因來修飾免疫細胞;及視需要地在免疫抑制劑之存在下使該等細胞增殖。免疫抑制劑為藉由幾種作用機制中之一種作用機制抑制免疫功能之藥劑。免疫抑制劑可減少免疫反應之程度及/或渦度(voracity)。免疫抑制劑之非限制性實例包括鈣調神經磷酸酶抑制劑、雷帕黴素之標靶、介白素-2α-鏈阻斷劑、肌苷單磷酸脫氫酶之抑制劑、二氫葉酸還原酶之抑制劑、皮質類固醇及免疫抑制抗代謝物。一些細胞毒性免疫抑制劑藉由抑制DNA合成來起作用。其他可藉由T細胞之活化或藉由抑制輔助細胞之活化來起作用。根據本發明之方法允許藉由滅活T細胞中免疫抑制劑之靶標而賦予T細胞免疫抑制抗性以用於免疫療法。作為非限制性實例,免疫抑制劑之靶標可為免疫抑制劑之受體,諸如(例如,但不限於)CD52、糖皮質激素受體(GR)、FKBP家族基因成員及親環素家族基因成員。
治療方法
治療方法
可將藉由上述方法獲得的分離的免疫細胞或衍生自此類分離的免疫細胞之細胞系投與有此需要的個體並用作藥物。在一些實施例中,分離的免疫細胞為T細胞。在一些實施例中,此類藥物可用於治療病症,諸如(例如)病毒性疾病、細菌性疾病、癌症、發炎性疾病、免疫疾病或衰老相關疾病。在一些實施例中,癌症可選自由如下組成之群:胃癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、頭頸癌、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌、肝癌、胃癌、甲狀腺癌、肺癌、卵巢癌、乳癌、前列腺癌、食道癌、胰臟癌、膠質瘤、白血病、多發性骨髓瘤、腎細胞癌、膀胱癌、子宮頸癌、絨毛膜癌、結腸癌、口腔癌、皮膚癌及黑色素瘤。在一些實施例中,個體為先前治療過的成人個體,其患有局部晚期或轉移性黑色素瘤、鱗狀細胞頭頸癌(SCHNC)、卵巢癌、肉瘤或複發或難治性典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)。
在一些實施例中,分離的免疫細胞(諸如根據本發明之分離的T細胞或衍生自分離的免疫細胞之細胞系)可用於製造用於治療有此需要的個體之病症之藥物。在一些實施例中,該病症可為(例如)癌症、自體免疫病症或感染。
本文亦提供用於治療個體之方法。在一些實施例中,該方法包括對有此需要的個體提供包含本發明之可誘導之嵌合細胞激素受體之分離的免疫細胞。在一些實施例中,該方法包括將本發明之分離的免疫細胞投與有此需要的個體之步驟。在一個示例性實施例中,該方法包括對有此需要的個體提供包含本發明之可誘導之嵌合細胞激素受體之分離的T細胞。在一些實施例中,該方法包括對有此需要的個體投與本發明之分離的T細胞之步驟。
在一些實施例中,本發明之分離的免疫細胞可經歷穩健活體內細胞增殖且可持續一段延長的時間。
該等方法可進一步包括在投與攜帶CAR及本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之工程化免疫細胞之前對個體投與一或多種治療劑。在某些實施例中,該藥劑為淋巴清除(預處理)方案。例如,對需要此種療法的個體進行淋巴清除之方法包括對個體投與指定有益劑量之環磷醯胺(200 mg/m2
/天至2000 mg/m2
/天、約100 mg/m2
/天至2000 mg/m2
/天;例如,約100 mg/m2
/天、約200 mg/m2
/天、約300 mg/m2
/天、約400 mg/m2
/天、約500 mg/m2
/天、約600 mg/m2
/天、約700 mg/m2
/天、約800 mg/m2
/天、約900 mg/m2
/天、約1000 mg/m2
/天、約1500 mg/m2
/天或約2000 mg/m2
/天)及指定劑量之氟達拉濱(fludarabine) (20 mg/m2
/天至900 mg/m2
/天、約10 mg/m2
/天至約900 mg/m2
/天;例如,約10 mg/m2
/天、約20 mg/m2
/天、約30 mg/m2
/天、約40 mg/m2
/天、約40 mg/m2
/天、約50 mg/m2
/天、約60 mg/m2
/天、約70 mg/m2
/天、約80 mg/m2
/天、約90 mg/m2
/天、約100 mg/m2
/天、約500 mg/m2
/天或約900 mg/m2
/天)。示例性給藥方案涉及治療個體,包括在投與治療有效量之工程化免疫細胞至患者之前,以組合方式或在投與約30 mg/m2
/天之氟達拉濱之前或之後每天對患者投與約300 mg/m2/天之環磷醯胺共三天。
在一些實施例中,尤其在本文所提供的工程化細胞已經過基因編輯以消除或最小化CD52之表面表現時,淋巴細胞清除進一步包括投與抗-CD52抗體,諸如阿來組單抗(alemtuzumab)。在一些實施例中,CD52抗體係以約1-20 mg/天 IV(例如,約13 mg/天 IV)之劑量投與1、2、3天或更多天。該抗體可以與淋巴細胞清除方案之其他元件(例如,環磷醯胺及/或氟達拉濱)組合之方式、在投與該等其他元件之前或之後投與。
在某些實施例中,包含本文所揭示的CAR-表現免疫效應子細胞之組合物可以與任何數量的化療劑聯合之方式投與。
本發明之治療之方法可係改善、治療或預防。本發明之方法可係自體免疫療法之部分或同種異體免疫療法治療之部分。本發明尤其適用於同種異體免疫療法。在一個示例性實施例中,可使用標準方案將來自供體之T細胞轉形為非同種異體反應性細胞且根據需要再生,藉此產生可投與一或多個個體之CAR-T細胞。此種CAR-T細胞療法可以「現成」治療產品獲得。
在另一個態樣中,本發明提供一種抑制患有腫瘤的個體之腫瘤生長或進展之方法,該方法包括對個體投與有效量之如本文所述之分離的免疫細胞。在另一個態樣中,本發明提供一種抑制或預防個體之癌細胞之轉移之方法,該方法包括對有此需要的個體投與有效量之如本文所述之分離的免疫細胞。在另一個態樣中,本發明提供一種誘導患有腫瘤的個體之腫瘤消退之方法,該方法包括對個體投與有效量之如本文所述之分離的免疫細胞。在一個示例性實施例中,分離的免疫細胞為T細胞。
在一些實施例中,分離的免疫細胞可於個體中以非經腸方式投與。在一些實施例中,該個體為人類。
亦提供一種本文所提供的任何分離的免疫細胞於製造用於治療癌症或用於抑制有此需要的個體之腫瘤生長或進展之藥物中之用途。在一個示例性實施例中,分離的免疫細胞為T細胞。
在一些實施例中,可將治療投與至經歷免疫抑制治療之個體中。實際上,本發明較佳依賴於細胞或細胞群,由於編碼此種免疫抑制劑之受體之基因之失活,該細胞或細胞群已經對至少一種免疫抑制劑產生抗性。在該態樣中,免疫抑制性治療應有助於在個體活體內選擇及增殖根據本發明之免疫細胞。根據本發明之細胞或細胞群之投與可以任何簡便方式進行,包括藉由氣溶膠吸入、注射、攝取、輸血、植入或移植。本文所述的組合物可經皮下、皮內、腫瘤內、結內、髓內、肌肉內、藉由靜脈內或淋巴內註射或經腹膜內投與個體。在一些實施例中,本發明之細胞組合物較佳係藉由靜脈內註射投與。
在一些實施例中,投與細胞或細胞群可包括每kg體重投與(例如)約104
至約109
個細胞,包括在其等範圍內的所有整數細胞數值。在一些實施例中,投與細胞或細胞群可包括每kg體重投與約105
至106
個細胞,包括在其等範圍內的所有整數細胞數值。該等細胞或細胞群可以一劑或多劑投與。在一些實施例中,該有效量之細胞可以單劑量投與。在一些實施例中,該有效量之細胞可在一段時間內以多於一劑投與。投藥時間係在管理醫師的判斷範圍內且取決於個體之臨床狀況。該等細胞或細胞群可從任何來源(例如血庫或供體)獲得。雖然個體需求改變,但針對於在本技術技藝範圍內之特定疾病或病症確定所給定細胞類型之有效量的最佳範圍。有效量意指提供治療性或預防性益處的量。所投與的劑量將取決於接受者的年齡、健康狀況及體重、合併治療類型(若有的話)、治療之頻率及所需效應之本質。在一些實施例中,以非經腸方式投與有效量之細胞或包含其等細胞之組合物。在一些實施例中,投藥可係靜脈內投與。在一些實施例中,投藥可藉由在腫瘤內註射直接進行。
套組
套組
本發明亦提供用於本發明方法中之套組。本發明之套組包括一或多個容器,其包含分離的免疫細胞,該分離的免疫細胞包含編碼可誘導之嵌合細胞激素受體及如本文所述的CAR之一或多個多核苷酸、及根據本文所述之本發明任何方法使用的說明書。通常,此等說明書包括針對於上述治療性治療投與分離的免疫細胞之描述。在一個示例性實施例中,套組可包含分離的T細胞。
與如本文所述之分離的免疫細胞之使用有關的說明書通常包括關於所欲治療之劑量、給藥方案及投藥途徑之資訊。該等容器可係單元劑量、批量包裝(例如,多劑量包裝)或子單元劑量。提供於本發明之套組中之說明書通常係在標籤或包裝插頁(例如,包括於該套組中之紙片)上之書面說明書,但機器可讀指令(例如,攜帶於磁性或光學儲存碟上之說明書)亦係可接受的。
本發明之套組係在適宜之包裝中。適宜之包裝包括(但不限於)小瓶、瓶、廣口瓶、軟包裝(例如,密封之Mylar或塑膠袋)及類似。亦考慮與特定裝置(諸如吸入器、鼻投與裝置(例如,霧化器)或輸註裝置(例如,微型泵))組合使用的包裝。套組可具有無菌進入口(例如,該容器可係靜脈內溶液袋或具有可以皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。該容器亦可具有無菌進入口(例如,該容器可係靜脈內注射溶液袋或具有可以皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為分離的免疫細胞,其包含可誘導之嵌合細胞激素受體及CAR。該容器可還包含第二醫藥活性劑。
套組可視需要提供額外組分,諸如緩衝液及解釋性資訊。通常,該套組包括容器及在該容器上或與該容器相關聯之標籤或包裝插頁。
提供以下實例僅用於說明目的,且並不意欲以任何方式限制本發明之範圍。實際上,除了本文所顯示及所描述之其等之外,本發明之各種修改對於熟習此項技術者而言從前面的描述將變得顯而易見且落在隨附申請專利範圍之範圍內。
編號實施例
編號實施例
可參考以下編號的示例性實施例來定義本文所揭示之本發明。
實施例1. 一種可誘導之嵌合細胞激素受體,其包含:
二聚化域;
酪胺酸激酶活化域;及
酪胺酸效應域。
二聚化域;
酪胺酸激酶活化域;及
酪胺酸效應域。
實施例2. 如實施例1之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該二聚化域結合小分子。
實施例3. 如實施例1或2之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該二聚化域結合至二聚配位體AP1903、AP20187、二聚FK506或二聚FK506樣類似物。
實施例4. 如實施例1至3中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該二聚化域包含FKBP12多肽。
實施例5. 如實施例4之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該FKBP12多肽包含胺基酸取代F36V。
實施例6. 如實施例1之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該二聚化域結合蛋白質。
實施例7. 如實施例1之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該二聚化域包含蛋白質之多肽,該蛋白質選自由如下組成之群:FKBP、親環素、類固醇結合蛋白、雌激素結合蛋白、糖皮質激素結合蛋白、維生素D結合蛋白、四環素結合蛋白、細胞激素受體之胞外域、受體酪胺酸激酶、TNFR家族受體及免疫輔受體。
實施例8. 如實施例7之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該免疫輔受體係選自由如下組成之群:紅血球生成素受體、催乳素受體、生長激素受體、血小板生成素受體、粒細胞群落刺激因子受體、GP130、共同γ鏈受體、共同β鏈受體、IFNα受體、IFNγ受體、IFNλ受體、IL2/IL15受體、IL3受體、IL4受體、IL5受體、IL7受體、IL9受體、IL10受體、IL12受體、IL13受體、IL20受體、IL21受體、IL22受體、IL23受體、IL27受體、TSLP受體、G-CSF受體、GM-CSF受體、CNTF受體、OSM受體、LIF受體、CT-1受體、TGFBR1/ALKL5、TGFBR2、EGFR/HER1、ERBB2/HER2、ERBB3/HER3、ERRB4/HER4、INSR、IGF-1R、IRR、PDGFRA、PDGFRB、CSF-1R、KIT/SCFR、FLK2/FLT3、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4、CCK4、TRKA、TRKB、TRKC、MET、RON、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR1、DDR2、RET、ROS、LTK、ALK、ROR1、ROR2、MUSK、AATYK、AATYK2、AATYK3、RTK106、TNFR1、Fas、TRAILR1、TRAILR2、NGFR、DR3、DR6、EDAR、TNFR2、LTbR、OX40、CD40、CD27、CD30、4-1BB、RANK、Fn14、TACI、BAFFR、HVEM、BCMA、GITR、TROY、RELT、XEDAR、TRAILR3、TRAILR4、OPG、DcR3、PD-1、CD80、CD86、ICOS-L、ICOS、CTLA-4、BTLA、CD160、LAG3及TIM3。
實施例9. 如實施例1至8中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該酪胺酸激酶活化域係衍生自或包含蛋白質之多肽,該蛋白質選自由如下組成之群:共同γ鏈受體、共同β鏈受體、IFNα受體、IFNγ受體、IFNλ受體、IL2/IL15受體、IL3受體、IL4受體、IL5受體、IL7受體、IL9受體、IL10受體、IL12受體、IL13受體、IL20受體、IL21受體、IL22受體、IL23受體、IL27受體、TSLP受體、G-CSF受體、GM-CSF受體、CNTF受體、OSM受體、LIF受體、CT-1受體、EGFR/HER1、ERBB2/HER2、ERBB3/HER3、ERRB4/HER4、INSR、IGF-1R、IRR、PDGFRA、PDGFRB、CSF-1R、KIT/SCFR、FLK2/FLT3、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4、CCK4、TRKA、TRKB、TRKC、MET、RON、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR1、DDR2、RET、ROS、LTK、ALK、ROR1、ROR2、MUSK、AATYK、AATYK2、AATYK3及RTK106受體。
實施例10. 如實施例1至9中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該酪胺酸效應域係衍生自或包含蛋白質之多肽,該蛋白質選自由如下組成之群:共同γ鏈受體、共同β鏈受體、IFNα受體、IFNγ受體、IFNλ受體、IL2/IL15受體、IL3受體、IL4受體、IL5受體、IL7受體、IL9受體、IL10受體、IL12受體、IL13受體、IL20受體、IL21受體、IL22受體、IL23受體、IL27受體、TSLP受體、G-CSF受體、GM-CSF受體、CNTF受體、OSM受體、LIF受體、CT-1受體、EGFR/HER1、ERBB2/HER2、ERBB3/HER3、ERRB4/HER4、INSR、IGF-1R、IRR、PDGFRA、PDGFRB、CSF-1R、KIT/SCFR、FLK2/FLT3、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4、CCK4、TRKA、TRKB、TRKC、MET、RON、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR1、DDR2、RET、ROS、LTK、ALK、ROR1、ROR2、MUSK、AATYK、AATYK2、AATYK3、RTK106、ALX、BLNK、Grb7、Nsp、SLP-76、SOCS、TSAd、APS、Bam32、Crk、Gads、Grb2、Nck、SLAP、Shc、FRS2、Dab、Dok、IRS、eps8、AFAP110、Gab、ADAP、Carma1、Cas、CIN85、Cortactin、E3B1、Vinexin、SKAP-55、BANK、BCAP、Dof、Paxillin、LAT、LAX、LIME、NTAL、PAG、SIT及TRIM。
實施例11. 如實施例1至10中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該二聚化域係位於該可誘導之嵌合細胞激素受體的N端處。
實施例12. 如實施例1至10中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該二聚化域係位於該可誘導之嵌合細胞激素受體的C端處。
實施例13. 如實施例1至12中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該可誘導之嵌合細胞激素受體包含跨膜域。
實施例14. 如實施例1至13中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該可誘導之嵌合細胞激素受體包含膜靶向模體。
實施例15. 如實施例14之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該膜靶向模體包含CD8信號序列或肉豆蔻醯基。
實施例16. 如實施例1至15中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該受體係經肉豆蔻醯基化。
實施例17. 如實施例1之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該二聚化域包含FKBP多肽,該酪胺酸激酶活化域包含EpoR或TpoR多肽,及該酪胺酸效應域包含IL7受體(IL7R)多肽。
實施例18. 如實施例17之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該酪胺酸效應域還包含EGFR多肽。
實施例19. 如實施例17之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該酪胺酸效應域包含IL7R (316-459)、IL12Rb2 (775-825)及/或EGFR (1122-1165)。
實施例20. 一種多核苷酸,其包含編碼如實施例1至19中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體之核酸序列。
實施例21. 一種表現載體,其包含如實施例20之多核苷酸。
實施例22. 一種工程化免疫細胞,其包含如實施例1至19中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體或如實施例20之多核苷酸。
實施例23. 如實施例22之工程化免疫細胞,其中該細胞還包含嵌合抗原受體(CAR)或編碼CAR之多核苷酸。
實施例24. 如實施例22或23之工程化免疫細胞,其中該免疫細胞為T細胞。
實施例25. 一種調節個體之工程化免疫細胞之方法,該方法包括對先前已投與如實施例22至24中任一項之工程化免疫細胞的個體投與二聚配位體,其中該二聚配位體結合至該可誘導之嵌合細胞激素受體之二聚化域。
實施例26. 如實施例25之方法,其中該配位體為AP1903。
實施例27. 一種製備工程化免疫細胞之方法,該方法包括將如實施例20之多核苷酸或如實施例21之表現載體引入至該免疫細胞中。
實施例28. 一種分離的T細胞,其包含
(i) 可誘導之嵌合細胞激素受體,其包含細胞激素受體之二聚化域、酪胺酸激酶活化域及酪胺酸效應域;及
(ii) 嵌合抗原受體(CAR),其包含胞外配位體結合域、跨膜域及細胞內訊號域。
(i) 可誘導之嵌合細胞激素受體,其包含細胞激素受體之二聚化域、酪胺酸激酶活化域及酪胺酸效應域;及
(ii) 嵌合抗原受體(CAR),其包含胞外配位體結合域、跨膜域及細胞內訊號域。
實施例29. 如實施例28之分離的T細胞,其中該可誘導之嵌合細胞激素受體為如實施例1至19中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體。
實施例30. 如實施例28或29之分離的T細胞,其中該分離的T細胞展示相對於第二分離的T細胞之活體內持久性改良之活體內持久性,其中該第二分離的T細胞包含該分離的T細胞之所有組分,但其不包含該可誘導之嵌合細胞激素受體。
實施例31. 一種產生分離的T細胞之方法,其中該方法包括如下之步驟:
(a) 提供T細胞;
(b) 修飾該T細胞以表現嵌合抗原受體(CAR),其包含胞外配位體結合域、跨膜域及細胞內訊號域;及
(c) 修飾該T細胞以表現可誘導之嵌合細胞激素受體。
(a) 提供T細胞;
(b) 修飾該T細胞以表現嵌合抗原受體(CAR),其包含胞外配位體結合域、跨膜域及細胞內訊號域;及
(c) 修飾該T細胞以表現可誘導之嵌合細胞激素受體。
實施例32. 如實施例31之方法,其中步驟c)包括將可誘導之嵌合細胞激素受體穩定地引入至該細胞中。
實施例33. 如實施例31或32之方法,其中步驟c)包括藉由轉位子/轉位酶系統、基於病毒之基因轉移系統或電穿孔將編碼該可誘導之嵌合細胞激素受體之多核苷酸引入至該細胞中。
實施例34. 如實施例31至33中任一項之方法,其中步驟b)包括藉由轉位子/轉位酶系統或基於病毒之基因轉移系統將編碼該嵌合抗原受體之多核苷酸引入至細胞。
