TW201932100A - Ｒｎａ奈米結構及製備與使用ｒｎａ奈米結構之方法 - Google Patents

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Abstract

某些實施例提供RNA奈米結構(例如，包含一種單鏈RNA(ssRNA)分子，其中該RNA奈米結構包含至少一個平行內聚交叉)，以及其組合物及使用方法。在某些實施例中，該等RNA奈米結構具免疫刺激性或免疫調節性。

Description

RNA奈米結構及製備與使用RNA奈米結構之方法
資訊承載聚合物自折疊成具有確定結構及功能之緻密粒子(例如，多肽折疊成蛋白質)為生物學之基礎且作為合成策略提供有吸引力的潛力。過去三十年來，核酸已用於建立多種複雜奈米級形狀及器件。特定言之，多條DNA鏈已經設計成在長骨架鏈之幫助下或在無幫助下自組裝成使用者規定之結構。近年來，RNA亦已作為獨特、可編程材料出現。然而，此等奈米結構通常含有數打或數百種不同組分且通常具有不合需要之缺陷，諸如缺失或不正確地併入或合成之組分鏈。另外，歸因於組分之數目，此等奈米結構通常並非可複製或具有成本效益的。
因此，需要新類型之核酸奈米結構。特定言之，需要新類型之RNA奈米結構。
某些實施例提供包含一種單鏈RNA(ssRNA)分子之RNA奈米結構，其中該ssRNA分子形成至少一個平行內聚交叉，且其中該RNA奈米結構具有免疫刺激(或免疫調節)特性。如本文所用，術語「單鏈RNA」或「ssRNA」係指在變性條件下呈單鏈之RNA分子。在替代條件下，該RNA分子可自形成二級結構(例如，複雜二級結構)。
某些實施例提供包含一種單鏈RNA(ssRNA)分子之RNA奈米結構， 其中該ssRNA分子包含複數個雙螺旋區及至少一個可操作性連接於兩個雙螺旋區之間的平行交叉，且其中該RNA奈米結構具有免疫刺激特性。
某些實施例提供包含與SEQ ID NO：1具有至少約75%序列一致性之核酸序列之RNA奈米結構。
某些實施例提供一條RNA單鏈，其經合理設計以自組裝成包含至少一個平行內聚交叉之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構具有免疫刺激特性。
某些實施例提供一種誘導個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構或組合物。
某些實施例提供一種增強/增加個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之促發炎細胞因子之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量的如本文所述之RNA奈米結構或組合物。某些實施例提供一種藉由個體(例如哺乳動物，諸如人類)中TLR3信號傳導路徑之特異性觸發來活化免疫細胞之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量的如本文所述之RNA奈米結構或組合物。
某些實施例提供一種減慢或抑制個體中之腫瘤生長之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量的如本文所述之RNA奈米結構或組合物。
某些實施例提供一種提高個體中抗腫瘤促發炎細胞因子之水準之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量的如本文所述之RNA奈米結構或組合物。
某些實施例提供一種減少個體中抗發炎細胞因子之水準之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量的如本文所述之RNA奈米結構或組合物。
某些實施例提供一種治療個體之疾病或病症之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量的如本文所述之RNA奈米結構或組合物。
在某些實施例中，欲治療之疾病或病症為過度增生性病症，包括腫 瘤、癌症及贅瘤組織，連同惡性前及非贅瘤或非惡性過度增生性病症。
某些實施例提供如本文所述之RNA奈米結構或組合物用於製造用於誘導個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之免疫反應的藥劑之用途。
某些實施例提供用於誘導免疫反應之如本文所述之RNA奈米結構或組合物。
某些實施例提供如本文所述之RNA奈米結構或組合物用於製造用於治療個體之疾病或病症的藥劑之用途。
某些實施例提供用於預防性或治療性治療疾病或病症之如本文所述之RNA奈米結構或組合物。
某些實施例提供一種套組，其包含如本文所述之RNA奈米結構或組合物及關於向個體投與該RNA奈米結構/組合物以誘導免疫反應或治療疾病或病症之說明書。
某些實施例亦提供適用於製備本文所述之RNA奈米結構之製程。在一些實施例中，該等方法包含在導致形成奈米結構之條件下培育一或多種RNA分子。
圖1A-1E。RNA ssOrigami。(A)關於8-8-9-8 RNA ssOrigami設計之設計示意圖。螺旋域及鎖定域分別以矩形及交叉線表示。底部軸示出了以鹼基對之量計各域之長度。(B)示出了有義及反義RNA ssOrigami結構之合成之示意圖。(C-E)使用(A)中之8-8-9-8設計的1868-nt矩形形狀(C及D)及6337-nt 9×9菱形形狀(E)RNA ssOrigami之示意圖(頂部)及AFM圖像(底部)。有義鏈(D)及反義鏈(E)矩形ssOrigami均根據(B)中描繪之工作流構建。
圖2A-2B。(A)矩形ssRNA及(B)9×9 ssRNA變性瓊脂糖凝膠圖像。活體外轉錄之RNA經純化且裝載於甲醛瓊脂糖凝膠上。
圖3。圖1C(8-8-9-8)之RNA ssOrigami結構之熔解分析。加熱及冷卻曲線之原始數據(A260對溫度)曲線，以及A260之一階導數隨溫度而變之曲線。
圖4。具有8 bp鎖定域之矩形RNA ssOrigami之設計詳情。暗鏈為正向鏈且明鏈為反向鏈。
圖5。具有8 bp鎖定域之含有6337 nt的9×9 RNA ssOrigami之設計詳情。紅色鏈為正向鏈且灰色鏈為反向鏈。
圖6。RNA折紙示意圖(左側圖)及AFM圖像(右側圖)。含有ssRNA折紙基因之質體經線性化且該ssRNA使用T7 RNA聚合酶經活體外轉錄。經純化RNA分子經由平行內聚交叉自組裝成ssRNA矩形折紙奈米結構。
圖7。核酸酶抗性。自組裝之RNA折紙抵抗RNase I消化，而未組裝之RNA分子可容易地由RNase I消化。泳道1表示1kb dsDNA標記物。1μg未組裝之RNA分子在室溫下不用RNase I處理(泳道2)或用1 U RNase I處理持續10min或30min(泳道3及4)。自組裝之RNA折紙亦在室溫下不用RNase I處理(泳道5)或用1 U RNase I處理持續10min或30min(泳道6及7)。形成高度穩定RNA矩形(RNA-Rec)，其甚至在無陽離子之情況下亦具有完整結構且抵抗RNase。
圖8。離體脾細胞刺激：T細胞中之CD69活化。RNA折紙活化CD8及CD4 T細胞。對CD4 T細胞及CD8 T細胞中之CD69+細胞百分率繪製曲線。PBS：磷酸鹽緩衝生理食鹽水，LPS：脂多糖；PMB：多黏菌素B；肌苷_1：肌苷併入性RNA折紙。關於各分組，CD4T細胞在左側示出且CD8 T細胞在右側示出。
圖9。離體脾細胞刺激：樹突狀細胞中之CD86活化。RNA折紙活化抗原呈現細胞(DC及漿細胞樣DC(pDC))。對各細胞群體中CD86之平均螢光 強度繪製曲線。
圖10。在刺激時離體脾細胞細胞培養物上清液中之細胞因子釋放。RNA-Rec誘導自經刺激之管細胞產生IFN-α及IFN-β。I型干擾素自經刺激之脾細胞活體外產生。
圖11。注射RNA折紙之小鼠中之血清細胞因子。與活體外刺激時之發現相似，經由眶後途徑靜脈內注射RNA折紙導致IFNa/b之短暫提高。
圖12。對腫瘤細胞活力之影響。在三天培育之後，發現RNA折紙活體外降低小鼠乳癌細胞株4T1之活力。延遲之抑制效應可能已經由在該等腫瘤細胞暴露於RNA折紙之後由該等腫瘤細胞產生促發炎細胞因子而經介導。RNA折紙對活體外測試之某些其他小鼠及人類腫瘤細胞株(未示出)之活力施加極少或最小影響。在各分組內，自左至右包括以下：NT(無治療)、RNA(RNA折紙)5μg/ml、RNA(RNA折紙)0.5μg/ml、RNA(RNA折紙)0.05μg/ml、PolyIC 5μg/ml、PolyIC 0.5μg/ml、PolyIC 0.05μg/ml+(喜樹鹼)。
圖13。TLR3促效劑。RNA折紙在報告基因細胞株HEK-BlueTM-mTLR3細胞中作為TLR3促效劑示出，儘管其活性不如polyIC強。
圖14。活體內抗腫瘤免疫性。用A20-iRFP模型追蹤活體內腫瘤生長。僅抗體在左側圖中示出且RNA折紙+抗體在右側圖中示出。所用抗體為來自Biolegend之抗PD1抗體(純系29F.1A12)，主要用於活體內應用(GoInVivoTM經純化抗小鼠CD279(PD-1)抗體)。RNA折紙為圖6中描繪者。
圖15。用抗PD1抗體及RNA折紙組合治療時之腫瘤縮小。該抗體及RNA折紙與圖14中所用相同。RNA-折紙協同加強檢查點抑制劑之抗腫瘤活性。
圖16。多重慢病毒表現(Multiple Leniviral Expression；MuLE)目的載體。
圖17。在IP治療之後三小時之細胞因子及趨化因子。
圖18。在RNA-折紙注射之後腫瘤生長之抑制作用。經RNA-折紙治療之小鼠顯示腫瘤生長之顯著降低。
圖19。RNA-折紙在對攜帶腫瘤之小鼠中之細胞因子型態再編程中的作用。RNA-折紙增加促發炎細胞因子且降低消炎細胞因子。經RNA-折紙治療之攜帶腫瘤之小鼠中的高水準IFNg及TNFa清楚地示出了適應性抗腫瘤免疫性之強烈誘導。
圖20。再攻擊癌症鼠科動物模型。對已注射CT26且在一個月過程中自第1天開始經16μg RNA折紙治療六次且具有衰退或無腫瘤生長之四隻BALB/c小鼠再注射500,000個CT26-iRFP細胞(小鼠#1及#2在最終治療之後49天接受再攻擊且小鼠#3及#4在最終治療之後36天接受再攻擊)。
圖21A-21E。A. RNA-折紙：基於TLR3之佐劑以誘導抗腫瘤免疫性而無全身性細胞因子風暴。B-E.ssRNA折紙之大規模合成及表徵。A：示出藉由活體外轉錄及自組裝成ssRNA折紙來大規模合成ssRNA之示意圖。右側圖指示自組裝ssRNA折紙之AFM表徵。插圖示出所概述結構之放大圖像。B RNA OG在4℃下儲存持續4個月之後保持完整。新鮮製備之RNA-OG(泳道1)及4月齡RNA-OG(泳道2)在瓊脂糖凝膠(左側圖)中具有相似遷移率。AFM圖像亦指示RNA-OG之完整性得以保持(右側圖)。插圖示出所概述結構之放大圖像。所有比例尺，50nm。C：RNA-OG之瓊脂糖凝膠電泳分析及在10%血清中之PolyIC-H穩定性。1μg RNA-OG(泳道1)在37℃下用10%小鼠血清培育持續1h(泳道2)、2h(泳道3)及16h(泳道4)。1μg polyIC-H(泳道5)分別在37℃下用10%血清培育持續0.5h(泳道6)、1h(泳道7)、2h(泳道8)及16h(泳道9)。M表示1kb標記物。D.在用10%人類血漿培育之後的dsRNA完整性，包括RNA-OG(泳道1-6)、polyIC-H(泳道7-12)及polyAU(泳道13-18)，持續0h(泳道1、7及13)；0.5h(泳 道2、8及14)；1h(3、9及15)；2h(泳道4、10、16)；4h(泳道5、11及17)；及18h(6、12及18)。
圖22A-22D。RNA-OG之活體外細胞刺激。A：用不同劑量之RNA-OG、polyIC-H或polyIC-L進行RAW 264.7刺激持續20小時。CD40-PE平均螢光強度(MFI)用PBS對照組標準化；B：用RNA-OG或PolyIC-H進行小鼠脾細胞刺激。CD86-PE MFI用PBS組標準化。C：用不同劑量之RNA-OG、PolyIC-H及PolyIC-L對TLR3報告基因細胞株HEK-Blue TLR3進行活體外刺激持續20小時；D：用3.5μg/ml RNA-OG、PolyAU或polyIC-H對A549-Dual及A549-Dual KO-MAVS報告基因株進行活體外刺激。
圖23A-23B。使用RNA-OG及PolyIC治療之細胞因子型態分析。A：在用RNA-OG、PolyIC-L及PolyIC-H進行活體外刺激時由脾細胞進行之細胞因子分析。B：在腹膜內注射後3h自用RNA-OG、PolyIC-H或PBS治療之小鼠取得的血清之細胞因子型態。
圖24A-24B。RNA-OG及PolyIC之抗腫瘤佐劑活性。A.腫瘤注射及治療時程之示意圖。小鼠在第0天接受8×105 CT26-iRFP之腹膜內(IP)注射。自第0天開始，小鼠兩週一次接受RNA-OG、PolyIC或PBS之IP注射，持續總計四次。B.藉由表現近紅外螢光蛋白(iRFP)之CT26-iRFP株之近紅外螢光強度的Li-Cor成像監測之腫瘤進展。在多天內(如左側之數字所指示)拍攝動物之螢光圖像，其中在腫瘤接種之前的小鼠圖像充當背景(表示為pre)。空白矩形指示到達末期階段之安樂死動物。
圖25A-25D。藉由RNA-OG誘導之時間依賴性抗腫瘤免疫性。A.顯示腫瘤接種之時程、治療及腫瘤細胞之第二劑量再攻擊之示意圖。B.藉由Li-Cor成像系統監測接受A中所說明之治療之小鼠中的腫瘤進展。C.Kaplan-Meier生存曲線。該圖彙編了來自數個獨立實驗之經治療小鼠的生存數據， 該等實驗包括PBS(●，n=25)、在腫瘤注射後一天注射之RNA-OG(■，n=15)、在腫瘤注射後3天投與之RNA-OG(▲，n=10)。D.在經RNA-OG治療之攜帶腫瘤之小鼠中發展的抗腫瘤免疫性。自第一次腫瘤攻擊(B中所示)生存之小鼠對腫瘤細胞之再攻擊免疫，因為其未顯示可偵測腫瘤生長(左側圖)，而原生對照小鼠發展具有高螢光強度之相當大腫瘤負荷(右側圖)。用正方形突出顯示之小鼠作為用於圖26中之過繼轉移實驗的供體經處死。
圖26。T細胞依賴性抗腫瘤免疫性。頂部圖：RNA-OG不能停止T細胞缺乏(無胸腺裸)小鼠中之腫瘤生長。底部圖。免疫細胞之過繼轉移對腫瘤生長的影響。無胸腺小鼠即使在接受來自免疫勝任、原生小鼠之脾細胞之後亦缺乏保護(底部左側)。然而，在接受自已發展抗腫瘤免疫性之小鼠取得的脾細胞時，此等無胸腺裸小鼠抵抗腫瘤攻擊且顯示腫瘤衰退(底部右側)。
圖27A-27D。RNA-OG介導之腹膜腫瘤微環境之再編程。攜帶腫瘤之小鼠之細胞因子型態。分析存在於自經或未經RNA-OG治療之攜帶腫瘤之小鼠收集的腹水液以及小鼠血清中之促發炎細胞因子(A)及消炎細胞因子(B)的水準。骨髓源性抑制細胞(MDSC)之流式細胞術分析。■：正常血清；□：來自攜帶腫瘤之小鼠之腹水液；且表示來自RNA-OG治療的攜帶腫瘤之小鼠之腹水液。C.腹膜腔細胞之骨髓源性抑制細胞(MDSC)分析。自PBS治療的攜帶腫瘤之小鼠(頂部圖)或顯示腫瘤衰退或低腫瘤負荷之RNA治療的小鼠(底部圖)取回之PC細胞用螢光團結合之抗CD11b、抗Ly6C及抗Ly6G染色。門控CD11b+細胞針對Ly6C及Ly6G染色型態經呈現。緊鄰各曲線之數字顯示了CD11b+細胞中MDSC之總體百分率(亦即，Q1、Q2及Q4之總和)。D。每個組中之數隻個別小鼠中之MDSC平均值經呈現。
圖28。RNA-OG之UV熔解曲線。RNA-OG之UV熔解曲線。繪製RNA在260nm(A260)處之UV吸光度隨溫度而變之曲線。藉由求出A260對溫 度之一階導數來觀察兩處熔解轉變。高且尖銳轉變(約76℃)對應於平行內聚之熔解；且短轉變(約84℃)對應於剩餘雜交區之熔解。
圖29A-29B。RNA-OG之穩定性評估。A. RNA-OG之RNase I消化。1μg RNA-OG(泳道1)在室溫下用1 U RNase I培育持續20分鐘(泳道2)。單位定義：一單位RNase I酶在37℃下催化每秒100ng大腸桿菌rRNA降解成酸可溶性核苷酸。B.在50%小鼠血清中之RNA-OG穩定性。1μg RNA-OG(泳道1)在37℃下用50%小鼠血清培育持續1小時(泳道2)、2小時(泳道3)、4小時(泳道4)及20小時(泳道5)。M表示1kb DNA標記物。
圖30。用RNA-OG快速刺激RAW 264.7細胞。鼠科動物巨噬細胞株RAW 264.7細胞在37℃下用5μg RNA-OG或PolyIC培育持續多個時間點。該等細胞接著用PE標記之抗CD40抗體染色且藉由FACS分析。示出MFI數字。
圖31。藉由硫酸右旋糖苷(DS)及GpC抑制RNA-OG介導之巨噬細胞活化(CD40)。RAW 264.7細胞在37℃下用多種濃度之DS或GpC預培育持續30分鐘。在DS或GpC頂部列出之數字為所用抑制劑濃度(μg/ml)。RNA-OG(5μg/ml)作為刺激劑添加持續另外60分鐘。該等細胞用PE標記之抗CD40抗體染色且藉由FACS分析。示出CD40 MFI數字。
圖32A-32G。藉由DS及GpC抑制RNA OG之巨噬細胞攝取。A、B及C：RAW 264.7細胞用或不用抑制劑，亦即硫酸右旋糖苷(DS：200ug/mL)或GpC寡核苷酸(GpC：50ug/mL)預培育持續30分鐘，且接著用AF488標記之RNA OG(綠色)處理持續60分鐘(5ug/mL)。細胞核用Hoechst(藍色)染色且用共聚焦顯微鏡成像，其中頂部圖示出用於樣品之所有通道，而底部圖僅示出AF488通道。D、E及F：左側示出之三種樣品(亦即，樣品A、B及C)用RNAse III處理以移除外部結合之RNA OG。經RNAse處理之樣品(用箭頭指示)中的亮球體為由RNAse緩衝液引起之人工製品，因為該等球體亦存在於經無核酸酶之 RNAse緩衝液處理的樣品中。未用AF488標記之RNA OG培育之細胞在G中示出。
圖33。RNA-OG未由mTLR7識別。用不同劑量之RNA-OG、PolyIC及ssRNA40對TLR7報告基因細胞株HEK-Dual mTLR7進行活體外刺激持續20小時。
圖34A-34C。A-B.具有RNA-OG之脾細胞培養物中CD69+活化之T細胞的增加。NK細胞之總數增加，其中經活化CD69+NK細胞亦提高。C.使用不同劑量之RNA-OG或PolyIC之CT26-iRFP MTT分析。使用不同劑量之RNA-OG或PolyIC來培育CT26-iRFP細胞。在MTT分析中評估細胞活力。
圖35A-35D。A.RNA-OG之抗腫瘤效應。呈現來自多個獨立實驗之小鼠之Kaplan-Meier生存曲線。來自三個獨立實驗之小鼠經由IP注射接受5×105個CT26-iRFP細胞。小鼠開始接受100μL PBS或含16μg RNA-OG之100μL PBS之4次兩週一次IP治療，在第1天、第3天或第5天針對RNA-OG且在第1天針對PBS。經由iRFP之螢光強度監測腫瘤進展。B-D。耗盡CD8及NK細胞之經RNA-OG治療之小鼠缺乏抗腫瘤免疫性。B.示出各組中之治療時程之示意圖。CD8或NK細胞之活體內耗盡藉由分別注射CD8或NK細胞特異性單株抗體(Mab)來實現。該等抗體在同一天但在腫瘤注射後4h經注射。RNA-OG在抗體治療後一天經投與(100ug/劑量持續總計4個劑量)。不相關IgG作為針對CD8/NK耗盡之陰性對照組包括在內。C.PBS對照小鼠中之腫瘤生長。D.具有或不具有CD8或NK細胞之靶向耗盡的經RNA-OG治療之小鼠中之腫瘤生長。
圖36。用於RNA折紙之電腦輔助設計製程。步驟1：建立RNA瓦片作為用於任何靶標結構之穩固結構單元。
圖37。用於RNA折紙之電腦輔助設計製程。步驟2：建立靶標形狀及產生單鏈RNA之選路路徑。
圖38。用於RNA折紙之電腦輔助設計製程。設計RNA序列。
圖39。RNA矩形折紙#1。
圖40。RNA矩形折紙#2。
圖41。RNA矩形折紙#3。
圖42。RNA菱形折紙。
圖43。使用多種形狀之RNA折紙之RAW 264.7細胞活體外刺激。以各種設計及各劑量示出流式細胞術螢光圖像。列出MFI數字。
圖44。使用具有多種環序列之矩形RNA折紙之RAW 264.7細胞活體外刺激。MFI數字針對其免疫刺激效應進行比較。
圖45。小鼠中RNA折紙對A20-iRFP淋巴瘤腫瘤之活體內有效性之測試。對照組=PBS組。
圖46A-46B。耗盡CD8及NK細胞之經RNA-OG治療之小鼠缺乏抗腫瘤免疫性。A.示出分別使用抗CD8或抗NK單株抗體來耗盡CD8或NK細胞之示意圖。該抗體在同一天但在腫瘤注射後4h經注射。RNA-OG在抗體治療後一天經投與(100ug/劑量持續總計4個劑量)。不相關IgG作為針對CD8/NK耗盡之陰性對照組包括在內。B.藉由量測接受多種治療之小鼠中的iRFP螢光強度監測之腫瘤生長。
圖47。其他RNA折紙形狀。
圖48。RNA折紙之核酸酶抗性。如與RNA-Rec(SEQ ID NO：1)相比，其他RNA-折紙不太穩定。
圖49。RNA折紙之穩定性。RNA-折紙已在4℃下在PBS中維持超過四個月且仍保持與新鮮製備之折紙相似的結構。該等結構即使在無陽離子之情況下儲存時仍穩定。
圖50。4℃下之RNA折紙AF689穩定性。
圖51。RNA折紙對Poly IC之RNase敏感性。具有高分子量(HMW)之PolyIC看來比具有LMW之polyIC更加抵抗Rnase。然而，在相同條件下，使用RNA-OG未觀察到降解。
圖52。HEK TLR3-報告基因株。
圖53。HEK-TLR3報告基因株。
圖54。A549報告基因株。
圖55。由不同RNA-OG刺激RAW-264。
圖56。用於評估之額外RNA折紙。
圖57。多種RNA折紙形狀之劑量依賴性活化。
圖58。矩形RNA折紙之劑量依賴性活化。
圖59。Cy5-RNA-OG之內化及RAW刺激之抑制。
圖60。在用多種RNA-折紙、具有高分子量之polyIC以及PBS對照物培育之後24h，脾臟B及T細胞之活化，分別藉由CD69+細胞相比總B及T細胞之百分率揭露。
圖61。藉由活體外刺激之脾細胞產生促發炎細胞因子。
圖62。RNA-折紙未對腫瘤細胞施加直接抑制作用。
圖63。PolyIC-H誘導TLR3及MDA5/RIG路徑兩者。後者已牽連於毒性。
圖64A-64B。(A)皮下及(B)靜脈內注射。由同一組提供之實驗數據，示出由ARNAX產生之IL6、TNFa及IFNb水準低於PolyIC，但IP-10(亦稱作CXCL-10)之水準可相當。Takeda,Y.等人2017 Cel lReports。
圖65。血清細胞因子。如與polyIC-H相比，RNA OG誘導高水準之趨化因子(CXCL10)，但誘導極低水準之IFNa/b。RNA OG可為較安全佐劑，使得有可能全身性使用(不同於polyIC，歸因於其在人類中之高毒性，其目前僅在 臨床試驗中局部地進行測試)。
圖66。藉由近紅外螢光監測之腫瘤生長。
圖67。在攜帶腫瘤之小鼠中自腫瘤接種後1天開始用RNA-OG進行治療，導致腫瘤生長之顯著延遲或衰退。
圖68。免疫勝任Balb/c小鼠(頂部圖)與T細胞缺乏裸小鼠(底部圖)之間RNA-OG介導之抗腫瘤效應的比較。經由iRFP之近紅外成像監測五隻對照小鼠與五隻經RNA-OG治療之小鼠的腫瘤生長。此等個別小鼠之螢光強度呈現於右側圖上以示出時間依賴性腫瘤進展或衰退。具有大腫瘤負荷之小鼠在腫瘤注射後第14天-第17天之間實施安樂死。
圖69。時間依賴性抗腫瘤效應。
圖70。HSP70蛋白及衍生之肽(稱作TPP或TKD)之功能的示意圖。
圖71。不同RNA-OG/TTP比率導致不同複合物大小。該複合物在其形成之後看來穩定，因為以1：200比率形成之舊及新複合物呈現相似遷移模式(泳道3及泳道7)。
圖72。不同複合物展現不同結合/內化型態，如藉由流式細胞術所示。由RAW細胞引起之RNA-OG內化高於CT-26。在增加該肽之量時，結合於CT-26及RAW細胞兩者之水準較低。形成RNA-OG與TPP-離胺酸肽之複合物。在不同肽：RNA-OG比率下形成之複合物藉由電泳法分析(左側圖)。肽/RNA比率愈高，呈現之複合物愈大(亦即，較慢遷移)。TPP對結合TPP-RNA-OG複合物之影響，藉由螢光標記之RNA-OG的螢光強度揭露(右側圖)。當RNA/TPP比率達到1：400時，TPP/RNA-OG複合物之內化顯著降低。
圖73。在第0天接種紅色螢光陽性腫瘤細胞且在第9天形成腫瘤結節(亦即，治療前)。此等小鼠接著用不同類型之RNA結構(游離RNA或經腫瘤靶向肽(TTP)塗佈之RNA-折紙)的單一注射來治療。監測該等小鼠持續超過20 天，且在接受RNA-折紙聚合物之小鼠中而未在投與游離RNA之小鼠中發現腫瘤衰退。
圖74A-74C。圖19A。記憶喚醒反應。活體外藉由PBS(緩衝液)、TPP、RNA-OG-TPP、無關(KLH)肽或RNA-OG刺激之脾細胞；圖19B。代表性ELISPOT讀出，其中各斑點表示藉由不同刺激物活化之IFNg產生性免疫細胞；及圖19C。ELISPOTS之定量。無腫瘤小鼠發展TPP特異性免疫性，如藉由ELISPOT分析所揭露，其中TTP刺激之脾細胞在脾細胞用TPP而未用無關肽培養之後產生IFNg。
圖75。RNA-OG/TPP複合物之抗腫瘤活性。
圖76。RNA-OG/TPP(或RNA-OG)複合物保持與RNA-OG相似之刺激活性。在100：1之TPP/RNA比率下，該等TPP/RNA-OG複合物呈現與RNA-OG可相當之刺激活性。
圖77。與TPP複合之RNA-OG的抗腫瘤效應。RNA-OG及TPP之組合進一步延遲腫瘤生長。監測經與TPP複合或未複合之RNA-OG治療的攜帶腫瘤之小鼠之腫瘤生長。經1：50比率之RNA-OG/TPP治療的小鼠看來顯示比經單獨RNA-OG或1：100之RNA-OG/TPP治療的彼等小鼠慢之腫瘤進展。
圖78A-D。ssRNA奈米結構之選路。A.形成鹼基配對及平行內聚。B.平行交叉瓦片。C及D示出單鏈RNA骨架選路路徑。
圖79。ssRNA奈米結構及其相應AFM圖像之設計參數。
相關申請案之交叉引用
此專利申請案主張2017年8月30日申請之美國申請案第62/552,183號、2017年12月8日申請之美國申請案第62/596,697號、2017年12月4日申請之美國申請案第62/594,473號、2017年12月4日申請之美國申請案第 62/594,471號、2018年2月2日申請之美國申請案第62/625,965號、2018年2月13日申請之美國申請案第62/630,020號及2018年3月2日申請之美國申請案第62/637,807號的優先權權益。以下申請案以引用之方式併入本文中：2017年8月30日申請之62/552,183、2017年12月4日申請之62/594,473、2017年12月4日申請之62/594,471、2018年2月2日申請之62/625,965、2018年2月13日申請之62/630,020及2018年3月2日申請之62/637,807。
政府資助
本發明在政府支持下以由海軍研究處(Office of Naval Research)授權之N000141512689進行。美國政府享有本發明之某些權利。
本文描述包含至少一種單鏈RNA(ssRNA)分子之兩維及三維RNA奈米結構，其中該ssRNA分子形成至少一個平行內聚交叉，以及製造及使用該等奈米結構之方法。一般而言，該(等)RNA分子經合理設計以使用簡單鹼基配對規則經由固有自身互補性折疊成任何使用者定義之形狀(例如，任意所需形狀或經設計具有特定功能或結構目的之形狀)，該固有自身互補性指導核酸折疊過程。更特定言之，該RNA經合理設計以組裝成「鏈」，該「鏈」包括髮夾環以及配對區(例如，「雙螺旋區」)及未配對區(例如，「平行內聚交叉」部分或位於RNA奈米結構內之雙螺旋的一端或兩端處之外周環區部分)，其指引該核酸鏈進一步組裝成最終奈米結構。在某些實施例中，該等奈米結構具有高結構複雜性，同時維持打結簡單性(例如，未打結結構或相交數為零之結構)。
如本文所述，某些RNA奈米結構亦已顯示具有免疫刺激及/或免疫調節活性，且因而可用作佐劑(例如，抗癌佐劑)(參見實例)。如本文所論述，術語免疫調節同樣適用於免疫刺激之實施例及描述。另外，本文所述之某些RNA奈米結構可用作抗腫瘤劑及/或其他有益用途，包括但不限於治療、診斷及藥物遞送目的。應注意，本文所述之某些RNA奈米結構具有某些所需特性： 1.高穩定性(例如，在冷儲存中及當經受核酸酶時)，且因此具有針對活體內應用之適用性；2.針對以相對低成本用於人類應用之可擴展量；3.安全性：本文所述之RNA奈米結構可選擇性地刺激適應性細胞免疫性(抗癌或抗病毒)之誘導所需的路徑，而非觸發細胞因子風暴(如細胞因子型態分析所示)之路徑；4.用於免疫細胞之較佳內化之固有奈米粒子結構，而無額外封裝以促進吞噬，與polyIC、dsRNA或合成寡DNA-RNA雜合物(亦即，ARNAX)所牽涉之過程相反；及/或5.針對再現性之充分確定結構及均一性。這與polyIC之異源群體(低對高分子量)相反，polyIC之異源群體具有不同功能活性。
RNA奈米結構
某些實施例提供包含至少一種單鏈RNA(ssRNA)分子之RNA奈米結構，其中該ssRNA分子形成至少一個平行內聚交叉。如本文所述，某些RNA奈米結構具有免疫刺激特性。因此，某些實施例提供包含至少一種單鏈RNA(ssRNA)分子之RNA奈米結構，其中該ssRNA分子形成至少一個平行內聚交叉，且其中該RNA奈米結構具有免疫刺激特性。
某些實施例亦提供包含至少一種單鏈RNA(ssRNA)分子之RNA奈米結構，其中該至少一種ssRNA分子包含複數個雙螺旋區及至少一個可操作性連接於兩個雙螺旋區之間的平行交叉，且其中該RNA奈米結構具有免疫刺激特性。
如本文所用，術語「RNA奈米結構」係指由RNA製成之奈米級結構，其中該RNA具有經設計序列且經折疊成具有幾何特徵之結構，且其中該奈米結構可充當結構及/或功能元件。在某些實施例中，該奈米結構內之RNA充當 結構及功能元件兩者。如本文所用，術語「RNA奈米結構」及「RNA折紙」可互換使用。
如本文所用，術語「平行內聚交叉」係指包含中央二重對稱軸之多鏈(例如，2、3、4條鏈)核酸複合物，該中央二重對稱軸涉及側接之平行雙螺旋(其一實例描述於Zhang等人J.Am Chem.Soc.2002中)。該交叉內之鏈可藉由Watson-Crick鹼基配對相互作用或其他非規範結合相互作用保持在一起。例如，在某些實施例中，相鄰平行雙螺旋可形成選擇性交叉。因此，相互交叉點以大或小槽分離側接中央二重對稱軸。在一實施例中，該平行內聚交叉為包含中央二重對稱軸之四鏈核酸複合物，該中央二重對稱軸涉及兩個側接之平行或反平行雙螺旋。如本文所用，術語「平行內聚交叉」及「鎖定域」可互換使用。
如本文所述，包含至少一種ssRNA分子(例如，一或多種寡核苷酸/聚核苷酸)之RNA奈米結構可使用本文所述之方法以及關於某些實施例使用此項技術中已知之技術來製備。該等RNA奈米結構之組裝可基於鹼基配對原則或其他非規範結合相互作用。例如，雖然無需特定RNA序列，但單一RNA分子內或多種RNA分子之間的互補區可用於組裝。一般技術者將容易理解及瞭解，用於任何既定RNA奈米結構之最佳序列將取決於該RNA結構之所需或預期形狀、大小、核酸含量及預期用途。在其中該奈米結構包含超過一種ssRNA分子(例如，兩種或兩種以上寡核苷酸/聚核苷酸)之某些實施例中，各ssRNA分子可具有與另一ssRNA分子上之區互補的區以使得能夠進行鏈雜交且組裝該奈米結構。在其中該奈米結構由單一ssRNA分子(亦即，單一單分子RNA寡核苷酸/聚核苷酸)組成之某些其他實施例中，該分子內之區可與該分子內之某些其他區互補以使得能夠進行雜交且組裝該奈米結構。
根據本發明產生之RNA奈米結構典型地為奈米級結構(例如，具有1至1000奈米之長度級)，不過在一些情況下，本文中之術語「奈米結構」可指微 米級結構(例如，由超過一個奈米級或微米級結構組裝)。在一些實施例中，本文所述之RNA奈米結構具有1至1000nm、1至900nm、1至800nm、1至700nm、1至600nm、1至500nm、1至400nm、1至300nm、1至200nm、1至100nm或1至50nm之長度級。在一些實施例中，本文所述之RNA奈米結構具有大於1000nm之長度級。在一些實施例中，本文所述之RNA奈米結構具有1微米至2微米之長度級。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含多種ssRNA分子(例如，超過一條寡核苷酸/聚核苷酸鏈，諸如兩種或兩種以上ssRNA分子)，基本上由多種ssRNA分子組成，或由多種ssRNA分子組成。在某些實施例中，該RNA奈米結構包含兩種或兩種以上ssRNA分子，該等ssRNA分子能夠自組裝(或經組態以自組裝)成奈米結構。在某些實施例中，該RNA奈米結構由兩種或兩種以上ssRNA分子經由平行內聚交叉組裝。因此，在某些實施例中，該RNA奈米結構包含兩種或兩種以上ssRNA分子，其中該等ssRNA分子自組裝以形成至少一個平行內聚交叉。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含單一ssRNA分子(亦即，一條單分子寡核苷酸/聚核苷酸鏈)，基本上由單一ssRNA分子組成，或由單一ssRNA分子組成。在某些實施例中，該RNA奈米結構使用一種ssRNA分子(例如，在某些實施例中一種且僅一種，精確地一種，或大於零且小於兩種)進行組裝。在某些實施例中，該RNA奈米結構包含一種ssRNA分子，該ssRNA分子能夠自組裝成奈米結構。在某些實施例中，該RNA奈米結構由一種ssRNA分子組成，該ssRNA分子能夠自組裝成奈米結構。在某些實施例中，該RNA奈米結構由一種ssRNA分子經由平行內聚交叉組裝。因此，在某些實施例中，該RNA奈米結構包含一種單鏈RNA(ssRNA)分子，其中該ssRNA分子形成至少一個平行內聚交叉。
