TW201938580A - Ｈｍｇｎ部分肽及使用其之癌症療法 - Google Patents

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弟子丸俊吾
陳昌佑
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Abstract

本發明揭示對癌症有效且實用性的新穎治療手段、及作為該種治療手段有用之新穎物質。本發明提供了源自HMGN1、HMGN2、HMGN4、HMGN5之部分區域的新穎肽、以及以該肽為有效成分的抗癌劑及抗癌作用增強劑。本發明之肽即使單獨也有抗腫瘤效果，但尤其是藉由與免疫檢查點控制劑、或抗CD4抗體或是其抗原結合性片段併用，會發揮明顯優異的抗腫瘤效果。

Description

HMGN部分肽及使用其之癌症療法
本發明有關於新穎肽及使用其之癌症療法。更具體而言，係有關於源自HMGN1、2、4、5之部分區域的肽、及利用該肽與免疫檢查點控制劑或抗CD4抗體之組合的癌症療法。
HMG蛋白質是核小體結合蛋白的超家族，被分類為HMGA、HMGB、HMGN之家族。此等之多肽藉由與DNA結合而調節基因表現。又，HMG蛋白質藉由不經由如因感染或傷害所誘導之細胞壞死(necrosis)的細胞死亡、或為通常之輸送路徑的內質網-高基氏體路徑之路徑被放出至細胞，且誘導發炎反應，而被分類為警報素(alarmin)分子群。再者，除了作為警報素蛋白之外，已知如IL-1α或IL-33的細胞激素或HSP(熱休克蛋白)、S100蛋白質等。警報素蛋白亦與經由類鐸受體(Toll-like receptor：TLR)所代表之樣式辨識受體(pattern recognition receptor)的病原體相關分子樣式(pathogen-associated molecular patterns：PAMPs)的辨識有關聯。
為HMG蛋白質之家族之一的HMGN中，有HMGN1、HMGN2、HMGN3、HMGN4及HMGN5的5種類。當中關於HMGN1，除了有HMGN1剔除小鼠中腫瘤的發生增加了的報告(例如，非專利文獻1~3)以外，有HMGN1為抗腫瘤免疫的助力器且可將HMGN1蛋白質與手術、化學療法、放射線療法等之以往的癌症療法、或免疫檢查點抑制劑等併用的報告(非專利文獻4)。
然而，此等之報告皆為有關於HMGN1全長蛋白質之對癌症治療的應用的可能性、或者在活體內的HMGN1全長蛋白質與腫瘤發生之關連的報告。專利文獻1有揭示將HMGN2的部分肽利用於癌症之治療的發明，但係所謂利用HMGN2部分肽容易積聚於腫瘤的血管而作為抗癌劑之載體來使用的發明，並非所謂HMGN2的部分肽具有抗腫瘤效果的內容。又，專利文獻2揭示HMGN肽或其機能性片段的抗原專一性免疫反應增強用途，但關於具體的抗腫瘤作用則未揭示。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1 美國專利第7544767號公報
專利文獻2 美國專利第8227417號公報
非專利文獻
非專利文獻1 Birger et al., "Increased Tumorigenicity and Sensitivity to Ionizing Radiation upon Loss of Chromosomal Protein HMGN1." Cancer Research, 65: (15). August 1, 2005, p.6711-6718
非專利文獻2 Gabi Gerlitz, "HMGNs, DNA Repair and Cancer." Biochim Biophys Acta. 2010; 1799(1-2): 80-85.
非專利文獻3 Postnikov et al., "Loss of the nucleosome-binding protein HMGN1 affects the rate of N-nitrosodiethylamine induced hepatocarcinogenesis in mice." Mol Cancer Res. 2014 January; 12(1): 82-90.
非專利文獻4 De Yang, Michael Bustin and Joost J Oppenheim, "Harnessing the alarmin HMGN1 for anticancer therapy." Immunotherapy, 2015;7(11):1129-31. Published Online: 16 Nov 2015
本發明以提供對癌症有效且實用性的新穎治療手段、及作為該種治療手段有用之新穎物質作為目的。
本案之發明者們使用腫瘤模型小鼠而專心致力鑽研了HMGN的部分肽之抗腫瘤效果的結果，發現包含HMGN1的特定區域之新穎部分肽，係即使是對腫瘤模型小鼠單獨投藥也會顯著地抑制腫瘤的增殖、以及其藉由與免疫檢查點控制劑的併用而可得到加乘的抗腫瘤效果，且進一步發現包含HMGN2、HMGN4、及HMGN5的特定區域之新穎部分肽也與HMGN1部分肽同樣地具 有抗腫瘤效果、以及本案之發明的新穎部分肽與專利文獻2所揭示的部分肽比較係具有明顯高的抗腫瘤效果，而完成了本案之發明。
亦即，本發明提供一種肽，其胺基酸序列係以選自下述(1)~(9)之任一種的胺基酸序列表示。
(1)SSAE GAAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號3)
(2)於(1)中，C末端之胺基酸殘基缺失了1~8個的胺基酸序列
(3)於(1)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列
(4)於(2)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列
(5)EGDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPKPKKAPAKKGE(序列識別號12)
(6)GDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPRPKKASAKKGE(序列識別號14)
(7)GQG DMRQEPKRR SARLSAMLV PVTPEVKPKRTSSSRKMKTKSD(序列識別號15)
(8)於(5)~(7)之任一者中，缺失了C末端之1~5個胺基酸殘基、及/或N末端之1~5個胺基酸殘基的胺基酸序列
(9)於(1)~(8)之任一者中，有1個~3個胺基酸殘基被取代的胺基酸序列
作為(9)之較佳的一例，可舉出
(10)於(1)~(4)之任一者中，有1個~3個胺基酸殘基被取代的胺基酸序列。
又，本發明提供一種抗癌劑，其係以至少1種肽為有效成分的抗癌劑，前述至少1種肽之胺基酸序列係以下述(1)~(9)的任一者表示。
(1)SSAE GAAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號3)
(2)於(1)中，C末端之胺基酸殘基缺失了1~8個的胺基酸序列
(3)於(1)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列
(4)於(2)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列
(5)EGDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPKPKKAPAKKGE(序列識別號12)
(6)GDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPRPKKASAKKGE(序列識別號14)
(7)GQG DMRQEPKRR SARLSAMLV PVTPEVKPKRTSSSRKMKTKSD(序列識別號15)
(8)於(5)~(7)之任一者中，缺失了C末端之1~5個胺基酸殘基、及/或N末端之1~5個胺基酸殘基的胺基酸序列
(9)於(1)~(8)之任一者中，有1個~3個胺基酸殘基被取代的胺基酸序列
作為(9)之較佳的一例，可舉出
(10)於(1)~(4)之任一者中，有1個~3個胺基酸殘基被取代的胺基酸序列。
進而，本發明提供一種抗癌作用增強劑，其係包含至少1種肽之抗癌劑的抗癌作用增強劑，前述至少1種肽之胺基酸序列係以下述(1)~(9)的任一者表示。
(1)SSAE GAAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號3)
(2)於(1)中，C末端之胺基酸殘基缺失了1~8個的胺基酸序列
(3)於(1)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列
(4)於(2)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列
(5)EGDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPKPKKAPAKKGE(序列識別號12)
(6)GDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPRPKKASAKKGE(序列識別號14)
(7)GQG DMRQEPKRR SARLSAMLV PVTPEVKPKRTSSSRKMKTKSD(序列識別號15)
(8)於(5)~(7)之任一者中，缺失了C末端之1~5個胺基酸殘基、及/或N末端之1~5個胺基酸殘基的胺基酸序列
(9)於(1)~(8)之任一者中，有1個~3個胺基酸殘基被取代的胺基酸序列
作為(9)之較佳的一例，可舉出
(10)於(1)~(4)之任一者中，有1個~3個胺基酸殘基被取代的胺基酸序列。
進而，本發明提供一種癌症的治療方法，其係包含將上述本發明之肽的有效量對必須進行癌症的治療之患者投藥。
作為本發明之一實施態樣，可舉出以下者。
[1]一種肽，其胺基酸序列係以選自下述(1)~(9)之任一種的胺基酸序列表示。
(1)SSAE GAAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號3)
(2)於(1)中，C末端之胺基酸殘基缺失了1~8個的胺基酸序列
(3)於(1)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列
(4)於(2)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列
(5)EGDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPKPKKAPAKKGE(序列識別號12)
(6)GDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPRPKKASAKKGE(序列識別號14)
(7)GQG DMRQEPKRR SARLSAMLV PVTPEVKPKRTSSSRKMKTKSD(序列識別號15)
(8)於(5)~(7)之任一者中，缺失了C末端之1~5個胺基酸殘基、及/或N末端之1~5個胺基酸殘基的胺基酸序列
(9)於(1)~(8)之任一者中，有1個~3個胺基酸殘基被取代的胺基酸序列
[2]如前述[1]記載之肽，其中前述(2)係於(1)中，C末端之胺基酸殘基缺失了1~5個的胺基酸序列，前述(3)係於(1)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~9個的胺基酸序列，前述(4)係於(2)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~9個的胺基酸序列。
[3]前述[1]或[2]記載之肽，其中該胺基酸序列係以前述(1)~(7)的任一者表示。
[4]前述[1]或[2]記載之肽，其中該胺基酸序列係以前述(1)~(3)、(5)~(7)的任一者表示。
