JP2022527473A - アンチセンスを用いてがんを治療するための方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）を標的とするアンチセンス（ＡＳ）核酸を用いてがんを治療するための組成物及び方法に関する。ＡＳは、患者に全身投与されるか、又は自家がん細胞ワクチンを製造するために使用され得る。実施形態では、ＡＳは、腫瘍細胞と有効量のＡＳとを含む植込み型照射生体用拡散チャンバーで提供される。チャンバーは、照射され、対象の腹部に植え込まれ、そして免疫反応を刺激して腫瘍を遠位から攻撃する。本明細書に開示される組成物及び方法は、多種多様ながん、例えば膠芽細胞腫を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態において、対象におけるインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）を標的とするアンチセンス（ＡＳ）核酸の有効性を予測するための方法が提供される。

Description

本開示は、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）を標的とするアンチセンス核酸を用いてがんを治療するための組成物及び方法に関する。本開示はまた、腫瘍細胞とＩＧＦ－１Ｒを標的とするアンチセンス核酸とを含む少なくとも１つの植込み型照射生体用拡散チャンバー（米国特許第６，５４１，０３６号明細書及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２６９７０号パンフレット（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）を用いて対象を治療することによりがんを治療するための組成物及び方法に関する。

特許文献１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、「インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）を標的とするアンチセンス（ＡＳ）核酸を使用してがんを治療するための組成物及び方法」を開示している。ＡＳは、患者に全身投与することも、自家がん細胞ワクチンを製造するために使用することもできる。ＩＧＦ－１Ｒに対する患者の反応は様々であり得るため、がんを患っている対象の、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮによる治療に応答した予後を予測する方法が必要である。

国際公開第２０１８／１６５５２８号

本開示は、少なくとも部分的に、がんを有する対象を治療するためのインスリン様成長因子受容体－１（ＩＧＦ－１Ｒ）（「ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ」）を標的とするアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳ－ＯＤＮ）の使用に関する。特定の態様において、本開示は、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮによる治療に応答する可能性が高い対象の特定、及びそのような対象へのＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの投与に関する方法及び組成物（診断及びコンパニオン診断を含む）に関する。特定の実施形態において、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮによる治療に応答する可能性が高い対象は、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化を判定すること及び／又はＴ細胞機能を判定することにより特定される。特定の実施形態において、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮによる治療に応答する可能性が高い対象は、前記対象においてＭＧＭＴメチル化を判定すること及び／又はＴ細胞機能を判定することにより特定され、ここで、対象においてメチル化ＭＧＭＴを有する、及び／又は良好なＴ細胞機能を有する患者は、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮによる治療に応答する可能性が高いことを示している。

いくつかの実施形態では、がん（例えば、神経膠腫又は神経膠芽腫）を有する対象の、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮでの治療に応答した予後を予測する方法が提供され、ここで、この方法は、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化を判定すること及び／又はＴ細胞機能を判定することを含む。

一態様において、がんと診断された対象におけるＭＧＭＴメチル化を判定及び／又はＴ細胞機能を判定し、続いて対象にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを投与することを含む方法が提供される。関連する実施形態では、がんと診断された対象におけるＭＧＴＭメチル化を判定及び／又はＴ細胞機能を判定し、続いて、対象がメチル化ＭＧＭＴを有すると確認され、及び／又は対象が良好なＴ細胞機能を有する場合にのみ、対象にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを投与することを含む方法が提供される。

本明細書で使用される場合、ＭＧＭＴは、Ｏ６－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ６ＬＤＤ１）を指す。Ｏ６－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）プロモーターのメチル化は、Ｏ６グアニンのメチル基を脱アルキル化する細胞の能力を停止させ、非メチル化ＭＧＭＴプロモーターを有する患者と比較してテモゾロミド（ＴＭＺ）の治療効果を高める。ＤＮＡメチル化は、シトシン又はグアニンヌクレオチドの通常は５’位にメチル基が共有結合で付加されるものである。ＭＧＭＴメチル化の評価は、当技術分野で周知の方法を使用して実施及び決定することができる。いくつかの実施形態では、ＭＧＭＴ遺伝子プロモーター内の８つのＣｐＧアイランドのメチル化状態が評価される。様々な実施形態におけるメチル化ＭＧＭＴは、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ治療に対する好ましい予後及び／又は陽性反応の予測の指標である。一方、非メチル化ＭＧＭＴは、様々な実施形態において、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ治療に対する好ましい予後及び／又は陽性反応の予測の指標である。

Ｔ細胞機能の判定もまた、当技術分野で周知の方法及び基準を使用して判定することができる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞機能は、非特異的刺激に応答してＩＦＮ－γを発現するＴ細胞の数を評価することによって決定される。特定の実施形態において、本明細書で使用される「良好なＴ細胞機能」という用語は、非特異的刺激に応答してＩＦＮ－γを発現するＴ細胞の数が中央値以上である対象を指す。「不十分なＴ細胞機能」という用語は、非特異的刺激に応答してＩＦＮ－γを発現するＴ細胞の数が中央値以下である対象を指す。

いくつかの実施形態において、テモゾラミドが対象に投与される前に、前記ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが前記対象に投与される。特定の実施形態において、前記ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、テモゾロミドが対象に投与される少なくとも２週間；少なくとも３週間；少なくとも４週間；少なくとも５週間；少なくとも６週間；少なくとも７週間；又は少なくとも８週間前に、前記対象に投与される。

本明細書で提供される態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、自家がん細胞ワクチンとして対象に投与される。本明細書で提供される態様及び実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、完全に製剤化された生体用拡散チャンバーとして対象に投与される。

本開示は、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）を標的とするアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳ－ＯＤＮ）が、本明細書に記載の治療法で使用されたとき、がんを治療する対象における反応を効果的に刺激することを実証する。特定の態様では、方法は、患者において自己由来がん細胞ワクチンの一部として単独で又は任意選択的に全身投与と共にがんを治療するのに有効である。好ましい方法では、本明細書に開示される方法は、単独療法として、すなわち、化学療法の不在下かつ放射線療法の不在下で有効ながん療法を提供する。

実施形態では、本開示は、腫瘍を患う対象に植え込むための生体用拡散チャンバーを提供する。この生体用拡散チャンバーは、照射腫瘍細胞と照射インスリン様成長因子１受容体アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ）とを含む。実施形態では、腫瘍細胞は、対象の切除部位から取り出される。

実施形態では、本開示は、照射ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮと、照射され、接着の強化された細片化腫瘍細胞とを含む拡散チャンバーを提供する。この生体内拡散チャンバーは、細胞に対して不透過性かつＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに対して透過性の膜を含む。

実施形態では、腫瘍細胞は、内視鏡デバイスを用いて切除部位から取り出される。さらなる実施形態では、腫瘍細胞は、組織モルセレータを用いて切除部位から取り出される。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、組織モルセレータを使用して切除部位から除去されたときに生存可能である。他の実施形態では、組織モルセレータは、静置外側カニューレ内に高速往復内側カニューレを含む。外側カニューレは、サイドアパーチャを含み得るとともに、さらに腫瘍細胞は、電子制御可変吸引によりサイドアパーチャに吸い込まれる。実施形態では、組織モルセレータは、切除部位で熱を生成しない。その他のさらなる実施形態では、腫瘍細胞は、生体用拡散チャンバーに配置される前にネスチン発現に関して富化される。いくつかの実施形態では、チャンバーの植込みは、対象において腫瘍の再成長を阻害する。いくつかの実施形態では、チャンバーの植込みは、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、又は少なくとも３６ヵ月間にわたり腫瘍の再成長を阻害する。

その他の実施形態では、本開示は、腫瘍を患う対象に植え込むための生体用拡散チャンバーの作製方法を提供する。この方法は、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの存在下で生体用拡散チャンバーに腫瘍細胞を配置することと、生体用拡散チャンバーに放射線照射することと、を含み、腫瘍細胞は、対象において、切除部位で熱を生成しない組織モルセレータを用いて切除部位から取り出される。典型的には、複数のチャンバーが使用される。例えば、約１０個のチャンバー又は約２０個のチャンバー。有利には、最適抗腫瘍反応は、チャンバー内の細胞数が約７５０，０００～約１，２５０，０００のときに達成される。例えば、２０個のチャンバーが植え込まれる場合、約１，０００，０００／チャンバーである。

いくつかの実施形態では、組織モルセレータは内視鏡デバイスである。さらなる実施形態では、組織モルセレータは、静置外側カニューレ内に高速往復内側カニューレを含む。そのほかの実施形態では、外側カニューレは、サイドアパーチャを含み、かつ腫瘍細胞は、電子制御可変吸引によりサイドアパーチャに吸い込まれる。

実施形態では、本開示は、腫瘍を患う対象の治療方法を提供する。この方法は、１つ以上の生体用拡散チャンバーを対象に植え込むことを含み、１つ以上の生体用拡散チャンバーは、照射腫瘍細胞と照射インスリン様成長因子１受容体アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ）とを含み、腫瘍細胞は、対象において、切除部位で熱を生成しない組織モルセレータを用いて切除部位から取り出される。

ＩＧＶ－００１を受けている患者のＯＳ。図１Ａは、ＩＴＴ母集団のＯＳを示す。図１Ｂは、ＩＧＶ－００１の最高の曝露を受けている患者のＯＳを示す。印は打ち切られたデータを示す（打ち切られたデータとは、様々な基準のいずれかに基づいて臨床試験から除外された患者のデータポイントを指す）。 ＩＧＶ－００１で治療された患者のＯＳ。最初の年の、膠芽腫の進行に起因しない死亡を除く。Ｓｔｕｐｐら^１１のＳＯＣのみを受けた患者と比較したもの。チェック印は打ち切られたデータを示す。 ＭＧＭＴプロモーターメチル化状態に基づく、ＩＧＶ－００１で治療された患者のＯＳ。チェック印は打ち切られたデータを示す。 ２件の公開された研究におけるＳＯＣのみを受けた患者と比較した、ＩＧＶ－００１で治療された患者のＰＦＳ。 ＩＧＶ－００１で治療された、メチル化ＭＧＭＴプロモーターを有する患者の、ＳＯＣのみと対比したＰＦＳ。

詳細な説明
定義
本明細書に定義されていない用語はすべて、当技術分野で認識されているそれらの通常の意味を有する。

本明細書で用いられる場合、「１つ（ａ、ａｎ）」、「前記（ｔｈｅ）」などの用語は、文脈上そうでないことが明確でない限り、単数及び複数の参照対象を含む。
本明細書で用いられる場合、数値の前に付く「約」という用語は、その値±１０％の範囲内を表す。例えば、「約１００」は、９０及び１１０を包含する。誤解を避けるために、約という用語は、示された値自体に加えてその１０％の範囲を含むことが理解され、例えば、「約１００」は、１００ちょうど及び９０～１００の範囲を含む。

本明細書で用いられる場合、「自己～」、「自家～」という用語は、同一個体から得られる細胞又は組織を意味する。
本明細書で用いられる場合、「自家がん細胞ワクチン」という用語は、部分的には、個体から腫瘍細胞を単離してこの腫瘍細胞をｅｘ ｖｉｖｏで処理することにより生成される治療剤を意味する。次いで、細胞は、腫瘍細胞が単離された個体に再投与される。実施形態では、自家がん細胞ワクチンは、腫瘍細胞のほか、追加の成分、例えば、緩衝剤及び／又はアンチセンス核酸（例えば、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮなど）を含み得る。実施形態では、「自家がん細胞ワクチン」は、腫瘍細胞と１つ以上の追加の成分とを含有する生体用拡散チャンバーを意味し得る。ある特定の態様では、「自家がん細胞ワクチン」は、本明細書では「完全製剤化生体用拡散チャンバー」ともいう「完全製剤化チャンバー」であり得る。

本明細書で用いられる場合、「完全製剤化チャンバー」又は「完全製剤化生体用拡散チャンバー」という用語は、第１の量のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮと共にチャンバーに封入する前に処理してもしなくてもよい、自己腫瘍細胞と腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に含まれる他の細胞とを含む生体用拡散チャンバーである。細胞に第２の量例えば少なくとも２μｇのＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの外因的添加を行って封入し、次いで、５Ｇｙのγ線をチャンバーに照射する。

本明細書で用いられる場合、「低分子」という用語は、核酸、ペプチド、タンパク質、及び他の化学物質（例えば、細胞により産生されるサイトカイン、成長ホルモンなど）を含むが、細胞、エキソソーム、マイクロベシクルを含まない。

