JP2022545167A - Ｔｇｆベータ結合ドメインを含むキメラサイトカイン受容体 - Google Patents

Abstract

ＴＧＦ－βリガンドまたはＴＧＦ－β受容体抗体に結合することができる結合ドメインを担持するキメラサイトカイン受容体が本明細書において提供される。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）担持免疫細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）上に存在する場合、当該受容体は、構造的に、および／またはＴＧＦ－βリガンドもしくはＴＧＦ－β受容体抗体の係合を通じて、ＣＡＲ－Ｔ細胞の拡張、活性および持続性を増加させる。また本明細書に記載されるキメラサイトカイン受容体の作製方法および使用方法も提供される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／８９４，６５８号および２０２０年７月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／０５３，３２２号の優先の利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表

本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に出願されており、．ｔｘｔ形式の電子的に提出された配列表を含む。．ｔｘｔファイルには、２０２０年８月２７日に作成された５７６，７８０バイトのサイズの“ＡＴ－０３０＿０３ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔ”という名称の配列表が含まれる。この．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

悪性腫瘍に関連した抗原を認識するように遺伝子改変された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の養子免疫伝達は、癌を治療するための新しいアプローチとして有望視されている。例えばＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されてもよい。ＣＡＲは抗原認識部分とＴ細胞活性化ドメインから構成される融合タンパク質である。

Ｔ細胞の増殖、細胞傷害性の効力および持続性は、シグナル伝達経路によって駆動される。従来的なＣＡＲ設計は、ＣＤ３ゼータ活性化（シグナル１）と共刺激（シグナル２、例えば、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、および／またはＣＤ２８発現を介したもの）の二つのシグナルを提供する。状況によって、第三のシグナル（シグナル３）であるサイトカイン誘導性のサイトカイン受容体シグナル伝達（例えば、免疫増強に関するサイトカインのサポート）が望ましい場合がある。しかしシグナル３を提供するアプローチはかなりの制約を受けている。

サイトカインのサポートを提供するための一つのアプローチには、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法と、組換えサイトカイン／サイトカイン模倣物の全身的な注入とを組み合わせること、およびサイトカインを細胞外に分泌／発現するようにＣＡＲ－Ｔ細胞を操作することが含まれる。サイトカインは多面的な効果を有しており、また他の細胞型の機能にも影響を及ぼすことができるため、ＣＡＲ－Ｔ細胞による免疫増強サイトカインの全身的な投与または全身的な産生は、少なくとも以下の二つの大きな難点がある：（ｉ）これらのアプローチは、ヒトに全身的な毒性を引き起こす可能性があること、および（ｉｉ）同種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の状況において、これらのアプローチは、バイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）的な宿主免疫活性化を引き起こす場合がある。当該活性化は、同種ＣＡＲ－Ｔ細胞の拒絶を加速させ、それにより治療効果を損なう可能性がある。サイトカインのサポートを提供するための別のアプローチは、構造的に活性化された二量体化サイトカイン受容体であるＩＬ－７Ｒａの導入に基づくものである。このアプローチは、シグナル伝達出力の機能（ＩＬ－７のシグナル伝達のみ）および程度を限定している。サイトカインのサポートを提供するためのさらに別のアプローチは、シグナル３をＣＡＲ分子へと直接組み込むことを含む（Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１８ Ｍａｒ；２４（３）：３５２－３５９）。このアプローチの制限は、シグナル３の強度は、ＣＡＲ活性化の強度に依存することである。標的（およびＣＡＲ活性化）が存在しない場合、シグナル３は伝達されない。

ＣＡＲ－Ｔ細胞に特異的なサイトカインシグナルを状況依存的な様式で標的化することによって、これらの欠点を回避し、安全性プロファイルと治療有効性が改善される解決法が必要とされている。本明細書において、このニーズに対処する組成物および方法が提供されている。

本明細書において、ＴＧＦ－β結合ドメインを含むキメラサイトカイン受容体が提供される。本明細書において、形質転換増殖因子ベータサイトカインファミリー（ＴＧＦ－βリガンド、例えばＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３）との係合時、または抗ＴＧＦ－β受容体抗体での活性化時に活性となる、誘導性ＴＧＦ－β駆動キメラサイトカイン受容体が提供される。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）担持免疫細胞上に提示され、ＴＧＦ－βリガンドと係合したとき、および／または抗ＴＧＦ－βＲ抗体で活性化されたとき、かかる受容体は、サイトカイン受容体シグナル伝達（シグナル３）を増強させ、それにより免疫細胞の活性化、増殖、持続性、および／またはＣＡＲ担持免疫細胞の効力が増強される。したがって本開示のキメラサイトカイン受容体は、内因性ＴＧＦ－βリガンドで免疫細胞内にサイトカインシグナルが伝達されることを可能にし、それによりその免疫抑制シグナルは妨害され、およびＣＡＲ駆動活性と協調して動作し、または相乗効果を発揮することができる免疫増強シグナルへと転換される。さらに、臨床的に承認された抗ＴＧＦ－β受容体抗体は、本開示のキメラサイトカイン受容体をクラスター形成させ、活性化することができる。そのため、抗ＴＧＦ－β受容体で治療された患者は、内因性ＴＧＦ－βシグナル伝達の遮断だけではなく、キメラサイトカイン受容体を担持する細胞におけるサイトカインシグナル伝達の活性化からも利益を得ることができる。また本明細書において、構造的に活性なＴＧＦ－β駆動型のＴＧＦ－β結合ドメイン含有キメラサイトカイン受容体も提供される。当該受容体は、誘導因子の非存在下でもシグナルを伝達し続けるが、例えばＴＧＦ－βリガンドの存在下または抗ＴＧＦ－βＲ抗体の存在下では、さらに誘導されることができ、またはさらに改善された性能もしくは活性を呈することができる。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βＲは、ＴＧＦ－βＲ２であり、抗体は抗ＴＧＦ－βＲ２抗体である。本明細書で使用される場合、「ＴＧＦ－ベータ」は、「ＴＧＦ－β」と相互交換可能に使用される。

したがって一つの態様では本明細書において、（ａ）ＴＧＦ－β受容体の細胞外部分またはＴＧＦ－β抗原結合ドメインを含む結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、（ｃ）ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）結合ドメイン、および（ｄ）リクルートドメイン、を含むキメラサイトカイン受容体が提供される。本明細書で使用される場合、「細胞外部分」とは、ＴＧＦ－β受容体の細胞外ドメインの任意の部分を指す。

関連の態様では、本明細書において、本開示のキメラサイトカイン受容体のいずれか一つをコードするポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはさらに、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、当該ＣＡＲは対象標的に結合する。対象標的は、例えば限定されないが、表８に提示されるもののうちの任意の一つ以上を含む、任意の対象分子であり得る。

さらなる態様では本明細書において、本開示の少なくとも一つのキメラサイトカイン受容体を含む操作された免疫細胞が提供される。別の態様では、本明細書において、本開示の少なくとも一つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および少なくとも一つのキメラサイトカイン受容体を含む操作された免疫細胞が提供される。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、同種免疫細胞である。他の実施形態では、免疫細胞は、自己免疫細胞である。免疫細胞は、以下からなる群から選択されてもよい：Ｔ細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、および幹細胞に由来する免疫細胞。関連の態様では、本明細書において、本開示の操作された免疫細胞のいずれかを含む医薬組成物、およびかかる医薬組成物を含むキットが提供される。また本明細書において、当該免疫細胞を作製する方法が提供される。

別の態様では、本明細書において、本明細書に記載される操作された免疫細胞のいずれかの治療有効量を対象に投与することを含む、対象において癌を治療する方法が提供される。

図１は、本開示の誘導性キメラサイトカイン受容体の概略図を示す。

図２Ａは、第２世代ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲと、ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２サイトカイン受容体のドミナントネガティブ短縮型の共発現のために使用されるレンチウイルスベクターの概略図を示す。図２Ｂは、ＴＧＦβＲ１ ＤＮまたはＴＧＦβＲ２ ＤＮのいずれかの発現による、ＴＧＦ－βシグナル伝達の阻害を示す。

図３は、第２世代ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲと、ＴＧＦβＲ２サイトカイン受容体を共発現するために使用されたレンチウイルスベクターの概略図を示す。

図４Ａは、ＩＬ７Ｒ（３１６－４５９）およびＩＬ１２Ｒｂ２（７７５－８２５）リクルートドメインを担持する、ＣＡＲ－Ｔ細胞においてＩＬ７シグナル伝達およびＩＬ１２シグナル伝達を模倣するために使用されたプロトタイプ型レンチウイルスベクターの概略を示す。

図４Ｂは、ルシフェラーゼレポーターアッセイによって決定されたＴＧＦ－βシグナル伝達活性を示す。

図４Ｃは、ＴＧＦ－βの存在下での、図４Ａのキメラサイトカイン受容体の活性化を示す。

図５Ａは、結合ドメイン内に短縮を有する、使用されたプロトタイプ型レンチウイルスベクターの概略図を示す。図５Ｂは、ルシフェラーゼレポーターアッセイによって決定されたＴＧＦ－βシグナル伝達活性を示す。

図５Ｃは、ＴＧＦ－βの存在下での、図５Ａのキメラサイトカイン受容体の活性化を示す。

図６Ａは、ＴＧＦβＲ２カセットに導入された改変の概略を示す。図６Ｂは、ＴＧＦβＲ２ΔＮ２５ キメラサイトカイン受容体が、ＴＧＦ－βシグナル伝達を阻害する能力をまだ保持していることを示す。

図６Ｃは、ＳＴＡＴレポーター活性により評価された、図６Ａのキメラサイトカイン受容体の活性化を示す。

図７は、構造的に活性なキメラサイトカイン受容体の概略を示す。

図８Ａは、ＴＧＦβＲ２カセットに導入された改変の概略を示す。図８Ｂは、図８Ａのキメラサイトカイン受容体の発現による、ＴＧＦ－βシグナル伝達の阻害を示す。

図８Ｃは、ＳＴＡＴ５レポーター活性により測定された、図８Ａのキメラサイトカイン受容体を介したサイトカインシグナル伝達の活性化を示す。

図９Ａ～９Ｂは、野生型ＴＰＯＲ、および様々な膜貫通部分の欠失または挿入のバリアントのアミノ酸配列を示す。図９Ａ－Ｂは、出現順にそれぞれ、配列番号２３５－２４６、２３５、および２４７－２５４を示す。

図１０Ａは、野生型ＴＰＯＲ、および追加の膜貫通部分のバリアントのアミノ酸配列を示す。 図１０Ｂは、ルシフェラーゼアッセイにより判定された、様々な濃度のＴＧＦ－βの存在下での、図１０Ａに示されるＴＧＦ－β駆動型キメラサイトカイン受容体の過剰発現による内因性ＴＧＦ－βシグナル伝達の阻害を示す。 図１０Ｃは、様々な濃度のＴＧＦ－βの存在下での、キメラサイトカイン受容体の活性化を示す。図１０Ａは、出現順にそれぞれ、配列番号２３５、および２５５－２７１を示す。

図１１Ａは、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）ＣＡＲ発現構築物の概略図を示す。この場合においてＣＣＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲの発現は、Ｐ２Ａペプチドによって連結される。図１１Ｂ～１１Ｃは、様々なＣＣＲを発現するＣＡＲ＋ Ｔ細胞の収率を示す棒グラフである。 図１１Ｄ～１１Ｅは、様々なＣＣＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞または対照におけるＳＴＡＴ５リン酸化の結果を示す。 図１１Ｆ～１１Ｇは、産生から１４日目のＣＡＲ Ｔ細胞の表現型を示す。 図１１Ｈは、ＣＡＲ Ｔ細胞上の総ＴＧＦ－βＲ２細胞外染色の結果を示す。図１１Ｉは、様々な濃度のＴＧＦ－βの存在下で様々なＣＣＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞におけるＴＧＦ－βＲ２シグナル伝達の阻害の結果を示す。

図１２Ａは、外因性ＴＧＦβの非存在下で、Ｕ８７－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞に対する、様々なＣＣＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞の細胞障害性のアッセイの結果を示す。 図１２Ｂ～１２Ｃは、様々な濃度のＴＧＦβで、様々なＣＣＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性のアッセイの結果を示す。

図１３Ａは、ＳＴＡＴ５リン酸化を示す。図１３Ｂは、ＴＯＰＲ／ＭＰＬＲおよびＪＡＫ結合ドメインにおいて、Ｋ５５３Ｒ／Ｋ５７３Ｒの置換を含む、または含まない、Ｓ５０５Ｎ／Ｗ５１５Ｋを含むＣＣＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞のＴ細胞表現型を示す。本実験で試験された全てのＴＧＦｂＲ２キメラサイトカイン受容体構築物は、Ｓ５０５Ｎ／Ｗ５１５Ｋの置換を含有する。ＲＲと標識された構築物はさらに、追加のＫ５５３Ｒ／Ｋ５７３Ｒの置換を含有する。

図１４Ａ～１４Ｂは、５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβの非存在下（図１４Ａ）または存在下（図１４Ｂ）で、様々なＣＣＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞の長期的な細胞殺傷アッセイの結果を示す。 図１４Ａ～１４Ｂは、５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβの非存在下（図１４Ａ）または存在下（図１４Ｂ）で、様々なＣＣＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞の長期的な細胞殺傷アッセイの結果を示す。

図１５Ａ～１５Ｃは、様々なＣＣＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞のＳＴＡＴ５シグナル伝達の活性化（図１５Ａ）、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害（図１５Ｂ）、および長期的な細胞殺傷アッセイ（図１５Ｃ）の結果を示し、それらＣＣＲの一部は、例えばＴＧＦβＲ２のＥＣＤにおいて、Ｄ３２Ａ、Ｅ１１９Ａ、および／またはＩ５３Ａの置換など）ＴＧＦβに対するアフィニティが低下している。

