KR20190034210A - 암 면역 아쥬반트 - Google Patents

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KR20190034210A
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츠카사 세야
미사코 마츠모토
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가부시키가이샤 츠기츠기세다이 이노베이숀 가이하츠
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Abstract

본 발명은, 면역 체크 포인트 저해제와 아쥬반트 조성물을 조합하여 포함하는, 암 또는 감염증을 치료하기 위한 의약에 관한 것이다. 보다 상세하게는 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체와, 이중쇄 RNA와 단일쇄 ODN으로 구성되는 핵산 아쥬반트를 병용하는 것을 특징으로 하는, 암 또는 감염증의 의약에 관한 것이다.

Description

암 면역 아쥬반트
[관련 출원]
본 출원은 일본 특허 출원 제2016-147657호(2016년 7월 27일 출원) 및 제2017-079445호(2017년 4월 13일 출원)에 기초하는 우선권을 주장하고 있으며, 이 내용은 본 명세서에 참조로서 도입된다.
[기술 분야]
본 발명은 면역 체크 포인트 저해제와 아쥬반트 조성물의 병용에 관한 것이다. 보다 상세하게는 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체와, 이중쇄 RNA와 단일쇄 ODN으로 구성되는 핵산 아쥬반트를 병용하는 것을 특징으로 하는, 암 또는 감염증의 신규 치료에 관한 것이다.
생체에는, 세포가 암화되었을 때나, 체 내에 세균이나 바이러스 등의 병원체가 침입했을 때, 이것을 배제하는 자연의 면역 방어 시스템이 구비되어 있으며, 그 면역 방어 시스템을 제어하는 분자를 면역 체크 포인트라 칭한다. 암 세포는 종종 「면역 체크 포인트」를 발현 증강함으로써, 면역 방어 시스템의 감시로부터 교묘하게 피하고 있다고 생각된다.
PD-1이나 PD-L1은 대표적인 면역 체크 포인트 분자이며, 이 분자를 표적으로 하는 항체는, 각종 암종에 있어서, 현저한 항암 작용을 나타내는 것이 확인되어, 현재 의약으로서 개발되어 있다. 그러나, PD-1/PD-L1 항체 요법에 대해서는, 50％ 이상의 전이성 멜라노마에서 관해(寬解)가 보였다는 보고가 있는 한편, 고형암에서의 관해는 20 내지 30％에 머물러, 그의 주효율은 충분한 것이라고는 할 수 없다. 또한, PD-1 항체 요법에 응답하는 환자와 응답하지 않는 환자가 존재하고, 그 감별이나, 응답하지 않는 환자에 대한 치료법의 개발이 요구되고 있다.
항암 면역 백신 요법은 수술, 항암제, 방사선 요법으로 치료할 수 없는 암에 대한 제4 치료법으로서, 근년 특히 주목받고 있다. 항암 창약(創藥)에서는 부작용이 문제가 되는 경우가 많지만, 면역 백신 요법에서는, 암 세포 특이적인 항원을 사용하여 암 세포를 선택적으로 공격하기 ?문에, 침습이나 부작용이 적다는 이점이 있다. 면역 백신 요법에서는, 종종 항원성을 보강함으로써, 백신의 효과를 보조·증강시키는 아쥬반트가 사용된다.
톨-유사 수용체(Toll-like receptor(TLR))의 활성화는 수상 세포에 자연 면역 응답을 야기하여, 사이토카인 산생이나 세포성 면역의 활성화를 유도한다. poly(I:C) 등의 2중쇄 RNA는 TLR3 리간드가 되어, 강한 항암 효과를 나타내기 때문에, 백신 아쥬반트로서 유망시되어 왔지만, 염증, 사이토카인 혈증 등의 부작용 때문에 임상 적용은 단념되었다.
발명자들은, poly(I:C)의 TLR3을 통한 IFN-β 발현 유도를 저해하는 GpC 디뉴클레오티드 함유 올리고데옥시뉴클레오티드(GpC ODN)를 발견하고, 이 GpC ODN이 TLR3을 통해 세포 내에 도입되는 것을 보고하고 있다(비특허문헌 1). 또한, 홍역 바이러스 유래의 diRNA(defective interference RNA)가 아쥬반트 기능을 갖는 것을 보고하고 있다(특허문헌 1).
또한, 발명자들은, 상기 GpC ODN과 diRNA에 기초하여 설계한 핵산이, 엔드솜 상의 TLR3에 도달하여, 강한 아쥬반트 활성을 갖는 것을 발견하였다(특허문헌 2). 이 아쥬반트는 과잉의 염증성 사이토카인 산생을 유도하지 않고, 마우스 이식 암 모델에 있어서 NK/CTL 의존적인 항암 활성을 유도하는 점에서(특허문헌 3 및 비특허문헌 2), 부작용이 적은 비염증성의 핵산 면역 아쥬반트로서 항암 면역 백신에 대한 적용이 기대된다.
WO2008/065752 WO2012/014945 WO2016/088784
Itoh et al., The Journal of Immunology, 2008, vol.181, No.8, pp5522-5529 Matsumoto et al., Nature Communications, 2015, 6: 6280
본 발명의 과제는, 안전성을 유지하면서, PD-1/PD-L1 항체 요법의 주효율을 개선하여, 새로운 암 면역 요법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해서, 항PD-L1 항체 단독으로는 효과가 없는 종양에 대하여, 이중쇄 RNA와 단일쇄 올리고데옥시뉴클레오티드(단일쇄 ODN)로 구성되는 핵산 아쥬반트를 병용함으로써, CTL 의존성이 현저한 종양 퇴축을 유도할 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 상기 지견에 기초하여 완성된 것으로, 이하의 (1) 내지 (17)에 관한 것이다.
(1) 면역 체크 포인트 저해제 및 아쥬반트 조성물을 조합하여 포함하는, 암 또는 감염증을 치료하기 위한 의약으로서, 상기 면역 체크 포인트 저해제가 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체를 포함하고, 상기 아쥬반트 조성물이, 이중쇄 RNA와, CpG ODN에 있어서 CpG가 GpC, TpC 또는 CpC로 치환된 서열 또는 그의 5 염기 길이 이상의 부분 서열을 포함하는 단일쇄 올리고데옥시뉴클레오티드(단일쇄 ODN)로 구성되는 핵산 아쥬반트를 포함하는, 상기 의약(이중쇄 RNA는 TLR3 리간드로서 기능하고, 단일쇄 ODN은 엔드솜으로의 송달 분자로서 기능함);
(2) 면역 체크 포인트 저해제와 아쥬반트 조성물이 병용되는 것을 특징으로 하는, (1)에 기재된 의약;
(3) 면역 체크 포인트 저해제와 아쥬반트 조성물이 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는, (2)에 기재된 의약;
(4) 이중쇄 RNA와, CpG ODN에 있어서 CpG가 GpC, TpC 또는 CpC로 치환된 서열 또는 그의 5 염기 길이 이상의 부분 서열을 포함하는 단일쇄 올리고데옥시뉴클레오티드(단일쇄 ODN)로 구성되는 핵산 아쥬반트를 포함하는 아쥬반트 조성물과 병용하는 것을 특징으로 하는, 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체를 포함하는 면역 체크 포인트 저해제를 유효 성분으로 하는 암 또는 감염증을 치료하기 위한 의약;
(5) 아쥬반트 조성물이 세균 항원, 바이러스 항원 및 암 항원으로부터 선택되는 항원 분자를 포함하는, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 의약;
(6) 핵산 아쥬반트를 구성하는 핵산의 말단이 인산화되지 않은, (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 의약;
(7) 이중쇄 RNA가, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열의 연속된 30 염기 이상, 바람직하게는 40 염기 이상의 염기 서열을 가지며, 또한 전체 길이가 100 내지 160 염기 길이, 바람직하게는 110 내지 150 염기 길이, 보다 바람직하게는 120 내지 140 염기 길이의 염기 서열을 갖는 핵산이거나, 또는 상기 서열과 80％의 서열 동일성을 가지며 또한 TLR3 활성화능을 갖는 핵산인, (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 의약;
상기 핵산에는, 이중쇄 RNA가, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열의 연속된 30 내지 80 염기 길이의 염기 서열을 2 내지 4회 반복해서 포함하는 핵산, 바람직하게는 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열의 연속된 30 내지 50 염기 길이의 염기 서열을 3회 반복해서 포함하는 핵산이 포함된다.
(8) 이중쇄 RNA가 서열 번호 2 내지 11 중 어느 것에 나타나는 염기 서열을 갖는 핵산이거나, 그의 연속된 100 염기 이상, 바람직하게는 110 염기 이상, 보다 바람직하게는 120 염기 이상의 염기 서열을 갖는 핵산, 또는 상기 서열과 80％의 서열 동일성을 가지며 또한 TLR3 활성화능을 갖는 핵산인, (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 의약;
(9) 이중쇄 RNA가 서열 번호 11에 나타나는 염기 서열을 갖는 핵산이거나, 그의 연속된 100 염기 이상, 바람직하게는 110 염기 이상, 보다 바람직하게는 120 염기 이상의 염기 서열을 갖는 핵산, 또는 상기 서열과 80％의 서열 동일성을 가지며 또한 TLR3 활성화능을 갖는 핵산인, (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 의약;
(10) 단일쇄 ODN이 서열 번호 19 내지 39 중 어느 것에 나타나는 염기 서열 또는 그의 5 염기 이상의 길이를 갖는 부분 서열을 포함하는 핵산인, (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 의약;
(11) 단일쇄 ODN이 서열 번호 19 내지 24 중 어느 것에 나타나는 염기 서열 또는 그의 5 염기 이상의 길이를 갖는 부분 서열을 포함하는 핵산인, (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 의약;
(12) 단일쇄 ODN이 15 내지 28 염기 길이인, (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 의약;
(13) 단일쇄 ODN을 구성하는 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 수식되어 있는, (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 의약;
(14) 핵산 아쥬반트가, 서열 번호 40으로 나타나는 센스쇄와 서열 번호 41로 나타나는 안티센스쇄를 포함하는 핵산, 서열 번호 42로 나타나는 센스쇄와 서열 번호 43으로 나타나는 안티센스쇄를 포함하는 핵산, 또는 상기 서열과 각각 80％의 서열 동일성을 갖는 센스쇄와 안티센스쇄를 포함하며 또한 아쥬반트 활성을 갖는 핵산인, (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 기재된 의약;
(15) 핵산 아쥬반트가,
1) 서열 번호 40으로 나타나는 센스쇄와 서열 번호 41로 나타나는 안티센스쇄를 포함하거나,
2) 서열 번호 42로 나타나는 센스쇄와 서열 번호 43으로 나타나는 안티센스쇄를 포함하거나,
3) 서열 번호 44로 나타나는 센스쇄와 서열 번호 45로 나타나는 안티센스쇄를 포함하거나, 또는
4) 서열 번호 46으로 나타나는 센스쇄와 서열 번호 47로 나타나는 안티센스쇄를 포함하는,
(1) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 의약.
(16) 이중쇄 RNA와, CpG ODN에 있어서 CpG가 GpC, TpC 또는 CpC로 치환된 서열 또는 그의 5 염기 길이 이상의 부분 서열을 포함하는 단일쇄 올리고데옥시뉴클레오티드(단일쇄 ODN)로 구성되는 핵산 아쥬반트를 포함하는 아쥬반트 조성물로서,
이중쇄 RNA가, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열의 연속된 30 내지 80 염기 길이의 염기 서열을 2 내지 4회 반복하여 포함하는 핵산, 바람직하게는 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열의 연속된 30 내지 50 염기 길이의 염기 서열을 3회 반복해서 포함하는 핵산인, 아쥬반트 조성물.
(17) (16)에 기재된 아쥬반트 조성물을 포함하는, 암 또는 감염증을 치료하기 위한 의약.
