TW201915024A - 含單株抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明有關於一種含單株抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物及其用途。前述單株抗體或其抗原結合片段可作為有效成分，專一性抑制或減緩PTX3與PTX3受體之結合，進而抑制或減緩PTX3與PTX3受體結合相關的疾病或症狀。

Description

含單株抗體或其抗原結合片段之醫藥組 成物及其用途
本發明是有關於一種醫藥組成物及其用途，特別是有關於一種含專一性抑制或減緩PTX3與PTX3受體結合之單株抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物及其用途。
目前已知癌細胞會刺激腫瘤周邊微環境產生各種發炎因子、白血球、血管過度增生及蛋白酶等，而癌症的慢性發炎反應也與癌細胞的生長、轉移與侵襲有關，然而其形成原因及詳細機制，仍有諸多未明之處。
腫瘤微環境除了與發炎反應有關之外，其他研究也指出，腫瘤微環境與腫瘤轉移(metastasis)及化療抗藥性(chemoresistance)亦息息相關。腫瘤微環境是由多種之基質細胞(stromal cells)及其他不同型態的細胞所構成，不僅可保護腫瘤，使腫瘤細胞得以逃脫和抵抗免疫細胞，而造成腫瘤細胞的抗藥性。
在腫瘤周邊基質組織中的纖維母細胞及巨噬細胞受到CEBPD活化後，會誘導產生分泌型因子-正五聚蛋白相關蛋白3(pentraxin-related protein 3；PTX3)，其具有促進血管新生的活性，且可增加鼻咽癌細胞之移行及侵入組織(或稱侵襲)的能力。另外，過去研究亦證實癌周邊組織細胞中CEBPD受到活化，亦可能促使癌轉移，甚至促使在化療過程中產生抗藥性癌細胞，這些抗藥性癌細胞會生長的更快並且更容易轉移。
目前市面上雖有一些小分子抗癌藥物，例如順-雙氨雙氯鉑(cis-diammine dichloroplatinum(II)；CDDP；商品名順鉑(Cisplatin))、太平洋紫杉醇(paclitaxel；商品名Taxol)以及5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil；5-FU)等，然而最近的研究發現，上述小分子抗癌藥物不僅活化癌細胞中的CEBPD表現，亦可活化巨噬細胞及纖維母細胞內CEBPD的表現，反而促使癌細胞產生抗藥性並快速轉移，導致癌症治療效果不佳。
有鑑於此，亟需發展一種醫藥組成物，藉以克服習知抗癌藥物會產生腫瘤細胞之抗藥性及快速轉移等問題。
因此，本發明之一態樣係在提供一種醫藥組成物，其包含具有有效劑量之單株抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑，且上述之單株抗體或其抗原結合片段 作為有效成分。
本發明之又另一態樣係在提供一種單株抗體或其抗原結合片段用於製備專一性抑制或減緩PTX3與PTX3受體結合之醫藥組成物之用途，其中單株抗體或其抗原結合片段為活性成份，且單株抗體或其抗原結合片段具有有效劑量，以抑制或減緩與PTX3及PTX3受體結合相關的疾病或症狀。
本發明之再一態樣係在提供一種用於體外抑制或減緩腫瘤細胞之活性的方法，包含對腫瘤細胞投予具有有效劑量之上述醫藥組成物，藉此抑制或減緩腫瘤細胞之活性。
根據本發明之上述態樣，提出一種醫藥組成物，其包含具有有效劑量之單株抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑，且上述之單株抗體或其抗原結合片段為有效成分。
根據本發明之另一態樣，提出一種單株抗體或其抗原結合片段用於製備專一性抑制或減緩正五聚蛋白相關蛋白(pentraxin-related protein；PTX3)與PTX3受體結合之醫藥組成物之用途。在一實施例中，前述單株抗體或其抗原結合片段為活性成份，且單株抗體或其抗原結合片段具有有效劑量，以抑制或減緩與PTX3及PTX3受體結合相關的疾病或症狀。
依據本發明一實施例，上述醫藥組成物係用於抑制或減緩與PTX3與PTX3受體結合相關的疾病或症狀， 其中此疾病或症狀包括肺癌(lung cancer)、乳癌(breast cancer)、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma；NPC)及神經膠母細胞瘤(glioblastoma multiforme；GBM)。
