KR20170082579A

KR20170082579A - 종양을 치료하기 위한 치료 조합

Info

Publication number: KR20170082579A
Application number: KR1020177015355A
Authority: KR
Inventors: 조나단 리오스-도리아; 로버트 이 홀링스워스
Original assignee: 메디뮨 리미티드
Priority date: 2014-11-11
Filing date: 2015-11-10
Publication date: 2017-07-14
Also published as: US20190076452A1; TW201625270A; JP2018500384A; WO2016075174A1; CN106999594A; RU2017120063A; CN106999594B; EP3218408A1; RU2017120063A3

Abstract

본 발명은 체크포인트 저해제(예컨대, 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, GITR 리간드, 또는 OX40 융합 단백질(FP))과 조합된 독소루비신 또는 독실 및 대상체에서 항-종양 활성을 증강시키기 위한 조합의 이용 방법을 특징으로 한다.

Description

종양을 치료하기 위한 치료 조합{THERAPEUTIC COMBINATIONS FOR TREATING NEOPLASIA}

서열 목록

본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2015년 10월 26일에 생성된 상기 ASCII 사본은 IMTC-200WO1_SL.txt로 명명되며 24,829바이트 크기이다.

암은 계속 주요한 세계적 건강 부담이 되고 있다. 암 치료에서의 진보에도 불구하고, 특히 진행된 질환 또는 기존 치료제에 내성이 있는 암을 갖는 환자에 대한, 더욱 효과적이고 독성이 더 적은 치료법에 대한 의학적 필요성은 충족되지 않고 있다.

종양 제어에서, 면역계, 특히 T 세포-매개 세포독성의 역할은 잘 인식되어 있다. T 세포가 질환의 초기 및 후기 단계에 모두, 암 환자에서 종양 성장 및 생존을 제어한다는 증거가 증가하고 있다. 그러나, 종양 특이적 T-세포 반응을 암 환자에서 증가시키고 유지하는 것은 어렵다.

상당한 관심을 받고 있는 2가지 T 세포 경로는 세포독성 T 림프구 항원-4(CTLA-4, CD152) 및 프로그래밍된 사멸 리간드 1(PD-L1, 또한 B7H-1 또는 CD274로 알려져 있음)을 통해 신호를 전달한다.

CTLA-4는 활성화 T 세포 상에서 발현되며, CD28-매개 T 세포 활성화에 뒤따르는 체크에서 T 세포 반응을 유지하기 위한 공동-저해제로서 작용한다. CTLA-4는 TCR 관여 후 나이브(naive) 및 메모리 T 세포의 초기 활성화 크기를 조절하고, 항종양 면역성 및 자가면역성 모두에 영향을 미치는 중추적 저해 경로의 일부인 것으로 여겨진다. CTLA-4는 T 세포 상에서 전적으로 발현되며, 그 리간드 CD80(B7.1) 및 CD86(B7.2)의 발현은 주로 항원-제시 세포, T 세포, 및 다른 면역 매개 세포로 제한된다. CTLA-4 신호전달 경로를 차단하는 길항성 항-CTLA-4 항체는 T 세포 활성화를 증강시키는 것으로 보고되었다. 이러한 항체 중 하나인 이필리무맵은 전이성 흑색종의 치료에 대해 2011년 FDA의 승인을 받았다. 또 다른 항-CTLA-4 항체인 트레멜리무맵은 진행된 흑색종의 치료에 대해 III상 시험에서 평가되었으나, 당시 표준 케어(테모졸로마이드 또는 다카르바진)에 비해 환자의 전반적 생존을 유의미하게 증가시키지 못했다.

PD-L1은 또한 T 세포 활성화의 제어에 관여되는 복잡한 수용체 및 리간드 시스템의 일부이다. 정상 조직에서, PD-L1은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 대식구, 중간엽 줄기 세포, 골수-유래 비만 세포뿐만 아니라 다양한 비조혈 세포 상에서 발현된다. 그 정상 기능은 그 두 수용체: programmed death 1(또한 PD-1 또는 CD279로도 알려져 있음) 및 CD80(또한 B7-1 또는 B7.1로도 알려져 있음)과의 상호작용을 통해 T-세포 활성화 및 관용 간 균형을 조절하는 것이다. PD-L1은 또한 종양에 의해 발현되며 여러 부위에서 작용하여 종양이 숙주 면역계에 의한 검출 및 제거를 탈출하는 것을 돕는다. PD-L1은 높은 빈도로 광범위한 암에서 발현된다. 일부 예에서, PD-L1의 발현은 감소된 생존 및 바람직하지 못한 예후와 연관되었다. PD-L1 및 그 수용체 간 상호작용을 차단하는 항체는 PD-L1-의존적 면역억제 효과를 완화시키고 시험관내 항종양 T 세포의 세포독성 활성을 증강시킬 수 있다. MEDI4736은 PD-1 및 CD80 수용체 모두에 대한 PD-L1의 결합을 차단할 수 있는 인간 PD-L1에 대해 유도된 인간 모노클로날 항체이다.

암 및 다른 질환과 싸우기 위한 전략의 개발에서 지난 십 년에 걸쳐 이루어진 상당한 진보에도 불구하고, 진행성, 난치성 및 전이성 질환을 갖는 환자는 제한된 임상 옵션을 갖는다. 화학치료법, 방사선 조사, 및 고용량 화학치료법은 용량이 제한되었다. 특히 진행된 질환 또는 기존 치료제에 내성이 있는 암을 갖는 환자에 있어서, 더 우수한 치료 유효성, 더 긴 임상적 이익, 및 개선된 안전성 프로필을 갖는 신규하고 독성이 더 적은 방법 및 치료제에 대해 상당한 충족되지 않은 필요성이 남아 있다.

후술되는 바와 같이, 본 발명은 면역조정제(예컨대, 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, GITR 리간드, 또는 OX40 융합 단백질(FP))와 조합된 독소루비신 또는 독실(Doxil) 및 대상체에서 항-종양 활성을 증강시키기 위한 조합의 이용 방법을 특징으로 한다.

하나의 양태에서, 본 발명은 대상체에서 항-종양 활성을 증가시키는 방법으로서, 독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태, 및 하나 이상의 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 유전자(GITR) 리간드, 및 OX40 융합 단백질인 면역조정제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 항-종양 면역 반응을 증가시키는 방법으로서, 독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태, 및 하나 이상의 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 유전자(GITR) 리간드, 및 OX40 융합 단백질인 면역조정제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 종양을 치료하는 방법으로서, 독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태, 및 하나 이상의 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 유전자(GITR) 리간드, 및 OX40 융합 단백질인 면역조정제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

하나의 양태에서, 본 발명은 항-종양 활성을 증가시키기 위한 키트로서, 독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태(예컨대, 독실), 및 하나 이상의 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, GITR 리간드, 및 OX40 작동제인 면역조정제를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트에는 본 발명의 방법에 따른 키트의 이용 지침이 포함된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태(예컨대, 독실)의 유효량, 및 하나 이상의 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, GITR 리간드, 및 OX40 작동제인 면역조정제의 유효량을 함유하는 약학 제형물을 제공한다.

본원에서 묘사된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태는 독실(Doxil®)이다.

본원에서 묘사된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 MEDI4736, BMS-936559, 또는 MPDL3280A이다. 특정 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 MEDI4736이다.

본원에서 묘사된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 항-PD-1 항체는 LOPD 18, 니볼루맵, 펨브롤리주맵, 람브롤리주맵, MK-3475, AMP-224, 및 피딜리주맵이다. 특정 구현예에서, 항-PD-1 항체는 LOPD 18이다.

본원에서 묘사된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 항-CTLA-4 항체는 트레멜리무맵 또는 이필리무맵이다. 특정 구현예에서, 항-CTLA-4 항체는 트레멜리무맵이다.

본원에서 묘사된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 면역조정제는 GITR 리간드 또는 GITR 리간드 융합 단백질이다.

본원에서 묘사된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 면역조정제는 OX40 융합 단백질이다.

본원에서 묘사된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 종양은 결장 암종 또는 육종이다.

본원에서 묘사된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 방법은 독소루비신, 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태(예컨대, 독실), 항 PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, GITR 리간드, 및 OX40 융합 단백질 단독 중 임의의 하나의 투여에 비해 전반적 생존 증가를 일으킨다. 다양한 구현예에서, 방법은 종양-특이적 면역 반응을 유도한다.

본원에서 묘사된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태(예컨대, 독실)는 임의의 하나 이상의 LOPD 18, 니볼루맵, 펨브롤리주맵, 람브롤리주맵, MK-3475, AMP-224, 및 피딜리주맵을 포함하는 항-PD-1항체와 조합되어 투여된다.

본원에서 묘사된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태(예컨대, 독실)는 임의의 하나 이상의 MEDI4736, BMS-936559, 및 MPDL3280A를 포함하는 항-PD-L1항체와 조합되어 투여된다.

본원에서 묘사된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태(예컨대, 독실)는 임의의 하나 이상의 트레멜리무맵 및 이필리무맵을 포함하는 항-CTLA-4 항체와 조합되어 투여된다.

본원에서 묘사된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태(예컨대, 독실)는 GITR 리간드 또는 GITR 리간드 융합 단백질과 조합되어 투여된다.

본원에서 묘사된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태(예컨대, 독실)는 OX40 융합 단백질과 조합되어 투여된다.

본원에서 묘사된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 독소루비신, 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태(예컨대, 독실), 또는 면역조정제(예컨대, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, GITR 리간드, 또는 OX40 융합 단백질)의 투여는 정맥내 주입에 의한다.

본원에서 묘사된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태(예컨대, 독실) 및 면역조정제는 동시에 투여된다.

본원에서 묘사된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태(예컨대, 독실)는 면역조정제의 투여 전에 투여된다.

본원에서 묘사된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 면역조정제는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태(예컨대, 독실)의 투여 전에 투여된다.

본원에서 묘사된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 대상체는 인간 환자이다.

본 발명의 다른 특징 및 장점은 상세한 설명으로부터, 그리고 청구범위로부터 자명할 것이다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 이용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 하기 참고문헌은 본 발명에서 이용되는 여러 용어의 일반적 정의를 당업자에게 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 본원에서 이용되는 하기 용어들은, 달리 명시되지 않는 한, 아래에서 이들에게 부여되는 의미를 갖는다.

"항-종양 활성"이란 종양 세포의 증식 또는 생존을 감소시키거나 안정화하는 임의의 생물학적 활성을 의미한다. 하나의 구현예에서, 항-종양 활성은 항-종양 면역 반응이다. "면역조정제"란 면역 반응(예컨대, 항-종양 면역 반응)을 증강시키는 제제를 의미한다. 본 발명의 예시적인 면역조정제에는 항체, 예컨대 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 및 이들의 단편뿐만 아니라 단백질, 예컨대 GITR 리간드, 또는 OX40 융합 단백질, 또는 이들의 단편이 포함된다. 하나의 구현예에서, 면역조정제는 면역 체크포인트 저해제이다.

"PD-1 폴리펩타이드"란 NCBI 접근 번호 NP_005009와 적어도 약 85% 아미노산 동일성을 가지며 PD-L1 및/또는 PD-L2 결합 활성을 가지는 폴리펩타이드 또는 이들의 단편을 의미한다. NP_005009의 서열이 아래에 제공된다.

"PD-1 핵산 분자"란 PD-1 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 예시적인 PD-1 핵산 분자 서열은 NCBI 접근 번호 NM_005018에 제공된다.

"항-PD-1 항체"란 PD-1 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는 항체를 의미한다. LOPD 180은 예시적인 PD-1 항체이다.

LOPD180 중쇄 가변 영역 폴리펩타이드 서열

LOPD180_VH_AA

LOPD180 중쇄 가변 영역 핵산 서열

LOPD180 _ VH _DNA

LOPD180 경쇄 가변 영역 폴리펩타이드 서열

LOPD180_VL_AA

LOPD180 경쇄 가변 영역 핵산 서열

LOPD180 _ VL _DNA

다른 예시적인 항-PD-1 항체에는 니볼루맵(ONO-4538/BMS-936558 또는 MDX110, Opdivo; BMS; 승인됨), 펨브롤리주맵(Keytrudat®, 람브롤리주맵, MK-3475; Merck; 승인됨), AMP-224(Amplimmune/GSK), 및 피딜리주맵(CT-011; Teva/Curetech)이 포함된다.

