CN106999594B

CN106999594B - 用于治疗瘤形成的治疗组合

Info

Publication number: CN106999594B
Application number: CN201580061063.0A
Authority: CN
Inventors: J.里奥斯-多里亚; R.E.霍林斯沃尔思
Original assignee: MedImmune Ltd
Current assignee: MedImmune Ltd
Priority date: 2014-11-11
Filing date: 2015-11-10
Publication date: 2020-08-18
Anticipated expiration: 2035-11-10
Also published as: KR20170082579A; US20190076452A1; TW201625270A; JP2018500384A; WO2016075174A1; CN106999594A; RU2017120063A; EP3218408A1; RU2017120063A3

Abstract

本发明的特征在于与检查点抑制剂(例如抗CTLA‑4抗体、抗PD‑1抗体、抗PD‑L1抗体、GITR配体或OX40融合蛋白(FP))组合的多柔比星或Doxil，以及使用该组合来增强受试者中的抗肿瘤活性的方法。

Description

用于治疗瘤形成的治疗组合

序列表

本申请包含已以ASCII格式以电子方式提交且特此以引用的方式整体并入的序列表。2015年10月26日创建的所述ASCII副本命名为IMTC-200WO1_SL.txt并且大小为24,829字节。

发明背景

癌症一直是主要的全球健康负担。尽管在癌症的治疗方面有所进展，但对于更有效且毒性更小的治疗仍然存在未满足的医疗需求，尤其对于患有对现有治疗具有抗性的晚期疾病或癌症的那些患者。

免疫系统，特别是T细胞介导的细胞毒性，在肿瘤控制中的作用是公认的。有越来越多的证据表明T细胞在癌症患者中控制肿瘤生长和存活，无论是在该疾病的早期和晚期阶段。然而，肿瘤特异性T-细胞应答很难在癌症患者中上升和维持。

收到显著关注的两种T细胞通路通过细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4，CD152)和程序性死亡配体1(PD-L1，又称为B7-H1或CD274)发信号。

CTLA-4在活化的T细胞上表达，并充当共抑制剂以在CD28介导的T细胞激活之后保持T细胞应答受到控制。CTLA-4被认为在TCR接合之后调节初始和记忆T细胞的早期激活幅度，并且是影响抗肿瘤免疫和自身免疫两者的中枢抑制通路的一部分。CTLA-4仅在T细胞上表达，并且其配体CD80(B7.1)和CD86(B7.2)的表达主要限于抗原呈递细胞、T细胞、和其他免疫介导的细胞。据报道阻断CTLA-4信号通路的拮抗性抗CTLA-4抗体增强T细胞激活。一种此类抗体，易普利姆玛在2011年被FDA批准用于治疗转移性黑素瘤。另一个抗CTLA-4抗体曲美木单抗，在III期试验中测试了对于晚期黑色素瘤的治疗，但相比当时的标准治疗(替莫唑胺或达卡巴嗪)没有显著增加患者的总体存活。

PD-L1也是涉及控制T细胞激活的受体和配体的复杂系统的一部分。在正常组织中，PD-L1在T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、骨髓源性肥大细胞以及不同非造血细胞上表达。它的正常功能是通过与它的两个受体程序性死亡1(又称为PD-1或CD279)和CD80(又称为B7-1或B7.1)的相互作用来调节T-细胞激活与耐受之间的平衡。PD-L1还通过肿瘤来表达并且在多个部位上起作用以帮助肿瘤避开由宿主免疫系统进行的检测和消除。PD-L1在宽范围的癌症中高频率地表达。在一些癌症中，PD-L1的表达与存活降低和不利预后相关联。阻断PD-L1与它的受体之间的相互作用的抗体能够在体外解除PD-L1依赖性免疫抑制作用并且增强抗肿瘤T细胞的细胞毒性活性。MEDI4736是针对人PD-L1的能够阻断PD-L1与PD-1和CD80受体两者的结合的人单克隆抗体。

尽管在过去十年在开发用于对抗癌症和其他疾病的策略中做出了显著的进步，但是患有晚期、难治性和转移性疾病的患者具有有限的临床选择。化疗、放射、和高剂量化疗已成为剂量限制。仍然存在对新的毒性更少的方法和具有更好的疗效、更长的临床益处、和改进的安全性特性的治疗的大量未满足的需要，特别是对于患有对现有的治疗具有抗性的晚期疾病或癌症的那些患者。

发明概述

如下所述，本发明的特征在于与免疫调节剂(例如抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、GITR配体或OX40融合蛋白(FP))组合的多柔比星或Doxil和使用该组合来增强受试者中的抗肿瘤活性的方法。

在一方面，本发明提供了一种增加受试者中抗肿瘤活性的方法，该方法涉及给予受试者多柔比星或聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星和免疫调节剂，该免疫调节剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、糖皮质激素诱导的TNFR相关基因(GITR)配体和OX40融合蛋白中的一种或多种。

在另一方面，本发明提供了一种增加受试者中的抗肿瘤免疫应答的方法，该方法涉及给予受试者多柔比星或聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星和免疫调节剂，该免疫调节剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、糖皮质激素诱导的TNFR相关基因(GITR)配体和OX40融合蛋白中的一种或多种。

在另一方面，本发明提供了一种治疗受试者中肿瘤的方法，该方法涉及给予受试者多柔比星或聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星和免疫调节剂，该免疫调节剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、糖皮质激素诱导的TNFR相关基因(GITR)配体和OX40融合蛋白中的一种或多种。

在一方面，本发明提供了一种用于增加抗肿瘤活性的试剂盒，该试剂盒包含多柔比星或聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星(例如Doxil)和免疫调节剂，该免疫调节剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、GITR配体和OX40激动剂中的一种或多种。在一些实施例中，该试剂盒包括用于根据本发明的方法来使用试剂盒的说明书。

在另一方面，本发明提供了一种药物配制品，该药物配制品包含有效量的多柔比星或聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星(例如Doxil)、和有效量的免疫调节剂，该免疫调节剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、GITR配体和OX40激动剂中的一种或多种。

在此描述的任何方面的不同的实施例中，聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星是

在此描述的任何方面的不同的实施例中，该抗PD-L1抗体是MEDI4736、BMS-936559或MPDL3280A。在具体实施例中，该抗PD-L1抗体是MEDI4736。

在此描述的任何方面的不同的实施例中，该抗PD-1抗体是LOPD18、纳武单抗、派姆单抗、兰布罗利珠单抗、MK-3475、AMP-224和皮迪力单抗。在具体实施例中，该抗PD-1抗体是LOPD 18。

在此描述的任何方面的不同的实施例中，该抗CTLA-4抗体是曲美木单抗或易普利姆玛。在具体实施例中，该抗CTLA-4抗体是曲美木单抗。

在此描述的任何方面的不同的实施例中，该免疫调节剂是GITR配体或GITR配体融合蛋白。

在此描述的任何方面的不同的实施例中，该免疫调节剂是OX40融合蛋白。

在此描述的任何方面的不同的实施例中，该肿瘤是结肠癌或肉瘤。

在此描述的任何方面的不同的实施例中，与单独给予多柔比星、聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星(例如Doxil)、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、GITR配体和OX40融合蛋白中的任一种相比，该方法导致总体存活的增加。在不同的实施例中，该方法诱导肿瘤特异性免疫应答。

在此描述的任何方面的不同的实施例中，将多柔比星或聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星(例如Doxil)与抗PD-1抗体组合给予，该抗PD-1抗体包括LOPD 18、纳武单抗、派姆单抗、兰布罗利珠单抗、MK-3475、AMP-224和皮迪力单抗中的任何一种或多种。

在此描述的任何方面的不同的实施例中，将多柔比星或聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星(例如Doxil)与抗PD-L1抗体组合给予，该抗PD-L1抗体包括MEDI4736、BMS-936559和MPDL3280A中的任何一种或多种。

在此描述的任何方面的不同的实施例中，将多柔比星或聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星(例如Doxil)与抗CTLA-4抗体组合给予，该抗CTLA-4抗体包括曲美木单抗和易普利姆玛中的任何一种或多种。

在此描述的任何方面的不同的实施例中，将多柔比星或聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星(例如Doxil)与GITR配体或GITR配体融合蛋白组合给予。

在此描述的任何方面的不同的实施例中，将多柔比星或聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星(例如Doxil)与OX40融合蛋白组合给予。

在此描述的任何方面的不同的实施例中，多柔比星、聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星(例如Doxil)或免疫调节剂(例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、GITR配体或OX40融合蛋白)的给予是通过静脉输注。

在此描述的任何方面的不同的实施例中，同时给予多柔比星或聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星(例如Doxil)和免疫调节剂。

在此描述的任何方面的不同的实施例中，在给予免疫调节剂之前，给予多柔比星或聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星(例如Doxil)。

在此描述的任何方面的不同的实施例中，在给予聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星(例如Doxil)之前，给予免疫调节剂。

在此描述的任何方面的不同的实施例中，该受试者是人患者。

本发明的其他特征及优点将在详细说明以及在权利要求书中呈现。

定义

除非另外说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。下面的参考文献为技术人员提供了本发明所用的多个术语的通用定义：辛格尔顿(Singleton)等人，微生物学和分子生物学词典(Dictionary ofMicrobiologyand Molecular Biology)(第2版，1994年)；剑桥科学与技术的词典(The CambridgeDictionary of Science and Technology)(沃克(Walker)编辑，1988年)；遗传学词汇(TheGlossary of Genetics)，第5版，R.丽格(Rieger)等人(编辑)，施普林格出版社(1991)；以及哈勒(Hale)与迈尔哈姆(Marham)，哈珀柯林斯生物学词典(The Harper CollinsDictionary of Biology)(1991)。除非另行指明，如在此使用的以下术语具有以下赋予它们的含义。

“抗肿瘤活性”意指任何降低或稳定肿瘤细胞的增殖或存活的生物学活性。在一个实施例中，该抗肿瘤活性是抗肿瘤免疫应答。

“免疫调节剂”意指增强免疫应答(例如抗肿瘤免疫应答)的试剂。本发明的示例性免疫调节剂包括抗体，如抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体及其片段，以及蛋白质，如GITR配体、或OX40融合蛋白、或其片段。在一个实施例中，该免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。

“PD-1多肽”意指与NCBI登录号NP_005009具有至少约85％氨基酸一致性、并且具有PD-L1和/或PD-L2结合活性的多肽或其片段。以下提供了Np_005009的序列。

“PD-1核酸分子”意指编码PD-1多肽的多核苷酸。示例性PD-1核酸分子序列以NCBI登录号NM_005018提供。

“抗PD-1抗体”意指选择性结合PD-1多肽的抗体。LOPD 180是示例性PD-1抗体。

LOPD180重链可变区的多肽序列

LOPD180_VH_AA

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGAYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYNGNTYYNPSLRSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVRASDYVWGGYHYFDAFDLWGRGTLVTVSS(SEQ ID NO：2)