본 발명에 따르면, PD-1/PD-L1 항체 요법의 효과나 주효율을 개선할 수 있다. 본 발명의 아쥬반트는, 수상 세포에 효율적으로 도입되고, 전신성의 염증성 사이토카인 산생을 유도하지 않고, TLR3을 특이적으로 활성화함과 함께, NK·CTL을 유도한다. 따라서, 다른 면역 복합 요법과는 달리, 사이토카인 혈증 등의 부작용을 발생하지 않고, PD-1/PD-L1 항체의 효과를 온화하게 향상시켜, 종양 퇴축을 초래한다.
도 1의 a는 PBS(대조), OVA, 또한 OVA+ARNAX를 피하 투여한 마우스(야생형(WT) 및 각종 녹아웃(KO) 마우스)의 비장 및 슬하 림프절에 있어서의 종양 특이적 CTL의 발현 유도(％)를 나타낸다.
도 1의 b는 PBS(대조), OVA, 또한 OVA+ARNAX를 피하 투여한 마우스(야생형(WT) 및 각종 녹아웃(KO) 마우스)의 비장 세포에 있어서의 IFN-γ 산생(pg/ml)을 나타낸다.
도 1의 c는 PBS(대조), OVA, 또한 OVA+ARNAX를 피하 투여한 마우스(야생형(WT) 및 각종 녹아웃(KO) 마우스)의 비장 유래의 종양 특이적 CTL을 플로우 사이토메트리로 해석한 결과를 나타낸다.
도 2는, 생식(대조), poly(I:C), 또한 ARNAX를 피하 투여(a) 및 정맥 투여(b)했을 때의, 사이토카인의 유도를 나타낸다.
도 3의 a는 EG7 세포주의 PD-L1 발현을 나타낸다. 도 3의 b는 실시예 3(ARNAX와 항원의 투여에 의한 항종양 효과)의 실험 프로토콜의 개요를 나타낸다. 도 3의 c는 Day0에서 EG7 세포를 피하 이식한 마우스의 종양 체적의 경시 변화를 나타낸다. Day7에서 OVA+ARNAX를 피하 투여한 마우스에서는 현저한 종양 퇴축이 보이지만(-●-), PBS를 투여한 마우스(대조)에서는 종양 퇴축은 보이지 않는다(-■-).
도 3의 d는 PBS(대조) 또는 OVA+ARNAX를 피하 투여한 마우스의 종양 내에 있어서의 CD8 양성 T 세포(좌측), OVA 사량체(tetramer) 양성/CD8 양성 T 세포(중간), CD11c 양성/CD8 양성 T 세포(우측)의 비율을 나타낸다. 도 3의 e는 PBS(대조) 또는 OVA+ARNAX를 피하 투여한 마우스에 있어서의 Gzmb, Ifng, Prf1, Cxcl9, Cxcl10, Cxcl11의 발현 유도의 정량 PCR에 의한 해석 결과를 나타낸다.
도 3의 f는 PBS(대조) 또는 OVA+ARNAX를 피하 투여한 마우스의 종양 조직에 있어서의 DAPI와 CD8α에 대한 면역 염색을 나타낸다.
도 4의 a는 PD-L1 고발현 EG7 세포주(실선)와 통상주(파선)의 PD-L1 발현을 비교하여 나타낸다. 도 4의 b는 실시예 4(ARNAX와 항αPD-L1 항체의 병용)의 실험 프로토콜의 개요를 나타낸다. 도 4의 c는 Day0에서 EG7 세포를 피하 이식하고, day7에 PBS(대조) 또는 OVA+ARNAX의 피하 투여 후, 항마우스 PD-L1 항체 또는 아이소타입 항체를 정맥 투여한 마우스의 종양 체적의 경시 변화를 나타낸다. PD-L1 항체 단독 투여(-■-)에서는 종양 퇴축은 보이지 않지만, PD-L1 항체에 OVA+ARNAX를 병용 투여(-x-)함으로써 현저한 종양 퇴축이 보이고, 그 효과는 OVA+ARNAX만의 투여(-▲-)보다도 높다.
도 4의 d는 PBS(대조) 또는 OVA+ARNAX의 피하 투여 후, 항마우스 PD-L1 항체 또는 아이소타입 항체를 정맥 투여한 마우스의 비장 및 종양에 있어서의 CD8 양성 T 세포(좌측), OVA 사량체 양성/CD8 양성 T 세포(중간 좌측), CD11c 양성/CD8 양성 T 세포(중간 우측), PD-1 양성/CD8 양성 T 세포(우측)의 비율을 나타낸다(상단은 비장, 하단은 종양 내).
도 4의 e는 PBS(대조) 또는 OVA+ARNAX를 피하 투여 후, 항마우스 PD-L1 항체 또는 아이소타입 항체를 정맥 투여한 마우스의 종양에 있어서의 Gzmb, Ifng, Prf1, Cxcl9, Cxcl10, Cxcl11의 발현 유도의 RT-PCR에 의한 해석 결과를 나타낸다.
도 5는, 본 발명에 따른 아쥬반트 핵산(ARNAX)과 항PD-L1 항체의 작용 기서를 나타낸다.
도 6의 a는 MO5 세포주(실선)의 PD-L1 발현을 나타낸다. 도 6의 b는 실시예 5(ARNAX와 항αPD-L1 항체의 병용)의 실험 프로토콜의 개요를 나타낸다. 도 6의 c는 Day0에서 MO5 세포를 피하 이식하고, day10에 PBS(대조) 또는 OVA+ARNAX의 피하 투여 후, 항마우스 PD-L1 항체 또는 아이소타입 항체를 정맥 투여한 마우스의 종양 체적의 경시 변화를 나타낸다. PD-L1 항체 단독 투여(-■-) 및 OVA+ARNAX 투여(-▲-)에 비해, PD-L1 항체와 OVA+ARNAX 병용 투여(-X-)에서는 현저하게 높은 종양 퇴축이 보인다. 도 6의 d는 PBS(대조) 또는 OVA+ARNAX의 피하 투여 후, 항마우스 PD-L1 항체 또는 아이소타입 항체를 정맥 투여한 마우스의 비장 및 종양에 있어서의 CD8 양성 T 세포(좌측), OVA 사량체 양성/CD8 양성 T 세포(중간 좌측), CD11c 양성/CD8 양성 T 세포(중간 우측), PD-1 양성/CD8 양성 T 세포(우측)의 비율을 나타낸다(상단은 비장, 하단은 종양 내). 도 6의 e는 PBS(대조) 또는 OVA+ARNAX를 피하 투여 후, 항마우스 PD-L1 항체 또는 아이소타입 항체를 정맥 투여한 마우스의 종양에 있어서의 Gzmb, Ifng, Prf1, Cxcl9, Cxcl10의 발현 유도의 RT-PCR에 의한 해석 결과를 나타낸다.
도 6의 f는 종양 침윤 면역 세포의 비율을 나타낸다. CD45 양성 세포에서 게이팅한 종양 침윤 림프구의 비율(상측), CD45 양성 세포에서 게이팅한 수상 세포(DC) 서브셋의 비율, CD45 양성 세포에서 게이팅한 종양 침윤 단구, CD11b 양성 골수 세포 서브셋 및 마크로파지의 비율.
도 7은, ARNAX120#1, ARNAX#2, ARNAX130, ARNAX140의 구조를 나타낸다.
도 8은, ARNAX120#2의 TLR3을 통한 IFN-β 프로모터 활성화능을 나타낸다.
도 9는, ARNAX120#1, ARNAX130의 TLR3을 통한 IFN-β 프로모터 활성화능을 나타낸다.
도 10은, ARNAX140의 생체내(in vivo) 크로스 프라이밍 활성(용량을 변량)을 나타낸다.
도 11은, ARNAX120#2의 생체내 크로스 프라이밍 활성(용량을 변량)을 나타낸다.
도 12는, ARNAX120#1의 항종양 효과(EG7)를 나타낸다.
본 발명은, 면역 체크 포인트 저해제(항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체)와, 이중쇄 RNA와 단일쇄 ODN으로 구성되는 핵산 아쥬반트를 조합하여 포함하는, 암 또는 감염증을 치료하기 위한 의약에 관한 것이다.
1. 면역 체크 포인트 저해제
암 세포, 세균이나 바이러스 등의 병원체에 대한 자연의 면역 방어 시스템을 제어하는 분자를 면역 체크 포인트라고 하고, 예를 들어 이펙터 T 세포 표면에 발현하는 PD-1이나, 종양 세포 표면에 발현하는 PD-L1이나 PD-L2, 활성화 T 세포 또는 억제성 T 세포 Treg의 표면에 발현하는 CTLA-4, 수상 세포 표면에 발현하는 CD80이나 CD86을 들 수 있다. 이들 중, CTLA-4/CD80/CD86은, 감작된 T 세포가 나이브 T 세포로부터 TH1, TH2, TFH 세포 등으로 분화되는 프라이밍 페이스에서 기능하고, PD-1/PD-L1/PD-L2는, 이펙터 세포가 종양 세포 등을 공격하는 이펙터 페이스에서 기능한다.
「면역 체크 포인트 저해제」란, 「면역 체크 포인트」를 저해하고, 자연의 면역 방어 시스템을 제어하는 물질·분자를 의미한다. 예를 들어, 상기 면역 체크 포인트에 특이적인 항체(항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 항CTLA-4 항체 등)를 「면역 체크 포인트 저해제」의 대표예로서 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 「면역 체크 포인트 저해제」는, 이펙터 페이스에서 기능하는 면역 체크 포인트 저해제, 즉, PD-1/PD-L1/PD-L2를 저해하는 물질·분자이다. 바람직하게는, 「면역 체크 포인트 저해제」는 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체이다.
「항PD-1 항체」
본 발명에서 사용되는 「항PD-1 항체」는 PD-1에 결합하여, 그의 면역 체크 포인트로서의 기능을 저해할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 항PD-1 항체로서는, 이미 의약으로서 승인 판매되고 있는 것이나, 개발 중인 것이 있고, 이들을 적합하게 이용할 수 있다. 그러한 「항PD-1 항체」로서는, 니볼루맙(옵디보(GSK/오노 야쿠힝)), 인간화 IgG4형 항체인 펨브롤리주맙(MK-3475(Merck)), 피디리주맙(CT-011(CureTech))을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
「항PD-L1 항체」
또한, 본 발명에서 사용되는 「항PD-L1 항체」는 PD-L1에 결합하여, 그의 면역 체크 포인트로서의 기능을 저해할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 항PD-L1 항체로서는, 이미 의약으로서 승인(판매)되고 있는 것이나, 개발중인 것이 있고, 이들을 적합하게 이용할 수 있다. 그러한 「항PD-L1 항체」로서는, 아테졸리주맙(MPDL3280A/RG-7446(Roche/쥬가이), 두르발루맙(Durvalumab)(MEDI4736(아스트라제네카)), 아벨루맙(MSB0010718C(Merck)), MED10680/AMP-514를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
항체는 통상의 방법에 기초하여 제작해도 된다. 그 경우, 항체는 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키기 때문에, 키메라(Chimeric) 항체, 인간화(Humanized) 항체이거나, 또는 완전 인간 항체인 것이 바람직하다. 항체는 면역 체크 포인트 저해제로서의 기능을 갖는 한, 항체 단편이어도 된다. 항체 단편으로서는, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv를 들 수 있다.
본 발명의 「면역 체크 포인트 저해제」는 약리학상 허용되는 담체나 첨가물을 포함하는 것이어도 된다. 그러한 담체나 첨가물로서는, 예를 들어 계면 활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 항산화제, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않고, 기타 상용되는 담체를 적절히 사용할 수 있다.
구체적으로는, 수성 담체로서는, 물, 에탄올, 폴리올(글리세롤, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 올리브 오일 등의 식물성 기름 및 에틸올레산 등의 유기 에스테르가 포함된다.
비수성 담체로서는, 경질 무수 규산, 유당, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카르멜로오스칼슘, 카르멜로오스나트륨, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 지방산 트리글리세라이드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 백당, 카르복시메틸셀룰로오스, 옥수수 전분, 무기염류 등을 들 수 있다.