實施例35. 如實施例34之方法,其中該基於病毒之基因轉移系統包含重組逆轉錄病毒或慢病毒。
實施例36. 如實施例31至35中任一項之方法,其中步驟(b)在步驟(c)之前發生。
實施例37. 如實施例31至35中任一項之方法,其中步驟(c)在步驟(b)之前發生。
實施例38. 一種醫藥組合物,其包含如實施例28至30中任一項之分離的T細胞,該醫藥組合物係用於治療病症。
實施例39. 如實施例38之醫藥組合物,其中該疾病為癌症、自體免疫疾病或感染。
實施例40. 如實施例38或39之醫藥組合物,其中將提供該等細胞不止一次。
實施例41. 如實施例40之醫藥組合物,其中該等細胞意欲相隔至少約1、2、3、4、5、6、7天或更多天提供給該個體。
實施例42. 如實施例41之醫藥組合物,其中該病症為病毒性疾病、細菌性疾病、癌症、發炎性疾病、免疫疾病或老化相關疾病。
實施例43. 一種用於治療個體之病症之方法,其中該方法包括將如實施例28至30中任一項之分離的T細胞投與給該個體。
實施例44. 如43之方法,其中將細胞提供給該個體不止一次。
實施例45. 如實施例43或44之方法,其中該個體在投與分離的T細胞之前已先前經治療劑治療。
實施例46. 如實施例45之方法,其中該治療劑為抗體或化療劑。
實施例47. 如實施例43至46中任一項之方法,其中該病症為病毒性疾病、細菌性疾病、癌症、發炎性疾病、免疫疾病或老化相關疾病。
實施例48. 如實施例47之方法,其中該癌症為惡性血液病或實體癌症。
實施例49. 如實施例48之方法,其中該惡性血液病係選自急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性嗜伊紅血球性白血病(CEL)、骨髓發育不良症候群(MDS)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或多發性骨髓瘤(MM)。
實施例50. 如實施例49之方法,其中該實體癌症係選自膽管癌、膀胱癌、骨及軟組織癌、腦腫瘤、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸腺癌、結腸直腸癌、硬纖維瘤、胚胎癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、胃腺癌、多形性膠質母細胞瘤、婦科腫瘤、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、肺癌、惡性黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、胰臟管腺癌、原發性星形細胞瘤、原發性甲狀腺癌、前列腺癌、腎癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、睾丸生殖細胞腫瘤、尿路上皮細胞癌、子宮肉瘤或子宮癌。
實例
實例 1A :可誘導之嵌合細胞激素受體
實例
實例 1A :可誘導之嵌合細胞激素受體
已知可增強T細胞持久性及功能之細胞激素(諸如IL-2、IL-7及IL-15)經天然異二聚細胞激素受體訊號,該等天然異二聚細胞激素受體繼而活化JAK1及JAK3激酶(JAK激酶之示例性活化示於圖1中)。可誘導之嵌合細胞激素受體(圖1)經設計且證實在調節CAR-T細胞中之細胞激素信號傳導方面係有效的(下文實例)。AP1903可誘導之嵌合細胞激素受體為AP1903反應性FKBPF36V
融合蛋白。內源性FKBP結合雷帕黴素以抑制mTOR (圖2A)。FKBPF36V
結合至雷帕黴素樣化合物(雷帕黴素類似物(Rapalogs)) (圖2B)。AP1903為臨床安全的雷帕黴素類似物二聚物,其使FKBPF36V
二聚化(圖2C)。
在超過四十個已知細胞激素受體中,存在五種同源二聚物。此五種同源二聚體偶聯至JAK2。JAK2作為同源二聚物活化。本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體之一個示例性實施例示於圖3。
為利用具有多個不同受體之AP1903,將異二聚細胞激素受體轉化為同源二聚物。
在一些實施例中,FKBP位於可誘導之嵌合細胞激素受體的N端處。在其他實施例中,FKBP位於可誘導之嵌合細胞激素受體的C端處。在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體具有跨膜域。在其他實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體缺少跨膜域。在一些實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體係經肉豆蔻醯基化。在其他實施例中,本文所提供的可誘導之嵌合細胞激素受體未經肉豆蔻醯基化。
實例 2 :小分子可誘導之 Epo 受體的比較
實例 2 :小分子可誘導之 Epo 受體的比較
該實例說明本文所提供的各種可誘導之嵌合細胞激素受體之功效。
在該研究中,測試以下可誘導之嵌合細胞激素受體之活性:
a. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-508;L241G、L242P)-V5 (SEQ ID NO:1)
b. V5-EpoR (273-508)
c. V5-EpoR (273-508)-FKBP (F36V)
d. V5-EpoR (273-508)-FKBP (E31G,F36V,R71G,K105E)
e. 肉豆蔻醯基-V5-EpoR (273-508)-FKBP (F36V)
f. 肉豆蔻醯基-V5-EpoR (273-508)-FKBP (E31G,F36V,R71G,K105E)
g. V5-EpoR (273-508)-FKBP (F36V)-FKBP (F36V) (SEQ ID NO 2)
h. V5-EpoR (273-508)-FKBP (E31G,F36V,R71G,K105E)-FKBP (E31G,F36V,R71G,K105E) (SEQ ID NO:3)
i. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-CD8(138-206)-EpoR (273-508)-V5
j. FKBP (F36V,L106P)-FKBP (F36V,L106P)-EpoR (273-508)-V5
k. FKBP (F36V,L106P)-EpoR (273-508)-V5
l. FKBP (F36V)-EpoR (273-508)-V5
m. FKBP (F36V)-FKBP (F36V)-EpoR (273-508)-V5
a. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-508;L241G、L242P)-V5 (SEQ ID NO:1)
b. V5-EpoR (273-508)
c. V5-EpoR (273-508)-FKBP (F36V)
d. V5-EpoR (273-508)-FKBP (E31G,F36V,R71G,K105E)
e. 肉豆蔻醯基-V5-EpoR (273-508)-FKBP (F36V)
f. 肉豆蔻醯基-V5-EpoR (273-508)-FKBP (E31G,F36V,R71G,K105E)
g. V5-EpoR (273-508)-FKBP (F36V)-FKBP (F36V) (SEQ ID NO 2)
h. V5-EpoR (273-508)-FKBP (E31G,F36V,R71G,K105E)-FKBP (E31G,F36V,R71G,K105E) (SEQ ID NO:3)
i. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-CD8(138-206)-EpoR (273-508)-V5
j. FKBP (F36V,L106P)-FKBP (F36V,L106P)-EpoR (273-508)-V5
k. FKBP (F36V,L106P)-EpoR (273-508)-V5
l. FKBP (F36V)-EpoR (273-508)-V5
m. FKBP (F36V)-FKBP (F36V)-EpoR (273-508)-V5
根據構築體名稱,受體包含膜靶向模體(CD8信號序列(CD8 SS)或肉豆蔻醯基)、二聚化域(FKBP (F36V)或其突變體)、包含跨膜(EpoR (237-272))之EpoR之一部分、JAK2結合模體(EpoR (273-338))及/或酪胺酸效應域(EpoR (339-508))。構築體亦可包含抗原決定基標籤(Myc或V5)以進行西方墨點法或流動分析。
將編碼可誘導之嵌合細胞激素受體之載體與STAT5轉錄因子(Promega E4651)之螢光素酶報導子一起轉染至HEK293T細胞中。報導子載體由在STAT5反應性DNA元件之控制下表現的螢火蟲螢光素酶組成。於加入紅血球生成素(Epo)後,紅血球生成素受體(EpoR)活化JAK2激酶,然後該JAK2激酶使EpoR細胞尾之酪胺酸磷酸化以產生STAT5之結合位點。然後,將所結合的STAT5磷酸化,活化STAT5以接合DNA模體且促進轉錄。將Epo加入至具有經EpoR轉染之細胞之樣品,及將AP1903加入至具有藉由使EpoR融合至FKBP而轉染之細胞之樣品。沒有將Epo或AP1903加入至樣品以評估基線信號傳導。STAT5檢定之結果概述於圖4。在圖4中,「配位體」為Epo或AP1903中任一者。
CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-508;L241G、L242P)-V5之信號傳導係最接近EpoR (1-508)陽性對照(圖4)。
此等結果證實某些AP1903可誘導之嵌合細胞激素受體可在藉由AP1903二聚化後有效地傳導信號以活化報導子。AP1903可誘導之嵌合細胞激素受體構築體CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-508;L241G、L242P)-V5證實強烈的活性。
實例 3A :可產生 IL2 、 IL7 、 IL12 、 IL21 及 IFNa/b 信號之嵌合小分子可誘導之 Epo 受體
實例 3A :可產生 IL2 、 IL7 、 IL12 、 IL21 及 IFNa/b 信號之嵌合小分子可誘導之 Epo 受體
藉由改變嵌合細胞激素受體(例如CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-細胞尾XYZ)之酪胺酸效應域(細胞尾),可將受體再導引至所選擇之信號傳導。所測試的可誘導之嵌合細胞激素受體利用CD8 SS膜靶向模體、FKBP (F36V)二聚化域、EpoR (237-338;L241G、L242P)酪胺酸激酶活化域、及來自EpoR、GHR、IL2Rb、IL7R、IL12Rb2、IL21R、IFNAR2或IFNLR1受體中任一者之酪胺酸效應域。缺少JAK2結合模體及酪胺酸效應子尾之陰性對照包括CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-282;L241G、L242P)。在該研究中測試以下可誘導之嵌合細胞激素受體:
a. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-EpoR (339-508)-V5 (SEQ ID NO 1)
b. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-GHR (353-638) (SEQ ID NO 4)
c. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL2Rb (333-551) (SEQ ID NO 5)
d. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (316-459) (SEQ ID NO 6)
e. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL12Rb2 (714-862) (SEQ ID NO 7)
f. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL12Rb2 (775-825) (SEQ ID NO 8)
g. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL21R (322-538) (SEQ ID NO 9)
h. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IFNAR2 (310-515) (SEQ ID NO 410)
i. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IFNLR1(300-520) (SEQ ID NO 11)
a. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-EpoR (339-508)-V5 (SEQ ID NO 1)
b. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-GHR (353-638) (SEQ ID NO 4)
c. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL2Rb (333-551) (SEQ ID NO 5)
d. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (316-459) (SEQ ID NO 6)
e. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL12Rb2 (714-862) (SEQ ID NO 7)
f. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL12Rb2 (775-825) (SEQ ID NO 8)
g. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL21R (322-538) (SEQ ID NO 9)
h. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IFNAR2 (310-515) (SEQ ID NO 410)
i. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IFNLR1(300-520) (SEQ ID NO 11)
用編碼以上可誘導之嵌合細胞激素受體之構築體短暫轉染HEK293細胞,且用針對於所示途徑之螢光素酶報導子轉染。用配位體處理細胞24小時。結果概述於圖5A中。在該研究中,「對照二聚物」為無尾構築體。
在圖5A中,黑箱誘導倍率>5。所有STAT4實驗均藉由共轉染STAT4來完成。
實例 3B :細胞尾域中之完整 JAK 結合域及可磷酸化之酪胺酸為信號傳導所必需
實例 3B :細胞尾域中之完整 JAK 結合域及可磷酸化之酪胺酸為信號傳導所必需
為識別可誘導之嵌合細胞激素受體信號傳導所必需的組分,吾人產生FKBP轉換,其缺少細胞尾域中之JAK結合域或酪胺酸殘基中之任一者。具體而言,來自TpoR (478-582)之任何一個或兩個JAK結合模體係經甘胺酸連接子置換,或IL7R (316-459)細胞尾中之全部或單個(即Y449)酪胺酸殘基係經突變為苯丙胺酸。術語「轉換」如實例部分中所用係指可誘導之嵌合細胞激素受體。例如,如本文所用「FKBP轉換」為可誘導之嵌合細胞激素受體,其包含作為二聚化域之FKBP。
使用HEK293T細胞報導子檢定來測試此等域中的每一個如何影響細胞激素信號傳導。簡言之,將20,000個HEK293T細胞接種至塗覆聚-L-離胺酸之96孔平底板的每個孔中且允許黏附過夜。將驅動螢火蟲螢光素酶(100 ng;Promega)及海腎螢光素酶對照報導子載體(1 ng;Promega)之嵌合細胞激素受體(2.5 ng)以最終體積5 uL混合於Opti-MEM (Gibco)中(「DNA混合物」)。在室溫下培養含在5 uL Opti-MEM中之0.3 uL脂質轉染胺2000 (Invitrogen) 5分鐘且然後加入至DNA混合物。在室溫下培養該混合物20分鐘且將總體積10 μL加入至包含HEK-293T的每個孔。在轉染後24小時,將細胞保持未處理,或用在無血清培養基中稀釋的指定濃度之AP1903(Apex Bio)處理,且使用Dual-Glo螢光素酶分析系統(Promega)處理後5小時確定Stat報導子活性。具有來自TpoR (478-582)之兩個完整JAK結合模體及未突變之IL7R (316-459)之FKBP轉換用作陽性對照。作為陰性對照(即模擬轉染),除嵌合細胞激素受體外,用所有組分轉染細胞。將Stat報導子活性之誘導倍率正規化至經除了可誘導之細胞激素受體之外且保持未處理之所有載體轉染之HEK293T細胞之誘導倍率。每種條件以一式三份設置孔。
圖5B顯示在AP1903處理後缺少指定域之FKBP轉換之Stat5報導子活性。與陽性對照相比,去除一個(即無JAK 2;IL7)或兩個(即無JAK 1,2;IL7) JAK結合模體消除AP1903誘導之Stat5報導子活性。類似地,IL7R (317-459)細胞尾中所有3個酪胺酸殘基突變為苯丙胺酸消除AP1903誘導之Stat5報導子活性。在該實例中,IL7R (317-459)細胞尾中之Y499經識別為介導Stat5活化之關鍵酪胺酸殘基。
實例 4 :用於同基因研究之小鼠受體
實例 4 :用於同基因研究之小鼠受體
產生工程化可誘導之受體之小鼠形式。由於FKBP高度保守,FKBP (F36V)序列未發生變化。然而,使用小鼠EpoR之跨膜及JAK2結合部分、及小鼠IL2Rb及IL7R受體之酪胺酸效應域。在該研究中測試以下可誘導之嵌合細胞激素受體:
a. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-muEpoR (236-337;L264G、L265P)-muIL2Rb (337-539) (SEQ ID NO 12)
b. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-muEpoR (236-337;L264G、L265P)-muIL7R (316-459) (SEQ ID NO 13)
a. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-muEpoR (236-337;L264G、L265P)-muIL2Rb (337-539) (SEQ ID NO 12)
b. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-muEpoR (236-337;L264G、L265P)-muIL7R (316-459) (SEQ ID NO 13)
將編碼可誘導之嵌合細胞激素受體之載體與STAT5之螢光素酶報導子一起轉染至HEK293T細胞中,且加入用於指定途徑之二聚化物。結果概述於圖6。
小鼠構築體能夠傳導信號(經短暫轉染之HEK293細胞上的配位體傳導信號6小時)(圖6)。
實例 5A :具有改良之信號傳導之可誘導之嵌合細胞激素受體
實例 5A :具有改良之信號傳導之可誘導之嵌合細胞激素受體
在另一個研究中,先前設計之EpoR部分(FKBP-EpoRm TM-EpoR JAK盒式細胞尾)係經其他同源二聚體細胞激素受體之相當域置換。為識別展示更強且/或更快之信號傳導之跨膜域,選擇EpoR二聚物傳導信號差的早期時間點(6-8小時,右圖)。
就該研究而言,使用其他方面相同的可誘導之細胞激素受體設計比較幾種酪胺酸激酶活化域。酪胺酸效應域由來自IL7R之STAT5活化序列融合至來自IL12Rb2之STAT4活化序列而組成。每個構築體包含膜靶向模體(CD8 SS)、二聚化域(FKBP (F36V))、衍生自EpoR、GP130、PrlR、GHR、GCSFR或TPOR/MPLR受體中任一者之酪胺酸激酶活化域、及由融合至IL12Rb2 (775-825)肽之IL7R (316-459)細胞尾組成之酪胺酸效應域。嵌合細胞激素受體亦包括用於檢測之抗原決定基標籤(Myc)。在該研究中測試以下可誘導之嵌合細胞激素受體:
a. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (316-459)-IL12Rb2 (775-825) (SEQ ID NO 14)
b. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-GP130(609-700)-IL7R (316-459)-IL12Rb2 (775-825) (SEQ ID NO 15)
c. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-PrlR (221-319)-IL7R (316-459)-IL12Rb2 (775-825) (SEQ ID NO 16)
d. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-GHR (251-352)-IL7R (316-459)-IL12Rb2 (775-825) (SEQ ID NO 17)
e. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-GCSFR (614-710)-IL7R (316-459)-IL12Rb2 (775-825) (SEQ ID NO 18)
f. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-TPOR/MPLR (478-582)-IL7R (316-459)-IL12Rb2 (775-825) (SEQ ID NO 19)
a. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (316-459)-IL12Rb2 (775-825) (SEQ ID NO 14)
b. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-GP130(609-700)-IL7R (316-459)-IL12Rb2 (775-825) (SEQ ID NO 15)
c. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-PrlR (221-319)-IL7R (316-459)-IL12Rb2 (775-825) (SEQ ID NO 16)
d. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-GHR (251-352)-IL7R (316-459)-IL12Rb2 (775-825) (SEQ ID NO 17)
e. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-GCSFR (614-710)-IL7R (316-459)-IL12Rb2 (775-825) (SEQ ID NO 18)
f. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-TPOR/MPLR (478-582)-IL7R (316-459)-IL12Rb2 (775-825) (SEQ ID NO 19)
用編碼以上可誘導之嵌合細胞激素受體之構築體及STAT4或STAT5中任一者之螢光素酶報導子轉染HEK293細胞。螢光素酶報導子(Promega)在STAT4或STAT5反應性元件中任一者之控制下編碼螢光素酶。由於HEK293細胞缺失STAT4,在經STAT4報導子轉染之孔中,轉染編碼連續表現之STAT4之質體。經轉染之EpoR、GHR及IL12Rb1+IL12Rb2 (IL12受體)用作陽性對照。結果概述於圖7、8、9及10A中。加入至可誘導之嵌合細胞激素受體之配位體為AP1903。將Epo加入至經EpoR轉染之細胞,將生長激素加入至經GHR轉染之細胞,及將IL-12加入至經IL12受體轉染之細胞。
具有EpoR組分之酪胺酸激酶活化域為最弱的信號傳導構築體(圖7)。STAT5及STAT4二者之最大誘導倍率係藉由基於TPOR/MPLR之二聚化物來達成:CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-TPOR/MPLR (478-582)-IL7R (316-459)-IL12Rb2 (775-825) (SEQ ID NO 19) (FIG.7)。
基於EpoR之細胞激素受體(CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (316-459)-IL12Rb2 (775-825) (SEQ ID NO 14))證實最低基礎信號傳導(基本上相當於單獨的報導子)。GCSFR構築體(CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-GCSFR (614-710)-IL7R (316-459)-IL12Rb2 (775-825) (SEQ ID NO 18))具有針對於STAT4之最強信號傳導(圖9)但具有基礎信號傳導。
實例 5B :藉由調節胞外域親和力來最佳化信號傳導輸出之效力
實例 5B :藉由調節胞外域親和力來最佳化信號傳導輸出之效力
為確定可誘導之嵌合細胞激素受體之無反應性/敏感性是否可藉由調節胞外域對其配位體之親和力來調諧,吾人產生藉由相同JAK結合域及細胞尾傳導信號但具有具有減少的對AP1903之親和力之FKBP胞外域變異體之FKBP轉換。
使用HEK293T細胞報導子檢定來測試胞外域親和力如何影響細胞激素信號傳導之無反應性。簡言之,將20,000個HEK293T細胞接種至塗覆聚-L-離胺酸之96孔平底板的每個孔中且允許黏附過夜。將驅動螢火蟲螢光素酶(100 ng;Promega)及海腎螢光素酶對照報導子載體(1 ng;Promega)之嵌合細胞激素受體(2.5 ng)以最終體積5 uL混合於Opti-MEM (Gibco)中(「DNA混合物」)。在室溫下培養含在5 uL Opti-MEM中之0.3 uL脂質轉染胺2000 (Invitrogen) 5分鐘且然後加入至DNA混合物。在室溫下培養該混合物20分鐘且將總體積10 μL加入至包含HEK-293T的每個孔。在轉染後24小時,將細胞保持未處理,或用在無血清培養基中稀釋的指定濃度之AP1903 (Apex Bio)處理,且使用Dual-Glo螢光素酶分析系統(Promega)處理後5小時確定Stat報導子活性。將Stat報導子活性之誘導倍率正規化至經除了可誘導之細胞激素受體之外且保持未處理之所有載體轉染之HEK293T細胞之誘導倍率。每種條件以一式三份設置孔。
圖10B顯示回應於AP1903之FKBP轉換胞外域變異體之Stat5報導子活性。與高親和力FKBP (F36V)突變體相比,削弱FKBP對AP1903之親和力之其他FKBP變異體亦增加Stat5誘導之EC50。
實例 5C :一種用於工程化具有改良的信號傳導能力之嵌合細胞激素受體之替代方法
實例 5C :一種用於工程化具有改良的信號傳導能力之嵌合細胞激素受體之替代方法
設計嵌合細胞激素受體之傳統方法涉及將一個受體之胞外配位體結合域融合至第二受體之跨膜及細胞內訊號域(Mol Ther. 2014年6月;22(6):1211-1220;Mol Ther. 2017年1月4日;25(1): 249–258;Nat Commun.2018年5月23日;9(1): 2034.)。吾人設計一種替代方法,其中吾人利用衍生自某些細胞激素受體之跨膜及JAK結合域,該等細胞激素受體(i)以其天然形式作為同源二聚物傳導信號,及(ii)當耦合至一個不同胞外域(即彼等描述於圖7中者)時保持作為嵌合體良好傳導信號之能力。在本發明方法中,一個受體之跨膜及細胞內JAK結合域係融合至第二受體之「細胞尾」(即在JAK結合域之後的區域)。
在圖7中,TpoR TM及JAK結合域產生最強的信雜比輸出。因此,吾人使用傳統方法藉由將TpoR之胞外域(TpoR/MPLR (1-478))融合至不同細胞激素受體之跨膜及細胞內域來產生基於TpoR之細胞激素受體嵌合體。吾人亦使用本發明方法藉由在與不同細胞激素受體之細胞尾融合之前融合包含TpoR跨膜及JAK2結合域之區域(即TpoR (478-582))來產生類似嵌合體。作為陽性對照,吾人使用編碼全長(FL) TpoR之載體。
HEK293T細胞報導子檢定法用於測試細胞激素信號傳導之可誘導性及程度。簡言之,將20,000個HEK293T細胞接種至塗覆聚-L-離胺酸之96孔平底板的每個孔中且允許黏附過夜。將驅動螢火蟲螢光素酶(100 ng;Promega)及海腎螢光素酶對照報導子載體(1 ng;Promega)之嵌合細胞激素受體(2.5 ng)以最終體積5 uL混合於Opti-MEM (Gibco)中(「DNA混合物」)。在室溫下培養含在5 uL Opti-MEM中之0.3 uL脂質轉染胺2000(Invitrogen)5分鐘且然後加入至DNA混合物。在室溫下培養該混合物20分鐘且將總體積10 μL加入至包含HEK-293T的每個孔。在轉染後24小時,將細胞保持未處理,用100 ng/ml TPO、或用在無血清培養基中稀釋之10 ug/mL AP1903 (Apex Bio)處理。將Stat報導子活性之誘導倍率正規化至經除了可誘導之細胞激素受體之外且保持未處理之所有載體轉染之HEK293T細胞之誘導倍率。每種條件以一式三份設置孔。
圖10C及10D顯示嵌合細胞激素受體工程化之傳統方法與本發明方法比較及對比之示意圖。雖然傳統方法(圖10C)僅將受體A之胞外域融合至跨膜域、JAK結合域及受體B之細胞尾,但本發明方法(圖10D)將受體A之胞外域、跨膜域及JAK結合域融合至受體B之細胞尾。
圖10E顯示在圖10F中測試的嵌合受體之示意圖。
圖10F顯示概述Stat報導子檢定之結果之熱圖。每行代表各別的融合搭配物;每列代表各別的Stat反應性螢火蟲螢光素酶報導子。每個框均描繪誘導倍率,每個柱係經正規化至各別的Stat報導子之最高誘導倍率:STAT1為2.75倍,STAT1/2為13.5倍,STAT3為354倍,STAT4為38倍,STAT5為173倍,及STAT6為10.5倍。與基於傳統設計之嵌合細胞激素受體相比,使用本發明方法設計的其等受體顯示回應於誘導物AP1903之更大量的下游信號傳導。
實例 6 :可誘導之嵌合細胞激素受體
實例 6 :可誘導之嵌合細胞激素受體
該實例說明具有改良且特定之功能之可誘導之嵌合細胞激素受體。
在一些實施例中,細胞激素尾可串聯連接以刺激多種途徑(例如,促持久性STAT5及促炎症性STAT4之IL7R (316-459)-IL12Rb2 (775-825)片段融合)。也就是說,在該實施例中,使用來自至少兩種受體之細胞激素尾。在一些其他實施例中,使用來自單個受體之細胞激素尾。
具有 STAT5 或 AP-1 輸出之最小酪胺酸效應域
具有 STAT5 或 AP-1 輸出之最小酪胺酸效應域
就每個細胞尾而言,小酪胺酸肽負責信號傳導途徑。識別相關模體以開發具有改良的信號傳導之顯著更小的構築體。例如,當用作酪胺酸效應域(參見實例3及5)時,確定包含Y800之IL12Rb2 (775-825)肽足以提供STAT4信號傳導。
在該研究中,分析IL2Rb、IL7R及EGFR細胞尾以識別足以用於信號傳導之關鍵態樣之酪胺酸。例如,包含STAT5相互作用酪胺酸Y418及Y436之IL2Rb區段可保留STAT5信號傳導,但可失去PI3K信號傳導,因為此需要IL2Rb細胞尾之Y364。包含IL7R、IL2Rb及IFNAR2尾之可誘導之嵌合細胞激素受體可包含細胞尾內的一或多個酪胺酸模體。在一些情況中消除尾(例如,IL12Rb2尾)的一或多個部分導致負調節模體之去除及更強之信號傳導。
在該研究中,測試使用基於EpoR之酪胺酸激酶活化域之各種IL7Ra及IL2Rb衍生的片段之信號傳導。在該研究中測試以下可誘導之嵌合細胞激素受體:
a. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (316-459) (SEQ ID NO 6)
b. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (376-416) (SEQ ID NO 20)
c. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (424-459) (SEQ ID NO 21)
d. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (376-416、424-459) (SEQ ID NO 22)
e. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (424-459;Y456F) (SEQ ID NO 23)
f. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (376-416、424-459;Y456F) (SEQ ID NO 24)
g. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL2Rb (333-551) (SEQ ID NO 5)
h. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL2Rb (393-433) (SEQ ID NO 25)
i. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL2Rb (518-551) (SEQ ID NO 26)
j. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL2Rb (339-379、393-433) (SEQ ID NO 27)
k. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL2Rb (339-379,518-551) (SEQ ID NO 28)
l. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL2Rb (393-433、518-551) (SEQ ID NO 29)
m. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL2Rb (339-379、393-433、518-551) (SEQ ID NO 30)
a. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (316-459) (SEQ ID NO 6)
b. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (376-416) (SEQ ID NO 20)
c. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (424-459) (SEQ ID NO 21)
d. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (376-416、424-459) (SEQ ID NO 22)
e. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (424-459;Y456F) (SEQ ID NO 23)
f. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (376-416、424-459;Y456F) (SEQ ID NO 24)
g. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL2Rb (333-551) (SEQ ID NO 5)
h. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL2Rb (393-433) (SEQ ID NO 25)
i. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL2Rb (518-551) (SEQ ID NO 26)
j. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL2Rb (339-379、393-433) (SEQ ID NO 27)
k. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL2Rb (339-379,518-551) (SEQ ID NO 28)
l. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL2Rb (393-433、518-551) (SEQ ID NO 29)
m. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL2Rb (339-379、393-433、518-551) (SEQ ID NO 30)
使用CD8 SS膜靶向模體、FKBP (F36V)二聚化域及EpoR (237-339;L241G、L242P)酪胺酸激酶活化域,測試IFNAR2構築體,但未藉由短(8小時)AP1903處理引發實質信號。繪製的構築體包括衍生自IL7R及IL2Rb細胞尾之酪胺酸效應域。
藉由STAT5之IL7信號傳導藉由包含Y401及Y449之兩個片段完全再建但沒有負調節Y456 (IL7R (376-416、424-459;Y456F);SEQ ID NO: 24;圖11)。藉由包含Y364、Y418及Y436之兩個片段再建IL2 STAT5信號傳導,但利用缺失Y364 (IL2Rb (393-433、518-551);SEQ ID NO: 29;圖11)之較小構築體觀察到更大的信號傳導。據報告Y364活化PI3K,PI3K促進T細胞分化及增殖且重新組織肌動蛋白骨架以促進受體內化。因此,Y364既是STAT5信號傳導之負調節模體,也是PI3K/AKT/TORC軸之關鍵正調節模體。根據所需的功能輸出,可包含或排除Y364。
非細胞激素受體
非細胞激素受體
在TCR活化後,Ca+移動導致NFAT之活化及促炎症性標靶(IL2、GzmB等)之上調。許多此等啟動子不係僅藉由NFAT活化,而係具有AP-1之NFAT之異源三聚物(Fos及Jun之捲曲螺旋)(圖12)。過度抗原刺激會發生耗儘,且認為在經活化之NFAT的量超過AP-1的量導致NFAT同源二聚物及不同啟動子之活化時發生。防止耗儘的一種方法係增加AP-1(Fos/Jun)的量(圖13)。細胞激素受體(諸如IL2R及IL7R)活化JNK(Jun激酶),其磷酸化且活化c-Jun。然而,單獨這一點不足以上調AP-1,因為Fos亦必須被上調及磷酸化。平行的MEK/ERK途徑導致Fos經Myc/Max上調、以及Fos之直接磷酸化。
AP-1藉由經協調之JNK及ERK信號傳導誘導。在一些實施例中,本文提供能夠活化JNK及/或MEK/ERK之可誘導之嵌合細胞激素受體。在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體可有效誘導AP-1以防止耗儘。
測試編碼以下可誘導之嵌合細胞激素受體之構築體之活性。每個構築體包含膜靶向模體(CD8 SS)、二聚化域(FKBP (F36V))、酪胺酸激酶活化域(EpoR (237-338;L241G、L242P))及衍生自RTK EGFR之細胞尾之酪胺酸效應域或細胞激素受體。嵌合細胞激素受體亦包括用於檢測之抗原決定基標籤(Myc):
a. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-EGFR (955-1186) (SEQ ID NO 31)
b. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-EGFR (955-1044,1058-1186;Y974F) (SEQ ID NO 32)
c. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-EGFR (955-1009;Y974F) (SEQ ID NO 33)
d.
e. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-EGFR (1019-1085) (SEQ ID NO 34)
f. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-EGFR (1037-1044,1058-1103;Y1068/1101F) (SEQ ID NO 35)
g. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-EGFR (1066-1118;Y1068/1086F) (SEQ ID NO 36)
h. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-EGFR (1122-1165) (SEQ ID NO 37)
i. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-EGFR (1133-1186;Y1148F) (SEQ ID NO 38)
j. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL2Rb (333-551) (SEQ ID NO 5)
k. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (316-459) (SEQ ID NO 6)
l. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL12Rb2 (714-862) (SEQ ID NO 7)
m. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL21R (322-538) (SEQ ID NO 9)
n. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IFNAR2 (310-515) (SEQ ID NO 410)
a. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-EGFR (955-1186) (SEQ ID NO 31)
b. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-EGFR (955-1044,1058-1186;Y974F) (SEQ ID NO 32)
c. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-EGFR (955-1009;Y974F) (SEQ ID NO 33)
d.
e. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-EGFR (1019-1085) (SEQ ID NO 34)
f. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-EGFR (1037-1044,1058-1103;Y1068/1101F) (SEQ ID NO 35)
g. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-EGFR (1066-1118;Y1068/1086F) (SEQ ID NO 36)
h. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-EGFR (1122-1165) (SEQ ID NO 37)
i. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-EGFR (1133-1186;Y1148F) (SEQ ID NO 38)
j. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL2Rb (333-551) (SEQ ID NO 5)
k. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (316-459) (SEQ ID NO 6)
l. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL12Rb2 (714-862) (SEQ ID NO 7)
m. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL21R (322-538) (SEQ ID NO 9)
n. CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IFNAR2 (310-515) (SEQ ID NO 410)
藉由上述構築體(用於指定的途徑之螢光素酶報導子)短暫轉染HEK293細胞。測定STAT5信號傳導。結果概述於圖14中。所有嵌合抗原受體之配位體為AP1903。最深色的盒表示誘導倍率>10。將FLT配位體加入至經轉染之Flt3受體酪胺酸激酶。經轉染之Flt3受體用作對照而不係EGFR,因為HEK293細胞表現內源性EGFR受體。
活化 PLC->NFkB 之受體
活化 PLC->NFkB 之受體
同種異體CAR-T細胞的一個缺點係TCR敲除或敲低(以防止GvHD)導致基礎TCR信號傳導缺失。基礎TCR信號傳導增加TCR持久性。雖然細胞激素可藉由STAT5增加持久性,此並不完全複製TCR。TCR移動Ca2+以活化PLC,導致NFAT及NFkB。
本文所提供的小分子可誘導之嵌合細胞激素受體已被工程化以移動鈣且活化NFAT及NFkB。
B細胞受體活化Bruton酪胺酸激酶(BTK),其然後活化PLCy2->PKC->NFAT及NFkB。在該情況中,BTK藉由酪胺酸激酶轉接蛋白BLNK上的酪胺酸識別靶標(圖15)。
產生包含以酪胺酸激酶活化域取代內源性BLNK-磷酸化激酶BTK之BLNK融合之可誘導之嵌合細胞激素受體(例如「CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-XYZ細胞尾」)(SEQ ID NO: 39、40及41)。在一些實施例中,可誘導之嵌合細胞激素受體包含串聯酪胺酸效應域,諸如細胞激素受體細胞尾及酪胺酸激酶轉接蛋白。
實例 7 :與 GoCART 相比,可誘導之嵌合細胞激素受體之二聚化對 CAR-T 細胞持久性之影響
實例 7 :與 GoCART 相比,可誘導之嵌合細胞激素受體之二聚化對 CAR-T 細胞持久性之影響
在該研究中,產生慢病毒(pLVX)構築體,其包含SFFV啟動子,接著係kozak序列、可誘導之嵌合細胞激素受體、T2A序列及嵌合抗原受體。嵌合抗原受體係針對於表現EGFRvIII之細胞。為比較,使用具有TagBFP或GoCART而非可誘導之嵌合細胞激素受體之慢病毒構築體。GoCART由肉豆蔻醯化序列組成,其後係融合至FKBP (F36V)之兩個複本之MyD88及CD40之一部分。
從人類周邊血液單核細胞中分離CD3+ T細胞且用IL-2培養。於分離後2天用慢病毒轉導T細胞,及3天後藉由結合經APC標記之EGFRvIII進行FACS分選。培養經分選之EGFRvIII+細胞培直至分離後14天。
在第14天,將0.5e6個細胞再懸浮於24孔板中,且在生產後用IL2、AP1903或不處理生長8天。活細胞計數結果概述於圖16及圖17。
包含AP1903可誘導之受體之幾種構築體促進輕微生長(例如CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL2Rb (333-551) (SEQ ID NO 5)及GoCART (前面報告的多聚化物、肉豆蔻醯基-Myd88-CD40-FKBP (F36V)x2,但僅CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-338;L241G、L242P)-IL7R (316-469) (SEQ NO 6)促進穩健生長(圖16)。與IL2處理(圖17)相比,包含受體及GoCART尾之IL7R (316-469)細胞尾保持就AP1903而言更高的活力(圖17)。
在用AP1903或IL2生長產生後第8天,將細胞表型化。結果概述於圖18及圖19之天然的TPOR/MPLR之胺基酸478-582。包含受體之可誘導之IL7R (316-469)證實更多的幹細胞記憶,而GoCART證實更少的幹細胞記憶及更多的效應子記憶。當用IL2進一步生長時,所有細胞的活力似乎相當;然而,GoCART似乎有點差異化。該等結果證實小分子可誘導之IL7R (316-469)受體促進增殖,同時保持較低分化狀態。
在第2天及第8天測定細胞激素。AP1903數據顯示於圖20及圖21之天然的TPOR/MPLR之胺基酸478-582。將所有值正規化至未處理的TagBFP-表現CAR-T細胞。隨著GoCART活化NFkB途徑,此導致穩健的細胞激素釋放,而其他則沒有。與IFN相關之尾確實會引起某種程度的細胞激素之釋放。
在沒有信號傳導下,所有構築體提供相當的生長(一週內倍增),包含具有IFNAR2尾之可誘導之嵌合細胞激素受體之細胞生長較少(圖22)。
測定在沒有任何處理下在產生後第2天及第8天誘導細胞激素。結果概述於圖23及圖24之天然的TPOR/MPLR之胺基酸478-582。表現小分子可誘導之IFNAR2 (310-515)構築體之CAR-T細胞組成型釋放少量IL5,同時表現小分子可誘導之IL2Rb (333-551)構築體之CAR-T細胞釋放IL13及一些TNFα(第2天,圖23),到第8天減少(第8天,圖24)。GoCART在第2天表現細胞GM-CSF、IL5、IL13、IL22及MIP1a,且在第8天時間點更多。該等結果證實IFNAR2 (310-515)及IL2Rb (333-551)尾輕微自動活化,同時GoCART強烈自動活化。從IL7R (316-459)尾構築體未觀察到細胞激素釋放,及在不存在小分子活化下觀察到所有可誘導之嵌合細胞激素受體構築體之最少細胞激素釋放。
圖25顯示經具有不同尾之可誘導之嵌合細胞激素受體轉導之CAR T細胞、GoCART、沒有JAK2結合模體或酪胺酸效應域之可誘導之細胞激素受體(CD8 SS-Myc-FKBP (F36V)-EpoR (237-282;L241G、L242P)或TagBFP在產生後第5天及第8天之CAR-T細胞數的圖。觀察到IFNAR2尾之生長最少;從第8天細胞激素測定,觀察到此等CAR T細胞不消耗儘可能多的IL-2。
本文所提供的AP1903可誘導之細胞激素受體為用於在CAR-T細胞中發起IFN、IL2、IL7、IL12、IL21、EGFR及其他基於酪胺酸激酶之信號傳導之穩健平臺。EpoR募集在同源二聚化(JAK2)後活化之激酶且磷酸化完全依賴於附著的細胞尾之信號傳導效應子。取決於CAR-T細胞中的所需的功能,可利用經工程化之細胞尾(例如,與IL12Rb2 (775-825)或EGFR細胞尾分融合之IL7細胞尾)來實現所需效應。亦可使用不同酪胺酸激酶活化域調節系統之信號強度。例如,可使用包含如本文所述的不同跨膜變異體之酪胺酸激酶活化域來調節信號強度。
IL7(316-450)酪胺酸效應域提供具有最小PI3K之STAT5信號傳導,其係足以促進生長而不驅動分化或細胞激素釋放。此外,IL7尾之內化及降解亦係較少的。
實例 8 :設計具有多重輸出之可誘導之細胞激素受體
實例 8 :設計具有多重輸出之可誘導之細胞激素受體
HEK293T細胞報導子檢定用於測試細胞激素信號傳導之可誘導性及程度。簡言之,將20,000個HEK293T細胞接種至塗覆聚-L-離胺酸之96孔平底板的每個孔中且允許黏附過夜。將驅動螢火蟲螢光素酶(100 ng;Promega)及海腎螢光素酶對照報導子載體(1 ng;Promega)之可誘導之細胞激素受體(2.5 ng)以最終體積5 uL混合於Opti-MEM(Gibco)中(「DNA混合物」)。在室溫下培養含在5 uL Opti-MEM中之0.3 uL脂質轉染胺2000 (Invitrogen) 5分鐘且然後加入至DNA混合物。在室溫下培養該混合物20分鐘且將總體積10 μL加入至包含HEK-293T的每個孔。在轉染後24小時,將細胞保持未處理,或用在無血清培養基中稀釋的1 ug/mL AP1903 (Apex Bio)處理。將Stat5報導子活性之誘導倍率正規化至經除了可誘導之細胞激素受體之外且保持未處理之所有載體轉染之HEK293T細胞之誘導倍率。
圖26顯示具有雙重IL-7R及IL-21R輸出之可誘導之細胞激素受體之示意性實例。由於細胞激素通常於增強T細胞反應上具有協同作用(例如IL-7與IL-21;IL-2與IL-21),因此模擬多種細胞激素信號傳導輸出之能力可能係有益的。為產生多種細胞激素信號傳導輸出,將兩個細胞尾在嵌合受體之細胞內C端處串聯連接。
當產生多個輸出時,單個細胞尾與細胞膜之接近可影響其各自的信號傳導輸出之強度。下表5顯示具有雙重輸出之可誘導之細胞激素受體的實例,其中每個輸出均係位於細胞膜的近端或遠端。
圖27顯示HEK293T細胞中Stat報導子活性之螢光素酶分析讀數。IL-21R細胞尾之膜遠端放置導致更大的Stat5 (圖27a)及Stat3 (圖27b)報導子活性。因此,不同細胞尾之最大信號傳導強度可另外藉由其與細胞膜之相對位置來調節。
為在初級人類CAR T細胞背景下評估此等雙重輸出可誘導之細胞激素受體,將可誘導之細胞激素受體選殖至編碼EGFRvIII-特異性CAR之慢病毒載體(2173 scFv;描述於Sci Transl Med. 2015年2月18日;7(275): 275ra22.)中以允許化學計量共同表現。為便於檢測經轉導之細胞,將v5抗原決定基標籤(KPIPNPLLGLDST)插入scFv與CD8鉸鏈域之間。為製備編碼FKBP轉換CAR之慢病毒,在第1天,將HEK293T細胞以0.45百萬個細胞/mL接種於6孔板每孔中補充10% FBS (Hyclone)之2 mL DMEM (Gibco)中。在第0天,藉由6孔板每孔在250 uL Opti-MEM (Gibco)中將慢病毒包裝載體1.5 ug psPAX2、0.5 ug pMD2G及0.5 μg適宜轉移CAR載體混合在一起來製備慢病毒(「DNA混合物」)。在室溫下培養含在250 uL Opti-MEM中之10 uL脂質轉染胺2000 (Invitrogen) 5分鐘且然後加入至DNA混合物。將該混合物在室溫下培養20分鐘且將總體積500 uL緩慢加入至包含HEK293T之孔的側面。在第0天,在Grex-24板(Wilson Wolf,目錄號80192M)中在補充100 IU/mL人類IL-2 (Miltenyi Biotec)、10% FBS(Hyclone)及人類T TransAct (Miltenyi Biotec,目錄號130-111-160,1:100稀釋液)之X-Vivo-15培養基(Lonza)中活化經純化之T細胞。在第1天,藉由2 mL/孔之T細胞轉導培養基(即補充10% FBS之X-Vivo-15)置換來自6孔板中HEK293T細胞之每個孔的培養基。在第2天,將T細胞以0.5百萬個細胞/mL再懸浮於Grex-24板的每孔1 mL T細胞轉導培養基中。收穫來自HEK293T細胞之慢病毒上清液且通過0.45微米過濾器(EMD Millipore)以除去細胞碎片,且接著與100 IU/mL人類IL-2一起加入至T細胞。在第5天,將4.5 mL T細胞擴增培養基(即補充5%人類AB血清(Gemini Bio)及100 IU/mL人類IL-2之X-Vivo-15)加入至Grex-24板的每個孔。使用T細胞擴增培養基根據需要將細胞擴增成更大的G-Rex血管(Wilson Wolf)。在第13天或第14天,藉由使用流動式細胞測量術檢測結合FITC結合之v5標籤單株抗體(Thermo Fisher)之T細胞之百分比來確定轉導效率。在第14天或第15天,將CAR-T細胞產物冷凍保存且根據需要解凍以用於進一步分析。
為確定經成功轉導之T細胞之百分比,首先將T細胞與FITC結合之v5標籤單株抗體(Thermo Fisher)在PBS+1% BSA中於4℃培養20分鐘。然後用PBS+1% BSA洗滌細胞,且使用流動式細胞測量術分析。
圖28A顯示包含圖28B及28C中所示細胞尾之FKBP轉換CAR載體的示意圖。
圖28B顯示如藉由v5標籤染色確定的FKBP轉換CAR T細胞之轉導效率。
為確定FKBP轉換CAR T細胞中細胞激素信號傳導之可誘導性及程度,將解凍的CAR T細胞產物在100 uL無血清RPMI (Corning)中於37℃、5% CO2下在潮濕培養箱中血清飢餓4小時,然後用1 ug/ml AP1903處理1小時。進入AP1903處理40分鐘後,將包含BUV395結合之抗人類CD3 (Biolegend)及FITC結合之v5標籤單株抗體(Thermo Fisher)之抗體混合物加入至細胞且允許培養最後20分鐘。在AP1903處理1小時後,藉由將35 uL 16%多聚甲醛加入至每個100 uL樣品來固定細胞且使其在37℃下培養15分鐘。然後用PBS洗滌細胞三次,且在-20℃下在100%冷甲醇中透化1或2夜。在FACS分析當天,用PBS洗滌細胞三次,Fc阻斷,且用在PBS+1% BSA中稀釋的AlexaFluor647結合之抗小鼠/人類Stat5(pY694) (BD Biosciences)染色。在室溫下在黑暗中培養1小時後,在FACS分析之前將細胞洗滌三次。
圖28C左下圖顯示藉由FACS分析的AP1903誘導之pStat5染色。與HEK293T報導子檢定一致,初級人類CAR T細胞之結果顯示膜遠端IL-21R細胞尾導致更大的pStat5誘導。
表 5 :具有雙重輸出之可誘導之細胞激素受體之實例
實例 9 : FKBP 轉換允許 CAR T 細胞中可調節之細胞激素信號傳導
表 5 :具有雙重輸出之可誘導之細胞激素受體之實例
為確定回應於AP1903之FKBP轉換CAR T細胞中細胞激素信號傳導之可調性,將攜帶IL-7R (316-459)細胞尾之FKBP轉換CAR T細胞在100 uL無血清RPMI (Corning)中在潮濕培養箱中於37℃、5% CO2下血清飢餓4小時,然後用所指定工作濃度之AP1903處理1小時。進入AP1903處理40分鐘後,將包含BUV395結合之抗人類CD3 (Biolegend)及FITC結合之v5標籤單株抗體(Thermo Fisher)之抗體混合物加入至細胞且允許培養最後20分鐘。在AP1903處理1小時後,藉由將35 uL 16%多聚甲醛加入至每個100 uL樣品來固定細胞且使其在37℃下培養15分鐘。然後用PBS洗滌細胞三次,且在-20℃下在100%冷甲醇中透化1或2夜。在FACS分析當天,用PBS洗滌細胞三次,Fc阻斷,且用在PBS+1% BSA中稀釋的AlexaFluor647結合之抗小鼠/人類Stat5 (pY694) (BD Biosciences)染色。在室溫下在黑暗中培養1小時後,在FACS分析之前將細胞洗滌三次。
圖29顯示FKBP轉換CAR+ T細胞中之Stat5活化隨著AP1903以劑量依賴性方式增加。此外,細胞激素信號傳導係FKBP轉換CAR+ T細胞特異性的,因為pStat5在FKBP轉換CAR+ T細胞中(而不係在相同培養物中的CAR-T細胞中)特異性地誘導。此表明FKBP轉換特異性地遞送細胞激素信號至治療性CAR+ T細胞,同時(i)防止旁觀者免疫活化,其將加速同種異體CAR T細胞排斥及(ii)避免與全身性細胞激素投與相關之毒性。
實例 10 : FKBP 轉換之 AP1903 誘導之活化增強 CAR T 細胞之抗腫瘤活性
實例 10 : FKBP 轉換之 AP1903 誘導之活化增強 CAR T 細胞之抗腫瘤活性
WM266.4及DMS 273細胞為購自Sigma之DLL3+靶細胞系。為藉由IncuCyte活細胞分析成像系統促進靶細胞成像,藉由用IncuCyte NucLight Green慢病毒試劑(Sartorius)慢病毒轉導以核GFP穩定地標記WM266.4及DMS 273細胞以分別產生WM266.4-nucGFP及DMS 273-nucGFP。將FKBP轉換選殖至DLL3 CAR (26C8 scFv)中以允許化學計量之共同表現。
為測試FKBP轉換CAR T細胞是否在AP1903之存在下反复暴露至靶細胞後顯示增強之靶細胞裂解及效力,吾人利用活體外連續殺死分析,其中將少量之CAR-T細胞與過量之標靶共培養。此等苛刻的條件使得單個CAR-T細胞連續裂解多個靶細胞;反過來,CAR-T細胞將經歷增殖且最終分化及衰竭。接種5,000個WM266.4-nucGFP靶細胞且允許在具有黑色壁及平坦透明底部之96孔板中於包含10% FBS (Hyclone)、非必需胺基酸、丙酮酸鈉及20-25 mM HEPES之50 uL RPMI中附著。將攜帶FKBP轉換之DLL3 CAR T細胞或對照CAR T細胞解凍且以效應子:標靶(E:T)比為1:9加入至所接種的靶細胞。
圖30A顯示攜帶使用的具有雙重輸出(IL7Ra(316-459)/IL12Rb2 (775-825)細胞尾)之FKBP轉換之DLL3 CAR的示意圖。
圖30B及圖30C顯示DLL3 CAR T細胞對DLL3+靶細胞之活體外細胞毒性。雖然缺失FKBP轉換之對照CAR T細胞未能以此種低的、次優的E:T比有效地裂解靶細胞(圖30B),但AP1903誘導之FKBP轉換之活化顯著增強CAR T細胞之細胞毒性(圖30C)。因此,AP1903增強FKBP轉換CAR T細胞之效力。