"PD-L1 폴리펩타이드"란 NCBI 접근 번호 NP_001254635와 적어도 약 85% 아미노산 동일성을 가지며 PD-L1 및 CD80 결합 활성을 가지는 폴리펩타이드 또는 이들의 단편을 의미한다.

"PD-L1 핵산 분자"란 PD-L1 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 예시적인 PD-L1 핵산 분자 서열은 NCBI 접근 번호 NM_001267706에 제공된다.

"항-PD-L1 항체"란 PD-L1 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는 항체를 의미한다. 예시적인 항-PD-L1 항체는, 예를 들어 US20130034559 / US8779108 및 US20140356353에 기재되며, 이는 본원에 참조로 포함된다. MEDI4736은 예시적인 항-PD-L1 항체이다. 다른 항-PD-L1 항체에는 BMS-936559(Bristol-Myers Squibb) 및 MPDL3280A(Roche)가 포함된다.

MEDI4736 VL

MEDI4736 VH

MEDI4736 VH CDR1

MEDI4736 VH CDR2

MEDI4736 VL CDR1

MEDI4736 VL CDR2

MEDI4736 VL CDR3

"CTLA-4 폴리펩타이드"란 GenBank 접근 번호 AAL07473.1와 적어도 85% 아미노산 서열 동일성을 가지는 폴리펩타이드 또는 T 세포 저해 활성을 가지는 이들의 단편을 의미한다. AAL07473.1의 서열은 아래에 제공된다:

"CTLA-4 핵산 분자"란 CTLA-4 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 예시적인 CTLA-4 폴리뉴클레오타이드는 GenBank 접근 번호 AAL07473에 제공된다.

"항-CTLA-4 항체"란 CTLA-4 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는 항체를 의미한다. 예시적인 항-CTLA-4 항체는, 예를 들어 US 특허 번호 6,682,736; 7,109,003; 7,123,281; 7,411,057; 7,824,679; 8,143,379; 7,807,797; 및 8,491,895(트레멜리무맵은 여기서 11.2.1임)에 기재되며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 트레멜리무맵은 예시적인 항-CTLA-4 항체이다. 트레멜리무맵 서열은 아래에 제공된다.

트레멜리무맵 U.S. 특허 번호 6,682,736

트레멜리무맵 VL

트레멜리무맵 VH

트레멜리무맵 VH CDR1

트레멜리무맵 VH CDR2

트레멜리무맵 VH CDR3

트레멜리무맵 VL CDR1

트레멜리무맵 VL CDR2

트레멜리무맵 VL CDR3

본 개시에서 이용되는 "항체"라는 용어는 면역글로불린 또는 이들의 단편 또는 유도체를 나타내며, 이것이 시험관내 또는 생체내 생산되는지 여부와 무관하게, 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 포괄한다. 용어에는 비제한적으로 폴리클로날, 모노클로날, 단일특이적, 다중특이적, 비-특이적, 인간화, 단일쇄, 키메라, 합성, 재조합, 하이브리드, 돌연변이화, 및 그래프팅된 항체가 포함된다. 본 개시의 목적을 위해, "온전한 항체"에서와 같이 "온전한" 이라는 용어로 달리 수식되지 않는 한, "항체"라는 용어에는 또한 항체 단편, 예컨대 Fab, F(ab')₂, Fv, scFv, Fd, dAb, 및 항원-결합 기능, 예를 들어 CTLA-4, PD-1, 또는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 다른 항체 단편이 포함된다. 전형적으로, 이러한 단편은 항원-결합 도메인을 포함할 것이다.

"항원-결합 도메인", "항원-결합 단편", 및 "결합 단편"이라는 용어는 항체 및 항원 간 특이적 결합에 관여하는 아미노산을 포함하는 항체 분자의 일부를 나타낸다. 항원이 큰 경우에, 항원-결합 도메인은 항원의 일부에만 결합할 수 있다. 항원-결합 도메인과의 특이적 상호작용에 관여하는 항원 분자의 일부는 "에피토프" 또는 "항원 결정기"로 불린다. 항원-결합 도메인은 전형적으로 항체 경쇄 가변 영역(V_L) 및 항체 중쇄 가변 영역(V_H)을 포함하지만, 반드시 둘 다를 포함할 필요는 없다. 예를 들어, 소위 Fd 항체 단편은 V_H 도메인으로만 구성되지만, 여전히 온전한 항체의 일부 항원-결합 기능을 보유한다.

항체의 결합 단편은 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산된다. 결합 단편에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 및 단일쇄 항체가 포함된다. "이중특이적" 또는 "이중작용성" 항체 이외의 항체는 각각의 그 결합 부위가 동일한 것으로 이해된다. 효소 파파인을 이용한 항체의 소화는 "Fab" 단편으로도 알려져 있는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 항원-결합 활성을 갖지 않지만 결정화하는 능력을 가지는 "Fc" 단편을 생성한다. 효소 펩신을 이용한 항체의 소화는 항체 분자의 2개 팔이 결합된 채 유지되고 2개의 항원-결합 부위를 포함하는 F(ab')2 단편을 생성한다. F(ab')2 단편은 항원을 가교하는 능력을 갖는다. 본원에서 이용되는 경우 "Fv"는 항원-인식 및 항원-결합 부위를 모두 보유하는 항체의 최소 단편을 나타낸다. 본원에서 이용되는 "Fab"는 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 CHI 도메인을 포함하는 항체의 단편을 나타낸다.

"mAb"라는 용어는 모노클로날 항체를 나타낸다. 본 발명의 항체는 비제한적으로 전체 원상태 항체, 이중특이적 항체; 키메라 항체; Fab, Fab', 단일쇄 V 영역 단편(scFv), 융합 폴리펩타이드, 및 비통상적 항체를 포함한다.

본 개시에서, "포함한다", "포함하는", "함유하는" 및 "가지는" 등은 U.S. 특허법에서 이들에게 부여되는 의미를 가질 수 있고, "포함된다", "포함되는" 등을 의미할 수 있으며; "로 본질적으로 구성되는" 또는 "본질적으로 구성되는" 등은 U.S. 특허법에서 부여되는 의미를 가지고, 이 용어는 개방형으로, 인용되는 기본적인 또는 신규한 특징이 인용되는 것 이외의 존재에 의해 변화되지 않는 한, 인용되는 것 이외의 존재를 허용하지만 선행 기술의 구현예는 배제한다.

본원에서 이용되는 "결정하는", "평가하는", "검정하는", "측정하는" 및 "검출하는"은 정성적 및 정량적 결정을 모두 나타내며, 이와 같이 "결정하는"이라는 용어는 본원에서 "검정하는", "측정하는" 등과 상호 교환적으로 이용된다. 정량적 결정을 의도하는 경우, 분석물 등의 "양의 결정"이라는 어구가 이용된다. 정성적 및/또는 정량적 결정을 의도하는 경우, 분석물의 "수준의 결정" 또는 분석물의 "검출"이라는 어구가 이용된다.

"독소루비신"이란 상표명 아드리아마이신(Adriamycin) 하에 판매되는 CAS 23214-92-8의 하기 구조식:

을 가지는 소형 화합물을 의미한다. 독실(Doxil®)은 Janssen Products LP에서 이용 가능한, 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태에 대한 상표명이다.

"글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 유전자(GITR) 폴리펩타이드"란 NP_683699와 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성을 가지는 단백질 또는 T 세포 조절 활성을 가지는 그 단편을 의미한다. 하나의 구현예에서, GITR은 T 세포 생존을 조절한다.

GITR은 또한 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 구성원 18로 명명된다.

"글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 유전자(GITR) 리간드"란 GITR에 특이적으로 결합하고 NP_005083과 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성을 가지는 단백질 또는 이들의 단편을 의미한다. 예시적인 인간 GITR 리간드인 NP_005083의 서열은 아래에 제공된다:

하나의 구현예에서, GITR 리간드는 GITR 작동제 또는 GITR 리간드 융합 단백질이다. GITR 작동제는 GITR에 결합하며 종양 퇴행을 유도한다. GITR 리간드는, 예를 들어 문헌[Clothier et al., The Journal of Immunology October 3, 2014 1401002]에 기재된다.

"OX40 융합 단백질"이란 OX40 수용체에 특이적으로 결합하고 면역 반응을 증가시키는 단백질을 의미한다. 하나의 구현예에서, OX-40 수용체에 대한 OX40 융합 단백질의 결합은 T-세포 인식을 증대시킴으로써 종양 항원 특이적 면역 반응을 증강시킨다. 예시적인 OX40 융합 단백질은 "Trimeric OX40 Immunoglobulin Fusion Protein and Methods of Use"을 표제로 하는 U.S. 특허 7,959,925에 기재된다. 예를 들어, U.S. 특허 7,959,925, SEQ ID NO. 8을 참고하도록 한다:

다른 OX40 융합 단백질은, 예를 들어, US 특허 번호 U.S. Pat. No. 6,312,700에 기재된다. 하나의 구현예에서, OX40 융합 단백질은 종양-특이적 T-세포 면역성을 증강시킨다.

"참조"란 대조 표준을 의미한다.

"대상체"란 비제한적으로 인간 또는 비-인간 포유류, 예컨대 소, 말, 개, 양, 또는 고양이를 포함하는 포유류를 의미한다.

본원에서 제공되는 범위는 범위 내의 모든 값에 대한 약기인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 구성되는 군의 임의의 수, 수의 조합, 또는 하위-범위를 포함하는 것으로 이해된다.

본원에서 이용되는 "치료하다", "치료하는", "치료" 등의 용어는 장애 및/또는 이와 연관된 증상의 감소 또는 완화를 나타낸다. 배제되지는 않지만, 장애 또는 질병의 치료는 장애, 질병 또는 이와 연관된 증상이 완전히 제거되는 것을 필요로 하지는 않음이 이해될 것이다.

구체적으로 언급되거나 맥락 상 명백하지 않은 경우, 본원에서 이용되는 "또는"이라는 용어는 포괄적인 것으로 이해된다. 구체적으로 언급되거나 맥락 상 명백하지 않은 경우, 본원에서 이용되는 단수 용어는 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.

구체적으로 언급되거나 맥락 상 명백하지 않은 경우, 본원에서 이용되는 "약"이라는 용어는 당분야의 일반 관용 범위 내인 것으로, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 내인 것으로 이해된다. 약은 언급되는 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 내인 것으로 이해될 수 있다. 맥락 상 달리 명확하지 않는 한, 본원에서 제공되는 모든 수치 값은 약이라는 용어로 수식된다.

본원에서 변수의 임의의 정의 내인 화학적 군의 목록의 기재에는 임의의 단일 군 또는 기재된 군의 조합으로서의 해당 변수의 정의가 포함된다. 본원에서 변수 또는 양태에 대한 구현예의 인용에는 임의의 단일 구현예 또는 임의의 다른 구현예 또는 이들의 일부와의 조합으로서의 해당 구현예가 포함된다.

본원에서 제공되는 임의의 조성물 또는 방법은 본원에서 제공되는 하나 이상의 임의의 다른 조성물 및 방법과 조합될 수 있다.