図１６Ａ～１６Ｂは、ＳＴＡＴ５シグナル伝達（図１６Ａ）および長期的な細胞殺傷（図１６Ｂ）に対する、分解抵抗性のＫ５３３Ｒ／Ｋ５７３Ｒ置換を含む、または含まない、ＴＧＦβＲ２キメラサイトカイン受容体の効果を比較する。

本明細書において、ＴＧＦ－β結合ドメインを含むキメラサイトカイン受容体が提供される。本明細書において、ＴＧＦ－βリガンド（例えばＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３）との係合時、または抗ＴＧＦ－β受容体抗体での活性化時に活性となる、誘導性キメラサイトカイン受容体が提供される。また本明細書において、ＴＧＦ－β結合ドメインを含む、構造的に活性なキメラサイトカイン受容体が提供される。また本明細書において、本開示のキメラサイトカイン受容体を発現する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）担持免疫細胞（ＣＡＲ－Ｉ細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）も提供される。一部の実施形態では、構造的に活性なキメラサイトカイン受容体は、ＴＧＦ－βリガンドとの係合時、または抗ＴＧＦ－β受容体抗体での活性化時に、ＴＧＦ－β結合ドメインを含まない構造的に活性なキメラサイトカイン受容体と比較して、性能または活性の改善を呈する。また本明細書において、キメラサイトカイン受容体の作製方法および使用方法も提供される。

Ｉ．ＴＧＦ－β担持キメラサイトカイン受容体
本開示のキメラサイトカイン受容体は、ＴＧＦ－βリガンド（例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、および／またはＴＧＦ－β３）、または抗ＴＧＦ－β－受容体抗体の結合時にシグナル伝達を活性化する。これらの受容体は、受容体の単量体がクラスター形成し、および／または二量体形成するときにシグナル伝達を活性化する。本開示のキメラサイトカイン受容体は、二重機能性のキメラサイトカイン受容体であり、ＴＧＦ－βリガンドの免疫抑制性効果の中和と、免疫増強サイトカインシグナルの伝達の模倣を同時に行うことができる。

一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体の単量体は、（ａ）ＴＧＦ－βリガンドまたは抗ＴＧＦ－β受容体抗体に結合することができる結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、（ｃ）ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）結合ドメイン、および（ｄ）ＳＴＡＴ－リクルートドメイン（例えば、サイトカイン受容体などの受容体の細胞質ドメインに由来）を含む。各ドメインは、直接的に、または一つ以上のペプチドリンカーを介して連結されることができる。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体の単量体は、（ａ）ＴＧＦ－βリガンドまたは抗ＴＧＦ－β受容体抗体に結合することができる結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、（ｃ）ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）結合ドメイン、および（ｄ）リクルートドメイン（例えば、サイトカイン受容体などの受容体の細胞質ドメインに由来）を含む。リクルートドメインは、ＳＴＡＴリクルートドメイン、ＡＰ１－リクルートドメイン、Ｍｙｃ／Ｍａｘリクルートドメイン、またはＮＦｋＢリクルートドメインであってもよい。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、ＴＧＦ－βリガンドに結合するときにクラスター形成および活性化され、ならびに／または抗ＴＧＦ－β受容体抗体でクラスター形成および活性化される。キメラサイトカイン受容体は、例えばＴＧＦ－βリガンドおよび／またはＴＧＦ－β受容体抗体の結合時に、シグナル伝達を活性化する。一部の実施形態では、ＴＧＦ－β受容体抗体は、限定されないが、ＰＦ－０３４４６９６２またはＬＹ３０２２８５９である。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、構造的にクラスター形成され、または二量体形成される。

本明細書で使用される場合、「ＴＧＦ－βリガンド」とは、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３、ならびにそれらのアイソフォームおよび誘導体を指す。「ＴＧＦ－βリガンド」および「ＴＧＦ－β」は、本明細書において相互交換可能に使用されることを理解されたい。

Ａ．結合ドメイン
本開示のキメラサイトカイン受容体は、ＴＧＦ－βリガンドまたは抗ＴＧＦ－β受容体抗体を結合する能力を有する結合ドメインを含む。本明細書で言及されるように、結合ドメインは、細胞外空間内へと伸長するキメラサイトカイン受容体のドメインである。結合ドメインは、ＴＧＦ－βに結合し、内因性ＴＧＦ－β受容体からＴＧＦ－βを隠蔽する。それによって、ＴＧＦ－β誘導性の免疫抑制を阻害または低下させる。本開示の結合ドメインは、ＴＧＦ－βリガンドおよび抗ＴＧＦ－β受容体抗体と結合し、結合誘導性のシグナル伝達を生じさせる。

一部の実施形態では、結合ドメインは、ＴＧＦ－β受容体の細胞外部分、例えば、ＴＧＦ－βＲ１またはＴＧＦ－βＲ２の細胞外部分を含む。

一部の実施形態では、結合ドメインは、野生型ＴＧＦ－β受容体の細胞外部分を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ－β受容体は、ＴＧＦβリガンドへの結合に対するアフィニティを増強または変化させる一つ以上の変異を含む。

一部の実施形態では、結合ドメインは、野生型ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２の細胞外部分を含み、一部の実施形態では、結合ドメインは、野生型ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２の細胞外部分を含み、それぞれ配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、結合ドメインは、野生型ＴＧＦ－β受容体の細胞外部分に対する変異を含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、野生型ＴＧＦ－β受容体の細胞外部分に対する変異を含み、配列番号４～配列番号２０のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、配列番号４－２０のアミノ酸配列のいずれか一つに対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％、または１００％同一である結合ドメインを含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、シグナル配列を含まない。

表１は、本開示の例示的な結合ドメインのアミノ酸配列を示す。例えばＴＧＦ－β受容体のアミノ酸配列などの例示的な結合ドメイン配列の発現および細胞外の配置は、シグナル配列を使用することで実現され得ることに留意されたい。例示的な実施形態では、ＣＤ８シグナル配列（ＣＤ８ＳＳ）ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号１）が利用される。一部の実施形態では、結合ドメインは、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む野生型ＴＧＦβＲ２の細胞外部ドメインを含む。一部の実施形態では、シグナル配列は、ヒトＴＧＦ－βＲ２の内因性シグナル配列である。
表１：例示的な結合ドメイン配列

一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、ドミナントネガティブ（ＤＮ）であり、この場合においてＴＧＦ－β受容体の結合ドメインは発現されるが、キメラサイトカイン受容体は細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。すなわちキメラサイトカイン受容体は、ＴＧＦ－βに結合することができるが、陽性シグナルは伝達しない（ＤＮキメラサイトカイン受容体）。一部の実施形態では、ＴＧＦ－β受容体は、ＴＧＦβＲ１（ドミナントネガティブＴＧＦβＲ１、またはＴＧＦβＲ１ ＤＮ）であり、配列番号２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ－β受容体は、ＴＧＦβＲ２（ドミナントネガティブＴＧＦβＲ２、またはＴＧＦβＲ２ ＤＮ）であり、配列番号３のアミノ酸配列を含む。ＴＧＦ－β受容体ドミナントネガティブ配列は、例えば配列番号１のＣＤ８ＳＳなどのシグナル配列の補助を得て発現されてもよい。ＤＮキメラサイトカイン受容体の概略図を図２Ａに示す。

他の実施形態では、結合ドメインは、ＴＧＦ－β抗原結合ドメインを含む。そのような抗原結合ドメインとしては限定されないが、ＴＧＦ－βリガンドに結合することができる一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、および単一ドメイン抗体（ナノボディ）が挙げられる。これらのｓｃＦｖおよび単一ドメイン抗体は、市販のｓｃＦｖおよび単一ドメイン抗体を含んでもよく、ならびに例えば、ラクダ科抗体およびサメ抗体に由来するものであってもよい。

他の実施形態では、結合ドメインは、ＴＧＦ－β抗原結合ドメインを含み、この場合において当該抗原結合ドメインは、Ｆａｂ断片を含む。

Ｂ．膜貫通ドメイン
本開示のキメラサイトカイン受容体は、膜貫通ドメインを含む。そのような膜貫通ドメインは、Ｎ末端上で細胞外結合ドメイン、およびＣ末端上で追加の細胞内／細胞質ドメインに結合される。一部の実施形態では、結合は、任意でリンカーを介して実現される。

本明細書で使用される場合、膜貫通ドメインは、自身が発現される細胞の膜内に挿入されることができる。一部の実施形態では、本開示の膜貫通ドメインは、細胞膜を貫通し、さらに細胞外部分および／または細胞内分を含む。

一部の実施形態では、本開示の膜貫通ドメインは操作され、いずれの天然の膜貫通ドメインにも類似せず、例えば、それらは非天然である。

他の実施形態では、本開示の膜貫通ドメインは、自然界に存在する受容体に由来する。

一部の実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫドメインは、例えば、以下の受容体のうちの一つ以上に由来する：エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）、インターロイキン６シグナル伝達物質（ＧＰ１３０またはＩＬ６ＳＴ）、プロラクチン受容体（ＰｒｌＲ）、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）、顆粒球コロニー刺激因子受容体（ＧＣＳＦＲ）、およびトロンボポエチン受容体／骨髄増殖性白血病タンパク質受容体（ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ）。天然受容体に由来する場合、受容体全体、または受容体の膜貫通配列全体が、細胞内部分での構造的活性化および構造的ＪＡＫ結合／活性化の実現に必要ではない場合がある。したがって天然受容体の断片を利用してもよい。さらに特定の変異を天然受容体に由来する膜貫通ドメイン内に導入して、下流のＪＡＫ依存性シグナル伝達をさらに調整してもよい。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、天然に存在する受容体の一部分または断片を含み、例えば、天然受容体の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫ結合／活性化ドメインを含み、任意でその中に一つ以上の変異（例えば、一つ以上の欠失、挿入および／または置換）を含む。

一部の実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫドメインは、天然ＥｐｏＲ受容体に由来する。

一部の実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫドメインは、天然ＧＰ１３０受容体に由来する。

一部の実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫドメインは、天然ＰｒｌＲ受容体に由来する。

一部の実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫドメインは、天然ＧＨＲ受容体に由来する。

一部の実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫドメインは、天然ＧＣＳＦ受容体に由来する。

一部の実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫドメインは、天然ＴＰＯＲ受容体に由来する。ＴＰＯＲ膜貫通ドメインが、リガンド、または例えば操作された改変の導入から生じる強制活性化に応答して、寛容的なホモ二量体立体構造をとると推測すると、ＪＡＫ２－依存性の様式で下流のサイトカインシグナル伝達を活性化することができる。ＴＰＯＲ膜貫通ドメインへの様々な改変の導入は、以下を生じさせる可能性がある：免疫増強サイトカインシグナルは、（ａ）細胞外ＴＧＦ－βの存在下で活性化が誘導されるまで不活性である、または（ｂ）ＴＧＦ－βの利用可能性に関わらず、構造的に活性化される、のいずれかであり得る。

表２は、本開示に提供される天然受容体の例示的な全長配列を提供し、当該配列から膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫドメインが誘導される。
表２：例示的な天然受容体

一部の実施形態では、本開示の膜貫通ドメインは、表２に示される天然ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体の短縮型、または別手段により改変されたバージョンから誘導される。

図９Ａ－９Ｂおよび１０Ａは、野生型ＴＰＯＲ、および様々な膜貫通部分の欠失（図９Ａ、１０Ａ）または挿入（図９Ｂ）のバリアントのアミノ酸配列を示す。

表３は、細胞内ＪＡＫ２結合ドメイン配列に結合された、例示的な膜貫通部分のアミノ酸配列を示す。

一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号６２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号７４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号７５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号７６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号７７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号７９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号２１７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、または配列番号２３４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体の膜貫通ドメインは、配列番号２７－７９、１６０、および２１７－２３４のいずれか一つのアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）は、配列番号３、４、または１５９のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、および配列番号６４、６９、または７０のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲは誘導性である。一部の実施形態では、ＣＣＲは、配列番号３、４、または１５９のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、および配列番号３８、３９、４０、または５３のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲは、配列番号３、４、または１５９のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、および配列番号５９、６０、１６０、または２１７のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲは、構造的に活性である。一部の実施形態では、本開示の構造的に活性なＣＣＲは、ＴＧＦ－βリガンドを伴わずに二量体形成する。
表３：例示的な膜貫通＋ＪＡＫ２結合ドメインの配列

Ｃ．ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）結合ドメイン
本開示のキメラサイトカイン受容体は、細胞内ＪＡＫ結合ドメインを含む。ＪＡＫ結合ドメインは、直接的またはリンカーを介して膜貫通ドメインのＣ末端に結合される。ＪＡＫ結合ドメインは、キメラサイトカイン受容体の細胞内側で膜貫通ドメインに結合される。

一部の実施形態では、ＪＡＫ結合ドメインは、ＪＡＫ－１－結合ドメイン、ＪＡＫ－２結合ドメイン、ＪＡＫ－３結合ドメイン、またはＴＹＫ２結合ドメインである。

一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体のＪＡＫ結合ドメインは、天然であり、および天然受容体から誘導される。

一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体のＪＡＫ結合ドメインは、合成である。

一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、配列番号２７－７９、１６０および２１７－２３４のアミノ酸配列のいずれか一つに対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％、または１００％同一である膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメインを含む。