根據本發明之又另一態樣，提出一種用於體外抑制或減緩腫瘤細胞之活性的方法，包括對腫瘤細胞投予有效劑量之上述醫藥組成物，藉此抑制或減緩腫瘤細胞之活性。
依據本發明一實施例，上述活性包含增生(proliferation)、癌幹原細胞性(cancer stemness)、移行(migration)、侵襲(invasiveness)、轉移(metastasis)或抗藥性(drug resistance)。
應用本發明之含單株抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物，其係利用特定的PTX3單株抗體或其抗原結合片段作為有效成分，專一性抑制或減緩PTX3與PTX3受體之結合，進而抑制或減緩與PTX3與PTX3受體結合相關的疾病或症狀。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：
〔圖1A〕至〔圖1C〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體抑制乳癌細胞株MDA-MB231之移行細胞數(圖1A)、侵襲細胞數(圖1B)、細胞球團數(圖1C)的結果。
〔圖2A〕至〔圖2C〕係繪示根據本發明一實施例之 PTX3單株抗體抑制肺癌細胞株A549之移行細胞數(圖2A)、侵襲細胞數(圖2B)、細胞球團數(圖2C)的結果。
〔圖3A〕至〔圖3C〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體抑制鼻咽癌細胞株HONE1之移行細胞數(圖3A)、侵襲細胞數(圖3B)、細胞球團數(圖3C)的結果。
〔圖4A〕至〔圖4C〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體抑制神經膠母細胞瘤細胞株U87MG之移行細胞數(圖4A)、侵襲細胞數(圖4B)、細胞球團數(圖4C)的結果。
〔圖5〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或市售抗體對於不同種PTX3重組蛋白之結合的結果。
〔圖6A〕至〔圖6B〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或市售抗體抑制乳癌細胞株MDA-MB231之移行細胞數(圖6A)及侵襲細胞數(圖6B)的結果。
〔圖7A〕至〔圖7B〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或市售抗體抑制肺癌細胞株A549之移行細胞數(圖7A)及侵襲細胞數(圖7B)的結果。
〔圖8A〕至〔圖8B〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或市售抗體抑制鼻咽癌細胞株HONE1之移行細胞數(圖8A)及侵襲細胞數(圖8B)的結果。
〔圖9A〕至〔圖9C〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或市售抗體抑制乳癌細胞株MDA-MB231(圖9A)、肺癌細胞株A549(圖9B)以及鼻咽癌細胞株HONE1(圖9C)之細胞球團數的結果。
〔圖10A〕至〔圖10B〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或控制組抗體抑制小鼠原位異種移植的乳癌細胞MDA-MB231之腫瘤體積(圖10A)及腫瘤轉移(圖10B)的結果。
〔圖11A〕至〔圖11B〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或同型對照抗體抑制小鼠原位同種移植乳癌細胞4T1之腫瘤體積(圖11A)及腫瘤轉移(圖11B)的結果。
承前所述，本發明提供一種含單株抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物及其用途，其係以單株抗體或其抗原結合片段作為有效成分，可專一性抑制或減緩正五聚蛋白相關蛋白(pentraxin-related protein；PTX3)受體與PTX3之結合，進而抑制或減緩與PTX3與PTX3受體結合相關的疾病或症狀。
本發明此處所稱的單株抗體或其抗原結合片段可包含特定序列的重鏈可變區序列以及輕鏈可變區序列，以專一性阻斷PTX3與PTX3受體的C端特定序列之結合。申言之，在一實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區序列以及輕鏈可變區序列，其中重鏈可變區序列可例如具有序列辨識編號(SEQ ID NO：)1所列之胺基酸序列，輕鏈可變區序列可例如SEQ ID NO：2所列之胺基酸序列。