本明細書で用いられる「ＩＧＦ－１Ｒ発現を標的とする」という用語は、ＩＧＦ－１Ｒに結合するように設計された配列を有するアンチセンス核酸を投与することを意味する。
本明細書で用いられる場合、「全身投与」という用語は、対象の体全体にわたり物質の送達を達成することを意味する。典型的な全身投与経路としては、非経口投与、経真皮投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、及び筋肉内投与が挙げられる。

他の投与経路としては、経口投与、鼻投与、局所投与、眼内投与、頬腔内投与、舌下投与、膣投与、肝内投与、心内投与、膵内投与、吸入投与、及び植込みポンプ投与が挙げられる。

アンチセンス分子
アンチセンス分子とは、ワトソン・クリック塩基対合則によりｍＲＮＡの相補的標的配列に結合することにより機能する核酸のことである。標的ｍＲＮＡの翻訳は、相補的ヘリックス間でハイブリダイゼーションが行われるとき、活性機序及び／又は受動的機序により阻害される。受動的機序では、ｍＲＮＡと外因性ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションは、リボソーム複合体によるメッセージの読取りを防止する二本鎖の形成をもたらす。活性機序では、ハイブリダイゼーションは、ＲｎａｓｅＨの結合を促進し、これによりＲＮＡを破壊するが、アンチセンスをインタクトな状態で残して、他方の相補的ｍＲＮＡ標的にハイブリダイズする。一方又は両方の機序は、悪性表現型に寄与する又はそれを持続するタンパク質の翻訳を阻害する。治療剤として、アンチセンス分子は、はるかに選択的であるので、従来の薬剤よりも有効でありかつ毒性が低い。

本明細書に開示される方法及び組成物は、がんを治療するためのアンチセンス分子の使用を含む。典型的には、アンチセンス分子は、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳ－ＯＤＮ）である。いくつかの実施形態では、アンチセンス分子は修飾リン酸骨格を含む。ある特定の態様では、リン酸骨格修飾は、ヌクレアーゼ分解に対するアンチセンスの耐性を増加させる。ある特定の実施形態では、修飾はロックドアンチセンスである。他の実施形態では、修飾はホスホロチオエート結合である。ある特定の態様では、アンチセンスは１つ以上のホスホロチオエート結合を含有する。ある特定の実施形態では、ホスホロチオエート結合は、ヌクレアーゼ耐性を付与することによりアンチセンス分子を安定化させ、それによりその半減期を増加させる。いくつかの実施形態では、アンチセンスは部分的にホスホロチオエート結合しうる。たとえば、アンチセンスの約１％まで、約３％まで、約５％まで、約１０％まで、約２０％まで、約３０％まで、約４０％まで、約５０％まで、約６０％まで、約７０％まで、約８０％まで、約９０％まで、約９５％まで、又は約９９％までホスホロチオエート結合されうる。いくつかの実施形態では、アンチセンスは完全にホスホロチオエート結合される。他の実施形態では、ホスホロチオエート結合はホスホジエステル結合と交互でありうる。ある特定の実施形態では、アンチセンスは少なくとも１つの末端ホスホロチオエート一リン酸を有する。

いくつかの実施形態では、アンチセンス分子は１つ以上のＣｐＧモチーフを含む。他の実施形態では、アンチセンス分子はＣｐＧモチーフを含まない。ある特定の態様では、１つ以上のＣｐＧモチーフはメチル化される。他の態様では、１つ以上のＣｐＧモチーフはメチル化されない。ある特定の実施形態では、アンチセンス分子が対象に投与されるとき、１つ以上の非メチル化ＣｐＧモチーフは先天性免疫反応を誘発する。いくつかの態様では、先天性免疫反応は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）への非メチル化ＣｐＧ含有アンチセンス分子の結合により媒介される。

ある特定の実施形態では、アンチセンス分子は、少なくとも１つの末端修飾又は「キャップ」を含む。キャップは、５’及び／又は３’キャップ構造であり得る。「キャップ」又は「エンドキャップ」という用語は、オリゴヌクレオチドのどちらかの末端の化学修飾を含むとともに（末端リボヌクレオチドに対して）、５’末端の最後の２つのヌクレオチド間及び３’末端の最後の２つヌクレオチドの間の結合の修飾を含む。キャップ構造は、標的配列との分子相互作用や細胞機構を損なうことなくエキソヌクレアーゼに対するアンチセンス分子の耐性を増加させ得る。そのような修飾は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏにおけるその効力の増加に基づいて選択しうる。キャップは、５’末端（５’キャップ）若しくは３’末端（３’キャップ）に存在し得るか、又は両方の末端に存在し得る。ある特定の実施形態では、５’及び／又は３’キャップは、ホスホロチオエート一リン酸、脱塩基残基（部分）、ホスホロチオエート結合、４’－チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、反転ヌクレオチド又は反転脱塩基部分（２’－３’又は３’－３’）、ホスホロジチオエート一リン酸、及びメチルホスホネート部分から独立して選択される。ホスホロチオエート結合又はホスホロジチオエート結合は、キャップ構造の一部のとき、一般に５’末端の２つの末端ヌクレオチド間及び３’末端の２つの末端ヌクレオチド間に配置される。

好ましい実施形態では、アンチセンス分子は、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）の発現を標的とする。ＩＧＦ－１Ｒは、インスリン受容体と７０％の相同性を共有するチロシンキナーゼ細胞表面受容体である。そのリガンド（ＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、及びインスリン）による活性化時、それは増殖、形質転換、及び細胞生存をはじめとする広範な細胞機能をレギュレートする。ＩＧＦ－１Ｒは、正常成長の絶対条件ではないが、悪性組織に生じ得る足場非依存条件における成長に不可欠である。腫瘍におけるＩＧＦ－１Ｒの役割のレビューは、バサーガ（Ｂａｓｅｒｇａ）ら著、「ビタミンとホルモン（Ｖｉｔａｍｉｎｓ ａｎｄ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ）」、第５３巻、ｐ．６５～９８、１９９７年（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提供される。

ある特定の実施形態では、アンチセンス分子は、成長因子又は成長因子受容体、例えば、ＩＧＦ－１ＲなどのＤＮＡ又はＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、アンチセンスは、ＩＧＦ－１Ｒを標的とするデオキシヌクレオチド（ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ）である。ＩＧＦ－１Ｒの全長コード配列は、配列番号１９として提供される（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／２６９７０号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

ある特定の実施形態では、アンチセンス分子は、ＲＮＡ又はＤＮＡのどちらかを含む、ＩＧＦ－１Ｒシグナル配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。ＩＧＦ－１Ｒのシグナル配列は３０アミノ酸配列である。他の実施形態では、アンチセンス分子は、ＲＮＡ又はＤＮＡのどちらかを含む、ＩＧＦ－１Ｒシグナル配列の一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス分子は、ＲＮＡ又はＤＮＡのどちらかを含む、ＩＧＦ－１Ｒのコドン１～３０９に相補的なヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、アンチセンス分子は、ＲＮＡ又はＤＮＡのどちらかを含む、ＩＧＦ－１Ｒのコドン１～３０９の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む。

ある特定の実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、少なくとも約５ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、又は少なくとも約５０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、約１５ヌクレオチド～約２２ヌクレオチドの長さである。ある特定の態様では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、約１８ヌクレオチドの長さである。

ある特定の実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、１８℃では二次構造を形成するが、約３７℃では二次構造を形成しない。他の実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、約１８℃でも約３７℃でも二次構造を形成しない。さらに他の実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、いずれの温度でも二次構造を形成しない。他の実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、３７℃で二次構造を形成しない。特定の実施形態では、二次構造は、ヘアピンループ構造である。

いくつかの態様では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、配列番号１のヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含む。ある特定の実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、配列番号１又はそのフラグメントに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、又は１００％の同一性を有しうる。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、１つ以上のホスホロチオエート結合を含む。

ある特定の態様では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは配列番号１からなる。ＮＯＢＥＬは、ホスホロチオエート骨格とＩＧＦ－１Ｒ遺伝子のコドン２～７に相補的な配列とを有する１８マーのオリゴデオキシヌクレオチドである。したがって、ＮＯＢＥＬは、ＩＧＦ－１Ｒを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ）である。５’末端でＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の相補的配列として誘導されるＮＯＢＥＬ配列は、
５’－ＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴ－３’（配列番号１）
である。

ＮＯＢＥＬは、そのホスホロチオエート骨格により安定な貯蔵寿命を有し、ヌクレアーゼ分解に耐性がある。ＮＯＢＥＬの投与は、当業者に公知のオリゴデオキシヌクレオチドの導入に関連する標準的方法のいずれかで提供可能である。有利には、ＮＯＢＥＬを含めて本明細書に開示されるＡＳ ＯＤＮは、毒性をほとんど／まったく伴うことなく投与され得る。マウス試験（尾静脈中４０μｇ）に基づく約２ｇ／ｋｇ（スケール調整）のレベルでさえも、毒性問題を示さなかった。ＮＯＢＥＬは、当業者に公知の通常の手順に従って製造可能である。

アンチセンス分子、例えば、配列番号１のＮＯＢＥＬ配列はまた、米国特許第９，７４４，１８７号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、１つ以上のｐ－エトキシ骨格修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、アンチセンス分子の核酸骨格は、少なくとも１つのｐ－エトキシ骨格結合を含む。たとえば、アンチセンス分子の約１％まで、約３％まで、約５％まで、約１０％まで、約２０％まで、約３０％まで、約４０％まで、約５０％まで、約６０％まで、約７０％まで、約８０％まで、約９０％まで、約９５％まで、又は約９９％までｐ－エトキシ結合され得る。結合の残りの部分は、ホスホジエステル結合又はホスホロチオエート結合又はそれらの組合せであり得る。好ましい実施形態では、各オリゴヌクレオチド中のリン酸骨格結合の５０％～８０％はｐ－エトキシ骨格結合であり、各オリゴヌクレオチド中のリン酸骨格結合の２０％～５０％は、ホスホジエステル骨格結合である。

各種ＩＧＦ－１Ｒアンチセンス配列は、ＮＯＢＥＬ配列のマルチモダリティー作用のいくつか又はすべてでバイオ活性である。１８マーのＮＯＢＥＬ配列は、ＩＧＦ－１Ｒ受容体のダウンレギュレーション活性とさらにはＴＬＲアゴニスト活性との両方を有し、マウスにおけるさらなる実験から、両方の活性がｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍免疫活性に必要であることが示唆される。ＡＳ ＯＤＮ分子は抗腫瘍活性を有するが、相補的センス配列は、同様にＣｐＧモチーフを有するにもかかわらずそうした活性を有していない。

ある特定の実施形態では、アンチセンス配列は、表１に示される配列番号１～１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アンチセンスは、配列番号１～１４の１つ以上に対して９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、アンチセンスは、配列番号１～１４の１つ以上に対して８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、アンチセンスは、配列番号１～１４の１つ以上に対して７０％の配列同一性を有する。

ある特定の実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、配列番号１～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含む。ある特定の実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、配列番号１～１４のいずれか１つ又はそのフラグメントに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、又は１００％の同一性を有し得る。

いくつかの実施形態では、アンチセンス分子は、細胞内でＩＧＦ－１Ｒ経路の下流の遺伝子の発現をダウンレギュレートする。ある特定の態様では、下流遺伝子はヘキソキナーゼ（ＨｅｘＩＩ）である。いくつかの実施形態では、アンチセンス分子は、細胞内でハウスキーピング遺伝子の発現をダウンレギュレートする。いくつかの態様では、ハウスキーピング遺伝子はＬ１３である。

ある特定の態様では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、化学合成される。ある特定の実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、固相有機合成により製造される。いくつかの態様では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの合成は、フロースルー技術を用いて密閉ケミカルカラムリアクターを備えたシンセサイザーで行われる。いくつかの実施形態では、固体担体上の各合成サイクルシーケンスは、全長ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが得られるまで逐次行われる複数のステップからなる。ある特定の実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、液状形態で貯蔵される。他の実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、貯蔵前に凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、凍結乾燥ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、使用前に水に溶解される。他の実施形態では、凍結乾燥ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、使用前に有機溶媒に溶解される。さらに他の実施形態では、凍結乾燥ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、医薬組成物として製剤化される。いくつかの態様では、医薬組成物は液状医薬組成物である。他の態様では、医薬組成物は固形医薬組成物である。追加のアンチセンス核酸は、米国特許出願公開第２０１７／００５６４３０号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）にも記載されている。