LOPD180重链可变区的核酸序列

LOPD180_VH_DNA

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGCTTATTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAATGGGAACACGTACTACAACCCGTCCCTCAGGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTCTATTACTGTGTGAGAGCGTCTGATTACGTTTGGGGGGGTTATCATTATTTCGACGCGTTCGACCTCTGGGGCCGGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：3)

LOPD180轻链可变区的多肽序列

LOPD180_VL_AA

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSNSNIGSNSVNWYQQLPGTAPKLLIYGNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKVTVL(SEQ ID NO：4)

LOPD180轻链可变区的核酸序列

LOPD180_VL_DNA

CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCAACTCCAACATCGGAAGTAATTCTGTAAACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTCCGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGGTCACCGTCCTA(SEQ ID NO：5)

其他示例性的抗PD-1抗体包括：纳武单抗(ONO-4538/BMS-936558或MDX110，Opdivo；美施贵宝公司(BMS)；已被批准)，派姆单抗(

兰布罗利珠单抗，MK-3475；默克公司(Merck)；已被批准)，AMP-224(安普利公司(Amplimmune)/葛兰素史克公司(GSK)，和皮迪力单抗(CT-011；梯瓦公司(Teva)/库雷科技(Curetech))。

“PD-L1多肽”意指与NCBI登录号NP_001254635具有至少约85％氨基酸一致性、并且具有PD-1和CD80结合活性的多肽或其片段。

“PD-L1核酸分子”意指编码PD-L1多肽的多核苷酸。示例性PD-L1核酸分子序列以NCBI登录号NM_001267706提供。

“抗PD-L1抗体”意指选择性结合PD-L1多肽的抗体。示例性的抗PD-L1抗体描述于例如US 20130034559/US 8779108和US 20140356353，其通过引用结合在此。MEDI4736是示例性抗PD-L1抗体。其他抗PD-L1抗体包括BMS-936559(美施贵宝公司(Bristol-MyersSquibb))和MPDL3280A(罗氏公司(Roche))。

MEDI4736VL

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：6)

MEDI4736VH

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：7)

MEDI4736VH CDR1

RYWMS(SEQ ID NO：8)

MEDI4736VH CDR2

NIKQDGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO：9)

MEDI4736VL CDR1

RASQRVSSSYLA(SEQ ID NO：10)

MEDI4736VL CDR2

DASSRAT(SEQ ID NO：11)

MEDI4736VL CDR3

QQYGSLPWT(SEQ ID NO：12)

“CTLA-4多肽”意指与基因库登录号AAL07473.1具有至少85％的氨基酸序列一致性的多肽或其具有T细胞抑制活性的片段。以下提供了AAL07473.1的序列：

gi|15778586|gb|AAL07473.1|AF414120_1CTLA-4[智人]

MACLGFQRHKAQLNLATRTWPCTLLFFLLFIPVFCKAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN(SEQ ID NO：13)

“CTLA-4核酸分子”意指编码CTLA-4多肽的多核苷酸。示例性CTLA-4多核苷酸以基因库登录号AAL07473提供。

“抗CTLA-4抗体”意指选择性结合CTLA-4多肽的抗体。示例性的抗CTLA-4抗体描述于例如美国专利号6,682,736；7,109,003；7,123,281；7,411,057；7,824,679；8,143,379；7,807,797；和8,491,895中(其中，曲美木单抗是11.2.1)，这些专利通过引用结合在此。曲美木单抗是示例性抗CTLA-4抗体。以下提供了曲美木单抗的序列。

曲美木单抗，美国专利号6,682,736

曲美木单抗VL

PSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLDWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV(SEQID NO：14)

曲美木单抗VH

GVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPRGATLYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH(SEQ ID NO：15)

曲美木单抗VH CDR1

GFTFSSYGMH(SEQ ID NO：16)

曲美木单抗VH CDR2

VIWYDGSNKYYADSV(SEQ ID NO：17)

曲美木单抗VH CDR3

DPRGATLYYYYYGMDV(SEQ ID NO：18)

曲美木单抗VL CDR1

RASQSINSYLD(SEQ ID NO：19)

曲美木单抗VL CDR2

AASSLQS(SEQ ID NO：20)

曲美木单抗VL CDR3

QQYYSTPFT(SEQ ID NO：21)

如在本披露中使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段或衍生物，并且涵盖包括抗原结合位点的任何多肽，无论它是在体外或在体内生产的。术语包括但不限于：多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、非特异性、人源化、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、以及接合抗体。除非用术语“完整”另行改进，如在“完整抗体”中，出于本披露的目的，术语“抗体”还包括抗体片段如Fab、F(ab')₂、Fv、scFv、Fd、dAb和保留抗原结合功能(即特异性结合例如CTLA-4、PD-1或PD-L1的能力)的其他抗体片段。典型地，这类片段将包括抗原结合结构域。

术语“抗原结合结构域”、“抗原结合片段”和“结合片段”是指包括负责抗体和抗原之间特异性结合的氨基酸的抗体分子的一部分。例如，在抗原很大的情况下，抗原结合结构域可只结合抗原的一部分。负责与抗原结合结构域特异性相互作用的抗原分子的一部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。抗原结合结构域典型地包括抗体轻链可变区(V_L)和抗体重链可变区(V_H)，然而，它不一定必须包括两者。例如，所谓的Fd抗体片段仅由V_H结构域组成，但仍保留了完整抗体的一些抗原结合功能。

抗体的结合片段可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解来产生。结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv以及单链抗体。除了“双特异性”或“双功能”抗体以外，抗体应理解为其每个结合位点是相同的。使用酶(木瓜蛋白酶)来消化抗体的结果是两个相同的抗原结合片段，又称为“Fab”片段和“Fc”片段，它们不具有抗原结合活性，但具有结晶的能力。用酶(胃蛋白酶)来消化抗体的结果是F(ab')2片段，其中该抗体分子的两个臂保持链接并且包括两个抗原结合位点。F(ab')2片段具有交联抗原的能力。当在此使用时，“Fv”是指保留了抗原识别和抗原结合位点的抗体的最小片段。当在此使用时，“Fab”是指包括轻链的恒定结构域和重链的CHI结构域的抗体的片段。

术语“mAb”是指单克隆抗体。本发明的抗体包括但不限于：全天然抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；Fab、Fab'、单链V区片段(scFv)、融合多肽、和非常规抗体。

在此披露中，“包括(comprises、comprising)”、“包含(containing)”、“具有(having)”等具有美国专利法赋予它们的含义并且可以意指“包括(includes、including)”等；“基本上由…组成(consisting essentially of或consists essentially)”同样具有美国专利法赋予的含义并且该术语是开放性的，允许超出所叙述的存在，只要所叙述的基本或新颖特征不被超过叙述的存在改变，但是排除现有技术实施例。

如在此使用的术语“确定”、“评估”、“测定”、“测量”和“检测”是指定量和定性确定，并且正因如此，术语“确定”在此可与“测定”、“测量”、等等互换使用。其中定量确定为目的时，使用短语“确定分析物以及类似物的量”。其中定性和/或定量确定为目的时，使用短语“确定分析物的水平”或“检测”分析物。

“多柔比星”意指具有以下结构式的小化合物：

，CAS 23214-92-8，其以商品名阿霉素(Adriamycin)出售。

是聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星的商品名，其可从詹森产品公司(Janssen Products LP)购得。

“糖皮质激素诱导的TNFR相关基因(GITR)多肽”意指与NP_683699具有至少约85％氨基酸序列一致性的蛋白质或该蛋白质的并且具有T细胞调节活性的片段。在一个实施例中，GITR调节T细胞存活。

GITR也被称为肿瘤坏死因子受体超家族成员18。

“糖皮质激素诱导的TNFR相关基因(GITR)配体”意指特异性结合GITR并且与NP_005083具有至少约85％氨基酸序列一致性的蛋白质或其片段。以下提供了NP_005083(示例性人类GITR配体)的序列：

在一个实施例中，GITR配体是GITR激动剂或GITR配体融合蛋白。GITR激动剂结合GITR并诱导肿瘤消退。GITR配体描述于例如克洛西尔(Clothier)等人，免疫学杂志(TheJournal of Immunology)，2014年10月3日，1401002。

“OX40融合蛋白”意指特异性结合OX40受体并增加免疫应答的蛋白质。在一个实施例中，OX40融合蛋白与OX-40受体的结合通过提高T细胞识别来增强肿瘤抗原特异性免疫应答。示例性OX40融合蛋白描述于美国专利7,959,925，该专利名称为“三聚OX40免疫球蛋白融合蛋白及使用方法(Trimeric OX40Immunoglobulin Fusion Protein and MethodsofUse)”。参见例如美国专利7,959,925，SEQ ID NO：8：

LATDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKELLGGGSIKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERGHGGGSNSQVSHRYPRFQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL(SEQ ID NO：24)

其他OX40融合蛋白描述于例如美国专利号6,312,700。在一个实施例中，OX40融合蛋白增强肿瘤特异性T细胞免疫。

“参比”意指用于比较的标准。

“受试者”意指哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，如牛、马、犬、羊或猫。

在此提供的范围被理解成对范围内的所有值的简写。例如，一个1到50的范围应当理解为包括来自下组的任何数字、数字组合或子范围，该组由以下各项组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

如在此所使用的术语“治疗(treat、treating、treatment等)”是指减少或改善障碍和/或与其相关的症状。将被理解的是，尽管不能排除，但是治疗障碍或病症并不要求完全地消除该障碍、病症或与其相关的症状。

除非明确声明或从上下文显而易见，如在此所使用的，术语“或”被理解为包括在内。除非明确声明或从上下文显而易见，如在此所使用的，术语“一种(a)”、“一个(an)”和“该(the)”被理解为单数的或复数的。

除非确切规定或从上下文显而易见，否则如在此所使用的术语“约(about)”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均数的2个标准偏差之内。大约可以被理解为在声明值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％之内。除非从上下文显而易见，在此提供的所有数值被该术语约修饰。

在此变量的任何定义中对化学基团清单的叙述包括将所述变量定义为任何单个基团或所列基团的组合。对在此变量或方面的实施例的叙述包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分结合的实施例。