在一些具體例示中，上述單株抗體或其抗原結合片段可專一性抑制或減緩PTX3與PTX3受體之結合，藉此專一性抑制或減緩PTX3受體與一或多種PTX3之交互作用、抑制或減緩PTX3訊息傳遞等。
上述之單株抗體或其抗原結合片段可作為有效成分，添加於醫藥組成物中。在一實施例中，前述醫藥組成物可選擇性包含醫藥學上可接受之載劑。本發明此處所稱之「醫藥學上可接受之載劑」係指本身非屬活性成分，而是用以將活性成分傳遞至個體之載劑、稀釋劑、佐劑及/或媒劑，或添加至上述組成物中以改善組成物之處理或儲存性質，或允許或有助於組合物之劑量單位形成適於醫藥組成物並方便投予的賦形劑或任何物質。前述醫藥學上可接受的載劑不應破壞活性成分之藥理學活性，且在傳遞足夠治療劑量之活性成分時應無毒性。
前述適用之醫藥學上可接受的載劑可為一般熟悉製造醫藥組成物之通常知識者所熟知，且包括但不限於緩衝劑、稀釋劑、崩解劑、黏合劑、黏著劑、濕潤劑、聚合物、潤滑劑、滑動劑、為遮蔽或抵消不良味道或氣味而添加之物質、染料、芳香劑及為改善組合物之外觀而添加之物質。前述醫藥學上可接受的載劑之具體例可包括但不限於檸檬酸鹽緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑、乙酸鹽緩衝劑、碳酸氫鹽緩衝劑、硬脂酸、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸及硫酸之鈉鹽及鈣鹽、碳酸鎂、滑石、明膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉、果膠、糊精、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、蔗糖、澱粉、明膠、纖維素物質 (諸如烷酸之纖維素酯及纖維素烷基酯)、低熔點蠟、可可脂、胺基酸、尿素、醇類、抗壞血酸、磷脂、蛋白質(例如血清白蛋白)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二甲亞碸(DMSO)、氯化鈉或其他鹽、脂質體、甘油或粉末、聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯醇及聚乙二醇)及其他醫藥學上可接受之物質。
本發明此處所稱的抑制或減緩與PTX3與PTX3受體結合相關的疾病或症狀可包括上皮細胞癌及神經膠母細胞瘤(glioblastoma multiforme；GBM)，其中上皮細胞癌可例如包括肺癌、乳癌及鼻咽癌。
在應用時，上述單株抗體或其抗原結合片段可用於對腫瘤細胞投予有效劑量之上述單株抗體或其抗原結合片段或上述的醫藥組成物，藉此抑制或減緩腫瘤細胞之活性。本發明前述所稱之「有效劑量」係指每公斤體重投以2mg至10mg的PTX3單株抗體或其抗原結合片段，以此劑量一週一次投予。在另一例示中，前述之PTX3單株抗體或其抗原結合片段之有效劑量可例如5mg/kg體重至10mg/kg體重，然以6mg/kg體重至9mg/kg體重為較佳。在此說明的是，倘若PTX3單株抗體之有效劑量低於2mg/kg體重，則無法於預設時間內有效減少或抑制或減緩PTX3與PTX3受體結合。
本發明此處所稱的腫瘤細胞之活性不拘，然可例如增生(proliferation)、癌幹原細胞性(cancer stemness)、移行(migration)、侵襲(invasion)、轉移 (metastasis)、腫瘤體積或抗藥性(drug resistance)。
上述之醫藥組成物可經由皮下注射(subcutaneous injection)、肌肉注射、靜脈注射、腹腔注射、原位注射(orthotopic injection)、經口投予、口鼻吸入等方式投予，藉此專一性抑制內生性PTX3活性，進而抑制或減緩癌細胞之活性。具體而言，經體外細胞實驗證實，本發明之單株抗體或其抗原結合片段及含此之醫藥組成物經使用達預設時間，例如4週至11週後，即可抑制或減緩癌細胞之活性。
以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。
實施例一、PTX3單株抗體的製備
此實施例係利用習知融合瘤法或重組蛋白表現法，製備專一性辨識PTX3重組蛋白之C端胺基酸序列的PTX3單株抗體。
簡言之，將如SEQ ID NO：3所列之非變性胺基酸序列之PTX3重組蛋白作為免疫原，以每頭小鼠50μg之劑量以腹腔注射(i.p.)的方式注入Balb/C小鼠或PTX3基因剔除(PTX3 knockout)小鼠腹腔內，2週後再以每頭小鼠50μg之劑量補強免疫，二週一次，共四次。接著，將活化的脾細胞與黑色素瘤細胞融合後，產生融合瘤細胞株。