[5]前述[1]~[3]的任一者所記載之肽，其中前述(2)為SSAE GAAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKK(序列識別號5)，前述(3)為AAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號7)或EPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號8)，前述(4)為EPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKK(序列識別號18)。
[6]前述[1]~[4]的任一者所記載之肽，其中前述(2)為SSAE GAAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKK(序列識別號5)，前述(3)為AAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號7)或EPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號8)。
[7]前述[1]記載之肽，其中該胺基酸序列係以選自序列識別號3、序列識別號5、序列識別號7、序列識別號 8、序列識別號12、序列識別號14、序列識別號15、及序列識別號18之任一胺基酸序列表示。
[8]前述[1]記載之肽，其中該胺基酸序列係以選自序列識別號3、序列識別號5、序列識別號7、序列識別號8、序列識別號12、序列識別號14、及序列識別號15之任一胺基酸序列表示。
[9]前述[1]~[8]的任一者所記載之肽，其係抗癌活性肽。
[10]前述[1]~[8]的任一者所記載之肽，其係抗癌作用增強肽。
[11]一種抗癌劑，其係用於與選自免疫檢查點控制劑、及抗CD4抗體或是其抗原結合性片段之至少1種組合而使用之含有至少1種肽作為有效成分的抗癌劑，前述至少1種肽之胺基酸序列係以下述(1)~(9)的任一者表示。
(1)SSAE GAAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號3)
(2)於(1)中，C末端之胺基酸殘基缺失了1~8個的胺基酸序列
(3)於(1)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列
(4)於(2)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列
(5)EGDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPKPKKAPAKKGE(序列識別號12)
(6)GDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPRPKKASAKKGE(序列識別號14)
(7)GQG DMRQEPKRR SARLSAMLV PVTPEVKPKRTSSSRKMKTKSD(序列識別號15)
(8)於(5)~(7)之任一者中，缺失了C末端之1~5個胺基酸殘基、及/或N末端之1~5個胺基酸殘基的胺基酸序列
(9)於(1)~(8)之任一者中，有1個~3個胺基酸殘基被取代的胺基酸序列
[12]前述[11]記載之抗癌劑，其中前述(2)係於(1)中，C末端之胺基酸殘基缺失了1~5個的胺基酸序列，前述(3)係於(1)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~9個的胺基酸序列，前述(4)係於(2)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~9個的胺基酸序列。
[13]前述[11]或[12]記載之抗癌劑，其中前述至少1種肽之胺基酸序列係以前述(1)~(7)的任一者表示。
[14]前述[11]或[12]記載之抗癌劑，其中前述至少1種肽之胺基酸序列係以前述(1)~(3)、(5)~(7)的任一者表示。
[15]前述[11]~[13]的任一者所記載之抗癌劑，其中前述(2)為SSAE GAAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKK(序列識別號5)，前述(3)為AAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號7)或EPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號8)，前述(4)為EPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKK(序列識別號18)。
[16]前述[11]~[14]的任一者1項所記載之抗癌劑，前述(2)為SSAE GAAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKK(序列識別號5)，前述(3)為AAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號7)或EPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號8)。
[17]前述[11]記載之抗癌劑，其中前述至少1種肽之胺基酸序列係以選自序列識別號3、序列識別號5、序列識別號7、序列識別號8、序列識別號12、序列識別號14、序列識別號15、及序列識別號18之任一胺基酸序列表示。
[18]前述[11]記載之抗癌劑，其中前述至少1種肽之胺基酸序列係以選自序列識別號3、序列識別號5、序列識別號7、序列識別號8、序列識別號12、序列識別號14、及序列識別號15之任一胺基酸序列表示。
[19]前述[11]~[18]的任一者所記載之抗癌劑，其中免疫檢查點控制劑係選自對抑制性的免疫檢查點分子之拮抗劑、及對共同刺激性的免疫檢查點分子之促效劑的至少1種。
[20]前述[19]記載之抗癌劑，其中免疫檢查點控制劑為至少1種的抗免疫檢查點抗體。
[21]前述[20]記載之抗癌劑，其中抗免疫檢查點抗體係選自拮抗性抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、及抗PD-L2抗體的至少1種。
[22]前述[11]~[21]的任一者所記載之抗癌劑，其中抗CD4抗體或是其抗原結合性片段為具有細胞毒殺活性之抗CD4抗體、或結合了細胞毒成分之抗CD4抗體或是其抗原結合性片段。
[23]前述[11]~[22]的任一者所記載之抗癌劑，其中前述癌症為實質癌(Solid carcinoma)。
[24]前述[11]~[18]的任一者所記載之抗癌劑，其中前述肽為抗癌活性肽。
[25]一種抗癌作用增強劑，其係包含至少1種肽之抗癌劑的抗癌作用增強劑，前述抗癌劑係以選自免疫檢查點控制劑、及抗CD4抗體或是其抗原結合性片段之至少1種為有效成分的抗癌劑，前述至少1種肽之胺基酸序列係以下述(1)~(9)的任一者表示。
(1)SSAE GAAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號3)
(2)於(1)中，C末端之胺基酸殘基缺失了1~8個的胺基酸序列
(3)於(1)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列
(4)於(2)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列
(5)EGDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPKPKKAPAKKGE(序列識別號12)
(6)GDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPRPKKASAKKGE(序列識別號14)
(7)GQG DMRQEPKRR SARLSAMLV PVTPEVKPKRTSSSRKMKTKSD(序列識別號15)
(8)於(5)~(7)之任一者中，缺失了C末端之1~5個胺基酸殘基、及/或N末端之1~5個胺基酸殘基的胺基酸序列
(9)於(1)~(8)之任一者中，有1個~3個胺基酸殘基被取代的胺基酸序列
[26]前述[25]記載之抗癌作用增強劑，其中前述肽為抗癌作用增強肽。
[27]前述[1]~[3]的任一者所記載之肽，其中該胺基酸序列係以前述(1)~(4)的任一者表示。
[28]一種抗癌劑，其係含有至少1種肽作為有效成分的抗癌劑，前述至少1種肽之胺基酸序列係以下述(1)~(9)的任一者表示。
(1)SSAE GAAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號3)
(2)於(1)中，C末端之胺基酸殘基缺失了1~8個的胺基酸序列
(3)於(1)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列
(4)於(2)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列
(5)EGDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPKPKKAPAKKGE(序列識別號12)
(6)GDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPRPKKASAKKGE(序列識別號14)
(7)GQG DMRQEPKRR SARLSAMLV PVTPEVKPKRTSSSRKMKTKSD(序列識別號15)
(8)於(5)~(7)之任一者中，缺失了C末端之1~5個胺基酸殘基、及/或N末端之1~5個胺基酸殘基的胺基酸序列
(9)於(1)~(8)之任一者中，有1個~3個胺基酸殘基被取代的胺基酸序列
[29]一種抗癌作用增強劑，其係包含至少1種肽之抗癌劑的抗癌作用增強劑，前述至少1種肽之胺基酸序列係以下述(1)~(9)的任一者表示。
(1)SSAE GAAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號3)
(2)於(1)中，C末端之胺基酸殘基缺失了1~8個的胺基酸序列
(3)於(1)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列
(4)於(2)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列
(5)EGDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPKPKKAPAKKGE(序列識別號12)
(6)GDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPRPKKASAKKGE(序列識別號14)
(7)GQG DMRQEPKRR SARLSAMLV PVTPEVKPKRTSSSRKMKTKSD(序列識別號15)
(8)於(5)~(7)之任一者中，缺失了C末端之1~5個胺基酸殘基、及/或N末端之1~5個胺基酸殘基的胺基酸序列
(9)於(1)~(8)之任一者中，有1個~3個胺基酸殘基被取代的胺基酸序列
[30]一種抗癌劑，其含有前述[1]~[10]、或[27]的任一者所記載之肽作為有效成分。
[31]一種抗癌劑，其含有前述[1]~[10]、或[27]的任一者所記載之肽的胺基酸序列。
[32]一種用於與選自免疫檢查點控制劑、及抗CD4抗體或是其抗原結合性片段之至少1種組合而使用之前述[30]或[31]記載之抗癌劑。
[33]一種抗癌劑的抗癌作用增強劑，其包含前述[1]~[10]、或[27]的任一者所記載之肽。
[34]一種抗癌劑的抗癌作用增強劑，其含有前述[1]~[10]、或[27]的任一者所記載之肽的胺基酸序列。
[35]前述[33]或[34]記載之抗癌作用增強劑，其中抗癌劑係以選自免疫檢查點控制劑、及抗CD4抗體或是其抗原結合性片段之至少1種為有效成分的抗癌劑。
