TW201923083A - 抗pd-l1的單結構域抗體及其變異體 - Google Patents

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Abstract

本申請提供了包含特異性識別PD-L1的單結構域抗體(sdAb)部分的構建體。還提供了製備和使用這些構建體的方法。

Description

抗PD-L1的單結構域抗體及其變異體
以ASCII文本文件提交序列表
以下ASCII文本文件的提交內容以其整體通過引用併入本文:計算機可讀形式(CRF)的序列表(文件名:688096.97序列表,標示日期:2017年11月1日,大小:271kb)。本發明涉及包含特異性識別PD-L1的單結構域抗體(sdAb)部分的構建體,以及其製備和使用方法。
主要在活化的T細胞和B細胞上表現的免疫抑制性受體,程序性細胞死亡受體1,也稱為程序性死亡受體1(PD-1),是與CD28和細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白-4(CTLA-4)相關的免疫球蛋白超家族的成員。PD-1和類似的家族成員是I型跨膜糖蛋白,其含有結合其配體的胞外Ig可變型(V型)結構域和結合信號傳導分子的胞質尾區(cytoplasmic tail)。PD-1的胞質尾區含有兩個基於酪胺酸的信號傳導基序、一個ITIM(免疫受體基於酪胺酸的抑制基序)和一個ITSM(免疫受體基於酪胺酸的開關基序)。
PD-1當結合至程序性細胞死亡配體1(也稱為程序性死亡配體1(PD-L1))和/或程序性細胞死亡配體2(也稱為程序性死亡配體2(PD-L2))時減弱T細胞應答。這些配體中的任一個與PD-1的結合會負向調節抗原受體信號傳導。阻斷PD-L1與PD-1的結合增強了腫瘤特異性CD8+ T細胞免疫,同時幫助免疫系統清除腫瘤細胞。
因此,治療性靶向PD-1和通過與PD-1相互作用而傳導信號的其它分子(諸如程序性死亡配體1(PD-L1)和程序性死亡配體2(PD-L2)),是一個非常感興趣的領域。已經提議將抑制PD-L1信號傳導作為一種手段來增強T細胞免疫,用於治療癌症(例如腫瘤免疫)和感染(包括急性感染和慢性(例如持續性)感染)。但是,由於針對該途徑中的靶標的治療尚未商品化,因此存在明顯未滿足的醫學需求。已經顯示抗PD-L1抗體治療在大量癌症諸如黑色素瘤中具有前景。
單鏈抗體(sdAb)不同於習用四鏈抗體,其具有一個單體抗體可變結構域。例如,駱駝和鯊魚產生被稱為僅重鏈抗體(HCAb)的單結構域抗體,其天然缺少輕鏈。駱駝科HCAb的每個臂中的抗原結合片段具有單一重鏈可變結構域(VH H),其在沒有輕鏈幫助的情況下可以展示出對抗原的高親和力。駱駝科VH H被認為是最小的功能性抗原結合片段,其具有約15 kD的分子量。
本文提及的所有出版物、專利、專利申請和公佈的專利申請的公開內容都以其整體通過引用併入本文。
本發明涉及包含特異性識別PD-L1的單結構域抗體(sdAb)部分的構建體,以及其製備和使用方法。
本申請的一個方面提供了一種分離的抗-PD-L1構建體,其包含特異性識別PD-L1的sdAb部分,其中所述sdAb部分包含以下:CDR1,其包含SEQ ID NO: 51-100中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 151-200中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 251-300中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換。
在根據以上所述的分離的抗-PD-L1構建體中的任一個的一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分包含以下:CDR1,其包含SEQ ID NO: 51-100中任一個的胺基酸序列;CDR2,其包含SEQ ID NO: 151-200中任一個的胺基酸序列;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 251-300中任一個的胺基酸序列。
在根據以上所述的分離的抗-PD-L1構建體中的任一個的一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分包含以下中的任一個:
(1) CDR1,其包含SEQ ID NO: 51的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 151的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 251的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(2) CDR1,其包含SEQ ID NO: 52的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 152的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 252的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(3) CDR1,其包含SEQ ID NO: 53的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 153的胺基酸序列的或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 253的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(4) CDR1,其包含SEQ ID NO: 54的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 154的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 254的胺基酸序列的或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(5) CDR1,其包含SEQ ID NO: 55的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 155的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 255的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(6) CDR1,其包含SEQ ID NO: 56的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 156的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 256的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(7) CDR1,其包含SEQ ID NO: 57的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 157的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 257的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(8) CDR1,其包含SEQ ID NO: 58的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 158的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 258的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(9) CDR1,其包含SEQ ID NO: 59的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 159的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 259的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(10) CDR1,其包含SEQ ID NO: 60的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 160的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 260的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(11) CDR1,其包含SEQ ID NO: 61的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 161的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 261的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(12) CDR1,其包含SEQ ID NO: 62的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 162的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 262的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(13) CDR1,其包含SEQ ID NO: 63的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 163的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 263的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(14) CDR1,其包含SEQ ID NO: 64的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 164的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 264的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(15) CDR1,其包含SEQ ID NO: 65的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 165的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 265的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(16) CDR1,其包含SEQ ID NO: 66的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 166的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 266的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(17) CDR1,其包含SEQ ID NO: 67的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 167的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 267的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(18) CDR1,其包含SEQ ID NO: 68的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 168的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 268的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(19) CDR1,其包含SEQ ID NO: 69的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 169的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 269的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(20) CDR1,其包含SEQ ID NO: 70的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 170的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 270的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(21) CDR1,其包含SEQ ID NO: 71的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 171的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 271的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(22) CDR1,其包含SEQ ID NO: 72的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 172的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 272的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(23) CDR1,其包含SEQ ID NO: 73的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 173的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 273的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(24) CDR1,其包含SEQ ID NO: 74的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 174的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 274的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(25) CDR1,其包含SEQ ID NO: 75的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 175的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 275的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(26) CDR1,其包含SEQ ID NO: 76的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 176的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 276的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(27) CDR1,其包含SEQ ID NO: 77的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 177的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 277的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(28) CDR1,其包含SEQ ID NO: 78的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 178的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 278的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(29) CDR1,其包含SEQ ID NO: 79的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 179的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 279的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(30) CDR1,其包含SEQ ID NO: 80的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 180的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 280的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(31) CDR1,其包含SEQ ID NO: 81的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 181的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 281的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(32) CDR1,其包含SEQ ID NO: 82的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 182的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 282的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(33) CDR1,其包含SEQ ID NO: 83的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 183的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 283的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(34) CDR1,其包含SEQ ID NO: 84的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 184的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 284的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(35) CDR1,其包含SEQ ID NO: 85的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 185的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 285的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(36) CDR1,其包含SEQ ID NO: 86的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 186的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 286的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(37) CDR1,其包含SEQ ID NO: 87的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 187的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 287的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(38) CDR1,其包含SEQ ID NO: 88的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 188的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 288的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(39) CDR1,其包含SEQ ID NO: 89的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 189的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 289的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換
(40) CDR1,其包含SEQ ID NO: 90的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 190的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 290的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(41) CDR1,其包含SEQ ID NO: 91的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 191的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 291的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(42) CDR1,其包含SEQ ID NO: 92的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 192的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 292的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(43) CDR1,其包含SEQ ID NO: 93的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 193的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 293的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(44) CDR1,其包含SEQ ID NO: 94的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 194的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 294的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(45) CDR1,其包含SEQ ID NO: 95的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 195的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和包含SEQ ID NO: 295的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(46) CDR1,其包含SEQ ID NO: 96的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 196的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 296的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(47) CDR1,其包含SEQ ID NO: 97的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 197的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 297的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(48) CDR1,其包含SEQ ID NO: 98的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 198的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 298的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(49) CDR1,其包含SEQ ID NO: 99的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 199的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 299的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;
(50) CDR1,其包含SEQ ID NO: 100的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 200的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 300的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換。
在根據以上所述的分離的抗-PD-L1構建體中的任一個的一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分包含VH H結構域,所述VH H結構域具有含有一個或多個以下胺基酸殘基的胺基酸序列:a-1)選自下組的位置37處的胺基酸殘基:F、Y、L、I和V,較佳F、V或Y;a-2)選自下組的位置44處的胺基酸殘基:A、G、E、D、G、Q、R、S和L,較佳G、E或Q;a-3) 選自下組的位置45處的胺基酸殘基:L、R和C,較佳諸如L或R;a-4)選自下組的位置103處的胺基酸殘基:G、W、R和S,較佳W或R,更佳W;和a-5)為Q的位置108處的胺基酸殘基,其中這些位置按照Kabat編號。
在根據以上所述的分離的抗-PD-L1構建體中的任一個的一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分包含VH H結構域,所述VH H結構域具有含有一個或多個以下胺基酸殘基的胺基酸序列:b-1)選自下組的位置37處的胺基酸殘基:F、Y、L、I和V,較佳F、V或Y;b-2)選自下組的位置44處的胺基酸殘基:G、E和Q;b-3) 為R或L的位置45處的胺基酸殘基;b-4)選自下組的位置103處的胺基酸殘基:G、W、R和S,較佳W;和b-5)選自下組的位置108處的胺基酸殘基:Q和L,其中這些位置按照Kabat編號。
在根據以上所述的分離的抗-PD-L1構建體中的任一個的一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分包含VH H結構域,所述VH H結構域包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體與SEQ ID NO: 288-328中的任一個具有至少約80%(諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中的任一個)序列同一性。在一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分包含VH H結構域,所述VH H結構域包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體在所述VH H結構域中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換。在一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分包含VH H結構域,所述VH H結構域包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列。
在根據以上所述的分離的抗-PD-L1構建體中的任一個的一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分與PD-L1之間的結合親和力(KD ,解離常數)為約10-5 M至約10-12 M (諸如約10-5 M 至約10-12 M,約10-7 M至約10-12 M,或約10-8 M至約10-12 M)。
在根據以上所述的分離的抗-PD-L1構建體中的任一個的一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分是駱駝科的、嵌合的、人的、部分人源化的、或全部人源化的。
在根據以上所述的分離的抗-PD-L1構建體中的任一個的一些實施例中,分離的抗PD-L1構建體是僅重鏈抗體(HCAb)。在一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分與人IgG1 Fc融合。在一些實施例中,HCAb是單體的或二聚的。在一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分包含SEQ ID NO: 351-400的胺基酸序列。在一些實施例中,HCAb包含SEQ ID NO: 401-440中的任一個的胺基酸序列。
在根據以上所述的分離的抗-PD-L1構建體中的任一個的一些實施例中,分離的抗PD-L1構建體還包含特異性識別第二抗原的第二抗體部分。在一些實施例中,第二抗體部分是全長抗體、Fab、Fab’、(Fab’)2、單鏈Fv (scFv)、scFv-scFv、微抗體、雙抗體、sdAb或抗體模擬物。在一些實施例中,抗-PD-L1構建體是單特異性的。在一些實施例中,抗-PD-L1構建體是多特異性的。在一些實施例中,第二抗體部分是sdAb。在一些實施例中,第二抗原是PD-L1。在一些實施例中,分離的抗PD-L1構建體包含三個或更多個特異性識別PD-L1的sdAb。在一些實施例中,第二抗原是人血清白蛋白(HSA)。在一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分在第二抗體部分的胺基(N)末端和/或羧基(C) 末端。在一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分和第二抗體部分任選地通過肽連接子(諸如SEQ ID NO: 443、444或445)連接。
在根據以上所述的分離的抗-PD-L1構建體中的任一個的一些實施例中,分離的抗PD-L1構建體還包含特異性識別第二抗原的第二抗體部分,其中第二抗體部分是全長抗體。在一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分的胺基(N)末端與全長抗體的至少一條重鏈的羧基(C)末端融合。在一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分的羧基(C)末端與全長抗體的至少一條重鏈的胺基(N)末端融合。在一些實施例中,全長抗體特異性識別TIGIT。在一些實施例中,全長抗體特異性識別TIM-3。在一些實施例中,全長抗體特異性識別LAG-3。在一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分包含SEQ ID NO: 351-400的胺基酸序列。在一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分和第二抗體部分任選地通過肽連接子(SEQ ID NO: 443-445)連接。
還提供了第二分離的抗-PD-L1構建體,其與上文所述的分離的抗-PD-L1構建體中的任一個競爭性地特異性結合PD-L1。在一些實施例中,第二分離的抗-PD-L1構建體包含以下:CDR1,其包含SEQ ID NO: 51-100中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 151-200中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 251-300中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換。
還提供了一種藥物組合物,其包含上文所述的分離的抗-PD-L1構建體的任一個以及藥學上可接受的載劑。
本申請的另一方面提供一種治療患有PD-L1相關疾病的個體的方法,包括向個體施用有效量的上文所述的藥物組合物中的任一個。在一些實施例中,PD-L1相關疾病是癌症。在一些實施例中,癌症是實體瘤,諸如結腸癌。在一些實施例中,該方法進一步包括向個體施用額外的癌症治療,諸如手術、放射、化學療法、免疫療法、激素療法或其組合。在一些實施例中,PD-L1相關疾病是病原體感染。在一些實施例中,藥物組合物全身施用,諸如靜脈內(i.v.)施用。在一些實施例中,藥物組合物局部施用,諸如瘤內施用。在一些實施例中,個體是人。
還提供了一種分離的核酸,其編碼上文所述的分離的抗-PD-L1構建體中的任一個。在一些實施例中,分離的核酸編碼選自SEQ ID NO: 351-400中的任一個的胺基酸序列。
還提供了一種載體,其包含上文所述的分離的核酸中的任一個。
還提供了一種分離的主體細胞,其包含上文所述的分離的核酸或載體中的任一個。
還提供了一種試劑盒,其包含上文所述的分離的抗-PD-L1構建體、分離的核酸、載體或分離的主體細胞中的任一個。
本申請的另一方面提供了一種產生上文所述的分離的抗-PD-L1構建體中的任一個的方法,所述方法包括在有效表現編碼的抗-PD-L1構建體的條件下培養包含上文所述的分離的核酸或載體中的任一個的主體細胞,或培養上文所述的分離的主體細胞中的任一個;和從所述主體細胞獲得表現的抗-PD-L1構建體。在一些實施例中,該方法還包括產生包含上文所述的分離的核酸或載體中的任一個的主體細胞。
本發明提供了一種特異性識別PD-L1的單結構域抗體(sdAb)(下文也稱為“抗-PD-L1 sdAb”)及其抗體變異體,所述抗體變異體包括但不限於,包含所述抗-PD-L1 sdAb的較大蛋白或多肽,諸如僅重鏈抗體(HCAb)或與全長抗體或其抗原結合片段融合的抗-PD-L1 sdAb,作為一種新的治療PD-L1相關疾病諸如癌症的策略。
