TW201923087A - Beta-1,3-1,6-葡聚糖粉末、含葡聚糖之組成物、Beta-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造方法、包接複合體、包接複合體之製造方法、以及客體分子之回收方法 - Google Patents
Beta-1,3-1,6-葡聚糖粉末、含葡聚糖之組成物、Beta-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造方法、包接複合體、包接複合體之製造方法、以及客體分子之回收方法 Download PDFInfo
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Abstract
本發明係提供一種於水中之溶解度高的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末、以及使用了該粉末等之含葡聚糖之組成物、β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造方法、包接複合體、包接複合體之製造方法及客體分子之回收方法。該β-1,3-1,6-葡聚糖粉末於25℃之水中之飽和溶解度為1.0~20.0質量%。該β-1,3-1,6-葡聚糖粉末於利用動態光散射測定法對於β-1,3-1,6-葡聚糖粉末進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在5~15nm之範圍,該粒徑落在5~15nm之範圍外之峰部之體積分率為體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下。
Description
本發明關於β-1,3-1,6-葡聚糖粉末、含葡聚糖之組成物、β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造方法、包接複合體、包接複合體之製造方法、以及客體分子之回收方法。
尤其關於在水中之溶解度高的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末。
尤其關於在水中之溶解度高的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末。
習知短梗黴屬(Aureobasidium sp.)等微生物會生產β-D-葡聚糖。據教示β-D-葡聚糖具有抗癌作用、免疫活化作用,作為健康食品材料係為有效。
通常,β-D-葡聚糖由於其結構而在水溶液中會採剛硬的三螺旋結構,故均方迴轉半徑(mean-square radius of gyration)大。因此,含有產生到菌體外的β-葡聚糖之微生物培養液為高黏度,且其純化困難。短梗黴屬微生物的培養液也不例外,由於含有產生到菌體外的β-1,3-1,6-D-葡聚糖,故黏度高,且從該培養液去除菌體並回收、純化β-1,3-1,6-D-葡聚糖非常困難。
基於上述狀況,專利文獻1揭示一種純化β-D-葡聚糖之製造方法,包括:第1步驟,將含有β-D-葡聚糖之微生物培養液或微生物破碎液調整至pH12以上;第2步驟,去除微生物或不溶性夾雜物而獲得上清液;及第3步驟,於鹼性條件下對於上清液進行超過濾來將全部或部分比起β-D-葡聚糖為低分子之夾雜物去除。專利文獻1也記載利用該製造方法可獲得透明度高的β-D-葡聚糖。 [先前技術文獻]
[專利文獻]
基於上述狀況,專利文獻1揭示一種純化β-D-葡聚糖之製造方法,包括:第1步驟,將含有β-D-葡聚糖之微生物培養液或微生物破碎液調整至pH12以上;第2步驟,去除微生物或不溶性夾雜物而獲得上清液;及第3步驟,於鹼性條件下對於上清液進行超過濾來將全部或部分比起β-D-葡聚糖為低分子之夾雜物去除。專利文獻1也記載利用該製造方法可獲得透明度高的β-D-葡聚糖。 [先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2007-267718號公報
[發明所欲解決之課題]
上述專利文獻1記載:在β-1,3-1,6-葡聚糖培養液添加鹼並添加矽藻土後進行過濾,再以檸檬酸水溶液中和後進行冷凍乾燥。
但是,本案發明人探討上述專利文獻1後發現:獲得的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末於水中之溶解度低。
本發明為了解決該課題,目的為提供於水中之溶解度高的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末、以及使用了前述粉末等之含葡聚糖之組成物、β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造方法、包接複合體、包接複合體之製造方法及客體分子之回收方法。
[解決課題之手段]
但是,本案發明人探討上述專利文獻1後發現:獲得的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末於水中之溶解度低。
本發明為了解決該課題,目的為提供於水中之溶解度高的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末、以及使用了前述粉末等之含葡聚糖之組成物、β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造方法、包接複合體、包接複合體之製造方法及客體分子之回收方法。
[解決課題之手段]
基於上述課題,本案發明人進行深入探討後之結果發現:藉由從含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之原料組成物去除大粒徑之β-1,3-1,6-葡聚糖後,利用冷凍乾燥及噴霧乾燥中之至少一者將β-1,3-1,6-葡聚糖粉末化,能解決上述課題。
具體而言,上述課題利用下述方法<1>,理想為利用<2>~<15>而獲得解決。
<1>一種β-1,3-1,6-葡聚糖粉末,其於25℃之水中之飽和溶解度為1.0~20.0質量%。
<2>如<1>所記載之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末,其中,於利用動態光散射測定法對於前述β-1,3-1,6-葡聚糖粉末進行測定而測得的β-1,3-1,6-葡聚糖的粒徑分布之中,體積分率最大的峰部的粒徑落在5nm以上且未達100nm之範圍,前述粒徑落在5nm以上且未達100nm之範圍外之峰部之體積分率為前述體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下。
<3>一種β-1,3-1,6-葡聚糖粉末,於利用動態光散射測定法對於前述β-1,3-1,6-葡聚糖粉末進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖的粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在5nm~15nm之範圍,前述粒徑落在5~15nm之範圍外之峰部之體積分率為前述體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下。
<4>一種含葡聚糖之組成物,含有如<1>~<3>中任一項所記載之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末及水。
<5>一種含葡聚糖之組成物,含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖,
係以相對於水為1.0~20.0質量%之比例溶有β-1,3-1,6-葡聚糖,
於利用動態光散射測定法對於前述組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在5nm以上且未達100nm之範圍,前述粒徑落在5~15nm之範圍外之峰部之體積分率為前述體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下。
<6>一種含葡聚糖之組成物,係含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之含β-1,3-1,6-葡聚糖之組成物,
於利用動態光散射測定法對於前述含葡聚糖之組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在5~15nm之範圍,前述粒徑落在5~15nm之範圍外之峰部之體積分率為前述體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下。
<7>如<4>~<6>中任一項所記載之含葡聚糖之組成物,其中,前述組成物之於25℃之波長660nm之光之透射率為70%以上。
<8>一種β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造方法,包括下列步驟:對於含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之預組成物進行冷凍乾燥及噴霧乾燥中之至少一者,於利用動態光散射測定法對於前述預組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在10nm以上且未達1000nm之範圍,粒徑落在1000nm以上之峰部之體積分率為前述體積分率最大之峰部之體積分率之10%以下。
<9>如<8>所記載之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造方法,其中,前述預組成物係藉由進行離心分離、過濾或透析從含有β-1,3-1,6-葡聚糖之原料組成物去除大粒徑之β-1,3-1,6-葡聚糖而獲得。
<10>如<8>或<9>所記載之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造方法,其中,前述β-1,3-1,6-葡聚糖粉末為如<1>~<3>中任一項所記載之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末。
<11>一種包接複合體,係客體分子包接於來自如<1>~<3>中任一項所記載之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末、及<4>~<6>中任一項所記載之含葡聚糖之組成物中之至少1種之β-1,3-1,6-葡聚糖中。
<12>如<11>所記載之包接複合體,其中,前述包接複合體為粉末狀。
<13>一種包接複合體之製造方法,包括下列步驟:使用如<1>~<3>中任一項所記載之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末、及如<4>~<7>中任一項所記載之含葡聚糖之組成物中之至少1種使客體分子包接。
<14>如<13>所記載之包接複合體之製造方法,其中,前述包接複合體為粉末狀。
<15>一種客體分子之回收方法,包括下列步驟:使用如<1>~<3>中任一項所記載之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末、及如<4>~<7>中任一項所記載之含葡聚糖之組成物中之至少1種使客體分子包接。
[發明之效果]
具體而言,上述課題利用下述方法<1>,理想為利用<2>~<15>而獲得解決。
<1>一種β-1,3-1,6-葡聚糖粉末,其於25℃之水中之飽和溶解度為1.0~20.0質量%。
<2>如<1>所記載之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末,其中,於利用動態光散射測定法對於前述β-1,3-1,6-葡聚糖粉末進行測定而測得的β-1,3-1,6-葡聚糖的粒徑分布之中,體積分率最大的峰部的粒徑落在5nm以上且未達100nm之範圍,前述粒徑落在5nm以上且未達100nm之範圍外之峰部之體積分率為前述體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下。
<3>一種β-1,3-1,6-葡聚糖粉末,於利用動態光散射測定法對於前述β-1,3-1,6-葡聚糖粉末進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖的粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在5nm~15nm之範圍,前述粒徑落在5~15nm之範圍外之峰部之體積分率為前述體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下。
<4>一種含葡聚糖之組成物,含有如<1>~<3>中任一項所記載之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末及水。
<5>一種含葡聚糖之組成物,含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖,
係以相對於水為1.0~20.0質量%之比例溶有β-1,3-1,6-葡聚糖,
於利用動態光散射測定法對於前述組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在5nm以上且未達100nm之範圍,前述粒徑落在5~15nm之範圍外之峰部之體積分率為前述體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下。