[36]前述[32]記載之抗癌劑或前述[35]所記載之抗癌作用增強劑，其中免疫檢查點控制劑係選自對抑制性的免疫檢查點分子之拮抗劑、及對共同刺激性的免疫檢查點分子之促效劑的至少1種。
[37]前述[36]記載之劑，其中免疫檢查點控制劑為至少1種的抗免疫檢查點抗體。
[38]前述[37]記載之劑，其中抗免疫檢查點抗體係選自拮抗性抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、及抗PD-L2抗體的至少1種。
[39]前述[32]、[35]~[38]的任一者所記載之劑，其中抗CD4抗體或是其抗原結合性片段為具有細胞毒殺活性之抗CD4抗體、或結合了細胞毒成分之抗CD4抗體或是其抗原結合性片段。
[40]前述[30]~[39]的任一者所記載之劑，其中前述癌症為實質癌。
[41]一種醫藥組成物，其含有前述[1]~[10]、或[27]的任一者所記載之肽作為有效成分。
[42]一種醫藥組成物，其含有以前述[1]~[10]、或[27]的任一者所記載之胺基酸序列為活性部分之肽。
[43]一種醫藥組成物，其含有前述[1]~[10]、或[27]的任一者所記載之肽的胺基酸序列。
[44]一種癌症的治療方法，其係包含將前述[1]~[10]、或[27]的任一者所記載之肽的有效量對必須進行癌症的治療之患者投藥。
[45]前述[1]~[10]、或[27]的任一者所記載之肽，其被使用於癌症治療。
[46]一種用於製造抗癌劑之前述[1]~[10]、或[27]的任一者所記載之肽的用途。
藉由本發明而提供分別源自HMGN1、HMGN2、HMGN4、及HMGN5之部分區域的各新穎肽、及使用了該等的新穎癌症療法。包含本發明之肽的抗癌劑係藉由單獨、或與選自免疫檢查點控制劑及清除型抗CD4抗體(depleting anti-CD4 antibody)、結合了細胞毒成分之抗CD4抗體或是其抗原結合性片段之至少1種併用，而會發揮明顯優異的抗腫瘤效果。其效果係如下述實施例中所示，確認到有複數例之腫瘤的完全消退(regression)例出現之程度的抗腫瘤效果。本發明之新穎肽所具有的抗腫瘤效果亦可解釋為增強抗癌作用的效果。亦可解釋為增強例如免疫檢查點控制劑或清除型抗CD4抗體等之抗癌劑之抗癌作用的效果。本發明之肽由於為數十殘基長左右，而能以化學合成來輕易地調製。化學合成的情形，係與基因重組不同，因無源自宿主細胞之成分的混入，而具有作為醫藥品之優勢。由下述實施例的結果，暗示本發明之肽的血中半衰期與原來的全長HMGN蛋白質為相同程度，而亦可舉出此點為本發明之優勢點。
圖1-1為將小鼠全長HMGN1蛋白質(mHMGN1)、及其部分肽2種(mPep1、mPep2)單獨、或與抗PD-L1抗體(200μg/小鼠)併用而進行了投藥之Colon26腫瘤小鼠各組之每隻小鼠個體的腫瘤體積的歷時變化。HMGN1蛋白質及部分肽係以圖中所示用量進行了投藥。
圖1-2為將小鼠全長HMGN1蛋白質(mHMGN1)、及其部分肽2種(mPep1、mPep2)單獨、或與抗PD-L1抗體(200μg/小鼠)併用而進行了投藥之Colon26腫瘤小鼠各組之每隻小鼠個體的腫瘤體積的歷時變化。HMGN1蛋白質及部分肽係以圖中所示用量進行了投藥。
圖2為將小鼠全長HMGN1蛋白質、及其部分肽2種(mPep1、mPep2)單獨、或與抗PD-L1抗體(200μg/小鼠)併用而進行了投藥之Colon26腫瘤小鼠各組之腫瘤細胞移植24天後的腫瘤體積的測量結果。HMGN1蛋白質及部分肽係以圖中所示用量進行了投藥。相對於控制組之顯著差異為*：p<0.05、**：p<0.01(Dunnett)。
圖3為將人類HMGN1之部分肽(Pep1)單獨、或與抗PD-L1抗體(200μg/小鼠)併用而進行了投藥之Colon26腫瘤小鼠各組之腫瘤細胞移植24天後的腫瘤體積的測量結果。Pep1係以圖中所示用量進行了投藥。相對於控制組之顯著差異為*：p<0.05、**：p<0.01(Dunnett)。
圖4-1為Pep1單獨投藥組及Pep1+抗PD-L1抗體併用組之每隻小鼠個體的腫瘤體積的歷時變化。Pep1係以圖中所示用量(ng/小鼠)進行了投藥。抗PD-L1抗體係以200μg/小鼠進行了投藥。
圖4-2為Pep1單獨投藥組及Pep1+抗PD-L1抗體併用組之每隻小鼠個體的腫瘤體積的歷時變化。Pep1係以圖中所示用量(ng/小鼠)進行了投藥。抗PD-L1抗體係以200μg/小鼠進行了投藥。
圖5-1為將Pep1的各種末端缺失體及R→D取代體分別與抗PD-L1抗體(200μg/小鼠)併用而進行了投藥之Colon26腫瘤小鼠各組之每隻小鼠個體的腫瘤體積的歷時變化。各肽係以圖中所示用量(ng/小鼠)進行了投藥。
圖5-2為將Pep1的各種末端缺失體及R→D取代體分別與抗PD-L1抗體(200μg/小鼠)併用而進行了投藥之Colon26腫瘤小鼠各組之每隻小鼠個體的腫瘤體積的歷時變化。各肽係以圖中所示用量(ng/小鼠)進行了投藥。
圖6為將Pep1的各種末端缺失體及R→D取代體分別與抗PD-L1抗體(200μg/小鼠)併用而進行了投藥之Colon26腫瘤小鼠各組之腫瘤細胞移植26天後的腫瘤體積的測量結果。各肽係以圖中所示用量進行了投藥。相對於抗PD-L1抗體單獨投藥組之顯著差異為**：p<0.01(Dunnett)。
圖7-1為將Pep1core與抗PD-L1抗體(200μg/小鼠)併用而進行了投藥之Colon26腫瘤小鼠各組之每隻小鼠個體的腫瘤體積的歷時變化。為了比較，也一併呈示Pep1+抗PD-L1抗體併用組、Pep1△C1+抗PD-L1抗體併用組及Pep1△N2+抗PD-L1抗體併用組之腫瘤體積的歷時變化。各肽係以圖中所示用量(ng/小鼠)進行了投藥。
圖7-2為將Pep1core與抗PD-L1抗體(200μg/小鼠)併用而進行了投藥之Colon26腫瘤小鼠各組之每隻小鼠個體的腫瘤體積的歷時變化。為了比較，也一併呈示Pep1+抗PD-L1抗體併用組、Pep1△C1+抗PD-L1抗體併用組及Pep1△N2+抗PD-L1抗體併用組之腫瘤體積的歷時變化。各肽係以圖中所示用量(ng/小鼠)進行了投藥。
圖8為將Pep1、Pep1△C1、Pep1△N2及Pep1core分別與抗PD-L1抗體(200μg/小鼠)併用而進行了投藥之Colon26腫瘤小鼠各組之腫瘤細胞移植27天後的腫瘤體積的測量結果。各肽係以圖中所示用量進行了投藥。相對於抗PD-L1抗體單獨投藥組之顯著差異為*：p<0.05、**：p<0.01(Dunnett)。
圖9為分別將Pep1(300ng/小鼠)及PepO(318ng、954ng/小鼠)與抗PD-L1抗體(200μg/小鼠)併用而對Colon26腫瘤小鼠進行投藥，且歷時性地測量了腫瘤體積的結果。
圖10為Pep1+抗PD-L1抗體併用組、PepO+抗PD-L1抗體併用組之腫瘤細胞移植24天後的腫瘤體積的測量結果。各肽係以圖中所示用量進行了投藥。抗PD-L1抗體係以200μg/小鼠進行了投藥。相對於抗PD-1抗體單獨投藥組之顯著差異為**：p<0.01(Dunnett)。
圖11為調查了HMGN2、HMGN3、HMGN4、HMGN5之部分肽的抗腫瘤效果的結果。將各部分肽與抗PD-L1抗體併用而對Colon26腫瘤小鼠進行投藥，且將在腫瘤移植24天後所測量的腫瘤體積，在抗PD-L1抗體單獨投藥組與各併用投藥組之間進行了比較。相對於抗PD-L1抗體單獨投藥組之顯著差異為**：p<0.01(Dunnett)。
圖12為將Pep1(800ng/小鼠)與抗CD4抗體(200μg/小鼠)併用而對Colon26腫瘤小鼠進行投藥，且歷時性地測量了腫瘤體積的結果。以圖表呈示了各組之每隻小鼠個體的腫瘤體積的歷時變化。
圖13為Pep1單獨投藥組、抗CD4抗體單獨投藥組、Pep1+抗CD4抗體併用組之腫瘤細胞移植24天後的腫瘤體積的測量結果。**為於兩組間有顯著差異，p<0.01(Dunnett)。
用以實施發明之形態
本發明之肽為其胺基酸序列以選自下述(1)~(9)之任一種的胺基酸表示的肽。(10)為(9)之較佳的一例。
(1)SSAE GAAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號3)
(2)於(1)中，C末端之胺基酸殘基缺失了1~8個的胺基酸序列
(3)於(1)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列
(4)於(2)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列
(5)EGDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPKPKKAPAKKGE(序列識別號12)
(6)GDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPRPKKASAKKGE(序列識別號14)
(7)GQG DMRQEPKRR SARLSAMLV PVTPEVKPKRTSSSRKMKTKSD(序列識別號15)
(8)於(5)~(7)之任一者中，缺失了C末端之1~5個胺基酸殘基、及/或N末端之1~5個胺基酸殘基的胺基酸序列
(9)於(1)~(8)之任一者中，有1個~3個胺基酸殘基被取代的胺基酸序列
(10)於(1)~(4)之任一者中，有1個~3個胺基酸殘基被取代的胺基酸序列
本發明之肽可為例如：抗癌活性肽、或抗癌作用增強肽。所謂抗癌活性肽，係指具有抗癌活性的肽。所謂抗癌作用增強肽，係指具有會增強抗癌劑之抗癌作用之活性的肽。抗癌活性肽所具有的抗癌活性中，於以該肽單獨抑制腫瘤的增殖或轉移、復發之活性以外，係包含與其他的抗癌活性成分組合而使用之時相加至加乘地抑制腫瘤的增殖或轉移、復發之活性。後者之活性、尤其是加乘地抑制腫瘤的增殖等之活性，亦可理解為抗癌作用增強活性。
於本發明中，保留型之胺基酸取代意指具有類似的支鏈之殘基的可交換性，例如，於具有脂肪族支鏈之胺基酸之群中為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸，於具有脂肪族羥基支鏈之胺基酸之群中為絲胺酸及蘇胺酸，於具有含醯胺支鏈之胺基酸之群中為天冬醯胺酸及麩醯胺酸，於具有芳香族支鏈之胺基酸之群中為苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸，於具有鹼性支鏈之胺基酸之群中為離胺酸、精胺酸及組胺酸，於具有含硫支鏈之胺基酸之群中為半胱胺酸及甲硫胺酸。就較佳的保留型之胺基酸取代之例而言，可舉出在纈胺酸、白胺酸及異白胺酸間的取代、在苯丙胺酸及酪胺酸間的取代、在離胺酸及精胺酸間的取代、在丙胺酸及纈胺酸間的取代以及在天冬醯胺酸及麩醯胺酸間的取代。
於本發明中，就缺失了C末端或N末端之胺基酸殘基的胺基酸序列之一態樣而言，可舉出自C末端或N末端起連續地缺失了胺基酸殘基的胺基酸序列。
<源自HMGN1蛋白質之部分區域的肽>
於一實施形態中，本發明之肽為源自HMGN1蛋白質之部分區域的(1)之胺基酸序列(序列識別號3)的肽。序列識別號3的胺基酸序列為人類HMGN1蛋白質(GenBank Accession No.NP_004956，序列識別號17)的第7位~第43位殘基之區域的胺基酸序列。NMGN1等之HMGN蛋白質係以核小體結合域(Nucleosomal Binding Domain；NBD)、夾著NBD的2個核定位訊號(Nuclear Localization Signal)、及C末端域的染色質未摺疊域(Chromatin Unfolding Domain)所構成之蛋白質，人類HMGN1中，第14位~第42位胺基酸之區域為NBD(Ueda et al.,MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY,May 2008,p.2872-2883)。序列識別號3係包含此NBD的HMGN1之部分區域的序列，於序列識別號3中，第8位~第36位胺基酸之區域為NBD。
又，於一實施形態中，本發明之肽為mPep1(序列識別號1)。