可以将在此提供的任何组合物或方法与在此提供的任何其他组合物和方法中的一种或多种进行组合。

附图简要说明

图1A-1J是一些图，这些图示出在CT26肿瘤模型中多柔比星或Doxil与α-PD-1和α-CTLA-4抗体的组合的协同作用。图1A是一幅图，该图描绘了未经处理的小鼠的肿瘤体积。图1B是一幅图，该图描绘了给予同种型对照(大鼠IgG2a+小鼠IgG2b(5/0.mg/kg))的小鼠的肿瘤体积。图1C是一幅图，该图描绘了给予多柔比星(4mg/kg)的小鼠的肿瘤体积。图1D是一幅图，该图描绘了给予Doxil(1mg/kg)的小鼠的肿瘤体积。图1E是一幅图，该图描绘了给予α-PD-1(5mg/kg)的小鼠的肿瘤体积。图1F是一幅图，该图描绘了给予α-CTLA-4(0.5mg/kg)的小鼠的肿瘤体积。图1G是一幅图，该图描绘了给予多柔比星+α-PD-1(4/5mg/kg)的小鼠的肿瘤体积。图1H是一幅图，该图描绘了给予Doxil+α-PD-1(1/5mg/kg)的小鼠的肿瘤体积。图1I是一幅图，该图描绘了给予多柔比星+α-CTLA-4(4/0.5mg/kg)的小鼠的肿瘤体积。图1J是一幅图，该图描绘了给予Doxil+α-CTLA-4(1/0.5mg/kg)的小鼠的肿瘤体积。*,p<0.005(布利斯独立性测试(Bliss independence test))。将CT26细胞植入Balb/C小鼠。细胞植入后4天，通过体重将小鼠随机化，并在第4、11和17天给药Doxil；在第4、8和12天给药多柔比星；和在第10、14、17和21天给药抗PD-1或抗CTLA-4。

图2A和2B示出了单独或与α-PD-1和α-CTLA-4的组合使用Doxil或多柔比星治疗的小鼠的存活率。示出了图1A-1J中研究的小鼠的存活率。图2A是一幅图，该图示出与Doxil或多柔比星的组合给予α-PD-1的小鼠组和相关对照组的存活率。图2B是一幅图，该图示出单独或与Doxil或多柔比星的组合给予α-CTLA-4的小鼠组和相关对照组的存活率。与Doxil(1mg/kg)或多柔比星(4mg/kg)的组合使用α-PD-1或α-CTLA-4抗体治疗的小鼠比单独使用α-PD-1或α-CTLA-4治疗的小鼠存活更久。与多柔比星组相比，α-PD-1+多柔比星(*)和α-CTLA-4+多柔比星(#)组具有统计学差异(通过对数秩测试(Log-ranktest)分别为p＝0.005和p＝0.0012)。

图3A-3D示出单独或与抗CTLA-4或抗PD-1抗体的组合使用Doxil实现完全应答的小鼠抵抗肿瘤再激发。图3A是一幅图，该图描绘了初始Balb/C小鼠的肿瘤体积(n＝10)。图3B是一幅图，该图描绘了通过Doxil治疗来实现完全应答和用CT26细胞进行再激发的小鼠的肿瘤体积。图3C是一幅图，该图描绘了通过α-CTLA-4+Doxil治疗(n＝10)来实现完全应答和用CT26细胞进行再激发的小鼠的肿瘤体积。图3D是一幅图，该图描绘了通过α-PD-1+Doxil治疗(n＝9)来实现完全应答和用CT26细胞进行再激发的小鼠的肿瘤体积。数字指示该组中小鼠总数中排斥肿瘤的小鼠数。

图4A-4E示出，针对体内Doxil活性，需要T细胞。图4A是一幅图，该图示出如所指示的给药Doxil(5mg/kg)或多柔比星(5mg/kg)的CT26荷瘤无胸腺裸鼠的肿瘤体积。图4B是一幅图，该图示出如所指示的给药Doxil(5mg/kg)或多柔比星(5mg/kg)的CT26荷瘤Balb/CX小鼠的肿瘤体积。图4C是一幅图，该图示出如所指示的给药吉西他滨(75mg/kg)的CT26荷瘤无胸腺裸鼠的肿瘤体积。图4D是一幅图，该图示出如所指示的给药吉西他滨(75mg/kg)的CT26荷瘤Balb/C小鼠的肿瘤体积。图4E是一幅图，该图示出如所指示的给药奥沙利铂(8mg/kg)的CT26荷瘤无胸腺裸鼠的肿瘤体积。图4F是一幅图，该图示出如所指示的给药奥沙利铂(8mg/kg)的CT26荷瘤Balb/C小鼠的肿瘤体积。箭头指示剂量给予。

图5A-5L示出，在已形成的CT26肿瘤模型中，Doxil与多种免疫治疗组合的协同抗肿瘤应答。图5A是一幅图，该图描绘了未经处理的小鼠的肿瘤体积。图5B是一幅图，该图描绘了给予Doxil的小鼠的肿瘤体积。图5C是一幅图，该图描绘了给予OX40L融合蛋白(FP)的小鼠的肿瘤体积。图5D是一幅图，该图描绘了给予α-PD-1的小鼠的肿瘤体积。图5E是一幅图，该图描绘了给予α-PD-L1的小鼠的肿瘤体积。图5F是一幅图，该图描绘了给予α-CTLA-4的小鼠的肿瘤体积。图5G是一幅图，该图描绘了给予GITR配体融合蛋白(GITRL FP)的小鼠的肿瘤体积。图5H是一幅图，该图描绘了给予Doxil+OX40L FP的小鼠的肿瘤体积。图5I是一幅图，该图描绘了给予Doxil+α-PD-1的小鼠的肿瘤体积。图5J是一幅图，该图描绘了给予Doxil+α-PD-L1的小鼠的肿瘤体积。图5K是一幅图，该图描绘了给予Doxil+α-CTLA-4的小鼠的肿瘤体积。图5L是一幅图，该图描绘了给予Doxil+GITRL FP的小鼠的肿瘤体积。通过肿瘤体积将荷有已形成的(约200-300mm3)CT26肿瘤的Balb/C小鼠随机化，并且用最大有效剂量的Doxil(5mg/kg，第11和19天)；OX40L FP(2.5mg/kg，第14和19天)；α-PD-1(20mg/kg，第11、14、19和22天)；α-PD-L1，(30mg/kg；第11、14、19和22天)；α-CTLA-4(20mg/kg，第14、19、22和26天)和GITRL FP(5mg/kg，第14、19、22、26、29和32天)进行治疗。CR数字指示12只中实现完全应答的小鼠数量。#，P＝0.056；*，p<0.008，布利斯独立性测试(Bliss independencetest)。

图6A-6E示出了在CT26已形成的肿瘤研究中的小鼠的存活率。示出了图5A-5L中CT26已形成的肿瘤研究中的小鼠的存活率。图6A是一幅图，该图示出单独或与Doxil的组合给予OX40FP的小鼠组和相关对照组的存活率。图6B是一幅图，该图示出单独或与Doxil的组合给予α-PD-1的小鼠组和相关对照组的存活率。图6C是一幅图，该图示出单独或与Doxil的组合给予α-PD-L1的小鼠组和相关对照组的存活率。图6D是一幅图，该图示出单独或与Doxil的组合给予α-CTLA-4的小鼠组和相关对照组的存活率。图6E是一幅图，该图示出单独或与Doxil的组合给予GITRL FP的小鼠组和相关对照组的存活率。与单一试剂治疗相比，通过对数秩测试*p<0.00625并且具有统计学意义。与Doxil治疗相比，通过对数秩测试#，p<0.00625并且具有统计学意义。

图7A-7L示出，在MCA205同源模型中，Doxil与α-PD-1、α-PD-L1和α-CTLA-4抗体组合的协同抗肿瘤应答。图7A是一幅图，该图描绘了未经处理的小鼠的肿瘤体积。图7B是一幅图，该图描绘了给予Doxil的小鼠的肿瘤体积。图7C是一幅图，该图描绘了给予OX40L融合蛋白(FP)的小鼠的肿瘤体积。图7D是一幅图，该图描绘了给予α-PD-1的小鼠的肿瘤体积。图7E是一幅图，该图描绘了给予α-PD-L1的小鼠的肿瘤体积。图7F是一幅图，该图描绘了给予α-CTLA-4的小鼠的肿瘤体积。图7G是一幅图，该图描绘了给予GITR配体融合蛋白(GITRL FP)的小鼠的肿瘤体积。图7H是一幅图，该图描绘了给予Doxil+OX40L FP的小鼠的肿瘤体积。图7I是一幅图，该图描绘了给予Doxil+α-PD-1的小鼠的肿瘤体积。图7J是一幅图，该图描绘了给予Doxil+α-PD-L1的小鼠的肿瘤体积。图7K是一幅图，该图描绘了给予Doxil+α-CTLA-4的小鼠的肿瘤体积。图7L是一幅图，该图描绘了给予Doxil+GITRL FP的小鼠的肿瘤体积。通过肿瘤体积将荷有已形成的(约100-150mm³)MCA205肿瘤的C57/Bl6小鼠随机化，并且用最大有效剂量的Doxil(5mg/kg，第10、17和24天)；OX40L FP(20mg/kg，第10和14天)；α-PD-1(10mg/kg，第10、14、17和21天)；α-PD-L1，(20mg/kg；第10、14、17和21天)；α-CTLA-4(10mg/kg，第10、14、17和21天)和GITRL FP(5mg/kg，第10、14、17、21、24和28天)进行治疗。CR数字指示12只中实现完全应答的小鼠数量。*p<0.008，布利斯独立性测试(Bliss independencetest)。

图8A-8E示出了MCA205已形成的肿瘤研究中的小鼠的存活率。示出了图7A-7L中MCA205已形成的肿瘤研究中的小鼠的存活率。图8A是一幅图，该图示出单独或与Doxil的组合给予OX40FP的小鼠组和相关对照组的存活率。图8B是一幅图，该图示出单独或与Doxil的组合给予α-PD-1的小鼠组和相关对照组的存活率。图8C是一幅图，该图示出单独或与Doxil的组合给予α-PD-L1的小鼠组和相关对照组的存活率。图8D是一幅图，该图示出单独或与Doxil的组合给予α-CTLA-4的小鼠组和相关对照组的存活率。图8E是一幅图，该图示出单独或与Doxil的组合给予GITRL的小鼠组和相关对照组的存活率。

图9A-9I示出，Doxil具有体内免疫调节功能。给药MCA205荷瘤C57/Bl6小鼠α-PD-L1、Doxil或如在此的组合。图9A是一幅图，该图描绘了血液中CD8⁺T细胞的百分比。图9B是一幅图，该图描绘了肿瘤中CD8⁺T细胞的百分比。图9C是一幅图，该图描绘了肿瘤中CD4⁺/FoxP3⁺细胞的百分比。图9D是一幅图，该图描绘了血液中CD45⁺CD11c⁺MHCII^hi中CD80的表达。图9E是一幅图，该图描绘了肿瘤中CD45⁺CD11c⁺MHCII^hi中CD80的表达。图9F是一幅图，该图描绘了在Doxil治疗的动物的血液中CD45⁺CD11c⁺MHCII^hi细胞的百分比增加，其通过添加α-PD-L1进一步增加。图9G是一幅图，该图描绘了肿瘤分离的CD45⁺CD11b⁺Ly6C⁺细胞中的CD80的表达。图9H是一幅图，该图描绘了肿瘤分离的CD45⁺CD11b⁺Ly6G⁺细胞中的CD80的表达。图9I是一幅图，该图描绘了在Doxil和Doxil+α-PD-L1治疗的动物的肿瘤中CD45⁺CD11b⁺Ly6C⁺细胞的百分比增加。*p<0.05，**p<0.01(不配对双尾学生t测试)。