<6>一種含葡聚糖之組成物,係含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之含β-1,3-1,6-葡聚糖之組成物,
於利用動態光散射測定法對於前述含葡聚糖之組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在5~15nm之範圍,前述粒徑落在5~15nm之範圍外之峰部之體積分率為前述體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下。
<7>如<4>~<6>中任一項所記載之含葡聚糖之組成物,其中,前述組成物之於25℃之波長660nm之光之透射率為70%以上。
<8>一種β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造方法,包括下列步驟:對於含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之預組成物進行冷凍乾燥及噴霧乾燥中之至少一者,於利用動態光散射測定法對於前述預組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在10nm以上且未達1000nm之範圍,粒徑落在1000nm以上之峰部之體積分率為前述體積分率最大之峰部之體積分率之10%以下。
<9>如<8>所記載之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造方法,其中,前述預組成物係藉由進行離心分離、過濾或透析從含有β-1,3-1,6-葡聚糖之原料組成物去除大粒徑之β-1,3-1,6-葡聚糖而獲得。
<10>如<8>或<9>所記載之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造方法,其中,前述β-1,3-1,6-葡聚糖粉末為如<1>~<3>中任一項所記載之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末。
<11>一種包接複合體,係客體分子包接於來自如<1>~<3>中任一項所記載之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末、及<4>~<6>中任一項所記載之含葡聚糖之組成物中之至少1種之β-1,3-1,6-葡聚糖中。
<12>如<11>所記載之包接複合體,其中,前述包接複合體為粉末狀。
<13>一種包接複合體之製造方法,包括下列步驟:使用如<1>~<3>中任一項所記載之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末、及如<4>~<7>中任一項所記載之含葡聚糖之組成物中之至少1種使客體分子包接。
<14>如<13>所記載之包接複合體之製造方法,其中,前述包接複合體為粉末狀。
<15>一種客體分子之回收方法,包括下列步驟:使用如<1>~<3>中任一項所記載之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末、及如<4>~<7>中任一項所記載之含葡聚糖之組成物中之至少1種使客體分子包接。
[發明之效果]
根據本發明能提供於水中之溶解度高的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末、以及使用了前述粉末等之含葡聚糖之組成物、β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造方法、包接複合體、包接複合體之製造方法及客體分子之回收方法。
以下針對本發明之內容進行詳細地說明。另外,本說明書中「~」係用來意指包含其前後所記載之數值作為下限值及上限值。
本發明中的溶液係指由2種以上之物質構成的液體狀態之混合物。因此,β-1,3-1,6-葡聚糖粒子或包接複合體等分散於水等溶劑之組成物等也屬於本發明中的溶液。
本發明中的溶液係指由2種以上之物質構成的液體狀態之混合物。因此,β-1,3-1,6-葡聚糖粒子或包接複合體等分散於水等溶劑之組成物等也屬於本發明中的溶液。
<β-1,3-1,6-葡聚糖粉末>
本發明中的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之第一形態係溶解於水中時之於25℃的飽和溶解度為1.0~20.0質量%。如同詳如後述之實施例所示,即便將利用習知方法得到的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末溶解於水中仍無法獲得如此高的飽和溶解度。但是,本案發明人經過探討後發現:藉由經以從含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之溶液(原料組成物)去除大粒徑之β-1,3-1,6-葡聚糖而得的溶液(預組成物)並予以粉末化,可獲得飽和溶解度高的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末。如上述般能將於水中之溶解度提高的話,會更簡單輕易地製造包接複合體。
又,本發明中的β-1,3-1,6-葡聚糖之溶解係指:即使重複進行離心分離操作也不會產生沉澱物,且上清液的葡聚糖濃度不變之狀態。更具體而言,係依照後述實施例之記載。又,本發明中的β-1,3-1,6-葡聚糖之飽和溶解度係指:以將β-1,3-1,6-葡聚糖粉末添加到水中並攪拌,且即使如上述般重複進行離心分離操作也不會產生沉澱物之最大濃度溶解β-1,3-1,6-葡聚糖後的β-1,3-1,6-葡聚糖之溶解度。更具體而言,係依照後述實施例之記載。
又,本發明中的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之另一形態係如下之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末:其於利用動態光散射測定法對於β-1,3-1,6-葡聚糖粉末進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在5~15nm(宜為8nm以上,且宜為13nm以下)之範圍,前述粒徑落在5~15nm之範圍外之峰部(其他峰部)之體積分率為前述體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下(宜為25%以下,為20%以下更佳)。其他峰部之體積分率為體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下係指:[(其他峰部之體積分率/最大之峰部之體積分率)]×100(單位%)為30%以下。以下皆為同樣的概念。體積分率係以實施例所記載之方法進行測定。
本發明中的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之第一形態係溶解於水中時之於25℃的飽和溶解度為1.0~20.0質量%。如同詳如後述之實施例所示,即便將利用習知方法得到的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末溶解於水中仍無法獲得如此高的飽和溶解度。但是,本案發明人經過探討後發現:藉由經以從含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之溶液(原料組成物)去除大粒徑之β-1,3-1,6-葡聚糖而得的溶液(預組成物)並予以粉末化,可獲得飽和溶解度高的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末。如上述般能將於水中之溶解度提高的話,會更簡單輕易地製造包接複合體。
又,本發明中的β-1,3-1,6-葡聚糖之溶解係指:即使重複進行離心分離操作也不會產生沉澱物,且上清液的葡聚糖濃度不變之狀態。更具體而言,係依照後述實施例之記載。又,本發明中的β-1,3-1,6-葡聚糖之飽和溶解度係指:以將β-1,3-1,6-葡聚糖粉末添加到水中並攪拌,且即使如上述般重複進行離心分離操作也不會產生沉澱物之最大濃度溶解β-1,3-1,6-葡聚糖後的β-1,3-1,6-葡聚糖之溶解度。更具體而言,係依照後述實施例之記載。
又,本發明中的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之另一形態係如下之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末:其於利用動態光散射測定法對於β-1,3-1,6-葡聚糖粉末進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在5~15nm(宜為8nm以上,且宜為13nm以下)之範圍,前述粒徑落在5~15nm之範圍外之峰部(其他峰部)之體積分率為前述體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下(宜為25%以下,為20%以下更佳)。其他峰部之體積分率為體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下係指:[(其他峰部之體積分率/最大之峰部之體積分率)]×100(單位%)為30%以下。以下皆為同樣的概念。體積分率係以實施例所記載之方法進行測定。
<原料β-1,3-1,6-葡聚糖>
本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造所使用的原料β-1,3-1,6-葡聚糖係存在於蕈菇、海藻、細菌等廣泛存在於自然界之多醣。
β-1,3-1,6-葡聚糖為β-葡聚糖的一種,係由葡萄糖構成的多醣體之一。β-1,3-1,6-葡聚糖之分子結構據推斷係葡萄糖利用β-1,3-葡萄糖苷鍵結大量鍵結而形成如鏈狀之結構,並部分地導入有其導入率依種類而異的β-1,6-葡萄糖苷側鏈,據推斷自然狀態下在水中乃3條β-1,3-1,6-葡聚糖分子主鏈互相交互影響而形成三鏈螺旋結構。本發明所使用的β-1,3-1,6-葡聚糖中,側鏈之β-1,6鍵結數相對於主鏈之β-1,3鍵結數的比率即分支度通常為1~100%,宜為5~100%,為30~100%更佳。β-1,3-1,6-葡聚糖具有上述分支度可由如下進行確認:將β-1,3-1,6-葡聚糖以外型β-1,3-葡聚糖酶(Kitalase M,K・I化成股份有限公司製)進行水解處理時,會游離出葡萄糖與龍膽二糖(gentiobiose)作為分解產物,以及NMR之累計比(今中忠行監修,微生物利用之大展開,1012-1015,N・T・S(2002))。
本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造所使用的原料β-1,3-1,6-葡聚糖係存在於蕈菇、海藻、細菌等廣泛存在於自然界之多醣。
β-1,3-1,6-葡聚糖為β-葡聚糖的一種,係由葡萄糖構成的多醣體之一。β-1,3-1,6-葡聚糖之分子結構據推斷係葡萄糖利用β-1,3-葡萄糖苷鍵結大量鍵結而形成如鏈狀之結構,並部分地導入有其導入率依種類而異的β-1,6-葡萄糖苷側鏈,據推斷自然狀態下在水中乃3條β-1,3-1,6-葡聚糖分子主鏈互相交互影響而形成三鏈螺旋結構。本發明所使用的β-1,3-1,6-葡聚糖中,側鏈之β-1,6鍵結數相對於主鏈之β-1,3鍵結數的比率即分支度通常為1~100%,宜為5~100%,為30~100%更佳。β-1,3-1,6-葡聚糖具有上述分支度可由如下進行確認:將β-1,3-1,6-葡聚糖以外型β-1,3-葡聚糖酶(Kitalase M,K・I化成股份有限公司製)進行水解處理時,會游離出葡萄糖與龍膽二糖(gentiobiose)作為分解產物,以及NMR之累計比(今中忠行監修,微生物利用之大展開,1012-1015,N・T・S(2002))。
成為本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末的原料之β-1,3-1,6-葡聚糖可經由細菌培養並進行分離提取,或從蕈菇、海藻等萃取而得。具體而言,就成為本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末的原料之β-1,3-1,6-葡聚糖而言,可例示例如:來自黑酵母菌(Aureobasidium pullulans)之β-1,3-1,6-葡聚糖、來自繡球菌(Sparassis crispa)之β-1,3-1,6-葡聚糖、來自麵包酵母之β-1,3-1,6-葡聚糖、來自姬松茸(Agaricus subrufescens)之β-1,3-1,6-葡聚糖、來自依蘭苔(Cetraria islandica)之地衣多醣(lichenin)、來自裂褶菌(Schizophyllum commune)之裂褶菌多醣(schizophyllan)、來自昆布之昆布多醣(laminarin)、來自菌核(sclerotium)之硬葡聚糖(scleroglucan)、來自香菇(Lentinula edodes)之香菇多醣(lentinan)、來自雲芝(Trametes versicolor)之雲芝多醣(krestin)、來自洋菇(Agaricus bisporus)之帕克糖(pakkiman)、來自農桿菌(agrobacterium)之卡德蘭多醣(curdlan)、來自舞菇(Grifola frondosa)之舞菇多醣(grifolan)、萃取自酵母之酵母聚糖(zymosan)、植物細胞壁所含的胼胝質(callose)、來自眼蟲(euglena)之裸藻多醣(paramylon)等。