於一實施形態中，本發明之肽為源自HMGN1蛋白質之部分區域的(2)之胺基酸序列的肽。(2)為序列識別號3所示胺基酸序列的C末端之胺基酸殘基缺失了1~8個，例如1~7個、1~6個、1~5個、1~4個、 1~3個、1~2個、或8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個、或是1個的胺基酸序列。作為(2)之胺基酸序列的具體例，可舉出序列識別號5所示胺基酸序列，但本發明之範圍不受限於此具體例。
於一實施形態中，本發明之肽為源自HMGN1蛋白質之部分區域的(3)之胺基酸序列的肽。(3)為序列識別號3所示胺基酸序列的N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個，例如1~12個、1~11個、1~10個、1~9個、1~8個、1~7個、1~6個、1~5個、1~4個、1~3個、1~2個、或13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個、或是1個的胺基酸序列。作為(3)之胺基酸序列的具體例，可舉出序列識別號7及序列識別號8所示胺基酸序列，但本發明之範圍不受限於此等之具體例。
於一實施形態中，本發明之肽為源自HMGN1蛋白質之部分區域的(4)之胺基酸序列的肽。(4)為於序列識別號3所示胺基酸序列中，C末端之胺基酸殘基缺失1~8個，例如1~7個、1~6個、1~5個、1~4個、1~3個、1~2個、或8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個、或是1個，且N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個，例如1~12個、1~11個、1~10個、1~9個、1~8個、1~7個、1~6個、1~5個、1~4個、1~3個、1~2個、或13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個、或是1個的胺基酸序列。作為(4)之胺基酸序列的具體例，可舉出序列識別號18所示胺基酸序列，但本發明之範圍不受限於此具體例。
於一實施形態中，本發明之肽為源自HMGN1蛋白質之部分區域的(10)之胺基酸序列的肽。(10)之胺基酸序列為在(9)之中源自HMGN1蛋白質之部分區域的胺基酸序列，係於(1)~(4)之任一者中，有1個~3個，例如1或是2個、或1個胺基酸殘基被取代的胺基酸序列。作為該種胺基酸序列的具體例，可舉出序列識別號11所示胺基酸序列(序列識別號3的N末端缺失1殘基，且將3個R殘基以D殘基取代之序列)，但不受限於此。作為該取代之一態樣，可舉出保留型之胺基酸取代。
於一實施形態中，本發明之肽為序列識別號3、序列識別號5、序列識別號7、序列識別號8、序列識別號11或序列識別號18。或為序列識別號3、序列識別號5、序列識別號7、序列識別號8、或序列識別號18。
<源自包含HMGN2、HMGN4、及HMGN5之NBD之部分區域的肽>
於一實施形態中，本發明之肽為源自包含HMGN2、HMGN4、或HMGN5之NBD之部分區域的(5)之胺基酸序列(序列識別號12)、(6)之胺基酸序列(序列識別號14)、或(7)之胺基酸序列(序列識別號15)的肽。序列識別號12、14、及15分別為包含人類HMGN2、人類HMGN4、及人類HMGN5之NBD之部分區域的胺基酸序列，係人類HMGN1中之對應序列識別號3之區域的各HMGN蛋白質中之區域。在序列識別號12係第12位~第41位胺 基酸，在序列識別號14係第11位~第40位胺基酸，在序列識別號15係第6位~第35位胺基酸之區域對應各個NBD。
於一實施形態中，本發明之肽為源自包含HMGN2、HMGN4、或HMGN5之NBD的部分區域的(8)之胺基酸序列的肽。(8)為於序列識別號12、序列識別號14、及序列識別號15之任一胺基酸序列中，缺失了C末端之1~5殘基、N末端之1~5殘基、或C末端之1~5殘基與N末端之1~5殘基的胺基酸序列。
於一實施形態中，本發明之肽為(9)之胺基酸序列的肽。(9)為於(1)~(8)之任一者中，有1個~3個，例如1或是2個、或1個胺基酸殘基被取代的胺基酸序列。作為該種胺基酸序列的具體例，可舉出序列識別號11所示胺基酸序列(序列識別號3的N末端缺失1殘基，且將3個R殘基以D殘基取代之序列)，但不受限於此。作為該取代之一態樣，可舉出保留型之胺基酸取代。(9)之胺基酸序列的肽之中，於(5)~(8)之任一者中，有1個~3個，例如1或是2個、或1個胺基酸殘基被取代的胺基酸序列的肽係符合源自包含HMGN2、HMGN4、及HMGN5之NBD之部分區域的肽。
本發明之肽的胺基酸序列可為上述之中之(1)~(7)的任一者、或(1)~(3)及(5)~(7)的任一者。進而本發明之肽的胺基酸序列可為上述之中之(1)~(4)及(10)的任一者、或(1)~(4)的任一者。例如，本發明之肽的胺基酸序列可為選自序列識別號3、序列識別號5、序列識別 號7、序列識別號8、序列識別號11、序列識別號12、序列識別號14、序列識別號15、及序列識別號18之任一胺基酸序列。又，本發明之肽的胺基酸序列可為於選自序列識別號3、序列識別號5、序列識別號7、序列識別號8、序列識別號12、序列識別號14、序列識別號15、及序列識別號18之任一胺基酸序列中，有1個~3個，例如1或是2個、或1個胺基酸殘基被取代的(較佳為經保留型胺基酸所取代的)胺基酸序列。
本發明之抗癌劑為本發明之肽的應用例之較佳的一例，係含有其胺基酸序列以上述(1)~(9)的任一者表示的肽作為有效成分。(10)係如上所述，為(9)之較佳的一例。
以(1)之胺基酸序列(序列識別號3)表示的肽係如下述實施例所記載，即使單獨也會發揮抗腫瘤效果，但藉由與抗PD-L1抗體等之免疫檢查點控制劑或抗CD4抗體的併用而加乘地作用，而發揮更為優異的抗腫瘤效果。所以，以序列識別號3之胺基酸序列表示的肽係有用於作為抗癌劑的有效成分。
包含序列識別號3所示胺基酸序列的肽係如下述實施例所示，在將其C末端去除了9殘基(NBD之中之C末端8殘基)以上的情形，會失去與免疫檢查點控制劑之併用所致加乘的抗癌作用，但若為5殘基(NBD之中之C末端4殘基)左右的去除，則維持抗癌作用。所以，(2)之胺基酸序列的肽亦與以序列識別號3所示胺基酸序列表示的肽同樣地，可作為抗癌劑的有效成分而利用。
包含序列識別號3所示胺基酸序列的肽係如下述實施例所示，在將其N末端去除了14殘基以上的情形，會失去與免疫檢查點控制劑之併用所致加乘的抗癌作用，但若為8殘基左右的去除，則維持抗癌作用。所以，(3)之胺基酸序列的肽亦與以序列識別號3所示胺基酸序列表示的肽同樣地，可作為抗癌劑的有效成分而利用。
又，由下述實施例之末端缺失體的實驗結果，可理解序列識別號3之中之至少第14位~第29位殘基之區域，例如第10位~第32位殘基之區域(序列識別號18)為對HMGN1蛋白質片段之抗癌作用重要的最小區域。(4)之胺基酸序列包含上述最小區域。所以，以(4)之胺基酸序列表示的肽亦與以序列識別號3所示胺基酸序列表示的肽同樣地，可作為抗癌劑的有效成分而利用。包含序列識別號18所示最小區域的肽具有抗癌作用一事，於下述實施例中亦被具體確認。
(5)之胺基酸序列(序列識別號12)、(6)之胺基酸序列(序列識別號14)、(7)之胺基酸序列(序列識別號15)具有抗癌活性一事，係如下述實施例所示。以此等之胺基酸序列表示的肽亦可作為抗癌劑的有效成分而利用。
(8)係如上所述，為於序列識別號12、序列識別號14、及序列識別號15的任一者之胺基酸序列中，缺失了C末端之1~5殘基、N末端之1~5殘基、或C末端之1~5殘基與N末端之1~5殘基的胺基酸序列。由使 用了序列識別號3所示人類HMGN1肽之末端缺失體的實驗結果，認為該種胺基酸序列的肽亦可與原來的肽同樣地發揮抗腫瘤效果，故有用於作為抗癌劑的有效成分。
序列識別號11所示胺基酸序列係如上所述，為(9)之胺基酸序列的具體例之一。以序列識別號11所示胺基酸序列表示的肽具有抗腫瘤效果一事，係如下述實施例中所示。
就可使用作為抗癌劑之有效成分的肽之胺基酸序列而言，較佳為上述之中之(1)~(7)的任一者、或(1)~(4)及(10)的任一者，作為特佳之例，可舉出選自序列識別號3、序列識別號5、序列識別號7、序列識別號8、序列識別號11、序列識別號12、序列識別號14、序列識別號15、及序列識別號18之任一胺基酸序列，但不受限於此等。
本發明之抗癌劑亦可與選自免疫檢查點控制劑、及抗CD4抗體或是其抗原結合性片段之至少1種的抗癌活性成分組合而使用。本發明之抗癌劑係藉由與該種抗癌活性成分組合而使用，而加乘地發揮抗腫瘤效果。以下，於本說明書中，為了方便說明，有時會將作為本發明之抗癌劑的有效成分使用之至少1種肽稱為「有效成分(a)」，將選自免疫檢查點控制劑及抗CD4抗體或是其抗原結合性片段之至少1種稱為「有效成分(b)」。
所謂「組合而使用」之用語，包含將複數的有效成分分別作為不同之劑使用之態樣、及作為於同 一製劑中含有複數的有效成分之配合劑來使用之態樣的二者。本發明之抗癌劑就典型而言，係採用前者之態樣之劑，有效成分(b)係一般使用與本發明之抗癌劑作為不同之劑而調製者。使用複數種類之有效成分(b)的情形亦相同，亦可使用於同一製劑中含有複數的有效成分(b)之劑，但一般來說，較佳為將複數的有效成分(b)分別作為不同之劑而組合。在作為不同之劑而組合各有效成分的情形，有可將各有效成分之投藥部位、投藥時期、投藥次數、投藥量等個別地進行最適化之優點。在使用複數種類之抗癌活性肽的情形，可使用於同一製劑中含有複數之抗癌活性肽之劑，亦可使用將複數之抗癌活性肽分別作為不同之劑而調製者，可較佳使用任一者。
所謂「組合而進行投藥」之用語，意指將複數之有效成分對患者同時地、依序地、或分別地投藥。所謂依序地投藥，係指1個有效成分的投藥結束了以後立刻繼續進行下一個有效成分的投藥。所謂分別地投藥，係指將複數之有效成分拉開間隔進行投藥，例如於同日中拉開數小時左右以上的間隔，或是於1療程的治療期間中的別天進行投藥。同時地投藥的情形，可將作為不同之劑而製劑之有效成分同時地投藥，亦可將於同一製劑中含有複數之成分之劑進行投藥。
所謂1療程，係如癌症療法之領域中的一般意思，指將投藥期間與停藥期間合起來的小單位之期間。單劑療法、多劑併用量之任一的情形中，一般都以1週或者數週左右投藥抗癌劑的投藥期間、與1週左右 的停藥期間為1療程，因應患者的狀態或癌症的縮小效果等而實施由醫師所決定之次數的療程(通常數療程)。
於本發明中，所謂「癌症的治療」之用語中包含以治療患者的癌症之目的所進行的各種醫療處置。具體而言，於原發癌、復發癌及轉移癌的治療之外，也包含癌症之復發及轉移的抑制。例如，對於藉由外科手術而切除了癌症病灶之後的患者，以防止復發之目的來投藥本發明之抗癌劑的態樣亦包含在「癌症的治療」中。因此，所謂「抗癌劑」之用語中，包含癌症(原發癌、復發癌、轉移癌)之治療劑、癌症的復發抑制劑、及癌症的轉移抑制劑。所謂「癌症患者」之用語中，於現已罹癌之患者之外，亦包含藉由外科手術而切除了癌症病灶之後的患者。
本發明之抗癌劑作為對象之癌症的種類並不被特別限定，可適用於包含實質癌(惡性黑色素瘤(例如，於皮膚、口腔黏膜上皮或眼窩內等之惡性黑色素瘤)、非小細胞肺癌(例如，扁平非小細胞肺癌及非扁平非小細胞肺癌)、小細胞肺癌、頭頸癌、腎細胞癌、腎臟透明細胞癌、乳癌、卵巢癌、漿液性卵巢癌、卵巢透明細胞腺癌、鼻咽癌、子宮癌(例如，子宮頸癌、子宮內膜癌及子宮體癌)、肛門癌(例如，肛管癌)、大腸癌、直腸癌、結腸癌、肝細胞癌、食道癌、食道腺癌、胃癌、食道胃接合部癌、小腸癌、胰臟癌、泌尿上皮癌(例如，膀胱癌、上泌尿道癌、輸尿管癌、腎盂癌及尿道癌)、前列腺癌、輸卵管癌、原發性腹膜癌、胸膜間皮瘤、膽囊癌、 膽管癌、膽道癌、皮膚癌(例如，葡萄膜惡性黑色素瘤及默克細胞癌)、睾丸癌(生殖細胞腫瘤)、陰道癌、陰門癌、陰莖癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、脊髓腫瘤、腦腫瘤、神經膠母細胞瘤、神經膠肉瘤、鱗狀上皮細胞癌、骨．軟組織肉瘤(例如，尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、兒童橫紋肌肉瘤及子宮平滑肌肉瘤)及卡波西氏肉瘤)及血液惡性腫瘤(惡性淋巴瘤、白血病、多發性骨髓瘤)的各種癌症。例如，本發明之抗癌劑可較佳使用於實質癌。作為實質癌之典型的具體例，可舉出肺癌、乳癌、胃癌、肝癌、大腸癌、舌癌、甲狀腺癌、腎臟癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌等上皮性實質癌、或黑色素瘤及神經膠瘤等不被分類為上皮性實質癌之其他實質癌。於1個態樣中，本發明作為對象之癌症可為皮膚癌以外的癌症。