도 1A~1J는 CT26 종양 모델에서 α-PD-1 및 α-CTLA-4 항체와 조합된 독소루비신 또는 독실의 상승작용을 나타내는 그래프이다. 도 1A는 미처리 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 1B는 이소형 대조군(래트 IgG2a + 마우스 IgG2b(5/0.5 mg/kg)이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 1C는 독소루비신(4 mg/kg)이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 1D는 독실(1 mg/kg)이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 1E는 α-PD-1(5 mg/kg)이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 1F는 α-CTLA-4(0.5 mg/kg)이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 1G는 독소루비신 + α-PD-1(4/5 mg/kg)이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 1H는 독실 + α-PD-1(1/5 mg/kg)이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 1I는 독소루비신 + α-CTLA-4(4/0.5 mg/kg)가 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이며, 도 1J는 독실 + α-CTLA-4(1/0.5 mg/kg)이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. *, p<0.005(Bliss 독립 평가). CT26 세포를 Balb/C 마우스 내로 이식하였다. 세포 이식 4일 후, 마우스를 체중별로 무작위화하고, 4, 11, 및 17일에 독실을; 4, 8, 및 12일에 독소루비신을; 및 10, 14, 17 및 21일에 항-PD-1 또는 항-CTLA-4를 투여하였다.
도 2A 및 2B는 단독으로 또는 α-PD-1 및 α-CTLA-4와 조합된 독실 또는 독소루비신으로 처리된 마우스의 생존을 나타낸다. 도 1A~1J에 연구로부터의 마우스의 생존을 나타낸다. 도 2A는 독실 또는 독소루비신과 조합된 α-PD-1이 투여된 마우스 군, 및 관련 대조군의 생존을 나타내는 그래프이다. 도 2B는 단독으로 또는 독실 또는 독소루비신과 조합된 α-CTLA-4가 투여된 마우스 군, 및 관련 대조군의 생존을 나타내는 그래프이다. 독실(1 mg/kg) 또는 독소루비신(4 mg/kg)과 조합된 α-PD-1 또는 α-CTLA-4 항체로 처리된 마우스는 α-PD-1 또는 α-CTLA-4 단독으로 처리된 마우스보다 길게 생존하였다. α-PD-1 + 독소루비신(*) 및 α-CTLA-4 + 독소루비신(#) 군은 독소루비신 군 대비 통계적으로 상이하였다(각각 Log-순위 평가에 의해 p=0.005 및 p=0.0012).
도 3A~3D는 단독으로 또는 항-CTLA-4 또는 항-PD-1 항체와 조합된 독실로 완전 반응을 달성하는 마우스가 종양-재유발접종에 내성이 있었음을 나타낸다. 도 3A는 나이브 Balb/C 마우스(n=10)에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 3B는 독실 처리에 의해 완전 반응을 달성하고 CT26 세포가 재-유발접종된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 3C는 α-CTLA-4 + 독실 처리에 의해 완전 반응을 달성하고(n=10) CT26 세포가 재-유발접종된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 3D는 α-PD-1 + 독실 처리에 의해 완전 반응을 달성하고(n=9) CT26 세포가 재-유발접종된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 수치는 군 내 마우스의 총수 중 종양을 거부한 마우스의 수를 나타낸다.
도 4A~4E는 T 세포가 생체내 독실 활성을 위해 필요함을 나타낸다. 도 4A는 나타낸 바와 같이 독실(5 mg/kg) 또는 독소루비신(5 mg/kg)이 투여된 CT26 종양-보유 무흉선 누드 마우스에서 종양 부피를 나타내는 그래프이다. 도 4B는 나타낸 바와 같이 독실(5 mg/kg) 또는 독소루비신(5 mg/kg)이 투여된 CT26 종양-보유 Balb/C 마우스에서 종양 부피를 나타내는 그래프이다. 도 4C는 나타낸 바와 같이 젬시타빈(75 mg/kg)이 투여된 CT26 종양-보유 무흉선 누드 마우스에서 종양 부피를 나타내는 그래프이다. 도 4D는 나타낸 바와 같이 젬시타빈(75 mg/kg)이 투여된 CT26 종양-보유 Balb/C 마우스에서 종양 부피를 나타내는 그래프이다. 도 4E는 나타낸 바와 같이 옥시플라틴(8 mg/kg)이 투여된 CT26 종양-보유 무흉선 누드 마우스에서 종양 부피를 나타내는 그래프이다. 도 4F는 나타낸 바와 같이 옥시플라틴(8 mg/kg)이 투여된 CT26 종양-보유 Balb/C 마우스에서 종양 부피를 나타내는 그래프이다. 화살표는 용량 투여를 나타낸다.
도 5A~5L은 확립된 CT26 종양 모델에서 다중 면역치료법과 조합된 독실의 상승적 항-종양 반응을 나타낸다. 도 5A는 미처리 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 5B는 독실이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 5C는 OX40L 융합 단백질(FP)이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 5D는 α-PD-1이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 5E는 α-PD-L1이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 5F는 α-CTLA-4가 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 5G는 GITR 리간드 융합 단백질(GITRL FP)이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 5H는 독실 + OX40L FP가 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 5I는 독실 + α-PD-1이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 5J는 독실 + α-PD-L1이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 5K는 독실 + α-CTLA-4가 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 5L은 독실 + GITRL FP가 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 확립된(약 200~300 mm3) CT26 종양을 보유하는 Balb/C 마우스를 종양 부피별로 무작위화하고 최대 유효 용량의 독실(5 mg/kg, 11 및 19일); OX40L FP(2.5 mg/kg, 14 및 19일); α-PD-1(20 mg/kg, 11, 14, 19, 및 22일); α-PD-L1(30 mg/kg; 11, 14, 19, 및 22일); α-CTLA-4(20 mg/kg, 14, 19, 22, 및 26일) 및 GITRL FP(5 mg/kg 14, 19, 22, 26, 29 및 32일)로 처리되었다. CR 수치는 12마리 중 완전 반응을 달성한 마우스의 수를 나타낸다. #, p=0.056; *, p<0.008, Bliss 독립 평가.
도 6A~6E는 CT26 확립-종양 연구에서 마우스의 생존을 나타낸다. 도 5A~5L에서 CT26 확립 종양 연구로부터 마우스의 생존을 나타낸다. 도 6A는 단독으로 또는 독실과 조합된 OX40 FP가 투여된 마우스 군, 및 관련 대조군의 생존을 나타내는 그래프이다. 도 6B는 단독으로 또는 독실과 조합된 α-PD-1이 투여된 마우스 군, 및 관련 대조군의 생존을 나타내는 그래프이다. 도 6C는 단독으로 또는 독실과 조합된 α-PD-L1이 투여된 마우스 군, 및 관련 대조군의 생존을 나타내는 그래프이다. 도 6D는 단독으로 또는 독실과 조합된 α-CTLA-4가 투여된 마우스 군, 및 관련 대조군의 생존을 나타내는 그래프이다. 도 6E는 단독으로 또는 독실과 조합된 GITRL FP가 투여된 마우스 군, 및 관련 대조군의 생존을 나타내는 그래프이다. *p<0.00625 및 Log-순위 평가에 의해 단일-제제 치료법 대비 통계적으로 유의미함. #, p<0.00625 및 Log-순위 평가에 의해 독실 처리 대비 통계적으로 유의미함.
도 7A~7L은 MCA205 동계 모델에서 α-PD-1, α-PD-L1 및 α-CTLA-4 항체와 조합된 독실의 상승적 항-종양 반응을 나타낸다. 도 7A는 미처리 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 7B는 독실이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 7C는 OX40L 융합 단백질(FP)이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 7D는 α-PD-1이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 7E는 α-PD-L1이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 7F는 α-CTLA-4가 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 7G는 GITR 리간드 융합 단백질(GITRL FP)이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 7H는 독실 + OX40L FP가 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 7I는 독실 + α-PD-1이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 7J는 독실 + α-PD-L1이 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 7K는 독실 + α-CTLA-4가 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 도 7L은 독실 + GITRL FP가 투여된 마우스에서 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 확립된(약 100~150 mm³) MCA205 종양을 보유하는 C57/Bl6 마우스를 종양 부피별로 무작위화하고 최대 유효 용량의 독실(5 mg/kg, 10, 17 및 24일); OX40L FP(20 mg/kg, 10 및 14일); α-PD-1(10 mg/kg, 10, 14, 17, 및 21일); α-PD-L1(20 mg/kg; 10, 14, 17, 및 21일); α-CTLA-4(10 mg/kg, 10, 14, 17, 및 21일) 및 GITRL FP(5 mg/kg 10, 14, 17, 21, 24 및 28일)로 처리하였다. CR 수치는 12마리 중 완전 반응을 달성한 마우스의 수를 나타낸다. *, p<0.008, Bliss 독립 평가.
도 8A~8E는 MCA205 확립-종양 연구에서 마우스의 생존을 나타낸다. 도 7A~7L에서 MCA205 확립 종양 연구로부터의 마우스의 생존을 나타낸다. 도 8A는 단독으로 또는 독실과 조합된 OX40 FP가 투여된 마우스 군, 및 관련 대조군의 생존을 나타내는 그래프이다. 도 8B는 단독으로 또는 독실과 조합된 α-PD-1이 투여된 마우스 군, 및 관련 대조군의 생존을 나타내는 그래프이다. 도 8C는 단독으로 또는 독실과 조합된 α-PD-L1이 투여된 마우스 군, 및 관련 대조군의 생존을 나타내는 그래프이다. 도 8D는 단독으로 또는 독실과 조합된 α-CTLA-4가 투여된 마우스 군, 및 관련 대조군의 생존을 나타내는 그래프이다. 도 8E는 단독으로 또는 독실과 조합된 GITRL이 투여된 마우스 군, 및 관련 대조군의 생존을 나타내는 그래프이다.
도 9A~9I는 독실이 생체내 면역조정 기능을 가짐을 나타낸다. MCA205 종양 보유 C57/Bl6 마우스에 α-PD-L1, 독실, 또는 본원에서의 조합을 투여하였다. 도 9A는 혈중 CD8⁺ T 세포 백분율을 도시하는 그래프이다. 도 9B는 종양 내 CD8⁺ T 세포 백분율을 도시하는 그래프이다. 도 9C는 종양 내 CD4⁺/FoxP3⁺ 세포 백분율을 도시하는 그래프이다. 도 9D는 혈중 CD45⁺CD11c⁺MHCII^hi 세포에서 CD80의 발현을 도시하는 그래프이다. 도 9E는 종양 내 CD45⁺CD11c⁺MHCII^hi 세포에서 CD80의 발현을 도시하는 그래프이다. 도 9F는 CD45⁺CD11c⁺MHCII^hi 세포 백분율이 독실 처리 동물에서 혈중 증가되었으며, α-PD-L1의 첨가에 의해 추가 증대됨을 도시하는 그래프이다. 도 9G는 종양-단리 CD45⁺CD11b⁺Ly6C⁺ 세포에서 CD80의 발현을 도시하는 그래프이다. 도 9H는 종양-단리 CD45⁺CD11b⁺Ly6G⁺ 세포에서 CD80의 발현을 도시하는 그래프이다. 도 9I는 CD45⁺CD11b⁺Ly6C⁺ 세포 백분율이 독실 및 독실 + α-PD-L1 처리 동물에서 종양 내 증가되었음을 도시하는 그래프이다. *p<0.05, **p< 0.01(비-페어링 투-테일화 Student t 평가).

후술되는 바와 같이, 본 발명은 면역조정제(예컨대, 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, GITRL, 또는 OX40 융합 단백질(FP))와 조합된 독소루비신 또는 독실을 특징으로 한다.

독소루비신은 육종, 폐암, 유방암 및 다른 암을 갖는 환자에 대해 널리 이용되는 화학치료 약물이다. 이전에, 독소루비신은 DNA 삽입제 및 토포이소머라제의 저해제로서 잘 특성규명되어 있다. 보고된 독소루비신의 다른 작용 기전은 DNA 가교, DNA 가닥 분리 방해, 자유-라디칼 형성, 헬리카제 활성 및 직접적 막 효과이다. 따라서 독소루비신은 종양 세포 상에서 직접적 세포 사멸 효과를 갖는 세포독성제로서 간주되어 왔다. 보다 최근에, 독소루비신은 면역원성 세포사의 유도제로서 확립되었으며, IFN 감마 생산을 증가시키고 마우스 모델에서 수지상 및 T 세포 종양 침윤을 유도하는 것으로 나타났다.

본원에서 기재된 바와 같이, 독소루비신 및 독실은 모두 2가지 동계 마우스 모델에서 몇몇 T-세포 표적화 면역치료법과 상승작용을 나타내었다. 중요하게는, 조합 활성은 장기 지속되어 높은 치유율로 이어졌으며, 마우스 모델에서 면역학적 기억을 생성하였다. 또한, 결과들은 최초로 독실이 전신 투여 후 종양 내 수지상 및 미성숙 골수구 세포에 대해 직접적 효과를 가짐을 드러낸다.