就獲得成為β-1,3-1,6-葡聚糖粉末的原料之β-1,3-1,6-葡聚糖之方法而言,可參考日本特開2014-193967號公報之段落0025及0026之記載,並將這些內容納入本說明書中。
就獲得成為β-1,3-1,6-葡聚糖粉末的原料之β-1,3-1,6-葡聚糖之方法而言,可參考日本特開2014-193967號公報之段落0025及0026之記載,並將這些內容納入本說明書中。
屬上述由細菌等得到的原料之β-1,3-1,6-葡聚糖,宜將不溶物、或培養原料、蛋白質等去除。具體而言,宜藉由進行離心分離、過濾或透析來去除它們。去除如此的混入物後之β-1,3-1,6-葡聚糖的重量平均分子量宜為5,000~20,000,000。又,去除混入物後之β-1,3-1,6-葡聚糖也可進行低分子量化。藉由進行低分子量化,於β-1,3-1,6-葡聚糖分子主鏈間發生的多點交互作用會減弱,β-1,3-1,6-葡聚糖於水中之溶解性會提高。更有變得不易生成大粒徑之β-1,3-1,6-葡聚糖的優點。低分子量化時,宜將β-1,3-1,6-葡聚糖之重量平均分子量設定在200,000以下,設定在80,000以下更佳。下限值為β-1,3-1,6-葡聚糖形成三鏈螺旋結構所必需的分子量,例如2,000以上,為3,000以上更佳。β-1,3-1,6-葡聚糖之低分子量化宜利用超音波分解、酸水解、使用內型之β-1,3-葡聚糖酶之酵素水解等來實施。去除混入物後之原料β-1,3-1,6-葡聚糖可藉由進行冷凍乾燥等先使其粉末化,也可未粉末化而進行後續的作業。
去除上述混入物後之原料β-1,3-1,6-葡聚糖宜使其進行鹼改性。藉由進行鹼改性,例如可將三鏈螺旋結構之β-1,3-1,6-葡聚糖轉變成單鏈。此外,經鹼改性之β-1,3-1,6-葡聚糖宜使其進行中和。藉由進行中和,可獲得包接能力更優良的三鏈螺旋結構之β-1,3-1,6-葡聚糖。針對鹼改性及中和可參考日本特開2014-193967號公報之段落0027~0029之記載,並將這些內容納入本說明書中。
本發明將使已去除混入物之原料β-1,3-1,6-葡聚糖溶解於溶劑而成者稱為原料組成物,原料組成物也可為已實施因應需要而進行之鹼改性與中和後之β-1,3-1,6-葡聚糖溶液。可例舉後述實施例中的再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液作為本發明之原料組成物之一例。又,原料組成物可僅含1種β-1,3-1,6-葡聚糖,也可含2種以上。原料組成物中的溶劑可例示水、或1種或2種以上之有機溶劑,宜為水。原料組成物之於25℃之波長660nm之光之透射率通常為98%以下,更為80%以下。就前述透射率之下限值而言,例如為30%以上,更為50%以上。又,原料組成物之β-1,3-1,6-葡聚糖的濃度取決於β-1,3-1,6-葡聚糖分子主鏈之分支度、分子量,而最大濃度有所不同,但考量有效率地製造預組成物、含葡聚糖之組成物的話,以單體葡萄糖濃度計宜為0.1~200mmol/L,為1~150mmol/L更佳。其他,有關原料組成物之調製,可參考日本特開2014-40394號公報之段落0027~0035之記載、日本特開2014-40640號公報之段落0026~0034之記載、日本特開2013-227471號公報之段落0023~0031之記載等,並將這些內容納入本說明書中。
原料組成物宜去除大粒徑之β-1,3-1,6-葡聚糖。去除大粒徑之β-1,3-1,6-葡聚糖之方法並無特別限定,可例示離心分離、過濾或透析等,宜為離心分離。將如此般從原料組成物去除大粒徑之β-1,3-1,6-葡聚糖後之含水及β-1,3-1,6-葡聚糖之組成物稱為預組成物。可例舉後述實施例中的冷凍乾燥前之離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液作為預組成物之一例。
<預組成物>
本發明中的預組成物如上所述,係從原料組成物去除大粒徑之β-1,3-1,6-葡聚糖後之組成物。
預組成物之第一實施形態為含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之預組成物,其係於利用動態光散射測定法對於前述預組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在10nm以上且未達1000nm之範圍,粒徑落在1000nm以上之峰部之體積分率為前述體積分率最大之峰部之體積分率之10%以下之組成物。又,預組成物可僅含1種β-1,3-1,6-葡聚糖,也可含2種以上。預組成物之第二實施形態為含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之預組成物,其係於利用動態光散射測定法對於前述預組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在10nm以上且未達100nm(宜為12nm以上,且宜為80nm以下,為60nm以下更佳,為50nm以下再更佳,為40nm以下又更佳,為30nm以下再更佳)之範圍,前述粒徑落在5nm以上且未達100nm之範圍外之峰部之體積分率均為前述體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下(宜為25%以下,為20%以下更佳,為15%以下再更佳)之組成物。預組成物之第三實施形態為含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之預組成物,其係於利用動態光散射測定法對於前述預組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在10nm以上且未達1000nm之範圍,且僅含1個體積分率為5%以上(宜為10%以上,為15%以上更佳)之峰部之組成物。本發明中的預組成物宜符合第一~第三實施形態中之至少1個,至少符合第一實施形態更佳。
本發明中的預組成物如上所述,係從原料組成物去除大粒徑之β-1,3-1,6-葡聚糖後之組成物。
預組成物之第一實施形態為含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之預組成物,其係於利用動態光散射測定法對於前述預組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在10nm以上且未達1000nm之範圍,粒徑落在1000nm以上之峰部之體積分率為前述體積分率最大之峰部之體積分率之10%以下之組成物。又,預組成物可僅含1種β-1,3-1,6-葡聚糖,也可含2種以上。預組成物之第二實施形態為含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之預組成物,其係於利用動態光散射測定法對於前述預組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在10nm以上且未達100nm(宜為12nm以上,且宜為80nm以下,為60nm以下更佳,為50nm以下再更佳,為40nm以下又更佳,為30nm以下再更佳)之範圍,前述粒徑落在5nm以上且未達100nm之範圍外之峰部之體積分率均為前述體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下(宜為25%以下,為20%以下更佳,為15%以下再更佳)之組成物。預組成物之第三實施形態為含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之預組成物,其係於利用動態光散射測定法對於前述預組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在10nm以上且未達1000nm之範圍,且僅含1個體積分率為5%以上(宜為10%以上,為15%以上更佳)之峰部之組成物。本發明中的預組成物宜符合第一~第三實施形態中之至少1個,至少符合第一實施形態更佳。
預組成物之於25℃之波長660nm之光之透射率宜為70%以上,為80%以上更佳。前述透射率之上限值並無特別限制,例如可設定在99%以下。尤其25℃之預組成物之於波長660nm之光之透射率宜比原料組成物之於波長660nm之透射率高1%以上,高2%以上更佳。又,25℃之預組成物之於波長660nm之光之透射率比原料組成物之於波長660nm之透射率高20%以下之範圍較為現實。此外,預組成物之β-1,3-1,6-葡聚糖的濃度取決於β-1,3-1,6-葡聚糖分子主鏈之分支度、分子量,而最大濃度有所不同,但考量有效率地製造含葡聚糖之組成物的話,以單體葡萄糖濃度計宜為30~60mmol/L(0.49~0.97質量%)。
<β-1,3-1,6-葡聚糖粉末及其製造方法>
在本發明,藉由將預組成物進行粉末化,可獲得期望的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末。β-1,3-1,6-葡聚糖粉末可僅含1種β-1,3-1,6-葡聚糖,也可含2種以上。就粉末化之方法而言,可例示冷凍乾燥、噴霧乾燥、靜電紡絲(electrospinning)、再沉澱、再結晶、濃縮乾固等,為冷凍乾燥及噴霧乾燥中之至少一者更佳,為冷凍乾燥再更佳。亦即,本發明揭示一種β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造方法,包括對於預組成物進行冷凍乾燥及噴霧乾燥中之至少一者。本發明藉由利用冷凍乾燥等將預組成物進行粉末化,可改善溶解度,且可將β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑進一步縮小。
在本發明,藉由將預組成物進行粉末化,可獲得期望的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末。β-1,3-1,6-葡聚糖粉末可僅含1種β-1,3-1,6-葡聚糖,也可含2種以上。就粉末化之方法而言,可例示冷凍乾燥、噴霧乾燥、靜電紡絲(electrospinning)、再沉澱、再結晶、濃縮乾固等,為冷凍乾燥及噴霧乾燥中之至少一者更佳,為冷凍乾燥再更佳。亦即,本發明揭示一種β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造方法,包括對於預組成物進行冷凍乾燥及噴霧乾燥中之至少一者。本發明藉由利用冷凍乾燥等將預組成物進行粉末化,可改善溶解度,且可將β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑進一步縮小。
噴霧乾燥法宜在入口溫度50~200℃、出口溫度30~100℃條件下實施。 此外,利用本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造方法的話,可調整成使於利用動態光散射測定法對於前述β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(使其溶解於蒸餾水而進行測定)進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑比起於利用動態光散射測定法對於前述預組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑更縮小3nm以上(宜為3~7nm,為3~5nm更佳)。
具體而言,本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之一實施形態係溶解於水時之於25℃之飽和溶解度為1.0~20.0質量%。前述飽和溶解度之下限值宜為3.0質量%以上,為4.0質量%以上更佳。前述飽和溶解度之上限並無特別限制,例如即使在15.0質量%以下仍充分符合需求的性能。
尤其藉由將本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之重量平均分子量設定在100,000以下,進一步設定在80,000以下,例如可將飽和溶解度調整在9.0質量%以上。
尤其藉由將本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之重量平均分子量設定在100,000以下,進一步設定在80,000以下,例如可將飽和溶解度調整在9.0質量%以上。
於利用動態光散射測定法對於本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在5nm以上且未達100nm之範圍(宜為8nm以上,且宜為60nm以下,為30nm以下更佳,為20nm以下再更佳,為15nm以下又更佳),前述粒徑落在5nm以上且未達100nm之範圍外之峰部之體積分率為前述體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下(宜為25%以下,為20%以下更佳)較理想。亦即,本發明藉由利用冷凍乾燥等將預組成物予以粉末化,可將β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑縮小。