在肽製劑的領域，以使肽在生體內的安定性提升，且提高血中半衰期等目的，而使用附加聚乙二醇(PEG)鏈(Clin Nephrol.2006 Mar；65(3)：180-90.或Proc Natl Acad Sci USA.2005 Sep 6；102(36)：12962-7.等)、主要主對N末端或C末端附加糖鏈(J Am Chem Soc.2004 Nov 3；126(43)：14013-22或Angew Chem Int Ed Engl.2004 Mar 12；43(12)：1516-20等)、使胺基酸殘基的至少一部份為D型(J Pharmacol Exp Ther.2004 Jun；309(3)：1190-7或J Pharmacol Exp Ther.2004 Jun；309(3)：1183-9.等)、適當變更抗體的Fc區域而進行附加(例如，J.Immunol.,154(10),5590-5600(1995)、 Nature,332,563-564(1998)、Nature,332,738-740(1998)、BioDrugs.2008；22：11-26等)等技術。本發明之肽，尤其是作為抗癌劑的有效成分使用的肽，亦可為應用了該種技術者。
如使用序列識別號3作為例子進行說明，則「其胺基酸序列以序列識別號3表示的肽」亦可為對於胺基酸殘基序列以編號3所示順序排列且包含37個胺基酸殘基的肽，附加了如Fc區域之其他的機能性多肽的形態。只要不失去肽的抗癌活性或者抗癌作用增強活性，則可附加任何機能性多肽。對序列識別號3之胺基酸序列附加了其他的機能性多肽之胺基酸序列的融合多肽中，係包含著包含序列識別號3之胺基酸序列的肽部分。所以，即使抗癌劑或抗癌作用增強劑含有該種融合多肽的情形，由於會發揮抗癌活性乃至抗癌作用增強活性的該多肽部分被包含在其中，而被包含在「含有以序列識別號3表示的肽作為有效成分之抗癌劑」、「含有以序列識別號3表示的肽作為有效成分之抗癌作用增強劑」、「含有以序列識別號3表示的肽之胺基酸序列之抗癌劑或抗癌作用增強劑」中。同樣地，「含有以序列識別號3表示的肽作為有效成分之醫藥組成物」或「含有以序列識別號3表示之胺基酸序列作為活性部分的肽之醫藥組成物」、「含有以序列識別號3表示的肽之胺基酸序列之醫藥組成物」中，包含含有如上述之融合多肽之醫藥組成物。
本發明之肽可藉由化學合成而輕易地調製。就化學合成法之具體例而言，可舉出例如Fmoc法(茀基甲氧羰基法)、tBoc法(三級丁氧羰基法)等。又，亦可利用各種市售的肽合成儀而藉由常規方法來合成。
為附加了其他的機能性多肽的融合多肽之形態之本發明的肽，由於多肽整體的尺寸大，而作為調製方法通常較佳採用基因重組法。藉由基因重組法之多肽的調製為周知的常規方法。若簡潔地記載，則為調製編碼本發明之肽之多核苷酸與編碼機能性多肽之多核苷酸，於將此等依序(無關順序)併入適當的表現載體之後導入適當的宿主細胞，在該宿主細胞內使融合多肽自表現載體表現，且自宿主細胞回收、精製該融合多肽即可。
有效成分(b)之中，所謂免疫檢查點控制劑，係指控制免疫檢查點分子的機能以促進免疫細胞的活性化之物質，包含對於抑制性的免疫檢查點分子阻礙地進行工作之物質、與對於共同刺激性的免疫檢查點分子促進地進行工作之物質。作為免疫檢查點控制劑之一態樣，可舉出免疫檢查點抑制劑。所謂「免疫檢查點分子」之用語中，包含作為免疫檢查點而作用之受體與配體的二者。
所謂免疫檢查點，係指免疫系用以不攻擊自己的身體的免疫逃脫(immune escape)機制。於T細胞上存在免疫檢查點受體，與於癌細胞或抗原呈現細胞上表現的配體互相作用。T細胞係辨識呈現於MHC分子上的抗原而活性化，引發免疫反應，但藉由同時發生的免 疫檢查點受體-配體的相互作用，而T細胞的活性化會受到調節。免疫檢查點受體中有共同刺激性之物與抑制性之物，藉由二者平衡而T細胞的活性化及免疫反應受到調節。
癌細胞係表現對於抑制性的免疫檢查點受體之配體，且利用該受體而逃脫因細胞傷害性T細胞所致破壞。所以，可投藥對抑制性的受體之拮抗劑以妨礙癌細胞之免疫檢查點機制的利用，且促進藉由CD8+T細胞之癌細胞的殺傷。近年作為抗癌劑而實用化正一面進展中之所謂的免疫檢查點抑制劑，係指以抑制性的免疫檢查點受體或其配體作為標的之抗體。以黑色素瘤、肺癌、白血病、胃癌、淋巴瘤、腎臟癌等為對象，抗CTLA-4抗體或抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體等的開發正進展中。
又，也能夠投藥對共同刺激性的免疫檢查點受體之促效劑以促進免疫反應，藉此而促進藉由CD8+T細胞之癌細胞的殺傷。
於本發明中，所謂「拮抗劑」之用語中，包含會妨礙藉由受體與配體之結合的受體之活性化的各種物質。可舉出例如，與受體結合而妨礙受體-配體間之結合的物質、及與配體結合而妨礙受體-配體間之結合的物質。
例如，「對抑制性的免疫檢查點分子之拮抗劑」係可為會與抑制性的免疫檢查點分子(抑制性的受體或該受體之配體)結合之拮抗性抗體、基於抑制性的免疫檢查點配體所設計之不會活性化受體的可溶性的多肽、 或能夠表現該多肽的載體等。作為成為對象之抑制性的免疫檢查點分子，就受體而言，可舉出PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、BTLA等，就配體而言，可舉出PD-L1(PD-1之配體)、PD-L2(PD-1之配體)、GAL9(TIM-3之配體)、HVEM(BTLA之配體)等。抗體的製造方法、藉由化學合成或基因工學手法之多肽的製造方法，係此領域中周知的常規方法，若為所屬技術領域中具有通常知識者，則可藉由常規方法來調製如上述之對抑制性的免疫檢查點分子之拮抗劑。
「對共同刺激性的免疫檢查點分子之促效劑」可為與共同刺激性的免疫檢查點受體結合之具有促效活性的抗體、基於共同刺激性的免疫檢查點配體所設計之具有活性化受體之作用的可溶性的多肽、或能夠表現該多肽的載體等。作為成為對象之共同刺激性的免疫檢查點分子，就受體而言，可舉出CD137、OX40、GITR等，就配體而言，可舉出CD137L(CD137之配體)、OX40L(OX40之配體)、TNFSF18(GITR之配體)等。
免疫檢查點控制劑可為對免疫檢查點分子之抗體(於本說明書中稱該抗體為「抗免疫檢查點抗體」)。如舉出抗免疫檢查點抗體的具體例，則就拮抗劑抗體而言，可舉出與受體結合而該阻礙配體對受體之結合的抗PD-1抗體、抗CTLA-4抗體、抗LAG-3抗體、抗TIM-3抗體、抗BTLA抗體等，就促效劑抗體而言，可舉出與受體結合而具有使下游的訊號路徑動作之活性的抗CD137抗體、抗OX40抗體及抗GITR抗體等。作 為更進一步之具體例，可舉出與對抑制性的免疫檢查點受體之配體結合而阻礙該配體對受體的結合之抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗GAL9抗體、及抗HVEM抗體等。
若將免疫檢查點控制劑的具體例與公知之醫藥品等公知例一起例示，則可舉出例如，抗CTLA-4抗體(例如，伊匹單抗(Ipilimumab)(YERVOY(註冊商標)、曲美單抗(Tremelimumab)、AGEN-1884)、抗PD-1抗體(例如，納武(Nivolumab)、西美匹單抗(Cemiplimab)(REGN-2810)、帕博利珠單抗(Pembrolizumab)(MK-3475)、斯帕它單抗(Spartalizumab)(PDR-001)、替雷利珠單抗(Tislelizumab)(BGB-A317)、AMP-514(MEDI0680)、多塔利單抗(Dostarlimab)(ANB011、TSR-042)、特瑞普利單抗(Toripalimab)(JS001)、卡瑞利珠單抗(Camrelizumab)(SHR-1210)、杰諾單抗(Genolimzumab)(CBT-501)、信迪利單抗(Sintilimab)(IBI308)、STI-A1110、ENUM 388D4、ENUM 244C8、GLS010、MGA012、AGEN2034、CS1003、HLX10、BAT-1306、AK105、AK103、BI 754091、LZM009、CMAB819、Sym021、GB226、SSI-361、JY034、HX008、ABBV181、BCD-100、PF-06801591、CX-188及JNJ-63723283等)、抗PD-L1抗體(例如，阿特珠單抗(Atezolizumab)(RG7446、MPDL3280A)、阿維魯單抗(Avelumab)(PF-06834635、MSB0010718C)、得瓦魯單抗(Durvalumab)(MEDI4736)、BMS-936559、STI-1010、 STI-1011、STI-1014、KN035、LY3300054、HLX20、SHR-1316、CS1001(WBP3155)、MSB2311、BGB-A333、KL-A167、CK-301、AK106、AK104、ZKAB001、FAZ053、CBT-502(TQB2450)、JS003及CX-072等)、抗PD-L2抗體(例如，rHIgM12B7)、PD-L1融合蛋白質、PD-L2融合蛋白質(例如，AMP-224)、抗Tim-3抗體(例如，MBG453)、抗LAG-3抗體(例如，BMS-986016、LAG525)、抗KIR抗體(例如，利麗單抗(Lirilumab))、PD-1拮抗劑(例如，AUNP-12、BMS-M1~BMS-M10之各化合物、BMS-1、BMS-2、BMS-3、BMS-8、BMS-37、BMS-200、BMS-202、BMS-230、BMS-242、BMS-1001、BMS-1166、Incyte-1~Incyte-6之各化合物、CAMC-1~CAMC-4、RG_1及DPPA-1等)、PD-L1/VISTA拮抗劑(例如，CA-170等)、PD-L1/TIM3拮抗劑(例如，CA-327等)等。又，包含上述已知的抗體之重鏈及輕鏈互補決定區(CDRs)或可變區(VR)的抗體亦為免疫檢查點控制劑之一態樣。例如，就抗PD-1抗體之更進一步之一態樣而言，可舉出包含納武單抗之重鏈及輕鏈互補決定區(CDRs)或可變區(VR)的抗體。
就免疫檢查點控制劑之較佳的具體例而言，可舉出選自拮抗性抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、拮抗性抗CTLA-4抗體、促效性抗CD137抗體、拮抗性抗LAG-3抗體、拮抗性抗BTLA抗體、及促效性抗GITR抗體的至少1種，尤其是選自拮抗性抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、及抗PD-L2抗體的至少1 種。就有效成分(b)的尤佳之例而言，可舉出選自具有細胞毒殺活性之抗CD4抗體、拮抗性抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、及抗PD-L2抗體的至少1種。當然本發明之範圍不受此等之具體例所限定。
有效成分(b)之中，就抗CD4抗體或其抗原結合性片段而言，通常使用具有清除CD4陽性細胞之作用的抗體或其抗原結合性片段。作為第一例，可舉出具有細胞毒殺活性的抗CD4抗體。作為第二例，可舉出結合了細胞毒成分之抗CD4抗體或其抗原結合性片段。