항산화제로서는, 수용성 항산화제인 아스코르브산, 시스테인히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨, 지용성 항산화제인 아스코르빌팔미테이트, 부틸화히드록시아니솔(BHA), 부틸화히드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필갈레이트, α-토코페롤 및 금속 킬레이트제인 시트르산, 에틸렌디아민사아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산을 들 수 있다.
본 발명의 「면역 체크 포인트 저해제」의 투여 경로는 특별히 한정되지 않지만, 비경구 투여가 바람직하고, 구체적으로는 주사 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 경피 투여 등을 들 수 있다. 주사 투여로서는, 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사를 예시할 수 있다. 투여 방법은 환자의 연령, 증상에 의해 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 「면역 체크 포인트 저해제」의 투여량은, 그의 사용 목적, 투여 경로 등에 의해 적절히 결정된다. 목적으로 하는 최적인 응답(예를 들어, 치료 응답)을 초래하도록 조정된다. 유효 성분은 항체이기 때문에, 투여량은 약 0.0001 내지 100mg/kg, 일반적으로는 0.01 내지 5mg/kg환자 체중의 범위이다. 예를 들어, 투여량은 약 0.3mg/kg체중, 1mg/kg체중, 3mg/kg체중, 5mg/kg체중 또는 10mg/kg체중이거나 또는 1 내지 10mg/kg의 범위이다. 전형적인 치료 방법에는, 예를 들어 주 1회 투여, 2주 간격으로 1회 투여, 3주 간격으로 1회 투여, 4주 간격으로 1회 투여, 1개월 1회 투여, 3개월 간격으로 1회 투여 또는 3 내지 6개월 간격으로 1회 투여 등이다. 예를 들어, 정맥 주사 투여의 경우, 1mg/kg체중 또는 3mg/kg체중이다. 투여 횟수는 증상에 따라서 적절히 설정되고, 단회의 볼루스로 투여해도 되고, 수회로 나누어 시간을 두고 투여해도 된다. 예를 들어, 투여 6회를 4주 간격으로, 다음으로 3주 간격으로 투여하는 경우도 있으며, 3주 간격으로 투여하는 경우도 있으며, 3mg/kg체중을 1회, 다음으로 3주 간격으로 1mg/kg체중으로 투여되는 경우도 있다.
2. 아쥬반트 조성물
2.1 핵산 아쥬반트
본 발명에 따른 「아쥬반트 조성물」은, 이중쇄 RNA와 엔드솜에 송달되는 단일쇄 올리고데옥시뉴클레오티드(단일쇄 ODN)로 구성되는 핵산(핵산 아쥬반트)을 포함한다.
(1) 「이중쇄 RNA」
미생물 유래의 이중쇄 RNA는, 톨-유사 수용체 3(TLR3)의 리간드로서 자연 면역을 활성화하는 것이 알려져 있다. 동일한 현상은 인공 합성한 이중쇄 RNA에서도 보인다(Matsumoto M., and T. Seya. 2008. TLR3: Interferon induction by double-stranded RNA including poly(I:C). Adv. Drug Del. Rev. 60: 805-812.). TLR은 1형의 막 단백질이며, 바이러스나 세균 유래의 성분을 인식하여 생체 방어의 응답을 유기한다. TLR3은 TLR 패밀리의 하나이며, 세포 외의 이중쇄 RNA를 리간드로 하여, TICAM-1을 통해 다채로운 세포 응답을 유도한다. TLR3은 골수계 수상 세포에서는 엔드솜에, 상피계 세포의 일부나 마크로파지에서는 세포 표면과 엔드솜에 국재되어 있지만, 어느 세포에서도 TLR3을 통한 시그널은 엔드솜으로부터 전달되기 때문에, 이중쇄 RNA가 세포 내에 도입되는 것이 필요해진다.
미생물 유래의 이중쇄 RNA는, 인간의 유전자에는 작용하지 않기 때문에, TLR3 리간드로서, 자연 면역을 제어함으로써, 백신 아쥬반트로서 이용하는 연구도 진행되고 있다. 본 발명에서 사용되는 「이중쇄 RNA」는, 그러한 외인성(예를 들어, 바이러스나 세균 유래)의 이중쇄 RNA이며, 인간의 내재성 유전자에 영향을 주지 않고, TLR3 리간드로서(TLR3 활성화능을 갖고), 자연 면역을 활성화한다.
본 발명의 「이중쇄 RNA」는, 예를 들어 RNA 바이러스 유래의 dsRNA를 단리하고, 이것을 주형으로 하여 합성할 수 있다. 대상이 되는 RNA 바이러스는 특별히 한정되지 않고, 마이너스쇄 단일쇄 RNA 바이러스, 플러스쇄 단일쇄 RNA 바이러스, 이중쇄 RNA 바이러스 중 어느 것이어도 된다. 구체적으로는 홍역 바이러스, 센다이 바이러스, RS 바이러스, C형 간염 바이러스, 폴리오 바이러스, 로타 바이러스 등을 들 수 있다. 바람직하게는 마이너스쇄 단일쇄 RNA 바이러스의 홍역 바이러스, 센다이 바이러스 및 RS 바이러스이며, 보다 바람직하게는 홍역 바이러스, 센다이 바이러스 및 RS 바이러스의 백신주이다.
순화 홍역 바이러스주인 에드먼스턴(Edmonston(ED))주 유래의 diRNA(defective interference RNA: 서열 번호 1)는 종래부터 백신에 포함되어(Shingai ey al., J Immunol. 2007; 179: 6123-6133), 인간에 대한 안전성이 확립되어 있다. 발명자들은, 이 ED주 유래의 diRNA가 아쥬반트의 기능을 갖는 것을 발견하고(전술한 Itoh et al., The Journal of Immunology, 2008; Matsumoto et al. Nat. Commun. 2015), 이것을 기초로 제작한 59 염기 길이 내지 140 염기 길이의 이중쇄 RNA가, 후술하는 단일쇄 ODN과 연결시킴으로써, 효율적으로 엔드솜에 송달되어, 세포 내 RNA 센서 RIG-I, MDA5를 활성화하지 않고 TLR3만을 활성화시켜, 종양 퇴축 효과를 갖는 것을 확인하였다(WO2012/014945 및 WO2016/088784). 이 ED주 유래의 diRNA에 기초하는 「이중쇄 RNA」는, 5' 말단을 캡핑함으로써 다른 면역계(예를 들어, MDA5/RIG-1)를 활성화하지 않고, TLR3만을 특이적으로 활성화하기 때문에, 전신성의 염증성 사이토카인의 유도를 일으킬 우려가 없어, 백신 아쥬반트로서 우수하였다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 「이중쇄 RNA」의 바람직한 일 형태로서, 이 ED주 유래의 diRNA에 기초하는 이중쇄 RNA를 들 수 있지만, 다른 바이러스나 세균 유래의 이중쇄 RNA도, TLR3 리간드로서, 본 발명의 핵산 아쥬반트에 이용할 수 있다.
「이중쇄 RNA」의 길이는 특별히 한정되지 않지만, TLR3 활성화능을 위해서는 약 50 염기쌍 이상이 바람직하고, 약 60 염기쌍 이상이 보다 바람직하고, 약 90 염기쌍 이상, 약 100 염기 길이 이상, 약 110 염기 이상이 더욱 바람직하고, 약 120 염기 길이 이상이 특히 바람직하다. 상한도 특별히 한정되지 않지만, 합성의 용이함 때문에, 약 160 염기쌍까지의 길이로 하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 「이중쇄 RNA」의 길이로서는, 약 50 내지 160 염기쌍이 바람직하고, 약 90 내지 150 염기쌍, 약 100 내지 150 염기쌍, 약 110 내지 140 염기쌍이 보다 바람직하고, 약 120 내지 140 염기쌍이 특히 바람직하다.
ED주 유래의 diRNA는 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 가지고, 루프 구조를 갖는 이중쇄 RNA(diRNA)를 형성한다(Shingai et al., J Immunol. 2007 Nov 1; 179(9): 6123-6133). ED주 유래의 diRNA를 기초로 「이중쇄 RNA」를 설계하는 경우, 서열 번호 1에 나타나는 ED주의 diRNA의 어느 부분을, 「이중쇄 RNA」로서 사용해도 되지만, AU 풍부한 영역이 합성 효율의 면에서는 바람직하다. 그러한 AU 풍부한 영역으로서는, 예를 들어 센스쇄측 서열로서는, 서열 번호 1의 17위치 내지 78위치, 101위치 내지 164위치, 및 216위치 내지 269위치 등을 들 수 있지만, 모두 합성 효율의 면에서 바람직한 영역이며, TLR3 리간드로서의 기능은 이들 영역에 한정되지 않는다.
전술한 특허 출원(WO2012/014945)에서는, 서열 번호 1에 나타나는 ED주의 diRNA에 있어서, 이하의 염기 서열을 갖는 이중쇄 RNA를 조제하여, 그 활성을 확인하였다.
제1017 위치 내지 제1074 위치의 염기 서열(서열 번호 2),
제1077 위치 내지 제1152 위치의 5' 말단에 시토신을 3개 부가한 염기 서열(서열 번호 3)
제1017 위치 내지 제1152 위치의 5' 말단에 시토신을 3개 부가한 염기 서열(서열 번호 4)
제1077 위치 내지 제1152 위치의 3' 말단에 시토신을 3개 부가한 염기 서열(서열 번호 5)
제1017 위치 내지 제1152 위치의 3' 말단에 시토신을 3개 부가한 염기 서열(서열 번호 6)
제1057 위치 내지 제1152 위치의 3' 말단에 시토신을 3개 부가한 염기 서열(서열 번호 7)
제1046 위치 내지 제1152 위치의 3' 말단에 시토신을 3개 부가한 염기 서열(서열 번호 8)
제1037 위치 내지 제1152 위치의 3' 말단에 시토신을 3개 부가한 염기 서열(서열 번호 9)
제1017 위치 내지 제1089 위치의 염기 서열(서열 번호 10).
또한, 특허 출원(WO2016/088784)에서는, 서열 번호 1에 나타나는 ED주의 diRNA에 있어서, 제1 위치 내지 제140 위치의 염기 서열(서열 번호 11)을 갖는 이중쇄 RNA를 조제하고, 그의 활성을 확인하였다. diRNA가 스템 루프를 형성하는 것을 고려하면, 서열 번호 11에 나타나는 서열은, 서열 번호 2 내지 9에 나타나는 서열과 상보쇄를 이루는 영역인 것을 이해할 수 있다.
따라서, 본 발명의 「이중쇄 RNA」로서는, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열의 연속된 30 내지 160 염기 길이의 염기 서열을 갖는 핵산(이중쇄 RNA)을 사용할 수 있다. 또한, 합성 효율의 면에서는, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열의 17위치 내지 78위치, 101위치 내지 164위치, 및 216위치 내지 269위치 중의 연속된 30 염기 이상, 바람직하게는 40 염기 이상을 포함하는(반복해서 포함하는 것일 수도 있는), 전체 길이가 100 내지 160 염기 길이, 바람직하게는 110 내지 150 염기 길이, 보다 바람직하게는 120 내지 140 염기 길이의 핵산(이중쇄 RNA)을 적합하게 사용할 수 있다. 또한, 「이중쇄 RNA」는 서열 번호 1의 부분 서열을 2 내지 4회 반복해서 포함하는 것이어도 된다. 예를 들어, 서열 번호 1의 17 내지 136위치의 연속된 120 염기 길이를 포함하는 것 이외에도(서열 번호 42(센스), 서열 번호 43(안티센스)), 서열 번호 1의 17 내지 56위치의 연속된 40 염기 길이를 3회 반복해서 포함하는 것(서열 번호 44(센스), 서열 번호 45(안티센스))도 사용할 수 있다.
서열 번호 2 내지 11 중 어느 것에 나타나는 염기 서열을 갖는 핵산은 그 일례이며, 이 중 서열 번호 11로 나타나는 염기 서열과 그의 부분 서열을 갖는 핵산에 대하여, 발명자들은 생체내에서의 종양 퇴축 효과를 확인하였다.