CAR T細胞療法中的挑戰係腫瘤靶標之低表現水平,其導致次優的CAR活化及細胞毒性。為測試FKBP轉換活化是否增強CAR T細胞對低靶表現細胞之敏感性,吾人利用具有低DLL3表面表現之DMS 273-nucGFP靶細胞系(400 DLL3/細胞)。接種5,000個DMS 273-nucGFP靶細胞且允許在具有黑色壁及平坦透明底部之96孔板中於包含10% FBS (Hyclone)、非必需胺基酸、丙酮酸鈉及20-25 mM HEPES之50 uL RPMI中附著。將攜帶FKBP轉換之DLL3 CAR T細胞或對照CAR T細胞解凍且以效應子:標靶(E:T)比為1:1加入至所接種的靶細胞。
圖30D及圖30E顯示DLL3 CAR T細胞對表現低水平之DLL3之靶細胞之活體外細胞毒性。圖30D顯示即使在1:1之較高E:T比下,對照CAR T細胞亦係無效的。相反,圖30E顯示FKBP轉換活化增強CAR T細胞之細胞毒性且增加其對低靶表現細胞之敏感性。
接下來,吾人使用人類腫瘤異種移植模型在活體內詢問FKBP轉換CAR T細胞之活性。藉由用全長人類EGFRvIII穩定轉導,從人類神經膠質母細胞瘤細胞系LN229(ATCC)衍生得LN229-EGFRvIII。將200 uL無血清RPMI中的300萬個LN229-EGFRvIII細胞經皮下植入至NSG小鼠中。從植入後第21天開始,使用數字測徑規藉由測徑規測量監測腫瘤生長。使用公式腫瘤體積=(寬度^2 x 長度/2)計算得腫瘤大小。在植入後第24天,基於腫瘤體積,將小鼠隨機分成8組,及每組的平均腫瘤體積為200 mm3。在植入後第25天,將未轉導的T細胞(NTD)、對照CAR T細胞及攜帶IL7Ra(316-459)/IL12Rb2 (775-825)細胞尾之FKBP轉換CAR-T細胞解凍且根據標準程序計數。將細胞再懸浮於無血清RPMI中且以100 uL/小鼠之體積經靜脈內註射300萬個CAR+細胞/小鼠。T細胞輸注後第二天及此後,每組亦每週接受腹膜內輸注5 mg/kg AP1903或媒劑對照(每組n = 8)。然後每3-4天監測腫瘤直至研究結束。
圖31A-31H顯示每組治療小鼠之腫瘤進展及總存活期。與對照CAR T細胞及與經與媒劑對照共同投與之FKBP轉換CAR T細胞相比,藉由AP1903活化FKBP轉換導致顯著增強的腫瘤控制(圖31A),允許更持久且完全之抗腫瘤反應(圖31B-31G)及延長之總存活期(圖31H)。
實例 11 : FKBP 轉換之 AP1903 誘導之活化增強 CAR T 細胞之增殖及移植
實例 11 : FKBP 轉換之 AP1903 誘導之活化增強 CAR T 細胞之增殖及移植
臨床試驗顯示患者對CD19 CAR T細胞療法之反應與高血清穩態細胞激素(例如IL-15)水平相關,此對於驅動CAR T細胞增殖及移植之初始爆發至關重要(J Clin Oncol.2017年6月1日;35(16):1803-1813.)。此外,不像在血液性惡性病中,其中循環中的靶細胞易於被CAR T細胞接近,實體腫瘤之治療可能需要CAR T細胞在滲出及滲透實體腫瘤之前在循環中花更長的時間;因此,靶依賴性、細胞激素支持之CAR T細胞增殖及存活尤其重要。因此,吾人研究單獨的AP1903是否足以驅動標靶獨立的CAR T細胞增殖及持久性。
用指定濃度之AP1903且於不存在外源細胞激素(除非在陽性對照之情況下指定)或靶細胞下培養攜帶IL7R (316-459)/IL12Rb2 (775-825)細胞尾之對照CAR T細胞或FKBP轉換2週。作為陽性對照,CAR T細胞可替代地補充外源性重組IL-7(10 ng/mL;Miltenyi)及IL-12p70 (10 ng/mL;Biolegend)以模擬藉由FKBP轉換活化傳遞之雙重IL-7R/IL12Rb2輸出。在2週培養結束時,測定存活的CAR T細胞之數量及品質。簡言之,收穫來自每種培養條件細胞之一式兩份樣品且使用Zombie NIR可確定的存活率套組(Biolegend)染色。用PBS洗滌樣品,Fc阻斷,然後用在PBS+1% BSA中稀釋的以下抗體混合物染色:BUV395結合之抗人類CD3、BV510結合之抗人類CD8、BV605結合人類CD4及FITC結合之v5標籤(用於CAR檢測)、PE/Cy7結合之抗人類CD62L (Biolegend)及BV785結合之抗人類CD45RO(Biolegend)。最後,在PBS中洗滌樣品且在FACS分析之前將細胞沉澱再懸浮於包含123count eBeads計數珠(Thermo Fisher)之130 μL PBS+1% BSA(10 μL計數珠含在120 uL PBS+1% BSA中)中。
圖32A顯示AP1903驅動之CAR T細胞之增殖;虛線表示補充外源IL7及IL12p70之CAR T細胞之增殖倍率。與缺失FKBP轉換之衰減之對照CAR T細胞相反,經AP1903處理之FKBP轉換CAR T細胞有效地增殖。值得注意地,低為1 ng/ml的AP1903足以達到藉由外源細胞激素補充所達到的增殖水平。
圖32B顯示在2週培養結束時存活的CAR T細胞之絕對數量及記憶T細胞表型。除了增加CAR T細胞之數量外,FKBP轉換之活化亦改良CAR T細胞之品質,此藉由維持及增殖幹細胞記憶(Tscm)及中樞記憶(Tcm) CAR+ T細胞(其為介導持久的抗腫瘤保護之長壽、自我更新之群體)來證明。
實例 12 :工程化基礎信號傳導減少之可誘導之細胞激素受體
實例 12 :工程化基礎信號傳導減少之可誘導之細胞激素受體
在配位體之存在下,呈天然形式之同源二聚體細胞激素/生長因子受體(例如EpoR及TpoR)依賴於JAK2活化之兩個要求:(i)受體同源二聚化及(ii)由跨膜區介導之受體旋轉,該跨膜區使兩個JAK2足夠接近以進行反式磷酸化及活化。已顯示,即使在配位體之存在下,藉由突變跨膜區中之關鍵胺基酸殘基來消除受體旋轉亦會消除受體信號傳導。真正可誘導之受體在不存在誘導物之情況下需要乾淨的OFF(無基礎活性),且需要寬動態範圍之配位體誘導之ON以獲得最大可調性。來自同源二聚體細胞激素/生長因子受體之酪胺酸活化域證實不同程度之基礎信號傳導(圖9)。已顯示EpoR及TpoR在不存在配位體之情況下以單體形式與同源二聚體形式間的某一平衡存在,且發現該自發性同源二聚化係藉由其跨膜域介導;因此,吾人假設在本發明未經處理之嵌合細胞激素受體中所觀察到的滲漏係歸因於藉由其跨膜域介導之自發性配位體非依賴性同源二聚化。
為減少本發明嵌合細胞激素受體中之基礎信號傳導,吾人將EpoR/TpoR之跨膜區以PD-1之跨膜區置換,PD-1係呈單體天然存在的。HEK293T細胞報導子檢定用於評估在不存在AP1903之情況下之基礎信號傳導、以及在存在AP1903之情況下細胞激素信號傳導之誘導性及大小。簡言之,將20,000個HEK293T細胞接種至塗覆聚-L-離胺酸之96孔平底板的每個孔中且允許黏附過夜。將驅動螢火蟲螢光素酶(100 ng;Promega)及海腎螢光素酶對照報導子載體(1 ng;Promega)之可誘導之細胞激素受體(2.5 ng)以最終體積5 uL混合於Opti-MEM(Gibco)中(「DNA混合物」)。在室溫下培養含在5 uL Opti-MEM中之0.3 uL脂質轉染胺2000(Invitrogen)5分鐘且然後加入至DNA混合物。在室溫下培養該混合物20分鐘且將總體積10 μL加入至包含HEK-293T的每個孔。轉染後24小時,不處理細胞以評估AP1903非依賴性基礎信號傳導,或用在無血清培養基中稀釋的指定濃度之AP1903(Apex Bio)處理。將Stat5報導子活性之誘導倍率正規化至經除了可誘導之細胞激素受體之外且保持未處理之所有載體轉染之HEK293T細胞之誘導倍率。
圖33A及圖33B分別顯示每個嵌合受體在不存在AP1903之情況下之基礎信號傳導,如藉由Stat5及Stat4報導子活性測定。與攜帶在不存在AP1903之情況下顯示顯著基礎Stat活性之TpoR跨膜區之嵌合受體相比,用PD-1跨膜區取代消除基礎Stat活性至與僅包含FKBP胞外域且缺失任何JAK活化域及細胞尾之構築體相當的水平。在一些實施例中,可使用跨膜域之插入及/或缺失突變進一步最佳化可誘導之嵌合細胞激素受體之基礎信號傳導,如圖38C中所示。
圖33C及圖33D分別顯示每個嵌合受體對指定濃度之AP1903之反應,如藉由Stat5及Stat4報導子活性測定。與具有TpoR跨膜域之對應物相比,攜帶PD1跨膜區之FKBP轉換變異體數量上相當地回應於AP1903處理。儘管跨膜域亦被認為對於受體之旋轉活化係關鍵的,但用TpoR跨膜區取代PD-1之跨膜區保留AP1903誘導之Stat活化。總之,吾人證實PD-1跨膜區可與來自同源二聚體細胞激素/生長因子受體之酪胺酸活化域組合使用以減少基礎信號傳導同時保留配位體誘導之受體活化。
為測試藉由PD1跨膜區取代是否保留嵌合受體之細胞毒性活性,吾人比較共同表現任一受體變異體之CAR T細胞之細胞毒性活性及AP1903驅動之增殖。就活體外細胞毒性檢定而言,接種5,000個U87KO-EGFRvIII-nucGFP靶細胞且允許在具有黑色壁及平坦透明底部之96孔板中於包含10% FBS (Hyclone)、非必需胺基酸、丙酮酸鈉及20-25 mM HEPES之50 uL RPMI中附著。U87KO-EGFRvIII為來自Cellectis SA (Paris,France)之一種產品。U87KO-EGFRvIII係衍生自親本細胞系U87MG (ATCC),藉由首先使用轉錄活化因子樣效應子核酸酶(TALEN)敲除內源野生型EGFR,然後藉由慢病毒轉導穩定地過度表現全長人類EGFRvIII。為藉由IncuCyte活細胞分析成像系統促進靶細胞成像,藉由用IncuCyte NucLight Green慢病毒試劑(Sartorius)進行第二次慢病毒轉導,從U87KO-EGFRvIII衍生得U87KO-EGFRvIII-nucGFP靶細胞。將攜帶具有TpoR或PD1 TM之FKBP轉換之EGFRvIII CAR (2173 scFv) T細胞解凍且以1:4之效應子:標靶(E:T)比加入至所接種的靶細胞。將指定濃度之AP1903加入至每個孔。每種條件以一式兩份設置孔。
圖34A顯示攜帶IL7R (316-459)/IL12Rb2 (775-825)細胞尾之具有TpoR TM域或PD1 TM域之FKBP轉換CAR的示意圖;共同表現FKBP胞外域(FKBP僅控制CAR)且不含任何JAK活化域及細胞尾之CAR T細胞用作對照。
圖34B-34D顯示雖然對照CAR T細胞未藉由AP1903處理增強,但攜帶TpoR TM域或PD1 TM域之FKBP轉換在AP1903之存在下相當地增強。因此,藉由PD1 TM域取代可減少基礎FKBP轉換活性,同時保留AP1903可誘導之轉換受體活化及信號傳導。
接下來,吾人測試藉由PD1跨膜區取代是否保留AP1903驅動之嵌合受體之增殖。用指定濃度之AP1903且於不存在外源細胞激素(除非在陽性對照之情況下指定)或靶細胞下培養攜帶任一種跨膜變異體之對照CAR T細胞或FKBP轉換2週。作為陽性對照,CAR T細胞可替代地補充外源性重組IL-7 (10 ng/mL;Miltenyi)及IL-12p70 (10 ng/mL;Biolegend)以模擬藉由FKBP轉換活化傳遞之雙重IL-7R/IL12Rb2輸出。在2週培養結束時,測定存活的CAR T細胞之數量及品質。簡言之,收穫來自每種培養條件細胞之一式兩份樣品且使用Zombie NIR Fixable Viability套組(Biolegend)染色。用PBS洗滌樣品,Fc阻斷,然後用在PBS+1% BSA中稀釋的以下抗體混合物染色:BUV395結合之抗人類CD3、BV510結合之抗人類CD8、BV605結合人類CD4及FITC結合之v5標籤(用於CAR檢測)、PE/Cy7結合之抗人類CD62L (Biolegend)及BV785結合之抗人類CD45RO (Biolegend)。最後,在PBS中洗滌樣品且在FACS分析之前將細胞沉澱再懸浮於包含123count eBeads計數珠(Thermo Fisher)之130 μL PBS+1% BSA (10 μL計數珠含在120 uL PBS+1% BSA中)中。
圖34E顯示在指定濃度之AP1903或在經外源補充之IL-7及IL-12p70中培養2週後的活CAR+ T細胞的數量。如所預期,AP1903不支持增殖及存活對照CAR T細胞,而外源IL7及IL12p70支持對照及FKBP轉換CAR T細胞之增殖及存活。在存在AP1903之情況下,具有PD1跨膜域之FKBP轉換CAR T細胞與其之攜帶TpoR跨膜區之對應物相比同等或更佳地增殖。
圖34F顯示每個記憶隔室中CAR+ T細胞的數量。與攜帶TpoR跨膜區之對應物相比,具有PD1跨膜域之FKBP轉換CAR T細胞在維持Tscm及Tcm CAR+細胞回應於AP1903時相等或更佳。此等發現證實具有減少的基礎信號傳導之PD1跨膜變異體在初級人類CAR T細胞之背景下保留轉換受體之可誘導性及功能性。
實例 13 :藉由 AP1903 驅動之 CAR T 細胞增殖改良 CAR T 細胞生產
實例 13 :藉由 AP1903 驅動之 CAR T 細胞增殖改良 CAR T 細胞生產
雖然慢病毒能夠提供相對較大的貨物,但增加有效負載-諸如藉由共同表現FKBP轉換——不可避免地降低病毒滴度及隨後的轉導效率。CAR T細胞生產的習知方法需要在高劑量之經補充之細胞激素(例如IL-2、IL-7及/或IL-15)之存在下增殖經轉導之T細胞,該等高劑量之經補充之細胞激素將增殖相同培養物中的經轉導之(CAR+)及未轉導之(CAR-) T細胞。由於FKBP轉換之活化可傳遞能夠驅動CAR T細胞增殖及濃化之細胞激素信號,吾人利用此點並假設用AP1903取代經補充之細胞激素可克服FKBP轉換CAR T細胞生產期間之低轉導效率。
在第0天,在Grex-24板(Wilson Wolf,目錄號80192M)中在補充100 IU/mL人類IL-2 (Miltenyi Biotec)、10% FBS(Hyclone)及人類T TransAct (Miltenyi Biotec,目錄號130-111-160,1:100稀釋液)之X-Vivo-15培養基(Lonza)中活化經純化之T細胞。在第2天,將T細胞以0.5百萬個細胞/mL再懸浮於Grex-24板(Wilson Wolf,目錄號80192M)的每孔1 mL T細胞轉導培養基中。如以上所述製備慢病毒上清液且在第2天進行轉導。在第5天,當轉導完成時,洗滌細胞以除去殘留的人類IL-2,再懸浮於新鮮的T細胞擴增培養基(即補充5%人類AB血清(Gemini Bio)之X-Vivo-15)中,且在Grex-24孔板中於20 ng/ml人類IL-2或指定濃度之AP1903中擴增。使用T細胞擴增培養基根據需要將細胞擴增成更大的G-Rex血管(Wilson Wolf)。在第5天、第9天及第15天,藉由使用流動式細胞測量術檢測結合FITC結合之v5標籤單株抗體(Thermo Fisher)之T細胞之百分比來確定CAR+ T之濃化。
圖35A顯示使用各種細胞尾的對照BFP CAR及FKBP轉換CAR的示意圖。圖35B-E顯示在IL-2或AP1903中擴增之CAR+ T細胞之百分比,如藉由指定天數之FACS分析測定。如所預期,由於培養物中CAR+及CAR- T細胞群之等效增殖,在20 ng/ml人類IL-2中之增殖維持穩定百分比之CAR+ T細胞。另一方面,儘管AP1903不濃化BFP CAR T細胞(圖35B),但在第5天與第14天之間使用AP1903代替IL-2以劑量依賴性方式逐漸濃化FKBP轉換CAR T細胞(圖35C-E);此外,FKBP轉換藉由IL7Ra(316-459)/IL12Rb2 (775-825)(圖35C)、IL2Rb (393-433、518-551)/IL21R (322)、IL2Rb (393-433、518-551)/IL21R (322-538)(圖35D)及IL7Ra(316-459)/IL21R (322-538)(圖35E)傳遞各種信號傳導輸出,可達成有效的CAR T細胞濃化。
實例 14 :回應於抗體及其他多聚化配位體 / 誘導物誘導細胞激素信號傳導
實例 14 :回應於抗體及其他多聚化配位體 / 誘導物誘導細胞激素信號傳導
由於二聚化可活化可誘導之嵌合細胞激素受體,合理地,藉由恰當的胞外域,抗體(或抗體衍生之分子)及多聚化配位體/誘導物亦將活化信號傳導。
為評估被抗體活化,吾人生成攜帶人類OX40(1-214)胞外域之嵌合細胞激素受體且測試其在基於HEK293T細胞之Stat報導子檢定中回應於臨床抗-OX40抗體(GSK109)傳導信號之能力。簡言之,將20,000個HEK293T細胞接種至塗覆聚-L-離胺酸之96孔平底板的每個孔中且允許黏附過夜。將驅動螢火蟲螢光素酶(100 ng;Promega)及海腎螢光素酶對照報導子載體(1 ng;Promega)之OX40胞外域細胞激素受體(2.5 ng)以最終體積5 uL混合於Opti-MEM (Gibco)中(「DNA混合物」)。在室溫下培養含在5 uL Opti-MEM中之0.3 uL脂質轉染胺2000 (Invitrogen) 5分鐘且然後加入至DNA混合物。在室溫下培養該混合物20分鐘且將總體積10 μL加入至包含HEK-293T的每個孔。在轉染後24小時,將細胞保持未處理,或用在無血清培養基中稀釋的抗-OX40抗體GSK109處理,且使用Dual-Glo螢光素酶分析系統(Promega)處理後5小時確定Stat報導子活性。將Stat報導子活性之誘導倍率正規化至經除了OX40胞外域細胞激素受體之外且保持未處理之所有載體轉染之HEK293T細胞之誘導倍率。每種條件設置四個孔。
圖36A顯示攜帶OX40胞外域之嵌合細胞激素受體的示意圖。圖36B-36C顯示回應於抗體之細胞激素信號傳導之活化。圖36B-36C顯示在不存在及存在抗-OX40抗體GSK109之情況下之Stat5(36B)及Stat4 (36C)報導子活性。OX40胞外域之抗體介導之二聚化誘導下游細胞激素信號傳導,如藉由Stat5及Stat4報導子活性之增加所反映。
為測試配位體誘導物及胞外域組是否可進一步延伸超過AP1903-FKBP (F36V)配對,吾人測試回應於其他多聚體配位體誘導物之信號傳導。由於配位體之腫瘤壞死家族(TNF)超家族為三聚體,其等以多聚體方式接合其各自的受體。因此,吾人將衍生自TNFR2超家族受體之胞外域(諸如BCMA(1-54)、TACI(1-165)及BAFFR (1-78))融合至本發明嵌合細胞激素受體之跨膜及訊號域,且測試回應於可溶性三聚體配位體之信號傳導。簡言之,將20,000個HEK293T細胞接種至塗覆聚-L-離胺酸之96孔平底板的每個孔中且允許黏附過夜。將驅動螢火蟲螢光素酶(100 ng;Promega)及海腎螢光素酶對照報導子載體(1 ng;Promega)之嵌合細胞激素受體(2.5 ng)以最終體積5 uL混合於Opti-MEM(Gibco)中(「DNA混合物」)。在室溫下培養含在5 uL Opti-MEM中之0.3 uL脂質轉染胺2000 (Invitrogen)5分鐘且然後加入至DNA混合物。在室溫下培養該混合物20分鐘且將總體積10 μL加入至包含HEK-293T的每個孔。在轉染後24小時,將細胞保持未處理,或用在無血清培養基中稀釋的可溶性BAFF或APRIL三聚物處理,且使用Dual-Glo螢光素酶分析系統(Promega)處理後5小時確定Stat報導子活性。將Stat報導子活性之誘導倍率正規化至經除了OX40胞外域細胞激素受體之外且保持未處理之所有載體轉染之HEK293T細胞之誘導倍率。每種條件設置4個孔。