單鏈抗體(sdAb)不同於習用四鏈抗體在於其具有一個單體抗體可變結構域,諸如重鏈可變結構域(VH H),其可以在沒有輕鏈的幫助下展示出與抗原的高親和力。駱駝科VH H被認為是最小的功能性抗原結合片段,其具有約15 kD的分子量。
因此,本申請的一個方面提供了一種分離的抗-PD-L1構建體,其包含特異性識別PD-L1的sdAb部分。所述分離的抗-PD-L1構建體可以是例如抗-PD-L1 sdAb(例如天然的或人源化的)、包含融合在一起的多個本文所述的抗-PD-L1 sdAb的多肽、包含與人IgG1 Fc融合的本文所述的抗-PD-L1 sdAb的HCAb、或與全長抗體(諸如抗-PD-1抗體或抗-PD-L1抗體)或其抗原結合片段融合的抗-PD-L1 sdAb。抗-PD-L1構建體可以是單特異性的或多特異性的,單價的或多價的。
還提供了包含所述包含抗-PD-L1 sdAb部分的構建體的組合物(諸如藥物組合物)、試劑盒和製品,製備所述包含抗-PD-L1 sdAb部分的構建體的方法,以及使用所述包含抗-PD-L1 sdAb部分的構建體治療PD-L1相關疾病(諸如癌症)的方法。
I. 定義
術語“程序性細胞死亡1配體1”、“PD-L1”、“B7同源物1(B7-H1)”、“PD-L1抗原”、“PDCD1配體1”和“CD274”(參見例如Chemnitz (2004) J. Immunol. 173:945-954)可互換使用,包括人PD-L1的變異體、同種型、物種同源物,具有至少一個與PD-L1的共同抗原決定區的類似物(參見例如Butte (2008) Mol Immunol. 45:3567-3572)。因此,在某些情況下,本發明的抗-PD-L1構建體可以與來自除了人之外的其它物種的PD-L1或結構上與人PD-L1相關的其它蛋白(例如人PD-L1同源物)交叉反應。在其它情況下,所述抗-PD-L1構建體可以對人PD-L1完全特異,並且不表現出物種交叉反應性或其它類型的交叉反應性。
術語“人PD-L1”是指人序列PD-L1,諸如具有GenBank登錄號Q9NZQ7的人PD-L1的完全胺基酸序列。所述人PD-L1序列可以不同於具有GenBank登錄號Q9NZQ7的人PD-L1,在於例如具有保守突變或在非保守區域中的突變,並且所述PD-L1與具有GenBank登錄號Q9NZQ7的人PD-L1具有基本相同的生物學功能。例如,人PD-L1的生物學功能是在PD-L1的胞外結構域中具有被本公開內容的抗-PD-L1構建體特異性結合的抗原決定區,或者人PD-L1的生物學功能是調節T細胞活性。
術語“抗原決定區”意指能夠與抗體特異性結合的蛋白質決定簇。抗原決定區通常由分子的化學活性表面基團(諸如胺基酸或糖側鏈)構成,並且通常具有獨特的三維結構特徵以及獨特的電荷特徵。構形抗原決定區和非構形抗原決定區的區別在於在變性溶劑的存在下失去與前者的結合,而不失去與後者的結合。
本文使用的術語“程序性細胞死亡1(PD-1)”意圖指屬於免疫球蛋白超家族並且在T細胞和祖B細胞上表現的細胞表面受體。人B7-1(CD80)的胺基酸序列以Genbank登錄號NP_005009公開。
本文使用的“治療(treatment)”或“治療(treating)”是用於獲得有益的或需要的結果(包括臨床結果)的方法。為了本發明的目的,有益的或需要的臨床結果包括但不限於以下的一個或多個:緩解由該疾病導致的一種或多種症狀、降低該疾病的嚴重程度、使該疾病穩定(例如預防或延遲該疾病的惡化)、預防或延遲該疾病的擴散(例如轉移)、預防或延遲該疾病的復發、延遲或減緩該疾病的進展、減輕該疾病的病況、提供該疾病的緩解(部分或全部)、減少治療該疾病所需的一種或多種其它藥物的劑量、延遲該疾病的進展、增加生活質量和/或延長存活。“治療”還涵蓋減少癌症的病理後果。本發明的方法考慮這些治療方面中的任意一個或多個。
本文使用的術語“有效量”是指足以治療指定的病症、病況或疾病(諸如減輕(ameliorate)、減輕(palliate)、減輕(lessen)和/或延遲其一種或多種症狀)的藥劑的量或藥劑的組合的量。關於癌症,有效量包括足以導致腫瘤縮小和/或降低腫瘤生長速度(諸如抑制腫瘤生長)或者預防或延遲其它不想要的細胞增生的量。在一些實施例中,有效量是足以延遲進展的量。在一些實施例中,有效量是足以預防或延遲復發的量。有效量可以一次或多次施用。藥物或組合物的有效量可以:(i) 減少癌細胞的數目;(ii) 減小腫瘤尺寸;(iii) 一定程度地抑制、延遲、減慢並且較佳終止癌細胞滲透到外周器官中;(iv) 抑制(例如一定程度地減慢並且較佳終止)腫瘤轉移;(v) 抑制腫瘤生長;(vi) 預防或延遲腫瘤的發生和/或復發;和/或(vii) 一定程度地減輕與該癌症相關的一種或多種症狀。
術語“抗體”或“抗體部分”以最寬的含義使用,並且涵蓋多種抗體結構,包括但不限於單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、全長抗體及其抗原結合片段,只要它們展示出所需的抗原結合活性。
基本的四鏈抗體單元是由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈組成的異四聚體糖蛋白。IgM抗體由5個該基本的四鏈抗體單元以及額外的被稱為J鏈的多肽一起組成,並且含有10個抗原結合位點,而IgA抗體包含2個至5個該基本的四鏈單元,其可以多聚化以與J鏈一起形成多價集聚體(assembage)在IgG的情況下,四鏈單元通常為約150,000道爾頓。每條L鏈通過一個共價二硫鍵與一條H鏈連接,而兩條H鏈通過一個或多個二硫鍵彼此連接,這取決於H鏈的同種型。每條H鏈和L鏈也具有規律間隔的鏈內二硫橋接。每條H鏈在N末端具有可變結構域(VH ),對於α和γ鏈中的每個來說隨後是三個恒定結構域(CH ),而對於μ和ε同種型來說隨後是4個CH 結構域。每條L鏈在N末端具有一個可變結構域(VL )隨後是在其另一端的一個恒定結構域。VL 與VH 比對,CL 與重鏈的第一恒定結構域(CH 1)比對。認為特定的胺基酸殘基形成輕鏈和重鏈可變結構域之間的界面。VH 和VL 對在一起形成一個抗原結合位點。對於不同類別抗體的結構和性質,參見例如Basic and Clinical Immunology, 第8版, Daniel P. Sties, Abba I. Terr和Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, 第71頁和第6章。來自任何脊椎動物物種的L鏈都能夠基於其恒定結構域的胺基酸序列而被分配到被稱為κ和λ的兩個明顯不同的類型之一中。根據其重鏈的恒定結構域(CH )的胺基酸序列,免疫球蛋白可以被分配到不同的類(class)或同種型。有五類免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其分別具有指定的α、δ、ε、γ和μ的重鏈。基於CH 序列和功能的相對微小的差異將γ和α類進一步劃分成亞類,例如人表現以下亞類:IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
術語“僅重鏈抗體”或“HCAb”是指一種功能性抗體,其包含重鏈但是缺少通常在四鏈抗體中存在的輕鏈。已知駱駝科動物(諸如駱駝、美洲駝或羊駝)產生HCAb。
術語“單結構域抗體”或“sdAb”是指具有三個互補決定區(CDR)的單個抗原結合多肽。僅SdAb就能夠在不與相應的含有CDR的多肽配對的情況下與抗原結合。在一些情況下,單結構域抗體從駱駝科HCAb工程化改造而得到,並且其重鏈可變結構域在本文中被稱為“VH H”(重鏈抗體的重鏈的可變結構域)。一些VH H也被稱為納米抗體。駱駝科sdAb是最小的已知抗原結合抗體片段之一(參見例如Hamers-Castermanet al ., Nature 363:446-8 (1993); Greenberget al ., Nature 374:168-73 (1995); Hassanzadeh-Ghassabehet al ., Nanomedicine (Lond), 8:1013-26 (2013))。一個基本的VH H具有以下從N末端至C末端的結構:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,其中FR1至FR4分別指架構區1至4,並且其中CDR1至CDR3指互補決定區1至3。
“分離的”抗體(或構建體)是從其產生環境的成分中鑒定、分離和/或回收的抗體(或構建體)(例如天然的或重組的)。較佳地,分離的多肽不與其產生環境中的所有其他成分相關聯。其產生環境的污染物成分,諸如由重組的轉染的細胞產生的那些,是通常會干擾抗體的研究、診斷或治療用途的材料,並且可以包括酶、激素和其它蛋白質的或非蛋白質的溶質。在較佳的實施例中,可以將多肽純化:(1) 至通過例如Lowry方法所測定的以重量計95%以上的抗體,並且在一些實施例中,至以重量計99%以上;(2) 至足以通過使用旋轉杯定序儀(spinning cup sequenator)獲得N末端或內部胺基酸序列的至少15個殘基的程度;或(3) 至在非還原或還原條件下使用考馬斯亮藍或較佳銀染色通過SDS-PAGE測得同質性。分離的抗體(或構建體)包括在重組細胞內的原位抗體,因為抗體的天然環境的至少一個組分會不存在。但是一般會通過至少一個純化步驟來製備分離的多肽、抗體或構建體。
抗體的“可變區”或“可變結構域”是指抗體的重鏈或輕鏈的胺基末端結構域。重鏈和輕鏈的可變結構域可以分別被稱為“VH ”和“VL ”。這些結構域通常是抗體的最可變部分(相對於同一類的其它抗體而言)並且含有抗原結合位點。來自駱駝科物種的僅重鏈抗體具有被稱為“VH H”的單個重鏈可變區。因此VH H是VH 的特殊類型。
術語“可變”是指可變結構域的某些節段在抗體之間序列差異廣泛的事實。V結構域介導抗原結合並且限定特定抗體對其特定抗原的特異性。但是可變性不是在整個可變結構域範圍內均勻分佈的。而是在輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域二者中都集中在被稱為互補決定區(CDR)或高變區(HVR)的三個節段中。可變結構域的更高度保守的部分被稱為架構區(FR)。天然的重鏈和輕鏈的可變結構域每個都包含由三個CDR(形成連接β-片層結構的環,並且在一些情況下形成β-片層結構的一部分)連接的四個FR區(主要採用β-片層組態)。每條鏈中的CDR通過FR區靠近地保持在一起,並且與來自其他鏈的CDR一起有助於形成抗體的抗原結合位點(參見Kabatet al .,Sequences of Immunological Interest , Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991))。恒定結構域不直接參與抗體與抗原的結合,但是展示出多種效應子功能,諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性。
本文使用的術語“單克隆抗體”是指從基本上同質的抗體的群體中獲得的抗體,即,包含所述群體的各個抗體除了可以微小的量存在的可能天然發生的突變和/或翻譯後修飾(例如異構化、醯胺化)之外都是相同的。單克隆抗體是針對單一抗原位點高度特異的。與通常包含針對不同決定簇(抗原決定區)的不同抗體的多克隆抗體製劑相反,每個單克隆抗體都針對抗原上的單一決定簇。除了其特異性之外,單克隆抗體的優勢還在於其是通過雜交瘤培養而合成的,未被其它免疫球蛋白污染。修飾詞“單克隆”是指從基本上同質的抗體群體中獲得的抗體的特徵,並且不解釋為需要通過任何特定的方法來產生該抗體。例如,根據本發明使用的單克隆抗體可以通過多種技術製備,包括例如雜交瘤方法(例如Kohler和Milstein.,Nature, 256:495-97 (1975); Hongoet al. ,Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlowet al. ,Antibodies: A Laboratory Manual , (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerlinget al. , in:Monoclonal Antibodies and T -Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981))、重組DNA方法(參見例如美國專利號4,816,567)、噬菌體展示技術(參見例如Clacksonet al. ,Nature, 352: 624-628 (1991); Markset al. ,J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhuet al. ,J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Leeet al. ,J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 和 Leeet al. ,J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004))以及用於在具有部分或全部的編碼人免疫球蛋白的人免疫球蛋白基因座或基因的動物中產生人或類人抗體的技術(參見例如WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovitset al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovitset al. ,Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemannet al. ,Year in Immunol. 7:33 (1993); 美國專利號5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 和5,661,016; Markset al. ,Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberget al. ,Nature 368: 856-859 (1994); Morrison,Nature 368: 812-813 (1994); Fishwildet al. ,Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger,Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); 以及Lonberg和Huszar,Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995))。
術語“全長抗體”、“完整抗體”或“全抗體”可互換使用,指其基本上完整形式的抗體,與抗體片段相對。具體地,全長四鏈抗體包括具有重鏈和輕鏈的包含Fc區的那些。全長僅重鏈抗體包括重鏈(諸如VH H)和Fc區。恒定結構域可以是天然序列恒定結構域(例如人天然序列恒定結構域)或其胺基酸序列變異體。在一些情況下,完整抗體可以具有一種或多種效應子功能。
“抗體片段”包含完整抗體的一部分,較佳完整抗體的抗原結合區和/或可變區。抗體片段的實例包括但不限於Fab、Fab′、F(ab′)2 和Fv片段;雙價抗體;線性抗體(參見美國專利號5,641,870的實例2;Zapataet al .,Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]);單鏈抗體分子;單結構域抗體(諸如VH H),和由抗體片段形成的多特異性抗體。木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的被稱為“Fab”片段的抗原結合片段和一個殘留的“Fc”片段(其命名反映易於結晶的能力)。Fab片段由完整的L鏈和H鏈的可變區結構域(VH )和一條重鏈的第一恒定結構域(CH 1)一起組成。每個Fab片段對於抗原結合是單價的,即其具有單個抗原結合位點。胃蛋白酶處理抗體產生一個大的F(ab′)2 片段,其大致對應於具有不同抗原結合活性的兩個二硫鍵連接的Fab片段,並且仍能夠交聯抗原。Fab′片段與Fab片段的區別在於在CH 1結構域的羧基末端具有一些額外的殘基,包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab′-SH在本文中是Fab′的名稱,其中恒定結構域的一個或多個半胱胺酸殘基攜帶一個游離的巰基。F(ab′)2 抗體片段最初作為Fab′片段對產生,該Fab′片段對之間具有鉸鏈半胱胺酸。抗體片段的其它化學結合也是已知的。
Fc片段包含通過二硫鍵保持在一起的兩條H鏈的羧基末端部分。抗體的效應子功能由Fc區中的序列確定,該區域也由在若干類型的細胞中發現的Fc受體(FcR)識別。
術語“恒定結構域”是指具有相對於含有抗原結合位點的免疫球蛋白的其它部分(即可變結構域)更加保守的胺基酸序列的免疫球蛋白分子的一部分。恒定結構域含有重鏈的CH 1、CH 2和CH 3結構域(統稱CH)和輕鏈的CHL(或CL)結構域。
來自任何哺乳動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可以基於它們的恒定結構域的胺基酸序列被分配為被稱為kappa (“κ”)和lambda (“λ”)的兩種明顯不同的類型中的一個。
“Fv”是含有完全抗原識別和抗原結合位點的最小抗體片段。該片段由緊密非共價締合的一個重鏈可變區結構域和一個輕鏈可變區結構域的二聚體組成。從這兩個結構域的折疊發出六個高變環(H和L鏈各自有3個環),這有助於抗原結合的胺基酸殘基並且給予抗體以抗原結合特異性。但是,甚至單個可變結構域(或Fv的一半,其僅包含對抗原具有特異性的三個CDR)具有識別並結合抗原的能力,雖然具有比全部結合位點更低的親和力。
“單鏈Fv”,也縮寫為“sFv”或“scFv”,是包含連接成一條多肽鏈的VH 和VL 抗體結構域的抗體片段。較佳地,sFv多肽還在VH 和VL 結構域之間包含多肽連接子,其使得sFv能夠形成用於抗原結合所需的結構。對於sFv的綜述,參見Pluckthun inThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies , vol. 113, Rosenburg和Moore編輯, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)。
本文所述的抗體的“功能片段”包含完整抗體的一部分,其一般包括保留FcR結合能力或具有修飾的FcR結合能力的完整抗體的抗原結合區或可變區或抗體的Fc區。抗體片段的實例包括線性抗體、單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性抗體。
術語“雙抗體”是指通過以下方法製備的小抗體片段:構建在VH 和VL 結構域之間具有短連接子(約5-10個殘基)的sFv片段(參見前段),使得實現這兩個V結構域的鏈間配對而非鏈內配對,從而產生雙價片段,即具有兩個抗原結合位點的片段。雙特異性雙抗體是兩個“交叉”sFv片段的異質二聚體,其中這兩個抗體的VH 和VL 結構域存在於不同多肽鏈上。雙抗體在例如EP 404,097; WO 93/11161; Hollingeret al .,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)中更加詳細地描述。
本文的單克隆抗體具體地包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)以及這樣的抗體的片段,只要它們展示出所需的生物學活性即可,在所述嵌合抗體中重鏈和/或輕鏈的一部分與來源於特定物種的抗體或屬於特定抗體類型或亞類的抗體中的相應序列相同或同源,而該一條或多條鏈的剩餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類型或亞類的抗體中的相應序列相同或同源(美國專利號 4,816,567; Morrisonet al .,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))。“人源化抗體”作為“嵌合抗體”的一個子集使用。
非人(例如美洲鴕或駱駝科)抗體的“人源化”形式是含有來源於非人免疫球蛋白的最小序列的抗體。在一些實施例中,人源化抗體是人免疫球蛋白抗體(受體抗體),其中來自受體的CDR(在下文中定義)的殘基被來自具有所需的特異性、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)的CDR的殘基替換,所述非人物種諸如小鼠、大鼠、兔、駱駝、美洲鴕、羊駝、或非人靈長類動物。在一些情況下,人免疫球蛋白的架構(“FR”)殘基被相應的非人殘基替換。此外,人源化抗體可以包含未在受體抗體或供體抗體中發現的殘基。可以進行這些修飾以進一步改善抗體性能,諸如結合親和力。一般地,人源化抗體會包含至少一個(典型地兩個)可變結構域的絕大部分,其中的高變環的全部或絕大部分對應於非人免疫球蛋白序列的那些,並且FR區的全部或絕大部分是人免疫球蛋白序列的那些,雖然FR區可以包括改善抗體性能(諸如結合親和力、異構化、免疫原性等)的一個或多個單個FR殘基置換。FR中的這些胺基酸置換的數量通常在H鏈中不多於6個,在L鏈中不多於3個。人源化抗體任選地還會包含免疫球蛋白(通常是人免疫球蛋白)恒定區的至少一部分(Fc)。對於進一步詳述,參見例如Joneset al. ,Nature 321:522-525 (1986); Riechmannet al. ,Nature 332:323-329 (1988);和Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。還參見例如Vaswani和Hamilton,Ann. Allergy, Asthma &Immunol. 1:105-115 (1998); Harris,Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle和Gross,Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994);以及美國專利號6,982,321和7,087,409。
“人抗體”是具有對應於由人產生的抗體的胺基酸序列的胺基酸序列的抗體,和/或使用本文所公開的用於製備人抗體的任何技術製備的抗體。人抗體的該定義特定地排除了包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。人抗體可以是使用業內已知的多種技術產生的,包括噬菌體展示文庫。Hoogenboom 和Winter,J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Markset al. ,J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。Coleet al. ,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy , Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerneret al. ,J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)中記載的方法也可用于製備人單克隆抗體。還參見van Dijk和van de Winkel,Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)。人抗體可以通過向轉基因動物施用抗原來製備,所述轉基因動物已經被修飾以響應於抗原攻毒而產生這樣的抗體但其內源性基因座已經失效,例如免疫的轉基因小鼠(xenomouse)(參見例如關於XENOMOUSE™技術的美國專利號6,075,181和6,150,584)。 還參見例如關於通過人B細胞雜交瘤技術產生的人抗體的Liet al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)。
在本文中使用時,術語“高變區”、“HVR”或“HV”是指序列高度可變的和/或形成結構限定環的抗體可變結構域的區域。一般地,單結構域抗體包含三個HVR(或CDR):HVR1 (或CDR1)、HVR2 (或CDR2)和HVR3 (或CDR3)。HVR3 (或CDR3)在三個HVR中表現出最高的多樣性,並且被認為在賦予抗體以精確的特異性方面發揮獨特作用。參見例如Hamers-Castermanet al .,Nature 363:446-448 (1993); Sheriffet al .,Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)。
術語“互補決定區”或“CDR”用於指由Kabat體系定義的高變區。參見Kabatet al .,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)。
大量HVR描述正在使用,並且也涵蓋在本文中。Kabat互補決定區(CDR)基於序列可變性並且最常用(Kabatet al .,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。替代性地,Chothia指結構環的位置(Chothia和Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。AbM HVR代表Kabat HVR與Chothia結構環之間的折中,並且由Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件使用。“接觸”HVR基於可得的複雜的晶體結構的分析。來自這些HVR每個的殘基在下表中標注。
表1. HVR描述
HVR可以包含如下“延伸的HVR(extended HVR)”:VL 中的24-36或24-34 (L1)、46-56或50-56 (L2)和89-97或89-96 (L3),以及VH 中的26-35 (H1)、50-65或49-65 (H2) 和93-102、94-102或95-102 (H3)。這些定義中的每個的可變結構域殘基都是根據上述的Kabat等人的進行編號的。
單結構域抗體(諸如VH H)的胺基酸序列是根據Kabat等人給出的用於VH結構域的一般編號進行編號的(“Sequence of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, Md., Publication No. 91),如在Riechmann和Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun. 23; 240 (1-2): 185-195的文章中應用於來自駱駝科的VH H結構域。根據這種編號方式,VH H的FR1包含位置1-30處的胺基酸殘基,VH H的CDR1包含位置31-35的胺基酸殘基,VH H的FR2包含位置36-49的胺基酸,VH H的CDR2包含位置50-65的胺基酸殘基,VH H的FR3包含位置66-94的胺基酸殘基,VH H的CDR3包含位置95-102的胺基酸殘基,VH H的FR4包含位置103-113的胺基酸殘基。在這方面,應當注意的是—如業內關於VH 結構域和關於VH H結構域所公知的—每個CDR中的胺基酸殘基的總數可以改變,並且可以不對應於由Kabat編號表示的胺基酸殘基的總數(即,根據Kabat編號的一個或多個位置可能在實際序列中不被佔據,或實際序列可以含有比由Kabat編號考慮的數目更多的胺基酸殘基)。
語句“如在Kabat中的可變結構域殘基編號”或“如在Kabat中的胺基酸位置編號”及其變型是指在如上的Kabat等中的用於抗體編制的重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域的編號體系。使用該編號體系,實際的線性胺基酸序列可以含有更少的或額外的胺基酸,其分別對應於可變結構域的FR或HVR的縮短或插入到可變結構域的FR或HVR中。例如,重鏈可變結構域可以在H2的殘基52後包含單個胺基酸插入(根據Kabat的殘基52a),並且在重鏈FR殘基82後包含多個插入殘基(例如根據Kabat的殘基82a、82b和82c)。可以通過與“標準”Kabat編號的序列在抗體序列的同源區域處進行比對而確定給定抗體的殘基的Kabat編號。
除非本文中另有說明,否者免疫球蛋白重鏈中的殘基編號都是如上文Kabat等人中的EU索引的編號。“如上文Kabat等人中的EU索引”是指人IgG1 EU抗體的殘基編號。
“架構”或“FR”殘基是除了如本文所定義的HVR殘基之外的那些可變結構域殘基。
“人共有架構(human consensus framework)”或“受體人架構”是一種架構,其代表在人免疫球蛋白VL 或VH 架構序列的選擇中最常出現的胺基酸殘基。一般地,人免疫球蛋白VL 或VH 序列的選擇來自可變結構域的亞組。一般地,該序列的亞組是如Kabatet al .,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)中的亞組。實例包括,對於VL ,該亞組可以是如上文的Kabat等人中的亞組κI、κII、κIII或κIV。另外,對於VH ,該亞組可以是如上文的Kabat等人中的亞組I、亞組II或亞組III。或者,人共有架構可以從上述特定殘基中,其中的特定胺基酸,諸如當通過將供體架構序列與多種人架構序列的集合進行比對而基於其與供體架構的同源性選擇人架構殘基時。“衍生自”人免疫球蛋白架構或人共有架構的受體人架構可以包含其相同的胺基酸序列,或者可以含有先已存在的胺基酸序列改變。在一些實施例中,先已存在的胺基酸改變的數目是10個或更少,9個或更少,8個或更少,7個或更少,6個或更少,5個或更少,4個或更少,3個或更少,或者2個或更少。
“親和力成熟的”抗體是在其一個或多個CDR中具有一個或多個改變的抗體,所述改變導致與不具有那些改變的親本抗體相比該抗體對抗原的親和力提高。在一些實施例中,親和力成熟的抗體具有納摩爾或甚至皮摩爾的對靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體是通過業內已知的程序產生的。例如,Markset al .,Bio/Technology 10:779-783 (1992)描述了通過VH 結構域和VL 結構域改組(shuffling)而實現的親和力成熟。CDR和/或架構殘基的隨機誘變由例如以下來描述:Barbaset al .Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schieret al .Gene 169:147-155 (1995); Yeltonet al .J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jacksonet al .,J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 和Hawkinset al ,J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)。
如本文所使用的術語“特異性結合”、“特異性識別”或“對於…是特異的”是指可量測的且可重複的(reproducible)相互作用,諸如靶標與抗原結合蛋白(諸如sdAb)之間的結合,其決定在包括生物分子在內的分子的異質群體的存在中存在所述靶標。例如,特異性結合靶標(其可以是抗原決定區)的抗原結合蛋白(諸如sdAb)是與它結合其它抗原相比以更大的親和力(affinity)、親和性(avidity)、更容易地、和/或以更長的持續時間結合該靶標。在一些實施例中,抗原結合蛋白(諸如sdAb)與不相關靶標的結合程度為該抗原結合蛋白(諸如sdAb)與該靶標結合的約10%以下,如通過例如放射免疫檢測法(RIA)所量測的。在一些實施例中,特異性結合靶標的抗原結合蛋白(諸如sdAb)的解離常數(Kd )為≤10-5 M、≤10-6 M、≤10-7 M、≤10-8 M、≤10-9 M、≤10-10 M、≤10-11 M或≤10-12 M。在一些實施例中,抗原結合蛋白特異性結合蛋白質上來自不同物種的蛋白質中保守的抗原決定區。在一些實施例中,特異性結合可以包括但不必需專一結合。
術語“特異性”是指抗原結合蛋白(諸如sdAb)對抗原的一個特定抗原決定區的選擇性識別。例如,天然的抗體是單特異性的。本文所使用的術語“多特異性的”是指抗原結合蛋白具有多抗原決定區特異性(即,能夠特異性結合一個生物分子上的兩個、三個或更多個不同的抗原決定區,或能夠特異性結合兩個、三個或更多個不同生物分子上的抗原決定區)。本文所使用的“雙特異性的”是指抗原結合蛋白具有兩個不同的抗原結合特異性。除非另有說明,否者列出的雙特異性抗體結合的抗原的順序是任意的。即,例如,術語“抗-PD-L1/PD-1” 、“抗-PD-1/PD-L1”、“PD-L1×PD-1”、“PD-1×PD-L1”、“PD-1-PD-L1”和“PD-L1-PD-1”可互換使用,是指特異性結合PD-L1和PD-1二者的雙特異性抗體。術語本文所使用的“單特異性的”是指具有一個或多個結合位點的抗原結合蛋白(諸如sdAb),每個結合位點都結合同一抗原的同一抗原決定區。
本文所使用的術語“價”是指在抗原結合蛋白中存在指定數量的結合位點。例如天然抗體或全長抗體具有兩個結合位點,並且是二價的。同樣地,術語“三價的”、“四價的”、“五價的”和“六價的”是指在抗原結合蛋白中分別存在兩個結合位點、三個結合位點、四個結合位點、五個結合位點和六個結合位點。
“抗體效應子功能”是指可歸因於抗體的Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異體Fc區)並且隨著抗體同種型的不同而變化的那些生物學活性。抗體效應子功能的實例包括:C1q結合和補體依賴性細胞毒性;Fc受體結合;抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用;細胞表面受體(例如B細胞受體)的下調;和B細胞活化。“降低的或最小化的”抗體效應子功能意指所述抗體效應子功能從野生型或未修飾的抗體降低了至少50%(或者60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%)。抗體效應子功能的確定是業內普通技術人員容易確定和量測的。在一個較佳的實施例中,補體結合、補體依賴性細胞毒性和抗體依賴性細胞毒性的抗體效應子功能受到影響。在一些實施例中,通過消除糖基化的恒定區中的突變而消除效應子功能,例如“效應子減少性突變”。在一方面,效應子減少性突變是CH 2區中的N297A或DANA突變(D265A+N297A)。Shieldset al .,J. Biol. Chem. 276 (9): 6591-6604 (2001)。或者,導致降低或消除的效應子功能的其它突變包括:K322A和L234A/L235A (LALA)。或者,效應子功能可以通過產生技術來降低或消除,諸如在不糖基化的主體細胞(例如大腸桿菌)或其中導致在促進效應子功能方面無效或效果較差的改變的糖基化模式的主體細胞中的表現(Shinkawaet al .,J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473 (2003))。
