TW201919652A - 調節腫瘤微環境之ｔｌｒ－９促效劑 - Google Patents

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Abstract

一種用於治療腫瘤疾病、特定言之結腸癌，及用於調節腫瘤微環境之TLR-9促效劑。

Description

調節腫瘤微環境之TLR-9促效劑
本發明係關於腫瘤療法之領域，特定言之係關於治療固體腫瘤之領域，更特定言之係關於治療人類之結腸癌。本發明進一步關於TLR-9促效劑之領域及其於治療該等腫瘤疾病之用途。在本發明之又另一態樣中，其係關於調節腫瘤(特定言之固體腫瘤)之腫瘤微環境，及藉此支援腫瘤療法的領域。
腫瘤微環境(TME)係其中存在腫瘤的細胞環境，包括周圍血管、免疫細胞、纖維母細胞、骨髓衍生之炎性細胞、淋巴細胞、傳訊分子及胞外基質。腫瘤與周圍微環境密切相關且持續地交互作用。腫瘤可藉由釋放細胞外信號、促進腫瘤血管生成及誘導周邊免疫耐受性而影響微環境，同時微環境中之免疫細胞可影響癌細胞的生長及演化。
歷史上，患者中黑色素瘤特異性T細胞之發現導致授受性轉移大量已經證實免疫系統具有控制癌症能力之活體外擴增腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的策略。然而，利用TIL之授受性T細胞療法(ACT)尚未具有利用病毒特異性CD8+ T細胞之ACT的成效。固體癌症之TME似乎基本上與白血病者不同，在白血病中利用嵌合抗原受體T細胞之臨床ACT試驗已展現效力。
腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)係穿透腫瘤(即浸潤至腫瘤中)的淋巴細胞。臨床前小鼠研究指示接近癌細胞的T細胞累積受到限制，克服此限制顯示增強的抗腫瘤效果。T細胞經由循環系統到達腫瘤位點，TME似乎自該系統先於T細胞優先補集其他免疫細胞。一個此種機制係釋放細胞類型特異性化學激活素，另一個係TME轉譯後改變化學激活素之能力。因此，熟悉技藝人士已知TIL參與殺死腫瘤細胞，且腫瘤中淋巴細胞之存在通常與較佳的臨床結果相關聯。
腫瘤相關巨噬細胞(TAM)主要源自腫瘤周圍組織或骨髓且可分成兩種主要類型：M1及M2。特定言之，M1巨噬細胞具有抗腫瘤性質。因此，M2巨噬細胞之轉變為M1巨噬細胞或M1巨噬細胞之優先浸潤有利於抗腫瘤免疫反應。
因此，進一步需要鑑別調節TME以改良腫瘤療法的手段及方法。特定而言，有需要刺激TIL(特定言之T細胞，諸如CD3+ T細胞)及巨噬細胞之浸潤至腫瘤中及藉此支援腫瘤療法之經進一步改良的方法及措施。
在一具體例中，此目的係藉由提供一種用於在有需要之個體中治療腫瘤疾病、較佳結腸癌之TLR-9促效劑來解決，該TLR-9促效劑包含i.包含至少一個未甲基化CG二核苷酸之寡去氧核糖核苷酸，其中C係去氧胞苷及G係去氧鳥苷，及ii.至少三個、特定言之四個連續去氧鳥苷的至少一個拉伸物，且寡去氧核糖核苷酸之去氧核糖部分係藉由磷酸二酯鍵鍵 聯，其中利用該TLR-9促效劑之治療刺激CD3+ T細胞之浸潤至腫瘤中。
在一較佳具體例中，浸潤的CD3+ T細胞係CD4+或CD8+ T細胞，在一更佳具體例中係CD8+ T細胞。在另一較佳具體例中，利用該TLR-9促效劑之治療導致在腫瘤中之CD8+ T細胞群體內之細胞毒性效應物T細胞(CD8+ CD69+顆粒酶(Granzyme，Grz)B+)的頻率增加。細胞毒性效應物T細胞之群體(CD8+ CD69+顆粒酶B+)亦可稱為具有溶細胞潛力的活化CD8+ T細胞，即此細胞群體優先具有抗腫瘤發生潛力。
在另一較佳具體例中，利用該TLR-9促效劑之治療導致CD8+ T細胞(較佳細胞毒性效應物T細胞(CD8+ CD69+顆粒酶B+))對調節T細胞的比率增加。調節T細胞具有促腫瘤發生潛力。調節T細胞可抑制T細胞之抗腫瘤效應，例如，藉由分泌抑制細胞激素，剝奪IL-2或藉由於其表面上表現之抑制性分子(例如CTLA-4)。
藉此，一個目的係利用該TLR-9促效劑之治療係用於刺激CD3+ T細胞之浸潤至腫瘤中。在一較佳具體例中，利用該TLR-9促效劑之治療係用於提高腫瘤中之CD8+ T細胞群體內之細胞毒性效應物T細胞(CD8+ CD69+顆粒酶(Grz)B+)的頻率及/或用於提高CD8+ T細胞(較佳細胞毒性效應物T細胞(CD8+ CD69+顆粒酶B+))對調節T細胞的比率。
在一具體例中，腫瘤係於其周邊及/或其中心經浸潤，較佳於其中心。
藉此，一個目的係利用該TLR-9促效劑之治療係用於 在其周邊及/或其中心(較佳於其中心)浸潤腫瘤。
在一具體例中，腫瘤係固體腫瘤，較佳結腸癌，及待治療之個體係人類。
本發明之目的進一步藉由施行增加CD3+ T細胞(較佳CD8+ T細胞)之浸潤至腫瘤(較佳結腸癌)中之方法來解決，其包括向有需要之患者投與TLR-9促效劑，其中該TLR-9促效劑包含i.包含至少一個未甲基化CG二核苷酸之寡去氧核糖核苷酸，其中C係去氧胞苷及G係去氧鳥苷，及ii.至少三個、特定言之四個連續去氧鳥苷的至少一個拉伸物，且其中該寡去氧核糖核苷酸之去氧核糖部分係藉由磷酸二酯鍵鍵聯。
在另一具體例中，該方法係用於提高腫瘤中之CD8+ T細胞群體內之細胞毒性效應物T細胞(CD8+ CD69+顆粒酶B+)的頻率。
在另一具體例中，該方法係用於提高CD8+ T細胞(較佳細胞毒性效應物T細胞(CD8+ CD69+顆粒酶B+))對調節T細胞的比率。
本發明人等已發現該等TLR-9促效劑可導致T細胞之增加轉運至腫瘤。藉此，TME及/或腫瘤中之T細胞的局部濃度提高，即T細胞累積於腫瘤附近並浸潤至其中，因此T細胞受TME的限制似乎經克服。因此，T細胞可展現其抗腫瘤效應。故在本發明之一特定態樣中，使用TLR-9促效劑來提高CD3+ T細胞(較佳CD8+ T細胞)的效力。
在另一具體例中，本發明之目的係藉由提供一種用於在有需要之個體中治療腫瘤疾病(較佳結腸癌)的TLR-9促效劑來解決，該TLR-9促效劑包含i.包含至少一個未甲基化CG二核苷酸之寡去氧核糖核苷酸，其中C係去氧胞苷及G係去氧鳥苷，及ii.至少三個、特定言之四個連續去氧鳥苷的至少一個拉伸物，且該寡去氧核糖核苷酸之去氧核糖部分係藉由磷酸二酯鍵鍵聯，其中利用該TLR-9促效劑之治療刺激巨噬細胞(較佳M1巨噬細胞)之浸潤至腫瘤中及/或利用該TLR-9促效劑之治療導致腫瘤內M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率增加。
藉此，一個目的係利用該TLR-9促效劑之治療係用於刺激巨噬細胞(較佳M1巨噬細胞)之浸潤至腫瘤中及/或利用該TLR-9促效劑之治療係用於增加腫瘤內M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率。
