TW201936927A - 用於低濃度核酸樣品的測量方法 - Google Patents

用於低濃度核酸樣品的測量方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種用於低濃度核酸樣品的測量方法。所述測量方法是一種對qPCR實驗中待測樣品處於低濃度核酸範圍的核酸定量方法，本方法藉由修正原始Cq值以延伸實驗檢測的線性動態範圍並增加偵測靈敏度。所述方法包括以下步驟，提供具有多個反應孔的測試載具，以對核酸樣品進行qPCR反應，接著根據以陽性反應孔的數目所得到的陽性孔量測值進行調整步驟，以修正所述qPCR反應Cq值至預期的線性範圍表現值。

Description

用於低濃度核酸樣品的測量方法
本發明是有關於一種測量方法，且特別是有關於一種用於低濃度核酸樣品的測量方法。
在目前所使用的高密度陣列形式qPCR系統（high-density array format qPCR system）中，大多具有低敏感度的問題。在待測樣品中核酸物質濃度較低時，因使用高密度的陣列形式qPCR，低濃度樣品不足以分配至每個反應孔，Cq值（量化反應循環數，quantification cycle）的線性範圍會受到每個反應孔中的單一拷貝數（single copy number）影響，使得所述qPCR反應的Cq值趨於一固定數值，造成低濃度範圍無偵測分辨力。此外，待測的核酸樣品中，核酸標靶可能具有相距甚廣的濃度範圍，此現象在臨床樣品中尤其常見，其中若存在濃度較低的核酸標靶，則有很大的機率出現上述問題。
舉例而言，圖1是習知的平均Cq值與所輸入的Log cDNA稀釋液的曲線關係圖。請參照圖1，可得知當平均Cq值為8至26時，平均Cq值與所投入的Log cDNA稀釋液（Log濃度於4至10）之間可維持線性關係（Cq穩定區域，Cq stable zone），動態範圍（dynamic range）約為6 logs。然而，在低濃度區域中，低樣本濃度因為分配於每個反應孔時平均己低於單一拷貝，Cq值傾向於成為一定值，而不再呈現線性關係。此時，每個孔洞中的平均拷貝數較低（例如小於1個拷貝或分配不平均，因此，Cq值的可靠性也受到不良影響，定量限制（limit of quantitation，LoQ）約為每個反應孔5至50個拷貝數。在呈現線性關係的條件下，才能夠順利進行qPCR檢測，否則可能會導致不準確性的問題。
在現有技術中，主要是透過前置放大（pre-amplification）來試著解決上述問題，藉由14至20個循環來將樣本數增加至104 倍以上，以移動至呈現線性關係的Cq穩定區域。然而，由於同一檢測中樣本通常同時含有多個核酸標靶，此方法可能無法在每個檢測中同時將樣本中的不同核酸標靶等倍數放大，而造成最終量測結果與初始狀態不一定相等的缺陷。
基於上述，如何於待測核酸樣品的低濃度範圍修正Cq值以改善即時定量聚合酶鏈式反應（qPCR）的穩定性及敏感性，並延伸動態範圍，進而適用於具有多樣濃度範圍的不同核酸標靶的樣品，為目前所需研究的重要課題。
本發明提供一種用於核酸樣品的測量方法，能夠改善qPCR的穩定性及敏感性，並延伸動態範圍，適用於具有多樣濃度範圍的不同核酸標靶的樣品。
本發明用於核酸樣品的測量方法包括以下步驟。提供具有多個反應孔的測試載具，以對核酸樣品進行qPCR反應。接著，根據以陽性反應孔數目所得到的陽性孔量測值，當陽性孔量測值表示樣品濃度小於一定值時，進行調整步驟以修正原始Cq值。
在本發明的一實施例中，調整步驟包括以下步驟。先得到qPCR反應效率，例如以核酸模板濃度為橫軸，原始Cq值為縱軸繪圖並取得斜率，此斜率可轉換為qPCR效率之後，將斜率乘以log(陽性孔量測值)，再加上原始Cq值，以取得經修正的Cq值。
在本發明的一實施例中，依此測量方法使用64個反應孔數目進行qPCR反應。
在本發明的一實施例中，核酸樣品含有多於一種的核酸標靶，且核酸標靶具有不同的濃度範圍。
在本發明的一實施例中，使用64個反應孔數目並經調整步驟後，動態範圍提高至9 logs。