“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”或ADCC是指一種細胞毒性形式,其中結合到存在於特定細胞毒性細胞(例如自然殺傷(NK)細胞、中性粒細胞和巨噬細胞)上的Fc受體(FcR)上的分泌的Ig使這些細胞毒性效應子細胞能夠特異性結合攜帶抗原的靶細胞,隨後以細胞毒性殺傷該靶細胞。抗體“武裝”細胞毒性細胞,並且是通過此機制殺傷靶細胞所必需的。用於介導ADCC的初級細胞NK細胞僅表現FcγRIII,而單核細胞表現FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血細胞上的Fc表現總結於Ravetch和Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)的第464頁表3中。為了評估感興趣的分子的ADCC活性,可以進行體外ADCC測定,諸如美國專利號5,500,362或5,821,337中所述的測定。對於這類測定有用的效應子細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。或者,或另外地,感興趣的分子的ADCC活性可以在體內例如在動物模型(諸如Clyneset al .,PNAS USA 95:652-656 (1998)中公開的動物模型)中評估。
本文的術語“Fc區”用於定義免疫球蛋白重鏈的C末端區域,包括天然序列Fc區和變異體Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈的Fc區的邊界可以變化,但是人IgG重鏈Fc區通常被定義為從位置Cys226或從Pro230處的胺基酸殘基延伸至其羧基末端。Fc區的C末端離胺酸(依據EU編號系統的殘基447)可以例如在該抗體的產生或純化期間或通過重組工程化改造編碼該抗體的重鏈的核酸被去除。因此,完整抗體的組成可以包含所有K447殘基都被去除的抗體群體、K447殘基都未被去除的抗體群體、以及具有具有和不具有K447殘基的抗體的混合物的抗體群體。用於本文所述的抗體中的合適的天然序列Fc區包括人IgG1、IgG2 (IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“Fc受體”或“FcR”描述結合抗體Fc區的受體。較佳的FcR是天然序列人FcR。此外,較佳的FcR是結合IgG抗體的FcR(γ受體),並且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體,包括這些受體的等位基因變異體和可替代性的剪接形式,FcγRII受體包括FcγRIIA(“活化性受體”)和FcγRIIB(“抑制性受體”),其具有主要在其細胞質結構域中有差異的相似胺基酸序列。活化性受體FcγRIIA在其細胞質結構域中含有免疫受體基於酪胺酸的活化基序(ITAM)。參見M. Daëron,Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)。Ravetch 和Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capelet al .,Immunomethods 4: 25-34 (1994);和de Haaset al .,J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)中綜述了FcR。包括將來鑒定的那些在內的其它FcR涵蓋在本文的術語“FcR”中。
術語“Fc受體”或“Fc”也包括新生兒受體FcRn,其負責將母體IgG轉移到胎兒中。Guyeret al .,J. Immunol. 117: 587 (1976)和Kimet al .,J. Immunol. 24: 249 (1994)。量測與FcRn結合的方法是已知的(參見例如Ghetie和Ward,Immunol. Today 18: (12): 592-8 (1997); Ghetieet al .,Nature Biotechnology 15 (7): 637-40 (1997); Hintonet al .,J. Biol. Chem. 279 (8): 6213-6 (2004); WO 2004/92219 (Hintonet al .))。體內與FcRn的結合和人FcRn高親和力結合多肽的血清半衰期可以被測定,例如在轉基因小鼠或表現人FcRn的轉染的人細胞株中或在施用了具有變異體Fc區的多肽的靈長類動物中測定。WO 2004/42072 (Presta)描述了提高或降低與FcR結合的抗體變異體。還參見例如Shieldset al .,J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)。
“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”是指在補體的存在下裂解靶細胞。經典的補體途徑的激活是通過補體系統的第一成分與結合至其相關抗原的(適當亞類的)抗體的結合起始的。為了評估補體激活,可以進行CDC測定,例如,如Gazzano-Santoroet al .,J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)中所描述的。具有改變的Fc區胺基酸序列和增加或減小的C1q結合能力的抗體變異體在美國專利號6,194,551B1和WO99/51642中描述。那些專利公開的內容通過引用具體併入本文。還參見Idusogieet al .J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)。
“結合親和力”一般是指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合伴侶(例如抗原)之間的非共價相互作用的總和的強度。除非另有說明,否則如在本文中使用的“結合親和力”是指反應結合對成員之間1:1相互作用的內在結合親和力。結合親和力可以由Kd Koff Kon K a 表示。如本文所使用的術語“Koff ”意欲指抗體(或抗原結合結構域)從抗體/抗原複合物解離的離率常數(off rate constant),其由動力選擇裝置測定,以s-1 為單位表現。如本文所使用的術語“Kon ”意欲指抗體(或抗原結合結構域)與抗原締合以形成抗體/抗原複合物的合率常數(on rate constant),以M-1 s-1 為單位表示。如本文所使用的術語平衡解離常數“KD ”或“Kd ”是指特定抗體-抗原相互作用的解離常數,並且描述平衡狀態時佔據抗體分子溶液中存在的所有抗體結合結構域的一半所需的抗原的濃度,並且等於Koff /Kon ,以M為單位表示。Kd 量測假設所有結合劑都在溶液中。在抗體系鏈至細胞壁的的情況下,例如在酵母表現系統中,相應的平衡率常數表達為EC50,其給出Kd 的良好近似值。親和常數Ka 是解離常數Kd 的倒數,以M-1 為單位表示。
解離常數(KD 或Kd )用作表示抗體與抗原的親和力的指示物。例如,可以通過使用多種標記劑標記的抗體的Scatchard方法以及通過使用櫃檯買賣的BiacoreX(Amersham Biosciences製造)量測試劑盒或類似試劑盒,根據試劑盒所附的用戶手動和實驗操作方法進行簡單分析。可以使用這些方法獲得的KD 值以M(摩爾)為單位表示。特異性結合靶標的抗體或其抗原結合片段可以具有例如≤10-5 M、≤10-6 M、≤10-7 M、≤10-8 M、≤10-9 M、≤10-10 M、≤10-11 M或≤10-12 M的解離常數(Kd )。
抗體或抗原結合結構域的結合特異性可以憑經驗通過業內已知的方法來確定。這類方法包括但不限於蛋白質印跡、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIAcore測試和肽掃描。
一半最大抑制濃度(IC50 )是物質(諸如抗體)在抑制特定生物學或生物化學功能方面的有效性的估量。其表示抑制給定生物學過程(例如PD-L1與B7-1之間的結合,或過程的成分,即酶、細胞、細胞受體或微生物)的一半需要多少特定藥物或其它物質(抑制劑,諸如抗體)。該值通常表示為摩爾濃度。IC50 與用於拮抗藥物或其它物質(諸如抗體)的EC50 相當。EC50 也表示在體內獲得最大效應的50%所需的血漿濃度。如本文所使用的“IC50 ”用於表示在體外中和50%的抗原生物活性(諸如PD-L1生物活性)所需的抗體的有效濃度。IC50 或EC50 可以通過生物測定,諸如通過FACS分析的配體結合抑制(競爭結合測定)、基於細胞的細胞因子釋放測定或放大化學發光親和均相檢測(AlphaLISA)來量測。
關於肽、多肽或抗體序列的“胺基酸序列同一性百分比(%)”和“同源性”被定義為比對序列和引入空位(如果需要的話)以實現最大序列同一性百分比後,並且不考慮作為序列同一性的一部分的任何保守性取代,候選序列中與特定肽或多肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分比。用於確定胺基酸序列同一性百分比的目的的比對可以以業內技術中的多種方式實現,例如,使用公眾可得的計算機軟件諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN™ (DNASTAR)軟件。熟習此項技術者可以確定用於量測比對的適當參數,包括實現被比較的序列全長範圍內的最大比對所需要的任何算法。
編碼本文所述的構建體、抗體或其抗原結合片段的“分離的”核酸分子是從通常與其在其產生環境中相關的至少一種污染核酸分子中鑒定並分離的核酸分子。較佳地,分離的核酸不與在產生環境中相關的所有成分相關聯。編碼本文所述的多肽和抗體的分離的核酸分子是除了其天然存在的形式或設置(setting)之外的形式。因此,分離的核酸分子區別于在細胞中天然存在的編碼本文所述的多肽和抗體的核酸。分離的核酸包括在通常含有該核酸分子的細胞中含有的核酸分子,但該核酸分子存在于染色體外或存在于不同于其天然染色體位置的染色體位置。
如本文所使用的術語“載體”是指能夠增生與其連接的另一核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製的核酸結構的載體以及被併入已經引入其的主體細胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導與其可操作地連接的核酸的表現。這類載體在本文中被稱為“表現載體”。
如本文所使用的術語“轉染的”或“轉化的”或“轉導的”是指將外源性核酸轉入或引入主體細胞的方法。“轉染的”或“轉化的”或“轉導的”細胞是已經用外源性核酸轉染、轉化或轉導的細胞。該細胞包括原代個體細胞及其後代。
術語“主體細胞”、“主體細胞株”和“主體細胞培養物”可互換使用,是指其中已經引入了外源性核酸的細胞,包括這類細胞的後代。主體細胞包括“轉化子”和“轉化細胞”,其包括原代轉化細胞和不考慮傳代次數的從其來源的後代。後代可以不完全與親本細胞的核酸內容完全相同,而是可以含有突變。本文包括具有與最初轉化細胞中篩選的或選擇的功能或生物學活性相同的功能或生物學活性的突變後代。
“輔助環境(adjuvant setting)”是指個體已經具有癌症史,並且通常(但不必須)已經對治療作出響應的臨床環境,所述治療包括但不限於手術(例如手術切除)、放射療法和化學療法。但是,由於他們的癌症史,這些個體被認為處於發展該疾病的風險中。在“輔助環境”中治療或施用是指一種後續治療模式。風險程度(例如當輔助環境中的個體被認為“高風險”或“低風險”)取決於若干因素,最常見的是首次治療時的疾病程度。
“新輔助環境”是指該方法在主要的/決定性的治療之前實施的臨床環境。
術語“藥物製劑”或“藥物組合物”是指處於允許活性成分的生物學活性有效的形式並且不含對將施用該製劑的個體具有不可接受的毒性的額外組分的製劑。這類製劑是無菌的(sterile)。“無菌”製劑是無菌的(aseptic)或不含所有活的微生物及其孢子。
認為本文所述的本發明的實施例包括“由實施例組成”和/或“基本上由實施例組成”。
本文中提及“約”一個數值或參數包括(並且描述)涉及該數值或參數本身的變化。例如,提及“約X”的描述包括“X”的描述。
如本文所使用的,提及“不是”一個數值或參數通常意指並描述“除了”一個數值或參數之外。例如,該方法不用於治療X型的癌症意指該方法用於治療除了X之外的類型的癌症。
本文所使用的術語“約X-Y”具有與“約X至約Y”相同的含義。
如本文和在所附申請專利範圍中所使用的,除非上下文另有明確說明,否則單數形式“一”、“或”和“所述”包括複數指示物。
II. PD-L1 構建體
PD-L1 單結構域抗體部分
本文所述的分離的抗PD-L1構建體包含特異性識別PD-L1的單結構域抗體(sdAb)部分(或“抗PD-L1 sdAb”)。在一些實施例中,分離的抗-PD-L1構建體是抗PD-L1 sdAb。
單結構域抗體
示例性的sdAb包括但不限於來自僅重鏈抗體的重鏈可變結構域(例如駱駝科的VH H(重鏈抗體的重鏈的可變結構域)或軟骨魚的VNAR (鯊魚新抗原受體的可變結構域))、天然缺少輕鏈的結合分子、衍生自習用四鏈抗體的單結構域(諸如VH 或VL )、人源化僅重鏈抗體、由表現人重鏈片節段的轉基因小鼠或大鼠產生的人單結構域抗體和除了衍生自抗體的那些之外的工程改造的結構域和單結構域支架。sdAb可以衍生自任何物種,包括但不限於小鼠、大鼠、人、駱駝、美洲駝、七鰓鰻、魚、鯊魚、山羊、兔和牛。本文考慮的單結構域抗體也包括來自除駱駝科和鯊魚之外的物種的天然存在的單結構域抗體分子。
在一些實施例中,sdAb衍生自天然存在的被稱為缺少輕鏈的重鏈抗體的單結構域抗原結合分子(在本文中液被稱為“僅重鏈抗體”或“HCAb”)。這樣的單結構域分子公開在例如WO 94/04678和Hamers-Casterman, C.et al . (1993)Nature 363:446-448中。為了清楚的原因,衍生自天然缺少輕鏈的重鏈分子的可變結構域在本文中被稱為VH H,以將其與四鏈免疫球蛋白的習用VH區別開。這樣的VH H分子可以衍生自在駱駝科物種(例如駱駝、美洲駝、小羊駝、單峰駱駝、羊駝和駝馬)中產生的抗體。除了駱駝科之外,其它物種也可以產生天然缺少輕鏈的重鏈分子,並且這樣的VH H在本申請的範圍內。
在一些實施例中,sdAb衍生自軟骨魚中發現的免疫球蛋白的可變區。例如,sdAb可以衍生自鯊魚血清中發現的被稱為新抗原受體(NAR)的免疫球蛋白同種型。產生衍生自NAR(“IgNAR”)的可變區的單結構域分子的方法記載於WO 03/014161和Streltsov (2005)Protein Sci. 14:2901-2909中。
在一些實施例中,sdAb是重組的、CDR移植的、人源化的、駱駝源化的(camelized)、去免疫的(de-immunized)和/或體外產生的(例如通過噬菌體展示選擇的)。在一些實施例中,可以通過架構區中的特定胺基酸殘基的“駱駝源化”來改變架構區的胺基酸序列。駱駝源化是指由在重鏈抗體的VH H結構域的一個或多個相應位置處存在的一個或多個胺基酸殘基取代或置換來自習用四鏈抗體的(天然存在的)VH結構域的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基。這可以以本身已知的方式進行,其對於熟習此項技術者來說是清楚的,例如在本文進一步描述的基礎上。如本文所定義的,這樣的“駱駝源化”置換較佳被插入在形成VH0VL界面和/或在VH-VL界面處存在的胺基酸位置處,和/或在所謂的駱駝科特點殘基處(參見例如WO 94/04678, Davies和Riechmann FEBS Letters 339: 285-290, 1994; Davies和Riechmann Protein Engineering 9 (6): 531-537, 1996; Riechmann J. Mol. Biol. 259: 957-969, 1996; 以及Riechmann和Muyldermans J. Immunol. Meth. 231: 25-38, 1999)。
在一些實施例中,sdAb是由表現人重鏈節段的轉基因小鼠或大鼠產生的人sdAb。參見例如US20090307787A1、美國專利號8,754,287、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794。在一些實施例中,sdAb是親和力成熟的。
在一些實施例中,天然存在的抗特定抗原或靶標的VH H結構域可以從駱駝科VHH 序列的(天然或免疫)文庫中獲得。這類方法可以包括或可以不包括使用一種或多種本身已知的篩選技術使用所述抗原或靶標或其至少一部分、片段、抗原決定簇或抗原決定區來篩選這樣的文庫。這樣的文庫或技術例如記載於WO 99/37681、WO 01/90190、WO 03/025020和WO 03/035694。或者,可以使用衍生自(天然或免疫)VH H文庫的改善的合成或半合成文庫,諸如通過諸如隨機誘變和/或CDR改組(shuffling)的技術從(天然或免疫)VH H文庫獲得的VHH 文庫,如例如WO 00/43507中所描述的。
在一些實施例中,sdAb從習用四鏈抗體產生。參見,例如EP 0 368 684, Ward et al. (Nature 1989 Oct. 12; 341 (6242): 544-6), Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490; WO 06/030220; 和WO 06/003388。
由於sdAb的獨特特性,使用VH H結構域作為單抗原結合蛋白或作為抗原結合結構域(即,作為較大蛋白質或多肽的一部分)提供超過習用VH 和VL 、scFv和習用抗體片段(諸如Fab或(Fab’)2)的大量顯著優勢:1) 僅單結構域被需要用於以高度親和力結合抗原,因此不存在具有第二結構域的需求,也不存在保證這兩個結構域以正確的空間組態和構造存在的需求(例如不存在在折疊期間將重鏈和輕鏈配對的需求,不存在使用特別設計的連接子的需求諸如對於scFv);2) VH H結構域和其它sdAb可以從單一基因表現,並且不需要翻譯後折疊或修飾;3) VH H結構域和其它sdAb可以被容易地工程改造為多價和/或多特異性形式(諸如在本申請中所述的那些);4) VH H結構域和其它sdAb是高度可溶的,並且不具有聚集的傾向(正如由Wardet al., Nature . 1989 Oct 12;341(6242):544-6所描述的小鼠衍生的“dAb”);5) VH H結構域和其它sdAb是對熱、pH、蛋白酶和其它變性劑或變性條件高度穩定的;6) VH H結構域和其它sdAb易於製備並且製備成本相對較低(甚至在大生產規模下)諸如使用微生物發酵,不存在使用(生產例如習用抗體片段所需要的)哺乳動物表現系統的需求;7) VH H結構域和其它sdAb與習用四鏈抗體及其抗原結合片段相比相對較小(大約15 kDa,或比習用IgG小10倍),因此具有高(較高)的組織滲透能力,諸如用於實體瘤和其它緻密組織;和8) VH H結構域和其它sdAb能夠展示出所謂的“凹處結合特性”(由於它們與習用VH 結構域相比延長的CDR3環),並且因此能夠接近對於習用四鏈抗體及其抗原結合片段不可接近的靶標和抗原決定區,例如,已經表明VH H結構域和其它sdAb能夠抑制酶(參見例如WO1997049805; Transueet al. , Proteins. 1998 Sep 1;32(4):515-22; Lauwereyset al. , EMBO J. 1998 Jul 1;17(13):3512-20)。
PD-L1
與結構上與相關B7家族成員相似,PD-L1蛋白含有胞外IGV和IgC結構域和短的細胞質區。PD-L1具有與CD28的細胞內結構域相似的細胞內結構域,其缺少固有的催化活性並且含有一個能夠結合 PI3K、PP2A和SHP-2的YVKM基序,和一個能夠結合含有SH3的蛋白質的富含脯胺酸的基序。
人PD-L1的胺基酸序列以Genbank登錄號Q9NZQ7公開。胺基酸1-18的區域是前導肽;19-238是細胞外結構域;239-259是跨膜結構域;並且260-290是細胞質結構域。
特定的人PD-L1序列的胺基酸序列通常與Genbank登錄號Q9NZQ7的人PD-L1具有至少90%的同一性,並且含有當與其它物種(例如小鼠)的PD-L1胺基酸序列相比時將該胺基酸序列鑒定為人的胺基酸序列。在一些實施例中,人PD-L1的胺基酸序列可以與Genbank登錄號Q9NZQ7的PD-L1具有至少約95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在一些實施例中,人PD-L1序列會表現出與Genbank登錄號Q9NZQ7的PD-L1相比不多於10個胺基酸的差異。在一些實施例中,人PD-L1可以表現出與Genbank登錄號Q9NZQ7的PD-L1相比不多於5、4、3、2或1個胺基酸的差異。同一性百分比可以如本文所述來確定。在一些實施例中,本文所述的抗PD-L1 sdAb部分特異地識別與Genbank登錄號Q9NZQ7的PD-L1具有100%胺基酸序列同一性的PD-L1多肽。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分特異地識別包含SEQ ID NO: 441的胺基酸序列的PD-L1多肽。
在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分可以與來自除了人之外的物種的PD-L1或結構上與人PD-L1相關的其它蛋白質(例如人PD-L1同源物)交叉反應。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分對於人PD-L1是完全特異的,並且不展示出物種交叉反應性或其它類型的交叉反應性。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分特異地識別人PD-L1的可溶同等型(isoform)。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分特異地識別人PD-L1的膜結合同等型(SEQ ID NO: 441)。
在一些實施例中,本文所述的抗PD-L1 sdAb部分特異地識別PD-L1的細胞外結構域(ECD)。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分特異地識別PD-L1細胞外結構域(ECD)的N末端部分。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分特異地識別PD-L1細胞外結構域(ECD)的C末端部分。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分特異地識別PD-L1細胞外結構域(ECD)的中間部分。在一些實施例中,被抗PD-L1 sdAb部分特異地識別的PD-L1的細胞外結構域的胺基酸序列與Genbank登錄號Q9NZQ7的PD-L1的細胞外結構域具有至少約95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在一些實施例中,被抗PD-L1 sdAb部分特異地識別的PD-L1的細胞外結構域的胺基酸序列與Genbank登錄號Q9NZQ7的PD-L1的細胞外結構域具有100%的同一性。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分特異地識別包含SEQ ID NO: 442的胺基酸序列的PD-L1多肽。
抗體親和力
抗體或抗原結合結構域的結合特異性可以通過實驗通過業內已知的方法來確定。這樣的方法包括但不限於免疫印跡、ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-, EIA-, BIAcore測試和肽掃描。
在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分與PD-L1之間結合的Kd 為約10-5 M至約10-6 M,約10-6 M至約10-7 M,約10-7 M至約10-8 M,約10-8 M至約10-9 M,約10-9 M至約10-10 M,約10-10 M至約10-11 M,約10-11 M至約10-12 M,約10-5 M至約10-12 M,約10-6 M至約10-12 M,約10-7 M至約10-12 M,約10-8 M至約10-12 M,約10-9 M至約10-12 M,約10-10 M至約10-12 M,約10-5 M至約10-11 M,約10-7 M至約10-11 M,約10-8 M至約10-11 M,約10-9 M至約10-11 M,約10-5 M至約10-10 M,約10-7 M至約10-10 M,約10-8 M至約10-10 M,約10-5 M至約10-9 M,約10-7 M至約10-9 M,約10-5 M至約10-8 M,或約10-6 M至約10-8 M。
在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分與PD-L1之間結合的Kon 為約102 M-1 s-1 至約104 M-1 s-1 ,約104 M-1 s-1 至約106 M-1 s-1 ,約106 M-1 s-1 至約107 M-1 s-1 ,約102 M-1 s-1 至約107 M-1 s-1 ,約103 M-1 s-1 至約107 M-1 s-1 ,約104 M-1 s-1 至約107 M-1 s-1 ,約105 M-1 s-1 至約107 M-1 s-1 ,約103 M-1 s-1 至約106 M-1 s-1 ,或約104 M-1 s-1 至約106 M-1 s-1
在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分與PD-L1之間結合的Koff 為約1 s-1 至約10-2 s-1 ,約10-2 s-1 至約10-4 s-1 ,約10-4 s-1 至約10-5 s-1 ,約10-5 s-1 至約10-6 s-1 ,約1 s-1 至約10-6 s-1 ,約10-2 s-1 至約10-6 s-1 ,約10-3 s-1 至約10-6 s-1 ,約10-4 s-1 至約10-6 s-1 ,約10-2 s-1 至約10-5 s-1 ,或約10-3 s-1 至約10-5 s-1
在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分的IC50 在使用0.12 nM PD-1和0.2 nM PD-L1的放大化學發光親和均相檢測(AlphaLISA)中為小於10 nM。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分的IC50 在通過FACS分析的配體結合的抑制(競爭結合測定)或基於細胞的細胞因子釋放測定中為小於500 nM。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分的IC50 為小於1 nM,約1 nM至約10 nM,約10 nM至約50 nM,約50 nM至約100 nM,約100 nM至約200 nM,約 200 nM至約300 nM,約300 nM至約400 nM,或約400 nM至約500 nM。
嵌合抗體或人源化抗體
在一些實施例中,本文提供的抗PD-L1抗體是嵌合抗體。某些嵌合抗體記載於例如美國專利號4,816,567;和Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81:6851-6855 (1984)中。在一個實例中,嵌合抗體包含非人可變區(例如衍生自駱駝科物種諸如美洲駝的可變區)和人恒定區。在一個另外的實例中,嵌合抗體是“類型轉換的”抗體,其中類或亞類已經從親本抗體的類或亞類改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在一些實施例中,嵌合抗體是人源化抗體。一般地,非人抗體被人源化以減少對人的免疫原性,同時保留親本非人抗體的特異性和親和力。一般地,人源化抗體包含一個或多個可變結構域,其中HVR(例如CDR)(或其部分)衍生自非人抗體,並且FR(或其部分)衍生自人抗體序列。人源化抗體任選地還會包含人恒定區的至少一部分。在一些實施例中,人源化抗體中的一些FR殘基被來自非人抗體(例如HVR殘基從其衍生的抗體)的相應殘基置換,例如,以恢復或改善抗體特異性或親和力。
人源化抗體和其製備方法綜述於例如Almagro和Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)中,並且在以下中進一步描述:例如Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al.,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 美國專利號5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321和7,087,409; Kashmiriet al .,Methods 36:25-34 (2005) (描述SDR (a-CDR)移植); Padlan,Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (描述“重新表面化(resurfacing)”); Dall’Acqua et al.,Methods 36:43-60 (2005) (描述“FR改組”);和Osbourn et al.,Methods 36:61-68 (2005)和Klimka et al.,Br. J. Cancer , 83:252-260 (2000) (描述FR改組(shuffling)的“導向選擇” 方法)。
可用於人源化的人架構區包括但不限於:使用“最佳擬合”方法選擇的架構區(參見例如Sims et al.J. Immunol. 151:2296 (1993));從重鏈可變區或輕鏈可變區的特定亞群的人抗體的共有序列衍生的架構區(參見例如Carter et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 89:4285 (1992); 和Presta et al.J. Immunol. , 151:2623 (1993));人成熟(體細胞突變的(somatically mutated))架構區或人種系架構區(參見例如Almagro 和 Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008));和衍生自篩選性FR文庫的架構區(參見例如Baca et al.,J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)和Rosok et al.,J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996))。
在一些實施例中,sdAb是經修飾的,諸如人源化的,不區分該結構域對抗原的天然親和力,同時降低其對於不同物種的免疫原性。例如,美洲駝抗體的抗體可變結構域(VH H)的胺基酸殘基可以被確定,並且(例如架構區中的)一個或多個駱駝科胺基酸用在人共有序列中存在的其人對應物取代,而不會存在多肽喪失其典型特徵的情況,即,人源化不顯著影響得到的多肽的抗原結合能力。駱駝科單結構域抗體的人源化需要引入和誘變單多肽鏈中的有限數量的胺基酸。這與scFv、Fab'、(Fab')2和IgG的人源化形成對比,後者需要在兩條鏈(輕鏈和重鏈)中引入胺基酸改變,和需要保留兩條鏈的組裝。
包含VH H結構域的單結構域抗體可以被人源化為具有類似人的序列。在一些實施例中,本文使用的VH H結構域的FR區包含與人VH架構區的至少約50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%或更多中的任一個的胺基酸序列同源性。人源化的VHH結構域的一個示例性類型的特徵在於:VH H攜帶來自由以下組成的組的胺基酸:根據Kabat編號的在位置45處的甘胺酸、丙胺酸、擷胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天門冬醯胺酸或麩醯胺酸,諸如例如L45,和在位置103處的色胺酸。同樣地,屬於該類的多肽表現出高度的與人VH架構區的胺基酸序列同源性,並且所述多肽可能被直接施用於人,而預期不具有由其產生的不想要的免疫應答,並且不需要負擔進一步的人源化。
人源化的駱駝科單結構域抗體的另一示例性類型已經記載於WO 03/035694,含有通常在人來源的或來自其它物種的習用抗體中發現的疏水性FR2殘基,但是通過在位置103處置換來自雙鏈抗體的VH 中存在的保守性色胺酸殘基的帶電荷精胺酸殘基來補償在親水性方面的這種損失。同樣地,屬於這兩類的肽顯示出與人VH 架構區的高度胺基酸序列同源性,並且所述肽可以被直接施用於人,同時預期不會有由其產生的不需要的免疫應答,並且不會負擔進一步的人源化。
人抗體
在一些實施例中,本文提供的抗PD-L1 sdAb部分是人抗體。人抗體可以使用業內已知的多種技術產生。一般地,人抗體記載於van Dijk和van de Winkel,Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)以及Lonberg,Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)。能夠產生全人單結構域抗體的轉基因小鼠或大鼠是業內已知的。參見,例如,US20090307787A1,美國專利號8,754,287, US20150289489A1, US20100122358A1和WO2004049794。
人抗體可以通過將免疫原施用至轉基因動物,所述轉基因動物已經被修飾以響應於抗原攻毒而產生完整人抗體或具有人可變區的完整抗體。這樣的動物通常含有人免疫球蛋白基因座的全部或一部分,其替換內源性免疫球蛋白基因座,或者在染色體外存在或被隨機整合到該動物的染色體中。在這樣的轉基因小鼠中,內源性免疫球蛋白基因座通常已經被滅活。對於用於從轉基因動物獲得轉基因抗體的方法的綜述,參見Lonberg,Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。還參見,例如記載XENOMOUSETM 技術的美國專利號6,075,181和6,150,584;記載HUMAB®技術的美國專利號5,770,429;記載K-M MOUSE®技術的美國專利號7,041,870;和記載VELOCIMOUSE®技術的美國專利申請公開號US 2007/0061900。來自由這類動物產生的完整抗體的人可變區可以被進一步修飾,例如通過與不同的人恒定區組合。
人抗體還可以通過基於雜交瘤的方法來製造。用於產生人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人種間骨髓瘤細胞株已經被記載。(參見,例如KozborJ. Immunol. , 133: 3001 (1984); Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications , pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 以及Boerner et al.,J. Immunol ., 147: 86 (1991).)通過人B細胞雜交瘤技術產生的人抗體還記載於Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 103:3557-3562 (2006)。其它方法包括例如在美國專利號7,189,826(描述從雜交瘤細胞株產生單克隆人IgM抗體)和Ni,Xiandai Mianyixue , 26(4):265-268 (2006)(描述人-人雜交瘤)中記載的那些。人雜交瘤技術(三源雜交瘤技術)還記載於Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology , 20(3):927-937 (2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology , 27(3):185-91 (2005)。