表３は、本開示の膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメインのアミノ酸配列の例を提供する。一部の実施形態では、膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメインは、一つ以上の変異、例えば、野生型配列の一つ以上の欠失、挿入および／または置換を含む。一部の実施形態では、膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメインは、野生型ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ配列のＨ４９９、Ｓ５０５、およびＷ５１５のアミノ酸位置で、一つ以上の置換を含む。表３を参照のこと。一部の実施形態では、膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメインは、野生型ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ配列のＫ５３３およびＫ５７３のアミノ酸位置で、一つ以上の置換を含む。一部の実施形態では、例えば表３に示されるように、膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメインは、例えば表１などにおいて本明細書に開示されるＴＧＦβＲ２外部ドメイン、またはＰＤ－１外部ドメイン（例えば、表６の配列番号２７４または２７５に指定される高アフィニティＰＤ－１外部ドメインなど）、およびリクルートドメインと組み合わされて、キメラサイトカイン受容体を形成してもよい。一部の実施形態では、膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメインは、外部ドメインを伴わずにリクルートドメインと組み合わされて、キメラサイトカイン受容体を形成してもよい。例えば配列番号２７２または２７３を参照のこと。また、２０２０年２月２８日に出願されたＵＳＳＮ１６／８０４，９１７、および２０２０年２月２８日に出願されたＵＳＳＮ１６／８０４，５４５も参照のこと。それら文献は両方ともその全体で参照により本明細書に組み込まれる。

Ｄ．リクルートドメイン
本開示のキメラサイトカイン受容体は、リクルートドメイン（「シグナル伝達ドメイン」とも呼称される場合がある）を含む細胞質ドメインを含む。リクルートドメインは、ＳＴＡＴリクルートドメイン、ＡＰ１－リクルートドメイン、Ｍｙｃ／Ｍａｘリクルートドメイン、またはＮＦｋＢリクルートドメインであってもよい。一部の実施形態では、リクルートドメインは、受容体尾部（細胞尾部（ｃｙｔｏｔａｉｌ））またはサイトカイン受容体尾部に由来するＳｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＳＴＡＴ）－リクルート（Ｓｔａｔ－活性化）ドメインである。本開示のキメラサイトカイン受容体のこれら細胞内リクルートドメインは、ＣＡＲおよびキメラサイトカイン受容体を含む免疫細胞（例えば、本開示のキメラサイトカイン受容体を有するＣＡＲ－Ｔ細胞）において、シグナル３の増幅を可能にする。Ｓｔａｔリクルートドメインを介して増幅されるサイトカインシグナル伝達は、細胞のサイトカインベースの免疫増強を可能にする。一部の実施形態では、免疫増強は恒常的であり、例えば、シグナル伝達は、ＣＡＲを担持する免疫細胞の増加を生じさせる。一部の実施形態では、免疫増強は炎症性であり、例えば、シグナル伝達は、ＣＡＲを担持する免疫細胞の有効性の増加を生じさせる。一部の実施形態では、免疫増強は、消耗を防止する。例えばシグナル伝達は、ＣＡＲを担持する免疫細胞の長期的な機能性を維持する。

一部の実施形態では、本開示のリクルートドメインは合成であり、任意の天然受容体断片に類似しない。

一部の実施形態では、本開示のＳｔａｔ－リクルートドメインは合成であり、任意の天然受容体断片に類似しない。

他の実施形態では、本開示のＳｔａｔ－リクルートドメインは、天然受容体の細胞質尾部から誘導され、例えば、天然サイトカイン受容体から誘導される。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、天然受容体の一部分または断片を含み、例えば、天然受容体の細胞内Ｓｔａｔ－リクルートドメインを含み、任意でその中に一つ以上の変異（例えば、一つ以上の欠失、挿入および／または置換）を含む。天然受容体のこれら細胞質尾部は、当該受容体の膜貫通ドメインのＪＡＫ－活性化ドメインの下流の領域であってもよい。キメラサイトカイン受容体のＳｔａｔ－リクルートドメインは、少なくとも一つの受容体に由来する少なくとも一つのＳＴＡＴリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、Ｓｔａｔ－リクルートドメインは、少なくとも一つのＳＴＡＴ１－リクルートドメインを含む。一部の実施形態では、Ｓｔａｔ－リクルートドメインは、少なくとも一つのＳＴＡＴ２－リクルートドメインを含む。一部の実施形態では、Ｓｔａｔ－リクルートドメインは、少なくとも一つのＳＴＡＴ３－リクルートドメインを含む。一部の実施形態では、Ｓｔａｔ－リクルートドメインは、少なくとも一つのＳＴＡＴ４－リクルートドメインを含む。一部の実施形態では、Ｓｔａｔ－リクルートドメインは、少なくとも一つのＳＴＡＴ５－リクルートドメインを含む。一部の実施形態では、ＳＴＡＴ－リクルートドメインは、少なくとも一つのＳＴＡＴ６－リクルートドメインを含む。一部の実施形態では、Ｓｔａｔ－リクルートドメインは、少なくとも一つのＳＴＡＴ７－リクルートドメインを含む。

一部の実施形態では、ＳＴＡＴリクルートドメインが由来する天然受容体は、サイトカイン受容体ではない。

一部の実施形態では、Ｓｔａｔリクルートドメインが由来する天然受容体は、サイトカイン受容体である。Ｔ細胞免疫増強サイトカインがシグナル伝達する例示的なサイトカイン受容体としては限定されないが、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１５受容体、ＩＬ－１２受容体、およびＩＬ－２１受容体が挙げられる。一部の実施形態では、ＳＴＡＴ－リクルートドメインが由来するサイトカイン受容体は、同族ＪＡＫ－結合モチーフの下流にリン酸化可能なチロシン残基を含有し、対象の一つ以上のシグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインの下流に融合されて、単一または複数のシグナル伝達出力を生成してもよい。別の実施形態では、Ｓｔａｔリクルートドメインが由来する受容体は、サイトカイン受容体ではない。キメラサイトカイン受容体のＳｔａｔリクルートドメインを選択することによって、当該受容体は、選択したシグナル伝達へとリダイレクトされることができる。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、複数の受容体に由来する二つ以上のＳｔａｔリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、当該二つ以上のＳｔａｔリクルートドメインは、ペプチドリンカーを伴い、または伴わずに連結される。

表４は、本開示のキメラサイトカイン受容体のＳｔａｔリクルートドメイン（シグナル伝達ドメイン）が由来する例示的な受容体を提供する。表５ａは、本開示のリクルートドメインのアミノ酸配列の例を提供する。

一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号８０のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号８１のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号８２のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号８３のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号８４のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号８５のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号８６のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号８７のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号８８のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号８９のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号９０のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号９１のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号９２のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号９３のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号９４のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号９５のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号９６のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号９７のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号９８のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号９９のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１００のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１０１のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１０２のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１０３のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１０４のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１０５のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１０６のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１０７のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１０８のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１０９のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１１０のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１１１のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１１２のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１１３のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１１４のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１１５のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１１６のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１１７のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１１８のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１１９のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１２０のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１２１のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１２２のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１６１のＳＴＡＴ－リクルートドメインのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、配列番号８０－１２２および配列番号１６１のアミノ酸配列のいずれか一つに対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。
表４：リクルートドメインの源

表５ａ：リクルートドメイン配列（細胞尾部配列）

*SRは、例示的なペプチドリンカーを示す

一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体のＳｔａｔ－リクルートドメインは、一つの受容体に由来するＳＴＡＴ－リクルートドメインを含む。

複数の出力を生成するために、一つ以上のＳＴＡＴリクルートドメインをタンデム結合して、一つ以上のサイトカインからのシグナル伝達を模倣してもよい。

一部の実施形態では、ＳＴＡＴリクルートドメインは、複数の受容体の部分を含む。例えば、複数のＳＴＡＴリクルートドメインを含む。そのような実施形態では、タンデムなサイトカインシグナル伝達ドメインが提供され、シグナル伝達が増強される。したがって一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体の単量体のＳＴＡＴリクルートドメインは、複数の受容体に由来するＳＴＡＴリクルートドメインを含み、例えば、二つ、三つ、四つ、五つ、またはさらには六つの受容体に由来するＳＴＡＴリクルートドメインを含む。例えば一部の実施形態では、ＳＴＡＴリクルートドメインは、複数の経路を刺激するためにタンデムで連結されてもよい（例えば、持続性促進型ＳＴＡＴ５および炎症促進型ＳＴＡＴ４については、ＩＬ７Ｒ（３１６－４５９）－ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５－８２５）断片融合、持続性促進型については、ＩＬ７Ｒ（３１６－４５９）－ＩＬ２Ｒｂｓｍａｌｌ（３９３－４３３、５１８－５５１）、持続性促進型および抗消耗型については、ＩＬ７Ｒ（３１６－４５９）－ＥＧＦＲ（１１２２－１１６５）、持続性促進型および抗消耗型については、ＩＬ２Ｒｂｓｍａｌｌ（３９３－４３３，５１８－５５１）－ＥＧＦＲ（１１２２－１１６５）など）。

複数の出力を生成する場合、個々のＳＴＡＴリクルートドメインを細胞膜に近接させることにより、それぞれのシグナル伝達出力の強度に影響を与えることができる。表５ｂは、二重出力を有するキメラサイトカイン受容体の例を示している。各出力は細胞膜の近くまたは遠くのいずれかに配置され得る。
表５ｂ：二重出力を有するキメラサイトカイン受容体の例

理論やメカニズムに拘束されるものではないが、一部の実施形態では、ＪＡＫ－タンパク質（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、またはＴＹＫ２）は、本開示のキメラサイトカイン受容体（結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ＪＡＫ結合ドメイン、およびリクルートドメインを含む）に結合される。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βリガンドまたは抗ＴＧＦ－β受容体抗体の存在下で（例えばそれらに結合されて）、キメラサイトカイン受容体はクラスター形成し、それにより二つの結合ＪＡＫタンパク質が活性化され、次いでキメラ受容体のリクルートドメイン上のチロシン残基がリン酸化される。その後、リン酸化されたリクルートドメインは、リクルートされたタンパク質に結合する能力を有し（例えば、リン酸化されたＳＴＡＴリクルートドメインは、ＳＴＡＴ－タンパク質に結合する）、次いで核内の転写イベントを生じさせる。

Ｅ．ＴＧＦ－β－駆動キメラサイトカイン受容体の例
本開示の状況依存性のキメラサイトカイン受容体は、例えば配列番号１のＣＤ８ＳＳなどのシグナル配列とともに発現されてもよい。表６は、本開示の例示的な状況依存性のサイトカイン受容体の配列を示す。受容体は、例えば配列番号１のＣＤ８ＳＳなどのシグナル配列とともに発現されてもよい。

一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号３－２０および１５９のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含むＴＧＦ－β結合ドメイン、配列番号２７－７９、１６０および２１７－２３４のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０－１２２および１６１のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、シグナル配列を含まない。

一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号３、４および１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴＧＦ－β結合ドメイン、配列番号３８、３９、４０、５３、５９、６０、６１、６４、６９、７０、１６０、および２１７－２３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、および１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。任意でキメラサイトカイン受容体は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むシグナル配列を含む。

一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、配列番号３、４、または１５９のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号６４、６９、または７０のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、誘導性である。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、配列番号３、４、または１５９のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号３８、３９、４０、または５３のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、配列番号３、４、または１５９のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号５９、６０、１６０、または２１７のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、構造的に活性である。一部の実施形態では、本開示の構造的に活性なキメラサイトカイン受容体は、ＴＧＦβリガンドまたは抗ＴＧＦβＲ抗体に結合することなく二量体形成する。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、構造的に、またはＴＧＦ－βもしくは抗ＴＧＦβＲ抗体により誘導されて、ＴＧＦβＲ介在性のシグナル伝達を阻害し、および／またはＳＴＡＴ介在性のシグナル伝達を活性化する。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、構造的に活性であり、および／またはＴＧＦ－βＲリガンド、例えばＴＧＦ－βもしくは抗ＴＧＦ－βＲ抗体の存在下でさらに強化された活性または性能を呈する。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βＲは、ＴＧＦ－βＲ２であり、抗体は抗ＴＧＦ－βＲ２抗体である。

一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、シグナル配列を含まない。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、ＴＧＦβＲ２内因性シグナル配列、または例えば、配列番号１のアミノ酸配列などを含むシグナル配列を含む。

一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１２７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１２８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１３１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１３２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１３４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１３５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１３６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１４０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１４１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１４２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１４３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１４５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１４６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１４７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１４８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１４９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１５０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１５１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１６３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１６５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１６６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１６８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１７５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１７６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１７７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１７９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１８０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１８１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１８４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１８８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１８９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１９０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１９１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１９２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１９３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１９４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１９６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１９８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号１９９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号２００のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号２０１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号２０２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号２０３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号２０４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号２０５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号２０６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号２０７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号２０８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号２０９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号２１０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号２１１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号２１２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号２１３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号２１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号２１５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号２１６のアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）は、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号４０のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲは、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号５３のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲは、配列番号４のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号３８のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲは、配列番号４のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号３９のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲは、配列番号４のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号４０のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲは、配列番号４のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号５３のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲは、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号７０のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲは、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号６９のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲは、配列番号４のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号６４のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲは、配列番号４のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号６９のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲは、配列番号４のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号７０のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲは、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号１６０または２１９のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲは、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号２２３、２２４のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲは、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号２２５または２２６のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲは、配列番号４のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号６０または１６０のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲは、配列番号４のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号２２３、２２４のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲは、配列番号４のアミノ酸配列を含む結合ドメイン、配列番号２２５または２２６のアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン、ならびに配列番号８０、９９、１１１、１１２、または１６１のアミノ酸配列を含むリクルートドメインを含む。

一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体は、配列番号２７２、配列番号２７３、配列番号２７４、または配列番号２７５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、配列番号１２３－２１６および配列番号２７２－２７５のアミノ酸配列のいずれか一つに対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
表６：キメラサイトカイン受容体配列の例（誘導性または構造的に活性なＴＧＦ－β受容体キメラサイトカイン受容体に組み立てられている）：