本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之重量平均分子量(Mw)宜為5,000以上,為10,000以上更佳。又,Mw之上限值宜為20,000,000以下。藉由將Mw調整在上述下限值以上,可更適當地包接客體分子。又,藉由將Mw調整在上述上限值以下,能有效果地抑制含有β-1,3-1,6-葡聚糖之溶液之黏度變得過高等。
本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之於25℃之溶解率(β-1,3-1,6-葡聚糖粉末中之已溶解者之比例,單位:質量%)也可調整為在25℃之水中為30質量%以上、50質量%以上、70質量%以上。溶解率之上限理想為100質量%,但冷凍乾燥、噴霧乾燥之條件下仍會被所含的結晶水影響,為99質量%以下較實際。
<含葡聚糖之組成物>
本發明之含葡聚糖之組成物係含有本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末及水之組成物。亦即,含葡聚糖之組成物包含藉由在粉末化後進行再溶解而獲得之粒徑更小的β-1,3-1,6-葡聚糖溶液。可例舉後述實施例中的冷凍乾燥後之離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液作為含葡聚糖之組成物之一例。
本發明之含葡聚糖之組成物之第一實施形態為含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之含葡聚糖之組成物,其係以相對於水為1.0~20.0質量%之比例溶有β-1,3-1,6-葡聚糖,利用動態光散射測定法對於前述含葡聚糖之組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在5nm以上且未達100nm之範圍(宜為8nm以上,且宜為60nm以下,為30nm以下更佳,為20nm以下再更佳,為15nm以下又更佳),前述粒徑落在5nm以上且未達100nm之範圍外之峰部之體積分率為前述體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下(宜為25%以下,為20%以下更佳)之含葡聚糖之組成物。
本發明之含葡聚糖之組成物之第二實施形態為含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之含葡聚糖之組成物,其係於利用動態光散射測定法對於前述含葡聚糖之組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在5~15nm(宜為8nm以上,且宜為13nm以下)之範圍,前述粒徑落在5nm以上且未達100nm之範圍外之峰部之體積分率為前述體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下(宜為25%以下,為20%以下更佳)之含葡聚糖之組成物。例如使用來自黑酵母菌之β-1,3-1,6-葡聚糖的話,可輕易獲得如此的含葡聚糖之組成物。
本發明之含葡聚糖之組成物之第三實施形態為含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之含葡聚糖之組成物,其係於利用動態光散射測定法對其進行測定而測得的β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑比起於利用動態光散射測定法對於前述預組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑更小3nm以上(宜為3~7nm,為3~5nm更佳)之含葡聚糖之組成物。
利用動態光散射測定法對於本發明之含葡聚糖之組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑之體積分率宜為10%以上,為15%以上更佳。上限愈高愈好,但例如即使25%以下,或即使20%以下仍符合所需求之性能。
本發明之含葡聚糖之組成物係含有本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末及水之組成物。亦即,含葡聚糖之組成物包含藉由在粉末化後進行再溶解而獲得之粒徑更小的β-1,3-1,6-葡聚糖溶液。可例舉後述實施例中的冷凍乾燥後之離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液作為含葡聚糖之組成物之一例。
本發明之含葡聚糖之組成物之第一實施形態為含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之含葡聚糖之組成物,其係以相對於水為1.0~20.0質量%之比例溶有β-1,3-1,6-葡聚糖,利用動態光散射測定法對於前述含葡聚糖之組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在5nm以上且未達100nm之範圍(宜為8nm以上,且宜為60nm以下,為30nm以下更佳,為20nm以下再更佳,為15nm以下又更佳),前述粒徑落在5nm以上且未達100nm之範圍外之峰部之體積分率為前述體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下(宜為25%以下,為20%以下更佳)之含葡聚糖之組成物。
本發明之含葡聚糖之組成物之第二實施形態為含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之含葡聚糖之組成物,其係於利用動態光散射測定法對於前述含葡聚糖之組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在5~15nm(宜為8nm以上,且宜為13nm以下)之範圍,前述粒徑落在5nm以上且未達100nm之範圍外之峰部之體積分率為前述體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下(宜為25%以下,為20%以下更佳)之含葡聚糖之組成物。例如使用來自黑酵母菌之β-1,3-1,6-葡聚糖的話,可輕易獲得如此的含葡聚糖之組成物。
本發明之含葡聚糖之組成物之第三實施形態為含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之含葡聚糖之組成物,其係於利用動態光散射測定法對其進行測定而測得的β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑比起於利用動態光散射測定法對於前述預組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑更小3nm以上(宜為3~7nm,為3~5nm更佳)之含葡聚糖之組成物。
利用動態光散射測定法對於本發明之含葡聚糖之組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑之體積分率宜為10%以上,為15%以上更佳。上限愈高愈好,但例如即使25%以下,或即使20%以下仍符合所需求之性能。
又,本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末於水中之溶解性高,故例如可將本發明之含葡聚糖之組成物之於25℃之波長660nm之光之透射率設定在70%以上。更可將前述透射率設定在80%以上,尤其可設定在83%以上。
又,本發明之含葡聚糖之組成物之β-1,3-1,6-葡聚糖的濃度,就於25℃之飽和濃度而言,以單體葡萄糖濃度計宜為300~650mmol/L。
又,本發明之含葡聚糖之組成物之β-1,3-1,6-葡聚糖的濃度,就於25℃之飽和濃度而言,以單體葡萄糖濃度計宜為300~650mmol/L。
又,本發明之含葡聚糖之組成物中的β-1,3-1,6-葡聚糖的重量平均分子量及分散度宜為和本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末的重量平均分子量及分散度相同之範圍。
<包接>已知β-1,3-1,6-葡聚糖在強鹼性溶液中、或在二甲基亞碸(DMSO)等非質子性極性溶劑中,三鏈螺旋結構會解開,並解離成單鏈之無規捲曲(randomcoil)結構。又,已知從該已藉由強鹼性、DMSO而解開成單鏈之無規捲曲結構的狀態將溶液進行中和、稀釋/透析的話,會再度回復成原來的三鏈狀態。在該從已解開成單鏈無規捲曲結構之狀態回復成原來的三鏈狀態之過程中,若使其他分子共存的話,則可將其他分子納入三鏈之中。亦即,β-1,3-1,6-葡聚糖可作為包接主體而發揮作用,並包接作為包接客體之其他分子。又,從該解開成單鏈無規捲曲結構之狀態,不使其他分子共存而回復成原來的三鏈狀態的話,可製成三鏈螺旋結構中有部分受到擾亂的β-1,3-1,6-葡聚糖。該β-1,3-1,6-葡聚糖可在中性水溶液中包接所添加的其他分子,也可包接會在強鹼性分解的分子。亦即,本發明揭示一種包接複合體,係使用本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末、及本發明之含葡聚糖之組成物中之至少1種來包接客體分子。 就客體分子而言,若為能以β-1,3-1,6-葡聚糖包接之化合物,則無特別限制,通常可使用1種或2種以上之水難溶性物質、水難溶性之維生素及其衍生物、類胡蘿蔔素及其衍生物、萜烯及其衍生物、脂肪酸及其衍生物、多酚及其衍生物、水難溶性之藥劑及其衍生物、水難溶性之染色劑及其衍生物、水難溶性之碳材料及其衍生物、水難溶性之導電性高分子及其衍生物、水難溶性之奈米粒子、以及水難溶性之顏料及其衍生物。
本發明也揭示一種包接複合體之製造方法,包括使用本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末、及本發明之組成物中之至少1種使客體分子包接。
本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末也可使用在客體分子之回收。更具體而言,可例舉一種客體分子之回收方法,包含使用本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末、及本發明之組成物中之至少1種使客體分子包接。
本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末也可使用在客體分子之回收。更具體而言,可例舉一種客體分子之回收方法,包含使用本發明之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末、及本發明之組成物中之至少1種使客體分子包接。
本發明中,為了進一步提高客體分子之包接能力,也可採用日本特開2016-183120號公報、日本特開2016-113381號公報所記載之包接技術,並將這些內容納入本說明書中。
本發明之包接複合體可僅對於β-1,3-1,6-葡聚糖添加客體分子而包接。此外,現已許可β-1,3-1,6-葡聚糖作為食品添加物,可直接利用在食品而不需要進行新的許可申請。
又,除了使用在食品之外,也可理想地使用在醫藥品、化粧品等。
[實施例]
本發明之包接複合體可僅對於β-1,3-1,6-葡聚糖添加客體分子而包接。此外,現已許可β-1,3-1,6-葡聚糖作為食品添加物,可直接利用在食品而不需要進行新的許可申請。
又,除了使用在食品之外,也可理想地使用在醫藥品、化粧品等。
[實施例]
以下舉實施例更具體地說明本發明。下列實施例所示之材料、使用量、比例、處理內容、處理程序等,只要不悖離本發明之概念,則可適當地變化。是以,本發明之範圍不限於如下所示之具體例。
另外,下列實驗若無特別述明,則係於25℃之環境下實施。
另外,下列實驗若無特別述明,則係於25℃之環境下實施。
<β-1,3-1,6-葡聚糖>
實施例1~4使用如下之葡聚糖。
實施例1
來自黑酵母菌之β-1,3-1,6-葡聚糖
實施例2
來自裂褶菌之β-1,3-1,6-葡聚糖(裂褶菌多醣):
主鏈為β-1,3-葡聚糖,且主鏈每3個葡萄糖具有1個β-1,6-單葡萄糖苷支鏈之β-1,3-1,6-葡聚糖
實施例3
來自昆布之β-1,3-1,6-葡聚糖(昆布多醣):
主鏈主要為β-1,3-葡聚糖,且有部分具有形成β-1,6-鍵結之處。而且具有β-1,6-鍵結之糖間交聯、或分支點。
實施例4
來自菌核之β-1,3-1,6-葡聚糖(硬葡聚糖):
主鏈為β-1,3-葡聚糖,且主鏈每3個葡萄糖具有1個β-1,6-單葡萄糖苷支鏈之β-1,3-1,6-葡聚糖
實施例1~4使用如下之葡聚糖。
實施例1
來自黑酵母菌之β-1,3-1,6-葡聚糖
實施例2
來自裂褶菌之β-1,3-1,6-葡聚糖(裂褶菌多醣):
主鏈為β-1,3-葡聚糖,且主鏈每3個葡萄糖具有1個β-1,6-單葡萄糖苷支鏈之β-1,3-1,6-葡聚糖
實施例3
來自昆布之β-1,3-1,6-葡聚糖(昆布多醣):
主鏈主要為β-1,3-葡聚糖,且有部分具有形成β-1,6-鍵結之處。而且具有β-1,6-鍵結之糖間交聯、或分支點。
實施例4
來自菌核之β-1,3-1,6-葡聚糖(硬葡聚糖):
主鏈為β-1,3-葡聚糖,且主鏈每3個葡萄糖具有1個β-1,6-單葡萄糖苷支鏈之β-1,3-1,6-葡聚糖
<β-1,3-1,6-葡聚糖之培養及萃取>