自家がん細胞ワクチン
緒言
免疫療法は、現在、１つの共通の細胞性抗原を用いて血液悪性腫瘍を標的とするように使用されている。残念ながら、固形腫瘍は、はるかに複雑であり、同定不能な数の腫瘍特異的標的を有して悪性状態への遺伝子変化のエピジェネティック進行を示す。さらに厄介なことに、ＷＨＯの診断用がんグループ内には腫瘍表現型の顕著な変動が存在する。自家細胞ワクチンは、すべてのこうした変動及び標的を包含して固形腫瘍がんに理想的な対象特異的免疫療法になるであろう。しかしながら、自家がん細胞ワクチンは、連続継代により腫瘍表現型が変化して腫瘍特異的抗原のアレイが減少するため、初代細胞培養から誘導することができない。このため、実現しがたいロットリリース認定が各継代で必要となるであろう。本開示は、新たに切除された細片化腫瘍細胞をプレーティングして２４時間以内にデポ抗原としてそれを再植込みすることにより、こうした懸念を排除する。ある特定の態様では、本明細書で達成される優れた結果は、本明細書に記載の具体例の中でも特に、適切な数の細胞がチャンバー内に存在することを確実にすることにより得られる。

従来の研究では、自己腫瘍細胞の代わりに抗原提示細胞を用いて自家細胞ワクチンを設計してきた。このパラダイムでは、治療前の血漿白血球分離（ｐｌａｓｍａ ｌｅｕｋｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）から対象の単球を集めて、ｅｘ ｖｉｖｏで自己由来樹状細胞（ＤＣ）に分化させる。次いで、対象の腫瘍粗ライセートに樹状細胞を提示してＤＣ活性化／成熟を誘発し、より後の時点で、今度は腫瘍抗原でクロスプライミングされた成熟樹状細胞をＤＣワクチンとして対象に注射する。しかしながら、ｅｘ ｖｉｖｏ分化は、ｉｎ ｖｉｖｏでのみ生じるいくつかの主要な刺激性成分が欠けている。そのほか、造血前駆体からのＤＣの分化は、高価な設備で多くの労力を要する細胞処理を行う大規模なｉｎ ｖｉｔｒｏ操作を必要とする。本開示は、内因的ＤＣ成熟プロセスと、適切な免疫反応の発生を促進する免疫モジュレート性及び免疫刺激性のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳ－ＯＤＮ）とを提供することにより、こうした懸念を回避する。より具体的には、本開示は、患者に由来する分散腫瘍細胞と照射アンチセンス分子とを含む生体用拡散チャンバーを提供する。これは治療有効期間にわたり患者に植え込まれる。いかなる理論にも拘束されるものではないが、照射腫瘍細胞とアンチセンスと生体用拡散チャンバーとの組合せは、局所免疫反応をシミュレートするように協奏的に作用するとともに、Ｍ２細胞を低減又は排除して免疫系の減衰を防止することにより反応を増強すると考えられる。

そのため、本開示は、新たに切除された腫瘍細胞とＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮとを含む照射植込み型生体用拡散チャンバーががん免疫療法に有効な対象特異的自家細胞ワクチンとして安全に機能することを示す。したがって、対象において腫瘍細胞を選択的に標的とする免疫反応を開始するための特許請求された植込み型生体用拡散チャンバーの使用は、がん、特にＧＢＭを治療するための新しい重要なアプローチを提供する。

生体用拡散チャンバー
代表的な拡散チャンバーは、第１の端部及び第２の端部の２つの端部を有するチャンバーバレルを含む。実施形態では、生体用拡散チャンバーは、ミリポア・コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により製造されるデュロポア（Ｄｕｒｏｐｏｒｅ）メンブレンなどの多孔性細胞不透過性メンブレンにより片側がキャップされた小リングである。任意選択的に、多孔性メンブレンを用いてシールするように１つの端部のみを開口した状態で残して、チャンバー本体の一部として端部の１つを密閉し得る。メンブレンは、強くて可撓性のある化学処理に耐えうるプラスチック、テフロン（登録商標）、ポリエステル、又はいずれかの不活性材料で作製可能である。チャンバーは、いずれかの物質、例えば、限定されるものではないが、プラスチック、テフロン（登録商標）、ルーサイト、チタン、プレキシガラス、又はヒトに対して非毒性で耐容性が良好ないずれかの不活性材料で作製可能である。そのほか、チャンバーは、滅菌処理に耐えられるようにすべきである。いくつかの態様では、拡散チャンバーは、使用前にエチレンオキシドで滅菌される。他の好適なチャンバーは、２０１８年１月２４日出願の米国仮特許出願第６２／６２１，２９５号明細書、米国特許第６，５４１，０３６号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ１６／２６９７０号パンフレット、及び米国特許第５，７１４，１７０号明細書（各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

ある特定の実施形態では、メンブレンは、低分子の通過を可能にするが、細胞の通過を可能にしない（すなわち、細胞は、チャンバーから出ることもそこに入ることもできない）。いくつかの態様では、メンブレンの細孔の直径は、チャンバーからの核酸及び他の化学物質（例えば、細胞により産生されたサイトカインなど）の拡散を可能にし、チャンバーと植え込まれた対象との間の細胞の通過を不能にする。本開示に有用な生体用拡散チャンバーは、チャンバーと植え込まれた対象との間の細胞の通過を不能にするいずれのチャンバーも含むが、ただし、チャンバーは、チャンバーと対象との間の因子の交換及び通過を可能にするものでなければならない。そのため、ある特定の態様では、細孔サイズは、チャンバーに出入りする１００μｍ^３超の体積の物質の通過を防止するカットオフを有する。いくつかの実施形態では、メンブレンの細孔は、約０．２５μｍ以下の直径を有する。たとえば、細孔は、約０．１μｍの直径を有しうる。特定の態様では、細孔は、直径０．１μｍ～０．２５μｍの範囲内である。また、ランゲ（Ｌａｎｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１９９４年、第１５３巻、ｐ．２０５～２１１、及びランザ（Ｌａｎｚａ）ら著、トランスプランテーション（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、１９９４年、第５７巻、ｐ．１３７１～１３７５（各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。この細孔直径は、チャンバーに出入りする細胞の通過を防止する。ある特定の実施形態では、拡散チャンバーは、０．１μｍの細孔サイズの親水性デュラポア（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）メンブレン（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を有する１４ｍｍルーサイトリングから構築される。

ある特定の実施形態では、生体用拡散チャンバーは、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮがチャンバーから拡散することを可能にするメンブレンを含む。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの約５０％が約１２時間でチャンバーから拡散し、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの約６０％が約２４時間でチャンバーから拡散し、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの約８０％が約４８時間でチャンバーから拡散し、かつ／又はＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの約１００％が約５０時間でチャンバーから拡散される。

例示的方法では、生体用拡散チャンバーを組み立てるために、第１の多孔性メンブレンは、耐密シールを形成するように接着剤及び圧力を用いて第１の拡散チャンバーの片側に装着される。第２の多孔性メンブレンは、第２の拡散チャンバーリングに同様に装着される。メンブレンは、より耐密なシールを同様に提供し得るゴムガスケットを用いて所定の位置に固定可能である。拡散チャンバーリングは、乾燥させるために一晩放置される（少なくとも８時間）。次いで、第１の拡散チャンバーリング及び第２の拡散チャンバーリングは、接着剤を用いて互いに装着され、そして乾燥させるために一晩放置される（少なくとも８時間）。好ましい実施形態では、第１のチャンバーリングと第２のチャンバーリングとの接合プロセスは、２つのリング間の接着を促進するために溶媒として２ジクロロエタンを使用することを含む。代替法では、チャンバーは、多孔性メンブレンを含有する側を１つのみ有しうる。

チャンバーのバレル部分には、チャンバーが植え込まれた後で対象の身体の外側からアクセスして拡散チャンバーに補充できるようにするキャップによりカバー可能な１つ以上の開口（たとえばポート）が提供される。開口は、汚染を伴うことなく、かつ対象に害を加えることなく内容物の多数回の逐次サンプリングを可能にするので、対象で実施される植込み手順の回数を有意に低減する。患者への植込み前に、ボーンワックス、ポートプラグ、又はＰＭＭＡなどで作製されたキャップを用いて１つ以上の開口をシールしうる。キャップは、ネジ込み型のセルフシーリングゴムにして開口に取付け可能である。いくつかの構成では、拡散チャンバーは、２つ以上の注入開口又はポートを含有しうる。チャンバー内容物のサンプリングは、対象の身体の外側でキャップを取り外して通常の針及びシリンジを挿入するように開口にアクセスすることにより、実施可能である。いくつかの実施形態では、チャンバーは、取出しデバイスをさらに含みうる。このようなデバイスは、患者からのチャンバーの取出しを容易にする。

実施形態では、チャンバーは、治療的宿主免疫反応を促進する目的で腫瘍抗原がチャンバーから拡散するように設計された抗原デポとして機能する。外因性ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ及びｅｘ ｖｉｖｏ照射は、炎症誘発反応を促進する。この製剤は、臨床上及びラジオグラフィー上の改善、プロトコルによる長期生存に関連し、外因性活性医薬成分（ＡＰＩ）と腫瘍免疫作用を誘発又は増強すると解釈される照射とを含む新規な自家細胞ワクチンとなる。さらに、低濃度のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの添加は、炎症誘発反応にきわめて重要である。

ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）腫瘍細胞と（ｂ）有効量のアンチセンス分子とを含む、がんを患う対象に植え込むための生体用拡散チャンバーを提供する。他の実施形態では、（ａ）腫瘍細胞と有効量のアンチセンス核酸とを含む生体用拡散チャンバーを得ることと、（ｂ）生体用拡散チャンバー及び内容物に照射することと、（ｃ）治療有効期間にわたり照射された生体用拡散チャンバーを対象に植え込むことと、を含む、対象においてがんを治療する方法が提供される。

ある特定の実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、約０．５μｇ～約１０μｇの範囲内の量で生体用拡散チャンバー内に存在する。ある特定の態様では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、約１μｇ～約５μｇ／チャンバー又は約２μｇ～４μｇ／チャンバーの範囲内の量で存在する。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、約２μｇ／チャンバーの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、約４μｇ／チャンバーの量で存在する。いくつかの実施形態では、約１．０マイクログラム（μｇ）～約５．０μｇの量で存在する。例えば、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、チャンバーあたり約１．０μｇ、約２．０μｇ、約３．０μｇ、約４．０μｇ、約５．０μｇ、約６．０μｇ、約７．０μｇ、約８．０μｇ、約９．０μｇ、又は約１０．０μｇの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、チャンバーあたり約５．０μｇ～約５０．０μｇの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、チャンバーあたり約５０．０μｇ～約１００．０μｇの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、チャンバーあたり約１０．０μｇ～約５００．０μｇの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、チャンバーあたり約１００．０μｇ～約５００．０μｇの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、チャンバーあたり約５００．０μｇ～約１．０ミリグラム（ｍｇ）の量で存在する。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、チャンバーあたり約１．０ｍｇ～約３．０ｍｇの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、チャンバーあたり約３．０ｍｇ～約５．０ｍｇの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、チャンバーあたり約５．０ｍｇ～約１０．０ｍｇの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、チャンバーあたり約１．０μｇ～約１０．０ｍｇの量で存在する。理論により拘束されるものではないが、これらのレベルは、対象においてＭ２免疫刺激反応を回避しつつ対象においてＴｈ１反応増強を促進すると考えられる。

ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、チャンバーへの封入前にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮで処理されない。しかしながら、典型的には、腫瘍細胞は、チャンバーへの封入前にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮで処理される。封入前に細胞を処理する時間は、様々でありうる。たとえば、腫瘍細胞は、最大約４時間、最大約６時間、最大約８時間、最大約１２時間、又は最大約１８時間にわたり、封入直前にｅｘ ｖｉｖｏでＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを用いて処理し得る。典型的には、腫瘍組織は、約１２時間～約１８時間にわたり封入前にｅｘ ｖｉｖｏで処理され得る。便宜上、細胞は、一晩まで前処理を継続した後で封入され得る。理論により拘束されるものではないが、封入前の処理は、腫瘍抗原の刺激生成に望ましい役割を果たすと考えられる。

封入前の処理に使用されるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの量は、約１ｍｇ～８ｍｇ／１００万細胞、例えば、約２ｍｇ～約６ｍｇ／１００万細胞、約３ｍｇ～約５ｍｇ／１００万細胞の範囲内でありうる。典型的には、封入前の処理に使用されるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの量は、約４ｍｇ／１００万細胞である。