RNA奈米結構內之各RNA鏈的長度為可變的且例如取決於欲形成之奈米結構之類型、大小、幾何學及/或預期用途。應理解，若特定RNA奈米結構包含超過一種ssRNA分子，則各RNA分子之長度可彼此獨立地經選擇。在某些實施例中，該至少一種ssRNA分子(亦即，寡核苷酸或RNA鏈)為約10個核苷酸長至約100,000個核苷酸長，該至少一種ssRNA分子(亦即，寡核苷酸或RNA鏈)為約10個核苷酸長至約90,000個核苷酸長、約10個至約80,000個核苷酸長、約10個至約70,000個核苷酸長、約10個至約60,000個核苷酸長、約10個至約50,000個核苷酸長、約10個至約40,000個核苷酸長、約10個至約30,000個核苷酸長、約10個至約25,000個核苷酸長或約10個至約20,000個核苷酸長。在某些實施例中，該至少一種ssRNA分子(亦即，寡核苷酸或RNA鏈)為約15個核苷酸長至約20,000個核苷酸長，該ssRNA分子(亦即，寡核苷酸或RNA鏈)為約15個核苷酸長至約10,000個核苷酸長、約15個至約7500個核苷酸長、約3000個至約7000個核苷酸長、約5000個至約7000個核苷酸長、約1500個至約6500個核苷酸長、約1000個至約7000個核苷酸長、約5500個至約6500個核苷酸長、約15個至約5000個核苷酸長、約15個至約4000個核苷酸長、約15個至約3000個核苷酸長、約250個至約3000個核苷酸長、約500個至約3000個核苷酸長、約1000個至約3000個核苷酸長或約1500個至約2500個核苷酸長。在某些實施例中，該ssRNA分子(亦即，寡核苷酸或RNA鏈)為約100個、約200個、約300個、約400個、約500個、約600個、約700個、約800個、約900個、約1000個、約1100個、約1200個、約1300個、約1400個、約1500個、約1600個、約1700個、約1800個、約1900個、約2000個、約2100個、約2200個、約2300個、約2400個、約2500個、約2600個、約2700個、約2800個、約2900個、約3000個、約3100個、約3200個、約3300個、約3400個、約3500個、約3600個、約3700個、約3800個、約3900個、約4000個、約 4100個、約4200個、約4300個、約4400個、約4500個、約4600個、約4700個、約4800個、約4900個、約5000個、約5100個、約5200個、約5300個、約5400個、約5500個、約5600個、約5700個、約5800個、約5900個、約6000個、約6100個、約6200個、約6300個、約6400個、約6500個、約6600個、約6700個、約6800個、約6900個、約7000個、約7100個、約7200個、約7300個、約7400個、約7500個、約7600個、約7700個、約7800個、約7900個、約8000個、約8100個、約8200個、約8300個、約8400個、約8500個、約8600個、約8700個、約8800個、約8900個、約9000個、約9100個、約9200個、約9300個、約9400個、約9500個、約9600個、約9700個、約9800個、約9900個、約10000個、約10100個、約10200個、約10300個、約10400個、約10500個、約10600個、約10700個、約10800個、約10900個、約11000個、約11000個、約11100個、約11200個、約11300個、約11400個、約11500個、約11600個、約11700個、約11800個、約11900個、約12000個、約12100個、約12200個、約12300個、約12400個、約12500個、約12600個、約12700個、約12800個、約12900個核苷酸長、約13000個核苷酸長、約14000個核苷酸長、約15000個核苷酸長、約16000個核苷酸長、約17000個核苷酸長、約18000個核苷酸長、約19000個核苷酸長、約20000個核苷酸長、約25000個核苷酸長、約30000個核苷酸長、約35000個核苷酸長、約40000個核苷酸長、約45000個核苷酸長、約50000個核苷酸長、約75000個核苷酸長、約100000個核苷酸長、約125000個核苷酸長、約150000個核苷酸長、約175000個核苷酸長或約200000個核苷酸長。
在某些實施例中，用於本文所述之RNA奈米結構之ssRNA分子使用此項技術中熟知之多種程序重新合成。例如，氰基乙基亞磷醯胺方法(Beaucage,S.L.及Caruthers,M.H.,Tet.Let.22：1859,1981)或核苷H-膦酸酯方法(Garegg等人， Tet.Let.27：4051-4054,1986；Froehler等人，Nucl.Acid.Res.14：5399-5407,1986；Garegg等人，Tet.Let.27：4055-4058,1986,Gaffney等人，Tet.Let.29：2619-2622,1988)。此等化學方法可藉由市場上可獲得之多種自動化寡核苷酸合成儀，包括使用活體外轉錄方法來執行。
用於本文所述之RNA奈米結構之ssRNA分子可包含一或多種修飾。該等修飾包括但不限於鹼基修飾、糖修飾及骨架修飾。該ssRNA分子可含有天然或合成核苷酸(例如，經修飾核苷酸)。例如，在某些實施例中，該ssRNA奈米結構包含一或多種經修飾核苷酸(例如，一或多個肌苷殘基)。本文所述之ssRNA分子可具有同源骨架(例如，完全磷酸二酯或完全硫代磷酸酯)或異源(或嵌合)骨架。
在某些實施例中，該至少一種ssRNA分子不包含轉錄終止序列。在某些實施例中，該至少一種ssRNA分子不包含AUCUGUU序列。
在某些實施例中，本文所述之RNA奈米結構具有打結簡單性。在核酸拓撲學之領域中，「打結」係指纏繞多次且系成結之核酸(參見例如Buck D,Proceedings of Symposia in Applied Mathematics 2009；66：1-33；Rybenkov VV等人Proc Natl Acad Sci USA.1993；90(11)：5307-5311)。打結簡單性使得該(等)RNA分子在折疊過程期間避免以動力學方式經俘獲，其可防止適當折疊成使用者定義之靶標形狀。因此，在一些實施例中，該奈米結構之相交數為零且該奈米結構未打結。相交數為顯示在結之任何圖中最小數目之相交的結不變數，表示結之拓撲複雜性。
雙螺旋及平行交叉
如本文所述，某些實施例提供包含至少一種單鏈RNA(ssRNA)分子之RNA奈米結構，其中該ssRNA分子形成至少一個平行內聚交叉。因此，該RNA奈米結構可包含單鏈區(例如，平行內聚交叉之一部分或環區)及雙鏈區(例 如，雙螺旋)，其為ssRNA分子中之多個序列之間的結合相互作用之結果。因此，如本文所用，術語「雙鏈區」係指RNA奈米結構中兩個相鄰RNA序列彼此鹼基配對之區。如本文所用，術語「單鏈區」係指RNA奈米結構中具有未與第二序列鹼基配對之序列的區。
在某些實施例中，經組裝RNA奈米結構之至少約20%包含雙鏈區。在某些實施例中，經組裝RNA奈米結構之至少約例如25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%包含雙鏈區。在某些實施例中，RNA奈米結構之約60-99%包含雙鏈區且RNA奈米結構之約1-40%包含單鏈區。在某些實施例中，該結構之大部分包含雙鏈區(例如，約95%)且該結構之僅小部分包含單鏈區(例如，約5%)。
在某些實施例中，本文所述之RNA奈米結構包含至少一個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含複數個平行內聚交叉。如本文所用，術語「複數種」意謂兩種或兩種以上。例如，在某些實施例中，RNA奈米結構包含至少一個至約200個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含一個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含2000個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含1800個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含1600個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含1400個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含1200個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含1000個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含800個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含600個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含400個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含200個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含1-175個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含1-150個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含1-125 個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含1-100個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含1-75個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含1-50個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含1-25個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含1-20個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含1-15個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含1-10個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含9個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含8個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含7個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含6個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含5個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含4個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含3個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含2個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含至少12個至約100個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含至少20個至約80個平行內聚交叉。在某些實施例中，RNA奈米結構包含至少40個至約60個平行內聚交叉。
促成平行內聚交叉之單鏈區典型地位於同一層或平面中。然而，應理解，一層之平行內聚交叉的單鏈區可與另一層之平行內聚交叉的單鏈區配對結合以一起「鎖定」多層。既定平行內聚交叉之長度可變化。另外，奈米結構中或奈米結構之單一層中之所有平行內聚交叉無需相對於彼此具有相同長度，不過在一些實施例中，其具有相同長度。平行內聚交叉之數目及相對長度可取決於奈米結構之所需形狀及大小(例如，任何所需及/或任意形狀或大小)。
在某些實施例中，平行內聚交叉具有約4個至15個核苷酸(或鹼基對)之長度。在一些實施例中，平行內聚交叉具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸(或鹼基對)之長度。在一些實施例中，平行內聚交叉具有 8個核苷酸(或鹼基對)之長度。應理解，在此申請書提及以核苷酸計之結構「長度」(例如，8個核苷酸之「長度」)的情況下，結構長度可關於鹼基對(例如，8個鹼基對將為與8個核苷酸相同之「長度」)互換地加以描述(出於描述其「長度」之目的)。
在某些實施例中，平行內聚交叉包含16個鹼基配對。在某些實施例中，該至少一個平行內聚交叉包含約2個至約14個之間之GC鹼基對。在某些實施例中，該至少一個平行內聚交叉包含約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13個與14個之間之GC鹼基對。
在某些實施例中，該至少ssRNA分子包含形成內部環之序列，該等內部環在形成該至少平行內聚交叉之前保持未配對。
在某些實施例中，本文所述之RNA奈米結構包含兩個或兩個以上雙螺旋(例如，複數個雙螺旋)。如本文所用，術語「雙螺旋」係指形成螺旋之RNA鏈之配對區。
如本文所用，術語「雙螺旋區」係指所提及之「雙螺旋」內的次單元、區或域。術語「雙螺旋區」及「螺旋域」可互換使用。促成配對螺旋之單鏈區典型地位於同一層中。雙螺旋或雙螺旋區之長度可變化。另外，奈米結構中或奈米結構之單一層中之所有雙螺旋或雙螺旋區無需相對於彼此具有相同長度，不過在一些實施例中，其具有相同長度。雙螺旋或雙螺旋區之數目及相對長度可取決於奈米結構之所需形狀(例如，任何任意形狀)。在一些實施例中，雙螺旋或雙螺旋區具有5個至100個核苷酸之長度。例如，雙螺旋或雙螺旋區可具有5個至90個、5個至80個、5個至70個、5個至60個、5個至50個、5個至40個、5個至30個、5個至25個、5個至20個或5個至15個之長度。在某些實施例中，雙螺旋或雙螺旋區具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸之長度。在某些實施例中，雙螺旋區具有8個核苷酸之長度。在某些 實施例中，雙螺旋區具有9個核苷酸之長度。在某些實施例中，RNA奈米結構包含複數個具有8個核苷酸之長度的雙螺旋區及複數個具有9個核苷酸之長度的雙螺旋區。
在某些實施例中，該ssRNA分子包含至少兩個平行雙螺旋。在某些實施例中，該等ssRNA分子包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個雙螺旋(例如，平行雙螺旋)。在一些實施例中，奈米結構僅含有平行交叉。
在一些實施例中，奈米結構含有沿著奈米結構之雙螺旋或雙螺旋區的超過50%(例如，超過60%、超過70%、超過80%、超過85%、超過90%、超過95%或超過98%)之連續π-π堆疊。
在某些實施例中，本文所述之RNA奈米結構進一步包含至少一個環區(例如，位於包括於RNA奈米結構內之一雙螺旋的一端處之外周環區)。在某些實施例中，環區連接一雙螺旋至另一雙螺旋。典型地，環區相對較短且位於RNA奈米結構之邊緣上。在某些實施例中，環區位於兩個邊緣上(在經成型為矩形之奈米結構中)。在某些實施例中，RNA奈米結構包含2個或2個以上環區(例如，複數個環區)。在某些實施例中，RNA奈米結構包含約1個至約100個之間的環區。在某些實施例中，RNA奈米結構包含約1個至約90個之間的環區。在某些實施例中，RNA奈米結構包含約1個至約80個之間的環區。在某些實施例中，RNA奈米結構包含約1個至約70個之間的環區。在某些實施例中，RNA奈米結構包含約1個至約60個之間的環區。在某些實施例中，RNA奈米結構包含約1個至約50個之間的環區。在某些實施例中，RNA奈米結構包含約1個至約40個之間的環區。在某些實施例中，RNA奈米結構包含約1個至約30個之間的環區。在某些實施例中，RNA奈米結構包含約1個至約20個之間的環區。在某些實施例中，RNA奈米結構包含約1個至約15個之間的環區。在某些實施 例中，RNA奈米結構包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個環區。
環區之長度可變化。另外，奈米結構中或奈米結構之單一層中之所有環區無需相對於彼此具有相同長度，不過在一些實施例中，其具有相同長度。在某些實施例中，環區具有約2個至約100個核苷酸之長度。在某些實施例中，環區具有約2個至約50個核苷酸之長度。在某些實施例中，環區之長度在約2個至約25個核苷酸之間。在某些實施例中，環區之長度在約2個至約20個核苷酸之間。在某些實施例中，環區之長度在約2個至約15個核苷酸之間。在某些實施例中，環區之長度在約2個至約10個核苷酸之間。在某些實施例中，環區之長度在約3個至約10個核苷酸之間。在某些實施例中，環區之長度為約4個核苷酸。在某些實施例中，環區之長度為約5個核苷酸。在某些實施例中，環區之長度為約6個核苷酸。在某些實施例中，環區之長度為約7個核苷酸。在某些實施例中，環區之長度為約8個核苷酸。在某些實施例中，環區之長度為約9個核苷酸。在某些實施例中，環區之長度為約10個核苷酸。
在某些實施例中，環區為「富G」的(亦即，該環區內之大多數核苷酸為G)。在某些實施例中，環區為「富C」的(亦即，該環區內之大多數核苷酸為C)。在某些實施例中，環區為「富A」的(亦即，該環區內之大多數核苷酸為A)。在某些實施例中，環區為「富U」的(亦即，該環區內之大多數核苷酸為U)。在某些實施例中，環區包含序列『UUUC』或由序列『UUUC』組成。在某些實施例中，環區包含序列『GGGAGGG』或由序列『GGGAGGG』組成。在某些實施例中，環區包含序列『CCCUCCC』或由序列『CCCUCCC』組成。在某些實施例中，環區包含序列『AAAGAAA』或由序列『AAAGAAA』組成。在某些實施例中，環區包含序列『UUUCUUU』或由序列『UUUCUUU』組成。
在某些實施例中，雙螺旋區及平行內聚交叉可但未必以交替模式經 安排。例如，在兩層奈米結構中，各層可具有藉由平行內聚交叉(內部)分離之雙螺旋區，或雙螺旋(其中雙螺旋區為一部分)可藉由環區(外周)分離。在某些實施例中，本文所述之RNA奈米結構之雙螺旋的至少兩個區可藉由一種(或至少一種)平行內聚交叉彼此分離及/或RNA奈米結構之至少兩個雙螺旋可藉由至少一個平行內聚交叉連接或偶合。在一些實施例中，RNA奈米結構之雙螺旋區的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或100%可藉由一種(或至少一種)平行內聚交叉彼此分離。
因此，在某些實施例中，RNA奈米結構包含結構重複單元。在某些實施例中，該結構單元重複2次或2次以上。因此，在某些實施例中，該結構單元重複在本文所述之RNA奈米結構內重複複數次。在某些實施例中，該結構重複單元依序包含：雙螺旋之第一區、第一平行內聚交叉、雙螺旋之第二區及第二平行內聚交叉。在某些實施例中，該結構重複單元之長度為總計33個鹼基對(bp)。
在某些實施例中，該RNA奈米結構係基於如實例1所述之8-8-9-8設計。在此設計中，該RNA奈米結構包含33 bp之結構重複單元，該結構重複單元含有雙螺旋之兩個區(雙螺旋之一個8核苷酸區及雙螺旋之一個9核苷酸區)，散佈有兩個8核苷酸平行內聚交叉。因此，在某些實施例中，本文所述之RNA奈米結構包含結構重複單元，該結構重複單元依序包含長度為8個核苷酸的雙螺旋之第一區、長度為8個核苷酸的第一平行內聚交叉、長度為9個核苷酸的雙螺旋之第二區及長度為8個核苷酸的第二平行內聚交叉。某些實施例亦提供包含至少一種單鏈RNA(ssRNA)分子之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構包含長度為33個核苷酸的至少兩個結構重複單元，且其中各結構重複單元依序包含：長度為8個核苷酸的雙螺旋之第一區、長度為8個核苷酸的第一平行內聚交叉、長度為9個核苷酸的雙螺旋之第二區及長度為8個核苷酸的第二平行內聚交 叉。
在某些實施例中，RNA奈米結構包含至少一種單鏈RNA(ssRNA)分子，其中該RNA奈米結構包含長度為33個核苷酸之至少兩個結構重複單元。在某些實施例中，各結構重複單元依序包含：雙螺旋之第一區，其中該第一區為9個或少於9個核苷酸長、8個或少於8個核苷酸長、7個或少於7個核苷酸長或6個或少於6個核苷酸長；第一平行內聚交叉，其為7個或7個以上核苷酸長、8個或8個以上核苷酸長、9個或9個以上核苷酸長或10個或10個以上核苷酸長；雙螺旋之第二區，其中該第二區為10個或少於10個核苷酸長、9個或少於9個核苷酸長、8個或少於8個核苷酸長、7個或少於7個核苷酸長或6個或少於6個核苷酸長；及第二平行內聚交叉，其為7個或7個以上核苷酸長、8個或8個以上核苷酸長、9個或9個以上核苷酸長或10個或10個以上核苷酸長。
在某些實施例中，本文所述之RNA奈米結構不包含如下結構重複單元，該結構重複單元具有10-6-11-6設計(亦即，含有雙螺旋之兩個區(雙螺旋之一個10核苷酸區及雙螺旋之一個11核苷酸區)，散佈有兩個6核苷酸平行內聚交叉。
RNA奈米結構內之層
RNA(例如，ssRNA分子)可經設計以組裝成雙鏈，類似大的髮夾結構。該髮夾結構接著組裝形成含有成對雙螺旋及平行內聚交叉之結構。如本文所用，RNA奈米結構之「層」係指RNA鏈之一部分的平坦安排。在某些實施例中，RNA奈米結構包含2個或2個以上層。例如，RNA奈米結構可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上層，視該奈米結構之所需形狀而定。
在某些實施例中，該平行內聚交叉指導RNA鏈進一步組裝成最終結構。底層內之平行內聚交叉經設計(或經組態或經序列編碼)以與頂層內之其相應平行內聚交叉進行鹼基配對，但未橫貫彼此。因此，在某些實施例中，奈米結 構包含第一層，其包含複數個雙螺旋及複數個平行內聚交叉，其中該第一層之至少兩個雙螺旋藉由平行內聚交叉彼此分離；及第二層，其包含複數個雙螺旋及複數個平行內聚交叉，其中該第二層之至少兩個雙螺旋藉由平行內聚交叉彼此分離，其中該第一層之平行內聚交叉雜交至該第二層之平行內聚交叉。
RNA奈米結構形狀
本文所述之RNA奈米結構為可編程結構，其可經設計以組裝成多種大小、形狀、核酸含量及組態。
在某些實施例中，該RNA奈米結構之形狀為例如矩形、菱形、四面體、三角形或任何其他使用者定義之幾何形狀。一般技術者在已研究本文中之教示之後應瞭解及理解，此等教示不限於任何特定RNA奈米結構形狀，而可應用於藉由編程(或產生)具有必要序列之RNA分子來產生任何所需形狀，該必要序列將使該分子經由配對相互作用自組裝成所需形狀。
在某些實施例中，該RNA奈米結構之形狀為矩形。在某些實施例中，該RNA奈米結構為由一種單鏈RNA分子經由平行內聚交叉自組裝之RNA矩形奈米結構。在某些實施例中，該矩形RNA奈米結構包含至少一個環區(例如，13個環區)。在某些實施例中，該等環區包含選自由UUUC、GGGAGGG、CCCUCCC、AAAGAAA及UUUCUUU組成之群之序列，或由該序列組成。在某些實施例中，該等環區之至少25%可包含UUUC、GGGAGGG、CCCUCCC、AAAGAAA或UUUCUUU，或由UUUC、GGGAGGG、CCCUCCC、AAAGAAA或UUUCUUU組成。在某些實施例中，該等環區之至少50%可包含UUUC、GGGAGGG、CCCUCCC、AAAGAAA或UUUCUUU，或由UUUC、GGGAGGG、CCCUCCC、AAAGAAA或UUUCUUU組成。在某些實施例中，該等環區之至少75%可包含UUUC、GGGAGGG、CCCUCCC、AAAGAAA或UUUCUUU，或由UUUC、GGGAGGG、CCCUCCC、AAAGAAA或UUUCUUU組成。在某些實施例中， 所有該等環區均可包含UUUC、GGGAGGG、CCCUCCC、AAAGAAA或UUUCUUU，或由UUUC、GGGAGGG、CCCUCCC、AAAGAAA或UUUCUUU組成。
在某些實施例中，該RNA奈米結構為矩形RNA奈米結構，其包含與SEQ ID NO：1(參見例如圖39及實例2)具有至少約60%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，該RNA奈米結構包含與SEQ ID NO：1具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，該RNA奈米結構由與SEQ ID NO：1具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列組成。因此，在某些實施例中，該RNA奈米結構包含SEQ ID NO：1。在某些實施例中，該RNA奈米結構由SEQ ID NO：1組成。
在某些實施例中，SEQ ID NO：1中之UUUC四環經諸如富G環序列、富C環序列、富A環序列或其他富U環序列之替代環區置換。
因此，在某些實施例中，SEQ ID NO：1中之環區經富G環置換： (SEQ ID NO：3)
因此，在某些實施例中，該RNA奈米結構為矩形RNA奈米結構，其包含與SEQ ID NO：3具有至少約60%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，該RNA奈米結構包含與SEQ ID NO：3具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，該RNA奈米結構由與SEQ ID NO：3具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列組成。因此，在某些實施例中，該RNA奈米結構包含SEQ ID NO：3。在某些實施例中，該RNA奈米結構由SEQ ID NO：3組成。
在某些實施例中，SEQ ID NO：1中之環區經富C環置換： (SEQ ID NO：4)
因此，在某些實施例中，該RNA奈米結構為矩形RNA奈米結構， 其包含與SEQ ID NO：4具有至少約60%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，該RNA奈米結構包含與SEQ ID NO：4具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，該RNA奈米結構由與SEQ ID NO：4具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列組成。因此，在某些實施例中，該RNA奈米結構包含SEQ ID NO：4。在某些實施例中，該RNA奈米結構由SEQ ID NO：4組成。
在某些實施例中，SEQ ID NO：1中之環區經富A環置換： (SEQ ID NO：5)
因此，在某些實施例中，該RNA奈米結構為矩形RNA奈米結構，其包含與SEQ ID NO：5具有至少約60%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，該RNA奈米結構包含與SEQ ID NO：5具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，該RNA奈米結構由與SEQ ID NO：5具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列組成。因此，在某些實施例中，該RNA奈米結構包含SEQ ID NO：5。在某些實施例中，該RNA奈米結構由SEQ ID NO：5組成。
在某些實施例中，SEQ ID NO：1中之環區經富U環置換： (SEQ ID NO：6)
因此，在某些實施例中，該RNA奈米結構為矩形RNA奈米結構，其包含與SEQ ID NO：6具有至少約60%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，該RNA奈米結構包含與SEQ ID NO：6具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，該RNA奈米結構由與SEQ ID NO：6具 有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列組成。因此，在某些實施例中，該RNA奈米結構包含SEQ ID NO：6。在某些實施例中，該RNA奈米結構由SEQ ID NO：6組成。
在某些實施例中，該RNA奈米結構為矩形RNA奈米結構，其包含與SEQ ID NO：7(參見例如圖40)具有至少約60%序列一致性之核酸序列：5' (SEQ ID NO：7)
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含與SEQ ID NO：7具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，該RNA奈米結構由與SEQ ID NO：7具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列組成。因此，在某些實施例中，該RNA奈米結構包含SEQ ID NO：7。在某些實施例中，該RNA奈米結構由SEQ ID NO：7組成。
在某些實施例中，該RNA奈米結構為矩形RNA奈米結構，其包含與SEQ ID NO：8(參見例如圖41)具有至少約60%序列一致性之核酸序列：5' (SEQ ID NO：8)
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含與SEQ ID NO：8具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，該RNA奈米結構由與SEQ ID NO：8具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、 68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列組成。因此，在某些實施例中，該RNA奈米結構包含SEQ ID NO：8。在某些實施例中，該RNA奈米結構由SEQ ID NO：8組成。
在某些實施例中，該RNA奈米結構為矩形RNA奈米結構，其包含與SEQ ID NO：9(參見例如實例1，有義形式)具有至少約60%序列一致性之核酸序列：5' (SEQ ID NO：9)
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含與SEQ ID NO：9具有至少約 61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，該RNA奈米結構由與SEQ ID NO：9具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列組成。因此，在某些實施例中，該RNA奈米結構包含SEQ ID NO：9。在某些實施例中，該RNA奈米結構由SEQ ID NO：9組成。
在某些實施例中，該RNA奈米結構為矩形RNA奈米結構，其包含與SEQ ID NO：10(參見例如實例1，反義形式)具有至少約60%序列一致性之核酸序列：5' (SEQ ID NO：10)
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含與SEQ ID NO：10具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，該RNA奈米結構由與SEQ ID NO：10具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列組成。因此，在某些實施例中，該RNA奈米結構包含SEQ ID NO：10。在某些實施例中，該RNA奈米結構由SEQ ID NO：10組成。
在某些實施例中，該RNA奈米結構之形狀為菱形。在某些實施例中，該RNA奈米結構為菱形RNA奈米結構，其包含與SEQ ID NO：11(參見例如圖42)具有至少約60%序列一致性之核酸序列：5' (SEQ ID NO：11)