*下線が引かれたLEおよびSRは、例示的なペプチドリンカーを示す。

Ｆ．キメラサイトカイン受容体の発現
本明細書において、本明細書に提供されるキメラサイトカイン受容体のいずれか一つをコードするポリヌクレオチドが提供される。同様に本明細書において、かかるポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターではない。

一部の実施形態では、ベクターは、キメラサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチド、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するポリヌクレオチドを含む。

一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体およびＣＡＲの発現は、リンカーによって分離される一つのポリペプチド鎖として発現される。図２Ａ、３、４Ａ、５Ａ、６Ａ、８Ａ、および１１Ａは、本開示のキメラサイトカイン受容体およびＣＡＲを共発現するために使用され得るベクターの概略図を示す。一つ以上のＳＴＡＴリクルートドメインをタンデム結合して、一つ以上のサイトカインからのシグナル伝達を模倣してもよい。

ＩＩ．ＣＡＲ担持免疫細胞
本明細書において、本開示のキメラ抗原受容体およびキメラサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドを含む操作された免疫細胞が提供される。および本明細書において、本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ－Ｉ細胞）およびキメラサイトカイン受容体を発現する操作された免疫細胞が提供される。免疫細胞の例としては、Ｔ細胞、例えばアルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、インバリアントＮＫＴ細胞、マスト細胞、骨髄由来貪食細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マクロファージ、および単球が挙げられる。免疫細胞とは、例えば限定されないが幹細胞に由来する細胞も指す。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より詳細には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、分化全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。

したがって一部の実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ－Ｔ細胞が本明細書に提供される。

一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外リガンド－結合ドメイン（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。一部の実施形態では、細胞外リガンド－結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインは、一つのポリペプチド中にある。すなわち、一本鎖中にある。多鎖のＣＡＲおよびポリペプチドも本明細書において提供される。一部の実施形態では、多鎖ＣＡＲは、膜貫通ドメインと少なくとも一つの細胞外リガンド－結合ドメインを含む第一のポリペプチド、および膜貫通ドメインと少なくとも一つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む第二のポリペプチドを含有し、この場合において当該ポリペプチドは一緒に組み立てられて多鎖ＣＡＲを形成する。

ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、対象標的に特異的に結合する。対象標的は、例えば限定されないが、表８に提示されるもののうちの任意の一つ以上を含む、任意の対象分子であり得る。
表８：対象標的のリスト

一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞外リガンド－結合ドメインは、標的抗原に特異的なモノクローナル抗体の軽鎖可変（ＶＬ）領域と重鎖可変（ＶＨ）領域を含有するｓｃＦｖを含有し、それら領域は柔軟なリンカーにより結合されている。一本鎖可変領域断片は、短い結合ペプチドを使用することで軽鎖および／または重鎖の可変領域を結合させることにより作製される（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６，１９８８）（例えば、グリシン－セリン含有リンカー）。概してリンカーは短い柔軟なポリペプチドであってもよく、概して約２０個以下のアミノ酸残基から構成される。リンカーも、例えば薬剤の付加または固形支持体への付加といった追加機能を目的として改変され得る。一本鎖バリアントは、組換えにより、または合成により、作製されてもよい。ｓｃＦｖの合成による作製については、自動化合成装置を使用することができる。ｓｃＦｖの組み換えによる作製については、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適切なプラスミドは、例えば酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞などの真核細胞、または例えば大腸菌などの原核細胞といった適切な宿主細胞に導入されることができる。対象のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、例えばポリヌクレオチドのライゲーションといった日常的な操作によって作製されることができる。得られるｓｃＦｖは、当分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を使用して単離することができる。

本発明によるＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、標的への細胞外リガンド－結合ドメインの結合の後の細胞内シグナル伝達に関与しており、免疫細胞の活性化および免疫反応（シグナル１および／または２）を生じさせる。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが発現されている免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも一つを活性化させる能力を有する。例えばＴ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解性の活性であってもよく、またはサイトカイン分泌を含むヘルパー活性であってもよい。

一部の実施形態では、ＣＡＲにおける使用のための細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば限定されないが、抗原受容体係合後にシグナル伝達を開始するよう協働して作用するＴ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびにこれら配列の任意の誘導体またはバリアント、および同じ機能を有する任意の合成配列であってもよい。細胞内シグナル伝達ドメインは、以下の二つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列を含有する：抗原依存性の一次活性化を開始させる配列、および抗原依存性の様式で作用して、二次シグナルまたは共刺激性シグナルを生じさせる配列。一次細胞質シグナル伝達配列は、ＩＴＡＭの免疫受容体活性化チロシンモチーフとして知られているシグナル伝達モチーフを含有してもよい。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスのチロシンキナーゼの結合部位としての役割を果たす、様々な受容体の細胞質内尾部に存在する明確に定義されたシグナル伝達モチーフである。本発明で使用されるＩＴＡＭの例としては、非限定的な例として、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するＩＴＡＭが挙げられる。一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含有してもよい。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子のドメインを含む。

一部の実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５３１３３．）およびＣＤ２８（ＮＰ＿００６１３０．１）の断片からなる群から選択される共刺激分子の一部を含む。

ＣＡＲは、細胞の表面膜上で発現される。ゆえにＣＡＲは、膜貫通ドメインを含有する。本明細書に開示されるＣＡＲに対する適切な膜貫通ドメインは、（ａ）例えば限定されないが、細胞、好ましくは例えばリンパ球またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞の表面で発現される能力、および（ｂ）リガンド－結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインと相互作用して、所定の標的細胞に対し、免疫細胞の細胞性反応を誘導する能力を有する。膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合型タンパク質または膜貫通型タンパク質から誘導されてもよい。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、例えばＣＤ３複合体を構成するα、β、γまたはδポリペプチドなどのＴ細胞受容体のサブユニット、ＩＬ－２受容体ｐ５５（α鎖）、ｐ７５（β鎖）、もしくはγ鎖、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体ＩＩＩのサブユニット鎖、またはＣＤタンパク質であってもよい。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、主にロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含んでもよい。一部の実施形態において、前述の膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）に由来する。膜貫通ドメインは、細胞外リガンド－結合ドメインと、前述の膜貫通ドメインの間にストーク（ｓｔａｌｋ）ドメインをさらに含有してもよい。ストークドメインは、最大３００アミノ酸、好ましくは１０～１００アミノ酸、最も好ましくは２５～５０アミノ酸を含み得る。ストーク領域は、例えばＣＤ８、ＣＤ４またはＣＤ２８の細胞外領域のすべて、もしくは一部、または抗体定常領域のすべてもしくは一部などの天然分子のすべてまたは一部から誘導されてもよい。あるいはストークドメインは、天然ストーク配列に相当する合成配列であってもよく、または全体が合成ストーク配列であってもよい。一部の実施形態では、前述のストークドメインは、ヒトＣＤ８α鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）の一部である。別の特定の実施形態では、前述の膜貫通およびヒンジドメインは、ヒトＣＤ８α鎖の一部を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＣＤ８αヒトヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、および４－１ＢＢシグナル伝達ドメインに特異的に結合する細胞外リガンド－結合ドメインを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、プラスミドベクターを介して導入遺伝子として免疫細胞内に導入され得る。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターはまた、例えば、ベクターを受容した細胞の識別および／または選択を提供する選択マーカーを含有してもよい。

表７は、本明細書に開示されるＣＡＲに使用され得るＣＡＲ構成要素の例示的な配列を提示する。
表７：配列の例

いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲ免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、例えば、ＲＱＲ８などの自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、ＷＯ２０１３１５３３９１Ａを参照のこと、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、細胞の表面上に発現される。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、ＣＡＲ構築物に含まれる。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドはＣＡＲ構築物の一部ではない。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲのいずれか一つの細胞外ドメインは、モノクローナル抗体に特異的な（モノクローナル抗体によって特異的に認識される）一つ以上のエピトープを含み得る。これらのエピトープは、本明細書ではｍＡｂ特異的エピトープとも呼称される。ｍＡｂ特異的エピトープの例は、国際特許公開第ＷＯ２０１６／１２０２１６号に開示されており、その全体が本明細書に組み込まれる。これらの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、対象標的に特異的に結合する抗原結合ドメインと、一つ以上のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合する一つ以上のエピトープとを含む。ｍＡｂ特異的エピトープを含むＣＡＲは、単鎖または複数鎖であり得る。

本明細書に記載されるＣＡＲの細胞外ドメインにおけるモノクローナル抗体に特異的なエピトープの含有は、ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞のソーティングおよび枯渇を可能にする。いくつかの実施形態において、枯渇を可能にすることは、例えば、対象への投与時に、有害な効果の場合の安全スイッチを提供する。

免疫療法における使用のための免疫細胞を作製する方法も本明細書に提供される。一部の実施形態では、方法は、キメラサイトカイン受容体およびＣＡＲを免疫細胞に導入すること、および当該細胞を拡張させることを含む。一部の実施形態では、本発明は、免疫細胞を操作する方法に関するものであり、当該方法は、細胞を提供すること、およびキメラサイトカイン受容体を発現させること、および少なくとも一つのＣＡＲを当該細胞表面上で発現させること、を含む。一部の実施形態では、方法は、キメラサイトカイン受容体をコードする少なくとも一つのポリヌクレオチド、およびＣＡＲをコードする少なくとも一つのポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすること、および当該細胞において当該ポリヌクレオチドを発現させること、を含む。一部の実施形態では、方法は、キメラサイトカイン受容体をコードする少なくとも一つのポリヌクレオチド、ＣＡＲをコードする少なくとも一つのポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすること、および当該細胞において当該ポリヌクレオチドを発現させること、を含む。一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体およびＣＡＲは、一つのポリヌクレオチド上に存在する。

一部の実施形態では、キメラサイトカイン受容体およびＣＡＲをコードする一つ以上のポリヌクレオチドは、細胞での安定的発現のための一つ以上の発現ベクター中に存在する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞での安定的発現のためのウイルスベクター中に存在する。一部の実施形態では、一つ以上のポリヌクレオチドは、ランダム統合によって細胞ゲノム内に挿入され、他の実施形態では、部位特異的統合によって細胞ゲノムの特定の場所に挿入される。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、例えば、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターであってもよい。一部の実施形態では、一つ以上のポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター中に存在する。

一部の実施形態では、本開示によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えばエレクトロポレーション法により直接細胞内に導入されるｍＲＮＡであってもよい。一部の実施形態では、例えばＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅなどのＣｙｔｏＰｕｌｓｅエレクトロポレーション技術を使用して、生きた細胞を一時的に透過させ、当該細胞内に物質を送達する（例えば、ＵＳ６，０７８，４９０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０００８２７、およびＰＣＴ／ＵＳ２００４／００５２３７）。パラメーターを改変し、最小の失敗率で高いトランスフェクト効率が得られる条件を決定してもよい。

また本明細書において、例えばＴ細胞などの免疫細胞をトランスフェクトする方法も提供される。一部の実施形態では、方法は、Ｔ細胞をＲＮＡと接触させること、および当該Ｔ細胞にアジャイルパルスシーケンスを適用すること、を含む。一部の実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）をＲＮＡと接触させ、当該細胞にアジャイルパルスシーケンスを適用することを含む、免疫細胞をトランスフェクトする方法である。

一部の実施形態では、方法は、例えば限定されないが、ＴＣＲの構成要素、免疫抑制剤の標的、ＨＬＡ遺伝子、および／または例えばＰＤＣＤ１もしくはＣＴＬＡ－４などの免疫チェックポイントタンパク質などを発現する遺伝子を少なくとも一つ不活化することにより、細胞を遺伝子改変する工程をさらに含み得る。遺伝子を不活化するとは、対象遺伝子が機能的なタンパク質の形態で発現されないことが意図される。一部の実施形態では、不活化される遺伝子は、例えば限定されないが、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＧＲ、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ：ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）、ＴＧＦ－ＢおよびＣＴＬＡ－４からなる群から選択される。一部の実施形態では、方法は、細胞内に、選択的なＤＮＡ切断によって遺伝子を選択的に不活化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼ（ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）を導入することによって、一つ以上の遺伝子を不活化することを含む。一部の実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、またはＣＲＩＳＰＲ系のエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ－９またはＣａｓ１２ａ）であってもよい。

別の態様では、細胞を遺伝子改変する工程は、免疫抑制剤の標的を発現する少なくとも一つの遺伝子を不活化することにより免疫細胞（例えばＴ細胞）を改変すること、および当該細胞を、任意で当該免疫抑制剤の存在下で拡張させること、を含んでもよい。

一部の実施形態では、本明細書に提供される操作された免疫細胞（例えばＴ細胞）は、キメラサイトカイン受容体を発現しない操作された免疫細胞と比較して、キメラサイトカイン受容体の結合ドメインに結合するＴＧＦ－βリガンドまたは抗ＴＧＦ－β受容体抗体と接触した際に、細胞傷害性の改善、拡張の増強、および／またはメモリー表現型マーカーのレベル増加を呈する。