在具備5L燒瓶之小型發酵槽(Sanki Seiki公司製)中,調製含有D-蔗糖10質量%、硝酸鉀0.24質量%、磷酸氫二鉀0.12質量%、氯化鉀0.06質量%、硫酸鎂七水合物0.05質量%、硫酸鐵(II)七水合物0.12質量%、L-抗壞血酸0.40質量%、酵母萃取物(朝日集團食品公司製,MEAST P1G)0.02質量%之培養基水溶液(3L),加入已事先進行菌酛培養而得的黑酵母菌之菌體溶液,於27℃培養7天。
將得到的培養液以蒸餾水稀釋成4倍,再利用布氏漏斗(Advantech公司製,編號:5C)過濾菌體,將濾液滴加進乙醇進行再沉澱。得到的固體用乙醇清洗後,加水進行冷凍乾燥,獲得白色的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末24.5g。得到的粉末稱為β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(來自黑酵母菌)。
在具備5L燒瓶之小型發酵槽(Sanki Seiki公司製)中,調製含有D-蔗糖10質量%、硝酸鉀0.24質量%、磷酸氫二鉀0.12質量%、氯化鉀0.06質量%、硫酸鎂七水合物0.05質量%、硫酸鐵(II)七水合物0.12質量%、L-抗壞血酸0.40質量%、酵母萃取物(朝日集團食品公司製,MEAST P1G)0.02質量%之培養基水溶液(3L),加入已事先進行菌酛培養而得的黑酵母菌之菌體溶液,於27℃培養7天。
將得到的培養液以蒸餾水稀釋成4倍,再利用布氏漏斗(Advantech公司製,編號:5C)過濾菌體,將濾液滴加進乙醇進行再沉澱。得到的固體用乙醇清洗後,加水進行冷凍乾燥,獲得白色的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末24.5g。得到的粉末稱為β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(來自黑酵母菌)。
<超音波分解所為之β-1,3-1,6-葡聚糖之低分子量化>
在β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(來自黑酵母菌)200mg中添加蒸餾水300mL,以微波爐加熱,使其盡可能地溶解。然後,利用離心分離操作(Avanti J-E(BECKMAN COULTER公司製),14,000rpm,30分鐘,25℃)將不溶物去除,製得β-1,3-1,6-葡聚糖溶液。將得到的β-1,3-1,6-葡聚糖溶液移置500mL之燒杯中,將探頭式超音波照射機(AS ONE公司製,UH-50)之探頭揚聲器插入溶液中,於室溫實施25小時之超音波照射。
利用離心分離操作(Avanti J-E(BECKMAN COULTER公司製),14,000rpm,30分鐘,25℃)將懸浮於得到的β-1,3-1,6-葡聚糖溶液中之不溶物去除後,將溶液冷凍乾燥,獲得低分子量化β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(以下稱為「β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(低分子量)」)。
利用凝膠排阻層析法(擔體:TOYOPEARL HW-65F,沖提液:0.7M氫氧化鈉水溶液,分子量標準:普魯蘭多醣(pullulan,Shodex公司製,P-82))進行測定,得到的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(低分子量)之分子量為重量平均分子量(Mw)=84,000,數目平均分子量(Mn)=2,500,Mw/Mn=33.5。
又,實施上述超音波照射處理前之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(來自黑酵母菌)的分子量為Mw=3,470,000,Mn=254,000,Mw/Mn=13.7。此為於鹼溶液中成為單鏈之β-1,3-1,6-葡聚糖以普魯蘭多醣換算而得的分子量。又,實驗所使用的其他β-1,3-1,6-葡聚糖之分子量如下:
硬葡聚糖(Funakoshi公司製,PS135):Mw=2,300,000,Mn=58,300,Mw/Mn=39.4;
昆布多醣(Sigma公司製,L9634):Mw=372,000,Mn=283,000,Mw/Mn=1.32;
裂褶菌多醣(Nacalai Tesque公司製,型錄編號:Tlrl-spg):Mw=675,000,Mn=287,000,Mw/Mn=2.35。
在β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(來自黑酵母菌)200mg中添加蒸餾水300mL,以微波爐加熱,使其盡可能地溶解。然後,利用離心分離操作(Avanti J-E(BECKMAN COULTER公司製),14,000rpm,30分鐘,25℃)將不溶物去除,製得β-1,3-1,6-葡聚糖溶液。將得到的β-1,3-1,6-葡聚糖溶液移置500mL之燒杯中,將探頭式超音波照射機(AS ONE公司製,UH-50)之探頭揚聲器插入溶液中,於室溫實施25小時之超音波照射。
利用離心分離操作(Avanti J-E(BECKMAN COULTER公司製),14,000rpm,30分鐘,25℃)將懸浮於得到的β-1,3-1,6-葡聚糖溶液中之不溶物去除後,將溶液冷凍乾燥,獲得低分子量化β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(以下稱為「β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(低分子量)」)。
利用凝膠排阻層析法(擔體:TOYOPEARL HW-65F,沖提液:0.7M氫氧化鈉水溶液,分子量標準:普魯蘭多醣(pullulan,Shodex公司製,P-82))進行測定,得到的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(低分子量)之分子量為重量平均分子量(Mw)=84,000,數目平均分子量(Mn)=2,500,Mw/Mn=33.5。
又,實施上述超音波照射處理前之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(來自黑酵母菌)的分子量為Mw=3,470,000,Mn=254,000,Mw/Mn=13.7。此為於鹼溶液中成為單鏈之β-1,3-1,6-葡聚糖以普魯蘭多醣換算而得的分子量。又,實驗所使用的其他β-1,3-1,6-葡聚糖之分子量如下:
硬葡聚糖(Funakoshi公司製,PS135):Mw=2,300,000,Mn=58,300,Mw/Mn=39.4;
昆布多醣(Sigma公司製,L9634):Mw=372,000,Mn=283,000,Mw/Mn=1.32;
裂褶菌多醣(Nacalai Tesque公司製,型錄編號:Tlrl-spg):Mw=675,000,Mn=287,000,Mw/Mn=2.35。
<再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液之調製>
再生β-1,3-1,6-葡聚糖係依循日本特開2016-113381號公報之段落0033及0034所記載之方法製得。
以2.5質量%之濃度將β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(來自黑酵母菌)溶解於1.0mol/L之氫氧化鈉水溶液中,獲得鹼水溶液。
將同體積之1.0mol/L之鹽酸緩慢地加入得到的鹼水溶液進行中和,於25℃持續攪拌7天,獲得再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液。將得到的溶液移置透析膜(截留分子量14,000,Nihon Medical Science公司製),以蒸餾水透析24小時。此時,得到的溶液(再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液)為懸浮液。得到的再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液之濃度(單體葡萄糖濃度)係利用酚-硫酸法判定。
酚-硫酸法係使用96孔微量盤實施。將樣本溶液50μL放入冰冷的96孔微量盤中,添加1.2μL之調製成80質量%之酚水溶液。添加124μL之濃硫酸於其中,持續維持10分鐘冰冷。使用振盪恆溫箱(AS ONE公司製,SI-150)以1300rpm攪拌平板20秒鐘,將溶液混合後,於60℃靜置30分鐘,使發色反應進行。然後,以紫外線(UV)平盤分析儀(Thermo Fisher Scientific公司製)測定492nm之吸光度。事先使用葡萄糖製作檢量線(葡萄糖濃度0.5~2.5mmol/L),並由得到的吸光度計算單體葡萄糖濃度。
又,濁度係測定波長660nm之OD660 (透射率)。亦即,將葡萄糖濃度稀釋成30mmol/L(0.49質量%)並進行測定、換算,算出波長660nm之OD660 。
就β-1,3-1,6-葡聚糖而言,針對裂褶菌多醣、昆布多醣及硬葡聚糖亦同樣地實施。
將得到的結果匯整於表1。所使用之全部的β-1,3-1,6-葡聚糖均可無關乎β-1,3-1,6-葡聚糖之結構,而以40~60mmol/L之單體葡萄糖濃度獲得再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液。但是,在全部的再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液均確認有懸浮。
再生β-1,3-1,6-葡聚糖係依循日本特開2016-113381號公報之段落0033及0034所記載之方法製得。
以2.5質量%之濃度將β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(來自黑酵母菌)溶解於1.0mol/L之氫氧化鈉水溶液中,獲得鹼水溶液。
將同體積之1.0mol/L之鹽酸緩慢地加入得到的鹼水溶液進行中和,於25℃持續攪拌7天,獲得再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液。將得到的溶液移置透析膜(截留分子量14,000,Nihon Medical Science公司製),以蒸餾水透析24小時。此時,得到的溶液(再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液)為懸浮液。得到的再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液之濃度(單體葡萄糖濃度)係利用酚-硫酸法判定。
酚-硫酸法係使用96孔微量盤實施。將樣本溶液50μL放入冰冷的96孔微量盤中,添加1.2μL之調製成80質量%之酚水溶液。添加124μL之濃硫酸於其中,持續維持10分鐘冰冷。使用振盪恆溫箱(AS ONE公司製,SI-150)以1300rpm攪拌平板20秒鐘,將溶液混合後,於60℃靜置30分鐘,使發色反應進行。然後,以紫外線(UV)平盤分析儀(Thermo Fisher Scientific公司製)測定492nm之吸光度。事先使用葡萄糖製作檢量線(葡萄糖濃度0.5~2.5mmol/L),並由得到的吸光度計算單體葡萄糖濃度。
又,濁度係測定波長660nm之OD660 (透射率)。亦即,將葡萄糖濃度稀釋成30mmol/L(0.49質量%)並進行測定、換算,算出波長660nm之OD660 。
就β-1,3-1,6-葡聚糖而言,針對裂褶菌多醣、昆布多醣及硬葡聚糖亦同樣地實施。
將得到的結果匯整於表1。所使用之全部的β-1,3-1,6-葡聚糖均可無關乎β-1,3-1,6-葡聚糖之結構,而以40~60mmol/L之單體葡萄糖濃度獲得再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液。但是,在全部的再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液均確認有懸浮。
[表1]
<離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液之調製>
利用離心分離操作(KUBOTA3740(久保田製作所公司製),14,000G,120分鐘)將上述所製得的各再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液中所含的不溶物去除,獲得透明的離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液(離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液)。得到的離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液之濃度(單體葡萄糖濃度)係利用酚-硫酸法進行判定,濁度係測定660nm之OD660 。亦即,將葡萄糖濃度稀釋成30mmol/L(0.49質量%)並進行測定、換算,算出660nm之OD660 。
將得到的結果匯整於表2。經離心分離操作後,懸浮於溶液中的不溶物(由葡聚糖構成的微凝膠)會沉降而成為透明的溶液。又,伴隨該操作,上清液的葡萄糖濃度變低。在所有樣本中透明度均增加。此時已確認即使重複離心分離操作,上清液之葡萄糖濃度仍無變化。