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含與SEQ ID NO：11具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，該RNA奈米結構由與SEQ ID NO：11具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列組成。因此，在某些實施例中，該RNA奈米結構包含SEQ ID NO：11。在某些實施例中，該RNA奈米結構由SEQ ID NO：11組成。
在某些實施例中，該RNA奈米結構之形狀為四面體。在某些實施例中，該RNA奈米結構為四面體RNA奈米結構，其包含與SEQ ID NO：12具有至少約60%序列一致性之核酸序列：5' (SEQ ID NO：12)
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含與SEQ ID NO：12具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，該RNA奈米結構由與SEQ ID NO：12具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列組成。因此，在某些實施例中，該RNA奈米結構包含SEQ ID NO：12。在某些實施例中，該RNA奈米結構由SEQ ID NO：12組成。
在某些實施例中，該RNA奈米結構之形狀為斜方形。在某些實施例中，該RNA奈米結構為斜方形RNA奈米結構，其包含與SEQ ID NO：13(參見例如實例1)具有至少約60%序列一致性之核酸序列： 3'(SEQ ID NO：13)
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含與SEQ ID NO：13具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列。在某些實施例中，該RNA奈米結構由與SEQ ID NO：13具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列組成。因此，在某些實施例中，該RNA奈米結構包含SEQ ID NO：13。在某些實施例中，該RNA奈米結構由SEQ ID NO：13組成。
某些實施例亦提供與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列(例如，經組態以基於其經組態序列及所引起之配對相互作用組裝成RNA奈米結構的核酸，其中該核酸包含核酸序列)。在某些實施例中，該RNA奈米結構由與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列組成。因此，在某些實施例中，該RNA奈米結構包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13。在某些實施例中，該RNA奈米結構由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13組成。在某些實施例中，該核酸形成RNA奈米結構。在某些實施例中，該RNA奈米結構具免疫刺激性或在其他方面具免疫調節性。
RNA奈米結構設計
RNA奈米結構可使用本文所述之方法以及在某些實施例中此項技術中已知之方法來設計。例如，RNA奈米結構可使用ASU之專有Tiamat RNA軟體來設計，該軟體促進RNA雙螺旋及結構單元之顯現(參見例如實例)。典型地，該設計過程涉及(及用於產生或設計本文所述之RNA奈米結構之方法可包含)以下：步驟1：建立RNA瓦片(例如，如本文所述之結構單元)作為用於任何靶標結構 之穩固結構單元(圖36)；步驟2：建立一或多種靶標形狀及產生單鏈RNA之選路路徑(圖37)；及步驟3：設計或產生RNA序列(圖38)。
因此，某些實施例提供一種使用電腦實施方法(例如，Tiamat RNA軟體)來設計本文所述之RNA奈米結構之方法。在某些實施例中，該方法包含：1)建立RNA瓦片作為用於任何靶標結構之結構單元(亦即，如本文所述之結構重複單元)；2)建立靶標形狀及產生ssRNA之選路路徑；及3)設計或產生RNA序列。
在某些實施例中，該ssRNA之序列經由手動修飾最佳化。例如，該Tiamat軟體將典型地控制該ssRNA序列之總體GC含量。因此，平行內聚區可具有高或低GC含量，該含量可進一步經調節。例如，特定平行內聚相交可具有16個鹼基配對。在該情形中，該平行內聚相交之GC含量可經調節以含有約6個至約10個GC鹼基對(例如，6、7、8、9或10個GC鹼基對)。
該平行內聚相交由兩個內部環(其中內部環此處係指該RNA分子在折疊之前之未配對區)形成。在某些實施例中，該至少一種ssRNA之序列可經修飾以確保在形成該平行內聚相交之前該等內部環保持未配對。核苷酸組成將手動地加以改變，使得該等內部環保持未配對。
該ssRNA之序列亦可含有轉錄終止序列(例如，AUCUGUU)。若存在，則此序列可經移除及/或經修飾為不同序列。
因此，某些實施例提供使用本文所述之方法來設計RNA奈米結構之方法。
某些實施例亦提供一種產生RNA奈米結構之方法，該方法包含在導致形成該奈米結構之條件下培育至少一種ssRNA分子(例如，經由配對相互作用自組裝)。在某些實施例中，該等條件為本文所述之條件(例如，在實例中)。在某些實施例中，該ssRNA分子具有本文所述之序列(例如，SEQ ID NO：1-13中任 一者)。
核酸酶抗性
在某些實施例中，本文所述之RNA奈米結構具有增加之核酸酶抗性(例如，如與對照物相比，諸如與該RNA奈米結構包含相同核酸序列之未折疊ssRNA分子)(參見例如圖7)。在某些實施例中，該RNA奈米結構之核酸酶抗性比對照物高約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多。評估核酸酶抗性之方法描述於本文中且為此項技術中已知的。因此，在某些實施例中，本文所述之RNA奈米結構的核酸酶抗性使用本文所述之分析來評估。
RNA奈米結構之免疫刺激(或免疫調節)特性
執行下文及實例中描述之一系列活體外及活體內實驗以評估本文所述之RNA奈米結構的免疫刺激特性。此等實驗證明了該等RNA奈米結構可具有免疫刺激(或在其他方面免疫調節)特性且可用作佐劑(例如，抗癌佐劑)。另外，此等實驗指示了本文所述之RNA奈米結構可用作抗腫瘤(抗癌)劑。最後，此等實驗指示了本文所述之RNA奈米結構具有優於先前已知之TLR3配位體的某些優勢。
雙鏈RNA(dsRNA)為病毒感染之副產物。其為Toll樣受體3(TLR3)之天然配位體及用於活化先天及適應性免疫性之有效刺激劑。PolyIC為合成dsRNA類似物且已針對抗癌免疫療法經廣泛研究。然而，PolyIC與高毒性相關，這主要歸因於細胞因子之過度產生，其隨後可能導致細胞因子血症。
在癌症免疫療法中測試RNA奈米結構(SEQ ID NO：1)之佐劑活性且發現該RNA奈米結構在16μg/劑量下之重複注射(例如，2、3、4、5、6、7或8次注射，取決於腫瘤負荷及固有腫瘤免疫原性)顯著地延遲腫瘤生長。在某些實施例中，該劑量大於零且：小於約5mg/kg、小於約4mg/kg、小於約3mg/kg、 小於約2mg/kg、小於約1mg/kg或小於約0.8mg/kg。另外，當分析細胞因子型態時，發現由經RNA奈米結構治療之小鼠產生的細胞因子具有較高水準之產生有效抗腫瘤免疫性所需的特定細胞因子及趨化因子，但具有較低水準之牽涉於全身性細胞因子風暴中之細胞因子。因此，RNA奈米結構可用作有效且安全佐劑。此外，證明了本文所揭示之RNA奈米結構展現有效抗腫瘤活性，但未展現明顯毒性。
TLR3配位體在癌症療法中具有多種作用模式。其可用作癌細胞之細胞凋亡/壞死性凋亡(neprotosis)的誘導劑。其為用於在包括宿主免疫細胞及癌細胞在內之多種細胞類型中產生I型干擾素之強活化劑，經由兩種主要路徑：TLR3(內溶酶體)及MDA/RIG(存在於細胞質中)。TLR3配位體與化學治療劑、細胞凋亡增強劑、其他TLR配位體、腫瘤抗原及檢查點抑制劑(例如，抗PD1、CTLA4或PD-L1)組合展現協同效應。相同配位體可用於鼠科動物模型及人類兩者中。
當前TLR3配位體包括PolyIC、Poly A：U及ARNAX。存在三種類型之PolyIC：(1)標準Poly-IC，其藉由血清快速地不活化；(2)Poly-IC/聚離胺酸(polyICLC,Hiltonol,Oncovir)，其已在12個臨床試驗中針對多種惡性腫瘤經研究；及(3)Poly(I：C12U)(Ampiligen)，其已在臨床試驗中針對OVC及腹膜腫瘤經研究。PolyIC自20世紀70年代末以來已作為抗癌佐劑在人類中經測試。然而，發現PolyIC藉由血清快速地不活化。儘管其與聚離胺酸之複合物極大地增強其在循環中之半衰期及功效，複合polyIC歸因於細胞因子的過度產生會引起不可耐受之逆境。咸信polyIC活化TLR3及MDA5/RIG信號傳導路徑兩者。後者已與全身性毒性相關。實際上，polyIC已作為癌症疫苗之一部分藉由與局部遞送之腫瘤特異性抗原混合來進行研究。另外，雙鏈poly A：U在20世紀八十年代早期在臨床研究中經測試。歸因於其低功效(可能不穩定)及不良細胞攝取，停止努力。
第三線研究涉及ARNAX，其為硫代磷酸酯ODN指導之dsRNA (sODN-dsRNA)，類似PolyA：U。其展現ODN介導之細胞攝取(Matsumoto,M.等人2015.Nature Communications.6：6280)。
本文所述之RNA奈米結構出於多種原因比先前已知之TLR3配位體有利。例如，其在以相對低成本用於產生之量方面為可擴展的。針對再現性，其為充分確定結構且具有均一性。特定大小及固有奈米粒子結構針對免疫細胞之較佳內化為優良的，而無額外封裝以促進吞噬，與polyIC、dsRNA或合成寡DNA-RNA雜合物(亦即，ARNAX)所牽涉之過程相反。其為高度穩定的以便關於活體內應用為切實可行的。本文所述之RNA奈米結構具有較佳安全性，因為其可選擇性地活化誘導適應性細胞免疫性(抗癌或抗病毒)所需之路徑(TLR3)，而非MDA5/RIG路徑，且因此不太可能誘導細胞因子風暴。其具有針對再現性之充分確定結構及均一性，不同於具有不同功能活性之polyIC異源群體(低對高分子量)。因此，其具有較佳穩定性、攝取、均質性、選擇性及低毒性。
活體外及活體內實驗之結果顯示RNA奈米結構有希望作為治療性抗癌佐劑之結果。活體外研究強調了該RNA奈米結構能夠使多種免疫細胞促進先天及適應性免疫反應且引起免疫活性細胞因子之釋放，其均可主要歸因於該RNA奈米結構起始該TLR3路徑。所有此等組分在用已經確立為免疫佐劑之Poly(I：C)進行的比較中均為明顯的。如表1中可見，Poly(I：C)與該RNA奈米結構之間的比較為有希望的。
注意。(+)指示與對照物相比至少一倍差異。(++)指示與對照物相比兩倍或兩倍以上差異。(-)指示與對照物相比很少至無差異。
在多種情況下，該RNA奈米結構比Poly(I：C)表現好。活體外Poly(I：C)與該RNA奈米結構之間之一實例功能差異為其活化之PRR(Poly(I：C)可與RIG-I及MDA5相互作用，且RNA奈米結構不能)。該RNA奈米結構不能活化此等PRR可能發揮優勢，歸因於Poly(I：C)之此等特徵可能促進當Poly(I：C)在高濃度下使用時關於其報告之毒性水準。這可能歸因於某些免疫反應之過表現，結果對宿主有毒，因此使得本文所揭示之RNA奈米結構成為比Poly(I：C)更有利的要求。活體外研究之此等積極結果有助於引起活體內研究。
使用該RNA奈米結構之活體內研究顯示了其可能在治療癌症(例如，在經設計PM模型中，作為一說明性實例)時用作有效治療劑。如表2中所概述，該RNA奈米結構實現了該癌症之生長，尤其在稍早(早於最初治療第一天)執行治療之情況下。
表2 RNA折紙之活體內效應的概述 注意。(+)指示與對照物相比至少一倍差異。(++)指示與對照物相比兩倍或兩倍以上差異。(-)指示與對照物相比很少至無差異。N/A指示該類別並非該研究之一部分。
在多種情況下，已證明該RNA奈米結構引起免疫反應，該免疫反應預防CT26細胞之生長，其中其在成像儀可能實現偵測之前經消除。在其他情況下，可觀察到清楚腫瘤衰退。腫瘤發展最初藉由放大腹部分區及藉由成像儀之螢光偵測均在視覺上可見，但隨著時間的推移及小鼠經治療，該腫瘤最終由免疫系統破壞。另外，顯示了該RNA奈米結構可能導致腫瘤生長延遲，通常在延遲治療研究中(治療第三天及第五天)。與其中小鼠到達其終點比經該RNA奈米結構治療之小鼠快得多之PBS組相比，這是可見的，因此證明了免疫系統之刺激對腫瘤進展的潛在影響。這僅進一步由觀察免疫抑制性細胞及消炎細胞因子之測試的結果支持。經RNA奈米結構治療之小鼠顯示了MDSC以及已知調節且抑制免疫刺激之細胞因子(諸如TGFbβ1、TGFβ2、IL-10及IL-4)以降低水準存在。由腫瘤再攻擊組及主動轉移組兩者均可見該RNA奈米結構趨向於與免疫系統相互作用之甚至更進一步確認。兩種情況均提出了其如何成為適應性免疫系統， 藉由在CT26癌細胞再注射至先前經RNA奈米結構治療之小鼠中時預防該等癌細胞生長，或經RNA奈米結構治療之脾細胞在免疫系統亦受損之新宿主中識別癌症且預防其生長之能力來攻擊癌症。此外，此裸小鼠組亦顯示CT26癌細胞免疫性之發展，意謂該RNA奈米結構可能導致針對癌症株發展記憶T細胞。最後，活體內試驗亦藉由說明該RNA奈米結構可能刺激T細胞、促進活體外研究中發現之相似細胞因子的分泌及引起IFN-γ(幫助上調先天及適應性免疫系統之關鍵細胞因子)之產生來支持初始活體外研究中之一些發現。
因此，某些實施例提供了具免疫刺激性之RNA奈米結構。如本文所用，免疫刺激RNA奈米結構會刺激免疫系統，由此誘導免疫系統之任何組分的活化或增加免疫系統之任何組分的活性。
例如，在某些實施例中，具有免疫刺激特性之RNA奈米結構包含包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之ssRNA分子。
在某些實施例中，該單鏈RNA分子為SEQ ID NO：1，如實例2中所述。如上文及實例中所述，此奈米結構可用作免疫佐劑以增強免疫反應，包括誘導抗腫瘤免疫性。有利的是，此佐劑可藉由生物化學產生容易地按比例增加。
在某些實施例中，如本文所述之RNA奈米結構的免疫刺激活性比PolyIC之免疫刺激活性更有效。
在某些實施例中，該RNA奈米結構之免疫刺激特性可藉由該RNA奈米結構之形狀來改變。在某些實施例中，該RNA奈米結構之免疫刺激特性可藉由ssRNA之序列(例如，環區處之核苷酸組成)來改變。
在某些實施例中，該RNA奈米結構為模式識別受體之促效劑。如本文所用，術語「模式識別受體」或「PRR」係指由先天免疫系統之細胞(諸如樹 突狀細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞及上皮細胞)表現的蛋白質，以鑒別兩個類別之分子：病原體相關分子模式(PAMP)，其與微生物病原體相關；及損傷相關分子模式(DAMP)，其與在細胞損傷或死亡期間釋放之宿主細胞組分相關。PRR亦介導抗原特異性適應性免疫反應之起始及發炎細胞因子之釋放。在某些實施例中，該PRR為toll樣受體(TLR)(例如，TLR3或TLR7)。
RNA奈米結構複合物
在某些實施例中，RNA奈米結構亦可充當用於其他結構之形成之骨架。在某些實施例中，該等RNA奈米結構自身(基礎結構)可由經折疊成所需形狀之單一ssRNA分子組成；然而，如本文所述，該等RNA奈米結構可包含添加至或附接至經折疊奈米結構之劑或其他分子。
因此，某些實施例提供本文所述之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構包含至少一種可操作性連接至該RNA奈米結構之診斷劑。某些實施例亦提供本文所述之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構包含至少一種可操作性連接至該RNA奈米結構之治療劑。
某些實施例亦提供一種複合物，其包含本文所述之RNA奈米結構及至少一種可操作性連接至該RNA奈米結構之診斷及/或治療劑。
在某些實施例中，一或多種劑(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種等)可操作性連接至該RNA奈米結構，諸如診斷劑或治療劑。在某些實施例中，至少一種診斷劑可操作性連接至該RNA奈米結構。在某些實施例中，至少一種治療劑可操作性連接至該RNA奈米結構。在某些實施例中，至少一種診斷劑及至少一種治療劑可操作性連接至該RNA奈米結構。
診斷劑為此項技術中已知的且包括成像劑，例如螢光團、放射性同位素及比色指示劑。
如本文所用，術語「治療劑」包括當投與至個體(例如哺乳動物，諸 如人類)時提供治療所需效應之劑。該劑可具有天然或合成起源。例如，其可為核酸、多肽、蛋白質、肽、放射性同位素、醣或多醣或諸如小分子之有機化合物。術語「小分子」包括具有小於約例如1000道爾頓之分子量的有機分子。在一實施例中，小分子可具有小於約800道爾頓之分子量。在另一實施例中，小分子可具有小於約500道爾頓之分子量。
在某些實施例中，該治療劑為免疫刺激劑、放射性同位素、化學治療藥物(例如，多柔比星)或免疫治療劑(諸如抗體或抗體片段)。在某些實施例中，該治療劑為疫苗，諸如癌症疫苗。在某些實施例中，該治療劑為腫瘤靶向劑，諸如單株腫瘤特異性抗體或適體。在某些實施例中，該治療劑為抗體(例如單株抗體，例如抗PD1抗體)。在某些實施例中，該治療劑為抗原(例如，腫瘤相關抗原或腫瘤特異性抗原)。在某些實施例中，該治療劑為腫瘤抗原肽。
在某些實施例中，該至少一種劑經由連接至單鏈連接體或「把手」或「反把手」(短，例如5至50 nt單鏈核酸：把手與反把手至少部分互補，且可完全互補)可操作性連接至該RNA奈米結構。
該(等)劑與該RNA奈米結構之間的連接不重要且可為可使用已知化學連接該RNA奈米結構及該劑之任何組，只要不干擾該劑或該RNA奈米結構之功能。可用於連接該劑至寡核苷酸之化學為此項技術中已知的，諸如二硫鍵、胺基鍵、共價鍵等。在某些實施例中，可使用熟習此項技術者熟知之脂族或乙二醇連接體。在某些實施例中，使用磷酸二酯、硫代磷酸酯及/或其他經修飾鍵。在某些實施例中，該連接體為結合對。在某些實施例中，該「結合對」係指經由多種分子力中之任一者彼此相互作用之兩種分子，該等分子力包括例如離子、共價、疏水性、範德瓦耳斯及氫鍵結，使得該對具有特異性彼此結合之特性。特異性結合意謂結合對成員在其中其未結合於另一分子之條件下展現彼此結合。結合對之實例為生物素-抗生物素蛋白、激素-受體、受體-配位體、酶-受質探針、 IgG-蛋白A、抗原-抗體、適體-靶標及其類似結合對。在某些實施例中，該結合對之第一成員包含抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素且該結合對之第二成員包含生物素。
組合物及套組
某些實施例亦提供一種包含本文所述之RNA奈米結構及載劑之組合物。某些實施例提供一種包含本文所述之RNA奈米結構複合物及載劑之組合物。在某些實施例中，該組合物包含複數種RNA奈米結構，及載劑。在某些實施例中，該組合物進一步包含至少一種本文所述之治療劑。
在某些實施例中，該組合物為醫藥組合物且該載劑為醫藥學上可接受之載劑。
在某些實施例中，該醫藥組合物進一步包含至少一種治療劑(例如，本文所述之治療劑)。在某些實施例中，該至少一種治療劑為化學治療藥物，諸如多柔比星或環磷醯胺。某些實施例亦提供一種包含如本文所述之RNA奈米結構複合物之疫苗。
某些實施例提供用於實施本發明方法之套組。因此，某些實施例提供一種套組，其包含本文所述之RNA奈米結構或RNA奈米結構複合物及關於投與該RNA奈米結構以誘導免疫反應(例如，抗腫瘤免疫性)或治療疾病或病狀之說明書。在某些實施例中，該套組進一步包含本文所述之治療劑及關於與該RNA奈米結構或RNA奈米結構複合物組合(例如，同時或依序)投與該治療劑之說明書。某些實施例提供一種套組，其包含本文所述之組合物及關於投與該組合物以誘導免疫反應(例如，抗腫瘤免疫性)或治療疾病或病狀之說明書。在某些實施例中，該套組進一步包含本文所述之治療劑及關於與該組合物組合(例如，同時或依序)投與該治療劑之說明書。
某些使用方法
如實例中所述，本文所述之RNA奈米結構、RNA奈米結構複合物或組合物可用作免疫佐劑以增強免疫反應(例如，誘導抗腫瘤免疫性)。
因此，某些實施例提供一種誘導個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構、RNA奈米結構複合物或組合物。
在某些實施例中，該投與增加免疫反應達至少約例如20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高(例如，如與對照物相比)。用於量測免疫反應之方法為此項技術中已知的，例如使用實例中所述之分析。措辭「誘導免疫反應」係指活化免疫細胞。用於量測免疫反應之方法為此項技術中已知的，例如使用實例中所述之分析。措辭「有效量」意謂本文所述之RNA奈米結構或RNA奈米結構複合物的量，其誘導免疫反應。
某些實施例亦提供一種治療個體之疾病或病症之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量的如本文所述之RNA奈米結構、RNA奈米結構複合物或組合物。
某些實施例提供一種方法，其中該方法進一步包含向個體投與至少一種治療劑。
該至少一種治療劑可與該RNA奈米結構、RNA奈米結構複合物或組合物組合投與。如本文所用，措辭「組合(in combination)」係指該RNA奈米結構、RNA奈米結構複合物或組合物及該至少一種治療劑之同時或依序投與。 關於同時投與，該RNA奈米結構、RNA奈米結構複合物或組合物及該至少一種治療劑可存在於單一複合物中或可為獨立的(例如，可藉由相同或不同途徑投與)。
某些實施例提供用於醫學療法中之如本文所述之RNA奈米結構、RNA奈米結構複合物或組合物。
某些實施例提供如本文所述之RNA奈米結構、RNA奈米結構複合物或組合物用於製造用於誘導個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之免疫反應的藥劑之用途。
某些實施例提供如本文所述之RNA奈米結構、RNA奈米結構複合物或組合物與至少一種治療劑組合用於製造用於誘導個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之免疫反應的藥劑之用途。
某些實施例提供用於誘導免疫反應之如本文所述之RNA奈米結構、RNA奈米結構複合物或組合物。
某些實施例提供與至少一種治療劑組合用於誘導免疫反應之如本文所述之RNA奈米結構、RNA奈米結構複合物或組合物。
某些實施例提供如本文所述之RNA奈米結構、RNA奈米結構複合物或組合物用於製造用於治療個體之疾病或病症的藥劑之用途。
某些實施例提供如本文所述之RNA奈米結構、RNA奈米結構複合物或組合物與至少一種治療劑組合用於製造用於治療個體之疾病或病症的藥劑之用途。
某些實施例提供用於預防性或治療性治療疾病或病症之如本文所述之RNA奈米結構、RNA奈米結構複合物或組合物。
某些實施例提供與至少一種治療劑組合用於預防性或治療性治療疾病或病症之如本文所述之RNA奈米結構、RNA奈米結構複合物或組合物。
在某些實施例中，該疾病或病症為需要宿主免疫性之增強之病狀。 在某些實施例中，該疾病或病症為過度增生性病症，諸如癌症。在某些實施例中，該疾病或病症為傳染病。
在某些實施例中，該癌症為癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤或白血病。在某些實施例中，該癌症為實體腫瘤癌症。
在某些實施例中，該癌症為鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、腹膜癌、肝細胞癌、腎細胞癌、胃腸癌、胃癌、食道癌、胰臟癌、神經膠質瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳癌(例如，內分泌抵抗型乳癌)、結腸癌、直腸癌、肺癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、陰門癌、甲狀腺癌、肝癌、黑色素瘤、白血病或頭頸部癌。在某些實施例中，該癌症為乳癌。在某些實施例中，該癌症為結腸癌。在某些實施例中，該癌症為結腸直腸癌。在某些實施例中，該癌症為淋巴瘤。
在某些實施例中，該治療劑為本文所述之治療劑。例如，在某些實施例中，該治療劑為免疫刺激劑、放射性同位素、化學治療藥物(例如，多柔比星)或免疫治療劑(諸如抗體或抗體片段)。在某些實施例中，該治療劑為疫苗，諸如癌症疫苗。在某些實施例中，該治療劑為腫瘤靶向劑，諸如單株腫瘤特異性抗體或適體。在某些實施例中，該治療劑為抗體(例如單株抗體，例如抗PD1抗體)。在某些實施例中，該治療劑為抗原(例如，腫瘤相關抗原或腫瘤特異性抗原)。在某些實施例中，該治療劑為腫瘤抗原肽。
應理解，任何以下方法均可與任何本文所述之其他方法呈一或多種組合使用。
某些實施例提供一種增強/增加個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之促發炎細胞因子之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供一種藉由個體(例如哺乳動物，諸如人類)中toll樣受體3(TLR3)信號傳導路徑之特異性觸發來活化免疫細胞之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供一種如與對照個體相比減慢或抑制個體(例如哺乳 動物，諸如人類)中之腫瘤生長之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供一種如與對照個體相比提高具有腫瘤之個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之抗腫瘤促發炎細胞因子的水準之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供一種如與對照個體相比減少具有腫瘤之個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之消炎細胞因子的水準之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供有效量之如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物，其用於增強/增加個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之促發炎細胞因子。
某些實施例提供有效量之如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物，其用於藉由個體(例如哺乳動物，諸如人類)中toll樣受體3(TLR3)信號傳導路徑之特異性觸發來活化免疫細胞。
某些實施例提供有效量之如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物，其用於如與對照個體相比減慢或抑制個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之腫瘤生長。
某些實施例提供有效量之如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物，其用於如與對照個體相比提高具有腫瘤之個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之抗腫瘤促發炎細胞因子的水準。
某些實施例提供有效量之如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物，其用於如與對照個體相比減少具有腫瘤之個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之消炎細胞因子的水準。
投與
如本文所述，在某些實施例中，方法可包含向個體投與本文所述之 RNA奈米結構，及視情況選用之治療劑。該等化合物(亦即，RNA奈米結構及/或治療劑)可經調配為醫藥組合物且以經調適以用於所選投與途徑(亦即，經口或非經腸、藉由靜脈內、肌肉內、腹膜內或表面或皮下途徑)之多種形式投與至哺乳動物宿主，諸如人類患者。
因此，該等化合物可與醫藥學上可接受之媒劑(諸如惰性稀釋劑或可同化食用之載劑)組合全身性投與，例如經口。其可封入硬或軟殼明膠膠囊中，可經壓製為錠劑，或可直接與患者之膳食的食物合併。關於經口治療性投與，該活性化合物可與一或多種賦形劑組合且以可攝取錠劑、頰錠劑、口含錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙及其類似形式之形式使用。該等組合物及製劑應含有至少0.1%之活性化合物。該等組合物及製劑之百分率當然可變化且可便利地在既定單位劑型之重量的約2至約60%之間。該等治療上適用之組合物中的活性化合物之量使得將獲得有效劑量水準。錠劑、口含錠、丸劑、膠囊及其類似物亦可含有以下：可添加黏合劑，諸如黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米澱粉或明膠；賦形劑，諸如磷酸二鈣；崩解劑，諸如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、褐藻酸及其類似物；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂；及甜味劑，諸如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜糖；或調味劑，諸如薄荷、冬青油或櫻桃調味劑。當單位劑型為膠囊時，除以上類型之材料以外，其亦可含有液體載劑，諸如植物油或聚乙二醇。多種其他材料可作為包衣存在或可存在以另外修飾固體單位劑型之實物形式。舉例而言，錠劑、丸劑或膠囊可經明膠、蠟、蟲膠或糖及其類似物包覆。糖漿或酏劑可含有活性化合物、作為甜味劑之蔗糖或果糖、作為防腐劑之對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、染料及調味劑(諸如櫻桃或橙調味劑)。當然，用於製備任何單位劑型之任何材料均應為醫藥學上可接受的且在所用之量下實質上無毒。此外，活性化合物可併入持續釋放製劑及器件中。
該活性化合物亦可藉由輸注或注射經靜脈內或腹膜內投與。該活性 化合物或其鹽之溶液可在水中製備，視情況與無毒界面活性劑混合。亦可於甘油、液體聚乙二醇、三乙酸甘油酯及其混合物中及於油中製備分散液。在一般儲存及使用條件下，此等製劑含有防腐劑以防止微生物生長。
適用於注射或輸注之醫藥劑型可包括包含該活性成分之無菌水溶液或分散液或無菌粉末，其經調適用於無菌可注射或可輸注溶液或分散液之臨時製備，視情況經封裝於脂質體中。在所有情況下，最終劑型均應在製造及儲存條件下為無菌、流體且穩定的。液體載劑或媒劑可為包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及其類似物)、植物油或無毒甘油酯及其合適混合物之溶劑或液體分散介質。適當流動性可例如藉由形成脂質體、在分散液之情況下藉由維持所需粒徑或藉由使用界面活性劑加以維持。微生物作用之預防可藉由多種抗細菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及其類似物來引起。在多種情況下，可包括等張劑，例如糖、緩衝液或氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由在該等組合物中使用延遲吸收之劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來引起。
無菌可注射溶液藉由將所需量之活性化合物與所需的多種在上文列舉之其他成分一起併入適當溶劑中，隨後過濾滅菌來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥技術，該等技術生成活性成分加上存在於先前經無菌過濾之溶液中的任何額外所需成分之粉末。
關於表面投與，本發明化合物可以純形式應用，亦即當其為液體時。然而，一般將合乎需要的是其以與皮膚學上可接受之可為固體或液體之載劑組合的組合物或調配物形式投與至皮膚。
適用之固體載劑包括精細分散之固體，諸如滑石、黏土、微晶纖維素、矽石、氧化鋁及其類似物。適用之液體載劑包括水、醇或二醇或水-醇/二醇 混合物，其中本發明化合物可以有效水準溶解或分散，視情況藉助於無毒界面活性劑。可添加諸如芳香劑及額外抗微生物劑之佐劑以最佳化針對既定用途之特性。所得液體組合物可自吸收墊應用，用於浸漬繃帶及其他敷料，或使用泵型或氣霧劑噴霧器噴霧於受影響區域上。
諸如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽及酯、脂肪醇、改質纖維素或改質礦物材料之增稠劑亦可與液體載劑一起用於形成直接應用於使用者之皮膚的可塗敷糊劑、凝膠、軟膏、皂劑及其類似物。
可用於遞送化合物至皮膚之適用皮膚病學組合物之實例為此項技術中已知的；例如，參見Jacquet等人(美國專利第4,608,392號)、Geria(美國專利第4,992,478號)、Smith等人(美國專利第4,559,157號)及Wortzman(美國專利第4,820,508號)。