发明的详细说明

如下所述，本发明的特征在于与免疫调节剂(例如抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、GITRL或OX40融合蛋白(FP))组合的多柔比星或Doxil。

多柔比星是针对患有肉瘤、肺癌、乳腺癌和其他癌症的患者广泛使用的化疗药物。之前，多柔比星已经被充分表征为DNA嵌入剂和拓扑异构酶抑制剂。所报道的多柔比星的其他作用机制是DNA交联、干扰DNA链分离、自由基形成、螺旋酶活性和直接膜效应。因此，多柔比星被视为对肿瘤细胞具有直接细胞杀伤作用的细胞毒剂。最近，多柔比星已经被确立为免疫原性细胞死亡的诱导物，并且已经显示增加IFNγ产生，并在小鼠模型中诱导树突细胞和T细胞肿瘤浸润。

如在此所述，多柔比星和Doxil都在两个同源小鼠模型中与若干种T细胞靶向免疫治疗协同作用。重要的是，组合活性持久，导致治愈率高，并在小鼠模型中产生免疫记忆。此外，结果首次揭示了在全身性给予后，Doxil对肿瘤中的树突细胞和未成熟骨髓细胞具有直接作用。

CTLA-4、PD-1和PD-L1

有越来越多的证据表明T细胞在癌症患者中控制肿瘤生长和存活，无论是在该疾病的早期和晚期阶段。然而，肿瘤特异性T-细胞应答很难在癌症患者中上升和维持。

收到显著关注的两种T细胞调节通路通过细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4，CD152)和程序性死亡配体1(PD-L1，又称为B7H-1或CD274)发信号。

CTLA-4在活化的T细胞上表达，并充当共抑制剂以在CD28介导的T细胞激活之后保持T细胞应答受到控制。CTLA-4被认为在TCR接合之后调节初始和记忆T细胞的早期激活幅度，并且是影响抗肿瘤免疫和自身免疫两者的中枢抑制通路的一部分。CTLA-4在T细胞上表达，并且其配体CD80(B7.1)和CD86(B7.2)的表达主要限于抗原呈递细胞、T细胞、和其他免疫介导的细胞。据报道阻断CTLA-4信号通路的拮抗性抗CTLA-4抗体增强T细胞激活。一种此类抗体，易普利姆玛在2011年被FDA批准用于治疗转移性黑素瘤。另一个抗CTLA-4抗体曲美木单抗，在III期试验中测试了对于晚期黑色素瘤的治疗，但相比当时的标准治疗(替莫唑胺或达卡巴嗪)没有显著增加患者的总体存活。

PD-L1也是涉及控制T细胞激活的受体和配体的复杂系统的一部分。在正常组织中，PD-L1在T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、骨髓源性肥大细胞以及不同非造血细胞上表达。它的正常功能是通过与它的两个受体程序性死亡1(又称为PD-1或CD279)和CD80(又称为B7-1或B7.1)的相互作用来调节T-细胞激活与耐受之间的平衡。PD-L1还通过肿瘤来表达并且在多个部位上起作用以帮助肿瘤避开由宿主免疫系统进行的检测和消除。PD-L1在宽范围的癌症中高频率地表达。在一些癌症中，PD-L1的表达与存活降低和不利预后相关联。阻断PD-L1与它的受体(例如PD-1)之间的相互作用的抗体能够在体外解除PD-L1依赖性免疫抑制作用并且增强抗肿瘤T细胞的细胞毒性活性。

PD-1是50-55kDa I型跨膜受体，其最初在经历激活诱导凋亡的T细胞系中鉴定。PD-1在T细胞、B细胞和巨噬细胞上表达。PD-1的配体是B7家族成员PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)。

PD-1是在其细胞外区域中包含单个Ig V样结构域的免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。PD-1细胞质结构域包含两个酪氨酸，其中最接近膜的酪氨酸(小鼠PD-1中的VAYEEL(SEQID NO：25))位于ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)内。在PD-1上ITIM的存在指示出该分子通过募集细胞质磷酸酶来用于减弱抗原受体信号传导。人和鼠类PD-1蛋白具有约60％的氨基酸一致性，具有四个潜在的N-糖基化位点的保守性，和定义Ig-V结构域的残基。细胞质区域中的ITIM和羧基末端酪氨酸周围的ITIM样基序(人和鼠类中的TEYATI(SEQ ID NO：26))在人和鼠类直系同源物之间也是保守的。

PD-1在活化的T细胞、B细胞和单核细胞上表达。实验数据表明PD-1与其配体在中枢和外周免疫应答下调中的相互作用。特别地，在PD-L1存在下，野生型T细胞中而不是在PD-1缺陷型T细胞中，增殖被抑制。另外，PD-1缺陷型小鼠表现出自身免疫表型。C57BL/6小鼠的PD-1缺乏导致慢性进行性狼疮样肾小球肾炎和关节炎。在Balb/c小鼠中，由于存在心脏组织特异性自身反应抗体，PD-1缺乏导致严重的心肌病。

抗PD-1和抗PD-L1抗体

已经描述了抗PD-1抗体及其抗原结合片段(参见例如美国专利号7,488,802，其通过引用以其全文结合在此)。LOPD180是示例性PD-1抗体。特异性结合并抑制PD-L1活性(例如，结合PD-1和/或CD80)的抗体可用于增强抗肿瘤免疫应答。抗PD-L1抗体在本领域是已知的，并且例如在以下美国专利公开号中进行了描述：US 20090055944(美施贵宝公司(BMS)/莫德瑞克斯公司(Medarex))，其对应于WO 2007/005874；US2006/0153841(达纳法伯(DanaFarber))对应于WO 01/14556；US2011/0271358(达纳法伯)；作为美国专利号8,217,149发布的US2010/0203056(基因泰克(Genentech))对应于WO 2010/077634；US2012/0039906(医学研究院(INSERM))；US 20140044738(安普利公司)对应于WO 2012/145493；US20100285039(约翰霍普金斯大学(John’s Hopkins University))；和美国专利号8,779,108(MEDI4736)，其各自通过引用结合在此。

MEDI4736是示例性抗PD-L1抗体，其对PD-L1有选择性并且阻断了PD-L1与PD-1和CD80受体的结合。MEDI4736可以在体外解除PD-L1介导的对人T-细胞激活的抑制，并且通过T-细胞依赖性机制在异种移植物模型中抑制肿瘤生长。

关于用于在此提供的方法中的MEDI4736(或其片段)的信息可以见于美国专利号8,779,108，其披露内容通过引用以其全文结合在此。MEDI4736的片段可结晶(Fc)结构域在IgG1重链的恒定结构域中包含三重突变，该三重突变减少与负责介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的补体组分C1q和Fcγ受体的结合。

用于在此提供的这些方法中的MEDI4736和其抗原结合片段包括重链和轻链或重链可变区和轻链可变区。在一个特定方面，用于在此提供的这些方法中的MEDI4736或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区。在一个特定方面，用于在此提供的这些方法中的MEDI4736或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包括上文所示的卡巴特(Kabat)定义的CDR1、CDR2和CDR3序列，并且其中该轻链可变区包括上文所示的卡巴特定义的CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域技术人员将能够容易地鉴定本领域技术人员已知的乔西亚(Chothia)定义的、Abm定义的或其他的CDR定义。在一个特定方面，用于在此提供的这些方法中的MEDI4736或其抗原结合片段包括如在美国专利号8,779,108中所披露的2.14H9OPT抗体的可变重链和可变轻链CDR序列，该专利通过引用以其全文结合在此。

抗CTLA-4抗体

特异性结合CTLA-4并抑制CTLA-4活性的抗体可用于增强抗肿瘤免疫应答。关于用于在此提供的方法中的曲美木单抗(或其抗原结合片段)的信息可以见于US 6,682,736(其中它被称为11.2.1)，该专利的披露内容通过引用以其全文结合在此。曲美木单抗(又称为CP-675,206、CP-675、CP-675206、和替西木单抗(ticilimumab))是一种人类IgG₂单克隆抗体，该单克隆抗体对于CTLA-4有高度选择性并阻断了CTLA-4与CD80(B7.1)和CD86(B7.2)的结合。它已被证明导致体外免疫激活，并且用曲美木单抗治疗的一些患者已表现出肿瘤消退。

用于在此提供的这些方法中的曲美木单抗包括重链和轻链或重链可变区和轻链可变区。在一个特定方面，用于在此提供的这些方法中的曲美木单抗或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包括上文所示的氨基酸序列，该重链可变区包括上文所示的氨基酸序列。在一个特定方面，用于在此提供的这些方法中的曲美木单抗或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包括上文所示的卡巴特(Kabat)定义的CDR1、CDR2和CDR3序列，并且其中该轻链可变区包括上文所示的卡巴特定义的CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域技术人员将能够容易地鉴定本领域技术人员已知的乔西亚(Chothia)定义的、Abm定义的或其他的CDR定义。在一个特定方面，用于在此提供的方法中的曲美木单抗或其抗原结合片段包括如在US 6,682,736中所披露的11.2.1抗体的可变重链和可变轻链CDR序列，该专利通过引用以其全文结合在此。

其他抗CTLA-4抗体描述于例如US 20070243184。在一个实施例中，该抗CTLA-4抗体是易普利姆玛，也称为MDX-010；BMS-734016。

抗体

选择性结合CTLA-4、PD-1或PD-L1并且抑制PD-1和/或PD-L1的结合或激活的抗体可用于本发明方法。

一般而言，抗体的制备可以例如使用传统的杂交瘤技术(科勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)(1975)自然(Nature)，256:495-499)、重组DNA方法(美国专利号4,816,567)、或用抗体、文库进行的噬菌体展示(克拉克森(Clackson)等人(1991)自然(Nature)，352:624-628；马克斯(Marks)等人(1991)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，222:581-597)。对于其他抗体生产技术，还参见抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)，哈洛(Harlow)等人编著，冷泉港实验室，1988。本发明不限于任何具体的来源、起源物种、生产方法。

完整抗体，又称为免疫球蛋白，典型地是四聚体糖基化蛋白质，该四聚体糖基化蛋白质由每个大约25kDa的两条轻(L)链和每个大约50kDa的两条重链(H)构成。被指定为λ链和κ链的两种类型的轻链被发现于抗体中。根据重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分为五个大类：A、D、E、G、和M，并且有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。