CTLA-4, PD-1 및 PD-L1

T 세포가 질환의 초기 및 후기 단계에 모두, 암 환자에서 종양 성장 및 생존을 제어한다는 증거가 증가하고 있다. 그러나, 종양 특이적 T-세포 반응을 암 환자에서 증가시키고 지속시키는 것은 어렵다.

상당한 관심을 받고 있는 2가지 T 세포 조정 경로는 세포독성 T 림프구 항원-4(CTLA-4, CD152) 및 programmed death 리간드 1(PD-L1, 또한 B7H-1 또는 CD274로 알려져 있음)을 통해 신호를 전달한다.

CTLA-4는 활성화 T 세포 상에서 발현되며, CD28-매개 T 세포 활성화 후 T 세포 반응을 체크 상태로 유지하기 위한 공동-저해제로서 작용한다. CTLA-4는 TGR 관여 후 나이브 및 메모리 T 세포의 초기 활성화 크기를 조절하고, 항종양 면역성 및 자가면역성 모두에 영향을 미치는 중추적 저해 경로의 일부인 것으로 여겨진다. CTLA-4는 T 세포 상에서 발현되며, 그 리간드 CD80(B7.1) 및 CD86(B7.2)의 발현은 주로 항원-제시 세포, T 세포, 및 다른 면역 매개 세포로 제한된다. CTLA-4 신호전달 경로를 차단하는 길항성 항-CTLA-4 항체는 T 세포 활성화를 증강시키는 것으로 보고되었다. 이러한 항체 중 하나인 이필리무맵은 전이성 흑색종의 치료에 대해 2011년 FDA의 승인을 받았다. 또 다른 항-CTLA-4 항체인 트레멜리무맵은 진행된 흑색종의 치료에 대해 III상 시험에서 평가되었으나, 당시 표준 케어(테모졸로마이드 또는 다카르바진)에 비해 환자의 전반적 생존을 유의미하게 증가시키지 않았다.

PD-L1은 또한 T 세포 활성화 제어에 관여되는 복잡한 수용체 및 리간드 시스템의 일부이다. 정상 조직에서, PD-L1은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 대식구, 중간엽 줄기 세포, 골수-유래 비만 세포뿐만 아니라 다양한 비조혈 세포 상에서 발현된다. 그 정상 기능은 그 두 수용체: programmed death 1(또한 PD-1 또는 CD279로도 알려져 있음) 및 CD80(또한 B7-1 또는 B7.1로도 알려져 있음)과의 상호작용을 통해 T-세포 활성화 및 관용 간 균형을 조절하는 것이다. PD-L1은 또한 종양에 의해 발현되며 여러 부위에서 작용하여 종양이 숙주 면역계에 의한 검출 및 제거를 탈출하는 것을 돕는다. PD-L1은 높은 빈도로 광범위한 암에서 발현된다. 일부 예에서, PD-L1의 발현은 감소된 생존 및 바람직하지 못한 예후와 연관되었다. PD-L1 및 그 수용체(예컨대, PD-1) 간 상호작용을 차단하는 항체는 PD-L1-의존적 면역억제 효과를 완화시키고 시험관내 항종양 T 세포의 세포독성 활성을 증강시킬 수 있다.

PD-1은 활성화-유도 아폽토시스를 겪고 있는 T 세포주에서 최초 확인된 50 kDa~55 kDa I형 막통과 수용체이다. PD-1은 T 세포, B 세포, 및 대식구 상에서 발현된다. PD-1에 대한 리간드는 B7 패밀리 구성원 PD-L1(B7-H1) 및 PD-L2(B7-DC)이다.

PD-1은 그 세포외 영역에 단일 Ig V-유사 도메인을 함유하는 면역글로불린(Ig) 수퍼패밀리의 구성원이다. PD-1 세포질 도메인은 2개의 티로신을 함유하며, 막에 가장 인접한 티로신(마우스 PD-1 내의 VAYEEL(SEQ ID NO: 25))은 ITIM(면역-수용체 티로신-기반 저해 모티프) 내에 위치한다. PD-1 상 ITIM의 존재는 상기 분자가 세포질 포스파타제의 모집에 의해 항원 수용체 신호전달을 약화시키는 기능을 함을 시사한다. 인간 및 쥐과 PD-1 단백질은 4개의 잠재적 N-글리코실화 부위, 및 Ig-V 도메인을 정의하는 잔기가 보존되며 약 60% 아미노산 동일성을 공유한다. 세포질 영역 내 ITIM 및 카복시-말단 티로신을 둘러싼 ITIM-유사 모티프(인간 및 마우스에서의 TEYATI(SEQ ID NO: 26))도 인간 및 쥐과 오르소로그 간에 보존되어 있다.

PD-1은 활성화 T 세포, B 세포, 및 단핵구 상에서 발현된다. 실험 데이터는 중추 및 말초 면역 반응의 하향조절에서 PD-1과 그 리간드의 상호작용을 암시한다. 특히, PD-1-결핍 T 세포가 아니라 야생형 T 세포에서의 증식은 PD-L1의 존재 하에 저해된다. 추가적으로, PD-1-결핍 마우스는 자가면역성 표현형을 나타낸다. C57BL/6 마우스에서의 PD-1 결핍은 만성 진행성 루푸스-유사 사구체신염 및 관절염을 일으킨다. Balb/c 마우스에서, PD-1 결핍은 심장-조직-특이적 자가-반응성 항체의 존재로 인해 중증 심근병증으로 이어진다.

항-PD-1 및 항-PD-L1 항체

항-PD-1 항체 및 이들의 항원-결합 단편이 기재되었다(예컨대, 본원에 그 전문이 참조로 포함되는 U.S. 특허 번호 7,488,802를 참고한다). LOPD180은 예시적인 PD-1 항체이다. PD-L1에 특이적으로 결합하고 그 활성(예컨대, PD-1 및/또는 CD80에 대한 결합)을 저해하는 항체는 항-종양 면역 반응의 강화에 유용하다. 항-PD-L1 항체는 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 하기 US 특허 공보: WO2007/005874에 대응하는 US20090055944(BMS/Medarex); WO01/14556에 대응하는 US2006/0153841(Dana Farber); US2011/0271358(Dana Farber); WO2010/077634에 대응하고 U.S. 특허 번호 8,217,149로 허여된 US2010/0203056(Genentech); US2012/0039906(INSERM); WO2012/145493에 대응하는 US20140044738(Amplimmune); US20100285039 (John's Hopkins University); 및 U.S. 특허 번호 8,779,108(MEDI4736)에 기재되어 있고, 그 각각은 본원에 참조로 포함된다.

MEDI4736은 PD-L1에 대해 선택적이고 PD-L1의 PD-1 및 CD80 수용체에 대한 결합을 차단하는 예시적인 항-PD-L1 항체이다. MEDI4736은 시험관내 인간 T-세포 활성화의 PD-L1-매개 억제를 완화시키고 T-세포 의존적 기전을 통해 이종이식편 모델에서 종양 성장을 저해할 수 있다.

본원에서 제공된 방법에서 이용하기 위한 MEDI4736(또는 이들의 단편)에 관한 정보는 US 특허 번호 8,779,108에서 확인될 수 있고, 그 개시는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. MEDI4736의 단편 결정형(Fc) 도메인은 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)의 매개에 관여되는 보체 성분 C1q 및 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키는 IgG1 중쇄의 불변 도메인 내에 3중 돌연변이를 함유한다.

본원에서 제공되는 방법에서 이용하기 위한 MEDI4736 및 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정한 양태에서, 본원에서 제공되는 방법에서 이용하기 위한 MEDI4736 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정한 양태에서, 본원에서 제공되는 방법에서 이용하기 위한 MEDI4736 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 상기에서 본원에 나타낸 Kabat-정의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상기에서 본원에 나타낸 Kabat-정의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함한다. 당업자는 당업자에게 공지된 Chothia-정의, Abm-정의, 또는 다른 CDR 정의를 쉽게 확인할 수 있을 것이다. 특정한 양태에서, 본원에서 제공되는 방법에서 이용하기 위한 MEDI4736 또는 이의 항원-결합 단편은, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 US 특허 번호 8,779,108에 개시된 바와 같은 2.14H9OPT 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 CDR 서열을 포함한다.

항-CTLA-4 항체

CTLA-4에 특이적으로 결합하고 CTLA-4 활성을 저해하는 항체는 항-종양 면역 반응의 증강에 유용하다. 본원에서 제공된 방법에서 이용하기 위한 트레멜리무맵(또는 이의 항원-결합 단편)에 관한 정보는 US 6,682,736에서 확인될 수 있고(11.2.1로 언급됨), 그 개시는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 트레멜리무맵(CP-675,206, CP-675, CP-675206, 및 티실리무맵으로도 알려져 있음)은 CTLA-4에 대해 고도로 선택적이고 CTLA-4의 CD80(B7.1) 및 CD86(B7.2)에 대한 결합을 차단하는 인간 IgG₂ 모노클로날 항체이다. 이는 시험관내 면역 활성화를 일으키는 것으로 나타났으며, 트레멜리무맵으로 치료받은 일부 환자는 종양 퇴행을 나타내었다.

본원에서 제공되는 방법에서 이용하기 위한 트레멜리무맵은 중쇄 및 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정한 양태에서, 본원에서 제공되는 방법에서 이용하기 위한 트레멜리무맵 또는 이의 항원-결합 단편은 본원에서 상기에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 본원에서 상기에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정한 양태에서, 본원에서 제공되는 방법에서 이용하기 위한 트레멜리무맵 또는 이들의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 상기에서 본원에서 나타낸 Kabat-정의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상기에서 본원에서 나타낸 Kabat-정의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함한다. 당업자는 당업자에게 공지된 Chothia-정의, Abm-정의, 또는 다른 CDR 정의를 쉽게 확인할 수 있을 것이다. 특정한 양태에서, 본원에서 제공되는 방법에서 이용하기 위한 트레멜리무맵 또는 이의 항원-결합 단편은, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 US 6,682,736에 개시된 바와 같은 11.2.1 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 CDR 서열을 포함한다.

다른 항-CTLA-4 항체는, 예를 들어, US 20070243184에 기재된다. 하나의 구현예에서, 항-CTLA-4 항체는 MDX-010; BMS-734016으로도 명명된 이필리무맵(Ipilimumab)이다.

항체

CTLA-4, PD-1, 또는 PD-L1에 선택적으로 결합하고 PD-1 및/또는 PD-L1의 결합 또는 활성화를 저해하는 항체가 본 발명의 방법에 유용하다.

일반적으로, 항체는, 예를 들어, 전통적 하이브리도마 기법(Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-499), 재조합 DNA 방법(U.S. 특허 번호 4,816,567), 또는 항체로 수행되는 파지 디스플레이, 라이브러리(Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597)를 이용하여 제조될 수 있다. 다른 항체 생산 기법에 대해서는 또한 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]을 참고한다. 본 발명은 임의의 특정한 원천, 기원 종, 생산 방법에 제한되지 않는다.

면역글로불린으로도 알려져 있는 온전한 항체는 전형적으로 각각 대략 25 kDa의 2개의 경쇄(L) 및 대략 50 kDa의 2개의 중쇄(H)로 이루어진 사량체성 글리코실화 단백질이다. λ쇄 및 κ쇄로 지칭되는 2가지 유형의 경쇄가 항체에서 확인된다. 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 5가지 주요 클래스: A, D, E, G, 및 M으로 할당될 수 있고, 이들 중 몇몇은 서브클래스(이소형), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가 구분될 수 있다.