いくつかの実施形態では、腫瘍細胞のｅｘ ｖｉｖｏ処理のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、少なくとも約２ｍｇ／ｍｌ～少なくとも約５ｍｇ／ｍｌの範囲内の濃度で使用される。ある特定の態様では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、少なくとも４ｍｇ／ｍｌの濃度で使用される。具体的な実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、４ｍｇ／ｍｌの濃度で使用される。

ある特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ及びチャンバーに存在するＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、同一である。他の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ及びチャンバーに存在するＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、異なる。ある特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、少なくとも約５ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、又は少なくとも約５０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、約１５ヌクレオチド～約２２ヌクレオチドの長さである。ある特定の態様では、腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、約１８ヌクレオチドの長さである。

ある特定の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、１８℃では二次構造を形成するが、約３７℃では二次構造を形成しない。他の実施形態では、腫瘍細胞を治療するために使用されるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、約１８℃でも約３７℃でも二次構造を形成しない。さらに他の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、いずれの温度でも二次構造を形成しない。他の実施形態では、腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、３７℃で二次構造を形成しない。特定の実施形態では、二次構造は、ヘアピンループ構造である。

いくつかの態様では、腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、配列番号１のヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含む。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、配列番号１又はそのフラグメントに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、又は１００％の同一性を有し得る。ある特定の態様では、腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、配列番号１である。

ある時間にわたり腫瘍細胞をＡＳ－ＯＤＮで処理した後、ＡＳ－ＯＤＮを除去して新たなＡＳ－ＯＤＮをチャンバーに添加し、次いで、対象への植込み前に照射する。ある特定の態様では、生体用拡散チャンバーは、約１Ｇｙ、約２Ｇｙ、約４Ｇｙ、約５Ｇｙ、約６Ｇｙ、約１０Ｇｙ、又は最大約１５Ｇｙの量でγ線照射により処理される。ある特定の態様では、照射線量は約５Ｇｙ以下である。他の態様では、照射線量は少なくとも約５Ｇｙである。いくつかの態様では、照射線量は５Ｇｙである。ある特定の実施形態では、生体用拡散チャンバーは、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、又は少なくとも５回照射され得る。いくつかの実施形態では、チャンバーは、対象への植込み前に約２４時間未満照射される。他の実施形態では、チャンバーは、対象への植込み前に約２４時間照射される。さらに他の実施形態では、チャンバーは、対象への植込み前に少なくとも約２４時間照射される。さらに他の実施形態では、チャンバーは、対象への植込み前に約４８時間以下照射される。さらに他の実施形態では、チャンバーは、対象への植込み前に少なくとも約４８時間照射される。

腫瘍細胞は、典型的には、植込み前に照射などにより死滅させるが、細胞を死滅させる必要はなく、実際には、抗原の放出を促進するために細胞を生存状態で維持することが有利なこともある。そのため、ある特定の実施形態では、植込み前に細胞に照射しないこともある。しかしながら、安全上の目的で、対象への腫瘍生細胞の放出を防止することが望ましい。

腫瘍細胞は、様々な数で拡散チャンバーに配置可能である。ある特定の実施形態では、約１×１０^４～約５×１０^６個の腫瘍細胞が各拡散チャンバーに配置される。他の実施形態では、約１×１０^５～約１．５×１０^６個の腫瘍細胞が拡散チャンバーに配置される。さらに他の実施形態では、約５×１０^５～約１×１０^６個の腫瘍細胞がチャンバーに配置される。我々は、腫瘍細胞の数が対象の抗腫瘍反応に影響を及ぼしうること及び所望の結果を得る機会を増加させるために適切な範囲を選択すべきであることを発見した。２０個のチャンバーが植え込まれた患者の抗腫瘍免疫反応は、１つのチャンバーに約７５０，０００～約１，２５０，０００細胞の範囲内が最適であり、約１００万細胞／チャンバーにピークを有する。照射腫瘍細胞を含有する複数のチャンバーが投与され、最適免疫反応を維持するために、細胞数／チャンバーは好ましくはその範囲内に維持される。好ましくは、腫瘍細胞はインタクトであり、本明細書に記載されるように自己分解したり損傷したりもしない。

ある特定の実施形態では、チャンバー内の細胞とＡＳ ＯＤＮとの比を維持することが好ましいこともある。そのため、ある特定の態様では、チャンバーは、約２μｇのＡＳ ＯＤＮと、７５０，０００～１，２５０，０００細胞例えば１，０００，０００細胞とを含有しうる。そのため、細胞とＡＳ ＯＤＮとの比は、約３．７５×１０^５～約６．２５×１０^５／μｇ ＡＳ ＯＤＮの範囲内、例えば、約５．０×１０^５細胞／μｇであり得る。そのため、２０個のチャンバーを収容する典型的患者では、ＡＳ ＯＤＮの総投与量は約４０μｇである。

典型的には、投与は、本明細書に記載されるようにチャンバーで行われるであろうが、ある特定の態様では、照射細胞及びＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、チャンバーや他の容器に物理的に一緒に閉じ込めることなく対象に共投与され得る。そのため、この方式を用いるある特定の方法では、照射細胞及びＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、対象の生理機能により制限される体内で、分散、拡散、又は代謝される。そのため、ある特定の態様では、例えば、使用に供される腫瘍細胞は、チャンバー用として本明細書に記載したように調製されてＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮと共に投与され得るが、投与は、物理的容器内に閉じ込めなくてもよい。そのような投与は、典型的には筋肉内である。

チャンバー用腫瘍組織調製物
自家ワクチン接種に使用される腫瘍細胞は、対象から外科的に取り出される。実施形態では、腫瘍細胞は、組織モルセレータを用いて患者から取り出される。抽出デバイスは、好ましくは、静置外側カニューレ内の高速往復内側カニューレと電子制御可変吸引とを組み合わせる。外側カニューレは、１．１ｍｍ、１．９ｍｍ、２．５ｍｍ、又は３．０ｍｍの直径と、１０ｃｍ、１３ｃｍ、又は２５ｃｍの長さと、を有する。装置はまた、サイドマウスカッティングとブラントデシケーター端部から０．６ｍｍに位置するアスピレーションアパーチャとに依拠する。除去される組織内へのアパーチャの弱い前進圧力と吸引との組合せによりサイドアパーチャ内に所望の組織を引き込んで、内側カニューレの往復カッティング動作を介して制御された正確な組織切除を可能にする。重要な特徴は、回転ブレードが存在しないことであり、これにより、意図されない組織がアパーチャに引き込まれないようにする。好適なデバイスの例は、ミリアド（Ｍｙｒｉａｄ）（登録商標）組織アスピレータ（ニコ・コーポレーション（ＮＩＣＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（登録商標）、インディアナポリス、インディアナ州）であり、これは直接的、微視的、又は内視鏡的な可視化を併用して軟組織の取出しに使用し得る侵襲を最小限に抑えた外科システムである。剃毛組織を吸引し、採取チャンバーに収集し、そして無菌組織トラップに採取する。無菌組織トラップへの組織の採取時、血液は調製物から除去される。好ましくは、無菌トラップは、トラップの底部の採取ディッシュと、トラップへのアクセスを提供するステムと、を含有する。トラップ構造はまた、トラップからの組織の取出しを容易にするためにトラップから取出し可能な内側レードル形構造を含有し得る。

好ましくは、モルセレータは、切除部位でもそのシャフトに沿っても熱を発生することがなく、組織取出しのために超音波エネルギーを必要としない。そのため、特定の実施形態では、腫瘍組織は、細片化腫瘍組織（すなわち、熱の不在下かつ任意選択的に超音波処理の不在下でサイドマウスカッティングにより得られた腫瘍剃毛組織）である。有利には、アスピレータ抽出物及び細片化組織は、他の方法により取り出された組織よりも高い生存能を有する。抽出プロセスは、部分的には取出し時に高温への腫瘍細胞の暴露が制限されるため、より高い腫瘍細胞生存能を維持すると考えられる。例えば、本明細書の方法は、取出し時に２５℃超に腫瘍細胞を暴露しない。そのため、細胞は、体温すなわち約３７℃を超える温度に暴露されない。

対象から得られる腫瘍組織の量は、様々であり得る。好ましくは、量は、患者から得られる湿潤腫瘍組織換算で少なくとも１グラム、少なくとも２グラム、少なくとも３グラム、又は少なくとも４グラムである。組織は、無菌組織トラップから取り出され、大きな組織片を破壊するために無菌ピペットを用いてピペッティングすることにより脱凝集される。次いで、脱凝集された細胞懸濁物は、無菌組織培養プレート上の血清含有媒体中に配置され、組織培養インキュベーターでインキュベートされる。このプレーティングステップは、接着により所望の機能細胞を富化するように機能し、調製物からデブリを除去するのに役立つ。そのため、本明細書に記載の治療に使用される腫瘍細胞は、好ましくは、腫瘍組織由来の接着細胞から本質的になるか又はそれからなる。

所定のインキュベーション時間後（例えば、６、１２、２４、又は４８時間後）、細胞はプレートから取り出される。細胞は、擦取により、化学的方法（たとえばＥＤＴＡ）により、又は酵素処理（たとえばトリプシン）により、取り出され得る。細胞は、１つ以上の拡散チャンバーに配置される。いくつかの実施形態では、細胞は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はそれ以上の個数の拡散チャンバーに分配される。多くの場合、２０個のチャンバーが使用される。いくつかの実施形態では、各拡散チャンバーは、等しい細胞数を含有する。いくつかの実施形態では、第１の拡散チャンバーは、第２のチャンバーよりも多くの細胞を含有する。

いくつかの実施形態では、細胞は、チャンバー内に配置される前に選別される。いくつかの実施形態では、細胞は、チャンバー内に配置される前に１つ以上の細胞マーカーを選択することにより富化される。選択は、例えば、ビーズを用いて又は当業者に公知の細胞選別技術により実施され得る。いくつかの実施形態では、チャンバー内に配置された細胞は、１つ以上のマーカについて濃縮される。

いくつかの実施形態では、治療有効期間にわたる生体用拡散チャンバーの植込みは、対象においてがんの再発を低減又は排除する。ある特定の態様では、生体用拡散チャンバーの植込みは、対象においてがんに関連する腫瘍体積の低減を引き起こす。さらに他の実施形態では、治療有効期間にわたる生体用拡散チャンバーの植込みは、対象において腫瘍の排除を誘発する。いくつかの実施形態では、チャンバーの植込みは、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも３６ヶ月間にわたり、又は無期限に腫瘍の再成長を阻害する。

生体用拡散チャンバーは、次のように、すなわち、対象の皮下、腹腔内、及び頭蓋内に、植込み可能であるが、これらに限定されるものではない。ある特定の実施形態では、拡散チャンバーは、良好なリンパ液排出及び／又は血管供給を有する身体の受容部位、例えば、腹直筋鞘に植え込まれる。他の実施形態では、治療後に拡散チャンバーを空にして治療に再使用できるように、補充可能なチャンバーを利用し得る。ある特定の態様では、複数、好ましくは５～２０個の拡散チャンバーを単一対象で使用可能である。

ある特定の実施形態では、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、又は少なくとも約５０の個数のチャンバーが対象に植え込まれる。いくつかの実施形態では、１０～２０個のチャンバーが対象に植え込まれる。好ましくは、約２０個のチャンバーが対象に植え込まれる。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、各チャンバーに等しく分配される。

典型的には、チャンバーは、ある時間後に取り出される。例えば、チャンバーは、約２４時間、約４８時間、約７２時間、又は約、９６時間にわたり対象に植え込まれ得る。約４８時間にわたる植込みは、有益な治療結果に関連する。したがって、好ましい植込み時間は約４８時間である。ある特定の実施形態では、ワクチン接種手順は、１回／患者で実施される。他の実施形態では、ワクチン接種手順は、複数回／患者で実施される。実施形態では、ワクチン接種手順は、単一患者で２回、３回、４回、５回、６回、７回、又は８回実施される。実施形態では、ワクチン接種は、所与の期間にわたり７日ごと、１４日ごと、２８日ごと、又は１ヶ月ごと、３ヶ月ごと、又は６ヶ月ごとに繰り返される。さらなる実施形態では、ワクチン接種手順は、患者のがんがなくなるまで定期的に繰り返される。