一部の実施形態では、本明細書に提供される操作された免疫細胞（例えばＴ細胞）は、キメラサイトカイン受容体を発現しない操作された免疫細胞と比較して、キメラサイトカイン受容体の結合ドメインに結合するＴＧＦ－βリガンドまたは抗ＴＧＦ－β受容体抗体と接触した際に、（ｉ）インビボの持続性の増加、（ｉｉ）ＳＴＡＴ活性化の増加、（ｉｉｉ）細胞傷害性の増加、（ｉｖ）メモリー表現型マーカーのレベル増加、（ｖ）拡張（増殖）の増強、またはこれら機能性の組み合わせを呈する。一部の実施形態では、本明細書に記載の一つ以上の機能性の改善は、用量依存性である。すなわち、キメラサイトカイン受容体を含む免疫細胞の機能的活性は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２／ＴＧＦ－Ｂまたは各受容体に対する抗体の投与量を増加させて接触した際に、増加する。一部の実施形態では、開示される一つ以上のキメラサイトカイン受容体を含む操作された免疫細胞によって活性化されるＳＴＡＴは、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、またはそれらの組み合わせである。一つの実施形態では、本開示のキメラサイトカイン受容体を含む免疫細胞によって増加される、または維持されるメモリー表現型マーカーとしては、幹細胞メモリー（Ｔｓｃｍ）マーカーおよびセントラルメモリー（Ｔｃｍ）マーカーが挙げられる。

一部の実施形態では、本明細書に提供されるキメラサイトカイン受容体を含む操作された免疫細胞により呈される一つ以上の機能性における改善は、キメラサイトカイン受容体を発現しない免疫細胞と比較して、少なくとも約２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１２５倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、またはさらには約１０～５００倍（その間の値および範囲を含む）である。

一部の実施形態では、本明細書に提供されるキメラサイトカイン受容体を含む操作された免疫細胞により呈される一つ以上の機能性における改善は、キメラサイトカイン受容体を発現しない操作された免疫細胞と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、またはさらには約８０～５００％（その間の値および範囲を含む）である。

ＩＩＩ．治療方法
本開示のキメラサイトカイン受容体およびＣＡＲを担持する細胞を含む医薬組成物が本明細書に提供される。

上述の方法により取得される、操作されたキメラサイトカイン受容体を担持する、およびＣＡＲを担持する免疫細胞（例えばＴ細胞）、または当該操作された免疫細胞から誘導される細胞株は、医薬品として使用することができる。一部の実施形態では、かかる医薬品は、例えば、ウイルス性疾患、細菌性疾患、癌、炎症性疾患、免疫疾患、または加齢関連疾患などの障害を治療するために使用することができる。一部の実施形態では、癌は、固形癌である。一部の実施形態では、癌は、液状癌である。癌は、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、肉腫、リンパ腫、白血病、頭頚部癌、胸腺癌、上皮性癌、唾液腺癌、肝臓癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌、肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、食道癌、膵臓癌、グリオーマ、グリア芽腫、白血病、多発性骨髄腫、腎細胞癌、膀胱癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸癌、口腔癌、皮膚癌、およびメラノーマからなる群から選択され得る。一部の実施形態では、対象は、局所的に進行した、または転移性のメラノーマ、扁平上皮細胞頭頚部癌（ＳＣＨＮＣ）、卵巣癌、肉腫、または再発性もしくは難治性の古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）を有する、過去に治療を受けた成人対象である。

一部の実施形態では、操作された免疫細胞、または操作された免疫細胞から誘導された細胞株は、その必要のある対象の障害の治療のための医薬品の製造において使用してもよい。一部の実施形態では、障害は、例えば、癌、自己免疫性障害、または感染症であってもよい。

また本明細書において、そのような治療を必要とする対象を治療するための方法が提供される。

本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、限定されないが、ヒトおよび他の霊長類（例えばチンパンジー、カニクイザルおよび他の類人猿およびサル種）、家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）、家庭内哺乳動物（例えばイヌおよびネコ）、実験動物（例えばウサギ、例えばマウス、ラットおよびモルモットなどの齧歯類）、および鳥類（例えばニワトリ、七面鳥および他の家禽類、アヒル、ガチョウなどの家禽、野鳥および狩猟鳥類）を含む任意の脊椎動物を指す。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物である。例示的な実施形態では、対象は、ヒトである。

一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載されるキメラサイトカイン受容体およびＣＡＲを担持する、本開示の免疫細胞を、その必要のある対象に提供すること、を含む。

一部の実施形態では、本発明のキメラサイトカイン受容体およびＣＡＲを担持するＴ細胞は、安定的なインビボでのＴ細胞拡張を行うことができ、および長期間、持続することができる。

本発明の治療方法は、改善、治癒または予防することができる。本発明の方法は、自己免疫療法の一部、または同種免疫療法的な処置の一部のいずれであってもよい。

別の態様では、本発明は、腫瘍を有する対象において腫瘍の増殖または進行を阻害する方法を提供するものであり、当該方法は、本明細書に記載されるキメラサイトカイン受容体を発現し、およびＣＡＲを発現する免疫細胞の有効量を当該対象に投与することを含む。別の態様では、本発明は、対象において癌の転移を阻害または予防する方法を提供するものであり、当該方法は、その必要のある対象に、本明細書に記載される操作された免疫細胞の有効量を投与することを含む。別の態様では、本発明は、腫瘍を有する対象において腫瘍の退縮を誘導する方法を提供するものであり、当該方法は、当該対象に、本明細書に記載される操作された免疫細胞の有効量を投与することを含む。一部の実施形態では、対象は、抗ＴＧＦ－βＲ抗体、特に抗ＴＧＦ－βＲ２抗体をさらに投与される。

一部の実施形態では、本明細書の操作されたＴ細胞は、対象に非経口的に投与されてもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示される操作Ｔ細胞は、対象に静脈内投与されてもよい。

また癌の治療のための医薬品の製造、またはその必要のある対象において腫瘍の増殖または進行を阻害するための医薬品の製造における、本明細書に提供される操作Ｔ細胞のいずれかの使用が提供される。

一部の実施形態では、治療は、免疫抑制性の治療を受けている対象に投与されてもよい。実際に本発明は、当該免疫抑制剤に対する受容体をコードする遺伝子の不活性化によって、少なくとも一つの免疫抑制剤に対し抵抗性となった細胞または細胞群に依存する。この態様において、免疫抑制性の治療は、対象内の本発明によるＴ細胞の選択および拡張を補助するものとする。本発明による細胞または細胞群の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸液、注入または移植をはじめとする任意の簡便な方法で実行されてもよい。本明細書に記載される組成物は、対象に、皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内注射もしくはリンパ管内注射、または腹腔内に投与されてもよい。本開示のキメラサイトカイン受容体および／またはＣＡＲを担持する細胞、またはその医薬組成物は、以下の投与経路のうちの一つ以上を介して投与されてもよい：静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮下、局所的、経口、経皮、腹腔内、眼窩内、移植、吸入、くも膜下腔内、脳室内、耳を介して、または鼻腔内。

一部の実施形態では、細胞または細胞群（本開示のキメラサイトカイン受容体およびＣＡＲを担持する）の投与は、例えば体重１ｋｇあたり約１０⁴～約１０⁹個の細胞の投与を含んでもよく、当該範囲内にある細胞数のすべての整数値を含む。一部の実施形態では、細胞または細胞群の投与は、体重１ｋｇ当たり約１０⁴～１０⁵個の細胞、体重１ｋｇ当たり約１０⁵～１０⁶個の細胞、体重１ｋｇ当たり約１０⁶～１０⁷個の細胞、体重１ｋｇ当たり約１０⁷～１０⁸個の細胞、または体重１ｋｇ当たり約１０⁸～１０⁹個の細胞の投与を含んでもよい。細胞または細胞群は、一つ以上の投与量で投与されてもよい。一部の実施形態では、当該細胞の有効量は、単回投与として投与されてもよい。一部の実施形態では、当該細胞の有効量は、ある期間にわたる複数の投与量として投与されてもよい。投与のタイミングは、担当医師の判断内にあり、対象の臨床状態に依存する。細胞または細胞群は、例えば血液バンク、またはドナーなどの任意の供給源から取得されてもよい。個々のニーズは変化する一方で、特定の疾患または状態に対する所与の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当業者の技術範囲内にある。有効量とは、治療利益または予防利益を提供する量を意味する。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、もしあれば併用治療の種類、治療頻度、および望ましい効果の性質に依存する。一部の実施形態では、細胞の有効量または当該細胞を含む組成物の有効量は、非経口的に投与される。一部の実施形態では、投与は、静脈内投与であってもよい。一部の実施形態では、投与は、腫瘍内に注射により直接行われてもよい。

方法は、本明細書に提供されるＣＡＲおよびキメラサイトカイン受容体を担持する操作された免疫細胞を投与する前に、一つ以上の剤を対象に投与することをさらに含んでもよい。特定の実施形態では、剤は、リンパ球枯渇（前処理）のレジメンである。例えばそうした治療の必要のある対象をリンパ球枯渇させる方法は、当該対象にシクロホスファミドの特定の有益な投与量（２００ｍｇ／ｍ²／日～２０００ｍｇ／ｍ²／日、約１００ｍｇ／ｍ²／日～約２０００ｍｇ／ｍ²／日、例えば、約１００ｍｇ／ｍ²／日、約２００ｍｇ／ｍ²／日、約３００ｍｇ／ｍ²／日、約４００ｍｇ／ｍ²／日、約５００ｍｇ／ｍ²／日、約６００ｍｇ／ｍ²／日、約７００ｍｇ／ｍ²／日、約８００ｍｇ／ｍ²／日、約９００ｍｇ／ｍ²／日、約１０００ｍｇ／ｍ²／日、約１５００ｍｇ／ｍ²／日または約２０００ｍｇ／ｍ²／日）および特定用量のフルダラビン（２０ｍｇ／ｍ²／日～９００ｍｇ／ｍ²／日、約１０ｍｇ／ｍ²／日～約９００ｍｇ／ｍ²／日；例えば、約１０ｍｇ／ｍ²／日、約２０ｍｇ／ｍ²／日、約３０ｍｇ／ｍ²／日、約４０ｍｇ／ｍ²／日、約４０ｍｇ／ｍ²／日、約５０ｍｇ／ｍ²／日、約６０ｍｇ／ｍ²／日、約７０ｍｇ／ｍ²／日、約８０ｍｇ／ｍ²／日、約９０ｍｇ／ｍ²／日、約１００ｍｇ／ｍ²／日、約５００ｍｇ／ｍ²／日または約９００ｍｇ／ｍ²／日）を投与することを含む。例示的な投与レジメンは、患者に治療有効量の操作された免疫細胞を投与する前に、三日間の約３０ｍｇ／ｍ²／日のフルダラビンと組み合わされて、またその投与の前後に、約３００ｍｇ／ｍ²／日のシクロホスファミドを患者に連日投与することを含む。

一部の実施形態では、特に、本明細書に提供される操作細胞が、ＣＤ５２の表面発現を排除または最小化するように遺伝子編集されていた場合には、リンパ球枯渇は、例えばアレムツズマブなどの抗ＣＤ５２抗体の投与をさらに含む。一部の実施形態では、ＣＤ５２抗体は、約１－２０ｍｇ／日 ＩＶの投与量で、例えば約１３ｍｇ／日 ＩＶの投与量で１、２、３日間以上投与される。抗体は、リンパ球枯渇レジメンの他の要素（例えば、シクロホスファミドおよび／またはフルダラビン）の投与と組み合わされて、またはその投与の前後に投与されてもよい。

特定の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む組成物は、任意の数の化学療法剤と併せて投与することができる。

ＩＶ．キットおよび製造物品
本開示は、本明細書に記載されるキメラサイトカイン受容体およびキメラサイトカイン受容体担持細胞、ならびにその医薬組成物のうちのいずれか一つ以上を含むキットを提供する。本開示はまた、本明細書に記載されるキメラサイトカイン受容体およびキメラサイトカイン受容体担持ＣＡＲ－Ｉ細胞、その医薬組成物、ならびに本明細書に記載されるキットの任意の一つ以上を含む、製造物品を提供する。

以下の実施例は、解説を目的として含有されており、本開示の範囲を限定する意図はない。

本開示全体を通して参照されるすべての特許および非特許文書は、すべての目的に対しその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

実施例１：ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２ドミナントネガティブ短縮型を有するキメラサイトカイン受容体－ＣＡＲ構築物の構築および検証
図１は、本開示の誘導性キメラサイトカイン受容体の概略図を示す。サイトカインシグナル伝達とＴＧＦβ係合を同時に結び付けるために、以下のモジュールから構成されるキメラサイトカイン受容体を構築した：（ｉ）ＴＧＦ－β受容体の細胞外部分またはＴＧＦ－β抗原結合ドメインを含む結合ドメイン、（ｉｉ）ＪＡＫ２－活性化ドメインを有する細胞内部分を含む膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）サイトカイン受容体尾部（細胞尾部）に由来するＳＴＡＴ－リクルートドメイン（ＳＴＡＴ－活性化ドメイン）を含むＳＴＡＴ－リクルートドメイン。図１に例として示されるように、結合ドメインは、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞レポーターアッセイを使用して、ＴＧＦ－βシグナル伝達の中和、またはＳＴＡＴ応答の活性化のいずれかに対する、キメラサイトカイン受容体を使用したサイトカインシグナル伝達の誘導性および程度を検証した。当該アッセイは、サイトカインＩＣＤ活性化およびサイトカインシグナル伝達のサロゲート測定として使用され得る。簡潔に述べると、２０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリ－Ｌ－リシン被覆９６ウェル平底プレートの各ウェルに播種し、５％ ＣＯ₂、３７℃で一晩培養した。キメラサイトカイン受容体－ＣＡＲ構築物（２．５ｎｇ）、ホタルルシフェラーゼを駆動するＴＧＦ－βまたはＳＴＡＴ応答因子（１００ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ対照レポーターベクター（１ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）中、５μｌの最終体積まで混合した（ＤＮＡ混合物）。