利用離心分離操作(KUBOTA3740(久保田製作所公司製),14,000G,120分鐘)將上述所製得的各再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液中所含的不溶物去除,獲得透明的離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液(離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液)。得到的離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液之濃度(單體葡萄糖濃度)係利用酚-硫酸法進行判定,濁度係測定660nm之OD660 。亦即,將葡萄糖濃度稀釋成30mmol/L(0.49質量%)並進行測定、換算,算出660nm之OD660 。
將得到的結果匯整於表2。經離心分離操作後,懸浮於溶液中的不溶物(由葡聚糖構成的微凝膠)會沉降而成為透明的溶液。又,伴隨該操作,上清液的葡萄糖濃度變低。在所有樣本中透明度均增加。此時已確認即使重複離心分離操作,上清液之葡萄糖濃度仍無變化。
[表2]
<來自β-1,3-1,6-葡聚糖葡聚糖之粉末的取得>
利用冷凍乾燥機(東京理化器械公司製,FDU-1200)對於上述得到的各再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液、各離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液進行冷凍乾燥,獲得各β-1,3-1,6-葡聚糖粉末。
又,針對來自黑酵母菌之β-1,3-1,6-葡聚糖,使用Büchi公司製之Mini Spray Dryer B-290(入口溫度:160℃,出口溫度:80℃)以噴霧乾燥法對於離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液進行粉末化。
此外,針對來自黑酵母菌之β-1,3-1,6-葡聚糖亦使用現有的方法進行粉末化。亦即,以使最終濃度成為2.4質量%的方式在黑酵母菌培養液中添加25質量%之氫氧化鈉水溶液並進行攪拌。以1質量%之濃度將矽藻土加入其中,再利用布氏漏斗過濾菌體。將50質量%檸檬酸水溶液加入得到的濾液中,調整pH至3.5後,利用乙醇進行再沉澱。此時,乙醇的最終濃度定為66體積%,用乙醇清洗生成的固體後,添加蒸餾水並進行冷凍乾燥,以現有的方法獲得β-1,3-1,6-葡聚糖粉末。
利用冷凍乾燥機(東京理化器械公司製,FDU-1200)對於上述得到的各再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液、各離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液進行冷凍乾燥,獲得各β-1,3-1,6-葡聚糖粉末。
又,針對來自黑酵母菌之β-1,3-1,6-葡聚糖,使用Büchi公司製之Mini Spray Dryer B-290(入口溫度:160℃,出口溫度:80℃)以噴霧乾燥法對於離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液進行粉末化。
此外,針對來自黑酵母菌之β-1,3-1,6-葡聚糖亦使用現有的方法進行粉末化。亦即,以使最終濃度成為2.4質量%的方式在黑酵母菌培養液中添加25質量%之氫氧化鈉水溶液並進行攪拌。以1質量%之濃度將矽藻土加入其中,再利用布氏漏斗過濾菌體。將50質量%檸檬酸水溶液加入得到的濾液中,調整pH至3.5後,利用乙醇進行再沉澱。此時,乙醇的最終濃度定為66體積%,用乙醇清洗生成的固體後,添加蒸餾水並進行冷凍乾燥,以現有的方法獲得β-1,3-1,6-葡聚糖粉末。
<β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之溶解度>
為了檢驗得到的各β-1,3-1,6-葡聚糖粉末於水中之再溶解性,實施如下實驗。
將上述得到的各β-1,3-1,6-葡聚糖粉末10mg放入1.5mL之塑膠試管,加入蒸餾水1mL後(1.0質量%之濃度),以漩渦混合器攪拌5分鐘使其盡可能地溶解(對於難溶解者最長持續攪拌30分鐘)。實施離心分離操作(Micro-12 High Speed Micro Centrifuge(Greiner公司製),15,000rpm,5分鐘),用以去除未溶解的β-1,3-1,6-葡聚糖,取出上清液,依酚-硫酸法算出溶解的β-1,3-1,6-葡聚糖之濃度(單體葡萄糖濃度)。同時,假設10mg之粉末全部為葡聚糖,並算出溶解率(β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之中溶解者之比例,單位:質量%)。
將得到的結果匯整於表3。由表3可知,就利用習知法進行粉末化之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末而言,所添加的10mg之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末幾乎未溶解而以固體形式沉澱,葡聚糖的溶解度僅22質量%,OD660 亦顯示0.28之高數值。另一方面,依循本發明之方法製得的β-1,3-1,6-葡聚糖表現出70質量%以上之溶解率,幾乎無法確認有沉澱物。OD660 亦為0.04以下,本發明可獲得比習知技術更高葡聚糖濃度,且再溶解性極高之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末。
為了檢驗得到的各β-1,3-1,6-葡聚糖粉末於水中之再溶解性,實施如下實驗。
將上述得到的各β-1,3-1,6-葡聚糖粉末10mg放入1.5mL之塑膠試管,加入蒸餾水1mL後(1.0質量%之濃度),以漩渦混合器攪拌5分鐘使其盡可能地溶解(對於難溶解者最長持續攪拌30分鐘)。實施離心分離操作(Micro-12 High Speed Micro Centrifuge(Greiner公司製),15,000rpm,5分鐘),用以去除未溶解的β-1,3-1,6-葡聚糖,取出上清液,依酚-硫酸法算出溶解的β-1,3-1,6-葡聚糖之濃度(單體葡萄糖濃度)。同時,假設10mg之粉末全部為葡聚糖,並算出溶解率(β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之中溶解者之比例,單位:質量%)。
將得到的結果匯整於表3。由表3可知,就利用習知法進行粉末化之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末而言,所添加的10mg之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末幾乎未溶解而以固體形式沉澱,葡聚糖的溶解度僅22質量%,OD660 亦顯示0.28之高數值。另一方面,依循本發明之方法製得的β-1,3-1,6-葡聚糖表現出70質量%以上之溶解率,幾乎無法確認有沉澱物。OD660 亦為0.04以下,本發明可獲得比習知技術更高葡聚糖濃度,且再溶解性極高之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末。
[表3]
如上述表3所示,各離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖均可獲得再溶解性高的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末。據認為此乃因利用離心分離操作已將大粒徑的粒子去除所致。
因此,利用動態光散射測定儀(Malvern公司製,Zetasizer Nano ZS)測定粒徑的變化來比較離心分離操作前後所造成的β-1,3-1,6-葡聚糖溶液之濁度差異。
用於動態光散射測定之樣本溶液係使用以來自黑酵母菌之β-1,3-1,6-葡聚糖製得的再生β-1,3-1,6-葡聚糖、離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖之溶液、使β-1,3-1,6-葡聚糖粉末再溶解而成的溶液,並於25℃進行測定。各β-1,3-1,6-葡聚糖溶液中的單體葡萄糖濃度(利用酚-硫酸法進行測定)係稀釋、調整成10mmol/L。
因此,利用動態光散射測定儀(Malvern公司製,Zetasizer Nano ZS)測定粒徑的變化來比較離心分離操作前後所造成的β-1,3-1,6-葡聚糖溶液之濁度差異。
用於動態光散射測定之樣本溶液係使用以來自黑酵母菌之β-1,3-1,6-葡聚糖製得的再生β-1,3-1,6-葡聚糖、離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖之溶液、使β-1,3-1,6-葡聚糖粉末再溶解而成的溶液,並於25℃進行測定。各β-1,3-1,6-葡聚糖溶液中的單體葡萄糖濃度(利用酚-硫酸法進行測定)係稀釋、調整成10mmol/L。
動態光散射測定係使用溶解於蒸餾水中之β-1,3-1,6-葡聚糖進行測定。具體而言,係以β-1,3-1,6-葡聚糖之折射率:1.673,葡聚糖之吸光度(633nm):0.01,分散介質(水)之溫度:25℃,分散介質之黏度:0.8872cP,分散介質之折射率:1.33,平衡時間:120秒,掃描次數:10次,測定時間:10秒之條件進行測定。重複10次該測定,並將得到的數據進行平均而作為結果使用。
結果如圖1及下述表4所示。橫軸表示粒徑,縱軸表示體積分率。虛線表示冷凍乾燥前之再生β-1,3-1,6-葡聚糖,實線表示冷凍乾燥前之離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖。由圖1可知,離心分離前的樣本中還混有粒徑1000nm以上(1μm以上)之大粒子,但實施離心分離操作後,大粒子被去除,粒徑成為未達100nm(數十nm程度)。
此外可知,使用實施了冷凍乾燥之離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖的話,粒徑變得比冷凍乾燥前更小(圖2、表4)。實線表示冷凍乾燥前之離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖,虛線表示冷凍乾燥後之離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖。例如,就再生β-1,3-1,6-葡聚糖而言,以粒徑51.3nm為中心之體積分率的峰部位移到以粒徑25.6nm為中心之體積分率的峰部,以粒徑1176nm為中心之體積分率的峰部位移到以粒徑817.7nm為中心之體積分率的峰部。就離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖而言,以粒徑16.0nm為中心之體積分率的峰部亦位移到以粒徑11.3nm為中心之體積分率的峰部(圖2)。又,就離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖而言,即使將冷凍乾燥後之粉末再溶解,仍未生成大粒徑之葡聚糖。
結果如圖1及下述表4所示。橫軸表示粒徑,縱軸表示體積分率。虛線表示冷凍乾燥前之再生β-1,3-1,6-葡聚糖,實線表示冷凍乾燥前之離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖。由圖1可知,離心分離前的樣本中還混有粒徑1000nm以上(1μm以上)之大粒子,但實施離心分離操作後,大粒子被去除,粒徑成為未達100nm(數十nm程度)。
此外可知,使用實施了冷凍乾燥之離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖的話,粒徑變得比冷凍乾燥前更小(圖2、表4)。實線表示冷凍乾燥前之離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖,虛線表示冷凍乾燥後之離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖。例如,就再生β-1,3-1,6-葡聚糖而言,以粒徑51.3nm為中心之體積分率的峰部位移到以粒徑25.6nm為中心之體積分率的峰部,以粒徑1176nm為中心之體積分率的峰部位移到以粒徑817.7nm為中心之體積分率的峰部。就離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖而言,以粒徑16.0nm為中心之體積分率的峰部亦位移到以粒徑11.3nm為中心之體積分率的峰部(圖2)。又,就離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖而言,即使將冷凍乾燥後之粉末再溶解,仍未生成大粒徑之葡聚糖。
[表4]
<離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之飽和溶解度>
如上所述,依循本發明之方法而製得的離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末比起利用習知法獲得的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末展現更高的溶解度。
因此,使用來自黑酵母菌之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末,測定於25℃的飽和溶解度。