化合物之適用劑量可藉由在動物模型中比較其活體外活性及活體內活性來測定。用於將小鼠及其他動物中之有效劑量外推至人類之方法為此項技術中已知的；例如，參見美國專利第4,938,949號。
用於治療所需之該化合物或其活性鹽或衍生物的量不僅將隨所選擇之特定鹽變化，而且將隨投與途徑、所治療之病狀的性質及患者之年齡及狀況變化，且最終將由巡診醫師或臨床醫師判斷。
該化合物可便利地以單位劑型經調配。某些實施例提供一種組合物，其包含以該單位劑型經調配之化合物。所需劑量可便利地以單一劑量呈遞或以在適當時間間隔下投與之分次劑量形式，例如以每天兩次、三次、四次或四次以上子劑量形式呈遞。子劑量自身可進一步分成例如多次個別寬鬆間隔之投與；諸如自吹入器進行多次吸入或藉由向眼中應用複數滴。
某些定義
如本文所用，術語「約」意謂±10%。
「可操作性連接」係指兩個化學部分之締合，使得一個化學部分之功能受另一者影響，例如要素之如下安排，其中如此描述之組分經組態以便執行其通常功能。
術語「核酸」係指呈單鏈或雙鏈形式之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，由含有糖、磷酸酯及鹼基嘌呤或嘧啶之單體(核苷酸)製得。除非特定地加以限制，否則該術語涵蓋含有天然核苷酸之已知類似物的核酸，其具有與參考核酸相似之結合特性且以類似於天然存在之核苷酸的方式代謝。除非另外指示，否則特定核酸序列亦涵蓋其經保守修飾之變異體(例如，簡併密碼子取代)及互補序列，以及明確指示之序列。特定言之，簡併密碼子取代可藉由產生如下序列來實現，在該等序列中一或多個所選(或全部)密碼子之第三位置經混合鹼基及/或去氧肌苷殘基取代。
術語「核苷酸序列」及「核酸序列」及「核酸鏈」係指DNA或RNA聚合物中之鹼基(嘌呤及/或嘧啶)的序列，其可為單鏈或雙鏈，視情況含有能夠併入至DNA或RNA聚合物中之合成、非天然或經改變核苷酸鹼基，及/或骨架修飾(例如經修飾寡聚物，諸如嗎啉基寡聚物、二胺基磷酸嗎啉基寡聚物或活性-嗎啉基(vivo-mopholino))。術語「寡聚物(oligo)」、「寡核苷酸(oligonucleotide)」及「寡聚物(oligomer)」可互換使用且係指嘌呤及/或嘧啶之該等序列。術語「經修飾oligo(modified oligos)」、「經修飾寡核苷酸(modified oligonucleotides)」或「經修飾寡聚物(modified oligomers)」同樣可互換使用，且係指含有合成、非天然或經改變鹼基及/或骨架修飾(例如，針對核苷酸間磷酸酯鍵及/或針對骨架糖之化學修飾)之該等序列。
經修飾核苷酸為此項技術中已知的且包括例如且不限於烷基化嘌呤及/或嘧啶；醯化嘌呤及/或嘧啶；或其他雜環。嘧啶及嘌呤之此等類別為此項技術中已知的且包括假異胞嘧啶；N4,N4-橋亞乙基胞嘧啶；8-羥基-N6-甲基腺嘌 呤；4-乙醯基胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-羧基甲基胺基甲基-2-硫尿嘧啶；5-羧基甲基胺基甲基尿嘧啶；二氫尿嘧啶；肌苷；N6-異戊基-腺嘌呤；1-甲基腺嘌呤；1-甲基假尿嘧啶；1-甲基鳥嘌呤；2,2-二甲基鳥嘌呤；2-甲基腺嘌呤；2-甲基鳥嘌呤；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N6-甲基腺嘌呤；7-甲基鳥嘌呤；5-甲基胺基甲基尿嘧啶；5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶；β-D-甘露糖基辮苷；5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶；5-甲氧基尿嘧啶；2-甲基硫-N6-異戊烯基腺嘌呤；尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯；假尿嘧啶；2-硫胞嘧啶；5-甲基-2硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶；4-硫尿嘧啶；5-甲基尿嘧啶；N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯；尿嘧啶5-氧乙酸；辮苷；2-硫胞嘧啶；5-丙基尿嘧啶；5-丙基胞嘧啶；5-乙基尿嘧啶；5-乙基胞嘧啶；5-丁基尿嘧啶；5-戊基尿嘧啶；5-戊基胞嘧啶；及2,6,-二胺基嘌呤；甲基假尿嘧啶；1-甲基鳥嘌呤；1-甲基胞嘧啶。骨架修飾同樣為此項技術中已知的，且包括針對磷酸酯鍵(例如，二胺基磷酸酯、硫代磷酸酯(PS)、N3'胺基磷酸酯(NP)、硼烷磷酸酯、2',5'磷酸二酯、醯胺連接、膦酸乙酸酯(PACE)、嗎啉基、肽核酸(PNA)及反向鍵(5'-5'及3'-3'鍵))之化學修飾及糖修飾(例如，2'-O-Me、UNA、LNA)。
本文所述之寡核苷酸可使用此項技術中已知的標準固相或溶液相合成技術來合成。在某些實施例中，該等寡核苷酸使用固相亞磷醯胺化學(美國專利第6,773,885號)用自動化合成儀合成。核酸之化學合成允許產生多種形式的核酸，該等核酸具有經修飾鍵、嵌合組合物及在經由核酸之完整長度選擇的位置中附接之非標準鹼基或修飾性基團。
某些實施例涵蓋經分離或實質上經純化之核酸組合物。「經分離」或「經純化」之DNA分子或RNA分子為遠離其原生環境存在的DNA分子或RNA分子且因此並非天然產物。經分離之DNA分子或RNA分子可以經純化形式存在或可存在於非原生環境(諸如轉殖基因宿主細胞)中。例如，「經分離」或 「經純化」之核酸分子當藉由重組技術產生時實質上不含其他細胞材料或培養基，或當以化學方式合成時實質上不含化學前驅體或其他化學品。在一實施例中，「經分離」核酸不含天然地側接得到該核酸之生物體之基因組DNA中的核酸(亦即，位於該核酸之5'及3'末端處的序列)之序列。
當「部分」或「片段」與核酸分子、序列或片段相關時，當其連接至用於表現之其他序列時，其意謂具有至少80個核苷酸、至少150個核苷酸或至少400個核苷酸之序列。若未用於表現，則「部分」或「片段」意謂對應於本文所述之核酸分子的核苷酸序列之至少9個、至少12個、至少15個或至少20個連續核苷酸，例如探針及引子(寡核苷酸)。
「重組DNA分子」為使用重組DNA技術及用於使DNA序列接合在一起之程序(如例如Sambrook及Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press(第3版，2001)中所述)接合在一起的DNA序列之組合。
「同源性」係指兩個聚核苷酸或兩個多肽序列之間之百分比一致性。當兩個RNA或多肽序列在該等序列之確定長度內展現至少約75%至85%(包括75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%及85%)、至少約90%或至少約95%至99%(包括95%、96%、97%、98%、99%)鄰接序列一致性時，該等序列彼此「同源」。
以下術語用於描述兩個或兩個以上核苷酸序列之間之序列關係：(a)「參考序列」、(b)「比較窗」、(c)「序列一致性」、(d)「序列一致性之百分率」、(e)「實質一致性」及(f)「互補性」。
(a)如本文所用，「參考序列」為用作序列比較之基礎之確定序列。參考序列可為規定序列之子集或全部；例如，呈全長cDNA或基因序列之區段或完全cDNA或基因序列形式。
(b)如本文所用，「比較窗」提及聚核苷酸序列之鄰接且規定區段，其中該比較窗中之聚核苷酸序列與用於兩個序列之最佳比對的參考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(亦即，間隙)。一般而言，比較窗為至少20個鄰接核苷酸長，且視情況可為30、40、50、100個或更長。熟習此項技術者應理解，為了避免與參考序列之高相似性，歸因於聚核苷酸序列中包括間隙，典型地引入間隙罰分且自匹配之數目中減去。
用於比較之序列之比對方法為此項技術中熟知的。因此，任何兩個序列之間之百分比一致性(包括序列互補性)的測定可使用數學算法來實現。該等數學算法之非限制性實例為Myers及Miller之算法(Myers及Miller,CABIOS,4,11(1988))；Smith等人(Smith等人，Adv.Appl.Math.,2,482(1981))之局部同源性算法；Needleman及Wunsch(Needleman及Wunsch,JMB,48,443(1970))之同源比對算法；Pearson及Lipman(Pearson及Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,2444(1988))之搜索相似性方法；Karlin及Altschul(Karlin及Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,2264(1990))之算法，如Karlin及Altschul(Karlin及Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5873(1993))中經修改。
此等數學算法之電腦實施可用於序列比較以測定序列一致性或互補性。該等實施包括但不限於：PC/Gene程式(可獲自Intelligenetics,Mountain View,Calif.)中之CLUSTAL；Wisconsin Genetics套裝軟體，第8版(可獲自Genetics Computer Group(GCG),575 Science Drive,Madison,Wis.,USA)中之ALIGN程式(第2.0版)及GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及TFASTA。使用此等程式之比對可使用預設參數來執行。CLUSTAL程式由Higgins等人(Higgins等人，CABIOS,5,151(1989))；Corpet等人(Corpet等人，Nucl.Acids Res.,16,10881(1988))；Huang等人(Huang等人，CABIOS,8,155(1992))；及Pearson等人(Pearson等人，Meth.Mol.Biol.,24,307(1994))充分描述。ALIGN程式係基於Myers及 Miller之算法，上述。Altschul等人(Altschul等人，JMB,215,403(1990))之BLAST程式係基於Karlin及Altschul之算法，上述。
用於執行BLAST分析之軟體經由美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開可獲得。此算法涉及首先藉由鑒別查詢序列中長度W之短字來鑒別高評分序列對(HSP)，該等短字當與數據庫序列中相同長度之字比對時匹配或滿足一些正值閾值分數T。T係稱作相鄰字分數閾值。此等初始相鄰字命中充當用於起始搜索以發現含有該等命中之較長HSP的啟動源。該等字命中接著沿著各序列之兩個方向延伸，直至累積比對分數可增加。關於核苷酸序列，累積分數使用參數M(針對一對匹配殘基之獎勵分數；始終>0)及N(針對錯配殘基之罰分；始終<0)來計算。關於胺基酸序列，使用評分矩陣來計算累積分數。當累積比對分數下降至距其最大實現值達量X，該累積分數歸因於一或多個評負分殘基比對之積聚而達到零或更低，或到達任一序列之末端時，停止各方向中字命中之延伸。
除了計算百分比序列一致性以外，該BLAST算法亦執行兩個序列之間之相似性的統計學分析。由BLAST算法提供之一種相似性量度為最小和可能性(P(N))，其提供了兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然將出現匹配的可能性之指示。例如，若測試核酸序列與參考核酸序列之比較中的最小和可能性小於約0.1、小於約0.01或甚至小於約0.001，則該測試核酸序列被視為類似於該參考序列。
為了獲得出於比較目的之間隙比對，可使用間隙BLAST(BLAST 2.0)。或者，可使用PSI-BLAST(BLAST 2.0)來執行迭代搜索，該搜索偵測分子之間之疏遠關係。當使用BLAST、間隙BLAST、PSI-BLAST時，可使用各別程式(例如，關於核苷酸序列為BLASTN，關於蛋白質為BLASTX)之預設參數。BLASTN程式(關於核苷酸序列)使用如下預設值：字長(W)為11，預期值(E)為10，截止值為100，M=5，N=-4，及兩條鏈之比較。關於胺基酸序列，BLASTP程式使用 如下預設值：字長(W)為3，預期值(E)為10，及BLOSUM62評分矩陣。比對亦可藉由檢查手動地執行。
出於本文所述之實施例之目的，用於百分比序列一致性的測定之核苷酸序列之比較可使用具有其預設參數之BlastN程式(第1.4.7版或後來版本)或任何相等程式來進行。「相等程式」意謂任何序列比較程式，關於所論述之任何兩個序列，當與藉由上述程式產生之相應比對相比時，該程式會產生具有一致核苷酸或胺基酸殘基匹配及一致百分比序列一致性之比對。
(c)如本文所用，在兩個核酸或多肽序列之情況下「序列一致性」或「一致性」提及該兩個序列中，當在規定比較窗中針對最大對應進行比對時，如藉由序列比較算法或藉由視覺檢查所量測相同之殘基的規定百分率。
(d)如本文所用，「序列一致性之百分率」意謂藉由在比較窗中比較兩個最佳比對之序列所測定的值，其中該比較窗中之聚核苷酸序列的部分如與用於兩個序列之最佳比對的參考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(亦即，間隙)。該百分率藉由測定在兩個序列中存在一致核酸鹼基或胺基酸殘基之位置的數目以生成匹配位置之數目，使匹配位置之數目除以比較窗中的位置總數，且使結果乘以100以生成序列一致性之百分率來計算。
(e)(i)術語聚核苷酸序列之「實質一致性」意謂聚核苷酸包含如下序列，使用使用標準參數描述之算法程式之一與參考序列相比，該序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%或94%或甚至至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
關於序列比較，典型地，一個序列充當與測試序列進行比較之參考序列。當使用序列比較算法時，將測試及參考序列輸入電腦中，必要時指定子序列座標，且指定序列算法程式參數。該序列比較算法接著基於指定之程式參 數計算該(等)測試序列相對於該參考序列之百分比序列一致性。
核苷酸序列實質上一致之另一指示在於兩種分子是否在嚴格條件下彼此雜交。一般而言，嚴格條件經選擇為針對特定序列，在確定離子強度及pH下，比熱熔點(Tm)低約5℃。然而，嚴格條件涵蓋約1℃至約20℃範圍內之溫度，取決於如本文中另外限定之所需嚴格程度。若在嚴格條件下並未彼此雜交之核酸編碼的多肽實質上一致，則該等核酸仍實質上一致。此可發生於例如使用由遺傳密碼准許之最大密碼子簡併性產生核酸複本時。兩個核酸序列實質上一致之一指示在於，當由第一核酸編碼之多肽在免疫學上可與由第二核酸編碼之多肽交叉反應時。
措辭「特異性雜交(hybridizing specifically to)」係指當特定核苷酸序列存在於複雜混合物(例如，總細胞)DNA或RNA中時在嚴格條件下僅一種分子與該序列結合、形成雙螺旋或雜交。「實質上結合」係指探針核酸與靶標核酸之間的互補雜交且涵蓋較少錯配，該等錯配可藉由降低雜交培養基之嚴格度以實現靶標核酸序列之所需偵測而提供。
如本文所用，術語「互補」係指在關於彼此之反義位置中比對之兩個核酸之間的互補鹼基配對之廣泛概念。當兩種分子中之核苷酸位置由通常能夠彼此鹼基配對之核苷酸佔據時，則該等核酸被視為在此位置處彼此互補。因此，當兩種核酸中之每一者中的相應位置之至少約50%、至少約60%或至少約80%由通常彼此鹼基配對之核苷酸(例如，A：T(關於RNA，A：U)及G：C核苷酸對)佔據時，該等分子實質上彼此互補。
如本文所用，關於核苷酸分子之術語「得到(derived)」或「針對(directed to)」意謂該分子與所關注之特定分子具有互補序列一致性。
如本文所用，術語「個體」係指人類、高等非人類靈長類動物、齧齒動物、家畜、牛、馬、豬、綿羊、犬及貓。在某些實施例中，該個體為人類。
關於治療疾病狀態/病狀之術語「治療有效量」係指當以單一劑量形式或以多個劑量投與時能夠對疾病狀態/病狀之任何症狀、態樣或特徵具有任何可偵測、積極影響之治療劑的量。該影響無需絕對為有益的。
術語「治療(treat)」及「治療(treatment)」係指治療性治療及預防性措施，其中目標在於預防或減少不需要之生理學改變或病症。有益或所需臨床結果包括但不限於症狀之減輕、疾病程度之削弱、疾病的穩定化(亦即，未惡化)狀態、延遲或減慢疾病進展、疾病狀態之改善或緩和以及緩解(部分或全部)，無論可偵測抑或不可偵測。「治療」亦可意謂如與未接受治療之情況下的預期生存相比，延長生存。需要治療者包括已經具有該病狀或病症者以及傾向於具有該病狀或病症者或其中意欲預防該病狀或病症者。
措辭「治療有效量」意謂本文所述之化合物、RNA奈米結構或組合物之量，其(i)治療特定疾病、病狀或病症，(ii)減弱、改善或消除該特定疾病、病狀或病症的一或多種症狀，或(iii)預防或延遲本文所述之特定疾病、病狀或病症的一或多種症狀之發作。在癌症之情況下，該RNA奈米結構/治療劑之治療有效量可降低癌細胞的數目；降低腫瘤大小；抑制(亦即，在某種程度上減慢且較佳地停止)癌細胞浸潤至周圍器官中；抑制(亦即，在某種程度上減慢且較佳地停止)腫瘤轉移；在某種程度上抑制腫瘤生長；及/或在某種程度上減輕與該癌症相關之一或多種症狀。就該RNA奈米結構/治療劑可預防生長及/或殺死現有癌細胞而言，其可為細胞抑制性及/或細胞毒性的。關於癌症療法，功效可例如藉由分析疾病進展時間及/或測定反應率(RR)來量測。
術語「癌症」及「癌的」係指或描述哺乳動物中之生理學病狀，其特徵典型地在於未調節細胞生長。「腫瘤」包含一或多個癌細胞。癌症之實例包括但不限於癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病或淋巴惡性腫瘤。該等癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌(例如，上皮鱗狀細胞癌)、包括小細胞肺癌、 非小細胞肺癌(「NSCLC」)、肺腺癌及肺鱗狀細胞癌在內之肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、包括胃腸癌在內之胃癌、胰臟癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、陰門癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌以及頭頸部癌。如本文所用，胃癌包括如下胃癌，其可在胃之任何部分中發展且可在胃中擴散且至其他器官；特別地，食道、肺、淋巴結及肝。
「化學治療劑」為適用於癌症治療之生物(大分子)或化學(小分子)化合物，無論作用機制如何。化學治療劑之類別包括但不限於烷基化劑、抗代謝物、紡錘體毒物植物生物鹼、細胞毒性/抗腫瘤抗生素、拓撲異構酶抑制劑、蛋白質、抗體、光敏劑及激酶抑制劑。化學治療劑包括用於「靶向療法」及非靶向習知化學療法之化合物。
如本文所用，術語「協同(synergistic)」係指治療組合，其比兩種或兩種以上單一劑之相加效應更有效。組合療法可提供「協同作用(synergy)」且證明「協同」，亦即，當一起使用活性成分時實現之效應大於單獨地使用該等化合物所引起的效應之總和。當活性成分如下時，可獲得協同效應：(1)在組合、單位劑量調配物中共調配且同時投與或遞送；(2)以獨立調配物形式交替或平行遞送；或(3)藉由一些其他方案。當以交替療法遞送時，當該等化合物例如藉由在獨立注射器中之不同注射依序投與或遞送時，可獲得協同效應。一般而言，在交替療法期間，各活性成分之有效劑量依序(亦即，連續地)經投與，而在組合療法中，兩種或兩種以上活性成分之有效劑量一起經投與。
此部分提供了用於測定針對靶標病變之客觀腫瘤反應之準則的定義。「完全反應」(CR)用於意謂具有病理學淋巴結(靶標或非靶標)之所有可觀測靶標病變之消失，該等淋巴結在短軸中降低至小於約10mm。「部分反應」(PR)用於意謂靶標病變之直徑的總和之至少約30%減少，直徑之基線總和被視作參考。 「進行性疾病」(PD)用於意謂靶標病變之直徑的總和之至少約20%增加，研究中之最小總和(最低點)被視作參考，包括基線。除了約20%之相對增加以外，該總和亦證明了至少約5mm之絕對增加。在一實例中，一或多個新病變之出現被視為PD。「穩定疾病」(SD)用於意謂既未充分收縮至有資格充任PR，亦未充分增加至有資格充任PD，研究中之最小總和被視作參考。
某些實施例
某些實施例提供一種複合物，其包含RNA奈米結構及至少一種可操作性連接至該RNA奈米結構之診斷及/或治療劑。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含一種單鏈RNA(ssRNA)分子，其中該ssRNA分子以某一方式折疊以產生至少一個平行內聚交叉，且其中該RNA奈米結構具有免疫刺激特性。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含一種單鏈RNA(ssRNA)分子，其中該ssRNA分子包含複數個雙螺旋區及至少一個可操作性連接於兩個雙螺旋區之間的平行交叉，且其中該RNA奈米結構具有免疫刺激特性。
在某些實施例中，該ssRNA分子包含至少兩個平行雙螺旋。
在某些實施例中，該RNA奈米結構之約60-99%為雙鏈且該RNA奈米結構之約1-40%為單鏈。
在某些實施例中，該RNA奈米結構之約95%為雙鏈且該RNA奈米結構之約5%為單鏈。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含矩形折紙奈米結構。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含約1500個至約2500個核苷酸長之核酸序列。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含與SEQ ID NO：1具有至少約75%序列一致性之核酸序列。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含與SEQ ID NO：1具有至少約85%序列一致性之核酸序列。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含與SEQ ID NO：1具有至少約90%序列一致性之核酸序列。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含與SEQ ID NO：1具有至少約95%序列一致性之核酸序列。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含與SEQ ID NO：1具有至少約95%序列一致性之核酸序列。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含SEQ ID NO：1。
在某些實施例中，該RNA奈米結構由SEQ ID NO：1組成。
在某些實施例中，該RNA奈米結構之核酸序列為約1500個至約2500個核苷酸長。
在某些實施例中，RNA奈米結構包含至少一個平行內聚交叉。
在某些實施例中，該診斷或治療劑為包含帶正電部分之肽。
在某些實施例中，該帶正電部分為包含約5個至20個帶正電胺基酸之肽。
在某些實施例中，該帶正電部分為包含約8個至12個帶正電胺基酸之肽。
在某些實施例中，該帶正電部分為包含約10個帶正電胺基酸之肽。
在某些實施例中，該帶正電部分為包含10個離胺酸殘基之肽。
在某些實施例中，該肽為腫瘤靶向肽(TTP)、人類癌症肽、傳染劑肽或鈣網蛋白。
在某些實施例中，該傳染劑肽為對針對流感、HIV、HCV之免疫性中所牽涉的CD8+ T細胞及其他傳染劑具特異性之抗原決定基。
在某些實施例中，該蛋白質為鈣網蛋白。鈣網蛋白允許該RNA-折紙參與腫瘤細胞與巨噬細胞或樹突狀細胞之間的相互作用以增強抗原呈現及刺激抗原特異性T細胞。
在某些實施例中，該蛋白質為人類癌症肽NY-ESO-1或Muc1。
在某些實施例中，該至少一種治療劑為腫瘤抗原肽。
在某些實施例中，該TTP為CTKD-K10(CTKDNNLLGRFELSGGGSK10)。
在某些實施例中，RNA奈米結構複合物之第二組分為腫瘤特異性抗原。
在某些實施例中，該腫瘤特異性抗原為TKD。應理解，腫瘤特異性抗原可經修飾以增強複合物形成、調節RNA奈米結構：腫瘤特異性抗原比率及可操作性連接一或多種劑。在某些實施例中，該腫瘤特異性抗原為經修飾以在N端處添加C之TKD。在某些實施例中，該腫瘤特異性抗原為經修飾以在C端處添加1至15個離胺酸殘基之TKD。在某些實施例中，該腫瘤特異性抗原為經修飾以在C端處添加10個離胺酸殘基之TKD。在某些實施例中，該腫瘤特異性抗原為經修飾以在N端處添加C且在C端處添加1至15個離胺酸之TKD。在某些實施例中，該腫瘤特異性抗原為經修飾以在N端處添加C且在C端處添加10個離胺酸之TKD。
某些實施例提供一種醫藥組合物，其包含本文所述之複合物及醫藥學上可接受之載劑。
某些實施例提供描述於本文中且進一步包含至少一種治療劑之醫藥組合物。
在某些實施例中，該至少一種治療劑為化學治療藥物。在某些實施例中，該化學治療藥物為多柔比星。
某些實施例提供一種誘導個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之複合物或組合物。
某些實施例提供一種治療個體之疾病或病症之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量的如本文所述之複合物或組合物。
在某些實施例中，該疾病或病症為癌症。
在某些實施例中，該癌症為乳癌。
在某些實施例中，該癌症為結腸癌。
在某些實施例中，該癌症為淋巴瘤。
在某些實施例中，該方法進一步包含向該個體投與至少一種治療劑。
在某些實施例中，該至少一種治療劑為腫瘤靶向劑。
在某些實施例中，該腫瘤靶向劑為單株腫瘤特異性抗體或適體。
某些實施例提供一種增強/增加個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之促發炎細胞因子之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之複合物或組合物。
某些實施例提供一種藉由個體(例如哺乳動物，諸如人類)中TLR3信號傳導路徑之特異性觸發來活化免疫細胞之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之複合物或組合物。
某些實施例提供一種如與對照個體相比減慢或抑制個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之腫瘤生長之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之複合物或組合物。
某些實施例提供一種如與對照個體相比提高具有腫瘤之個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之抗腫瘤促發炎細胞因子的水準之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之複合物或組合物。
某些實施例提供一種如與對照個體相比減少具有腫瘤之個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之消炎細胞因子的水準之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之複合物或組合物。
某些實施例提供如本文所述之複合物或組合物用於製造用於誘導個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之免疫反應的藥劑之用途。
某些實施例提供用於誘導免疫反應之如本文所述之複合物或組合物。
某些實施例提供如本文所述之複合物或組合物用於製造用於治療個體之疾病或病症的藥劑之用途。
某些實施例提供用於預防性或治療性治療疾病或病症之如本文所述之複合物或組合物。
某些實施例提供一種套組，其包含如本文所述之複合物或組合物及關於向個體投與該RNA奈米結構/組合物以誘導免疫反應或治療疾病或病症之說明書。
在某些實施例中，該套組進一步包含至少一種治療劑。
在某些實施例中，該RNA奈米結構為如實例或圖中所述之奈米結構。
某些實施例提供包含一種單鏈RNA(ssRNA)分子之RNA奈米結構，其中該ssRNA分子形成至少一個平行內聚交叉，且其中該RNA奈米結構具有免疫刺激特性。
在某些實施例中，該RNA奈米結構為RNA矩形折紙奈米結構。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含約1500個至約2500個核苷酸長之核酸序列。
某些實施例提供包含與SEQ ID NO：1具有至少約75%序列一致性之 核酸序列之RNA奈米結構。
在某些實施例中，該核酸序列與SEQ ID NO：1具有至少約85%序列一致性。
在某些實施例中，該核酸序列與SEQ ID NO：1具有至少約95%序列一致性。
在某些實施例中，該核酸序列與SEQ ID NO：1具有至少約99%序列一致性。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含SEQ ID NO：1。
在某些實施例中，該RNA奈米結構由SEQ ID NO：1組成。
在某些實施例中，該核酸序列為約1500個至約2500個核苷酸長。
在某些實施例中，RNA奈米結構包含至少一個平行內聚交叉。
在某些實施例中，該RNA奈米結構為RNA矩形折紙奈米結構。
在某些實施例中，該RNA奈米結構為模式識別受體之促效劑。
在某些實施例中，至少一種診斷劑可操作性連接至該RNA奈米結構。
在某些實施例中，至少一種治療劑可操作性連接至該RNA奈米結構。
在某些實施例中，該至少一種治療劑為腫瘤抗原肽。
某些實施例提供一種醫藥組合物，其包含本文所述之RNA奈米結構及醫藥學上可接受之載劑。
在某些實施例中，該醫藥組合物進一步包含至少一種治療劑。
在某些實施例中，該至少一種治療劑為化學治療藥物(例如，多柔比星)。
某些實施例提供一種誘導個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之免疫反 應之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構或如本文所述之組合物。
某些實施例提供一種治療個體之疾病或病症之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量的如本文所述之RNA奈米結構或如本文所述之組合物。
在某些實施例中，該疾病或病症為癌症。
在某些實施例中，該癌症為乳癌。
在某些實施例中，該方法進一步包含向該個體投與至少一種治療劑。
在某些實施例中，該至少一種治療劑為腫瘤靶向劑(例如，單株腫瘤特異性抗體或適體)。
某些實施例提供如本文所述之RNA奈米結構或如本文所述之組合物用於製造用於誘導個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之免疫反應的藥劑之用途。
某些實施例提供用於誘導免疫反應之如本文所述之RNA奈米結構或如本文所述之組合物。
某些實施例提供用於製造用於治療個體之疾病或病症之藥劑的如本文所述之RNA奈米結構或如本文所述之組合物。
某些實施例提供用於預防性或治療性治療疾病或病症之如本文所述之RNA奈米結構或如本文所述之組合物。
某些實施例提供一種套組，其包含如本文所述之RNA奈米結構或如本文所述之組合物及關於向個體投與該RNA奈米結構/組合物以誘導免疫反應或治療疾病或病症之說明書。
在某些實施例中，該套組進一步包含至少一種治療劑。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含約15個至約20000個核苷 酸長之核酸序列。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含約1000個至約12000個核苷酸長之核酸序列。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含約1000個至約10000個核苷酸長之核酸序列。
某些實施例提供包含一種單鏈RNA(ssRNA)分子之RNA奈米結構，其中該至少一種ssRNA分子包含複數個雙螺旋區及至少一個可操作性連接於兩個雙螺旋區之間的平行交叉，且其中該RNA奈米結構具有免疫刺激特性。
在某些實施例中，該ssRNA分子包含至少兩個平行雙螺旋。
在某些實施例中，該ssRNA分子包含至少七個平行雙螺旋。
在某些實施例中，該RNA奈米結構為RNA矩形折紙奈米結構。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含約1500個至約2500個核苷酸長之核酸序列。