상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배치는 당분야에 널리 공지되어 있다. 항체 구조의 리뷰를 위해서는 문헌[Harlow et al., 상기]을 참고하도록 한다. 간략하게, 각각의 경쇄는 N-말단 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)으로 이루어진다. 각각의 중쇄는 N-말단 가변 도메인(VH), 3개 또는 4개의 불변 도메인(CH), 및 힌지 영역으로 이루어진다. VH에 가장 인접한 CH 도메인이 CH1로 명명된다. VH 및 VL 도메인은 프레임워크 영역으로 불리는 4개 영역의 상대적으로 보존된 서열(FR1, FR2, FR3, 및 FR4)로 구성되며, 이는 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 3개 영역의 고가변 서열을 위한 골격을 형성한다. CDR은 항원과의 특이적 상호작용에 관여하는 대부분의 잔기를 함유한다. 3개의 CDR은 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 불린다. 이에 따라, 중쇄 상의 CDR 구성요소는 H1, H2, 및 H3으로 불리는 반면, 경쇄 상의 CDR 구성요소는 L1, L2, 및 L3으로 불린다. CDR3 및 특히 H3은 항원-결합 도메인 내의 가장 큰 분자 다양성의 원천이다. H3은, 예를 들어, 2개 아미노산 잔기만큼 짧을 수도 있고 또는 26개 잔기를 초과할 수도 있다.

Fab 단편(Fragment antigen-binding)은 불변 영역 간 디설파이드 결합에 의해 공유 결합된 VH-CH1 및 VL-CL 도메인으로 구성된다. 숙주 세포에서 공동-발현되는 경우 Fv에서 비-공유 결합된 VH 및 VL 도메인이 해리되는 경향을 극복하기 위해, 소위 단일쇄(sc) Fv 단편(scFv)이 구축될 수 있다. scFv에서, 가요성이고 적절한 길이의 폴리펩타이드는 VH의 C-말단을 VL의 N-말단으로, 또는 VL의 C-말단을 VH의 N-말단으로 결합시킨다. 가장 일반적으로, 15-잔기(Gly4Ser)3 펩타이드(SEQ ID NO: 27)가 링커로서 이용되지만, 다른 링커도 당분야에 공지되어 있다.

항체 다양성은 가변 영역을 인코딩하는 여러 생식계열 유전자 및 다양한 체세포 이벤트의 조합 조립의 결과이다. 체세포 이벤트에는 완전 VH 영역을 제조하기 위한 다양성(D)을 갖는 가변 유전자 절편 및 연결(J) 유전자 절편의 재조합 및 완전 VL 영역을 제조하기 위한 가변 및 연결 유전자 절편의 재조합이 포함된다. 재조합 공정은 그 자체가 부정확하여, V(D)J 접합부에서 아미노산 손실 또는 부가를 일으킨다. 이러한 다양성 기전은 항원 노출 전에 발달 중인 B 세포에서 일어난다. 항원 자극 후, B 세포에서 발현된 항체 유전자는 체세포 돌연변이를 거친다.

추산된 수의 생식계열 유전자 절편, 이들 절편의 무작위 재조합, 및 무작위 VH-VL 페어링에 기반하여, 최대 1.6×107의 상이한 항체가 생산될 수 있다(Fundamental Immunology, 3rd ed., ed. Paul, Raven Press, New York, N.Y., 1993). 항체 다양성에 기여하는 다른 공정(예컨대 체세포 돌연변이)을 고려하면, 1×1010개 이상의 상이한 항체가 잠재적으로 생성될 수 있다고 여겨진다(Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1995). 항체 다양성에 관여되는 여러 공정으로 인해, 독립적으로 생성된 항체는 CDR에서 동일하거나 심지어 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 가질 가능성이 매우 적다.

예시적인 항-CTLA-4, 항-PD-L1 및/또는 항-PD-1 CDR의 서열이 본원에서 제공된다. CDR을 수반하기 위한 구조는 일반적으로 항체 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 일부일 것이며, 여기서 CDR은 천연 생성 VH 및 VL의 CDR에 대응하는 위치에 배치된다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는, 예를 들어, 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, No. 91-3242, National Institutes of Health Publications, Bethesda, Md., 1991]에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.

본 발명의 항체(예를 들어, 항-CTLA-4, 항-PD-L1 및/또는 항-PD-1)는 선택적으로 항체 불변 영역 또는 이의 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 그 C-말단에서, 인간 Cκ 또는 Cλ쇄를 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인에 부착될 수 있다. 유사하게, VH 도메인에 기반하는 특정한 항원-결합 도메인은 임의의 항체 이소형, 예를 들어, IgG, IgA, IgE, 및 IgM 및 비제한적으로 IgG1 및 IgG4를 포함하는 임의의 이소형 서브-클래스에서 유래되는 면역글로불린 중쇄의 전부 또는 일부에 부착될 수 있다.

당업자는 본 발명의 항체가 CTLA-4, PD-L1 및 PD-1과 다소 상이한 단백질을 검출하고, 측정하고, 저해하기 위해 이용될 수 있음을 인식할 것이다. 표적 단백질이 본원에서 기재되는 적어도 100, 80, 60, 40, 또는 20개의 인접 아미노산의 임의의 서열과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 한, 항체는 결합 특이성을 보유할 것으로 예상된다. 동일성 백분율은 표준 정렬 알고리즘, 예를 들어, 문헌[Altshul et al. (1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410]에 기재된 BLAST(Basic Local Alignment Tool), 문헌[Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol., 48: 444-453]의 알고리즘, 또는 문헌[Meyers et al. (1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17]의 알고리즘에 의해 결정된다.

서열 상동성 분석에 부가하여, 에피토프 맵핑(예를 들어, Epitope Mapping Protocols, ed. Morris, Humana Press, 1996 참고) 및 이차 및 삼차 구조 분석이 수행되어 개시된 항체가 맡게 되는 특정한 3D 구조 및 이들과 항원의 복합체를 확인할 수 있다. 이러한 방법에는 비제한적으로 X-선 결정측정(Engstom (1974) Biochem. Exp. Biol., 11:7-13) 및 본원에서 개시된 항체의 실제 표시 컴퓨터 모델링이 포함된다(Fletterick et al. (1986) Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

유도체

본 발명의 항체(예를 들어, 항-CTLA-4, 항-PD-L1 및/또는 항-PD-1)에는 이들의 표적에 특이적으로 결합하는 능력을 포함하는 이들 서열의 변이형이 포함될 수 있다. 이러한 변이형은 당분야에 널리 공지된 기법을 이용하여 당업자에 의해 이들 항체의 서열로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환, 결실, 또는 부가가 FR 및/또는 CDR에서 수행될 수 있다. FR에서의 변화는 보통 항체의 안정성 및 면역원성을 개선하기 위해 설계되지만, CDR에서의 변화는 전형적으로 그 표적에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 설계된다. FR의 변이형에는 또한 천연 생성 면역글로불린 동종이형이 포함된다. 이러한 친화도 증가-변화는 CDR을 변형하는 단계 및 그 표적에 대한 항체 친화도를 평가하는 단계가 관여되는 일상적 기법에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 임의의 하나의 개시된 CDR 내에서 수행될 수 있다. 다양한 변형이 문헌[Antibody Engineering, 2nd ed., Oxford University Press, ed. Borrebaeck, 1995]에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 이들에는 비제한적으로 서열 내 기능적으로 동등한 아미노산 잔기를 인코딩하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변형되어 "침묵" 변화를 일으키는 뉴클레오타이드 서열이 포함된다. 예를 들어, 비극성 아미노산에는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌이 포함된다. 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민이 포함된다. 양으로 하전된(염기성) 아미노산에는 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘이 포함된다. 음으로 하전된(산성) 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함된다.

본 발명의 항체의 유도체 및 유사체는 재조합 및 합성 방법(Maniatis (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 및 Bodansky et al. (1995) The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed., Spring Verlag, Berlin, Germany)을 포함하는, 당분야에 널리 공지된 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다.

하나의 구현예에서, 본 발명의 VH 도메인의 아미노산 서열 변이형인 VH 도메인의 제조 방법은 본원에서 개시되는 VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산을 부가하거나, 결실하거나, 치환하거나, 삽입하는 단계, 선택적으로 이렇게 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하는 단계, 및 VH 도메인 또는 VH/VL 조합 또는 조합들을 항원에 대한 특이적 결합에 대해 평가하는 단계를 포함한다. 본원에서 개시된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이형이 하나 이상의 VH 도메인과 조합되는 유사한 방법이 채용될 수 있다.

유사한 셔플링 또는 조합 기법은 또한 β-락타마제 유전자에 관한 기법을 기재하지만 그 접근이 항체 생성을 위해 이용될 수 있음을 관찰하는 문헌[Stemmer (Nature (1994) 370: 389-391)]에 의해 개시된다.

추가 구현예에서, 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자의 무작위 돌연변이화를 이용하여 본원에서 개시된 서열로부터 유도되는 하나 이상의 서열을 수반하는 신규한 VH 또는 VL 영역을 생성할 수 있다. 이러한 기법의 하나인 오차-빈발(error-prone) PCR은 문헌[Gram et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89: 3576-3580)]에 기재된다.

이용될 수 있는 또 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR에 대한 돌연변이화를 지시하는 것이다. 이러한 기법은 문헌[Barbas et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1994) 91: 3809-3813) 및 Schier et al. (J. Mol. Biol. (1996) 263: 551-567)]에 의해 개시된다.

유사하게, 하나 이상의, 또는 모든 3개의 CDR이 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리 내로 그래프팅될 수 있고, 이어서 CTLA-4, PD-1 또는 PD-L1에 특이적인 항원-결합 단편에 대해 스크리닝된다.

면역글로불린 가변 도메인의 일부는 실질적으로 본원에서 나타내는 적어도 하나의 CDR, 및 선택적으로 본원에서 나타내는 scFv 단편으로부터의 개입 프레임워크 영역을 포함할 것이다. 이 부분에는 FR1 및 FR4 중 어느 하나 또는 둘 다의 적어도 약 50%가 포함될 수 있고, 이 50%는 FR1의 C-말단 50% 및 FR4의 N-말단 50%이다. 가변 도메인의 상당부의 N-말단 또는 C-말단 끝에서의 추가 잔기는 천연 생성 가변 도메인 영역과 정상적으로 연관되지 않는 것들일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기법에 의한 항체의 구축은 클로닝 또는 다른 조작 단계를 촉진하기 위해 도입된 링커에 의해 인코딩되는 N- 또는 C-말단 잔기의 도입을 일으킬 수 있다. 다른 조작 단계에는 면역글로불린 중쇄 불변 영역, 다른 가변 도메인(예를 들어, 디아바디의 생산에서), 또는 아래에서 추가로 상세히 논의되는 단백질성 표지를 포함하는 추가 단백질 서열에 가변 도메인을 연결하기 위한 링커의 도입이 포함된다.

당업자는 본 발명의 항체가 VL 또는 VH 도메인으로부터 하나의 CDR만을 함유하는 항원-결합 단편을 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 단일쇄 특이적 결합 도메인 중 어느 하나가, 예를 들어 CTLA-4, PD-L1 및 PD-1 중 2개에 결합할 수 있는, 2-도메인 특이적 항원-결합 단편을 형성할 수 있는 상보적 도메인에 대해 스크리닝하기 위해 이용될 수 있다.

본원에서 기재되는 본 발명의 항체(예를 들어, 항-PD-L1 및/또는 항-PD1)는 또 다른 기능적 분자, 예를 들어, 또 다른 펩타이드 또는 단백질(알부민, 또 다른 항체 등)에 결합될 수 있다. 예를 들어, 항체는 화학적 가교에 의해 또는 재조합 방법에 의해 결합될 수 있다. 항체는 또한, U.S. 특허 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; 또는 4,179,337에 나타낸 방식으로, 다양한 비단백질성 중합체 중 하나, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에 결합될 수 있다. 항체는, 예를 들어, 이들의 순환 반감기를 증가시키기 위해, 중합체에 대한 공유 접합에 의해 화학적으로 개질될 수 있다. 이들을 부착하기 위한 예시적인 중합체 및 방법은 또한 U.S. 특허 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285, 및 4,609,546에 나타난다.