理論により拘束されるものではないが、生体用拡散チャンバーの植込みは、チャンバーから拡散した腫瘍抗原に対する免疫反応が達成されるように植込み部位又はその近傍でＭ２細胞の排除又は低減を引き起こすと考えられる。ある特定の態様では、植込み部位におけるＭ２細胞の排除又は低減は、ＣＤ４ Ｔ細胞への抗原提示細胞（ＡＰＣ）による自家腫瘍抗原の提示増強をもたらし、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）の産生及び１型腫瘍免疫の誘導をもたらす。ある特定の態様では、腫瘍抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生及びＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの抗Ｍ２効果は、１型抗腫瘍免疫並びに循環系及び腫瘍微小環境からの抗炎症性Ｍ２細胞の喪失を促進し、腫瘍成長を間接的に妨害する。いくつかの態様では、腫瘍抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生及びＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの抗Ｍ２効果は、腫瘍細胞及び腫瘍マイクロ環境（Ｍ２細胞）に対するエフェクター媒介損傷の抑制を解いて、腫瘍抗原を認識するメモリーＴ細胞をプログラムするより長いプロセスを開始する。ある特定の実施形態では、抗腫瘍適応免疫反応は、腫瘍退縮の継続を維持する。

任意選択的に、チャンバーに導入される細胞は、ある特定の細胞型が富化されうる。細胞骨格関連クラスＶＩ中間径フィラメント（ＩＦ）タンパク質のネスチンは、神経幹細胞マーカーとしてのその重要性が従来から有名である。我々は、ある特定の脳腫瘍サンプルでネスチン陽性細胞（ネスチン＋細胞）が良性組織と比較して富化されること及びこの関連物質が治療反応の改善に対応することを発見した。そのため、ある特定の態様では、ネスチン発現の程度を評価するように対象の腫瘍の生検を行うことが可能であり、したがって、ある特定の態様では、チャンバー細胞は、良性組織と比較してネスチン陽性（「＋」）細胞が富化される。理論により拘束されるものではないが、ネスチンは、抗腫瘍免疫反応を起こすのに有用な好適な抗原に関連するマーカを提供すると考えられる。したがって、チャンバーに植え込まれる細胞は、対象から抽出したとき全体として腫瘍細胞集団と比較してネスチン＋細胞が富化され得る。いくつかの実施形態において、免疫反応の増強は、ネスチンが富化された腫瘍サンプルを反応の刺激に使用したときに得られる。

全身投与
チャンバーの植込みの代わりとして又は補足として、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、全身投与され得る。そのため、実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、全身投与用医薬組成物で提供される。ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮのほか、医薬組成物は、例えば生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）を含み得る。組成物はリン脂質を含み得る。いくつかの態様では、リン脂質は、生理学的ｐＨで非荷電であるか又は中性電荷を有する。いくつかの態様では、リン脂質は中性リン脂質である。ある特定の態様では、中性リン脂質はホスファチジルコリンである。ある特定の態様では、中性リン脂質はジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）である。いくつかの態様では、リン脂質は本質的にコレステロールを含まない。

いくつかの態様では、リン脂質及びオリゴヌクレオチドは、約５：１～約１００：１のモル比又はそれから演繹し得るいずれかの比で存在する。各種態様では、リン脂質及びオリゴヌクレオチドは、約５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、又は１００：１のモル比で存在する。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチド及びリン脂質は、オリゴヌクレオチド－脂質複合体例えばリポソーム複合体などを形成する。いくつかの態様では、リポソームの少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、５ミクロン未満の直径である。各種態様では、組成物は、少なくとも１種の界面活性剤例えばポリソルベート２０などをさらに含む。いくつかの態様では、全リポソームアンチセンス製剤の少なくとも約５％は界面活性剤からなり、かつリポソームの少なくとも約９０％は５ミクロン未満の直径である。いくつかの態様では、全リポソームアンチセンス製剤の少なくとも約１５％は界面活性剤からなり、かつリポソームの少なくとも約９０％は３ミクロン未満の直径である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの集団はリポソームの集団に組み込まれる。

いくつかの態様では、医薬組成物は液状医薬組成物である。他の態様では、医薬組成物は固形医薬組成物である。
ヒト対象におけるアンチセンスの全身投与の用量は、約０．０２５ｇ／ｋｇ、約０．０５ｇ／ｋｇ、約０．１ｇ／ｋｇ、約０．１５ｇ／ｋｇ、又は約０．２ｇ／ｋｇであり得る。ある特定の実施形態では、全身投与の用量は、０．０２５ｇ／ｋｇ～０．２ｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態では、用量は約０．２ｇ／ｋｇである。他の実施形態では、用量は０．００４ｇ／ｋｇ～０．０１ｇ／ｋｇである。他の実施形態では、用量は０．０１ｇ／ｋｇ未満である。さらなる実施形態では、用量は０．０１ｇ／ｋｇ～０．２ｇ／ｋｇではない。ある特定の態様では、アンチセンスは凍結乾燥粉末として供給され、投与前に再懸濁される。再懸濁されある場合、アンチセンスの濃度は、約５０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、約５００ｍｇ／ｍｌ、約１０００ｍｇ／ｍｌ、又はそれらの量の間の範囲であり得る。

ある特定の実施形態では、ＡＳ ＯＤＮは、例えば、術前に腫瘍負荷を低減するために、術前に全身投与され得る。例えば、ＡＳ ＯＤＮは、術前２４時間まで、３６時間まで、４８時間まで、又は７２時間までに投与され得る。特定の態様では、医薬組成物は、術前約４８～約７２時間で投与され得る。典型的には、このような状況では、投与は静脈内ボーラスによる。

組合せ療法
歴史的には、がん療法は、放射線療法、化学療法、又はその両方で対象を治療することを含むものである。このような方法の取組みは、数多く報告されている。しかしながら、有利には、本明細書に開示されるチャンバー植込み方法は、がんを有する対象を単独療法として治療するために使用され得る。そのため、本明細書に開示される方法は化学療法も放射線療法も含まないことが好ましい。しかしながら、本明細書の単独療法により達成される優れた効果にもかかわらず、ある特定の状況下では、チャンバー法を他の療法例えば放射線療法と組み合わせることが有益なこともある。ある特定の実施形態では、放射線療法としては、限定されるものではないが、内部線源放射線療法、外部ビーム放射線療法、及び全身放射性同位体放射線療法が挙げられる。ある特定の態様では、放射線療法は外部ビーム放射線療法である。いくつかの実施形態では、外部ビーム放射線療法としては、限定されるものではないが、γ線療法、Ｘ線療法、強度変調放射線療法（ＩＧＲＴ）、及び画像誘導放射線療法（ＩＧＲＴ）が挙げられる。ある特定の実施形態では、外部ビーム放射線療法はγ線療法である。照射は、チャンバー植込み前又は植込み後に例えばサルベージ療法として施され得る。典型的には、このようなサルベージ療法は、がんが再発したと判定されるまで実施されない。

そのため、ある特定の組合せ法では、本明細書に記載のチャンバー法及び全身法及び組成物はいずれも、単独で又は放射線療法若しくは化学療法との組合せで同一対象において使用され得る。本明細書に記載の組合せ法では、チャンバー植込みは、好ましくは第一選択療法として使用される。対象の免疫系は、他の療法により阻害されてチャンバー植込みの治療効果を低減する可能性があるので、最初にチャンバー植込みを使用することが望ましい。

任意選択的に、チャンバー植込み前に全身投与が実施され得る。このような方法は、プライミング法として対象免疫系を増強するために使用可能である。プライミング法は、先行療法の結果として対象の免疫系が損なわれた場合にとりわけ有利であり得る。

全身投与を組合せで使用する場合、ＡＳ ＯＤＮは、自家がん細胞ワクチンを用いた患者の治療の少なくとも２週間前、少なくとも１週間前、少なくとも３日間前、又は少なくとも１日前に全身投与され得る。他の実施形態では、ＡＳ ＯＤＮは、自家がん細胞ワクチンすなわちチャンバーを用いた患者の治療の少なくとも１日後、少なくとも３日後、少なくとも１週間後、又は少なくとも２週間後に全身投与され得る。

任意選択的に、対象は、１回目のワクチン接種後に記載の方法を用いてチャンバーにより再ワクチン接種され得る。２回目以降の追加のワクチン接種では、組織取出し時に対象から採取して貯蔵した腫瘍細胞を使用し得る。任意選択的に、２回目以降の追加のワクチン接種では、対象から取り出して本明細書に記載されるように処理した新たな腫瘍組織を使用し得る。対象に残留するいずれの腫瘍も、同一抗原を発現しうるので、デポ剤として作用して再刺激を提供し得る。しかしながら、再発腫瘍は、新たな抗原を発生し得るので、抗腫瘍反応を刺激する追加の選択肢を提供し得る。後続のワクチン接種は、１回目の治療が終了し且つ腫瘍が再発した後又は対象が１回目の治療に反応しなくなった場合であり得る。

ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮで治療される対象
好適な対象は、がんを有する動物であり、典型的には、対象はヒトである。膠芽細胞腫などの脳腫瘍は本明細書に開示される方法がとくに奏効するが、本方法はがん一般に適用される。したがって、本開示は、神経膠腫、星状細胞腫、肝がん、乳がん、頭頸部扁平上皮細胞癌、肺がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆嚢がん、古典的ホジキンリンパ腫、食道がん、子宮がん、直腸がん、甲状腺がん、黒色腫、結腸直腸がん、前立腺がん、卵巣がん、及び膵臓がんからなる群から選択されるものを含めてがんの治療方法を提供する。具体的な実施形態では、がんは神経膠腫である。ある特定の態様では、神経膠腫は再発悪性神経膠腫である。いくつかの実施形態では、がんは星状細胞腫である。ある特定の実施形態では、治療の候補となる対象は、ＷＨＯグレードＩＩ、ＷＨＯグレードＩＩＩ、又はＷＨＯグレードＩＶの腫瘍に罹患している。いくつかの態様では、腫瘍は星状細胞腫である。ある特定の実施形態では、腫瘍は、グレードＩＩ星状細胞腫、ＡＩＩＩ（ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈ突然変異グレードＩＩＩ星状細胞腫）、ＡＩＩＩ－Ｇ（多形膠芽細胞腫の星状細胞腫の特性を有するＩＤＨ１野生型グレードＩＩＩ）、又はグレードＩＶ星状細胞腫から選択される。

グレードＩＶ星状細胞腫は、最高グレード神経膠腫であり、膠芽細胞腫（ＧＢＭ）と同義である。１００，０００例あたり３又は４例の年間発生率で、ＧＢＭは成人において最も一般的な悪性原発脳腫瘍である。標準ケア療法（典型的には、放射線療法とテモゾロミドを用いた化学療法との組合せ）は十分に機能せず、ＧＢＭ患者の転帰平均余命は１５～１７ヶ月と、依然として不良である。有利には、本明細書の方法は、新たに診断された脳のがんを治療するために使用され得るとともに、例えば標準ケア療法で以前に治療された患者で再発膠芽細胞腫を治療するためにも使用され得る。そのため、ある特定の態様では、対象は、新たに診断されたＧＢＭ対象又は再発ＧＢＭ対象でありうる。対象は、好ましくは、免疫抑制的ないずれの治療法でも以前に治療されていない者である。特定の態様では、適格対象は、１８歳超の年齢であり、かつ６０以上のカルノフスキースコアを有する。任意選択的に、対象は、両半球疾患を有しておらず、かつ／又は自己免疫疾患を有していない。

任意選択的に、治療の候補となる対象は、対象で腫瘍生検を実施することにより同定され得る。いくつかの実施形態では、単球の存在に関して対象の腫瘍がアッセイされる。ある特定の態様では、単球としては、限定されるものではないが、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１５＋、ＣＤ２３＋、ＣＤ６４＋、ＣＤ６８＋、ＣＤ１６３＋、ＣＤ２０４＋、又はＣＤ２０６＋の単球が挙げられる。腫瘍における単球の存在は、免疫組織化学を用いてアッセイされ得る。ある特定の実施形態では、治療の候補となる対象は、対象の全末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、又は約５０％を超えるＣＤ１６３＋Ｍ２細胞を示す。ある特定の態様では、対象は、対象の全ＰＢＭＣの約２０％を超えるＣＤ１６３＋Ｍ２細胞を示す。

さらに他の実施形態では、治療の候補となる対象は、対象の血清中の１種以上のサイトカインの存在により同定される。こうしたサイトカインとしては、限定されるものではないが、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、及びＣＸＣＬ７、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＦＮ－γ、並びにＨＳＰ－７０が挙げられる。

さらに他の実施形態では、治療の候補となる対象は、対象の血清中の１種以上の成長因子の存在により同定される。こうした成長因子としては、限定されるものではないが、ＦＧＦ－２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＭ－ＣＳＦが挙げられる。