본 발명의 「이중쇄 RNA」와 ED주 유래의 diRNA의 기능·구조를 고려하면, 서열 번호 2 내지 11에 나타나는 염기 서열을 갖는 핵산(이중쇄 RNA)에 한정되지 않고, 그의 연속된 100 염기 이상, 바람직하게는 110 염기 이상, 보다 바람직하게는 120 염기 이상의 염기 서열을 갖는 이중쇄 RNA도 사용할 수 있다. 또한, 상기 서열과 80％의 서열 동일성, 바람직하게는 85％, 보다 바람직하게는 90％, 더욱 바람직하게는 95％의 서열 동일성을 갖는 염기 서열을 갖는 이중쇄 RNA도, TLR3 활성화능을 갖는 한, 본 발명의 「이중쇄 RNA」로서 이용할 수 있다. 또한, 「이중쇄 RNA」가 부분 서열을 반복해서 포함하는 것인 경우, 서열 동일성은 부분 서열과 당해 부분 서열에 대응하는 서열을 비교한 수치로 한다.
또한, 서열 번호 2 내지 11에 나타나는 염기 서열, 그의 연속된 100 염기 이상, 바람직하게는 110 염기 이상, 보다 바람직하게는 120 염기 이상의 염기 서열에 있어서, 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 6개, 보다 바람직하게는 1 내지 3개의 염기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 염기 서열을 갖는 이중쇄 RNA도, TLR3 활성화능을 갖는 한, 본 발명의 「이중쇄 RNA」로서 이용할 수 있다.
TLR3 활성화능은, WO2012/014945의 실시예 2에 기재되어 있는 바와 같이, 인간 TLR3 발현 플라스미드를, IFN-β 프로모터를 포함하는 리포터 플라스미드와 함께 트랜스펙트한 세포를 제작하고, 그의 배양액 중에 이중쇄 RNA를 첨가하고, 리포터 활성의 상승을 봄으로써 용이하게 확인할 수 있다. 따라서, 서열 번호 2 내지 11에서 나타나는 「이중쇄 RNA」에 한정되지 않고, 당업자라면 서열 번호 1에 나타낸 바와 같은 바이러스나 세균 유래의 dsRNA의 염기 서열과, WO2012/014945 및 WO2016/088784의 기재, 및 당해 분야의 기술 상식으로부터, 본 발명에서 사용되는 다른 「이중쇄 RNA」를 용이하게 취득할 수 있다.
(2) 단일쇄 올리고데옥시뉴클레오티드(단일쇄 ODN)
TLR9는 바이러스 DNA나 박테리아 DNA의 비메틸화 CpG 모티프를 인식한다. TLR9를 통한 시그널링은 짧은 합성 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)에 의해 고효율로 행해진다. 이 ODN에는 세균이나 바이러스의 유전자에 특유의 CpG 모티프가 포함되어 있고, 「CpG ODN」으로서 당해 분야에서 주지되어 있다. CpG ODN은 수상 세포의 엔드솜에 송달되어, TLR9 리간드로서 기능하기 때문에, 강한 백신 아쥬반트나 항체 산생 증강제로서 유용한 것이 알려져 있다. 한편, MyD88 의존성의 사이토카인(특히 IFN-γ)을 강하게 유도하고, Th2 응답을 야기한다. CpG ODN은 3개의 타입으로 분류되고, A 타입은 IFNα를 강력하게 유도하는 NK 세포의 액티베이터이며, B 타입은 IFNα의 유도는 약한 B 세포의 액티베이터이며, C 타입은 B 타입의 작용과 A 타입의 작용을 겸비한다. 본 발명의 「단일쇄 ODN」은 CpG의 사이토카인 유도 활성을 제거한 GpC형으로 하고, B 타입 또는 C 타입의 GpC ODN에 기초하는 것이 바람직하다.
전술한 특허 출원(WO2012/014945)에서는, 상기 CpG ODN에 있어서, CpG를 GpC로 변환한 ODN(GpC ODN)이나, 상기 GpC를 TpC 또는 CpC로 변환한 ODN도 엔드솜에 송달되는 것이, 본 발명자들에 의해 확인되었다. 또한 상기 ODN의 5 염기 이상의 길이를 갖는 부분 서열을 포함하는 핵산도, 엔드솜에 송달되는 것이, 본 발명자들에 의해 확인되었다.
CpG를 GpC, TcP, CPC로 변환한 ODN은, 수상 세포의 엔드솜에 송달되지만, TLR9 아고니스트 활성을 갖지 않기 때문에, 불필요한 면역 응답을 유도하지 않는다. 즉, 본 발명에서 사용되는 「단일쇄 ODN」은, TLR9 아고니스트 활성을 갖지 않는 엔드솜에 송달되는 단일쇄 ODN이다.
CpG ODN은 TLR9 아고니스트로서, GpC ODN은 그의 컨트롤(TLR9 아고니스트 활성을 갖지 않기 때문에)로서 시판되고 있으며, 본 발명에서는 이들 ODN을 적합하게 이용할 수 있다. 이하에, Invivogen으로부터 판매되고 있는 CpG ODN(B 타입 또는 C 타입) 및 그 GpC ODN(컨트롤)과 그의 서열을 기재한다(http://www.invivogen.com/tlr9-agonist).
Figure pct00001
본 발명의 「단일쇄 ODN」은, CpG ODN에 있어서 CpG 디뉴클레오티드가 GpC, TpC 또는 CpC 디뉴클레오티드로 치환된 염기 서열을 갖는 ODN, 또는 엔드솜 송달 기능을 갖는 그의 부분 서열을 들 수 있다.
그러한 「단일쇄 ODN」의 구체예로서, 서열 번호 19 내지 39에 나타나는 염기 서열을 갖는 ODN, 또는 그의 5 염기 이상의 길이를 갖는 부분 서열을 포함하는 핵산을 들 수 있다.
또한, 서열 번호 19 내지 39에 나타나는 서열에 있어서, 1 내지 3개, 바람직하게는 1 또는 2개, 보다 바람직하게는 1개의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 갖는 염기 서열을 갖는 ODN도, TLR9 아고니스트 활성을 갖지 않으며 엔드솜에 송달되는 한, 본 발명의 「단일쇄 ODN」으로서 이용할 수 있다.
본 발명의 「단일쇄 ODN」은, 엔드솜으로의 송달 기능의 관점에서, 15 염기 길이 이상인 것이 바람직하고, 15 내지 28 염기 길이인 것이 보다 바람직하다.
엔드솜으로의 송달 능력은, WO2012/014945의 실시예 5에 기재되어 있는 바와 같이, 인간 TLR3을, IFN-β 프로모터를 포함하는 리포터 플라스미드와 함께 트랜스펙트한 세포를 제작하고, 그 배양액 중에 이중쇄 RNA에 단일쇄 ODN을 연결한 핵산을 첨가하고, 리포터 활성을 컨트롤과 비교함으로써 용이하게 확인할 수 있다. 따라서, 서열 번호 19 내지 39로 나타나는 염기 서열을 갖는 단일쇄 ODN뿐만 아니라, 당업자라면, 시판되는 CpG ODN이나 GpC ODN(컨트롤)의 염기 서열과, WO2012/014945 및 WO2016/088784의 기재로부터, 본 발명에서 사용되는 다른 「단일쇄 ODN」을 용이하게 취득할 수 있다.
본 발명의 「GpC ODN」을 구성하는 단일쇄 뉴클레오티드는, 안정성(뉴클레아제 내성)의 점에서 수식되어 있는 것이 바람직하다. 그러한 수식으로서는, 포스포로티오에이트 수식을 들 수 있다. 포스포로티오에이트 수식됨으로써, 단일쇄 ODN은 뉴클레아제로 분해되는 일이 없으며, 효율적으로 핵산을 엔드솜에 송달할 수 있다.
(3) 아쥬반트 핵산의 합성
본 발명의 아쥬반트 핵산은 상기한 「이중쇄 RNA」와 「단일쇄 ODN」으로 구성된다. 「이중쇄 RNA」와 「단일쇄 ODN」이 연결되는 순서나, 연결 양식은 특별히 한정되지 않고, 「단일쇄 ODN」의 3'측에 「이중쇄 RNA」의 5'측이 결합되어도, 「단일쇄 ODN」의 5'측에 「이중쇄 RNA」의 3'측이 결합되어 있어도 되지만, 「단일쇄 ODN」의 3'측에 「이중쇄 RNA」의 5'측이 결합되어 있는 것이 바람직하고, 「단일쇄 ODN」의 3' 말단이 「이중쇄 RNA」의 센스쇄의 5' 말단과 결합되어 있는 것이 더욱 바람직하다.
「이중쇄 RNA」와 「단일쇄 ODN」은 직접 연결되어도 되고, 적당한 링커를 통해 연결되어도 된다. 링커 서열의 길이(염기수)는 한정되지는 않는다. 링커 서열 이외에도, 어느 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에, 추가로 다른 핵산을 연결하고 있어도 되지만, 이 경우, RNA의 3'측에 다른 핵산을 연결하고 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 핵산을 형성하는 각 단일쇄 핵산은, 어느 말단에도 인산기가 결합되지 않은 것이 바람직하다. 5' 말단에 인산기가 남아있으면, 생체 내에서의 대량 투여에 의해 세포질 내 RIG-I 경로를 활성화하여, 대량의 사이토카인 산생이 유도되어 부작용의 원인이 되기 때문이다(Robinson RA, DeVita VT, Levy HB, Baron S, Hubbard SP, Levine AS. A phase I-II trial of multiple-dose polyriboinosic-polyribocytidylic acid in patients with leukemia or solid tumors. J Natl Cancer Inst. 1976 Sep; 57(3): 599-602). 인비트로 전사에 의해 합성된 RNA쇄의 5' 말단에는, 3인산이 부가되지만, 본 발명의 핵산은 화학 합성에 의해 제조할 수 있기 때문에, 5' 말단 및 3' 말단 중 어느 쪽에도 인산기가 결합되지 않은 핵산으로서 합성할 수 있다.
「단일쇄 ODN」의 3' 말단이 「이중쇄 RNA」의 센스쇄의 5' 말단과 직접 공유 결합되어 있는 경우, 본 발명의 핵산 아쥬반트는, 단일쇄 핵산 A(「단일쇄 ODN」과 「이중쇄 RNA」 센스쇄의 키메라 핵산)와, 단일쇄 핵산 B(「이중쇄 RNA」 안티센스쇄)를 포함하는 핵산으로서 합성할 수 있다.
일례로서, WO2016/088784에는, 서열 번호 40으로 나타나는 센스쇄(단일쇄 핵산 A)와 서열 번호 41로 나타나는 안티센스쇄(단일쇄 핵산 B)로 구성되는 핵산과 그의 합성 방법이 기재되어 있다. 이 예에서는, 「이중쇄 RNA」와 「단일쇄 ODN」은 직접 연결되어 있지만, 핵산의 안정성과 아쥬반트 활성에 마이너스의 영향을 주지 않는 한, 양자간에 링커가 포함되어 있어도 된다. 본 명세서에 있어서는, 이 서열 번호 40으로 나타나는 센스쇄와 서열 번호 41로 나타나는 안티센스쇄로 구성되는 핵산 아쥬반트를 「ARNAX」라고 칭하는 경우도 있다.
본 발명의 핵산은, 상기 센스쇄와 안티센스쇄에 한정되는 것은 아니며, 상기 서열과 각각 80％, 바람직하게는 85％, 보다 바람직하게는 90％, 더욱 바람직하게는 95％의 서열 동일성을 갖는 센스쇄와 안티센스쇄로 구성되는 핵산도, 그것이 아쥬반트 활성을 갖는 한, 본 발명의 핵산으로서 이용할 수 있다. 또한, 전술한 바와 같이, 「이중쇄 RNA」가 특정한 부분 서열을 반복해서 포함하는 경우에는, 상기 서열 동일성은, 당해 반복 부분에 대해서는, 부분 서열과 당해 부분 서열에 대응하는 서열을 비교한 수치로 한다.