抗體所具有的細胞毒殺活性中有抗體依賴性細胞毒殺活性(ADCC活性)與補體依賴性細胞毒殺活性(CDC活性)。清除型抗CD4抗體可為具有ADCC活性與CDC活性的任一者之物，但使用對CD4+細胞可發揮充分高的殺傷能力之具有高細胞毒殺活性者。該種具有高細胞毒殺活性之抗CD4抗體已知對各式各樣的癌症有抗癌作用(例如，WO 2015/125652 A1)。清除型抗CD4抗體係藉由攸關免疫抑制之CD4+細胞的去除而解除實質癌中的免疫不全環境，促進藉由CD8+ CTL(T細胞)之癌細胞的破壞，藉此而發揮治療效果。對於血液惡性腫瘤而言，由於癌細胞本身為CD4陽性，因此直接傷害癌細胞以發揮治療效果。
所謂「高細胞毒殺活性」，在ADCC活性的情形，係指使用公知的測定方法測定了對CD4表現細胞的ADCC活性之時，具有比已知具有ADCC活性之公知的抗CD4抗體6G5(札木單抗(zanolimumab))或CE9.1(克 立昔單抗(keliximab))還高的ADCC活性。又，在CDC活性的情形，係指使用公知的測定方法，以使用了同一補體的實驗系測定了對CD4表現細胞的CDC活性之時，顯示比已知具有CDC活性之公知的抗CD4抗體OKT4還強的CDC活性。
測定抗體的ADCC活性或CDC活性的方法係被記載於Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)等而為公知，且亦有市售的套組類存在。亦可使用該種市售的套組來評價細胞毒殺活性是否比公知的抗CD4抗體還高。或是，可混合人類周邊血液單核球與抗CD4抗體，使其於37℃反應數小時，藉由流動式細胞測量術解析來測定反應液中之CD3+細胞對CD8+細胞之比例，且藉由將所得之測定值與使用了不具有ADCC活性的抗CD4抗體或上述之公知的抗CD4抗體之情形的測定值比較，而評價抗CD4抗體的ADCC活性之強度。
較佳為具有高細胞毒殺活性之抗CD4抗體係具有公知的抗CD4抗體6G5或CE9.1的10倍以上，更佳為100倍以上的ADCC活性，或較佳為具有公知的抗CD4抗體OKT4的10倍以上，更佳為100倍以上的CDC活性。此處所謂「10倍以上」意指例如對於固定量的細胞顯示細胞毒殺活性之抗體濃度的最小值為公知的上述抗體之該量的1/10以下。再者，關於抗CD4抗體對於CD4的親和性，若抗體結合活性KD為1×10-9M左右以下即可。
具有高細胞毒殺活性之抗CD4抗體，係例如可自藉由公知的手法而作成的單株抗CD4抗體或已被樹立之公知的抗CD4抗體，藉由此領域中公知的手法而利用提高其細胞毒殺活性來作成。又，專一性地辨識在細胞表面表現之CD4且具有強烈的細胞毒殺活性之抗CD4抗體亦為公知，例如WO 2010/074266 A1中揭示ADCC活性比以往的抗CD4抗體還被提高的抗CD4抗體。亦已知藉由後述之POTELLIGENT技術而提高了ADCC活性之人化抗CD4抗體IT1208。亦可較佳使用這類公知的清除型抗CD4抗體。
單株抗體的製作方法本身為此領域中周知的常規方法。例如，藉由周知的融合瘤法而製作之情形，可使用CD4蛋白質或者其適當的片段(細胞外區域，例如由CD4的N末端至第394位之區域)作為免疫原而對動物(人類除外)進行免疫，自該動物採集如脾細胞或淋巴球之抗體產生細胞，使其與骨髓瘤細胞融合而調製融合瘤，篩選出會產生會與CD4蛋白質結合之抗體的融合瘤，使其增殖而自培養上清獲得抗CD4單株抗體。CD4的基因序列、胺基酸序列及立體結構等資訊被登錄於公開的資料庫，例如於NCBI之GenBank以M12807的存取編號被登錄。作為免疫原而使用的CD4蛋白質或者其適當的片段，可基於這種序列資訊而藉由周知的基因工學手法來輕易地調製。
對人類投藥的情形，希望清除型抗CD4抗體為抗人類CD4之人類型嵌合抗體、人化抗體(將非源自 人類之抗體的CDR區域移植至人類抗體的對應區域者)、或重組人類抗體(使用非人類動物或人類細胞株所製造之與在人類的體內所產生者相同之抗體)。人類型嵌合抗體、人化抗體及重組人類抗體的製作方法也被樹立為此領域中周知的方法。例如，抗CD4人類抗體可利用確保CD4辨識之CDR序列片段以卡匣置換法(cassettes exchange)來調製。
提高抗體的細胞毒殺活性之手法亦為公知，可使用任一手法。於以下記載公知手法之一例。
作為增強ADCC活性的方法之一，可舉出將存在於抗體的Fc部分之糖鏈所含的岩藻醣(核心岩藻糖)去除的POTELLIGENT(註冊商標)技術(Yamane-Ohnuki N,Satoh M,Production of therapeutic antibodies with controlled fucosylation,MAbs 2009；1：230-236.)。附加此核心岩藻糖之酵素由於編碼於被稱為FucT-8(Fut-8)之基因，因此可藉由在剔除了Fut-8之動物細胞內使編碼重組抗體之基因表現，而得到增強了ADCC活性之抗體分子(Yamane-Ohnuki N,et al.,Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells：an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity,Biotechnol Bioeng 2004；87：614-622.)。
作為增強ADCC活性之其他的方法，可舉出變更存在於抗體的Fc部位之糖鏈的方法。該方法中藉由將天線型分枝糖鏈部的GlcNAc以GnT-III基因操作來 導入而迴避核心岩藻糖附加(M.Schuster et al.,Improved effector functions of a therapeutic monoclonal Lewis Y-specific antibody by glycoform engineering,Cancer Res 2005；65：7934-7941.)。亦可使用藉由這種手法所作成之增強了ADCC活性的抗CD4抗體。
就CDC活性增強的方法而言，已知例如，於同型IgG1的一部分組合同型IgG3之序列而提高CDC活性的COMPLEGENT(註冊商標)技術(Natsume A,In M,Takamura H,et al.Engineered antibodies of IgG1/IgG3 mixed isotype with enhanced cytotoxic activities,Cancer Res.2008；68：3863-3872.)。
進而，亦已知組合上述之POTELLIGENT(註冊商標)技術與COMPLEGENT(註冊商標)技術而強力地提高抗體之細胞毒殺活性的AccretaMab(註冊商標)技術(Natsume A,et al.,Improving effector functions of antibodies for cancer treatment：Enhancing ADCC and CDC,Drug Des Devel Ther.2009；3：7-16)。亦可使用以這種手法來提高了ADCC活性及CDC活性二者的抗CD4抗體。
將於抗CD4抗體或其抗原結合性片段結合了細胞毒成分者作為有效成分(b)而使用的情形，由於CD4陽性細胞因細胞毒成分而被傷害，因此作為抗體之反應器機能的細胞毒殺活性並非必要。所謂細胞毒成分，係指具有破壞活細胞之活性的物質，包含源自生物之毒物、化學物質、放射性物質等。
抗原結合性片段係只要維持著對於原來的抗體之對應抗原的結合性(抗原抗體反應性)，則可為任何抗體片段。就具體例而言，可舉出Fab、F(ab')2、scFv等，但不受限於此等。Fab或F(ab')2係如周知，可藉由將單株抗體以如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的蛋白分解酵素來處理而獲得。scFv(可變區之單鏈片段(single chain fragment of variable region)，單鏈抗體)的製作方法亦為周知，例如，可提取如上述地製作之融合瘤的mRNA，調製單股cDNA，使用對免疫球蛋白H鏈及L鏈專一性的引子進行PCR，將免疫球蛋白H鏈基因及L鏈基因增幅，將此等以連結器連結，賦予恰當的限制酵素部位而導入質體載體，以該載體將大腸菌轉形而使scFv表現，將其自大腸菌回收，藉此而得到scFv。
投藥有效成分(a)、或有效成分(a)與(b)之組合的對象為癌症患者，亦即為有必要進行癌症的治療之患者，包含現已罹癌之患者、及藉由外科手術而切除了癌症病灶之後的患者。患者就典型而言，係哺乳動物，尤其是人類，但不受限於此。所謂癌症的治療之用語的定義如上所述。
本發明之肽的投藥量，若為對癌症的治療之有效量即可。有效量可因應腫瘤的大小或症狀、患者的年齡或體重等而適當選擇。本發明之抗癌劑的投藥量並不被特別限定，但作為對於對象每1天的有效量(此處所謂每1天的有效量，於有效成分之肽為附加了Fc區域等之其他的機能性多肽之形態的情形，係指包含(1)~(9) 之胺基酸序列的肽部分的量，於投藥複數之肽的情形，為其合計量)，係每1kg體重1ng~1mg左右，可為例如100ng~100μg左右。1天的投藥可為1次，亦可分為數次進行投藥。又，藉由本發明之抗癌劑的治療期間中之該抗癌劑的投藥，可為1次，或是亦可為數日中每天、或隔數日、數週或是數月而進行複數次投藥。
本發明之抗癌劑的投藥路徑可為經口投藥亦可為非經口投藥，但一般來說較佳為肌肉內投藥、皮下投藥、靜脈內投藥、動脈內投藥等之非經口投藥。可全身投藥亦可局部投藥。局部投藥的情形，例如，可對腫瘤組織內或其附近、或腫瘤附近之所屬淋巴結投藥。所謂全身投藥之用語，意指對與腫瘤組織、其附近、腫瘤附近之所屬淋巴結不同的部位之投藥，於經口投藥或靜脈內．動脈內投藥之外，皮下投藥或肌肉內投藥亦包含在全身投藥中。
將免疫檢查點控制劑與本發明之肽組合而使用的情形，免疫檢查點控制劑的投藥量亦因應腫瘤的大小或症狀、患者的年齡或體重等而適當選擇。可以與將公知的免疫檢查點控制劑用於癌症的治療之情形同樣的投藥量、投藥路徑、投藥日程來使用，一般係於治療期間中每天或隔數日而進行複數次投藥。當然，由於與有效成分(a)組合而使用係可得到更高的抗癌作用，因此也可能比通常使用公知之免疫檢查點控制劑的情形還減少投藥量及投藥次數。可以與能夠表現HMG蛋白質或者該蛋白質之重組載體相同的日程來投藥，亦可以不同的 日程來投藥。投藥路徑可為經口投藥亦可為非經口投藥，但一般來說較佳為肌肉內投藥、皮下投藥、靜脈內投藥、動脈內投藥等之非經口投藥。可全身投藥亦可局部投藥，但較佳為全身投藥。
於本發明之肽組合抗CD4抗體而使用的情形，抗CD4抗體的投藥量亦因應腫瘤的大小或症狀、患者的年齡或體重等而適當選擇。其投藥量並不被特別限定，但作為對於對象每1天的有效量，可為每1kg體重0.001mg/kg~1000mg/kg左右，例如0.01mg/kg~100mg/kg左右。1天的投藥可為1次，亦可分為數次進行投藥。治療期間中之抗CD4抗體的投藥可為1次，或是亦可為數日中每天、或隔數日、數週或是數月而進行複數次投藥。可以與能夠表現HMG蛋白質或者該蛋白質之重組載體相同的日程來投藥，亦可以不同的日程來投藥。抗CD4抗體的投藥路徑可為經口投藥亦可為非經口投藥，但一般來說較佳為肌肉內投藥、皮下投藥、靜脈內投藥、動脈內投藥等之非經口投藥。可全身投藥亦可局部投藥，但較佳為全身投藥。關於結合了細胞毒成分之抗CD4抗體或其抗原結合性片段的投藥，亦為同樣。
將有效成分(a)與(b)組合而使用的情形，如上所述，可將有效成分(a)與(b)同時地投藥，亦可依序地或分別地進行投藥。依序地或分別地進行投藥的情形，先投藥何者皆可。下述實施例中，係先開始有效成分(b)的投藥，但不受此所限定，亦可先開始有效成分(a)的投藥。
任一有效成分都可與適合各投藥路徑的藥劑上所容許之載體、稀釋劑、賦形劑、結合劑、潤滑劑、崩散劑、甜味劑、懸浮劑、乳化劑、著色劑、調味劑、穩定劑等之添加劑適當混合而進行製劑。就製劑形態而言，可舉出錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑等之經口劑、或吸入劑、注射劑、栓劑、液劑等之非經口劑等。製劑方法及能夠使用的添加劑係於醫藥製劑之領域中為周知，可使用任一方法及添加劑。