細胞は、ＢＦＰ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ構築物でトランスフェクトされた。ＢＦＰ遺伝子は、陰性対照としてキメラサイトカイン受容体の代わりである。また、追加の対照としてＴＧＦβＲ２のドミナントネガティブ短縮型（以下、ＴＧＦβＲ２ ＤＮ）、およびＴＧＦβ１のドミナントネガティブ短縮型（以下、ＴＧＦβＲ１ ＤＮ）も構築され、細胞内サイトカインシグナルの非存在下でのドミナントネガティブの効果を検証した。０．３μｌのリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）および５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭと予混合されたＤＮＡ混合物を室温で２０分間インキュベートした後、総体積１０μｌの混合物を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含有する各ウェルに添加した。トランスフェクションから１日後、市販のＴＧＦ－β１リガンド（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、以下の実施例１～４では「ＴＧＦ－β」と呼称される）を、刺激用に様々な最終濃度で培養物に添加した。２０～２４時間の刺激後、ＴＧＦ－βまたはＳＴＡＴ５レポーター活性を、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して評価した。ＴＧＦ－βまたはＳＴＡＴ５レポーターの活性の誘導倍率は、レポーターベクターのみでトランスフェクトされ、未処置とされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して正規化された。

図２Ａは、第２世代ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲと、ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２キメラサイトカイン受容体のドミナントネガティブ短縮型の共発現のために使用されるレンチウイルスベクターの概略図を示す。

図２Ｂは、ＴＧＦβＲ１ ＤＮまたはＴＧＦβＲ２ ＤＮ（図２Ａに示され、それぞれ配列番号２および３のアミノ酸配列を含む）のいずれかの発現による、ＴＧＦ－βシグナル伝達の阻害を示す。示されるデータから、ＴＧＦβＲ２ ＤＮキメラサイトカイン受容体が、ＴＧＦβＲ１ ＤＮよりも高効率で、ＴＧＦβリガンド（最大１００ｎｇ／ｍｌ）により誘導されるＴＧＦ－βシグナル伝達を阻害したことが示される。これは、ＴＧＦ－βリガンドへのＴＧＦβＲ１の結合の結合アフィニティと比較して、ＴＧＦ－βリガンドへのＴＧＦβＲ２の結合のアフィニティが高いことに起因する可能性が高い（Ｇｒｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２９（２）：１５７－６８に記載される）。結果として、以下の実施例の設計は、ＴＧＦβＲ２の結合ドメインを有するキメラサイトカイン受容体に焦点が置かれた。

実施例２：ＴＧＦβＲ２を使用した誘導性キメラサイトカイン受容体の設計および検証
図１を参照して簡潔に記載されるように、キメラサイトカイン受容体が構築され、結合ドメインはＴＧＦβＲ２に由来するドメインとした（ＴＧＦβ２キメラサイトカイン受容体）。ＣＡＲ－Ｔ細胞を背景としたＴＧＦβＲ２キメラサイトカイン受容体の有用性を調査するために、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のバリアント、およびＴＰＯＲ膜貫通（ＴＭ）ドメインのバリアントを構築した。各ＴＧＦβＲ２ ＥＣＤバリアント、各ＴＰＯＲ ＴＭドメインバリアント、および所望のサイトカイン受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の融合物を、第２世代ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクター内にクローニングし（２１７３ｓｃＦｖ、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１５ Ｆｅｂ １８；７（２７５）：２７５ｒａ２２に記載される）、これら受容体バリアントの活性を検証した。キメラサイトカイン受容体とＣＡＲの化学量論的共発現を可能にするために、両方の遺伝子をＰ２Ａペプチドを介して連結した（キメラサイトカイン受容体－ＣＡＲ構築物）。形質導入細胞の検出を容易にするために、ｖ５エピトープタグ（配列番号１５２）をｓｃＦｖとＣＤ８ヒンジドメインの間に挿入した。

図３は、第２世代ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲと、ＴＧＦβＲ２キメラサイトカイン受容体を共発現するために使用されたレンチウイルスベクターの概略図を示す。一つ以上の細胞尾部またはリクルートドメインをタンデム結合して、一つ以上のサイトカインからのシグナル伝達を模倣してもよい。

図４Ａ－４Ｃは、ＴＧＦβＲ２を使用して構築されたキメラサイトカイン受容体の過剰発現による、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害を示す。使用されたレンチウイルスベクターは、実施例１に記載される内容と同様に構築された。図４Ａは、ＩＬ７Ｒ（３１６－４５９）およびＩＬ１２Ｒｂ２（７７５－８２５）細胞尾部またはリクルートドメインを担持する、ＣＡＲ－Ｔ細胞においてＩＬ７シグナル伝達およびＩＬ１２シグナル伝達を模倣するために使用されたプロトタイプ型レンチウイルスベクターの概略を示す。ＴｐｏＲカセットの膜貫通ドメイン中に様々な短縮型を設計した（表３に示す）。これら短縮型がサイトカインシグナル伝達を調節する能力を判定した。図４Ｂは、ルシフェラーゼレポーターアッセイによって決定されたＴＧＦ－βシグナル伝達活性を示す。ＴＧＦβＲ２を使用して構築された、すべての試験されたキメラサイトカイン受容体は、ＴＧＦ－βシグナル伝達を阻害できることが示され、これら操作キメラ受容体中のＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを介して結合に関して競合する。図４Ｃは、ＴＧＦ－βの存在下での、図４Ａのキメラサイトカイン受容体の活性化を示す。キメラサイトカイン受容体の活性化は、ＳＴＡＴレポーター活性によって測定される。いくつかのバリアントが、ＴＧＦ－βリガンドによるサイトカインシグナル伝達を誘導する能力を有すると特定された。図４Ｂ－４ＣのＸ軸に列挙される膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、表３に提示される配列番号２９～配列番号４０、および配列番号５０～配列番号５７である。

図５Ａ－５Ｃは、ＴＧＦβＲ２を使用して構築された追加のキメラサイトカイン受容体の過剰発現による、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害を示す。使用されたレンチウイルスベクターは、図４Ａ－４Ｃを参照し、および実施例１に記載される内容と同様に構築された。図５Ａは、結合ドメイン内に短縮を有する、使用されたプロトタイプ型レンチウイルスベクターの概略図を示す。

再度、ＴｐｏＲカセットのＴＭドメインにおける追加の短縮型（Ｎ－１０、Ｎ－１１、Ｎ－１２など）を設計し（表３に示す）、サイトカインシグナル伝達を調節するその能力を判定した。図５Ｂは、ルシフェラーゼレポーターアッセイによって決定されたＴＧＦ－βシグナル伝達活性を示す。試験されたキメラサイトカイン受容体の大部分は、ＴＧＦ－βシグナル伝達を阻害できることが示された（Ｎ－１２、Ｎ－１３、Ｎ－１４ ＴＭ短縮型以外、それらの阻害の程度は低いことが示された）。図５Ｃは、ＴＧＦ－βの存在下での、図５Ａのキメラサイトカイン受容体の活性化を示す。キメラサイトカイン受容体の活性化は、ＳＴＡＴレポーター活性によって測定される。いくつかのバリアントが、ＴＧＦ－βリガンドによるサイトカインシグナル伝達を誘導する能力を有すると特定された。図５Ｂ－５Ｃのｘ軸に列挙される膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２９、３８、５３、配列番号４０～配列番号４４、および配列番号６１～配列番号７２であり、表３に提示される。

実施例３：キメラサイトカイン受容体結合ドメインの改変、および構築されたキメラサイトカイン受容体の検証
ＴＧＦβＲ２の非存在下では、ＴＧＦβＲ１は、非常に低いアフィニティでＴＧＦ－βリガンドと相互作用する。ＴＧＦβＲ２のＥＣＤがＴＧＦβリガンドに結合した場合、当該二元複合体は広い境界面を有しており、ＴＧＦβＲ１を効率的にリクルートし、三元複合体を形成する。操作されたＴＧＦβＲ２キメラサイトカイン受容体も、内因性ＴＧＦβＲ１と係合することができる。この係合は、サイトカイン受容体ＩＣＤを通じて、意図されるシグナル伝達に立体的に干渉し得る。ＴＧＦβＲ２キメラサイトカイン受容体とＴＧＦβＲ１との間の相互作用を遮断するために、ＴＧＦβＲ１カセットのバリアントをいくつか設計し、ＴＧＦ－βシグナル伝達を阻害しながらサイトカインシグナル伝達を強化することができる改変を特定した。

図６Ａ～６Ｃは、改変を有するＴＧＦβＲ２を用いて構築されたキメラサイトカイン受容体の過剰発現による、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害を示す。図６Ａは、ＴＧＦβＲ２カセットに導入された改変の概略を示す。使用されたレンチウイルスベクターは、実施例１に記載される内容と同様に構築された。ＴＧＦβＲ１の係合を遮断するために、短縮型（ΔＮ２５）を、図６Ａ－６Ｃに言及する際に記載された上述の構築物に基づき、ＴＧＦβＲ２結合ドメイン内に導入して（ＴＧＦβＲ２ΔＮ２５）、ＴＧＦ－βシグナル伝達の阻害を、ＴＧＦ－βレポーターアッセイにより検証した。図６Ｂは、ＴＧＦβＲ２ΔＮ２５キメラサイトカイン受容体が、ＴＧＦ－βシグナル伝達を阻害する能力をまだ保持していることを示す。図６Ｃは、ＳＴＡＴレポーター活性により評価された、図６Ａのキメラサイトカイン受容体の活性化を示す。図６Ｂ－６ＣのＸ軸に列挙される膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４または配列番号３の結合ドメイン配列を伴う、配列番号２９、３８、３９、４０、および５３であり、表１および３に提示される。

ＴＧＦβＲ２結合ドメインの短縮型は、ＴＧＦ－βリガンドの非存在下であっても、サイトカインシグナル伝達を５～１０倍強化すると判定された。興味深いことに、ΔＮ２５短縮型は、ＴｐｏＲ ＴＭ短縮型（例えば、Ｎ－７、Ｎ－８、Ｎ－９、およびＮ＋４）と相乗的にシグナル伝達を強化することができた。ＴＧＦβＲ２結合ドメインとＴｐｏＲ ＴＭ短縮型変異体のこの組み合わせの使用は、免疫増強サイトカインシグナルを伝達しながら、免疫抑制性のＴＧＦ－βシグナル伝達を同時に抑制するための新しいアプローチとなる。

実施例４：構造的に活性なキメラサイトカイン受容体の設計および検証
図７は、構造的に活性なキメラサイトカイン受容体の概略を示す。サイトカイン細胞内ドメインの構造的に活性なシグナル伝達を可能にするために、ＴＰＯＲ膜貫通ドメインを生得的に二量体形成させ、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路を活性化する二重変異を、ＴＰＯＲ膜貫通ドメインに導入した。図７の構築物の例として示されるように、結合ドメインは、ＴＧＦβＲ２の細胞外部分を含む。膜貫通ドメインの例は、配列番号２９、４０、５３、または６０を含んでもよい。

図８Ａ～８Ｃは、構造的に活性なキメラサイトカイン受容体の設計および検証された機能を示す。使用されたレンチウイルスベクターは、実施例１に記載される内容と同様に構築された。二重変異（Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ）をＴＰＯＲカセット内に導入し、受容体の二量体形成および活性化を強制させて、最も有望な機能性を示したバリアント（例えば、ＴＰＯＲカセットのＴＧＦβＲ２ΔＮ２５、Ｎ－９、およびＮ＋４短縮型）と組み合わせた。図８Ａは、ＴＧＦβＲ２カセットに導入された改変の概略を示す。図８Ｂは、図８Ａのキメラサイトカイン受容体の発現による、ＴＧＦ－βシグナル伝達の阻害を示す。図８Ｃは、２９３細胞においてＳＴＡＴ５レポーター活性により測定された、図８Ａのキメラサイトカイン受容体を介したサイトカインシグナル伝達の活性化を示す。親設計（ＴＧＦβＲ２＿ＴｐｏＲ、ＴＧＦβＲ２＿ＴｐｏＲ＿Ｎ－９、およびＴＧＦβＲ２＿ＴｐｏＲ＿Ｎ＋４）と比較して、Ｓ５０５ＮおよびＷ５１５Ｋの変異を有する受容体は、しっかりとしたサイトカインシグナル伝達を示した（例えば、ＴＧＦβＲ２＿ＴｐｏＲ．Ｓ５０５．Ｗ５１５Ｋ、ＴＧＦβＲ２＿ＴｐｏＲ＿Ｎ－９．Ｓ５０５Ｎ．Ｗ５１５Ｋ）。図８Ｂ－８ＣのＸ軸に列挙される膜貫通ドメインの配列は、配列番号４または配列番号３の結合ドメイン配列を伴う、配列番号４０、５３、５９および６０を含み、表１および３に提示される。

実施例５：追加のキメラサイトカイン受容体の検証
図１０Ａは、誘導性ＴＧＦ－β駆動型キメラサイトカイン受容体の追加設計を示す。ＥＣＤと細胞内シグナル伝達ドメインとの間の柔軟性を減少させるために膜貫通ドメイン内にさらに短縮を有する構築物が作製された。図１０Ｂは、ルシフェラーゼアッセイにより判定された、様々な濃度のＴＧＦ－βの存在下での２９３細胞における、図１０Ａに示されるＴＧＦ－β駆動型キメラサイトカイン受容体の過剰発現による内因性ＴＧＦ－βシグナル伝達の阻害を示す。構築物の一部はさらに、ＥＣＤドメイン内にΔＮ２５欠失を担持する（ＴＧＦ－βＲ２ΔＮ２５）。図１０ＢのすべてのＴＧＦ－β駆動型キメラサイトカイン受容体が、内因性ＴＧＦ－βシグナル伝達を阻害した。しかしΔＮ２５欠失を有するクローンは、わずかに低いＴＧＦ－βシグナル伝達の阻害を示した。図１０Ｃのデータは、様々な濃度のＴＧＦ－βの存在下での、キメラサイトカイン受容体の活性化を示す。膜貫通ドメインにおける欠失、およびΔＮ２５欠失を有するキメラ受容体は、ＴＧＦ－βの存在下でＳＴＡＴ５シグナル伝達を誘導した。