較佳地，腫瘤經CD3+ T細胞及/或經巨噬細胞(較佳M1巨噬細胞)之浸潤與沒有TLR-9促效劑之治療的浸潤相比受到刺激及/或腫瘤內M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率與沒有TLR-9促效劑之治療之M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率相比增加。
在另一具體例中，本發明之目的係藉由施行增加巨噬細胞(較佳M1巨噬細胞)之浸潤至腫瘤(較佳結腸癌)中、及/或用來增加腫瘤(較佳結腸癌)內M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率的方法來解決，其包括向有需要之患者投與TLR-9促效劑，其中該TLR-9促效劑包含i.包含至少一個未甲基化CG二核苷酸之寡去氧核糖核苷酸， 其中C係去氧胞苷及G係去氧鳥苷，及ii.至少三個、特定言之四個連續去氧鳥苷的至少一個拉伸物，且其中該寡去氧核糖核苷酸之去氧核糖部分係藉由磷酸二酯鍵鍵聯。
在本發明之又另一特佳具體例中，使用如上所定義之TLR-9促效劑來將所謂的「冷腫瘤」(即具有低度免疫細胞浸潤之腫瘤)轉變為「熱腫瘤」(其係免疫性腫瘤，即具有高度免疫細胞浸潤)。「冷」及「熱」腫瘤之概念為熟悉技藝人士所知曉。冷腫瘤通常富含免疫抑制細胞激素且具有大量Treg細胞及骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)。冷腫瘤通常具有極少量TH1細胞、NK細胞及CD8+ T細胞及極少功能性抗原呈現細胞(APC)(例如樹狀細胞/DC)。相對地，熱腫瘤富含TH1型化學激活素且具有大量效應免疫細胞(TH1細胞、NK細胞及CD8+ T細胞)及大量DC。
一些腫瘤類型即使於治療前亦係屬於熱腫瘤類型，例如黑色素瘤。此等腫瘤通常對諸如查核點抑制劑之藥物反應良好。本發明提議在此等腫瘤中投與TLR-9促效劑導致T細胞之進一步增進活化及免疫細胞之浸潤至腫瘤中。利用TLR-9促效劑之治療亦可導致腫瘤對其他藥物(例如查核點抑制劑)之增進反應性。
冷腫瘤通常對諸如查核點抑制劑之藥物的反應不良。本發明提議TLR-9促效劑可藉由提高免疫細胞之浸潤至腫瘤中來改良此反應性及藉此正面影響TME。因此，罹患冷腫瘤的患者尤其自利用TLR-9促效劑之治療獲益。腫瘤可因此顯示對諸如查核點抑制劑之藥物的較佳反應性。冷腫瘤可藉此轉變為熱腫瘤。
用於此特定用途的一尤佳TLR-9促效劑為來非莫德(Lefitolimod)。
在一個具體例中，提供TLR-9促效劑用於增加CD3+ T細胞(較佳CD8+ T細胞)之浸潤至腫瘤(較佳結腸癌)中、及/或用於增加腫瘤中之CD8+ T細胞群體內之細胞毒性效應物T細胞(CD8+ CD69+顆粒酶B+)之頻率及/或用於增加CD8+ T細胞(較佳細胞毒性效應物T細胞(CD8+ CD69+顆粒酶B+))對調節T細胞之比率及/或用於增加巨噬細胞(較佳M1巨噬細胞)之浸潤至腫瘤中及/或用於增加腫瘤內M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率的用途，其中該TLR-9促效劑包含i.包含至少一個未甲基化CG二核苷酸之寡去氧核糖核苷酸，其中C係去氧胞苷及G係去氧鳥苷，及ii.至少三個、特定言之四個連續去氧鳥苷的至少一個拉伸物，且其中該寡去氧核糖核苷酸之去氧核糖部分係藉由磷酸二酯鍵鍵聯。
因此，如本發明投與TLR-9促效劑導致腫瘤生長速率減小。此可由本發明人在如更詳細說明於以下實施例部分中之鼠類結腸癌模型(CT26)中所展示。
在本發明之一較佳具體例中，TLR-9促效劑可直接投與至腫瘤中，即腫瘤內投與、或皮下投與。皮下注射較佳係投與至皮下層，即位於真皮及表皮(總稱為皮膚)正下方的皮膚層。為模擬在人類中的皮下施用，如以下的實施例部分中所展示，使小鼠在遠離經接種腫瘤之引流淋巴區域的遠端部位接受皮下治療。向腫瘤 內，較佳向腫瘤中心內直接投與腫瘤內注射。
皮下注射對於許多腫瘤類型係可行的，且其亦可用來靶向轉移中的腫瘤。就腫瘤內注射而言，腫瘤較佳係未轉移且可容易接近的，例如黑色素瘤或頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)。然而，肝臟轉移亦可藉由腫瘤內注射，較佳藉由影像輔助注射來靶向。皮下注射可於較長時段內重複地使用。腫瘤內注射容許較皮下注射低的劑量，因TLR-9促效劑係直接施加至腫瘤中。本發明之TLR-9促效劑(較佳來非莫德(Lefitolimod))因其由於缺乏硫代磷酸酯(phosphorothioate)所致之低毒性而可以高劑量施用。
類鐸(Toll-like)受體(TLR)為熟悉技藝人士所知曉。其存在於許多免疫系統的細胞上且已經顯示參與先天性免疫反應。在脊椎動物中，此家族由稱為TLR-1至TLR-11之11種蛋白質組成，已知該等蛋白質識別來自細菌、真菌、寄生蟲、及病毒的病原體相關分子型態。
TLR係脊椎動物藉以對外來分子進行識別及採取免疫反應的關鍵手段，且亦提供藉以連結先天性及後天性免疫反應的手段((Akira,S.等人(2001)Nature Immunol.2：675-680；Medzhitov,R.(2001)Nature Rev.Immunol.1：135-145))。一些TLR位在細胞表面上用來偵測及起始對細胞外病原體的反應，及其他TLR位在細胞內部用來偵測及起始對細胞內病原體的反應。
已知TLR-9識別細菌DNA及合成寡核苷酸中之未甲基化CpG基序(Hemmi,H.等人(2000)Nature 408：740-745)。已顯示天然存在的TLR-9促效劑產生抗腫瘤活性(例如，腫瘤生長及血管生成)，從而導致有效的抗癌反應(例如，抗白血病)(Smith,J.B.及 Wickstrom,E.(1998)J.Natl.Cancer Inst.90：1 146-1154)。
較佳的TLR-9促效劑包括含有至少一個未甲基化CG二核苷酸的寡去氧核糖核苷酸，其中C為去氧胞苷及G為去氧鳥苷，及至少三個(特定言之四個)連續去氧鳥苷之至少一個拉伸物，且寡去氧核糖核苷酸之去氧核糖部分係藉由磷酸二酯鍵鍵聯，其中該至少一個CG二核苷酸係序列N1N2CGN3N4的部分，其中N1N2係AA、TT、GG、GT、GA或AT及N3N4係CT、TT、TG或GG及C係去氧胞苷，G係去氧鳥苷，A係去氧腺苷，及T係去氧胸苷。
在一具體例中，寡去氧核糖核苷酸包含至少一個呈L-組態之核苷酸，較佳地，該至少一個呈L-組態之核苷酸係包含於寡去氧核糖核苷酸之至少一端的末端五個核苷酸內，較佳於寡去氧核糖核苷酸之3’端的末端五個核苷酸內。
在一具體例中，寡去氧核糖核苷酸包含至少三個CG二核苷酸。
在一具體例中，寡去氧核糖核苷酸為單股及/或部分或完全雙股。
在一具體例中，寡去氧核糖核苷酸包含兩個單股環圈且形成啞鈴形狀。
在一具體例中，所有核苷酸係呈D-組態。