在本發明的一實施例中，核酸模板濃度與經修正Cq值的相關係數R2 為0.98以上。
在本發明的一實施例中，陽性孔量測值為將陽性反應孔數目除以全部反應孔數目以得到陽性反應孔的比例值，再代入卜瓦松分布以得到每個反應孔的平均樣本拷貝數目，即為陽性孔量測值。
在本發明的一實施例中，當每個反應孔的平均樣本拷貝數目(陽性孔量測值)小於1時，進行調整步驟以修正原始Cq值。
在本發明的一實施例中，陽性孔量測值為將陽性反應孔數目除以全部反應孔數目所得到的比例值，即為陽性孔量測值。
在本發明的一實施例中，當陽性反應孔的數目除以全部反應孔數目(陽性孔量測值)所得到的比例值低於95%時，進行調整步驟以修正所述原始Cq值。
基於上述，本發明提出一種用於核酸樣品的測量方法，能夠針對濃度較低的核酸標靶調整Cq值，改善qPCR的靈敏度，並延伸動態範圍。更具體而言，本發明能夠使動態範圍由約6 logs（Cq值為約6至25）提高至約9 logs（Cq值為約6至35）。
為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。
本發明提供一種用於核酸樣品的測量方法。下文中，先針對說明書內文所使用的名詞加以定義說明。
｢qPCR」或｢real-time quantitative PCR」（即時定量聚合酶鏈鎖反應）是指使用PCR以擴增並同時定量目標DNA的實驗方法。利用多種測定化學物質來進行定量(包括諸如SYBR® green的螢光染料或Taqman探針的螢光報告寡核苷酸探針等)，隨著每次擴增循環之後反應中積累的擴增DNA來對其進行即時定量。
｢cDNA」（complementary DNA，互補DNA）是指利用逆轉錄酶對RNA模板進行逆轉錄所產生的互補DNA。
｢Cq值」為qPCR操作流程中，開始顯著地增加螢光強度時的擴增循環數目。
「樣品」是指被測試的核酸樣品。例如，樣品可以是從血液、組織、唾液等來源中提取的核酸片段（包括DNA或RNA等）。模板(template)是指有具體序列的DNA或RNA或微RNA鏈，也被稱為生物標記並且可以經由qPCR反應來檢測。
｢陽性反應孔」是指在qPCR反應呈現陽性結果的反應孔，｢陰性反應孔」是指在qPCR反應呈現陰性結果的反應孔。
具有多個反應孔的測試載具是指具有多個反應孔的載片板，其中每個反應孔用來進行qPCR反應。
本發明提供一種用於核酸樣品的測量方法，先提供具有多個反應孔的測試載具，以對核酸樣品進行qPCR反應，核酸樣品可含有一種以上的核酸標靶。當核酸樣品含有多於一種的核酸標靶時，各核酸標靶的濃度範圍可能不同，甚至差異甚大。將測試載具中的反應孔個別地分配，以一次性地測量具有多樣濃度範圍的不同類型的核酸模板。在本實施例中，例如是使用64個反應孔數目進行qPCR反應。
圖2是依照本發明的用於核酸樣品的測量方法的機制示意圖。如圖2所示，可得知本發明的主要機制是將低濃度區域中趨於定值的Cq值調整回到線性關係。更詳細而言，本發明是根據陽性反應孔的數目(positive well number)，獲得陽性孔量測值，當此量測值表示樣品處於低濃度時，進行調整步驟以修正原始Cq值。
在本發明中，陽性孔量測值包括但不限於以下二種，第一種是根據卜瓦松分布(Poisson Distribution)得到的每個反應孔的平均樣本拷貝數目，將陽性反應孔數目除以全部反應孔數目以得到所述陽性反應孔的比例值，再代入卜瓦松分布以得到每個所述反應孔的平均樣本拷貝數目，即為一種陽性孔量測值。當每個反應孔的平均樣品拷貝數目(陽性孔量測值)低於1時，進行調整步驟以修正原始Cq值。第二種是陽性反應孔佔所有反應孔的比例值，將陽性反應孔的數目除以全部反應孔數目所得到的比例值，即為一種陽性孔量測值。當陽性反應孔的比例低於所有反應孔的95%時，進行調整步驟以修正原始Cq值。