在此所用的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末除離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末外,還使用利用超音波照射而低分子量化而成的離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(低分子),其操作係如下般實施。
將離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末1mg添加入裝有200μL之蒸餾水之1.5mL之塑膠試管中,以漩渦混合器攪拌5分鐘,持續進行該操作直到所添加的粉末不溶而殘留為止,結果直到總量10mg為止皆可溶解,但11mg則不溶解。對於離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(低分子量)亦實施同樣的實驗,結果於總量20mg達到飽和。
由得到的結果顯示,離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末展現出5.0質量%之飽和溶解度,離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(低分子)展現出10.0質量%之飽和溶解度,分子量變低的話,飽和溶解度會上昇。
又,下述表5表示冷凍乾燥前之離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖之濃度。溶解於鹼溶液中之葡聚糖濃度變高的話,溶液會凝膠化,無法獲得離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液,最大也只能得到0.8質量%。但是,經過依循本發明之粉末化法並使其再溶解的話,可使葡聚糖濃度上昇到5.0質量%(習知法之6倍濃度)。亦即,伴隨粉末化,以往無法製造之高濃度葡聚糖溶液變成得以調製。
如上所述,依循本發明之方法而製得的離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末比起利用習知法獲得的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末展現更高的溶解度。
因此,使用來自黑酵母菌之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末,測定於25℃的飽和溶解度。
在此所用的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末除離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末外,還使用利用超音波照射而低分子量化而成的離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(低分子),其操作係如下般實施。
將離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末1mg添加入裝有200μL之蒸餾水之1.5mL之塑膠試管中,以漩渦混合器攪拌5分鐘,持續進行該操作直到所添加的粉末不溶而殘留為止,結果直到總量10mg為止皆可溶解,但11mg則不溶解。對於離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(低分子量)亦實施同樣的實驗,結果於總量20mg達到飽和。
由得到的結果顯示,離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末展現出5.0質量%之飽和溶解度,離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(低分子)展現出10.0質量%之飽和溶解度,分子量變低的話,飽和溶解度會上昇。
又,下述表5表示冷凍乾燥前之離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖之濃度。溶解於鹼溶液中之葡聚糖濃度變高的話,溶液會凝膠化,無法獲得離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液,最大也只能得到0.8質量%。但是,經過依循本發明之粉末化法並使其再溶解的話,可使葡聚糖濃度上昇到5.0質量%(習知法之6倍濃度)。亦即,伴隨粉末化,以往無法製造之高濃度葡聚糖溶液變成得以調製。
[表5]
※凝膠化,且即使進行離心分離仍無法取出上清液溶液。
<水難溶性物質之包接實驗(包接複合體之調製)>
為了檢驗伴隨粉末化之離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖的特性變化,針對離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖所具有之對於水難溶性物質之包接、可溶化能力進行比較。
離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末使用來自黑酵母菌之β-1,3-1,6-葡聚糖(冷凍乾燥),水難溶性物質使用薑黃素(東京化成工業公司製,型錄編號:C0435)。
離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末係以1.0質量%之濃度溶解於蒸餾水中,並利用酚-硫酸法算出葡萄糖濃度後,稀釋使用。又,用以檢驗粉末化所致之包接能力的變化之控制組係使用粉末化前之離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液,同樣稀釋使用於實驗。
準備已將單體葡萄糖濃度調整至0.002mol/L之各離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液各1mL,添加已將濃度調整至0.05mol/L之薑黃素之丙酮溶液,使丙酮的最終濃度成為1體積%。此時,為了使未包接之薑黃素沉澱,利用振盪恆溫箱(AS ONE公司製,SI-150)於25℃,以1300rpm搖動攪拌3小時。實施離心分離操作(KUBOTA3740(久保田製作所公司製),14,000G,5分鐘),去除不溶物,針對上清液在波長405nm的吸光度進行比較。由於未包接之薑黃素已利用離心分離操作而去除,故吸光度係來自於利用離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖所包接、可溶化之薑黃素。
如圖3所示,上清液中來自薑黃素的吸光度(波長405nm),在無β-1,3-1,6-葡聚糖存在下為0.045,於未實施冷凍乾燥之再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液為0.340,於來自再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之溶液(冷凍乾燥)為0.404(增加18%),於來自再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之溶液(噴霧乾燥)為0.138。顯見實施過冷凍乾燥之離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末對於薑黃素之包接能力有改善。
為了檢驗伴隨粉末化之離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖的特性變化,針對離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖所具有之對於水難溶性物質之包接、可溶化能力進行比較。
離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末使用來自黑酵母菌之β-1,3-1,6-葡聚糖(冷凍乾燥),水難溶性物質使用薑黃素(東京化成工業公司製,型錄編號:C0435)。
離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末係以1.0質量%之濃度溶解於蒸餾水中,並利用酚-硫酸法算出葡萄糖濃度後,稀釋使用。又,用以檢驗粉末化所致之包接能力的變化之控制組係使用粉末化前之離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液,同樣稀釋使用於實驗。
準備已將單體葡萄糖濃度調整至0.002mol/L之各離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液各1mL,添加已將濃度調整至0.05mol/L之薑黃素之丙酮溶液,使丙酮的最終濃度成為1體積%。此時,為了使未包接之薑黃素沉澱,利用振盪恆溫箱(AS ONE公司製,SI-150)於25℃,以1300rpm搖動攪拌3小時。實施離心分離操作(KUBOTA3740(久保田製作所公司製),14,000G,5分鐘),去除不溶物,針對上清液在波長405nm的吸光度進行比較。由於未包接之薑黃素已利用離心分離操作而去除,故吸光度係來自於利用離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖所包接、可溶化之薑黃素。
如圖3所示,上清液中來自薑黃素的吸光度(波長405nm),在無β-1,3-1,6-葡聚糖存在下為0.045,於未實施冷凍乾燥之再生β-1,3-1,6-葡聚糖溶液為0.340,於來自再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之溶液(冷凍乾燥)為0.404(增加18%),於來自再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之溶液(噴霧乾燥)為0.138。顯見實施過冷凍乾燥之離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末對於薑黃素之包接能力有改善。
<包接複合體之粉末化及飽和溶解度>
在已將濃度調整至30mM之再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末溶液20mL中添加已將濃度調整至0.05mol/L之薑黃素之丙酮溶液0.20mL,使丙酮的最終濃度成為1體積%。為了使未包接之薑黃素沉澱,利用漩渦混合器攪拌5分鐘。實施離心分離操作(KUBOTA3740(久保田製作所公司製),14,000G,5分鐘),去除不溶物,將上清液冷凍乾燥,獲得黃色的粉末80mg。
測定得到的薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體之粉末的飽和溶解度。將薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體粉末1mg添加入裝有200μL之蒸餾水之1.5mL之塑膠試管中,以漩渦混合器攪拌5分鐘,持續進行該操作直到所添加的粉末不溶而殘留為止,結果於總量10mg達到飽和。
由於得到的結果和上述所得到的離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(未包接水難溶性物質之β-1,3-1,6-葡聚糖)之飽和溶解度並無差異,顯見無論是否包接水難溶性物質,得到的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之飽和溶解度並無差異。
在已將濃度調整至30mM之再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末溶液20mL中添加已將濃度調整至0.05mol/L之薑黃素之丙酮溶液0.20mL,使丙酮的最終濃度成為1體積%。為了使未包接之薑黃素沉澱,利用漩渦混合器攪拌5分鐘。實施離心分離操作(KUBOTA3740(久保田製作所公司製),14,000G,5分鐘),去除不溶物,將上清液冷凍乾燥,獲得黃色的粉末80mg。
測定得到的薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體之粉末的飽和溶解度。將薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體粉末1mg添加入裝有200μL之蒸餾水之1.5mL之塑膠試管中,以漩渦混合器攪拌5分鐘,持續進行該操作直到所添加的粉末不溶而殘留為止,結果於總量10mg達到飽和。
由於得到的結果和上述所得到的離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖粉末(未包接水難溶性物質之β-1,3-1,6-葡聚糖)之飽和溶解度並無差異,顯見無論是否包接水難溶性物質,得到的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之飽和溶解度並無差異。
<針對薑黃素之飽和溶解度的比較>
為了評價上述製得的薑黃素/β-1,3-1,6-葡聚糖複合體粉末之溶解性的高低,對於含有薑黃素之溶液及其吸光度進行比較。實驗中分別使用:由薑黃素(東京化成工業公司製,型錄編號:C0435)依上述製得的薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體溶液、得自於將該溶液進行冷凍乾燥而製得的薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體之粉末之飽和溶解度之溶液、使用漩渦混合器在1mL水中溶解秋薑黃100質量%粉末(ORIHIRO公司製)10mg達最大限度之溶液、薑黃之力(註冊商標,HOUSE WELLNESS FOODS公司製)之市售品溶液。