いくつかの実施形態では、生体用拡散チャンバーによる治療の候補となる対象は、サイトカインの特定のセットのレベルを測定することにより同定される。いくつかの実施形態では、対象は、健常対象と比較してこれらのサイトカインのレベルの上昇を有する。本明細書で用いられる場合、「健常対象」という用語は、がんやいずれの他の疾患にも罹患しておらず、かつ生体用拡散チャンバーによる治療を必要としない対象を意味する。

特定の実施形態では、サイトカインは、抗腫瘍免疫反応を補うためにチャンバーに添加され得る。例えば、チャンバーに添加されるサイトカインは、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、及びＣＸＣＬ１２及びそれらの組合せからなる群から選択され得る。

ある特定の実施形態では、循環ＣＤ１４＋単球は、健常対象と比較して上昇したＣＤ１６３レベルを有する。いくつかの態様では、循環ＣＤ１４＋単球上のＣＤ１６３レベルは、健常対象と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、又は少なくとも約１００倍に上昇する。特定の実施形態では、循環ＣＤ１４＋単球上のＣＤ１６３レベルは、健常対象と比較して約２倍に上昇する。

他の実施形態では、治療の候補となる対象は、未分化単球をＭ２細胞に向けて分極する血清を有する。ある特定の態様では、未分化単球を併用した対象の血清のインキュベーションは、限定されるものではないが、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０４、及び／又はＣＤ２０６をはじめとする単球上の１種以上の細胞表面マーカーの発現を誘発する。他の態様では、未分化単球を併用した対象の血清のインキュベーションは、対象の血清を併用してインキュベートされない単球と比較して単球上の１種以上の細胞表面マーカーの発現を上昇させる。ある特定の態様では、細胞表面マーカーとしては、限定されるものではないが、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０４、及び／又はＣＤ２０６が挙げられる。いくつかの態様では、１種以上の表面マーカーのレベルは、対象の血清を併用してインキュベートされない未分化単球と比較して、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、又は少なくとも約１００倍に上昇する。特定の実施形態では、１種以上の表面マーカーのレベルは、対象の血清を併用してインキュベートされない未分化単球と比較して約２倍に上昇する。対象の血清により分極された単球は、ＦＡＣＳを用いて測定され得る。

標的細胞
理論により拘束されるものではないが、ＡＳ ＯＤＮは、ＩＧＦ－１Ｒ発現をダウンレギュレートすることにより、対象のＭ２細胞の低減及び／又はＭ２細胞への細胞の分極化の阻害を行うと考えられる。いくつかの実施形態では、Ｍ２細胞におけるＩＧＦ－１Ｒ発現は、アンチセンスで処理されていない細胞と比較して、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％ダウンレギュレートされる。Ｍ２細胞におけるＩＧＦ－１Ｒ発現は、定量ＲＴ－ＰＣＲにより測定され得る。

いくつかの実施形態では、Ｍ２細胞におけるＩＧＦ－１Ｒ発現は、アンチセンスの単回投与を受けた後、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、又は少なくとも約６週間にわたり、対象においてダウンレギュレートされた状態を維持する。

いくつかの態様では、Ｍ２細胞におけるＩＧＦ－１Ｒの発現のダウンレギュレーションは、ＩＧＦ－１Ｒを発現しない細胞と比較して対象のＭ２細胞の選択的低減を引き起こす。ある特定の実施形態では、対象のＭ２細胞は、アンチセンスで治療されていない対象と比較して、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％低減される。他の実施形態では、Ｍ２細胞集団は排除される。例えば、生体用拡散チャンバーの植込み後、Ｍ２細胞集団は、生体用拡散チャンバーの植込み前の集団の約１％、約２％、約５％、又は約１０％であり得る。対象のＭ２細胞は、ＦＡＣＳを用いて測定され得る。ある特定の態様では、治療後、Ｍ２細胞は排除される。すなわち、ＦＡＣＳにより検出不能である。他の態様では、Ｍ２細胞の減少は、プロキシアッセイを用いて測定され得る。例えば、処理の前後で対象から血清を得てＭ２細胞に分極化するその能力を評価しうる。本明細書に開示される方法で処理した後、Ｍ２細胞に分極化する血清の能力は、約８０％～約１００％、約２０％～約６０％、又は約１０％～約５０％低減される。

いくつかの実施形態では、Ｍ２細胞におけるＩＧＦ－１Ｒの発現を標的としてＭ２細胞に細胞死を引き起こす。ある特定の実施形態では、細胞死は壊死である。他の実施形態では、細胞死はアポトーシスである。アポトーシスは、本開示の目的では、プログラム細胞死として定義され、限定されるものではないが、原発腫瘍及び転移腫瘍の退縮を含む。アポトーシスは、膨大な数の生理学的及び病理学的プロセスにおいてきわめて重要な役割を果たす広範にわたる現象であるプログラム細胞死である。壊死は、これとは対照的に、様々な有害条件及び毒性物質に対する細胞の反応である偶発的細胞死である。さらに他の実施形態では、Ｍ２細胞におけるＩＧＦ－１Ｒの発現を標的としてＭ２細胞に細胞周期停止を引き起こす。

キット
完成チャンバーの作製には、複数の構成要素及び複数のステップが必要とされる。本開示の他の一態様では、本明細書に開示される方法を実施するための構成要素を含有するキットが提供される。ある特定の態様では、キットは、一方の部分又は２つの半体に存在しうるチャンバー本体を含む。また、１つ以上のメンブレン、接着剤、及び溶媒（たとえば、アルコール又は２ジクロロエタン）を含めて、チャンバーをシールするアイテムも含まれうる。任意選択的に、メンブレンは、シールを形成するようにチャンバーに超音波溶接され得る。キットはアンチセンスＯＤＮを含む。任意選択的に、ＯＤＮは２つの部分に分配され得る。対象から外科的に取り出した後で細胞を処理するための第１の部分及び対象に導入する時に細胞と組み合わせるための第２の部分。他の任意選択的キットアイテムとしては、細胞を培養するための培地及び培地における細菌成長を防止するための抗生物質が挙げられる。

任意選択的に、キットのチャンバーは、アイレット又はチャンバーに装着されて接続材料を受け取るように適合化された他のデバイスを用いて、互いにあらかじめ接続され得る（例えば、縫合により）。有利には、複数のチャンバーをあらかじめ接続することにより、外科医により所望の数のチャンバーを容易に導入したり取り出したりできる。

本明細書に開示される様々な態様及び実施形態に加えて、以下の実施形態が具体的に企図される。
１．がんを有する対象におけるＭＧＭＴメチル化及び／又はＴ細胞機能を判定し、前記対象にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを投与することを含む方法。

２．がんを有する対象におけるＭＧＭＴメチル化を判定し、前記対象にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを投与することを含む方法。
３．がんを有する対象におけるＭＧＭＴメチル化を判定し、前記対象がメチル化ＭＧＭＴを有する場合にのみ、前記対象にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを投与することを含む方法。

４．がんを有する対象におけるＴ細胞機能を判定、前記対象にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを投与することを含む方法。
５．がんを有する対象におけるＴ細胞機能を判定し、前記対象が良好なＴ細胞機能を有する場合にのみ、前記対象にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを投与することを含む方法。

６．がんを有し、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答する可能性が高い対象を特定し、前記対象にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを投与することを含む方法。
７．がんを有し、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答する可能性が高い対象を特定し、前記対象にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを投与することを含む方法であって、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答する可能性が高いことは、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化及び／又はＴ細胞機能を判定することによって評価される方法。

８．がんを有し、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答する可能性が高い対象を特定し、前記対象にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを投与することを含む方法であって、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答する可能性が高いことは、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化及び／又はＴ細胞機能を判定することによって評価され、前記可能性が高いことは、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化を特定することによって、及び／又は前記対象における良好なＴ細胞機能を判定することによって確立される方法。

９．がんを有し、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答する可能性が高い対象を特定し、前記対象にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを投与することを含む方法であって、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答する可能性が高いことは、ＭＧＭＴメチル化を判定することによって評価され、前記可能性が高いことは、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化を特定することによって確立される方法。

１０．がんを有し、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答する可能性が高い対象を特定し、前記対象にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを投与することを含む方法であって、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答する可能性が高いことは、前記対象におけるＴ細胞機能を判定することによって評価され、前記可能性が高いことは、前記対象における良好なＴ細胞機能を判定することによって確立される方法。

１１．がんを患っている対象のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答した予後を予測する方法であって、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化を判定すること、及び／又はＴ細胞機能を判定することを含む方法。

１２．がんを有する対象のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答した予後を予測する方法であって、前記方法は、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化を判定すること、及び／又はＴ細胞機能を判定することを含み、前記対象におけるメチル化ＭＧＭＴ及び／又は良好なＴ細胞機能は、良好な予後を示す方法。

１３．がんを有する対象のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答した予後を予測する方法であって、前記方法は、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化を判定することを含み、前記対象におけるメチル化ＭＧＭＴは、良好な予後を示す方法。

１４．がんを有する対象のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答した予後を予測する方法であって、前記方法は、前記対象におけるＴ細胞機能を判定することを含み、前記対象における良好なＴ細胞機能は、良好な予後を示す方法。

１５．がんを有する対象のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答した予後を予測する方法であって、前記方法は、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化を判定すること、及び／又はＴ細胞機能を判定することを含み、前記対象における非メチル化ＭＧＭＴ及び／又は不十分なＴ細胞機能は、予後不良を示す方法。

１６．がんを有する対象のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答した予後を予測する方法であって、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化を決定することを含み、前記対象における非メチル化ＭＧＭＴは、予後不良を示す方法。

１７．がんを有する対象のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答した予後を予測する方法であって、前記対象におけるＴ細胞機能を判定することを含む方法であって、前記対象における不十分なＴ細胞機能は、予後不良を示す方法。

１８．前記Ｔ細胞機能が、非特異的刺激に応答して発現するＩＦＮ－γの数を評価することによって判定される、前述の実施形態のいずれかの方法。
前記Ｔ細胞機能が、非特異的刺激に応答して発現するＩＦＮ－γの数を評価することによって判定され、特異的刺激に応答して中央値以上の数のＴ細胞がＩＦＮ－γを発現することは、良好なＴ細胞機能として分類され、非特異的刺激に応答して中央値未満又はより少ない数のＴ細胞がＩＦＮ－γを発現することは、不十分なＴ細胞機能として分類される、前述の実施形態のいずれかの方法。

２０．テモゾラミドが前記対象に投与される前に、前記ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが対象に投与される、前述の実施形態のいずれかの方法。
２１．テモゾラミドが対象に投与されるよりも少なくとも２週間；少なくとも３週間；少なくとも４週間；少なくとも５週間；少なくとも６週間；少なくとも７週間；又は少なくとも８週間前に、前記ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが前記対象に投与される、前述の実施形態のいずれかの方法。

２２．ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが自家がん細胞ワクチンとして対象に投与される、前述の実施形態のいずれかの方法。
２３．ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが完全に製剤化された生体用拡散チャンバーとして対象に投与される、前述の実施形態のいずれかの方法。

２４．生体用拡散チャンバーは、存在する場合、（ａ）対象から得られた腫瘍細胞を、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの存在下で生体用拡散チャンバーに封入し、ここで、チャンバー内の腫瘍細胞：ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの比は約３．７５×１０^５：１ ｇ～約６．２５×１０^５：１μｇの範囲であり、前記腫瘍細胞は、組織モルセレータを使用して対象から得られ、さらに（ｂ）前記生体用拡散チャンバーに放射線照射することによって調製される、前述の実施形態のいずれかの方法。

２５．前記腫瘍細胞が生体用拡散チャンバー内に配置される前にネスチン発現に関して濃縮される、生体用拡散チャンバーを用いる前述の実施形態のいずれかの方法。
２６．チャンバー内の腫瘍細胞が、対象から得られた腫瘍細胞と比較して、接着細胞について濃縮される、生体用拡散チャンバーを用いる前述の実施形態のいずれかの方法。

２７．腫瘍細胞が本質的に接着細胞からなる、生体用拡散チャンバーを用いる前述の実施形態のいずれかの方法。
２８．細胞がチャンバーに封入される前にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮで処理される、生体用拡散チャンバーを用いる前述の実施形態のいずれかの方法。

２９．ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが、封入前の処理の間、１００万個の細胞あたり約２ｍｇ～約６ｍｇで存在する、生体用拡散チャンバーを用いる前述の実施形態のいずれかの方法。