某些實施例提供包含與SEQ ID NO：1具有至少約75%序列一致性之核酸序列之RNA奈米結構。
在某些實施例中，該核酸序列與SEQ ID NO：1具有至少約85%序列一致性。
在某些實施例中，該核酸序列與SEQ ID NO：1具有至少約95%序列一致性。
在某些實施例中，該核酸序列與SEQ ID NO：1具有至少約99%序列一致性。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含SEQ ID NO：1。
在某些實施例中，該RNA奈米結構由SEQ ID NO：1組成。
在某些實施例中，該核酸序列為約1500個至約2500個核苷酸長。
在某些實施例中，RNA奈米結構包含至少一個平行內聚交叉。
在某些實施例中，該RNA奈米結構為RNA矩形折紙奈米結構。
在某些實施例中，該RNA奈米結構為模式識別受體之促效劑。
某些實施例提供一種複合物，其包含本文所述之RNA奈米結構及至少一種可操作性連接至該RNA奈米結構之診斷劑。
某些實施例提供一種包含本文所述之RNA奈米結構之複合物，其中至少一種治療劑可操作性連接至該RNA奈米結構。
某些實施例提供一種包含本文所述之RNA奈米結構之複合物，其中該至少一種治療劑為腫瘤抗原肽。
某些實施例提供一種醫藥組合物，其包含本文所述之RNA奈米結構或複合物及醫藥學上可接受之載劑。
在某些實施例中，該醫藥組合物進一步包含至少一種治療劑。
在某些實施例中，該至少一種治療劑為化學治療藥物。
在某些實施例中，該化學治療藥物為多柔比星。
某些實施例提供一種誘導個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構或本文所述之複合物或本文所述之組合物。
某些實施例提供一種治療個體之疾病或病症之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量的如本文所述之RNA奈米結構或本文所述之複合物或如本文所述之組合物。
在某些實施例中，該疾病或病症為癌症。
在某些實施例中，該癌症為乳癌。
在某些實施例中，該癌症為結腸癌。
在某些實施例中，該方法進一步包含向該個體投與至少一種治療 劑。
在某些實施例中，該至少一種治療劑為腫瘤靶向劑。
在某些實施例中，該腫瘤靶向劑為單株腫瘤特異性抗體或適體。
某些實施例提供一種增強/增加個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之促發炎細胞因子之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構或本文所述之複合物或如本文所述之組合物。
某些實施例提供一種藉由個體(例如哺乳動物，諸如人類)中TLR3信號傳導路徑之特異性觸發來活化免疫細胞之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構或本文所述之複合物或如本文所述之組合物。
某些實施例提供一種如與對照個體相比減慢或抑制個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之腫瘤生長之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構或本文所述之複合物或如本文所述之組合物。
某些實施例提供一種如與對照個體相比提高具有腫瘤之個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之抗腫瘤促發炎細胞因子的水準之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構或本文所述之複合物或如本文所述之組合物。
某些實施例提供一種如與對照個體相比減少具有腫瘤之個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之消炎細胞因子的水準之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構或本文所述之複合物或如本文所述之組合物。
某些實施例提供如本文所述之RNA奈米結構或本文所述之複合物或如所述之組合物用於製造用於誘導個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之免疫反應的藥劑之用途。
某些實施例提供用於誘導免疫反應之如本文所述之RNA奈米結構或本文所述之複合物或如本文所述之組合物。
某些實施例提供如本文所述之RNA奈米結構或本文所述之複合物或如本文所述之組合物用於製造用於治療個體之疾病或病症的藥劑之用途。
某些實施例提供用於預防性或治療性治療疾病或病症的如本文所述之RNA奈米結構或本文所述之複合物或如本文所述之組合物。
某些實施例提供一種套組，其包含如本文所述之RNA奈米結構或本文所述之複合物或如本文所述之組合物及關於向個體投與該RNA奈米結構/組合物以誘導免疫反應或治療疾病或病症之說明書。
在某些實施例中，該套組進一步包含至少一種治療劑。
在某些實施例中，該診斷或治療劑為包含帶正電部分之肽。
在某些實施例中，該帶正電部分為包含約5個至20個帶正電胺基酸之肽。
在某些實施例中，該帶正電部分為包含約8個至12個帶正電胺基酸之肽。
在某些實施例中，該帶正電部分為包含約10個帶正電胺基酸之肽。
在某些實施例中，該帶正電部分為包含10個離胺酸殘基之肽。
在某些實施例中，該肽為腫瘤靶向肽(TTP)、人類癌症肽、傳染劑肽或鈣網蛋白。
在某些實施例中，該傳染劑肽為對針對流感、HIV、HCV之免疫性中所牽涉的CD8+ T細胞及其他傳染劑具特異性之抗原決定基。
在某些實施例中，該蛋白質為鈣網蛋白。鈣網蛋白允許該RNA-折紙參與腫瘤細胞與巨噬細胞或樹突狀細胞之間的相互作用以增強抗原呈現及刺激抗原特異性T細胞。
在某些實施例中，該蛋白質為人類癌症肽NY-ESO-1或Muc1。
在某些實施例中，該至少一種治療劑為腫瘤抗原肽。
在某些實施例中，該TTP為CTKD-K10(CTKDNNLLGRFELSGGGSK10)。
在某些實施例中，本發明之RNA奈米結構複合物之第二組分為腫瘤特異性抗原。
在某些實施例中，該腫瘤特異性抗原為TKD。應理解，腫瘤特異性抗原可經修飾以增強複合物形成、調節RNA奈米結構：腫瘤特異性抗原比率及可操作性連接一或多種劑。在某些實施例中，該腫瘤特異性抗原為經修飾以在N端處添加C之TKD。在某些實施例中，該腫瘤特異性抗原為經修飾以在C端處添加1至15個離胺酸殘基之TKD。在某些實施例中，該腫瘤特異性抗原為經修飾以在C端處添加10個離胺酸殘基之TKD。在某些實施例中，該腫瘤特異性抗原為經修飾以在N端處添加C且在C端處添加1至15個離胺酸之TKD。在某些實施例中，該腫瘤特異性抗原為經修飾以在N端處添加C且在C端處添加10個離胺酸之TKD。
某些實施例提供包含至少一種單鏈RNA(ssRNA)分子之RNA奈米結構，其中該ssRNA分子形成至少一個平行內聚交叉，且其中該RNA奈米結構具有免疫刺激特性。
某些實施例提供包含至少一種單鏈RNA(ssRNA)分子之RNA奈米結構，其中該至少一種ssRNA分子包含複數個雙螺旋區及至少一個可操作性連接於兩個雙螺旋區之間的平行交叉，且其中該RNA奈米結構具有免疫刺激特性。
在某些實施例中，本文所述之RNA奈米結構包含一種ssRNA分子。
在某些實施例中，本文所述之RNA奈米結構由一種ssRNA分子組 成。
在某些實施例中，該至少一種ssRNA分子為約10個至約100,000個核苷酸長。
在某些實施例中，該至少一種ssRNA分子為約10個至約20,000個核苷酸長。
在某些實施例中，該至少一種ssRNA分子為約10個至約10,000個核苷酸長。
在某些實施例中，該至少一種ssRNA分子不包含轉錄終止序列。
在某些實施例中，該至少一種ssRNA分子不包含AUCUGUU序列。
在某些實施例中，該RNA奈米結構之約60-99%包含雙鏈區且該RNA奈米結構之約1-40%包含單鏈區。
在某些實施例中，該RNA奈米結構之約95%包含雙鏈區且該RNA奈米結構之約5%包含單鏈區。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含至少兩個平行雙螺旋。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含至少七個平行雙螺旋。
在某些實施例中，雙螺旋具有約5個至約50個核苷酸之長度。
在某些實施例中，雙螺旋具有約5個至約25個核苷酸之長度。
在某些實施例中，雙螺旋具有8或9個核苷酸之長度。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含複數個具有8個核苷酸之長度的雙螺旋及複數個具有9個核苷酸之長度的雙螺旋。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含約1個至約200個之間的平行內聚交叉。
在某些實施例中，RNA奈米結構包含複數個平行內聚交叉。
在某些實施例中，該至少一個平行內聚交叉具有約4個至約15個核 苷酸之長度。
在某些實施例中，該至少一個平行內聚交叉具有約8個核苷酸之長度。
在某些實施例中，平行內聚交叉包含16個鹼基配對。
在某些實施例中，該至少一個平行內聚交叉包含約6個至約10個之間之GC鹼基對。
在某些實施例中，該至少一種ssRNA分子包含形成內部環之序列，該等內部環在形成該至少一個平行內聚交叉之前保持未配對。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含至少一個連接一個雙螺旋至另一雙螺旋之環區，且其中該至少一個環區沿著該RNA奈米結構之邊緣定位。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含複數個環區。
在某些實施例中，該至少一個環區具有約2個至約100個核苷酸之長度。
在某些實施例中，該至少一個環區具有約2個至約50個核苷酸之長度。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含具有33個核苷酸之結構重複單元。
在某些實施例中，該結構重複單元依序包含：第一雙螺旋區、第一平行內聚交叉、第二雙螺旋區及第二平行內聚交叉。
在某些實施例中，該第一雙螺旋區為8個核苷酸長，該第一平行內聚交叉為8個核苷酸長，該第二雙螺旋區為9個核苷酸長，且該第二平行內聚交叉為8個核苷酸長。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含： 第一層，其包含複數個雙螺旋及複數個平行內聚交叉，其中該第一層之至少兩 個雙螺旋藉由平行內聚交叉彼此分離；及第二層，其包含複數個雙螺旋及複數個平行內聚交叉，其中該第二層中之至少兩個雙螺旋藉由平行內聚交叉彼此分離；且其中該第一層之平行內聚交叉雜交至該第二層之平行內聚交叉。
在某些實施例中，該RNA奈米結構之相交數為零，且其中該RNA奈米結構未打結。
在某些實施例中，該RNA奈米結構僅包含平行交叉。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含沿著該奈米結構之雙螺旋的超過50%之連續π-π堆疊。
在某些實施例中，該RNA奈米結構具有矩形形狀、菱形形狀或四面體形狀。
在某些實施例中，該RNA奈米結構具有矩形形狀。
某些實施例提供包含至少一種單鏈RNA(ssRNA)分子之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構包含長度為33個核苷酸的至少兩個結構重複單元，且其中各結構重複單元依序包含：長度為8個核苷酸的第一雙螺旋、長度為8個核苷酸的第一平行內聚交叉、長度為9個核苷酸的第二雙螺旋及長度為8個核苷酸的第二平行內聚交叉。
某些實施例提供包含與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少約75%序列一致性之核酸序列的RNA奈米結構。
在某些實施例中，該核酸序列與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13 具有至少約85%序列一致性。
在某些實施例中，該核酸序列與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少約95%序列一致性。
在某些實施例中，該核酸序列與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少約99%序列一致性。
在某些實施例中，本文所述之RNA奈米結構包含SEQ ID NO：1。
在某些實施例中，本文所述之RNA奈米結構由SEQ ID NO：1組成。
在某些實施例中，本文所述之RNA奈米結構包含至少一個平行內聚交叉。
在某些實施例中，該RNA奈米結構具有矩形、菱形或四面體形狀。
在某些實施例中，該RNA奈米結構具有免疫刺激特性。
在某些實施例中，該RNA奈米結構為模式識別受體之促效劑。
在某些實施例中，至少一種診斷劑可操作性連接至該RNA奈米結構。
在某些實施例中，至少一種治療劑可操作性連接至該RNA奈米結構。
某些實施例提供一種複合物，其包含本文所述之RNA奈米結構及至少一種可操作性連接至該RNA奈米結構之診斷劑。
某些實施例提供一種複合物，其包含本文所述之RNA奈米結構及至少一種可操作性連接至該RNA奈米結構之治療劑。
在某些實施例中，該診斷或治療劑為包含帶正電部分之肽。
在某些實施例中，該帶正電部分為包含約5個至20個帶正電胺基酸之肽。
在某些實施例中，該帶正電部分為包含約8個至12個帶正電胺基酸之肽。
在某些實施例中，該帶正電部分為包含約10個帶正電胺基酸之肽。
在某些實施例中，該帶正電部分為包含10個離胺酸殘基之肽。
在某些實施例中，該肽為腫瘤靶向肽(TTP)、人類癌症肽、傳染劑肽、腫瘤抗原肽或鈣網蛋白。
在某些實施例中，該傳染劑肽包含對針對流感、HIV、HCV之免疫性中所牽涉的CD8+ T細胞或其他傳染劑具特異性之抗原決定基。
在某些實施例中，該肽為鈣網蛋白。
在某些實施例中，該肽為人類癌症肽NY-ESO-1或Muc1。
在某些實施例中，該肽為腫瘤抗原肽。
在某些實施例中，該肽為CTKD-K10(CTKDNNLLGRFELSGGGSK10)。
某些實施例提供一種醫藥組合物，其包含本文所述之RNA奈米結構或複合物及醫藥學上可接受之載劑。
在某些實施例中，本文所述之醫藥組合物進一步包含至少一種治療劑。
在某些實施例中，該至少一種治療劑為化學治療藥物(例如，多柔比星)。
某些實施例提供一種誘導個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構、複 合物或組合物。
某些實施例提供一種治療個體之疾病或病症之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量的本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
在某些實施例中，該疾病或病症為癌症。
在某些實施例中，該癌症為乳癌、結腸直腸癌或淋巴瘤。
在某些實施例中，本文所述之方法進一步包含向該個體投與至少一種治療劑。
在某些實施例中，該至少一種治療劑為腫瘤靶向劑(例如，單株腫瘤特異性抗體或適體)。
某些實施例提供一種增強/增加個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之促發炎細胞因子之方法，該方法包含向該個體投與有效量的本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供一種藉由個體(例如哺乳動物，諸如人類)中toll樣受體3(TLR3)信號傳導路徑之特異性觸發來活化免疫細胞之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供一種如與對照個體相比減慢或抑制個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之腫瘤生長之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供一種如與對照個體相比提高具有腫瘤之個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之抗腫瘤促發炎細胞因子的水準之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供一種如與對照個體相比減少具有腫瘤之個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之消炎細胞因子的水準之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物用於製造用於誘導個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之免疫反應的藥劑之用途。
某些實施例提供用於誘導免疫反應之如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物用於製造用於治療個體之疾病或病症的藥劑之用途。
某些實施例提供用於預防性或治療性治療疾病或病症之如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供一種套組，其包含如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物及關於向個體投與該RNA奈米結構、複合物或組合物以誘導免疫反應或治療疾病或病症之說明書。
在某些實施例中，如本文所述之套組進一步包含至少一種治療劑。
某些實施例提供一條RNA單鏈，其經合理設計以自組裝成包含至少一個平行內聚交叉之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構具有免疫刺激特性。
某些實施例提供與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少約75%一致性之核酸。
某些實施例提供技術方案85之核酸，其中該核酸與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少約90%一致性。
在某些實施例中，該核酸形成RNA奈米結構。
某些實施例提供包含至少一種單鏈RNA(ssRNA)分子之RNA奈米 結構，其中該RNA奈米結構包含長度為33個核苷酸的至少兩個結構重複單元，且其中各結構重複單元依序包含：長度為8個核苷酸的第一雙螺旋區、長度為8個核苷酸的第一平行內聚交叉、長度為9個核苷酸的第二雙螺旋區及長度為8個核苷酸的第二平行內聚交叉。
在某些實施例中，本文所述之RNA奈米結構包含一種ssRNA分子。
在某些實施例中，本文所述之RNA奈米結構由一種ssRNA分子組成。
在某些實施例中，該至少一種ssRNA分子為約10個至約100,000個核苷酸長。
在某些實施例中，該至少一種ssRNA分子為約10個至約20,000個核苷酸長。
在某些實施例中，該至少一種ssRNA分子為約10個至約10,000個核苷酸長。
在某些實施例中，該至少一種ssRNA分子不包含轉錄終止序列。
在某些實施例中，該至少一種ssRNA分子不包含AUCUGUU序列。
在某些實施例中，該RNA奈米結構之約60-99%包含雙鏈區且該RNA奈米結構之約1-40%包含單鏈區。
在某些實施例中，該RNA奈米結構之約95%包含雙鏈區且該RNA奈米結構之約5%包含單鏈區。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含至少兩個平行雙螺旋。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含至少七個平行雙螺旋。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含約2個至約100個之間的結構重複單元。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含複數個結構重複單元。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含約2個至約200個之間的平行內聚交叉。
在某些實施例中，RNA奈米結構包含複數個平行內聚交叉。
在某些實施例中，平行內聚交叉包含16個鹼基配對。
在某些實施例中，該至少一個平行內聚交叉包含約6個至約10個之間之GC鹼基對。
在某些實施例中，該至少ssRNA分子包含形成內部環之序列，該等內部環在形成該至少平行內聚交叉之前保持未配對。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含至少一個連接一個雙螺旋至另一雙螺旋之環區，且其中該至少一個環區沿著該RNA奈米結構之邊緣定位。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含複數個環區。
在某些實施例中，該至少一個環區具有約2個至約100個核苷酸之長度。
在某些實施例中，該至少一個環區具有約2個至約50個核苷酸之長度。
在某些實施例中，技術方案1-23中任一者之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構包含：第一層，其包含長度為33個核苷酸的至少兩個結構重複單元；及第二層，其包含長度為33個核苷酸的至少兩個結構重複單元；其中各結構重複單元依序包含：長度為8個核苷酸的第一雙螺旋區、長度為8個核苷酸的第一平行內聚交叉、長度為9個核苷酸的第二雙螺旋區及長度為8個核苷酸的第二平行內聚交叉；且其中該第一層之平行內聚交叉雜交至該第二層之平行內聚交叉。
在某些實施例中，該RNA奈米結構之相交數為零，且其中該RNA奈米結構未打結。
在某些實施例中，該RNA奈米結構僅包含平行交叉。
在某些實施例中，該RNA奈米結構包含沿著該奈米結構之雙螺旋的超過50%之連續π-π堆疊。
在某些實施例中，該RNA奈米結構具有矩形形狀、菱形形狀或四面體形狀。
在某些實施例中，該RNA奈米結構具有矩形形狀。
某些實施例提供包含與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少約75%序列一致性之核酸序列的RNA奈米結構。
在某些實施例中，該核酸序列與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少約85%序列一致性。
在某些實施例中，該核酸序列與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少約95%序列一致性。
在某些實施例中，該核酸序列與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少約99%序列一致性。
在某些實施例中，技術方案30之RNA奈米結構，其包含SEQ ID NO：1。
在某些實施例中，技術方案30之RNA奈米結構，其由SEQ ID NO：1組成。
在某些實施例中，該RNA奈米結構具有矩形、菱形或四面體形狀。
在某些實施例中，該RNA奈米結構具有免疫刺激特性。
在某些實施例中，該RNA奈米結構為模式識別受體之促效劑。
在某些實施例中，至少一種診斷劑可操作性連接至該RNA奈米結構。
在某些實施例中，至少一種治療劑可操作性連接至該RNA奈米結構。
某些實施例提供一種複合物，其包含如本文所述之RNA奈米結構及至少一種可操作性連接至該RNA奈米結構之診斷劑。
某些實施例提供一種複合物，其包含本文所述之RNA奈米結構及至少一種可操作性連接至該RNA奈米結構之治療劑。
在某些實施例中，該診斷或治療劑為包含帶正電部分之肽。
在某些實施例中，該帶正電部分為包含約5個至20個帶正電胺基酸之肽。
在某些實施例中，該帶正電部分為包含約8個至12個帶正電胺基酸之肽。
在某些實施例中，該帶正電部分為包含約10個帶正電胺基酸之肽。
在某些實施例中，該帶正電部分為包含10個離胺酸殘基之肽。
在某些實施例中，該肽為腫瘤靶向肽(TTP)、人類癌症肽、傳染劑肽、腫瘤抗原肽或鈣網蛋白。
在某些實施例中，該傳染劑肽包含對針對流感、HIV、HCV之免疫性中所牽涉的CD8+ T細胞及其他傳染劑具特異性之抗原決定基。
在某些實施例中，該肽為鈣網蛋白。
在某些實施例中，該肽為人類癌症肽NY-ESO-1或Muc1。
在某些實施例中，該肽劑為腫瘤抗原肽。
在某些實施例中，該肽為CTKD-K10(CTKDNNLLGRFELSGGGSK10)。
某些實施例提供一種醫藥組合物，其包含本文所述之RNA奈米結構或複合物及醫藥學上可接受之載劑。
在某些實施例中，本文所述之醫藥組合物進一步包含至少一種治療劑。
在某些實施例中，該至少一種治療劑為化學治療藥物(例如，多柔比星)。
某些實施例提供一種誘導個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供一種治療個體之疾病或病症之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量的如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
在某些實施例中，該疾病或病症為癌症。
在某些實施例中，該癌症為乳癌、結腸直腸癌或淋巴瘤。
在某些實施例中，本文所述之方法進一步包含向該個體投與至少一種治療劑。
在某些實施例中，該至少一種治療劑為腫瘤靶向劑(例如，單株腫瘤特異性抗體或適體)。
某些實施例提供一種增強/增加個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之促發炎細胞因子之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA 奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供一種藉由個體(例如哺乳動物，諸如人類)中toll樣受體3(TLR3)信號傳導路徑之特異性觸發來活化免疫細胞之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供一種如與對照個體相比減慢或抑制個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之腫瘤生長之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供一種如與對照個體相比提高具有腫瘤之個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之抗腫瘤促發炎細胞因子的水準之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供一種如與對照個體相比減少具有腫瘤之個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之消炎細胞因子的水準之方法，該方法包含向該個體投與有效量的如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物用於製造用於誘導個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之免疫反應的藥劑之用途。
某些實施例提供用於誘導免疫反應之如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物用於製造用於治療個體之疾病或病症的藥劑之用途。
某些實施例提供用於預防性或治療性治療疾病或病症之如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物。
某些實施例提供一種套組，其包含如本文所述之RNA奈米結構、複合物或組合物及關於向個體投與該RNA奈米結構、複合物或組合物以誘導免疫反應或治療疾病或病症之說明書。
在某些實施例中，本文所述之套組進一步包含至少一種治療劑。
某些實施例提供與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少約75%一致性之核酸。
在某些實施例中，該核酸與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少約90%一致性。
在某些實施例中，該核酸形成RNA奈米結構。
某些實施例提供使用本文所述之程序來製備RNA奈米結構之方法。
某些實施例現將藉由以下非限制性實例來說明。
實例1 單鏈RNA折紙
資訊承載聚合物自折疊成確定結構為生物學之基礎且作為合成策略提供有吸引力的潛力。儘管多組分自組裝已產生複雜合成奈米結構，僅單分子折疊可見有限進展。本文中描述設計及合成單一RNA鏈以自折疊成複雜但未打結結構之構架，該複雜但未打結結構近似任意使用者規定之形狀。用實驗方法構建不同的多千鹼基單鏈結構，包括約6000-nt RNA結構。該鏈之容易複製在活體外及在活細胞中得到證明。此處，該工作因此確立了單分子折疊為用於構建複雜且可複製核酸奈米結構之一般策略且擴展了針對自下至上奈米技術之設計空間及材料可擴展性。
生物學複製、功能及進化之基礎在於序列特異性聚合物之間的資訊 轉移(例如，DNA複製、RNA轉錄及蛋白質轉譯)及資訊承載聚合物折疊成具有確定結構及功能之緻密粒子(例如，蛋白質及RNA折疊)。關於分子尺度之生物學操作原則促動了設計可複製、資訊承載聚合物的合成努力，該等聚合物可自折疊成使用者規定之奈米級形狀。
使用核酸之特異性鹼基配對，已由DNA及RNA(1-27)產生複雜奈米結構，使得不同應用(28-40)成為可能。特別值得注意的是具有任意使用者規定之幾何形狀之多千鹼基、兆道爾頓尺度奈米粒子，其由數百條合成DNA鏈自組裝，具有及不具有中央組織骨架鏈(亦即，骨架式DNA折紙(4、8-10、13、20-23)及DNA磚(14,15))之輔助。與由多種組分自組裝之結構的顯著成功相比，設計可自折疊成確定形狀之單鏈DNA(ssDNA)或RNA(ssRNA)的進展有限，且僅相對簡單形狀得到證明(例如，79-核苷酸(nt)DNA鏈折疊成四臂接合(41)，146-nt鏈折疊成平行交叉(42)，286-nt DNA鏈折疊成四面體(43)，且660-nt RNA折疊成六螺旋矩形瓦片(44))。另外，1700-nt DNA鏈在五條輔助鏈之幫助下經折疊成八面體結構(3)。值得注意的是，簡單ssDNA結構(41-43)以及用於八面體(3)之1700-nt骨架可活體外複製(3、41-43)，且此等簡單單鏈結構在活細胞中經選殖及複製(43、45)。660-nt RNA結構可自DNA模板轉錄且等溫折疊(44)。
設計以類蛋白質方式自折疊成使用者規定之緻密形狀的核酸聚合物之能力不僅在基礎方面引起關注且至關重要，而且在實用性方面(3、41-45)提供優於多組分RNA自組裝之目前範例的關鍵概念優勢。與經由自組裝形成之多鏈RNA結構相比，經由自折疊形成之ssRNA奈米結構提供可擴增、可複製及可選殖之較大潛力，且因此提供使用酶及生物學複製進行具有成本效益、大規模生產之機會，以及使用活體外進化來產生複雜表型及功能性之可能性。另外，單分子折疊過程不依賴於反應濃度且因此，原則上提供高於用濃度依賴性分子間自組裝產生之多鏈結構的形成產率及更穩固折疊動力學。此外，不同於典型地 含有數打或數百種不同組分及通常非所需之缺陷(諸如缺失或不正確地併入或合成之組分鏈)的多鏈RNA奈米結構，單鏈結構原則上可能經合成為具有高純度之均質系統(例如，經由單株鏈之酶產生(46))。
儘管其具有基礎重要性及實用合意性，以及上述有希望之早期努力(41-45)，開發關於可折疊成使用者規定之複雜任意形狀之ssRNA的設計及合成之一般策略(例如，在複雜性及可編程性方面與骨架式核酸折紙(4)可相當)仍然構成挑戰。關鍵挑戰在於實現結構複雜性、可編程性及普遍性，同時維持鏈選路之拓撲學簡單性(以避免由結施加之動力學陷阱)且因此確保平滑折疊。
本文中描述用於將多千鹼基ssRNA鏈折疊成複雜的使用者規定之形狀之一般設計及合成構架。關鍵創新在於使用部分互補之雙鏈RNA(dsRNA)及平行交叉內聚(3、47-50)來構建可平滑地自單一鏈折疊之結構上複雜但無結結構。此等結構被稱作ssRNA折紙、RNA ssOrigami或ssRNA奈米結構。該策略之多功能性藉由構建多種空間填充性、緻密形狀(例如，斜方形(亦即，菱形)四面體及矩形形狀)而用實驗方法驗證。該結構之空間填充性質及沿鏈之獨特鹼基分辨可尋址性使得能夠在結構表面上產生使用者規定之突出髮夾或環模式，且該等環可用作「把手」以附接其他部分。該策略產生具有順從擴增及複製之架構的結構；用實驗方法證明了，經折疊ssOrigami結構可熔融且用作活體外藉由聚合酶擴增之模板，且ssOrigami鏈可經由活細胞中之純系產生經複製及擴增。該設計亦為可擴展的。