개시되는 항체는 또한 원상태 패턴과 상이한 글리코실화 패턴을 갖도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 탄수화물 모이어티가 결실될 수 있고/있거나 하나 이상의 글리코실화 부위가 원래 항체에 부가될 수 있다. 본원에서 개시된 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가는 당분야에 공지된 글리코실화 부위 공통 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변형하여 달성될 수 있다. 항체 상에서 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 또 다른 수단은 항체의 아미노산 잔기에 대한 글리코사이드의 화학적 또는 효소적 커플링에 의한다. 이러한 방법은 WO 87/05330 및 문헌[Aplin et al. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259-306]에 기재된다. 항체로부터의 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는, 예를 들어 문헌[Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259: 52; 및 Edge et al. (1981) Anal. Biochem., 118: 131 및 Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol., 138: 350]에 기재된 바와 같이 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 항체는 또한 검출 가능한, 또는 기능적인, 표지로 태그화될 수 있다. 검출 가능한 표지에는 방사선표지, 예컨대 131I 또는 99Tc가 포함되며, 이는 또한 통상적 화학을 이용하여 항체에 부착될 수 있다. 검출 가능한 표지에는 또한 효소 표지, 예컨대 홀스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼린 포스파타제가 포함된다. 검출 가능한 표지에는 화학적 모이어티, 예컨대 바이오틴이 추가로 포함되며, 이는 특정한 검출 가능한 인지체 모이어티, 예를 들어, 표지된 애비딘에 대한 결합을 통해 검출될 수 있다.

CDR 서열이 본원에서 나타낸 것들과 약간만 상이한 항체는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 전형적으로, 아미노산은 유사한 전하, 소수성, 또는 입체화학적 특징을 갖는 관련 아미노산에 의해 치환된다. 이러한 치환은 당업자의 일반 기술 수준 내일 것이다. CDR에서와는 다르게, 항체의 결합 특성에 유해한 영향을 미치지 않고 FR에서 보다 실질적인 변화가 수행될 수 있다. FR에 대한 변화에는 비제한적으로, 항원 접촉을 위해 또는 결합 부위의 안정화를 위해 중요한 비인간-유래 잔기의 인간화 또는 특정 프레임워크 잔기의 조작, 예를 들어, 불변 영역 클래스 또는 서브클래스의 변화, 효과기 기능, 예컨대 Fc 수용체 결합을 변형할 수 있는, 예를 들어 U.S. 특허 5,624,821 및 5,648,260 및 문헌[Lund et al. (1991) J. Immun. 147: 2657-2662 및 Morgan et al. (1995) Immunology 86: 319-324]에 기재되는 특정한 아미노산 잔기의 변화, 또는 불변 영역이 유도되는 종의 변화가 포함된다.

당업자는 상술된 개질이 모든 것을 포괄하는 것이 아니며, 여러 다른 개질이 본 개시의 교시의 견지에서 당업자에게 자명할 것임을 이해할 것이다.

공동-치료법

본 발명의 조합, 예컨대 독소루비신 또는 독실 및 GITR 리간드(GITRL) 또는 OX40 융합 단백질, 또는 독소루비신 또는 독실 및 임의의 하나의 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 또는 본원에서 제공되는 이의 항원 결합 단편을 이용한 고체 종양 환자의 치료는 부가적 또는 상승적 효과를 일으킬 수 있다. 본원에서 이용되는 "상승적"이라는 용어는 단일 치료법의 부가 효과보다 더 효과적인 조합 치료법(예를 들어, 독소루비신 또는 독실 및 GITR 리간드(GITRL) 또는 OX40 융합 단백질, 또는 독소루비신 또는 독실 및 임의의 하나의 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 조합)을 나타낸다.

특정 구현예에서, 상승작용은 Bliss 독립 모델(Zhao et al.,. J Biomol Screen 2014;19(5):817-21)을 이용한 통계 분석에 의해 결정된다. 모델은 다음과 같이 기재된다. 약물 A 단독으로 인한 총 종양 퇴행 비율이

이고 약물 B 단독으로 인한 비율이

인 경우, 조합된 약물 A 및 약물 B로 인한 총 종양 퇴행의 예상 비율은, 두 약물이 bliss 독립적이라고 가정하면

이다. 관찰되는 총 종양 퇴행 비율

및 예상 비율 간 차이가 상승작용 지수로 정의된다:

이어서, 상승작용 지수의 분산은 다음과 같이 기재될 수 있다:

또한,

식에서,

,

, 및

는 조합 실험 및 두 단독치료법 실험의 각각의 샘플 크기이다. 두 약물은 다음과 같은 경우, 상승적인 것으로 언급된다:

식에서

는 표준 정상 분포의 95% 백분위수이다.

치료법 조합(예를 들어, 독소루비신 또는 독실 및 GITR 리간드(GITRL) 또는 OX40 융합 단백질, 또는 독소루비신 또는 독실 및 임의의 하나의 항-CTLA-4-항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 조합)의 상승적 효과는 하나 이상의 치료제의 더 낮은 투여량의 이용 및/또는 고형 종양 환자에 대한 상기 치료제의 덜 빈번한 투여를 허용한다. 더 낮은 투여량의 치료제를 이용하고/하거나 상기 치료법을 덜 빈번하게 투여하는 능력은 고형 종양의 치료에서 상기 치료법의 유효성을 감소시키지 않고 대상체에 대한 상기 치료제의 투여와 연관된 독성을 감소시킨다. 또한, 상승적 효과는 고형 종양의 관리, 치료, 또는 완화에서 치료제의 효능 개선을 일으킬 수 있다. 치료제 조합의 상승적 효과는 어느 하나의 단일 치료법의 이용과 연관되는 유해하거나 원치 않는 부작용을 회피하거나 감소시킬 수 있다.

공동-치료법에서, 독소루비신 또는 독실 및 GITR 리간드(GITRL) 또는 OX40 융합 단백질, 또는 독소루비신 또는 독실 및 임의의 하나의 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 조합은 선택적으로 동일한 약학 조성물에 포함될 수도 있고, 또는 별도의 약학 조성물에 포함될 수도 있다. 후자의 경우, 독소루비신 또는 독실을 포함하는 약학 조성물은 GITR 리간드, OX40 융합 단백질, 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물의 투여 이전에, 이와 동시에, 또는 이후에 투여하는 데 적합하다. 특정한 경우에, 독소루비신 또는 독실은 별도 조성물 중 GITR 리간드, OX40 융합 단백질, 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 또는 이의 항원-결합 단편과 중복되는 시간에 투여된다. MEDI4736 또는 이의 항원-결합 단편 및 트레멜리무맵 또는 이의 항원-결합 단편은 환자에게 이익을 제공하면서도 1회만 또는 빈번하지 않게 투여될 수 있다. 추가 양태에서, 환자에는 추가적인 후속 용량이 투여된다. 후속 용량은 환자의 연령, 체중, 임상 평가, 종양 부담, 및/또는 주치의의 판단을 포함하는 다른 요인에 근거하여 다양한 시간 간격으로 투여될 수 있다.

본원에서 제공되는 방법은 종양 성장을 감소시키거나 지연시킬 수 있다. 일부 양태에서, 감소 또는 지연은 통계적으로 유의미할 수 있다. 종양 성장의 감소는 기준선에서의 환자의 종양 성장, 예상되는 종양 성장, 대규모 환자군에 기반하는 예상되는 종양 성장, 또는 대조군의 종양 성장에 대한 비교에 의해 측정될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 생존을 증가시킨다.

키트

본 발명은 항-종양 활성을 증강시키기 위한 키트를 제공한다. 하나의 구현예에서, 키트에는 유효량의 독소루비신 또는 독실 및 하나 이상의 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, GITR 리간드, OX40 융합 단백질을 단위 투여량 형태로 함유하는 치료 조성물이 포함된다.

일부 구현예에서, 키트는 치료 조성물을 함유하는 멸균 용기를 포함한다; 이러한 용기는 상자, 앰플, 병, 바이알, 튜브, 가방, 파우치, 블리스터-팩, 또는 당분야에 공지된 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 라미네이트지, 금속 호일, 또는 약제 보유에 적합한 다른 물질로 제조될 수 있다.

바람직한 경우, 키트는 본 발명의 치료 조합의 투여 지침을 추가로 포함한다. 특정한 구현예에서, 지침에는 다음 중 적어도 하나가 포함된다: 치료제의 설명; 투여 일정 및 항-종양 활성을 증강시키기 위한 투여; 주의; 경고; 적응증; 반대 적응증; 과투여 정보; 유해 반응; 동물 약리; 임상 연구; 및/또는 참고문헌. 지침은 용기(존재하는 경우) 상에 직접, 또는 용기에 적용되는 표지로서, 또는 용기 내에 또는 이와 함께 공급되는 별도 시트, 팜플렛, 카드, 또는 폴더로서 인쇄될 수 있다.

본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적 기법을 채용하며, 이는 확실히 당업자의 수준 내에 속한다. 이러한 기법은 문헌, 예컨대 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)]에서 자세히 설명된다. 이들 기법은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 생산에 적용 가능하며, 이대로 본 발명의 수행 및 실시에서 고려될 수 있다. 특정한 구현에에 특히 유용한 기법은 후술되는 섹션에서 논의될 것이다.

하기 실시예는 본 발명의 검정, 스크리닝, 및 치료 방법을 어떻게 수행하고 이용하는지에 대한 전체 개시와 설명을 당업자에게 제공하기 위해 나타내며, 본 발명자들이 자신의 발명에 대해 간주하는 범위를 제한하려는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 체크포인트 저해제와 조합된 독실 또는 독소루비신의 처리가 상승적 항-종양 활성을 가졌다.

독소루비신 또는 독실이 항-종양 효과 IMT-C(암에 대한 면역-매개 치료법) 제제를 증강시킬 수 있다는 가설을 평가하기 위해, CT26 종양-보유 Balb/C 마우스를 다양한 용량의 이들 약물만으로 및 항-마우스 PD-1 및 항-CTLA-4 항체와의 조합으로 처리하였다. 이들 마우스를 예방적 방식으로 치료하고, 임의의 측정 가능한 종양 전에 처리하였다. 이것은 예방 연구였으므로, 본 환경에서 더 높은 용량이 강력한 항-종양 반응을 일으키는 것으로 알려져 있어서 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체의 투여를 낮추었다.

CT26 모델을 몇몇 연구에서 이용하였다. CT26 세포는 쥐과 결장암 세포이다. CT26 세포를 ATCC(Manassas, VA)에서 입수하였고, 10% 우태 혈청이 보강된 RPMI로 성장시켰다. 수령 후, 세포주를 STR-기반 DNA 프로필 분석 및 멀티플렉스 PCR(IDEXX Bioresearch, Columbia, MO)을 이용해서 재-입증하였다. 세포를 단층 배양으로 성장시키고, 트립신 처리에 의해 수확하고, 6~8주령 암컷 Balb/C(CT26), C57/Bl6(MCA205), 또는 4~6주령 무흉선 암컷 누드 마우스(Harlan, Indianapolis, IN)의 우측 넙다리 내로 피하 이식하였다. CT26 종양 모델에 있어서, 5 x 10⁵개 세포를 26-게이지 바늘을 이용해서 우측 넙다리에 이식하였다. 항체는 항-PD-1(RMP1-14), 항-PD-L1(10F.9G2), 항-CTLA-4(9D9), 및 마우스 IgG2b 대조군(MPC-11)으로부터 입수하였다. 마우스 OX40 융합 단백질(OX40 FP) 및 래트 IgG2a 이소형 대조군 항체는 MedImmune(Gaithersburg, MD)에서 생산하였다. 모든 항체 및 OX40 FP를 복강내 주사를 통해 투여하였다. 독실(Bluedoor Pharma, Rockville, MD) 및 독소루비신(Henry Schein, Melville, NY)을 정맥내 투여를 통해 투여하였다. 일부 연구에서, 이소형 대조군을 래트 IgG2a 및 마우스 IgG2b의 칵테일로 마우스에 투여하였다. 처리 시작 시, 마우스를 종양 부피별(확립-종양 연구) 또는 체중별(예방 연구) 무작위화하였다. 군 당 동물의 수는 nQuery 소프트웨어를 이용한 샘플 크기 계산에 기반하여 결정되는 군 당 10~12마리 동물의 범위였다. 종양 및 체중 측정을 모두 주 2회 수집하고, 종양 부피를 공식 (L x W²)/2를 이용해서 계산하였고, 식에서 L 및 W는 각각 길이 및 폭 치수를 나타낸다. 오차 막대는 평균의 표준 오차로 계산하였다. 마우스의 일반 건강을 매일 모니터링하고, 모든 실험을 인간 치료 및 실험실 동물 케어에 대한 AAALAC 및 MedImmune IACUC 가이드라인에 따라 수행하였다. Kaplan-Meier 통계 분석을 GraphPad Prism을 이용한 Log-순위 평가를 이용해서 수행하였다. Log-순위(Mantel-Cox) 평가를 이용해서 생존 곡선을 비교하였다(Prism 6.03). Bonferroni 방법을 이용하여 다중 비교를 위해 0.05 알파 수준을 조정하였다. 보고되는 p-값은 2-측 p-값이다.