３０．ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが、封入前の処理の間、１００万個の細胞あたり約４ｍｇで存在する、生体用拡散チャンバーを用いる前述の実施形態のいずれかの方法。
３１．封入前のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮによる処理が最大約１８時間である、生体用拡散チャンバーを用いる前述の実施形態のいずれかの方法。

３２．封入前のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮによる処理が約１２時間～約１８時間である、生体用拡散チャンバーを用いる前述の実施形態のいずれかの方法。
３３．ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが配列番号１の配列を有する、前述の実施形態のいずれかの方法。

３４．チャンバー内のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが約２μｇで存在する、生体用拡散チャンバーを用いる前述の実施形態のいずれかの方法。
３５．照射された腫瘍細胞がチャンバーあたり約７５０，０００～約１，２５０，０００個の範囲で存在する、生体用拡散チャンバーを用いる前述の実施形態のいずれかの方法。

３６．照射された腫瘍細胞がチャンバーあたり約１，０００，０００個で存在する、生体用拡散チャンバーを用いる前述の実施形態のいずれかの方法。
３７．２つ以上の生体用拡散チャンバーを対象に植え込むことを含む、生体用拡散チャンバーを用いる前述の実施形態のいずれかの方法。

３８．約１０～約３０個の生体用拡散チャンバーが対象に植え込まれる、生体用拡散チャンバーを用いる前述の実施形態のいずれかの方法。
３９．約１０～約２０個の生体用拡散チャンバーが対象に植え込まれる、生体用拡散チャンバーを用いる前述の実施形態のいずれかの方法。

４０．拡散チャンバーが対象に４８時間にわたって植え込まれる、生体用拡散チャンバーを用いる前述の実施形態のいずれかの方法。
４１．がんが脳のがんである、前述の実施形態のいずれかの方法。

４２．脳のがんが、グレードＩＩ星状細胞腫、グレードＡＩＩＩ星状細胞腫、グレードＡＩＩＩ－Ｇ星状細胞腫、及びグレードＩＶ星状細胞腫（多形性膠芽腫）から選択される、前述の実施形態のいずれかの方法。

脳のがんがグレードＩＶ星状細胞腫（多形性膠芽腫）である、前述の実施形態のいずれかの方法。
４３．前記対象がヒトである、前述の実施形態のいずれかの方法。

実施例
実施例１
緒言
新たに膠芽腫と診断された成人を対象に、独自の併用ワクチンであるＩＧＶ－００１を評価した。ＩＧＶ－００１は、自己神経膠芽腫腫瘍細胞と、インスリン様成長因子１型受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）ＤＮＡ／ｍＲＮＡ（ＩＭＶ－００１；以前はＮＯＢＥＬと呼ばれていた）に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドからなり、腹部に埋め込まれた生体用拡散チャンバーを介して同時投与される。ＩＧＶ－００１は、抗原提示の刺激を伴う腫瘍抗原の放出を通じて腫瘍免疫を促進すると考えられている。このフェーズ１ｂの研究は、再発性の世界保健機関のグレードＩＩＩ又はＩＶの星状細胞腫の患者を対象としたフェーズ１ａの研究に基づいており、１２人の患者のうち８人がＸ線写真で改善を示した。

方法
研究計画
放射線学的に確認された、新たに診断された悪性神経膠腫の成人が登録された。カルノフスキーパフォーマンスステータススコアが少なくとも６０であることも条件とした。患者を、最低（２４時間植え込んだ１０個のチャンバー）；低い（４８時間植え込んだ１０個のチャンバー）；高い（２４時間植え込んだ２０個のチャンバー）；及び最高（４８時間植え込んだ２０個のチャンバー）の４種類のＩＧＶ－００１曝露のうちの１つにランダムに割り振った。

腫瘍切除のための開頭術の間、Ｍｙｒｉａｄ製組織吸引器を利用して、腫瘍組織を吸引及び粉砕し、標準治療（ＳＯＣ）に従って腫瘍細胞の生存率を維持した。外科医は、その後の拡散チャンバーの植込みのために、腹直筋鞘と腹直筋との間に腹部アクセプター部位を作成した。採取した腫瘍細胞をｅｘ ｖｉｖｏでＩＭＶ－００１で４～８時間処理した後、追加のＩＭＶ－００１と共に１０個又は２０個（ランダム化に応じる）の１．４ｃｍ生体用拡散チャンバーに封入し５Ｇｙで放射線照射した。ＩＭＶ－００１で処理された細胞の放射線は、免疫刺激性抗原の放出を引き起こす。開頭から２４時間以内に腹部アクセプター部位にチャンバーを植え込んだ。２４時間又は４８時間後（ランダム化に応じる）にチャンバーを取り外し、腹部を閉じた。ＩＭＶ－００１を用いた以前の経験では、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）の発生率が予想よりも高かったため、予防的エノキサパリンを３か月間毎日投与し、最初の入院中は週２回、その後３ヵ月間は毎月、圧迫超音波によって患者をＤＶＴについてモニタリングした。ＳＯＣ（すなわち、放射線及びテモゾロミド［ＴＭＺ］）を、術後４～６週間で開始し６週間続けた。患者は維持療法としてさらに１２サイクルのＴＭＺを受けた。

最高の曝露コホートは、治療後に、循環する、潜在的に治療的な炎症誘発性のサイトカイン、ならびに臨床的及び放射線学的改善において最高レベルを示したため、ランダム化は患者２３の後に停止した。プロトコルを修正し、その後の患者はその最高の曝露を受けた。この修正は、関連する探索的バイオマーカー評価と共に安全性を記録することを主な目的とするプロトコルから、全生存期間（ＯＳ）及び無増悪生存期間（ＰＦＳ）を含む臨床探索的エンドポイントとするプロトコルへの移行を反映している。

評価
有害事象（ＡＥ）及び重篤なＡＥを、チャンバーの植込みから試験終了後３０日まで、治療後最低６週間記録した。ＡＥは、米国国立がん研究所の有害事象共通毒性基準ｖ４．０３に従って評価及び分類した。無症候性のグレード１及びグレード２の検査値は、治療を行う医師によって臨床的に重要であると判断されない限り、ＡＥとして捉えなかった。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を、手術前１４日以内、及び術後少なくとも２４ヵ月までの時点で実施した。ＭＲＩスキャンの読影は、患者のコルチコステロイドの投与量と臨床状態を知らされていない神経放射線科医によって行われた。放射線写真の反応は、神経腫瘍学における反応評価（ＲＡＮＯ）２及び免疫療法ＲＡＮＯ（ｉＲＡＮＯ）基準に基づいていた。進行までの時間は、手術の日からＭＲＩによって測定された客観的な疾患の進行の最初の観察の日まで評価された。疾患の進行の証拠は、独立した放射線審査委員会によって裏付けられる必要があった。ＰＦＳを、手術日から進行又は打ち切りまで測定した（打ち切りとは、様々な基準のいずれかについて、患者を臨床試験から除外することを指す）。ＯＳは、手術日から最新のフォローアップ又は死亡までの経過時間であった。研究から離脱したと考えられる患者を、ＯＳについて追跡した。

ＩＧＶ－００１の作用機序は免疫応答に大きく依存すると考えられるため、治療の前後に、循環リンパ球と単球のサブセット、血清サイトカインとケモカイン、及びＴ細胞機能（非特異的刺激に応答した炎症誘発性サイトカインインターフェロン－γ［ＩＦＮ－γ］を発現するＴ細胞の数に基づく）を定量化した。

統計分析
治療意図（ＩＴＴ）集団には、スクリーニングの失敗せず、安全性と臨床転帰の評価に使用されたすべての登録患者が含まれていた。ＡＥを有する被験者の数と割合を、全体的に、重症度グレードごとに、及び治験薬又はＳＯＣ及び望ましい期間との関連ごとにまとめた。望ましい期間中の被験者ごとの複数のＡＥについては、最も深刻なものだけが報告される。事象までの時間データ（ＰＦＳ及びＯＳ）を、積極限法を使用して分析し、ステップ関数を使用して結合されたポイントでグラフ化した。ＳＡＳバージョン９．４（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ノースカロライナ州ケアリー）をすべての分析に使用した。Ｇｕｙｏｔら（２０１２）によって記述された方法を使用して、同様の登録基準を有する公開された研究のＳＯＣアームからの患者レベルのデータを推定した。これらのＳＯＣアームのＯＳとＰＦＳを、ログランク検定を使用してＩＧＶ－００１処理コホートと比較した。

Ｔ細胞アッセイプロトコル
膠芽腫の臨床試験で患者から得られた全血又は白血球アフェレーシスのサンプルを分離し、ＰＢＭＣをＤＭＳＯ中で凍結保存した。これらのＰＢＭＣサンプルを、Ｔ細胞の分離と刺激に利用した。トリガーされた細胞のダウンストリーム分析は、ＥＬＩＳＰＯＴを使用して行った。

ナイーブＴ細胞の単離
ＰＢＭＣサンプルを解凍し、１０％ＦＢＳ、１％Ｌ－グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した加温ＲＰＭＩ培地で洗浄してＤＭＳＯを除去した。ペレットを既知量の培地に再懸濁し、ＣｏｕｎｔｅｓｓＩＩ ＦＬ自動セルカウンター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して初期細胞数を取得した。磁気ビーズを使用したナイーブＴ細胞の分離は、Ｅａｓｙｓｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ細胞分離キット（ステムセルテクノロジー＃１７９５１）を使用したネガティブセレクション法によって行った。Ｔ細胞の単離は、臨床試験からの複数のサンプルについて９６ウェルプレートで同時に行った。

Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激－ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ポリビニリデンジフルオリドメンブレンＥｌｉｓｐｏｔプレート（９６ウェルプレート、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃Ｓ２ＥＭ００４Ｍ９９）を抗ＩＦＮ－γモノクローナル抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ＃３４２０－３－１０００）でコーティングし、４℃で１４～１６時間一晩インキュベートした。抗体溶液を廃棄し、無血清培地を使用してプレートをブロッキングした。室温で２時間インキュベートした後、培地をデカントし、５０，０００個のＴ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２（Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ、ステムセルテクノロジー＃１０９１０）Ｔ細胞活性化因子とともに各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。これらのＴ細胞活性化因子を含む培地を陰性対照（ＮＣ）として使用し、健康なドナーからのＰＢＭＣを陽性対照（ＰＣ）として使用した。インキュベーション後、上清を吸引し、ウェルを脱イオン水で２回洗浄した後、洗浄バッファーＡ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む１×ＰＢＳ）で洗浄した。ウェルを検出抗体（１０％ＦＢＳを含む１×ＰＢＳで１：２５０希釈、Ｍａｂｔｅｃｈ＃３４２０－６－２５０）とともに室温で２時間インキュベートした。次に、ウェルを洗浄バッファーＡで洗浄し、ストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシド（１０％ＦＢＳを含む１×ＰＢＳで１：１００希釈、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃５５７６３０）と室温で１時間インキュベートした。ストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシド溶液を廃棄し、ウェルを洗浄バッファーＡ及び洗浄バッファーＢ（１×ＰＢＳ）で洗浄した。ＡＥＣ基質溶液（１ｍｌのＡＥＣ基質あたり１滴のＡＥＣ色素原、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃５５１９５１）を各ウェルに添加し、５分から最大２０分まで、スポット発生をモニタリングした。脱イオン水を使用して反応を停止し、Ｅｌｉｓｐｏｔリーダーを使用してスポットを数える前にプレートを風乾した。得られたデータを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７を使用して分析した。

結果
患者
３１ヵ月の期間内に合計３３人の患者が治療された。人口統計及びベースラインの臨床的特徴を表２に示す。６人、５人、５人、及び１７人の患者が、それぞれ最低の、低い、高い、及び最高の曝露を受けた。

安全性
ＩＧＶ－００１は総じて忍容性が良好であった。最初の患者が治療されてから４１ヵ月以上経過した日付の時点で、腹部切開に関連するＡＥが５つあり、１つはグレード３の血腫、３つはグレード２の血腫、１つはグレード１の創傷合併症であった。記録された腹部創傷感染はなかった。治療に関連している可能性のあるＡＥは８つあり、グレード３の発作が２つ、グレード３のＤＶＴが１つ、グレード３の水頭症が１つ、グレード３のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）上昇が１つ、グレード３のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）上昇が１つ、グレード３の脳症が１つ、及びグレード２のＤＶＴが１つであった。

２２人の死亡のうち１１人は、膠芽腫の進行に起因するものではなかった。これらの１１人の死亡のうち７人は、ＩＧＶ－００１による治療から１２ヵ月以内に発生し、詳細を表３に示す。