收集上述所得的融合瘤細胞株之培養上清液經由市售管柱純化出PTX3單株抗體後，委由台灣偉喬生醫股份公司分析重鏈可變區及輕鏈可變區的互補決定區(complementarity-determining region；CDR)之胺基酸序列及對應的核酸序列，其重鏈可變區之胺基酸序列具有如SEQ ID NO：1所列之胺基酸序列，輕鏈可變區之胺基酸序列具有如SEQ ID NO：2所列之胺基酸序列。
另外，上述PTX3單株抗體經市售單株抗體分型套組分析後，確認其抗體分型為IgG1k。
實施例二、評估PTX3單株抗體對癌細胞活性之影響
乳癌、肺癌、鼻咽癌、神經膠母細胞瘤(glioblastoma multiforme；GBM)屬於惡性腫瘤，且上述癌細胞具有移行(migration)、侵襲(invasion)及癌幹原細胞性(cancer stemness)等活性。此實施例係利用人類乳癌細胞株(MDA-MB231，寄存編號：BCRC 60425，ATCC HTB-26；三陰性乳腺癌細胞株，以下簡稱MB231)、人類肺癌細胞株A549(寄存編號：BCRC 60074；ATCC CCL-185)、人類鼻咽癌細胞株HONE1(Int.J.Cancer.1990 Jan 15；45(1)：83-9；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.86,pp.9524-9528,December 1989)、人類GBM癌細胞U87MG(ATCC寄存編號：HTB-14；BCRC寄存編號：60360)等，藉由下述試驗評估實施例一之PTX3單株抗體對癌細胞活性之影響。
1.評估PTX3單株抗體對癌細胞移行之影響
在進行移行實驗時，將上述癌細胞以1×105細胞/孔之細胞密度，接種於24孔之博登細胞移行器(Boyden chamber)的上層(底部孔徑為8μm)，並培養3小時。接著，將上層之細胞培養液更換為不含血清之細胞培養液，並於下層之不含血清之細胞培養基中添加2.5μg/mL之PTX3重組蛋白(如SEQ ID NO：4所列之非變性胺基酸序列)、2μg/mL之PTX3單株抗體或2μg/mL之控制組抗體(IgG1k)。
在培養16小時後，以棉棒刮除上層內側之細胞，移行至上層底部外側的細胞利用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI；Invitrogen)進行染色，並於螢光顯微鏡之放大倍率200倍的視野下，計算移動至上層底部外側之細胞數，其結果如圖1A、圖2A、圖3A及圖4A所示。
請參閱圖1A、圖2A、圖3A及圖4A，其係分別繪示利用本發明實施例一之PTX3單株抗體抑制乳癌細胞MB231(圖1A)、肺癌細胞A549(圖2A)、鼻咽癌細胞HONE1(圖3A)及神經膠母細胞瘤細胞株U87MG(圖4A)之移行細胞數直條圖。上述實施例之數據皆係將每一時間點及每一樣品之三重複實驗數據，正負其平均標準差而獲得，所有的值皆係藉由單因子變異數分析(one way ANOVA)而分析。上述實施例之圖號「＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.01)之數據，圖號「＊＊＊」代表具有統計顯著性(P< 0.001)之數據。
由圖1A、圖2A、圖3A及圖4A之結果可知，相較於控制組抗體IgG1k，PTX3單株抗體可顯著抑制或減緩乳癌細胞MB231、肺癌細胞A549、鼻咽癌細胞HONE1及神經膠母細胞瘤細胞株U87MG的移行細胞數，且此項差異具有統計顯著性。
2.評估PTX3單株抗體對癌細胞侵襲之影響
在進行侵襲實驗時，24孔之博登細胞移行器(Boyden chamber)的上層(底部孔徑為8μm)底面預先以基底膜基質(matrigel，購自BD Bioscience)塗覆後，將上述癌細胞以1×105細胞/孔之細胞密度，接種於24孔之博登細胞移行器的上層，並培養3小時。接著，將上層之細胞培養液更換為不含血清之細胞培養液，並於下層之不含血清之細胞培養基中添加2.5μg/mL之PTX3重組蛋白(如SEQ ID NO：4所列之非變性胺基酸序列)、2μg/mL之PTX3單株抗體或2μg/mL之控制組抗體(IgG1k)。
在培養16小時後，以棉棒刮除上層內側之細胞，移行至上層底部外側的細胞利用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI；Invitrogen)進行染色，並於螢光顯微鏡之放大倍率200倍的視野下，計算移動至上層底部外側之細胞數，其結果如圖1B、圖2B、圖3B及圖4B所示。