根據本發明為較佳的TLR-9促效劑特定言之係如EP 1 196 178中所揭示之寡去氧核糖核苷酸，最佳為熟悉技藝人士已知為INN來非莫德(Lefitolimod)(CAS登錄號1548439-51-5；亦稱為「MGN1703」；參照圖1；SEQ ID NO：3)的免疫調節寡去氧核糖核苷酸。來非莫德(Lefitolimod)(MGN1703)係一種對先天性及後天性 免疫系統具有寬廣免疫調節作用的共價閉合啞鈴狀免疫監視再活化劑。來非莫德(Lefitolimod)目前在mCRC患者中之3期試驗(IMPALA研究)、SCLC患者中之2期試驗(IMPULSE研究)、及在兩個1/2期試驗(i)在固體腫瘤中與查核點抑制劑伊匹單抗(ipilimumab)組合及(ii)在HIV患者中(TEACH研究)進行評估。
在本發明之TLR-9促效劑中，寡去氧核糖核苷酸之去氧核糖部分係經由磷酸二酯鍵鍵聯。其意謂寡去氧核糖核苷酸之去氧核糖部分並非經由硫代磷酸酯鍵鍵聯。
適合根據本發明使用之更佳的TLR-9促效劑揭示於EP 2 655 623 B1及EP 2 999 787 B1中。根據本發明之再其他較佳的TLR-9促效劑係如圖2中所示如SEQ ID NO：4及5所揭示的TLR-9促效劑。然而，本發明所使用之最佳的TLR-9促效劑為來非莫德(Lefitolimod)(SEQ ID NO：3)。
根據本發明之腫瘤疾病係指贅瘤，其繼而係指組織之一種類型的異常及過度生長。贅瘤包括良性及惡性贅瘤。惡性贅瘤或腫瘤亦可稱為癌症。固體腫瘤可指通常不含胞囊或液體區域之組織的異常團塊。固體腫瘤可係良性或惡性的。固體腫瘤的實例為肉瘤、癌、及淋巴瘤，諸如乳癌、黑色素瘤、皮膚贅瘤、胃腸腫瘤，包括結腸惡性瘤、胃癌、胰臟癌、結腸癌、小腸癌、卵巢癌、子宮頸癌、肺癌、前列腺癌、腎細胞癌及/或肝臟轉移。白血病一般不會形成固體腫瘤。結腸癌或結腸直腸癌係產生自結腸或直腸之內壁的惡性腫瘤。結腸癌係固體腫瘤。
較佳地，本發明之腫瘤疾病係固體腫瘤，較佳結腸癌。其他較佳的腫瘤係結腸直腸癌及黑色素瘤。
細胞(例如T細胞或巨噬細胞)可浸潤至腫瘤中。腫瘤浸潤應理解為意指細胞自腫瘤外部遷移至腫瘤組織中(例如，回應於化學激活素)。
當細胞浸潤至腫瘤中時，細胞隨後存在於腫瘤中。在本發明之一具體例中，TLR-9促效劑刺激巨噬細胞(較佳M1巨噬細胞)之浸潤至腫瘤中及/或利用該TLR-9促效劑之治療導致腫瘤內之M1巨噬細胞對M2巨噬細胞的比率增加。「在腫瘤內」在本發明之含意中係指腫瘤中之細胞。腫瘤內之增加比率可藉由增加各別細胞之浸潤至腫瘤中或將(例如)M2巨噬細胞轉變為M1巨噬細胞或巨噬細胞前驅體相較於M2巨噬細胞增加分化成M1巨噬細胞來產生。
腫瘤之「侵襲性邊界」或「周邊」應意指以分離惡性細胞巢與原組織之邊界為中心的區域。腫瘤之「中心」代表其餘的腫瘤區域。
在本發明之含意中，「刺激」細胞浸潤係指腫瘤內之各別細胞類型的量增加。
術語頻率係指特定細胞群體在母細胞群體內的頻率，例如細胞毒性效應物T細胞(CD8+ CD69+顆粒酶(Grz)B+)在CD8+ T細胞群體內的頻率。
術語比率係指未重疊之兩種一定細胞群體之間的關係或比率，例如M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率。
CD3+ T細胞之浸潤至腫瘤中可藉由偵測CD3來識別。CD3已被用來偵測腫瘤樣本中之淋巴細胞(「Immunotherapy Doubts Fading」，GI Cancers,2016年4月)。巨噬細胞之浸潤可藉由標幟物CD11b及F4/80來偵測。隨後可在M1巨噬細胞 (MHC-II/CD86高)與M2巨噬細胞(MHC-II/CD86低)之間作區別。
腫瘤免疫浸潤亦可使用基因表現方法如微陣列或RNA定序來確定。隨後可使用針對不同種類免疫細胞群體具特異性之基因表現的偵測來確定淋巴細胞或巨噬細胞浸潤程度，如已針對淋巴細胞浸潤顯示於乳癌中(Bedognetti,Davide；Hendrickx,Wouter；Marincola,Francesco M.；Miller,Lance D.「Prognostic and predictive immune gene signatures in breast cancer」.Current Opinion in Oncology.27(6)：433-444)。如可由免疫排斥常數所確定，腫瘤內之活性免疫環境通常指示較佳的預後。
如以上所概述，T細胞可藉由標幟物CD3來識別。T細胞被分成兩個主要群體：CD4+ T輔助細胞及CD8+細胞毒性T細胞。CD4+ T輔助細胞係活化B細胞以分化成抗體分泌漿細胞或記憶B細胞所需。CD4+陽性T細胞亦對CD8+ T細胞之分化提供幫助並分泌細胞激素(Th1細胞激素-例如，IFN-γ或Th2細胞激素-例如，IL-4)以塑造免疫反應。CD8+ T細胞鑑別在MHC 1之情形中由腫瘤細胞(或受感染細胞)所呈現之特定肽並藉由可溶性(穿孔蛋白、顆粒酶、顆粒素(granulosin))或膜結合(Fas-配位體)分子誘導其破壞。細胞毒性效應物T細胞(即經活化且具有溶細胞能力)可藉由標幟物CD8、CD69及顆粒酶B來偵測。調節T細胞可藉由標幟物CD3、CD4及FOXP3來偵測。
可使用Thy1作為CD3之替代標幟物，因CD3可在細胞活化時下調。
熟悉技藝人士已知各種識別CD3+ T細胞之方法，其可例如藉由流動式細胞測量術或免疫組織學(IHC)來識別。雖然流 動式細胞測量術容許並行使用若干標幟物來深入分析細胞，但免疫組織學分析提供關於細胞之定位(腫瘤中心/腫瘤周邊/周圍健康組織)的資訊。因此，使用IHC，熟悉技藝人士可識別T細胞在腫瘤之周邊或中心中的定位。周邊或侵襲性邊界意指腫瘤鄰近於健康組織之邊界。T細胞浸潤腫瘤中心為較佳。
根據本發明所使用之寡去氧核糖核苷酸較佳包含雙股主幹及兩個單股環圈並形成啞鈴形狀。寡去氧核糖核苷酸較佳係共價閉合。至少一個CG二核苷酸位於單股環圈之一者或各者係有利的。
根據本揭示內容之「主幹」應理解為藉由在同一DNA分子內(其隨後係部分自互補)或在不同DNA分子內(其係部分或完全互補)之鹼基配對所形成的DNA雙股。分子內鹼基配對指示在相同分子內之鹼基配對，及在不同DNA分子間之鹼基配對稱為分子間鹼基配對。
在本揭示內容之意義內之「環圈」應理解為在主幹結構內或在主幹結構末端處之未配對、單股區域。
「啞鈴形」係描述包括雙股主幹(在相同寡核苷酸內之鹼基配對)及在雙股主幹之兩端處之兩個單股環圈的寡核苷酸。
在此等啞鈴形寡核苷酸中，較佳所有核苷酸係呈D-組態。此外，較佳寡去氧核糖核苷酸包含至少50個、較佳至少80個、最佳116個核苷酸。此類型之TLR-9促效劑之兩個較佳代表的核苷酸序列描述於圖2(SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4)。
根據本發明之最佳的TLR-9促效劑為來非莫德(Lefitolimod)(SEQ ID NO：3)。
L-DNA或呈L-組態之核苷酸係指包含L-去氧核糖而非天然存在之D-去氧核糖作為糖殘基的核苷酸。L-去氧核糖係D-去氧核糖之鏡像異構物(鏡像)。部分或完全地由呈L-組態之核苷酸組成之DNA構築體可部分或完全地為單股或雙股。L-DNA的可溶性及選擇性與D-DNA相等。然而，L-DNA可抵抗被天然存在之酶(尤其核酸外切酶)的降解，因此L-DNA受到保護防止生物降解。因此，L-DNA的應用相當寬廣。