핵산의 아쥬반트 활성은, WO2012/014945 및 WO2016/088784의 실시예 기재에 따라서, 예를 들어 1차적으로는 인간 TLR3 발현 플라스미드를, IFN-β 프로모터를 포함하는 리포터 플라스미드와 함께 트랜스펙트한 세포를 제작하고, 그의 배양액 중에 핵산 아쥬반트를 첨가하여, 리포터 활성의 상승을 보는 것에 의해, 보다 엄밀하게는 생체내에서의 종양 퇴축 효과 등을 봄으로써 확인할 수 있다.
상기한 센스쇄와 안티센스쇄를 포함하는 핵산은, 예를 들어 WO2016/088784의 기재된 방법에 따라서, 부분 서열을 합성하고, 순차로 라이게이션함으로써 합성할 수 있다. 물론, 상기 방법에 한정되지 않고, 사용되는 이중쇄 RNA와 단일쇄 ODN의 길이나 구조에 따라서, 통상의 방법에 따라서, 합성 방법은 적절히 최적화해도 된다.
종양의 미소 환경에서는, 종양 세포 이외에도 종양에 침윤된 골수계 세포에 의한 면역 제어 상태가 발생하고 있다. 종양 관련 마크로파지(Tumor-associated macrophage: TAM)는 종양의 증식·유지·침윤을 강하게 서포트하고 있으며, 종양에 상태가 양호한 미소 환경의 형성에 기여하고, 골수 유래 억제 세포(myeloid-derived suppressor cell(MDSC))는 항원 특이적 T 세포의 활성을 억제한다. 이러한 억제성 마크로파지가 종양 내에 침윤하는 마우스 이식암에서 poly(I:C) 치료를 행하면, 종양이 퇴축된다(Shime et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109(6): 2066-2071.2012). 종양 퇴축의 요인은, poly(I:C)에 응답한 TAM으로부터의 TLR3-TICAM-1 의존적인 TNF-α 산생에 의한 종양의 출혈성 괴사이지만, 동시에, 종양 내의 마크로파지는 억제형의 M2 타입으로부터 이펙터형의 M1 타입으로 변환되어 있으며, TLR3 시그널에서 에피제네틱한 변화가 유도된다. TLR3 특이적 아쥬반트인 본 발명의 아쥬반트 조성물의 투여에 의해, 종양 내의 암 억제 세포를 암 공격형으로 전환하고, 종양 내 미소 환경을 제어함으로써 종양의 증식을 저해할 수 있다고 생각된다.
본 발명의 핵산 아쥬반트는, 1) 수상 세포에 효율적으로 도입되고, 2) TLR3만 활성화하고 MDA5/RIG-1을 활성화하지 않으며, 3) 전신적인 염증성 사이토카인/타입 I IFN 산생을 유도하지 않고, 4) 수상 세포를 활성화하며, NK 세포, CTL을 유도하고, 5) 강한 항종양 활성을 나타내며, 6) 종양 내 미소 환경을 제어함으로써 종양의 증식을 저해할 수 있고, 7) GMP 기준에 의한 화학 합성이 가능하다는 특징을 갖는다. 따라서, 암 면역 요법에 있어서의 아쥬반트로서 매우 유용하다.
(4) 제제화
본 발명의 「아쥬반트 조성물」은, 약리학상 허용되는 담체나 첨가물을 포함하는 것이어도 된다. 그러한 담체나 첨가물로서는, 예를 들어 계면 활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 항산화제, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않고, 기타 상용되는 담체를 적절히 사용할 수 있다. 이들의 구체예는, 「면역 체크 포인트 저해제」에 있어서 기재한 바와 같다.
본 발명의 「아쥬반트 조성물」의 투여 경로는 특별히 한정되지 않지만, 비경구 투여가 바람직하고, 구체적으로는 주사 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 경피 투여 등을 들 수 있다. 주사 투여로서는, 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사를 예시할 수 있다. 투여 방법은 환자의 연령, 증상에 의해 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 「아쥬반트 조성물」의 투여량은 그의 사용 목적, 투여 경로 등에 의해 적절히 결정된다. 인간에게 투여하는 경우에는, 예를 들어 1회의 투여에 대하여 체중 1kg당 0.00001mg 내지 10mg의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 또는, 예를 들어 환자당 1 내지 100mg/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 그러나, 본 발명의 「아쥬반트 조성물」의 투여량은 상기 투여량에 제한되는 것은 아니다.
2.2 항원 분자
본 발명은, 아쥬반트 조성물은 항원 분자를 포함하고 있어도 된다. 암 환자나 세균 감염자의 체 내에는, 내인성의 항원이 존재하기 때문에, 아쥬반트 핵산만으로도 면역 효과는 얻어진다. 무엇보다, 아쥬반트 핵산만으로 충분한 효과를 얻지 못하는 경우에는, 치료 대상으로 하는 질환에 따라서, 항원 분자를 아쥬반트와 함께 투여하는 것이 바람직하다. 항원 분자로서는, 바이러스 항원, 세균 항원, 암 항원, 및 이들의 항원성 성분 등을 들 수 있다.
바이러스 항원으로서는, 예를 들어 아데노 바이러스, 레트로 바이러스, 피코르나 바이러스, 헤르페스 바이러스, 로타 바이러스, 한타 바이러스, 코로나 바이러스, 토가 바이러스, 플라비 바이러스, 랍도 바이러스, 파라믹소 바이러스, 오르소 믹소 바이러스, 브니야 바이러스, 아레나 바이러스, 레오 바이러스, 파필로마 바이러스, 파르보 바이러스, 폭스 바이러스, 헤파드나 바이러스, 해면상 바이러스, HIV, CMV, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 폴리오 바이러스, 천연두 바이러스, 풍진 바이러스, 단순 포진 바이러스, 수두 대상 포진 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 광견병 바이러스, 인플루엔자 바이러스 등의 바이러스 항원 또는 이들의 조합을 들 수 있다.
세균 항원으로서는, 예를 들어 바실루스속, 에스케리키아속, 리스테리아속, 네이세리아속, 노카르디아속, 살모넬라균속, 스타필로코커스속, 스트렙토코커스속 등의 세균 항원 또는 이들의 조합을 들 수 있다.
암 항원으로서는, 예를 들어 백혈병, 림프종, 성장 세포종, 신경교아종, 멜라노마, 유방암, 폐암, 두경부암, 소화기계 종양, 위암, 결장암, 간암, 췌장암, 자궁암, 난소암, 질암, 정소암, 전립선암, 음경암, 골종양, 혈관 종양, 식도암, 직장암, 대장암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 후두암, 기관지암, 방광암, 신장암, 뇌종양, 갑상선암, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 다발 골수종 등의 암 항원 또는 이들의 조합을 들 수 있다.
본 발명의 아쥬반트 조성물은 단독으로도 암 또는 감염증의 치료 효과를 가지고, 본 발명은 아쥬반트 조성물을 포함하는 암 또는 감염증을 치료하기 위한 의약도 제공한다.
3. 암 또는 감염증을 치료하기 위한 의약
본 발명은 상기한 면역 체크 포인트 저해제 및 아쥬반트 조성물을 조합하여 포함하는, 암 또는 감염증을 치료하기 위한 의약을 제공한다.
본 발명의 의약은, 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체를 포함하는 면역 체크 포인트 저해제에, 아쥬반트 조성물을 동시에, 따로따로 또는 순차적으로 투여하기 위해 조합한(병용 투여하는) 의약을 의미한다.
면역 체크 포인트 저해제와 아쥬반트 조성물은 따로따로 제공되어도 되고, 면역 체크 포인트 저해제와 아쥬반트 조성물로 구성되는 키트로서 제공되어도 된다.
본 발명의 의약의 치료 대상이 되는 질환으로서는, 면역 체크 포인트 저해제의 대상이 될 수 있는 질환(암, 감염증 등)이다. 암으로서는, 예를 들어 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 멜라노마, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부 암, 위암, 정소 암, 자궁암, 난관 암종, 자궁 내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 유조직 육종, 요도암, 음경암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프 아구성 백혈병, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 소아 고형암, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암, 요관암, 신우 암종, 중추 신경계(CNS) 종양, 원발성 CNS 림프종, 종양 신맥관 형성, 척추 종양, 뇌간 종양, 하수체 선종, 카포시 육종, 편평 상피암, 편평 세포암, T 세포 임파종, 환경 유발 종양 등을 들 수 있다. 특히, PD-L1을 발현하는 전이성 암에 적합하게 적용할 수 있다.
감염증으로서는, 예를 들어 HIV 감염(AIDS), 간염, 포진, 말라리아, 리슈마니아증, 인플루엔자, 이질, 폐렴, 결핵, 패혈증 등을 들 수 있다. 특히, 위독한 면역 부전을 발생하는 HIV 감염에 적합하게 적용할 수 있다.
전술한 바와 같이 항PD-1 항체나 항PD-L1 항체는, 면역 방어 기구의 이펙터 페이스에서 작용하는 것에 비해, 본 발명의 핵산 아쥬반트는, 수상 세포의 엔드솜에 송달되어 TLR3을 활성화하고, NK 세포, CTL을 유도하는 등 프라이밍 페이스에서 작용한다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 아쥬반트 핵산을 항PD-1 항체나 항PD-L1 항체와 병용함으로써, 프라이밍 페이스와 이펙터 페이스의 양쪽을 통하여 면역 방어 기구를 활성화할 수 있다(도 5 참조).
상기한 작용 기서에 의해, 본 발명의 의약은, 아쥬반트 조성물과 항PD-1 항체 및 항PD-L1 항체를 병용함으로써, 항PD-1 항체나 항PD-L1 항체가 단독으로는 성공하지 않는 암에 대해서도 효과를 발휘하며, 또한 보다 강력하게 CTL 의존성의 종양 퇴축을 유도한다. 아쥬반트 조성물과 항PD-1 항체나 항PD-L1 항체는 병용함으로써, 각각 단독으로 투여하는 것보다도 상승적으로 항종양 효과가 증대된다.
또한, 아쥬반트 조성물과 병용함으로써, 항PD-1 항체나 PD-L1 항체 단독으로는 달성할 수 없는 항체 산생이나 NK 세포 활성화라는 효과, 종양 미소 환경의 개선이라는 효과도 발휘된다. 본 발명의 의약은 안전성이 높고, 고령자에게도 안전하게 투여할 수 있어, 항PD-1 항체나 항PD-L1 항체를 사용한 치료 대상을 확장하여, 그 효과를 높일 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: ARNAX와 항원의 투여에 의한 CTL의 유도
1. 재료 및 방법
8 내지 11주령의 야생형(C57BL/6) 및 B57BL/6 백그라운드의 녹아웃 ♂ 마우스(MAVS KO, MyD88 KO, TLR3 KO, TICAM-1 KO, IRF3 KO, IRF3/7D KO)를 실험에 사용하였다. PBS, OVA(100μg), 또는 OVA(100μg)+ARNAX(60μg)를 day0, day7에 마우스 피하 투여하고, day11에 비장과 슬하 림프절을 채취하고, CD8+ T 세포 중의 OVA 특이적 CD8+T 세포의 비율을 OVA-사량체(MBL사제)로 측정하였다. 사량체 검정(tetramer assay)은 첨부 문서를 따라서 행하였다. 구체적으로는, 비장 및 림프절 세포(1x107/ml)를 50배 희석한 H2-Kb OVA 사량체(PE)로 20분간 염색하고, 세정 후, 항-CD3em Ab(APC), 항-CD8am Ab(FITC)로 염색하고, CD8+T 세포 중의 OVA 특이적 CD8+T 세포의 비율을 FACS Aria(BD사)로 해석하였다. 또한, 비세포(1x107/ml)를 100nM의 OVA 특이적 펩티드(SL8: SIINFEKL) 또는 컨트롤 WT1 펩티드(Db126: RMFPNAPYL)로 3일간 자극하고, 배양 상청 중의 IFN-γ를 사이토카인 비드 검정(Cytokine bead assay(CBA; BD사))으로 측정하였다.