請參閱圖1B、圖2B、圖3B及圖4B，其係分別 繪示利用本發明實施例一之PTX3單株抗體抑制乳癌細胞MB231(圖1B)、肺癌細胞A549(圖2B)、鼻咽癌細胞HONE1(圖3B)及神經膠母細胞瘤細胞株U87MG(圖4B)之侵襲細胞數直條圖，其中圖號「＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.01)之數據，圖號「＊＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.001)之數據。
由圖1B、圖2B、圖3B及圖4B之結果可知，相較於控制組抗體IgG1k，PTX3單株抗體可顯著抑制或減緩乳癌細胞MB231、肺癌細胞A549、鼻咽癌細胞HONE1及神經膠母細胞瘤細胞株U87MG的侵襲細胞數，且此項差異具有統計顯著性。
3.評估PTX3單株抗體對癌細胞移行之影響
上述癌細胞具有癌幹原細胞性(cancer stemness)，添加PTX3單株抗體可引起前述癌細胞形成細胞球團(sphere)。
在進行細胞球團實驗時，將上述癌細胞加入含2.5μg/mL之PTX3重組蛋白、2μg/mL之PTX3單株抗體或2μg/mL之控制組抗體(IgG1k)之含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum；FBS)的RPMI-1640細胞培養液〔含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum；FBS)，50~100μg/mL的鏈黴素及50~100U/mL的青黴素〕中，並在37℃保持溼度之5%二氧化碳濃度下培養，此為本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，故不另贅述。
然後，將上述不同處理的癌細胞以5×103細胞/孔之細胞密度，接種於超低吸附表面多孔培養皿(multi-well plate with ultra-low attachment surface；Corning Inc.)中，以不含血清(serum-free)之細胞培養基DMEM/F12(Gibco)[含B27(Invitrogen)、20ng/mL之表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF；Abcam)以及10ng/mL之鹼性纖維母細胞生長因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF；Peprotech)]，進行共同培養。經培養2週後，以光學顯微鏡觀察細胞球團數，其結果如圖1C、圖2C、圖3C及圖4C所示。
請參閱圖1C、圖2C、圖3C及圖4C，其係分別繪示利用本發明實施例一之PTX3單株抗體抑制乳癌細胞MB231(圖1C)、肺癌細胞A549(圖2C)、鼻咽癌細胞HONE1(圖3C)及神經膠母細胞瘤細胞株U87MG(圖4C)之細胞球團數直條圖，其中圖號「＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.01)之數據，圖號「＊＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.001)之數據。
由圖1C、圖2C、圖3C及圖4C結果可知，相較於控制組抗體IgG1k，實施例一之PTX3單株抗體可顯著抑制或減緩乳癌細胞MB231、肺癌細胞A549、鼻咽癌細胞HONE1及神經膠母細胞瘤細胞株U87MG的細胞球團數，且此項差異具有統計顯著性。
4.評估實施例一之PTX3單株抗體與市售PTX3單株抗 體與PTX3結合的表位定位區域之差異
此實施例係利用與實施例三相同的方式，評估實施例一之PTX3單株抗體與市售PTX3單株抗體(型號：ab90806；abcam plc.，U.K.)對於PTX3結合的表位定位區域，其結果如圖5所示。每個數值為三重複。
請參閱圖5，其係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體及市售PTX3單株抗體與不同片段之PTX3重組蛋白結合的表位定位圖譜，其中PTX3/FL代表如SEQ ID NO：4所列之PTX3重組蛋白片段，RI37代表如SEQ ID NO：5所列之PTX3重組蛋白片段，KT37代表如SEQ ID NO：6所列之PTX3重組蛋白片段，GI40代表如SEQ ID NO：7所列之PTX3重組蛋白片段，而圖號「＊＊＊」則代表相較於控制組(即BSA組)具有統計顯著性(p<0.001)。