圖4係顯示溶液的照片。左起顯示秋薑黃100質量%粉末、薑黃之力、薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體溶液、得自於薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體粉末之飽和溶液,顯然可觀察到從依循本發明之粉末製得之溶液的溶解度較高。
從表6所示之上清液的吸光度(440nm)推算出相對於秋薑黃100質量%粉末的薑黃素之溶解度,薑黃之力為15倍,薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體溶液為143倍,反觀得自於依循本發明之薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體粉末之飽和溶液則提昇了1320倍。即使將其與未粉末化之薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體溶液相比,仍高了9.2倍。
另外,稀釋後進行測定之樣本係顯示將稀釋後所測得的吸光度乘以稀釋倍率而得的值。
為了評價上述製得的薑黃素/β-1,3-1,6-葡聚糖複合體粉末之溶解性的高低,對於含有薑黃素之溶液及其吸光度進行比較。實驗中分別使用:由薑黃素(東京化成工業公司製,型錄編號:C0435)依上述製得的薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體溶液、得自於將該溶液進行冷凍乾燥而製得的薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體之粉末之飽和溶解度之溶液、使用漩渦混合器在1mL水中溶解秋薑黃100質量%粉末(ORIHIRO公司製)10mg達最大限度之溶液、薑黃之力(註冊商標,HOUSE WELLNESS FOODS公司製)之市售品溶液。
圖4係顯示溶液的照片。左起顯示秋薑黃100質量%粉末、薑黃之力、薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體溶液、得自於薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體粉末之飽和溶液,顯然可觀察到從依循本發明之粉末製得之溶液的溶解度較高。
從表6所示之上清液的吸光度(440nm)推算出相對於秋薑黃100質量%粉末的薑黃素之溶解度,薑黃之力為15倍,薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體溶液為143倍,反觀得自於依循本發明之薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體粉末之飽和溶液則提昇了1320倍。即使將其與未粉末化之薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體溶液相比,仍高了9.2倍。
另外,稀釋後進行測定之樣本係顯示將稀釋後所測得的吸光度乘以稀釋倍率而得的值。
[表6]
<包接複合體之安定性>
使用上述製得的薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體溶液、薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體粉末,對於經包接之薑黃素的釋放行為(包接安定性)進行比較。使用量取薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體粉末3mg並使其溶解於蒸餾水5mL而成者。
得到的溶液之安定性係以微量盤分析儀測定靜置於設定成40℃之恆溫培養箱中,每經過一定時間之上清液的吸光度(波長:405nm)。薑黃素的水溶性低,從β-1,3-1,6-葡聚糖釋放出來即會沉澱,故吸光度會逐漸減少。亦即,吸光度變得愈小意指複合體愈不安定。
由得到的結果可知,例如在40℃,薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體溶液(圖5中的白圓圈)於1小時後釋放出45質量%之薑黃素,反觀使薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體粉末再溶解而成的溶液(圖5中的黑圓圈),於1小時後釋放停留在30質量%。由釋放速度算出半衰期,結果薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體溶液為1.6小時,薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體粉末為2.2小時,可知顯然安定性有增加(圖5)。伴隨該粉末化之熱安定性的改善即使在40℃以外的溫度也同樣會展現,可謂是粉末化所帶來的功能改善。
使用上述製得的薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體溶液、薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體粉末,對於經包接之薑黃素的釋放行為(包接安定性)進行比較。使用量取薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體粉末3mg並使其溶解於蒸餾水5mL而成者。
得到的溶液之安定性係以微量盤分析儀測定靜置於設定成40℃之恆溫培養箱中,每經過一定時間之上清液的吸光度(波長:405nm)。薑黃素的水溶性低,從β-1,3-1,6-葡聚糖釋放出來即會沉澱,故吸光度會逐漸減少。亦即,吸光度變得愈小意指複合體愈不安定。
由得到的結果可知,例如在40℃,薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體溶液(圖5中的白圓圈)於1小時後釋放出45質量%之薑黃素,反觀使薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體粉末再溶解而成的溶液(圖5中的黑圓圈),於1小時後釋放停留在30質量%。由釋放速度算出半衰期,結果薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體溶液為1.6小時,薑黃素/離心再生β-1,3-1,6-葡聚糖複合體粉末為2.2小時,可知顯然安定性有增加(圖5)。伴隨該粉末化之熱安定性的改善即使在40℃以外的溫度也同樣會展現,可謂是粉末化所帶來的功能改善。
<對於其他水難溶性物質之粉末化效果>
又,於上述包接複合體中,將薑黃素替換成白藜蘆醇、β-胡蘿蔔素,其他步驟同樣地實施後之結果確認其展現出同樣的傾向。
[產業上利用性]
又,於上述包接複合體中,將薑黃素替換成白藜蘆醇、β-胡蘿蔔素,其他步驟同樣地實施後之結果確認其展現出同樣的傾向。
[產業上利用性]
根據本發明可獲得於水中之溶解度高的β-1,3-1,6-葡聚糖粉末,即使對於水難溶性客體分子等仍可提供高濃度溶液。
無。
[圖1]圖1係顯示本實施例所準備之冷凍乾燥前的β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑之分布之圖表。
[圖2]圖2係顯示本實施例所準備之冷凍乾燥後的β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑之分布之圖表。
[圖3]圖3係顯示包接有本實施例所準備之薑黃素之β-1,3-1,6-葡聚糖包接複合體及未包接之薑黃素(無葡聚糖)的吸光度之圖表。
[圖4]圖4顯示本實施例所準備之溶液的照片。
[圖5]圖5係顯示包接有本實施例所準備之薑黃素之β-1,3-1,6-葡聚糖包接複合體之隨時間之安定性之圖表。
Claims (16)
- 一種β-1,3-1,6-葡聚糖粉末,其於25℃之水中之飽和溶解度為1.0~20.0質量%。
- 如申請專利範圍第1項之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末,其中,於利用動態光散射測定法對於該β-1,3-1,6-葡聚糖粉末進行測定而測得的β-1,3-1,6-葡聚糖的粒徑分布之中,體積分率最大的峰部的粒徑落在5nm以上且未達100nm之範圍,該粒徑落在5nm以上且未達100nm之範圍外之峰部之體積分率為該體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下。
- 一種β-1,3-1,6-葡聚糖粉末,於利用動態光散射測定法對於該β-1,3-1,6-葡聚糖粉末進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在5nm~15nm之範圍,該粒徑落在5~15nm之範圍外之峰部之體積分率為該體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下。
- 一種含葡聚糖之組成物,含有如申請專利範圍第1至3項中任一項之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末及水。
- 一種含葡聚糖之組成物,含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖, 係以相對於水為1.0~20.0質量%之比例溶有β-1,3-1,6-葡聚糖, 於利用動態光散射測定法對於該組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在5nm以上且未達100nm之範圍,該粒徑落在5~15nm之範圍外之峰部之體積分率為該體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下。
- 一種含葡聚糖之組成物,係含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之含β-1,3-1,6-葡聚糖之組成物, 於利用動態光散射測定法對於該含葡聚糖之組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在5~15nm之範圍,該粒徑落在5~15nm之範圍外之峰部之體積分率為該體積分率最大之峰部之體積分率之30%以下。
- 如申請專利範圍第4項之含葡聚糖之組成物,其中,該組成物之於25℃之波長660nm之光之透射率為70%以上。
- 如申請專利範圍第5項之含葡聚糖之組成物,其中,該組成物之於25℃之波長660nm之光之透射率為70%以上。
- 一種β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造方法,包括下列步驟: 對於含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之預組成物進行冷凍乾燥及噴霧乾燥中之至少一者,於利用動態光散射測定法對於該預組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在10nm以上且未達1000nm之範圍,粒徑落在1000nm以上之峰部之體積分率為該體積分率最大之峰部之體積分率之10%以下。
- 如申請專利範圍第9項之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造方法,其中,該預組成物係藉由進行離心分離、過濾或透析從含有β-1,3-1,6-葡聚糖之原料組成物去除大粒徑之β-1,3-1,6-葡聚糖而獲得。
- 一種如申請專利範圍第1至3項中任一項之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之製造方法,包括下列步驟: 對於含有水及β-1,3-1,6-葡聚糖之預組成物進行冷凍乾燥及噴霧乾燥中之至少一者,於利用動態光散射測定法對於該預組成物進行測定而測得之β-1,3-1,6-葡聚糖之粒徑分布之中,體積分率最大之峰部之粒徑落在10nm以上且未達1000nm之範圍,粒徑落在1000nm以上之峰部之體積分率為該體積分率最大之峰部之體積分率之10%以下。
- 一種包接複合體,係客體分子包接於來自如申請專利範圍第1至3項中任一項之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末之β-1,3-1,6-葡聚糖中。
- 如申請專利範圍第12項之包接複合體,其中,該包接複合體為粉末狀。
- 一種包接複合體之製造方法,包括下列步驟: 使用如申請專利範圍第1至3項中任一項之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末使客體分子包接。
- 如申請專利範圍第14項之包接複合體之製造方法,其中,該包接複合體為粉末狀。
- 一種客體分子之回收方法,包括下列步驟: 使用如申請專利範圍第1至3項中任一項之β-1,3-1,6-葡聚糖粉末使客體分子包接。
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