圖37A顯示衍生自所測試的TNFR2超家族之各種胞外域的示意圖。圖37B為受體BCMA、TACI及BAFFR與其配位體BAFF及APRIL間之相互作用(Drug Des Devel Ther. 2015年1月7日;9:333-47.)的示意圖。圖37C-37D顯示回應於多聚體配位體誘導物之細胞激素信號傳導之活化。圖37C-37D顯示回應於可溶性BAFF及APRIL三聚物之Stat5(37C)及Stat4 (37D)報導子活性。藉由可溶性BAFF三聚物多聚化各自的嵌合細胞激素受體誘導Stat5及Stat4活化,及藉由可溶性APRIL三聚物多聚化BCMA胞外域細胞激素受體誘導下游Stat活化。
實例 15 :藉由修改 TPOR TM 螺旋來最佳化 FKBP 轉換之信號傳導強度及靈敏度
實例 15 :藉由修改 TPOR TM 螺旋來最佳化 FKBP 轉換之信號傳導強度及靈敏度
已確認TpoR之螺旋跨膜(TM)區藉由控制JAK2活化對於配位體誘導之受體信號傳導而言至關重要。吾人假設在嵌合細胞激素轉換中,其中不同胞外域(例如FKBP)係與TpoR TM/JAK2活化域融合,可擾亂受體活化之最佳結構構形。利用TM區在TpoR活性中的重要性,吾人試圖藉由修改TpoR TM區來增加FKBP轉換之反應性。為此,吾人在TpoR TM區中產生具有缺失或插入之FKBP轉換變異體且在HEK293T細胞報導子檢定中測試其等。
簡言之,將20,000個HEK293T細胞接種至塗覆聚-L-離胺酸之96孔平底板的每個孔中且允許黏附過夜。將FKBP轉換(2.5 ng)(驅動螢火蟲螢光素酶(100 ng;Promega)及海腎螢光素酶對照報導子載體(1 ng;Promega)之Stat5反應元件)以最終體積5 uL混合於Opti-MEM(Gibco)中(「DNA混合物」)。攜帶野生型TpoR跨膜域之FKBP轉換用作比較子。在室溫下培養含在5 uL Opti-MEM中之0.3 uL脂質轉染胺2000 (Invitrogen) 5分鐘且然後加入至DNA混合物。在室溫下培養該混合物20分鐘且將總體積10 μL加入至包含HEK-293T的每個孔。在轉染24後小時,將細胞保持未處理,或用在無血清培養基中稀釋的指定濃度之AP1903 (APEX Bio)處理。在處理後24小時,使用Dual-Glo螢光素酶分析系統(Promega)評估Stat5報導子活性。將Stat5報導子活性之誘導倍率正規化至經除了轉換受體之外且保持未處理之所有載體轉染之HEK293T細胞之誘導倍率。
圖38A-38C顯示TpoR跨膜域修飾對FKBP轉換之信號傳導之強度及靈敏度之影響。
圖38A-38B顯示野生型TpoR及各種TM缺失(圖38A)或插入(圖38B)變異體之胺基酸序列。
圖38C顯示在不存在或存在AP1903之情況下攜帶TpoR TM缺失(圖38A)及插入(圖38B)之FKBP轉換變異體之反應。用矩形框突出顯示的為攜帶野生型TpoR TM域之FKBP轉換,TM變異體係衍生自該野生型TpoR TM域。與攜帶野生型TpoR TM域之FKBP轉換(即FKBP轉換)相比,TpoR TM缺失變異體(諸如TpoR (478-582;N-3)、TpoR (478-582;N-5)、TpoR (478-582);N-6)及TpoR (478-582;N-7))增加AP1903誘導之Stat5活性之強度。此外,幾種TpoR TM變異體亦增加回應於極低濃度之AP1903 (即1 ng/ml或0.1 ng/ml)之敏感性,且TpoR (478-582;N-7)及TpoR (478-582;N)-9)係最敏感的。此等證實調節TpoR TM區增強FKBP轉換對AP1903之反應性及靈敏度。
實例 16 :藉由不同及組合細胞尾信號輸出控制 CAR T 細胞分化
A. 將細胞尾組合以活化添加劑信號傳導途徑
實例 16 :藉由不同及組合細胞尾信號輸出控制 CAR T 細胞分化
A. 將細胞尾組合以活化添加劑信號傳導途徑
在TCR活化後,Ca+移動導致NFAT之活化及促炎症性標靶(IL2、GzmB等)之上調。許多此等啟動子不係僅藉由NFAT活化,而係具有AP-1之NFAT之異源三聚物(Fos及Jun之捲曲螺旋)。過度抗原刺激會發生耗儘,且認為在經活化之NFAT的量超過AP-1的量導致NFAT同源二聚物及不同啟動子之活化時發生。防止耗儘的一種方法係增加AP-1(Fos/Jun)的量。細胞激素受體(諸如IL2R及IL7R)活化JNK(Jun激酶),其磷酸化且活化c-Jun。然而,單獨這一點不足以上調AP-1,因為Fos亦必須被上調及磷酸化。平行的MEK/ERK途徑導致Fos經Myc/Max上調、以及Fos之直接磷酸化。因此,活化JNK及MEK/ERK之假定受體將導致更多的AP-1。EGF受體(EGFR)為熟知活化MEK/ERK信號傳導途徑之受體酪胺酸激酶之一。藉由使用EGFR細胞尾,吾人證實穩健地活化Myc/Max且因此活化Fos之能力。藉由將EGFR及IL7R細胞尾組合,吾人證實成功誘導AP-1及Myc/Max信號傳導途徑,此阻止CAR T細胞之最終分化及耗儘。
為測試藉由不同細胞尾活化之信號傳導途徑,吾人使用HEK293T細胞報導子檢定。簡言之,將20,000個HEK293T細胞接種至塗覆聚-L-離胺酸之96孔平底板的每個孔中且允許黏附過夜。將可誘導之細胞激素受體(2.5 ng) (驅動螢火蟲螢光素酶(100 ng;Promega)及海腎螢光素酶對照報導子載體(1 ng;Promega)之各自的轉錄因子元件)以最終體積5 uL混合於Opti-MEM(Gibco)中(「DNA混合物」)。在室溫下培養含在5 uL Opti-MEM中之0.3 uL脂質轉染胺2000(Invitrogen)5分鐘且然後加入至DNA混合物。在室溫下培養該混合物20分鐘且將總體積10 μL加入至包含HEK-293T的每個孔。作為陰性對照,將FKBP胞外域偶聯至缺失JAK結合域及細胞尾(即TpoR CTRL)之TpoR (478-528)之跨膜及短細胞內區。作為比較,將FKBP胞外域偶聯至MyD88/CD40訊號域(以下稱為「FKBP-MyD88-CD40」)。在轉染24後小時,將細胞保持未處理,或用在無血清培養基中稀釋的1 ug/mL AP1903 (Apex Bio)處理。在AP1903處理後6小時,使用Dual-Glo螢光素酶分析系統(Promega)測定Stat5報導子活性。將Stat5報導子活性之誘導倍率正規化至經除了可誘導之細胞激素受體之外且保持未處理之所有載體轉染之HEK293T細胞之誘導倍率。
圖39A顯示所測試的嵌合受體的示意圖。
圖39B顯示使用單個細胞尾及細胞尾之組合之HEK293T細胞中報導子活性之螢光素酶分析讀數的結果。每行代表各自的轉錄因子反應性螢火蟲螢光素酶報導子;每列代表攜帶各自的細胞尾/訊號域之嵌合受體。每個框描繪誘導倍率,每行係經正規化至各自的螢火蟲螢光素酶報導子之最高誘導倍率。如所預期,單個細胞尾輸出活化所需的信號傳導途徑,其中IL7R (316-459)活化Stat5,IL12Rb2small(775-825)活化Stat4,及EGFR (1122-1165)活化AP-1及Myc/Max途徑。當將其自身活化不同信號傳導路徑上的個別細胞尾組合時,隨之產生加成效應-在AP1903之存在下,IL7R (316-459)/IL12Rb2small(775-825)細胞尾誘導Stat5及Stat4活化,而IL7R (316-459)/EGFR (1122-1165)細胞尾誘導Stat5(儘管程度較低)、AP-1及Myc/Max活化。與FKBP-細胞尾受體之可誘導性相比,FKBP-MyD88-CD40受體在不存在AP1903之情況下顯示高的基礎信號傳導。
B. 藉由不同細胞尾輸出傾斜T 細胞細胞毒性效應子活性及記憶分化
B. 藉由不同細胞尾輸出傾斜T 細胞細胞毒性效應子活性及記憶分化
熟知IL-12信號傳導促進T細胞細胞毒性及效應子分化;另一方面,圖Fb表明EGFR信號傳導可阻止T細胞衰竭且促進記憶T細胞之產生。為測試藉由不同細胞尾活化的不同信號傳導途徑是否可控制CAR T細胞效應子功能及記憶分化,吾人共同表現攜帶相同跨膜及JAK2結合域之(單獨地或雙重串聯地)具有不同細胞尾之FKBP轉換。
為測試不同細胞尾輸出是否影響CAR T細胞之效應子功能,吾人進行4天的活體外細胞毒性檢定。簡言之,接種30,000個U87KO-EGFRvIII-nucRFP靶細胞且允許在具有黑色壁及平坦透明底部之96孔板中於包含10% FBS (Hyclone)、非必需胺基酸、丙酮酸鈉及20-25 mM HEPES之50 uL RPMI中附著。U87KO-EGFRvIII為來自Cellectis SA (Paris,France)之一種產品。U87KO-EGFRvIII係衍生自親本細胞系U87MG (ATCC),藉由首先使用轉錄活化因子樣效應子核酸酶(TALEN)敲除內源野生型EGFR,然後藉由慢病毒轉導穩定地過度表現全長人類EGFRvIII。為藉由IncuCyte活細胞分析成像系統促進靶細胞成像,藉由用IncuCyte NucLight Red慢病毒試劑(Sartorius)進行第二次慢病毒轉導,從U87KO-EGFRvIII衍生得U87KO-EGFRvIII-nucRFP 靶細胞。將攜帶具有各自的細胞尾之FKBP轉換之EGFRvIII CAR (2173 scFv) T細胞解凍且以1:8之效應子:標靶(E:T)比加入至所接種的靶細胞。作為比較,包括共同表現FKBP-MyD88-CD40之CAR T細胞。將孔保持未處理或用500 ng/ml AP1903 (ApexBio)處理。藉由使用Incucyte活細胞分析成像系統計算得活核RFP+細胞的數量來確定每個時間點的活靶細胞的數量。每種條件以一式兩份設置孔。
在4天的細胞毒性分析結束時,旋轉平板且收集上清液以用於分析細胞激素釋放,使用MSD分析(Meso Scale Discovery)。
圖40A-40F顯示在不存在或存在AP1903之情況下,單獨地或雙重串聯地攜帶不同細胞尾之FKBP轉換之活體外細胞毒性檢定的結果。
圖40A-40C顯示所測試的幹細胞/中樞記憶(Tscm/Tcm)T細胞促進細胞尾(即IL7R (316-459)及EGFR (1122-1165))之細胞毒性活性。在4天的相對短的時間範圍內,IL7R (316-459)及EGFR (1122-1165)-單獨地或組合地-在AP1903之存在下不增強CAR T細胞細胞毒性。此可能係預期的,因為雖然Tscm/Tcm記憶表型之T細胞長期自我更新且存活期更長,但亦展示執行細胞毒性效應子功能之延遲。
圖40D-40E顯示IL12Rb2small(775-825)細胞尾之細胞毒性活性,其模擬IL-12信號傳導以促進效應子記憶/效應子(Tem/Temra)T細胞分化。IL12Rb2small(775-825)細胞尾-單獨或在與IL7R (316-459)組合時-在AP1903之存在下增強CAR T細胞細胞毒性效力。
圖40F顯示攜帶FKBP-MyD88-CD40之CAR T細胞之細胞毒性活性。不像圖40A-40E中之細胞尾,攜帶FKBP-MyD88-CD40之CAR T細胞在不存在AP1903之情況下顯示增強之殺死活性。此外,AP1903之加入沒有進一步增強細胞毒性,表明FKBP-MyD88-CD40受體係具有高基礎活性且缺失可誘導性之受體。
圖41A-41B顯示在不存在及存在AP1903之情況下,在4天的細胞毒性分析結束時培養物上清液中細胞激素之水平。每行顯示在不存在或存在AP1903之情況下各自的細胞尾,每列顯示所分析的各別細胞激素。將每個柱正規化至所分析的各自的細胞激素之最高濃度,將其設定為100%。
圖41A顯示所有細胞尾(但不包括FKBP-MyD88-CD40受體)之細胞激素之釋放。在AP1903之存在下,包含促進效應子之IL12Rbsmall(775-825)細胞尾之FKBP轉換釋放升高量之促發炎性細胞激素,包括IL-17A/F、IL-21、TNFα及IFNg。有趣地,IL12Rbsmall(775-825)細胞尾亦導致IL-10分泌之增加,此可能係回應於強烈炎症性信號藉由負反饋機制而產生。
圖41B顯示所有細胞尾以及FKBP-MyD88-CD40受體之細胞激素之釋放。與攜帶細胞尾之FKBP轉換相比,即使在不存在AP1903之情況下,FKBP-MyD88-CD40受體亦分泌升高水平之細胞激素,此一結果與其高基礎活性一致。
為測試不同細胞尾輸出是否影響CAR T細胞之記憶分化及長期存活期,吾人進行AP1903驅動之生長分析。將攜帶指定的嵌合受體之CAR T細胞解凍且藉由添加未轉導之T細胞將CAR+細胞之百分比正規化至具有最低轉導效率(即20% CAR+)之樣品。將細胞保持未處理,或用500 ng/ml之AP1903且在不存在外源細胞激素(除非在陽性對照之情況下指定)或靶細胞之情況下處理2週。作為陽性對照,CAR T細胞可替代地補充外源性重組IL-7或IL-2 (各10 ng/mL;Miltenyi)。在AP1903驅動之生長分析的第5天,使用MSD分析(Meso Scale Discovery)針對於上清液進行取樣以用於分析細胞激素之釋放。在2週培養結束時,測定存活的CAR T細胞之記憶及衰竭表型。簡言之,收穫來自每種培養條件細胞之一式兩份樣品且使用Zombie NIR Fixable Viability套組(Biolegend)染色。用PBS洗滌樣品,Fc阻斷,然後用在PBS+1% BSA中稀釋的以下抗體混合物染色:BUV395結合之抗人類CD3、BV510結合之抗人類CD8、BV605結合人類CD4及FITC結合之v5標籤(用於CAR檢測)、PE/Cy7結合之抗人類CD62L (Biolegend)、BV785結合之抗人類CD45RO(Biolegend)、APC結合之抗人類PD-1 (Biolegend)、BV711結合之抗人類Tim-3 (Biolegend)及PerCP/eFluor710結合之抗人類Lag-3 (eBioscience)。最後,將樣品在PBS中洗滌且將細胞沉澱再懸浮於PBS+1% BSA中以用於FACS分析。
圖42A-42B顯示在AP1903之存在下AP1903驅動之生長的第5天培養物上清液中細胞激素之水平。每行顯示在AP1903之存在下之各別訊號域,每列顯示所分析的各別細胞激素。將每個柱正規化至所分析的各自的細胞激素之最高濃度,將其設定為100%。
圖42A顯示所有細胞尾(但不包括FKBP-MyD88-CD40受體)之細胞激素之釋放。包含IL12Rbsmall(775-825)之細胞尾分泌升高量之促發炎性細胞激素,包括IL-17A/F、IL-21、TNFα,且尤其係IFNg。
圖42B顯示所有細胞尾以及FKBP-MyD88-CD40受體之細胞激素之釋放。與FKBP-MyD88-CD40受體相比,在AP1903驅動之生長期間FKBP-細胞尾嵌合受體之細胞激素之釋放總體上較低。
圖43顯示AP1903驅動之攜帶細胞尾之CAR T細胞之濃化。虛線表示在分析開始時接種之CAR+細胞之百分比(即20%)。如所預期,用外源性重組IL-7或IL-2處理促進相同培養物中CAR+及CAR- T細胞之增殖及存活,導致CAR+細胞穩定維持在~20%。相反地,用AP1903處理選擇並濃化表現FKBP-細胞尾受體之CAR T細胞,表明生長及存活優勢係具有CAR+ T細胞特異性的。
圖44A-44G顯示在AP1903驅動之增殖的第14天CAR T細胞之記憶子集分佈。與消除Stat5活性之IL7R (424-459;Y456F)細胞尾相比(圖5B),Stat5感受態IL7R (316-459)細胞尾促進Tscm CAR+ T細胞濃化至等於或優於外源性重組IL-7之程度。此外,與用外源性重組IL-7或IL-2治療相比,AP1903誘導之EGFR (1122-1165)細胞尾之活化-單獨地或與IL7R (316-459)組合地-導致Tcm CAR+ T細胞群濃化,表明EGFR (1122-1165)細胞尾信號傳導促進Tcm分化。
圖45A-45G顯示在AP1903驅動之增殖的第14天CAR+ T細胞之耗儘表型。與消除Stat5活性之IL7R (424-459;Y456F)細胞尾相比(圖5B),Stat5感受態IL7R (316-459)細胞尾有效地抑制PD-1、Tim-3及Lag-3之表現至等於或優於外源性重組IL-7之程度。此外,與用外源性重組IL-7或IL-2治療相比,AP1903誘導之EGFR (1122-1165)細胞尾之活化-單獨地或與IL7R (316-459)組合地-抑制Tim-3及Lag-3之表現。
總之,長壽命CAR T細胞之濃化可藉由併入促進記憶且防止耗儘之細胞尾(諸如IL7R (316-459)及/或EGFR (1122-1165))來實現;然而,藉由併入促進效應子之細胞尾(諸如Il12Rb2small(775-825)),可有利於具有有效且立即之細胞毒性功能之CAR T細胞。
儘管已參考各種應用、方法、套組及組合物描述所揭示的教示,但應瞭解,在不脫離本文之教示及下面所主張的發明下,可進行各種改變及修改。提供前述實例以更佳地說明所揭示的教示而不旨在限制本文所給出的教示之範圍。雖然已根據此等示例性實施例描述本發明教示,但熟習此項技術者將容易瞭解,此等示例性實施例之許多變化及修改係可能的,而無需過多的實驗。所有此類變化及修改均在當前教示之範圍內。
本文引述的所有參考文獻(包括專利、專利申請案、論文、教科書及類似、以及其中引述的參考文獻)在其等尚未引述的範圍內以全文引用的方式併入本文中。若所併入的文獻及類似材料中之一或多者與本申請案不同或相矛盾(包括(但不限於)所定義的術語、術語用法、所描述的技術或類似),則由本申請案控制。
前面的描述及實例詳述本發明之某些特定實施例且描述發明人設想的最佳模式。然而,應瞭解,無論前述內容如何詳細地出現在文本中,本發明可以多種方式來實施及本發明應根據隨附申請專利範圍請求項及其任何等效物來解釋。
圖1描繪示例性可誘導之嵌合細胞激素受體的示意圖。
圖2A描繪FKBP結合雷帕黴素(rapamycin)以抑制mTOR的示意圖。
圖2B描繪FKBPF36V
結合至雷帕黴素樣化合物的示意圖。
圖2C描繪AP1903將FKBPF36V
二聚化的示意圖。
圖3描繪示例性可誘導之嵌合細胞激素受體的示意圖。
圖4描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的STAT5檢定之結果的條形圖。