由圖5的結果可知，實施例一之PTX3單株抗體與市售PTX3單株抗體(ab90806)對於PTX3/FL(SEQ ID NO：4)的親和力皆較高，但實施例一之PTX3單株抗體PTX3單株抗體對於RI37(SEQ ID NO：5)之PTX3重組蛋白片段的親和力高於市售PTX3單株抗體(ab90806)，且具有統計顯著性，代表PTX3單株抗體與市售PTX3單株抗體(ab90806)對於PTX3結合的表位定位區域確實具有差異。
5.評估實施例一之PTX3單株抗體與市售PTX3單株抗體對癌細胞活性之影響
此實施例係利用與實施例二相同的方式，評估 實施例一之PTX3單株抗體與市售PTX3單株抗體(型號：ab90806；abcam plc.，U.K.)對於癌細胞活動之抑制效果，其結果如圖6A至圖9C所示。
請參閱圖6A、圖7A及圖8A，其係分別繪示利用本發明實施例一之PTX3單株抗體或與市售PTX3單株抗體抑制乳癌細胞MB231(圖6A)、肺癌細胞A549(圖7A)及鼻咽癌細胞HONE1(圖8A)之移行細胞數直條圖，其中圖號「＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.01)之數據，圖號「＊＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.001)之數據。
由圖6A、圖7A及圖8A之結果可知，相較於控制組抗體IgG1k，實施例一之PTX3單株抗體與市售PTX3單株抗體(ab90806)可顯著抑制或減緩乳癌細胞MB231、肺癌細胞A549及鼻咽癌細胞HONE1的移行細胞數，但實施例一之PTX3單株抗體抑制或減緩癌細胞移行的效果，明顯高於市售PTX3單株抗體(ab90806)，且具有統計顯著性。
請參閱圖6B、圖7B及圖8B，其係分別繪示利用本發明實施例一之PTX3單株抗體或與市售PTX3單株抗體抑制乳癌細胞MB231(圖7B)、肺癌細胞A549(圖8B)及鼻咽癌細胞HONE1(圖9B)之侵襲細胞數直條圖，其中圖號「＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.01)之數據，圖號「＊＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.001)之數據。
由圖6B、圖7B及圖8B之結果可知，相較於控制組抗體IgG1k，實施例一之PTX3單株抗體與市售PTX3單株抗體(ab90806)可顯著抑制或減緩乳癌細胞MB231、 肺癌細胞A549及鼻咽癌細胞HONE1的侵襲細胞數，但實施例一之PTX3單株抗體抑制或減緩癌細胞侵襲的效果，明顯高於市售PTX3單株抗體(ab90806)，且具有統計顯著性。
請參閱圖9A、圖9B及圖9C，其係分別繪示利用本發明實施例一之PTX3單株抗體或與市售PTX3單株抗體抑制乳癌細胞MB231(圖9A)、肺癌細胞A549(圖9B)及鼻咽癌細胞HONE1(圖9C)之細胞球團數直條圖，其中圖號「＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.01)之數據，圖號「＊＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.001)之數據。
由圖9A、圖9B及圖9C之結果可知，相較於控制組抗體IgG1k，實施例一之PTX3單株抗體與市售PTX3單株抗體(ab90806)可顯著抑制或減緩乳癌細胞MB231、肺癌細胞A549及鼻咽癌細胞HONE1的細胞球團數，但實施例一之PTX3單株抗體抑制或減緩細胞球團數的效果，仍明顯高於市售PTX3單株抗體(ab90806)，且具有統計顯著性。
實施例三、評估PTX3單株抗體在活體內對腫瘤之生長及轉移的影響
1.評估實施例一之PTX3單株抗體在活體內抑制原位異種移植之腫瘤的生長及轉移
此實施例係將上述人類癌細胞株原位注射至免疫缺陷小鼠的乳腺脂肪墊中，待形成腫瘤後，再施用實施例一之PTX3單株抗體，藉此評估實施例一之PTX單株抗體抑制或減緩腫瘤之效果。