人抗體還可以通過分離從人源性噬菌體展示文庫選擇的Fc克隆可變結構域序列來產生。然後這樣的可變結構域序列可以與需要的人恒定結構域組合。用於從抗體文庫中選擇人抗體的技術在下文中描述。
用於獲得針對特定抗原或靶標的VH H序列的一項技術包括使用任何合適的本身已知的技術(諸如本文所述的任何方法或雜交瘤技術),適當地免疫能夠表現重鏈抗體的轉基因哺乳動物(即,以產生免疫應答和/或針對所述抗原或靶標的重鏈抗體),從含有所述VH H序列(編碼所述VH H序列的核酸序列)的所述轉基因哺乳動物中獲得合適的生物樣品(諸如血液樣品、血清樣品或B細胞樣品),然後從所述樣品開始產生針對所述抗原或靶標的VH H序列。例如,為此目的,可以使用表現重鏈抗體的小鼠和記載於WO 02/085945, WO 04/049794和WO 06/008548以及Janssens et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006 Oct. 10; 103(41):15130-5中的其它方法和技術。例如,這樣的表現重鏈抗體的小鼠可以表現具有任何合適的(單個)可變結構域的重鏈抗體,諸如來自天然來源的(單個)可變結構域(例如人(單個)可變結構域、駱駝科(單個)可變結構域或鯊魚(單個)可變結構域),以及例如合成的或半合成的(單個)可變結構域。
源自文庫的抗體
本申請的抗體可以通過對組合文庫進行篩選以選出具有所需一種或多種活性的抗體來分離。例如,用於產生噬菌體展示文庫和對這類文庫進行篩選以選出具有所需結合特性的抗體多種方法是業內已知的。這類方法綜述於例如Hoogenboom et al.Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001),並且在例如以下中進一步描述:McCafferty et al.,Nature 348:552-554; Clackson et al.,Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al.,J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks和Bradbury, inMethods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al.,J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al.,J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004);以及Lee et al.,J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)。用於構建單結構域抗體文庫的方法已經被描述,例如參見美國專利號7371849。
在某些噬菌體展示方法中,全部VH和VL基因通過聚合酶鏈式反應(PCR)分開克隆,並且被隨機重組在噬菌體文庫中,然後該噬菌體文庫能夠被篩選以選出抗原結合噬菌體,如在Winter et al.,Ann. Rev. Immunol. , 12: 433-455 (1994)中所記載的。噬菌體通常展示作為單鏈Fv(scFv)片段或作為Fab片段的抗體片段。來自被免疫的來源的文庫提供對免疫原的高親和力抗體,而不需要構建雜交瘤。或者,可以(例如從人)克隆天然全套抗體以在不進行任何免疫的情況下提供非自身和自身抗原的廣泛的單一來源的抗體,如Griffiths et al.,EMBO J, 12: 725-734 (1993)所記載的。最後,還可以通過從幹細胞克隆未重排的V基因節段並且使用含有隨機序列的PCR引子來編碼高度可變CDR3區並且完成體外重排,而合成性地製造天然文庫,如Hoogenboom 和Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)所記載的。記載人抗體噬菌體文庫的專利公開包括例如:美國專利號5,750,373和美國專利公開號2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
從人抗體文庫分離的抗體或抗體片段在本文中被認為是人抗體或人抗體片段。
生物活性
本文所述的抗PD-L1 sdAb部分的生物活性可以通過量測其半最大抑制濃度(IC50 )來確定,這種方法量測抗體在抑制特定生物學或生物化學功能(諸如抑制PD-L1和其受體PD-1之間的結合)方面的有效性。例如,這裡的IC50 可以用於表示體外中和50%的PD-L1生物活性所需要的抗PD-L1 sdAb的有效濃度。IC50 與用於拮抗性藥物或其它物質(諸如抗體)的EC50 相當。 EC50 還表示體內獲得最大效果的50%所需的血漿濃度。IC50 或EC50 可以通過業內已知的測定方法來量測,例如生物測定,諸如通過FACS分析的配體結合的抑制(競爭結合測定)、基於細胞的細胞因子釋放測定或放大化學發光親和均相檢測(AlphaLISA)。
例如,配體結合的阻斷可以使用流式細胞術來研究(還參見實例1)。可以從貼壁培養瓶中解離表現人PD-L1的CHO細胞,並且將其與用於測試的可變濃度的抗PD-L1 sdAb和恒定濃度的標記的PD-1蛋白(諸如生物素標記的hPD-1/Fc蛋白)混合。可以採用抗PD-L1抗體陽性對照,諸如Tecentriq®。使該混合物在室溫平衡30分鐘,用FACS緩衝液(含有1%BSA的PBS)洗滌三次。然後,添加特異性識別恒定濃度的標記的PD-1蛋白的抗體(諸如PE/Cy5鏈黴親和素第二抗體),並且在室溫溫育15分鐘。用FACS緩衝液洗滌細胞,並且通過流式細胞術分析。用Prism(GraphPad軟件, San Diego, CA)使用非線性回歸分析數據以計算IC50 。來自競爭測定的結果會證實抗PD-L1 sdAb在抑制標記的PD-1和PD-L1之間的相互作用方面的能力。
抗PD-L1 sdAb部分的生物活性還可以通過基於PD-L1的阻斷細胞因子釋放的測定來測試(還參見實例1)。PD-1信號傳導通常對細胞因子產生比對細胞增生具有更大的影響,對IFN-γ、TNF-α和IL-2產生具有顯著影響。PD-1介導的抑制性信號傳導還取決於TCR信號傳導的強度,在低水平的TCR刺激下產生更大程度的抑制。該降低可以由通過藉由CD28(Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1027-34 (2000))或IL-2的存在(Carter et al., Eur. J. Immunol. 32: 634-43 (2002))的共同刺激來克服。另外,若干研究顯示出不依賴於PD-1的PD-L1或PD-L2的受體。B7.1已經被鑒定為PD-L1的結合伴侶(Butte et al., Immunity 27: 111-22 (2007))。化學交聯研究表明,PD-L1和B7.1可以通過它們的IgV樣結構域相互作用。B7.1:PD-L1相互作用可以將抑制信號誘導進入T細胞中。作為結果,通過PD-L1的信號傳導的拮抗作用(包括阻斷PD-L1與PD-1、B7.1或二者的相互作用,由此防止PD-L1向T細胞和其它抗原呈遞細胞發出負共刺激信號)可能增強響應感染(例如急性和慢性)的免疫力和腫瘤免疫力。另外,本發明的抗PD-L1抗體可以與PD-1:PD-L1信號傳導中的其它組成的拮抗劑相結合。因此,通過抗PD-L1抗體的PD-L1途徑的阻斷可以使用監測T細胞增生、IFN-γ釋放或IL-2分泌的多種生物測定來研究。
例如,將PD-1效應子細胞(用人PD-1蛋白和NFAT螢光素酶穩定轉染的Jurkat細胞)和CHO-K1/人CD274(穩定表現人CD80的CHO-K1)混合在孔中。將不同濃度的抗-PD-L1 sdAb添加到每個孔中。不含有抗體可以用作背景對照。可以採用陰性對照(諸如人IgG)和陽性對照(諸如Tecentriq®)。在37°C/5% CO2 培養箱中溫育24小時後,從每個測試孔中取出培養基用於IL-2分泌量測(Cisbio)。量測每個測試抗體的EC50 值,這會反應測試抗PD-L1 sdAb在阻斷Jurkat細胞上的PD-1與PD-L1之間相互作用因此抑制T細胞的IL-2產生方面的能力。
在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分阻斷或拮抗由PD-L1配體轉導的信號。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分能夠結合至PD-L1上的抗原決定區以抑制PD-L1與PD-1的相互作用。在一些實施例中,在抗體結合位點與PD-L1配體結合位點的比率大於1:1並且抗體的濃度大於10-8 M的條件下,抗PD-L1 sdAb部分能夠將PD-L1與其受體PD-1的結合降低至少約5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、99%或99.9%中的任一個。
在一些實施例中,提供了一種抗PD-L1 sdAb部分,其包含CDR1,其包含SEQ ID NO: 51-100中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 151-200中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 251-300中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分與PD-L1之間的結合的Kd 為約10-5 M至約10-12 M (諸如約10-7 M至約10-12 M,或約10-8 M至約10-12 M)。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分是駱駝科的、嵌合的、人的、部分人源化的或全部人源化的。
在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分包含CDR3,其包含SEQ ID NO: 251-300中任一個的胺基酸序列,並且所述胺基酸置換在CDR1和/或CDR2中。
因此,在一些實施例中,提供了一種抗PD-L1 sdAb部分,其包含CDR1,其包含SEQ ID NO: 51-100中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 151-200中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 251-300中任一個的胺基酸序列。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分與PD-L1之間的結合的Kd 為約10-5 M至約10-12 M (諸如約10-7 M至約10-12 M,或約10-8 M至約10-12 M)。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分是駱駝科的、嵌合的、人的、部分人源化的或全部人源化的。
在一些實施例中,提供了一種抗PD-L1 sdAb部分,其包含CDR1,其包含SEQ ID NO: 51-100中任一個的胺基酸序列;CDR2,其包含SEQ ID NO: 151-200中任一個的胺基酸序列;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 251-300中任一個的胺基酸序列。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分與PD-L1之間的結合的Kd 為約10-5 M至約10-12 M (諸如約10-7 M至約10-12 M,或約10-8 M至約10-12 M)。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分是駱駝科的、嵌合的、人的、部分人源化的或全部人源化的。
本文所記錄的CDR的序列提供在表15中。
CDR可以以多種成對組合的方式組合,以產生大量抗PD-L1 sdAb部分。
抗PD-L1 sdAb部分可以在一個或多個FR序列中包含一個或多個“標記殘基”。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分可以包含VH H結構域,其包含以下中的任一個的胺基酸序列:a-1)位置37處的胺基酸殘基選自下組:F、Y、L、I和V(諸如Y或諸如F);a-2)位置44處的胺基酸殘基選自下組:A、G、E、D、G、Q、R、S和L(諸如G、E或Q);a-3)位置45處的胺基酸殘基選自下組:L、R和C(諸如L或R);a-4)位置103處的胺基酸殘基選自下組:G、W、R和S(諸如W或R,或諸如W);a-5)位置108處的胺基酸殘基是Q;或者b-1)位置37處的胺基酸殘基選自下組:F、Y、L、I和V(諸如Y或諸如F);b-2)位置44處的胺基酸殘基選自下組:E和Q;b-3)位置45處的胺基酸殘基是R;b-4)位置103處的胺基酸殘基選自下組:G、W、R和S(諸如W);b-5)位置108處的胺基酸殘基選自下組:Q和L(諸如Q);其中所述胺基酸位置按照Kabat編號。應當注意的是,在按照Kabat編號的胺基酸位置37、44、45、103和108處的這些“標記殘基”應用于天然VH H序列的抗PD-L1 sdAb部分,並且能夠在人源化期間被置換。例如,按照Kabat編號的胺基酸位置108處的Q可以任選地被人源化為L。其它人源化的置換對熟習此項技術者來說是清楚的。例如,可能可用的人源化置換可以通過以下步驟來確定:將天然存在的VH H的FR序列與一個或多個緊密相關的人VH 的相應FR序列進行比較,然後使用業內已知的方法(也如本文所述的)將這樣的可能有用的人源化置換中的一個或多個引入所述VH H中。可以測試所得到的人源化VH H序列的PD-L1結合親和力、穩定性、表現的容易程度和表現水平、和/或其它需要的特性。可能的殘基置換還可以來源於抗體VH 結構域,其中VH/VL界面包含一個或多個高度帶電荷的胺基酸殘基。本文所述的抗PD-L1 sdAb部分可以被部分或全部人源化。較佳地,所得到的人源化抗PD-L1 sdAb以本文所述的Kd 、Kon 、Koff 與PD-L1結合。
在一些實施例中,提供了一種包含VH H結構域的抗PD-L1 sdAb部分,所述VH H結構域包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列或其與SEQ ID NO: 351-400中任一個具有至少約80%(諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中的任一個)序列同一性的變異體。在一些實施例中,提供了一種包含VH H結構域的抗PD-L1 sdAb部分,所述VH H結構域包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列或其在VH H結構域中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換的變異體。在一些實施例中,所述包含VH H結構域(其包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列或其變異體)的抗PD-L1 sdAb部分,包含在多個CDR(諸如SEQ ID NO: 351-400中任一個的CDR1和/或CDR2和/或CDR3)中的胺基酸置換。在一些實施例中,所述包含VH H結構域(其包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列或其變異體)的抗PD-L1 sdAb部分,包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的CDR1、CDR2和CDR3,並且所述胺基酸置換在FR(諸如SEQ ID NO: 351-400中任一個的FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4)中。
在一些實施例中,提供了一種抗PD-L1 sdAb部分(下文稱為“競爭性抗PD-L1 sdAb部分”或“競爭性抗PD-L1 sdAb”),其與本文所述的抗PD-L1 sdAb部分的任一個競爭特異性結合PD-L1。在一些實施例中,競爭性結合可以使用ELISA測定來確定。例如,在一些實施例中,提供了一種抗PD-L1 sdAb部分,其與包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列的抗PD-L1 sdAb部分競爭特異性結合PD-L1。舉另一個例子,在一些實施例中,提供了一種抗PD-L1 sdAb部分,其與包含CDR1、CDR2和CDR3的抗PD-L1 sdAb部分競爭特異性結合PD-L1,所述CDR1包含SEQ ID NO: 51-100中任一個的胺基酸序列,所述CDR2包含SEQ ID NO: 151-200中任一個的胺基酸序列,所述CDR3包含SEQ ID NO: 251-300中任一個的胺基酸序列。在一些實施例中,競爭性抗PD-L1 sdAb部分與PD-L1之間的結合的Kd 為約10-5 M至約10-12 M (諸如約10-7 M至約10-12 M,或約10-8 M至約10-12 M)。在一些實施例中,競爭性抗PD-L1 sdAb部分是駱駝科的、嵌合的、人的、部分人源化的或全部人源化的。
包含所述抗 PD-L1 sdAb 部分的構建體
包含所述抗PD-L1 sdAb部分的抗PD-L1構建體可以是任何可能的形式。
在一些實施例中,包含所述抗PD-L1 sdAb部分的抗PD-L1構建體可以進一步包含額外的多肽序列,諸如一個或多個抗體部分、或免疫球蛋白的Fc片段。這樣的額外的多肽序列可以改變或可以不改變或者以其他方式影響所述sdAb的(生物學)特性,並且可以向或可以不向本文所述的sdAb增加額外的功能。在一些實施例中,所述額外的多肽序列為本發明的sdAb賦予一個或多個所需的特性或功能。在一些實施例中,所述抗-PD-L1構建體是一種包含細胞外抗原結合結構域的嵌合抗原受體(CAR),所述細胞外抗原結合結構域包含一個或多個本文所述的抗PD-L1 sdAb部分。
在一些實施例中,額外的多肽序列可以是特異性識別第二抗原的第二抗體部分(諸如sdAb、scFv、全長抗體)。在一些實施例中,第二抗原不是PD-L1。在一些實施例中,第二抗體部分特異性識別PD-L1上的與本文所述的抗PD-L1 sdAb的抗原決定區相同的抗原決定區。在一些實施例中,第二抗體部分特異性識別PD-L1上的與本文所述的抗PD-L1 sdAb的抗原決定區不同的抗原決定區。
在一些實施例中,與本文所述的抗PD-L1 sdAb本身相比,額外的多肽序列可以增加抗體構建體的半衰期、可溶性或吸收性,降低免疫原性或毒性,消除或減弱不需要的副作用,和/或為本發明的抗PD-L1構建體賦予其它有利的特性,和/或減少本發明的抗PD-L1構建體的不需要的特性。這類額外的多肽序列的一些非限制性實例是血清蛋白,諸如人血清白蛋白(參見例如WO 00/27435)或半抗原分子(例如被循環抗體識別的半抗原,參見例如WO 98/22141)。已經表明,免疫球蛋白與血清白蛋白或其片段的連接片段(諸如VH 結構域)可以增加抗體的半衰期(參見例如WO 00/27435和WO 01/077137)。因此,在一些實施例中,本發明的抗PD-L1構建體可以包含(任選地經由合適的連接子(諸如肽連接子))連接至血清白蛋白(或連接至其合適的片段)的本文所述的抗PD-L1 sdAb部分。在一些實施例中,本文所述的抗PD-L1 sdAb部分可以連接至至少包含血清白蛋白結構域III的血清白蛋白的片段(參見PCT/EP2007/002817)。
僅重鏈抗體(HCAb)
在一些實施例中,本文所述的抗PD-L1 sdAb部分可以(任選地經由連接子序列)連接至一個或多個(較佳人)CH 2和/或CH 3結構域,以增加其體內半衰期。
因此,在一些實施例中,抗PD-L1構建體是HCAb(下文稱為“抗PD-L1 HCAb”),其包含與免疫球蛋白(諸如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)的Fc片段融合的本文所述的抗PD-L1 sdAb部分。在一些實施例中,抗PD-L1 HCAb包含IgG(諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任一個)的Fc序列。在一些實施例中,Fc片段是人Fc。在一些實施例中,Fc片段是人IgG1 Fc。在一些實施例中,抗PD-L1 HCAb是單體的。在一些實施例中,抗PD-L1 HCAb是二聚的。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分和Fc片段任選地通過肽連接子連接。在一些實施例中,肽連接子是突變的人IgG鉸鏈(SEQ ID NO: 445)。在一些實施例中,肽連接子包含SEQ ID NO: 443的胺基酸序列(GGGGSGGGS)。在一些實施例中,肽連接子包含SEQ ID NO: 444的胺基酸序列(GGGGSGGGGSGGGGS)。
因此,在一些實施例中,提供了一種抗PD-L1 HCAb,其包含特異性識別PD-L1的sdAb部分,其中所述sdAb部分包含CDR1、CDR2和CDR3,所述CDR1包含SEQ ID NO: 51-100中任一個的胺基酸序列或其包含最高達約3個(諸如約1個、2個或三個)胺基酸置換的變異體,所述CDR2包含SEQ ID NO: 151-200中任一個的胺基酸序列或其包含最高達約3個(諸如約1個、2個或三個)胺基酸置換的變異體,所述CDR3包含SEQ ID NO: 251-300中任一個的胺基酸序列或其包含最高達約3個(諸如約1個、2個或三個)胺基酸置換的變異體,並且其中所述sdAb部分融合至免疫球蛋白的Fc片段。在一些實施例中,提供了一種抗PD-L1 HCAb,其包含特異性識別PD-L1的sdAb部分,其中所述sdAb部分包含CDR1、CDR2和CDR3,所述CDR1包含SEQ ID NO: 51-100中任一個的胺基酸序列,所述CDR2包含SEQ ID NO: 151-200中任一個的胺基酸序列,所述CDR3包含SEQ ID NO: 251-300中任一個的胺基酸序列,或其在所述多個CDR中包含最高達約3個(諸如1個、2個或3個)胺基酸置換的變異體,並且其中所述sdAb部分融合至免疫球蛋白的Fc片段。在一些實施例中,提供了一種抗PD-L1 HCAb,其包含特異性識別PD-L1的sdAb部分,其中所述sdAb部分包含CDR1、CDR2和CDR3,所述CDR1包含SEQ ID NO: 51-100中任一個的胺基酸序列,所述CDR2包含SEQ ID NO: 151-200中任一個的胺基酸序列,所述CDR3包含SEQ ID NO: 251-300中任一個的胺基酸序列,並且其中所述sdAb部分融合至免疫球蛋白的Fc片段。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分包含VH H結構域,其包含以下中的任一個的胺基酸序列:a-1)位置44處的胺基酸殘基選自下組:A、G、E、D、G、Q、R、S和L(諸如G、E或Q);a-2)位置45處的胺基酸殘基選自下組:L、R和C(諸如L或R);a-3)位置103處的胺基酸殘基選自下組:W、R和S(諸如W或R,或諸如W);a-4)位置108處的胺基酸殘基是Q;或者b-1)位置44處的胺基酸殘基選自下組:E和Q;b-2)位置45處的胺基酸殘基是R;b-3)位置103處的胺基酸殘基選自下組:W、R和S(諸如W);b-4)位置108處的胺基酸殘基選自下組:Q和L(諸如Q);其中所述胺基酸位置按照Kabat編號,並且其中當位置108是Q時位置108可以任選地人源化為L。在一些實施例中,Fc片段是人IgG1 Fc。在一些實施例中,所述抗PD-L1 HCAb是單體的。在一些實施例中,所述抗PD-L1 HCAb是二聚的。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分和Fc片段任選地通過肽連接子連接。在一些實施例中,肽連接子包含SEQ ID NO: 443、SEQ ID NO: 444或SEQ ID NO: 445的胺基酸序列。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分與PD-L1之間的結合的Kd 為約10-5 M至約10-12 M (諸如約10-7 M至約10-12 M,或約10-8 M至約10-12 M)。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分是駱駝科的、嵌合的、人的、部分人源化的、或全部人源化的。
在一些實施例中,提供了一種抗PD-L1 HCAb,其包含SEQ ID NO: 401-440中任一個的胺基酸序列。
在一些實施例中,提供了一種抗PD-L1 HCAb(下文稱為“競爭性抗PD-L1 HCAb”),其與本文所述的抗PD-L1 HCAb中的任一個競爭特異性結合PD-L1。競爭性結合可以使用ELISA測定來確定。例如,在一些實施例中,提供了一種抗PD-L1 HCAb,其與包含SEQ ID NO: 401-440中任一個的胺基酸序列的抗PD-L1 HCAb競爭特異性結合PD-L1。舉另一個例子,在一些實施例中,提供了一種抗PD-L1 HCAb,其與包含CDR1、CDR2和CDR3的抗PD-L1 HCAb競爭特異性結合PD-L1,所述CDR1包含SEQ ID NO: 51-100中任一個的胺基酸序列,所述CDR2包含SEQ ID NO: 151-200中任一個的胺基酸序列,所述CDR3包含SEQ ID NO: 251-300中任一個的胺基酸序列。在一些實施例中,競爭性抗PD-L1 HCAb與PD-L1之間的結合的Kd 為約10-5 M至約10-12 M (諸如約10-7 M至約10-12 M,或約10-8 M至約10-12 M)。在一些實施例中,競爭性抗PD-L1 HCAb是駱駝科的、嵌合的、人的、部分人源化的或全部人源化的。
多價和/或多特異性抗體
在一些實施例中,抗PD-L1抗體包含與一個或多個其它抗體部分(諸如特異性識別另一抗原的抗體部分)融合的本文所述的抗PD-L1 sdAb部分。所述一個或多個其它抗體部分可以是任何抗體或抗體片段形式,諸如多特異性sdAb(諸如雙特異性sdAb)、全長抗體、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、單鏈Fv(scFv)、scFv-scFv、微抗體、雙抗體或sdAb。對於某些抗體片段的綜述,參見Hudson et al.Nat. Med. 9:129-134 (2003)。對於scFv片段的綜述,參見例如Pluckthün, 在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , vol. 113, Rosenburg和Moore編輯, (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); 還參見WO 93/16185; 和美國專利號5,571,894和5,587,458。對於包含結合救援(salvage)受體的抗原決定區殘基並且具有增加的體內半衰期的Fab和F(ab’)2 片段的討論,參見美國專利號5,869,046。對於多特異性抗體的綜述,參見Weidleet al. , Cancer Genomics Proteomics, 10(1):1-18, 2013; Geering和Fussenegger, Trends Biotechnol., 33(2):65-79, 2015; Stamovaet al. , Antibodies, 1(2):172-198, 2012。雙抗體是具有兩個抗原結合位點的抗體片段,其可以是雙價的或雙特異性的。參見例如EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al.,Nat. Med. 9:129-134 (2003); 和Hollinger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。三抗體和四抗體也記載於Hudson et al.,Nat. Med. 9:129-134 (2003)。抗體片段可以通過多種技術製造,包括但不限於如本文所述的完整抗體的蛋白質水解消化以及由重組主體細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生。在一些實施例中,所述一個或多個其它抗體部分是抗體模擬物,其是包含抗體的抗原結合結構域的小的工程改造的蛋白質(Geering和Fussenegger, Trends Biotechnol., 33(2):65-79, 2015)。這些分子衍生自現存的人支架蛋白,並且包含單一多肽。可以包含在本文所述的抗-PD-L1構建體中的示例性抗體模擬物可以是,但不限於,設計的錨蛋白重複蛋白(DARPin;包含側接N末端和C末端帽子結構域的3-5個完全合成的錨蛋白重複)、親和性多聚體(avimer;一種高親和力的蛋白質,其包含多個A結構域,每個結構域具有對靶標的低親和力)或Anticalin(基於脂質運載蛋白的支架,具有四個可接近的環,每個環的序列可以被隨機化)。
用於製造多特異性抗體的技術包括,但不限於,具有不同特異性的兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表現(參見Milstein和Cuello,Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, 和Traunecker et al.,EMBO J. 10: 3655 (1991))以及“杵臼(knob-in-hole)”工程改造(參見例如美國專利號5,731,168)。多特異性抗體還可以通過用於製造抗體Fc異源二聚體分子的工程改造靜電操縱效果來製造,(WO 2009/089004A1);交聯兩個或更多個抗體或片段(參見例如美國專利號4,676,980,和Brennan et al., Science , 229: 81 (1985));使用白胺酸拉鍊以產生雙特異性抗體(參見例如Kostelnyet al.,J. Immunol. , 148(5):1547-1553 (1992));使用用於製造雙特異性抗體片段的“雙抗體”技術(參見例如Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90:6444-6448 (1993));和使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber et al., J. Immunol. ,152:5368 (1994));和如例如Tutt et al.J. Immunol. 147: 60 (1991)中所述的製備三特異性抗體;和產生包含串聯單結構域抗體的多肽(參見例如美國專利申請號20110028695;和Conrath et al. J. Biol. Chem., 2001; 276(10):7346-50)。包括“章魚抗體”在內的具有三個或更多個功能抗原結合位點的工程改造的抗體也包含在本文中(參見例如US 2006/0025576A1)。
肽連接子
在一些實施例中,抗PD-L1構建體內的所述兩個或更多個抗體部分可以任選地通過肽連接子連接。在抗PD-L1構建體中使用的一個或多個肽連接子的長度、柔性程度和/或其它特性可以對以下特性具有一些影響,所述特性包括但不限於針對一個或多個特定抗原或抗原決定區的親和力(affinity)、特異性或親和性(avidity)。例如,較長的肽連接子可以被選擇以確保兩個相鄰的結構域不會在空間上彼此干擾。在一些實施例中,肽連接子包含柔性殘基(諸如甘胺酸和絲胺酸),使得相鄰的結構域不會相對移動。例如,甘胺酸-絲胺酸雙聯體可以是合適的肽連接子。
肽連接子可以具有任何合適的長度。在一些實施例中,肽連接子是最少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100個或更多個胺基酸長。在一些實施例中,肽連接子是不多於約100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5個或更少的胺基酸長。在一些實施例中,肽連接子的長度是約1個胺基酸至約10個胺基酸、約1個胺基酸至約20個胺基酸、約1個胺基酸至約30個胺基酸、約5個胺基酸至約15個胺基酸、約10個至約25個胺基酸、約5個至約30個胺基酸、約10個至約30個胺基酸、約30個至約50個胺基酸、約50個至約100個胺基酸,或約1個至約100個胺基酸。
肽連接子可以具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如,衍生自僅重鏈抗體的鉸鏈區的序列可以用作連接子。參見,例如WO1996/34103。在一些實施例中,肽連接子是突變的人IgG1鉸鏈(SEQ ID NO: 445)。在一些實施例中,肽連接子是柔性連接子。示例性的柔性連接子包括甘胺酸聚合物(G)n 、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括例如(GS)n , (GSGGS)n , (GGGS)n 和(GGGGS)n ,其中n是至少為1的整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物和業內已知的其它柔性連接子。在一些實施例中,肽連接子包含GGGGSGGGS(SEQ ID NO: 443)的胺基酸序列。在一些實施例中,肽連接子包含SEQ ID NO: 444 (GGGGSGGGGSGGGGS)的胺基酸序列。在一些實施例中,肽連接子包含SEQ ID NO: 445 (EPKSSDKTHTSPPSP)的胺基酸序列。
在一些實施例中,包含抗PD-L1 sdAb部分和一個或多個其它抗體部分的抗PD-L1構建體是單特異性的。在一些實施例中,包含抗PD-L1 sdAb部分和一個或多個其它抗體部分的抗PD-L1構建體是多特異性的(諸如雙特異性的)。多特異性分子是對至少兩個不同的抗原或抗原決定區具有結合特異性的分子(例如雙特異性抗體對兩個抗原或抗原決定區具有結合特異性)。具有多於二價和/或多於兩種特異性的多特異性分子也被涵蓋在內。例如,可以製備三特異性抗體。Tuttet al. J. Immunol. 147: 60 (1991)。可以領會的是,熟習此項技術者可以選擇本文所述的多個單獨多特異性分子的適當特徵以彼此互相組合,以形成本發明的多特異性抗PD-L1分子。
在一些實施例中,抗PD-L1構建體是多價的但是單特異性的,即,抗PD-L1構建體包含本文所述的抗PD-L1 sdAb部分和至少一種第二抗體部分,所述至少一種第二抗體部分特異性識別與所述抗PD-L1 sdAb部分識別的抗原決定區相同的PD-L1抗原決定區。在一些實施例中,所述特異性識別與本文所述抗PD-L1 sdAb部分識別的抗原決定區相同的PD-L1抗原決定區的一個或多個抗體部分可以包含與所述抗PD-L1 sdAb部分的CDR相同的CDR和/或與所述抗PD-L1 sdAb部分的VH H相同的VH H胺基酸序列。例如,抗PD-L1構建體可以包含兩個或更多個本文所述的抗PD-L1 sdAb部分,其中所述兩個或更多個抗PD-L1 sdAb部分是相同的。在一些實施例中,所述抗PD-L1 sdAb部分任選地通過一個或多個肽連接子連接。在一些實施例中,所述肽連接子包含SEQ ID NO: 443-445中任一個的胺基酸序列。
在一些實施例中,抗PD-L1構建體是多價的和多特異性的,即,抗PD-L1構建體包含本文所述的抗PD-L1 sdAb和至少一種第二抗體部分,所述至少一種第二抗體部分特異性識別除了PD-L1之外的第二抗原,或與所述抗PD-L1 sdAb部分所識別的PD-L1抗原決定區不同的PD-L1抗原決定區。在一些實施例中,所述第二抗體部分是sdAb。在一些實施例中,所述第二抗體部分特異性識別人血清白蛋白(HSA)。在一些實施例中,所述特異性識別PD-L1的sdAb部分在所述第二抗體部分的N末端或C末端。在一些實施例中,所述抗PD-L1構建體是三價的和雙特異性的。在一些實施例中,所述抗PD-L1構建體包含兩個本文所述的抗PD-L1 sdAb以及一個第二抗體部分(諸如一個抗HSA sdAb),其中所述第二抗體部分在所述兩個抗PD-L1 sdAb之間。在一些實施例中,所述抗體部分任選地通過一個或多個肽連接子連接。在一個實施例中,肽連接子包含SEQ ID NO: 443-445中任一個的胺基酸序列。