독소루비신에 비해, 독실은 4 mg/kg 용량에서 더 강력한 항-종양 활성을 가졌다(표 1). 실제로, 그 MTD(5 mg/kg)에서 독실로 처리된 모든 마우스는 완전 반응(CR)을 가졌다. 1 mg/kg에서의 감소된 투여량의 독실은 4 mg/kg의 독소루비신과 거의 동등한 항-종양 활성을 가졌다(도 1C 및 1D). 항-PD-1 및 항-CTLA-4 처리는 단일 제제로서 중등도 내지 낮은 항-종양 활성을 가지는 반면(도 1E 및 1F), 두 항체는 모두 독소루비신 또는 독실과 조합된 경우 상승적 항-종양 효과를 나타내었다(도 1G~1J). 항-PD-1이 독소루비신(4 mg/kg)과 조합된 경우, 완전 반응체의 수는 2마리에서 8마리 동물로 증가하였다(도 1G). 유사하게, 항-CTLA-4와의 조합은 반응체의 수를 2마리에서 9마리 동물로 증가시켰다(도 1I). 항-PD-1 및 항-CTLA-4가 1 mg/kg의 독실과 조합된 경우, 유사한 결과가 수득되었다(도 1H 및 1J). 전체 연구에 있어서 군 당 완전 반응체의 수를 표 1에 나타낸다.

[표 1] PD-1 또는 CTLA -4 mAb와 조합된 독소루비신 또는 독실이 더 많은 수의 치유를 일으켰음. 도 1A~1J에서의 실험으로부터 모든 군의 완전 반응(CR) 수를 나타낸다. 독실이 독소루비신보다 더 활성이 높았다. PD-1 또는 CTLA-4와 조합된 독소루비신 또는 독실은 강력한 항-종양 반응을 일으켰다.

이들 데이터는 독소루비신 및 독실이 모두 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체와 상승적임을 나타내며, 리포좀 독소루비신의 이용이 자유 약물로서 IMT-C와 유사한 상승 활성을 가졌으므로, 상기 특징이 독소루비신 자체에 내재하는 것임을 시사한다.

연구 종료 시, 항-PD-1 항체 및 독소루비신(4 mg/kg)의 조합으로 처리된 마우스는 단일-제제 치료법에 비해 증가된 생존을 나타내었다(도 2A, p=0.005). 유사하게, 항-CTLA-4와 조합된 독소루비신(4 mg/kg) 또는 독실(1 mg/kg)은 임의의 단일 제제 단독에 비해 개선된 생존을 나타내었다(도 2B, p=0.012). 통계적으로 유의미하지는 않지만, 독실(1 mg/kg) + 항-CTLA-4 또는 항-PD-1 항체로 처리된 마우스도 본 연구에서 단일 제제 치료법으로 처리된 마우스보다 긴 생존을 갖는 경향을 보였다.

실시예 2. 단독으로 또는 체크포인트 저해제와 조합된 독실로의 처리가 종양-특이적 면역학적 메모리를 일으켰다.

단독으로 또는 항-PD-1 또는 항-CTLA-4과 조합된 독실 처리의 완전 반응을 수득한 마우스가 면역학적 메모리를 나타내었는지 여부를 결정하기 위해, 이들 동물을 최초 처리 70일 후 살아있는 CT26 세포로 재-유발접종하였다. CT26 세포가 10마리의 나이브, 미처리 마우스(도 3A) 중 모든 10마리에서 성장한 경우, 독실로 완전 반응을 달성한 마우스는 종양을 거부하는 10마리 마우스 중 9마리가 확산된 종양 거부를 나타내었다(도 3B). 독실 + 항-CTLA-4로 처리된 10마리 마우스 중 8마리 및 독실 + 항-PD-1로 처리된 9마리 마우스 중 9마리가 종양을 거부하였다(도 3C 및 3D). 이들 결과는 단일-제제로서의 독실뿐만 아니라 체크포인트 저해제와 조합된 독실을 이용한 처리가 종양-특이적인 면역학적 메모리를 생성하였음을 나타낸다.

실시예 3. 독실 항-종양 활성이 면역적격 대상체에서 관찰되었으며 T 세포가 관여되었다.

독실 및 독소루비신이 모두 예방적 CT26 종양 모델에서 활성이 있었으므로, 또한 이들 약물이 확립 CT26 종양의 제어에서 효과적인지 여부 및 이들 약물의 활성이 기능적 면역계의 존재 하에 상이한지 여부가 관심의 대상이었다. CT26 세포를 T 세포-결핍 무흉선 누드 마우스 및 면역적격 Balb/C 마우스 내로 모두 이식하고, 종양이 대략 200 mm³에 도달했을 때, 이들 약물의 최대 관용 용량으로 처리하였다.

본 실험에서, 독소루비신은 면역손상 또는 면역적격 마우스에서 항-종양 활성을 일으키지 않았다(도 4A 및 4B). 대조적으로, 독실 처리는 확립 CT26 종양을 보유하는 면역적격 마우스에서 강력한 항종양 활성을 나타내었지만(도 4B), 면역결핍 마우스에서 훨씬 더 작은 활성을 나타내어(도 4A), 독실 활성이 기능적 면역계의 존재 하에 증가되며, T 세포의 존재에 의존할 수 있음을 나타낸다.

다른 화학치료제가 유사한 결과를 달성할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 면역결핍 및 면역적격 CT26 종양-보유 마우스에 옥살리플라틴 또는 젬시타빈을 투여하였다. 옥살리플라틴은 이전 보고(Zhao et al. J Biomol Screen 2014;19(5):817-2)와 일치하게, 면역결핍 마우스에 비해(도 4E), 면역적격 마우스에서 증가된 항종양 활성을 나타내었다(도 4F). 대조적으로, 젬시타빈은 면역결핍뿐만 아니라 면역적격 마우스에서 모두 유의미한 항-종양 활성을 가졌다(도 4C 및 4D). 이들 결과는 특정한 화학치료법이 면역학적 세포사의 효율적 유도제임을 제시한 이전 연구와 일치하며(Obeid et al. Nat Med 2007;13(1):54-61), 또한 상기 특징이 생체내 젬시타빈에 의해 유지되지 않음을 최초로 드러낸다.

실시예 4. 독실은 다양한 면역조정제와 조합되는 경우, 항-종양 활성의 증강제이다.

독실과 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체의 조합이 CT26 모델에서 강한 항-종양 효과를 나타내었으나(도 1A~1J), 이것이 예방 연구이고 더 낮은 용량의 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체가 이용되었다는 것이 실험의 한계였다. 독실이 확립 종양 환경에서 IMT-C와 상승적으로 유지되는지 여부를 결정하기 위해, 종양이 약 200~300 mm³가 되었을 때, CT26 종양-보유 마우스를, 독실 단독으로 및 모두 최대 유효 용량으로 CTLA-4를 표적으로 하는 IMT-C 제제(항-CTLA-4(9D9), West Lebanon, NH), 항-PD-1(PD-1(RMP1-14), West Lebanon, NH), PD-L1(항-PD-L1(10F.9G2), West Lebanon, NH), OX40(마우스 OX40 융합 단백질, MedImmune, Gaithersburg, MD) 및 GITR(마우스 GITRL 리간드 융합 단백질, MedImmune, Gaithersburg, MD)과 조합하여 처리하였다(도 5A~5L). 이전 연구는 더 높은 용량의 이러한 항-마우스 IMTC-제제가 이러한 확립 종양 부피에서 더 큰 항-종양 유효성을 일으키지 않음을 나타내었다.

독실 처리는 종양 성장의 일시적 제어에 이은 빠른 종양 재성장을, 그리고 1건의 완전 반응만을 일으켰다(도 5B). OX40 FP, 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-CTLA-4 항체를 이용한 처리는 낮은 내지 중등도 활성을 나타내었고(도 5C~5F), 각 군에 소수의 완전 반응체가 있었다. 독실과 OX40 FP의 조합은 단일-제제 치료법에 비해 종양 진행까지의 시간을 증가시켰고, 통계적으로 유의미한 상승작용 경향을 보였다(도 5G). GITR 리간드는 단독으로 더욱 강력한 반응을 일으켰으며, 6/12가 완전 반응체였다(도 5G). 독실과 OX40 FP의 조합은 어느 한 단일 제제에 비해 활성의 중등도 증가를 일으켰다(도 5H).

놀랍게도, 항-PD-1, 항-PD-L1 및 항-CTLA-4 항체와 조합된 독실은 완전 반응체의 수에서 상승적 증가를 일으켰고, 각각 11/12, 9/12, 및 8/12이 치유되었다(도 5H~5J). 현저하게는, 독실 및 GITRL FP의 조합은 모든 마우스를 치유하여 12/12가 완전 반응을 나타내었다(도 5L). 이들 실험은 체크포인트 차단제와 조합된 독실이 확립-종양 환경에서도 항-종양 반응의 극적 증가를 일으킴을 나타내었다. 이는 독실 + PD-1, PD-L1 및 CTLA-4 항체의 조합으로 처리된 모든 마우스가 단일 제제 단독에 비해 더 길게 생존하였음을 나타내는 카플란-마이어 생존 곡선에서도 반영되었다(도 6A~6E).

실시예 5. 독실은 여러 면역조정제와 조합되는 경우, 항-종양 활성의 증강제이다.

CT26이 면역치료법에 고도로 민감하므로, 독실이 덜 민감한 모델인 MCA205에서 면역치료법의 활성을 증강시킬 수 있는지 여부를 결정하였다. 독실, 항-CTLA-4(9D9, West Lebanon, NH); 항-PD-1(RMP1-14, West Lebanon, NH); 항-PD-L1(10F.9G2, West Lebanon, NH); OX40 FP(마우스 OX40 융합 단백질(MedImmune, Gaithersburg, MD) 및 GITRL FP(마우스 GITR 리간드 융합 단백질, MedImmune, Gaithersburg, MD)를 종양 부피 100~150 mm³에서 시작하여 확립 MCA205 종양에 이들의 최대 유효 용량으로 투여하였다(도 7A~7L).

MCA205 세포는 Agonox(Portland, OR)에서 입수하였고, 10% 우태 혈청이 보강된 RPMI 중에 성장시켰다. 수령 후, 세포주를 STR-기반 DNA 프로필 분석 및 멀티플렉스 PCR(IDEXX Bioresearch, Columbia, MO)을 이용해서 재-입증하였다. MCA205는 섬유육종 종양 세포이다. MCA205 종양 모델에 있어서, 2.5 x 10⁵개 세포를 이식하였다. 모든 항체 및 OX40 FP를 복강내 주사를 통해 투여하였다. 독실(Bluedoor Pharma, Rockville, MD) 및 독소루비신(Henry Schein, Melville, NY)은 정맥내 투여를 통해 투여하였다. 일부 연구에서, 이소형 대조군은 래트 IgG2a 및 마우스 IgG2b의 칵테일로 마우스에 투여하였다. 처리 시작 시, 마우스를 종양 부피별(확립-종양 연구) 또는 체중별(예방 연구) 무작위화하였다. 군 당 동물의 수는 nQuery 소프트웨어를 이용한 샘플 크기 계산에 기반하여 결정되는 군 당 10~12마리 동물의 범위였다. 종양 및 체중 측정을 모두 주 2회 수집하고, 종양 부피를 공식 (L x W²)/2를 이용해서 계산하였고, 식에서 L 및 W는 각각 길이 및 폭 치수를 나타낸다. 오차 막대는 평균의 표준 오차로 계산하였다. 마우스의 일반 건강을 매일 모니터링하고, 모든 실험을 인간 치료 및 실험실 동물 케어에 대한 AAALAC 및 MedImmune IACUC 가이드라인에 따라 수행하였다. Kaplan-Meier 통계 분석을 GraphPad Prism을 이용한 Log-순위 평가를 이용해서 수행하였다. Log-순위(Mantel-Cox) 평가를 이용해서 생존 곡선을 비교하였다(Prism 6.03). Bonferroni 방법을 이용하여 다중 비교를 위해 0.05 알파 수준을 조정하였다. 보고되는 p-값은 2-측 p-값이다.