2. 결과
야생형 마우스에 있어서 PBS 또는 OVA 단독 투여에서는, 비장 및 슬하 림프절에서, OVA 특이적 CTL은 유도되지 않지만, OVA+ARNAX 투여로 유도되었다. RIG-I-유사 수용체(RIG-I-like receptor(RLR))의 하류의 어댑터 분자인 MAVS의 녹아웃 마우스, TLR3 이외의 TLR의 어댑터 분자인 MyD88 녹아웃 마우스는 야생형 마우스와 동일한 결과였다. TLR3, TLR3의 어댑터 분자인 TICAM-1, TypeI IFN 유도에 필수적인 전사 인자 IRF3, IRF7의 녹아웃 마우스에서는, OVA+ARNAX에 의한 OVA 특이적 CTL은 완전히 유도되지 않았다(도 1의 a, c). 또한, 야생형 마우스와 MAVS 녹아웃 마우스의 비세포에서는, OVA 특이적 펩티드 자극으로 대량의 IFN-γ가 산생되었지만, TLR3, TICAM-1, IRF3, IRF3/7 녹아웃 마우스에서는 완전히 IFN-γ 산생은 보이지 않았다(도 1의 b).
3. 고찰
항원 특이적 CTL은 항원 단독으로는 유도되지 않고, 항원+ARNAX 투여에 의해 유도되는 것이 명확해졌다. 녹아웃 마우스의 결과로부터, ARNAX에 의한 항원 특이적 CTL 유도는 TLR3-TICAM-1-IRF3 경로에 의존하고, RLR-MAVS 경로나 TLR3 이외의 TLR-MyD88 경로는 관여하지 않는 것이 판명되었다. ARNAX의 프라이밍 아쥬반트 활성은 TLR3-TICAM-1 시그널로서 정의할 수 있다.
실시예 2: 투여 경로에 의한 ARNAX의 사이토카인 산생 효과 및 안전성의 비교
1. 재료 및 방법
8주령의 야생형(C57BL/6) ♀ 마우스의 피하에 염수(saline), poly(I:C)(150μg), ARNAX(150μg)를, 또는 정맥 중에 염수, poly(I:C)(50μg), ARNAX(50μg)를 투여하고, 3시간 및 6시간 후의 혈중의 사이토카인량을 측정하였다(도 2). IL-6, TNF-α, IL-12p40은 CBA로, IFN-βIP-10은 ELISA로 측정하였다.
2. 결과
ARNAX 피하 투여에 있어서, 혈중의 염증성 사이토카인 IL-6, TNF-α는 poly(I:C) 투여보다 적고, IFN-γ도 매우 적었다. 한편, Th1형 사이토카인인 IL-12p40은 poly(I:C)보다 많이 산생 유도되고, NK 세포, NKT 세포, T 세포를 불러 모으는 케모카인의 IP-10은 poly(I:C)와 동등하게 유도되었다. 정맥 내 투여에서는, poly(I:C)는 TNF-α, IL-6, IFN-β를 강하게 유도하지만, ARNAX는 거의 유도하지 않았다.
3. 고찰
ARNAX는 투여 경로에 불구하고, 전신적인 염증성 사이토카인이나 타입 I IFN 산생을 거의 유도하지 않는 점에서, poly(I:C)에서 보이는 부작용이 경감된 비염증성 아쥬반트라고 할 수 있다. 한편, Th1형 사이토카인의 IL-12는 poly(I:C)보다 많이 산생 유도된다. 항원 특이적 CTL 유도에서는 제3 시그널로서 IL-12나 type I IFN 등의 사이토카인이 필요하지만, IL-12로 유도된 CTL은 type I IFN으로 유도된 CTL보다, 종양 내에서의 PD-1의 발현이 낮고, 더 길게 생존한다는 보고도 있으며, ARNAX의 IL-12high/IFN-βlow의 사이토카인 프로필은, 종양 내에서의 기능적인 항원 특이적 CD8+T 세포의 유도에 적합하였다.
실시예 3: ARNAX와 항원의 투여에 의한 항종양 효과(흉선종)
1. 재료 및 방법
C67BL/6 마우스(7주령, ♀)의 등허리부에 OVA 발현 종양(흉선종)주인 EG7(2x106/200μl PBS)을 피하 이식하고, day7에 PBS(n=5) 또는 OVA(100μg)+ARNAX(60μg)(n=5)을 피하 투여하고, 종양의 증식을 경시적으로 측정하였다(도 3의 c). Day14에 종양을 채취하고, 종양 내의 CD8+ T 세포의 비율, CD8+ T 세포 중의 OVA 특이적 CD8+T 세포 및 CD11c 양성 CD8+T 세포의 비율을 플로우 사이토메트리로 측정하였다(도 3의 d). 또한, 종양 조직 절편을 제작하고, 항CD8α 항체로 면역 염색하여 종양 내의 CD8+T 세포의 침윤을 공초점 현미경으로 PBS군 20 시야, OVA+ARNAX군 16 시야를 관찰하여 수치화하였다(도 3의 f). 또한, 종양 조직으로부터 RNA를 트리졸(Trizol)을 사용하여 정제하고, Gzmb, Ifng, Perf1, Cxcl9, Cxcl10, Cxcl11의 유전자 발현을 정량 PCR로 측정하였다(도 3의 e).
2. 결과
OVA+ARNAX 치료에서 EG7 종양 내에 CD8+T 세포가 매우 많이 침윤되어 있었다(도 3의 d, f). CD8+T 세포 중의 OVA 특이적 CTL의 비율도 높고, 활성화 마커의 CD11c도 발현하고 있어, 이펙터 메모리의 종양 반응성 CTL이 유도되었다고 생각된다. 거기에 따른 종양의 퇴축이 유도되었다(도 3의 c). 종양 내에서는, 그랜자임(granzyme)(Gzmb), 퍼포린(perforin)(Prf1), IFN-γ(Ifng), Cxcl9, 10, 11 등의 유전자가 OVA+ARNAX에서 발현 상승되어 있었다(도 3의 e).
3. 고찰
ARNAX+암 항원 투여로, 종양 특이적 CTL을 효율적으로 유도하여 종양 내에 침윤시켜, 종양 퇴축을 유도할 수 있다고 생각된다. 종양 내에서는, 그랜자임, 퍼포린, IFN-γ 등 세포 상해 관련 유전자나 Cxcl9, 10, 11과 같은 CTL을 유도하는 케모카인 유전자의 발현이 상승되어 있으며, ARNAX는 종양 내에 Th1형 면역 응답을 구축할 수 있는 아쥬반트이다.
실시예 4: ARNAX와 PD-L1 항체의 병용 투여(흉선종)
1. 재료 및 방법
C67BL/6 마우스(7주령, ♀)의 등허리부에 PD-L1 고발현 EG7(Kataoka et al., Nature 534: 402, 2016)(2x106/200μl PBS)을 피하 이식하고, day7에 PBS(아이소타입(isotype) Ab군)(n=4), PBS(항-PD-L1 Ab군)(n=4), OVA(100μg)+ARNAX(60μg)(아이소타입 Ab군)(n=6), OVA(100μg)+ARNAX(60μg)(항-PD-L1 Ab군)(n=6)를 피하 투여하고, day7, 9, 11에 아이소타입 Ab 또는 항-PD-L1 Ab(200μg/head)를 정맥 내 투여하여 종양의 증식을 경시적으로 측정하였다(도 4의 c). Day13에 비장 및 종양을 채취하고, 비장 및 종양 내의 CD8+T 세포의 비율, CD8+ T 세포 중의 OVA 특이적 CD8+T 세포, CD11c 양성 CD8+T 세포, PD-1 양성 CD8+T 세포의 비율을 플로우 사이토메트리로 측정하였다(도 4의 d). 또한, 종양 조직으로부터 RNA를 트리졸을 사용하여 정제하고, Gzmb, Ifng, Perf1, Cxcl9, Cxcl10, Cxcl11의 유전자 발현을 정량 PCR로 측정하였다(도 4의 e).
2. 결과
PD-L1 고발현 EG7에 있어서, PD-L1 항체 단독 치료에서는 종양 증식은 억제되지 않았지만, OVA+ARNAX로 종양의 퇴축이 유도되었다. 또한, PD-L1 항체와의 병용으로 더 효과적으로 종양이 퇴축되었다(도 4의 c). OVA+ARNAX에서 종양 내에 CD8+T 세포가 침윤되었으며, 항PD-L1 항체를 병용하면 더 많은 T 세포가 침윤되었다. 종양 내의 OVA 특이적 CD8+T 세포의 비율은 OVA+ARNAX, OVA+ARNAX+항-PD-L1 Ab 모두 높아져 있었다(도 4의 d). 한편 비장에서는, 항원 특이적 CD8+T 세포의 증식은 PD-L1 항체의 병용으로 현저하게 증가되어 있으며, 활성화 마커의 CD11c, PD-1 양성 CD8+T 세포의 비율도 높아, 이펙터 메모리의 종양 반응성 CTL이 유도되었음이 판명되었다. 또한, 종양 내의 Gzmb, Ifng, Perf1, Cxcl9의 유전자 발현도 ARNAX+OVA와 항-PD-L1 항체 병용으로 상승하였다(도 4의 e).
3. 고찰
PD-L1 항체 치료에 저항성의 PD-L1 고발현의 EG7 종양에 있어서, OVA+ARNAX로 종양의 증식은 어느 정도 억제되지만, 항PD-L1 항체를 병용함으로써 효과적으로 종양 퇴축을 유도할 수 있었던 점에서, 병용 치료에 의해 PD-1/PD-L1 저항성을 해제할 수 있다고 생각된다.
PD-1 경로가 블록됨으로써, 프라이밍 상에 있어서 많은 종양 특이적 CTL이 유도되어 종양 내에 침윤되고, 이펙터상에서의 기능 억제 해제에 의해 효과적으로 암 퇴축을 유도하였다고 생각되고, 항PD-1/PD-L1 항체와의 병용은 ARNAX의 작용 강화에 유용하다(도 5 참조).
실시예 5: ARNAX와 PD-L1 항체의 병용 투여(멜라노마)
1. 재료 및 방법
C67BL/6 마우스(7주령, ♀)의 등허리부에 OVA 발현 B16 멜라노마주인 MO5(2x106/200μl PBS)를 피하 이식하고, day10에 PBS(아이소타입 Ab군)(n=5), PBS(항-PD-L1 Ab군)(n=4), OVA(100μg)+ARNAX(60μg)(아이소타입 Ab군)(n=4), OVA(100μg)+ARNAX(60μg)(항-PD-L1 Ab군)(n=4)를 피하 투여하고, day10, 12, 14, 16에 아이소타입 Ab 또는 항-PD-L1 Ab(200μg/head)를 정맥 내 투여하고, 종양의 증식을 경시적으로 측정하였다(도 6의 c). Day17에 비장 및 종양을 채취하고, 비장 및 종양 내의 CD8+T 세포의 비율, CD8+ T 세포 중의 OVA 특이적 CD8+T 세포 및 CD11c 양성 CD8+T 세포, PD-1 양성 CD8+T 세포의 비율을 플로우 사이토메트리로 측정하였다(도 6의 d). 또한, 종양 조직으로부터 RNA를 트리졸을 사용하여 정제하고, 그랜자임(Gzmb), 퍼포린(Prf1), IFN-γ(Ifng), Cxcl10의 유전자 발현을 정량적 PCR로 측정하였다(도 6의 e). 또한, 종양 침윤 면역 세포의 비율을, 림프구, 수상 세포, CD11b 양성 골수 세포 각각에 대하여 측정하였다(도 6의 f).