包含至少一種呈L-組態之核苷酸的最佳TLR9促效劑係具有SEQ ID NO：5之核苷酸序列的TLR9促效劑。
在本發明之另一具體例中，提供包含TLR-9促效劑之醫藥組成物，其適用於治療腫瘤疾病，較佳結腸癌。此醫藥組成物包含存於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之1mg/ml至50mg/ml、較佳10mg/ml至20mg/ml、更佳15mg/ml之來非莫德(Lefitolimod)，其中該PBS具有pH 6至8、特定言之7.0至7.5之pH值，且包含- 6mg/ml至12mg/ml、較佳8.8mg/ml之氯化鈉，- 0.1mg/ml至0.3mg/ml、較佳0.22mg/ml之氯化鉀，- 0.1mg/ml至0.3mg/ml、較佳0.22mg/ml之磷酸二氫鉀，及- 1.0mg/ml至1.5mg/ml、較佳1.265mg/ml之磷酸氫二鈉。
在一特佳具體例中，該PBS具有7.2至7.6之pH值，且包含- 8.0mg/ml之氯化鈉，- 0.2mg/ml之氯化鉀，- 0.2mg/ml之磷酸二氫鉀，及 - 1.15mg/ml之磷酸氫二鈉。
關於腫瘤內注射，人類患者中之較佳週劑量係約10至約30mg/週，較佳約15mg/週。關於皮下注射，人類患者中之較佳週劑量係約100至約150mg/週，較佳約120mg/週，其可分若干劑量施用，例如每週兩次約60mg或每週一次約120mg。
在一較佳醫藥組成物中，TLR-9促效劑係來非莫德(Lefitolimod)(SEQ ID NO：3)或具有SEQ ID NO：5之序列的TLR-9促效劑，更佳地，TLR-9促效劑係來非莫德(Lefitolimod)(SEQ ID NO：3)。
根據本發明之一較佳具體例，TLR-9促效劑(較佳來非莫德(Lefitolimod))係作為單藥療法使用。術語「單藥療法」係指使用藥物作為單一活性醫藥成分(API)來治療特定病症或疾病。因此，在單藥療法中，藥物係在未與另一藥物組合的情況下投與。
在另一較佳具體例中，提供包含TLR-9促效劑及化學治療劑及/或查核點抑制劑之組合用來在有需要之個體中治療腫瘤疾病，較佳結腸癌，該TLR-9促效劑包含i.包含至少一個未甲基化CG二核苷酸之寡去氧核糖核苷酸，其中C係去氧胞苷及G係去氧鳥苷，及ii.至少三個、特定言之四個連續去氧鳥苷的至少一個拉伸物，且該寡去氧核糖核苷酸之去氧核糖部分係藉由磷酸二酯鍵鍵聯，其中利用該TLR-9促效劑之治療刺激CD3+ T細胞之浸潤至腫瘤中及/或刺激巨噬細胞(較佳M1巨噬細胞)之浸潤至腫瘤中及/或導致腫瘤內M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率增加。
該組合之組分(即TLR-9促效劑及化學治療劑及/或 查核點抑制劑)可因此同時及/或連續地一起施用。因此，在一具體例中，待治療之個體先前已接受及/或隨後接受另一癌症治療。「另一癌症治療」可例如指放射療法及/或施用化學治療劑及/或查核點抑制劑，較佳係施用化學治療劑及/或查核點抑制劑。
熟悉技藝人士知曉適當的化學治療劑。臨床前期及臨床數據顯示某些習知化學療法可部分通過免疫刺激機制來作用。該等化學治療劑為較佳。舉例來說，蒽環素驅動經調節的免疫性細胞死亡(ICD)表現型並直接阻斷TME中之免疫抑制路徑。誘導免疫性細胞死亡或阻斷免疫抑制路徑的化學治療藥物係，例如，奧沙利鉑(oxaliplatin)、卡鉑(carboplatin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、紫杉醇(paclitaxel)、5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil)、阿黴素(doxorubicin)、泛艾黴素(epirubucin)、艾達黴素(idarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、博來黴素(bleomycin)、及硼替佐米(bortezomib)。
替代化學治療劑或在其之外，可使用「標靶抗癌劑」，諸如酪胺酸激酶抑制劑。
放射療法可誘導免疫性細胞死亡，導致自死亡細胞釋放腫瘤抗原，其繼而促進活化效應物T細胞及增強抗腫瘤免疫反應，甚至抵抗未經照射的位置(遠隔效應(abscopal effect))。
查核點抑制劑阻斷藉由一些免疫細胞(諸如T細胞)、及一些癌細胞表現的特定蛋白質。此等所謂的查核點蛋白質幫助保持查核免疫反應且可阻止T細胞殺死癌細胞。當此等蛋白質經阻斷時，免疫系統上之「剎車」經釋放且T細胞可殺死癌細胞。查核點抑制劑例如係PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3或LAG3之抑制劑。此外，所謂的共刺激分子如OX-40、CD137(4-1BB)或GITR可經活 化以增進免疫反應來最佳化T細胞活化。熟悉技藝人士知曉有用的查核點抑制劑。較佳的查核點抑制劑係PD-1之抑制劑諸如帕博利珠單抗(Pembrolizumab)及納武單抗(Nivolumab)及PD-L1之抑制劑諸如阿特珠單抗(Atezolizumab)、阿維魯單抗(Avelumab)及得瓦魯單抗(Durvalumab)。CTLA-4之較佳抑制劑為伊匹單抗(Ipilimumab)。亦可使用其他抗體。
因為化學療法或放射療法會導致腫瘤尺寸減小及釋放腫瘤相關抗原，因此在施用TLR-9促效劑之前的化學療法或放射療法可係有利的。TLR-9促效劑隨後可活化抗原呈現細胞，其繼而將經釋放的腫瘤相關抗原呈現給T細胞並刺激T細胞。
因為施用TLR-9促效劑可導致T細胞活化，其繼而可浸潤至腫瘤中，因此在查核點抑制劑之前施用TLR-9促效劑可係有利的。查核點抑制劑隨後可阻斷腫瘤中之已活化T細胞上的抑制分子。T細胞可藉此完全經活化且產生其抗腫瘤作用。
因為TLR-9促效劑可隨後消除對查核點抑制劑的潛在不反應性，因此在施用TLR-9促效劑之前施用查核點抑制劑可係有利的。換言之，在腫瘤未對查核點抑制劑良好反應的情況中(可能由於其係冷腫瘤)，TLR-9促效劑可隨後以回復對查核點抑制劑之反應性的方式調節腫瘤微環境。舉例來說，由於抑制分子在T細胞上上調，因此腫瘤可抵抗利用查核點抑制劑之治療。藉由TLR-9促效劑活化之經重新活化的T細胞可能不會表現此等抑制分子且因此可能對利用查核點抑制劑之療法敏感。
在一具體例中，提供包含TLR-9促效劑及化學治療劑及/或查核點抑制劑之組合物用來在有需要之個體中治療腫瘤疾 病，較佳結腸癌，該TLR-9促效劑包含i.包含至少一個未甲基化CG二核苷酸之寡去氧核糖核苷酸，其中C係去氧胞苷及G係去氧鳥苷，及ii.至少三個、特定言之四個連續去氧鳥苷的至少一個拉伸物，且該寡去氧核糖核苷酸之去氧核糖部分係藉由磷酸二酯鍵鍵聯，其中利用該TLR-9促效劑之治療刺激CD3+ T細胞之浸潤至腫瘤中及/或刺激巨噬細胞(較佳M1巨噬細胞)之浸潤至腫瘤中及/或導致腫瘤內M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率增加。