本發明之醫藥組成物中包含至少1種的本發明之肽、與選自藥劑上所容許之載體、稀釋劑、賦形劑、結合劑、潤滑劑、崩散劑、甜味劑、懸浮劑、乳化劑、著色劑、調味劑、穩定劑等之至少1種的添加劑。
本發明之抗癌劑尤其是藉由與免疫檢查點控制劑等之有效成分(b)的併用，而發揮優異的抗腫瘤效果。此併用效果亦能夠理解為增強與本發明之肽併用之抗癌劑的抗癌作用之活性。含有上述之本發明之肽作為有效成分之抗癌劑的抗癌作用增強劑，係由上述觀點來表現了肽的抗癌活性之發明。作為抗癌劑之一例，可舉出以上述之有效成分(b)作為有效成分的抗癌劑。作為抗癌作用增強劑的有效成分使用的肽之較佳例、有效成分(b)之較佳例、投藥量或投藥方法之較佳例，係與本發明之抗癌劑中之此等的較佳例相同。
實施例
以下，基於實施例來更具體說明本發明。當然，本發明並不受下述實施例所限定。
<材料> 腫瘤小鼠：
以1組8隻來使用7週齡的雄性BALB/c系小鼠，將Colon26大腸癌細胞以2×105細胞/小鼠移植於右側腹部皮下。
抗體：
抗小鼠PD-L1抗體(clone 10F.9G2)、清除型抗小鼠CD4抗體(clone GK1.5)係自BioXcell公司購入。
HMGN肽、HMGN1蛋白質：
於下述表1呈示本實驗中使用之HMGN肽的胺基酸序列。肽係藉由常規方法之化學合成而調製。小鼠全長HMGN1蛋白質(序列識別號16)係自CUSABIO公司購入了重組蛋白質。
<方法及結果>
HMGN肽係於腫瘤細胞移植的9、14、17及20天後，以後述之用量對腹腔內進行了合計4次投藥。抗小鼠PD-L1抗體係於腫瘤細胞移植的4、8、14及18天後，以200μg/小鼠對腹腔內進行了合計4次投藥。抗小鼠CD4抗體係於腫瘤細胞移植的5及9天後以200μg/小鼠對腹腔內進行了合計2次投藥。每3~4天測定固態腫瘤的長徑與短徑，以以下的計算式算出了腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=(長徑；mm)×(短徑；mm)2×0.5236
1.小鼠HMGN1 NBD肽1與抗PD-L1抗體之併用所致加乘的抗腫瘤效果
圖1為將小鼠全長HMGN1蛋白質(HMGN1，序列識別號16，以80或800ng/小鼠合計投藥4次)、小鼠HMGN1 NBD肽1(mPep1，序列識別號1，以30或300ng/小鼠合計投藥4次)、及包含小鼠HMGN1 NBD起C末端側之區域的小鼠HMGN1 NBD肽2(mPep2，序列識別號2，以33或330ng/小鼠合計投藥4次)單獨、或與抗PD-L1抗體併用之時之每隻小鼠個體的腫瘤體積的歷時變化。與抗PD-L1抗體之併用中，mPep1加乘地抑制腫瘤增殖，且以30ng、300ng的投藥量而8隻中在5~7隻，Colon26固態腫瘤完全地消退了。另一方面，mPep2完全不被認為有併用效果。
圖2係在各投藥組間比較了Colon26腫瘤細胞移植24天後的腫瘤體積之測量結果的結果。mPep1與mPep2係以同莫耳數進行了投藥。mPep1係以30,300ng/小鼠的用量而與抗PD-L1抗體顯示加乘作用(相對於控制組之顯著差異為*：p<0.05、**：p<0.01(Dunnett))，在第24天，8隻中在4隻觀察到固態腫瘤的完全消退。另一方面，mPep2係無效。
比較了全長蛋白質與其片段的情形，通常全長蛋白質的血中半衰期較長。然而，根據本實驗的結果，mPep1係以比小鼠全長HMGN1蛋白質還少的用量而顯示同等以上的抗腫瘤效果，暗示了mPep1的半衰期與全長HMGN1蛋白質為相同程度。
2.人類HMGN1 NBD肽1的抗腫瘤效果
調製相當於mPep1之人類HMGN1(序列識別號17)的部分片段(人類HMGN1 NBD肽1，Pep1，序列識別號3)，並單獨或與抗PD-L1抗體(200μg/小鼠)併用而對Colon26腫瘤小鼠進行投藥，調查了抗腫瘤效果。
圖3係於腫瘤移植23天後測量腫瘤體積，且在控制組(不投藥肽也不投藥抗PD-L1抗體的Colon26腫瘤小鼠組)與各投藥組之間進行了比較的結果。圖4為Pep1單獨投藥組及Pep1+抗PD-L1抗體併用組之每隻小鼠個體的腫瘤體積的歷時變化。Pep1係即使單獨也用量依存性地顯著地抑制了Colon26固態腫瘤的增殖(圖3中相對於控制組之顯著差異為*：p<0.05、**：p< 0.01(Dunnett))。在與抗PD-L1抗體的併用，Pep1加乘地腫瘤抑制增殖，以30,300ng的投藥量而8隻中在5~7隻中Colon26固態腫瘤完全地消退了。又，於小鼠中，人類序列的肽亦為有效，因此暗示了HMGN肽的抗腫瘤效果並無種的差別。
3.對HMGN1 NBD肽1的抗腫瘤效果重要的區域之探索
作為Pep1的C末端缺失肽，而調製了去除了Pep1之C末端13殘基的Pep1△C(序列識別號4)、去除了Pep1之C末端5殘基的Pep1△C1(序列識別號5)、去除了Pep1之C末端9殘基的Pep1△C2(序列識別號6)。又，作為Pep1的N末端缺失肽，而調製了去除了Pep1之N末端5殘基的Pep1△N1(序列識別號7)、去除了Pep1之N末端9殘基的Pep1△N2(序列識別號8)、去除了Pep1之N末端14殘基的Pep1△N3(序列識別號9)。進而，調製了去除Pep1之N末端1殘基，且將3部位的R殘基取代為D殘基之序列的Pep1突變體(序列識別號11)。分別將此等之肽與抗PD-L1抗體(200μg/小鼠)併用而對Colon26腫瘤小鼠進行投藥，且歷時性地測定了腫瘤體積。肽的用量係以Pep1的投藥量300ng/小鼠為基準，使莫耳數相同而進行了腹腔內投藥。在以2用量進行了投藥的肽(Pep1△N1、Pep1△N2、Pep1突變體)，係使公比為5，且同樣地使莫耳數相同而進行了投藥。
圖5為每隻小鼠個體的腫瘤體積的歷時變化。圖6為在各投藥組間比較了在腫瘤細胞移植26天後 的時間點之腫瘤體積的結果(相對於抗PD-L1抗體單獨投藥組之顯著差異為**：p<0.01(Dunnett))。在Pep1+抗PD-L1抗體併用組，係如圖3及圖4所示，Colon26固態腫瘤的增殖被顯著地抑制了。在Pep1△C1+抗PD-L1抗體併用組亦Colon26固態腫瘤的增殖被顯著地抑制了。另一方面，在自Pep1△C1進一步去除了4個C末端胺基酸殘基的Pep1△C2與抗PD-L1抗體的併用組，以與其他的肽等莫耳的投藥也無效，失去了肽的抗腫瘤效果。在自Pep1△C2進一步去除了C末端殘基的Pep1△C亦確認到失去了肽的抗腫瘤效果。
Pep1△N1係以53及267ng/小鼠的投藥而顯著地抑制了Colon26固態腫瘤增殖。Pep1△N2也同樣地抑制固態腫瘤，在2~4隻中固態腫瘤完全地消退了。另一方面，在自Pep1△N2進一步去除了5個N末端胺基酸殘基的Pep1△N3與抗PD-L1抗體的併用組，以與其他的肽等莫耳之投藥也無效，失去了肽的抗腫瘤效果。
由所謂在Pep1△C1及Pep1△N2係維持有肽的抗腫瘤效果，在Pep1△C2及Pep1△N3則失去了肽的抗腫瘤效果之上述結果，而假定了於Pep1△C1及Pep1△N2中被保持的Pep1之第10位~第32位殘基的區域為作為抗腫瘤肽的最小活性單位(核心，core)。於是，調製包含該區域的肽作為肽1核心(Pep1core)，與Pep1、Pep1△C1及Pep1△N2比較了抗腫瘤效果。肽的用量係以Pep1的投藥量300ng、60ng/小鼠為基準，使莫耳數相同而進行了腹腔內投藥(i.p.)。在以3用量進行了投藥的肽 (Pep1core、Pep1△C1、Pep1△N2)，係進一步使公比為5，且同樣地使莫耳數相同而進行了腹腔內投藥。
圖7為每隻小鼠個體的腫瘤體積的歷時變化。作為基準的Pep1係在與抗PD-L1抗體的併用，加乘地抑制腫瘤增殖，以60ng、300ng的投藥量，8隻中於5~7隻中Colon26固態腫瘤完全地消退了。Pep1core亦以8~200ng/小鼠的投藥量而用量依存性地抑制固態腫瘤增殖，認定了1組8隻中有1~2例的腫瘤完全消退個體。作為比較對照的Pep1△C1係藉由11及265ng/小鼠的投藥而8例中在3例認定有固態腫瘤的完全消退，以53ng投藥也在1例認定有完全消退。Pep1△N2也於進行了投藥的3用量中認定有加乘作用，尤其是以9.4ng/小鼠的投藥係8例中在4例中固態腫瘤完全消退了。
圖8為在各投藥組間比較了在腫瘤細胞移植27天後的時間點之腫瘤體積的結果(相對於抗PD-L1抗體單獨投藥組之顯著差異為*：p<0.05、**：p<0.01(Dunnett))。以與抗PD-L1抗體之併用，而Pep1加乘地顯著地抑制了腫瘤增殖。作為比較對照的Pep1△C1亦加乘地顯著地抑制腫瘤增殖，以11及265ng/小鼠的投藥量而8例中在3例中固態腫瘤完全消退了。Pep1△N2亦顯著地抑制了腫瘤增殖。Pep1core也藉由與抗PD-L1抗體的併用，而Colon26固態腫瘤的增殖被抑制，投藥量40及200ng/小鼠之組被認定相對於抗PD-L1抗體單獨投藥組有顯著差異。
由圖7、8的結果，明白了EPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKK(序列識別號18)為HMGN1的最小活性肽(minimum active peptide)。
相當於Pep1之R→D突變體的Pep1突變體被認定有與Pep1同樣的抗腫瘤作用(圖6)。HMGN1之NBD中的RRSARLSA係在各種動物所有的HMGN蛋白質中被保存，是對核小體的結合而言重要的區域，但已明白即使將此區域中的精胺酸(R)全部取代為天冬胺酸(D)，也會維持肽的抗腫瘤效果。
進而，調製由在HMGN1蛋白質序列中自Pep1之區域往C末端側偏移了數殘基之區域的序列所構成的肽(PepO，KEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKDKSSDKK，序列識別號10)，將與抗PD-L1抗體之併用所致抗腫瘤效果與Pep1+抗PD-L1抗體併用進行了比較。PepO的胺基酸序列係於揭示HMGN蛋白質之抗原專一性免疫反應增強用途的美國專利第8227417號中，作為HMGN蛋白質之機能性片段的胺基酸序列而記載之序列，為公知的HMGN肽之一例。
圖9為將Pep1或PepO與抗PD-L1抗體(200μg/小鼠)併用而對Colon26腫瘤小鼠進行投藥，且歷時性地測量了腫瘤體積的結果。圖10為在腫瘤移植24天後測量腫瘤體積，且在各投藥組間進行了比較的結果(相對於抗PD-1抗體投藥組之顯著差異為**：p<0.01(Dunnett))。Pep1的用量設為300ng/小鼠，PepO係以與Pep1等莫耳量(318ng/小鼠)或其3倍量(954ng/ 小鼠)進行了投藥。PepO於以318ng/小鼠的用量與抗PD-L1抗體(200μg/小鼠)併用的情形完全未顯示抗腫瘤效果，但以3倍量的954ng/小鼠之用量，則顯著地抑制腫瘤增殖，在3隻觀察到固態腫瘤的完全消退。
Pep1係如圖3所示，在以3ng/小鼠及30ng/小鼠與抗PD-L1抗體併用之情形也有效。若合併此結果，則PepO與本發明所致Pep1的抗腫瘤作用被認為有300倍以上的效力差。
4.HMGN2、HMGN3、HMGN4、HMGN5之部分肽的抗腫瘤效果
調查了於HMGN2、HMGN3、HMGN4、HMGN5的NBD肽是否也具有抗腫瘤效果。將HMGN2 NBD-肽(PepN2)、HMGN3 NBD-肽(PepN3)、HMGN4 NBD-肽(PepN4)、HMGN5 NBD-肽(PepN5)與抗PD-L1抗體併用而對Colon26腫瘤小鼠進行投藥，測量了腫瘤體積。各肽係以與Pep1 300ng同莫耳數的用量對小鼠進行了投藥。
圖11為在抗PD-L1抗體單獨投藥組與各併用投藥組之間比較了在腫瘤移植24天後所測量的腫瘤體積的結果。PepN2、PepN4及PepN5係在與抗PD-L1抗體的併用被認為有顯著之抗腫瘤效果(相對於抗PD-L1抗體投藥組之顯著差異為**：p<0.01(Dunnett))，其抗腫瘤效果與Pep1同等級。另一方面，PepN3未被認定有抗腫瘤效果。
5.HMGN1部分肽與抗CD4抗體之併用所致抗腫瘤效果
將人類HMGN1之部分肽Pep1(800ng/小鼠)與抗CD4抗體(200μg/小鼠)併用而對Colon26腫瘤小鼠進行投藥，且調查了抗腫瘤效果。