首先，將乳癌細胞MB231-Luc2〔MB231為人類乳癌細胞，不表現雌激素受體(estrogen receptor；ER)α及ERβ；Luc2為表現螢光素酶的基因〕原位接種到NOD-SCID小鼠(購自於樂斯科生物科技股份有限公司，台灣)的乳腺脂肪墊中。待腫瘤的平均體積達到80mm3後，對實驗小鼠施予實施例一之PTX3抗體(8mg/kg體重)或控制組抗體(IgG1k，8mg/kg體重)，每週施予一次，其結果如圖10A至圖10B所示。圖10B係在接種乳癌細胞MB231-Luc2後第11週活體成像結果，其中發光圖像處代表小鼠體內具有乳癌細胞MB231-Luc2形成的腫瘤。然後，犧牲所有小鼠，測量其體內腫瘤大小，並利用下式(I)計算腫瘤體積：V=(w×l 2)×0.52 (I)
在式(I)中，l代表腫瘤長度，w代表腫瘤寬度。
請參閱圖10A至圖10B，其係分別顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或控制組抗體抑制小鼠原位異種移植的乳癌細胞MDA-MB231之腫瘤體積(圖10A)及腫瘤轉移(圖10B)的結果。圖10A之數據係將每一時間點及每一樣品之六重複實驗數據，取其正負平均標準差而獲得，而圖號「＊」則代表相較於控制組抗體(IgG1k)具有統計顯著性(p<0.05)。
由圖10A及圖10B的結果可知，相較於控制組抗體(IgG1k)，實施例一之PTX3單株抗體可顯著抑制或減緩原位異種移植的乳癌細胞MB231的腫瘤體積及腫瘤轉 移，且此項差異具有統計顯著性。
2.評估實施例一之PTX3單株抗體在活體內抑制原位同種移植之腫瘤的生長及轉移
此實施例係將上述人類癌細胞株原位注射至免疫系統正常小鼠的乳腺脂肪墊中，待形成腫瘤後，再施用實施例一之PTX3單株抗體，藉此評估實施例一之PTX單株抗體抑制腫瘤之效果。
首先，將乳癌細胞4T1-Luc2(4T1為小鼠乳癌細胞株，表現ERβ但不表現ERα)原位接種到野生型BALB/c小鼠(購自於樂斯科生物科技股份有限公司，台灣)的乳腺脂肪墊中。待腫瘤的平均體積達到80mm3後，對實驗小鼠施予實施例一之PTX3抗體(8mg/kg體重)或控制組抗體(IgG1k，8mg/kg體重)，每週施予一次，其結果如圖11A至圖11B所示。圖11B係在接種乳癌細胞4T1-Luc2後第11週活體成像結果，其中發光圖像處代表小鼠體內具有乳癌細胞4T1-Luc2形成的腫瘤。然後，犧牲所有小鼠，測量其體內腫瘤大小，並利用上式(I)計算腫瘤體積。
請參閱圖11A至圖11B，其係分別顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或控制組抗體抑制小鼠原位同種移植的乳癌細胞4T1之腫瘤體積(圖11A)及腫瘤轉移(圖11B)的結果。圖11A之數據係將每一時間點及每一樣品之六重複實驗數據，取其正負平均標準差而獲得，而圖號「＊＊」則代表相較於控制組抗體(IgG1k)具有統計顯著性 (p<0.01)。
由圖11A及圖11B的結果可知，相較於控制組抗體(IgG1k)，實施例一之PTX3單株抗體可顯著抑制或減緩原位同種移植的乳癌細胞4T1的腫瘤體積及腫瘤轉移，且此項差異具有統計顯著性。
綜言之，本發明雖以特定序列的PTX3單株抗體、特定的分析模式或特定的評估方式作為例示，說明本發明之含單株抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物及其用途，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明之含單株抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物及其用途，亦可使用其他的分析模式或其他的評估方式進行。
由上述實施例可知，本發明之含單株抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物及其用途，其優點在於利用特定的PTX3單株抗體或其抗原結合片段作為有效成分，專一性抑制或減緩PTX3與PTX3受體之結合，進而抑制或減緩與PTX3與PTX3受體結合相關的疾病或症狀。
雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
<110> 國立成功大學
<120> 含單株抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物及其用途
<130>
<150> US 62/560,202
<151> 2017-09-19
<150> PCT/CN2018/105733
<151> 2018-09-14
<160> 7
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<223> PTX3單株抗體重鏈可變區
<400> 1