圖1：來非莫德(Lefitolimod)(MGN1703)之序列及結構。
圖2：啞鈴形TLR-9促效劑來非莫德(Lefitolimod)(MGN1703)、dSLIM 2006之部分及完整序列(部分序列係用來合成完整序列)，及包含L-核苷酸之TLR-9促效劑的序列。黑體及加底線的核苷酸係呈L-組態。
圖3、圖4、圖5：來非莫德(Lefitolimod)治療對腫瘤生長之影響；圖4及5呈現圖3中呈現之值的單一值。
圖6：於利用來非莫德(Lefitolimod)治療後在腫瘤中心內之CD3+ T細胞的定量。
圖7：於利用來非莫德(Lefitolimod)治療後在腫瘤中心內之CD8+ T細胞的定量。
圖8及圖9：經浸潤CD8+ T細胞與腫瘤生長減小之關聯。
圖10、圖11及圖12：於利用來非莫德(Lefitolimod)治療後包含L-核苷酸之TLR-9促效劑(SEQ ID NO：5)治療對腫瘤生長的影 響；圖11及12呈現圖10中呈現之值的單一值。
圖13：於利用包含L-核苷酸之TLR-9促效劑(SEQ ID NO：5)治療後在腫瘤中心內之CD3+ T細胞的定量。
圖14：於利用包含L-核苷酸之TLR-9促效劑(SEQ ID NO：5)治療後在腫瘤中心內之CD8+ T細胞的定量。
圖15及圖16：於利用包含L-核苷酸之TLR-9促效劑(SEQ ID NO：5)治療後經浸潤CD8+ T細胞與腫瘤生長減小之關聯。
圖17：於利用來非莫德(Lefitolimod)治療後藉由流動式細胞測量術分析腫瘤內之T細胞群體。
圖18：於利用來非莫德(Lefitolimod)治療後藉由流動式細胞測量術分析CD8+ T細胞、細胞毒性效應物T細胞(CD8+CD69+GrzB+)及調節T細胞。
圖19：於利用來非莫德(Lefitolimod)治療後藉由IHC分析腫瘤內之巨噬細胞。
圖20：於利用來非莫德(Lefitolimod)治療後藉由流動式細胞測量術分析腫瘤內之巨噬細胞。
圖21至23：皮下來非莫德(Lefitolimod)治療對腫瘤生長之影響；圖22及23呈現圖21中呈現之值的單一值。
圖24：於利用來非莫德(Lefitolimod)皮下治療後在腫瘤中心內之CD8+ T細胞的定量。
圖25：於利用來非莫德(Lefitolimod)皮下治療後在腫瘤邊界內之CD8+ T細胞的定量。
特定具體例
1.一種用於在有需要之個體中治療腫瘤疾病、較佳結腸癌之TLR-9促效劑，該TLR-9促效劑包含i.包含至少一個未甲基化CG二核苷酸之寡去氧核糖核苷酸，其中C係去氧胞苷及G係去氧鳥苷，及ii.至少三個、特定言之四個連續去氧鳥苷的至少一個拉伸物，且該寡去氧核糖核苷酸之去氧核糖部分係藉由磷酸二酯鍵鍵聯，其中利用該TLR-9促效劑之治療刺激CD3+ T細胞之浸潤至腫瘤中。
在另一具體例1中，利用該TLR-9促效劑之治療刺激巨噬細胞(較佳M1巨噬細胞)之浸潤至腫瘤中及/或利用該TLR-9促效劑之治療導致腫瘤內M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率增加。
2.根據具體例1來使用之TLR-9促效劑，其中腫瘤經CD3+ T細胞及/或經巨噬細胞(較佳M1巨噬細胞)之浸潤與沒有TLR-9促效劑之治療的浸潤相比受到刺激。
在另一具體例2中，腫瘤內M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率與沒有TLR-9促效劑之治療之M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率相比增加。
3.根據具體例1或2來使用之TLR-9促效劑，其中該等CD3+ T細胞係CD4+或CD8+ T細胞，較佳CD8+ T細胞。
在另一具體例3中，利用該TLR-9促效劑之治療導致在腫瘤中之CD8+ T細胞群體內之細胞毒性效應物T細胞(CD8+ CD69+顆粒酶B+)的頻率增加。
在另一具體例3中，利用該TLR-9促效劑之治療導致CD8+ T細胞(較佳細胞毒性效應物T細胞(CD8+ CD69+顆粒酶B+)) 對調節T細胞的比率增加。
4.根據先前具體例中任一者所使用之TLR-9促效劑，其中該腫瘤係於其周邊及/或其中心經浸潤，較佳於其中心。
5.根據先前具體例中任一者所使用之TLR-9促效劑，其中該腫瘤係固體腫瘤，較佳結腸癌，及該待治療之個體係人類。
6.根據先前具體例中任一者所使用之TLR-9促效劑，其中該TLR-9促效劑係腫瘤內投與或皮下投與。
7.根據先前具體例中任一者所使用之TLR-9促效劑，其中該至少一個CG二核苷酸係序列N1N2CGN3N4的部分，其中N1N2係AA、TT、GG、GT、GA或AT及N3N4係CT、TT、TG或GG及C係去氧胞苷，G係去氧鳥苷，A係去氧腺苷，及T係去氧胸苷。
8.根據先前具體例中任一者所使用之TLR-9促效劑，其中該寡去氧核糖核苷酸包含至少一個呈L-組態之核苷酸，較佳地，該至少一個呈L-組態之核苷酸係包含於寡去氧核糖核苷酸之至少一端的末端五個核苷酸內，較佳於寡去氧核糖核苷酸之3’端的末端五個核苷酸內。
9.根據先前具體例中任一者所使用之TLR-9促效劑，其中該寡去氧核糖核苷酸包含至少三個CG二核苷酸。
10.根據先前具體例中任一者所使用之TLR-9促效劑，其中該寡去氧核糖核苷酸係單股及/或部分或完全雙股。
11.根據先前具體例中任一者所使用之TLR-9促效劑，其中該寡去氧核糖核苷酸包含兩個單股環圈且形成啞鈴形狀。
12.根據具體例11所使用之TLR-9促效劑，其中所有核苷酸係呈D-組態。
13.根據具體例11或12所使用之TLR-9促效劑，其具有SEQ ID NO：3之序列。
14.根據具體例8所使用之TLR-9促效劑，其具有SEQ ID NO：5之序列。
15.一種增加CD3+ T細胞(較佳CD8+ T細胞)之浸潤至腫瘤(較佳結腸癌)中之方法，其包括向有需要之患者投與TLR-9促效劑，其中該TLR-9促效劑包含i.包含至少一個未甲基化CG二核苷酸之寡去氧核糖核苷酸，其中C係去氧胞苷及G係去氧鳥苷，及ii.至少三個、特定言之四個連續去氧鳥苷的至少一個拉伸物，且其中該寡去氧核糖核苷酸之去氧核糖部分係藉由磷酸二酯鍵鍵聯。
在另一具體例15中，該方法係用來增加腫瘤中之CD8+ T細胞群體內之細胞毒性效應物T細胞(CD8+ CD69+顆粒酶B+)的頻率。
在另一具體例15中，該方法係用來增加CD8+ T細胞(較佳細胞毒性效應物T細胞(CD8+ CD69+顆粒酶B+))對調節T細胞的比率。
在另一具體例15中，該方法係用來增加巨噬細胞(較佳M1巨噬細胞)之浸潤至腫瘤中及/或用來增加腫瘤內M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率。