不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型在本领域中是公知的。对于抗体结构的综述，参见哈洛(Harlow)等人，见上文。简单地说，每个轻链由一个N-末端可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)构成。每个重链由一个N-末端可变结构域(VH)，三个或四个恒定结构域(CH)和铰链区构成。最邻近VH的CH结构域被指定为CH1。VH和VL结构域由称为框架区(FR1、FR2、FR3、和FR4)的相对保守序列的四个区域组成，这些框架区为称为互补性决定区(CDR)的高变序列的三个区域形成一个支架。CDR包含大多数负责与抗原特异性相互作用的残基。三个CDR被称为CDR1、CDR2和CDR3。重链上的CDR组分被称为H1、H2和H3，而轻链上的CDR组分相应地被称为L1、L2、和L3。CDR3和特别是H3，是抗原结合结构域中分子多样性的最大来源。例如，H3可以是短至两个氨基酸残基或大于26个氨基酸残基。

Fab片段(抗原结合片段)由通过恒定区之间的二硫键共价连接的VH-CH1和VL-CL结构域组成。为了克服Fv中非共价连接的VH和VL结构域在宿主细胞中共表达时离解的倾向，可构建一个所谓的单链(sc)Fv片段(scFv)。在scFv中，柔性和足够长的多肽将VH的C末端链接至VL的N-末端或将VL的C末端链接至VH的N-末端。最通常地，一个15残基的(Gly4Ser)3肽(SEQ ID NO：27)可用作接头，但是其他接头在本领域中也是已知的。

抗体多样性是编码可变区和各种体细胞事件的多个种系基因的组合装配的结果。体细胞事件包括具有多样性(D)的可变基因区段和连接(J)基因区段的重组来构成一个完整的VH区以及可变基因区段和连接基因区段的重组来构成一个完整的VL区。重组过程本身是不精确的，导致在V(D)J交叉点的氨基酸的缺失或添加。多样性的这些机制发生在抗原暴露之前的发育的B细胞中。抗原刺激后，B细胞中表达的抗体基因经历体细胞突变。

基于种系基因区段的估计的数目、这些区段的随机重组和随机VH-VL配对，可产生多达1.6×107个不同的抗体(基础免疫学(Fundamental Immunology)，第3版，保罗(Paul)编著，雷文出版社(Raven Press)，纽约州纽约市，1993)。当将促进抗体多样性(如体细胞突变)的其他方法考虑在内时，据认为可以潜在地产生多于1×1010个不同的抗体(免疫球蛋白基因(Immunoglobulin Genes)，第2版，吉诺(Jonio)等人编著，学术出版社(AcademicPress)，加利福尼亚州圣地亚哥，1995)。因为许多方法涉及抗体多样性，独立地产生的抗体在多个CDR中将具有相同或甚至基本上相似的氨基酸序列是极不可能的。

在此提供了示例性抗CTLA-4、抗PD-L1和/或抗PD-1的CDR的序列。用于携带CDR的结构将大体上是一个抗体重链或轻链或其一部分，其中该CDR位于对应于天然存在的VH和VL的CDR的位置。可以确定免疫球蛋白可变结构域的结构和位置，例如，如描述于卡巴特(Kabat)等人，免疫学感兴趣的蛋白质序列(Sequences ofProteins ofImmunologicalInterest)，第91-3242号，国立卫生研究院出版物(National Institutes of HealthPublications)，马里兰州贝塞斯达，1991。

本发明的抗体(例如抗CTLA-4、抗PD-L1和/或抗PD-1)可任选地包括抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可以具有在其C-末端附接的抗体轻链恒定结构域，包括人Cκ或Cλ链。类似地，基于VH结构域的特定的抗原结合结构域可以具有附接一个免疫球蛋白重链的全部或一部分，该免疫球蛋白重链起源于任何抗体同位素，例如IgG、IgA、IgE和IgM，和任何该同位素子类，其包括但不限于IgG1和IgG4。

本领域的普通技术人员将认识到，本发明的抗体可用于检测、测量和抑制与CTLA-4、PD-L1和PD-1有些不同的蛋白质。这些抗体预计有望保持结合的特异性，只要靶蛋白质包括与至少100、80、60、40、或20个连续氨基酸的任何序列(如在此所述)具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、或更高一致性的序列。百分比一致性是通过标准比对算法来确定，这些标准比对算法例如像阿特舒勒(Altshul)等人描述的基本局部比对工具(BLAST)(1990，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，215:403-410)，内德勒曼(Needleman)等人的算法(1970，分子生物学杂志，48:444-453)，或迈耶斯(Meyers)等人的算法(1988，计算机应用生物科学(Comput.Appl.Biosci.)，4:11-17)。

除了序列同源性分析，可以进行表位作图(参见，例如，表位作图实验方案，莫里斯(Morris)编著，胡玛纳出版社(Humana Press)，1996)和二级和三级结构分析，以鉴定由所披露的抗体假定的具体3D结构和它们与抗原的复合物。这些方法包括但不限于：X射线晶体学(恩斯特龙(Engstom)(1974)生物化学实验生物学(Biochem.Exp.Biol.)，11:7-13)和本披露抗体的虚拟表现形式的计算机建模(福莱特瑞克(Fletterick)等人(1986)计算机图形学和分子建模，在分子生物学现代通讯(Current Communications in MolecularBiology)中，冷泉港实验室，纽约州冷泉港)。

衍生物

本发明的抗体(例如抗CTLA-4、抗PD-L1和/或抗PD-1)可以包括这些序列的变体，其保留了特异性结合它们的靶标的能力。这些变体可以由熟练的技术人员通过使用本领域中公知的技术从这些抗体的序列中衍生而来。例如，可以在FR和/或CDR中制造氨基酸取代、缺失、或添加。虽然FR的改变一般被设计来改进抗体的稳定性及免疫原性，而CDR的改变典型地被设计来增加抗体对它的靶标的亲和力。FR的变体还包括天然存在的免疫球蛋白同种异型。这些亲和力增加的变化可凭经验通过涉及改变CDR和测试其靶标的亲和抗体的常规技术来确定。例如，可以在所披露的CDR中的任何一个中制造保守的氨基酸取代。可以根据抗体工程(Antibody Engineering)，第2版，牛津大学出版社，博雷贝克(Borrebaeck)编著，1995中描述的方法进行各种改变。这些包括但不限于由在序列内编码功能上等同的氨基酸残基的不同密码子的取代改变的核苷酸序列，从而产生“沉默”的变化。例如，非极性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。

本发明的抗体的衍生物和类似物可以通过本领域中公知的各种技术来生产，这些技术包括重组的和合成的方法(马尼亚蒂斯(Maniatis)(1990)分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港实验室，纽约州冷泉港；和博丹斯基(Bodansky)等人(1995)肽合成的实践(The Practice of Peptide Synthesis)，第2版，施普林格出版社，德国柏林)。

在一个实施例中，用于制造为本发明VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域的方法包括在当前披露的VH结构域的氨基酸序列中添加、缺失、取代、或插入一个或多个氨基酸的一个步骤，任选地将这样提供的VH结构域与一个或多个VL结构域组合，并测试该VH结构域或VH/VL组合或特异性结合抗原的组合。可使用类似方法，其中将在此披露的VL结构域的一个或多个序列变体与一个或多个VH结构域组合。

施特默尔(Stemmer)(自然(Nature)(1994)370:389-391)也披露了类似改组或组合技术，施特默尔描述了与β-内酰胺酶基因相关的技术但观察到该方法可用于产生抗体。

在进一步的实施例中，人们可以使用一个或多个选择的VH和/或VL基因的随机诱变产生携带源自在此所披露的序列的一个或多个序列的新颖的VH或VL区。格拉姆(Gram)等人(美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.)(1992)89:3576-3580)描述了一种这样的技术，易错PCR。

可使用的另一个方法是将诱变引导至VH或VL基因的CDR。巴博斯(Barbas)等人(美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.)(1994)91:3809-3813)和希尔(Schier)等人(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)(1996)263:551-567)披露了这些技术。

类似地，一个或多个或所有三个CDR可接合至VH或VL结构域的谱系中，然后筛选CTLA-4、PD-1或PD-L1特异的抗原结合片段。

免疫球蛋白可变结构域的一部分将包括大致上如在此阐述的CDR中的至少一个，以及任选地，来自如在此阐述的scFv片段的干预框架区。该部分可包括FR1和FR4中的一个或两个的至少约50％，该50％为FR1的C-末端50％和FR4的N-末端50％。可变域的实质性部分的N-末端或C-末端的另外残基可以是通常不与天然存在的可变域区域相关联的那些残基。例如，通过重组DNA技术构建的抗体可导致由所引入的接头编码的N-或C-末端残基的引入以便促进克隆或其他操纵步骤。其他操纵步骤包括引入接头以将可变结构域连接至另外的蛋白质序列，这些蛋白质序列包括免疫球蛋白重链恒定区、其他可变结构域(例如在双抗体产生中)、或蛋白质的标签，如在下文更详细地讨论。

熟练的技术人员将认识到，本发明的抗体可以包括抗原结合片段，该抗原结合片段仅包含来自VL或VH结构域的单个CDR。任一单链特异性结合结构域可用于筛选能够形成一个两结构域特异性抗原结合片段的互补结构域，该抗原结合片段能够例如结合至CTLA-4、PD-L1和PD-1中的两个。

在此所述的本发明的抗体(例如，抗PD-L1和/或抗PD1)可连接至另一功能性分子，例如另一种肽或蛋白质(白蛋白，另一种抗体等)。例如，该抗体可以通过化学交联或通过重组方法连接。抗体还可以按在美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；或4,179,337中列出的方式连接至多种非蛋白性聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。抗体可以通过共价轭合至聚合物来进行化学修饰，例如增加其循环半衰期。在美国专利号4,766,106；4,179,337；4,495,285和4,609,546也示出了示例性的聚合物和附接它们的方法。

所披露的抗体还可以改变以具有与天然模式不同的糖基化模式。例如，一个或多个碳水化合物部分可以被删除和/或一个或多个糖基化位点可以被添加到原始抗体。将糖基化位点添加到当前披露的抗体可以通过改变氨基酸序列以包含本领域中已知的糖基化位点共有序列来实现。在抗体上增加碳水化合物部分的数目的另一种方式是通过使糖苷与抗体的氨基酸残基进行化学或酶促偶联。这些方法描述在WO 87/05330中以及在阿普林(Aplin)等人(1981)化学橡胶公司生物化学关键评论(CRC Crit.Rev.Biochem.)，22:259-306中。将任何碳水化合物部分从抗体除去可以通过化学或酶促方法来实现，例如，如哈吉木丁(Hakimuddin)等人(1987)，生物化学与生物物理学集刊(Arch.Biochem.Biophys.)，259:52；以及埃奇(Edge)等人(1981)分析生物化学(Anal.Biochem.)，118:131；以及通过汤塔库拉(Thotakura)等人(1987)酶学方法(Meth.Enzymol.)，138:350所描述的。抗体也可以用可检测或功能标记来加标记。可检测标记包括放射性标记，如131I或99Tc，可使用常规化学来将它们附接至抗体。可检测标记还包括酶标记，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。可检测标记进一步包括化学部分，如生物素，其可经由结合至特定同源可检测部分(例如标记的抗生物素蛋白)来检测。