包含兩個或更多個特異性識別PD-L1的sdAb部分的單特異性或多特異性抗PD-L1構建體與本文所述的單個抗-PD-L1 sdAb部分的親和性相比,可以具有增加的親和性。
包含與全長抗體融合的 sdAb 的雙特異性抗體
在一些實施例中,抗PD-L1構建體包含與第二抗體部分融合的本文所述的抗PD-L1 sdAb部分,其中所述第二抗體部分是全長抗體(諸如抗TIGIT全長抗體)。包含針對PD-L1和TIGIT的雙特異性的構建體在下文中被稱為“抗PD-L1/TIGIT抗體”、“抗PD-L1/TIGIT構建體”或“PD-L1×TIGIT抗體”。
在一些實施例中,抗PD-L1構建體包含與第二抗體部分融合的本文所述的抗PD-L1 sdAb部分,其中所述第二抗體部分是全長抗體(諸如抗TIM-3全長抗體)。包含針對PD-L1和TIM-3的雙特異性的構建體在下文中被稱為“抗PD-L1/ TIM-3抗體”、“抗PD-L1/ TIM-3構建體”或“PD-L1×TIM-3抗體”。
在一些實施例中,抗PD-L1構建體包含與第二抗體部分融合的本文所述的抗PD-L1 sdAb部分,其中所述第二抗體部分是全長抗體(諸如抗LAG-3全長抗體)。包含針對PD-L1和LAG-3的雙特異性的構建體在下文中被稱為“抗PD-L1/ LAG-3抗體”、“抗PD-L1/ LAG-3構建體”或“PD-L1×LAG-3抗體”。
類似於PD-L1,TIGIT、TIM-3和LAG-3是抑制性免疫檢查點分子。
在一些實施例中,提供了一種分離的抗PD-L1構建體,其包含特異性識別PD-L1的sdAb部分和選自下組的全長抗體:抗TIGIT抗體、抗TIM-3抗體和抗LAG-3抗體,其中所述抗PD-L1 sdAb部分包含:CDR1,其包含SEQ ID NO: 51-100中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;CDR2,其包含SEQ ID NO: 151-200中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換;和CDR3,其包含SEQ ID NO: 251-300中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換。在一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分的N末端與所述全長抗體的至少一條重鏈的C末端融合。在一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分的C末端與所述全長抗體的至少一條重鏈的N末端融合。在一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分與全長抗體任選地通過肽連接子連接。在一些實施例中,肽連接子包含SEQ ID NO: 443-445中任一個的胺基酸序列。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分與PD-L1之間的結合的Kd 為約10-5 M至約10-12 M (諸如約10-7 M至約10-12 M,或約10-8 M至約10-12 M)。在一些實施例中,抗-PD-L1 sdAb部分是駱駝科的、嵌合的、人的、部分人源化的、或全部人源化的。
在一些實施例中,提供了一種分離的抗PD-L1構建體,其包含特異性識別PD-L1的sdAb部分和選自下組的全長抗體:抗TIGIT抗體、抗TIM-3抗體和抗LAG-3抗體,其中所述sdAb包含VH H結構域,所述VH H結構域包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列或其與SEQ ID NO: 351-400中任一個具有至少約80%(諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的變異體。在一些實施例中,提供了一種分離的抗PD-L1構建體,其包含特異性識別PD-L1的sdAb部分和選自下組的全長抗體:抗TIGIT抗體、抗TIM-3抗體和抗LAG-3抗體,其中所述sdAb包含VH H結構域,所述VH H結構域包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列或其在VH H結構域中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換的變異體。在一些實施例中,包含VH H結構域(其包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列或其變異體)的抗-PD-L1 sdAb部分在多個CDR(諸如SEQ ID NO: 351-400中任一個的CDR1和/或CDR2和/或CDR3)中包含胺基酸置換。在一些實施例中,包含VH H結構域(其包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列或其變異體)的抗-PD-L1 sdAb部分包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的CDR1、CDR2和CDR3,並且所述胺基酸置換在FR(諸如SEQ ID NO: 351-400中任一個的FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4)中。在一些實施例中,包含VH H結構域(其包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列或其變異體)的抗-PD-L1 sdAb部分在多個CDR和多個FR中都包含胺基酸置換。在一些實施例中,提供了一種分離的抗PD-L1構建體,其包含特異性識別PD-L1的sdAb部分和選自下組的全長抗體:抗TIGIT抗體、抗TIM-3抗體和抗LAG-3抗體,其中所述sdAb包含VH H結構域,所述VH H結構域包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列。在一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分的N末端與全長抗體的至少一條重鏈的C末端融合。在一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分的C末端與全長抗體的至少一條重鏈的N末端融合。在一些實施例中,特異性識別PD-L1的sdAb部分與全長抗體任選的通過肽連接子連接。在一些實施例中,肽連接子包含SEQ ID NO: 443-445中任一個的胺基酸序列。在一些實施例中,抗PD-L1 sdAb部分與PD-L1之間的結合的Kd 為約10-5 M至約10-12 M (諸如約10-7 M至約10-12 M,或約10-8 M至約10-12 M)。在一些實施例中,抗-PD-L1 sdAb部分是駱駝科的、嵌合的、人的、部分人源化的、或全部人源化的。
在一些實施例中,還提供了一種包含特異性識別PD-L1的sdAb部分的抗PD-L1構建體(下文稱為“競爭性抗PD-L1構建體”),其與本文所述的抗PD-L1/TIGIT構建體、抗PD-L1/TIM-3構建體或抗PD-L1/LAG-3構建體競爭特異性結合PD-L1。
PD-L1 抗體變異體
在一些實施例中,考慮本文提供的抗體的胺基酸序列變異體。例如,可能需要提高所述抗體的結合親和力和/或其它生物學特性。抗體的胺基酸序列變異體可以通過將適當修飾引入編碼所述抗體的核酸序列中或通過肽合成來製備。這類修飾包括,例如,從所述抗體的胺基酸序列中缺失、和/或插入所述抗體的胺基酸序列中和/或置換所述抗體的胺基酸序列中的殘基。可以進行缺失、插入和置換的任意組合以獲得最終構建體,條件是最終構建體具有所需特性例如抗原結合性。
a) 置換、插入、缺失和變異體
在一些實施例中,提供了具有一個或多個胺基酸置換的胺基酸變異體。用於置換型誘變的感興趣位點包括HVR和FR。保守性置換在表2中在 “較佳的置換”的標題下示出。更多實質改變在表2中在“示例性置換”的標題下提供,並且如下文根據胺基酸側鏈類型進一步示出的。胺基酸置換可以被引入感興趣的抗體中,並且產物被篩選用於獲得所需活性,例如保留的/提高的抗原結核性、降低的免疫原性或提高的ADCC或CDC。
表2. 胺基酸置換
胺基酸可以根據常見側鏈特性被分組為:
(1) 疏水性:正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2) 中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3) 酸性:Asp、Glu;
(4) 鹼性:His、Lys、Arg;
(5) 影響鏈方向的殘基:Gly、Pro;
(6) 芳香族的:Trp、Tyr、Phe。
非保守性置換會涉及這些類之一中的一個成員變成另一類。
一種類型的置換性變異體涉及置換親本抗體(例如人源化抗體或人抗體)的一個或多個高變區殘基。一般地,被選擇用於進一步研究的一個或多個所得變異體會在某些生物學特性方面(例如親和力增加、免疫原性降低)相對於親本抗體具有改變(例如改善)和/或會具有基本上保留的親本抗體的某些生物學特性。一個示例性置換性變異體是親和力成熟的抗體,其可以例如使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術諸如本文所述的那些便利地產生。簡言之,突變一個或多個HVR殘基,並且在噬菌體上展示變異體抗體並且對其進行篩選以選擇特定的生物學活性(例如結合親和力)。
改變(例如置換)可以發生在HVR中,例如以提高抗體親和力。這類改變可以發生在HVR“熱點”(即在體細胞成熟過程期間以高頻率經歷突變的由密碼子編碼的殘基(參見例如Chowdhury,Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)))和/或SDR(a-CDR)中,測試所得的變異體VH或VL的結合親和力。通過從二級文庫構建和再次選擇實現的親和力成熟已經記載於例如Hoogenboom et al.Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))中。在親和力成熟的一些實施例中,差異被引入可變基因中,所述可變基因被選擇通過多種方法的任一個(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定點誘變)而進行成熟。然後產生二級文庫。然後對該文庫進行篩選以鑒定具有所需親和力的任何抗體變異體。引入差異的另一方法涉及HVR定向方法,其中若干HVR殘基(例如一次4-6個殘基)被隨機化。參與抗原結合的HVR殘基可以被明確鑒定,例如,使用丙胺酸掃描誘變或建模。特別是CDR-H3和CDR-L3經常被靶向。
在一些實施例中,置換、插入或缺失可以發生在一個或多個HVR內,只要這些改變不會顯著降低抗體結合抗原的能力。例如,不顯著降低結合親和力的保守性改變(例如本文提供的保守性置換)可以發生在HVR中。這些改變可以在HVR“熱點”或CDR的外部。在上文提供的變異體VH H序列的一些實施例中,每個HVR各自未改變,或含有不多於一個、2個或3個胺基酸置換。
如Cunningham 和 Wells (1989)Science , 244:1081-1085所記載的,用於鑒定可以被靶向用於進行誘變的抗體殘基或區域的方法被稱為“丙胺酸掃描誘變”。在該方法中,鑒定一個殘基或靶標殘基組(例如帶電殘基諸如Arg、Asp、His、Lys和Glue)並且將其用中性或帶相反電荷的胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)取代,以確定該抗體與抗原之間的相互作用是否受到影響。可以在證實對最初置換具有功能敏感性的胺基酸位置處引入進一步的置換。或者,或另外,抗體-抗原複合物的晶體結構用於鑒定抗體與抗原之間的接觸點。這樣的接觸殘基和鄰近殘可以作為置換的候選者被靶向或被消除。可以對變異體進行篩選以確定它們是否含有所需特性。
胺基酸序列插入包括從一個殘基至含有一百個或更多個殘基的多肽的長度範圍的胺基和/或羧基末端融合,以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括具有N末端甲硫氨醯基殘基的抗體。抗體分子的其它插入性變異體包括將該抗體的N末端或C末端與酶(例如對於ADEPT)或增加該抗體的血清半衰期的多肽融合。
b) 糖基化變異體
在一些實施例中,本文提供的抗PD-L1構建體被改變以增加或降低構建體糖基化的程度。將糖基化位點添加到抗體中或從抗體中刪除糖基化位點可以通過改變胺基酸序列使得產生或去除一個或多個糖基化位點來便利地實現。
當抗-PD-L1構建體包含Fc區時,可以改變其附接的碳水化合物。由哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含分支的雙觸角寡糖,其通常通過N連接與Fc區的CH2結構域的Asn297附接。參見,例如,Wright et al.TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡糖可以包括多種碳水化合物,例如甘露糖、N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸,以及與雙觸角寡糖結構的“主幹”中的GlcNAc附接的岩藻糖。在一些實施例中,為了產生具有某些改善特性的抗體變異體,可以進行本申請的抗PD-L1構建體中的寡糖的修飾。
在一些實施例中,提供了抗體變異體,其具有缺乏與Fc區(直接或間接)附接的岩藻糖的碳水化合物結構。例如,在這樣的抗體中的岩藻糖的量可以為從1%至80%,從1%至65%,從5%至65%或從20%至40%。岩藻糖的量通過計算在Asn297處的糖鏈內部的岩藻糖相對於與Asn297附接的所有糖結構(例如複合物、雜合物和高甘露糖結構)的總和的平均量,如通過MALDI-TOF質譜量測的,例如,如WO 2008/077546中所記載的。Asn297是指位於Fc區中大約位置297處(Fc位置殘基的EU編號)的天門冬醯胺酸殘基;但是,由於抗體中的小序列變化,Asn297還可以位於位置297的上游或下游約±3個胺基酸處,即在位置294和300之間。這樣的岩藻糖化變異體可以具有提高的ADCC功能。參見,例如美國專利公開號US 2003/0157108 (Presta, L.);US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。涉及“去岩藻糖化的”或“岩藻糖缺陷型”抗體變異體的公開的實例包括:US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al.J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al.Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)。能夠產生去岩藻糖化的抗體的細胞株的實例包括在蛋白質鹽藻糖基化方面有缺陷的Lec13 CHO細胞(Ripka et al.Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 美國專利申請號US 2003/0157108 A1, Presta, L; 和WO 2004/056312 A1, Adamset al .,特別是實例)和敲除細胞株諸如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因、FUT8、敲除CHO細胞(參見,例如Yamane-Ohnuki et al.Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng ., 94(4):680-688 (2006);和WO2003/085107)。
抗PD-L1構建體變異體被進一步提供有二等分(bisected)的寡糖,例如其中附接至抗體的Fc區的雙觸角寡糖被GlcNAc二等分。這樣的抗體變異體可以具有降低的鹽藻糖基化和/或提高的ADCC功能。這樣的抗體變異體的實例記載於例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.);美國專利號6,602,684 (Umana et al.);和US 2005/0123546 (Umanaet al .)。還提供了在附接至Fc區的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變異體。這樣的抗體變異體可以具有提高的CDC功能。這樣的抗體變異體記載於例如WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 和WO 1999/22764 (Raju, S.)。
c)Fc區變異體
在一些實施例中,一個或多個胺基酸修飾可以被引入本文提供的抗PD-L1構建體的Fc區,從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可以包含在一個或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如置換)的人Fc區序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在一些實施例中,本申請考慮抗PD-L1構建體變異體,其具有一些但非全部效應子功能,這使其成為合意的用於應用的候選者,其中抗PD-L1構建體在體內的半衰期是重要的,但是某些效應子功能(諸如補體和ADCC)是不必要的或有害的。可以進行體外和/或體內細胞毒性測定以證實CDC和/或ADCC活性的降低/損耗。例如,可以進行Fc受體(FcR)結合測定以確保抗體缺少FcgR結合性(因此可能缺少ADCC活性)但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC的原代細胞,NK細胞,僅表現FcγRIII,而單核細胞表現FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血細胞上的FcR表現總結於Ravetch和Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)的第464頁的表3中。評估感興趣分子的ADCC活性的體外測定的非限制性實例記載於美國專利號5,500,362(參見,例如Hellstrom, I. et al.Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) 和Hellstrom, I et al.,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (參見 Bruggemann, M. et al.,J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987))。或者,可以採用非放射性測定方法(參見例如ACTI™ 用於流式細胞術的非放射性細胞毒性測定(Cell Technology, Inc. Mountain View, CA);和CytoTox 96® 非放射性細胞毒性測定(Promega, Madison, WI))。可用於這類測定的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細胞。或者,或另外,感興趣分子的ADCC活性可以體內測定,例如在動物模型中,諸如在Clynes et al.Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)中公開的動物模型中。也可以實施C1q結合測定以證實抗體不能結合C1q並因此缺少CDC活性。參見,例如,WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c結合ELISA。為了評估補體活性,可以進行CDC測定(參見例如Gazzano-Santoroet al .,J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al.,Blood 101:1045-1052 (2003); 和Cragg, M.S. 和 M.J. Glennie,Blood 103:2738-2743 (2004))。還可以使用業內已知的方法進行FcRn結合和體內清除/半衰期測定(參見例如Petkova, S.B. et al.,Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006))。
具有降低的效應子功能的抗體包括具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327和329中的一個或多個的置換的那些抗體(美國專利號6,737,056)這類Fc突變包括在胺基酸位置265、269、270、297和327中的兩個或更多個處具有置換的Fc突變異體,包括殘基265和197置換為丙胺酸的所謂的“DANA”Fc突變異體(美國專利號7,332,581)。
具有提高的或降低的與FcR的結合性的某些抗體變異體被記載。(參見,例如,美國專利號6,737,056; WO 2004/056312和Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001))。
在一些實施例中,抗PD-L1構建體變異體包含具有提高ADCC的一個或多個胺基酸置換的Fc區,例如在Fc區的位置298、333和/或334處的置換(殘基的EU編號)。
在一些實施例中,在Fc區中進行改變,產生改變的(即提高的或降低的)C1q結合性和/或補體依賴性細胞毒性(CDC),例如如美國專利號6,194,551、WO 99/51642和Idusogie et al.J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)中所記載的。
在一些實施例中,提供了一種抗PD-L1構建體(例如HCAb)變異體,其包含變異體Fc區,所述變異體Fc區包含增加半衰期和/或提高與新生兒Fc受體(FcRn)的結合性的一個或多個胺基酸置換。具有增加的半衰期和提高的與負責將母體IgG轉運至胎兒(Guyer et al.,J. Immunol. 117:587 (1976) 和Kim et al.,J. Immunol. 24:249 (1994))的新生兒Fc受體(FcRn)的結合性的抗體記載於US2005/0014934A1(Hinton et al.)。那些抗體包含其中具有一個或多個置換的Fc區,該一個或多個置換提高Fc區與FcRn的結合性。這樣的Fc變異體包括在以下Fc區殘基中的一個或多個處具有置換的那些Fc變異體:238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434,例如Fc區殘基434的置換(美國專利號7,371,826)。
還參見涉及Fc區變異體的其它實例的Duncan & Winter,Nature 322:738-40 (1988); 美國專利號5,648,260;美國專利號5,624,821;和WO 94/29351。
考慮包含本文所述的任何Fc變異體的抗PD-L1構建體(諸如HCAb或與全長抗體融合的抗PD-L1 sdAb)或其組合。
d) 半胱胺酸工程改造的抗體變異體
在一些實施例中,可能需要產生半胱胺酸工程改造的抗PD-L1構建體,例如“thioMAb”,其中抗體的一個或多個殘基被半胱胺酸殘基置換。在特定的實施例中,置換的殘基出現在抗體的可接近位點。如本文進一步描述的,通過用半胱胺酸置換那些殘基,活性巰基由此被放置在抗體的可接近位點,並可用於將抗體綴合至其它部分,諸如藥物部分或連接子-藥物部分,以產生免疫綴合物。在一些實施例中,以下殘基中的任意一個或多個可以用半胱胺酸置換:重鏈的A118(EU編號);和重鏈Fc區的S400(EU編號)。如例如美國專利號7,521,541中所記載的,可以產生半胱胺酸工程改造的抗PD-L1構建體。
e) 抗體衍生物
在一些實施例中,本文提供的抗PD-L1構建體可以被進一步修飾為含有額外的業內已知且容易得到的非蛋白質的部分。適用於衍生抗體的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊環,聚-1,3,6-三噁烷,乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸類(均聚物或隨機共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物(propropylene glycol homopolymer)、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化的多元醇(例如丙三醇)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中的穩定性而在製造方面具有優勢。聚合物可以具有任何分子量,並且可以是分支的或不分支的。與抗體附接的聚合物的數量可以改變,並且如果多於一個聚合物被附接,那麼它們可以是相同的或不同的分子。一般地,用於衍生化的聚合物的數量和/或類型可以基於以下考慮來確定:包括但不限於,待提高的抗體的特定特性或功能,抗體衍生物是否會在限定的條件下用於治療等。
在一些實施例中,提供了抗PD-L1構建體和非蛋白質的部分的綴合物,所述非蛋白質的部分可以通過暴露於輻射而被選擇性地加熱。在一些實施例中,非蛋白質的部分是碳納米管(Kam et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。輻射可以具有任意波長,並且包括但不限於,不傷害普通細胞但是將非蛋白質的部分加熱至這樣的溫度的波長,在該溫度下在抗體-非蛋白質的部分的近端的細胞被殺死。
在一些實施例中,本文提供的抗PD-L1構建體(諸如抗PD-L1 sdAb、抗PD-L1 HCAb、抗PD-L1/抗CTLA-4 HCAb、抗PD-L1/TIGIT雙特異性抗體、抗PD-L1/TIM-3雙特異性抗體或抗PD-L1/LAG-3雙特異性抗體)可以被進一步修飾為含有一個或多個生物活性蛋白、多肽或其片段。本文所使用的“生物活性”或“生物學活性”意指在身體中顯示出執行特定功能的生物學活性。例如,其可以意指與特定生物分子諸如蛋白質、DNA等結合,然後促進或抑制該生物分子的活性。在一些實施例中,生物活性蛋白質或其片段具有免疫刺激/免疫調節、膜轉運或酶促活性。
在一些實施例中,可以與本文所述的抗PD-L1構建體融合的生物活性蛋白質或其片段是配體,諸如與特定細胞受體相互作用的淋巴因子和細胞因子。淋巴因子是當抗原或凝集素刺激T細胞生長時由T細胞分泌的低分子量蛋白。淋巴因子的實例包括但不限於干擾素-α、干擾素γ、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-3(IL-3)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(例如CSF-1、G-CSF或GM-CSF)、趨化因子、巨噬細胞遊走抑制因子(MIF)、巨噬細胞活化因子(LIF)、NK細胞活化因子、T細胞替代因子、白細胞抑制因子(LIF)、淋巴毒素、破骨細胞活化因子(OAF)、可溶性免疫應答因子(SIRS)、生長刺激因子、單核細胞生長因子等。可以納入本發明的抗PD-L1融合蛋白內的細胞因子包括但不限於腫瘤壞死因子α(TNFα)、干擾素(IFN)和神經生長因子(NGF)等。
III. 藥物組合物
本申請還提供了藥物組合物,其包含本文所述的包含特異性識別PD-L1的sdAb的抗PD-L1構建體(諸如抗PD-L1 sdAb、抗PD-L1 HCAb、抗PD-L1/抗CTLA-4 HCAb、抗PD-L1/TIGIT雙特異性抗體、抗PD-L1/TIM-3雙特異性抗體或抗PD-L1/LAG-3雙特異性抗體)中的任一個,以及任選的藥學上可接受的載劑。藥物組合物可以通過混合具有所需純度的本文所述的抗PD-L1構建體和任選的藥學上可接受的載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))而製備成凍幹製劑或水性溶液的形式。
藥物組合物較佳是穩定的,其中本文所述的包含抗PD-L1 sdAb的抗PD-L1構建體基本上保留其在儲存期間的物理和化學穩定性和完整性。用於量測蛋白質穩定性的多種分析技術是業內可得的,並且綜述於Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)和Jones, A.Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)中。穩定性可以在選擇的溫度下量測選擇的一段時間。為了快速篩選,可以將製劑保持在40℃持續2周至1個月,在這個時間量測穩定性。當製劑待保存在2-8℃時,通常該製劑應該在30℃或40℃下持續至少1個月是穩定的,和/或在2-8℃持續至少2年是穩定的。當製劑待保存在30℃時,通常該製劑應該在30℃持續至少2年是穩定的,和/或在40℃持續至少6個月是穩定的。例如,保存期間的聚集程度可以用作蛋白質穩定性的指示物。在一些實施例中,本文所述的抗PD-L1構建體的穩定製劑可以包含在製劑中作為聚集物存在的少於約10%(較佳少於約5%)的抗PD-L1構建體。
可接受的載劑、賦形劑或穩定劑在採用的劑量和濃度下對接受者是無毒的,並且包括緩衝劑、抗氧化劑(包括抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素E、焦亞硫酸鈉);防腐劑、等滲透壓劑(isotonicifier)(例如氯化鈉)、穩定劑、金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物);螯合劑諸如EDTA和/或非離子表面活性劑。
生理上可接受的載劑的實例包括緩衝劑諸如磷酸、檸檬酸和其它有機酸;抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫胺酸;防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨;氯化六甲銨;苯紮氯銨、苄索氯銨;苯酚、丁基或苄基醇;對羥基苯甲酸烷基酯諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯;鄰苯二酚;間苯二酚;環己醇;3-戊醇;和間甲酚);低分子量(少於約10個殘基)多肽;蛋白質諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物諸如聚乙烯吡咯烷酮;胺基酸諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸;單糖、二糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖;螯合劑諸如EDTA;糖諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇;成鹽抗平衡離子諸如鈉;金屬錯合物(諸如Zn-蛋白質錯合物);和/或非離子表面活性劑諸如TWEEN™、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。
緩衝劑用於將pH控制在一個優化治療有效性的範圍內,特別是如果穩定性是pH依賴性的時。緩衝劑較佳以從約50 mM至約250 mM的範圍內的濃度存在。適用於本申請的緩衝劑包括有機酸和無機酸二者以及其鹽。例如,檸檬酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、醋酸鹽。另外,緩衝劑可包含組胺酸和三甲胺鹽諸如Tris。
防腐劑被加入以阻止微生物生長,並且通常在0.2%-1.0% (w/v)的範圍內存在。防腐劑的添加可以例如有助於生產多次使用(多劑量)製劑。適用於本申請的防腐劑包括十八烷基二甲基苯甲基氯化銨;氯化六甲銨;苯甲烴銨鹵化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)、苄索氯銨;硫汞撒、苯酚、丁基或苄基醇;對羥基苯甲酸烷基酯諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯;鄰苯二酚;間苯二酚;環己醇;3-戊醇;和間甲酚。
張度劑,有時被稱為“穩定劑”存在以調節或維持組合物中液體的張度。當大量使用時,帶電荷的生物分子,諸如蛋白質和抗體,它們經常被稱為“穩定劑”,因為它們能夠與胺基酸側鏈的帶電荷基團相互作用,由此減少分子間和分子內相互作用的可能性。考慮其它成分的相對量,張度劑可以以重量計0.1%-25%(較佳1%至5%)的任意量存在。較佳的張度劑包括多元糖醇,較佳三元或更高的糖醇,諸如甘油、赤蘚糖醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
額外的賦形劑包括能夠充當以下中的一個或多個的劑:(1) 膨脹劑、(2) 溶解度增強劑、(3)穩定劑和(4)防止變性或貼在容器壁上的劑。這樣的賦形劑包括:多元糖醇(以上列舉的);胺基酸諸如丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸、離胺酸、鳥胺酸、白胺酸、2-苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸等;有機糖或糖醇諸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、myoinisitose、myoinisitol、半乳糖、半乳糖醇、丙三醇、環醇類(例如肌醇)、聚乙二醇;含硫的還原劑諸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉;低分子量蛋白質諸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或其它免疫球蛋白;親水性聚合物諸如聚乙烯基吡咯烷酮;單糖(例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖;二糖(例如乳糖、麥芽糖、蔗糖);三糖諸如棉子糖;和多糖諸如糊精或右旋糖酐)。
非離子表面活性劑或去污劑(也稱為“潤濕劑”)存在以幫助溶解治療劑以及保護治療性蛋白質免於攪拌引起的聚集,這還允許製劑暴露于表面剪切應力而不會引起活性治療性蛋白質或抗體的變性。非離子表面活性劑以約0.05 mg/ml至約1.0 mg/ml(較佳約0.07 mg/ml至約0.2 mg/ml)的範圍內存在。
合適的非離子表面活性劑包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、polyoxamer(184、188等)、PLURONIC®多元醇、TRITON®、聚氧乙烯山梨醇酐單醚(TWEEN®-20、TWEEN®-80等)、聚桂醇400、聚乙二醇40硬脂酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻子油10、50和60、單硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素和羧甲基纖維素。可以使用的陰離子去污劑包括十二醇硫酸鈉、二辛基磺基琥珀酸鈉(dioctyle sodium sulfosuccinate)、二辛基磺酸鈉(dioctyl sodium sulfonate)。陽離子去污劑包括苯紮氯銨或苄索氯銨。