16.根據具體例8所使用之TLR-9促效劑，其中該寡去氧核糖核苷酸包含至少20個核苷酸，較佳30至35個核苷酸。
17.根據具體例8或16所使用之TLR-9促效劑，其中該至少三個、特定言之四個連續去氧鳥苷的至少一個拉伸物係呈D-組態且係位在寡去氧核糖核苷酸之至少一端的末端六個核苷酸內，較佳在寡去氧核糖核苷酸之5’端的末端六個核苷酸內。
18.根據具體例11所使用之TLR-9促效劑，其中至少三個、特定言之四個連續去氧鳥苷係位在兩個CG二核苷酸之間。
19.根據具體例11所使用之TLR-9促效劑，其中至少五個核苷酸位在兩個CG二核苷酸之間，不包括去氧鳥苷。
20.根據先前具體例中任一者所使用之TLR-9促效劑，其中該至少一個CG二核苷酸係位在寡去氧核糖核苷酸的單股及/或雙股區域內。
21.根據具體例1至10中任一者所使用之TLR-9促效劑，其中該寡去氧核糖核苷酸包含雙股主幹及至少一個單股環圈。
22.根據具體例11或21所使用之TLR-9促效劑，其中該寡去氧核糖核苷酸包含至少50個、較佳至少80個、最佳116個核苷酸。
23.根據具體例11或21所使用之TLR-9促效劑，其中該寡去氧核糖核苷酸包含至多200個、較佳至多150個、最佳116個核苷酸。
24.根據具體例11或21所使用之TLR-9促效劑，其中該至少一個CG二核苷酸係位在 i.該單股環圈的一者或各者內，較佳在單股環圈的各者內，或ii.該雙股主幹，或iii.該單股環圈的一者或各者內及在該雙股主幹中。
25.根據具體例11或21所使用之TLR-9促效劑，其中該寡去氧核糖核苷酸包含雙股主幹及至少一個單股環圈且該至少一個CG二核苷酸係位在該單股環圈中。
26.根據具體例25所使用之TLR-9促效劑，其中三個CG二核苷酸位在該等單股環圈之各者中。
27.根據具體例11或21所使用之TLR-9促效劑，其中該等單股環圈的一者或各者包含至少20個核苷酸，較佳由30個核苷酸組成。
28.根據具體例27所使用之TLR-9促效劑，其中該等單股環圈的各者係由30個核苷酸組成且具有相同序列。
29.根據具體例11或21所使用之TLR-9促效劑，其中該雙股主幹包含至少15個、較佳至少20個鹼基對，最佳由28個鹼基對組成。
30.根據具體例11或21所使用之TLR-9促效劑，其中該雙股主幹包含至多90個、較佳至多60個鹼基對，最佳由28個鹼基對組成。
31.根據具體例11所使用之TLR-9促效劑，其中該等單股環圈的各者係由30個核苷酸組成，該雙股主幹係由28個鹼基對組成且三個CG二核苷酸位在該等單股環圈之各者中。
32.根據具體例11所使用之TLR-9促效劑，其中該TLR-9促效劑係由兩個SEQ ID NO：1之部分雜合序列組成。
33.根據具體例11所使用之TLR-9促效劑，其中該TLR-9促效劑係由兩個SEQ ID NO：2之部分雜合序列組成。
34.根據具體例11所使用之TLR-9促效劑，其中該TLR-9促效劑係由SEQ ID NO：4之序列組成。
35.根據先前具體例中任一者所使用之TLR-9促效劑，其中至少一個核苷酸經選自包含以下之群的官能基修飾：羧基、胺、醯胺、醛亞胺、縮酮、縮醛、酯、醚、二硫化物、硫醇及醛基。
36.根據具體例35所使用之TLR-9促效劑，其中該經修飾核苷酸係鍵聯至選自包含以下之群的化合物：肽、蛋白質、碳水化合物、抗體、脂質、微胞、囊胞、合成分子、聚合物、微拋射體、金屬粒子、奈米粒子、及固相。
37.根據具體例15之方法，其中該TLR-9促效劑係如先前具體例中任一者所定義。
38.一種醫藥組成物，其用來治療腫瘤疾病、較佳結腸癌，包含存於PBS中之1mg/ml至50mg/ml、較佳10mg/ml至20mg/ml、更佳15mg/ml之TLR-9促效劑，其中該PBS具有pH 6至8、特定言之7.2至7.6之pH值，且包含˙6mg/ml至12mg/ml、較佳8.0mg/ml之氯化鈉，˙0.1mg/ml至0.3mg/ml、較佳0.2mg/ml之氯化鉀，˙0.1mg/ml至0.3mg/ml、較佳0.2mg/ml之磷酸二氫鉀，及˙1.0mg/ml至1.5mg/ml、較佳1.15mg/ml之磷酸氫二鈉。
在一較佳具體例38中，該TLR-9促效劑為來非莫德(Lefitolimod)(SEQ ID NO：3)或具有SEQ ID NO：5之序列的TLR-9 促效劑，更佳地該TLR-9促效劑係來非莫德(Lefitolimod)(SEQ ID NO：3)。
39.一種治療個體中之腫瘤疾病(較佳結腸癌)之方法，其包括投與TLR-9促效劑，其中該TLR-9促效劑包含i.包含至少一個未甲基化CG二核苷酸之寡去氧核糖核苷酸，其中C係去氧胞苷及G係去氧鳥苷，及ii.至少三個、特定言之四個連續去氧鳥苷的至少一個拉伸物，且該寡去氧核糖核苷酸之去氧核糖部分係藉由磷酸二酯鍵鍵聯，其中利用該TLR-9促效劑之治療刺激CD3+ T細胞之浸潤至腫瘤中及/或刺激巨噬細胞(較佳M1巨噬細胞)之浸潤至腫瘤中及/或導致腫瘤內M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率增加。
較佳地，該TLR-9促效劑係來非莫德(Lefitolimod)。
40.一種包含TLR-9促效劑及化學治療劑及/或查核點抑制劑之組合，其用於在有需要之個體中治療腫瘤疾病，較佳結腸癌，該TLR-9促效劑包含i.包含至少一個未甲基化CG二核苷酸之寡去氧核糖核苷酸，其中C係去氧胞苷及G係去氧鳥苷，及ii.至少三個、特定言之四個連續去氧鳥苷的至少一個拉伸物，且該寡去氧核糖核苷酸之去氧核糖部分係藉由磷酸二酯鍵鍵聯，其中利用該TLR-9促效劑之治療刺激CD3+ T細胞之浸潤至腫瘤中及/或刺激巨噬細胞(較佳M1巨噬細胞)之浸潤至腫瘤中及/或導致腫瘤內M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率增加。
較佳地，該TLR-9促效劑係來非莫德(Lefitolimod)。
實施例
如同本發明使用TLR9促效劑之效益藉由兩種TLR9促效劑-來非莫德(Lefitolimod)(SEQ ID NO：3)及包含L-核苷酸的TLR-9促效劑(SEQ ID NO：5)來例示。評估來非莫德(Lefitolimod)及包含L-核苷酸之TLR-9促效劑(SEQ ID NO：5)針對抗腫瘤免疫反應所需之免疫細胞的浸潤調節腫瘤微環境(TME)的能力。來非莫德(Lefitolimod)及包含L-核苷酸之TLR-9促效劑(SEQ ID NO：5)兩者係本發明之特佳具體例。
使用同源鼠類結腸癌模型(CT26)來證實此等作用。使用免疫組織學(IHC)及流動式細胞測量術來評估TME之生物調節。
材料/方法 1.)於腫瘤內投與後之免疫組織學(IHC)