圖12為每隻小鼠個體的腫瘤體積的歷時變化。圖13係在腫瘤移植24天後測量腫瘤體積，且在各投藥組間進行了比較的結果(**為於兩組間有顯著差異，p<0.01(Dunnett))。和與抗PD-L1抗體之併用係同樣地，Pep1與抗CD4抗體之併用亦加乘地抑制了Colon26固態腫瘤增殖。
<110> 東京大學小野藥品工業股份有限公司
<120> HMGN部分肽及使用其之癌症療法
<130> PF641-PCT
<160> 18
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠HMGN1 NBD-peptide 1(mPep1)
<400> 1
<210> 2
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠HMGN1 NBD-peptide 2(mPep2)
<400> 2
<210> 3
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類HMGN1 NBD-peptide 1(Pep1)
<400> 3
<210> 4
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類HMGN1 NBD-peptide 1 delta-C(Pep1 delta-C)
<400> 4
<210> 5
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類HMGN1 NBD-peptide 1 delta-C1(Pep1 delta-C1)
<400> 5
<210> 6
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類HMGN1 NBD-peptide 1 delta-C2(Pep1 delta-C2)
<400> 6
<210> 7
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類HMGN1 NBD-peptide 1 delta-N1(Pep1 delta-N1)
<400> 7
<210> 8
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類HMGN1 NBD-peptide 1 delta-N2(Pep1 delta-N2)
<400> 8
<210> 9
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類HMGN1 NBD-peptide 1 delta-N3(Pep1 delta-N3)
<400> 9
<210> 10
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類HMGN1 peptide 0(Pep0)
<400> 10
<210> 11
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類HMGN1 NBD-peptide 1突變體(Pep1突變體)
<400> 11
<210> 12
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類HMGN2 NBD-peptide(N2Pep)
<400> 12
<210> 13
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類HMGN3 NBD-peptide(N3Pep)
<400> 13
<210> 14
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類HMGN4 NBD-peptide(N4Pep)
<400> 14
<210> 15
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類HMGN5 NBD-peptide(N5Pep)
<400> 15
<210> 16
<211> 96
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 16
<210> 17
<211> 100
<212> PRT
<213> 人類
<400> 17
<210> 18
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類HMGN1 NBD-peptide1 core(Pep1core)
<400> 18

Claims (21)

  1. 一種肽，其胺基酸序列係以選自下述(1)~(9)之任一種的胺基酸序列表示，(1)SSAE GAAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號3)；(2)於(1)中，C末端之胺基酸殘基缺失了1~8個的胺基酸序列；(3)於(1)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列；(4)於(2)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列；(5)EGDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPKPKKAPAKKGE(序列識別號12)；(6)GDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPRPKKASAKKGE(序列識別號14)；(7)GQG DMRQEPKRR SARLSAMLV PVTPEVKPKRTSSSRKMKTKSD(序列識別號15)；(8)於(5)~(7)之任一者中，缺失了C末端之1~5個胺基酸殘基、及/或N末端之1~5個胺基酸殘基的胺基酸序列；(9)於(1)~(8)之任一者中，有1個~3個胺基酸殘基被取代的胺基酸序列。
  2. 如請求項1之肽，其中該(2)係於(1)中，C末端之胺基酸殘基缺失了1~5個的胺基酸序列，該(3)係於(1)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~9個的胺基酸序列，該(4) 係於(2)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~9個的胺基酸序列。
  3. 如請求項1或2之肽，其胺基酸序列係以該(1)~(7)的任一者表示。
  4. 如請求項1至3中任一項之肽，其胺基酸序列係以該(1)~(4)的任一者表示。
  5. 如請求項1至4中任一項之肽，其中該(2)為SSAE GAAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKK(序列識別號5)，該(3)為AAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號7)或EPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號8)，該(4)為EPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKK(序列識別號18)。
  6. 如請求項1之肽，其胺基酸序列係以選自序列識別號3、序列識別號5、序列識別號7、序列識別號8、序列識別號12、序列識別號14、序列識別號15、及序列識別號18之任一胺基酸序列表示。
  7. 如請求項1至6中任一項之肽，其係抗癌活性肽。
  8. 如請求項1至6中任一項之肽，其係抗癌作用增強肽。
  9. 一種醫藥組成物，其含有如請求項1至8中任一項之肽作為有效成分。
  10. 一種抗癌劑，其係含有至少1種肽作為有效成分的抗癌劑，該至少1種肽之胺基酸序列係以下述(1)~(9)的任一者表示，(1)SSAE GAAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號3)； (2)於(1)中，C末端之胺基酸殘基缺失了1~8個的胺基酸序列；(3)於(1)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列；(4)於(2)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列；(5)EGDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPKPKKAPAKKGE(序列識別號12)；(6)GDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPRPKKASAKKGE(序列識別號14)；(7)GQG DMRQEPKRR SARLSAMLV PVTPEVKPKRTSSSRKMKTKSD(序列識別號15)；(8)於(5)~(7)之任一者中，缺失了C末端之1~5個胺基酸殘基、及/或N末端之1~5個胺基酸殘基的胺基酸序列；(9)於(1)~(8)之任一者中，有1個~3個胺基酸殘基被取代的胺基酸序列。
  11. 如請求項10之抗癌劑，其係用於與選自免疫檢查點控制劑、及抗CD4抗體或是其抗原結合性片段之至少1種組合而使用。
  12. 如請求項11之任一項之抗癌劑，其中免疫檢查點控制劑係選自對抑制性的免疫檢查點分子之拮抗劑、及對共同刺激性的免疫檢查點分子之促效劑的至少1種。
  13. 如請求項11之抗癌劑，其中免疫檢查點控制劑為至少1種的抗免疫檢查點抗體。
  14. 如請求項11之抗癌劑，其中抗免疫檢查點抗體係選自拮抗性抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、及抗PD-L2抗體的至少1種。
  15. 如請求項11至14之抗癌劑，其中抗CD4抗體或是其抗原結合性片段為具有細胞毒殺活性之抗CD4抗體、或結合了細胞毒成分之抗CD4抗體或是其抗原結合性片段。
  16. 如請求項11至15中任一項之抗癌劑，其中該癌症為實質癌(Solid carcinoma)。
  17. 如請求項11至16中任一項之抗癌劑，其中該肽為抗癌活性肽。
  18. 一種抗癌作用增強劑，其係包含至少1種肽之抗癌劑的抗癌作用增強劑，前述至少1種肽之胺基酸序列係以下述(1)~(9)的任一者表示，(1)SSAE GAAKEEPKRR SARLSAKPPA KVEAKPKKAA AKD(序列識別號3)；(2)於(1)中，C末端之胺基酸殘基缺失了1~8個的胺基酸序列；(3)於(1)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列；(4)於(2)中，N末端之胺基酸殘基缺失了1~13個的胺基酸序列；(5)EGDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPKPKKAPAKKGE(序列識別號12)； (6)GDAKGDK AKVKDEPQRR SARLSAKPA PPKPEPRPKKASAKKGE(序列識別號14)；(7)GQG DMRQEPKRR SARLSAMLV PVTPEVKPKRTSSSRKMKTKSD(序列識別號15)；(8)於(5)~(7)之任一者中，缺失了C末端之1~5個胺基酸殘基、及/或N末端之1~5個胺基酸殘基的胺基酸序列；(9)於(1)~(8)之任一者中，有1個~3個胺基酸殘基被取代的胺基酸序列。
  19. 如請求項18之抗癌作用增強劑，其中該抗癌劑係以選自免疫檢查點控制劑、及抗CD4抗體或是其抗原結合性片段的至少1種為有效成分的抗癌劑。
  20. 如請求項18或19之抗癌作用增強劑，其中該肽為抗癌作用增強肽。
  21. 一種癌症的治療方法，其包含將有效量之請求項1至10之任一項之肽對必須進行癌症的治療之患者投藥。
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