本発明者らは次に、ＣＡＲ Ｔ細胞における構造的キメラ受容体を試験した。図１１～１６で試験された全ての構築物は、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ膜貫通ドメイン中にＳ５０５ＮおよびＷ５１５Ｋの置換を含有する。図１１Ａは、ＴＧＦβＲ２キメラサイトカイン受容体と、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ（２１７３ｓｃＦｖ）をＣＡＲ Ｔ細胞において共発現するために使用されたレンチウイルスベクターの概略図を示す。すべてのキメラサイトカイン受容体は、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲの膜貫通ドメインに二量体形成変異（Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ、配列番号６０を参照）を担持し、およびタンデム結合された一つ以上のサイトカイン受容体リクルートドメインを担持し、一つ以上のサイトカインからのシグナル伝達を模倣した。「ＩＬ２ＹＹ」とは、ＩＬ２Ｒｂ （３９３－４３３、５１８－５５１）を指し、「ＩＬ７ＩＬ１２」とは、タンデム結合されたＩＬ７Ｒ（３１６－４５９）とＩＬ１２Ｒｂ２（７７５－８２５）を指す。対照として、ＴＧＦβＲ２のドミナントネガティブ短縮型（ＴＧＦ－βＲ２．ＤＮ）、ＴＧＦ－βＲ２ ＥＣＤを含まない構造的キメラサイトカイン受容体（ＩＬ７ＩＬ１２、ＩＬ２ＹＹ）、またはＢＦＰタンパク質を発現するＣＡＲ Ｔ細胞も作製された。ＣＡＲ Ｔ細胞を産生する方法は、Ｓｏｍｍｅｒ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＢＣＭＡ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１９． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１９．０４．００１、およびＳｏｍｍｅｒ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＦＬＴ３ ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａｎ Ｏｆｆ－Ｓｗｉｔｃｈ Ｅｘｈｉｂｉｔ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ＡＭＬ ａｎｄ Ｃａｎ Ｂｅ Ｄｅｐｌｅｔｅｄ ｔｏ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０２０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０２０．０６．０２２に記載されている通りである。簡潔に述べると、健康なドナーからの初代Ｔ細胞を、ＣＡＲと、ＴＧＦβＲ２キメラサイトカイン受容体または対照の各々を発現するレンチウイルスを用いて、５のＭＯＩで形質導入した。図１１Ｂは、ＣＡＲ Ｔ細胞を産生中の７、９および１４日目のＣＡＲ＋ Ｔ細胞の割合を示す。指定される構造的キメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ Ｔ細胞（ＴＧＦ－βＲ２．ＩＬ７ＩＬ１２、ＴＧＦ－βＲ２．ＩＬ２ＹＹ、ＩＬ７ＩＬ１２、またはＩＬ２ＹＹ）は、ＢＦＰ単独を比較して、産生期間にわたり高い増殖と富化を示した。結果として、キメラサイトカイン受容体を含まずＢＦＰのみを発現するＣＡＲ Ｔと比較して、より多くのＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞が経時的に取得された（図１１Ｃ）。

図１１Ｄおよび１１Ｅは、様々なキメラサイトカイン受容体または対照のいずれかを共発現するＣＡＲ Ｔ細胞における、ＳＴＡＴ ５リン酸化の評価結果を示す。リン酸化ＳＴＡＴ５の検出に使用された抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（ＢＤＢ６１２５９９）から取得したＴＧＦ－βＲ２ ＥＣＤとともに構造的キメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ Ｔ細胞、すなわちＴＧＦ－βＲ２．ＩＬ７ＩＬ１２ またはＴＧＦ－βＲ２．ＩＬ２ＹＹは、ＩＬ２ＹＹおよびＩＬ７ＩＬ１２、すなわちＴＧＦ－βＲ２ ＥＣＤを含まない構造的キメラサイトカイン受容体と比較して、ＴＧＦβの非存在下であっても高いレベルのＳＴＡＴ５リン酸化を呈した。このことから、ＴＧＦ－βＲ２ ＥＣＤドメインで強いサイトカインシグナル伝達があったことが示唆される。データは、ＴＧＦ－βＲ２ ＥＣＤが、ＣＡＲ Ｔ細胞において、細胞間リクルートドメインシグナル伝達を改善したことを示唆している。

図１１Ｆおよび１１Ｇのデータは、キメラサイトカイン受容体が、ＣＡＲ Ｔ産生の１４日目にＣＡＲ Ｔ細胞の分化を制御したことを示す。ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＯ染色は、それぞれＢｉｏＬｅｇｎｅｄ社（＃３０４８２２）およびＢｉｏＬｅｇａｎｄ社（＃３０４２３４）の抗体を使用して実施された。注目すべきは、ＴＧＦβＲ２．ＩＬ７ＩＬ１２キメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞は、主にセントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ６２Ｌ^hiＣＤ４５ＲＯ^hi）に分化したことである。この結果は、強いＩＬ１２Ｒｂシグナル伝達に起因する可能性が高い。一方で、ＴＧＦｂＲ２．ＩＬ２ＹＹまたはＩＬ２ＹＹキメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞は、幹細胞様（幹）メモリーＴ細胞（ＣＤ６２Ｌ^hiＣＤ４５ＲＯ^low）の集団増加を呈した。この集団の表現型は、臨床転帰の良好さと関連している望ましいＴ細胞表現型である。

次に本発明者らは、抗ヒトＴＧＦ－βＲ２ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＦＡＢ２４１１Ａ１００）を使用したフローサイトメトリーにより、総表面ＥＣＤを測定することによって、内因性ＴＧＦ－βＲ２の発現と、ＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体の発現を比較した。図１１Ｈの結果は、ＩＬ７ＩＬ１２またはＩＬ２ＹＹキメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞、およびＢＦＰを発現するＣＡＲ Ｔ細胞における、内因性ＴＧＦβＲ２から生じた、約１４００－２３００のＥＣＤ染色のＭＦＩを示す。ＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞（ＴＧＦ－βＲ２．ＩＬ７ＩＬ１２およびＴＧＦ－βＲ２．ＩＬ２ＹＹ）は、２～３倍多いＭＦＩ値を示した。このことから、内因性ＴＧＦ－βＲ２受容体のレベルよりも２～３倍高いレベルのＴＧＦ－βＲ２ ＥＣＤ染色が示唆される。図１１Ｉは、様々な濃度のＴＧＦβに曝露されたときの、様々なキメラサイトカイン受容体または対照を発現するＣＡＲ Ｔ細胞内のＳＭＡＤリン酸化のレベルを示す。リン酸化ＳＭＡＤの検出に使用された抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社 （ＢＤＢ５６２５８６）から取得した。結果は、ＴＧＦ－βＲ２．ＩＬ７ＩＬ１２、およびＴＧＦ－βＲ２．ＩＬ２ＹＹキメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴＧＦ－βＲ２外部ドメインを含まないＩＬ７ＩＬ１２およびＩＬ２ＹＹキメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、それぞれＳＭＡＤリン酸化の低下を呈したことを示す。

次に本発明者らは、標的細胞のＵ８７－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞に対する、様々なキメラサイトカイン受容体または対照を発現するＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を評価した。簡潔に述べると、ＣＡＲ Ｔ細胞を、１０，０００個の標的細胞とともに、１：２のＥ：Ｔ比で、１０％ＦＢＳ、ならびに０、５、および２０ｎｇ／ｍｌの様々な濃度のＴＧＦ－βを含む２００ｕｌのＲＰＭＩ培地中でインキュベートした。標的細胞との一週間の共培養後、１００ｕｌの上清中のＣＡＲ Ｔ細胞を、前週と同じＴＧＦβ濃度で、新しい標的細胞（１０，０００個）に移した。ＴＧＦ－β添加が無い第二週におけるＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性を評価し、結果を図１２Ａに示す。外因性ＴＧＦβの非存在下では、ＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞（ＴＧＦ－βＲ２．ＩＬ７ＩＬ１２およびＴＧＦ－βＲ２．ＩＬ２ＹＹ）は、最も持続性のある細胞傷害性を示し、ＣＡＲ Ｔ細胞によってほとんどの標的細胞が死滅した。ＴＧＦ－βＲ２ ＥＣＤを含まないキメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞（ＩＬ７ＩＬ１２およびＩＬ２ＹＹ）も、第二週まで、相当な細胞傷害性を呈し、Ｕ８７細胞の増殖を阻害した。比較すると、ＢＦＰまたはＴＧＦ－βＲ２．ＤＮを有するＣＡＲ Ｔ細胞は活性を失い、Ｕ８７細胞の増殖を阻害することができなかった（図１２Ａ）。データは、ＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体が、標的細胞に対して、より持続的な細胞傷害が可能であることを示している。ＴＧＦβの存在下では、ＴＧＦβＲ２ ＥＣＤを有するキメラサイトカイン受容体を発現しないＣＡＲ Ｔ細胞の活性は、ＴＧＦ－βによって様々なレベルに阻害され、これは内因性ＴＧＦ－β受容体を介したシグナル伝達の効果である可能性が高い（図１２Ｂ－１２Ｃ）。対照的に、ＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴＧＦ－β阻害に対して抵抗性であり、最大で２０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－βの条件下でも強い細胞傷害性を維持することができた（図１２Ｂ、１２Ｃ）。

本発明者らは次に、ＣＡＲ Ｔ細胞における、さらに改変された構造的ＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体を評価した。上記に示されるように、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ膜貫通ドメイン中にＳ５０５Ｎ／Ｗ５１５Ｋ置換、およびＩＬ７Ｒａ／ＩＬ１２Ｒｂリクルートドメイン（例えば、配列番号１６３）を有する構造的ＴＧＦβＲ２．ＩＬ７ＩＬ１２キメラサイトカイン受容体は、ＳＴＡＴ５リン酸化を増加させ、セントラルメモリーＴ細胞へのかなりの分化を生じさせた。ＩＬ１２サイトカインシグナル伝達は、メモリーＴ細胞の分化に関与しているため、本発明者らは、ＩＬ１２シグナル伝達を消去するＴＧＦ－βＲ２．ＩＬ７キメラサイトカイン受容体を設計した。それに加えて本発明者らは、ＴｐｏＲ ＪＡＫ－結合ドメイン中に二つの変異、Ｋ５５３ＲとＫ５７３Ｒを導入し（「ＲＲ」と指定される、例えば配列番号１６５および１７０）、ユビキチン誘導性の受容体分解を低下させた。Ｓａｕｒ ＳＪ， Ｓａｎｇｋｈａｅ Ｖ， Ｇｅｄｄｉｓ ＡＥ， Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ Ｋ， Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ ＩＳ． Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃ－Ｍｐｌ． Ｂｌｏｏｄ． ２０１０． ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２００９－０６－２２７０３３を参照のこと。キメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞を作製し、ＳＴＡＴ５リン酸化およびＴ細胞分化について評価した。前述と同様に、これらのさらに改変されたＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体は、ＳＴＡＴ５リン酸化により判定した場合、ＴＧＦ－βＲ２ ＥＣＤドメインを含まないキメラサイトカイン受容体よりも高レベルのＳＴＡＴ５シグナル伝達を示した（ＩＬ７ＩＬ１２およびＩＬ７キメラサイトカイン受容体構築物の両方ともＳ５０５Ｎ／Ｗ５１５Ｋ置換を含む）（図１３Ａ）。Ｔ細胞分化の評価では、ＩＬ１２Ｒリクルートドメインを含まないキメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞（ＴＧＦ－βＲ２．ＩＬ７、ＴＧＦ－βＲ２．ＩＬ７＿ＲＲ、およびＩＬ７）は、ＩＬ１２Ｒリクルートドメインを含むカウンターパートよりも高い割合の幹メモリーＴ細胞を示した（図１３Ｂ）。これらのデータは、異なるサイトカイン受容体モチーフを選択することによって、ＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体シグナル伝達とＴ細胞分化を調節できることを示す。

ＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体がどのようにＴ細胞機能に影響を与えるかを評価するために、ＣＡＲ Ｔ細胞を長期間の殺傷アッセイで評価した。簡潔に述べると、異なるキメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞を、１０％のＦＢＳを含み、５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－βを含む、または含まない２００ｕｌ ＲＰＭＩ培地中、１：１のＥ：Ｔ比で１０，０００個のＵ８７－ＥＧＦＲｖＩＩＩ癌細胞と混合した。２日または３日ごとに、ＣＡＲ Ｔ細胞を含む１００ｕｌの上清を１０，０００個の新たな標的細胞上へと移し、１０％ ＦＢＳおよび５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβを含むＲＰＭＩ培地で２００ｕｌの最終体積とし、古い標的細胞の生存率を定量した。異なるＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ Ｔ細胞の長期的な細胞傷害性を、図１４Ａ－Ｂに要約する。外因性のＴＧＦβの非存在下では、様々なリクルートドメインを有するＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体、例えば、ＴＧＦ－βＲ２．ＩＬ２ＹＹ、ＴＧＦ－βＲ２．ＩＬ７、またはＴＧＦ－βＲ２．ＩＬ２ＹＹＹ（ＩＬ２Ｒｂ（３３９－３７９、３９３－４３３、５１８－５５１））はすべて、ＴＧＦ－βＲ２ ＥＣＤを含まないキメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞よりも強力で長期的な細胞傷害性を与えた。このことから、ＴＧＦ－βＲ２ ＥＣＤドメインは、キメラサイトカイン受容体のシグナル伝達を強化したという従前の実験結果が確認される（図１４Ａ）。５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβの存在下では、ＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴＧＦ－βＲ２ ＥＣＤを含まないキメラサイトカイン受容体を発現する、または発現しないＣＡＲ Ｔ細胞よりも強力で持続的な細胞傷害性を維持した（図１４Ｂ）。試験されたキメラサイトカイン受容体はすべて、Ｓ５０５Ｎ／Ｗ５１５Ｋ置換を含有し、ＴＧＦｂＲ２．ＩＬ２ＹＹＹおよびＩＬ２ＹＹＹ構築物は、ＴＯＰＲ／ＭＰＬＲ膜貫通ドメイン中に追加のＨ４９９Ｌ置換を有している。

ＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体によるＴＧＦβシグナル伝達の阻害、およびＣＡＲ Ｔ細胞の機能性に対するその影響をさらに評価するために、本発明者らは、ＴＭ領域中に二量体形成変異（Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ）、およびＪＡＫ－結合ドメイン中に分解抵抗性変異（Ｋ５５３Ｒ、およびＫ５７３Ｒ）を担持するＴＧＦ－βＲ２．ＩＬ２ＹＹ＿ＲＲキメラサイトカイン受容体（配列番号１６６）を分析した。本発明者らは、ＴＧＦβリガンドに結合する受容体の能力を無効化する、ＴＧＦ－βＲ２ ＥＣＤ中の変異（Ｄ３２Ａ．Ｅ１１９ＡおよびＤ３２Ａ．Ｅ１１９Ａ．Ｉ５３Ａ）を担持する二つの追加バリアントを設計した。指定のキメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞を作製し、サイトカインシグナル伝達（ｐＳＴＡＴ５）、ＴＧＦβシグナル伝達（ｐＳＭＡＤ）、およびＵ８７－ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的細胞に対する細胞傷害性の持続性について評価した。図１５Ａは、ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５シグナル伝達の分析を示しており、この解析では、全てのＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体が、ＣＡＲのみを発現するＴ細胞と比較して、ＣＡＲ Ｔ細胞において強力なＳＴＡＴ５リン酸化をもたらしたことを示している。ＣＡＲ Ｔ細胞が５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβリガンドに曝露されたとき、様々なレベルのＳＭＡＤリン酸化が観察された。結合能力を失った変異体を含むＴＧＦ－βＲ２キメラ受容体と比較して、野生型ＴＧＦβ結合ドメインを含むＴＧＦ－βＲ２．ＩＬ２ＹＹ＿ＲＲは、ＳＭＡＤリン酸化のレベル低下を呈した。このことから、野生型の機能性リガンド結合ドメインを含むＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体により、内因性ＴＧＦβシグナル伝達の阻害に成功したことが示唆される（図１５Ｂ）。

５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβの存在下での、異なるＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞の癌細胞に対する長期的な細胞傷害性を、図１５Ｃに示す。対照のＣＡＲ Ｔ細胞は８日目に標的細胞を殺傷する活性を急速に失ったことと比較して、ＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体を有するＣＡＲ Ｔ細胞は、より持続的な活性を与えた。また、ＴＧＦβに結合する能力が損なわれたＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体（Ｄ３２Ａ．Ｅ１１９ＡおよびＤ３２Ａ．Ｅ１１９Ａ．Ｉ５３Ａ）も、細胞傷害性アッセイにおいて、野生型ＴＧＦβ結合ＥＣＤを有するＴＧＦ－βＲ２．ＩＬ２ＹＹ＿ＲＲキメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞よりも早く減衰を示した。これらのデータから、サイトカインシグナル伝達と、内因性ＴＧＦβシグナル伝達を阻害する能力の両方が、ＣＡＲ Ｔ細胞の長期的な活性に重要であることが示される。

図１６Ａ－Ｂの結果は、分解抵抗性変異であるＫ５５３ＲおよびＫ５７３Ｒが、構造的ＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体の機能性をさらに改善し得ることを示す。この実験では、分解抵抗性変異（ＲＲとして指定される）を含む、または含まないＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞は、サイトカインシグナル伝達の強度について、ならびに５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβリガンドを含む培地中でのＵ８７－ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する長期的な細胞障害性アッセイについて評価された。Ｋ５３３ＲおよびＫ５７３Ｒの置換を有するＴＧＦ－βＲ２キメラサイトカイン受容体は一貫して、より強力なＳＴＡＴ５リン酸化（図１６Ａ）と、より長期的な標的細胞殺傷能力を示している（図１６Ｂ）。

Claims (57)

1. キメラサイトカイン受容体であって、
   ａ．ＴＧＦ－β受容体の細胞外部分、またはＴＧＦ－β抗原結合ドメインを含む結合ドメイン、
   ｂ．膜貫通ドメイン、
   ｃ．ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）結合ドメイン、および
   ｄ．リクルートドメイン、
   を含む、キメラサイトカイン受容体。
2. 前記リクルートドメインが、ＳＴＡＴ－リクルートドメインである、請求項１に記載のキメラサイトカイン受容体。
3. 前記リクルートドメインが、受容体、任意でサイトカイン受容体に由来する、請求項１または２に記載のキメラサイトカイン受容体。
4. 前記キメラサイトカイン受容体が、クラスター形成される、請求項１～３のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
5. 前記キメラサイトカイン受容体が、二量体形成され、および各単量体が、
   ａ．ＴＧＦ－β受容体の細胞外部分、またはＴＧＦ－β抗原結合ドメインを含む結合ドメイン、
   ｂ．膜貫通ドメイン、
   ｃ．ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）結合ドメイン、および
   ｄ．リクルートドメイン、
   を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
6. 前記ＴＧＦ－β抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項１～５のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
7. 前記結合ドメインが、野生型ＴＧＦ－β受容体配列の細胞外部分を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
8. 前記結合ドメインが、野生型ＴＧＦ－β受容体配列の細胞外部分に対して一つ以上の変異を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
9. 前記結合ドメインが、ＴＧＦβＲ２の細胞外部分を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
10. 前記結合ドメインが、配列番号２～配列番号２０および配列番号１５９のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
11. 前記キメラサイトカイン受容体が、構造的に活性であるか、または前記結合ドメインがＴＧＦ－βリガンドに結合されたときに活性化される、請求項１～１０のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
12. 前記ＴＧＦ－βリガンドが、ＴＧＦβ－１、ＴＧＦ－β２、またはＴＧＦ－β３のいずれか一つである、請求項１１に記載のキメラサイトカイン受容体。
13. 前記キメラサイトカイン受容体が、構造的に活性であるか、または前記結合ドメインが抗ＴＧＦ－β受容体抗体に結合されたときに活性化される、請求項１～１０のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
14. 前記ＪＡＫ－結合ドメインが、ＪＡＫ１－結合ドメイン、ＪＡＫ２－結合ドメイン、ＪＡＫ３－結合ドメイン、またはＴＹＫ２－結合ドメインである、請求項１～１３のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
15. 前記膜貫通ドメインが、ＥｐｏＲ、ＧＰ１３０、ＰｒｌＲ、ＧＨＲ、ＧＣＳＦＲ、またはＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体から誘導される、請求項１～１４のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
16. 前記膜貫通ドメインが、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体から誘導される、請求項１～１５のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
17. 前記膜貫通ドメインおよびＪＡＫ結合ドメインが、配列番号２６の天然ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体のアミノ酸４７８－５８２を含む、請求項１６に記載のキメラサイトカイン受容体。前記膜貫通ドメインおよびＪＡＫ結合ドメインが、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体のＨ４９９、Ｓ５０５、Ｗ５１５、Ｋ５５３、またはＫ５７３のアミノ酸位置で少なくとも一つの置換をさらに含む、請求項１７に記載のキメラサイトカイン受容体。
18. 前記膜貫通ドメインおよびＪＡＫ結合ドメインが、Ｈ４９９Ｌ、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ、Ｋ５５３Ｒ、およびＫ５７３Ｒから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を含む、請求項１７に記載のキメラサイトカイン受容体。
19. 前記ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体の膜貫通ドメインおよびＪＡＫ結合ドメインが、（ａ）Ｈ４９９Ｌ置換、（ｂ）Ｓ５０５Ｎ置換、（ｃ）Ｗ５１５Ｋ置換、（ｄ）Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ置換、または（ｅ）Ｈ４９９Ｌ、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ置換を含む、請求項１８に記載のキメラサイトカイン受容体。
20. 前記ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体の膜貫通ドメインおよびＪＡＫ結合ドメインが、Ｋ５５３Ｒおよび／またはＫ５７３Ｒ置換をさらに含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
21. 前記膜貫通ドメインおよびＪＡＫ結合ドメインが、配列番号２７～配列番号７９、配列番号１６０、および配列番号２１７～配列番号２３４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
22. 前記ＳＴＡＴリクルートドメインが、表４に示される受容体から選択される受容体に由来する、請求項２～２１のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
23. 前記リクルートドメインが、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ１２Ｒｂ２、ＥＧＦＲ、ＩＬ－２１Ｒ、またはＩＬ２Ｒｂのうちの一つ以上の受容体に由来するＳＴＡＴ－リクルートドメインを含む、請求項２～２２のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
24. 前記ＳＴＡＴ－リクルートドメインが、配列番号８０～配列番号１２２、および配列番号１６１のアミノ酸配列のうちのいずれか一つを含む、請求項２～２３のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
25. 前記ＳＴＡＴ－リクルートドメインが、ＩＬ７Ｒａ（３１６－４５９）（配列番号８０）、ＩＬ２Ｒｂ（３３９－３７９、３９３－４３３、５１８－５５１）（配列番号１１２）、ＩＬ２Ｒｂ（３９３－４３３、５１８－５５１）（配列番号１１１）、ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５－８２５）（配列番号１０１）、ＩＬ１２Ｒｂ２（７１４－８６２）（配列番号１２０）、ＥＧＦＲ（１１２２－１１６５）（配列番号９９）、またはＩＬ７Ｒａ（３１６－４５９）．ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５－８２５）（配列番号１６１）を含む、請求項２～２４のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
26. 前記キメラサイトカイン受容体が、配列番号１２３～１５１および配列番号１６２～２１６から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
27. 前記キメラサイトカイン受容体が、誘導性である、または構造的に活性である、請求項１～２６のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
28. 前記キメラサイトカイン受容体が、ＴＧＦβまたは抗ＴＧＦβＲ抗体によって誘導されることができる、請求項２７に記載のキメラサイトカイン受容体。
29. 前記キメラサイトカイン受容体が、構造的に活性であり、ＴＧＦβまたは抗ＴＧＦβＲ抗体の存在下で、さらに誘導されることができる、またはさらに改善された活性を呈する、請求項２８に記載のキメラサイトカイン受容体。
30. 前記キメラサイトカイン受容体が、細胞において発現されるとき、ＴＧＦｂＲ２－介在性シグナル伝達を阻害することができる、および／またはＳＴＡＴ介在性シグナル伝達を強化することができる、請求項１～２９のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体。
31. 前記細胞が免疫細胞である、請求項３０に記載のキメラサイトカイン受容体。
32. 請求項１～３１のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチド。
33. 請求項３２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
34. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３３に記載の発現ベクター。
35. 前記ＣＡＲが、表８の標的のうちのいずれか一つ以上に結合する、請求項３４に記載の発現ベクター。
36. 前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
37. 請求項３３～３６のいずれか一項に記載のベクターを含む、操作された免疫細胞。
38. 請求項１～３１のいずれか一項に記載のキメラサイトカイン受容体を発現する操作された免疫細胞。
39. 少なくとも一つのＣＡＲをさらに発現する、請求項３７または３８に記載の操作された免疫細胞。
40. 前記ＣＡＲおよび前記キメラサイトカイン受容体が、化学量論的に等しい量で発現される、請求項３９に記載の操作された免疫細胞。
41. 前記ＣＡＲが、表８の標的のうちのいずれか一つ以上に結合する、請求項３９または４０に記載の操作された免疫細胞。
42. 前記免疫細胞が、同種免疫細胞である、請求項３７～４１のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
43. 前記免疫細胞が、自己免疫細胞である、請求項３７～４１のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
44. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、および幹細胞に由来する免疫細胞からなる群から選択される、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
45. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項４４に記載の操作された免疫細胞。
46. 前記免疫細胞が、キメラサイトカイン受容体の発現を欠く免疫細胞と比較して、ＴＧＦ－βＲ介在性シグナル伝達の低下および／またはＳｔａｔ介在性シグナル伝達の強化を呈する、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
47. 前記免疫細胞が、ＴＧＦ－βまたは抗ＴＧＦ－βＲ抗体と係合したときに、ＴＧＦ－βＲ介在性シグナル伝達の低下、および／またはＳｔａｔ介在性シグナル伝達の強化を呈する、請求項３７～４６のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
48. 前記免疫細胞と、ＴＧＦ－βまたは抗ＴＧＦ－β受容体抗体とを接触させることを含む、請求項３７～４７のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞の活性を調節する方法。
49. 操作された免疫細胞を調製する方法であって、請求項３２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３３～３６のいずれか一項に記載の発現ベクターを、免疫細胞に導入することを含む、方法。
50. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、および幹細胞に由来する免疫細胞からなる群から選択される、請求項４８または４９に記載の方法。
51. 請求項３７～４７のいずれか一項に記載の免疫細胞を含む医薬組成物。
52. 請求項３７～４７のいずれか一項に記載の免疫細胞、または請求項５１に記載の医薬組成物を含むキット。
53. 対象の癌を治療する方法であって、前記対象に、請求項３７～４７のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞または請求項５１に記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
54. 前記癌が、固形腫瘍を含む、請求項５３に記載の方法。
55. 前記癌が、液状腫瘍を含む、請求項５３に記載の方法。
56. 前記腫瘍が、ＴＧＦβ陽性腫瘍である、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の方法。
57. 前記対象が、抗ＴＧＦ－β受容体抗体で治療される、請求項５３～５６のいずれか一項に記載の方法。

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