為了使待使用的藥物組合物用於體內施用,它們必須是無菌的。藥物組合物可以通過過濾穿過無菌濾膜而實現無菌。本文的藥物組合物通常被放置在具有無菌入口的容器中,例如,具有可由皮下注射針頭刺穿的塞子的靜脈溶液袋或小管。
施用途徑依據已知的被接受的方法,諸如長期以適當的方式通過單次或多次丸劑或輸注,例如,通過皮下、靜脈內、腹膜內、肌內、動脈內、病灶內或關節內途徑注射或輸注、局部施用、吸入或通過緩釋(sustained release)或延長釋放(extended-release)方式。在一些實施例中,局部施用藥物組合物,諸如腫瘤內施用。
可以製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括含有拮抗物的固體疏水性聚合物的半滲透基質,所述基質為成形制品的形式,例如薄膜或微膠囊。緩釋基質的實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美國專利號3,773,919)、L麩胺酸和L-麩胺酸乙酯的共聚物、不可降解性乙烯-醋酸乙烯酯、可降解性乳酸-甘醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOT™ (由乳酸-甘醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)組成的可注射的微球)以及聚-D-(-)-3-羥丁酸。
對於特定適應症進行治療來說必要時,本文的藥物組合物還可以含有多於一種活性化合物,較佳相互之間沒有不利影響的具有互補活性的那些活性化合物。或者,或另外,組合物可以含有細胞毒性劑、化療劑、細胞因子、免疫抑制劑或生長抑制劑。這樣的分子以對於預定目的有效的量適當地以組合的方式存在。
活性成分還可以被陷入製備的微囊中,例如,通過凝聚技術或通過界面聚合作用,例如分別是羥甲基纖維素或明膠微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊,在膠狀藥物遞送系統中(例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米囊)或在粗乳液中。這樣的技術公開於Remington's Pharmaceutical Sciences 第18版中。
在一些實施例中,藥物組合物被包含在一次性小瓶諸如一次性密封小瓶中。在一些實施例中,藥物組合物被包含在多次使用型小瓶中。在一些實施例中,藥物組合物被大量包含在容器中。在一些實施例中,藥物組合物被冷藏保存。
IV. 治療 PD-L1 相關疾病的方法
本文所述的包含特異性識別PD-L1的sdAb的抗PD-L1構建體(諸如抗PD-L1 sdAb、抗PD-L1 HCAb、抗PD-L1/抗CTLA-4 HCAb、抗PD-L1/TIGIT雙特異性抗體、抗PD-L1/TIM-3雙特異性抗體或抗PD-L1/LAG-3雙特異性抗體)和其組合物(諸如藥物組合物)可用于多種應用,諸如用在診斷、分子測定和治療中。
本發明的一個方面提供了一種在有此需要的個體中治療PD-L1相關疾病或病症的方法,包括向該個體施用有效量的包含本文所述的抗-PD-L1構建體的藥物組合物。在一些實施例中,PD-L1相關疾病是癌症。在一些實施例中,PD-L1相關疾病是病原體感染,諸如病毒感染。
本發明部分考慮蛋白質構建體(諸如抗PD-L1 sdAb、抗PD-L1 HCAb、抗PD-L1/抗CTLA-4 HCAb、抗PD-L1/TIGIT雙特異性抗體、抗PD-L1/TIM-3 雙特異性抗體或抗PD-L1/LAG-3雙特異性抗體)、編碼其的核酸分子和/或載體、包含編碼其的核酸分子和/或載體的主體細胞,這些可以單獨或與另一療法任意組合施用,並且在至少一些方面,與藥學上可接受的載體或賦形劑一起施用。在一些實施例中,在施用該抗PD-L1構建體之前,它們可以與合適的業內熟知的藥物載劑和賦形劑組合。根據本公開內容製備的組合物可以用於治療癌症或延緩癌症的惡化。
在一些實施例中,提供了一種治療癌症的方法,包括向個體施用有效量的包含分離的抗PD-L1構建體的藥物組合物,所述構建體包含特異性識別PD-L1的單結構域抗體(sdAb)部分(諸如抗PD-L1 sdAb、抗PD-L1 HCAb、抗PD-L1/抗CTLA-4 HCAb、抗PD-L1/TIGIT雙特異性抗體、抗PD-L1/TIM-3 雙特異性抗體或PD-L1/LAG-3雙特異性抗體)。在一些實施例中,癌症是實體瘤(諸如結腸癌)。在一些實施例中,藥物組合物全身施用(諸如通過靜脈內)。在一些實施例中,藥物組合物局部施用(諸如通過腫瘤內)。在一些實施例中,該方法進一步包含向個體施用另外的癌症治療(諸如外科手術、放射、化學療法、免疫療法、激素療法或其組合)。在一些實施例中,個體是人。在一些實施例中,治療癌症的方法具有以下生物學活性中的一個或多個:(1) 殺死癌細胞 (包括旁觀者效應性殺傷);(2) 抑制癌細胞增生;(3) 在腫瘤內誘導免疫應答;(4) 減小腫瘤尺寸;(5) 緩解患有癌症的個體中的一種或多種症狀;(6)抑制腫瘤轉移;(7) 延長存活期;(8) 延長癌症進展的時間;以及(9) 預防、抑制癌症復發或降低癌症復發的可能性。在一些實施例中,由本文所述的藥物組合物介導的殺死癌細胞的方法可以達到至少約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高的腫瘤細胞死亡率。在一些實施例中,由本文所述的藥物組合物介導的殺死癌細胞的方法可以達到至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高的(未被溶瘤細胞的VV感染的)旁觀者效應腫瘤細胞死亡率。在一些實施例中,由本文所述的藥物組合物介導的減小腫瘤尺寸的方法可以減小腫瘤尺寸的至少約10%(包括例如至少約20%、30%、40%、 60%、70%、80%、90%或100%)。在一些實施例中,由本文所述的藥物組合物介導的抑制腫瘤轉移的方法能夠抑制轉移的至少約10%(包括例如至少約20%、30%、40%、 60%、70%、80%、90%或100%)。在一些實施例中,由本文所述的藥物組合物介導的延長個體的生存期的方法能夠將個體的生存期延長至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24個月。在一些實施例中,由本文所述的藥物組合物介導的延長癌症進展的時間的方法能夠將癌症進展的時間延長至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12周。
本文所述的方法適用於治療多種癌症,包括實體癌症和液體癌症。該方法可以應用於所有階段的癌症,包括早期階段癌症、非轉移性癌症、原發性癌、晚期癌症、局部晚期癌症、轉移性癌症或緩解中的癌症。本文所述的方法可以用作第一療法、第二療法、第三療法或與業內已知的其它類型的癌症療法的組合療法(所述其它類型的癌症療法諸如化學療法、外科手術、激素療法、放射、基因療法、免疫療法(諸如T細胞療法)、骨髓移植、幹細胞移植、靶向療法、冷凍療法、超聲療法、光動力療法、射頻消蝕等),在輔助環境中或新輔助環境中(即該方法可以在主要的/決定性的療法之前實施)。在一些實施例中,該方法用於治療以前已經進行過治療的個體。在一些實施例中,癌症是先前的療法難以治療的。在一些實施例中,該方法用於治療先前未經過治療的個體。
在一些實施例中,該方法適用於治療具有異常PD-L1表現、活性和/或信號傳導的癌症,包括,作為非限制性實例,黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、結腸癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌和膠質母細胞瘤。
因此,在一些實施例中,提供了一種治療免疫療法應答性實體瘤(諸如癌或腺癌,諸如具有異常PD-L1表現、活性和/或信號傳導的癌症)的方法,包括向個體施用有效量的包含分離的抗PD-L1構建體的藥物組合物,所述構建體包含特異性識別PD-L1的sdAb部分(諸如抗PD-L1 sdAb、抗PD-L1 HCAb、抗PD-L1/抗CTLA-4 HCAb、抗PD-L1/TIGIT雙特異性抗體、抗PD-L1/TIM-3 雙特異性抗體或抗PD-L1/LAG-3雙特異性抗體)。在一些實施例中,癌症是實體瘤(諸如結腸癌)。在一些實施例中,藥物組合物全身施用(諸如通過靜脈內)。在一些實施例中,藥物組合物局部施用(諸如通過腫瘤內)。在一些實施例中,該方法進一步包含向個體施用另外的癌症治療(諸如外科手術、放射、化學療法、免疫療法、激素療法或其組合)。在一些實施例中,個體是人。在一些實施例中,治療癌症的方法具有以下生物學活性中的一個或多個:(1) 殺死癌細胞 (包括旁觀者效應性殺傷);(2) 抑制癌細胞增生;(3) 在腫瘤內誘導免疫應答;(4) 減小腫瘤尺寸;(5) 緩解患有癌症的個體中的一種或多種症狀;(6)抑制腫瘤轉移;(7) 延長存活期;(8) 延長癌症進展的時間;以及(9) 預防、抑制癌症復發或降低癌症復發的可能性。在一些實施例中,由本文所述的藥物組合物介導的殺死癌細胞的方法可以達到至少約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高的腫瘤細胞死亡率。在一些實施例中,由本文所述的藥物組合物介導的殺死癌細胞的方法可以達到至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高的(未被溶瘤細胞的VV感染的)旁觀者效應腫瘤細胞死亡率。在一些實施例中,由本文所述的藥物組合物介導的減小腫瘤尺寸的方法可以減小腫瘤尺寸的至少約10%(包括例如至少約20%、30%、40%、 60%、70%、80%、90%或100%)。在一些實施例中,由本文所述的藥物組合物介導的抑制腫瘤轉移的方法能夠抑制轉移的至少約10%(包括例如至少約20%、30%、40%、 60%、70%、80%、90%或100%)。在一些實施例中,由本文所述的藥物組合物介導的延長個體的生存期的方法能夠將個體的生存期延長至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24個月。在一些實施例中,由本文所述的藥物組合物介導的延長癌症進展的時間的方法能夠將癌症進展的時間延長至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12周。
在一些實施例中,該方法適用於治療具有異常PD-L1或PD-L1/PD-L2表現、活性和/或信號傳導的癌症,包括,作為非限制性實例,血液學癌症和/或實體瘤。使用本發明的抗體可以抑制生長的一些癌症包括通常對免疫療法作出響應的癌症。用於治療的其它癌症的非限制性實例包括黑色素瘤(例如轉移性惡性黑色素瘤)、腎癌(例如明細胞癌)、前列腺癌(例如激素難治性前列腺腺癌)、乳腺癌、結腸癌和肺癌(例如非小細胞性肺癌)。另外,本發明包括使用本發明的抗體可以抑制生長的難治性或復發性惡性腫瘤。使用本發明的方法可以治療的其它癌症的實例包括骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門癌、胃癌、睾丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、 何傑金氏病(Hodgkin's Disease)、非何傑金氏淋巴瘤、食管癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病)、兒童實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)癌、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管發生、脊髓軸腫瘤、腦幹膠質細胞瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、類上皮癌、鱗狀細胞癌、T細胞性淋巴瘤、環境誘導的癌症(包括由石棉引起的那些癌症)以及所述癌症的組合。本發明還可用於治療轉移性癌、特別是表現PD-L1的轉移性癌(Iwaiet al. (2005)Int. Immunol. 17:133-144)。
因此,在一些實施例中,提供了一種治療免疫療法響應性實體瘤(諸如癌或腺癌,諸如具有異常PD-L1表現、活性和/或信號傳導和/或異常TIGIT、TIM3和LAG-3表現、活性和/或信號傳導的癌症)的方法,包括向個體施用有效量的包含分離的抗PD-L1構建體的藥物組合物,所述構建體包含與TIGIT、TIM3或LAG-3全長抗體融合的特異性識別PD-L1的單結構域抗體(sdAb)部分。在一些實施例中,提供了一種治療免疫療法響應性實體瘤(諸如癌或腺癌,諸如具有異常PD-L1表現、活性和/或信號傳導和/或異常TIGIT、TIM3、LAG-3表現、活性和/或信號傳導的癌症)的方法,包括向個體施用有效量的包含分離的抗PD-L1構建體的藥物組合物,所述構建體包含與TIGIT、TIM3或LAG-3全長抗體融合的特異性識別PD-L1的單結構域抗體(sdAb)部分。
在一些實施例中,本文所述的方法適用於治療結腸直腸癌,諸如腺癌、胃腸良性腫瘤、胃腸道間質瘤、平滑肌肉瘤、黑色素瘤或鱗狀細胞癌。
本申請的藥物組合物的劑量和所需藥物濃度可以依據特定預想用途而改變。適當的施用劑量或途徑的確定是業內普通技術人員熟知的。動物實驗提供了用於確定人類療法有效劑量的可靠指導。有效劑量的種間換算可以依據Mordenti, J.和Chappell, W. “The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics,” InToxicokinetics and New Drug Development , Yacobiet al ., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46中主張的原則進行。
當使用體內施用本文所述的包含抗PD-L1 sdAb部分的抗PD-L1構建體時,正常劑量量可以取決於施用途徑從每天約10 ng/kg最高至約100 mg/kg哺乳動物體重或更多的範圍內變化,較佳約1 mg/kg/日至10 mg/kg/日,諸如約1-3 mg/kg/日,約2-4 mg/kg/日,約3-5 mg/kg/日,約4-6 mg/kg/日,約5-7 mg/kg/日,約6-8 mg/kg/日,約6-6.5 mg/kg/日,約6.5-7 mg/kg/日,約7-9 mg/kg/日,或約8-10 mg/kg/日。以下在本申請的範圍內:不同製劑對於不同治療和不同病症是有效的,並且意圖治療特定器官或組織的施用可以使以不同於遞送至另一器官或組織的方式不同的方式遞送成為必需。此外,多個劑量可以通過一次或多次分開施用或通過連續輸注來施用。為了在若干天或更長的時間內重複施用,依據病症,保持治療直至發生希望抑制的疾病症狀。但是,其它劑量方案可以是可用的。該療法的進展易於通過習用技術和測定來監控。
在一些實施例中,藥物組合物施用一次(例如推注)。在一些實施例中,藥物組合物施用多次(諸如2、3、4、5、6次或更多次)。如果多次施用,可以通過相同或不同途徑進行,並且可以發生在相同位點或替代位點。藥物組合物可以每週2次,每週3次、每週4次、每週5次、每天、每天不間斷(daily without break)、每週一次、每週不間斷(weekly without break)、每2周1次、每3周1次、每月一次、每2月一次、每3月一次、每4月一次、每5月一次、每6月一次、每7月一次、每8月一次、每9月一次、每10月一次、每11月一次、或每年一次施用。施用之間的間隔可以為約24小時至48小時、2日至3日、3日至5日、5日至1周、1周至2周、2周至1月、1月至2月、2月至3月、3月至6月、6月至1年。間隔還可以是不規律的(例如依照腫瘤進展)。在一些實施例中,給藥時間表中無間斷。在一些實施例中,藥物組合物每4天施用,持續4次。用於特定患者的最佳劑量和治療方案可以由醫藥領域技術人員通過監測患者的疾病跡象和由此調整治療而容易地確定。
本申請的藥物組合物(包括但不限於複水製劑和液體製劑)被施用至需要用本文所述的抗PD-L1構建體治療的個體,較佳人,根據已知方法,諸如一次推注或通過在一段時間內的連續輸注的靜脈內施用,通過肌內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、靜脈內(i.v.)、動脈內、滑膜內、鞘內、口服、局部或吸入途徑。複水製劑可以通過將凍幹的本文所述的抗PD-L1構建體溶解在稀釋劑中使得蛋白質分散在各處來製備。適合在本申請中使用的示例性的藥學上可接受的(施用于人安全且無毒的)稀釋劑包括但不限於無菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液或鹽和/或緩衝液的水溶液。
在一些實施例中,藥物組合物通過皮下(即在皮膚下方)施用被施用至個體。為了該目的,可以使用注射器注射藥物組合物。但是,用於施用藥物組合物的其它裝置是可得的,諸如注射裝置;注射筆;自動注射器裝置、無針頭裝置;和皮下片狀物遞送系統。
在一些實施例中,藥物組合物被靜脈內施用至個體。在一些實施例中,藥物組合物被通過輸注諸如靜脈內輸注施用至個體。用於免疫療法的輸注技術是業內已知的(參見例如Rosenberget al ., New Eng. J. of Med. 319: 1676 (1988))。
V. 製備方法
本文所述的抗PD-L1構建體(諸如抗PD-L1單結構域抗體)可以使用業內已知的任何方法或本文所述的方法製備。還參見實例1-2。
製備單結構域抗體的方法已經被記載。參見,例如,Els Pardon et al,Nature Protocol , 2014; 9(3): 674。單結構域抗體(諸如VH H)可以使用業內已知的方法獲得,諸如通過免疫駱駝科物種(諸如駱駝或美洲駝)並且從其獲得雜交瘤,或者通過使用業內已知的分子生物學技術克隆單結構域抗體的文庫並且隨後通過使用未選擇的文庫的單個克隆的ELISA或通過使用噬菌體展示來進行選擇。
為了重組產生單結構域抗體,將編碼該單結構域抗體的核酸分離並插入到複製型載體中用於進一步克隆(DNA擴增)或用於表現。編碼單結構域抗體的DNA可以使用習用程序容易地分離和定序(例如通過使用能夠與編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)。許多載體是可得的。載體的選擇部分取決於待使用的主體細胞。一般地,較佳的主體細胞是原核或真核(一般是哺乳動物)來源。
實施例
本發明還提供了以下非限制性實施例。
實施例1是一種分離的抗PD-L1構建體,其包含特異性識別PD-L1的單結構域抗體(sdAb)部分,其中所述sdAb部分包含CDR1、CDR2和CDR3,所述CDR1包含SEQ ID NO: 51-100中任一個的胺基酸序列或其包含最高達約3個胺基酸置換的變異體,所述CDR2包含SEQ ID NO: 151-200中任一個的胺基酸序列或其包含最高達約3個胺基酸置換的變異體,所述CDR3包含SEQ ID NO: 251-300中任一個的胺基酸序列或其包含最高達約3個胺基酸置換的變異體。
實施例2是實施例1的分離的抗PD-L1構建體,其中所述sdAb部分包含包含SEQ ID NO: 51-100中任一個的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 151-200中任一個的胺基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO: 251-300中任一個的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換。
實施例3是實施例1-2中任一項的分離的抗PD-L1構建體,其中所述sdAb部分包含以下中的任一個:
(1) 包含SEQ ID NO: 51的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 151的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 251的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(2) 包含SEQ ID NO: 52的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 152的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 252的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(3) 包含SEQ ID NO: 53的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 153的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 253的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(4) 包含SEQ ID NO: 54的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 154的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 254的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(5) 包含SEQ ID NO: 55的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 155的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 255的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(6) 包含SEQ ID NO: 56的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 156的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 256的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(7) 包含SEQ ID NO: 57的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 157的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 257的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(8) 包含SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 158的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 258的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(9) 包含SEQ ID NO: 59的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 159的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 259的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(10) 包含SEQ ID NO: 60的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 160的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 260的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(11) 包含SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 161的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 261的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(12) 包含SEQ ID NO: 62的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 162的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 262的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(13) 包含SEQ ID NO: 63的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 163的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 263的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(14) 包含SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 164的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 264的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(15) 包含SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 165的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 265的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(16) 包含SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 166的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 266的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(17) 包含SEQ ID NO: 67的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 167的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 267的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(18) 包含SEQ ID NO: 68的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 168的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 268的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(19) 包含SEQ ID NO: 69的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 169的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 269的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(20) 包含SEQ ID NO: 70的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 170的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 270的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(21) 包含SEQ ID NO: 71的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 171的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 271的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(22) 包含SEQ ID NO: 72的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 172的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 272的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(23) 包含SEQ ID NO: 73的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 173的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 273的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(24) 包含SEQ ID NO: 74的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 174的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 274的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(25) 包含SEQ ID NO: 75的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 175的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 275的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(26) 包含SEQ ID NO: 76的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 176的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 276的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(27) 包含SEQ ID NO: 77的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 177的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 277的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(28) 包含SEQ ID NO: 78的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 178的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 278的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(29) 包含SEQ ID NO: 79的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 179的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 279的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(30) 包含SEQ ID NO: 80的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 180的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 280的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(31) 包含SEQ ID NO: 81的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 181的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 281的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(32) 包含SEQ ID NO: 82的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 182的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 282的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(33) 包含SEQ ID NO: 83的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 183的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 283的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(34) 包含SEQ ID NO: 84的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 184的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 284的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(35) 包含SEQ ID NO: 85的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 185的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 285的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(36) 包含SEQ ID NO: 86的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 186的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 286的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(37) 包含SEQ ID NO: 87的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 187的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 287的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(38) 包含SEQ ID NO: 88的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 188的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 288的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(39) 包含SEQ ID NO: 89的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 189的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 289的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(40) 包含SEQ ID NO: 90的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 190的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 290的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(41) 包含SEQ ID NO: 91的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 191的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 291的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(42) 包含SEQ ID NO: 92的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 192的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 292的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(43) 包含SEQ ID NO: 93的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 193的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 293的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(44) 包含SEQ ID NO: 94的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 194的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 294的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(45) 包含SEQ ID NO: 95的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 195的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 295的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(46) 包含SEQ ID NO: 96的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 196的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 296的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(47) 包含SEQ ID NO: 97的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 197的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 297的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(48) 包含SEQ ID NO: 98的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 198的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 298的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(49) 包含SEQ ID NO: 99的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 199的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 299的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換;