RNA已用於構建合成奈米結構(44、51-54)且提供了優於DNA結構之獨特應用潛力(例如，功能多樣性、經由基因表現實現經濟生產及針對細胞內應用之順從性)(44)。然而，儘管多千鹼基、兆道爾頓大小之個別DNA奈米結構已經證明(例如，經由骨架式折紙(4、8)及DNA磚(14、15))，合成RNA奈米結構仍然相當簡單：所證明之最大個別結構為上述660-nt ssRNA瓦片(44)。如本文 所述，產生了具有使用者規定之形狀的多種多千鹼基複雜RNA ssOrigami結構(例如，斜方形及矩形形狀)，包括6000-nt RNA結構，其表示關於RNA奈米技術之複雜性的10倍增加。ssOrigami架構之普遍性及可調適性另外藉由兩種一致靶標形狀藉由自同一dsDNA模板轉錄之有義及反義RNA鏈兩者成功折疊來揭露。
ssOrigami工作確定了有可能設計多千鹼基ssRNA以折疊成使用者規定之複雜形狀。此技術增加了關於可設計RNA奈米技術之結構複雜性。單分子折疊連同自組裝(例如，骨架式核酸折紙及核酸磚)因此表示用於構建數位可編程奈米結構之另一基礎、通用而在實踐上可獲得之設計策略且擴展了針對自下至上奈米技術之設計空間及材料可擴展性。
RNA ssOrigami之設計
儘管多種DNA奈米結構已以多鏈形式產生，自現有折紙設計簡單地分裂且再連接鏈將無法解決設計ssOrigami之關鍵挑戰，該關鍵挑戰在於產生具有最小打結複雜性之ssOrigami結構以避免在折疊過程期間以動力學方式經俘獲。
為了精確地量化不同ssOrigami模型之打結複雜性以促進設計過程，開鏈線性RNA鏈可藉由連接其5'及3'末端而轉化為閉合環，且接著表徵此閉合環之拓撲學複雜性，該閉合環可作為數學結經處理。若兩個RNA結可經由連續變形彼此轉變，則其為同倫的，這意謂鏈在任何操作期間均無法經切割(55)。該等規則亦適用於ssOrigami，因為核酸骨架在折疊過程期間無法經切割或分割。ssOrigami設計之打結複雜性可由相交數大致描述，相交數為結不變數，其經定義為在結之任何圖中發現的最小數目之相交(56、57)。
若結之相交數為零，則其在拓撲學上與未打結環(亦稱作平凡紐結(unknot))相等。實際上，大多數RNA及蛋白質結構之相交數為零，且僅在極少 情況下，一些蛋白質可具有極小相交數(58-61)。相反，源於傳統折紙結構(例如，DNA)之ssOrigami設計傾向於產生具有高相交數之複雜結，其將有可能妨礙適當折疊。
為了實現具有小相交數之ssOrigami結構，ssOrigami設計中之第一考慮因素在於在用於螺旋間內聚之反平行及平行交叉中進行選擇。在每一個反平行交叉位置處，RNA鏈均需要穿過含有所有平行RNA螺旋軸之中央平面，如同穿針通過一片織物。相反，在平行交叉位置處，RNA鏈不通過此平面，這可能降低該結構之打結複雜性。
RNA ssOrigami之設計及合成
為了合成長ssRNA分子，首先合成具有T7及T3啟動子序列之DNA模板，呈兩個片段。該兩個DNA片段經由Eco RI及Hind III限制位點經次選殖至載體中且在大腸桿菌中經擴增。經純化質體接著藉由Eco RI及Hind III線性化，且使用T7 RNA聚合酶及/或T3 RNA聚合酶經轉錄(參見圖1B，其描繪兩者)。接著純化經活體外轉錄之RNA分子，使其以每15分鐘1℃斜線自65℃至25℃進行自折疊。用AFM表徵該等RNA分子。
在一實施例中，設計如下設計：8 nt螺旋域、隨後8 nt鎖定域、隨後9 nt螺旋域、隨後8 nt鎖定域(亦即，8-8-9-8結構)，該設計產生三次旋轉/33-bp重複單元(圖1A)。使用該8-8-9-8設計，構建1868-nt矩形(圖1，C及D)及6337-nt 9×9斜方形(圖1E)RNA ssOrigami。測試用於來自有義鏈(圖1C)及反義鏈(圖1D)兩者之1868-nt矩形的RNA鏈且均在AFM下產生預期且一致形狀。6337-nt斜方形RNA ssOrigami為任何先前合成之個別RNA奈米結構(44)的10倍大。
論述
ssOrigami結構由具有長度介於約1000至約10,000 nt範圍內之合成序列的ssRNA構建，其表示迄今已實現之合成核酸結構的最大單分子折疊。與 2004(3)中報告之自1700-nt骨架鏈及五條輔助短鏈組裝之線框DNA八面體相比，ssOrigami未使用輔助鏈且可經設計以形成多種空間填充性緻密形狀。同時，與2014(44)中報告之ssRNA奈米結構相比，該等設計策略可應用於RNA ssOrigami，因為其不受RNA吻合環相互作用限制(64)。因而，ssOrigami為完全地重新設計之結構，其不依賴於具有確定幾何安排的高度序列特異性、天然存在之分子相互作用基序(例如，RNA吻合環)之可用性且因此原則上保證較佳可設計性及可擴展性，如實際上由6000-nt ssRNA結構之構建所反映。
先前工作證明了複雜結構自數百種不同組分自組裝而成(具有及不具有骨架之輔助)，且此處ssOrigami工作證明了複雜結構自單一鏈折疊而成。因此，先前多組分組裝工作(骨架式折紙及DNA磚)及目前單分子折疊工作表示用於工程改造合成核酸奈米結構之兩個極端，且一起保證其間之巨大設計空間。
材料及方法 材料
限制核酸內切酶EcoRI(5,000單位)、XhoI(5,000單位)及HindIII(5,000單位)、T7及T3 RNA聚合酶(5,000單位)、NEB 10-β勝任大腸桿菌購自NEW ENGLAND BIO LABS INC。Pureyield質體miniprep系統及Wizard SV Gel and PCR Clean-UP系統購自Promega(www.promegA.com)。RNA Clean and Concentrator-25購自Zymo Research(www.zymoresearch.com)。
DNA及RNA序列設計
DNA序列用Tiamat軟體(66)設計。ssOrigami結構之序列產生使用該軟體中之以下準則：(1)獨特序列限制：8-10；(2)重複限制：8；(3)G充實限制：4；(4)G/C百分率：0.38-0.5。關於ssRNA折紙序列，跟隨有兩個或三個連續G之T7/T3啟動子序列添加至末端以促進有效活體外轉錄反應。
活體內選殖樣品製備
用於轉錄ssRNA之DNA模板分成末端添加有T7及T3啟動子序列之兩個DNA序列，且作為基因合成產品自BioBasic Inc定購。該兩個片段接著使用與ssDNA折紙相同之限制位點經次選殖至pUC19載體中。最終質體藉由EcoRI及HindIII線性化，且根據製造商之說明書(New England Biolabs)藉由T7或T3 RNA聚合酶轉錄。轉錄反應混合物藉由RNA Clean and Concentrator套組如製造商之說明書(Zymo Research)所述經純化。在純化之後，ssRNA使用與ssDNA折紙相同之程式經退火。
AFM成像
關於AFM成像，樣品(15mL)沉積至新近裂開之雲母表面(Ted Pella,Inc.)上且留待吸附持續1分鐘。40mL 1×TAE-Mg2+及2-15mL 100mM NiCl2添加至雲母上，且該樣品在Veeco 5 Multimode AFM上以Scanasyst in Fluid模式使用scanasyst in fluid+尖端(Veeco,Inc.)進行掃描。
用於ssOrigami折疊之ssRNA的合成及複製
用於轉錄ssRNA之DNA模板分成末端添加有T7及T3啟動子序列之兩個DNA序列，且作為基因合成產品自BioBasic Inc定購。該兩個片段接著使用與ssDNA折紙相同之限制位點經次選殖至pUC19載體中。最終質體藉由EcoRI及HindIII線性化，且根據製造商之說明書(New England Biolabs)藉由T7或T3 RNA聚合酶轉錄。轉錄反應混合物藉由RNA Clean & Concentrator套組如製造商之說明書(Zymo Research)所述經純化。在純化之後，ssRNA使用與ssDNA折紙相同之程式經退火，且藉由AFM進行表徵。(圖2A及2B)。
關於RNA ssOrigami結構之熔融研究
為了比較ssRNA折紙之熱穩定性，藉由熔融充分形成之折紙且量測1×TAE/Mg2+緩衝液中隨溫度而變的在260nm下之吸光度改變來對RNA ssOrigamis 8-8-9-8進行熔融分析。樣品以+0.05℃/min之速率自15℃加熱至90℃。 關於RNA ssOrigami 8-8-9-8之熔融分析之結果在圖3A-B中繪製曲線。
用於產生ssRNA奈米結構之DNA模板 1868-nt矩形(參見圖4) 正向鏈：
(SEQ ID NO：14)
反向鏈：
(SEQ ID NO：15)
6337-nt 9×9斜方形(亦即，菱形形狀)(參見圖5) 正向鏈：
(SEQ ID NO：16)
反向鏈：
(SEQ ID NO：17)
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實例2
RNA折紙具有能夠形成大小、形狀及組態變化之可編程結構的結構特徵(參見例如圖47)。RNA折紙為緻密的且形成均勻分散之奈米結構。如圖6中所述，含有ssRNA折紙基因之質體經線性化且該ssRNA使用T7 RNA聚合酶經活體外轉錄。經純化RNA分子接著自組裝成ssRNA折紙奈米結構(RNA-Rec)。 該RNA折紙具有完整結構，甚至無陽離子。經適當折疊之RNA折紙顯示抵抗核酸酶消化且含有dsRNA及ssRNA區，該等區可充當病原體相關分子模式。特定言之，進行活體外RNase消化實驗，且發現該RNA折紙展現高於與該RNA折紙具有相同序列之未折疊ssRNA的核酸酶抗性(圖7、51)。另外，使用離體脾細胞刺激分析來測試RNA折紙之免疫刺激效應且觀察到相比PolyIC增強的由RNA折紙介導之刺激活性(圖8-10)。與刺激時之活體外發現相似，經由眶後途徑靜脈內注射RNA折紙導致小鼠中IFNa/b之短暫提高(圖11)。
在延長培育時，亦發現該RNA折紙降低活體外一些腫瘤細胞之活力(圖12)。如圖13中所示，該RNA折紙在HEK-BlueTM-mTLR3報告基因細胞株中充當促效劑。最後，使用A20-iRFP模型活體內評估抗腫瘤免疫性，該模型允許活體內追蹤腫瘤生長(圖14-15)。在此等實驗中，小鼠經投與單獨抗PD1抗體或與RNA折紙組合之抗PD1抗體。如圖14及15中所示，在用RNA折紙治療時觀察到腫瘤降低，其大於單獨投與抗體時。
總之，此等結果指示了RNA折紙可在免疫細胞中充當諸如TLR3及TLR7之模式識別受體的促效劑，且可能潛在地充當新線佐劑。藉由使用確定小鼠腫瘤模型，可進一步針對腫瘤特異性疫苗之構建研究此平台。另外，此RNA折紙有助於可擴展生產。
RNA奈米結構設計
使用Tiamat軟體(Yanlab.asu.edu/Tiamat.exe)來設計RNA矩形折紙奈米結構及RNA序列，該軟體促進了DNA/RNA螺旋之顯現。人工RNA序列藉由使用Tiamat軟體中之以下準則來產生：(1)獨特序列限制：8nt；(2)重複限制：6-8nt；(3)G充實限制：4nt；(4)GC含量：0.45-0.55。一旦產生序列，即調節一些核苷酸以出於選殖目的消除限制酶靶向序列(例如，藉由EcoRI、EcoRV、HindIII及XbaI)。跟隨有三個連續G之T7啟動子序列手動地併入至DNA模板 之5'端上以便促進有效活體外轉錄反應。dsDNA模板由BioBasic Inc.合成且經由EcoRI及HindIII限制位點經選殖至pUC19載體中。
RNA鏈合成
含有ssRNA奈米結構基因之質體藉由使用HindIII酶(New England Biolabs)線性化且該線性質體藉由使用苯酚/氯仿萃取及乙醇沉澱經純化。藉由使用T7 RiboMAX快速大規模RNA產生系統(Promega)根據製造商之說明書進行活體外轉錄反應。關於含肌苷RNA製備，額外5mM肌苷-5'-三磷酸酯(TriLink BioTechnologies)添加至活體外轉錄反應中。該等RNA分子接著經由RNA Clean & Concentrator-25套組(Zymo Research)經純化。
RNA折紙奈米結構組裝
經純化RNA分子在1xPBS緩衝液(20mM磷酸鈉、130mM氯化鈉，pH 7.4)中經稀釋至20-250nM。所得溶液以每20分鐘1℃之冷卻斜線自65℃至25℃進行退火以形成所需結構。
原子力顯微鏡表徵
RNA折紙使用具有PEAKFORCE-HiRs-F-A尖端之Dimension FastScan顯微鏡(Bruker Corporation)以「ScanAsyst in fluid模式」成像。在退火之後，2μl樣品沉積至新近裂開之雲母表面(Ted Pella,Inc.)上且留待吸附持續1分鐘。接著，80μl 1x TAE-Mg緩衝液及2μl 100mM NiCl2溶液添加至雲母上，且40μl相同緩衝液沉積至顯微鏡尖端上。該等樣品接著藉由遵循製造商之說明書進行掃描。
動物
雌性BALB/c小鼠獲自Charles River Laboratories且維持於亞利桑那州立大學動物資源中心(Arizona State University Animal Resource Center)之無病原體動物設施中。所有小鼠均根據動物福利法(Animal Welfare Act)及亞利桑那州 立大學機構動物管理及使用委員會(Arizona State University Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC))進行處置。在實驗性治療之前，該等小鼠隨機地分佈於籠中且在疫苗接種之前使其適應至少1週。
脾細胞分離及刺激
小鼠用二氧化碳窒息實施安樂死，且移出脾臟且藉由快速地浸漬於70%乙醇中持續1s來滅菌，接著在生物安全櫃中轉移至補充有10%胎牛血清(FBS)之無菌RPMI-1640培養基中。在一個末端切割脾臟，且使用薄、經密封L型玻璃管推出脾髓。經萃取之脾細胞集結成粒且藉由在上述無菌RPMI-1640培養基中以380×g旋轉持續3min加以洗滌，且紅血球藉由ACT溶解緩衝液(體積比為9：1之0.16M NH4Cl及0.17M Tris[pH 7.65]的組合，pH用1M HCl調節至7.2，且經過濾滅菌)耗盡。在補充有10% FBS及抗生素之RPMI-1640培養基中洗滌兩次之後，脾細胞以4×106個細胞/mL之密度接種於12孔板中。RNA折紙、肌苷併入性RNA折紙或其他佐劑以所需濃度(5μg/mL、0.5μg/mL或0.05μg/mL)添加至各孔中，50ng/mL脂多糖(LPS)添加至陽性對照孔中且多黏菌素B(PMB)添加至各孔中，不過LPS單獨孔之最終濃度為100μg/mL以防止內毒素污染。在刺激之後24小時或48小時，收集細胞，針對表面標記物進行標記，且藉由流式細胞術進行分析。
流式細胞術
經刺激脾細胞藉由以380×g短暫離心持續3min加以收集，且保存上清液用於細胞音質分析。集結成粒之細胞用1X PBS洗滌一次，且在室溫下經Zombie Violet活力染料(Biolegend)標記持續15min。在染色緩衝液(1X PBS、2% BSA、0.01%疊氮化鈉)中洗滌兩次之後，細胞在含有FcR阻斷之以下抗體混合液中經培育：(a)FITC抗小鼠CD4、PE抗小鼠CD3、PE/Cy5抗小鼠CD69及PE/Cy7抗小鼠PD1；b)FITC抗小鼠CD11b、PE抗小鼠CD86、PE/Cy5抗小鼠 B220及PE/Cy7抗小鼠CD11c。在4℃下培育30min之後，細胞在染色緩衝液中洗滌兩次且再懸浮於200uL染色緩衝液中。接著，各樣品在亞利桑那州立大學生物設計機構之FACSAria II儀器上進行分析。活細胞經定義為Zombie Violet-低細胞群體，且CD4 T細胞作為CD3+CD4+活細胞經閘控，CD8 T細胞作為CD3+CD4-活細胞經閘控。CD4 T細胞群體及CD8 T細胞群體中之CD69+細胞的百分率針對T細胞刺激量測繪製曲線。漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)經定義為CD11b-CD11c+B220+活細胞，且習知樹突狀細胞(DC)經定義為CD11b+CD11c+細胞。作為DC刺激狀態之指示劑，對各DC細胞群體中CD86之平均螢光強度繪製曲線。
細胞因子分析
離體脾細胞細胞培養物上清液中之細胞因子釋放藉由Eve Technologies之小鼠Procarta IFN 2-plex特徵分析(目錄號MIFN-02-103)加以量測。關於血清細胞因子分析，100uL RNA折紙(25μg)、PolyIC(25μg)或1X PBS經由眶後途徑iv.注射至原生小鼠，在注射後3h、6h及24h藉由頰靜脈出血來收集小鼠血清。血液在4℃下以7000rpm短暫離心持續10min，且藉由Eve Technologies之小鼠Procarta IFN 2-plex特徵分析(目錄號MIFN-02-103)加以量測。
細胞活力測試
在用RNA折紙培育之後細胞的活力藉由MTT分析(來自Thermo Fisher之Vybrant®MTT細胞增生分析套組)根據製造商之方案加以分析。最終濃度為5μM之喜樹鹼(Sigma-Aldrich，目錄號C9911)充當陽性對照物，因為已知其誘導細胞凋亡。
TLR3促效劑測試
表現小鼠TLR3之報告基因細胞株(HEK-BlueTM mTLR3細胞)購自 Invivogen。RNA折紙及其他佐劑之促效劑活性藉由在根據製造商之方案共培育此等佐劑與細胞之後HEK-Blue培養基的吸光度量化。購自Invivogen之ssRNA40/LyoVecTM充當陰性對照物。
A20-iFRP-OVA腫瘤模型
小鼠B細胞淋巴瘤細胞A20使用來自Invivogen之LENTI-SmartTM轉導套組藉由遵循製造商之方案經慢病毒載體轉導，該慢病毒載體經構建以表現近紅外螢光蛋白(圖16)iRFP及卵白蛋白。在亞利桑那州立大學生物設計機構之BD FACSAria II上進行細胞分選，以分離具有頂部1%螢光強度之A20-iRFP細胞用於後續細胞培養。A20細胞中iRFP之明亮且穩定表現藉由流式細胞術及Pearl小動物成像系統(LI-COR,SanDiego,CA)確認。關於腫瘤接種，BALB/c小鼠在左側腹處經刮毛且s.c.注射10×106個A20-iRFP細胞。注射後7-10天，小鼠在該Pearl小動物成像系統中成像，且攜帶具有相似近紅外強度之腫瘤的小鼠經隨機分至不同組中用於後續治療。
關於治療，小鼠在第0天經由腫瘤內注射來注射含25ug RNA折紙之50uL PBS，或50uL PBS。抗PD1抗體(Biolegend，目錄號114108)在第2天及第4天以每次注射2.5ug之劑量注射至小鼠腫瘤中。每隔一天追蹤腫瘤生長且藉由量測近紅外螢光強度使用來自LI-COR之Image StudioTM軟體來量化腫瘤大小。
RNA奈米結構序列
(SEQ ID NO：1)
編碼RNA奈米結構之序列
(SEQ ID NO：2)
實例3
使用TLR3及TLR7/8HEK-293T報告基因株來研究RNA-折紙(例如，SEQ ID NO：1)是否可能活化TLR3信號傳導路徑及/或TLR7路徑。結果指示了該RNA-折紙可能活化TLR3信號傳導路徑，而非TLR7。不同於dsRNA介導之活化，所觀察到之刺激活性獨立於轉染，表明RNA-折紙可能由HEK-293T細胞攝取以觸發TLR3信號傳導路徑，而非經由細胞質RNA感測器(亦即，MDA5/RIG)介導。有趣的是，儘管該RNA-折紙及polyIC在TLR3-報告基因株中呈現可相當水準之活化，藉由RNA-折紙發現比polyIC有效得多的脾細胞活化(參見圖8及圖9)。此發現表明了存在於脾臟中之抗原呈現細胞可攝取RNA-折紙用於此等免疫細胞之活化。
此外，在接受RNA折紙或介於與本發明RNA-折紙相同的大小範圍內之低分子量polyIC之腹膜內注射的小鼠中檢查細胞因子型態。有趣的是，發現RNA-折紙小鼠中之細胞因子型態顯示高水準之趨化因子IL12，但分別顯示低及中等水準之TNFa及IL6(圖17)。用於此實例中之PolyIC具有低分子量，而用於Takeda之報告中的PolyIC可能為高分子量PolyIC，這與高毒性相關。(Takeda等人，A TLR3-Specific Adjuvant Relieves Innate Resistance to PD-L1 Blockade without Cytokine Toxicity in Tumor Vaccine Immunotherapy,Cell Rep. 2017年5月30日；19(9)：1874-1887。)然而，polyIC-LMW不誘導此等細胞因子之顯著提高，類似於由Zhou等人(Zhou,Y.等人2012.TLR3 activation efficiency by high or low molecular mass Poly I：C.Innate Immunity.19：184-192)報告之研究，該研究顯示高分子量(HMW)PolyIC(稱作PolyIC-HMW)活體內比低分子量(LMW)polyIC(polyIC-LMW)更有效。另外，PolyIC-HMW通常用作疫苗接種佐劑且其全身性應用會導致毒性。與Takeda之研究中所示的TNFa及IL-6水準相比，由RNA-折紙誘導之此等細胞因子之水準在由兩種ARNAX誘導的彼等水準範圍內，亦即，具有低毒性。因此，本發明RNA-折紙可更類似於ARNAX起作用。另一方面，已知三種趨化因子CXCL9、CXCL10及CCL2之提高對於募集CD8-T及NK細胞來發動抗腫瘤免疫性發揮重要作用。
為了確定免疫細胞之活體外刺激是否可轉譯為抗癌免疫佐劑，使用CT26腹膜結腸癌模型來測試RNA-折紙是否可降低腹膜腔中之腫瘤生長，該模型已作為腹膜轉移性模型加以研究。為了即時監測腫瘤生長，將基因iRFP引入至CT26細胞中，該基因編碼近紅外螢光蛋白，以致腫瘤細胞之生長藉由iRFP螢光強度加以量測。較高螢光強度指示較大腫瘤質量。特定言之，在第0天，小鼠經由ip.注射接受一百萬個CT26-iRFP細胞。該等小鼠在第1、3及7天經16微克/劑量之RNA-折紙或對照物PBS治療，且腹膜腔中之腫瘤細胞藉由iRFP螢光強度使用LI-COR Pearl小動物成像系統來監測。發現雖然注射PBS之小鼠快速地發展腫瘤(經10-12天)，但經RNA-折紙治療之小鼠顯示腫瘤生長之顯著降低(圖18)。因此，在實驗中所用之相當低劑量下，RNA-折紙抑制腫瘤生長。當分析由積聚於存在於腹膜腔中之腫瘤細胞內的腹水液產生之細胞因子時，發現腹水含有極高水準之免疫抑制性細胞因子，包括TGFb1、TGFb2、IL-10及IL-4(圖19)。相反，關於經RNA-折紙治療之攜帶腫瘤之小鼠，其具有低得多的水準之免疫抑制性細胞因子，但具有提高水準之抗腫瘤促發炎細胞因子，這與經治 療小鼠中之小腫瘤負荷相關。
鼠科動物模型中之CT26免疫性分析。 藉由再攻擊已顯示衰退之經RNA治療之小鼠來測試抗腫瘤免疫性的存在。使用四隻小鼠，兩隻小鼠在最後一次RNA折紙治療之後49天進行測試，且兩隻小鼠在最後一次RNA折紙治療之後36天進行測試。此等小鼠第二次在小鼠之腹部上皮下注射500,000個CT26-iRFP細胞。此處未給出治療，且結果顯示於圖20中。在該四隻小鼠中，僅一隻發展腫瘤，且甚至此小鼠之腫瘤衰退，說明T-細胞之喚醒反應的可能性。
實例4 自組裝可編程用於有效且安全抗癌免疫療法之RNA-折紙
核酸(NA)奈米技術在過去30年中已得到極大發展且眾多DNA及RNA奈米結構已合理地經設計及表徵。先前研究已證明了NA奈米結構之一些活體內生物應用，主要充當用於諸如疫苗設計之功能性分子的藥物遞送媒劑及骨架。吾人先前開發了可複製單鏈RNA(ssRNA)折紙技術，該技術允許長RNA分子經編程以自組裝成RNA-折紙(RNA-OG)奈米結構，該等奈米結構經均一分散且高度抵抗血清或血漿中之RNAse及核酸酶。受其RNA性質及奈米級均一幾何形狀啟發，此處吾人研究其充當佐劑以活化免疫反應之潛力。吾人證明了高度穩定性RNA-OG主要經由Toll樣受體3(TLR3)路徑刺激有效的免疫反應。在鼠科動物腹膜轉移結腸癌模型中，腹膜內注射之RNA-OG顯著地誘導腫瘤延遲或衰退。儘管其對於血清核酸酶之抗性高於polyIC(熟知之雙鏈RNA類似物)，RNA-OG治療不會觸發I型干擾素之全身性產生，暗示較低毒性，且因此較安全用於其活體外應用。此外，自經或未經RNA-OG治療之攜帶腫瘤之小鼠取回的腹膜腔細胞之分析顯示，RNA-OG治療導致腹膜腫瘤環境中之骨髓源性抑制細胞(MDSC)的顯著降低，其與顯示腫瘤衰退之小鼠中的細胞因子型態一致。因此，RNA-OG能夠再編程腫瘤腹膜環境以逆轉免疫抑制。已知其在可擴展生產中之 優越性、自組裝成充分確定奈米結構之可編程性及高結構穩定性，RNA-OG可構成新線佐劑，該等佐劑關於癌症免疫療法為安全且有效的。
引言：
核酸(NA)分子已顯示為用於建立具有精確形狀及幾何形狀之奈米結構的極佳材料1,2。在過去數十年來，已開發了新穎方法及策略來基於DNA/RNA自組裝製造合成架構，諸如DNA折紙3、ssDNA瓦片(SST)奈米結構4及單鏈DNA/RNA折紙5。迄今，成功地構建且表徵了具有多種幾何形狀之數種2D及3D DNA/RNA奈米結構5-11。奈米技術之一項主要挑戰在於控制且組織具有奈米精度之物質12。在完全可尋址性之情況下，該等DNA/RNA奈米結構成功地且精確地經構建為主客體分子(諸如DNA、RNA或蛋白質)2。此導致DNA/RNA奈米結構作為藥物遞送媒劑之主要生物應用。據報道，DNA/RNA奈米結構可有效地負載siRNA13、蛋白質14及藥物15以遞送至特定細胞或位置中來治療癌症。吾人先前研究了DNA奈米結構作為合成疫苗之另一生物應用，該合成疫苗精確地組織抗原及佐劑16。
除了DNA/RNA奈米結構之上述生物應用以外，先前研究集中於使其用於某些功能性NA分子之呈現，以便刺激免疫反應。熟知核酸藉由數種模式識別受體(PRR)識別以經由先天免疫性誘導免疫活化17。當內化至內體中時，核酸由包括TLR318(關於內體dsRNA)、TLR7/819,20(關於內體ssRNA)及TLR921(關於內體CpG DNA)在內之Toll樣受體(TLR)識別。諸如視黃酸誘導性基因I(RIG-I)及黑色素瘤分化相關蛋白5(MDA5)之細胞質受體亦感測dsRNA且觸發強烈免疫反應22。CpG DNA為經充分表徵且普及之免疫佐劑23。吾人先前將其併入至DNA奈米結構中以構建合成疫苗16。然而，CpG DNA之缺點之一在於其不會在智人中誘導實質免疫反應，歸因於TLR9在人類中之有限細胞分佈24。合成dsRNA類似物聚肌苷酸-聚胞苷酸(PolyIC)數十年來已經研究且用作免疫佐劑25。 作為用於多種PRR之配位體，其不僅活化內體中之TLR3，而且經由線粒體抗病毒信號傳導蛋白(MAVS)路徑26,27刺激細胞質中之RIG-I及MDA5。然而，在polyIC投與時已歸因於RIG-I/MDA5信號傳導路徑之全身性細胞因子釋放會引起實質細胞毒性及逆境，由此在臨床上顯著地限制其全身性應用28-29。新近開發之dsRNA佐劑ARNAX為由140bp dsRNA及5' GpC DNA oligo組成之合成DNA-dsRNA雜合分子，據報道其僅誘導TLR3活化，因此提供較安全之免疫刺激效應30。該ARNAX仍處於早期開發階段中且穩定、有效且安全RNA佐劑之構建/鑒別仍具有吸引力。吾人新近開發之單鏈RNA折紙(RNA-OG)為含有緻密dsRNA區之合成奈米結構5。受以上合成RNA佐劑啟發，吾人研究了單鏈RNA折紙之佐劑潛力，及其在癌症免疫療法中之應用。
以高產率自長單鏈RNA分子自組裝，該RNA-OG能夠便利地以高精確度大量產生，其克服了傳統DNA折紙奈米結構之缺點。穩定性測試證明了其在血清中展現強烈RNase I抗性及極佳穩定性，且具有長貨架期。在活體外細胞刺激實驗中，吾人發現了該RNA-OG主要經由TLR3路徑誘導有效免疫刺激效應，其行為類似於ARNAX31。符合此發現，細胞因子型態分析指示RNA-OG之活體內投與不會誘導實質全身性I型干擾素釋放，表明其為比polyIC安全之免疫佐劑。當經腹膜內(IP)投與至具有轉移之結腸直腸癌之小鼠中時，該RNA-OG急劇地降低腫瘤生長或引起腫瘤衰退。進一步分析亦揭露，RNA-OG治療藉由增加促發炎細胞因子(IFNγ及TNFα)之產生，但降低免疫抑制性細胞因子(TGFβ、IL10及IL4)之水準及骨髓源性抑制細胞(MDSC)之數目來改變腹膜環境。因此，RNA-OG之IP投與可能再編程腫瘤微環境以逆轉腫瘤介導之免疫抑制且增強抗腫瘤免疫性。連同其在可擴展生產中之穩固性、優良結構穩定性及良好安全性型態，該RNA-OG表示用於癌症免疫療法之新型且有希望之免疫佐劑。
結果： RNA-OG之可擴展生產及極佳穩定性
不同於需要數百個短寡核苷酸之輔助的習知DNA折紙奈米結構3，該ssRNA折紙經設計以可編程方式自組裝長ssRNA分子。為了實現序列精確度及一致性，DNA模板在質體DNA中經選殖且複製。該RNA分子可便利地經由活體外轉錄反應大量產生(圖21B)，具有超過5mg/ml轉錄混合物之典型產率。因此，該RNA-OG可以較少努力或成本容易地實現可擴展生產。均一RNA-OG經由1x PBS緩衝液中之簡單退火過程自組裝而成，而未添加任何二價陽離子，指示其為高度熱穩定性的。為了證明其熱穩定性，使用UV熔融分析來量測其熔融溫度。觀察到在約76℃及約84℃下之兩個轉變溫度，分別對應於該平行內聚及剩餘經雜交dsRNA區之熔融(補充圖28)，與吾人先前發現相似5。在該緩衝液中無二價陽離子之情況下使用76℃作為其第一熔融溫度，該RNA-OG絕對展現比DNA折紙奈米結構優良之熱穩定性32。為了證明其總體穩定性，經組裝RNA-OG在4℃下儲存持續四個月，且其完整性保持，如凝膠電泳以及AFM圖像中所示(圖21C)。大多數DNA折紙奈米結構易經受DNase消化且因此在血清中行為極不穩定33。相反，該RNA-OG抵抗RNase I消化(圖29A)且在用於隔夜培育之小鼠血清中保持完整(圖21E泳道1-4及圖29B)。吾人推測該高穩定性可能歸因於其固有特性：極緻密結構而無內部缺口位置。然而，經充分研究之dsRNA免疫佐劑polyIC-高分子量(PolyIC-H)在小鼠血清中培育30min時降低至低分子量(圖21D，泳道6)。亦在具有RNA-OG、polyIC及polyAU之人類血漿中執行全面穩定性比較。雖然RNA-OG在隔夜培育之後保持完整，僅具有略微降檔(圖21E，比較泳道1-5與泳道6)，但polyIC及polyAU均易隨時間經受降解且最終消失(圖21E，泳道12及18)。總之，RNA-OG展現極高熱穩定性及極佳酶穩定性。
RNA-OG之活體外刺激
經充分組裝之RNA-OG由作為主要結構之dsRNA區及懸掛於兩側之一些小單鏈RNA環組成。此等RNA組分均具有經由不同受體刺激先天免疫性之潛力。首先在小鼠巨噬細胞細胞株RAW 264.7中檢查RNA-OG之免疫刺激效應，量測活化時在免疫細胞之表面上表現的共刺激分子CD40之上調16。RNA-OG誘導比經polyIC-H及polyIC低分子量(polyIC-L)治療之組更有效的細胞活化(圖22A)。早在RNA-OG添加後30min即可能偵測到刺激，指示RNA-OG而非polyIC與該等細胞之快速相互作用(圖30)。清道夫受體A已經報道促進細胞外核酸之細胞攝取，該等細胞外核酸包括dsRNA及未甲基化CpG寡核苷酸(ODN)。有趣的是，發現硫代磷酸酯CpG(B/C型TLR9促效劑)或GpC(TLR9非促效劑)抑制polyIC介導之TLR3活化，據推測藉由阻斷polyIC之細胞結合及攝取34,35。此處，吾人發現非刺激硫代磷酸酯TLR9配位體GpC顯著地抑制RNA-OG介導之刺激，不過其僅引起RNA-OG之細胞相互作用及內化的適度但顯著降低(圖31及32A-G)。此外，吾人對原生脾細胞測試了RNA-OG之刺激活性。脾細胞之不同細胞群體基於方法中描述之策略進行閘控，且在不同類型的抗原呈現細胞(APC)B細胞、巨噬細胞習知樹突狀細胞(cDC)及漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)中比較藉由平均螢光強度(MFI)量測之共刺激信號分子CD86之水準。此等細胞類型中增加之CD86水準(圖22B)表明RNA-OG有效活化APC，其將幫助起始適應性免疫性。
基於RNA-OG對免疫細胞之強烈刺激，吾人研究潛在機制。由於RNA-OG含有dsRNA區及ssRNA環，其可能經由識別dsRNA或ssRNA之PRR工作。鼠科動物TLR3及TLR7報告基因細胞株HEK-BlueTM mTLR3及HEK-BlueTM mTLR7分別地用於評估。與polyIC-H及polyIC-L相似，用RNA-OG培育會在HEK-BlueTM mTLR3而非HEK-BlueTM mTLR7細胞中引起報告基因信 號之水準增加(圖22C)，指示RNA-OG經由TLR3而不可能經由TLR7刺激細胞。另一常見類型之識別dsRNA信號之PRR包括細胞質RNA感測器RIG-I及MDA5。此處，吾人使用A549-DualTM報告基因株(具有野生型MAVS)及其變異體A549-DualTM KO-MAVS細胞株(其中RIG-I/MDA5路徑中之信號接頭MAVS經基因剔除)來測試RNA-OG是否經由RIG-1及MDA-5感測器下游之MAVS路徑起作用。如所預期，已知觸發RIG-I/MDA5路徑之polyIC在野生型MAVS A549報告基因株中誘導強烈活化，但在KO-MAVS突變型細胞株中並未如此(圖22D)。另一方面，RNA-OG之轉染僅導致報告信號相對於對照組之略微增加(圖22D)，表明RNA-OG並非RIG-I/MDA5 dsRNA感測器之有效促效劑，這可保證其不太可能造成全身性細胞因子反應。
使用RNA-OG時之離體及活體內細胞因子型態