<210> 2
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> V_region
<223> PTX3單株抗體輕鏈可變區
<400> 2
<210> 3
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> (200)...(359)
<223> 人類PTX3重組蛋白
<400> 3
<210> 4
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> (19)...(381)
<223> 人類PTX3重組蛋白
<400> 4
<210> 5
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<222> (200)...(236)
<223> Human sapiens PTX3第200至236個胺基酸(RI37)
<400> 5
<210> 6
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Human sapiens PTX3第255至298個胺基酸(KT44)
<400> 6
<210> 7
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Human sapiens PTX3第320至359個胺基酸(GI40)
<400> 7

Claims (12)

  1. 一種醫藥組成物，包含具有一有效劑量之一單株抗體或其抗原結合片段及一醫藥學上可接受之載劑，且該單株抗體或其抗原結合片段係作為一有效成分。
  2. 根據申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中該有效劑量為每公斤體重2mg至10mg/kg體重。
  3. 根據申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中該有效劑量為5mg/kg體重至10mg/kg體重。
  4. 根據申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中該有效劑量為6mg/kg體重至9mg/kg體重。
  5. 一種單株抗體或其抗原結合片段用於製備專一性抑制或減緩正五聚蛋白相關蛋白(pentraxin-related protein；PTX3)與PTX3受體結合之醫藥組成物之用途，其中該單株抗體或其抗原結合片段為一活性成份，且該單株抗體或其抗原結合片段具有一有效劑量，以抑制或減緩與該PTX3與PTX3受體結合相關的一疾病或一症狀。
  6. 根據申請專利範圍第5項所述之單株抗體或其抗原結合片段用於製備專一性抑制或減緩PTX3與PTX3受體結合之醫藥組成物之用途，其中該疾病或該症狀包括上皮細胞癌及神經膠母細胞瘤(glioblastoma multiforme；GBM)。
  7. 根據申請專利範圍第5項所述之單株抗體或其抗原結合片段用於製備專一性抑制或減緩PTX3與 PTX3受體結合之醫藥組成物之用途，其中該上皮細胞癌包括肺癌、乳癌及鼻咽癌。
  8. 根據申請專利範圍第5項所述之單株抗體或其抗原結合片段用於製備專一性抑制或減緩PTX3與PTX3受體結合之醫藥組成物之用途，其中該醫藥組成物係經由皮下注射(subcutaneous injection)、肌肉注射、靜脈注射、腹腔注射、原位注射(orthotopic injection)、經口投予、口鼻吸入之方式投予。
  9. 一種用於體外抑制或減緩腫瘤細胞之活性的方法，包括對一腫瘤細胞投予一有效劑量如申請專利範圍第1項至第4項任一項所述的醫藥組成物，藉此抑制或減緩該腫瘤細胞之一活性。
  10. 根據申請專利範圍第9項所述之用於體外抑制或減緩腫瘤細胞之活性的方法，其中該腫瘤細胞之一來源包括神經膠母細胞瘤及上皮細胞癌。
  11. 根據申請專利範圍第9項所述之用於體外抑制或減緩腫瘤細胞之活性的方法，其中該上皮細胞癌包括肺癌、乳癌及鼻咽癌。
  12. 根據申請專利範圍第9項所述之用於體外抑制或減緩腫瘤細胞之活性的方法，其中該活性包含增生(proliferation)、癌幹原細胞性(cancer stemness)、移行(migration)、侵襲(invasiveness)、轉移(metastasis)、腫瘤體積或抗藥性(drug resistance)。
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