(50) 包含SEQ ID NO: 100的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 200的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 300的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個胺基酸置換。
實施例4是實施例1-3中任一項的分離的抗PD-L1構建體,其中所述sdAb部分包含VH H結構域,所述VH H結構域具有含有以下的胺基酸序列:
a-1)位置37處的胺基酸殘基選自下組:F、Y、L、I和V,較佳Y和V,更佳F;
a-2)位置44處的胺基酸殘基選自下組:A、G、E、D、G、Q、R、S和L,較佳Q和G,更佳E;
a-3) 位置45處的胺基酸殘基選自下組:L、R和C;
a-4)位置103處的胺基酸殘基選自下組:G、W、R和S;和
a-5)為Q的位置108處的胺基酸殘基,
其中每個胺基酸位置按照Kabat編號。
實施例5是實施例4的分離的抗PD-L1構建體,其中所述sdAb部分包含VH H結構域,所述VH H結構域具有含有以下的胺基酸序列:
a-1)位置37處的胺基酸殘基選自下組:F、Y、L、I和V,較佳Y和V,更佳F;
a-2)位置44處的胺基酸殘基選自下組:G、E和Q;
a-3) 位置45處的胺基酸殘基選自下組:L和R;
a-4)位置103處的胺基酸殘基選自下組:G、W和R;和
a-5)為Q的位置108處的胺基酸殘基。
實施例6是實施例5的分離的抗PD-L1構建體,其中所述sdAb部分包含VH H結構域,所述VH H結構域具有含有以下的胺基酸序列:
a-1)位置37處的胺基酸殘基選自下組:F、Y和V;
a-2)位置44處的胺基酸殘基選自下組:G、E和Q;
a-3) 位置45處的胺基酸殘基選自下組:L和R;
a-4)為W或G的位置103處的胺基酸殘基;和
a-5)為Q的位置108處的胺基酸殘基,其任選地被人源化為L。
實施例7是實施例1-3中任一項的分離的抗PD-L1構建體,其中所述sdAb部分包含VH H結構域,所述VH H結構域具有含有以下的胺基酸序列:
b-1)位置37處的胺基酸殘基選自下組:F、Y、L、I和V,較佳Y和V,更佳F;
b-2)位置44處的胺基酸殘基選自下組:E、G和Q;
b-3) 為R的位置45處的胺基酸殘基;
b-4)位置103處的胺基酸殘基選自下組:W、G和S;和
b-5)位置108處的胺基酸殘基選自下組:Q和L,
其中每個胺基酸位置按照Kabat編號。
實施例8是實施例7的分離的抗PD-L1構建體,其中所述sdAb部分包含VH H結構域,所述VH H結構域具有含有以下的胺基酸序列:
b-1)位置37處的胺基酸殘基選自下組:F、Y、L、I和V;
b-2)位置44處的胺基酸殘基選自下組:E、G和Q;
b-3)為R的位置45處的胺基酸殘基;
b-4)為W或G的位置103處的胺基酸殘基;和
b-5)為Q的位置108處的胺基酸殘基,其任選地被人源化為L。
實施例9是實施例1-8中任一項的分離的抗PD-L1構建體,其中所述sdAb部分包含VH H結構域,所述VH H結構域包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體與SEQ ID NO: 351-400中任一個具有至少約80%、至少約90%,或至少約95%的序列同一性。
實施例10是實施例9的分離的抗PD-L1構建體,其中所述sdAb部分包含VH H結構域,所述VH H結構域包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體在所述VH H結構域中包含最高達約3個胺基酸置換。
實施例11是實施例1-10中任一項的分離的抗PD-L1構建體,其中所述sdAb部分與PD-L1之間的結合的KD 為約10-5 M至約10-12 M,約10-7 M至約10-12 M,或約10-8 M至約10-12 M。
實施例12是實施例1-11中任一項的分離的抗PD-L1構建體,其中所述特異性識別PD-L1的sdAb部分是駱駝科的、嵌合的、人的、部分人源化的、或全部人源化的。
實施例13是實施例1-12中任一項的分離的抗PD-L1構建體,其中所述分離的抗PD-L1構建體是僅重鏈抗體(HCAb)。
實施例14是實施例13的分離的抗PD-L1構建體,其中所述特異性識別PD-L1的sdAb部分與人IgG Fc融合。
實施例15是實施例13或14的分離的抗PD-L1構建體,其中所述HCAb是單體的或二聚的。
實施例16是實施例13-15中任一項的分離的抗PD-L1構建體,其中所述特異性識別PD-L1的sdAb部分包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列。
實施例17是實施例13-15中任一項的分離的抗PD-L1構建體,其中所述HCAb包含SEQ ID NO: 401-440中任一個的胺基酸序列。
實施例18是實施例1-13中任一項的分離的抗PD-L1構建體,其中所述分離的抗PD-L1構建體還包含特異性識別第二抗原的第二抗體部分。
實施例19是實施例18的分離的抗PD-L1構建體,其中所述第二抗體部分是全長抗體、Fab、Fab’、(Fab’)2、單鏈Fv (scFv)、scFv-scFv、微抗體、雙抗體、sdAb或抗體模擬物。
實施例20是實施例18或19的分離的抗PD-L1構建體,其中所述抗PD-L1構建體是單特異性的或多特異性的。
實施例21是實施例18-20中任一項的分離的抗PD-L1構建體,其中所述第二抗體部分是sdAb。
實施例22是實施例18-21中任一項的分離的抗PD-L1構建體,其中所述第二抗原是PD-L1。
實施例23是實施例22的分離的抗PD-L1構建體,其中所述分離的抗PD-L1構建體包含三個或更多個特異性識別PD-L1的sdAb。
實施例24是實施例22或23的分離的抗PD-L1構建體,其中所述第二抗體包含SEQ ID NO:351-400中任一個的胺基酸序列。
實施例25是實施例18-21中任一項的分離的抗PD-L1構建體,其中所述第二抗原是人血清白蛋白(HSA)。
實施例26是實施例18-21中任一項的分離的抗PD-L1構建體,其中所述第二抗原是CTLA-4,並且所述第二抗體是抗CTLA-4 sdAb。
實施例27是實施例18-26中任一項的分離的抗PD-L1構建體,其中所述特異性識別PD-L1的sdAb部分是在所述第二抗體部分的胺基(N)末端和/或羧基(C)末端。
實施例28是實施例18-21中任一項的分離的抗PD-L1構建體,其中所述第二抗體部分是全長抗體。
實施例29是實施例28的分離的抗PD-L1構建體,其中所述特異性識別PD-L1的sdAb部分的胺基(N)末端與所述全長抗體的至少一條重鏈的羧基(C)末端融合。
實施例30是實施例28的分離的抗PD-L1構建體,其中所述特異性識別PD-L1的sdAb部分的C末端與所述全長抗體的至少一條重鏈的N末端融合。
實施例31是實施例28-30中任一項的分離的抗PD-L1構建體,其中所述全長抗體特異性識別選自下組的多肽:TIGIT、TIM-3和LAG-3。
實施例32是實施例28-30中任一項的分離的抗PD-L1構建體,其中由所述sdAb部分特異性識別的PD-L1包含SEQ ID NO:441或SEQ ID NO:442的胺基酸序列。
實施例33是實施例28-30中任一項的分離的抗PD-L1構建體,其中所述特異性識別PD-L1的sdAb部分和所述第二抗體部分任選地通過肽連接子連接。
實施例34是實施例33的分離的抗PD-L1構建體,其中所述肽連接子包含SEQ ID NO: 443-445的胺基酸序列。
實施例35是第二分離的抗PD-L1構建體,其與實施例1-34中任一項的分離的抗PD-L1構建體競爭特異性結合PD-L1。
實施例36是實施例35的第二分離的抗PD-L1構建體,其中所述第二分離的抗PD-L1構建體包含CDR1、CDR2和CDR3,所述CDR1包含SEQ ID NO: 51-100中任一個的胺基酸序列或其包含最高達約3個胺基酸置換的變異體,所述CDR2包含SEQ ID NO: 151-200中任一個的胺基酸序列或其包含最高達約3個胺基酸置換的變異體,所述CDR3包含SEQ ID NO: 251-300中任一個的胺基酸序列或其包含最高達約3個胺基酸置換的變異體。
實施例37是一種藥物組合物,其包含實施例1-36中任一項的分離的抗PD-L1構建體和藥學上可接受的載劑。
實施例38是一種在有此需要的個體中治療患有PD-L1相關疾病的個體的方法,包括向所述個體施用有效量的實施例37的藥物組合物。
實施例39是實施例38的方法,其中所述PD-L1相關疾病是癌症。
實施例40是實施例39的方法,其中所述癌症是實體瘤。
實施例41是實施例39或40的方法,其中所述癌症是結腸癌。
實施例42是實施例39-41中任一項的方法,還包括向所述個體施用額外的癌症療法。
實施例43是實施例42的方法,其中所述額外的癌症療法是外科手術、放射、化療、免疫療法、激素療法或其組合。
實施例44是實施例38的方法,其中所述PD-L1相關疾病是病原體感染。
實施例45是實施例38-44中任一項的方法,其中所述藥物組合物被全身或局部施用。
實施例46是實施例45的方法,其中所述藥物組合物通過靜脈內施用。
實施例47是實施例45的方法,其中所述藥物組合物通過腫瘤內施用。
實施例48是實施例38-47中任一項的方法,其中所述個體是人。
實例
以下實例意圖是本發明的純示例,並且因此不應當被認為以任何方式限制本發明。以下實例和詳細描述通過示例性說明的方式提供,而不是通過限制的方式提供。
實例 1 :產生抗 PD-L1 sdAb
免疫
根據所有現行的動物福利條例用重組PD-L1 ECD蛋白免疫兩隻美洲駝。為了免疫,將抗原配製成具有CFA(初次免疫)或IFA(加強免疫)的乳劑。通過在頸部雙位點肌肉內注射施用抗原。每只動物接受每隔一周的兩次含有100μg的PD-L1 ECD乳劑注射和4次隨後的含有50μg的抗原的注射。在免疫期間的不同時間點,從動物採集10 ml血液樣品並製備血清。在使用免疫的PD-L1 ECD蛋白的基於ELISA的實驗中使用血清樣品驗證抗原特異性體液免疫應答的誘導(圖1和圖2)。最後一次免疫後五天,採集300ml的血液樣品。使用Ficoll-Paque梯度 (Amersham Biosciences)從300 ml血液樣品中分離外周血淋巴細胞(PBL),作為美洲駝重鏈免疫球蛋白(HCAb)的遺傳來源,得到1×109 個PBL。預期抗體的最大多樣性等於樣品化的B淋巴細胞的數目,約為PBL的數目的10%(1×108 )。美洲駝中的重鏈抗體的級分為最高達B淋巴細胞的數目的20%。因此,300 ml血液樣品中HCAb的最大多樣性計算為2×107 種不同分子。
文庫構建
將從PBL和淋巴結中提取的RNA用作用於RT-PCR的起始材料,以擴增編碼sdAb的基因片段。將這些片段克隆到內部噬菌粒載體中。在具有編碼sdAb的序列的讀碼框中,載體編碼C末端(His)6標簽。文庫大小為多於1×109 個。根據標準程序製備文庫噬菌體,並且在過濾除菌後將其保存在4℃中用於進一步使用。
選擇和高通量篩選
使用以上文庫使用固體跨越以及基於細胞的跨越進行選擇。對於兩個條件僅進行一輪選擇。分析每個選擇輸出的富集因素(#相對於對照的溶離物中存在的噬菌體)、PD-L1陽性克隆的多樣性和百分比(ELISA)。基於這些參數,選擇出最佳選擇用於進一步分析。為了這個目的,將來自每個選擇的輸出作為一個庫重新克隆到可溶性表現載體中用於高通量篩選。在具有sdAb編碼序列的讀碼框中,載體編碼C末端(His)6標簽。挑取克隆並將其培養在96深孔板(1 ml體積)中,並且通過添加IPTG和0.1%Triton誘導sdAb表現在上清液中。
分析上清液的結合PD-L1 ECD蛋白的能力(通過ELISA)和結合PD-L1穩定細胞株的能力(通過FACS)。對陽性結合物(binder)定序並且選擇單克隆用於進一步表徵。
將單克隆培養在2XYT培養基中,並且通過IPTG誘導sdAb表現在上清液中。分析單結合物的上清液的抑制PD-L1-PD-1相互作用的能力。為了這個目的,將上清液與PD-L1 ECD蛋白溫育,然後將複合物添加到PD-1穩定細胞株用於進行結合評價。在PD-1細胞株上具有陰性信號的sdAb被認為是PD-L1抑制劑。
選擇所有可能的抑制劑用於進行通過在BIAcore T200儀器上進行表面等離子共振(SPR)的離率分析(off-rate analysis)。使用解離階段計算每個單獨sdAb的Koff 值。
產生sdAb
通過ÄKTA從周質提取物中純化His6標記的sdAb。依照製造商的說明書進行NTA樹脂處理。將製備的周質提取物與樹脂在旋轉器上在室溫溫育30分鐘。用PBS洗滌樹脂並將其轉移至柱。用15 mM咪唑洗滌填裝的樹脂。使用150 mM咪唑從柱上溶離sdAb。通過在Hybond膜上點樣分析溶離的級分,並且用Ponceau進行可視化。彙集含有蛋白質的級分並且相對於PBS透析。將透析的蛋白質收集、過濾除菌、測定濃度並保存在-20°C。
為了確定純度,在12% SDS-PAGE凝膠上分析蛋白質樣品。將10 μl Laemmli樣品緩衝液添加至10 μl (2 µg)純化的蛋白質中,然後將樣品在95℃加熱10分鐘,冷卻並裝載到12% SDS-PAGE凝膠上。依照一般程序處理凝膠並且用考馬斯亮藍(CBB)染色。
產生HCAb
通過融合sdAb與人Fc區而產生HCAb構建體。製備大量(maxiprep)HCAb構建體用於進行CHO-K1細胞瞬時表現和純化。通過穿過含有蛋白A瓊脂糖樹脂的柱隨後穿過尺寸排阻柱的層析法純化表現的HCAb。
為了確定純度,在12% SDS-PAGE凝膠上分析蛋白質樣品。將10 μl Laemmli樣品緩衝液添加至10 μl (2 µg)純化的蛋白質中,然後將樣品在95℃加熱10分鐘,冷卻並裝載到12% SDS-PAGE凝膠上。依照一般程序處理凝膠並且用考馬斯亮藍(CBB)染色。純化的HCAb的純度為>85%。數據總結在表20中。
表20. HCAb純度的總結
sdAb親和力測定和HCAb親和力測定
通過在BIAcore T200儀器上進行表面等離子體共振(SPR),測定每個sdAb和HCAb的親和力常數(Kd )。簡言之,將PD-L1 His胺偶聯至CM5傳感器芯片上,密度不高於100 RU。注射0.33~27 nM的5種不同濃度的抗PD-L1 sdAb或抗PD-L1 HCAb。所有實驗中的流速都是30 μl/min。結合和解離階段分別是5分鐘和10分鐘。使用甘胺酸/HCl pH 1.5再生芯片。sdAb和HCAb的不同濃度下的結合曲線用於計算動力學參數kon ,koff 和KD (圖3A-3N和圖4A-4N)。動力學數據總結於表3和表4中。
表3. sdAb針對PD-L1的親和力測定
表4. HCAb針對PD-L1的親和力測定
*kd在通過Biacore T200能夠量測的界限外。
靶標結合測定
使用表面等離子共振方法(例如BIACORE®)、酶聯免疫吸附測定、熒光輔助細胞分選方法(FACS)或其組合測定純化的抗原結合蛋白結合PD-L1的能力。可以在PD-L1轉染的細胞上進行這些分析。
從貼壁培養瓶上解離表現人PD-L1的CHO-K1細胞,並且將其與不同濃度的抗體和恒定濃度的抗PD-L1 sdAb或HCAb混合(在96孔板中)。Tecentriq®用作抗PD-L1抗體陽性對照。使抗體和細胞溫育物在室溫下平衡30分鐘,用FACS緩衝液(含有1% BSA的PBS)洗滌三次。然後添加FITC綴合的抗人IgG的第二抗體,在室溫下溫育15分鐘。用Prism(GraphPad Software, San Diego, CA)使用非線性回歸分析數據,並且計算EC50 值(圖5A和圖5B)。
通過FACS分析配體結合的抑制
使用流式細胞術研究配體結合的阻斷。對於抗PD-L1 HCAb評價,從貼壁培養瓶上解離表現人PD-L1的CHO-K1細胞,並將其與不同濃度的抗體和恒定濃度的生物素標記的hPD-1/Fc蛋白混合(二者均在96孔板中)。Tecentriq®用作抗PD-L1抗體陽性對照。使混合物在室溫下平衡30分鐘,用FACS緩衝液(含有1% BSA的PBS)洗滌三次。然後添加PE/Cy5鏈黴親和素第二抗體,在室溫下溫育15分鐘。再次用FACS緩衝液洗滌細胞,並通過流式細胞術分析。用Prism(GraphPad Software, San Diego, CA)使用非線性回歸分析數據,並且計算IC50 值。如圖6A和圖6B所示,競爭測定證實了大多數抗PD-L1 HCAb在低濃度下(1-10 µg/ml)有效抑制PD-L1-PD-1相互作用的能力,大多數HCAb的IC50 與Tecentriq®相當。
基於PD-L1的阻斷測定
CHO-K1穩定表現PD-L1的細胞和Jurkat效應細胞用於評估抗PD-L1 sdAb和HCAb評價的PD-1阻斷。效應細胞含有螢光素酶構建體,該構建體在PD-1/PD-L1受體-配體相互作用被中斷時(例如PD-L1細胞與表現PD-1的效應細胞混合時)被誘導。因此,可以通過量測螢光素酶的報告活性,評估抗PD-L1 sdAb和HCAb抑制CHO-K1穩定細胞上的PD-L1的功效。如下進行該測定。
在第一天,在37℃水浴中解凍PD-L1細胞直至細胞剛好被解凍(約3-4分鐘),將0.5 mL解凍的細胞轉移至14.5 mL的細胞恢復培養基(10% FBS/F-12)中。通過溫和顛倒管1-2次很好地混合細胞懸液。然後將細胞懸液轉移至無菌試劑容器中,並且分配到測定板中,每孔含有25 μL細胞懸液。每孔添加100 μL的測定培養基作為空白對照。對於用作空白對照的孔,每孔加入100 μ0細胞回收培養基。然後給板蓋上蓋子,在CO2 培養箱中在37℃溫育過夜。
在測定那天,製備新鮮的測定緩衝液(RPMI 1640 + 1% FBS)。對每個對照抗PD-L1抗體(例如Tecentriq®)、sdAb或HCAb在測定緩衝液中進行八點系列稀釋。優化起始濃度和稀釋方案,以實現完全劑量反應曲線。從CO2 培養箱中取回含有PD-L1細胞的測定板。從所有孔中每孔除去95μl的培養基。向含有PD-L1細胞的孔中每孔添加40 μL的對照抗PD-L1抗體或抗原結合蛋白的系列稀釋物。向每個板的空白對照孔中每孔添加80 μL測定緩衝液。
接下來,在37℃水浴中解凍PD-1效應細胞直至細胞剛好被解凍(約3-4分鐘)。通過用移液管上下吸取在小管中溫和混合細胞懸浮液,將0.5 mL的細胞添加至5.9 mL的測定緩衝液中。通過溫和顛倒管1-2次很好地混合細胞懸液。然後將細胞懸液轉移至無菌試劑容器中,並且將40μL的細胞懸浮液分配到每個含有PD-1細胞和對照抗體或雙特異性抗原結合蛋白的孔中。然後給板蓋上蓋子,在CO2 培養箱中在37℃溫育6小時。
通過將一瓶緩衝液轉移至含有受質的瓶中而重新構建螢光素酶測定體系。將體系保存在室溫下,並且屏蔽光線用於同一天的使用。6小時溫育後,從CO2 培養箱中取出測定板,並且使其在環境溫度下平衡5-10分鐘。將80μL的試劑添加到每孔。在環境溫度下溫育板5-10分鐘。在GloMax® Discover系統(Promega, Madison, WI)中或具有發光型發光讀取能力的讀板儀中量測發光。
發光表示為相對光單位(RLU)。具有稀釋的抗體或雙特異性抗原結合蛋白的孔的RLU值被標準化為無抗體或雙特異性抗原結合蛋白對照的RLU,以提供螢光素酶誘導的倍數。將數據作圖為RLU對比抗體或雙特異性抗原結合蛋白的濃度的Log10 ,以及誘導倍數對比抗體或雙特異性抗原結合蛋白的濃度的Log10 。使用曲線擬合軟件諸如GraphPad Prism將數據擬合到曲線上並確定每個雙特異性抗原結合蛋白和對照抗PD-1抗體的EC50 (圖7A至7O和圖8A至8O,表5和表6)。
表5. sdAb的基於PD-L1的阻斷測定的EC50
表6. HCAb的基於PD-L1的阻斷測定的EC50
實例 2 PD-L1 sdAb 人源化
選擇五個抗PD-L1 sdAb(AS06730、AS06750、AS11948、AS06617和AS06675)用於人源化。將野生型駱駝科sdAb的蛋白質序列與具有最高同源性程度的5個最接近的人種系序列比對。選擇最佳的人種系序列作為人受體。製成同源性模型。根據模型分析數據,可能對抗原結合或抗體支架形成至關重要的殘基保留不變,而選擇剩餘的殘基用於轉變成人對應物。首先生成一組四個序列優化的變異體(第一階段)。分析這些變異體的大量參數,得到的結果用於設計第二組sdAb(第二階段)。對於每個野生型sdAb,設計1-9個人源化的sdAb用於進行結合、穩定性和功能評價,它們的序列比對結果在圖9A-9E中示出。
產生人源化的HCAb
通過融合sdAb和人Fc區產生HCAb構建體。製備大量HCAb構建體用於進行CHO-K1細胞瞬時表現和純化。通過穿過含有蛋白A瓊脂糖樹脂的柱隨後穿過尺寸排阻柱的層析法純化表現的HCAb。
人源化的HCAb的親和力等級
使用包被在CM5(Biacore)傳感器芯片上的重組人PD-L1 His蛋白(R&D系統)測定每個人源化的HCAb與PD-L1的結合動力學。使用表面等離子共振,使每種抗原結合蛋白流過抗原包被的芯片。或者,在CM5傳感器芯片上捕獲每種抗原結合蛋白,在其上應用人PD-1-His蛋白。僅選擇與親本HCAb的結合親和力相當的人源化克隆的結合親和力用於進一步表徵(表7-11)。
表7. 人源化sdAb(AS06730)的親和力等級
表8. 人源化sdAb(AS06750)的親和力等級
表9. 人源化sdAb(AS11948)的親和力等級
表10. 人源化sdAb(AS06617)的親和力等級
表11. 人源化sdAb(AS06775)的親和力等級
親和力測定
選擇AS06730S、AS06730SVH3a、AS06730SVH12、AS06730AVH12M8、AS06730SVH12M9、AS06750VH2、AS06750VH11、AS06750VH4、AS11948S、AS11948SVH12、AS11948SV12M8、AS11948SV12M9、AS06617VH11、AS06775VH11和AS06775VH4用於親和力測定。通過在BIAcore T200儀器上進行表面等離子共振(SPR)測定每個HCAb的親和力常數(Kd )。簡言之,對於大多數HCAb親和力測定,將PD-L1 His胺偶聯至CM5傳感器芯片上,密度不高於100 RU。注射0.11~27 nM的5個不同濃度的抗PD-L1 HCAb。所有實驗中的流速都是30 μl/min。結合和解離階段分別是5分鐘和10分鐘。使用甘胺酸/HCl pH 1.5再生芯片。對於AS06730SVH12、AS06730SVH12M8、AS06730VH12M9、AS11948SV12、AS11948SV12M8和AS11948SV12M9 HCAb親和力測定,通過抗人IgG抗體在CM傳感器芯片上捕獲抗PD-L1 HCAb,密度不高於100 RU。注射0.33~27 nM的5種不同濃度的抗PD-L1 His。結合和解離階段是5分鐘。HCAb的不同濃度下的結合曲線用於計算動力學參數kon koffKd (圖10A-10T)。動力學數據總結於表12和表13中。
表12. 人源化HCAb的親和力參數
表13. 人源化HCAb的親和力參數
基於PD-L1的阻斷測定
如實例1中所述進行基於PD-L1的阻斷測定。如圖11A-11Q所示,所有選擇的人源化抗PD-L1 HCAb在抑制PD-L1和PD-1之間的結合方面與Tecentriq®相當。EC50 數據總結於表14中。
表14. HCAb的基於PD-L1的阻斷測定的EC50
人源化HCAb的體內活性
在本文所述的研究中,研究了針對鼠科腫瘤模型的PD-L1 HCAb阻斷功效。PD-L1相互作用的抑制被提出通過恢復抗腫瘤CD8+ T細胞應答而產生治療效果,因此,在同系鼠科腫瘤模型中進行臨床前功效研究,在所述模型中主體的免疫系統是完全完整的。使用人PD-1轉基因小鼠。
在該研究中,在小鼠的右側翼皮下接種1×106 個過表現人PD-L1的MC38結腸癌細胞。當腫瘤達到˜100 mm3 的平均體積時,將小鼠分成多個治療組(n=5)(定義為研究第0天)。列出了本研究中受測的6個人源化HCAb:AS06730QVH1、AS06750VH11、AS11948SVH12、AS06617VH11、AS06617VH11、AS11948QVH1和AS06775VH11。在第0天、第2天、第5天、第7天、第9天和第12天向這些組靜脈施用基準抗體MEDI4736 (10 mg/kg)或人源化HCAb (5.33 mg/kg)。用10 ml/kg的PBS處理對照組。在研究期間每週兩次量測腫瘤。與對照組相比,所有治療組都顯示出顯著的功效(P<0.050)(圖12)。這些觀察結果支持了抗PD-L1治療作為一種用於促進抗腫瘤CD8+ T細胞應答的有效策略。
表15. 分離的sdAb的CDR
ID: SEQ ID NO
表16. 架構區1和2
ID: SEQ ID NO;FR:架構區
表17. 架構區3和4
ID: SEQ ID NO;FR:架構區
表18. sdAb
ID: SEQ ID NO
表19. HCAb
當與附圖一起閱讀時會更好地理解本發明的上述概述以及以下詳述。為了示例性說明本發明的目的,顯示了目前較佳的附圖實施例。但是,應理解的是,本發明不限於所顯示的準確安排和手段。在附圖中:
圖1描繪了免疫前血清和第4次和第6次用重組PD-L1 ECD蛋白免疫後的免疫血清的免疫應答評估。
圖2描繪了第6次用重組PD-L1 ECD蛋白免疫(終點采血)後重鏈抗體(IgG2和IgG3)的免疫應答評估;從免疫前血清分離的重鏈抗體用作陰性對照。
圖3A-3N描繪了選擇的sdAb (AS06617 (圖3A); AS06618 (圖3B); AS06628 (圖3C); AS06682 (圖3D); AS06686 (圖3E); AS06703 (圖3F); AS06730 (圖3G); AS06750 (圖3H); AS06775 (圖3I); AS06778 (圖3J); AS06791 (圖3K); AS11947 (圖3L); AS11948 (圖3M);和AS12003 (圖3N))的親和力測定;PD-L1被固定到芯片上,並且抗PD-L1 sdAb作為分析物以0.11、0.33、1、3和9 nM的濃度流過。
圖4A-4N描繪了選擇的sdAb (AS06617 (圖4A); AS06618 (圖4B); AS06628 (圖4C); AS06682 (圖4D); AS06686 (圖4E); AS06703 (圖4F); AS06730 (圖4G); AS06750 (圖4H); AS06775 (圖4I); AS06778 (圖4J); AS06791 (圖4K); AS11947 (圖4L); AS11948 (圖4M); 和AS12003 (圖4N))的親和力測定;PD-L1被固定到芯片上,並且抗PD-L1 HCAb作為分析物以0.11、0.33、1、3和9 nM的濃度流過。
圖5A和5B描繪了基於選擇的抗PD-L1 HCAb的FACS使用穩定表現PD-L1的細胞株的相對結合測定:Tecentriq®用作陽性抗PD-L1抗體對照。
圖6A和6B描繪了通過使用穩定表現PD-L1的細胞株和生物素標記的hPD-1/Fc蛋白實現的基於FACS的選擇的抗PD-L1 HCAb的配體競爭測定:Tecentriq®用作陽性抗PD-L1抗體對照。
圖7A-7O描繪了通過基於PD-L1的阻斷測定實現的純化的sdAb(AS06617 (圖7A); AS06618 (圖7B); AS06628 (圖7C); AS06682 (圖7D); AS06686 (圖7E); AS06703 (圖7F); AS06730 (圖7G); AS06750 (圖7H); AS06775 (圖7I); AS06778 (圖7J); AS06791 (圖7K); AS11947 (圖7L); AS11948 (圖7M); AS12003 (圖7N); 和Tecentriq (圖7O))的功能活性評估:Tecentriq®用作陽性抗PD-L1抗體對照。
圖8A-8O描繪了通過基於PD-L1的阻斷測定實現的純化的最高的HCAb(AS06617 (圖8A); AS06618 (圖8B); AS06628 (圖8C); AS06682 (圖8D); AS06686 (圖8E); AS06703 (圖8F); AS06730 (圖8G); AS06750 (圖8H); AS06775 (圖8I); AS06778 (圖8J); AS06791 (圖8K); AS11947 (圖8L); AS11948 (圖8M); AS12003 (圖8N);和Tecentriq (圖8O))的功能活性評估:Tecentriq®用作陽性抗PD-L1抗體對照。
圖9A-9E描繪了三個野生型抗PD-L1 sdAb和人源化後的前1-9個克隆的sdAb序列比對,架構區中相對於人受體(與野生型sdAb共有最高程度的同源性的最佳人種系序列)的胺基酸差異為深灰色陰影:
圖9A描繪了AS06730 (SEQ ID NO: 360)、人源化後的前9個克隆(SEQ ID NO: 376-384)和共有序列的sdAb序列比對;
圖9B描繪了AS06750 (SEQ ID NO: 361)、人源化後的前5個克隆(SEQ ID NO: 385-389)和共有序列的sdAb序列比對;和
圖9C描繪了AS11948 (SEQ ID NO: 372)、人源化後的前9個克隆(SEQ ID NO: 390-398)和共有序列的sdAb序列比對;
圖9D描繪了AS06617 (SEQ ID NO: 351)、人源化後的前1個克隆(SEQ ID NO: 399)和共有序列的sdAb序列比對;
圖9E描繪了AS06775 (SEQ ID NO: 365)、人源化後的前1個克隆(SEQ ID NO: 400)和共有序列的sdAb序列比對。
圖10A-10T描繪了選擇的人源化HCAb與親本HCAb的親和力測定:
圖10A-10C((AS06730 (圖10A); AS06730S (圖10B); AS06730SVH3a (圖10C)):親和力測定使用被固定到芯片上的PD-L1 His和作為分析物的濃度為0.11、0.33、1、3和9 nM的抗PD-L1 HCAb完成;
圖10D-10F(AS06730SVH12 (圖10D); AS06730SVH12M8 (圖10E); AS06730SVH12M9 (圖10F)):親和力測定使用被抗人IgG捕獲到芯片上的HCAb和作為分析物的濃度為0.33、1、3、9 和27nM的PD-L1 His完成;
圖10G-10J(AS06750 (圖10G); AS06750VH2 (圖10H); AS06750VH11 (圖10I); AS06750VH4 (圖10J)):親和力測定使用被固定到芯片上的PD-L1 His和作為分析物的濃度為0.11、0.33、1、3和9 nM的抗PD-L1 HCAb完成;
圖10K-10L(AS11948 (圖10K); AS11948S (圖10L)):親和力測定使用被固定到芯片上的PD-L1 His和作為分析物的濃度為0.11、0.33、1、3和9 nM的抗PD-L1 HCAb完成;