在第0天向Balb/c小鼠於側腹皮下接種含有基底膠(matrigel)的0.05×106個CT26腫瘤細胞。利用籠形等化器軟體將小鼠依其腫瘤體積隨機分至治療組中。在第10天當腫瘤達到大約140mm3之體積時，經由腫瘤內途徑投與化合物(溶解於PBS中)或媒劑(PBS)。每週3次施用200μg來非莫德(Lefitolimod)或200μg包含L-核苷酸之TLR-9促效劑(SEQ ID NO：5)。在第21天使小鼠犧牲並收集腫瘤進行IHC。關於CD3染色以及巨噬細胞標幟物F4/80之染色，將組織固定於福馬林中並嵌埋於石蠟中。關於CD8染色，進行冷凍切片。藉由標準方法進行IHC染色。針對腫瘤中心以及侵襲性邊界分析免疫細胞之染色。藉由Definiens軟體(Definiens AG,Munich,Germany)定量CD3-染色及藉由評分策略人工定量CD8染色： CD8之評分策略從1至4：
1=無標記
2=極少標記
3=中間標記
4=密集標記
由一位IHC操作員進行評分並由另一位未參與研究的IHC操作員作查核。
2.)於腫瘤內投與後之流動式細胞測量術
生命中部分(CT 26小鼠)係如前所述，除了使用250μg來非莫德(Lefitolimod)。在第21天使小鼠犧牲並收集腫瘤來藉由流動式細胞測量術進行腫瘤浸潤白血球的分析。使用兩組螢光團結合抗體來評估T細胞及巨噬細胞：
使用存活性染料(viability dye)eFluor 520來鑑別死亡細胞。CD45係白血球之標幟物且用來區別白血球與腫瘤細胞。
已使用以下標幟物來偵測以下細胞類型：
使用Thy1來替代CD3，因CD3可在細胞活化時下調。
3.)於皮下投與後之IHC
在第0天向Balb/c小鼠於右下側腹中皮下接種0.5×106個CT26腫瘤細胞。使用StudyDirectorTM軟體(Studylog Systems,Inc.,South San Francisco,CA,USA)將小鼠根據其體重隨機分至治療組中。在第2天經由遠距皮下途徑(左前側腹附近的腋淋巴結)投與來非莫德(Lefitolimod)(溶解於PBS中)或媒劑(PBS)。每週3次施用250μg來非莫德(Lefitolimod)直至第16天為止。在第17天使小鼠犧牲並收集腫瘤進行IHC。將組織固定於福馬林中並嵌埋於石蠟中。藉由熟悉技藝人士已知之標準方法進行用於CD8之IHC染色。利用NanoZoomer-HT 2.0影像系統(Hamamatsu photonics)掃描所有經染色的切片。選擇各樣本之五個代表性範圍進行分析。利用ImageJ軟體(https：//imagej.net/)進行經掃描區域的定量。將IHC分數呈現為在五個範圍中之陽性細胞計數之平均值相對該等範圍中之總細胞數的比率。腫瘤邊界及腫瘤中心之IHC評分係分開地進行。
結果
利用腫瘤內投與之來非莫德(Lefitolimod)的治療相較於媒劑對照物導致降低的腫瘤生長(圖3、圖4及圖5)。此伴隨CD3+ T細胞之增強浸潤至腫瘤中心中(圖6)。來非莫德(Lefitolimod)治療亦導致細胞毒性CD8+ T細胞之浸潤至腫瘤中心中(圖7)。在CD8+ T細胞浸潤與腫瘤生長減小之間存在關聯(p=0.022；圖8及圖9)。
利用包含L-核苷酸之TLR-9促效劑(SEQ ID NO：5)(腫瘤內投與)的治療相較於媒劑對照物導致降低的腫瘤生長(圖10、圖11及圖12)。觀察到CD3+ T細胞的中度浸潤至腫瘤中(圖13)。利用包含L-核苷酸之TLR-9促效劑(SEQ ID NO：5)的治療亦導致細胞毒性CD8+ T細胞之浸潤至腫瘤中心中(圖14)。存在在CD8+ T細胞浸潤與腫瘤生長減小之間存在關聯的趨勢(圖15及圖16)。
藉由流動式細胞測量術確認藉由來非莫德(Lefitolimod)(腫瘤內投與)之CD3+ T細胞以及CD8+ T細胞的浸潤。觀察到兩種細胞群體在全體腫瘤細胞內之增加。(圖17)。
此外，藉由來非莫德(Lefitolimod)(腫瘤內投與)，抗腫瘤性細胞毒性效應物T細胞(CD8+CD69+GrzB+)對促腫瘤發生調節T細胞之比率顯著地增加。細胞毒性效應物T細胞表現溶細胞分子，例如顆粒酶B(Grz B)，且因此可破壞腫瘤細胞。針對全體CD8+ T細胞群體觀察到相同結果。調節T細胞之頻率保持不變(圖18)。
來非莫德(Lefitolimod)治療(腫瘤內投與)導致巨噬細胞被吸引至腫瘤中(圖19)。
流動式細胞測量分析之結果顯示藉由來非莫德 (Lefitolimod)(腫瘤內投與)，腫瘤內之M1巨噬細胞(CD86及MHC II高)增加、M2巨噬細胞(CD86及MHC II低)減少及M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率增加(圖20)。
已使用克默果夫-史密諾夫檢定(Kolmogorov-Smirnov test)進行圖17、圖18及圖20之數據的統計分析。
腫瘤體積不僅於腫瘤內投與來非莫德(Lefitolimod)後減小，而且亦於遠距皮下投與來非莫德(Lefitolimod)後減小(圖21-23)。來非莫德(Lefitolimod)治療(皮下投與)亦導致細胞毒性CD8+ T細胞浸潤至腫瘤之中心及邊界中(圖24-25)。
因此，根據本發明之TLR-9促效劑有利於調節TME及促進抗腫瘤反應，其中促進M2巨噬細胞之轉變為M1巨噬細胞及/或刺激M1巨噬細胞及/或CD8+ T細胞(例如，細胞毒性效應物T細胞(CD8+CD69+GrzB+))之浸潤至腫瘤中。
<110> 摩洛基公司
<120> 調節腫瘤微環境之TLR-9促效劑
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 來非莫德(Lefitolimod)之部分序列
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<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dSLIM 2006之部分序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 來非莫德(Lefitolimod)之完整序列
<400> 3
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<211> 116
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<213> 人工序列
<220>
<223> dSLIM 2006之完整序列
<400> 4
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EnanDIM581之完整序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 核苷酸31及32：呈L-組態
<400> 5

Claims (22)