由於RNA-OG顯示活體外及離體共刺激分子之有效刺激，吾人接下來檢查RNA-OG刺激之後免疫細胞之細胞因子型態。收集離體刺激之後的細胞培養上清液用於細胞因子分析。與圖22B中觀察到之脾細胞的刺激型態一致，RNA-OG誘導經活化免疫細胞中高於PIC-H及PIC-L但適度之I型IFN產生(圖23A)。有趣的是，募集T細胞至腫瘤環境中36所牽涉之趨化因子CXCL10已與結腸直腸癌患者中之良好預後相關37。發現此趨化因子在離體及活體內刺激中藉由RNA-OG及polyIC提高至相似水準(圖23A及23B)。因此，回應於RNA-OG及polyIC-H之刺激，有可能自活體外已發現可回應於此等刺激劑之免疫細胞產生血清CXCL10。相反，具有RNA-OG之脾細胞培養物中可見的IFN-α/β之略微增加(圖23A)未在血清細胞因子分析(圖23B)中再現。反而，IFN-α/β之顯著提高僅在來自經polyIC-H而非RNA-OG治療之小鼠的血清中觀察到(圖23B)。據報道，polyIC介導之刺激活性極大地變化，取決於聚合物鏈之長度及靶標細胞之類型38,39。然而，如與polyIC-H相比，RNA-OG之IP注射可能誘導CXCL10而 非IFN-α/β之全身性產生。此活體內細胞因子模式與藉由ARNAX及polyAU40,Gatti,2013 #79,41誘導之彼等模式極其相似，暗示RNA-OG之安全型態(若活體內使用)。接下來，吾人研究了RNA-OG在癌症免疫療法中之潛力。
鼠科動物結腸直腸腹膜轉移性模型中RNA-OG之抗腫瘤免疫性
活體內證明之RNA-OG之安全性型態促使吾人測試RNA-OG是否可經由腹膜內投與途徑來延遲腹膜轉移(PM)及腹膜癌擴散(PC)的腫瘤進展，因為PM/PC被視為具有不良預後及有限治療選項之晚期階段及致命疾病42。為了測試此情形，吾人使用同基因腹膜轉移(PM)結腸癌CT26-iRFP模型，該模型經工程改造以表現近紅外螢光蛋白(iRFP)，其允許整體動物中腫瘤生長之即時監測，尤其當腫瘤負荷較低時43。在第0天腹膜內投與CT26-iRFP細胞之後，小鼠自第1天開始接受兩週一次治療(圖24A)。經由iRFP之螢光強度監測腫瘤進展(圖24B)。經PBS治療之對照小鼠至第4天開始顯示可見腫瘤且至第12天均已發展腫瘤。對照小鼠在第16天之前到達終點。相反，所有經RNA-OG及PolyIC治療之小鼠均未發展可見腫瘤，指示兩種類型之核酸的佐劑活性能夠誘導足以停止腫瘤生長之活性。因此，儘管其不能誘導I型干擾素之全身性產生，RNA-OG證明了可與PolyIC誘導之活性相當的抗腫瘤活性。為了研究用RNA-OG觀察到之抗腫瘤活性是否歸功於其對腫瘤細胞之直接影響，執行MTT分析以評估RNA-OG介導之細胞毒性。然而，細胞活力未受RNA-OG或polyIC顯著影響(圖34A-34B)，暗示RNA-OG未發揮直接抗腫瘤效應。
為了進一步測試RNA-OG之抗腫瘤效應，吾人延遲攜帶腫瘤之小鼠的治療，亦即，RNA-OG在腫瘤接種後3天經起始且繼續兩週一次(圖25A)。所有未治療對照小鼠至第14天均發展腫瘤(圖25B)，且在第21天之前到達終點。在經RNA-OG治療之小鼠中，當小鼠接受兩個劑量之RNA-OG時，可見腫瘤最初在第10天長出。接著，在五隻經治療小鼠中之四隻中，腫瘤叢集逐漸地隨時 間消失，且小鼠保持無腫瘤持續一段延長時間(圖25B及25C)。自多個實驗彙編之小鼠生存數據顯示，儘管RNA-OG之立即治療誘導的效應顯著優於RNA-OG治療中具有3天延遲之情況下的效應，兩種治療均提供與PBS對照物相比之優良抗腫瘤效應及生存力(圖25C及圖34C)。此發現指示，類似在作為用於管理具有PM/MC之患者的目前治療形式之細胞減滅術(cytoreductive surgery)或超熱腹膜內升溫化學療法(hyperthermal intraperitoneal hyperthermic chemotherapy；HIPEC)之後具有殘餘疾病病狀的情形，當腹膜隔室中之腫瘤負荷相對較低時，RNA-OG可能誘導有效腫瘤抑制效應44。為了確定小鼠是否顯示腫瘤衰退，發展抗腫瘤免疫性，在第47天用CT26-iRFP之IP注射再攻擊生存小鼠(圖25A)。對照組亦經由IP接受相同數目之CT26-iRFP細胞。iRFP螢光在所有原生對照小鼠中均出現，但未在任何經再攻擊之小鼠中出現(圖25D)。同樣，當腫瘤細胞經皮下投與時，經再攻擊之小鼠均未顯示腫瘤生長，而五隻原生小鼠中之四隻屈服於腫瘤形成(圖35A)。因此，經RNA-OG治療之攜帶腫瘤之小鼠發展全身性及長期抗腫瘤免疫性。
NK及T細胞依賴性抗腫瘤免疫性
吾人接下來藉由耗盡經RNA-OG治療之小鼠中的CD8及NK細胞來測試CD8T細胞及NK細胞在RNA-OG介導之抗腫瘤免疫性中之作用(圖35B-D)。有趣的是，NK細胞耗盡完全地消除RNA-OG在遏制腫瘤生長方面之活性，而CD8細胞之降低顯著地損害腫瘤-抑制劑活性(圖35B-D)。為了進一步研究T細胞是否為抗腫瘤活性所必需，吾人在T細胞缺乏無胸腺Balb/C小鼠中進行圖24A-24B中所述之相似實驗。如圖26之頂部圖中所示，儘管RNA-OG治療早在腫瘤注射後一天即開始，從而在免疫勝任Balb/C小鼠中引起良好抗腫瘤免疫性(圖24B)，但腫瘤在該等無胸腺小鼠中快速地生長，無論用PBS治療抑或RNA-OG治療。此結果指示在功能性T細胞不存在下，RNA-OG無法起始針對 腫瘤細胞之保護性免疫性。另一方面，在接受取自證明了對腫瘤再攻擊之抵抗的腫瘤免疫小鼠(圖25D中所示者)之免疫細胞之過繼轉移之後，此等相同小鼠變得對腫瘤攻擊免疫(圖26，底部右側)。然而，原生脾細胞之過繼轉移無法對該等無胸腺小鼠賦予免疫性(圖26，底部左側)。因此，RNA-OG需要T細胞之存在來誘導抗腫瘤免疫性。
RNA-OG介導將腫瘤微環境自免疫抑制再編程為促發炎反應
腹膜內惡性疾病之腹膜腔構成用於腫瘤進展之極佳環境，因為其由多種類型之腫瘤支持細胞、基質細胞及免疫抑制細胞(如骨髓源性抑制細胞(MDSC))組成，且高度富集腫瘤促進及免疫抑制因子，諸如VEGF、TGFβ及IL1045。已知RNA-OG對IP注射之CT26-iRFP細胞之腫瘤進展的有效影響，吾人詢問RNA-OG是否可能用於減輕腹膜腫瘤微環境。自經PBS或RNA-OG治療之小鼠收集腹水液。準備腹水上清液用於細胞因子分析。如圖27A及27B中所呈現，發現如與經PBS治療之對照小鼠相比，對於腫瘤細胞具細胞毒性之IFNγ及TNFα的水準在經RNA-OG治療之小鼠中提高。相反，發現在經RNA-OG治療之小鼠中，包括TGFβ1、TGFβ2、IL10及IL4在內之免疫抑制性細胞因子的水準低於對照組。因此，RNA-OG治療導致腫瘤環境自促腫瘤免疫抑制性轉變為抗腫瘤免疫反應性狀態。此發現與自腹水及腹膜灌洗液回收之腹膜細胞的細胞分析一致。基於CD11b+腹膜細胞中Ly6C及Ly6G之閘控，表現Ly6C及/或Ly6G之MDSC的百分率在接受PBS注射之攜帶腫瘤之小鼠中達到91%，而在經RNA-OG治療之小鼠中發現彼數目顯著降低(圖27C及27D)。總之，藉由刺激TLR3信號傳導路徑，RNA-OG可能活化NK及T細胞依賴性抗腫瘤免疫性，且亦將腹膜腔自免疫抑制性環境再編程為免疫反應性環境以維持該免疫性。
論述
在此研究中，吾人發現經自組裝之RNA-OG充當有效TLR3促效劑 以活體外活化免疫細胞且活體內發揮抗腫瘤活性。使用TLR3-報告基因株及RIG/MDA5反應性或基因剔除細胞株，吾人證明了RNA-OG優先活化TLR3信號傳導路徑。儘管HEK-TLR3報告基因株中用RNA-OG活化之倍數略微低於用polyIC-H活化之倍數，RNA-OG在其對免疫細胞的刺激方面展現比polyIC強得多之活化，如RAW264巨噬細胞株及原代脾細胞培養物中所揭露(圖22A及B)。由RNA-OG呈現之有效刺激可能歸因於其在含血清培養基中之結構穩定性高於polyIC，如圖21D及E中所示)。或者，如與彼等非免疫細胞相比，免疫細胞可攝取多於polyIC之RNA-OG以用於其在免疫細胞中之活化，例如用於此研究之兩種報告基因株(HEK，人類胚胎腎細胞；及A549，肺上皮癌細胞)。此兩種情形並非相互排斥的。RAW巨噬細胞株之刺激可能由硫代磷酸酯GpC及硫酸右旋糖苷以劑量依賴性方式阻斷之實情表明，此等免疫細胞對RNA-OG之攝取有可能經由已知轉運包括CpG或GpC寡核苷酸(ODN)及polyIC在內之核酸的清道夫受體介導46，不過其他受體亦已經報告牽涉於dsRNA結合及轉運中47。
如與polyIC相比，RNA-OG具有數種優勢。首先，RNA-OG為具有充分確定幾何形狀之單分散且高度均一奈米結構。RNA-OG之結構均一性使得有可能對結構/功能關係進行一致且可再現表徵，不同於在大小方面異質之polyIC，polyIC會引起其功能及作用模式之變異性38。關於活體內應用，據報告具有高分子量之polyIC(亦即，polyIC-H)比具有低分子量之polyIC((polyIC-L)有效且因此，polyIC-H在此處用作陽性對照物(圖22A-D及23A-B)。此外，RNA-OG之充分確定奈米結構使得有可能合理地設計且最佳化基於RNA-OG之佐劑以用於較佳功效及安全性。其次，RNA-OG為高度穩定的，由其在PBS(無陽離子之生理溶液)中保持之長貨架期(>10個月)及對於存在於血清/血漿中的核酸酶之抵抗證明，更甚於polyAU及polyIC-H(圖22D)。吾人推測RNA-OG之高穩定性有可能歸因於其高度緻密結構，該結構使其可獲得較少血清RNase用 於降解。因此，在添加時，未與諸如脂質或聚合物之任何其他組分複合的裸RNA-OG結構可充當強TLR3促效劑以活體外刺激免疫細胞，其比polyIC-H有效(圖22A及22D)。同樣，活體內投與之RNA-OG亦誘導CXCL10的強產生，其水準與藉由polyIC-H刺激之水準可相當(圖23)，指示具有單一化學實體之RNA-OG具有有效佐劑活性。第三，儘管其活體外對免疫細胞且活體內對CXCL10趨化因子產生具有強烈刺激活性，RNA-OG不會觸發I型干擾素之全身性產生。儘管此等干擾素在引起先天及適應性免疫性以遏制腫瘤生長方面發揮重要作用，此等細胞因子之全身性產生(例如，藉由polyIC觸發)亦已造成細胞因子風暴及活體內毒性48。結果，已致力於修飾polyIC結構以降低其全身性毒性或使其應用限於局部遞送，諸如皮下、皮內或鼻內投與49。兩種polyIC衍生產品目前在臨床試驗中作為癌症疫苗佐劑49。一種為Hiltonol(由Oncovir Inc製造)，稱作Poly-ICLC，其為與聚離胺酸羧基甲基纖維素複合之polyIC以增加其穩定性；且另一種為Ampligen(Hemispherx Biopharma)poly(I：C12U)，其為在C鏈之每第12個鹼基處具有U錯配以降低穩定性之polyIC。據報告Ampligen在人類中經充分耐受，且其與DC-疫苗接種或其他化學治療劑組合之腹膜內(IP)投與目前在用於治療復發性卵巢癌毒性之I/II期臨床試驗中49。另一方面，使用Hiltonol之臨床試驗(I/II期)排他地使用局部遞送途徑，據推測歸因於其全身性毒性49。或者，亦已測試除polyIC以外之dsRNA以搜索有效且安全佐劑。有趣的是，polyAU及合成dsRNA結構(稱作ARNAX50)已顯示主要地充當TLR3促效劑且其不展現I型干擾素之全身性產生51,52。因此，具有TLR3信號傳導路徑之排他性使用而未活化細胞質RNA感測器(諸如RIG-I及MDA5)之dsRNA類似物看來與其不能活體內誘導全身性細胞因子風暴相關40。因此，已建議排他地觸發TLR3信號傳導路徑之dsRNA類似物可構成一線有效且安全之佐劑30。基於其活體內刺激型態(圖22A-D)及此處表徵之活體內細胞因子產生(圖23A-D)，經自組裝之 RNA-OG有可能屬此類別之dsRNA佐劑。
實際上，在測試活體內RNA-OG之抗癌活性時，吾人證明了與polyIC-H相似，RNA-OG可能誘導強烈腫瘤延遲或腫瘤衰退(圖24A-B)。經RNA-OG治療之攜帶腫瘤之小鼠發展全身性及長期免疫性，因為其抵抗腫瘤細胞之第二次攻擊(圖25A-D)。有趣的是，此抗腫瘤免疫性之產生取決於NK細胞及CD8+ T細胞兩者之存在，因為缺失該兩種細胞類型中的任一者均會損害RNA-OG引起抗腫瘤免疫性之能力(圖35B-D)。因此，RNA-OG介導之免疫細胞活化及抗腫瘤免疫性的特徵類似先前關於polyIC及ARNAX報告之多種特徵，亦即，活化包括DC、巨噬細胞及NK細胞在內之先天免疫細胞，這又幫助募集及引發細胞毒性T淋巴細胞以攻擊腫瘤細胞30，以及減輕免疫抑制性環境53。
總之，RNA-OG表示新線dsRNA佐劑，其在結構上為單分散且穩定的，且在功能上為有效且安全的，這關於活體內應用為理想的。例如，與腹膜轉移(PM)或腹膜癌擴散(PC)相關之疾病病狀被視為具有極不良預後之末期階段45,54。用於治療PM/PC之目前治療形式依賴於細胞減滅術及腹膜內超熱化學療法，其為低效的且有時不可應用於某些患者44。儘管polyIC之腹膜內注射在用於治療PM/PC之動物模型中經測試，發現在臨床試驗中穩定化polyICLC之全身性應用為不可耐受的且與高毒性相關49。可想而知，在此研究中經證明誘導強烈局部抗腫瘤活性而未造成全身性反應之RNA-OG可能充當用於治療PM/PC之免疫治療劑。
方法 RNA-OG產生
如先前所述進行矩形RNA-OG設計、序列產生及DNA模板選殖。在RNA轉錄之前，DNA質體藉由EcoRI限制酶線性化且隨後進行苯酚/氯仿萃取及乙醇沉澱。在補充有20mM NTP mix、400U/ml SUPERase IN(ThermoFisher Scientific)、1U/ml無機焦磷酸酶(New England Biolabs)及0.01mg/ml自製T7 RNA聚合酶之1x轉錄反應緩衝液(80mM HEPES(pH 7.5)、24mM MgCl2、40mM DTT及2mMspermidine)中用0.05mg/ml線性質體模板執行大規模RNA產生。該活體外轉錄反應在30℃下培育持續5小時，隨後在37℃下藉由添加20U/ml DNase I(New England Biolabs)進行15分鐘培育以完全地消化該DNA模板。經轉錄RNA接著使用RNA clean & concentrator 100套組(Zymo research)根據製造商之說明書經純化。RNA分子之典型產率為>5mg/ml轉錄混合物。該RNA-OG在1xPBS緩衝液中以-1℃/15分鐘之斜線自65℃至25℃自組裝而成。
RNA-OG穩定性分析
在10μl 1X PBS緩衝液中用與1U RNase I(ThermoFisher Scientific)混合之1μg RNA-OG執行RNase I消化。該反應在室溫下培育持續20分鐘，隨後進行1%瓊脂糖凝膠電泳。藉由在10μl 1X PBS緩衝液中用10%小鼠血清/人類血漿補充1μg RNA-OG或polyIC-H(Invivogen)或polyAU(Invivogen)來進行血清/血漿穩定性測試。該等混合物在37℃下以多個時間點進行培育且藉由添加1X紫色凝膠負載染料(New England Biolabs)來終止。
使用具有溫度控制附件之CARY 300BIO UV-vis光譜儀在石英比色槽(Starna Cells)中量測UV熱曲線。RNA-OG在1×PBS緩衝液中經預退火且稀釋至A260約為0.9。RNA-OG(135μL)用移液管吸移至該比色槽中且使300μL礦物油在鏈混合物之頂部上分層以防止溫度斜線期間之樣品蒸發。在該熱程式中以1-min時間間隔記錄在260nm下RNA之UV吸光度(A260)。1×PBS緩衝液用作背景參考物。該樣品在15℃下保持10min且以+0.1℃/min加熱至90℃。
RAW 264.7細胞活體外刺激
在補充有10%熱不活化FBS之DMEM培養基中培養RAW 264.7細胞。細胞以2×105個細胞/孔接種於24孔板中且在37℃下培育隔夜。替換該培養 基且PBS、硫酸右旋糖苷(200μg/mL)或硫代磷酸酯鍵結人類GpC(50μg/mL)作為抑制劑經添加。在37℃下培育持續30分鐘之後，RNA-OG、PIC-H或PIC-L(5μg/mL)作為刺激劑經添加且細胞再在37℃下培育持續60分鐘。自該板回收細胞且藉由在380x g下離心持續5分鐘進行收集。其在PBS中洗滌一次，在染色緩衝液(1×PBS、2% BSA、0.01%疊氮化鈉)中洗滌一次且接著在4℃下用PE抗小鼠CD40染色持續30分鐘。在用染色緩衝液洗滌兩次且再懸浮於200μL PBS中之後，在FACSAria II儀器上分析細胞樣品。使用各樣品之平均螢光強度(MFI)來評估活化。
動物
雌性BALB/c小鼠獲自Charles River Laboratories且維持於亞利桑那州立大學動物資源中心(Arizona State University Animal Resource Center)之無病原體動物設施中。所有小鼠均根據動物福利法(Animal Welfare Act)及亞利桑那州立大學機構動物管理及使用委員會(Arizona State University Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC))進行處置。在實驗性治療之前，該等小鼠隨機地分佈於籠中且在治療之前使其適應至少1週。在8週齡時，該等小鼠在第0天經由IP注射接受在100μL無菌PBS中之5×105個CT26-iRFP細胞。PBS、RNA-OG及polyIC-H之治療在第1、3或5天開始。IP治療兩週一次給予4-6次且含有懸浮於100uL無菌PBS中之16μg核酸。使用吸入之異氟烷(Henry Schein)來麻醉小鼠，在LI-COR Biosciences Pearl Impulse小動物成像儀上經由iRFP之螢光(激發：690nm，發射：713nm)監測腫瘤進展。
根據IACUC方案處置裸雌性無胸腺BALB/c小鼠。PBS及RNA-OG組以與上述免疫勝任小鼠相同之方式經治療。過繼轉移組接受來自原生免疫勝任雌性BALB/c或在其初始CT26-iRFP攻擊之後已經RNA-OG治療且經確認對第二次CT26-iRFP攻擊免疫之CT26-iRFP免疫雌性BALB/c的1.1×107個脾細胞。 該等脾細胞懸浮於100μL無菌PBS中且經IP注射。其經獲得且根據以下脾細胞分離程序經分離，但懸浮於注射用PBS而非RPMI中進行培養。
關於免疫細胞耗盡，小鼠在第0、4、7及11天(亦即，在RNA-OG的每一次注射之前一天)IP注射250ug/劑量之單株大鼠抗小鼠CD8b、對照IgG(純系Lyt 3.2及TNP6A7，Bio X細胞)或50ul多株兔抗小鼠NK細胞抗體(Ultra-LEAFTM經純化抗Asialo-GM1抗體，Poly21460,Biolegend)。
脾細胞分離及刺激
小鼠用二氧化碳窒息實施安樂死，且移出脾臟且藉由快速地浸漬於70%乙醇中持續1秒來滅菌，接著在生物安全櫃中轉移至補充有10%胎牛血清(FBS)之無菌RPMI-1640培養基中。在一個末端切割脾臟，且使用薄、經密封L型玻璃管推出脾髓。經萃取之脾細胞集結成粒且藉由在上述無菌RPMI-1640培養基中以380×g旋轉持續3min加以洗滌，且紅血球藉由ACT溶解緩衝液(體積比為9：1之0.16M NH4Cl及0.17M Tris[pH 7.65]的組合，pH用1M HCl調節至7.2，且經過濾滅菌)耗盡。在補充有10% FBS及抗生素之RPMI-1640培養基中洗滌兩次之後，脾細胞以4×106個細胞/mL之密度接種於12孔板中。RNA折紙、PolyIC或PBS對照物以所需濃度添加至各孔中，50ng/mL脂多糖(LPS)添加至陽性對照孔中且多黏菌素B(PMB)添加至各孔中，不過LPS單獨孔之最終濃度為100μg/mL以防止內毒素污染。在刺激之後24小時，收集細胞，用抗體混合液染色，且藉由流式細胞術進行分析。
流式細胞術
經刺激脾細胞藉由以380×g短暫離心持續3min加以收集，且保存上清液用於細胞音質分析。集結成粒之細胞用1×PBS洗滌一次，且在室溫下經Zombie Violet活力染料(Biolegend，目錄# 423114)標記持續15分鐘。在染色緩衝液(1×PBS、2% BSA、0.01%疊氮化鈉)中洗滌兩次之後，細胞在含有FcR阻 斷之以下抗體混合液中經培育：(a)FITC抗小鼠CD3、PE抗小鼠CD69、太平洋藍抗B220、APC抗CD49b及PE/Cy7抗小鼠CD4；b)FITC抗小鼠CD11b、PE抗小鼠CD86、PE/Cy5抗小鼠B220及PE/Cy7抗小鼠CD11c。在4℃下培育30分鐘之後，細胞在染色緩衝液中洗滌兩次且再懸浮於200μL染色緩衝液中。各樣品在亞利桑那州立大學生物設計機構之FACSAria II儀器上進行分析。活細胞經定義為Zombie Violet-低細胞群體且針對活CD3 T細胞進行閘控。CD3 T細胞群體中之CD69+細胞的百分率針對T細胞刺激量測繪製曲線。NK細胞及CD69+ NK細胞係基於分別地針對CD49+B220-CD3-及CD69+CD49b+B220-CD3-群體之閘控，其以佔總的活脾細胞之百分率呈現。漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)經定義為CD11b-CD11c+B220+活細胞，且習知樹突狀細胞(cDC)經定義為CD11b+CD11c+細胞。作為DC刺激狀態之指示劑，對各DC細胞群體中CD86之平均螢光強度繪製曲線。
細胞因子分析
使用基於BioLegend之LEGENDplexTM珠粒的小鼠抗病毒反應組(13-plex，目錄740621)陣列，針對一組13種細胞因子檢查來自離體脾細胞培養之細胞培養物上清液該陣列允許同時定量13種小鼠蛋白質，包括IFN-γ、CXCL1(KC)、TNF-α、CCL2(MCP-1)、IL-12p70、CCL5(RANTES)、IL-1β、CXCL10(IP-10)、GM-CSF、IL-10、IFN-β、IFN-α、IL-6。根據製造商之說明書執行該分析，包括細胞因子染色、流式細胞術分析及用於定量之數據采集。關於血清細胞因子分析，100μL RNA-OG(16μg)、PolyIC(16μg)或1×PBS經I.P.注射至原生8-10週齡小鼠中，且在自小鼠面靜脈注射後3h及24h收集小鼠血液，且藉由在4℃下以7000rpm旋轉持續10分鐘自血樣回收血清。使用相同的Biolegend之LEGENDplexTM細胞因子陣列，在針對血清分析設計之略微修飾下分析血清。來自Biolegend之Jason Lehmann在數據分析中提供輔助。
關於存在於腹膜腔中之促發炎及免疫抑制性細胞因子的分析，自經PBS或RNA-OG治療之攜帶腫瘤之小鼠(其具有極低量的腹水液)回收腹水液，將腹水上清液發送至Eve Technologies來測試TGF-β3-Plex(TGFB1-3)及小鼠細胞因子陣列促發炎聚焦10-plex(MDF10)。後者偵測GM-CSF、IFNy、IL-1B、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、MCP-1及TNF-α。
細胞活力分析
在用RNA折紙培育之後細胞的活力藉由MTT分析(來自Thermo Fisher之Vybrant®MTT細胞增生分析套組)根據製造商之方案加以分析。最終濃度為5μM之喜樹鹼(Sigma-Aldrich，目錄號C9911)充當陽性對照物，因為已知其誘導細胞凋亡。
TLR3促效劑測試
表現小鼠TLR3之報告基因細胞株(HEK-BlueTM mTLR3細胞)購自Invivogen。RNA折紙及其他佐劑之促效劑活性藉由在根據製造商之方案共培育此等佐劑與細胞之後HEK-Blue培養基的吸光度量化。購自Invivogen之ssRNA40/LyoVecTM充當陰性對照物。
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實例5
設計三種不同矩形形狀及一種菱形形狀RNA折紙，其均具有富U環(參見圖39-42；SEQ ID NO：1、7-8及10)。在小鼠巨噬細胞細胞株RAW 264.7中檢查RNA奈米結構之免疫刺激效應，量測活化時在免疫細胞之表面上表現的 共刺激分子CD40之上調。不同劑量之RNA奈米結構用RAW 264.7細胞培育持續20小時。該等細胞接著用PE抗小鼠CD40抗體染色且用流式細胞儀分析。初始矩形奈米結構(由SEQ ID NO：1形成之結構)展現較高平均螢光強度(MFI)，暗示較強免疫刺激效應(圖43)。
亦檢查環序列之比較。本文所述之RNA奈米結構可包含作為該結構之主要部分的雙鏈RNA，連同在兩個邊緣上之短環。初始矩形RNA奈米結構含有13個具有序列『UUUC』(SEQ ID NO：1)之四環。在新型設計中，該環經修飾為如下所列出之其他序列：『富G』：『GGGAGGG』；『富C』：『CCCUCCC』；『富A』：『AAAGAAA』及『富U』：『UUUCUUU』(參見SEQ ID NO：2-5)。使用先前在實例4中所述之方法檢查RNA奈米結構之免疫刺激效應。具有『富C』及『富U』環之RNA折紙顯示與含有『UUUC』環之初始折紙相似的免疫刺激效應，而『富G』及『富A』環略微不太有效(圖44)。
實例6
執行進一步實驗來測試小鼠中RNA折紙(SEQ ID NO：1)對A20-iRFP淋巴瘤腫瘤之活體內有效性。在第-10天注射腫瘤細胞以形成腫瘤結節。治療在第0天開始，隨後再經腫瘤內進行兩次注射。在A20腫瘤中，注射為皮下。關於抗PD1實驗，遵循相似治療方案，除了抗PD1在RNA-OG治療後2天經遞送，且僅給予兩輪抗PD1。黑色箭頭指示RNA-OG之注射。圖45。執行進一步實驗，其中抗PD1與RNA-折紙組合，其中監測腫瘤生長及小鼠生存兩者。圖15。
實例7
執行一系列實驗來評估某些RNA奈米結構對原代脾細胞之刺激。用於此等實驗中之方法與用於實例4中之彼等方法相似。此等實驗指示，1)RNA-Rec(SEQ ID NO：1)為活化B細胞之有效刺激劑(藉由增加之CD69表現揭露)；2)RNA-Rec在T細胞中誘導CD69之上調；3)RNA-Rec看來不會直接地抑 制腫瘤細胞生長。另外，該等實驗指示所測試之其他RNA-折紙誘導不太有效之B及T細胞活化。
細胞因子分析揭露，RNA-Rec誘導IFN-α及IFN-β之局部產生。在RNA-Rec及小鼠脾細胞之共培養後24-h或48-h收集細胞培養物上清液，且RNA-Rec組之IFN-α及IFN-β水準與其他組相比有所提高(圖10)。當在小鼠中經由眶後途徑投與時，RNA-Rec誘導小鼠血清中提高之IFN-α及IFN-β產生(圖11)。
在小鼠結腸癌模型中，RNA-Rec誘導腫瘤衰退。(圖18)自經RNA-Rec或PBS治療之攜帶腫瘤之小鼠收集腹水液，且此等腹水液的細胞因子型態揭露了經RNA Rec治療之小鼠中的抗腫瘤(促發炎)細胞因子水準增加，而經RNA Rec治療之小鼠中的免疫抑制性(消炎)細胞因子水準降低(圖19)。
在小鼠淋巴瘤模型中，經由腫瘤內注射向攜帶腫瘤之小鼠投與檢查點抑制劑(抗PD1抗體)，具有或不具有RNA-rec。在經RNA-Rec+抗PD1抗體治療之小鼠中觀察到顯著腫瘤衰退。(圖15)
實例8
研究CD8及NK細胞在RNA-OG介導之抗腫瘤免疫性中之作用。如此實例中所用，術語RNA-OG係指包含SEQ ID NO：1之RNA奈米結構。顯示如下實驗設計之示意圖顯示於圖46A中，該實驗設計用於評估分別使用抗CD8或抗NK單株抗體之CD8或NK細胞耗盡的效應。該抗體在同一天但在腫瘤注射後4h經注射。RNA-OG在抗體治療後一天經投與(100ug/劑量持續總計4個劑量)。不相關IgG作為針對CD8/NK耗盡之陰性對照組包括在內。如圖46B中所示，藉由量測接受多種治療之小鼠中的iRFP螢光強度監測之腫瘤生長。此等實驗指示NK細胞之耗盡完全地消除藉由RNA-OG誘導的抗腫瘤免疫性且CD8之耗盡會損害由RNA-OG誘導的抗腫瘤免疫性。
實例9 RNA折紙之佐劑活性
單鏈RNA(ssRNA)及雙鏈RNA(dsRNA)可藉由哺乳動物細胞中之模式識別抗體來偵測。合成ssRNA及合成dsRNA已作為免疫刺激性佐劑加以研究(Alexopoulou等人，2001.Nature 413：732-738.)。例如，合成dsRNA類似物聚肌苷酸：聚胞苷酸(polyIC)已作為治療諸如上呼吸道感染及腫瘤之疾病的佐劑經廣泛研究，因此使其作為流感及癌症疫苗中之佐劑加以研究。然而，dsRNA對於核酸酶消化之易感性傾向於引起關注，尤其當活體內使用該dsRNA時。如以下實驗中所述，本文所述之RNA奈米結構可具有免疫刺激及/或核酸酶抵抗特性。用於執行下文所述之實驗的方法與實例4中所述之彼等方法相似。
如下文所述，顯示RNA-OG(SEQ ID NO：1)具有佐劑活性。特定言之，該RNA折紙刺激TLR3報告基因株(圖52-53)，從而充當有效TLR3配位體。其亦刺激A549報告基因株(圖54)。RAW-264由不同RNA-OG刺激(圖55-56)。該等細胞株以劑量依賴性方式經活化(圖57-58)。RNA-OG具有比PolyIC有效得多之刺激活性，其可依賴於RNA-折紙之形狀及/或在RNA-矩形之環處的核苷酸組成。
TLR3依賴性活化藉由CpG寡核苷酸(ODN)抑制(圖59-60)，指示RNA-OG及CpG-ODN共享相同內化路徑。RNA-OG不會活化細胞質RIG/MDA5信號傳導路徑(不同於polyIC)。與TLR3-報告基因株中之發現相似，RAW細胞之刺激可能藉由GpC-ODN抑制，據推測經由阻斷RNA-OG之細胞攝取。
RNA-OG在經刺激之脾細胞中誘導高於PolyIC之促發炎細胞因子產生(圖61)。如圖62中所示，RNA-OG不顯示對於數種鼠科動物腫瘤株中之腫瘤生長的直接抑制作用。
RNA折紙之活體內抗腫瘤活性
低水準之促發炎細胞因子活體內回應於RNA-OG產生，使得RNA-OG成為比polyIC安全之佐劑。PolyIC-H誘導TLR3及MDA5/RIG路徑兩者。後者已牽連於毒性(圖63)。實驗數據示出由ARNAX產生之IL6、TNFa及IFNb水準低於PolyIC，但IP-10(亦稱作CXCL-10)之水準可相當(圖64A-B)。不同細胞類型活體外對活體內藉由此等佐劑活化。RNA-OG不活化已與全身性細胞因子毒性相關之RIG/MDA5路徑，因此表示其安全性型態優於polyIC(圖65)。RNA-OG抑制腫瘤生長(圖65-69)。低劑量(16μg/劑量)之重複注射導致腫瘤生長之延遲及衰退。所觀察到之抗腫瘤活性取決於完整適應性免疫系統。
自攜帶腫瘤之小鼠收集的腹水細胞因子之分析顯示，如與PBS對照小鼠相比，使用RNA-OG之治療導致免疫抑制性及抗腫瘤促發炎細胞因子之顯著降低及增加(圖19)。
抗PD1抗體及RNA-折紙之組合會增強抗腫瘤活性(圖15)。
因此，RNA-OG有效作為抗腫瘤免疫治療劑。其具有有效佐劑活性而無全身性細胞因子型態。腫瘤衰退之誘導取決於T細胞介導之免疫性。
實例10
分子量大約為70及90kDa之熱休克蛋白(HSP)具有作為用於抗原肽之載劑刺激抗腫瘤免疫反應的能力。(Shevtsov M.及Multhoff G.Heat Shock Protein-Peptide and HSP-Based Immunotherapies for the Treatment of Cancer,2016年4月29日；7：171,Frontiers in Immunology，參見圖70。)熱休克蛋白-70(HSP70)及衍生肽充當伴侶蛋白。在功能上，其可充當腫瘤特異性抗原及免疫原。使HSP70連接至奈米粒子允許捕捉腫瘤細胞溶解產物以向樹突狀細胞(DC)提供抗原。HSP70蛋白及衍生肽可預活化NK細胞以直接殺死HSP-70+腫瘤細胞。在0.2-2.0μg/ml下關於活化發現劑量依賴性及可飽和增強，且在>4μg/ml下無反應。HSP70誘導腫瘤細胞之增生，誘導NK細胞朝向HSP70+腫瘤細胞之遷移、藉由 結合於顆粒酶且誘導靶標細胞之細胞凋亡實現的HSP70+腫瘤細胞溶解，且增加CD94表現，CD94可與NKG2A締合且結合於HSP70以與腫瘤細胞交戰。HSP70亦增加DC成熟及交叉呈現，增加Thl及CTL活性，且增加M1活性。HSP70/TKD轉向臨床試驗(I及II)，其中12名具有腦腫瘤之患者中的一名顯示CR，其顯示增加之Thl及降低之Treg，且其中12名具有HCV-HCC之患者中的7名在接受經轉染至DC之HSP70-mRNA之後顯示CR或SD。
基於核酸之Toll樣受體配位體(諸如poly IC、ssRNA及CpG寡核苷酸)為分別地經由TLR3、TLR7/8及TLR9信號傳導路徑之活化的有效佐劑。與此等TLR配位體組合之腫瘤特異性抗原已作為癌症疫苗經研究以降低腫瘤生長。基於RNA折紙作為上文所論述之TLR3配位體的發現，構建肽標記之RNA-折紙複合物，且該等複合物顯示為穩定的且能夠誘導強烈抗腫瘤免疫性。
熱休克蛋白70(HSP70)為細胞脅迫反應蛋白，據推測保護細胞免於毒性劑及嚴苛環境。另一方面，由於與腫瘤特異性或腫瘤相關抗原(TSA或TAA)相關之其伴侶蛋白功能，HSP70亦已作為TAA加以研究。據報告其誘導針對癌細胞之多面反應，包括先天及適應性免疫性。有趣的是，自HSP70之C端衍生的一種肽(稱作TKD肽)已經證明(1)活化NK細胞，(2)指導腫瘤靶向結合及內化，且(3)促進DC交叉呈現及最終誘導針對腫瘤細胞之細胞毒性T細胞反應。研究此肽與RNA-折紙之組合是否將構成有效癌症疫苗。