圖5A描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖5B描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖6描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖7描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖8描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖9描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖10A描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖10B描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖10C描繪顯示工程化嵌合細胞激素受體之傳統方法的示意圖。
圖圖10D描繪顯示在本發明中用於工程化嵌合細胞激素受體所使用之方法的示意圖。
圖10E描繪在實例5C之基於細胞之報導子檢定中所測試的嵌合受體的示意圖。
圖10F描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖11描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖12描繪AP-1結合至啟動子序列之NFAT的示意圖。
圖13描繪導致經Myc/Max上調Fos之MEK/ERK途徑的示意圖。
圖14描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖15描繪BTK途徑的示意圖。
圖16描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞生長之影響的圖。
圖17描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞存活率之影響的圖。
圖18描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞表型之影響的圖。
圖19描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞表型之影響的圖。
圖20描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞激素釋放之影響的圖。
圖21描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞激素釋放之影響的圖。
圖22描繪概述在不存在信號傳導下所示可誘導之嵌合細胞激素受體對增殖之影響的圖。
圖23描繪概述在不存在信號傳導下所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞激素釋放之影響的圖。
圖24描繪概述在不存在信號傳導下所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞激素釋放之影響的圖。
圖25描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞生長之影響的圖。
圖26描繪具有雙重酪胺酸效應域之示例性可誘導之細胞激素受體的示意圖。
圖27A描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖27B描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖28A描繪包含CAR及可誘導之細胞激素受體之示例性構築體的示意圖。
圖28B顯示經包含顯示於圖28A中之構築體之載體轉導之T細胞的轉導效率。
圖28C描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體之FACS分析測試功能之結果的圖。
圖29描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的FACS分析之結果的圖。
圖30A描繪包含CAR及可誘導之細胞激素受體之示例性構築體的示意圖。
圖30B描繪概述測試所示CAR-T細胞之細胞毒性的活體外檢定之結果的圖。
圖30C描繪概述測試所示CAR-T細胞之細胞毒性的活體外檢定之結果的圖。
圖30D描繪概述測試所示CAR-T細胞之細胞毒性的活體外檢定之結果的圖。
圖30E描繪概述測試所示CAR-T細胞之細胞毒性的活體外檢定之結果的圖。
圖31A描繪概述所示治療組之腫瘤體積檢定之結果的圖。
圖31B描繪概述所示治療組之腫瘤體積檢定之結果的圖。
圖31C描繪概述所示治療組之腫瘤體積檢定之結果的圖。
圖31D描繪概述所示治療組之腫瘤體積檢定之結果的圖。
圖31E描繪概述所示治療組之腫瘤體積檢定之結果的圖。
圖31F描繪概述所示治療組之腫瘤體積檢定之結果的圖。
圖31G描繪概述所示治療組之腫瘤體積檢定之結果的圖。
圖31H描繪概述所示治療組之總體存活率的圖。
圖圖32A描繪概述所示CAR-T細胞之擴增的圖。
圖32B描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞表型之影響的圖。
圖33A描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖33B描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖33C描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖33D描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖34A描繪包含CAR及可誘導之細胞激素受體之示例性構築體的示意圖。
圖34B描繪概述測試所示CAR-T細胞之細胞毒性的活體外檢定之結果的圖。
圖30C描繪概述測試所示CAR-T細胞之細胞毒性的活體外檢定之結果的圖。
圖30D描繪概述測試所示CAR-T細胞之細胞毒性的活體外檢定之結果的圖。
圖34E描繪概述測試所示CAR-T細胞之擴增之檢定之結果的圖。
圖34F描繪概述測試所示CAR-T細胞之擴增之檢定之結果的圖。
圖35A描繪包含CAR及可誘導之嵌合細胞激素受體之示例性構築體的示意圖。
圖35B描繪顯示包含所示可誘導之嵌合細胞激素受體之對照CAR-T細胞之擴增的圖。
圖35C描繪顯示包含所示可誘導之嵌合細胞激素受體之CAR-T細胞之擴增的圖。
圖35D描繪顯示包含所示可誘導之嵌合細胞激素受體之CAR-T細胞之擴增的圖。
圖35E描繪顯示包含所示可誘導之嵌合細胞激素受體之CAR-T細胞之擴增的圖。
圖36A描繪示例性可誘導之嵌合細胞激素受體的示意圖。
圖36B描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖36C描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖37A描繪示例性可誘導之嵌合細胞激素受體的示意圖。
圖37B為受體BCMA、TACI及BAFFR與其配位體BAFF及APRIL間之相互作用的示意圖。
圖37C描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖37D描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖38A顯示野生型TpoR及各種跨膜缺失變異體之胺基酸序列。
圖38B顯示野生型TpoR及各種跨膜插入變異體之胺基酸序列。
圖38C描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖39A描繪示例性可誘導之嵌合細胞激素受體的示意圖。
圖39B描繪概述測試所示可誘導之嵌合細胞激素受體之功能的基於細胞之報導子檢定之結果的圖。
圖40A描繪概述包含所示可誘導之嵌合細胞激素受體之CAR-T細胞之活體外細胞毒性檢定之結果的圖。
圖40B描繪概述包含所示可誘導之嵌合細胞激素受體之CAR-T細胞之活體外細胞毒性檢定之結果的圖。
圖40C描繪概述包含所示可誘導之嵌合細胞激素受體之CAR-T細胞之活體外細胞毒性檢定之結果的圖。
圖40D描繪概述包含所示可誘導之嵌合細胞激素受體之CAR-T細胞之活體外細胞毒性檢定之結果的圖。
圖40E描繪概述包含所示可誘導之嵌合細胞激素受體之CAR-T細胞之活體外細胞毒性檢定之結果的圖。
圖40F描繪概述包含所示嵌合受體之CAR-T細胞之活體外細胞毒性檢定之結果的圖。
圖41A描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞激素釋放之影響的圖。
圖41B描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞激素釋放之影響的圖。
圖42A描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞激素釋放之影響的圖。
圖42B描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞激素釋放之影響的圖。
圖43描繪概述包含所示嵌合細胞激素受體之CAR-T細胞之濃化的圖。
圖44A描繪概述包含所示嵌合細胞激素受體之CAR-T細胞之記憶子集分佈的圖。
圖44B描繪概述包含所示嵌合細胞激素受體之CAR-T細胞之記憶子集分佈的圖。
圖44C描繪概述包含所示嵌合細胞激素受體之CAR-T細胞之記憶子集分佈的圖。
圖44D描繪概述包含所示嵌合細胞激素受體之CAR-T細胞之記憶子集分佈的圖。
圖44E描繪概述包含所示嵌合細胞激素受體之CAR-T細胞之記憶子集分佈的圖。
圖44F描繪概述包含所示嵌合細胞激素受體之CAR-T細胞之記憶子集分佈的圖。
圖44G描繪概述包含所示嵌合細胞激素受體之CAR-T細胞之記憶子集分佈的圖。
圖45A描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞表型之影響的圖。
圖45B描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞表型之影響的圖。
圖45C描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞表型之影響的圖。
圖45D描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞表型之影響的圖。
圖45E描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞表型之影響的圖。
圖45F描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞表型之影響的圖。
圖45G描繪概述所示可誘導之嵌合細胞激素受體對細胞表型之影響的圖。
Claims (110)
- 一種可誘導之嵌合細胞激素受體,其包含: 二聚化域; 酪胺酸激酶活化域;及 酪胺酸效應域。
- 如請求項1之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該酪胺酸激酶活化域包含蛋白質之(或衍生自其之)詹納斯激酶(JAK)結合域。
- 如請求項1之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該酪胺酸激酶活化域包含受體酪胺酸激酶(RTK)之(或衍生自其之)酪胺酸激酶域。
- 如請求項2或3之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該酪胺酸激酶活化域包含跨膜域。
- 如請求項1至4中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該酪胺酸效應域包含受體之(或衍生自其之)至少一個STAT活化域。
- 如請求項1至5中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該酪胺酸效應域包含兩種受體之(或衍生自其之)至少兩個STAT活化域。
- 如請求項1至6中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該酪胺酸效應域包含至少一個受體酪胺酸激酶(RTK)之(或衍生自其之)細胞質尾之一部分。
- 如請求項1至7中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該二聚化域結合至配位體AP1903、AP20187、二聚體FK506或二聚體FK506樣類似物。
- 如請求項1至8中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該二聚化域包含FKBP多肽。
- 如請求項9之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該FKBP多肽為FKBP12多肽。
- 如請求項10之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該FKBP12多肽包含胺基酸取代F36V (SEQ ID NO: 218)。
- 如請求項1至8中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該二聚化域包含選自由如下組成之群之胺基酸序列:(i)包含一或多個胺基酸取代之FKBP多肽,(ii)未經修飾之FKBP多肽之兩個或三個串聯重複序列,及(iii)包含一或多個胺基酸取代之FKBP多肽之兩個或三個串聯重複序列。
- 如請求項1至8中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該二聚化域包含選自SEQ ID NO: 69-87之二聚化域序列。
- 如請求項1至8中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該二聚化域包含選自SEQ ID NO.69-73之FKBP二聚化域序列。
- 如請求項1至8中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該二聚化域包含多肽之(或衍生自其之)胺基酸序列,該多肽選自由如下組成之群:FKBP12、FKBP12 (F36V)、OX-40之胞外域及TNFR2超家族受體之胞外域。
- 如請求項15之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該TNFR2超家族受體為BCMA、TACI或BAFFR。
- 如請求項1至7中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該二聚化域結合小分子。
- 如請求項1至7中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該二聚化域結合蛋白質。
- 如請求項1至7中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該二聚化域包含蛋白質之(或衍生自其之)胺基酸序列,該蛋白質選自由如下組成之群:FKBP、親環素、類固醇結合蛋白、雌激素結合蛋白、糖皮質激素結合蛋白、維生素D結合蛋白、四環素結合蛋白、細胞激素受體之胞外域、受體酪胺酸激酶、TNFR家族受體及免疫輔受體。
- 如請求項19之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該免疫輔受體係選自由如下組成之群:紅血球生成素受體、催乳素受體、生長激素受體、血小板生成素受體、粒細胞群落刺激因子受體、GP130、共同γ鏈受體、共同β鏈受體、IFNα受體、IFNγ受體、IFNλ受體、IL2/IL15受體、IL3受體、IL4受體、IL5受體、IL7受體、IL9受體、IL10受體、IL12受體、IL13受體、IL20受體、IL21受體、IL22受體、IL23受體、IL27受體、TSLP受體、G-CSF受體、GM-CSF受體、CNTF受體、OSM受體、LIF受體、CT-1受體、TGFBR1/ALKL5、TGFBR2、EGFR/HER1、ERBB2/HER2、ERBB3/HER3、ERRB4/HER4、INSR、IGF-1R、IRR、PDGFRA、PDGFRB、CSF-1R、KIT/SCFR、FLK2/FLT3、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4、CCK4、TRKA、TRKB、TRKC、MET、RON、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR1、DDR2、RET、ROS、LTK、ALK、ROR1、ROR2、MUSK、AATYK、AATYK2、AATYK3、RTK106、TNFR1、Fas、TRAILR1、TRAILR2、NGFR、DR3、DR6、EDAR、TNFR2、LTbR、OX40、CD40、CD27、CD30、4-1BB、RANK、Fn14、TACI、BAFFR、HVEM、BCMA、GITR、TROY、RELT、XEDAR、TRAILR3、TRAILR4、OPG、DcR3、PD-1、CD80、CD86、ICOS-L、ICOS、CTLA-4、BTLA、CD160、LAG3及TIM3。
- 如請求項2之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該蛋白質為受體。
- 如請求項21之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該受體為激素受體。
- 21或22之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該蛋白質或該受體係選自由EPOR、GP130、PRLR、GHR、GCSFR及TPOR/MPLR組成之群。
- 如請求項3之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該RTK係選自由如下組成之群:EGFR/HER1、ERBB2/HER2、ERBB3/HER3、ERRB4/HER4、INSR、IGF-1R、IRR、PDGFRA、PDGFRB、CSF-1R、KIT/SCFR、FLK2/FLT3、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4、CCK4、TRKA、TRKB、TRKC、MET、RON、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR1、DDR2、RET、ROS、LTK、ALK、ROR1、ROR2、MUSK、AATYK、AATYK2、AATYK3及RTK106。