  1. 一種用於在有需要之個體中治療腫瘤疾病之TLR-9促效劑，該疾病較佳為結腸癌，該TLR-9促效劑包含i.包含至少一個未甲基化CG二核苷酸之寡去氧核糖核苷酸，其中C係去氧胞苷及G係去氧鳥苷，及ii.至少三個、特定言之四個連續去氧鳥苷的至少一個拉伸物，且該寡去氧核糖核苷酸之去氧核糖部分係藉由磷酸二酯鍵鍵聯，其中利用該TLR-9促效劑之治療係刺激CD3+ T細胞之浸潤至腫瘤中及/或刺激巨噬細胞，較佳M1巨噬細胞之浸潤至腫瘤中及/或導致腫瘤內M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率增加。
  2. 如請求項1所使用之TLR-9促效劑，其中，該腫瘤經CD3+ T細胞及/或經巨噬細胞，較佳M1巨噬細胞之浸潤與沒有該TLR-9促效劑之治療的浸潤相比受到刺激，及/或該腫瘤內M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率與沒有該TLR-9促效劑之治療之M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率相比增加。
  3. 如請求項1或2所使用之TLR-9促效劑，其中，該等CD3+ T細胞係CD4+或CD8+ T細胞，較佳係CD8+ T細胞。
  4. 如請求項3所使用之TLR-9促效劑，其中，利用該TLR-9促效劑之治療導致該腫瘤中之CD8+ T細胞群體內之細胞毒性效應物T細胞(CD8+ CD69+顆粒酶B+)的頻率增加及/或導致CD8+ T細胞，較佳細胞毒性效應物T細胞(CD8+ CD69+顆粒酶B+)對調節T細胞的比率增加。
  5. 如前述請求項中任一項所使用之TLR-9促效劑，其中，該腫瘤係於其周邊及/或其中心被浸潤，較佳於其中心。
  6. 如前述請求項中任一項所使用之TLR-9促效劑，其中，該腫瘤係固體腫瘤，較佳結腸癌，及該待治療之個體係人類。
  7. 如前述請求項中任一項所使用之TLR-9促效劑，其中，該TLR-9促效劑係腫瘤內投與或皮下投與。
  8. 如前述請求項中任一項所使用之TLR-9促效劑，其中，該至少一個CG二核苷酸係序列N 1N 2CGN 3N 4的部分，其中N 1N 2係AA、TT、GG、GT、GA或AT及N 3N 4係CT、TT、TG或GG，及C係去氧胞苷，G係去氧鳥苷，A係去氧腺苷，及T係去氧胸苷。
  9. 如前述請求項中任一項所使用之TLR-9促效劑，其中，該寡去氧核糖核苷酸包含至少一個呈L-組態之核苷酸，較佳地，該至少一個呈L-組態之核苷酸係包含於該寡去氧核糖核苷酸之至少一端的末端五個核苷酸內，較佳於該寡去氧核糖核苷酸之3’端的末端五個核苷酸內。
  10. 如前述請求項中任一項所使用之TLR-9促效劑，其中，該寡去氧核糖核苷酸包含至少三個CG二核苷酸。
  11. 如前述請求項中任一項所使用之TLR-9促效劑，其中，該寡去氧核糖核苷酸係單股及/或部分或完全雙股。
  12. 如前述請求項中任一項所使用之TLR-9促效劑，其中，該寡去氧核糖核苷酸包含兩個單股環圈且形成啞鈴形狀。
  13. 如請求項12所使用之TLR-9促效劑，其中，所有核苷酸係呈D-組態。
  14. 如請求項12或13所使用之TLR-9促效劑，其具有SEQ ID NO：3之序列。
  15. 如請求項9所使用之TLR-9促效劑，其具有SEQ ID NO：5 之序列。
  16. 如前述請求項中任一項所使用之TLR-9促效劑，其中，該待治療之個體先前已接受及/或隨後接受另一癌症治療，較佳係化學治療劑及/或查核點抑制劑。
  17. 如前述請求項中任一項所使用之TLR-9促效劑，其中，利用該TLR-9促效劑之治療導致冷腫瘤轉變為熱腫瘤。
  18. 一種用於將冷腫瘤轉變為熱腫瘤之TLR-9促效劑，其中，該TLR-9促效劑包含i.包含至少一個未甲基化CG二核苷酸之寡去氧核糖核苷酸，其中C係去氧胞苷及G係去氧鳥苷，及ii.至少三個、特定言之四個連續去氧鳥苷的至少一個拉伸物，且其中該寡去氧核糖核苷酸之去氧核糖部分係藉由磷酸二酯鍵鍵聯且其中該腫瘤較佳係結腸癌。
  19. 一種用於增加CD3+ T細胞(較佳CD8+ T細胞)之浸潤至腫瘤(較佳結腸癌)中之方法，及/或用於增加腫瘤中之CD8+ T細胞群體內之細胞毒性效應物T細胞(CD8+ CD69+顆粒酶B+)之頻率及/或用於增加CD8+ T細胞，較佳細胞毒性效應物T細胞(CD8+ CD69+顆粒酶B+)對調節T細胞之比率及/或用來增加巨噬細胞，較佳M1巨噬細胞之浸潤至腫瘤中及/或用來增加腫瘤內M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率的方法，其包括向有需要之患者投與TLR-9促效劑，其中該TLR-9促效劑包含i.包含至少一個未甲基化CG二核苷酸之寡去氧核糖核苷酸，其中C係去氧胞苷及G係去氧鳥苷，及 ii.至少三個、特定言之四個連續去氧鳥苷的至少一個拉伸物，且其中該寡去氧核糖核苷酸之去氧核糖部分係藉由磷酸二酯鍵鍵聯。
  20. 一種TLR-9促效劑用於增加CD3+ T細胞(較佳CD8+ T細胞)之浸潤至腫瘤(較佳結腸癌)中之用途，及/或用於增加腫瘤中之CD8+ T細胞群體內之細胞毒性效應物T細胞(CD8+ CD69+顆粒酶B+)之頻率及/或用於增加CD8+ T細胞，較佳細胞毒性效應物T細胞(CD8+ CD69+顆粒酶B+)對調節T細胞之比率及/或用於增加巨噬細胞，較佳M1巨噬細胞之浸潤至腫瘤中及/或用於增加腫瘤內M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率的用途，其中，該TLR-9促效劑包含i.包含至少一個未甲基化CG二核苷酸之寡去氧核糖核苷酸，其中C係去氧胞苷及G係去氧鳥苷，及ii.至少三個、特定言之四個連續去氧鳥苷的至少一個拉伸物，且其中該寡去氧核糖核苷酸之去氧核糖部分係藉由磷酸二酯鍵鍵聯。
  21. 一種包含TLR-9促效劑及化學治療劑及/或查核點抑制劑之組合物，其用於在有需要之個體中治療腫瘤疾病，較佳結腸癌，該TLR-9促效劑包含i.包含至少一個未甲基化CG二核苷酸之寡去氧核糖核苷酸，其中C係去氧胞苷及G係去氧鳥苷，及ii.至少三個、特定言之四個連續去氧鳥苷的至少一個拉伸物， 且該寡去氧核糖核苷酸之去氧核糖部分係藉由磷酸二酯鍵鍵聯，其中利用該TLR-9促效劑之治療係刺激CD3+ T細胞之浸潤至腫瘤中及/或刺激巨噬細胞，較佳M1巨噬細胞之浸潤至腫瘤中及/或導致腫瘤內M1巨噬細胞對M2巨噬細胞之比率增加。
  22. 一種醫藥組成物，其用於治療腫瘤疾病，較佳結腸癌，包含於PBS中之1mg/ml至50mg/ml、較佳10mg/ml至20mg/ml、更佳15mg/ml之TLR-9促效劑，其中該PBS具有pH 6至8、特定言之7.2至7.6之pH值，且包含6mg/ml至12mg/ml、較佳8.0mg/ml之氯化鈉，0.1mg/ml至0.3mg/ml、較佳0.2mg/ml之氯化鉀，0.1mg/ml至0.3mg/ml、較佳0.2mg/ml之磷酸二氫鉀，及1.0mg/ml至1.5mg/ml、較佳1.15mg/ml之磷酸氫二鈉。
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