在本實施例中，陽性孔量測值可以是每個反應孔的平均樣本拷貝數目，如下所述：將陽性反應孔數目除以全部反應孔數目以得到陽性反應孔的比例值，再代入卜瓦松分布以得到每個反應孔的平均樣本拷貝數目。卜瓦松分布如下： λ=-ln(1-k/n) 其中λ表示每個反應孔的平均樣本拷貝數目，n代表全部反應孔數目，k代表陽性反應孔的數目。
當每個反應孔的平均樣本拷貝數目(陽性孔量測值)小於1時，進行調整步驟以修正原始Cq值，以使低濃度區域中趨於定值的原始Cq值修正回到線性關係。舉例而言，調整步驟可包括：以核酸模板濃度為橫軸，原始Cq值為縱軸繪圖並取得斜率（此斜率與PCR效率相關），將斜率乘以log(陽性孔量測值)，再加上原始Cq值，以取得經修正Cq值。如此一來，便可如圖2所示，將低濃度區域中趨於定值的原始Cq值調整成經修正Cq值，以趨近於預期的線性關係。
在本實施例中，陽性孔量測值可以是陽性反應孔所佔的比例值，其中將陽性反應孔的數目除以全部反應孔數目以得到比例值，如下所述： μ=k/n 其中n代表全部反應孔數目，k代表陽性反應孔的數目。 當陽性反應孔的數目在全部反應孔數目中所佔的比例值小於95%時，進行調整步驟以修正原始Cq值，方式如上所述。
透過本發明的用於核酸樣品的測量方法，使用64個反應孔數目並經調整步驟後，動態範圍可由約6 logs（Cq值為約6至25）提高至約9 logs（Cq值為約6至35）。此外，核酸模板濃度與經修正Cq值的相關係數R2 為0.99以上。
以下，藉由實驗例來詳細說明上述各設計方法。然而，下述實驗例並非用以限制本發明。實驗例
為了證明本發明所提出的用於核酸樣品的測量方法能夠修正Cq值，提升qPCR的靈敏度及準確性，以下特別作此實驗例，其中包含以pUC57 cDNA核酸樣品進行的實例1以及以人類參考RNA（Human reference RNA）核酸樣品進行的實例2。Cq 值、相關係數 R2 評估 ( 實例 1)
以pUC57 cDNA核酸樣品進行序列稀釋，量測核酸標靶的樣本濃度、原始Cq值以及修正Cq值列於表1與圖3。如圖3所示，前6個測量點的Cq與樣本濃度呈現高度相關性(樣本濃度取log10後於9, 8, 7, 6, 5, Cq 5~25之間)，圖3中最低的3個測量點(樣本濃度取log10後為3,2,1)，每個反應井的平均濃度己經低於單一拷貝數目，故Cq值趨近一固定數值(本例中約為26)，故相關係數不高(R2 值為0.93)，在經本發明的方法修正最後三個測量點的Cq之後，R2 提升至0.99。在本例中動態範圍由6個log(Cq5~25)提升至9個log(Cq5~35)。表 1 Cq 值、相關係數 R2 及 PCR 效率評估 ( 實例 2)
以人類參考RNA（Human reference RNA）核酸樣品進行序列稀釋，在具有多個反應孔的測試載片進行qPCR反應，此核酸樣品含有Beta-Actin、HER2、PD-1及c-Met等多種不同濃度範圍的核酸標靶。量測各核酸標靶的原始Cq值、相關係數R2 及PCR效率，量測結果列於表2中。
在表2中，以PD-1為例，在300ng時Cq值為24.44，稀釋4倍成75ng時Cq值增加2.91成為27.35，但是在9.38ng之後的4倍稀釋中，Cq值只微量增加(例如由30.06增加至30.11只增加了0.05)，由於後半段的Cq值並沒有依比例增長，所以全部稀釋與Cq值之間的相關係數只有0.919。之後，再將陽性反應孔數目之比例值（陽性反應孔數目/全部反應孔數目=陽性反應孔數目比例值）代入卜瓦松分布得到每個反應孔的平均拷貝數(Copies per well, c/w)，即為陽性孔量測值。再以本發明的機制，當每個反應孔的平均拷貝數目(陽性孔量測值)小於1時，進行調整步驟以修正原始Cq值，經修正Cq值、相關係數R2 及PCR效率列於表3中。此外，將陽性反應孔的數目除以全部反應孔數目所得到的比例值作為陽性孔量測值，當此比例值低於95%時，進行調整步驟以修正原始Cq值，經修正Cq值、相關係數R2 及PCR效率列於表4中。表 2