圖10M-10O(AS11948SV12 (圖10M); AS11948SV12M8 (圖10N); AS11948V12M9 (圖10O)):親和力測定使用被抗人IgG捕獲到芯片上的HCAb和作為分析物的濃度為0.33、1、3、9和27nM的PD-L1 His完成;
圖10P-10Q(AS06617 (圖10P); AS06617VH11 (圖10Q)):親和力測定使用被固定到芯片上的PD-L1 His和作為分析物的濃度為0.11、0.33、1、3和9 nM的抗PD-L1 HCAb完成;
圖10R-10T(AS06775 (圖10R); AS06775VH11 (圖10S); AS06775VH4 (圖10T)):親和力測定使用被固定到芯片上的PD-L1 His和作為分析物的濃度為0.11、0.33、1、3和9 nM的抗PD-L1 His完成。
圖11A-11Q(AS06730 (圖11A); AS06730S (圖11B); AS06730SVH3a (圖11C); AS06730SVH12 (圖11D); AS06750 (圖11E); AS06750VH2 (圖11F); AS06750VH11 (圖11G); AS06750VH4 (圖11H); AS11948 (圖11I); AS11948S (圖11J); AS11948SVH12 (圖11K); AS11948SVH12M8 (圖11L); AS06617 (圖11M); AS06617VH11 (圖11N); AS06775 (圖11O); AS06775VH11 (圖11P); AS06775VH4 (圖11Q))描繪了通過基於PD-L1的阻斷測定實現的純化的最高人源化的HCAb與親本HCAb的功能活性評估。
圖12描繪了6個人源化的HCAb(AS06730QVH1、AS06750VH11、AS11948SVH12、AS06617VH11、AS06617VH11、AS11948QVH1和AS06775VH11)的體內功效研究。

Claims (45)

  1. 一種分離的抗PD-L1構建體,其包含特異性識別PD-L1的單結構域抗體(sdAb)部分,其中所述sdAb部分包含CDR1、CDR2和CDR3,所述CDR1包含SEQ ID NO: 51-100中任一個的胺基酸序列或其包含最高達約3個胺基酸置換的變異體,所述CDR2包含SEQ ID NO: 151-200中任一個的胺基酸序列或其包含最高達約3個胺基酸置換的變異體,所述CDR3包含SEQ ID NO: 251-300中任一個的胺基酸序列或其包含最高達約3個胺基酸置換的變異體。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述sdAb部分包含下列中的任一項: (1) 包含SEQ ID NO: 51的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 151的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 251的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如1個、2個或3個)胺基酸置換; (2) 包含SEQ ID NO: 52的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 152的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 252的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (3) 包含SEQ ID NO: 53的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 153的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 253的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (4) 包含SEQ ID NO: 54的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 154的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 254的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (5) 包含SEQ ID NO: 55的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 155的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 255的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (6) 包含SEQ ID NO: 56的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 156的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 256的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (7) 包含SEQ ID NO: 57的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 157的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 257的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (8) 包含SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 158的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 258的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (9) 包含SEQ ID NO: 59的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 159的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 259的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (10) 包含SEQ ID NO: 60的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 160的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 260的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (11) 包含SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 161的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 261的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (12) 包含SEQ ID NO: 62的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 162的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 262的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (13) 包含SEQ ID NO: 63的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 163的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 263的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (14) 包含SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 164的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 264的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (15) 包含SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 165的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 265的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (16) 包含SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 166的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 266的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (17) 包含SEQ ID NO: 67的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 167的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 267的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (18) 包含SEQ ID NO: 68的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 168的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 268的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (19) 包含SEQ ID NO: 69的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 169的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 269的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (20) 包含SEQ ID NO: 70的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 170的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 270的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (21) 包含SEQ ID NO: 71的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 171的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 271的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (22) 包含SEQ ID NO: 72的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 172的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 272的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (23) 包含SEQ ID NO: 73的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 173的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 273的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (24) 包含SEQ ID NO: 74的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 174的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 274的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (25) 包含SEQ ID NO: 75的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 175的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 275的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (26) 包含SEQ ID NO: 76的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 176的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 276的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (27) 包含SEQ ID NO: 77的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 177的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 277的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (28) 包含SEQ ID NO: 78的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 178的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 278的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (29) 包含SEQ ID NO: 79的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 179的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 279的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (30) 包含SEQ ID NO: 80的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 180的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 280的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (31) 包含SEQ ID NO: 81的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 181的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 281的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (32) 包含SEQ ID NO: 82的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 182的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 282的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (33) 包含SEQ ID NO: 83的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 183的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 283的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (34) 包含SEQ ID NO: 84的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 184的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 284的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (35) 包含SEQ ID NO: 85的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 185的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 285的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (36) 包含SEQ ID NO: 86的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 186的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 286的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (37) 包含SEQ ID NO: 87的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 187的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 287的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (38) 包含SEQ ID NO: 88的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 188的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 288的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (39) 包含SEQ ID NO: 89的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 189的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 289的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (40) 包含SEQ ID NO: 90的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 190的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 290的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (41) 包含SEQ ID NO: 91的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 191的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 291的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (42) 包含SEQ ID NO: 92的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 192的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 292的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (43) 包含SEQ ID NO: 93的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 193的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 293的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (44) 包含SEQ ID NO: 94的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 194的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 294的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (45) 包含SEQ ID NO: 95的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 195的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 295的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (46) 包含SEQ ID NO: 96的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 196的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 296的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (47) 包含SEQ ID NO: 97的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 197的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 297的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (48) 包含SEQ ID NO: 98的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 198的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 298的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (49) 包含SEQ ID NO: 99的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 199的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 299的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換; (50) 包含SEQ ID NO: 100的胺基酸序列的CDR1;包含SEQ ID NO: 200的胺基酸序列的CDR2;和包含SEQ ID NO: 300的胺基酸序列的CDR3;或其變異體,所述變異體在所述多個CDR區中包含最高達約3個(諸如約1個、2個或3個)胺基酸置換。
  3. 如申請專利範圍第1項至第2項中任一項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述sdAb部分包含VH H結構域,所述VH H結構域包含以下任一項的胺基酸序列: a-1)位置37處的胺基酸殘基選自下組:F、Y、L、I和V,較佳Y和V,更佳F; a-2)位置44處的胺基酸殘基選自下組:A、G、E、D、G、Q、R、S和L,較佳Q和G,更佳E; a-3)位置45處的胺基酸殘基選自下組:L、R和C; a-4)位置103處的胺基酸殘基選自下組:W、R、G和S;和 a-5)位置108處的胺基酸殘基為Q;或 b-1)位置37處的胺基酸殘基選自下組:F、Y、L、I和V,較佳Y和V,更佳F; b-2)位置44處的胺基酸殘基選自下組:E、Q和G; b-3)位置45處的胺基酸殘基為R; b-4)位置103處的胺基酸殘基選自下組:W、R和S;和 b-5)位置108處的胺基酸殘基選自下組:Q和L, 其中每個胺基酸位置按照Kabat編號。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述sdAb部分包含VH H結構域,所述VH H結構域包含以下任一項的胺基酸序列: a-1)位置37處的胺基酸殘基選自下組:F、Y、L、I和V,較佳Y和V,更佳F; a-2)位置44處的胺基酸殘基選自下組:G、E和Q; a-3)位置45處的胺基酸殘基選自下組:L和R; a-4)位置103處的胺基酸殘基選自下組:W、G和R;和 a-5)位置108處的胺基酸殘基為Q;或 b-1)位置37處的胺基酸殘基選自下組:F、Y、L、I和V; b-2)位置44處的胺基酸殘基選自下組:E、G和Q; b-3)位置45處的胺基酸殘基為R; b-4)位置103處的胺基酸殘基為W或G;和 b-5)位置108處的胺基酸殘基為Q, 其中所述胺基酸位置按照Kabat編號,並且其中位置108處的Q可以任選地被人源化為L。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述sdAb部分包含VH H結構域,所述VH H結構域包含以下任一項的胺基酸序列: a-1)位置37處的胺基酸殘基選自下組:F、Y和V; a-2)位置44處的胺基酸殘基選自下組:G、E和Q; a-3)位置45處的胺基酸殘基選自下組:L和R; a-4)位置103處的胺基酸殘基為W或G;和 a-5)位置108處的胺基酸殘基為Q; 其中所述胺基酸位置按照Kabat編號,並且其中位置108處的Q可以任選地被人源化為L。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述sdAb部分包含VH H結構域,所述VH H結構域包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體與SEQ ID NO: 351-400中任一個具有至少約80%、至少約90%,或至少約95%的序列同一性。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述sdAb部分包含VH H結構域,所述VH H結構域包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列或其變異體,所述變異體在所述VH H結構域中包含最高達約3個胺基酸置換。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述sdAb部分與PD-L1之間的結合的Kd 為約10-5 M至約10-12 M,約10-7 M至約10-12 M,或約10-8 M至約10-12 M。
  9. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述特異性識別PD-L1的sdAb部分是駱駝科的、嵌合的、人的、部分人源化的、或全部人源化的。
  10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述分離的抗PD-L1構建體是僅重鏈抗體(HCAb)。
  11. 如申請專利範圍第90項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述特異性識別PD-L1的sdAb部分與人IgG Fc融合。
  12. 如申請專利範圍第90項或第101項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述HCAb是單體的或二聚的。
  13. 如申請專利範圍第10項至第12項中任一項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述特異性識別PD-L1的sdAb部分包含SEQ ID NO: 351-400中任一個的胺基酸序列。
  14. 如申請專利範圍第10項至第12項中任一項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述HCAb包含SEQ ID NO: 401-440中任一個的胺基酸序列。
  15. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述分離的抗PD-L1構建體還包含特異性識別第二抗原的第二抗體部分。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述第二抗體部分是全長抗體、Fab、Fab’、(Fab’)2、單鏈Fv (scFv)、scFv-scFv、微抗體、雙抗體、sdAb或抗體模擬物。
  17. 如申請專利範圍第15項或第16項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述抗PD-L1構建體是單特異性的或多特異性的。
  18. 如申請專利範圍第15項至第17項中任一項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述第二抗體部分是sdAb。
  19. 如申請專利範圍第15項至第18項中任一項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述第二抗原是PD-L1。
  20. 如申請專利範圍第19項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述分離的抗PD-L1構建體包含三個或更多個特異性識別PD-L1的sdAb。
  21. 如申請專利範圍第19項或第20項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述第二抗體包含SEQ ID NO:351-400中任一個的胺基酸序列。
  22. 如申請專利範圍第15項至第18項中任一項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述第二抗原是人血清白蛋白(HSA)。
  23. 如申請專利範圍第15項至第18項中任一項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述第二抗原是CTLA-4,並且所述第二抗體是抗CTLA-4 sdAb。
  24. 如申請專利範圍第15項至第23項中任一項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述特異性識別PD-L1的sdAb部分是在所述第二抗體部分的胺基(N)末端和/或羧基(C)末端。
  25. 如申請專利範圍第15項至第21項中任一項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述第二抗體部分是全長抗體。
  26. 如申請專利範圍第25項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述特異性識別PD-L1的sdAb部分的胺基(N)末端與所述全長抗體的至少一條重鏈的羧基(C)末端融合。
  27. 如申請專利範圍第25項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述特異性識別PD-L1的sdAb部分的C末端與所述全長抗體的至少一條重鏈的N末端融合。
  28. 如申請專利範圍第25項至第27項中任一項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述全長抗體特異性識別選自下組的多肽:TIGIT、TIM-3和LAG-3。
  29. 如申請專利範圍第25項至第28項中任一項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中由所述sdAb部分特異性識別的PD-L1包含SEQ ID NO:441-442的胺基酸序列。
  30. 如申請專利範圍第25項至第28項中任一項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述特異性識別PD-L1的sdAb部分和所述第二抗體部分任選地通過肽連接子連接。
  31. 如申請專利範圍第280項所述的分離的抗PD-L1構建體,其中所述肽連接子包含SEQ ID NO: 443-445的胺基酸序列。
  32. 第二分離的抗PD-L1構建體,其與如申請專利範圍第1項至第31項中任一項所述的分離的抗PD-L1構建體競爭特異性結合PD-L1。
  33. 如申請專利範圍第32項所述的第二分離的抗PD-L1構建體,其中所述第二分離的抗PD-L1構建體包含CDR1、CDR2和CDR3,所述CDR1包含SEQ ID NO: 51-100中任一個的胺基酸序列或其包含最高達約3個胺基酸置換的變異體,所述CDR2包含SEQ ID NO: 151-200中任一個的胺基酸序列或其包含最高達約3個胺基酸置換的變異體,所述CDR3包含SEQ ID NO: 251-300中任一個的胺基酸序列或其包含最高達約3個胺基酸置換的變異體。
  34. 一種藥物組合物,其包含如申請專利範圍第1項至第33項中任一項所述的分離的抗PD-L1構建體和藥學上可接受的載劑。
  35. 一種治療患有PD-L1相關疾病的個體的方法,包括向所述個體施用有效量的如申請專利範圍第34項所述的藥物組合物。
  36. 如申請專利範圍第35項所述的方法,其中所述PD-L1相關疾病是癌症。
  37. 如申請專利範圍第36項所述的方法,其中所述癌症是實體瘤。
  38. 如申請專利範圍第36項或第37項所述的方法,其中所述癌症是結腸癌。
  39. 如申請專利範圍第36項至第38項中任一項所述的方法,還包括向所述個體施用額外的癌症療法。
  40. 如申請專利範圍第39項所述的方法,其中所述額外的癌症療法是外科手術、放射、化學療法、免疫療法、激素療法或其組合。
  41. 如申請專利範圍第35項所述的方法,其中所述PD-L1相關疾病是病原體感染。
  42. 如申請專利範圍第35項至第41項中任一項所述的方法,其中所述藥物組合物被全身或局部施用。
  43. 如申請專利範圍第42項所述的方法,其中所述藥物組合物通過靜脈內施用。
  44. 如申請專利範圍第42項所述的方法,其中所述藥物組合物通過腫瘤內施用。
  45. 如申請專利範圍第35項至第44項中任一項所述的方法,其中所述個體是人。
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