2. 결과
PD-L1 발현 MO5에 있어서, OVA+ARNAX는 PD-L1 항체 단독 치료와 동일한 정도의 종양 퇴축을 유도시켰다. 또한, OVA+ARNAX는 PD-L1 항체와 병용함으로써 더 효과적으로 종양을 퇴축시켰다(도 6의 c). OVA+ARNAX에서는 종양 내에 CD8+T 세포가 침윤되었으며, 항PD-L1 항체를 병용하면 더 많은 T 세포가 침윤되었다. 종양 내의 OVA 특이적 CD8+T 세포의 비율은 OVA+ARNAX, OVA+ARNAX+항-PD-L1 Ab 모두 높아져 있었다(도 6의 d). 한편 비장에서는, 항원 특이적 CD8+T 세포의 증식은 PD-L1 항체의 병용으로 현저하게 증가되어 있으며, 활성화 마커의 CD11c, PD-1 양성 CD8+T 세포의 비율도 높아, 이펙터 메모리의 종양 반응성 CTL이 유도되어 있음이 판명되었다. 또한, 종양 내의 Gzmb, Ifng, Perf1, Cxcl9의 유전자 발현도 ARNAX+OVA와 항-PD-L1 항체 병용으로 상승되었다(도 6의 e).
3. 고찰
MO5 종양에 있어서, ARNAX+암 항원 치료는 종양 증식을 억제하지만, PD-L1 항체와 병용함으로써 더 효과적으로 종양 퇴축을 유도할 수 있다. 이로부터, 멜라노마에 대해서도, ARNAX+암 항원과의 병용 치료에 의해 PD-1/PD-L1 면역 체크 포인트 저해제는 높은 항종양 효과를 발휘할 수 있는 것으로 생각된다.
실시예 6: ARNAX의 구조와 TLR3을 통한 IFNβ 활성화능
1. 재료 및 방법
이하의 4종류의 이중쇄 RNA를 합성하였다.
ARNAX140: 서열 번호 1의 1 내지 140위치의 염기 서열을 갖는 이중쇄 RNA
ARNAX120#1: 서열 번호 1의 17 내지 136위치의 염기 서열을 갖는 이중쇄 RNA
ARNAX120#2: 서열 번호 1의 17 내지 56의 염기 서열을 3회 연결한 서열을 갖는 이중쇄 RNA
ARNAX130: 서열 번호 1의 1 내지 130위치의 염기 서열을 갖는 이중쇄 RNA
서열 번호 1의 17 내지 56위치는 AU 풍부한 영역이다(도 7).
HEK293 세포에 대조 플라스미드(pEF/BOS) 또는 인간 TLR3 발현 플라스미드를 IFN-β 프로모터 리포터 플라스미드와 함께 트랜스펙트하고, 24시간 후에 배지, poly(I:C), ARNAX140 또는 ARNAX120#2를 2, 5, 10μg/ml의 농도로 첨가하였다. 6시간 후에 세포 중의 루시페라아제 활성을 측정하였다. pEF/BOS 발현 세포에 음성 대조로서 배지를 첨가했을 때의 루시페라아제 활성을 1로 하여, fold로 나타냈다(도 8).
동일한 실험을, poly(I:C), ARNAX140, ARNAX130 또는 ARNAX120#1을 2, 5, 10μg/ml의 농도로 첨가하여 실시하였다(도 9).
2. 결과
ARNAX120의 TLR3을 통한 IFN-β 프로모터 활성화능은 ARNAX140의 7 내지 8할로, RNA 서열이 다른 ARNAX120#1과 ARNAX120#2에서 TLR3 활성화능에 차이는 확인되지 않았다. ARNAX130은, ARNAX140과 동등한 TLR3을 통한 IFN-β 프로모터 활성화능을 갖는 것이 확인되었다.
실시예 7: ARNAX120의 CTL의 유도 활성
1. 재료 및 방법
실시예 1에 따라서, 8주령의 야생형(C57BL/6) 자성 마우스를 사용하여, PBS, OVA(100μg), OVA(100μg)+poly(I:C)(50μg), OVA(100μg)+ARNAX140(10μg), OVA(100μg)+ARNAX140(30μg), OVA(100μg)+ARNAX140(60μg)의 피하 투여에 의한 비장과 슬하 림프절에 있어서의 OVA 특이적 CD8+T 세포의 비율을 측정하였다.
동일하게, 8주령의 야생형(C57BL/6) 자성 마우스를 사용하여, PBS, OVA(100μg), OVA(100μg)+poly(I:C)(50μg), OVA(100μg)+ARNAX120#2(10μg), OVA(100μg)+ARNAX120#2(30μg)의 피하 투여에 의한 비장에 있어서의 OVA 특이적 CD8+T 세포의 비율을 측정하였다. 또한, 비세포(1x107/ml)를 100nM의 OVA 특이적 펩티드(SL8: SIINFEKL) 또는 컨트롤 WT1 펩티드(Db126: RMFPNAPYL)로 3일간 자극하고, 배양 상청 중의 IFN-γ를 ELISA로 측정하였다.
2. 결과
PBS 또는 OVA 단독 투여에서는 OVA 특이적 CTL은 유도되지 않지만, OVA+poly(I:C), OVA+ARNAX140, OVA+ARNAX120#2 투여에서는 CTL이 유도되어, 생체내에서의 크로스 프라이밍 활성이 확인되었다(도 10, 도 11). ARNAX140의 투여량을 변화시킨 결과, 10μg/head로 충분한 CTL 유도 활성이 있음이 판명되었다(도 10). ARNAX120은 ARNAX140과 동등한 CTL 유도 활성(크로스 프라이밍 활성)을 가지고, 10μg/head의 투여량으로 충분한 CTL 유도 활성을 나타내는 것이 확인되었다(도 11).
실시예 8: ARNAX120의 항종양 활성
1. 재료 및 방법
실시예 3에 따라서, C67BL/6 마우스(7주령, ♀)의 등허리부에 EG7(2x106/200μl PBS)을 피하 이식하고, day7에 PBS(n=5), ARNAX120#1(10μg)(n=4) 또는 OVA(100μg)+ARNAX120#1(10μg)(n=5)을 피하 투여하고, 종양의 증식을 경시적으로 측정하였다.
2. 결과
ARNAX120#1 10μg 단독 투여로 EG7 종양의 증식 억제가 보이지만, OVA 항원과의 동시 투여로 종양을 현저하게 퇴축시키는 것이 확인되었다(도 12). 이상의 결과로부터, ARNAX는 120 염기 길이이면 충분히 효과를 발휘할 수 있고, 그의 서열에는 서열 번호 1에 나타나는 서열 중의 연속된 적어도 40 염기가 포함되어 있으면 되는 것이 확인되었다. 제조 효율 및 비용면에서는 짧은 핵산 쪽이 바람직한 점에서, ARNAX120이나 ARNAX130은 실용면에서 유용한 아쥬반트 후보가 될 수 있다.
본 발명에 따르면, PD-1/PD-L1 항체 요법의 효과나 주효율을 개선할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 암이나 감염증 등 면역 체크 포인트 저해제(PD-1/PD-L1 항체)를 사용한 면역 요법이 기대되는 의료 분야에 있어서 유용하다.
본 명세서 중에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서 중에 있어서 도입하는 것으로 한다.
서열 번호 12: 합성 DNA(ODN M362)
서열 번호 13: 합성 DNA(ODN2006)
서열 번호 14: 합성 DNA(ODN1668)
서열 번호 15: 합성 DNA(ODN1826)
서열 번호 16: 합성 DNA(ODN2007)
서열 번호 17: 합성 DNA(ODN BW006)
서열 번호 18: 합성 DNA(ODN2395)
서열 번호 19: 합성 DNA(ODN M362 컨트롤)
서열 번호 20: 합성 DNA(ODN M362 컨트롤_TpC 치환체)
서열 번호 21: 합성 DNA(ODN M362 컨트롤_CpC 치환체)
서열 번호 22: 합성 DNA(ODN2006 컨트롤)
서열 번호 23: 합성 DNA(ODN2006 컨트롤_TpC 치환체)
서열 번호 24: 합성 DNA(ODN2006 컨트롤_CpC 치환체)
서열 번호 25: 합성 DNA(ODN2007 컨트롤)
서열 번호 26: 합성 DNA(ODN2007 컨트롤_TpC 치환체)
서열 번호 27: 합성 DNA(ODN2007 컨트롤_CpC 치환체)
서열 번호 28: 합성 DNA(ODN BW006 컨트롤)
서열 번호 29: 합성 DNA(ODN BW006 컨트롤_TpC 치환체)
서열 번호 30: 합성 DNA(ODN BW006 컨트롤_CpC 치환체)
서열 번호 31: 합성 DNA(ODN2395 컨트롤)
서열 번호 32: 합성 DNA(ODN2395 컨트롤_TpC 치환체)
서열 번호 33: 합성 DNA(ODN2395 컨트롤_CpC 치환체)
서열 번호 34: 합성 DNA(ODN1668 컨트롤)
서열 번호 35: 합성 DNA(ODN1668 컨트롤_TpC 치환체)
서열 번호 36: 합성 DNA(ODN1668 컨트롤_CpC 치환체)
서열 번호 37: 합성 DNA(ODN1826 컨트롤)
서열 번호 38: 합성 DNA(ODN1826 컨트롤_TpC 치환체)
서열 번호 39: 합성 DNA(ODN1826 컨트롤_CpC 치환체)
서열 번호 40: 센스쇄용 DNA/RNA 키메라 분자(ARNAX140)
서열 번호 41: 안티센스쇄용 합성 RNA(ARNAX140)
서열 번호 42: 센스쇄용 DNA/RNA 키메라 분자(ARNAX120#1)
서열 번호 43: 안티센스쇄용 합성 RNA(ARNAX120#1)
서열 번호 44: 센스쇄용 DNA/RNA 키메라 분자(ARNAX120#2)
서열 번호 45: 안티센스쇄용 합성 RNA(ARNAX120#2)
서열 번호 46: 센스쇄용 DNA/RNA 키메라 분자(ARNAX130)
서열 번호 47: 안티센스쇄용 합성 RNA(ARNAX130)
SEQUENCE LISTING <110> National University Corporation Hokkaido University <120> Adjuvant for Cancer Immunotherapy <130> PHU-9004WO <150> JP2016-147657 <151> 2016-07-27 <150> JP2017-079445 <151> 2017-04-13 <160> 47 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1152 <212> RNA <213> Measles virus <400> 1 accagacaaa gcugggaaua gaaacuucgu auuuucaaag uuuucuuuaa uauauugcaa 60 auaaugccua accaccuagg gcaggauuag gguuccggag uucaaccaau uaguccuuaa 120 ucagggcacu guauccgacu aacuuauacc auucuuuggu cuccuugacu guuaccuuaa 180 aaacccacuc acguuucaaa ccccccguca uaauaaucug uuucucugac uuggauagau 240 ucuuaacgaa gauauucugg uguaagucua guaucagaua gccggacuug agauucugga 300 uaaacuuauu uaucaacuuu cuguucccgg aguaaagaag aaugugcccc caaaauuugc 360 gggugauccu agauauaagu ucucguugcc ugcuacuuac caauacgggg uaagcgugga 420 acaucccuug uugacuucuu ugguugucuu ugaaucuugc caacucccug uagaggauga 480 guauagaauu aagcaaucca ucuugcccug aggcaacauc augguggauc aauucuuugc 540 acagcuuagg uccguuaauu gccaacccgc aauugaucag caccugcucu auagguguaa 600 guuuuuucag aguaggauug auaucaccuc uacuaacugc gucucccaca auugcuugua 660 ugcagcuuag uugcuuaaug gauaggaugu gaccuauaag uccaggugaa guccucacag 720 augauucaau uaucugcugc uuaaucuuuu caggauucau uagccgguua gccuugagau 780 cugucauaac caaauaagau ucaguagaua ugaaguugcu guaucuaggg uauacaaggu 840 ucacuucucu auaaugagac ccuacauaac uuauaaaucc cugaacaaaa uccccgcuga 900 aaggcauaag cuuaaucacc aguauugauc cuauuuugcc caggagcaga gccaucgaua 960 agauggcugc caauuccucu agcuucucua uaguaucuuu guuaggcaag uuagucggau 1020 acagugcccu gauuaaggac uaauugguug aacuccggaa cccuaauccu gcccuaggug 1080 guuaggcauu auuugcaaua uauuaaagaa aacuuugaaa auacgaaguu ucuauuccca 1140 gcuuugucug gu 1152 <210> 2 <211> 58 <212> RNA <213> Measles virus <400> 2 ggauacagug cccugauuaa ggacuaauug guugaacucc ggaacccuaa uccugccc 58 <210> 3 <211> 79 <212> RNA <213> Measles virus <400> 3 cccggugguu aggcauuauu ugcaauauau uaaagaaaac uuugaaaaua cgaaguuucu 60 auucccagcu uugucuggu 79 <210> 4 <211> 139 <212> RNA <213> Measles virus <400> 4 cccggauaca gugcccugau uaaggacuaa uugguugaac uccggaaccc uaauccugcc 60 cuaggugguu aggcauuauu ugcaauauau uaaagaaaac uuugaaaaua cgaaguuucu 120 auucccagcu uugucuggu 139 <210> 5 <211> 79 <212> RNA <213> Measles virus <400> 5 ggugguuagg cauuauuugc aauauauuaa agaaaacuuu gaaaauacga aguuucuauu 60 cccagcuuug ucugguccc 79 <210> 6 <211> 139 <212> RNA <213> Measles virus <400> 6 ggauacagug cccugauuaa ggacuaauug guugaacucc ggaacccuaa uccugcccua 60 ggugguuagg cauuauuugc aauauauuaa agaaaacuuu gaaaauacga aguuucuauu 120 cccagcuuug ucugguccc 139 <210> 7 <211> 99 <212> RNA <213> Measles virus <400> 7 ggaacccuaa uccugcccua ggugguuagg cauuauuugc aauauauuaa agaaaacuuu 60 gaaaauacga aguuucuauu cccagcuuug ucugguccc 99 <210> 8 <211> 110 <212> RNA <213> Measles virus <400> 8 gguugaacuc cggaacccua auccugcccu aggugguuag gcauuauuug caauauauua 60 aagaaaacuu ugaaaauacg aaguuucuau ucccagcuuu gucugguccc 110 <210> 9 <211> 119 <212> RNA <213> Measles virus <400> 9 ggacuaauug guugaacucc ggaacccuaa uccugcccua ggugguuagg cauuauuugc 60 aauauauuaa agaaaacuuu gaaaauacga aguuucuauu cccagcuuug ucugguccc 119 <210> 10 <211> 73 <212> RNA <213> Measles virus <400> 10 ggauacagug cccugauuaa ggacuaauug guugaacucc ggaacccuaa uccugcccua 60 ggugguuagg cau 73 <210> 11 <211> 140 <212> RNA <213> Measles virus <400> 11 accagacaaa gcugggaaua gaaacuucgu auuuucaaag uuuucuuuaa uauauugcaa 60 auaaugccua accaccuagg gcaggauuag