如上方表2所示，Beta-Actin的基因表現量較大，相關係數R2 為0.999，PCR效率為81%，且每個反應孔的平均拷貝數目並未小於1，Cq值呈現線性關係，故不需調整。相較之下，HER2、PD-1及c-Met的在較後段的4倍稀釋中Cq值趨於定值，每個反應孔的平均拷貝數目小於1，且相關係數R2 偏低，PCR效率也不佳，故需要藉由本發明的機制進行調整。表 3 表 4
如上方表3以及表4所示，針對HER2、PD-1及c-Met進行調整步驟以修正原始Cq值後，相關係數R2 可提升至0.98以上。同時，也可使原本趨於定值的Cq值調整回到線性關係，進而提升qPCR的靈敏度及準確性。
綜上所述，本發明提出一種用於核酸樣品的測量方法，利用qPCR的實驗資訊修正Cq值，提升qPCR的靈敏度及準確性，並延伸動態範圍，且改善現有技術中低濃度範圍核酸樣品偵測準確性問題的缺點。由於本發明可針對濃度較低的核酸標靶進行Cq值調整，使趨於定值的Cq值修正回到線性關係，以延伸檢測動態線性範圍，因此，適用於具有多樣濃度範圍的不同核酸標靶的樣品，尤其是臨床樣品。
雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
無。
圖1是習知的平均Cq值與所投入的Log cDNA稀釋液的曲線關係圖。 圖2是依照本發明的用於核酸樣品的測量方法的機制示意圖。 圖3是pUC57 cDNA核酸樣品的平均Cq值與樣品濃度的曲線關係圖。

Claims (10)

  1. 一種用於核酸樣品的測量方法，包括： 提供具有多個反應孔的測試載具，以對核酸樣品進行qPCR；以及 根據以 陽性反應孔的數目所得到的陽性孔量測值，進行調整步驟以修正原始Cq值。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的用於核酸樣品的測量方法，所述調整步驟包括： 以核酸模板濃度為橫軸，所述原始Cq值為縱軸繪圖並取得斜率；以及 將所述斜率乘以log (陽性孔量測值)，再加上所述原始Cq值，以取得經修正Cq值， 其中所述斜率與PCR效率相關。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的用於核酸樣品的測量方法，其中所述核酸樣品含有多於一種的核酸標靶，且所述核酸標靶具有不同的濃度範圍。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的用於核酸樣品的測量方法，其中使用64個反應孔數目進行qPCR反應。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的用於核酸樣品的測量方法，其中使用64個反應孔數目並經所述調整步驟後，動態範圍提高至9 logs。
  6. 如申請專利範圍第2項所述的用於核酸樣品的測量方法，其中所述核酸模板濃度與所述經修正Cq值的相關係數R2 為0.98以上。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的用於核酸樣品的測量方法，其中所述陽性孔量測值為將陽性反應孔數目除以全部反應孔數目以得到所述陽性反應孔的比例值，再代入卜瓦松分布以得到每個所述反應孔的平均樣本拷貝數目。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的用於核酸樣品的測量方法，其中當每個所述反應孔的所述平均樣本拷貝數目小於1時，進行所述調整步驟以修正所述原始Cq值。
  9. 如申請專利範圍第1項所述的用於核酸樣品的測量方法，其中所述陽性孔量測值為將所述陽性反應孔的數目除以全部反應孔數目所得到的比例值。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的用於核酸樣品的測量方法，其中當所述陽性反應孔的數目除以所述全部反應孔數目所得到的比例值低於95%時，進行所述調整步驟以修正所述原始Cq值。
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