상기 모델에서, 독실은 종양 성장을 일시적으로 제어하였으나, 대부분의 종양이 재-성장하였다(도 7B). 한 마리 마우스가 독실 군에서 완전 반응을 달성하였다. OX40 FP, PD-1, GITRL FP 및 PD-L1 항체는 본 모델에서 최소 활성을 가졌으며 종양 진행에 일부 지연이 있었으나, OX40 FP 군에서는 1건의 완전 반응만 있었다(도 7C~7G). 항-CTLA-4 항체를 이용한 처리는 중등도 반응을 일으켜서 8/12의 마우스가 완전 반응을 달성하였다. 조합 치료의 경우, 독실과 OX40 FP 작동제의 조합은 독실 단독에 비해 종양 성장을 지연시키지 않았고, 또한 완전 반응의 유의미한 증가를 제공하지 않았다(도 7H).

대조적으로, 체크포인트 저해제 PD-1, PD-L1 및 CTLA-4에 대한 항체와 조합된 독실은 각각 9/12, 12/12, 및 12/12의 마우스가 완전 반응을 달성하는 놀라운 반응을 일으켰다(도 7I~7K). 이들 결과는 독실이 단일 제제로의 면역치료법에 민감하지 않은 모델에서 면역치료법의 항종양 효과를 증강시킴을 시사한다. 본 연구에서는 독실 처리에 비해 독실 + 항-PD-1, 항-PD-L1 및 항-CTLA-4 항체로 처리된 마우스에서 증가된 생존이 관찰되었다(도 8A~8E).

실시예 6 독실이 종양 Treg를 감소시키고, 세포독성 T 세포 증식을 유도하고, 종양 내 성숙 DC를 활성화하였다.

생체내 면역 세포 집단에 대한 독실의 임의의 효과를 규명하기 위해 역학적 연구를 수행하였다. MCA205-종양 보유 마우스를 독실, α-PD-L1 항체, 또는 조합으로 처리하고 종양 및 혈액을 수확하였다. MCA205 세포(2.5 x 10⁵)를 6~8주령 C57/Bl6 암컷 마우스의 우측 넙다리에 이식하였다. 종양이 평균 ~250 mm³에 도달했을 때, 마우스를 6개 군으로 무작위화하고, 독실(5 mg/kg); OX40 FP(20 mg/kg); α-PD-L1(20 mg/kg) 또는 독실과 OX40 FP 또는 α-PD-L1의 조합을 투여하였다(0일차). 두 번째 용량의 OX40 FP 및 α-PD-L1을 3일차에 제공하고, 독실을 7일차에 다시 제공하였다. 8일차에 모든 마우스를 안락사시키고 조직을 마우스로부터 수집하였다. 적혈구를 ACK 용액(Life Tech, Carlsbad, CA)으로 용해시켰다. 종양을 2 mm³ 조각으로 절단하고 200 units/mL의 콜라게나제 3형(Worthington, Lakewood, NJ) 및 0.25 mg/mL DNase(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)와 37℃에서 20분 동안 소화시켰다. 96웰 플레이트의 웰 당 1~2백만 개 세포를 로딩하고 Live Dead Blue(Life Tech, Carlsbad, CA)로 염색하고, FACS 완충액(PBS + 0.5% FBS 및 2 mm EDTA) 중 CD11b(BD Clone M1/70), CD11c(Biolegend Clone n418), CD80(Biolegend Clone 16-10A1), Ly6G(Biolegend Clone 1A8), Ly6C(Biolegend HK1.4), CD45(Ebioscience Clone 30-F11), MHC-II(Biolegend Clone M5/114.15.2), CD4(Biolegend Clone RM4-5), CD8(BD Clone RPA-T8), 및 FOXP3(Ebioscience Clone FJK-16S)에 대한 항체로 염색하였다. FOXP3 검출을 위해, FOXP3 전사 키트를 이용하였다(Ebioscience, San Diego, CA). 세포를 20분 동안 4℃에서 염색하고, 세척하고, 4% 파라포름알데하이드로 고정하였다. 샘플 데이터를 BD Fortessa(BD, San Jose, CA) 상에서 입수하였다. 데이터를 Flowjo(Treestar, Ashland, OR)를 이용해서 분석하였다.

독실, α-PD-L1 항체 또는 조합으로 처리된 MCA205-종양 보유 마우스에서, 독실은 혈중 CD8+ T 세포 퍼센트를 증가시켰고, 독실 및 P α-D-L1의 조합은 종양 내 CD8⁺ T 세포 퍼센트의 유의미한 증가를 일으켰다(도 9A 및 9B). 세포독성 T-세포에 부가하여, 독실 처리 결과 종양 침윤 Treg 양의 유의미한 감소가 관찰되었고, 이는 독실 및 항-PD-L1의 조합에 의해 추가 증강되는 것으로 보였다(도 9C).

T-세포 변화 원인을 조사하기 위해, 혈액 및 종양 내 골수구 분획의 표현형을 연구하였다. 혈액 및 종양 모두에서, 항-PD-L1 단독이 아닌 독실 및 독실 + 항-PD-L1이 성숙 수지상 세포를 나타내는 CD45⁺CD11c⁺MHCII^hi 세포 상에서 공동-자극 분자 CD80의 발현을 유도하였다(도 9D 및 9E). CD80 발현 수준은 독실 단독에 비해 조합 군에서 더 높은 경향을 보였다. 동시에, 독실 처리는 또한 혈중 CD45⁺CD11c⁺MHCII^hi세포 백분율을 증가시켰으며, 이는 항-PD-L1과 조합되는 경우 추가로 유의미하게 증가되었다(도 9F). 이는 독실이 성숙 수지상 세포 상의 CD80 수준을 증가시켰을 뿐만 아니라 이들 세포의 증식을 유도하였음을 나타낸다. 흥미롭게도, CD80의 독실-유도 상향조절 효과가 종양 내 CD45⁺CD11b⁺Ly6c⁺단핵구 MDSC 및CD45⁺CD11b⁺Ly6G⁺과립구 MDSC 상에서도 관찰되었다(도 9G 및 9H). 독실뿐만 아니라 독실 + 항-PD-L1도 종양 내 CD45⁺CD11b⁺Ly6c⁺세포 백분율을 증가시켰다(도 9I). 요약하면, 이들 결과는 생체내 독실이 종양 Treg를 감소시키고, 세포독성 T 세포 증식을 유도하고, 종양 내 성숙 DC를 활성화함을 나타내었다. 이들 발견은 항-PD-L1, 그리고 잠재적으로는 본 연구에서 또한 관찰되는 체크포인트 차단의 다른 매개체와 조합된 독실이 갖는 현저한 항-종양 효과와 일치하며 이에 대한 설명을 제공할 수 있다.

다른 구현예

상기 설명으로부터, 본원에서 기재된 발명에 다양한 이용 및 조건을 채택하여 변화 및 개질이 수행될 수 있음은 자명할 것이다. 이러한 구현예도 하기 청구범위의 범위 내이다.

본원에서 변수의 임의의 정의 내 요소 목록의 인용에는 임의의 단일 요소 또는 기재된 요소의 조합(또는 하위조합)으로서의 해당 변수의 정의가 포함된다. 본원에서 구현예의 인용에는 임의의 단일 구현예 또는 임의의 다른 구현예 또는 이의 일부와 조합된 구현예가 포함된다.

본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 공보는 각각의 독립적 특허 및 공보가 구체적이고 개별적으로 참조로 포함됨을 나타내는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> MEDIMMUNE LIMITED <120> THERAPEUTIC COMBINATIONS AND METHODS FOR TREATING NEOPLASIA <130> IMTC-200WO1 <140> <141> <150> 62/154,287 <151> 2015-04-29 <150> 62/078,238 <151> 2014-11-11 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140 Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 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ggtaataatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240 tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggtccggta 300 ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta 330 <210> 6 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 6 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Claims

대상체에서 항-종양 활성을 증가시키는 방법으로서, 독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태, 및 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 유전자(GITR) 리간드, 및 OX40 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 면역조정제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
대상체에서 항-종양 면역 반응을 증가시키는 방법으로서, 독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태, 및 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, GITR 리간드, 및 OX40 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 면역조정제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
대상체에서 종양을 치료하는 방법으로서, 독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태, 및 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, GITR 리간드, 및 OX40 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 면역조정제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태가 독실(Doxil®)인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
항-PD-L1 항체가 MEDI4736, BMS-936559, 또는 MPDL3280A인 방법.
제5항에 있어서,
항-PD-L1 항체가 MEDI4736인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
항-PD-1 항체가 LOPD 18, 니볼루맵, 펨브롤리주맵, 람브롤리주맵, MK-3475, AMP-224, 및 피딜리주맵인 방법.
제7항에 있어서,
항-PD-1 항체가 LOPD 18인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
항-CTLA-4 항체가 트레멜리무맵 또는 이필리무맵인 방법.
제9항에 있어서,
항-CTLA-4 항체가 트레멜리무맵인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
면역조정제가 GITR 리간드 또는 GITR 리간드 융합 단백질인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
면역조정제가 OX40 융합 단백질인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
종양이 결장 암종 또는 육종인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
방법이 임의의 하나의 독소루비신, 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태, 항 PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, GITR 리간드, 및 OX40 융합 단백질 단독의 투여에 비해 전반적 생존 증가를 일으키는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
종양-특이적 면역 반응을 유도하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
독소루비신 또는 독실이 항-PD-1 항체와 조합되어 투여되는 방법.
제16항에 있어서,
항-PD-1 항체가 LOPD 18, 니볼루맵, 펨브롤리주맵, 람브롤리주맵, MK-3475, AMP-224, 또는 피딜리주맵인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
독소루비신 또는 독실이 항-PD-L1 항체와 조합되어 투여되는 방법.
제18항에 있어서,
항-PD-L1 항체가 MEDI4736, BMS-936559, 또는 MPDL3280A인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
독소루비신 또는 독실이 항-CTLA-4 항체와 조합되어 투여되는 방법.
제20항에 있어서,
항-CTLA-4 항체가 트레멜리무맵 또는 이필리무맵인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
독소루비신 또는 독실이 GITR 리간드 또는 GITR 리간드 융합 단백질과 조합되어 투여되는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
독소루비신 또는 독실이 OX40 융합 단백질과 조합되어 투여되는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
독소루비신, 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, GITR 리간드, 또는 OX40 융합 단백질의 투여가 정맥내 주입에 의하는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태 및 면역조정제가 동시에 투여되는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태가 면역조정제 전에 투여되는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
면역조정제가 독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태 전에 투여되는 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
대상체가 인간 환자인 방법.
항-종양 활성을 증가시키기 위한 키트로서, 독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태, 및 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, GITR 리간드, 및 OX40 작동제로 구성되는 군으로부터 선택되는 면역조정제를 포함하는 키트.
제28항에 있어서,
제1항의 방법에서 키트의 이용 지침을 추가로 포함하는 키트.
독소루비신 또는 독소루비신의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포좀 캡슐화 형태의 유효량, 및 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, GITR 리간드, 및 OX40 작동제로 구성되는 군으로부터 선택되는 면역조정제의 유효량을 포함하는 약학 제형물.
제31항에 있어서,
항-CTLA-4 항체가 트레멜리무맵 또는 이필리무맵인 방법.
제31항에 있어서,
항-PD-1 항체가 LOPD 18, 니볼루맵, 펨브롤리주맵, 람브롤리주맵, MK-3475, AMP-224, 또는 피딜리주맵인 방법.
제31항에 있어서,
항-PD-L1 항체가 MEDI4736, BMS-936559, 또는 MPDL3280A인 방법.