ＩＧＶ－００１を投与された患者の追跡期間中央値（範囲）は１３ヵ月（４～４０）であった。放射線写真の反応は、全摘出後の解剖学的増強の持続的な欠如、最初の術後腫瘍体積からの持続的退縮、及び、部分摘出後の解剖学的腫瘍体積の増加に続く手術後から約６ヵ月以内に始まる持続的退縮を含んでいた。２人の患者はまた、再発腫瘍の自然寛解を示した（掲載なし）。腫瘍の再発は通常同側であり、局所的であると考えられている（発生中心点から２ｃｍ以内）。生存している１１人の患者のうち、６人は最後の観察でＲＡＮＯ基準に従って無増悪である。

臨床転帰
膠芽腫が疑われる場合の現在の標準治療（ＳＯＣ）は、最大限の安全な摘出から始まる。病理学的に確認された症例は、その後放射線療法とテモゾロミド（ＴＭＺ）を同時に受け、続いてＴＭＺ．６を維持する。このＳＯＣは、Ｒｏｇｅｒ Ｓｔｕｐｐの指揮下で欧州がん研究治療機構が実施した２００５年の研究によって確立された。この治験は、テモゾロミド（ＴＭＺ）を放射線療法に追加すると、放射線単独よりもＯＳが延長されることを示した（１４．６ヵ月対１２．１ヵ月）。上位の査読付きジャーナルで８年以上にわたって公開された大規模なランダム化臨床試験のＳＯＣアーム間でも、ＯＳには顕著な一貫性がある。

最初の患者が治療されてから４１ヵ月以上経過した日付の時点で、ＩＧＶ－００１で治療された１１人の患者は生存しており、身体機能も正常であった。ＯＳの中央値は１７．３ヵ月であり（図１Ａ）、２４ヵ月でのＯＳ率は３１％であった。ＩＧＶ－００１のＯＳの利点は、分析がＩＧＶ－００１の最高の曝露を受けた患者に限定された場合に強化された（中央値、２１．９ヵ月、図１Ｂ）。

ＯＳを、表４に曝露群ごとにまとめる。有利な生存率は、ＩＧＶ－００１への最高の曝露（すなわち、２０チャンバーで４８時間）と関係していた。

Ｓｔｕｐｐらは、新たに診断された神経膠芽腫のＳＯＣを受けた全患者の９５％で死亡前に腫瘍の進行があったことを示した。我々の研究では、１４人の患者が最初の１年以内に死亡し、うち７人（５０％）には疾患の進行がなかった（表２）。ＩＧＶ－００１で治療された患者のＯＳを、病気の進行に起因する死亡を除外することにより、ＳＯＣによって引き起こされた可能性のある死亡率とは無関係に評価した。結果として得られたＯＳの中央値は２２．１ヵ月であり、これは公表されているＳＯＣの推定値とは有利に対照的である。

また、より良好なＯＳに有利に働く可能性のある臨床的特徴を有する他の治験サブグループを評価した。Ｏ６－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）プロモーターのメチル化は、Ｏ６グアニンのメチル基を脱アルキル化する細胞の能力を停止させ、非メチル化ＭＧＭＴプロモーターを有する患者と比較してＴＭＺの治療効果を高める。Ｓｔｕｐｐの治験のコンパニオンペーパーでは、ＳＯＣを受けている患者の生存転帰に対するＭＧＭＴプロモーターの効果を検討した。メチル化ＭＧＭＴプロモーターを有する患者のＯＳ中央値は２１．７ヵ月であったのに対し、メチル化されていない患者では１２．７ヵ月であった。同様に、ＩＧＶ－００１に続いてＳＯＣで治療されたメチル化ＭＧＭＴプロモーターを有する患者での有利な生存率（中央値ＯＳ、３０．９ヵ月対１１．３ヵ月）は注目に値した（図３）。

最初の患者が治療されてから４１ヵ月以上経過した日付の時点で、１５人の患者が原発部位で無増悪であり、そのうち６人が生存した。ＩＧＶ－００１で治療された患者のＰＦＳ中央値は１０．４ヵ月であり、６ヵ月でのＰＦＳ率は８７％であった（表５）。

ＰＦＳデータはＯＳデータよりも早く得られるため、我々のＰＦＳの結果を、上位の査読付きジャーナルに発表された２つの大規模なランダム化臨床試験のＳＯＣアームと比較した。ＳＯＣと比較して、ＩＧＶ－００１ではＰＦＳに大幅な改善があった（図４）。

Ｈｅｇｉ、Ｇｉｌｂｅｒｔ、及びＳｔｕｐｐは、ＳＯＣのみを投与されたメチル化ＭＧＭＴプロモーターを有する患者において、ＰＦＳ中央値がそれぞれ１０．３、１０．５、及び１０．７ヵ月であると報告した。ＩＧＶ－００１を投与されたメチル化ＭＧＭＴプロモーターを有する患者のＰＦＳ中央値は３０．９ヵ月であり（表６）、ＳＯＣと比較して遜色がない（ｐ＝０．００４；図５）。

予測バイオマーカーの初期検討
予備分析では、治療前の良好なＴ細胞機能（すなわち、非特異的刺激に応答してＩＦＮ－γを発現するＴ細胞の数が中央値又はそれ以上であること）は、Ｔ細胞機能が不十分な場合よりも、より長期のＯＳに関連した（すなわち、中央値未満；表７）。これは、ＩＧＶ－００１の作用機序における免疫系の関与を示唆している。

結論
新たに神経膠芽腫と診断された患者を対象としたＩＧＶ－００１のこのフェーズｌｂ臨床試験の結果には説得力がある。併用ワクチンが３３人の患者に植え込まれ、忍容性は総じて良好であった。最初の年に死亡した１４人のうち７人では疾患の進行がなく、すべての死亡は治療とは無関係であった。大規模な臨床試験で報告されたＳＯＣと比較して、ＯＳとＰＦＳの中央値は遜色がなかった。ＩＧＶ－００１への最高の曝露、ＭＧＭＴプロモーターのメチル化、及び治療前の良好なＴ細胞機能は、より長い生存と関連していた。

参考文献

参照による組み込み
本明細書で参照されるすべての特許及び刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (37)

1. がんを有し、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮによる治療に応答する可能性が高い対象を特定し、前記対象にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを投与することを含む方法であって、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答する可能性が高いことは、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化及び／又はＴ細胞機能を判定することによって評価される方法。
2. がんを有し、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮによる治療に応答する可能性が高い対象を特定し、前記対象にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを投与することを含む方法であって、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答する可能性が高いことは、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化及び／又はＴ細胞機能を判定することによって評価され、前記可能性が高いことは、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化を特定すること及び／又は前記対象における良好なＴ細胞機能を判定することによって確立される方法。
3. がんを有し、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答する可能性が高い対象を特定し、前記対象にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを投与することを含む方法であって、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答する可能性が高いことは、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化を判定することによって評価され、前記可能性が高いことは、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化を特定することによって確立される方法。
4. がんを有し、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮによる治療に応答する可能性が高い対象を特定し、前記対象にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを投与することを含む方法であって、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答する可能性が高いことは、前記対象におけるＴ細胞機能を判定することによって評価され、前記可能性が高いことは、前記対象における良好なＴ細胞機能を判定することによって確立される方法。
5. がんを患っている対象のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答した予後を予測する方法であって、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化を判定すること、及び／又はＴ細胞機能を判定することを含む方法。
6. がんを有する対象のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答した予後を予測する方法であって、前記方法は、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化を判定すること、及び／又はＴ細胞機能を判定することを含み、前記対象におけるメチル化ＭＧＭＴ及び／又は良好なＴ細胞機能は、良好な予後を示す方法。
7. がんを有する対象のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答した予後を予測する方法であって、前記方法は、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化を判定することを含み、前記対象におけるメチル化ＭＧＭＴは、良好な予後を示す方法。
8. がんを有する対象のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答した予後を予測する方法であって、前記方法は、前記対象におけるＴ細胞機能を判定することを含み、前記対象における良好なＴ細胞機能は、良好な予後を示す方法。
9. がんを有する対象のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答した予後を予測する方法であって、前記方法は、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化を判定すること、及び／又はＴ細胞機能を判定することを含み、前記対象における非メチル化ＭＧＭＴ及び／又は不十分なＴ細胞機能は、予後不良を示す方法。
10. がんを有する対象のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答した予後を予測する方法であって、前記対象におけるＭＧＭＴメチル化を決定することを含み、前記対象における非メチル化ＭＧＭＴは、予後不良を示す方法。
11. がんを有する対象のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに応答した予後を予測する方法であって、前記対象におけるＴ細胞機能を判定することを含む方法であって、前記対象における不十分なＴ細胞機能は、予後不良を示す方法。
12. 前記Ｔ細胞機能が、非特異的刺激に応答して発現するＩＦＮ－γの数を評価することによって判定される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記Ｔ細胞機能が、非特異的刺激に応答して発現するＩＦＮ－γの数を評価することによって判定され、特異的刺激に応答して中央値以上の数のＴ細胞がＩＦＮ－γを発現することは、良好なＴ細胞機能として分類され、非特異的刺激に応答して中央値未満又はより少ない数のＴ細胞がＩＦＮ－γを発現することは、不十分なＴ細胞機能として分類される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. テモゾラミドが前記対象に投与される前に、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが対象に投与される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. テモゾラミドが対象に投与されるよりも少なくとも２週間；少なくとも３週間；少なくとも４週間；少なくとも５週間；少なくとも６週間；少なくとも７週間；又は少なくとも８週間前に、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが前記対象に投与される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが自家がん細胞ワクチンとして対象に投与される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが完全に製剤化された生体用拡散チャンバーとして対象に投与される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 生体用拡散チャンバーは、存在する場合、（ａ）対象から得られた腫瘍細胞を、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの存在下で生体用拡散チャンバーに封入し、ここで、チャンバー内の腫瘍細胞：ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの比は約３．７５×１０^５：１μｇ～約６．２５×１０^５：１μｇの範囲であり、前記腫瘍細胞は、組織モルセレータを使用して対象から得られ、さらに（ｂ）前記生体用拡散チャンバーに放射線照射することによって調製される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記腫瘍細胞が生体用拡散チャンバー内に配置される前にネスチン発現に関して濃縮される、生体用拡散チャンバーを用いる請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. チャンバー内の腫瘍細胞が、対象から得られた腫瘍細胞と比較して、接着細胞について濃縮される、生体用拡散チャンバーを用いる請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 腫瘍細胞が本質的に接着細胞からなる、生体用拡散チャンバーを用いる請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 細胞がチャンバーに封入される前にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮで処理される、生体用拡散チャンバーを用いる請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが、封入前の処理の間、１００万個の細胞あたり約２ｍｇ～約６ｍｇで存在する、生体用拡散チャンバーを用いる請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが、封入前の処理の間、１００万個の細胞あたり約４ｍｇで存在する、生体用拡散チャンバーを用いる請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 封入前のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮによる処理が最大約１８時間である、生体用拡散チャンバーを用いる請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 封入前のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮによる処理が約１２時間～約１８時間である、生体用拡散チャンバーを用いる請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが配列番号１の配列を有する、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. チャンバー内のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが約２μｇで存在する、生体用拡散チャンバーを用いる請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 照射された腫瘍細胞がチャンバーあたり約７５０，０００～約１，２５０，０００個の範囲で存在する、生体用拡散チャンバーを用いる請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 照射された腫瘍細胞がチャンバーあたり約１，０００，０００個で存在する、生体用拡散チャンバーを用いる請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. ２つ以上の生体用拡散チャンバーを対象に植え込むことを含む、生体用拡散チャンバーを用いる請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 約１０～約３０個の生体用拡散チャンバーが対象に植え込まれる、生体用拡散チャンバーを用いる請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 約１０～約２０個の生体用拡散チャンバーが対象に植え込まれる、生体用拡散チャンバーを用いる請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 拡散チャンバーが対象に４８時間にわたって植え込まれる、生体用拡散チャンバーを用いる請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. がんが脳のがんである、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 脳のがんが、グレードＩＩ星状細胞腫、グレードＡＩＩＩ星状細胞腫、グレードＡＩＩＩ－Ｇ星状細胞腫、及びグレードＩＶ星状細胞腫（多形性膠芽腫）から選択される、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
    脳のがんがグレードＩＶ星状細胞腫（多形性膠芽腫）である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
37. 前記対象がヒトである、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。

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