在本发明的范围内涵盖CDR序列仅在非本质上与在此所阐述的抗体不同的抗体。典型地，一个氨基酸被具有类似电荷、疏水性、或立体化学特征的相关氨基酸取代。这些取代将在技术人员的普通技能之内。不像在CDR中，可以在FR中进行更多实质性的改变，而不对抗体的结合性质造成不利影响。对FR的改变包括但不限于人源化非人衍生的的或工程化某些框架残基，这些框架残基对于抗原接触或将结合位点稳定化是重要的，例如，改变恒定区的类或亚类，改变可能改变效应子功能(如Fc受体结合)的特定氨基酸残基(例如，如在美国专利号5,624,821和5,648,260和伦德(Lund)等人(1991)免疫学杂志(J.Immun.)147:2657-2662和摩根(Morgan)等人(1995)免疫学(Immunology)86:319-324中所描述的)，或改变恒定区起源的物种。

本领域的技术人员将理解，以上所述的改变不是全部详尽的，并且由于本披露的传授，许多其他的改变将对熟练的技术人员是显而易见的。

共同治疗

使用本发明的组合，如多柔比星或Doxil与GITR配体(GITRL)或OX40融合蛋白的组合，或多柔比星或Doxil与抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段(如在此提供)中的任一种的组合，治疗患有实体瘤的患者可导致加和效应或协同效应。如在此使用，术语“协同”是指治疗的组合(例如多柔比星或Doxil与GITR配体(GITRL)或OX40融合蛋白的组合，或多柔比星或Doxil与抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段中的任一种的组合)，其比单一治疗的加和效应更加有效。

在某些实施例中，通过使用布利斯独立模型的统计分析来确定协同作用(周(Zhou)等人，生物分子筛选杂志(J Biomol Screen)2014；19(5):817-21)。该模型描述如下。如果由于单独药物A导致的总肿瘤消退率为r_a，并且由于单独药物B导致的总肿瘤消退率为r_b，那么由于药物A和药物B的组合而导致的预期的总肿瘤消退率为r_Bliss＝r_a+r_b-r_ar_b，假设这两种药物是布利斯独立的。观察到的总肿瘤消退率rab与预期率之间的差异被定义为协同指数：

I＝r_ab-r_Bliss

那么协同指数的方差可以写成

var(I)＝var(r_ab)+var(r_Bliss)

此外，

var(r_Bliss)＝var(r_a)+var(r_b)+var(r_ar_b)-2cov(r_a+r_b，r_ar_b)

var(r_ar_b)＝var(r_a)var(r_b)+r_a ²var(r_b)+r_b ²var(r_a)

cov(r_a+r_b’r_ar_b)＝r_avar(r_b)+r_bvar(r_a)

其中n_ab、n_a和n_b是组合实验和两个单一治疗实验的各自的样本大小。据说这两种药物是协同的，条件是：

其中z_0.95是标准正态分布的95％百分位数。

治疗的组合(例如多柔比星或Doxil与GITR配体(GITRL)或OX40融合蛋白的组合，或多柔比星或Doxil与抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段中的任一种的组合)的协同效应允许使用更低剂量的一种或多种治疗剂的和/或向患有实体瘤的患者以更少的频率给予所述治疗剂。利用更低剂量的治疗剂和/或以更少频率给予所述治疗的能力减少与向受试者给予所述治疗相关的毒性而不降低所述治疗在实体瘤的治疗中的功效。此外，协同效应可以导致治疗剂在实体瘤的管理、治疗或改善中改进的功效。治疗剂的组合的协同效应可避免或减少与使用任一单一治疗相关的不良或不需要的副作用。

在共同治疗中，多柔比星或Doxil与GITR配体(GITRL)或OX40融合蛋白的组合，或多柔比星或Doxil与抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段中的任一种的组合，可以任选地被包括在相同的药物组合物中，或者可以被包括在单独的药物组合物中。在后一种情况下，包括多柔比星或Doxil的药物组合物适合在给予包括GITR配体、OX40融合蛋白、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的药物组合物之前、同时或之后给予。在某些情况下，将多柔比星或Doxil在与单独的组合物中的GITR配体、OX40融合蛋白、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段重叠时间给予。MEDI4736或其抗原结合片段和曲美木单抗或其抗原结合片段可以仅被给予一次或偶尔给予，而仍然为该患者提供益处。在另外的方面，该患者被给予另外的后继剂量。可以取决于该患者的年龄、体重、临床评价、肿瘤负荷和/或其他因素(包括主治医生的判断)，在不同时间间隔下给予后续剂量。

在此提供的这些方法可以减弱或延迟肿瘤生长。在一些方面，该减小或延迟可以是统计学上显著的。可以通过与基线处的患者肿瘤的生长、针对预期的肿瘤生长、针对基于大的患者群体的预期的肿瘤生长或针对对照群体的肿瘤生长进行比较来测量肿瘤生长的减少。在其他实施例中，本发明的方法增加了存活率。

试剂盒

本发明提供用于增强抗肿瘤活性的试剂盒。在一个实施例中，该试剂盒包括治疗性组合物，该治疗性组合物在单位剂型中包含有效量的多柔比星或Doxil，和抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、GITR配体、OX40融合蛋白中的一种或多种。

在一些实施例中，该试剂盒包括一个包含治疗性组合物的无菌容器；此类容器可以是盒子、安瓿、瓶子、小瓶、试管、袋子、小袋、泡罩包装、或本领域已知的其他适合的容器形式。此类容器可以是由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或其他适用于容纳药物的材料制成的。

如果需要的话，该试剂盒还包括用于给予本发明的治疗组合的说明书。在具体实施例中，这些说明书包括以下各项中的至少一种：治疗剂的描述；用于增强抗肿瘤活性的剂量日程表和给予；注意事项；警告信息；适应症；禁忌症；超剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。这些说明书可以直接打印在容器(当存在时)上，或作为标签应用于容器，或作为单独的页、小册子、卡片、或在容器中或一起提供的文件夹。

除非另外指明，本发明的实施采用很好地处在熟练的技术人员的见识范围之内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。这些技术在文献中被充分阐明，如，“分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)”，第二版，(萨布鲁克(Sambrook)，1989)；“寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)”(盖特(Gait)，1984)；“动物细胞培养(Animal Cell Culture)”(弗莱士尼(Freshney)，1987)；“酶学方法(Methods in Enzymology)”“实验免疫学手册(Handbook ofExperimental Immunology)”(韦尔(Weir)，1996)；“用于哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)”(米勒(Miller)和卡洛斯(Calos)，1987)：“分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology)”(奥苏贝尔(Ausubel)，1987)：“PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)”(穆利斯(Mullis)，1994)；“免疫学现代方法(Current Protocols in Immunology)”(科里根(Coligan)，1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的生产，并且按照这样，可以被考虑用于制备和实施本发明。对具体实施例特别有用的技术将在下面的部分进行讨论。

给出以下的实例是为了给本领域普通技术人员提供如何准备和使用测试、筛选和本发明的治疗方法的一个完整的公开和说明，而不是旨在限定诸位发明人认为是自己的发明的范围。

实例

实例1.用Doxil或多柔比星与检查点抑制剂的组合的治疗具有协同抗肿瘤活性。

为了测试多柔比星或Doxil可增强抗肿瘤作用IMT-C(免疫介导的癌症治疗)试剂的假设，单独以及与抗小鼠PD-1和抗CTLA-4抗体组合用不同剂量的这些药物来治疗CT26荷瘤Balb/C小鼠。以预防性方式治疗这些小鼠，并在任何可测量的肿瘤之前接受治疗。由于这是一项预防性研究，减少了抗PD-1和抗CTLA-4抗体的给药，因为已知这种环境下的更高剂量产生强抗肿瘤应答。

在若干研究中使用CT26模型。CT26细胞是鼠类结肠癌细胞。CT26细胞从ATCC(马纳萨斯，弗吉尼亚州)获得，并在补充有10％胎牛血清的RPMI中生长。收到后，使用基于STR的DNA纹印测试和多重PCR(IDEXX生物研究(IDEXX Bioresearch)，哥伦比亚市，密苏里)来重新验证细胞系。细胞在单层培养物中生长，通过胰蛋白酶化收获，并且将细胞通过皮下植入到6-8周龄雌性Balb/C(CT26)、C57/Bl6(MCA205)或4-6周无胸腺雌性裸鼠的右侧翼(哈兰公司(Harlan)，印第安纳波利斯，印第安纳州)。对于CT26肿瘤模型，使用26号针将5×10⁵个细胞植入右侧翼。抗体是从抗PD-1(RMP1-14)、抗PD-L1(10F.9G2)、抗CTLA-4(9D9)和小鼠IgG2b对照(MPC-11)获得的。小鼠OX40融合蛋白(OX40FP)和大鼠IgG2a同种型对照抗体由米迪缪尼有限公司(MedImmune)(盖瑟斯堡，马里兰州)生产。所有抗体和OX40FP均通过腹腔注射给药。Doxil(蓝门制药，罗克维尔，马里兰州)和多柔比星(汉瑞祥，梅尔维尔，纽约州)是通过静脉给予来给药。在一些研究中，作为大鼠IgG2a和小鼠IgG2b的混合物向小鼠给予同种型对照。治疗开始时，通过肿瘤体积(已形成的肿瘤的研究)或通过体重(预防性研究)将小鼠随机化。如基于使用nQuery软件的样本量计算所确定的，每组动物数量的范围为每组10-12只动物之间。每周两次收集肿瘤和体重测量值，并使用方程(L x W²)/2来计算肿瘤体积，其中L和W分别指长度和宽度尺寸。将误差条计算为平均值的标准误差。每天监测小鼠的一般健康状况，并且所有实验均按照AAALAC和米迪缪尼有限公司(MedImmune)IACUC指南进行，以用于人性化治疗和实验动物保健。使用GraphPad prism使用对数秩测试来进行卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)统计分析。使用对数秩(曼特尔-考克斯(Mantel-Cox))测试来比较存活曲线(Prism 6.03)。使用邦弗朗尼(Bonferroni)方法来调整0.05α水平以进行多重比较。报告的p值是双侧p值。