已知RNA-折紙之有效且獨特佐劑活性，猜測使RNA-折紙與TKD肽複合將會增加腫瘤特異性免疫性。RNA-折紙與腫瘤靶向肽(TPP)TKD-肽複合。TKD(TPP)-肽具有序列TKDNNLLGRFELSG(人類HSP70之C端區)，該序列與鼠科動物HSP70序列TRDNNLLGRFELSG高度同源。
為了簡化使用RNA-折紙之複合物形成，該TKD藉由在N端處添加胱胺酸(C)且向TKD肽之C端添加10個離胺酸殘基而經修飾，因此產生 CTKD-K10：CTKDNNLLGRFELSGGGSK10。該C殘基允許肽-二聚化以促進肽結合於腫瘤細胞之表面及HSP70叢集於該表面上。CTKD-K10與脾細胞之預培育可活化NK細胞，該等NK細胞又殺死腫瘤細胞。CTKD-K10亦可結合於多種腫瘤細胞，稱作腫瘤穿透肽(TPP)且在結合時，其可誘導該等肽之內化，可能經由HSP70寡聚，從而到達內體、溶酶體及甚至線粒體。
RNA-折紙為帶負電結構，因此TKD-K肽上之聚離胺酸的正電荷使得能夠使用該RNA-折紙進行直接、非共價複合物形成。該複合物形成藉由凝膠電泳證明(圖71)。視RNA：肽比率而定，該等複合物之大小增加且一些複合物經聚集。不同RNA-OG/TTP比率導致不同複合物大小。該複合物在其形成之後看來穩定，因為以1：200比率形成之舊及新複合物呈現相似遷移模式(圖71，泳道3及泳道7)。
不同複合物展現不同結合/內化型態，如藉由流式細胞術所示(圖72)。觀察到若更多肽與該RNA締合，則RNA-OG-肽複合物之內化可能受到阻礙。發現在1：100或1：200之RNA-OG：肽比率下，複合物大小略微上移，但可能仍由CT-26結腸癌細胞株及RAW-264巨噬細胞株攝取(圖72)。由RAW細胞引起之RNA-OG內化高於CT-26。在增加該肽之量時，結合於CT-26及RAW細胞兩者之水準較低。預測該RNA-折紙及TKD肽之組合將進一步增強且整合TLR3活化、NK-活化、用於細胞毒性T細胞反應之有效誘導的抗原交叉呈現。
在活體內腫瘤模型中，測試在1：100比率下之RNA-OG--肽複合物。有趣的是，將此複合物單一注射至攜帶腫瘤之小鼠中會導致完全腫瘤衰退(圖73)。在第0天接種紅色螢光陽性腫瘤細胞且在第9天形成腫瘤結節(亦即，治療前)。此等小鼠接著用不同類型之RNA結構(游離RNA或經腫瘤靶向肽(TTP)塗佈之RNA-折紙)的單一注射來治療。監測該等小鼠持續超過20天，且在接受RNA-折紙聚合物之小鼠中而未在其他組(包括僅RNA-折紙組)中發現腫瘤衰退。
在一個獨立實驗中，亦經腹膜內注射RNA-OG-肽複合物(1：200比率)，其中接種腹膜內結腸腫瘤細胞(圖74A)。五隻經治療小鼠中之一只(RNA-OG/TPP及RNA-OG)顯示腫瘤衰退，而所有對照組均屈服於腫瘤生長，包括接受游離RNA之小鼠。進一步測試自經RNA-OG/TPP治療之無腫瘤小鼠回收的脾細胞之適應性免疫性且發現此等細胞可能活體外藉由與TPP共培養而經再活化，但當投與無關KLH肽時並非如此(圖74B-74C)。因此，藉由該等RNA-OG-TPP複合物引起腫瘤靶向適應性免疫性。
實例11
AG特異性抗腫瘤免疫性之刺激。研究RNA-OG/TPP複合物之抗腫瘤活性。RNA-OG/TPP證明了其作為治療劑之潛力(圖75)。
實例12
在某些實施例中，RNA-OG與諸如HSP70肽之肽複合。在某些實施例中，形成RNA-OG與離胺酸連接之肽的穩定締合。RNA-Pep複合物之細胞攝取取決於RNA：肽比率(圖72)。在某些實施例中，形成RNA-OG/肽聚合物。該複合物可經內化，從而誘導刺激。RNA-OG/TPP(或RNA-OG)複合物保持與RNA-OG相似之刺激活性(圖76)。觀察到與TPP複合之RNA-OG的活體內抗腫瘤效應(圖77)。RNA-OG及TPP之組合進一步延遲腫瘤生長。抗腫瘤活性與腫瘤特異性IFNg產生相關。
實例13
奈米技術之發展中的重要界標在於使用核酸(DNA及RNA)作為可編程材料來建立所需奈米架構及用於精確控制奈米級之特定物體的奈米器件。在過去三十年中，已開發了用於DNA自組裝之不同設計技術及方法，從而產生展現可相當或甚至超出自然界中發現之幾何複雜度的多種奈米結構(1-6)。已沿平行線開發了數種計算設計工具(7-13)，其加寬了多個學科之科學家的參與且加速 了多個研究領域中之潛在應用。
RNA已作為獨特聚合材料出現，關於奈米構建具有其自身獨特優勢。不同於DNA，RNA具有其固有建築潛力以形成遠遠超出Watson-Crick家族之多種不同相互作用(14、15)。多種天然存在之3D分子及在原子解析度下之RNA結構單元/瓦片可經修飾且已提供通用工具套組來建立多種結構。另外，與RNA分子相關之功能(諸如催化(16)、基因調節(17)及將蛋白質組織成大機構(18))使得生物醫學及材料科學中之潛在應用成為可能。然而，RNA奈米技術中之主要挑戰之一仍在於合理設計具有與天然RNA機器或具有重分子量之目前高度複雜DNA奈米結構可相當的大小或複雜性之物體。單鏈RNA(ssRNA)折紙方法之新近發現推進了按比例增加RNA總成之能力且使得能夠產生多達660個核苷酸之大RNA瓦片，該等瓦片經標記為經編程合成RNA總成之記錄(19)。
此處，提供用於大2D及3D ssRNA奈米結構之自動設計的一般方法，該等奈米結構之大小為多達6300個核苷酸長，與自然界中之最大催化性RNA分子28S核糖體RNA之大小進行比較。構建具有1.7k個鹼基之RNA矩形以測試該方法且成功地獲得經設計結構，藉由高解析度原子力顯微鏡(AFM)圖像確認。接下來，產生具有6.3k個鹼基之空前大小的菱形RNA物體，且證明了用於按比例增加ssRNA折紙結構之方法的普遍性。該設計策略原則上允許任何任意2D形狀之建立且可經調適以形成更複雜3D架構。與DNA及RNA奈米技術中之先前自下至上手動編程工具形成對比，此處連同定製之自上至下設計工具提供的設計策略可能使得能夠有效篩選大RNA分子物件及功能性奈米器件。一般而言，該工作不僅充實RNA重新設計之工具箱，而且推進奈米級製造能力，該等能力允許建立具有增加的大小及複雜性之結構及功能。
概述設計方法
為了產生可擴展ssRNA結構，遵循兩步折疊策略，其中使用簡單 RNA基序作為模塊結構單元。圖78A顯示了如何在兩個步驟中選路發送長ssRNA至幾何形狀。首先，一個ssRNA之半長將向後折疊以部分地與另一半配對，留下數個未配對單鏈區。其次，彼等經設計游離區將藉由平行內聚相互作用彼此匹配且最終折疊靶標架構(圖78A說明了一個平行內聚之形成)。
模塊基序
為了保證該等ssRNA結構之可擴展性，首先將穩固RNA基序構建為模塊結構單元。需要測定兩個關鍵參數：多少鹼基用於平行內聚，及常規dsRNA之莖有多長。第一個參數決定了該內聚相互作用之剛性。基於A形式螺旋之3D模型化，選擇8或3個鹼基作為兩個呈最佳幾何配合之交叉之間的內部長度(圖79A)。關於8個鹼基之內聚，總計48=65536種可能性提供了用於獨特互補性之選擇的適當序列空間。3個鹼基之內聚具有43=64種組合。第二個參數決定了基序之最終經組裝結構的平面度。已知標準dsRNA之每個旋轉11個鹼基對，如圖79中所示指派基序間莖長。選擇RNA基序總成之兩種佈局：一種含有8個鹼基之平行內聚且另一種交替地含有8個鹼基及3個鹼基之內聚。跳過僅具有3個鹼基之內聚的設計之原因在於其微弱相互作用以及獨特序列組合之限制。在使相鄰末端成環以形成ssRNA之後，適當序列經指派至骨架鏈(骨架選路及序列指派論述於下文中)。該等實驗結果揭露了僅成功形成8個鹼基之設計(圖79)，指示3個鹼基之內聚不提供充足結合或特定識別。
結構單元之安排經計劃為週期性等角鋪瓦，佈置了數列具有垂直偏移之矩形。各結構單元含有一對雙鏈螺旋，其顏色二中擇一地為橙色及藍色。結構單元之每兩個垂直列彼此移動半單元以及一個螺旋，從而在各水平列中產生相同顏色螺旋。一個藍色或橙色單元由17個鹼基對之長螺旋組成，表示設計畫布中之一個可編輯像素。在同一列中選擇相同顏色單元會自動地產生連續的一個長dsRNA。一對相鄰藍色及橙色單元表示一個平行RNA基序，呈現為X 型線。
選路ssRNA
在選擇所需模塊來表示靶標結構之後，下一步在於選路發送所有螺旋至一個單鏈中。已知各點擊突出顯示一個模塊且產生零個或另外兩個末端之實情，任何形狀中的線之末端之總數均將為偶數。使具有2個N末端之任何構造成環為單線需要N-1連接。另外，當連接相鄰末端時，亦需要考慮空間可及性。已強調，該連接僅可在同一垂直行中之兩個相鄰末端之間產生。因此，可需要關於末端長度之適當調節以促進有效連接。例如，三角形形狀之傾斜邊緣可在一個垂直列中產生奇數個螺旋末端，其中一個螺旋之長度必須經調節以促進可能連接。
最終步驟在於在此線之一個末端處產生ssRNA帽(環)以產生ssRNA鏈。關於一種結構之可行性骨架路徑可為多樣的。
該設計程序中之下一步驟在於對具有結構複雜性之長ssRNA指派適當序列，這可為相當具挑戰性的。該內置序列產生算法與軟體Tiamat相似，在軟體Tiamat中三個約束施加於任何隨機產生序列：獨特序列限制、重複限制(G重複單獨地列出)及GC百分率。此輸出格式可用於指派ssDNA結構。
關於產生有效序列建立了數種準則：首先，該等RNA序列之所有區中的GC含量之理想百分率範圍在30%與70%之間，因為此範圍外部之任何峰均將不利地影響RNA合成。其次，檢查用於形成交叉之鹼基以確保交叉之位置穩定。第三，在產生滿足總體GC含量之需求的序列之後單獨地檢查各平行內聚區中之GC百分率，以致用於第二步驟折疊之所有平行內聚均具有相對一致之熔融溫度。
合成長ssRNA
該ssRNA藉由將全長RNA序列分成兩個區段且個別地合成且選殖 來獲得。在最佳化RNA序列下，任一區段均將不含強二級結構。因此，其極容易合成且選殖至質體載體中。在該兩個RNA區段完全地經合成且選殖至質體載體中之後，將進行RNA測序以確保精確度。若鑒別出突變，則可執行定點突變誘發以校正該等突變。在獲得正確純系之後，將執行次選殖以使用經設計限制酶位點將該兩個區段組合至單一載體中。
經調適用於3D
此處提供之設計工具的集合原則上可能使得任何任意2D形狀之構建成為可能。該方法亦可經調適用於有頂飾的3D對象。該方法之多功能性藉由構建線框多面體網來證明。
用於產生由1.7k個鹼基之骨架及少量輔助鏈組成之DNA八面體之相似方法由Shih等人於2004年報告。先前策略與本發明方法之間存在兩種主要差異。首先，本發明方法僅使用平行內聚相互作用來完成2.8k ssRNA骨架選路，而在先前工作中，亦使用雙重交叉(DX)基序來折疊八面體且需要輔助鏈來形成DX區。其次，歸因於RNA與DNA之間之物理及化學差異，在本發明方法中產生的ssRNA四面體係基於A-形式而非B-形式。因此，用於設計RNA結構之幾何參數不同。另外，關於ssRNA之序列設計需要更專門調整。
與用於構建RNA奈米結構之先前技術相比，本發明方法使得能夠穩固地按比例增加RNA至空前大小及複雜度。本發明方法相對於針對設計ssRNA之選路路徑及序列最佳化建立之四個準則的可擴展性。首先，本發明結構之第一步折疊將ssRNA骨架轉型成大髮夾，該髮夾在其長度之超過一半中含有雙鏈RNA(dsRNA)區，其使得能夠將初始長ssRNA分裂成兩個較短ssRNA以獲得骨架。彼兩個ssRNA中之每一者均可相對容易地經合成，因為不存在預設計之長dsRNA域或顯著二級結構。其次，本發明折疊方法為逐步及分等級的，其促進以高效率形成大且複雜結構。第一步折疊容易實現，因為其極其青睞經歷拉鍊 機制。第二步藉由將折疊數千個個別鹼基轉化成匹配數十個平行內聚相互作用來減少組裝之複雜度。第三，任意幾何形狀均轉化為模塊單元。本發明自上至下設計程序允許藉由重複一個經設計之穩固模塊結構單元來形成多種幾何形狀，其使組裝期間之潛在拓撲或動力學陷阱減至最少。最後，本發明序列產生程式以較少假性相互作用最佳化兩步折疊中之識別特異性。
此處，關於複雜ssRNA物件之構建證明了一般藍圖，該等複雜ssRNA物件對抗已經針對DNA物件實現之彼等。一個重要的持續目標在於開發具有多種功能性之大ssRNA折紙。與DNA奈米結構相似，該ssRNA可能用作模板以藉由引入自結構突出之環來組織其他功能性材料。吻合環相互作用可用於結合其他材料。不同於DNA結構，存在生物活性RNA基序，特別是多種核酶、siRNA及嵌入核糖開關中之天然RNA適體。在天然RNA複合物中顯現之獨特功能性可能貫徹至大ssRNA折紙結構中以產生生物活性奈米器件。
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儘管前述說明書及實例充分地揭示且實現某些實施例，其不意欲限制範圍，該範圍由此處隨附之申請專利範圍限定。
所有公開案、專利及專利申請案均以引用之方式併入本文中。雖然在前述說明書中已描述某些實施例，且已出於說明目的陳述多種詳情，但熟習此項技術者應顯而易知，本文所述之額外實施例及某些詳情可顯著地變化而不偏離基礎原則。
除非本文中另外指示或清楚地與本文相抵觸，否則術語「一(a)」及「一(an)」及「該(the)」及相似指示物之使用意欲解釋為涵蓋單數及複數。
除非另有說明，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」意欲解釋為開放式術語(亦即，意謂「包括但不限於」)。除非本文中另外指示，否則本文中敘述之值範圍僅意欲作為個別地提及屬於該範圍之各單獨值之簡寫方法，且各單獨值併入本說明書中，就如同其個別地在本文中敘述一般。除非本文中另外指示或另外清楚地與本文相抵觸，否則本文所述之所有方法可以任何合適次序執行。除非另外聲明，否則使用之任何及所有實例，或本文所提供之例示性語言(例如，「諸如」)僅意欲更好地說明該技術且不對該技術之範圍構成限制。本說明書中之語言不應解釋為指示任何未提出申請之要素對該技術之實踐為必需的。
在本說明書中，除非本文另外要求，否則措辭「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」之變化形式應理解為暗示包括所述整數或整數群，但不排除任何其他整數或整數群。亦應注意在本發明中且特 別地在申請專利範圍及/或段落中，諸如「包含(comprises)」、「包含(comprised)」、「包含(comprising)」及其類似術語之術語可具有美國專利法中歸於其的意義；例如，其可意謂「包括(includes)」、「包括(included)」、「包括(including)」及其類似術語；且諸如「基本上由......組成(consisting essentially of)」及「基本上由......組成(consists essentially of)」之術語具有美國專利法中歸於其的意義，例如其允許未明確地敘述之要素，但排除在先前技術中發現或影響實施例之基礎或新穎特徵的要素。
本文中描述實施例，包括本發明人已知之最佳模式。彼等實施例之變化形式對於一般技術者而言在閱讀了上述描述之後可變得顯而易知。本發明人期望熟練技術人員在適當時使用該等變化形式，且本發明人意欲以除如本文中特定描述之方式以外之其他方式來實施實施例。因此，此技術包括如由適用法律所允許在此處隨附之申請專利範圍中敘述的標的物之所有修改及等效物。此外，除非本文中另外指示或另外清楚地與本文相抵觸，否則實施例涵蓋其所有可能變化形式中上述要素之任何組合。
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<213> 小鼠屬
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Claims (93)

  1. 一種包含至少一種單鏈RNA(ssRNA)分子之RNA奈米結構，其中該ssRNA分子形成至少一個平行內聚交叉，且其中該RNA奈米結構具有免疫刺激或免疫調節特性。
  2. 一種包含至少一種單鏈RNA(ssRNA)分子之RNA奈米結構，其中該至少一種ssRNA分子包含複數個雙螺旋區及至少一個可操作性連接於兩個雙螺旋區之間的平行交叉，且其中該RNA奈米結構具有免疫刺激特性。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之RNA奈米結構，其精確地包含一種ssRNA分子。
  4. 如申請專利範圍第1項或第2項之RNA奈米結構，其由一種ssRNA分子組成。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之RNA奈米結構，其中該至少一種ssRNA分子為約10個至約100,000個核苷酸長。
  6. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之RNA奈米結構，其中該至少一種ssRNA分子為約10個至約20,000個核苷酸長。
  7. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之RNA奈米結構，其中該至少一種ssRNA分子為約10個至約10,000個核苷酸長。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之RNA奈米結構，其中該至少一種ssRNA分子不包含轉錄終止序列。
  9. 如申請專利範圍第8項之RNA奈米結構，其中該至少一種ssRNA分子不包含AUCUGUU序列。
  10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構之約60-99%包含雙鏈區且該RNA奈米結構之約1-40%包含單鏈區。
  11. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構之約95%包含雙鏈區且該RNA奈米結構之約5%包含單鏈區。
  12. 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構包含至少兩個平行雙螺旋。
  13. 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構包含至少七個平行雙螺旋。
  14. 如申請專利範圍第2項至第13項中任一項之RNA奈米結構，其中雙螺旋具有約5個至約50個核苷酸之長度。
  15. 如申請專利範圍第2項至第13項中任一項之RNA奈米結構，其中雙螺旋具有約5個至約25個核苷酸之長度。
  16. 如申請專利範圍第2項至第13項中任一項之RNA奈米結構，其中雙螺旋具有8或9個核苷酸之長度。
  17. 如申請專利範圍第16項之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構包含複數個具有8個核苷酸之長度的雙螺旋及複數個具有9個核苷酸之長度的雙螺旋。
  18. 如申請專利範圍第1項至第17項中任一項之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構包含約1個至約200個之間的平行內聚交叉。
  19. 如申請專利範圍第1項至第17項中任一項之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構包含複數個平行內聚交叉。
  20. 如申請專利範圍第1項至第19項中任一項之RNA奈米結構，其中該至少一個平行內聚交叉具有約4個至約15個核苷酸之長度。
  21. 如申請專利範圍第20項之RNA奈米結構，其中該至少一個平行內聚交叉具有約8個核苷酸之長度。
  22. 如申請專利範圍第21項之RNA奈米結構，其中該平行內聚交叉包含16個鹼基配對。
  23. 如申請專利範圍第1項至第22項中任一項之RNA奈米結構，其中該至少一個平行內聚交叉包含約6個至約10個之間的GC鹼基對。
  24. 如申請專利範圍第1項至第23項中任一項之RNA奈米結構，其中該至少一種ssRNA分子包含形成內部環之序列，該等內部環在形成該至少一個平行內聚交叉之前保持未配對。
  25. 如申請專利範圍第12項至第24項中任一項之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構包含至少一個連接一個雙螺旋至另一雙螺旋之環區，且其中該至少一個環區沿著該RNA奈米結構之邊緣定位。
  26. 如申請專利範圍第25項之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構包含複數個環區。
  27. 如申請專利範圍第25項或第26項之RNA奈米結構，其中該至少一個環區具有約2個至約100個核苷酸之長度。
  28. 如申請專利範圍第25項或第26項之RNA奈米結構，其中該至少一個環區具有約2個至約50個核苷酸之長度。
  29. 如申請專利範圍第1項至第28項中任一項之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構包含具有33個核苷酸之結構重複單元。
  30. 如申請專利範圍第29項之RNA奈米結構，其中該結構重複單元依序包含：第一雙螺旋之區、第一平行內聚交叉、第二雙螺旋之區及第二平行內聚交叉。
  31. 如申請專利範圍第30項之RNA奈米結構，其中該第一雙螺旋之該區為8個核苷酸長，該第一平行內聚交叉為8個核苷酸長，該第二雙螺旋之該區為9個核苷酸長，且該第二平行內聚交叉為8個核苷酸長。
  32. 如申請專利範圍第1項至第31項中任一項之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構包含：第一層，其包含複數個雙螺旋及複數個平行內聚交叉，其中該第一層之至少兩個雙螺旋藉由平行內聚交叉彼此分離；及第二層，其包含複數個雙螺旋及複數個平行內聚交叉，其中該第二層中之至少兩個雙螺旋藉由平行內聚交叉彼此分離；且其中該第一層之平行內聚交叉雜交至該第二層之平行內聚交叉。
  33. 如申請專利範圍第1項至第32項中任一項之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構之相交數為零，且其中該RNA奈米結構未打結。
  34. 如申請專利範圍第1項至第33項中任一項之奈米結構，其中該RNA奈米結構僅包含平行交叉。
  35. 如申請專利範圍第1項至第34項中任一項之奈米結構，其中該RNA奈米結構包含沿著該奈米結構之該等雙螺旋的超過50%之連續π-π堆疊。
  36. 如申請專利範圍第1項至第35項中任一項之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構具有矩形形狀、菱形形狀或四面體形狀。
  37. 如申請專利範圍第36項之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構具有矩形形狀。
  38. 一種包含至少一種單鏈RNA(ssRNA)分子之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構包含長度為33個核苷酸的至少兩個結構重複單元，且其中各結構重複單元依序包含：長度為8個核苷酸的第一雙螺旋之區、長度為8個核苷酸的第一平行內聚交叉、長度為9個核苷酸的第二雙螺旋之區及長度為8個核苷酸的第二平行內聚交叉。
  39. 一種RNA奈米結構，其包含與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、 SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少約75%序列一致性之核酸序列。
  40. 如申請專利範圍第39項之RNA奈米結構，其中該核酸序列與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少約85%序列一致性。
  41. 如申請專利範圍第39項之RNA奈米結構，其中該核酸序列與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少約95%序列一致性。
  42. 如申請專利範圍第39項之RNA奈米結構，其中該核酸序列與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少約99%序列一致性。
  43. 如申請專利範圍第39項之RNA奈米結構，其包含SEQ ID NO：1。
  44. 如申請專利範圍第39項之RNA奈米結構，其由SEQ ID NO：1組成。
  45. 如申請專利範圍第39項至第44項中任一項之RNA奈米結構，其包含至少一個平行內聚交叉。
  46. 如申請專利範圍第38項至第45項中任一項之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構具有矩形、菱形或四面體形狀。
  47. 如申請專利範圍第38項至第46項中任一項之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構具有免疫刺激特性。
  48. 如申請專利範圍第1項至第47項中任一項之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構為模式識別受體之促效劑。
  49. 如申請專利範圍第1項至第48項中任一項之RNA奈米結構，其中至少一種診斷劑可操作性連接至該RNA奈米結構。
  50. 如申請專利範圍第1項至第49項中任一項之RNA奈米結構，其中至少一種治療劑可操作性連接至該RNA奈米結構。
  51. 一種複合物，其包含如申請專利範圍第1項至第48項中任一項之RNA奈米結構，及至少一種可操作性連接至該RNA奈米結構之診斷劑。
  52. 一種複合物，其包含如申請專利範圍第1項至第48項中任一項之RNA奈米結構，及至少一種可操作性連接至該RNA奈米結構之治療劑。
  53. 如申請專利範圍第49項至第52項中任一項之RNA奈米結構或複合物，其中該診斷或治療劑為包含帶正電部分之肽。
  54. 如申請專利範圍第53項之RNA奈米結構或複合物，其中該帶正電部分為包含約5個至20個帶正電胺基酸之肽。
  55. 如申請專利範圍第53項之RNA奈米結構或複合物，其中該帶正電部分為包含約8個至12個帶正電胺基酸之肽。
  56. 如申請專利範圍第53項之RNA奈米結構或複合物，其中該帶正電部分為包含約10個帶正電胺基酸之肽。
  57. 如申請專利範圍第54項之RNA奈米結構或複合物，其中該帶正電部分為包含10個離胺酸殘基之肽。
  58. 如申請專利範圍第53項至第57項中任一項之RNA奈米結構或複合物，其中該肽為腫瘤靶向肽(TTP)、人類癌症肽、傳染劑肽、腫瘤抗原肽或鈣網蛋白。
  59. 如申請專利範圍第58項之RNA奈米結構或複合物，其中該傳染劑肽包含對針對流感、HIV、HCV之免疫性中所牽涉的CD8+ T細胞或其他傳染劑具特異性之抗原決定基。
  60. 如申請專利範圍第58項之RNA奈米結構或複合物，其中該肽為鈣網蛋白。
  61. 如申請專利範圍第58項之RNA奈米結構或複合物，其中該肽為人類癌症肽NY-ESO-1或Muc1。
  62. 如申請專利範圍第58項之RNA奈米結構或複合物，其中該肽為腫瘤抗原肽。
  63. 如申請專利範圍第57項之RNA奈米結構或複合物，其中該肽為CTKD-K10(CTKDNNLLGRFELSGGGSK10)。
  64. 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1項至第63項中任一項之RNA奈米結構或複合物及醫藥學上可接受之載劑。
  65. 如申請專利範圍第64項之醫藥組合物，其進一步包含至少一種治療劑。
  66. 如申請專利範圍第65項之醫藥組合物，其中該至少一種治療劑為化學治療藥物(例如，多柔比星)。
  67. 一種誘導個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之免疫反應之方法，其包含向該個體投與有效量的如申請專利範圍第1項至第66項中任一項之RNA奈米結構、複合物或組合物。
  68. 一種治療個體之疾病或病症之方法，其包含向該個體投與治療有 效量的如申請專利範圍第1項至第66項中任一項之RNA奈米結構、複合物或組合物。
  69. 如申請專利範圍第68項之方法，其中該疾病或病症為癌症。
  70. 如申請專利範圍第69項之方法，其中該癌症為乳癌、結腸直腸癌或淋巴瘤。
  71. 如申請專利範圍第67項至第70項中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與至少一種治療劑。
  72. 如申請專利範圍第71項之方法，其中該至少一種治療劑為腫瘤靶向劑(例如，單株腫瘤特異性抗體或適體)。
  73. 一種增強/增加個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之促發炎細胞因子之方法，其包含向該個體投與有效量的如申請專利範圍第1項至第66項中任一項之RNA奈米結構、複合物或組合物。
  74. 一種藉由個體(例如哺乳動物，諸如人類)中toll樣受體3(TLR3)信號傳導路徑之特異性觸發來活化免疫細胞之方法，其包含向該個體投與有效量的如申請專利範圍第1項至第66項中任一項之RNA奈米結構、複合物或組合物。
  75. 一種如與對照個體相比減慢或抑制個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之腫瘤生長之方法，其包含向該個體投與有效量的如申請專利範圍第1項至第66項中任一項之RNA奈米結構、複合物或組合物。
  76. 一種如與對照個體相比提高具有腫瘤之個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之抗腫瘤促發炎細胞因子的水準之方法，其包含向該個體投與有效量的如申請專利範圍第1項至第66項中任一項之RNA奈米結構、複合物或組合物。
  77. 一種如與對照個體相比減少具有腫瘤之個體(例如哺乳動物，諸 如人類)中之消炎細胞因子的水準之方法，其包含向該個體投與有效量的如申請專利範圍第1項至第66項中任一項之RNA奈米結構、複合物或組合物。
  78. 一種如申請專利範圍第1項至第66項中任一項之RNA奈米結構、複合物或組合物之用途，其用於製造用於誘導個體(例如哺乳動物，諸如人類)中之免疫反應的藥劑。
  79. 如申請專利範圍第1項至第66項中任一項之RNA奈米結構、複合物或組合物，其用於誘導免疫反應。
  80. 一種如申請專利範圍第1項至第66項中任一項之RNA奈米結構、複合物或組合物之用途，其用於製造用於治療個體之疾病或病症的藥劑。
  81. 如申請專利範圍第1項至第66項中任一項之RNA奈米結構、複合物或組合物，其用於預防性或治療性治療疾病或病症。
  82. 一種套組，其包含如申請專利範圍第1項至第66項中任一項之RNA奈米結構、複合物或組合物及關於向個體投與該RNA奈米結構、複合物或組合物以誘導免疫反應或治療疾病或病症之說明書。
  83. 如申請專利範圍第82項之套組，其進一步包含至少一種治療劑。
  84. 一條RNA單鏈，其經合理設計以自組裝成包含至少一個平行內聚交叉之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構具有免疫刺激特性。
  85. 一種與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少約75%一致性之核酸。
  86. 如申請專利範圍第85項之核酸，其中該核酸與SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有至少約90%一致性。
  87. 如申請專利範圍第85項或第86項之核酸，其中該核酸形成RNA奈米結構。
  88. 一種包含至少一種單鏈RNA(ssRNA)分子之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構包含長度為33個核苷酸的至少兩個結構重複單元，且其中各結構重複單元依序包含：長度為8個核苷酸的雙螺旋之第一區、長度為8個核苷酸的第一平行內聚交叉、長度為9個核苷酸的雙螺旋之第二區及長度為8個核苷酸的第二平行內聚交叉。
  89. 一種包含至少一種單鏈RNA(ssRNA)分子之RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構包含長度為33個核苷酸的至少兩個結構重複單元，且其中各結構重複單元依序包含：雙螺旋之第一區，其中該第一區之長度為9個或少於9個核苷酸；長度為7個或7個以上核苷酸的第一平行內聚交叉；雙螺旋之第二區，其中該第二區之長度為10個或少於10個核苷酸；及長度為7個或7個以上核苷酸的第二平行內聚交叉。
  90. 如申請專利範圍第1項至第50項或第88項至第89項中任一項之RNA奈米結構，其中該環區富A。
  91. 如申請專利範圍第1項至第50項或第88項至第89項中任一項之RNA奈米結構，其中該環區富U。
  92. 如申請專利範圍第1項至第50項或第88項至第89項中任一項之RNA奈米結構，其中該環區富G。
  93. 如申請專利範圍第1項至第50項或第88項至第89項中任一項之RNA奈米結構，其中該環區富C。
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