- 如請求項3或24之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該RTK為EGFR。
- 如請求項1至25中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該酪胺酸激酶活化域包含選自SEQ ID NO.: 88-133之酪胺酸激酶活化域序列。
- 如請求項4至26中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該跨膜域包括蛋白質之(或衍生自其之)跨膜域,該蛋白質選自由如下組成之群:EPOR、GP130、PRLR、GHR、GCSFR、PD-1及TPOR/MPLR。
- 如請求項4至27中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該跨膜域包括衍生自TPOR/MPLR之跨膜域。
- 如請求項4至27中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該跨膜域係衍生自SEQ ID No.: 64之天然的TPOR/MPLR序列之胺基酸478-582。
- 如請求項4至27中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該跨膜域包含SEQ ID No.: 64之天然的TPOR/MPLR序列之胺基酸區478-582之缺失變異體。
- 如請求項30之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該缺失變異體包含SEQ ID No.: 64之天然的TPOR/MPLR序列之區域478-582中1至18個胺基酸之缺失。
- 如請求項30或31之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該缺失變異體包含SEQ ID No.: 64之天然的TPOR/MPLR序列之區域489-510中1至18個胺基酸之缺失。
- 如請求項4至27中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該跨膜域包含SEQ ID No.: 64之天然的TPOR/MPLR序列之胺基酸區478-582之插入變異體。
- 如請求項33之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該插入變異體包含SEQ ID No.: 64之天然的TPOR/MPLR序列之區域478-582中1至8個胺基酸之插入。
- 如請求項33或34之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該插入變異體包含SEQ ID No.: 64之天然的TPOR/MPLR序列之區域489-510中1至8個胺基酸之插入。
- 如請求項33至35中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中插入於該插入變異體中之胺基酸係選自由如下組成之群:白胺酸、纈胺酸及異白胺酸。
- 如請求項1至25中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該酪胺酸激酶活化域包含選自SEQ ID NO.: 104-133之序列。
- 如請求項5或6之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該受體為激素受體。
- 如請求項5或6之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該受體為細胞激素受體。
- 如請求項5-7及38-39中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該受體係選自由如下組成之群:BLNK、IL2RG、EGFR、EpoR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNAR1/2、IFNLR1、IL10R1、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、IL2Rb、IL2small、IL7R、IL7Ra、IL9R、IL15R及IL21R。
- 如請求項1之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該酪胺酸激酶活化域包含跨膜域及詹納斯激酶(JAK)結合域且該酪胺酸效應域包含受體之(或衍生自其之)至少一個STAT活化域。
- 如請求項41之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中, 該二聚化域包含FKBP多肽; 該跨膜域包含蛋白質之(或衍生自其之)跨膜域,該蛋白質選自由如下組成之群:EPOR、GP130、PRLR、GHR、GCSFR、PD-1及TPOR; 該JAK結合域包括蛋白質之(或衍生自其之)JAK結合域,該蛋白質選自由如下組成之群:EPOR、GP130、PRLR、GHR、GCSFR及TPOR;及 該STAT活化域包含受體之(或衍生自其之)至少一個STAT活化域,該受體選自由如下組成之群:BLNK、IL2RG、EGFR、EpoR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNAR1/2、IFNLR1、IL10R1、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、IL2Rb、IL2small、IL7R、IL7Ra、IL9R、IL15R及IL21R。
- 如請求項42之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該酪胺酸效應域包含至少兩種受體之(或衍生自其之)至少兩個STAT活化域。
- 如請求項1至43中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該酪胺酸效應域包含選自SEQ ID NO: 134-176之酪胺酸效應域序列。
- 如請求項1至44中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該二聚化域係位於該可誘導之嵌合細胞激素受體的N端處。
- 如請求項1至44中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該二聚化域係位於該可誘導之嵌合細胞激素受體的C端處。
- 如請求項1至46中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該可誘導之嵌合細胞激素受體包含膜靶向模體。
- 如請求項47之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該膜靶向模體包含肉豆蔻醯基化模體。
- 如請求項1至48中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該受體係經肉豆蔻醯基化。
- 如請求項1之可誘導之嵌合細胞激素受體,其包含揭示於表2A或表2B中之序列。
- 一種多核苷酸,其包含編碼如請求項1至50中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體之核酸序列。
- 一種表現載體,其包含如請求項51之多核苷酸。
- 一種工程化免疫細胞,其包含如請求項1至50中任一項之至少一種可誘導之嵌合細胞激素受體或如請求項51之至少一種多核苷酸。
- 如請求項53之工程化免疫細胞,其中該細胞包含如請求項1至50中任一項之至少兩種可誘導之嵌合細胞激素受體或如請求項51之至少兩種多核苷酸。
- 如請求項53或54之工程化免疫細胞,其中該細胞包含如請求項1至50中任一項之至少三種或四種可誘導之嵌合細胞激素受體或如請求項51之至少三種或四種多核苷酸。
- 如請求項53至55中任一項之工程化免疫細胞,其中,當存在超過一種可誘導之嵌合細胞激素受體時,每種受體之該二聚化域、該酪胺酸激酶活化域及該酪胺酸效應域可相同或不同。
- 如請求項53至56中任一項之工程化免疫細胞,其中該細胞還包含嵌合抗原受體(CAR)或編碼CAR之多核苷酸。
- 如請求項53至57中任一項之工程化免疫細胞,其中該免疫細胞係選自由如下組成之群:T細胞、樹突細胞、殺手樹突細胞、肥大細胞、NK細胞、巨噬細胞、單核細胞、B-細胞及衍生自幹細胞之免疫細胞。
- 如請求項53至58中任一項之工程化免疫細胞,其中該免疫細胞為T細胞。
- 一種調節個體中工程化免疫細胞之方法,該方法包括對個體投與配位體,該個體先前已經投與如請求項53至59中任一項之工程化免疫細胞,其中該二聚配位體結合至該可誘導之嵌合細胞激素受體之二聚化域。
- 如請求項60之方法,其中該配位體為AP1903。
- 一種製備工程化免疫細胞之方法,該方法包括將如請求項51之多核苷酸或如請求項52之表現載體引入至免疫細胞中。
- 如請求項62之方法,其中該免疫細胞係選自由如下組成之群:T細胞、樹突細胞、殺手樹突細胞、肥大細胞、NK細胞、巨噬細胞、單核細胞、B-細胞及衍生自幹細胞之免疫細胞。
- 如請求項62或63之方法,其中該免疫細胞為T細胞。
- 一種分離的免疫細胞,其包含: (i)至少一種可誘導之嵌合細胞激素受體,其包含二聚化域、酪胺酸激酶活化域及酪胺酸效應域;及 (ii)嵌合抗原受體(CAR),其包含胞外配位體結合域、跨膜域及細胞內訊號域。
- 如請求項65之分離的免疫細胞,其中該可誘導之嵌合細胞激素受體為如請求項1至50中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體。
- 如請求項66之分離的免疫細胞,其中該細胞包含至少兩種、三種或四種可誘導之嵌合細胞激素受體。
- 如請求項65之分離的免疫細胞,其中該CAR之該胞外配位體結合域特異性結合BCMA、EGFRvIII、Flt-3、WT-1、CD20、CD23、CD30、CD38、CD70、CD33、CD133、LeY、NKG2D、CS1、CD44v6、ROR1、CD19、緊密連接蛋白-18.2 (緊密連接蛋白-18A2或緊密連接蛋白18同功異形物2)、DLL3 (δ樣蛋白3、果蠅δ同源物3、δ3)、Muc17 (Mucin17、Muc3、Muc3)、FAPα(纖維母細胞活化蛋白α)、Ly6G6D (淋巴細胞抗原6複合基因座蛋白G6d、c6orf23、G6D、MEGT1、NG25)、RNF43(E3泛素-蛋白連接酶RNF43或RING指蛋白43)。
- 如請求項65至68中任一項之分離的免疫細胞,其中該免疫細胞係選自由如下組成之群:T細胞、樹突細胞、殺手樹突細胞、肥大細胞、NK細胞、巨噬細胞、單核細胞、B-細胞及衍生自幹細胞之免疫細胞。
- 如請求項65至68中任一項之分離的免疫細胞,其中該免疫細胞為T細胞。
- 如請求項65至70中任一項之分離的免疫細胞,其中該分離的免疫細胞展示在與結合至二聚化域之配位體接觸後相對於不表現該可誘導之嵌合細胞激素受體之分離的免疫細胞之持久性改良之持久性。
- 如請求項65至71中任一項之分離的免疫細胞,其中該分離的免疫細胞展示在與結合至二聚化域之配位體接觸後相對於由不表現該可誘導之嵌合細胞激素受體之分離的免疫細胞展示的STAT之活化增加之STAT之活化。
- 如請求項72之分離的免疫細胞,其中該STAT為STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6或其組合。
- 如請求項72或73之分離的免疫細胞,其中在與結合至二聚化域之配位體接觸後,與由不表現該可誘導之嵌合細胞激素受體之分離的免疫細胞所顯示的STAT之活化相比,由該分離的免疫細胞之STAT之活化隨著配位體之劑量而增加。
- 如請求項65至74中任一項之分離的免疫細胞,其中該分離的免疫細胞展示在與結合至二聚化域之配位體接觸後與由不表現該可誘導之嵌合細胞激素受體之分離的免疫細胞所展示的細胞毒性相比增加之細胞毒性。
- 如請求項65至75中任一項之分離的免疫細胞,其中該分離的免疫細胞在與結合至二聚化域之配位體接觸後與不表現該可誘導之嵌合細胞激素受體之分離的免疫細胞相比擴增。
- 如請求項65至76中任一項之分離的免疫細胞,其中該分離的免疫細胞上之幹細胞記憶(Tscm)及/或中樞記憶(Tcm)之細胞標記之水平在與結合至二聚化域之配位體接觸後與不表現該可誘導之嵌合細胞激素受體之分離的免疫細胞上的此等標記之水平相比係增加或不變。
- 如請求項71至77中任一項之分離的免疫細胞,其中該分離的免疫細胞為T細胞。
- 一種產生分離的免疫細胞之方法,該分離的免疫細胞包含如請求項1至50中任一項之可誘導之嵌合細胞激素受體,其中該方法包括如下步驟: (a)提供免疫細胞; (b)將編碼包含胞外配位體結合域、跨膜域及細胞內訊號域之嵌合抗原受體(CAR)之多核苷酸引入至該免疫細胞中;及 (c)將編碼該可誘導之嵌合細胞激素受體之多核苷酸引入至該免疫細胞中。
- 如請求項79之方法,其中步驟c)包括穩定地表現該可誘導之嵌合細胞激素受體至細胞中。
- 如請求項79或80之方法,其中在步驟c)中,編碼該可誘導之嵌合細胞激素受體之該多核苷酸係藉由轉位子/轉位酶系統、基於病毒之基因轉移系統或電穿孔引入至該細胞中。
- 如請求項79至81中任一項之方法,其中在步驟b)中,編碼該嵌合抗原受體之該多核苷酸係藉由轉位子/轉位酶系統或基於病毒之基因轉移系統引入至該細胞中。
- 如請求項81或82之方法,其中該基於病毒之基因轉移系統包含重組逆轉錄病毒或慢病毒。
- 如請求項79至83中任一項之方法,其中步驟(b)係在步驟(c)之前進行。
- 如請求項79至83中任一項之方法,其中步驟(c)係在步驟(b)之前進行。
- 如請求項79至85中任一項之方法,其中該免疫細胞係選自由如下組成之群:T細胞、樹突細胞、殺手樹突細胞、肥大細胞、NK細胞、巨噬細胞、單核細胞、B-細胞及衍生自幹細胞之免疫細胞。
- 如請求項79至86中任一項之方法,其中該免疫細胞為T細胞。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項65至78中任一項之分離的免疫細胞。
- 一種用於治療個體之病症之方法,其中該方法包括對該個體投與如請求項65至78中任一項之分離的免疫細胞或對該個體投與如請求項88之醫藥組合物。
- 如請求項89之方法,其中將該等細胞或醫藥組合物提供給該個體不止一次。
- 如請求項89或90之方法,其中該等細胞或該醫藥組合物係相隔至少約1、2、3、4、5、6、7天或更多天提供給該個體。
- 如請求項89至91中任一項之方法,其中該個體在對其投與該分離的免疫細胞或該醫藥組合物之前已先經治療劑治療。
- 如請求項92之方法,其中該治療劑為抗體或化療劑。
- 如請求項89至93中任一項之方法,其中該病症為病毒性疾病、細菌性疾病、癌症、發炎性疾病、免疫疾病或老化相關疾病。
- 如請求項94之方法,其中該癌症為惡性血液病或實體癌症。
- 如請求項95之方法,其中該惡性血液病係選自急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性嗜伊紅血球性白血病(CEL)、骨髓發育不良症候群(MDS)、非霍奇金氏(non-Hodgkin's)淋巴瘤(NHL)或多發性骨髓瘤(MM)。
- 如請求項95之方法,其中該實體癌症係選自膽管癌、膀胱癌、骨及軟組織癌、腦腫瘤、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸腺癌、結腸直腸癌、硬纖維瘤、胚胎癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、胃腺癌、多形性膠質母細胞瘤、婦科腫瘤、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、肺癌、惡性黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、胰臟管腺癌、原發性星形細胞瘤、原發性甲狀腺癌、前列腺癌、腎癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、睾丸生殖細胞腫瘤、尿路上皮細胞癌、子宮肉瘤或子宮癌。
- 一種如請求項65至78中任一項之分離的免疫細胞或如請求項88之醫藥組合物於治療病症之用途。
- 如請求項98之用途,其中該等細胞或該醫藥組合物係提供給該個體不止一次。
- 如請求項98或99之用途,其中該等細胞或該醫藥組合物係相隔至少約1、2、3、4、5、6、7天或更多天提供給該個體。
- 如請求項98至100中任一項之用途,其中該個體在對其投與該分離的免疫細胞或該醫藥組合物之前已先經治療劑治療。
- 如請求項101之用途,其中該治療劑為抗體或化療劑。
- 如請求項98至102中任一項之用途,其中該病症為病毒性疾病、細菌性疾病、癌症、發炎性疾病、免疫疾病或老化相關疾病。
- 如請求項103之用途,其中該癌症為惡性血液病或實體癌症。
- 如請求項104之用途,其中該惡性血液病係選自急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性嗜伊紅血球性白血病(CEL)、骨髓發育不良症候群(MDS)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或多發性骨髓瘤(MM)。
- 如請求項104之用途,其中該實體癌症係選自膽管癌、膀胱癌、骨及軟組織癌、腦腫瘤、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸腺癌、結腸直腸癌、硬纖維瘤、胚胎癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、胃腺癌、多形性膠質母細胞瘤、婦科腫瘤、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、肺癌、惡性黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、胰臟管腺癌、原發性星形細胞瘤、原發性甲狀腺癌、前列腺癌、腎癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、睾丸生殖細胞腫瘤、尿路上皮細胞癌、子宮肉瘤或子宮癌。
- 如請求項53至59中任一項之工程化免疫細胞,其中該細胞為自體T細胞。
- 如請求項53至59中任一項之工程化免疫細胞,其中該細胞為同種異體T細胞。
- 如請求項65至78中任一項之分離的免疫細胞,其中該細胞為自體T細胞。
- 如請求項65至78中任一項之分離的免疫細胞,其中該細胞為同種異體T細胞。
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