与多柔比星相比，Doxil在4mg/kg剂量下具有更有效的抗肿瘤活性(表1)。实际上，所有用Doxil治疗的小鼠在MTD(5mg/kg)下均具有完全应答(CR)。减少剂量的1mg/kg的Doxil与4mg/kg的多柔比星具有近似等效的抗肿瘤活性(图1C和1D)。虽然作为单一试剂，抗PD-1和抗CTLA-4治疗具有中至低等的抗肿瘤活性(图1E和1F)，但当与多柔比星或Doxil组合时，两种抗体都显示出协同的抗肿瘤作用(图1G-1J)。当将抗PD-1与多柔比星(4mg/kg)组合时，完全应答者的数量从2只增加到8只动物(图1G)。类似地，与抗CTLA-4的组合使应答者的数量从2只增加到9只动物(图1I)。当将抗PD-1和抗CTLA-4与1mg/kg的Doxil组合时获得了类似的结果(图1H和1J)。整个研究的每组完全应答者的数量示于表1。

表1.多柔比星或Doxil与PD-1或CTLA-4mAb组合产生大量治愈。示出了来自图1A-1J中实验的所有组的完全应答(CR)的数量。Doxil比多柔比星更有活性。与PD-1或CTLA-4组合的多柔比星或Doxil产生强抗肿瘤应答。

这些数据表明，多柔比星和Doxil均与抗PD-1和抗CTLA-4抗体具有协同作用，并表明该特征是多柔比星本身固有的，因为脂质体多柔比星的利用与IMT-C作为游离药物具有相似的协同活性。

在研究完成时，与单一试剂治疗相比，用抗PD-1抗体和多柔比星(4mg/kg)的组合来治疗的小鼠显示增加的存活率(图2A，p＝0.005)。类似地，与任何单独地单一试剂相比，多柔比星(4mg/kg)或Doxil(1mg/kg)与抗CTLA-4的组合示出改进的存活率(图2B，p＝0.012)。尽管没有统计学意义，但在本研究中，用Doxil(1mg/kg)+抗CTLA-4或抗PD-1抗体来治疗的小鼠也趋向于比用单一试剂治疗来治疗的小鼠具有更长的存活期。

实例2.单独或其与检查点抑制剂组合使用Doxil治疗导致肿瘤特异性免疫记忆。

为了确定单独或与抗PD-1或抗CTLA-4的组合使用Doxil治疗而获得完全应答的小鼠是否显示免疫记忆，在初始治疗后70天，对这些动物用活CT26细胞进行再激发。虽然CT26细胞在十只初始、未经处理小鼠中的所有十只中生长(图3A)，但用Doxil实现完全应答的小鼠显示出广泛的肿瘤排斥，即10只小鼠中有9只排斥肿瘤(图3B)。用Doxil+抗CTLA-4治疗的10只小鼠中有8只，用Doxil+抗PD-1治疗的9只小鼠中有9只排斥肿瘤(图3C和3D)。这些结果表明，用作为单一试剂的Doxil以及用Doxil与检查点抑制剂的组合的治疗导致肿瘤特异性免疫记忆。

实例3.在免疫活性受试者中可观察到Doxil抗肿瘤活性，并且其涉及T细胞。

虽然Doxil和多柔比星都在预防性CT26肿瘤模型中具有活性，但是还感兴趣的是这些药物是否有效控制已形成的CT26肿瘤以及这些药物的活性在功能性免疫系统存在下是否不同。将CT26细胞植入T细胞缺陷型无胸腺裸鼠和免疫活性Balb/C小鼠中，并在肿瘤达到约200mm³时以最大耐受剂量用这些药物进行治疗。

在该实验中，多柔比星在免疫受损或免疫活性小鼠中没有引起抗肿瘤活性(图4A和4B)。相比之下，Doxil治疗在荷有已形成的CT26肿瘤的免疫活性小鼠中显示出稳键的抗肿瘤活性(图4B)，但在免疫缺陷小鼠中具有低得多的活性(图4A)，表明Doxil活性在功能性免疫系统存在下增加并且可能依赖于T细胞的存在。

为了评估其他化疗试剂是否能达到类似的结果，给予免疫缺陷和免疫活性CT26荷瘤小鼠奥沙利铂或吉西他滨。与免疫缺陷小鼠(图4E)相比，奥沙利铂在免疫活性小鼠中表现出增加的抗肿瘤活性(图4F)，这与先前的报道是一致的(周(Zhou)等人，生物分子筛选杂志(J Biomol Screen)2014；19(5):817-2)。相比之下，吉西他滨在免疫缺陷小鼠和免疫活性小鼠中都具有显著的抗肿瘤活性(图4C和4D)。这些结果与表明某些化学治疗是免疫细胞死亡的有效诱导物(欧贝得(Obeid)等人，自然医学(Nat Med)2007；13(1):54-61)的先前的研究一致，并且还首次揭示在体内吉西他滨没有该特征。

实例4.当与各种免疫调节剂组合时，Doxil是抗肿瘤活性的加强剂。

尽管Doxil与抗PD-1和抗CTLA-4抗体的组合在CT26模型中示出强抗肿瘤作用(图1A-1J)，实验的局限性在于它是一种预防性研究，并且使用的是较低剂量的抗PD-1和抗CTLA-4抗体。为了确定Doxil是否在已形成的肿瘤环境中与IMT-C保持协同作用，一旦肿瘤大约在200-300mm³(图5A-5L)，就以最大有效剂量、单独以及与靶向CTLA-4(抗CTLA-4(9D9)，西黎巴嫩，新罕布什尔)，抗PD-1(PD-1(RMP1-14)，西黎巴嫩，新罕布什尔)，PD-L1(抗PD-L1(10F.9G2)，西黎巴嫩，新罕布什尔)，OX40(小鼠OX40融合蛋白，米迪缪尼有限公司(MedImmune)，盖瑟斯堡，马里兰州)和GITR(小鼠GITRL配体融合蛋白，米迪缪尼有限公司，盖瑟斯堡，马里兰州)的IMT-C试剂组合使用Doxil来治疗CT26荷瘤小鼠。先前的研究表明，在这些已形成的肿瘤体积中，更高剂量的这些抗小鼠IMTC试剂不会产生更多的抗肿瘤功效。

Doxil治疗导致肿瘤生长的暂时控制，然后肿瘤快速再生，并且只有一个完全应答(图5B)。用OX40FP、抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4抗体的治疗显示了低至中等活性(图5C-5F)，并且每组中有少许完全应答者。与单一试剂治疗相比，Doxil与OX40FP的组合增加了肿瘤进展的时间，并且具有统计学显著的协同作用的趋势(图5G)。单独的GITR配体产生更稳键的应答，其中具有6/12的完全应答者(图5G)。与单一试剂相比，Doxil与OX40FP的组合产生了活性的适度增加(图5H)。

令人瞩目的是，Doxil与抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA-4抗体的组合产生了完全应答者的数量的协同增加，分别具有11/12、9/12和8/12的治愈(图5H-5J)。值得注意的是，Doxil和GIRL FP的组合治愈了所有小鼠，其中12/12的完全应答者(图5L)。这些实验表明，即使在已形成的肿瘤环境中，Doxil与检查点阻断剂的组合也能产生显著的抗肿瘤应答的提高。这也反映在卡普兰-迈耶存活图中，该图表明所有用Doxil加PD-1、PD-L1和CTLA-4抗体的组合来治疗的小鼠比单独用单一试剂来治疗的小鼠存活更久(图6A-6E)。

实例5.当与多种免疫调节剂组合时，Doxil是抗肿瘤活性的加强剂。

由于CT26对免疫治疗高度敏感，因此在较不敏感的模型MCA205中确定Doxil是否可以增强免疫治疗的活性。在已形成的MCA205肿瘤中，以肿瘤体积为在100-150mm³之间时开始，以最大有效剂量给药Doxil、抗CTLA-4(9D9，西黎巴嫩，新罕布什尔)；抗PD-1(RMP1-14，西黎巴嫩，新罕布什尔)；抗PD-L1(10F.9G2，西黎巴嫩，新罕布什尔)；OX40FP(小鼠OX40融合蛋白(米迪缪尼有限公司，盖瑟斯堡，马里兰州)和GITRL FP(小鼠GITR配体融合蛋白，米迪缪尼有限公司，盖瑟斯堡，马里兰州)(图7A-7L)。

MCA205细胞从阿贡西公司(Agonox)(波特兰市，俄勒冈州)获得，并在补充有10％胎牛血清的RPMI中生长。收到后，使用基于STR的DNA纹印测试和多重PCR(IDEXX生物研究(IDEXX Bioresearch)，哥伦比亚市，密苏里)来重新验证细胞系。MCA205是纤维肉瘤肿瘤细胞。对于MCA205肿瘤模型，植入2.5×10⁵个细胞。所有抗体和OX40FP均通过腹腔注射给药。Doxil(蓝门制药，罗克维尔，马里兰州)和多柔比星(汉瑞祥，梅尔维尔，纽约州)是通过静脉给予来给药。在一些研究中，作为大鼠IgG2a和小鼠IgG2b的混合物向小鼠给予同种型对照。治疗开始时，通过肿瘤体积(已形成的肿瘤的研究)或通过体重(预防性研究)将小鼠随机化。如基于使用nQuery软件的样本量计算所确定的，每组动物数量的范围为每组10-12只动物之间。每周两次收集肿瘤和体重测量值，并使用方程(L x W²)/2来计算肿瘤体积，其中L和W分别指长度和宽度尺寸。将误差条计算为平均值的标准误差。每天监测小鼠的一般健康状况，并且所有实验均按照AAALAC和米迪缪尼有限公司IACUC指南进行，以用于人性化治疗和实验动物保健。使用GraphPad prism使用对数秩测试来进行卡普兰-迈耶统计分析。使用对数秩(曼特尔-考克斯(Mantel-Cox))测试来比较存活曲线(Prism 6.03)。使用邦弗朗尼方法来调整0.05α水平以进行多重比较。报告的p值是双侧p值。

在该模型中，Doxil暂时控制肿瘤生长，然而大多数肿瘤会重新生长(图7B)。在Doxil组中，一只小鼠确实实现了完全应答。OX40FP、PD-1、GITRL FP和PD-L1抗体在该模型中具有最低的活性，肿瘤进展有一些延迟，但在OX40FP组中只有一个完全应答(图7C-7G)。用抗CTLA-4抗体治疗产生中度应答，有8/12小鼠实现完全应答。对于组合治疗，将Doxil与OX40FP激动剂组合没有比单独使用Doxil更延缓肿瘤生长，而且也没有提供完全响应的显着增加(图7H)。