gguuccggag uucaaccaau uaguccuuaa 120 ucagggcacu guauccgacu 140 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN M362) <400> 12 tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 2006) <400> 13 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 1668) <400> 14 tccatgacgt tcctgatgct 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 1826) <400> 15 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 2007) <400> 16 tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN BW006) <400> 17 tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 2395) <400> 18 tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN M362 control) <400> 19 tgctgctgct tgcaagcagc ttgat 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN M362 control_TpC substitute) <400> 20 ttcttcttct ttcaatcatc ttgat 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN M362 control_CpC substitute) <400> 21 tcctcctcct tccaaccacc ttgat 25 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 2006 control) <400> 22 tgctgctttt gtgcttttgt gctt 24 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 2006 control_TpC substitute) <400> 23 ttcttctttt gttcttttgt tctt 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 2006 control_CpC substitute) <400> 24 tcctcctttt gtccttttgt cctt 24 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 2007 control) <400> 25 tgctgcttgt gcttttgtgc tt 22 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 2007 control_TpC substitute) <400> 26 ttcttcttgt tcttttgttc tt 22 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 2007 control_CpC substitute) <400> 27 tcctccttgt ccttttgtcc tt 22 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN BW006 control) <400> 28 tgcagcttgc tgcttgctgc ttc 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN BW006 control_TpC substitute) <400> 29 ttcatctttc ttctttcttc ttc 23 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN BW006 control_CpC substitute) <400> 30 tccaccttcc tccttcctcc ttc 23 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 2395 control) <400> 31 tgctgctttt ggggggcccc cc 22 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 2395 control_TpC substitute) <400> 32 ttcttctttt gggggtcccc cc 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 2395 control_CpC substitute) <400> 33 tcctcctttt gggggccccc cc 22 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 1668 control) <400> 34 tccatgagct tcctgatgct 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 1668 control_TpC substitute) <400> 35 tccatgatct tcctgattct 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 1668 control_CpC substitute) <400> 36 tccatgacct tcctgatcct 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 1826 control) <400> 37 tccatgagct tcctgagctt 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 1826 control_TpC substitute) <400> 38 tccatgatct tcctgatctt 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA(ODN 1826 control_CpC substitute) <400> 39 tccatgacct tcctgacctt 20 <210> 40 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA/RNA chimeric molecule for sense chain <220> <221> misc_feature <222> (26)..(165) <223> RNA <400> 40 tgctgctgct tgcaagcagc ttgataccag acaaagcugg gaauagaaac uucguauuuu 60 caaaguuuuc uuuaauauau ugcaaauaau gccuaaccac cuagggcagg auuaggguuc 120 cggaguucaa ccaauuaguc cuuaaucagg gcacuguauc cgacu 165 <210> 41 <211> 140 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic RNA for antisense chain <400> 41 agucggauac agugcccuga uuaaggacua auugguugaa cuccggaacc cuaauccugc 60 ccuagguggu uaggcauuau uugcaauaua uuaaagaaaa cuuugaaaau acgaaguuuc 120 uauucccagc uuugucuggu 140 <210> 42 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA/RNA chimeric molecule for sense chain <400> 42 tgctgctgct tgcaagcagc ttgataauag aaacuucgua uuuucaaagu uuucuuuaau 60 auauugcaaa uaaugccuaa ccaccuaggg caggauuagg guuccggagu ucaaccaauu 120 aguccuuaau cagggcacug uaucc 145 <210> 43 <211> 120 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic RNA for antisense chain <400> 43 ggauacagug cccugauuaa ggacuaauug guugaacucc ggaacccuaa uccugcccua 60 ggugguuagg cauuauuugc aauauauuaa agaaaacuuu gaaaauacga aguuucuauu 120 <210> 44 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA/RNA chimeric molecule for sense chain <400> 44 tgctgctgct tgcaagcagc ttgataauag aaacuucgua uuuucaaagu uuucuuuaau 60 auauuaauag aaacuucgua uuuucaaagu uuucuuuaau auauuaauag aaacuucgua 120 uuuucaaagu uuucuuuaau auauu 145 <210> 45 <211> 120 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic RNA for antisense chain <400> 45 aauauauuaa agaaaacuuu gaaaauacga aguuucuauu aauauauuaa agaaaacuuu 60 gaaaauacga aguuucuauu aauauauuaa agaaaacuuu gaaaauacga aguuucuauu 120 <210> 46 <211> 155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA/RNA chimeric molecule for sense chain <400> 46 tgctgctgct tgcaagcagc ttgataccag acaaagcugg gaauagaaac uucguauuuu 60 caaaguuuuc uuuaauauau ugcaaauaau gccuaaccac cuagggcagg auuaggguuc 120 cggaguucaa ccaauuaguc cuuaaucagg gcacu 155 <210> 47 <211> 130 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic RNA for antisense chain <400> 47 agugcccuga uuaaggacua auugguugaa cuccggaacc cuaauccugc ccuagguggu 60 uaggcauuau uugcaauaua uuaaagaaaa cuuugaaaau acgaaguuuc uauucccagc 120 uuugucuggu 130

Claims (15)

  1. 면역 체크 포인트 저해제 및 아쥬반트 조성물을 조합하여 포함하는, 암 또는 감염증을 치료하기 위한 의약으로서,
    상기 면역 체크 포인트 저해제가 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체를 포함하고,
    상기 아쥬반트 조성물이, 이중쇄 RNA와, CpG ODN에 있어서 CpG가 GpC, TpC 또는 CpC로 치환된 서열 또는 그의 5 염기 길이 이상의 부분 서열을 포함하는 단일쇄 올리고데옥시뉴클레오티드(단일쇄 ODN)로 구성되는 핵산 아쥬반트를 포함하는 상기 의약.
  2. 제1항에 있어서, 면역 체크 포인트 저해제와 아쥬반트 조성물이 병용되는 것을 특징으로 하는 의약.
  3. 제2항에 있어서, 면역 체크 포인트 저해제와 아쥬반트 조성물이 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 의약.
  4. 이중쇄 RNA와, CpG ODN에 있어서 CpG가 GpC, TpC 또는 CpC로 치환된 서열 또는 그의 5 염기 길이 이상의 부분 서열을 포함하는 단일쇄 올리고데옥시뉴클레오티드(단일쇄 ODN)로 구성되는 핵산 아쥬반트를 포함하는 아쥬반트 조성물과 병용하는 것을 특징으로 하는, 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체를 포함하는 면역 체크 포인트 저해제를 유효 성분으로 하는 암 또는 감염증을 치료하기 위한 의약.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 아쥬반트 조성물이 세균 항원, 바이러스 항원 및 암 항원으로부터 선택되는 항원 분자를 포함하는 의약.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 아쥬반트를 구성하는 핵산의 말단이 인산화되지 않은 의약.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 이중쇄 RNA가, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열의 연속된 30 염기 이상의 서열을 포함하고, 전체 길이가 80 내지 160 염기 길이의 염기 서열을 갖는 핵산이거나, 또는 상기 서열과 80％의 서열 동일성을 가지며 또한 TLR3 활성화능을 갖는 핵산인 의약.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 이중쇄 RNA가 서열 번호 2 내지 11 중 어느 것에 나타나는 염기 서열을 갖는 핵산이거나, 그의 연속된 100 염기 이상의 염기 서열을 갖는 핵산, 또는 상기 서열과 80％의 서열 동일성을 가지며 또한 TLR3 활성화능을 갖는 핵산인 의약.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 이중쇄 RNA가 서열 번호 11에 나타나는 염기 서열을 갖는 핵산이거나, 그의 연속된 100 염기 이상의 염기 서열을 갖는 핵산, 또는 상기 서열과 80％의 서열 동일성을 가지며 또한 TLR3 활성화능을 갖는 핵산인 의약.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단일쇄 ODN이 서열 번호 19 내지 39 중 어느 것에 나타나는 염기 서열 또는 그의 5 염기 이상의 부분 서열을 포함하는 핵산인 의약.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단일쇄 ODN이 서열 번호 19 내지 24 중 어느 것에 나타나는 염기 서열 또는 그의 5 염기 이상의 부분 서열을 포함하는 핵산인 의약.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단일쇄 ODN이 15 내지 28 염기 길이인 의약.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단일쇄 ODN을 구성하는 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 수식되어 있는 의약.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 아쥬반트가, 서열 번호 40으로 나타나는 센스쇄와 서열 번호 41로 나타나는 안티센스쇄를 포함하는 핵산, 서열 번호 42로 나타나는 센스쇄와 서열 번호 43으로 나타나는 안티센스쇄를 포함하는 핵산, 또는 상기 서열과 각각 80％의 서열 동일성을 갖는 센스쇄와 안티센스쇄를 포함하며 또한 아쥬반트 활성을 갖는 핵산인 의약.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 아쥬반트가,
    1) 서열 번호 40으로 나타나는 센스쇄와 서열 번호 41로 나타나는 안티센스쇄를 포함하거나,
    2) 서열 번호 42로 나타나는 센스쇄와 서열 번호 43으로 나타나는 안티센스쇄를 포함하거나,
    3) 서열 번호 44로 나타나는 센스쇄와 서열 번호 45로 나타나는 안티센스쇄를 포함하거나, 또는
    4) 서열 번호 46로 나타나는 센스쇄와 서열 번호 47로 나타나는 안티센스쇄를 포함하는
    의약.
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