相比之下，Doxil与检测点抑制剂PD-1、PD-L1和CTLA-4的抗体组合产生显著应答，分别有9/12、12/12和12/12小鼠实现完全应答(图7I-7K)。这些结果表明，在模型中，Doxil增强免疫治疗的抗肿瘤作用，该模型不像单一试剂一样对免疫治疗敏感。在本研究中，与Doxil的治疗相比，在用Doxil+抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA-4抗体治疗的小鼠中观察到存活率增加(图8A-8E)。

实例6Doxil降低肿瘤Treg，诱导细胞毒性T细胞扩增，并激活肿瘤中的成熟DC。

进行机械研究以阐明Doxil对体内免疫细胞群体的任何作用。用Doxil、α-PD-L1抗体或其组合来治疗荷有MCA205肿瘤的小鼠，收获肿瘤和血液。将MCA205细胞(2.5×10⁵)植入6-8周龄的C57/Bl6雌性小鼠的右侧翼。当肿瘤达到约250mm³的平均值时，小鼠被随机分为6组，并且给药Doxil(5mg/kg)；OX40FP(20mg/kg)；α-PD-L1(20mg/kg)或Doxil与OX40FP或α-PD-L1的组合(第0天)。在第3天给予第二剂OX40FP和α-PD-L1，并且在第7天再次给予Doxil。在第8天，将所有小鼠安乐死并从小鼠收集组织。用ACK溶液(生命技术公司(LifeTech)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)裂解红细胞。将肿瘤切割成2mm³的片，并用200单位/mL的3型胶原酶(沃辛顿(Worthington)，雷克伍德，新泽西州)和0.25mg/mL的DNA酶(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，密苏里州)在37℃下消化20分钟。在96孔板中每孔加载一百万至二百万个细胞，并且进行活死蓝(Live Dead Blue)(生命技术公司(LifeTech)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)染色，并在FACS缓冲液(PBS+0.5％FBS和2mm EDTA)中用CD11b(BD生物科学公司(BD)克隆M1/70)、CD11c(拜力生物(Biolegend)克隆n418)、CD80(拜力生物克隆16-10A1)、Ly6G(拜力生物克隆1A8)、Ly6C(拜力生物HK1.4)、CD45(联科生物(Ebioscience)克隆30-F11)、MHC-II(拜力生物克隆M5/114.15.2)、CD4(拜力生物克隆RM4-5)、CD8(BD生物科学公司(BD)克隆RPA-T8)和FOXP3(联科生物克隆FJK-16S)的抗体染色。对于FOXP3检测，使用FOXP3转录试剂盒(联科生物，圣地亚哥，加利福尼亚州)。在4℃下将细胞染色20分钟、洗涤、然后用4％多聚甲醛固定。样品数据在BD Fortessa(BD生物科学公司(BD)，圣何塞，加利福尼亚州)上获得。使用FlowJo软件(树星(TreeStar)，阿什兰，俄勒冈州)来分析数据。

在使用Doxil、α-PD-L1抗体或组合来治疗的荷有MCA205肿瘤小鼠中，Doxil增加了血液中CD8+T细胞的百分比，并且Doxil和Pα-D-L1的组合在肿瘤中产生CD8⁺T细胞的百分比显着增加(图9A和9B)。除了细胞毒性T细胞外，由于Doxil治疗，观察到肿瘤浸润性Treg的量显著减少，该减少似乎被Doxil和抗PD-L1的组合进一步增强(图9C)。

为了检查T细胞变化的原因，研究了血液和肿瘤中骨髓隔室的表型。在血液和肿瘤中，Doxil和Doxil+抗PD-L1，而不是单独的抗PD-L1，诱导CD45⁺CD11c⁺MHCII^hi细胞(代表成熟的树突细胞)上的共刺激分子CD80的表达(图9D和9E)。与单独的Doxil相比，组合组的CD80表达水平趋于较高。同时，Doxil治疗也增加了血液中CD45⁺CD11c⁺MHCII^hi细胞的百分比，当与抗PD-L1组合时，该百分比进一步显著增加(图9F)。这表明，Doxil不仅增加了成熟树突细胞上的CD80水平，还诱导了这些细胞的扩增。有趣的是，在肿瘤中的CD45⁺CD11b⁺Ly6c⁺单核细胞MDSC和CD45⁺CD11b⁺Ly6G⁺粒细胞MDSC上也观察到了Doxil诱导的CD80上调的作用(图9G和9H)。Doxil以及Doxil+抗PD-L1也增加了肿瘤中CD45⁺CD11b⁺Ly6c⁺细胞的百分比(图9I)。总之，这些结果表明，在体内，Doxil降低肿瘤Treg，诱导细胞毒性T细胞扩增，并激活肿瘤中的成熟DC。这些发现与以下各项一致并可为其提供解释：Doxil与抗PD-L1组合的意义深远的抗肿瘤作用，以及还有如本研究中所观察的潜在的检查点阻断的其他介质。

其他实施例

从前述说明中，将显而易见的是，可以对在此所述的发明作出变更和修改以使其适应于各种用途和状况。这些实施例也在下述权利要求的范围内。

在此变量的任何定义中对要素清单的叙述包括将所述变量定义为任何单个要素或所列要素的组合(或次组合)。在此实施例的叙述包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分结合的实施例。

本说明书中提及的全部专利和出版物通过引用方式以相同的程度结合在此，如同每份单独的专利和出版物具体地且个别地指出通过引用的方式结合。

<110>米迪缪尼有限公司（MEDIMMUNE LIMITED）

<120>用于治疗瘤形成的治疗组合和方法

<130> IMTC-200WO1

<140>

<141>

<150> 62/154,287

<151> 2015-04-29

<150> 62/078,238

<151> 2014-11-11

<160> 27

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 288

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

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Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly

165 170 175

Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys

180 185 190

Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro

195 200 205

Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly

210 215 220

Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro

225 230 235 240

Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly

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Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg

260 265 270

Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu

275 280 285

<210> 2

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的多肽”

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly

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Ala Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu

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Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

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Leu Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Val Arg Ala Ser Asp Tyr Val Trp Gly Gly Tyr His Tyr Phe Asp

100 105 110

Ala Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 3

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的多核苷酸”

<400> 3

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgctt attactggag ctggatccgc 120

cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacaatgg gaacacgtac 180

tacaacccgt ccctcaggag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240

tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tctattactg tgtgagagcg 300

tctgattacg tttggggggg ttatcattat ttcgacgcgt tcgacctctg gggccgggga 360

accctggtca ccgtctcctc a 381

<210> 4

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的多肽”

<400> 4

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

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Ile Tyr Gly Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

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Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

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Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

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Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的多核苷酸”

<400> 5

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaagcaactc caacatcgga agtaattctg taaactggta ccagcagctc 120

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<210> 6

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的多肽”

<400> 6

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser

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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

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<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的多肽”

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<210> 8

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的肽”

<400> 8

Arg Tyr Trp Met Ser

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<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的肽”

<400> 9

Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的肽”

<400> 10

Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的肽”

<400> 11

Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的肽”

<400> 12

Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 13

<211> 223

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala

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Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro

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Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr

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Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser

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<210> 14

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的多肽”

<400> 14

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

1 5 10 15

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys

20 25 30

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln

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Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

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Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys

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Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

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Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val

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<210> 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的多肽”

<400> 15

Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

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Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro

20 25 30

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn

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Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

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Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

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Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

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<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的肽”

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Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His

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<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的肽”

<400> 17

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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<210> 18

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的肽”

<400> 18

Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的肽”

<400> 19

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的肽”

<400> 20

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的肽”

<400> 21

Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr

1 5

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

Met Thr Leu His Pro Ser Pro Ile Thr Cys Glu Phe Leu Phe Ser Thr

1 5 10 15

Ala Leu Ile Ser Pro Lys Met Cys Leu Ser His Leu Glu Asn Met Pro

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Leu Ser His Ser Arg Thr Gln Gly Ala Gln Arg Ser Ser Trp Lys Leu

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100 105 110

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115 120 125

Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp

130 135 140

Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly

145 150 155 160

Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser

165 170 175

Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu

180 185 190

Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser

195

<210> 24

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的多肽”

<400> 24

Leu Ala Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

1 5 10 15

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

20 25 30

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

35 40 45

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

50 55 60

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

85 90 95

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

100 105 110

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

115 120 125

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

130 135 140

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

145 150 155 160

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

165 170 175

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

180 185 190

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

195 200 205

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Leu Leu Gly Gly Gly Ser Ile Lys Gln

225 230 235 240

Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu

245 250 255

Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Arg Gly His Gly

260 265 270

Gly Gly Ser Asn Ser Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Phe Gln Ser

275 280 285

Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu

290 295 300

Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val

305 310 315 320

Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe

325 330 335

Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro

340 345 350

Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala

355 360 365

Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn

370 375 380

Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile

385 390 395 400

His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu

405 410

<210> 25

<211> 6

<212> PRT

<213> 鼠属

<400> 25

Val Ala Tyr Glu Glu Leu

1 5

<210> 26

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 26

Thr Glu Tyr Ala Thr Ile

1 5

<210> 27

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注意=“人工序列的描述：合成的肽”

<400> 27

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Claims

1.多柔比星或聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星和抗PD-1抗体在制备用于在受试者中增加抗肿瘤活性的药物中的用途。

2.多柔比星或聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星和抗PD-1抗体在制备用于在受试者中增加抗肿瘤免疫应答的药物中的用途。

3.多柔比星或聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星和抗PD-1抗体在制备用于治疗受试者的肿瘤的药物中的用途。

4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中该聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星是Doxil®。

5.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中该抗PD-1抗体是LOPD 180、纳武单抗、派姆单抗、兰布罗利珠单抗、MK-3475、AMP-224和皮迪力单抗。

6.如权利要求5所述的用途，其中该抗PD-1抗体是LOPD 180。

7.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中该肿瘤是结肠癌或肉瘤。

8.如权利要求1-3或6中任一项所述的用途，其中与单独给予多柔比星、聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星、或抗PD-1抗体中的任一种相比，该药物导致总体存活的增加。

9.如权利要求1-3或6中任一项所述的用途，其中该药物诱导肿瘤特异性免疫应答。

10.如权利要求1-3或6中任一项所述的用途，其中所述药物用于静脉输注。

11.如权利要求1-3或6中任一项所述的用途，其中该受试者是人患者。

12.一种用于增加抗肿瘤活性的试剂盒，该试剂盒包括多柔比星或聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星和抗PD-1抗体。

13.如权利要求12所述的试剂盒，其中该试剂盒进一步包括用于在如权利要求1所述的用途中使用该试剂盒的说明书。

14.一种药物配制品，该药物配制品包括有效量的多柔比星或聚乙二醇包覆的脂质体封装形式的多柔比星和有效量的抗PD-1抗体。

15.如权利要求14所述的药物配制品，其中该抗PD-1抗体是LOPD 180、纳武单抗、派姆单抗、兰布罗利珠单抗、MK-3475、AMP-224或皮迪力单抗。